ガングリオシドを抽出および精製する方法
ＧＭ１の安定かつ再生可能な供給源としての、ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒されたヒツジから得られる細胞またはＧＭ１ガングリオシドーシスのヒト患者から得られる細胞から、ＧＭ１ガングリオシドを精製および抽出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００９年９月１日出願の米国仮特許出願第６１／２３８７７５号に対する優先権を請求する。本出願は、それぞれの全内容が参照により組み込まれている、米国仮特許出願第６１／２３８７３５号；第６１／２３８７４８号および第６１／２３８７２６号に基づく、２０１０年９月１日出願のＰＣＴ出願第＿号に関連する。
【０００２】
本明細書では、ガングリオシド、例えばモノシアロガングリオシド（ＧＭ１）を抽出および精製する方法が記載される。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、臨床症状の時間依存的悪化をもたらす、徐々にではあるが絶え間なく進行性の神経変性障害である。臨床症状には、振戦、運動緩慢（遅い運動）、筋強剛、障害性の姿勢および平衡、自動運動の喪失、ならびに発声変化が含まれる。患者間でかなりの臨床的変動性が存在するが、現在の抗ＰＤ薬物の医療設備は、たとえ一時的であっても、大多数の患者における主要なパーキンソン病様徴候および症状の大半を効果的に回復させる。伝統的な薬物療法による一過性の症状の改善にもかかわらず、機能的障害は時間の経過とともに悪化する。
【０００４】
レボドパ療法は、症状の進行を遅らせないが、この療法の出現は、ＰＤ患者の生存期間の延長と関連してきた。レボドパ、すなわちドーパミンの代謝前駆体（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）は、現在、ＰＤの治療における唯一の最も効果的な薬剤である。トルカポン（ｔｏｌｃａｐｏｎｅ）およびエンタカポン（ｅｎｔａｃａｐｏｎｅ）などのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤が、経口投与されるレボドパの異化を防止するためにレボドパと付随して投与される、；そのため、ＣＮＳに到達するレボドパの血漿内半減期および割合が増加する。レボドパ療法を継続する問題は、患者の長期効能期間後、症状を減少させる有効性が各投与後により短くなることである。さらに、ジスキネジアが時間の経過とともに起こる。レボドパの継続使用のこれらの効果は、進行性のドーパミン変性の結果である。
【０００５】
ＰＤの進行を確実に遅らせるもしくは停止する、またはＰＤ患者の不可避の機能低下を実質的に未然に防ぐ薬物はまだ同定されていない。
【０００６】
臨床的進行を修正する、運動もしくは認知障害を治療する、ドーパミン（「ＤＡ」）系の残存部分の機能を回復もしくは増強する、または代償機能を活性化することができる薬物が切実に必要とされている。しかしながら、現在までに研究された薬剤で、神経保護または疾患修飾の確かな証拠を得たものはなく、神経再生剤として研究された薬剤はない。
【０００７】
前臨床インビトロおよびインビボ研究は、ＧＭ１が、損傷したＤＡニューロンを救助し、ドーパミン作動性ニューロンおよび機能的ドーパミン作動性終末の生存および修復を刺激し、線条体のＤＡレベルを増加させ、ならびに残存ニューロンのＤＡ合成能力を上方制御することを示した。例えば、「ＧＭ１ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８４５、３６３〜７３（２００６年２月）を参照されたい。ＰＤ患者におけるＧＭ１の予備的臨床研究はまた、ＧＭ１の短期間使用による患者の臨床的効果および５年間にわたるＧＭ１の使用による患者の副集団における最小限の症状の進行、その後の長期間のＧＭ１使用の中断後の症状の有意な進行を示した。
【０００８】
そのため、ＰＤの治療に対する潜在的に実りあるアプローチは、ＧＭ１などの薬剤の投与からなり、これは損傷したもしくは瀕死のＤＡニューロンを安定化する、新しいドーパミン作動性線維および終末の新芽形成を刺激する、または残存ドーパミン作動性ニューロンの機能を増強する、または代償プロセスを刺激もしくは維持することができる。
【０００９】
ＧＭ１、モノシアロガングリオシドは、神経細胞膜の正常な成分であり、いくつかの細胞表面および受容体の活性を調節する、ならびに神経分化および発達、タンパク質リン酸化、およびシナプス機能において重要な役割を果たすことが知られている。多数の前臨床研究において、中枢神経系への異なる種類の障害の後のＧＭ１による慢性的治療が、生化学的および行動上の回復をもたらし、これらの効果は損傷ＤＡ系において特に印象的であった。
【００１０】
今まで、臨床的に使用されるＧＭ１の唯一の形態は、ウシ脳から得られてきた。脳１個当たり得られるＧＭ１の限定された量および脳抽出手順に伴う費用が、市販品としてのその発展を制限してきた。さらに、ＧＭ１供給源としてのウシの脳の使用は、牛海綿状脳症（「狂牛病」）などのプリオン病に対するもっともな懸念を引き起こす。
【００１１】
ＧＭ１を抽出および精製する新規な改善された方法、特に非ウシ供給源を使用する方法についての継続的かつ未だ対処されていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、非ウシ供給源からの、ガングリオシド、例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１を抽出および精製する新規な方法を開示する。
【００１３】
本明細書では、組織からＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中でＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；培養液からＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む、ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製することにより、ＧＭ１ガングリオシドを単離する方法が提供される。ＧＭ１産生細胞は神経細胞であり得る。別の態様では、該細胞は線維芽細胞であり得る。本明細書で使用するＧＭ１産生細胞は、基礎的にまたは正常細胞と比較して上昇したレベルでＧＭ１を発現する細胞である。
【００１４】
別の実施形態では、本方法は、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型の被験体から収集した非ウシおよび非ブタ線維芽細胞から得られる神経細胞からＧＭ１を単離するステップを含み得る。そのため、ＧＭ１はＢＳＥ汚染物質を含まない。
【００１５】
別の実施形態では、ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製するステップと；前記組織からＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中で前記ＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；前記培養液から前記ＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む本明細書で開示される方法により製造されるＧＭ１ガングリオシド組成物が提供される。そのため、ＧＭ１ガングリオシドはＢＳＥ汚染物質を実質的に含まないまたは含まない。
【００１６】
以下の詳細な説明および実施例を参照することにより、さらなる特徴が理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本明細書に記載の１型培地の低Ｏ２培養液におけるヒツジ海馬細胞の伸長統計を列挙する表である。
【図２】海馬神経前駆細胞の累積集団倍加の線グラフである。
【図３】本明細書に記載の１型培地の低Ｏ２培養液における海馬細胞の全体倍加および収量を列挙する表である。
【図４】本明細書に記載の１型培地の低Ｏ２培養液におけるヒツジ線維芽細胞の伸長統計を列挙する表である。
【図５】ヒツジ線維芽細胞の累積集団倍加の線グラフである。
【図６】肺対硬膜外結合組織の伸長を示す棒グラフである。
【図７】肺対結合組織の線維芽細胞の伸長を列挙する表である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書では、ここで、ＧＭ１の安定かつ再生可能な供給源としての、ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒されたヒツジから得られる細胞またはＧＭ１ガングリオシドーシスのヒト患者から得られる細胞から、ＧＭ１ガングリオシドを精製および抽出する新規な方法が記載される。
【００１９】
本明細書では、組織からＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中でＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；培養液からＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む、ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製することにより、ＧＭ１ガングリオシドを単離する方法が提供される。ＧＭ１産生細胞は神経細胞であり得る。別の態様では、該細胞は線維芽細胞であり得る。本明細書で使用するＧＭ１産生細胞は、正常細胞と比較して上昇したレベルでＧＭ１を発現する過剰産生細胞である。特に、このような細胞は、ガングリオシドーシスに冒されたヒツジおよび／またはヒトから得ることができる。
【００２０】
細胞を単離および調製する組織には、半卵円中心、小脳皮質、海馬、尾状核頭、前頭葉、頭頂皮質、または脳の脳室壁、顆粒細胞下層もしくは脳室裏層領域が含まれる。本方法において、これらの異なる領域から抽出される細胞の任意の組み合わせが、伸長および培養され得る。ＧＭ産生細胞は、表皮組織または肺組織から得られる線維芽細胞であり、ここでＧＭ１産生細胞には、コア脳組織細胞（ｃｏｒｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌ）または前駆細胞が含まれる。
【００２１】
さらに、開示される別の態様は、組織の一部を切除するステップと；前記組織を輸送培地中に固定するステップであって、該培地が、高グルコースＤＭＥＭ；４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５〜１０％、１０〜２０％または２０〜３０％ウシ胎児血清、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１Ｘ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン；アンホマイシンおよびゲンタマイシンであり得るステップと；前記細胞の伸長を維持するのに十分な温度で組織を冷蔵するステップとにより、非ウシまたは非ブタ組織を調製する方法である。
【００２２】
一実施形態では、神経細胞は、ＧＭ１ガングリオシドが過剰発現している脳組織から得られるか、またはＧＭ１ガングリオシドーシスに冒された脳から得られる。神経細胞は、正常細胞と比較してＧＭ１の過剰発現につながるＯ−ガラクトシダーゼの欠損を有し得る。本方法で使用する神経細胞は、部分的ａ−ノイラミニダーゼ活性を有し得る。
