キナーゼ活性を測定するための方法
本発明は、特異的キナーゼの活性を検出および/または測定するための方法に関し、この方法は、1つ以上のキナーゼを結合剤と接触させて、目的の特異的キナーゼを単離する工程を含む。次いで、この単離されたキナーゼを、キナーゼ活性センサと接触させる。ここで、キナーゼ活性センサは、単離されたキナーゼが認識することができるキナーゼ認識モチーフ、および少なくとも1つのリン酸化部位を含む。単離されたキナーゼは、上記キナーゼ活性センサのアミノ酸標的をリン酸化して、リン酸化された標的アミノ酸のレベルを定量することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本願は、2006年1月18日出願の米国仮出願第60/759,919号および2006年7月7日出願の米国仮出願第60/819,432号への優先権を主張する。これらの仮出願の内容は、あたかもそれらが本明細書中にすべて示されたかのように、参考として援用する。
【0002】
発明の分野
本発明は、興味ある特異的キナーゼの活性を検出および/または測定するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
プロテインキナーゼは、多くの異なる疾患の形成において役割を果たしていると信じられている。それゆえ、新しい薬物候補および治療プロトコルが、プロテインキナーゼ活性およびその活性に影響を及ぼす分子を理解して同定するための方法を使用して、同定されている。
【0004】
プロテインキナーゼは、アデノシン三リン酸(ATP)から、ペプチドまたはたんぱく質配列中のセリン、トレオニンまたはチロシン残基へのリン酸基の移動を触媒する。プロテインキナーゼは、細胞内の調節のすべての局面に関与する。キナーゼ活性をアッセイするための従来の方法は、不連続的であり、32Pで標識されたATPを必要とし、これは特別の取り扱いを必要とする。多くの会社が特別の蛍光キナーゼアッセイシステムを市販しているが、これらのすべてが不連続的であり、反応混合物のサンプリング、およびその後の、反応の生成物を蛍光部分で標識するための付加的な取り扱い段階を必要とする(例えば、Promega, Panvera,Calbiochem, Cell Signaling Technology,Molecular Devices,DiscoveRx,Upstate,PerkinElmer)。リアルタイムで実施することができる連続的な蛍光アッセイが非常に有用である。現在、このようなアッセイを可能にするセンサの例は、ほとんど存在しない。
【0005】
本明細書中に参考として援用する米国特許第6,906,104号(特許文献1)は、溶液中においてフリーのキナーゼの検出のためのスルホンアミド置換キノリン化合物(「SOX」が挙げられる)を記載する。Lawrenceらの論文は、生体細胞中のプロテインキナーゼ活性のリアルタイムの可視化を記載する(Journal of Biological Chemistry 277巻、第13号、3月29日発行、11527-11532頁, 2002(非特許文献1))。
【0006】
リアルタイムでキナーゼの活性を測定するための1つの方法は、キナーゼ認識モチーフ、すなわち特定のキナーゼが認識してリン酸化するアミノ酸配列を使用してキナーゼを捕捉することである。いったん捕捉されると、ATPがこのアッセイに添加され、次いでシグナル伝達部分がリン酸化事象の際に信号を発生させるかまたは変化させることができる。一般に、各キナーゼは、特定のキナーゼ認識モチーフについて特異的であってもよいが、キナーゼ中の標的アミノ酸の周囲にあるキナーゼ認識モチーフのアミノ酸配列には、いくつかの配列の類似性が存在する。従って、キナーゼ認識モチーフを使用して特定のキナーゼを捕捉すると、すべてが同一または類似のキナーゼ認識モチーフを認識する異なるキナーゼの集団を捕捉することになりかねない。これらのアッセイの結果は、特異的キナーゼの活性を同定および/または測定しようとするときは、偽陽性の結果を生む傾向がある。それゆえに、偽陽性の発生を低減するためにキナーゼ活性アッセイの特異性を改善し、キナーゼ活性を評価するアッセイ結果に価値を与えることが必要である。現在、特異的キナーゼを捕捉する際のキナーゼ認識モチーフの乱雑さにより引き起こされるこの問題を克服する方法は文献には存在しない。
【0007】
【特許文献1】米国特許第6,906,104号
【非特許文献1】Lawrenceら、Journal of Biological Chemistry 277巻、第13号、3月29日発行、11527-11532頁, 2002
【発明の開示】
【0008】
発明の概要
本発明は、特異的キナーゼの活性を検出および/または測定するための方法であって、1つ以上のキナーゼを結合剤と接触させて、目的の特異的キナーゼを単離する工程を含む方法に関する。次いで、この単離されしたキナーゼを、キナーゼ活性センサと接触させる。ここで、このキナーゼ活性センサは、単離されたキナーゼが認識することができるキナーゼ認識モチーフ、および少なくとも1つのリン酸化部位を含むからなる。単離したキナーゼが存在する場合には、その単離したキナーゼは、上記キナーゼ活性センサのアミノ酸標的をリン酸化し、次いでリン酸化されたアミノ酸標的のレベルを定量することができる。
【0009】
本発明の1つの局面は、特異的キナーゼの活性を測定する方法であって、下記の工程を含む方法を提供する:
固定化結合剤を含む固体または半固体支持体を提供する工程;
固定化された結合剤を、特異的キナーゼを含む試料と接触させて、固定化した特異的キナーゼを形成する工程;
固定化した特異的キナーゼをキナーゼ活性センサと接触させ、接触した特異的キナーゼを形成する工程であって、該キナーゼ活性センサが、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドおよびキレート剤を含む、工程;
接触した特異的キナーゼを、該キナーゼがリン酸供給源および金属イオンの存在下で該ペプチドをリン酸化するのに十分な時間、インキュベーションする工程であって、該キナーゼ活性センサが、該金属イオンおよびリン酸化ペプチドと三元複合体を形成して、検出可能なシグナルを発生させる、工程;ならびに
該シグナルを検出して、それによりこの特異的キナーゼの活性を測定する工程。
【0010】
より特定の態様では、上記結合剤は、抗体またはその機能的断片を含む。
【0011】
別の態様では、上記支持体は、ガラス、プラスチック、金属、ポリマー粒子、ポリマーゲル、またはポリマー膜である。
【0012】
別の態様では、上記キナーゼ活性センサは、上記金属イオンと複合体を形成したときには、増強された蛍光シグナルを有する。別の態様では、上記キナーゼ活性センサは、さらに上記キレート剤から離れたシグナル伝達部分を含む。さらにより特定すると、上記シグナル伝達部分は、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセンまたはキサンテンを含む。
【0013】
別の態様では、上記キレート剤は、シグナル伝達部分を含む。さらにより特定すると、上記シグナル伝達部分は、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセンまたはキサンテンを含む。別の態様では、上記キレート剤は、キノリンまたはその誘導体、フェナントロリンまたはその誘導体、BAPTA、IDA、DTPAおよびその誘導体を含む。
【0014】
別の態様では、上記金属イオンは、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ga3+、Tb3+、La3+、Pb2+、Hg2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、またはSr2+である。
【0015】
別の態様では、上記ペプチドは、リン酸化されたときにマグネシウムと錯体を形成するアミノ酸を含む。
【0016】
別の態様では、上記方法は、上記固定化された特異的キナーゼをATPと接触させる工程をさらに含む。
【0017】
別のより特定の態様では、上記キナーゼ活性センサは、下記式を含む:
式中、少なくとも1つのR基は-SO2Xであり、Xは-OR''または-NR''R'''であり;
R'はヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり;
R''はC1-6アルキルであり;
R'''は水素またはアルキルであり;かつ
nは1,2、または3である。
【0018】
あるいは、上記キナーゼ活性センサは、下記式を有するかまたはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
式中、R1は、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R2は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R3は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R4は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R5は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R6は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R7は、水素、アルキル、置換アルキル、カルボニル、または保護基であり;
R8は、水素、アルキル、置換アルキル、カルボニル、または保護基であり;
Lはリンカーであり;かつ
Yは、ペプチドである。
【0019】
より特定すれば、R2、R3、R4、R5およびR6のうちの少なくとも1つはフルオロフォアである。
【0020】
別の態様では、上記ペプチドは、SEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 133のうちの少なくとも1つである。
【0021】
本発明の別の局面は、上記ペプチドは、SEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 133のうちの少なくとも1つを含む組成物を提供する。
【0022】
本発明の別の局面は、
(a)結合剤により固定化したキナーゼ、および
(b)リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドとキレート剤とを含むキナーゼ活性センサ
を含む組成物を提供する。
【0023】
本発明の別の局面は、特異的キナーゼに結合する結合剤とキナーゼ活性センサとを含む、特異的キナーゼの活性を検出するためのキットであって、該キナーゼ活性センサが、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドおよびキレート剤を含むキットを提供する。より特定すれば、上記キットは、さらに、ATPおよび上記キレート剤およびリン酸化ペプチドの両方に対して親和性を有する金属イオンを含む。
【0024】
本発明の他の対象、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、それらは例示としてのみ提示されていることを理解すべきである。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から、当業者には明らかだからである。
【0025】
発明の詳細な説明
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が具体的な組成物またはプロセス工程に限定されないことを理解すべきである。なぜなら、このようなものは変更されてもよいからである。本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用する場合、文脈が明らかにそうではないと示していないかぎり、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は複数形の指示対象を含んでいることに留意しなくてはならない。従って、例えば、「1つのペプチド」と言うときは複数のペプチドを含み、「1つの酵素」と言うときは複数の酵素を含む、などである。
【0026】
別段の定義がされない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。以下の用語を、本明細書中で記載される場合の本発明の目的のために定義する。
【0027】
「アルキル」は、1〜10個の炭素原子、好ましくは1〜6個の炭素原子を有する1価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基である。この用語は、例として、メチル(CH3-)、エチル(CH3CH2-)、n-プロピル(CH3CH2CH2-)、イソプロピル((CH3)2CH-)、n-ブチル(CH3CH2CH2CH2-)、イソブチル((CH3)2CHCH2-)、sec-ブチル((CH3)(CH3CH2)CH-)、t-ブチル((CH3)3C-)、n-ペンチル(CH3CH2CH2CH2CH2-)およびネオペンチル((CH3)3CCH2-)のような直鎖状および分枝状ヒドロカルビル基を含む。
【0028】
「置換アルキル」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個の置換基を有するアルキル基をいい、この置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されている。
【0029】
「アルコキシ」とは、-O-アルキル基をいい、ここでアルキル基は本明細書中に定義されている。アルコキシとしては、例として、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、t-ブトキシ、sec-ブトキシ、およびn-ペントキシが挙げられる。
【0030】
「置換アルコキシ」とは、-O-(置換アルキル)をいい、ここで置換アルキルは本明細書中に定義されている。
【0031】
「アシル」とは、H-C(O)-、アルキル-C(O)-、置換アルキル-C(O)-、アルケニル-C(O)-、置換アルケニル-C(O)-、アルキニル-C(O)-、置換アルキニル-C(O)-、シクロアルキル-C(O)-、置換シクロアルキル-C(O)-、シクロアルケニル-C(O)-、置換シクロアルケニル-C(O)-、アリール-C(O)-、置換アリール-C(O)-、ヘテロアリール-C(O)-、置換ヘテロアリール-C(O)-、複素環式-C(O)-、および置換複素環式-C(O)-の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書中で定義されているとおりである。アシルとしては、「アセチル」基CH3C(O)-が挙げられる。
【0032】
「アシルアミノ」とは、-NRC(O)アルキル、-NRC(O)置換アルキル、-NRC(O)シクロアルキル、-NRC(O)置換シクロアルキル、-NRC(O)シクロアルケニル、-NRC(O)置換シクロアルケニル、-NRC(O)アルケニル、-NRC(O)置換アルケニル、-NRC(O)アルキニル、-NRC(O)置換アルキニル、-NRC(O)アリール、-NRC(O)置換アリール、-NRC(O)ヘテロアリール、-NRC(O)置換ヘテロアリール、-NRC(O)複素環式、および-NRC(O)置換複素環式の基をいい、ここでRは水素またはアルキルであり、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中で定義されるとおりである。
【0033】
「アシルオキシ」とは、アルキル-C(O)O-、置換アルキル-C(O)O-、アルケニル-C(O)O-、置換アルケニル-C(O)O-、アルキニル-C(O)O-、置換アルキニル-C(O)O-、アリール-C(O)O-、置換アリール-C(O)O-、シクロアルキル-C(O)O-、置換シクロアルキル-C(O)O-、シクロアルケニル-C(O)O-、置換シクロアルケニル-C(O)O-、ヘテロアリール-C(O)O-、置換ヘテロアリール-C(O)O-、複素環式-C(O)O-、および置換複素環式-C(O)O-の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0034】
「アミノ」とは、-NH2基をいう。
【0035】
「置換アミノ」とは、-NR'R''基をいい、ここでR'およびR''は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、置換複素環式、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アルケニル、-SO2-置換アルケニル、-SO2-シクロアルキル、-SO2-置換シクロアルキル、-SO2-シクロアルケニル、-SO2-置換シクロアルケニル、-SO2-アリール、-SO2-置換アリール、-SO2-ヘテロアリール、-SO2-置換ヘテロアリール、-SO2-複素環式、および-SO2-置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR'およびR''が両方とも水素でない場合には、R'およびR''は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。R'が水素であり、R''がアルキルである場合、この置換アミノ基は、本明細書中でアルキルアミノと呼ばれることがある。R'およびR''がアルキルである場合、この置換アミノ基は、本明細書中でジアルキルアミノと呼ばれることがある。一置換アミノと呼ぶときは、R'またはR''のいずれかは水素であるが、両方が水素ではないことを意味する。二置換アミノと呼ぶときは、R'もR''も水素ではないことを意味する。
【0036】
「アミノカルボニル」とは、-C(O)N R10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0037】
「アミノチオカルボニル」とは、-C(S)NR10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0038】
「アミノカルボニルアミノ」とは、-NRC(O)NR10R11基をいい、ここでRは水素またはアルキルであり、R10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0039】
「アミノチオカルボニルアミノ」とは、-NRC(S)NR10R11基をいい、ここでRは水素またはアルキルであり、R10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0040】
「アミノカルボニルオキシ」とは、-O-C(O)NR10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0041】
「アミノスルホニル」とは、-SO2NR10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0042】
「アミノスルホニルオキシ」とは、-O-SO2NR10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0043】
「アミノスルホニルアミノ」とは、-NR-SO2NR10R11基をいい、ここでRは水素またはアルキルであり、R10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0044】
「アミジノ」とは、-C(=NR12)R10R11基をいい、ここでR10、R11およびR12は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0045】
「アリール」または「Ar」とは、1個の環(例えば、フェニル)または多数個の縮合環(例えば、ナフチルまたはアントリル)を有する、6〜14個の炭素原子を有する1価の芳香族炭素環式基をいい、この縮合環は、結合点が芳香族炭素原子上にあれば、芳香族であってもなくてもよい(例えば、2-ベンゾオキザゾリノン、2H-1,4-ベンソオキサジン-3(4H)-オン-7-イルなど)。好ましいアリール基としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【0046】
「置換アリール」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個の置換基で置換されたアリール基をいい、この置換基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されている。
【0047】
「アリールオキシ」とは、-O-アリール基をいい、ここでアリールは、本明細書中で定義されるとおりであり、このアリールオキシとしては、例としてフェノキシおよびナフトキシが挙げられる。
【0048】
「置換アリールオキシ」とは、-O-(置換アリール)基をいい、ここで置換アリールは本明細書中で定義されるとおりである。
【0049】
「アリールチオ」とは、-S-アリール基をいい、ここでアリールは本明細書中で定義されるとおりである。
【0050】
「置換アリールチオ」とは、-S-(置換アリール)基をいい、置換アリールは本明細書中で定義されている。
【0051】
「アルケニル」とは、2〜6個の炭素原子、好ましくは2〜4個の炭素原子を有し、かつ少なくとも1つ、好ましくは1〜2つのアルケニル不飽和部位を有するアルケニル基をいう。このような基としては、例えば、ビニル、アリル、およびブト-3-エン-1-イルが挙げられる。
【0052】
「置換アルケニル」とは、1〜3個の置換基、好ましくは1〜2個の置換基を有するアルケニル基をいい、この置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されているが、ただし、どのヒドロキシ置換基もビニル(不飽和)炭素原子に結合していない。
【0053】
「アルキニル」とは、2〜6個の炭素原子、好ましくは2〜3個の炭素原子を有し、かつ少なくとも1つ、好ましくは1〜2つのアルキニル不飽和部位を有するアルキニル基をいう。
【0054】
「置換アルキニル」とは、1〜3個の置換基、好ましくは1〜2個の置換基を有するアルキニル基をいい、この置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されているが、ただし、どのヒドロキシ置換基もアセチレン炭素原子に結合していない。
【0055】
「カルボニル」とは、2価の-C(O)-基をいい、これは-C(=O)-と等価である。
【0056】
「カルボキシル」または「カルボキシ」とは、-COOHまたはその塩をいう。
【0057】
「カルボキルエステル」または「カルボキシエステル」とは、-C(O)O-アルキル、-C(O)O-置換アルキル、-C(O)O-アルケニル、-C(O)O-置換アルケニル、-C(O)O-アルキニル、-C(O)O-置換アルキニル、-C(O)O-アリール、-C(O)O-置換アリール、-C(O)O-シクロアルキル、-C(O)O-置換シクロアルキル、-C(O)O-シクロアルケニル、-C(O)O-置換シクロアルケニル、-C(O)O-ヘテロアリール、-C(O)O-置換ヘテロアリール、-C(O)O-複素環式、および-C(O)O-置換複素環式の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書中で定義されているとおりである。
【0058】
「(カルボキシエステル)アミノ」とは、-NR-C(O)O-アルキル、置換-NR-C(O)O-アルキル、-NR-C(O)O-アルケニル、-NR-C(O)O-置換アルケニル、-NR-C(O)O-アルキニル、-NR-C(O)O-置換アルキニル、-NR-C(O)O-アリール、-NR-C(O)O-置換アリール、-NR-C(O)O-シクロアルキル、-NR-C(O)O-置換シクロアルキル、-NR-C(O)O-シクロアルケニル、-NR-C(O)O-置換シクロアルケニル、-NR-C(O)O-ヘテロアリール、-NR-C(O)O-置換ヘテロアリール、-NR-C(O)O-複素環式、および-NR-C(O)O-置換複素環式の基をいい、ここでRはアルキルまたは水素であり、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書中で定義されているとおりである。
【0059】
「(カルボキシエステル)オキシ」とは、-O-C(O)O-アルキル、置換-O-C(O)O-アルキル、-O-C(O)O-アルケニル、-O-C(O)O-置換アルケニル、-O-C(O)O-アルキニル、-O-C(O)O-置換アルキニル、-O-C(O)O-アリール、-O-C(O)O-置換アリール、-O-C(O)O-シクロアルキル、-O-C(O)O-置換シクロアルキル、-O-C(O)O-シクロアルケニル、-O-C(O)O-置換シクロアルケニル、-O-C(O)O-ヘテロアリール、-O-C(O)O-置換ヘテロアリール、-O-C(O)O-複素環式、および-O-C(O)O-置換複素環式の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書中で定義されているとおりである。
【0060】
「シアノ」とは、-CN基をいう。
【0061】
「シクロアルキル」とは、1つまたは複数個の環式環(縮合環系、架橋環系、およびスピロ環系が挙げられる)を有する、3〜10個の炭素原子の環状アルキル基をいう。適切なシクロアルキル基の例としては、例えば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【0062】
「シクロアルケニル」とは、1つまたは複数個の環式環を有し、かつ少なくとも1つの>C=C<環不飽和、好ましくは1〜2つの>C=C<環不飽和部位を有する、3〜10個の炭素原子の非芳香族環状アルキル基をいう。
【0063】
「置換シクロアルキル」および「置換シクロアルケニル」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個の置換基を有するシクロアルキル基またはシクロアルケニル基をいい、この置換基は、オキソ、チオン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されている。
【0064】
「シクロアルキルオキシ」とは、-O-シクロアルキルをいう。
【0065】
「置換シクロアルキルオキシ」とは、-O-(置換シクロアルキル)をいう。
【0066】
「シクロアルキルチオ」とは、-S-シクルアルキルをいう。
【0067】
「置換シクロアルキルチオ」とは、-S-(置換シクロアルキル)をいう。
【0068】
「シクロアルケニルオキシ」とは、-O-シクロアルケニルをいう。
【0069】
「置換シクロアルケニルオキシ」とは、-O-(置換シクロアルケニル)をいう。
【0070】
「シクロアルケニルチオ」とは、-S-シクロアルケニルをいう。
【0071】
「置換シクロアルケニルチオ」とは、-S-(置換シクロアルケニル)をいう。
【0072】
「FMOC」とは、下記の一般式を有する化合物(またはその誘導体)をいう。
【0073】
「グアニジノ」とは、-NHC(=NH)NH2基をいう。
【0074】
「置換グアニジノ」とは-NR13C(=NR13)N(R13)2をいい、ここで各R13は、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここで共通のグアニジノ窒素原子に結合した2つのR13基は、少なくとも1つのR13が水素ではない場合は、必要に応じてそれらに結合する窒素と一緒に連結し、複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、ここで上記置換基は本明細書中に定義されるとおりである。
【0075】
「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードをいう。
【0076】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」とは、-OH基をいう。
【0077】
「ヘテロアリール」とは、環内に1〜10個の炭素原子および1〜4個のヘテロ原子を有する芳香族基をいい、このへテロ原子は、環内の酸素、窒素および硫黄からなる群より選択される。このようなヘテロアリール基は1つの環(例えば、ピリジニルまたはフラニル)または多数個の縮合環(例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル)を有することができ、ここで結合点がこの芳香族ヘテロアリール基の原子を通っているかぎり、この縮合環は芳香族であってもなくてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもいなくてもよい。1つの態様では、このヘテロアリール基の窒素および/または硫黄環原子(複数個であってもよい)は、必要に応じて酸化されてN-オキシド(N→O)、スルフィニル、またはスルホニル部分となっていてもよい。好ましいヘテロアリールとしては、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、およびフラニルが挙げられる。
【0078】
「置換ヘテロアリール」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個の置換基で置換されているヘテロアリール基をいい、この置換基は置換アリールについて定義した置換基と同一の群からなる群より選択される。
【0079】
「ヘテロアリールオキシ」とは、-O-ヘテロアリール基をいう。
【0080】
「置換ヘテロアリールオキシ」とは、-O-(置換ヘテロアリール)基をいう。
【0081】
「ヘテロアリールチオ」とは、-S-ヘテロアリール基をいう。
【0082】
「置換ヘテロアリールチオ」とは、-S-(置換ヘテロアリール)基をいう。
【0083】
「複素環」もしくは「複素環式」または「ヘテロシクロアルキル」もしくは「ヘテロシクリル」とは、環内に1〜10個の炭素原子および1〜4個のヘテロ原子を有する、1つまたは複数個の環式環を有する、飽和または不飽和の基をいい、ここでこのヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄からなる群より選択され、この環式環としては縮合環系、架橋環系、およびスピロ環系が挙げられ、この縮合環系では、1つ以上のその環は、結合点がその非芳香環を通っているかぎり、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであってもよい。1つの態様では、このヘテロアリール基の窒素および/または硫黄原子(複数個であってもよい)は、必要に応じて酸化されてN-オキシド、スルフィニル、またはスルホニル部分となっていてもよい。