【００２３】
別の実施形態では、本方法は、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型のヒト被験体から収集した非ウシおよび非ブタ線維芽細胞からＧＭ１を単離するステップを含み得る。そのため、ＧＭ１はＢＳＥ汚染物質を含まない。本明細書で使用するＢＳＥ汚染物質は、任意の生体分子タンパク質、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）またはＰｒＰタンパク質に対する抗体を通して検出され得る任意の生体分子を意味する。典型的には、ＧＭ１の商業的に入手可能な供給源はウシ由来のものであり、考えられる汚染物質を除去するために照射された形態で見られるが、このような供給源の治療上のリスクは残る。このような典型的なＧＭ１供給源にはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈが含まれる。
【００２４】
別の実施形態では、ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製するステップと；前記組織からＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中で前記ＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；前記培養液から前記ＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む本明細書で開示される方法により製造されるＧＭ１ガングリオシド組成物が提供される。そのため、ＧＭ１ガングリオシドはＢＳＥ汚染物質を実質的に含まないまたは含まない。
【００２５】
本発明は、パーキンソン病および他の神経障害の治療で使用するための、商業的に実行可能な量のＧＭ１ガングリオシドを得るための、ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒されたヒツジから得られる細胞またはＧＭ１ガングリオシドーシスのヒトから得られる細胞の使用を含む。ガングリオシドは、単独で、またはＰＤ患者もしくは他の種類の神経変性疾患（それだけに限定されないが、ハンチントン舞踏病等を含む）の患者のための標準的な医療と共に投与され得る。
【００２６】
ＧＭ１は、単独でまたは他のガングリオシドと組み合わせて、中でも皮下もしくは静脈内注射または経鼻もしくは粘膜投与を通して投与され得る。これはまた、持続性作用剤形を含んでもよく、薬物活性を延長するために放出制御製剤（リポソーム、ナノ粒子、マイクロスフェア）を使用してガングリオシドを投与してもよい。血液脳関門を通過するためにガングリオシドを適当な輸送分子と結合させてもよい。
【００２７】
ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒されたヒツジならびにこのような動物の脳からのＧＭ１および他のガングリオシドの抽出は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５５３２１４１号に記載されている。これらの動物の疾患は、Ｏ−ガラクトシダーゼ活性の欠損および部分的ａ−ノイラミニダーゼ活性を特徴とし、その結果として、脳組織中に大量のＧＭ１ガングリオシドが蓄積した（非罹患動物と比較して４０倍までの増加）動物が得られる。最適化された抽出手順を使用すると、単一のガングリオシドーシスヒツジ脳は１〜２ｇのＧＭ１をもたらすと推定される。１ｋｇの罹患脳は約１５ｇのＧＭ１をもたらすとさらに推定される。比較すると、１ｋｇのブタ脳は、２５０ｍｇのＧＭ１をもたらすと推定される。しかしながら、これらの増強された発現レベルでさえ、商業的な量のＧＭ１を得るためには、１年当たり数十万頭のヒツジが必要であろう。
【００２８】
細胞工学を使用して、ＧＭ１ガングリオシドーシスヒツジから得られるいくつかの潜在的な供給源からＧＭ１を得ることができる。例えば、神経前駆細胞を成長および伸長させ、それらをニューロン表現型に駆動し、それらの成長および発達（およびおそらく、それだけに限定されないが、Ｂ系列ガングリオシド産生の阻害（例えば、ＧＤ３合成酵素を阻害することにより）、およびＧＭ１でのＡ系列ガングリオシドの生合成経路の停止、したがってＧＭ１に向かうより多くのガングリオシド産生の短絡を含む種々の操作を使用するＧＭ１産生でさえ）を最適化し、次いで、培養された神経細胞からのＧＭ１ならびに培地中に細胞により排出されたＧＭ１を抽出することができる。ガングリオシド排出を増強し、培養された細胞からのガングリオシドの回収をさらに最適化するためにさらなる変更を行うこともできる。上で概説した一般的スキームの代わりに、またはこれと組み合わせて、線維芽細胞または肝細胞を、ＧＭ１の供給源として培養液中で培養し使用することもできる。
【００２９】
本方法で使用される細胞は、それだけに限定されないが、半卵円中心、小脳皮質、海馬、尾状核、大脳皮質、脳室壁またはこれらの組み合わせを含む脳組織から得ることができる。
【００３０】
ＧＭ１の別の潜在的供給源は、Ｉ型（小児型）ＧＭ１ガングリオシドーシスの患者由来の線維芽細胞（または肝細胞）である。ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型の患者は、細胞内に正常な量の１％未満のガラクトシダーゼを有する傾向があり、したがって、これらの細胞は非常に高レベルのＧＭ１ガングリオシドを産生する傾向がある。正常なヒト線維芽細胞は、タンパク質１ｍｇ当たりＧＭ１約０．７ｎｍｏｌを含有し得る。ＧＭ１ガングリオシドーシス線維芽細胞は、タンパク質１ｍｇ当たりＧＭ１ ２．５８ｎｍｏｌまでを含有し得る。培養されたヒトＧＭ１ガングリオシドーシス線維芽細胞から得られるＧＭ１の量は、最適な細胞成長パラメータ、培養液および栄養条件を使用して、ＧＭ１抽出用の細胞を収集するための最適な時間を決定することにより、最適化されるだろう。さらに、多数のサンプルをＧＭ１Ｉ型患者ドナーからスクリーニングして、患者間で異なるβ−ガラクトシダーゼ欠損の重症度による最適なＧＭ１蓄積を示す細胞系を発見するだろう。さらに、同一患者からの肝細胞を、ＧＭ１の代替または相補細胞供給源として使用することができる。
【００３１】
いったんガングリオシドーシスヒツジからの細胞を有すると、これらの細胞からのＧＭ１収量をさらに増強するいくつかの可能な方法が存在する。一つの方法は、細胞を低濃度のクロロキン、弱塩基で処理するものであり、これはエンドソーム内および細胞表面上のＧＭ１の顕著な蓄積を引き起こすだろう（Ｙｕｙａｍａ等、２００６）。別の方法は、細胞を、全ての主要な脳複合ガングリオシド（例えば、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂ）を完全細胞上のＧＭ１に転換するシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）で処理するものである（Ｓｃｈａｕｅｒ等、１９８０）。別の方法は、主にＧＭ１を得るためにポリシアル化ガングリオ−Ｎ−テトラオース系列ガングリオシドの高選択的脱シアリル化を触媒するＤｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｈ＋を使用する非酵素的方法を使用するものである（ＳｃｈｅｎｇｒｕｎｄおよびＫｏｖａｃ、１９９９）。これらの方法を使用して、増強した量のＧＭ１を細胞および膜から回収すること、ならびに培地中に排出されるおよび培地から回収されるＧＭ１の量を増加させることが可能である。
【００３２】
細胞工学によりＧＭ１ガングリオシドを産生する追加の潜在的手段には、大腸菌にＧＭ１ガングリオシドを産生させるための、多重ゲノム工学および加速させた進化による細胞のプログラミングが含まれ得る。多重自動ゲノム工学（「ＭＡＧＥ」）を使用して、ＧＭ１ガングリオシドを過剰産生するために大腸菌のＧＭ１の生合成経路を操作することができる。例えば、ＧＭ１産生を最適化するおよび他のガングリオシドの産生を阻害するために、特定の関連遺伝子の発現を最適に調整することおよび特定の遺伝子を抑制または省略することにより、多くの遺伝子位置を同時に変更してＧＭ１生合成を修飾することができる。当技術分野で既知の標準的方法を通してガングリオシド遺伝子を大腸菌系中に組み込む当業者に既知の方法により、大腸菌を修飾することができる。例として、標準的方法は、培養液中でＧＭ１を産生するＧＭ１合成酵素を発現するよう修飾されたプラスミドＤＮＡを単離するステップを含む。他のガングリオシド産生遺伝子には、ＧＤ３合成酵素が含まれる。
【００３３】
大腸菌は、必要に応じて、合成ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ、植物源）およびシアル酸（非動物源から入手可能であるか、合成することができる）などの前駆物質が培地中で利用可能である特定の条件下で培養することができる。酵素活性（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ）をＭＡＧＥプロセスにより微調整することができ、活性化因子（トランスフェラーゼ酵素の活性化のためのグアノシン三リン酸）を提供することができ、ならびにＮ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトース（糖供与体として働くために、糖はそのヌクレオチド誘導体に転換される必要がある）を提供することができる。
【００３４】
ＧＭ１は、現在、ウシまたはブタ脳から抽出されており、これは低収率で高価な方法である。本発明は、ＧＭ１ガングリオシドの安全かつ効率的な細胞ベースの産生を提供するだろう。本発明はまた、ヒトＧＭ１ガングリオシドの初めての商業的供給源も提供するだろう。本技術により、ＧＭ１以外の他のガングリオシド種も産生することができ、ＧＭ１および他のガングリオシドは、パーキンソン病などの種々の神経障害における用途を有し得る。
【００３５】
脳ガングリオシドを抽出、分離および精製する典型的な手順が記載され、それは以下を含む：緩衝テトラヒドロフランまたは当技術分野で既知の他の適当な溶媒による脳の徹底的抽出；最初にエチルエーテル、次いで、蒸留水による抽出物の分配；得られた水相の透析、およびシリカゲルカラムによる透析液のクロマトグラフィー。徹底的な抽出後の残渣は、全ての脳糖タンパク質を含有する。手順は、抽出プロセスのクロロホルム法を含む。
実施例
実施例１
【００３６】
以下の組織供給源を含むヒツジ脳組織を入手した：半卵円中心、小脳皮質；海馬、尾状核、大脳皮質（例えば、前頭葉、頭頂部）および脳室壁。
【００３７】
全組織を以下の方法を通して個々に処理した：ＰＩＰＥＳ緩衝液により各組織型を洗浄した；抗生物質／抗真菌剤を含むパパイン／ＤＮアーゼ／ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）の混合物中で各組織を消化し、酵素を中和し、解離細胞をセルストレーナーに通した；細胞を遠心分離し、抗生物質／抗真菌剤を含有する５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２に再懸濁した；細胞を数え上げ、次いでａ．培地型番号１：抗生物質／抗真菌剤を含有する５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２中フィブロネクチン被覆２フラスコ中に播種した；１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを補充した。Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ａ培地；各培地型中の細胞を、低Ｏ２および比較用の高Ｏ２下で、３７℃加湿インキュベーター中で培養した。
【表１】
【００３８】
上記表１は、種々の成長条件における細胞の増殖および伸長を説明したものである。Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ａで培養した培養液は、あまり成長せず、そのため、Ｐ．０で収集した少数の細胞は凍結し、さらに伸長しなかった。
実施例２
【００３９】
以下の組織供給源を含むヒツジ組織を繊維芽細胞単離のために入手した：肺（左肺および右肺をプールした）、および硬膜外結合組織。
全組織を以下の方法を使用して個々に処理した：ＰＩＰＥＳ緩衝液により各組織型を洗浄した。抗生物質／抗真菌剤を含むＤＭＥＭ中コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）中で各組織を消化し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で酵素を中和し、解離細胞をセルストレーナーに通した。細胞を遠心分離し、抗生物質／抗真菌剤を含有するＦＧＭ−２に再懸濁した。細胞を数え上げ、次いで、フラスコ中に播種し、残りの組織をＦＧＭ−２培地中培養皿中に入れた。細胞を、低Ｏ２圧下でのみ、３７℃加湿インキュベーター中で培養した。
【表２】
実施例３
【００４０】
消化
標本を種々の遠心管に入れ、１〜１０のラベルをつけ、外装箱から取り出し、きれいに拭き、５０ｍＬ試験管立てに入れた。各管の画像を取得した。各管にエタノールを噴霧し、再度きれいに拭き、次いで、無菌処理のために安全キャビネットに移した。各管からの輸送培地を、清潔な１０ｍＬピペットを使用して慎重に吸引し、廃棄物容器中に排出した。過剰（４０ｍＬ）ＰＩＰＥＳ溶液を各管へ移し、蓋を取り替え、管を穏やかに数回前後に反転させて組織から残留輸送媒体を洗い流した。次いで、１０ｍＬピペットを使用してこれを吸引し、廃棄物容器中に排出した。
【００４１】
２０ｍＬの脳消化液を、脳組織を含有する管へ移し、各管に１〜６のラベルをつけた。各数字に対応する脳の領域を後で翻訳するための鍵を作った。２０ｍＬのコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ（１Ｘ）溶液を、他の器官からの組織を含有する管の各々に移した。滅菌２５ｍｌおよび５０ｍｌピペット、滅菌ピンセットおよびメスを使用して、管の各々からの組織を滅菌１０ｃｍ皿に移し、消化液に浸し、非常に小さい断片に分割した。各皿の内容物（組織断片および消化液）を２５ｍＬまたは５０ｍＬピペットで吸い上げ、適当な管へ移し、蓋をし、全て３７℃のインキュベーター中に４５分間置いた。４５分後、管を無菌的にフードへ移し、各々をそれぞれ滅菌２５ｍＬおよび１０ｍＬピペットを使用してすりつぶした。蓋を交換し、管を３７℃インキュベーター中試験管立てに１５分間戻した。インキュベーション後、管を無菌的にフードへ移した。２５ｍＬの中和媒体を１０本の管の各々へ移し、管に蓋をし、各々を数回前後に反転させて混合した。管を２００ｇで１０分間遠心分離して細胞および残りの組織塊をペレットにした。管を無菌的にフードへ移し、いかなる組織断片または細胞も吸い上げられないようにして、各管から上清を慎重に吸引した。脳領域１〜６を含有する管に、４０ｍＬ培地型番号１を入れ、細胞および残りの組織断片を再懸濁した。肺、硬膜外結合組織および骨結合組織を含有する管を、４０ｍＬ ＦＧＭ−２線維芽細胞成長培地に再懸濁した。再懸濁した細胞および組織を含む１０本の管の各々を、ピペットで４０ｕｍセルストレーナーを通し、新しいラベルをつけた５０ｍＬ管へ移した。各管についてカウントおよび生存率調査を行った。
【００４２】
低Ｏ２伸長条件
脳の６つの異なる領域からの細胞を、１０００００個／ｃｍ２で、１５ｍＬの培地型番号１または１５ｍＬの培地型番号２（Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ａ培地）中６つのフィブロネクチン被覆Ｔ８０フラスコに播種し、加湿３７℃インキュベーター中、低酸素圧（４％Ｏ２、５％ＣＯ２および窒素で釣り合わせた）でインキュベートした。２日毎に、培養培地の５０％を新鮮な培地と交換した。培養液は不均一であった。コロニー形成細胞は、初期の頃に存在する細胞の少数であったが、数日後、これらの細胞はコロニー形成および成長を始めた。継代０培養液を９日目に収集した。収量については表１．０を参照されたい。
【００４３】
６つの領域の各々について、第１継代細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、３６ｍｌの培地型番号１および培地型番号２の両方中２つのＴ２２５ｃｍ２フィブロネクチン被覆フラスコに播種した。５日目に培養液に１００％新鮮な培地を与えた。培養液はこの継代中はまだ不均一であったが、有意にきれいになり、この継代の初期でより多くのコロニー形成細胞が存在しており、これらの細胞は前の継代よりも早く成長した。６日目に４ｘ、１００ｘ、２００ｘで画像を取得した。培養液を６日目に収集した。
【００４４】
６つの領域の各々について、第２継代細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、３６ｍｌの培地型番号１および培地型番号２の両方中２つのＴ２２５ｃｍ２フィブロネクチン被覆フラスコに播種した。５日目に培養液に１００％新鮮な培地を与えた。培養液は９０％以上均一であった。培養液を６日目に収集した。次いで、培地型番号２中に維持した全培養液を凍結し、さらには伸長させなかった。培地型番号１中に維持した培養液（すなわち、海馬神経前駆細胞）を第６継代までさらに継代培養した（以下）：
【００４５】
第３継代細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、３６ｍｌの培地型番号１中２つのＴ２２５ｃｍ２フィブロネクチン被覆フラスコに播種した。５日目に培養液に１００％新鮮な培地を与えた。培養液は、この継代中均一であるように見えた。６日目に４ｘ、１００ｘ、２００ｘで画像を取得した。培養液を６日目に収集した。
【００４６】
第４継代細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、３６ｍｌの培地型番号１中２つのＴ２２５ｃｍ２フィブロネクチン被覆フラスコに播種した。５日目に培養液に１００％新鮮な培地を与えた。６日目に４ｘ、１００ｘ、２００ｘで画像を取得した。培養液を６日目に収集した。
【００４７】
線維芽細胞
ヒツジ肺の消化により得られた細胞を１０００００個細胞／ｃｍ２で播種し、硬膜外結合組織から得られた細胞を５００００個細胞／ｃｍ２でＦＧＭ−２培地に播種した。２日毎に培養液に５０％新鮮な培地を与え、第０継代を５日目に収集した。両培養液をより低密度で継代培養し、残りを凍結し保管した。
【００４８】
第１継代硬膜外および肺線維芽細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ中ＦＧＭ−２培地に播種した。５日目に培養液に１００％新鮮なＦＧＭ−２培地を与え、７日目に収集した。肺培養液を継代培養し、残りを凍結し保管した。硬膜外線維芽細胞は全て凍結し保管した。
【００４９】
第２継代肺線維芽細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ中ＦＧＭ−２培地に播種した。非常に重いので４日目に培養液に１００％新鮮なＦＧＭ−２培地を与え、次いで、５日目に収集した。培養液を継代培養し、残りを凍結し保管した。
【００５０】
第３継代肺線維芽細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ中ＦＧＭ−２培地に播種した。５日目に培養液に１００％新鮮なＦＧＭ−２培地を与え、６日目に収集した。培養液を継代培養し、残りを凍結し保管した。
【００５１】
高Ｏ２条件（標準法）
６つの領域の各々からの細胞を、１０００００個／ｃｍ２で、５ｍｌの培地型番号１および１３ｍｌの培地型番号２中、４つのＴ２５ｃｍ２および１つのＴ８０ｃｍ２（全てフィブロネクチンで被覆されている）に播種し、加湿３７℃インキュベーター中、１８％Ｏ２、５％ＣＯ２（標準条件）でインキュベートした。５日目に培養液にそれぞれの培地を与え、次いで、２４時間後の６日目に収集した。６日目の収集前に４ｘ、１００ｘ、２００ｘで画像を取得した。全領域からの細胞をカウントし、次いで、凍結し保管した。
【００５２】
輸送培地
死後および輸送中に組織の保管のために使用する培地。成分：高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；２０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１１４０、１００Ｘ溶液、ロット番号６７２５５５）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号、１００Ｘ溶液、ロット番号）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）。
【００５３】
消化液
脳：
高グルコース １：１ ＤＭＥＭ：Ｆ１２：４ｍＭ Ｌ−グルタミン；ディスパーゼ（１Ｕ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９４２０８６００１）；ＤＮアーゼ（２５０Ｕ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８０４７−０１９）；パパイン（２．５Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７６２１８）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号、１００Ｘ溶液）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）；
【００５４】
肺、硬膜外および骨：
高グルコースＤＭＥＭ：４ｍＭ Ｌ−グルタミン；コラゲナーゼ（３００Ｕ／ｍｌ）／ヒアルロニダーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）。
４．培養培地 脳：
【００５５】
ａ．培地型番号１
高グルコース １：１ ＤＭＥＭ：Ｆ１２；４ｍＭ Ｌ−グルタミン；Ｎ２サプリメント（１００Ｘ）液体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）；２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子、ヒト、組換え体（ｒｈ ＥＧＦ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト、組換え体（ｒｈ ｂＦＧＦ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００５６】
ｂ．培地型番号２
Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ ＮＳ−Ａ増殖用培地。Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ ＮＳ−Ａ基礎培地（ヒト）、４５０ｍｌ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ ＮＳ−Ａ増殖サプリメント（ヒト）、５０ｍｌ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）；２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子、ヒト、組換え体（ｒｈ ＥＧＦ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト、組換え体（ｒｈ ｂＦＧＦ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
実施例４
【００５７】
ＧＭ１でパーキンソン病患者を治療する臨床試験において、全機能査定（ベースラインおよびその後の全訪問の間）は、医薬品の投与前（事実上定義される「オフ」期間と考えられる）から、患者が最初に抗パーキンソン医薬品を服用する前および少なくとも１２時間前の午前中に行った。以下の機能的測定にしたがって、ベースライン能力について、３回の別々の機会に（２週間以内）全患者を試験した：（１）一次および二次評価者により独立に評価される、統一パーキンソン病評価尺度（「ＵＰＤＲＳ」）；（２）実行する時間：２０回の手の回内運動／回外運動；２０回のかかと−つま先タップ；２０回の親指−示指タップ；親指を順次他の指に１０回あてる時間；可能な限り速く２０フィート歩き、方向転換し、出発点に戻ってくる時間；単純な反応の時間の評価；（３）患者が体性感覚および固有受容フィードバックにのみ基づいて特定の運動を作り出す必要がある感覚運動統合の試験。この試験は、月に４回のフォローアップ訪問で行った。
【００５８】
各患者についての平均ベースラインスコアを計算し、治療スコアとの比較に使用した。主要な効能測定は、標準的な臨床的評価手段であるＵＰＤＲＳの運動要素における変化とした。ＧＭ１処理群（Ｎ＝２２）は、ＵＰＤＲＳ運動スコアの有意な改善（４週で５．０５ポイントおよび１６週で７．５３ポイントの平均的改善）を示した一方で、プラセボ処理群についての平均スコアは、処理の１６週にわたって本質的に変化しなかった。４週（−５．９５±１．１２）、８週（−５．６１±１．３９）、１２週（−５．３７±１．３０）および１６週（−６．７９±１．２４）の処理効果量は、統計学的に有意であった（ＡＮＣＯＶＡ、ｐ＜０．０００２）。運動機能の二次評価は、両群がベースラインで感覚運動統合課題に対する類似した数のエラーをした一方で（ＧＭ１＝５．３±２．３；プラセボ＝５．４±３．１）、ＧＭ１処理患者は、プラセボ処理患者（５．１エラー±３．１、ｐ＝０．０００１）よりも、処理の１６週後にしたエラーが有意に少なかった（０．７エラー±０．８）。ＧＭ１処理群はまた、プラセボ処理患者よりも、ベースラインと比較して、１６週で有意に速く時限運動課題（すなわち、回内運動／回外運動（ｐ＝０．０００１）、かかと／つま先タッピング（ｐ＝０．０００８）、指タッピング（ｐ＝０．０００１）、連続的指タッピング（ｐ＝０．０００１）および歩行（ｐ＝０．０２））を行った。患者は、５年間のＧＭ１の公開使用の終わりで、事前ランダム化ベースラインにおけるよりも低いＵＰＤＲＳ運動スコアを有し、日常生活の「オフ」期間の活動で報告される問題がより少なかった。
【００５９】
いったんベースライン試験が完了したら、患者は、５０ｍＬ滅菌リンガー液中の１０００ｍｇＧＭ１ガングリオシドまたはプラセボ（すなわち、ＧＭ１を含まない賦形剤）のいずれかの静脈内注入を受けた。患者は、皮下注射を自己投与するよう教えられ、同一の２．０ｍＬバイアル中に提供されたＧＭ１ガングリオシド（２．０ｍｌのビヒクル中１００ｍｇのＧＭ１／バイアル）またはプラセボのいずれかの４週間分を供給されて帰された。患者は、午前中に１回および夕方に１回、１日当たり２本のバイアルの内容物を投与するよう指示された（総一日量＝２００ｍｇ ＧＭ１）。併用医薬品は一定に保った。
【００６０】
本記載は代表的な実施形態を参照してなされているが、本範囲を逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、その要素の代わりに同等物を用いることができることが当業者により理解されよう。さらに、本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または物質をこの教示に適合させるために多くの修正を行うことができる。また、図面および説明において、代表的な実施形態が開示されており、特定の用語が使用されてきたかもしれないが、それらは特に明記しない限り、一般的かつ説明的意味でのみ使用されており、限定を目的とするものではなく、そのため、特許請求の範囲は限定されない。さらに、当業者は、本明細書で論じる方法の特定のステップを代わりの順序で順番付けることができる、またはステップを組み合わせることができることを認識するだろう。そのため、添付の特許請求の範囲は、本明細書で開示する特定の実施形態に限定されないことが意図されている。
【００６１】
この本文中に引用された出願および特許の各々、ならびにその出願および特許の各々に引用された各文書または参考文献（各登録特許の審査中を含む；「出願引用文書」）、ならびに任意のこれらの出願および特許に対応するおよび／またはそれらに基づく優先権を請求するＰＣＴおよび外国の出願または特許の各々、ならびに出願引用文書の各々で引用または参照された文書の各々は、本明細書によって明確にその全内容が参照により本明細書に組み込まれている。より一般的に、文書または参考文献は、特許請求の範囲の前の参考文献一覧またはこの本文自体のいずれかにおいてこの本文に引用され；そして、これらの文書または参考文献（「本明細書中に引用された参考文献」）の各々ならびに本明細書中に引用された参考文献の各々において引用された各文書または参考文献（任意の製造業者の仕様書、説明書等を含む）は、本明細書によって明確に参照により本明細書に組み込まれている。
【００６２】
参考文献
１Ｎｅｅｔａ Ｓ．Ｒｏｙ等。２０００。Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５９：３２１〜３１。
２（Ｐｈｉｌｉｐ Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ等。２００３。Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；７４：８３８〜５１。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００９年９月１日出願の米国仮特許出願第６１／２３８７７５号に対する優先権を請求する。本出願は、それぞれの全内容が参照により組み込まれている、米国仮特許出願第６１／２３８７３５号；第６１／２３８７４８号および第６１／２３８７２６号に基づく、２０１０年９月１日出願のＰＣＴ出願第＿号に関連する。
【０００２】
本明細書では、ガングリオシド、例えばモノシアロガングリオシド（ＧＭ１）を抽出および精製する方法が記載される。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、臨床症状の時間依存的悪化をもたらす、徐々にではあるが絶え間なく進行性の神経変性障害である。臨床症状には、振戦、運動緩慢（遅い運動）、筋強剛、障害性の姿勢および平衡、自動運動の喪失、ならびに発声変化が含まれる。患者間でかなりの臨床的変動性が存在するが、現在の抗ＰＤ薬物の医療設備は、たとえ一時的であっても、大多数の患者における主要なパーキンソン病様徴候および症状の大半を効果的に回復させる。伝統的な薬物療法による一過性の症状の改善にもかかわらず、機能的障害は時間の経過とともに悪化する。
【０００４】
レボドパ療法は、症状の進行を遅らせないが、この療法の出現は、ＰＤ患者の生存期間の延長と関連してきた。レボドパ、すなわちドーパミンの代謝前駆体（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）は、現在、ＰＤの治療における唯一の最も効果的な薬剤である。トルカポン（ｔｏｌｃａｐｏｎｅ）およびエンタカポン（ｅｎｔａｃａｐｏｎｅ）などのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤が、経口投与されるレボドパの異化を防止するためにレボドパと付随して投与される、；そのため、ＣＮＳに到達するレボドパの血漿内半減期および割合が増加する。レボドパ療法を継続する問題は、患者の長期効能期間後、症状を減少させる有効性が各投与後により短くなることである。さらに、ジスキネジアが時間の経過とともに起こる。レボドパの継続使用のこれらの効果は、進行性のドーパミン変性の結果である。
【０００５】
ＰＤの進行を確実に遅らせるもしくは停止する、またはＰＤ患者の不可避の機能低下を実質的に未然に防ぐ薬物はまだ同定されていない。
【０００６】
臨床的進行を修正する、運動もしくは認知障害を治療する、ドーパミン（「ＤＡ」）系の残存部分の機能を回復もしくは増強する、または代償機能を活性化することができる薬物が切実に必要とされている。しかしながら、現在までに研究された薬剤で、神経保護または疾患修飾の確かな証拠を得たものはなく、神経再生剤として研究された薬剤はない。
【０００７】
前臨床インビトロおよびインビボ研究は、ＧＭ１が、損傷したＤＡニューロンを救助し、ドーパミン作動性ニューロンおよび機能的ドーパミン作動性終末の生存および修復を刺激し、線条体のＤＡレベルを増加させ、ならびに残存ニューロンのＤＡ合成能力を上方制御することを示した。例えば、「ＧＭ１ Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８４５、３６３〜７３（２００６年２月）を参照されたい。ＰＤ患者におけるＧＭ１の予備的臨床研究はまた、ＧＭ１の短期間使用による患者の臨床的効果および５年間にわたるＧＭ１の使用による患者の副集団における最小限の症状の進行、その後の長期間のＧＭ１使用の中断後の症状の有意な進行を示した。
【０００８】
そのため、ＰＤの治療に対する潜在的に実りあるアプローチは、ＧＭ１などの薬剤の投与からなり、これは損傷したもしくは瀕死のＤＡニューロンを安定化する、新しいドーパミン作動性線維および終末の新芽形成を刺激する、または残存ドーパミン作動性ニューロンの機能を増強する、または代償プロセスを刺激もしくは維持することができる。
【０００９】
ＧＭ１、モノシアロガングリオシドは、神経細胞膜の正常な成分であり、いくつかの細胞表面および受容体の活性を調節する、ならびに神経分化および発達、タンパク質リン酸化、およびシナプス機能において重要な役割を果たすことが知られている。多数の前臨床研究において、中枢神経系への異なる種類の障害の後のＧＭ１による慢性的治療が、生化学的および行動上の回復をもたらし、これらの効果は損傷ＤＡ系において特に印象的であった。
【００１０】
今まで、臨床的に使用されるＧＭ１の唯一の形態は、ウシ脳から得られてきた。脳１個当たり得られるＧＭ１の限定された量および脳抽出手順に伴う費用が、市販品としてのその発展を制限してきた。さらに、ＧＭ１供給源としてのウシの脳の使用は、牛海綿状脳症（「狂牛病」）などのプリオン病に対するもっともな懸念を引き起こす。
【００１１】
ＧＭ１を抽出および精製する新規な改善された方法、特に非ウシ供給源を使用する方法についての継続的かつ未だ対処されていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、非ウシ供給源からの、ガングリオシド、例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１を抽出および精製する新規な方法を開示する。