【0084】
「置換複素環式」または「置換ヘテロシクロアルキル」または「置換ヘテロシクリル」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個の、置換シクロアルキルについて定義したのと同じ置換基で置換されたヘテロシクリル基をいう。
【0085】
「ヘテロシクリルオキシ」とは、-O-ヘテロシクリル基をいう。
【0086】
「置換ヘテロシクリルオキシ」とは、-O-(置換ヘテロシクリル)基をいう。
【0087】
「ヘテロシクリルチオ」とは、-S-ヘテロシクリル基をいう。
【0088】
「置換ヘテロシクリルチオ」とは、-S-(置換ヘテロシクリル)基をいう。
【0089】
複素環およびヘテロアリールの例としては、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミタゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン、4,5,6,7-テトラヒドロベンゾ[b]チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ[b]チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル(チアモルホリニルとも呼ばれる)、1,1-ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、およびテトラヒドロフラニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0090】
「ニトロ」とは、-NO2基をいう。
【0091】
「オキソ」とは、原子(=O)または(-O-)をいう。
【0092】
「スピロシクリル」とは、スピロ連結(それらの環の唯一共通のメンバーである1つの原子により形成される連結)を伴うシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環を有する、3〜10個の2価の飽和環状基をいい、その例としては以下の構造が挙げられる。
【0093】
「スルホニル」とは、2価の-S(O)2-基をいう。
【0094】
「置換スルホニル」とは、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アルケニル、-SO2-置換アルケニル、-SO2-シクロアルキル、-SO2-置換シクロアルキル、-SO2-シクロアルケニル、-SO2-置換シクロアルケニル、-SO2-アリール、-SO2-置換アリール、-SO2-ヘテロアリール、-SO2-置換ヘテロアリール、-SO2-複素環式、-SO2-置換複素環式の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。置換スルホニルとしては、メチル-SO2-、フェニル-SO2-および4-メチルフェニル-SO2-のような基が挙げられる。
【0095】
「スルホニルオキシ」とは、-OSO2-アルキル、-OSO2-置換アルキル、-OSO2-アルケニル、-OSO2-置換アルケニル、-OSO2-シクロアルキル、-OSO2-置換シクロアルキル、-OSO2-シクロアルケニル、-OSO2-置換シクロアルケニル、-OSO2-アリール、-OSO2-置換アリール、-OSO2-ヘテロアリール、-OSO2-置換ヘテロアリール、-OSO2-複素環式、-OSO2-置換複素環式の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0096】
「チオアシル」とは、H-C(S)-、アルキル-C(S)-、置換アルキル-C(S)-、アルケニル-C(S)-、置換アルケニル-C(S)-、アルキニル-C(S)-、置換アルキニル-C(S)-、シクロアルキル-C(S)-、置換シクロアルキル-C(S)-、シクロアルケニル-C(S)-、置換シクロアルケニル-C(S)-、アリール-C(S)-、置換アリール-C(S)-、ヘテロアリール-C(S)-、置換ヘテロアリール-C(S)-、複素環式-C(S)-、および置換複素環式-C(S)-の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0097】
「チオール」とは、-SH基をいう。
【0098】
「チオカルボニル」とは、2価の-C(S)-基をいい、これは-C(=S)-と等価である。
【0099】
「チオン」とは、原子(=S)をいう。
【0100】
「アルキルチオ」とは、-S-アルキル基をいい、ここでアルキルは、本明細書中に定義されるとおりである。
【0101】
「置換アルキルチオ」とは、-S-(置換アルキル)基をいい、ここで置換アルキルは本明細書中に定義されるとおりである。
【0102】
ヒドロキシ基、アミン基、およびスルフヒドリル基に関する、用語「保護された」または「保護基」とは、Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, T.W., Solon Wiley & Sons, New York, NY, (第1版,1981)に示される保護基のような、当業者に公知の保護基を用いて望ましくない反応から保護されたこれらの官能性の形態をいう。これらの保護基は、その刊行物中に示された手順を使用して付加または除去することができる。保護されたヒドロキシル基の例としては、ヒドロキシル基とt-ブチルメチル-クロロシラン、トリメチルクロロシラン、トリイソプロピルクロロシラン、トリエチルクロロシランのような反応剤(これらに限定されない)との反応により得られるもののようなシリルエーテル;メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、t-ブトキシメチルエーテル、2-メトキシエトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、1-エトキシエチルエーテル、アリルエーテル、ベンジルエーテルのような置換メチルエーテルおよびエチルエーテル(これらに限定されない);ベンゾイルホルメート、ホルメート、アセテート、トリクロロアセテート、およびトリフルオロアセテートのようなエステル(これらに限定されない)が挙げられるが、これらに限定されない。保護されたアミン基の例としては、ベンジルもしくはジベンジル、アミド(例えば、ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、およびベンズアミド)、イミド(例えば、フタルイミド、BOC(tBoc)、FMOCおよびジチオスクシンイミド)などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、アミンについての保護基は、FMOC基である。保護されたスルフヒドリルの例としては、S-ベンジルチオエーテルおよびS-4-ピコリルチオエーテルのようなチオエーテル、ヘミチオアセタール、ジチオアセタールおよびアミノチオアセタールのような置換S-メチル誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0103】
「立体異性体(単数または複数)」とは、1つ以上の立体中心のキラリテイが異なる化合物をいう。立体異性体としては、エナンチオマーおよびジアステレオマーが挙げられる。
【0104】
「互変異性体」とは、プロトンの位置が異なる化合物の互変の形態をいい、例えばエノール-ケトおよびイミン-エナミン互変異性体、または環の-NH-部分と環の=N-部分の両方に結合した環原子を含むヘテロアリール基(例えば、ピラゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾールおよびテトラゾール)の互変異性形態をいう。
【0105】
本明細書中で使用する場合の用語「親和性」とは、2つの分子、例えば金属キレート化合物および金属イオンの結合性相互作用の強さをいう。
【0106】
本明細書中で使用する場合の用語「検出可能な応答」とは、観察によるかまたは計測によるかのいずれかによって直接または間接に検出可能なシグナルの発生または変化をいう。代表的には、この検出可能な応答は、波長分布パターン、または吸光度もしくは蛍光の強度の変化、あるいは光散乱、蛍光寿命、蛍光偏光の変化、あるいはこれらのパラメータの組合せをもたらす光学的応答である。あるいは、この検出可能な応答は、上記色素が生来的に蛍光性であり、金属イオンもしくはリン酸化された標的分子との結合の際にシグナルの変化を生じない場合には、シグナルの発生である。あるいは、この検出可能な応答は、シグナル(例えば、リン酸化された標的分子を含む本発明の三元複合体の形成の結果として、試料の一部分(ゲル中、ブロット上、もしくはアレイ、マイクロプレートのウェル中、微小流体チャンバー中、もしくは微小粒子上)に空間的に局在するようになる検出可能な標識の、色、蛍光、放射活性、もしくは別の物理的特性)の結果である。
【0107】
本明細書中で使用する場合の用語「酵素」とは、生命体により、または天然タンパク質分子の化学変性を通して生成されるタンパク質分子であって、反応の完了時にそれ自身が破壊されたり変化したりすることなく他の物質の化学反応を触媒するものをいう。他の物質の例としては、化学発光性物質、発色性物質、蛍光発生物質またはタンパク質ベースの基質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0108】
「キナーゼ」は、基質をリン酸化することができる酵素である。本明細書中に記載する方法および成分が非常に豊富なおかげで、本発明は、すべてのキナーゼに由来する活性の検出において用途を見出すことができる。本発明での使用のために好ましいキナーゼとしては、LCK、IRK(=INSR=イスリン受容体)、IGF-1受容体、SYK、ZAP-70、IRAK1、BLK、BMX、BTK、FRK、FGR、FYN、HCK、ITK、LYN、TEC、TXK、YES、ABL、SRC、EGF-R(=ErbB-1)、ErbB-2(=NEU=HER2)、ErbB-4、FAK、FGF1R(=FGR-1)、FGF2R(=FGR-2)、IKK-1(=IKK-α=CHUK)、IKK-2 (=IKK-β)、MET(=c-MET)、NIK、PDGF受容体α、PDGF受容体β、TIE1、TIE2(=TEK)、VEGFR1 (=FLT-1)、VEGFR2(=KDR)、FLT-3、FLT-4、KIT、CSK、JAK1、JAK2、JAK3、TYK2、RIP、RIP-2、LOK、TAKI、RET、ALK、MLK3、COT、TRKA、PYK2、アクチビン様キナーゼ(Alkl-7)、EPHA(1-8)、EPHB(1-6)、RON、GSK3(AおよびB)、Ilk、PDK1、SGK、Fes、Fer、MatK、Ark(1-3)、Plk(1-3)、LimK(1および2)、RhoK、Pak(1-3)、Raf(A、B、およびC)、PknB、CDK(1-10)、Chk(1および2)、CamK(I-IV)、CamKK、CK1、CK2、PKR、Jnk(1-3)、EPHB4、UL13、ORF47、ATM、PKA(α、β、およびγ)、P38(α、β、およびγ)、Erk(1-3)、PKB(すべてのPKBサブタイプを含む)(=AKT-1、AKT-2、AKT-3)ならびにPKC(すべてのPKCサブタイプを含む)ならびにこれらのキナーゼのすべてのサブタイプが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましいキナーゼは、チロシンおよび/またはセリン/トレオニンキナーゼである。
【0109】
用語「キナーゼ活性センサ」とは、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチド基質、キレート剤および検出部分を含む化合物または組成物をいい、ここでこの検出部分は、それ自身でキレート剤であるか、または付加的な検出部分(例えば、フルオロフォア)を含んでいる。本発明の好ましいキナーゼ活性センサは、以下の式を有する:
ここで、これら可変要素は、本明細書中に記載されるとおりである。
【0110】
本明細書中で使用する場合の用語「フルオロフォア」とは、生来的に蛍光性であるか、または生物学的化合物または金属イオンに結合するときに蛍光の変化を示す、すなわち蛍光発生性である組成物をいう。フロオロフォアは、フルオロフォアの溶解性、分光学的特性または物理的特性を変化させる置換基を含んでいてもよい。多数のフルオロフォアが当業者に公知であり、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセンおよびキサンテン(フルオレセイン、ローダミン、ロドールが挙げられる)、ならびに半導体ナノ結晶およびRICHARD P.HAUGLAND,MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(第10版,2005)に記載されている他のフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されない。
【0111】
用語「リンカー」とは、単独の共有結合としてか、またはC、N、O、SおよびPからなる群より選択される、1〜30個の非水素原子を組み込む一連の安定な共有結合のとしてのいずれかで、2つの粒子を連結することができる2価の部分をいう。これらの原子は、フルオロフォア、キノリン基とアミノ酸とを共有結合で結合し、本発明のキナーゼ活性センサを形成する。例示的なリンクメンバーとしては、-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-などが挙げられる。例示的なリンカーとしては、共有結合、アミノ酸、スクシンイミジル誘導体、メチン、およびアルケニル基、アルキルおよび置換アルキル基、エチレン、プロピレン、ポリエチレン、およびポリプロピレングリコール、エステル、エーテル、アミド、カルバメート、およびカルボニル含有部分、ジオン、スクアレート、アジピン酸、ならびにSusan WongによるChemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking中に記載された他の基が挙げられる。
【0112】
「切断可能なリンカー」は、反応または条件の結果によって破壊されてもよい、1つ以上の切断可能な基を有するリンカーである。用語「切断可能な基」とは、放出される部分を結合体の残りの部分に連結している結合を切断することによって、結合体の残りの部分から、結合体の部分(例えば、レポーター分子、担体分子、または固体支持体)の放出を可能にする部分をいう。このような切断は、性質上化学的であるか、または酵素によって媒介されるかのいずれかである。例示的な酵素により切断可能な基としては、天然アミノ酸または天然アミノ酸で終結するペプチド配列が挙げられる。
【0113】
本発明は、特異的キナーゼの活性を検出および/または測定するための方法に関する。「特異的キナーゼ」は、本発明の方法を実行する前に、活性および/または構造についての少なくともいくつかの情報が実行者に公知である、目的の公知のキナーゼを示すために使用する。
【0114】
上記方法は、1つ以上のキナーゼを含む試料を、結合剤と接触させて、目的の特異的キナーゼを単離する工程を含む。この1つ以上のキナーゼは、任意の環境(細胞、組織、体液、緩衝液または別の合成組成物もしくは合成流体が挙げられるが、これらに限定されない)中に存在していてもよい。1つより多いタイプのキナーゼが存在する場合には、キナーゼが集合して、複数のキナーゼまたはキナーゼの一群となる。本明細書中で理解できるように、そのキナーゼの一群のあらゆるメンバーが特異的キナーゼである必要はない。むしろ、異なるキナーゼの一群を含み得る試料は、アッセイされる特異的キナーゼを含むはずであるか、または含むものと考えてよい。
【0115】
この特異的キナーゼは、次いで、この特異的キナーゼを特異的に結合することができる結合剤に暴露されるか、または接触されねばならない。本明細書中で使用する場合、用語「結合剤」は、公知のバイオマーカーに特異的に結合する組成物を意味するために使用する。結合剤の例としては、受容体、抗体、およびそれらの機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、用語「抗体」は、供給源およびその断片を生成した方法にかかわらず、免疫グロブリン分子およびその機能的断片を意味するために使用する。本明細書中で使用する場合、免疫グロブリンの「機能的断片」は、結合標的に特異的に結合する免疫グロブリン分子の一部分である。従って、本明細書中で使用する場合の用語「抗体」は、イソタイプをもつ抗体のような抗体全体を網羅し、このイソタイプをもつ抗体としては、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEおよびIgYが挙げられるが、これらに限定されない。抗体全体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、それらはヒト化されていても、キメラであってもよい。本明細書中で使用する場合の用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体に限定されない。むしろ、用語「モノクローナル抗体」とは、単一のクローンに由来する抗体をいい、それが生成された方法について言うのではない。この単一のクローンとしては、任意の真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンが挙げられる。用語「抗体」はまた、免疫グロブリンの機能的断片を包含し、この機能的断片としては、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2 断片およびFd断片が挙げられる。「抗体」はまた、VLおよび/またはVHドメインの少なくとも一部分を含む免疫グロブリンの断片を包含し、この断片としては、単鎖抗体、単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合したFvなどが挙げられる。
【0116】
本発明において使用する抗体は、単一特異的であってもよく、二種特異的(bispecific)であってもよく、三種特異的(trispecific)であってもよく、まはさらにより多くの多特異性であってもよい。さらに、上記抗体は、1価、2価、3価またはさらにより多価であってもよい。さらに、本発明の抗体は、任意の動物起源由来であってもよく、この動物としては、トリおよび哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な態様では、上記抗体は、ヒト、マウス、ネズミ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ウマ、またはニワトリ由来である。本明細書中で使用する場合、「ヒト」の抗体としては、ヒトの免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が挙げられ、そしてヒトの免疫グロブリンのライブラリから、または1つ以上のヒトの免疫グロブリンのために遺伝子組み換えされた動物から単離されて、固有の免疫グロブリンを発現しない抗体(米国特許第5,939,598号に記載されているものなど)を含む。この特許文献を本明細書中に参考として援用する。
【0117】
本発明において使用する抗体は、その抗体が認識するかまたは特異的に結合するポリペプチドのエピトープ(単数もしくは複数)または部分(単数もしくは複数)によって、記載するか特定するかしてもよい。または、上記抗体は抗原の特異的なコンホーメションに結合する能力に基づいて、記載してもよい。1つの態様では、本発明の方法において使用する単一の抗体は、目的の特異的キナーゼについて提示されるエピトープに対して特異的である。
【0118】
本発明において使用する抗体の特異性はまた、抗原(エピトープ)に対するそれらの結合親和性によって、またはそれらの交差反応性によって記載するか特定するかしてもよい。本発明に網羅される結合親和性の具体例としては、5×l0-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×l0-4M、10-4 M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×l0-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12 M、10-12M、5×10-13M、10-13 M、5×10-14M、10-14M、5×10-15Mまたは10-15Mよりも小さい解離定数(Kd)を有する結合親和性が挙げられるが、これらに限定されない。
【0119】
本発明において使用する抗体はまた、共有結合によって抗体が抗イディオタイプの応答を生成することが妨げられないように、例えば任意のタイプの分子を共有結合によってその抗体に結合することによって改変した誘導体を包含する。抗体に対する改変の例としては、グルコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他の組成物(例えば、シグナル伝達部位)への連結、標識などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記抗体は、固体基材に連結または結合されていてもよく、この固体基材としては、ビーズ、粒子、ガラス表面、プラスチック表面、セラミック表面、金属表面が挙げられるが、これらに限定されない。抗体を表面に結合する方法は、Coligan, JEら、Current Protocols In Immunology, Wiley Intersciences' (1993)およびHarlowら、Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 (1988)に記載されており、これらの刊行物を参考として援用する。多くの化学的改変のいずれもが、公知の技術によって実施することができ、この技術としては、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない。さらには、上記誘導体は1つ以上の非古典的なアミノ酸を含有していてもよい。
【0120】
本発明において使用する抗体は、当技術分野で公知の任意の適切な方法により生成することができる。ポリクロナール抗体は、当技術分野で周知の種々の手順により生成することができる。例えば、キナーゼまたはそのキナーゼ上のエピトープは、種々の宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。この宿主動物としては、ウサギ、マウス、ラットが挙げられる。宿主種に応じて、種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増大させてもよい。このアジュバントとしては、フロインドアジュバント(完全または不完全)、鉱物ゲル(例えば、水酸化アルミニウム)、表面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール(pluronic polyol)、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール)、および潜在的に有用なヒトのアジュバント(BCG(カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvum))が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアジュバントは、当技術分野で周知である。さらに、上記キナーゼを構築するペプチド鎖の一部分は、多重抗原ペプチド(multiple antigentic peptide)(MAP)として周知の多腕のペプチドに結合されていてもよい。次いで、このMAPを動物に投与して、MAPの腕(単数または複数)上に提示されるエピトープに高度に適合させた免疫応答を発生させることもできる。MAP技術を使用して抗体を発生させる方法は、当技術分野で周知である。MAP技術を使用して抗体を発生させる方法は、Tam, JP, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5409 (1988)およびOlive, C.ら、Mini Rev. Med. Chem. 1:429 (2001)に記載してあり、これらの刊行物を参考として援用する。
【0121】
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の非常に多様な技術を使用して調製することができ、この技術としては、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組合せの使用が挙げられる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して生成することができ、ハイブリドーマ技術としては、当技術分野で公知であり、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版、1988);Hammerling, ら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)に教示される技術が挙げられる(これらの刊行物の両方を参考として援用する)。
【0122】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を生成し、それについてスクリーニングするための方法は日常的業務であって当技術分野で周知であり、例えば、マウスに免疫性を付与することが挙げられるが、これに限定されない。いったん免疫応答を検出すると、そのマウスの脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。その脾細胞は、次いで、周知の技術によって、任意の適切な骨髄腫細胞(例えば、ATCCから入手可能な細胞株SP20由来の細胞)に融合する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローン化する。次いで、このハイブリドーマクローンは、本発明のバイオマーカーを結合することができる抗体を分泌する細胞について当技術分野で公知の方法によりアッセイすることができる。腹水は、一般に高レベルの抗体を含有し、腹水は、陽性ハイブリドーマクローンでマウスに免疫性を付与することにより生成させることができる。
【0123】
本発明において使用する抗体はまた、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して生成することができる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをエンコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面上に提示される。特定の態様では、このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリから発現される抗原結合ドメインを提示するために利用することができる。目的の抗原を結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合されたか捕捉された抗原を使用して、目的の抗原で選択するか、または同定することができる。これらの方法において使用するファージは、代表的には繊維状ファージであり、その例としては、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに組換え操作により融合されたFab、Fvまたはジスルフィドで安定化されたFv抗体ドメインを伴うファージから発現したfdおよびM13結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら、J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995);Amesら、J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995);Kettleboroughら、Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994);Persicら、Gene 187 9-18 (1997);Burtonら、Advances in Immunology 57:191-280 (1994);PCT出願番号第PCT/GB91/01134;PCT公報第WO90/02809号;同第WO91/10737号;同第WO92/01047号;同第WO92/18619号;同第WO93/11236号;同第WO95/15982号;同第WO95/20401号;および米国特許第5,698,426号;同第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,580,717号;同第5,427,908号;同第5,750,753号;同第5,821,047号;同第5,571,698号;同第5,427,908号;同第5,516,637号;同第5,780,225号;同第5,658,727号;同第5,733,743号および同第5,969,108号に開示される方法が挙げられる。これらの刊行物のすべてを参考として援用する。
【0124】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術により生成することができる。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片を生成するため)またはペプシン(F(ab')2断片を生成するため)のような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断により生成することができる。F(ab')2断片は、可変領域、軽鎖の一定領域および重鎖のCH1ドメインを含む。
【0125】
組換え技術のような他の方法を使用して、Fab断片、Fab'断片、およびF(ab')2断片を生成することができ、このような他の方法は、PCT公報第WO92/22324号;Mullinaxら、BioTechniques 12(6):864-869 (1992);およびSawaiら、AJRI 34:26-34 (1995);ならびにBetterら、Science 240:1041-1043 (1988)に開示されている。これらの刊行物を、本明細書中に参考として援用する。ファージ選択の後に、例えばそのファージ由来の領域をコードする抗体を単離して、抗体全体(ヒトの抗体が挙げられる)、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成することができ、そしてそのファージ由来の領域をコードする抗体を任意の所望の宿主(哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌が挙げられる)中で発現することができる。
【0126】
他のタイプの断片(例えば、scFv)を生成するために使用することができる技術の例としては、米国特許第4,946,778号および同第5,258,498号;Hustonら、Methods in Enzymology 203:46-88 (1991);Shuら、Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 90:7995-7999 (1993);ならびにSkerraら、Science 240:1038-1040 (1988)に記載される技術が挙げられる。これらの刊行物のすべてを参考として援用する。いくつかの用途(抗体をヒトにおいてインビボで使用すること、およびインビトロ検出アッセイが挙げられる)については、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒトの抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒトの免疫グロブリンの一定領域を有する抗体が挙げられる。キメラ抗体を生成する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985);Oiら、BioTechniques 4:214 (1986);Gilliesら、J.Immunol.Methods 125:191-202 (1989);米国特許第5,807,715号;同第4,816,567号;および同第4,816,397号を参照のこと。これらの刊行物のすべてを、本明細書中に参考として援用する。ヒト化された抗体は、非ヒト種由来の1つ以上の相補性決定領域(CDR)およびヒトの免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原を結合する非ヒト種の抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトのフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、CDR供与体抗体由来の対応する残基で置換され、抗原結合性が変更、好ましくは改善される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により同定され、この方法としては、例えばCDRとフレームワーク残基との相互作用をモデリングして、抗原との結合について重要なフレームワーク残基を同定すること、および配列を比較して、特定の位置の独特のフレームワーク残基を同定することが挙げられる(米国特許第5,585,089号;Riechmannら、Nature 332:323 (1988)を参照のこと。これらの刊行物の両方を、本明細書中に参考として援用する)。抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を使用してヒト化することができ、その技術としては、例えばCDR-グラフト化(欧州特許第239,400号;PCT公報第WO91/09967号;米国特許第5,225,539号;同第5,530,101号;および同第5,585,089号)、皮膜(veneering)または表面付け替え(resurfacing)(欧州特許第592,106号;同第519,596号;Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991);Studnickaら、Protein Engineering 7(6):805-814(1994);Roguska.ら、Proc. Nat'l Acad. Sci. 91:969-913(1994))、ならびにチェイン・シャッフリング法(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)が挙げられる。これらの刊行物を、本明細書中に参考として援用する。
【0127】
完全にヒトの抗体は、ヒト患者の治療的処置または診断のために特に好ましい場合がある。ヒトの抗体は、当技術分野で公知の種々の方法により作製することができ、その方法としては、ヒトの免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリを使用する上記のファージディスプレイ法が挙げられる。米国特許4,444,887号および同第4,716,111号;ならびにPCT公報第WO98/46645号、同第WO98/50433号、同第WO98/24893号、同第WO98/16654号、同第WO96/34096号、同第WO96/33735号および同第WO91/10741号もまた参照のこと。これらの各々を、参考として援用する。
【0128】
ヒトの抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して生成することができる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または相同的組み換えによってマウスの胚幹細胞中に導入してもよい。あるいは、ヒトの可変領域、一定領域および多様性領域を、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウスの胚幹細胞中に導入してもよい。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同的組み換えによるヒトの免疫グロブリン座の導入とは別個に、またはそれと同時に、非機能的なものとしてもよい。特に、JH領域のホモ接合体欠失が起こると、内因性の抗体生産が妨げられる。改変した胚幹細胞を展開し、胚盤胞中に微量注入して、キメラマウスを生成する。このキメラマウスを交配させて、ヒトの抗体を発現する同型の子孫を生成する。このトランスジェニックマウスに、通常のやり方で、選択した抗原を用いて免疫性を与える。その抗原に対して指向性のモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、上記免疫を付与したトランスジェニックマウスから得ることができる。このトランスジェニックマウスが宿すヒトの免疫グロブリンのトランス遺伝子は、B細胞の分化の間に再配列し、その後、クラス切替えおよび体細胞変異を受ける。このようにして、このような技術を使用すると、治療的に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を生成することが可能である。ヒトの抗体を生成するためのこの技術を概観するために、LonbergおよびHuszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照のこと。この文献を、本明細書中に参考として援用する。ヒトの抗体およびヒトのモノクローナル抗体を生成するためのこの技術ならびにこのような抗体を生成するためのプロトコルについての詳細な考察については、例えば、PCT公報第WO98/24893号;同第WO92/01047号;同第WO96/34096号;同第WO96/33735号;欧州特許第0 598 877号;米国特許第5,413,923号; 同第5,625,126号;同第5,633,425;同第5,569,825号;同第5,661,016号;同第5,545,806号;同第5,814,318号;同第5,885,793号;同第5,916,771号、および同第5,939,598号を参照のこと。これらの刊行物を、参考として援用する。
【0129】
ヒトの抗体を生成するためのさらに別のアプローチは、案内された選択(guided selection)と呼ばれる技術を利用する。案内された選択では、選択された非ヒトのモノクローナル抗体(例えば、マウスの抗体)を同一のエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択を案内するために使用する(Jespersら、Biotechnology 12:899-903 (1988)、本明細書中に参考として援用する)。
【0130】
単離されたキナーゼを、次いで、キナーゼ活性センサと接触させる。本明細書中で使用する場合、キナーゼ活性センサは、少なくとも1つのリン酸化部位を有するキナーゼ認識モチーフを含む組成物である。このリン酸化部位は、このキナーゼ活性センサのキナーゼ認識モチーフ内に存在してもしなくてもよい。1つの態様では、このリン酸化部位は、リン酸化を受けることができるアミノ酸残基(reside)である。従って、ある局面では、上記キナーゼ活性センサは、リン酸化を受けることができるペプチドを含む。リン酸化を受けることができるアミノ酸の例としては、セリン、トレオニン、およびチロシンのような天然のヒドロキシル含有アミノ酸残基、ならびに非天然のヒドロキシル含有アミノ酸残基が挙げられるが、これらに限定されない。
【0131】
キナーゼ認識モチーフ
キナーゼ認識モチーフを、本発明に従って使用することができる。いまだ機能的ではある間は、酸性残基を有するキナーゼ認識モチーフは、あまり望ましくない場合がある。なぜなら、アッセイの間、これらの残基が酸性条件を作り出すかも知れないからである。上記キナーゼ活性センサにおいて使用することができる認識モチーフの例としては、表1に示すモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。
【0132】
【表1】
【0133】
他の単離されたキナーゼ認識モチーフとしては、表2、表3および表4の認識モチーフが挙げられるが、これらに限定されない。
【0134】
【表2】
【0135】
【表3】
【0136】
【表4】
【0137】
「Sx」というときは、SOX(本明細書中に記載するキナーゼ活性センサ)を示し、「dP」はD-プロリンを示し、「Ac」はアシルを示し、-NH2はアミノを示す。
【0138】
本発明の好ましい態様は、SEQ ID NO: 1〜133のうちの少なくとも1つを含む組成物を提供する。より具体的には、本発明は、SEQ ID NO: 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、またはSEQ ID NO: 49を含むか、またはこれらからなる組成物を提供する。さらにより具体的には、SEQ ID NO: 1〜133のうちの少なくとも1つをキナーゼ認識モチーフとして使用する。
【0139】
単離したキナーゼが存在する場合には、その単離したキナーゼは次いでキナーゼ活性センサのアミノ酸標的をリン酸化する。本発明者らは、単離されて結合剤で固定化されたキナーゼはまだ活性な酵素であることを見出した。従って、活性な特異的キナーゼは、標的アミノ酸残基(複数個であってもよい)をリン酸化するのに利用することができる。1つの態様では、アデノシン三リン酸(ATP)および上記キナーゼ活性センサのキレート剤とリン酸化されたアミノ酸とに対して親和性を有する金属イオンを、単離したキナーゼが上記キナーゼ活性センサと接触する前、接触する間または接触した後のいずれかにアッセイに添加する。特定の局面では、この金属イオンは、マグネシウムであるが、しかし上記のような任意の金属イオンも本発明の一部である。
【0140】
キナーゼ活性センサ
次に、リン酸化部位上でのリン酸化活性のレベルを、種々の技術を使用して定量することができる。1つの態様では、上記キナーゼ活性センサは、標的のリン酸化部位上でのリン酸化事象に応答してシグナルを発生するかまたは変化させることができるシグナル伝達部分を含む。より具体的な態様では、このシグナル伝達部分は、蛍光シグナルを発生することができる。シグナル伝達部分の例としては、Fluorescent Magnesium Indicators (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)およびキレート化事象の際に蛍光を発する金属結合性アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアミノ酸は、米国特許第6,906,194号に記載されており、この特許文献を本明細書中に参考として援用する。
【0141】
本明細書中で使用する場合、用語「金属キレート剤」は、当技術分野で意味するとおりに使用する。つまり、金属キレート剤は、金属イオンと2つ以上の配位結合を形成することができる化合物である。用語「配位結合」は、当技術分野で周知であり、金属イオンとキレート剤との間の配位性共有結合を示すために使用する。
【0142】
本発明の金属キレート部分は、金属イオンを同時に結合する部分であり、キナーゼ基質のセリン、トレオニン、またはチロシン残基上の曝露されたリン酸基に対して親和性を有し、三元複合体が、この金属キレート部分、金属イオン、およびリン酸化されたセリン、トレオニン、またはチロシン残基の間で形成される。リン酸基と結合することがすでに見出されている金属イオンとしては、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ga3+、Tb3+、La3+、Pb2+、Hg2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、およびSr2+が挙げられる。本発明のキナーゼ活性センサによるキレート化のために好ましい金属イオンは、マグネシウムである。従って、上記金属キレート部分は、1)リン酸基に対する親和性を有する金属イオンを結合せねばならず、2)リン酸基に対する金属イオンの結合を妨げてはならず、そして3)安定な三元複合体を維持しなければならない。これらの3つの基準に適合する金属キレート部分としては、キノリンまたはその誘導体、フェナントロリンまたはその誘導体、BAPTA、IDA、DTPAおよびこれらの誘導体が挙げられる。
【0143】
1つの態様では、本発明のキナーゼ活性センサは、以下の式で表されるか、またはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
式中、R1、R2、R3、R4、R5およびR6は、独立にフルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環式、または置換複素環式であり;
R7およびR8は、独立にH、アルキル、置換アルキル、カルボニル、またはFMOCであり;
Lは、リンカーであり;かつ
YはペプチドまたはHである。
【0144】
好ましい態様では、上記キナーゼ活性センサは以下の式を有するか、またはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
式中、R4は、スルホンアミド基またはフルオロフォアであり;
R7およびR8は、独立にH、アルキル、置換アルキル、カルボニル、またはFMOCであり;
Lはリンカーであり;かつ
YはペプチドまたはHである。
【0145】
別の好ましい態様では、上記キナーゼ活性センサは、以下の式を有するか、またはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
R7およびR8は、独立にH、アルキル、置換アルキル、カルボニル、またはFMOCであり;
Lはリンカーであり;かつ
Yはペプチドである。
【0146】
別の好ましい態様では、上記キナーゼ活性センサ上のフルオロフォアは以下の式を有する:
式中、R9およびR10は、各々、独立にハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHである。
【0147】
別の好ましい態様では、上記キナーゼ活性センサは以下の式を有するか、またはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
式中、R7はHであるか、または保護基であり;
R9は、ハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHであり;
R10は、ハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHであり;
Lはリンカーであり;かつ
YはペプチドまたはHである。
【0148】
上述の態様のいずれかのより具体的な態様では、R4はフルオロフォアである。別の態様では、上記フルオロフォアは、ダンシル、キサンテン、シアニン、ボラポリアザインダセン、ピレン、ナフタレン、クマリン、オキサジンまたはこれらの誘導体である。別の態様では、上記フルオロフォアは、クマリン、キサンテンまたはこれらの誘導体である。別の態様では、R1はヒドロキシである。別の態様では、R2、R3、R5およびR6はすべてHである。別の態様では、R7はHまたはFMOCである。別の態様では、R8はHである。別の態様では、Yはペプチドである。別の態様では、上記ペプチドは、キナーゼ認識部位、およびキナーゼによるリン酸化を受けやすい、セリン、トレオニン、またはチロシンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を含む。別の態様では、
結合で示された位置は、S配置であるか;あるいはそれはR配置であるか;あるいは上記キナーゼ活性センサはラセミ体である。別の態様では、上記キナーゼ活性センサの塩は、マグネシウムである。別の態様では、Lは共有結合である。別の態様では、YはHである。別の態様では、R9およびR10は、ともにフッ素である。
【0149】
本発明のフルオロフォアは、キレート部分と結合した際に蛍光発生性であるか、または本質的に非蛍光性である、当技術分野で公知の任意のフルオロフォアであってよい。本発明のフルオロフォアは、キナーゼ活性センサ化合物の一部がその独特の分光学的特性を保持して検出可能なシグナルを提供するときに、280nmを超えて吸収極大を示す任意の化学的部分である。1つの態様では、本発明のフルオロフォアは、キナーゼ活性センサのキレート部分とは別個の部分である。別の態様では、キレート剤はまた、フルオロフォアでもある。
【0150】
本発明において使用することができるフルオロフォアとしては、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンゾインドール、オキサゾールまたはベンゾオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、4-アミノ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾール(NBD)、カルボシアニン(米国特許出願第09/557,275号;同第09/968,401号および同第09/969,853号ならびに米国特許第6,403,807号;同第6,348,599号;同第5,486,616号;同第5,268,486号;同第5,569,587号;同第5,569,766号;同第5,627,027号および同第6,048,982号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレートアントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン(米国特許第4,774,339号;同第5,187,288号;同第5,248,782号;同第5,274,113号;および同第5,433,896号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、キサンテン(米国特許第6,162,931号;同第6,130,101号;同第6,229,055号;同第6,339,392号;同第5,451,343号および米国特許出願第09/922,333号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、オキサジンまたはベンゾオキサジン、カルバジン(米国特許第4,810,636号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、フェナレノン、クマリン(米国特許第5,696,157号;同第5,459,276号;同第5,501,980号および同第5,830,912号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、ベンゾフラン(米国特許第4,603,209号および同第4,849,362号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)ならびにベンゾフェナレノン(米国特許第4,812,409号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)ならびにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、オキサジンとしては、レゾルフィン(米国特許第5,242,805号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジンおよびそれらのベンゾ置換アナログが挙げられる。
【0151】
特定の態様では、本発明のフルオロフォアは、アクリジン、アントラセン、ベンゾフラン、インドール、ダンシル、シアニン、ボラポリアザインダセン、ピレン、ナフタレン、クマリン、オキサジン、ボロン ジピロメタン ジフルオリド、およびキサンテン(フルオレセイン、ローダミンおよびロドール、ならびにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない)からなる群より選択される。本発明で使用することができるさらなるフルオロフォアは、Richard P. Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第9版)に列挙されている。 より具体的な態様では、このキサンテンは、フルオレセインまたはローダミンである。上記フルオロフォアは、溶解性、分光学的特性または他の物理的特性を調整するために、置換されていてもよい。
【0152】
上記フルオロフォアがキサンテンである場合には、このフルオロフォアは、フルオレセイン、ロドール(米国特許第5,227,487号および同第5,442,045号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、ロサミンもしくはローダミン(米国特許第5,798,276号;同第5,846,737号;同第5,847,162号;同第6,017,712号;同第6,025,505号;同第6,080,852号;同第6,716,979号;同第6,562,632号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)であってよいが、これらである必要はない。本明細書中で使用する場合、フルオレセインとしては、ベンゾフルオレセインまたはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、またはナフトフルオレセインが挙げられる。同様に、本明細書中で使用する場合、ロドールとしては、セミナフトロダフルオル(seminaphthorhodafluor)(米国特許第4,945,171号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)が挙げられる。フッ素化キサンテンフルオロフォアは、すでに以前に、特に有用な蛍光特性を保有しているとして記載されており(国際公開第WO97/39064号および米国特許第6,162,931号)、OREGON GREENの商標名で市販されているものが挙げられる。
【0153】
特に、このOregon Green前駆体は、ペプチドキナーゼの基質における非常に明るくて非常に吸光性のpH非感受性のフルオレセイン誘導体の戦略的な配置を可能にする。蛍光は、最初はPETを介して8-ヒドロキシキノリン部分により消光されるが、β-ターンジペプチド配列により色素から離されている適切なSer/Thr/Tyr残基のリン酸化の際に、マグネシウム(II)によって媒介される、キレート化に誘導される蛍光の増加が観察される。蛍光(490nm 励起/520nm 発光)の増加は、カルシウム測定についてのFluo-4を使用する際に観察されるものと、機構上も強度も類似している。重要な合成ステップは、8-ヒドロキシキノリンアミノ酸の位置選択的ヒドロホルミル化、およびそれに続く4-フルオロレゾルシノールおよび脱水素的酸化である。本発明の成功への鍵は、フルオロフォア-アミノ酸部分の適切な構築、およびキレート部分およびリン酸部分が介在する金属イオンによって一緒に近接することができるような三次元幾何学におけるフルオロフォア-アミノ酸部分の配置である。この幾何学的最適化は、PKCαペプチド基質Ac-Oregon Greenアラニン-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg-Arg-Arg-NH2の半経験的分子モデリングでのエネルギー最小化により可視化できる。Oregon Greenアラニン誘導体の金属キレート部分がホスホセリン部分に向かって配向することができるように、このフルオロフォア置換アミノ酸を、リン酸化されるべきセリンから2つのアミノ酸残基離して配置する。このヒドロキシキノリンフルオロフォア 部分を、蛍光が金属イオンによるキレート化がない場合に消光するように構築し、そしてヒドロキシキノリン-アミノ酸の連結点もまた最適の幾何学を求めて選択する。
【0154】
代表的には、上記フルオロフォアは、1つ以上の芳香族環またはヘテロ芳香族環を含み、これらの環は、必要に応じて、1回以上、種々の置換基(ハロゲン、ニトロ、スルホ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールもしくはヘテロアリール環系、ベンゾ、または当技術分野で公知のクロモフォアもしくはフルオロフォアに代表的に存在する他の置換基が挙げられるが、これらに限定されない)によって置換されている。
【0155】
例示的な態様では、上記フルオロフォアは、独立に、水素、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、スルホ、反応性基および担体分子からなる群より選択される置換基で置換される。別の態様では、本発明のキサンテンフルオロフォアは、置換基によって、キサンテンの中心環の炭素原子が置換されているかまたは置換されていない化合物の両方を含む。この置換基としては、キサンテンベースのフルオロフォアで代表的に見出される置換基、例えばフェニルおよび置換フェニル部分が挙げられる。さらに別の態様では、本発明のアミノ酸および組成物において使用するフルオロフォアは、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、ナフタレンおよびこれらの誘導体である。キレート部分に結合されたフルオロフォアの選択は、本発明のアミノ酸および組成物の吸収特性および蛍光発光特性、ならびにその生体細胞特性を決定する。
【0156】
選択したスルホン化フルオロフォアはまた、有利な特性を示し、そして選択したスルホン化フルオロフォアとしては、(米国特許第5,132,432号;同第5,696,157号;同第5,268,486号;同第6,130,101号に記載されるように)スルホン化ピレン、クマリン、カルボシアニンおよびキサンテンが挙げられる。スルホン化ピレンおよびクマリンは、代表的には、約450nm未満の波長で励起される(米国特許第5,132,432号よび同第5,696,157号)。
【0157】
1つの態様では、上記標識は、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、5-TMRIA(テトラメチルローダミン-5-ヨードアセトアミド)、(9-(2(または4)-(N-(2-マレイミジルエチル)-スルホンアミジル)-4(または2)-スルホフェニル)-2,3,6,7,12,13,16,17-オクタヒドロ-(1H, 5H, 11H, 15H-キサンテノ(2,3,4-ij:5,6,7-i'j')ジキノリジン-18-ニウム塩)(Texas Red(登録商標))、2-(5-(1-(6-(N-(2-マレイミジルエチル)-アミノ)-6-オキソヘキシル)-1,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-5-スルホ-2H-インドール-2-イリデン)-1,3-プロピルジエニル)-1-エチル-3,3-ジメチル-5-スルホ-3H-インドリウム塩(Cy(商標)3)、N,N'-ジメチル-N-(ヨードアセチル)-N'-(7-ニトロベンゾ-2-オキサ- 1,3-ジアゾール-4-イル)エチレンジアミン(IANBDアミド)、6-アクリロイル-2-ジメチルアミノナフタレン(アクリロダン(acrylodan))、ピレン、6-アミノ-2,3-ジヒドロ-2-(2-((ヨードアセチル)アミノ)エチル)-1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ(デ)イソキノリン-5,8-ジスルホン酸塩(ルシファーイエロー)、2-(5-(1-(6-(N-(2-マレイミジルエチル)-アミノ)-6-オキソヘキシル)-1,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-5-スルホ-2H-インドール-2-イリデン)-1,3-ペンタジエニル)-1-エチル-3,3-ジメチル-5-スルホ-3H-インドリウム塩(Cy(商標)5)、4-(5-(4-ジメチルアミノフェニル)オキサゾール-2-イル)フェニル-N-(2-ブロモアセトアミドエチル)スルホンアミド(Dapoxyl(登録商標)(2-ブロモアセトアミドエチル)スルホンアミド))、(N-(4,4-ジフルオロ-1,3,5,7-テトラメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-2-イル)ヨードアセトアミド(BODIPY(登録商標) 507/545 IA)、N-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオニル)-N'-ヨードアセチルエチレンジアミン(BODIPY 530/550 IA)、5-((((2-ヨードアセチル)アミノ)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸(1,5-IAEDANS)、およびカルボキシ-X-ローダミン、5/6-ヨードアセトアミド(XRIA 5,6)からなる群より選択されるフルオロフォアである。標識の別の例は、BODIPY-FL-ヒドラジドである。