【００１３】
本明細書では、組織からＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中でＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；培養液からＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む、ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製することにより、ＧＭ１ガングリオシドを単離する方法が提供される。ＧＭ１産生細胞は神経細胞であり得る。別の態様では、該細胞は線維芽細胞であり得る。本明細書で使用するＧＭ１産生細胞は、基礎的にまたは正常細胞と比較して上昇したレベルでＧＭ１を発現する細胞である。
【００１４】
別の実施形態では、本方法は、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型の被験体から収集した非ウシおよび非ブタ線維芽細胞から得られる神経細胞からＧＭ１を単離するステップを含み得る。そのため、ＧＭ１はＢＳＥ汚染物質を含まない。
【００１５】
別の実施形態では、ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製するステップと；前記組織からＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中で前記ＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；前記培養液から前記ＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む本明細書で開示される方法により製造されるＧＭ１ガングリオシド組成物が提供される。そのため、ＧＭ１ガングリオシドはＢＳＥ汚染物質を実質的に含まないまたは含まない。
【００１６】
以下の詳細な説明および実施例を参照することにより、さらなる特徴が理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本明細書に記載の１型培地の低Ｏ２培養液におけるヒツジ海馬細胞の伸長統計を列挙する表である。
【図２】海馬神経前駆細胞の累積集団倍加の線グラフである。
【図３】本明細書に記載の１型培地の低Ｏ２培養液における海馬細胞の全体倍加および収量を列挙する表である。
【図４】本明細書に記載の１型培地の低Ｏ２培養液におけるヒツジ線維芽細胞の伸長統計を列挙する表である。
【図５】ヒツジ線維芽細胞の累積集団倍加の線グラフである。
【図６】肺対硬膜外結合組織の伸長を示す棒グラフである。
【図７】肺対結合組織の線維芽細胞の伸長を列挙する表である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書では、ここで、ＧＭ１の安定かつ再生可能な供給源としての、ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒されたヒツジから得られる細胞またはＧＭ１ガングリオシドーシスのヒト患者から得られる細胞から、ＧＭ１ガングリオシドを精製および抽出する新規な方法が記載される。
【００１９】
本明細書では、組織からＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中でＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；培養液からＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む、ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製することにより、ＧＭ１ガングリオシドを単離する方法が提供される。ＧＭ１産生細胞は神経細胞であり得る。別の態様では、該細胞は線維芽細胞であり得る。本明細書で使用するＧＭ１産生細胞は、正常細胞と比較して上昇したレベルでＧＭ１を発現する過剰産生細胞である。特に、このような細胞は、ガングリオシドーシスに冒されたヒツジおよび／またはヒトから得ることができる。
【００２０】
細胞を単離および調製する組織には、半卵円中心、小脳皮質、海馬、尾状核頭、前頭葉、頭頂皮質、または脳の脳室壁、顆粒細胞下層もしくは脳室裏層領域が含まれる。本方法において、これらの異なる領域から抽出される細胞の任意の組み合わせが、伸長および培養され得る。ＧＭ産生細胞は、表皮組織または肺組織から得られる線維芽細胞であり、ここでＧＭ１産生細胞には、コア脳組織細胞（ｃｏｒｅ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌ）または前駆細胞が含まれる。
【００２１】
さらに、開示される別の態様は、組織の一部を切除するステップと；前記組織を輸送培地中に固定するステップであって、該培地が、高グルコースＤＭＥＭ；４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５〜１０％、１０〜２０％または２０〜３０％ウシ胎児血清、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１Ｘ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン；アンホマイシンおよびゲンタマイシンであり得るステップと；前記細胞の伸長を維持するのに十分な温度で組織を冷蔵するステップとにより、非ウシまたは非ブタ組織を調製する方法である。
【００２２】
一実施形態では、神経細胞は、ＧＭ１ガングリオシドが過剰発現している脳組織から得られるか、またはＧＭ１ガングリオシドーシスに冒された脳から得られる。神経細胞は、正常細胞と比較してＧＭ１の過剰発現につながるＯ−ガラクトシダーゼの欠損を有し得る。本方法で使用する神経細胞は、部分的ａ−ノイラミニダーゼ活性を有し得る。
【００２３】
別の実施形態では、本方法は、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型のヒト被験体から収集した非ウシおよび非ブタ線維芽細胞からＧＭ１を単離するステップを含み得る。そのため、ＧＭ１はＢＳＥ汚染物質を含まない。本明細書で使用するＢＳＥ汚染物質は、任意の生体分子タンパク質、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）またはＰｒＰタンパク質に対する抗体を通して検出され得る任意の生体分子を意味する。典型的には、ＧＭ１の商業的に入手可能な供給源はウシ由来のものであり、考えられる汚染物質を除去するために照射された形態で見られるが、このような供給源の治療上のリスクは残る。このような典型的なＧＭ１供給源にはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈが含まれる。
【００２４】
別の実施形態では、ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製するステップと；前記組織からＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中で前記ＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；前記培養液から前記ＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む本明細書で開示される方法により製造されるＧＭ１ガングリオシド組成物が提供される。そのため、ＧＭ１ガングリオシドはＢＳＥ汚染物質を実質的に含まないまたは含まない。
【００２５】
本発明は、パーキンソン病および他の神経障害の治療で使用するための、商業的に実行可能な量のＧＭ１ガングリオシドを得るための、ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒されたヒツジから得られる細胞またはＧＭ１ガングリオシドーシスのヒトから得られる細胞の使用を含む。ガングリオシドは、単独で、またはＰＤ患者もしくは他の種類の神経変性疾患（それだけに限定されないが、ハンチントン舞踏病等を含む）の患者のための標準的な医療と共に投与され得る。
【００２６】
ＧＭ１は、単独でまたは他のガングリオシドと組み合わせて、中でも皮下もしくは静脈内注射または経鼻もしくは粘膜投与を通して投与され得る。これはまた、持続性作用剤形を含んでもよく、薬物活性を延長するために放出制御製剤（リポソーム、ナノ粒子、マイクロスフェア）を使用してガングリオシドを投与してもよい。血液脳関門を通過するためにガングリオシドを適当な輸送分子と結合させてもよい。
【００２７】
ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒されたヒツジならびにこのような動物の脳からのＧＭ１および他のガングリオシドの抽出は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５５３２１４１号に記載されている。これらの動物の疾患は、Ｏ−ガラクトシダーゼ活性の欠損および部分的ａ−ノイラミニダーゼ活性を特徴とし、その結果として、脳組織中に大量のＧＭ１ガングリオシドが蓄積した（非罹患動物と比較して４０倍までの増加）動物が得られる。最適化された抽出手順を使用すると、単一のガングリオシドーシスヒツジ脳は１〜２ｇのＧＭ１をもたらすと推定される。１ｋｇの罹患脳は約１５ｇのＧＭ１をもたらすとさらに推定される。比較すると、１ｋｇのブタ脳は、２５０ｍｇのＧＭ１をもたらすと推定される。しかしながら、これらの増強された発現レベルでさえ、商業的な量のＧＭ１を得るためには、１年当たり数十万頭のヒツジが必要であろう。
【００２８】
細胞工学を使用して、ＧＭ１ガングリオシドーシスヒツジから得られるいくつかの潜在的な供給源からＧＭ１を得ることができる。例えば、神経前駆細胞を成長および伸長させ、それらをニューロン表現型に駆動し、それらの成長および発達（およびおそらく、それだけに限定されないが、Ｂ系列ガングリオシド産生の阻害（例えば、ＧＤ３合成酵素を阻害することにより）、およびＧＭ１でのＡ系列ガングリオシドの生合成経路の停止、したがってＧＭ１に向かうより多くのガングリオシド産生の短絡を含む種々の操作を使用するＧＭ１産生でさえ）を最適化し、次いで、培養された神経細胞からのＧＭ１ならびに培地中に細胞により排出されたＧＭ１を抽出することができる。ガングリオシド排出を増強し、培養された細胞からのガングリオシドの回収をさらに最適化するためにさらなる変更を行うこともできる。上で概説した一般的スキームの代わりに、またはこれと組み合わせて、線維芽細胞または肝細胞を、ＧＭ１の供給源として培養液中で培養し使用することもできる。
【００２９】
本方法で使用される細胞は、それだけに限定されないが、半卵円中心、小脳皮質、海馬、尾状核、大脳皮質、脳室壁またはこれらの組み合わせを含む脳組織から得ることができる。
【００３０】
ＧＭ１の別の潜在的供給源は、Ｉ型（小児型）ＧＭ１ガングリオシドーシスの患者由来の線維芽細胞（または肝細胞）である。ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型の患者は、細胞内に正常な量の１％未満のガラクトシダーゼを有する傾向があり、したがって、これらの細胞は非常に高レベルのＧＭ１ガングリオシドを産生する傾向がある。正常なヒト線維芽細胞は、タンパク質１ｍｇ当たりＧＭ１約０．７ｎｍｏｌを含有し得る。ＧＭ１ガングリオシドーシス線維芽細胞は、タンパク質１ｍｇ当たりＧＭ１ ２．５８ｎｍｏｌまでを含有し得る。培養されたヒトＧＭ１ガングリオシドーシス線維芽細胞から得られるＧＭ１の量は、最適な細胞成長パラメータ、培養液および栄養条件を使用して、ＧＭ１抽出用の細胞を収集するための最適な時間を決定することにより、最適化されるだろう。さらに、多数のサンプルをＧＭ１Ｉ型患者ドナーからスクリーニングして、患者間で異なるβ−ガラクトシダーゼ欠損の重症度による最適なＧＭ１蓄積を示す細胞系を発見するだろう。さらに、同一患者からの肝細胞を、ＧＭ１の代替または相補細胞供給源として使用することができる。
【００３１】
いったんガングリオシドーシスヒツジからの細胞を有すると、これらの細胞からのＧＭ１収量をさらに増強するいくつかの可能な方法が存在する。一つの方法は、細胞を低濃度のクロロキン、弱塩基で処理するものであり、これはエンドソーム内および細胞表面上のＧＭ１の顕著な蓄積を引き起こすだろう（Ｙｕｙａｍａ等、２００６）。別の方法は、細胞を、全ての主要な脳複合ガングリオシド（例えば、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂおよびＧＴ１ｂ）を完全細胞上のＧＭ１に転換するシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）で処理するものである（Ｓｃｈａｕｅｒ等、１９８０）。別の方法は、主にＧＭ１を得るためにポリシアル化ガングリオ−Ｎ−テトラオース系列ガングリオシドの高選択的脱シアリル化を触媒するＤｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｈ＋を使用する非酵素的方法を使用するものである（ＳｃｈｅｎｇｒｕｎｄおよびＫｏｖａｃ、１９９９）。これらの方法を使用して、増強した量のＧＭ１を細胞および膜から回収すること、ならびに培地中に排出されるおよび培地から回収されるＧＭ１の量を増加させることが可能である。
【００３２】
細胞工学によりＧＭ１ガングリオシドを産生する追加の潜在的手段には、大腸菌にＧＭ１ガングリオシドを産生させるための、多重ゲノム工学および加速させた進化による細胞のプログラミングが含まれ得る。多重自動ゲノム工学（「ＭＡＧＥ」）を使用して、ＧＭ１ガングリオシドを過剰産生するために大腸菌のＧＭ１の生合成経路を操作することができる。例えば、ＧＭ１産生を最適化するおよび他のガングリオシドの産生を阻害するために、特定の関連遺伝子の発現を最適に調整することおよび特定の遺伝子を抑制または省略することにより、多くの遺伝子位置を同時に変更してＧＭ１生合成を修飾することができる。当技術分野で既知の標準的方法を通してガングリオシド遺伝子を大腸菌系中に組み込む当業者に既知の方法により、大腸菌を修飾することができる。例として、標準的方法は、培養液中でＧＭ１を産生するＧＭ１合成酵素を発現するよう修飾されたプラスミドＤＮＡを単離するステップを含む。他のガングリオシド産生遺伝子には、ＧＤ３合成酵素が含まれる。
【００３３】
大腸菌は、必要に応じて、合成ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ、植物源）およびシアル酸（非動物源から入手可能であるか、合成することができる）などの前駆物質が培地中で利用可能である特定の条件下で培養することができる。酵素活性（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ）をＭＡＧＥプロセスにより微調整することができ、活性化因子（トランスフェラーゼ酵素の活性化のためのグアノシン三リン酸）を提供することができ、ならびにＮ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトース（糖供与体として働くために、糖はそのヌクレオチド誘導体に転換される必要がある）を提供することができる。
【００３４】
ＧＭ１は、現在、ウシまたはブタ脳から抽出されており、これは低収率で高価な方法である。本発明は、ＧＭ１ガングリオシドの安全かつ効率的な細胞ベースの産生を提供するだろう。本発明はまた、ヒトＧＭ１ガングリオシドの初めての商業的供給源も提供するだろう。本技術により、ＧＭ１以外の他のガングリオシド種も産生することができ、ＧＭ１および他のガングリオシドは、パーキンソン病などの種々の神経障害における用途を有し得る。
【００３５】
脳ガングリオシドを抽出、分離および精製する典型的な手順が記載され、それは以下を含む：緩衝テトラヒドロフランまたは当技術分野で既知の他の適当な溶媒による脳の徹底的抽出；最初にエチルエーテル、次いで、蒸留水による抽出物の分配；得られた水相の透析、およびシリカゲルカラムによる透析液のクロマトグラフィー。徹底的な抽出後の残渣は、全ての脳糖タンパク質を含有する。手順は、抽出プロセスのクロロホルム法を含む。
実施例
実施例１
【００３６】
以下の組織供給源を含むヒツジ脳組織を入手した：半卵円中心、小脳皮質；海馬、尾状核、大脳皮質（例えば、前頭葉、頭頂部）および脳室壁。
【００３７】
全組織を以下の方法を通して個々に処理した：ＰＩＰＥＳ緩衝液により各組織型を洗浄した；抗生物質／抗真菌剤を含むパパイン／ＤＮアーゼ／ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）の混合物中で各組織を消化し、酵素を中和し、解離細胞をセルストレーナーに通した；細胞を遠心分離し、抗生物質／抗真菌剤を含有する５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２に再懸濁した；細胞を数え上げ、次いでａ．培地型番号１：抗生物質／抗真菌剤を含有する５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２／Ｎ２中フィブロネクチン被覆２フラスコ中に播種した；１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦおよび２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを補充した。Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ａ培地；各培地型中の細胞を、低Ｏ２および比較用の高Ｏ２下で、３７℃加湿インキュベーター中で培養した。
【表１】
【００３８】
上記表１は、種々の成長条件における細胞の増殖および伸長を説明したものである。Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ａで培養した培養液は、あまり成長せず、そのため、Ｐ．０で収集した少数の細胞は凍結し、さらに伸長しなかった。
実施例２
【００３９】
以下の組織供給源を含むヒツジ組織を繊維芽細胞単離のために入手した：肺（左肺および右肺をプールした）、および硬膜外結合組織。
全組織を以下の方法を使用して個々に処理した：ＰＩＰＥＳ緩衝液により各組織型を洗浄した。抗生物質／抗真菌剤を含むＤＭＥＭ中コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）中で各組織を消化し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で酵素を中和し、解離細胞をセルストレーナーに通した。細胞を遠心分離し、抗生物質／抗真菌剤を含有するＦＧＭ−２に再懸濁した。細胞を数え上げ、次いで、フラスコ中に播種し、残りの組織をＦＧＭ−２培地中培養皿中に入れた。細胞を、低Ｏ２圧下でのみ、３７℃加湿インキュベーター中で培養した。
【表２】
実施例３
【００４０】
消化
標本を種々の遠心管に入れ、１〜１０のラベルをつけ、外装箱から取り出し、きれいに拭き、５０ｍＬ試験管立てに入れた。各管の画像を取得した。各管にエタノールを噴霧し、再度きれいに拭き、次いで、無菌処理のために安全キャビネットに移した。各管からの輸送培地を、清潔な１０ｍＬピペットを使用して慎重に吸引し、廃棄物容器中に排出した。過剰（４０ｍＬ）ＰＩＰＥＳ溶液を各管へ移し、蓋を取り替え、管を穏やかに数回前後に反転させて組織から残留輸送媒体を洗い流した。次いで、１０ｍＬピペットを使用してこれを吸引し、廃棄物容器中に排出した。
【００４１】
２０ｍＬの脳消化液を、脳組織を含有する管へ移し、各管に１〜６のラベルをつけた。各数字に対応する脳の領域を後で翻訳するための鍵を作った。２０ｍＬのコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ（１Ｘ）溶液を、他の器官からの組織を含有する管の各々に移した。滅菌２５ｍｌおよび５０ｍｌピペット、滅菌ピンセットおよびメスを使用して、管の各々からの組織を滅菌１０ｃｍ皿に移し、消化液に浸し、非常に小さい断片に分割した。各皿の内容物（組織断片および消化液）を２５ｍＬまたは５０ｍＬピペットで吸い上げ、適当な管へ移し、蓋をし、全て３７℃のインキュベーター中に４５分間置いた。４５分後、管を無菌的にフードへ移し、各々をそれぞれ滅菌２５ｍＬおよび１０ｍＬピペットを使用してすりつぶした。蓋を交換し、管を３７℃インキュベーター中試験管立てに１５分間戻した。インキュベーション後、管を無菌的にフードへ移した。２５ｍＬの中和媒体を１０本の管の各々へ移し、管に蓋をし、各々を数回前後に反転させて混合した。管を２００ｇで１０分間遠心分離して細胞および残りの組織塊をペレットにした。管を無菌的にフードへ移し、いかなる組織断片または細胞も吸い上げられないようにして、各管から上清を慎重に吸引した。脳領域１〜６を含有する管に、４０ｍＬ培地型番号１を入れ、細胞および残りの組織断片を再懸濁した。肺、硬膜外結合組織および骨結合組織を含有する管を、４０ｍＬ ＦＧＭ−２線維芽細胞成長培地に再懸濁した。再懸濁した細胞および組織を含む１０本の管の各々を、ピペットで４０ｕｍセルストレーナーを通し、新しいラベルをつけた５０ｍＬ管へ移した。各管についてカウントおよび生存率調査を行った。
【００４２】
低Ｏ２伸長条件
脳の６つの異なる領域からの細胞を、１０００００個／ｃｍ２で、１５ｍＬの培地型番号１または１５ｍＬの培地型番号２（Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ａ培地）中６つのフィブロネクチン被覆Ｔ８０フラスコに播種し、加湿３７℃インキュベーター中、低酸素圧（４％Ｏ２、５％ＣＯ２および窒素で釣り合わせた）でインキュベートした。２日毎に、培養培地の５０％を新鮮な培地と交換した。培養液は不均一であった。コロニー形成細胞は、初期の頃に存在する細胞の少数であったが、数日後、これらの細胞はコロニー形成および成長を始めた。継代０培養液を９日目に収集した。収量については表１．０を参照されたい。
【００４３】
６つの領域の各々について、第１継代細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、３６ｍｌの培地型番号１および培地型番号２の両方中２つのＴ２２５ｃｍ２フィブロネクチン被覆フラスコに播種した。５日目に培養液に１００％新鮮な培地を与えた。培養液はこの継代中はまだ不均一であったが、有意にきれいになり、この継代の初期でより多くのコロニー形成細胞が存在しており、これらの細胞は前の継代よりも早く成長した。６日目に４ｘ、１００ｘ、２００ｘで画像を取得した。培養液を６日目に収集した。
【００４４】