【0158】
例示的な態様では、上記フルオロフォアは50nmより大きいストークスシフトを有する。特に有用な態様では、上記フルオロフォアは、約100nmよりも大きいか、または約150nmよりも大きいストークスシフトを有する。さらにより多くの態様では、本発明の化合物は、約200nmよりも大きいか、または約250nmよりも大きいストークスシフトを有する。本明細書中で使用する場合の用語「ストークスシフト」は、吸収したエネルギーと放出したエルギーとの間の波長の差をいう。具体的には、このストークスシフトは、同一の電子遷移に由来する吸収およびルミネセンスのスペクトル位置およびバンド極大(またはバンドの根源)の差(通常は、周波数単位)である。
【0159】
正しいキナーゼ基質認識モチーフを容易にするために、96ウェルプレートの表面上に乾燥した14基質を用いるS/TまたはYペプチド基質サンプラープレート(1ウェルあたり1基質、かつ1基質あたり6ウェル)を提供する。各基質を反応緩衝液中に再懸濁し、目的のキナーゼ(複数個であってもよい)を各ウェルに添加し、次いでリアルタイムで蛍光の増加をモニタリングする。
【0160】
本発明の別の態様は、キナーゼ活性を検出する方法を提供し、この方法は、
金属キレート剤、1つ以上のアミノ酸およびフルオロフォアを含むキナーゼ活性センサの蛍光を測定する工程であって、このキレート剤がキノリン基を含み、そしてフルオロフォアおよびアミノ酸の両方がこのキノリン基に結合されており、そしてこのアミノ酸がキナーゼ認識部位およびリン酸化部位を含む、工程;
固定化した結合剤を含む固体または半固体支持体を提供する工程;
この固定化した結合剤を、特異的キナーゼを含む試料と接触させ、固定化した特異的キナーゼを形成する工程;
この固定化した特異的キナーゼを、キナーゼ活性センサと接触させ、接触した特異的キナーゼを形成する工程であって、このキナーゼ活性センサがリン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドおよびキレート剤を含む、工程;
この接触した特異的キナーゼを、このキナーゼがリン酸供給源および金属イオンの存在下で上記ペプチドをリン酸化するのに十分な時間、インキュベーションする工程であって、このキナーゼ活性センサが、金属イオンおよびリン酸化されたペプチドと三元複合体を形成し、検出可能なシグナルを発生する工程;ならびに
このシグナルを検出し、これにより上記特異的キナーゼの活性を測定する工程;
非接触状態と接触状態との間での上記キナーゼ活性センサの蛍光の差を定量する工程
を含み、ここで蛍光の差がキナーゼ活性の存在を示す。
【0161】
別のより具体的な態様では、上記測定した蛍光は、強度、励起波長または発光波長、蛍光の分布、蛍光寿命、蛍光偏光およびこれらの組合せからなる群より選択される。
【0162】
本発明の別の態様は、キナーゼ活性を検出する方法を提供し、この方法は、
1つ以上のキナーゼを結合剤と接触させて特異的キナーゼを単離し、単離したキナーゼを形成する工程;
この単離したキナーゼを、キナーゼ活性センサと接触させる工程であって、このキナーゼ活性センサが、この単離したキナーゼによるリン酸化を受けることができるキナーゼ認識モチーフおよび少なくとも1つのリン酸化部位を含む、工程;
インキュベーションした試料を適切な波長で照射して、照射した試料を形成する工程;
この照射した試料を観察する工程であって、キナーゼ活性が観察可能な蛍光シグナルの存在により検出される工程、
を含む。
【0163】
スキーム1は、キナーゼ活性センサを採用する本発明の1つの態様の説明図を提供する。
スキーム1:
【0164】
マグネシウム錯体は、このペプチドのリン酸化を検出し、かつ/または定量することができるように、このキナーゼ活性センサの発光スペクトルおよび/または励起スペクトルを改変する。
【0165】
本発明のキナーゼ活性センサは、1つ以上のアミノ酸を含む。1つの態様では、このアミノ酸は、少なくとも1つのキナーゼ認識モチーフを含むペプチドを形成し、このキナーゼ認識モチーフは、少なくとも1つのリン酸化可能なアミノ酸残基を含む。
【0166】
任意のキナーゼ認識モチーフが、本発明に従って使用できる。酸性残基を有する認識配列は、リン酸化の際に、相当する配列より小さい大きさの蛍光増加を示す。なぜなら、マグネシウムに対するリン酸化されていないペプチドの親和性は、酸性条件下で増加する傾向があるからである。本発明に従う上記キナーゼ認識モチーフ内のリン酸化部位としては、ヒドロキシル基を含むアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。例としては、天然のヒドロキシル含有アミノ酸残基(例えば、セリン、トレオニン、およびチロシン)ならびに非天然のヒドロキシル含有アミノ酸残基が挙げられるが、これに限定されない。好ましい認識モチーフを表1、2、および3に列挙する。
【0167】
リン酸化活性のレベルを検出する他の方法としては、リン酸化されたアミノ酸残基を認識して結合することができるリン酸化部位特異的抗体の使用が挙げられるが、これに限定されない。リン酸化されたアミノ酸残基を認識する抗体の例としては、米国特許出願第2003/0162330号、Mandel, J., Phosphorylation State-Specific Antibodies, Amer. J. Pathol., 163:1687 (2003)およびGlenney, JRら、Monoclonal antibodies to phosphotyrosin. J. Immunol. Methods. 109:277 (1988)に記載される抗体が挙げられる。これらの刊行物を本明細書中に参考として援用する。
【0168】
本発明の方法は、創薬環境のために有用である。1つの特定の態様では、本発明の方法は、目的の特異的キナーゼを単離する前に細胞または組織を化合物(例えば、薬物、または薬物候補)に曝露する工程を含む。その際、キナーゼの集団が細胞または組織中に存在し、薬物または薬物候補をこの細胞または組織に投与する。いったん曝露すると、この細胞組織を溶解させることができ、次いで目的の特異的キナーゼを単離することができ、その活性を本発明の方法を使用して定量することができる。
【0169】
固体または半固体支持体
例示的な態様では、本発明の化合物または結合剤(例えば、抗体)を固体または半固体支持体に結合する。本発明において使用するのに適した支持体は、代表的には、液体相には実質的に不溶である。本発明の固体または半固体支持体は、特定のタイプの支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用可能であり、それらは当業者に公知である。従って、有用な固体支持体としては、半固体(例えば、エーロゲルおよびヒドロゲル)、樹脂、ビーズ、バイオチップ(薄膜で被覆されたバイオチップが挙げられる)、マルチウェルプレート(マイクロタイタープレートとも呼ばれる)、膜、導電性金属および非導電性金属、ならびに磁気支持体が挙げられる。有用な固体支持体のより具体的な例としては、シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖(例えば、セファロース)、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、FICOLL、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン(ポリエチレングリコールを含む)、ナイロン、ラテックスビーズ、電磁ビーズ、超常磁性ビーズ(Dynabeads(例えば、M-280))、デンプンなどが挙げられる。好ましい支持体としては、アガロースおよび電磁ビーズが挙げられる。
【0170】
いくつかの態様では、上記固体または半固体支持体は、本発明の化合物を結合するための支持体反応性官能基を備え、この支持体反応性官能基としては、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシドなどが挙げられる。好ましい態様では、上記固体支持体は、求核剤(x)(例えば、アミノ、チオール、またはヒドロキシル)を含有する。
【0171】
適切な固体または半固体支持体は、所望の最終用途および種々の合成プロトコルについての適合性に基づいて選択することができる。例えば、本発明の化合物を上記固体支持体に結合するためにアミド結合生成が望ましい場合には、一般にペプチド合成において有用な樹脂を用いてもよく、このような樹脂としては、ポリスチレン(例えば、Bachem Inc.、Peninsula Laboratoriesなどから入手できるPAMレジン)、POLYHIPE(商標)樹脂(Aminotech, Canadaから入手できる)、ポリアミド樹脂(Peninsula Laboratoriesから入手)、ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン樹脂(TentaGel(商標)、Rapp Polymere, Tubingen, Germany)、ポリジメチルアクリルアミド樹脂(Milligen/Biosearch, Californiaから入手可能)、またはPEGAビーズ(Polymer Laboratoriesから入手)が挙げられる。
【0172】
キット
本発明のさらなる態様は、本明細書中に記載されるキナーゼ活性の検出において使用するための組成物を含むキットを包含する。さらに、このキットは、目的のキナーゼの活性を最良に検出する方法についての使用説明書を備える。
【0173】
本発明の別の局面は、特異的キナーゼの活性を検出するためのキットを提供し、このキットは、その特異的キナーゼに結合する結合剤およびキナーゼ活性センサを含み、ここでこのキナーゼ活性センサは、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドおよびキレート剤を含む。より具体的には、このキットは、ATPならびにこのキレート剤およびリン酸化されたペプチドの両方に対して親和性を有する金属イオンをさらに含む。
【0174】
正しいキナーゼ基質認識モチーフを容易にするために、96ウェルプレートの表面上に乾燥した14基質を用いるS/TまたはYペプチド基質サンプラープレート(1ウェルあたり1基質、かつ1基質あたり6ウェル)を提供する。各基質を反応緩衝液中に再懸濁し、目的のキナーゼ(複数個であってもよい)を各ウェルに添加し、次いでリアルタイムで蛍光の増加をモニタリングする。
【0175】
本発明の好ましいキットは、種々のSer/Thrキナーゼの活性を測定するために使用することができる14個のSoxベースのペプチド基質を含む。このペプチドは、対照ペプチドの12個の複製物の最下段列とともに6個の複製物がセットになって配置されている。これらの基質は、SEQ ID NO: 20〜33に列挙されたペプチドに対応する。
【0176】
別の好ましいキットは、種々のSer/Thrキナーゼの活性を測定するために使用することができる14個のSoxベースのペプチド基質(キナーゼ活性センサ)を含む。このペプチドは、対照ペプチドの12個の複製物の最下段列とともに6個の複製物がセットになって配置されている。これらの基質は、SEQ ID NO: 4およびSEQ ID NO: 34-36に列挙されたペプチドに対応する。また、必要に応じて、Ser/Thrキナーゼの検出のための付加的なキナーゼ活性センサがこのキットの中に備えられている。
【0177】
別の好ましいキットは、種々のTyrキナーゼの活性を測定するために使用することができる14個の異なるキナーゼ活性センサを含む。このペプチドは、対照ペプチドの12個の複製物の最下段列とともに6個の複製物がセットになって配置されている。これらの基質は、SEQ ID NO: 42〜49に列挙されたペプチドに対応する。また、必要に応じて、チロシンキナーゼの検出のための付加的なキナーゼ活性センサがこのキットの中に備えられている。
【0178】
種々の補助的な物質が、しばしば、本発明に従うアッセイまたはキットにおいて用いられる。例示的な態様は、緩衝液および/または安定剤がこのキット構成成分として存在する。さらなる構成成分としては、ゲル、ビーズ、支持体、反応剤などが挙げられる。別の例示的な態様では、このキットは、指示薬溶液または指示薬の「試験紙(dipstick)」、吸取紙(blotter)、培地、キュベットなどを備える。さらに別の態様では、このキットは、自動化検出器で使用するための指示薬カートリッジ(キット構成成分を固体支持体に結合する場所)を備える。別の例示的な態様では、このキットは、添加剤をさらに備える。この添加剤は、リン酸化ポリペプチドおよび非リン酸化ポリペプチド、カルシウム結合ポリペプチドおよび非カルシウム結合ポリペプチド、スルホン化ポリペプチドおよび非スルホン化ポリペプチド、ならびにシアル化ペプチドおよび非シアル化ペプチドからなる群より選択される。別の例示的な態様では、このキットは、定着液、検出用試薬、標品、洗浄液およびこれらの組合せから選択されるメンバーをさらに含む。
【0179】
照射
リン酸化アミノ酸、金属イオンおよび上記キナーゼ活性センサのキレート剤が存在する試料または培地を、検出可能な光学的応答を与えるように選択した波長で照射し、この光学的応答を検出するための手段を用いて観察する。本発明の化合物および組成物を照射するのに有用である装置としては、手持ちサイズの紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、レーザー、およびレーザーダイオードが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射源は、必用に応じて、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダーまたは標準的な蛍光光度計もしくはマイクロフルオロメーターに一体化されている。
【0180】
本発明のキナーゼ活性センサを、アッセイ後またはアッセイの間いつでも、検出可能な光学的応答をもたらす波長の光で照射し、この光学的応答を検出するための手段を用いて観察することができる。本発明のキナーゼ活性センサを照射するのに有用である選択した装置としては、手持ちサイズの紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、アルゴンレーザー、レーザーダイオードおよびYAGレーザーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射源は、必要に応じて、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準的な蛍光光度計もしくは小型蛍光光度計、またはクロマトグラフィー検出器に一体化されている。この蛍光発光は、必要に応じて、目視によって、または以下のデバイス(CCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャン装置、蛍光光度計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光(epifluorescence)顕微鏡、走査電子顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー)のいずれかを使用することにより、あるいは光電子増倍管のようなシグナルを増幅するための手段により検出する。
【0181】
これまで本発明を詳細に説明してきたが、本発明を例示する目的で以下の実施例を提示する。これらの実施例は、本発明または特許請求の範囲の範囲を限定しようとするものではない。
【0182】
実施例
実施例1:p38キナーゼ活性の定量
p38キナーゼに特異的なマウスのモノクローナル抗体を、96ウェルプレートのウェルに結合した。炭酸塩緩衝液中のp38抗体の濃度は、3μg/ml、6μg/mlおよび12μg/mlであり、そして各濃度の100μlを1ウェルあたりで使用した。
【0183】
マウスのマクロファージ細胞(RAW264.7)をアニソマイシンに曝露し、そして培養物中で約2時間インキュベーションした。対照細胞は処理しなかった。インキュベーション後、細胞培養物を細胞から取り出して、その細胞を洗浄した。次いで、細胞を市販されている細胞溶解剤を用いて溶解し、そしてこの細胞溶解物をコーティングしたプレートのウェルに添加した。
【0184】
結合剤で目的の特異的キナーゼ(p38)を捕捉した後、キナーゼ活性センサ(50ng)を1mMのATPとともにこのウェルに加えた。この例では、この活性センサのキナーゼ認識モチーフは、アミノ酸配列AHLQRLSI(dP)(SEQ ID NO: 134)を含んでおり、セリンがリン酸化標的部位であった。このキナーゼ活性センサは、米国特許第6,906,194号に記載されかつSOXと呼ばれる金属結合性アミノ酸をさらに含んでいた。このSOXアミノ酸は、マグネシウムとのキレート化の際に蛍光を発する。図1は、p38にのみ帰属することができるリン酸化活性のレベルを図示する。
【0185】
実施例2:Erk1/2キナーゼ活性の定量
Erk1/2キナーゼに特異的なウサギのモノクローナル抗体を、96ウェルプレートのウェルに結合した。炭酸塩緩衝液中のErk1/2抗体の濃度は、3μg/ml、6μg/mlおよび12μg/mlであり、そして各濃度の100μlを1ウェルあたりで使用した。
【0186】
マウスの胚線維芽細胞(3T3)を血小板由来増殖因子(PDGF)に曝露し、そして培養物中で約2時間インキュベーションした。対照細胞は処理しなかった。インキュベーション後、細胞培養物を細胞から取り出して、その細胞を洗浄した。次いで、細胞を市販されている細胞溶解剤を用いて溶解し、そしてこの細胞溶解物をコーティングしたプレートのウェルに添加した。
【0187】
結合剤で目的の特異的キナーゼ(Erk1/2)を捕捉した後、キナーゼ活性センサ(50ng)を1mMのATPとともにこのウェルに加えた。この例では、この活性センサのキナーゼ認識モチーフは、アミノ酸配列AHLQRLSI(dP)(SEQ ID NO: 134)を含んでおり、セリンがリン酸化標的部位であった。このキナーゼ活性センサは、米国特許第6,906,194号に記載されかつSOXと呼ばれる金属結合性アミノ酸をさらに含んでいた。このSOXアミノ酸は、マグネシウムとのキレート化の際に蛍光を発する。図2は、Erk1/2にのみ帰属することができるリン酸化活性のレベルを図示する。
【0188】
実施例3:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるAkt1活性の測定
NIH3T3細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでPDGF A/B(50ng/mL、10分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、以下にアッセイ手順で説明するようにして、Akt1活性をアッセイした。
【0189】
PDGF処理した試料は、1.13RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.12RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が9という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.12RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 25を使用して、以下のアッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図3に示す。
【0190】
アッセイ手順
試薬
洗浄緩衝液(1×ストックを調製する):適切な量の10×洗浄緩衝液濃縮物を、超純水を用いて10倍に希釈する(例えば、10×洗浄緩衝液5mL+超純水45mL)。
【0191】
Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液(1×ストックを調製する):適切な量の10×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液を、超純水を用いて10倍に希釈して、0.2mMの最終濃度までDTTを(必要な場合)加える(例えば、10×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液500μL+100mM DTT 10μL+超純水4490μL)。
【0192】
本発明者らは、Ser/Thrキナーゼのリン酸化についての有用な反応緩衝液は、20mM Tris、pH 7.5;15mM MgCl2;1mM EGTA;5mM β-グリセロリン酸塩;5% グリセロール;1mM ATP(別個のストックから添加);0.2mM DTT(別個のストックから添加);1.5mM CaCl2(PKCのみ;別個のストックから添加);2.5ug/mL ホスファチジルセリン(PKCのみ;別個のストックから添加);および0.5ug/mL ジアシルグリセロール(PKCのみ;別個のストックから添加)を含むことを見出した。
【0193】
あるいは、本発明者らは、Tyrキナーゼのリン酸化についての有用な反応緩衝液は、20mM Tris、pH 7.5;5mM MgCl2;1mM EGTA;5mM β-グリセロリン酸塩;5% グリセロール;1mM ATP(別個のストックから添加);および0.2mM DTT(別個のストックから添加)を含むことを見出した。
【0194】
キナーゼ活性センサ(100μMストックを調製する):適切な量のペプチド基質溶液(1mM)を1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液を用いて10倍に希釈する(例えば、1mMペプチド10μL+1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液90μL)。
【0195】
ATP溶液(2mMストックを調製する):適切な量の100mM ATP溶液を1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液を用いて50倍に希釈する(例えば、100mM ATP 10μL+1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液490μL)。
【0196】
細胞溶解物:
上記細胞溶解物を0.5〜1mg/mLの全タンパク質にまでOmnia(商標)細胞溶解緩衝液を用いて希釈する。このアッセイに使用する細胞溶解物タンパク質の量は、個々の細胞株におけるキナーゼ酵素の量および活性に応じて変動する。
【0197】
本発明者らは、粗細胞溶解物または粗組織溶解物由来のキナーゼのキナーゼ活性を保持するための有用な反応緩衝液は、50mM Tris、pH 7.5;150mM NaCl;2mM EGTA;30mM NaF;10mM Na4P2O7;100mM Na3VO4;1% Triton X-100;50mM β-グリセロリン酸塩;1mM DTT;Sigma Protease Inhibitorカクテル(カタログ番号 P8340)およびSigma Phosphatase Inhibitorカクテル1(カタログ番号 P2850)を含むことを見出した。
【0198】
キナーゼ混合物(1×ストックを調製する):
適切な量のキナーゼ溶液を1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液を用いて希釈する(例えば、キナーゼ混合物10μL+1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液290μL)。
【0199】
キナーゼ対照:
組換えキナーゼ酵素を、細胞溶解物中でのキナーゼの活性を定量するための正の対照として使用することができる。
【0200】
手順:
Omnia(商標)細胞溶解緩衝液中に調製した25-100μgの全タンパク質を含有する細胞溶解物100μLを、抗体をコーティングしたプレートのストリップ中の各試料ウェルに加える。このプレートをAdhesive Plate Cover Stripでシールし、そして室温で2時間インキュベーションする。細胞溶解物を取り除いて捨て、ウェルおよびプレートを200μLの洗浄緩衝液で数回洗浄する。洗浄緩衝液を吸引するかまたは傾瀉する。洗浄と洗浄との間には、プレートを吸収紙上でしっかりとたたくことによってすべての残留液体を取り除く。
【0201】
30μLのキナーゼ混合物を、20μLのキナーゼ活性センサ溶液(100μM)および50μLのATP(2mM)に加える。反応混合物中のキナーゼ活性センサの最終濃度は20μMであり、ATPの最終濃度は1mMである。反応物の最終体積は100μLである。
【0202】
この溶液を30℃で1時間インキュベーションする。このプレートを蛍光プレートリーダー(例えば、Molecular DevicesによるSpectraMax M5(登録商標)またはこれと同等の機器)に移す。蛍光の値を、反応速度論モードで、30℃で5時間まで、360nmの励起波長および485nmの発光波長で30秒毎に各ウェルから読み取る。
【0203】
このアッセイ手順は、IPキナーゼ活性アッセイキット、カタログ番号KNZ7011, Omnia(商標), B-RafについてのPlate IPキットにも記載されている。これを本明細書中に参考として援用する。
【0204】
実施例4:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるAkt3活性の測定
NIH3T3細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでPDGF A/B(50ng/mL、10分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、Akt3活性をアッセイした。PDGF処理した試料は、1.24RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.28RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が4.42という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.28RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 25を使用して、実施例3のアッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図4に示す。
【0205】
実施例5:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるERK1/2活性の測定
NIH3T3細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでPDGF A/B(50ng/mL、10分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、ERK1/2活性をアッセイした。PDGF処理した試料は、1.55RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.27RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が5.7という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.27RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 41を使用して、実施例3のアッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図5に示す。
【0206】
実施例6:PDGF処理したMCF-7細胞または対照MCF-7細胞由来の粗溶解物におけるp70-S6K活性の測定
MCF-7細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでインスリン(100nM、10分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、p70-S6K活性をアッセイした。インスリン処理した試料は、1.13RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.12RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が9.4という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.12RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 42を使用して、アッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。
【0207】
実施例7:PMA処理したHeLa細胞または対照HeLa細胞由来の粗溶解物におけるRSK活性の測定
HeLa細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでPMA(200nM、30分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、RSK活性をアッセイした。PMA処理した試料は、3.17RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.64RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が4.95という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.64RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 30を使用して、アッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図7に示す。