６つの領域の各々について、第２継代細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、３６ｍｌの培地型番号１および培地型番号２の両方中２つのＴ２２５ｃｍ２フィブロネクチン被覆フラスコに播種した。５日目に培養液に１００％新鮮な培地を与えた。培養液は９０％以上均一であった。培養液を６日目に収集した。次いで、培地型番号２中に維持した全培養液を凍結し、さらには伸長させなかった。培地型番号１中に維持した培養液（すなわち、海馬神経前駆細胞）を第６継代までさらに継代培養した（以下）：
【００４５】
第３継代細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、３６ｍｌの培地型番号１中２つのＴ２２５ｃｍ２フィブロネクチン被覆フラスコに播種した。５日目に培養液に１００％新鮮な培地を与えた。培養液は、この継代中均一であるように見えた。６日目に４ｘ、１００ｘ、２００ｘで画像を取得した。培養液を６日目に収集した。
【００４６】
第４継代細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、３６ｍｌの培地型番号１中２つのＴ２２５ｃｍ２フィブロネクチン被覆フラスコに播種した。５日目に培養液に１００％新鮮な培地を与えた。６日目に４ｘ、１００ｘ、２００ｘで画像を取得した。培養液を６日目に収集した。
【００４７】
線維芽細胞
ヒツジ肺の消化により得られた細胞を１０００００個細胞／ｃｍ２で播種し、硬膜外結合組織から得られた細胞を５００００個細胞／ｃｍ２でＦＧＭ−２培地に播種した。２日毎に培養液に５０％新鮮な培地を与え、第０継代を５日目に収集した。両培養液をより低密度で継代培養し、残りを凍結し保管した。
【００４８】
第１継代硬膜外および肺線維芽細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ中ＦＧＭ−２培地に播種した。５日目に培養液に１００％新鮮なＦＧＭ−２培地を与え、７日目に収集した。肺培養液を継代培養し、残りを凍結し保管した。硬膜外線維芽細胞は全て凍結し保管した。
【００４９】
第２継代肺線維芽細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ中ＦＧＭ−２培地に播種した。非常に重いので４日目に培養液に１００％新鮮なＦＧＭ−２培地を与え、次いで、５日目に収集した。培養液を継代培養し、残りを凍結し保管した。
【００５０】
第３継代肺線維芽細胞を、１００個細胞／ｃｍ２で、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ中ＦＧＭ−２培地に播種した。５日目に培養液に１００％新鮮なＦＧＭ−２培地を与え、６日目に収集した。培養液を継代培養し、残りを凍結し保管した。
【００５１】
高Ｏ２条件（標準法）
６つの領域の各々からの細胞を、１０００００個／ｃｍ２で、５ｍｌの培地型番号１および１３ｍｌの培地型番号２中、４つのＴ２５ｃｍ２および１つのＴ８０ｃｍ２（全てフィブロネクチンで被覆されている）に播種し、加湿３７℃インキュベーター中、１８％Ｏ２、５％ＣＯ２（標準条件）でインキュベートした。５日目に培養液にそれぞれの培地を与え、次いで、２４時間後の６日目に収集した。６日目の収集前に４ｘ、１００ｘ、２００ｘで画像を取得した。全領域からの細胞をカウントし、次いで、凍結し保管した。
【００５２】
輸送培地
死後および輸送中に組織の保管のために使用する培地。成分：高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；２０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１１４０、１００Ｘ溶液、ロット番号６７２５５５）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号、１００Ｘ溶液、ロット番号）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）。
【００５３】
消化液
脳：
高グルコース １：１ ＤＭＥＭ：Ｆ１２：４ｍＭ Ｌ−グルタミン；ディスパーゼ（１Ｕ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９４２０８６００１）；ＤＮアーゼ（２５０Ｕ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８０４７−０１９）；パパイン（２．５Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７６２１８）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号、１００Ｘ溶液）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）；
【００５４】
肺、硬膜外および骨：
高グルコースＤＭＥＭ：４ｍＭ Ｌ−グルタミン；コラゲナーゼ（３００Ｕ／ｍｌ）／ヒアルロニダーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）。
４．培養培地 脳：
【００５５】
ａ．培地型番号１
高グルコース １：１ ＤＭＥＭ：Ｆ１２；４ｍＭ Ｌ−グルタミン；Ｎ２サプリメント（１００Ｘ）液体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）；２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子、ヒト、組換え体（ｒｈ ＥＧＦ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト、組換え体（ｒｈ ｂＦＧＦ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００５６】
ｂ．培地型番号２
Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ ＮＳ−Ａ増殖用培地。Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ ＮＳ−Ａ基礎培地（ヒト）、４５０ｍｌ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ ＮＳ−Ａ増殖サプリメント（ヒト）、５０ｍｌ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ｕｇ／ｍｌ）、アンホマイシン（／ｍｌ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）；２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子、ヒト、組換え体（ｒｈ ＥＧＦ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１０ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト、組換え体（ｒｈ ｂＦＧＦ）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
実施例４
【００５７】
ＧＭ１でパーキンソン病患者を治療する臨床試験において、全機能査定（ベースラインおよびその後の全訪問の間）は、医薬品の投与前（事実上定義される「オフ」期間と考えられる）から、患者が最初に抗パーキンソン医薬品を服用する前および少なくとも１２時間前の午前中に行った。以下の機能的測定にしたがって、ベースライン能力について、３回の別々の機会に（２週間以内）全患者を試験した：（１）一次および二次評価者により独立に評価される、統一パーキンソン病評価尺度（「ＵＰＤＲＳ」）；（２）実行する時間：２０回の手の回内運動／回外運動；２０回のかかと−つま先タップ；２０回の親指−示指タップ；親指を順次他の指に１０回あてる時間；可能な限り速く２０フィート歩き、方向転換し、出発点に戻ってくる時間；単純な反応の時間の評価；（３）患者が体性感覚および固有受容フィードバックにのみ基づいて特定の運動を作り出す必要がある感覚運動統合の試験。この試験は、月に４回のフォローアップ訪問で行った。
【００５８】
各患者についての平均ベースラインスコアを計算し、治療スコアとの比較に使用した。主要な効能測定は、標準的な臨床的評価手段であるＵＰＤＲＳの運動要素における変化とした。ＧＭ１処理群（Ｎ＝２２）は、ＵＰＤＲＳ運動スコアの有意な改善（４週で５．０５ポイントおよび１６週で７．５３ポイントの平均的改善）を示した一方で、プラセボ処理群についての平均スコアは、処理の１６週にわたって本質的に変化しなかった。４週（−５．９５±１．１２）、８週（−５．６１±１．３９）、１２週（−５．３７±１．３０）および１６週（−６．７９±１．２４）の処理効果量は、統計学的に有意であった（ＡＮＣＯＶＡ、ｐ＜０．０００２）。運動機能の二次評価は、両群がベースラインで感覚運動統合課題に対する類似した数のエラーをした一方で（ＧＭ１＝５．３±２．３；プラセボ＝５．４±３．１）、ＧＭ１処理患者は、プラセボ処理患者（５．１エラー±３．１、ｐ＝０．０００１）よりも、処理の１６週後にしたエラーが有意に少なかった（０．７エラー±０．８）。ＧＭ１処理群はまた、プラセボ処理患者よりも、ベースラインと比較して、１６週で有意に速く時限運動課題（すなわち、回内運動／回外運動（ｐ＝０．０００１）、かかと／つま先タッピング（ｐ＝０．０００８）、指タッピング（ｐ＝０．０００１）、連続的指タッピング（ｐ＝０．０００１）および歩行（ｐ＝０．０２））を行った。患者は、５年間のＧＭ１の公開使用の終わりで、事前ランダム化ベースラインにおけるよりも低いＵＰＤＲＳ運動スコアを有し、日常生活の「オフ」期間の活動で報告される問題がより少なかった。
【００５９】
いったんベースライン試験が完了したら、患者は、５０ｍＬ滅菌リンガー液中の１０００ｍｇＧＭ１ガングリオシドまたはプラセボ（すなわち、ＧＭ１を含まない賦形剤）のいずれかの静脈内注入を受けた。患者は、皮下注射を自己投与するよう教えられ、同一の２．０ｍＬバイアル中に提供されたＧＭ１ガングリオシド（２．０ｍｌのビヒクル中１００ｍｇのＧＭ１／バイアル）またはプラセボのいずれかの４週間分を供給されて帰された。患者は、午前中に１回および夕方に１回、１日当たり２本のバイアルの内容物を投与するよう指示された（総一日量＝２００ｍｇ ＧＭ１）。併用医薬品は一定に保った。
【００６０】
本記載は代表的な実施形態を参照してなされているが、本範囲を逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、その要素の代わりに同等物を用いることができることが当業者により理解されよう。さらに、本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または物質をこの教示に適合させるために多くの修正を行うことができる。また、図面および説明において、代表的な実施形態が開示されており、特定の用語が使用されてきたかもしれないが、それらは特に明記しない限り、一般的かつ説明的意味でのみ使用されており、限定を目的とするものではなく、そのため、特許請求の範囲は限定されない。さらに、当業者は、本明細書で論じる方法の特定のステップを代わりの順序で順番付けることができる、またはステップを組み合わせることができることを認識するだろう。そのため、添付の特許請求の範囲は、本明細書で開示する特定の実施形態に限定されないことが意図されている。