【0208】
実施例8:c-SrcでトランスフェクトしたCEF細胞由来の粗溶解物におけるc-Src活性の測定
c-Srcでトランスフェクトしたニワトリ胚線維芽(CEF)細胞溶解液および偽トランスフェクトしたニワトリ胚線維芽(CEF)細胞溶解液を、Thomasら、(1999) J. Biol. Chem., 74:36684-36692に記載されるように調製した。c-SrcでトランスフェクトしたCEF試料は50RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.048RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が10.5という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.05RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 48を使用して、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図8に示す。
【0209】
実施例9:NGF処理したPC12細胞または対照PC12細胞由来の粗溶解物におけるB-Raf活性の測定
PC12細胞を100mmのペトリ皿に播種し、2.5%のウシ胎仔血清および15%のウマ血清を含むDMEM中で増殖させた。次いで、細胞を、NGF(50ng/mL、15分)または対照培地で処理した。細胞溶解物を調製し、B-Raf活性を実施例3に記載したようにアッセイした。NGF処理した処理した試料は、150分のインキュベーションでプラトー(3200RFU)に到達した蛍光シグナルを生成したが、他方、対照グループは、反応開始後240分でプラトーに到達した。活性化したMK2酵素のレベルを測定するために使用したSEQ ID NO: 27とのカスケード反応を使用して、アッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図9に示す。
【0210】
実施例10:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるERK1/2活性の測定
NIH3T3細胞を100mmのペトリ皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で増殖させた。次いで、細胞をPDGF(50ng/mL、15分)または対照培地で処理した。次いで、細胞溶解液を調製し、実施例1で説明したようにして、ERK1/2活性をアッセイした。PDGF処理した試料は、335分のインキュベーションでプラトーに到達した3000RFUの蛍光シグナルを生成したが、他方、対照グループは845RFUの蛍光シグナルを生成した。活性化したMK2酵素のレベルを測定するために使用したSEQ ID NO: 27とのカスケード反応を使用して、実施例3で説明したようにして、活性をアッセイした結果を図10に示す。
【0211】
実施例11:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるMEK1活性の測定
NIH3T3細胞を100mmのペトリ皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で増殖させた。次いで、細胞をPDGF(50ng/mL、15分)または対照培地で処理した。次いで、細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明したようにして、MEK1活性をアッセイした。PDGF処理した試料は、250分のインキュベーションで平坦部プラトーに到達した3650RFUの蛍光シグナルを生成したが、他方、対照グループは1050RFUの蛍光シグナルを生成した。活性化したMK2酵素のレベルを測定するために使用したSEQ ID NO: 27とのカスケード反応を使用して、アッセイ手順の節で説明したようにして、活性をアッセイした。結果を図11に示す。
【0212】
実施例12:アニソマイシン処理したRAW細胞または対照RAW細胞由来の粗溶解物におけるp38 MAPK活性の測定
RAW細胞を100mmのペトリ皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で増殖させた。次いで、細胞をアニソマイシン(10μg/mL、15分)または対照培地で処理した。次いで、細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明したようにして、p38 MAPK活性をアッセイした。アニソマイシン処理した試料は、60分のインキュベーションでプラトーに到達した3350RFUの蛍光シグナルを生成したが、他方、対照グループは1250RFUの蛍光シグナルを生成した。活性化したMK2酵素のレベルを測定するために使用したSEQ ID NO: 27とのカスケード反応を使用して、アッセイ手順の節で説明したようにして、活性をアッセイした。結果を図12に示す。
【0213】
上記の引用文献の各々を、あたかもそれらの全体が本明細書中に示されたかのように、本明細書中に参考として援用する。
【図面の簡単な説明】
【0214】
【図1】本発明の方法を使用して評価した場合のp38キナーゼのキナーゼ活性を図示する。
【図2】本発明の方法を使用して評価した場合のErk1/2キナーゼのキナーゼ活性を図示する。
【図3】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるAkt1活性を図示する。
【図4】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるAkt3活性を図示する。
【図5】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるERK1/2活性を図示する。
【図6】PDGF処理したMCF-7細胞または対照MCF-7細胞由来の粗溶解物におけるp70-S6K活性を図示する。
【図7】PMA処理したHeLa細胞または対照HeLa細胞由来の粗溶解物におけるRSK活性を図示する。
【図8】c-SrcでトランスフェクトしたCEF細胞由来の粗溶解物におけるc-Src活性を図示する。
【図9】NGF処理したPC12細胞または対照PC12細胞由来の粗溶解物におけるB-Raf活性を図示する。
【図10】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるERK1/2活性を図示する。
【図11】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるMEK1活性を図示する。
【図12】アニソマイシン処理したRAW細胞または対照RAW細胞由来の粗溶解物におけるp38 MAPK活性を図示する。
【図13】種々のキナーゼ標的についてのOmniaチロシンキナーゼ組換え体アッセイSN比を図示する。ここで、図の各々についてのキナーゼ認識モチーフは以下のとおりである:図13AはSEQ ID NO: 42(約2.8倍)に対応し;図13BはSEQ ID NO: 43(約2.2倍)に対応し;図13CはSEQ ID NO: 45(約2.4倍)に対応し;図13DはSEQ ID NO: 44(約1.8倍)に対応し;図13EはSEQ ID NO: 46(約8.3倍)に対応し;図13FはSEQ ID NO: 48(約6.8倍)に対応し;図13GはSEQ ID NO: 47(約7.9倍)に対応し;そして図13HはSEQ ID NO: 49(約6.9倍)に対応する。
【図14】Akt/PKBキナーゼについての細胞ベースの(電磁ビーズ捕捉)キナーゼアッセイを図示する。ヒツジ抗マウスIgGを固定化したDynabeads M-280を、Aktマウスモノクローナル抗体(Invitrogen)とともに使用した。2ugの抗Akt mAbを400ugの溶解物に添加し、4℃で一晩インキュベーションした。20ulのDynabeadsを、4℃で2時間各試料に添加し、次いでビーズを3回洗浄した。20uMのAktideを1mM ATPとともに添加し、結果をM5中で5時間読み取った。単離およびキナーゼ活性センサは、選択性および調整可能なシグナルを増加させた。
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本願は、2006年1月18日出願の米国仮出願第60/759,919号および2006年7月7日出願の米国仮出願第60/819,432号への優先権を主張する。これらの仮出願の内容は、あたかもそれらが本明細書中にすべて示されたかのように、参考として援用する。
【0002】
発明の分野
本発明は、興味ある特異的キナーゼの活性を検出および/または測定するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
プロテインキナーゼは、多くの異なる疾患の形成において役割を果たしていると信じられている。それゆえ、新しい薬物候補および治療プロトコルが、プロテインキナーゼ活性およびその活性に影響を及ぼす分子を理解して同定するための方法を使用して、同定されている。
【0004】
プロテインキナーゼは、アデノシン三リン酸(ATP)から、ペプチドまたはたんぱく質配列中のセリン、トレオニンまたはチロシン残基へのリン酸基の移動を触媒する。プロテインキナーゼは、細胞内の調節のすべての局面に関与する。キナーゼ活性をアッセイするための従来の方法は、不連続的であり、32Pで標識されたATPを必要とし、これは特別の取り扱いを必要とする。多くの会社が特別の蛍光キナーゼアッセイシステムを市販しているが、これらのすべてが不連続的であり、反応混合物のサンプリング、およびその後の、反応の生成物を蛍光部分で標識するための付加的な取り扱い段階を必要とする(例えば、Promega, Panvera,Calbiochem, Cell Signaling Technology,Molecular Devices,DiscoveRx,Upstate,PerkinElmer)。リアルタイムで実施することができる連続的な蛍光アッセイが非常に有用である。現在、このようなアッセイを可能にするセンサの例は、ほとんど存在しない。
【0005】
本明細書中に参考として援用する米国特許第6,906,104号(特許文献1)は、溶液中においてフリーのキナーゼの検出のためのスルホンアミド置換キノリン化合物(「SOX」が挙げられる)を記載する。Lawrenceらの論文は、生体細胞中のプロテインキナーゼ活性のリアルタイムの可視化を記載する(Journal of Biological Chemistry 277巻、第13号、3月29日発行、11527-11532頁, 2002(非特許文献1))。
【0006】
リアルタイムでキナーゼの活性を測定するための1つの方法は、キナーゼ認識モチーフ、すなわち特定のキナーゼが認識してリン酸化するアミノ酸配列を使用してキナーゼを捕捉することである。いったん捕捉されると、ATPがこのアッセイに添加され、次いでシグナル伝達部分がリン酸化事象の際に信号を発生させるかまたは変化させることができる。一般に、各キナーゼは、特定のキナーゼ認識モチーフについて特異的であってもよいが、キナーゼ中の標的アミノ酸の周囲にあるキナーゼ認識モチーフのアミノ酸配列には、いくつかの配列の類似性が存在する。従って、キナーゼ認識モチーフを使用して特定のキナーゼを捕捉すると、すべてが同一または類似のキナーゼ認識モチーフを認識する異なるキナーゼの集団を捕捉することになりかねない。これらのアッセイの結果は、特異的キナーゼの活性を同定および/または測定しようとするときは、偽陽性の結果を生む傾向がある。それゆえに、偽陽性の発生を低減するためにキナーゼ活性アッセイの特異性を改善し、キナーゼ活性を評価するアッセイ結果に価値を与えることが必要である。現在、特異的キナーゼを捕捉する際のキナーゼ認識モチーフの乱雑さにより引き起こされるこの問題を克服する方法は文献には存在しない。
【0007】
【特許文献1】米国特許第6,906,104号
【非特許文献1】Lawrenceら、Journal of Biological Chemistry 277巻、第13号、3月29日発行、11527-11532頁, 2002
【発明の開示】
【0008】
発明の概要
本発明は、特異的キナーゼの活性を検出および/または測定するための方法であって、1つ以上のキナーゼを結合剤と接触させて、目的の特異的キナーゼを単離する工程を含む方法に関する。次いで、この単離されしたキナーゼを、キナーゼ活性センサと接触させる。ここで、このキナーゼ活性センサは、単離されたキナーゼが認識することができるキナーゼ認識モチーフ、および少なくとも1つのリン酸化部位を含むからなる。単離したキナーゼが存在する場合には、その単離したキナーゼは、上記キナーゼ活性センサのアミノ酸標的をリン酸化し、次いでリン酸化されたアミノ酸標的のレベルを定量することができる。
【0009】
本発明の1つの局面は、特異的キナーゼの活性を測定する方法であって、下記の工程を含む方法を提供する:
固定化結合剤を含む固体または半固体支持体を提供する工程;
固定化された結合剤を、特異的キナーゼを含む試料と接触させて、固定化した特異的キナーゼを形成する工程;
固定化した特異的キナーゼをキナーゼ活性センサと接触させ、接触した特異的キナーゼを形成する工程であって、該キナーゼ活性センサが、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドおよびキレート剤を含む、工程;
接触した特異的キナーゼを、該キナーゼがリン酸供給源および金属イオンの存在下で該ペプチドをリン酸化するのに十分な時間、インキュベーションする工程であって、該キナーゼ活性センサが、該金属イオンおよびリン酸化ペプチドと三元複合体を形成して、検出可能なシグナルを発生させる、工程;ならびに
該シグナルを検出して、それによりこの特異的キナーゼの活性を測定する工程。
【0010】
より特定の態様では、上記結合剤は、抗体またはその機能的断片を含む。
【0011】
別の態様では、上記支持体は、ガラス、プラスチック、金属、ポリマー粒子、ポリマーゲル、またはポリマー膜である。
【0012】
別の態様では、上記キナーゼ活性センサは、上記金属イオンと複合体を形成したときには、増強された蛍光シグナルを有する。別の態様では、上記キナーゼ活性センサは、さらに上記キレート剤から離れたシグナル伝達部分を含む。さらにより特定すると、上記シグナル伝達部分は、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセンまたはキサンテンを含む。
【0013】
別の態様では、上記キレート剤は、シグナル伝達部分を含む。さらにより特定すると、上記シグナル伝達部分は、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセンまたはキサンテンを含む。別の態様では、上記キレート剤は、キノリンまたはその誘導体、フェナントロリンまたはその誘導体、BAPTA、IDA、DTPAおよびその誘導体を含む。
【0014】
別の態様では、上記金属イオンは、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ga3+、Tb3+、La3+、Pb2+、Hg2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、またはSr2+である。
【0015】
別の態様では、上記ペプチドは、リン酸化されたときにマグネシウムと錯体を形成するアミノ酸を含む。
【0016】
別の態様では、上記方法は、上記固定化された特異的キナーゼをATPと接触させる工程をさらに含む。
【0017】
別のより特定の態様では、上記キナーゼ活性センサは、下記式を含む:
式中、少なくとも1つのR基は-SO2Xであり、Xは-OR''または-NR''R'''であり;
R'はヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり;
R''はC1-6アルキルであり;
R'''は水素またはアルキルであり;かつ
nは1,2、または3である。
【0018】
あるいは、上記キナーゼ活性センサは、下記式を有するかまたはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
式中、R1は、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R2は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R3は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R4は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R5は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R6は、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R7は、水素、アルキル、置換アルキル、カルボニル、または保護基であり;
R8は、水素、アルキル、置換アルキル、カルボニル、または保護基であり;
Lはリンカーであり;かつ
Yは、ペプチドである。
【0019】
より特定すれば、R2、R3、R4、R5およびR6のうちの少なくとも1つはフルオロフォアである。
【0020】
別の態様では、上記ペプチドは、SEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 133のうちの少なくとも1つである。
【0021】
本発明の別の局面は、上記ペプチドは、SEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 133のうちの少なくとも1つを含む組成物を提供する。
【0022】
本発明の別の局面は、
(a)結合剤により固定化したキナーゼ、および
(b)リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドとキレート剤とを含むキナーゼ活性センサ
を含む組成物を提供する。
【0023】
本発明の別の局面は、特異的キナーゼに結合する結合剤とキナーゼ活性センサとを含む、特異的キナーゼの活性を検出するためのキットであって、該キナーゼ活性センサが、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドおよびキレート剤を含むキットを提供する。より特定すれば、上記キットは、さらに、ATPおよび上記キレート剤およびリン酸化ペプチドの両方に対して親和性を有する金属イオンを含む。
【0024】
本発明の他の対象、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、それらは例示としてのみ提示されていることを理解すべきである。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から、当業者には明らかだからである。
【0025】
発明の詳細な説明
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が具体的な組成物またはプロセス工程に限定されないことを理解すべきである。なぜなら、このようなものは変更されてもよいからである。本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用する場合、文脈が明らかにそうではないと示していないかぎり、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は複数形の指示対象を含んでいることに留意しなくてはならない。従って、例えば、「1つのペプチド」と言うときは複数のペプチドを含み、「1つの酵素」と言うときは複数の酵素を含む、などである。
【0026】
別段の定義がされない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。以下の用語を、本明細書中で記載される場合の本発明の目的のために定義する。
【0027】
「アルキル」は、1〜10個の炭素原子、好ましくは1〜6個の炭素原子を有する1価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基である。この用語は、例として、メチル(CH3-)、エチル(CH3CH2-)、n-プロピル(CH3CH2CH2-)、イソプロピル((CH3)2CH-)、n-ブチル(CH3CH2CH2CH2-)、イソブチル((CH3)2CHCH2-)、sec-ブチル((CH3)(CH3CH2)CH-)、t-ブチル((CH3)3C-)、n-ペンチル(CH3CH2CH2CH2CH2-)およびネオペンチル((CH3)3CCH2-)のような直鎖状および分枝状ヒドロカルビル基を含む。
【0028】
「置換アルキル」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個の置換基を有するアルキル基をいい、この置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されている。
【0029】
「アルコキシ」とは、-O-アルキル基をいい、ここでアルキル基は本明細書中に定義されている。アルコキシとしては、例として、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、t-ブトキシ、sec-ブトキシ、およびn-ペントキシが挙げられる。
【0030】
「置換アルコキシ」とは、-O-(置換アルキル)をいい、ここで置換アルキルは本明細書中に定義されている。
【0031】
「アシル」とは、H-C(O)-、アルキル-C(O)-、置換アルキル-C(O)-、アルケニル-C(O)-、置換アルケニル-C(O)-、アルキニル-C(O)-、置換アルキニル-C(O)-、シクロアルキル-C(O)-、置換シクロアルキル-C(O)-、シクロアルケニル-C(O)-、置換シクロアルケニル-C(O)-、アリール-C(O)-、置換アリール-C(O)-、ヘテロアリール-C(O)-、置換ヘテロアリール-C(O)-、複素環式-C(O)-、および置換複素環式-C(O)-の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書中で定義されているとおりである。アシルとしては、「アセチル」基CH3C(O)-が挙げられる。
【0032】
「アシルアミノ」とは、-NRC(O)アルキル、-NRC(O)置換アルキル、-NRC(O)シクロアルキル、-NRC(O)置換シクロアルキル、-NRC(O)シクロアルケニル、-NRC(O)置換シクロアルケニル、-NRC(O)アルケニル、-NRC(O)置換アルケニル、-NRC(O)アルキニル、-NRC(O)置換アルキニル、-NRC(O)アリール、-NRC(O)置換アリール、-NRC(O)ヘテロアリール、-NRC(O)置換ヘテロアリール、-NRC(O)複素環式、および-NRC(O)置換複素環式の基をいい、ここでRは水素またはアルキルであり、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中で定義されるとおりである。
【0033】
「アシルオキシ」とは、アルキル-C(O)O-、置換アルキル-C(O)O-、アルケニル-C(O)O-、置換アルケニル-C(O)O-、アルキニル-C(O)O-、置換アルキニル-C(O)O-、アリール-C(O)O-、置換アリール-C(O)O-、シクロアルキル-C(O)O-、置換シクロアルキル-C(O)O-、シクロアルケニル-C(O)O-、置換シクロアルケニル-C(O)O-、ヘテロアリール-C(O)O-、置換ヘテロアリール-C(O)O-、複素環式-C(O)O-、および置換複素環式-C(O)O-の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0034】
「アミノ」とは、-NH2基をいう。
【0035】
「置換アミノ」とは、-NR'R''基をいい、ここでR'およびR''は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、置換複素環式、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アルケニル、-SO2-置換アルケニル、-SO2-シクロアルキル、-SO2-置換シクロアルキル、-SO2-シクロアルケニル、-SO2-置換シクロアルケニル、-SO2-アリール、-SO2-置換アリール、-SO2-ヘテロアリール、-SO2-置換ヘテロアリール、-SO2-複素環式、および-SO2-置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR'およびR''が両方とも水素でない場合には、R'およびR''は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。R'が水素であり、R''がアルキルである場合、この置換アミノ基は、本明細書中でアルキルアミノと呼ばれることがある。R'およびR''がアルキルである場合、この置換アミノ基は、本明細書中でジアルキルアミノと呼ばれることがある。一置換アミノと呼ぶときは、R'またはR''のいずれかは水素であるが、両方が水素ではないことを意味する。二置換アミノと呼ぶときは、R'もR''も水素ではないことを意味する。
【0036】
「アミノカルボニル」とは、-C(O)N R10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0037】
「アミノチオカルボニル」とは、-C(S)NR10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0038】
「アミノカルボニルアミノ」とは、-NRC(O)NR10R11基をいい、ここでRは水素またはアルキルであり、R10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0039】
「アミノチオカルボニルアミノ」とは、-NRC(S)NR10R11基をいい、ここでRは水素またはアルキルであり、R10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0040】
「アミノカルボニルオキシ」とは、-O-C(O)NR10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0041】
「アミノスルホニル」とは、-SO2NR10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0042】
「アミノスルホニルオキシ」とは、-O-SO2NR10R11基をいい、ここでR10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0043】
「アミノスルホニルアミノ」とは、-NR-SO2NR10R11基をいい、ここでRは水素またはアルキルであり、R10およびR11は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0044】
「アミジノ」とは、-C(=NR12)R10R11基をいい、ここでR10、R11およびR12は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここでR10およびR11は必要に応じて連結し、それらが結合する窒素と一緒になって複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0045】
「アリール」または「Ar」とは、1個の環(例えば、フェニル)または多数個の縮合環(例えば、ナフチルまたはアントリル)を有する、6〜14個の炭素原子を有する1価の芳香族炭素環式基をいい、この縮合環は、結合点が芳香族炭素原子上にあれば、芳香族であってもなくてもよい(例えば、2-ベンゾオキザゾリノン、2H-1,4-ベンソオキサジン-3(4H)-オン-7-イルなど)。好ましいアリール基としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【0046】
「置換アリール」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個の置換基で置換されたアリール基をいい、この置換基は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されている。
【0047】
「アリールオキシ」とは、-O-アリール基をいい、ここでアリールは、本明細書中で定義されるとおりであり、このアリールオキシとしては、例としてフェノキシおよびナフトキシが挙げられる。
【0048】
「置換アリールオキシ」とは、-O-(置換アリール)基をいい、ここで置換アリールは本明細書中で定義されるとおりである。
【0049】
「アリールチオ」とは、-S-アリール基をいい、ここでアリールは本明細書中で定義されるとおりである。
【0050】
「置換アリールチオ」とは、-S-(置換アリール)基をいい、置換アリールは本明細書中で定義されている。
【0051】
「アルケニル」とは、2〜6個の炭素原子、好ましくは2〜4個の炭素原子を有し、かつ少なくとも1つ、好ましくは1〜2つのアルケニル不飽和部位を有するアルケニル基をいう。このような基としては、例えば、ビニル、アリル、およびブト-3-エン-1-イルが挙げられる。
【0052】
「置換アルケニル」とは、1〜3個の置換基、好ましくは1〜2個の置換基を有するアルケニル基をいい、この置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されているが、ただし、どのヒドロキシ置換基もビニル(不飽和)炭素原子に結合していない。
【0053】
「アルキニル」とは、2〜6個の炭素原子、好ましくは2〜3個の炭素原子を有し、かつ少なくとも1つ、好ましくは1〜2つのアルキニル不飽和部位を有するアルキニル基をいう。
【0054】
「置換アルキニル」とは、1〜3個の置換基、好ましくは1〜2個の置換基を有するアルキニル基をいい、この置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されているが、ただし、どのヒドロキシ置換基もアセチレン炭素原子に結合していない。