【００６１】
この本文中に引用された出願および特許の各々、ならびにその出願および特許の各々に引用された各文書または参考文献（各登録特許の審査中を含む；「出願引用文書」）、ならびに任意のこれらの出願および特許に対応するおよび／またはそれらに基づく優先権を請求するＰＣＴおよび外国の出願または特許の各々、ならびに出願引用文書の各々で引用または参照された文書の各々は、本明細書によって明確にその全内容が参照により本明細書に組み込まれている。より一般的に、文書または参考文献は、特許請求の範囲の前の参考文献一覧またはこの本文自体のいずれかにおいてこの本文に引用され；そして、これらの文書または参考文献（「本明細書中に引用された参考文献」）の各々ならびに本明細書中に引用された参考文献の各々において引用された各文書または参考文献（任意の製造業者の仕様書、説明書等を含む）は、本明細書によって明確に参照により本明細書に組み込まれている。
【００６２】
参考文献
１Ｎｅｅｔａ Ｓ．Ｒｏｙ等。２０００。Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５９：３２１〜３１。
２（Ｐｈｉｌｉｐ Ｈ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ等。２００３。Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；７４：８３８〜５１。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製するステップと；前記組織から前記ＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中で前記ＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；前記培養液から前記ＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む、ＧＭ１ガングリオシドを単離する方法。
【請求項２】
前記ＧＭ１産生細胞が神経細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織が、半卵円中心、小脳皮質、海馬、尾状核頭、前頭葉、頭頂皮質、または脳の脳室壁、顆粒細胞下層もしくは脳室裏層領域、あるいはこれらの任意の組み合わせから調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＭ産生細胞が表皮組織または肺組織から得られる線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＭ１産生細胞がコア脳組織細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＭ１産生細胞が前駆細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
非ウシまたは非ブタ組織を調製するステップが、組織の一部を切除するステップと；前記組織を輸送培地中に固定するステップであって、前記培地が、高グルコースＤＭＥＭ；４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５〜１０％、１０〜２０％または２０〜３０％ウシ胎児血清、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１Ｘ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン；アンホマイシンおよびゲンタマイシンを含むステップと；前記細胞の伸長を維持するのに十分な温度で前記組織を冷蔵するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記神経細胞が、ＧＭ１ガングリオシドが過剰発現している脳組織から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経細胞が、ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒された脳から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経細胞が、Ｏ−ガラクトシダーゼの欠損を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経細胞が、部分的ａ−ノイラミニダーゼ活性を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経細胞が、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型の被験体から収集したヒト線維芽細胞から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＭ１がＢＳＥ汚染物質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製するステップと；前記組織から前記ＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中で前記ＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；前記培養液から前記ＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む方法により製造されるＧＭ１ガングリオシド組成物。
【請求項１６】
前記ＧＭ１がＢＳＥ汚染物質を含まない、請求項１５に記載のＧＭ１ガングリオシド。
【請求項１７】
ＧＭ１ガングリオシドを非ウシおよび非ブタ動物から単離するステップを含む、ＧＭ１ガングリオシドを製造する方法。
【請求項１】
ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製するステップと；前記組織から前記ＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中で前記ＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；前記培養液から前記ＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む、ＧＭ１ガングリオシドを単離する方法。
【請求項２】
前記ＧＭ１産生細胞が神経細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組織が、半卵円中心、小脳皮質、海馬、尾状核頭、前頭葉、頭頂皮質、または脳の脳室壁、顆粒細胞下層もしくは脳室裏層領域、あるいはこれらの任意の組み合わせから調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＭ産生細胞が表皮組織または肺組織から得られる線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＭ１産生細胞がコア脳組織細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＭ１産生細胞が前駆細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
非ウシまたは非ブタ組織を調製するステップが、組織の一部を切除するステップと；前記組織を輸送培地中に固定するステップであって、前記培地が、高グルコースＤＭＥＭ；４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５〜１０％、１０〜２０％または２０〜３０％ウシ胎児血清、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液１Ｘ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン；アンホマイシンおよびゲンタマイシンを含むステップと；前記細胞の伸長を維持するのに十分な温度で前記組織を冷蔵するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記神経細胞が、ＧＭ１ガングリオシドが過剰発現している脳組織から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記神経細胞が、ＧＭ１ガングリオシドーシスに冒された脳から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経細胞が、Ｏ−ガラクトシダーゼの欠損を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記神経細胞が、部分的ａ−ノイラミニダーゼ活性を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経細胞が、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ型の被験体から収集したヒト線維芽細胞から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＭ１がＢＳＥ汚染物質を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＭ１産生細胞を含む非ウシおよび非ブタ組織を調製するステップと；前記組織から前記ＧＭ１ガングリオシド産生細胞を単離するステップと；前記細胞の伸長を促進する適当な条件下、培養液中で前記ＧＭ１産生細胞を伸長させるステップと；適当な条件下、培養液中でＧＭ１ガングリオシド発現を発現させるステップと；前記培養液から前記ＧＭ１ガングリオシドを単離するステップとを含む方法により製造されるＧＭ１ガングリオシド組成物。
【請求項１６】
前記ＧＭ１がＢＳＥ汚染物質を含まない、請求項１５に記載のＧＭ１ガングリオシド。
【請求項１７】
ＧＭ１ガングリオシドを非ウシおよび非ブタ動物から単離するステップを含む、ＧＭ１ガングリオシドを製造する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０３６３５（Ｐ２０１３−５０３６３５Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２８００８（Ｐ２０１２−５２８００８）
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７５２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８７９５
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５１２０５１４３５）エルゼット セラピューティクス，インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７５２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８７９５
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５１２０５１４３５）エルゼット セラピューティクス，インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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