【0055】
「カルボニル」とは、2価の-C(O)-基をいい、これは-C(=O)-と等価である。
【0056】
「カルボキシル」または「カルボキシ」とは、-COOHまたはその塩をいう。
【0057】
「カルボキルエステル」または「カルボキシエステル」とは、-C(O)O-アルキル、-C(O)O-置換アルキル、-C(O)O-アルケニル、-C(O)O-置換アルケニル、-C(O)O-アルキニル、-C(O)O-置換アルキニル、-C(O)O-アリール、-C(O)O-置換アリール、-C(O)O-シクロアルキル、-C(O)O-置換シクロアルキル、-C(O)O-シクロアルケニル、-C(O)O-置換シクロアルケニル、-C(O)O-ヘテロアリール、-C(O)O-置換ヘテロアリール、-C(O)O-複素環式、および-C(O)O-置換複素環式の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書中で定義されているとおりである。
【0058】
「(カルボキシエステル)アミノ」とは、-NR-C(O)O-アルキル、置換-NR-C(O)O-アルキル、-NR-C(O)O-アルケニル、-NR-C(O)O-置換アルケニル、-NR-C(O)O-アルキニル、-NR-C(O)O-置換アルキニル、-NR-C(O)O-アリール、-NR-C(O)O-置換アリール、-NR-C(O)O-シクロアルキル、-NR-C(O)O-置換シクロアルキル、-NR-C(O)O-シクロアルケニル、-NR-C(O)O-置換シクロアルケニル、-NR-C(O)O-ヘテロアリール、-NR-C(O)O-置換ヘテロアリール、-NR-C(O)O-複素環式、および-NR-C(O)O-置換複素環式の基をいい、ここでRはアルキルまたは水素であり、そしてアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書中で定義されているとおりである。
【0059】
「(カルボキシエステル)オキシ」とは、-O-C(O)O-アルキル、置換-O-C(O)O-アルキル、-O-C(O)O-アルケニル、-O-C(O)O-置換アルケニル、-O-C(O)O-アルキニル、-O-C(O)O-置換アルキニル、-O-C(O)O-アリール、-O-C(O)O-置換アリール、-O-C(O)O-シクロアルキル、-O-C(O)O-置換シクロアルキル、-O-C(O)O-シクロアルケニル、-O-C(O)O-置換シクロアルケニル、-O-C(O)O-ヘテロアリール、-O-C(O)O-置換ヘテロアリール、-O-C(O)O-複素環式、および-O-C(O)O-置換複素環式の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式および置換複素環式は、本明細書中で定義されているとおりである。
【0060】
「シアノ」とは、-CN基をいう。
【0061】
「シクロアルキル」とは、1つまたは複数個の環式環(縮合環系、架橋環系、およびスピロ環系が挙げられる)を有する、3〜10個の炭素原子の環状アルキル基をいう。適切なシクロアルキル基の例としては、例えば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【0062】
「シクロアルケニル」とは、1つまたは複数個の環式環を有し、かつ少なくとも1つの>C=C<環不飽和、好ましくは1〜2つの>C=C<環不飽和部位を有する、3〜10個の炭素原子の非芳香族環状アルキル基をいう。
【0063】
「置換シクロアルキル」および「置換シクロアルケニル」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個の置換基を有するシクロアルキル基またはシクロアルケニル基をいい、この置換基は、オキソ、チオン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、SO3H、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群より選択され、ここで上記の置換基は、本明細書中に定義されている。
【0064】
「シクロアルキルオキシ」とは、-O-シクロアルキルをいう。
【0065】
「置換シクロアルキルオキシ」とは、-O-(置換シクロアルキル)をいう。
【0066】
「シクロアルキルチオ」とは、-S-シクルアルキルをいう。
【0067】
「置換シクロアルキルチオ」とは、-S-(置換シクロアルキル)をいう。
【0068】
「シクロアルケニルオキシ」とは、-O-シクロアルケニルをいう。
【0069】
「置換シクロアルケニルオキシ」とは、-O-(置換シクロアルケニル)をいう。
【0070】
「シクロアルケニルチオ」とは、-S-シクロアルケニルをいう。
【0071】
「置換シクロアルケニルチオ」とは、-S-(置換シクロアルケニル)をいう。
【0072】
「FMOC」とは、下記の一般式を有する化合物(またはその誘導体)をいう。
【0073】
「グアニジノ」とは、-NHC(=NH)NH2基をいう。
【0074】
「置換グアニジノ」とは-NR13C(=NR13)N(R13)2をいい、ここで各R13は、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群より独立に選択され、そしてここで共通のグアニジノ窒素原子に結合した2つのR13基は、少なくとも1つのR13が水素ではない場合は、必要に応じてそれらに結合する窒素と一緒に連結し、複素環式基もしくは置換複素環式基を形成し、ここで上記置換基は本明細書中に定義されるとおりである。
【0075】
「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードをいう。
【0076】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」とは、-OH基をいう。
【0077】
「ヘテロアリール」とは、環内に1〜10個の炭素原子および1〜4個のヘテロ原子を有する芳香族基をいい、このへテロ原子は、環内の酸素、窒素および硫黄からなる群より選択される。このようなヘテロアリール基は1つの環(例えば、ピリジニルまたはフラニル)または多数個の縮合環(例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル)を有することができ、ここで結合点がこの芳香族ヘテロアリール基の原子を通っているかぎり、この縮合環は芳香族であってもなくてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもいなくてもよい。1つの態様では、このヘテロアリール基の窒素および/または硫黄環原子(複数個であってもよい)は、必要に応じて酸化されてN-オキシド(N→O)、スルフィニル、またはスルホニル部分となっていてもよい。好ましいヘテロアリールとしては、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、およびフラニルが挙げられる。
【0078】
「置換ヘテロアリール」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個の置換基で置換されているヘテロアリール基をいい、この置換基は置換アリールについて定義した置換基と同一の群からなる群より選択される。
【0079】
「ヘテロアリールオキシ」とは、-O-ヘテロアリール基をいう。
【0080】
「置換ヘテロアリールオキシ」とは、-O-(置換ヘテロアリール)基をいう。
【0081】
「ヘテロアリールチオ」とは、-S-ヘテロアリール基をいう。
【0082】
「置換ヘテロアリールチオ」とは、-S-(置換ヘテロアリール)基をいう。
【0083】
「複素環」もしくは「複素環式」または「ヘテロシクロアルキル」もしくは「ヘテロシクリル」とは、環内に1〜10個の炭素原子および1〜4個のヘテロ原子を有する、1つまたは複数個の環式環を有する、飽和または不飽和の基をいい、ここでこのヘテロ原子は酸素、窒素および硫黄からなる群より選択され、この環式環としては縮合環系、架橋環系、およびスピロ環系が挙げられ、この縮合環系では、1つ以上のその環は、結合点がその非芳香環を通っているかぎり、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであってもよい。1つの態様では、このヘテロアリール基の窒素および/または硫黄原子(複数個であってもよい)は、必要に応じて酸化されてN-オキシド、スルフィニル、またはスルホニル部分となっていてもよい。
【0084】
「置換複素環式」または「置換ヘテロシクロアルキル」または「置換ヘテロシクリル」とは、1〜5個、好ましくは1〜3個の、置換シクロアルキルについて定義したのと同じ置換基で置換されたヘテロシクリル基をいう。
【0085】
「ヘテロシクリルオキシ」とは、-O-ヘテロシクリル基をいう。
【0086】
「置換ヘテロシクリルオキシ」とは、-O-(置換ヘテロシクリル)基をいう。
【0087】
「ヘテロシクリルチオ」とは、-S-ヘテロシクリル基をいう。
【0088】
「置換ヘテロシクリルチオ」とは、-S-(置換ヘテロシクリル)基をいう。
【0089】
複素環およびヘテロアリールの例としては、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミタゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン、4,5,6,7-テトラヒドロベンゾ[b]チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ[b]チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル(チアモルホリニルとも呼ばれる)、1,1-ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、およびテトラヒドロフラニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0090】
「ニトロ」とは、-NO2基をいう。
【0091】
「オキソ」とは、原子(=O)または(-O-)をいう。
【0092】
「スピロシクリル」とは、スピロ連結(それらの環の唯一共通のメンバーである1つの原子により形成される連結)を伴うシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環を有する、3〜10個の2価の飽和環状基をいい、その例としては以下の構造が挙げられる。
【0093】
「スルホニル」とは、2価の-S(O)2-基をいう。
【0094】
「置換スルホニル」とは、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アルケニル、-SO2-置換アルケニル、-SO2-シクロアルキル、-SO2-置換シクロアルキル、-SO2-シクロアルケニル、-SO2-置換シクロアルケニル、-SO2-アリール、-SO2-置換アリール、-SO2-ヘテロアリール、-SO2-置換ヘテロアリール、-SO2-複素環式、-SO2-置換複素環式の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。置換スルホニルとしては、メチル-SO2-、フェニル-SO2-および4-メチルフェニル-SO2-のような基が挙げられる。
【0095】
「スルホニルオキシ」とは、-OSO2-アルキル、-OSO2-置換アルキル、-OSO2-アルケニル、-OSO2-置換アルケニル、-OSO2-シクロアルキル、-OSO2-置換シクロアルキル、-OSO2-シクロアルケニル、-OSO2-置換シクロアルケニル、-OSO2-アリール、-OSO2-置換アリール、-OSO2-ヘテロアリール、-OSO2-置換ヘテロアリール、-OSO2-複素環式、-OSO2-置換複素環式の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0096】
「チオアシル」とは、H-C(S)-、アルキル-C(S)-、置換アルキル-C(S)-、アルケニル-C(S)-、置換アルケニル-C(S)-、アルキニル-C(S)-、置換アルキニル-C(S)-、シクロアルキル-C(S)-、置換シクロアルキル-C(S)-、シクロアルケニル-C(S)-、置換シクロアルケニル-C(S)-、アリール-C(S)-、置換アリール-C(S)-、ヘテロアリール-C(S)-、置換ヘテロアリール-C(S)-、複素環式-C(S)-、および置換複素環式-C(S)-の基をいい、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書中に定義されるとおりである。
【0097】
「チオール」とは、-SH基をいう。
【0098】
「チオカルボニル」とは、2価の-C(S)-基をいい、これは-C(=S)-と等価である。
【0099】
「チオン」とは、原子(=S)をいう。
【0100】
「アルキルチオ」とは、-S-アルキル基をいい、ここでアルキルは、本明細書中に定義されるとおりである。
【0101】
「置換アルキルチオ」とは、-S-(置換アルキル)基をいい、ここで置換アルキルは本明細書中に定義されるとおりである。
【0102】
ヒドロキシ基、アミン基、およびスルフヒドリル基に関する、用語「保護された」または「保護基」とは、Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, T.W., Solon Wiley & Sons, New York, NY, (第1版,1981)に示される保護基のような、当業者に公知の保護基を用いて望ましくない反応から保護されたこれらの官能性の形態をいう。これらの保護基は、その刊行物中に示された手順を使用して付加または除去することができる。保護されたヒドロキシル基の例としては、ヒドロキシル基とt-ブチルメチル-クロロシラン、トリメチルクロロシラン、トリイソプロピルクロロシラン、トリエチルクロロシランのような反応剤(これらに限定されない)との反応により得られるもののようなシリルエーテル;メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、t-ブトキシメチルエーテル、2-メトキシエトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、1-エトキシエチルエーテル、アリルエーテル、ベンジルエーテルのような置換メチルエーテルおよびエチルエーテル(これらに限定されない);ベンゾイルホルメート、ホルメート、アセテート、トリクロロアセテート、およびトリフルオロアセテートのようなエステル(これらに限定されない)が挙げられるが、これらに限定されない。保護されたアミン基の例としては、ベンジルもしくはジベンジル、アミド(例えば、ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、およびベンズアミド)、イミド(例えば、フタルイミド、BOC(tBoc)、FMOCおよびジチオスクシンイミド)などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、アミンについての保護基は、FMOC基である。保護されたスルフヒドリルの例としては、S-ベンジルチオエーテルおよびS-4-ピコリルチオエーテルのようなチオエーテル、ヘミチオアセタール、ジチオアセタールおよびアミノチオアセタールのような置換S-メチル誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0103】
「立体異性体(単数または複数)」とは、1つ以上の立体中心のキラリテイが異なる化合物をいう。立体異性体としては、エナンチオマーおよびジアステレオマーが挙げられる。
【0104】
「互変異性体」とは、プロトンの位置が異なる化合物の互変の形態をいい、例えばエノール-ケトおよびイミン-エナミン互変異性体、または環の-NH-部分と環の=N-部分の両方に結合した環原子を含むヘテロアリール基(例えば、ピラゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾールおよびテトラゾール)の互変異性形態をいう。
【0105】
本明細書中で使用する場合の用語「親和性」とは、2つの分子、例えば金属キレート化合物および金属イオンの結合性相互作用の強さをいう。
【0106】
本明細書中で使用する場合の用語「検出可能な応答」とは、観察によるかまたは計測によるかのいずれかによって直接または間接に検出可能なシグナルの発生または変化をいう。代表的には、この検出可能な応答は、波長分布パターン、または吸光度もしくは蛍光の強度の変化、あるいは光散乱、蛍光寿命、蛍光偏光の変化、あるいはこれらのパラメータの組合せをもたらす光学的応答である。あるいは、この検出可能な応答は、上記色素が生来的に蛍光性であり、金属イオンもしくはリン酸化された標的分子との結合の際にシグナルの変化を生じない場合には、シグナルの発生である。あるいは、この検出可能な応答は、シグナル(例えば、リン酸化された標的分子を含む本発明の三元複合体の形成の結果として、試料の一部分(ゲル中、ブロット上、もしくはアレイ、マイクロプレートのウェル中、微小流体チャンバー中、もしくは微小粒子上)に空間的に局在するようになる検出可能な標識の、色、蛍光、放射活性、もしくは別の物理的特性)の結果である。
【0107】
本明細書中で使用する場合の用語「酵素」とは、生命体により、または天然タンパク質分子の化学変性を通して生成されるタンパク質分子であって、反応の完了時にそれ自身が破壊されたり変化したりすることなく他の物質の化学反応を触媒するものをいう。他の物質の例としては、化学発光性物質、発色性物質、蛍光発生物質またはタンパク質ベースの基質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0108】
「キナーゼ」は、基質をリン酸化することができる酵素である。本明細書中に記載する方法および成分が非常に豊富なおかげで、本発明は、すべてのキナーゼに由来する活性の検出において用途を見出すことができる。本発明での使用のために好ましいキナーゼとしては、LCK、IRK(=INSR=イスリン受容体)、IGF-1受容体、SYK、ZAP-70、IRAK1、BLK、BMX、BTK、FRK、FGR、FYN、HCK、ITK、LYN、TEC、TXK、YES、ABL、SRC、EGF-R(=ErbB-1)、ErbB-2(=NEU=HER2)、ErbB-4、FAK、FGF1R(=FGR-1)、FGF2R(=FGR-2)、IKK-1(=IKK-α=CHUK)、IKK-2 (=IKK-β)、MET(=c-MET)、NIK、PDGF受容体α、PDGF受容体β、TIE1、TIE2(=TEK)、VEGFR1 (=FLT-1)、VEGFR2(=KDR)、FLT-3、FLT-4、KIT、CSK、JAK1、JAK2、JAK3、TYK2、RIP、RIP-2、LOK、TAKI、RET、ALK、MLK3、COT、TRKA、PYK2、アクチビン様キナーゼ(Alkl-7)、EPHA(1-8)、EPHB(1-6)、RON、GSK3(AおよびB)、Ilk、PDK1、SGK、Fes、Fer、MatK、Ark(1-3)、Plk(1-3)、LimK(1および2)、RhoK、Pak(1-3)、Raf(A、B、およびC)、PknB、CDK(1-10)、Chk(1および2)、CamK(I-IV)、CamKK、CK1、CK2、PKR、Jnk(1-3)、EPHB4、UL13、ORF47、ATM、PKA(α、β、およびγ)、P38(α、β、およびγ)、Erk(1-3)、PKB(すべてのPKBサブタイプを含む)(=AKT-1、AKT-2、AKT-3)ならびにPKC(すべてのPKCサブタイプを含む)ならびにこれらのキナーゼのすべてのサブタイプが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましいキナーゼは、チロシンおよび/またはセリン/トレオニンキナーゼである。
【0109】
用語「キナーゼ活性センサ」とは、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチド基質、キレート剤および検出部分を含む化合物または組成物をいい、ここでこの検出部分は、それ自身でキレート剤であるか、または付加的な検出部分(例えば、フルオロフォア)を含んでいる。本発明の好ましいキナーゼ活性センサは、以下の式を有する:
ここで、これら可変要素は、本明細書中に記載されるとおりである。
【0110】
本明細書中で使用する場合の用語「フルオロフォア」とは、生来的に蛍光性であるか、または生物学的化合物または金属イオンに結合するときに蛍光の変化を示す、すなわち蛍光発生性である組成物をいう。フロオロフォアは、フルオロフォアの溶解性、分光学的特性または物理的特性を変化させる置換基を含んでいてもよい。多数のフルオロフォアが当業者に公知であり、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセンおよびキサンテン(フルオレセイン、ローダミン、ロドールが挙げられる)、ならびに半導体ナノ結晶およびRICHARD P.HAUGLAND,MOLECULAR PROBES HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(第10版,2005)に記載されている他のフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されない。
【0111】
用語「リンカー」とは、単独の共有結合としてか、またはC、N、O、SおよびPからなる群より選択される、1〜30個の非水素原子を組み込む一連の安定な共有結合のとしてのいずれかで、2つの粒子を連結することができる2価の部分をいう。これらの原子は、フルオロフォア、キノリン基とアミノ酸とを共有結合で結合し、本発明のキナーゼ活性センサを形成する。例示的なリンクメンバーとしては、-C(O)NH-、-C(O)O-、-NH-、-S-、-O-などが挙げられる。例示的なリンカーとしては、共有結合、アミノ酸、スクシンイミジル誘導体、メチン、およびアルケニル基、アルキルおよび置換アルキル基、エチレン、プロピレン、ポリエチレン、およびポリプロピレングリコール、エステル、エーテル、アミド、カルバメート、およびカルボニル含有部分、ジオン、スクアレート、アジピン酸、ならびにSusan WongによるChemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking中に記載された他の基が挙げられる。
【0112】
「切断可能なリンカー」は、反応または条件の結果によって破壊されてもよい、1つ以上の切断可能な基を有するリンカーである。用語「切断可能な基」とは、放出される部分を結合体の残りの部分に連結している結合を切断することによって、結合体の残りの部分から、結合体の部分(例えば、レポーター分子、担体分子、または固体支持体)の放出を可能にする部分をいう。このような切断は、性質上化学的であるか、または酵素によって媒介されるかのいずれかである。例示的な酵素により切断可能な基としては、天然アミノ酸または天然アミノ酸で終結するペプチド配列が挙げられる。
【0113】
本発明は、特異的キナーゼの活性を検出および/または測定するための方法に関する。「特異的キナーゼ」は、本発明の方法を実行する前に、活性および/または構造についての少なくともいくつかの情報が実行者に公知である、目的の公知のキナーゼを示すために使用する。
【0114】
上記方法は、1つ以上のキナーゼを含む試料を、結合剤と接触させて、目的の特異的キナーゼを単離する工程を含む。この1つ以上のキナーゼは、任意の環境(細胞、組織、体液、緩衝液または別の合成組成物もしくは合成流体が挙げられるが、これらに限定されない)中に存在していてもよい。1つより多いタイプのキナーゼが存在する場合には、キナーゼが集合して、複数のキナーゼまたはキナーゼの一群となる。本明細書中で理解できるように、そのキナーゼの一群のあらゆるメンバーが特異的キナーゼである必要はない。むしろ、異なるキナーゼの一群を含み得る試料は、アッセイされる特異的キナーゼを含むはずであるか、または含むものと考えてよい。
【0115】
この特異的キナーゼは、次いで、この特異的キナーゼを特異的に結合することができる結合剤に暴露されるか、または接触されねばならない。本明細書中で使用する場合、用語「結合剤」は、公知のバイオマーカーに特異的に結合する組成物を意味するために使用する。結合剤の例としては、受容体、抗体、およびそれらの機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、用語「抗体」は、供給源およびその断片を生成した方法にかかわらず、免疫グロブリン分子およびその機能的断片を意味するために使用する。本明細書中で使用する場合、免疫グロブリンの「機能的断片」は、結合標的に特異的に結合する免疫グロブリン分子の一部分である。従って、本明細書中で使用する場合の用語「抗体」は、イソタイプをもつ抗体のような抗体全体を網羅し、このイソタイプをもつ抗体としては、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEおよびIgYが挙げられるが、これらに限定されない。抗体全体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、それらはヒト化されていても、キメラであってもよい。本明細書中で使用する場合の用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体に限定されない。むしろ、用語「モノクローナル抗体」とは、単一のクローンに由来する抗体をいい、それが生成された方法について言うのではない。この単一のクローンとしては、任意の真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンが挙げられる。用語「抗体」はまた、免疫グロブリンの機能的断片を包含し、この機能的断片としては、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2 断片およびFd断片が挙げられる。「抗体」はまた、VLおよび/またはVHドメインの少なくとも一部分を含む免疫グロブリンの断片を包含し、この断片としては、単鎖抗体、単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合したFvなどが挙げられる。
【0116】
本発明において使用する抗体は、単一特異的であってもよく、二種特異的(bispecific)であってもよく、三種特異的(trispecific)であってもよく、まはさらにより多くの多特異性であってもよい。さらに、上記抗体は、1価、2価、3価またはさらにより多価であってもよい。さらに、本発明の抗体は、任意の動物起源由来であってもよく、この動物としては、トリおよび哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な態様では、上記抗体は、ヒト、マウス、ネズミ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ウマ、またはニワトリ由来である。本明細書中で使用する場合、「ヒト」の抗体としては、ヒトの免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が挙げられ、そしてヒトの免疫グロブリンのライブラリから、または1つ以上のヒトの免疫グロブリンのために遺伝子組み換えされた動物から単離されて、固有の免疫グロブリンを発現しない抗体(米国特許第5,939,598号に記載されているものなど)を含む。この特許文献を本明細書中に参考として援用する。
【0117】
本発明において使用する抗体は、その抗体が認識するかまたは特異的に結合するポリペプチドのエピトープ(単数もしくは複数)または部分(単数もしくは複数)によって、記載するか特定するかしてもよい。または、上記抗体は抗原の特異的なコンホーメションに結合する能力に基づいて、記載してもよい。1つの態様では、本発明の方法において使用する単一の抗体は、目的の特異的キナーゼについて提示されるエピトープに対して特異的である。
【0118】
本発明において使用する抗体の特異性はまた、抗原(エピトープ)に対するそれらの結合親和性によって、またはそれらの交差反応性によって記載するか特定するかしてもよい。本発明に網羅される結合親和性の具体例としては、5×l0-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×l0-4M、10-4 M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×l0-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12 M、10-12M、5×10-13M、10-13 M、5×10-14M、10-14M、5×10-15Mまたは10-15Mよりも小さい解離定数(Kd)を有する結合親和性が挙げられるが、これらに限定されない。
【0119】
本発明において使用する抗体はまた、共有結合によって抗体が抗イディオタイプの応答を生成することが妨げられないように、例えば任意のタイプの分子を共有結合によってその抗体に結合することによって改変した誘導体を包含する。抗体に対する改変の例としては、グルコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他の組成物(例えば、シグナル伝達部位)への連結、標識などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記抗体は、固体基材に連結または結合されていてもよく、この固体基材としては、ビーズ、粒子、ガラス表面、プラスチック表面、セラミック表面、金属表面が挙げられるが、これらに限定されない。抗体を表面に結合する方法は、Coligan, JEら、Current Protocols In Immunology, Wiley Intersciences' (1993)およびHarlowら、Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 (1988)に記載されており、これらの刊行物を参考として援用する。多くの化学的改変のいずれもが、公知の技術によって実施することができ、この技術としては、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない。さらには、上記誘導体は1つ以上の非古典的なアミノ酸を含有していてもよい。
【0120】
本発明において使用する抗体は、当技術分野で公知の任意の適切な方法により生成することができる。ポリクロナール抗体は、当技術分野で周知の種々の手順により生成することができる。例えば、キナーゼまたはそのキナーゼ上のエピトープは、種々の宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。この宿主動物としては、ウサギ、マウス、ラットが挙げられる。宿主種に応じて、種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増大させてもよい。このアジュバントとしては、フロインドアジュバント(完全または不完全)、鉱物ゲル(例えば、水酸化アルミニウム)、表面活性物質(例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール(pluronic polyol)、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール)、および潜在的に有用なヒトのアジュバント(BCG(カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvum))が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアジュバントは、当技術分野で周知である。さらに、上記キナーゼを構築するペプチド鎖の一部分は、多重抗原ペプチド(multiple antigentic peptide)(MAP)として周知の多腕のペプチドに結合されていてもよい。次いで、このMAPを動物に投与して、MAPの腕(単数または複数)上に提示されるエピトープに高度に適合させた免疫応答を発生させることもできる。MAP技術を使用して抗体を発生させる方法は、当技術分野で周知である。MAP技術を使用して抗体を発生させる方法は、Tam, JP, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5409 (1988)およびOlive, C.ら、Mini Rev. Med. Chem. 1:429 (2001)に記載してあり、これらの刊行物を参考として援用する。
【0121】
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の非常に多様な技術を使用して調製することができ、この技術としては、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組合せの使用が挙げられる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して生成することができ、ハイブリドーマ技術としては、当技術分野で公知であり、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版、1988);Hammerling, ら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)に教示される技術が挙げられる(これらの刊行物の両方を参考として援用する)。
【0122】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を生成し、それについてスクリーニングするための方法は日常的業務であって当技術分野で周知であり、例えば、マウスに免疫性を付与することが挙げられるが、これに限定されない。いったん免疫応答を検出すると、そのマウスの脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。その脾細胞は、次いで、周知の技術によって、任意の適切な骨髄腫細胞(例えば、ATCCから入手可能な細胞株SP20由来の細胞)に融合する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローン化する。次いで、このハイブリドーマクローンは、本発明のバイオマーカーを結合することができる抗体を分泌する細胞について当技術分野で公知の方法によりアッセイすることができる。腹水は、一般に高レベルの抗体を含有し、腹水は、陽性ハイブリドーマクローンでマウスに免疫性を付与することにより生成させることができる。
【0123】
本発明において使用する抗体はまた、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して生成することができる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをエンコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面上に提示される。特定の態様では、このようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリから発現される抗原結合ドメインを提示するために利用することができる。目的の抗原を結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原または固体表面もしくはビーズに結合されたか捕捉された抗原を使用して、目的の抗原で選択するか、または同定することができる。これらの方法において使用するファージは、代表的には繊維状ファージであり、その例としては、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに組換え操作により融合されたFab、Fvまたはジスルフィドで安定化されたFv抗体ドメインを伴うファージから発現したfdおよびM13結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら、J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995);Amesら、J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995);Kettleboroughら、Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994);Persicら、Gene 187 9-18 (1997);Burtonら、Advances in Immunology 57:191-280 (1994);PCT出願番号第PCT/GB91/01134;PCT公報第WO90/02809号;同第WO91/10737号;同第WO92/01047号;同第WO92/18619号;同第WO93/11236号;同第WO95/15982号;同第WO95/20401号;および米国特許第5,698,426号;同第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,580,717号;同第5,427,908号;同第5,750,753号;同第5,821,047号;同第5,571,698号;同第5,427,908号;同第5,516,637号;同第5,780,225号;同第5,658,727号;同第5,733,743号および同第5,969,108号に開示される方法が挙げられる。これらの刊行物のすべてを参考として援用する。
【0124】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術により生成することができる。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片を生成するため)またはペプシン(F(ab')2断片を生成するため)のような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断により生成することができる。F(ab')2断片は、可変領域、軽鎖の一定領域および重鎖のCH1ドメインを含む。
【0125】
組換え技術のような他の方法を使用して、Fab断片、Fab'断片、およびF(ab')2断片を生成することができ、このような他の方法は、PCT公報第WO92/22324号;Mullinaxら、BioTechniques 12(6):864-869 (1992);およびSawaiら、AJRI 34:26-34 (1995);ならびにBetterら、Science 240:1041-1043 (1988)に開示されている。これらの刊行物を、本明細書中に参考として援用する。ファージ選択の後に、例えばそのファージ由来の領域をコードする抗体を単離して、抗体全体(ヒトの抗体が挙げられる)、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成することができ、そしてそのファージ由来の領域をコードする抗体を任意の所望の宿主(哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌が挙げられる)中で発現することができる。
【0126】
他のタイプの断片(例えば、scFv)を生成するために使用することができる技術の例としては、米国特許第4,946,778号および同第5,258,498号;Hustonら、Methods in Enzymology 203:46-88 (1991);Shuら、Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 90:7995-7999 (1993);ならびにSkerraら、Science 240:1038-1040 (1988)に記載される技術が挙げられる。これらの刊行物のすべてを参考として援用する。いくつかの用途(抗体をヒトにおいてインビボで使用すること、およびインビトロ検出アッセイが挙げられる)については、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒトの抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒトの免疫グロブリンの一定領域を有する抗体が挙げられる。キメラ抗体を生成する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985);Oiら、BioTechniques 4:214 (1986);Gilliesら、J.Immunol.Methods 125:191-202 (1989);米国特許第5,807,715号;同第4,816,567号;および同第4,816,397号を参照のこと。これらの刊行物のすべてを、本明細書中に参考として援用する。ヒト化された抗体は、非ヒト種由来の1つ以上の相補性決定領域(CDR)およびヒトの免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原を結合する非ヒト種の抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトのフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、CDR供与体抗体由来の対応する残基で置換され、抗原結合性が変更、好ましくは改善される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により同定され、この方法としては、例えばCDRとフレームワーク残基との相互作用をモデリングして、抗原との結合について重要なフレームワーク残基を同定すること、および配列を比較して、特定の位置の独特のフレームワーク残基を同定することが挙げられる(米国特許第5,585,089号;Riechmannら、Nature 332:323 (1988)を参照のこと。これらの刊行物の両方を、本明細書中に参考として援用する)。抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を使用してヒト化することができ、その技術としては、例えばCDR-グラフト化(欧州特許第239,400号;PCT公報第WO91/09967号;米国特許第5,225,539号;同第5,530,101号;および同第5,585,089号)、皮膜(veneering)または表面付け替え(resurfacing)(欧州特許第592,106号;同第519,596号;Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991);Studnickaら、Protein Engineering 7(6):805-814(1994);Roguska.ら、Proc. Nat'l Acad. Sci. 91:969-913(1994))、ならびにチェイン・シャッフリング法(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)が挙げられる。これらの刊行物を、本明細書中に参考として援用する。
【0127】
完全にヒトの抗体は、ヒト患者の治療的処置または診断のために特に好ましい場合がある。ヒトの抗体は、当技術分野で公知の種々の方法により作製することができ、その方法としては、ヒトの免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリを使用する上記のファージディスプレイ法が挙げられる。米国特許4,444,887号および同第4,716,111号;ならびにPCT公報第WO98/46645号、同第WO98/50433号、同第WO98/24893号、同第WO98/16654号、同第WO96/34096号、同第WO96/33735号および同第WO91/10741号もまた参照のこと。これらの各々を、参考として援用する。
【0128】
ヒトの抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して生成することができる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または相同的組み換えによってマウスの胚幹細胞中に導入してもよい。あるいは、ヒトの可変領域、一定領域および多様性領域を、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウスの胚幹細胞中に導入してもよい。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同的組み換えによるヒトの免疫グロブリン座の導入とは別個に、またはそれと同時に、非機能的なものとしてもよい。特に、JH領域のホモ接合体欠失が起こると、内因性の抗体生産が妨げられる。改変した胚幹細胞を展開し、胚盤胞中に微量注入して、キメラマウスを生成する。このキメラマウスを交配させて、ヒトの抗体を発現する同型の子孫を生成する。このトランスジェニックマウスに、通常のやり方で、選択した抗原を用いて免疫性を与える。その抗原に対して指向性のモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、上記免疫を付与したトランスジェニックマウスから得ることができる。このトランスジェニックマウスが宿すヒトの免疫グロブリンのトランス遺伝子は、B細胞の分化の間に再配列し、その後、クラス切替えおよび体細胞変異を受ける。このようにして、このような技術を使用すると、治療的に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を生成することが可能である。ヒトの抗体を生成するためのこの技術を概観するために、LonbergおよびHuszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照のこと。この文献を、本明細書中に参考として援用する。ヒトの抗体およびヒトのモノクローナル抗体を生成するためのこの技術ならびにこのような抗体を生成するためのプロトコルについての詳細な考察については、例えば、PCT公報第WO98/24893号;同第WO92/01047号;同第WO96/34096号;同第WO96/33735号;欧州特許第0 598 877号;米国特許第5,413,923号; 同第5,625,126号;同第5,633,425;同第5,569,825号;同第5,661,016号;同第5,545,806号;同第5,814,318号;同第5,885,793号;同第5,916,771号、および同第5,939,598号を参照のこと。これらの刊行物を、参考として援用する。
【0129】
ヒトの抗体を生成するためのさらに別のアプローチは、案内された選択(guided selection)と呼ばれる技術を利用する。案内された選択では、選択された非ヒトのモノクローナル抗体(例えば、マウスの抗体)を同一のエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択を案内するために使用する(Jespersら、Biotechnology 12:899-903 (1988)、本明細書中に参考として援用する)。
【0130】
単離されたキナーゼを、次いで、キナーゼ活性センサと接触させる。本明細書中で使用する場合、キナーゼ活性センサは、少なくとも1つのリン酸化部位を有するキナーゼ認識モチーフを含む組成物である。このリン酸化部位は、このキナーゼ活性センサのキナーゼ認識モチーフ内に存在してもしなくてもよい。1つの態様では、このリン酸化部位は、リン酸化を受けることができるアミノ酸残基(reside)である。従って、ある局面では、上記キナーゼ活性センサは、リン酸化を受けることができるペプチドを含む。リン酸化を受けることができるアミノ酸の例としては、セリン、トレオニン、およびチロシンのような天然のヒドロキシル含有アミノ酸残基、ならびに非天然のヒドロキシル含有アミノ酸残基が挙げられるが、これらに限定されない。
【0131】
キナーゼ認識モチーフ
キナーゼ認識モチーフを、本発明に従って使用することができる。いまだ機能的ではある間は、酸性残基を有するキナーゼ認識モチーフは、あまり望ましくない場合がある。なぜなら、アッセイの間、これらの残基が酸性条件を作り出すかも知れないからである。上記キナーゼ活性センサにおいて使用することができる認識モチーフの例としては、表1に示すモチーフが挙げられるが、これらに限定されない。
【0132】
【表1】
【0133】
他の単離されたキナーゼ認識モチーフとしては、表2、表3および表4の認識モチーフが挙げられるが、これらに限定されない。
【0134】
【表2】
【0135】
【表3】
【0136】
【表4】
【0137】
「Sx」というときは、SOX(本明細書中に記載するキナーゼ活性センサ)を示し、「dP」はD-プロリンを示し、「Ac」はアシルを示し、-NH2はアミノを示す。
【0138】
本発明の好ましい態様は、SEQ ID NO: 1〜133のうちの少なくとも1つを含む組成物を提供する。より具体的には、本発明は、SEQ ID NO: 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、またはSEQ ID NO: 49を含むか、またはこれらからなる組成物を提供する。さらにより具体的には、SEQ ID NO: 1〜133のうちの少なくとも1つをキナーゼ認識モチーフとして使用する。
【0139】
単離したキナーゼが存在する場合には、その単離したキナーゼは次いでキナーゼ活性センサのアミノ酸標的をリン酸化する。本発明者らは、単離されて結合剤で固定化されたキナーゼはまだ活性な酵素であることを見出した。従って、活性な特異的キナーゼは、標的アミノ酸残基(複数個であってもよい)をリン酸化するのに利用することができる。1つの態様では、アデノシン三リン酸(ATP)および上記キナーゼ活性センサのキレート剤とリン酸化されたアミノ酸とに対して親和性を有する金属イオンを、単離したキナーゼが上記キナーゼ活性センサと接触する前、接触する間または接触した後のいずれかにアッセイに添加する。特定の局面では、この金属イオンは、マグネシウムであるが、しかし上記のような任意の金属イオンも本発明の一部である。
【0140】
キナーゼ活性センサ
次に、リン酸化部位上でのリン酸化活性のレベルを、種々の技術を使用して定量することができる。1つの態様では、上記キナーゼ活性センサは、標的のリン酸化部位上でのリン酸化事象に応答してシグナルを発生するかまたは変化させることができるシグナル伝達部分を含む。より具体的な態様では、このシグナル伝達部分は、蛍光シグナルを発生することができる。シグナル伝達部分の例としては、Fluorescent Magnesium Indicators (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)およびキレート化事象の際に蛍光を発する金属結合性アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアミノ酸は、米国特許第6,906,194号に記載されており、この特許文献を本明細書中に参考として援用する。
【0141】
本明細書中で使用する場合、用語「金属キレート剤」は、当技術分野で意味するとおりに使用する。つまり、金属キレート剤は、金属イオンと2つ以上の配位結合を形成することができる化合物である。用語「配位結合」は、当技術分野で周知であり、金属イオンとキレート剤との間の配位性共有結合を示すために使用する。
【0142】
本発明の金属キレート部分は、金属イオンを同時に結合する部分であり、キナーゼ基質のセリン、トレオニン、またはチロシン残基上の曝露されたリン酸基に対して親和性を有し、三元複合体が、この金属キレート部分、金属イオン、およびリン酸化されたセリン、トレオニン、またはチロシン残基の間で形成される。リン酸基と結合することがすでに見出されている金属イオンとしては、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ga3+、Tb3+、La3+、Pb2+、Hg2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、およびSr2+が挙げられる。本発明のキナーゼ活性センサによるキレート化のために好ましい金属イオンは、マグネシウムである。従って、上記金属キレート部分は、1)リン酸基に対する親和性を有する金属イオンを結合せねばならず、2)リン酸基に対する金属イオンの結合を妨げてはならず、そして3)安定な三元複合体を維持しなければならない。これらの3つの基準に適合する金属キレート部分としては、キノリンまたはその誘導体、フェナントロリンまたはその誘導体、BAPTA、IDA、DTPAおよびこれらの誘導体が挙げられる。
【0143】
1つの態様では、本発明のキナーゼ活性センサは、以下の式で表されるか、またはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
式中、R1、R2、R3、R4、R5およびR6は、独立にフルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環式、または置換複素環式であり;
R7およびR8は、独立にH、アルキル、置換アルキル、カルボニル、またはFMOCであり;
Lは、リンカーであり;かつ
YはペプチドまたはHである。
【0144】
好ましい態様では、上記キナーゼ活性センサは以下の式を有するか、またはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
式中、R4は、スルホンアミド基またはフルオロフォアであり;
R7およびR8は、独立にH、アルキル、置換アルキル、カルボニル、またはFMOCであり;
Lはリンカーであり;かつ
YはペプチドまたはHである。
【0145】
別の好ましい態様では、上記キナーゼ活性センサは、以下の式を有するか、またはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
R7およびR8は、独立にH、アルキル、置換アルキル、カルボニル、またはFMOCであり;
Lはリンカーであり;かつ
Yはペプチドである。
【0146】
別の好ましい態様では、上記キナーゼ活性センサ上のフルオロフォアは以下の式を有する:
式中、R9およびR10は、各々、独立にハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHである。
【0147】
別の好ましい態様では、上記キナーゼ活性センサは以下の式を有するか、またはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である:
式中、R7はHであるか、または保護基であり;
R9は、ハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHであり;
R10は、ハロゲン、-SO3H、置換スルホニル、またはHであり;
Lはリンカーであり;かつ
YはペプチドまたはHである。
【0148】
上述の態様のいずれかのより具体的な態様では、R4はフルオロフォアである。別の態様では、上記フルオロフォアは、ダンシル、キサンテン、シアニン、ボラポリアザインダセン、ピレン、ナフタレン、クマリン、オキサジンまたはこれらの誘導体である。別の態様では、上記フルオロフォアは、クマリン、キサンテンまたはこれらの誘導体である。別の態様では、R1はヒドロキシである。別の態様では、R2、R3、R5およびR6はすべてHである。別の態様では、R7はHまたはFMOCである。別の態様では、R8はHである。別の態様では、Yはペプチドである。別の態様では、上記ペプチドは、キナーゼ認識部位、およびキナーゼによるリン酸化を受けやすい、セリン、トレオニン、またはチロシンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を含む。別の態様では、
結合で示された位置は、S配置であるか;あるいはそれはR配置であるか;あるいは上記キナーゼ活性センサはラセミ体である。別の態様では、上記キナーゼ活性センサの塩は、マグネシウムである。別の態様では、Lは共有結合である。別の態様では、YはHである。別の態様では、R9およびR10は、ともにフッ素である。
【0149】
本発明のフルオロフォアは、キレート部分と結合した際に蛍光発生性であるか、または本質的に非蛍光性である、当技術分野で公知の任意のフルオロフォアであってよい。本発明のフルオロフォアは、キナーゼ活性センサ化合物の一部がその独特の分光学的特性を保持して検出可能なシグナルを提供するときに、280nmを超えて吸収極大を示す任意の化学的部分である。1つの態様では、本発明のフルオロフォアは、キナーゼ活性センサのキレート部分とは別個の部分である。別の態様では、キレート剤はまた、フルオロフォアでもある。
【0150】
本発明において使用することができるフルオロフォアとしては、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンゾインドール、オキサゾールまたはベンゾオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、4-アミノ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾール(NBD)、カルボシアニン(米国特許出願第09/557,275号;同第09/968,401号および同第09/969,853号ならびに米国特許第6,403,807号;同第6,348,599号;同第5,486,616号;同第5,268,486号;同第5,569,587号;同第5,569,766号;同第5,627,027号および同第6,048,982号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレートアントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン(米国特許第4,774,339号;同第5,187,288号;同第5,248,782号;同第5,274,113号;および同第5,433,896号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、キサンテン(米国特許第6,162,931号;同第6,130,101号;同第6,229,055号;同第6,339,392号;同第5,451,343号および米国特許出願第09/922,333号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、オキサジンまたはベンゾオキサジン、カルバジン(米国特許第4,810,636号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、フェナレノン、クマリン(米国特許第5,696,157号;同第5,459,276号;同第5,501,980号および同第5,830,912号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、ベンゾフラン(米国特許第4,603,209号および同第4,849,362号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)ならびにベンゾフェナレノン(米国特許第4,812,409号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)ならびにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する場合、オキサジンとしては、レゾルフィン(米国特許第5,242,805号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジンおよびそれらのベンゾ置換アナログが挙げられる。
【0151】
特定の態様では、本発明のフルオロフォアは、アクリジン、アントラセン、ベンゾフラン、インドール、ダンシル、シアニン、ボラポリアザインダセン、ピレン、ナフタレン、クマリン、オキサジン、ボロン ジピロメタン ジフルオリド、およびキサンテン(フルオレセイン、ローダミンおよびロドール、ならびにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない)からなる群より選択される。本発明で使用することができるさらなるフルオロフォアは、Richard P. Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(第9版)に列挙されている。 より具体的な態様では、このキサンテンは、フルオレセインまたはローダミンである。上記フルオロフォアは、溶解性、分光学的特性または他の物理的特性を調整するために、置換されていてもよい。
【0152】
上記フルオロフォアがキサンテンである場合には、このフルオロフォアは、フルオレセイン、ロドール(米国特許第5,227,487号および同第5,442,045号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)、ロサミンもしくはローダミン(米国特許第5,798,276号;同第5,846,737号;同第5,847,162号;同第6,017,712号;同第6,025,505号;同第6,080,852号;同第6,716,979号;同第6,562,632号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)であってよいが、これらである必要はない。本明細書中で使用する場合、フルオレセインとしては、ベンゾフルオレセインまたはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセイン、またはナフトフルオレセインが挙げられる。同様に、本明細書中で使用する場合、ロドールとしては、セミナフトロダフルオル(seminaphthorhodafluor)(米国特許第4,945,171号に開示される任意の対応する化合物が挙げられる)が挙げられる。フッ素化キサンテンフルオロフォアは、すでに以前に、特に有用な蛍光特性を保有しているとして記載されており(国際公開第WO97/39064号および米国特許第6,162,931号)、OREGON GREENの商標名で市販されているものが挙げられる。
【0153】
特に、このOregon Green前駆体は、ペプチドキナーゼの基質における非常に明るくて非常に吸光性のpH非感受性のフルオレセイン誘導体の戦略的な配置を可能にする。蛍光は、最初はPETを介して8-ヒドロキシキノリン部分により消光されるが、β-ターンジペプチド配列により色素から離されている適切なSer/Thr/Tyr残基のリン酸化の際に、マグネシウム(II)によって媒介される、キレート化に誘導される蛍光の増加が観察される。蛍光(490nm 励起/520nm 発光)の増加は、カルシウム測定についてのFluo-4を使用する際に観察されるものと、機構上も強度も類似している。重要な合成ステップは、8-ヒドロキシキノリンアミノ酸の位置選択的ヒドロホルミル化、およびそれに続く4-フルオロレゾルシノールおよび脱水素的酸化である。本発明の成功への鍵は、フルオロフォア-アミノ酸部分の適切な構築、およびキレート部分およびリン酸部分が介在する金属イオンによって一緒に近接することができるような三次元幾何学におけるフルオロフォア-アミノ酸部分の配置である。この幾何学的最適化は、PKCαペプチド基質Ac-Oregon Greenアラニン-Pro-Gly-Ser-Phe-Arg-Arg-Arg-NH2の半経験的分子モデリングでのエネルギー最小化により可視化できる。Oregon Greenアラニン誘導体の金属キレート部分がホスホセリン部分に向かって配向することができるように、このフルオロフォア置換アミノ酸を、リン酸化されるべきセリンから2つのアミノ酸残基離して配置する。このヒドロキシキノリンフルオロフォア 部分を、蛍光が金属イオンによるキレート化がない場合に消光するように構築し、そしてヒドロキシキノリン-アミノ酸の連結点もまた最適の幾何学を求めて選択する。
【0154】
代表的には、上記フルオロフォアは、1つ以上の芳香族環またはヘテロ芳香族環を含み、これらの環は、必要に応じて、1回以上、種々の置換基(ハロゲン、ニトロ、スルホ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールもしくはヘテロアリール環系、ベンゾ、または当技術分野で公知のクロモフォアもしくはフルオロフォアに代表的に存在する他の置換基が挙げられるが、これらに限定されない)によって置換されている。
【0155】
例示的な態様では、上記フルオロフォアは、独立に、水素、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、スルホ、反応性基および担体分子からなる群より選択される置換基で置換される。別の態様では、本発明のキサンテンフルオロフォアは、置換基によって、キサンテンの中心環の炭素原子が置換されているかまたは置換されていない化合物の両方を含む。この置換基としては、キサンテンベースのフルオロフォアで代表的に見出される置換基、例えばフェニルおよび置換フェニル部分が挙げられる。さらに別の態様では、本発明のアミノ酸および組成物において使用するフルオロフォアは、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、ナフタレンおよびこれらの誘導体である。キレート部分に結合されたフルオロフォアの選択は、本発明のアミノ酸および組成物の吸収特性および蛍光発光特性、ならびにその生体細胞特性を決定する。
【0156】
選択したスルホン化フルオロフォアはまた、有利な特性を示し、そして選択したスルホン化フルオロフォアとしては、(米国特許第5,132,432号;同第5,696,157号;同第5,268,486号;同第6,130,101号に記載されるように)スルホン化ピレン、クマリン、カルボシアニンおよびキサンテンが挙げられる。スルホン化ピレンおよびクマリンは、代表的には、約450nm未満の波長で励起される(米国特許第5,132,432号よび同第5,696,157号)。
【0157】
1つの態様では、上記標識は、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、5-TMRIA(テトラメチルローダミン-5-ヨードアセトアミド)、(9-(2(または4)-(N-(2-マレイミジルエチル)-スルホンアミジル)-4(または2)-スルホフェニル)-2,3,6,7,12,13,16,17-オクタヒドロ-(1H, 5H, 11H, 15H-キサンテノ(2,3,4-ij:5,6,7-i'j')ジキノリジン-18-ニウム塩)(Texas Red(登録商標))、2-(5-(1-(6-(N-(2-マレイミジルエチル)-アミノ)-6-オキソヘキシル)-1,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-5-スルホ-2H-インドール-2-イリデン)-1,3-プロピルジエニル)-1-エチル-3,3-ジメチル-5-スルホ-3H-インドリウム塩(Cy(商標)3)、N,N'-ジメチル-N-(ヨードアセチル)-N'-(7-ニトロベンゾ-2-オキサ- 1,3-ジアゾール-4-イル)エチレンジアミン(IANBDアミド)、6-アクリロイル-2-ジメチルアミノナフタレン(アクリロダン(acrylodan))、ピレン、6-アミノ-2,3-ジヒドロ-2-(2-((ヨードアセチル)アミノ)エチル)-1,3-ジオキソ-1H-ベンゾ(デ)イソキノリン-5,8-ジスルホン酸塩(ルシファーイエロー)、2-(5-(1-(6-(N-(2-マレイミジルエチル)-アミノ)-6-オキソヘキシル)-1,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-5-スルホ-2H-インドール-2-イリデン)-1,3-ペンタジエニル)-1-エチル-3,3-ジメチル-5-スルホ-3H-インドリウム塩(Cy(商標)5)、4-(5-(4-ジメチルアミノフェニル)オキサゾール-2-イル)フェニル-N-(2-ブロモアセトアミドエチル)スルホンアミド(Dapoxyl(登録商標)(2-ブロモアセトアミドエチル)スルホンアミド))、(N-(4,4-ジフルオロ-1,3,5,7-テトラメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-2-イル)ヨードアセトアミド(BODIPY(登録商標) 507/545 IA)、N-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオニル)-N'-ヨードアセチルエチレンジアミン(BODIPY 530/550 IA)、5-((((2-ヨードアセチル)アミノ)エチル)アミノ)ナフタレン-1-スルホン酸(1,5-IAEDANS)、およびカルボキシ-X-ローダミン、5/6-ヨードアセトアミド(XRIA 5,6)からなる群より選択されるフルオロフォアである。標識の別の例は、BODIPY-FL-ヒドラジドである。
【0158】
例示的な態様では、上記フルオロフォアは50nmより大きいストークスシフトを有する。特に有用な態様では、上記フルオロフォアは、約100nmよりも大きいか、または約150nmよりも大きいストークスシフトを有する。さらにより多くの態様では、本発明の化合物は、約200nmよりも大きいか、または約250nmよりも大きいストークスシフトを有する。本明細書中で使用する場合の用語「ストークスシフト」は、吸収したエネルギーと放出したエルギーとの間の波長の差をいう。具体的には、このストークスシフトは、同一の電子遷移に由来する吸収およびルミネセンスのスペクトル位置およびバンド極大(またはバンドの根源)の差(通常は、周波数単位)である。
【0159】
正しいキナーゼ基質認識モチーフを容易にするために、96ウェルプレートの表面上に乾燥した14基質を用いるS/TまたはYペプチド基質サンプラープレート(1ウェルあたり1基質、かつ1基質あたり6ウェル)を提供する。各基質を反応緩衝液中に再懸濁し、目的のキナーゼ(複数個であってもよい)を各ウェルに添加し、次いでリアルタイムで蛍光の増加をモニタリングする。
【0160】
本発明の別の態様は、キナーゼ活性を検出する方法を提供し、この方法は、
金属キレート剤、1つ以上のアミノ酸およびフルオロフォアを含むキナーゼ活性センサの蛍光を測定する工程であって、このキレート剤がキノリン基を含み、そしてフルオロフォアおよびアミノ酸の両方がこのキノリン基に結合されており、そしてこのアミノ酸がキナーゼ認識部位およびリン酸化部位を含む、工程;
固定化した結合剤を含む固体または半固体支持体を提供する工程;
この固定化した結合剤を、特異的キナーゼを含む試料と接触させ、固定化した特異的キナーゼを形成する工程;
この固定化した特異的キナーゼを、キナーゼ活性センサと接触させ、接触した特異的キナーゼを形成する工程であって、このキナーゼ活性センサがリン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドおよびキレート剤を含む、工程;
この接触した特異的キナーゼを、このキナーゼがリン酸供給源および金属イオンの存在下で上記ペプチドをリン酸化するのに十分な時間、インキュベーションする工程であって、このキナーゼ活性センサが、金属イオンおよびリン酸化されたペプチドと三元複合体を形成し、検出可能なシグナルを発生する工程;ならびに
このシグナルを検出し、これにより上記特異的キナーゼの活性を測定する工程;
非接触状態と接触状態との間での上記キナーゼ活性センサの蛍光の差を定量する工程
を含み、ここで蛍光の差がキナーゼ活性の存在を示す。
【0161】
別のより具体的な態様では、上記測定した蛍光は、強度、励起波長または発光波長、蛍光の分布、蛍光寿命、蛍光偏光およびこれらの組合せからなる群より選択される。
【0162】
本発明の別の態様は、キナーゼ活性を検出する方法を提供し、この方法は、
1つ以上のキナーゼを結合剤と接触させて特異的キナーゼを単離し、単離したキナーゼを形成する工程;
この単離したキナーゼを、キナーゼ活性センサと接触させる工程であって、このキナーゼ活性センサが、この単離したキナーゼによるリン酸化を受けることができるキナーゼ認識モチーフおよび少なくとも1つのリン酸化部位を含む、工程;
インキュベーションした試料を適切な波長で照射して、照射した試料を形成する工程;
この照射した試料を観察する工程であって、キナーゼ活性が観察可能な蛍光シグナルの存在により検出される工程、
を含む。
【0163】
スキーム1は、キナーゼ活性センサを採用する本発明の1つの態様の説明図を提供する。
スキーム1:
【0164】
マグネシウム錯体は、このペプチドのリン酸化を検出し、かつ/または定量することができるように、このキナーゼ活性センサの発光スペクトルおよび/または励起スペクトルを改変する。
【0165】
本発明のキナーゼ活性センサは、1つ以上のアミノ酸を含む。1つの態様では、このアミノ酸は、少なくとも1つのキナーゼ認識モチーフを含むペプチドを形成し、このキナーゼ認識モチーフは、少なくとも1つのリン酸化可能なアミノ酸残基を含む。
【0166】
任意のキナーゼ認識モチーフが、本発明に従って使用できる。酸性残基を有する認識配列は、リン酸化の際に、相当する配列より小さい大きさの蛍光増加を示す。なぜなら、マグネシウムに対するリン酸化されていないペプチドの親和性は、酸性条件下で増加する傾向があるからである。本発明に従う上記キナーゼ認識モチーフ内のリン酸化部位としては、ヒドロキシル基を含むアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。例としては、天然のヒドロキシル含有アミノ酸残基(例えば、セリン、トレオニン、およびチロシン)ならびに非天然のヒドロキシル含有アミノ酸残基が挙げられるが、これに限定されない。好ましい認識モチーフを表1、2、および3に列挙する。
【0167】
リン酸化活性のレベルを検出する他の方法としては、リン酸化されたアミノ酸残基を認識して結合することができるリン酸化部位特異的抗体の使用が挙げられるが、これに限定されない。リン酸化されたアミノ酸残基を認識する抗体の例としては、米国特許出願第2003/0162330号、Mandel, J., Phosphorylation State-Specific Antibodies, Amer. J. Pathol., 163:1687 (2003)およびGlenney, JRら、Monoclonal antibodies to phosphotyrosin. J. Immunol. Methods. 109:277 (1988)に記載される抗体が挙げられる。これらの刊行物を本明細書中に参考として援用する。
【0168】
本発明の方法は、創薬環境のために有用である。1つの特定の態様では、本発明の方法は、目的の特異的キナーゼを単離する前に細胞または組織を化合物(例えば、薬物、または薬物候補)に曝露する工程を含む。その際、キナーゼの集団が細胞または組織中に存在し、薬物または薬物候補をこの細胞または組織に投与する。いったん曝露すると、この細胞組織を溶解させることができ、次いで目的の特異的キナーゼを単離することができ、その活性を本発明の方法を使用して定量することができる。
【0169】
固体または半固体支持体
例示的な態様では、本発明の化合物または結合剤(例えば、抗体)を固体または半固体支持体に結合する。本発明において使用するのに適した支持体は、代表的には、液体相には実質的に不溶である。本発明の固体または半固体支持体は、特定のタイプの支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用可能であり、それらは当業者に公知である。従って、有用な固体支持体としては、半固体(例えば、エーロゲルおよびヒドロゲル)、樹脂、ビーズ、バイオチップ(薄膜で被覆されたバイオチップが挙げられる)、マルチウェルプレート(マイクロタイタープレートとも呼ばれる)、膜、導電性金属および非導電性金属、ならびに磁気支持体が挙げられる。有用な固体支持体のより具体的な例としては、シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖(例えば、セファロース)、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、FICOLL、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン(ポリエチレングリコールを含む)、ナイロン、ラテックスビーズ、電磁ビーズ、超常磁性ビーズ(Dynabeads(例えば、M-280))、デンプンなどが挙げられる。好ましい支持体としては、アガロースおよび電磁ビーズが挙げられる。
【0170】
いくつかの態様では、上記固体または半固体支持体は、本発明の化合物を結合するための支持体反応性官能基を備え、この支持体反応性官能基としては、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミド、スルホキシドなどが挙げられる。好ましい態様では、上記固体支持体は、求核剤(x)(例えば、アミノ、チオール、またはヒドロキシル)を含有する。
【0171】
適切な固体または半固体支持体は、所望の最終用途および種々の合成プロトコルについての適合性に基づいて選択することができる。例えば、本発明の化合物を上記固体支持体に結合するためにアミド結合生成が望ましい場合には、一般にペプチド合成において有用な樹脂を用いてもよく、このような樹脂としては、ポリスチレン(例えば、Bachem Inc.、Peninsula Laboratoriesなどから入手できるPAMレジン)、POLYHIPE(商標)樹脂(Aminotech, Canadaから入手できる)、ポリアミド樹脂(Peninsula Laboratoriesから入手)、ポリエチレングリコールをグラフトしたポリスチレン樹脂(TentaGel(商標)、Rapp Polymere, Tubingen, Germany)、ポリジメチルアクリルアミド樹脂(Milligen/Biosearch, Californiaから入手可能)、またはPEGAビーズ(Polymer Laboratoriesから入手)が挙げられる。
【0172】
キット
本発明のさらなる態様は、本明細書中に記載されるキナーゼ活性の検出において使用するための組成物を含むキットを包含する。さらに、このキットは、目的のキナーゼの活性を最良に検出する方法についての使用説明書を備える。
【0173】
本発明の別の局面は、特異的キナーゼの活性を検出するためのキットを提供し、このキットは、その特異的キナーゼに結合する結合剤およびキナーゼ活性センサを含み、ここでこのキナーゼ活性センサは、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドおよびキレート剤を含む。より具体的には、このキットは、ATPならびにこのキレート剤およびリン酸化されたペプチドの両方に対して親和性を有する金属イオンをさらに含む。
【0174】
正しいキナーゼ基質認識モチーフを容易にするために、96ウェルプレートの表面上に乾燥した14基質を用いるS/TまたはYペプチド基質サンプラープレート(1ウェルあたり1基質、かつ1基質あたり6ウェル)を提供する。各基質を反応緩衝液中に再懸濁し、目的のキナーゼ(複数個であってもよい)を各ウェルに添加し、次いでリアルタイムで蛍光の増加をモニタリングする。
【0175】
本発明の好ましいキットは、種々のSer/Thrキナーゼの活性を測定するために使用することができる14個のSoxベースのペプチド基質を含む。このペプチドは、対照ペプチドの12個の複製物の最下段列とともに6個の複製物がセットになって配置されている。これらの基質は、SEQ ID NO: 20〜33に列挙されたペプチドに対応する。
【0176】
別の好ましいキットは、種々のSer/Thrキナーゼの活性を測定するために使用することができる14個のSoxベースのペプチド基質(キナーゼ活性センサ)を含む。このペプチドは、対照ペプチドの12個の複製物の最下段列とともに6個の複製物がセットになって配置されている。これらの基質は、SEQ ID NO: 4およびSEQ ID NO: 34-36に列挙されたペプチドに対応する。また、必要に応じて、Ser/Thrキナーゼの検出のための付加的なキナーゼ活性センサがこのキットの中に備えられている。
【0177】
別の好ましいキットは、種々のTyrキナーゼの活性を測定するために使用することができる14個の異なるキナーゼ活性センサを含む。このペプチドは、対照ペプチドの12個の複製物の最下段列とともに6個の複製物がセットになって配置されている。これらの基質は、SEQ ID NO: 42〜49に列挙されたペプチドに対応する。また、必要に応じて、チロシンキナーゼの検出のための付加的なキナーゼ活性センサがこのキットの中に備えられている。
【0178】
種々の補助的な物質が、しばしば、本発明に従うアッセイまたはキットにおいて用いられる。例示的な態様は、緩衝液および/または安定剤がこのキット構成成分として存在する。さらなる構成成分としては、ゲル、ビーズ、支持体、反応剤などが挙げられる。別の例示的な態様では、このキットは、指示薬溶液または指示薬の「試験紙(dipstick)」、吸取紙(blotter)、培地、キュベットなどを備える。さらに別の態様では、このキットは、自動化検出器で使用するための指示薬カートリッジ(キット構成成分を固体支持体に結合する場所)を備える。別の例示的な態様では、このキットは、添加剤をさらに備える。この添加剤は、リン酸化ポリペプチドおよび非リン酸化ポリペプチド、カルシウム結合ポリペプチドおよび非カルシウム結合ポリペプチド、スルホン化ポリペプチドおよび非スルホン化ポリペプチド、ならびにシアル化ペプチドおよび非シアル化ペプチドからなる群より選択される。別の例示的な態様では、このキットは、定着液、検出用試薬、標品、洗浄液およびこれらの組合せから選択されるメンバーをさらに含む。
【0179】
照射
リン酸化アミノ酸、金属イオンおよび上記キナーゼ活性センサのキレート剤が存在する試料または培地を、検出可能な光学的応答を与えるように選択した波長で照射し、この光学的応答を検出するための手段を用いて観察する。本発明の化合物および組成物を照射するのに有用である装置としては、手持ちサイズの紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、レーザー、およびレーザーダイオードが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射源は、必用に応じて、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダーまたは標準的な蛍光光度計もしくはマイクロフルオロメーターに一体化されている。
【0180】
本発明のキナーゼ活性センサを、アッセイ後またはアッセイの間いつでも、検出可能な光学的応答をもたらす波長の光で照射し、この光学的応答を検出するための手段を用いて観察することができる。本発明のキナーゼ活性センサを照射するのに有用である選択した装置としては、手持ちサイズの紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、アルゴンレーザー、レーザーダイオードおよびYAGレーザーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの照射源は、必要に応じて、レーザースキャナー、蛍光マイクロプレートリーダー、標準的な蛍光光度計もしくは小型蛍光光度計、またはクロマトグラフィー検出器に一体化されている。この蛍光発光は、必要に応じて、目視によって、または以下のデバイス(CCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザースキャン装置、蛍光光度計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光(epifluorescence)顕微鏡、走査電子顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー)のいずれかを使用することにより、あるいは光電子増倍管のようなシグナルを増幅するための手段により検出する。
【0181】
これまで本発明を詳細に説明してきたが、本発明を例示する目的で以下の実施例を提示する。これらの実施例は、本発明または特許請求の範囲の範囲を限定しようとするものではない。
【0182】
実施例
実施例1:p38キナーゼ活性の定量
p38キナーゼに特異的なマウスのモノクローナル抗体を、96ウェルプレートのウェルに結合した。炭酸塩緩衝液中のp38抗体の濃度は、3μg/ml、6μg/mlおよび12μg/mlであり、そして各濃度の100μlを1ウェルあたりで使用した。
【0183】
マウスのマクロファージ細胞(RAW264.7)をアニソマイシンに曝露し、そして培養物中で約2時間インキュベーションした。対照細胞は処理しなかった。インキュベーション後、細胞培養物を細胞から取り出して、その細胞を洗浄した。次いで、細胞を市販されている細胞溶解剤を用いて溶解し、そしてこの細胞溶解物をコーティングしたプレートのウェルに添加した。
【0184】
結合剤で目的の特異的キナーゼ(p38)を捕捉した後、キナーゼ活性センサ(50ng)を1mMのATPとともにこのウェルに加えた。この例では、この活性センサのキナーゼ認識モチーフは、アミノ酸配列AHLQRLSI(dP)(SEQ ID NO: 134)を含んでおり、セリンがリン酸化標的部位であった。このキナーゼ活性センサは、米国特許第6,906,194号に記載されかつSOXと呼ばれる金属結合性アミノ酸をさらに含んでいた。このSOXアミノ酸は、マグネシウムとのキレート化の際に蛍光を発する。図1は、p38にのみ帰属することができるリン酸化活性のレベルを図示する。
【0185】
実施例2:Erk1/2キナーゼ活性の定量
Erk1/2キナーゼに特異的なウサギのモノクローナル抗体を、96ウェルプレートのウェルに結合した。炭酸塩緩衝液中のErk1/2抗体の濃度は、3μg/ml、6μg/mlおよび12μg/mlであり、そして各濃度の100μlを1ウェルあたりで使用した。
【0186】
マウスの胚線維芽細胞(3T3)を血小板由来増殖因子(PDGF)に曝露し、そして培養物中で約2時間インキュベーションした。対照細胞は処理しなかった。インキュベーション後、細胞培養物を細胞から取り出して、その細胞を洗浄した。次いで、細胞を市販されている細胞溶解剤を用いて溶解し、そしてこの細胞溶解物をコーティングしたプレートのウェルに添加した。
【0187】
結合剤で目的の特異的キナーゼ(Erk1/2)を捕捉した後、キナーゼ活性センサ(50ng)を1mMのATPとともにこのウェルに加えた。この例では、この活性センサのキナーゼ認識モチーフは、アミノ酸配列AHLQRLSI(dP)(SEQ ID NO: 134)を含んでおり、セリンがリン酸化標的部位であった。このキナーゼ活性センサは、米国特許第6,906,194号に記載されかつSOXと呼ばれる金属結合性アミノ酸をさらに含んでいた。このSOXアミノ酸は、マグネシウムとのキレート化の際に蛍光を発する。図2は、Erk1/2にのみ帰属することができるリン酸化活性のレベルを図示する。
【0188】
実施例3:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるAkt1活性の測定
NIH3T3細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでPDGF A/B(50ng/mL、10分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、以下にアッセイ手順で説明するようにして、Akt1活性をアッセイした。
【0189】
PDGF処理した試料は、1.13RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.12RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が9という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.12RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 25を使用して、以下のアッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図3に示す。
【0190】
アッセイ手順
試薬
洗浄緩衝液(1×ストックを調製する):適切な量の10×洗浄緩衝液濃縮物を、超純水を用いて10倍に希釈する(例えば、10×洗浄緩衝液5mL+超純水45mL)。
【0191】
Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液(1×ストックを調製する):適切な量の10×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液を、超純水を用いて10倍に希釈して、0.2mMの最終濃度までDTTを(必要な場合)加える(例えば、10×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液500μL+100mM DTT 10μL+超純水4490μL)。
【0192】
本発明者らは、Ser/Thrキナーゼのリン酸化についての有用な反応緩衝液は、20mM Tris、pH 7.5;15mM MgCl2;1mM EGTA;5mM β-グリセロリン酸塩;5% グリセロール;1mM ATP(別個のストックから添加);0.2mM DTT(別個のストックから添加);1.5mM CaCl2(PKCのみ;別個のストックから添加);2.5ug/mL ホスファチジルセリン(PKCのみ;別個のストックから添加);および0.5ug/mL ジアシルグリセロール(PKCのみ;別個のストックから添加)を含むことを見出した。
【0193】
あるいは、本発明者らは、Tyrキナーゼのリン酸化についての有用な反応緩衝液は、20mM Tris、pH 7.5;5mM MgCl2;1mM EGTA;5mM β-グリセロリン酸塩;5% グリセロール;1mM ATP(別個のストックから添加);および0.2mM DTT(別個のストックから添加)を含むことを見出した。
【0194】
キナーゼ活性センサ(100μMストックを調製する):適切な量のペプチド基質溶液(1mM)を1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液を用いて10倍に希釈する(例えば、1mMペプチド10μL+1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液90μL)。
【0195】
ATP溶液(2mMストックを調製する):適切な量の100mM ATP溶液を1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液を用いて50倍に希釈する(例えば、100mM ATP 10μL+1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液490μL)。
【0196】
細胞溶解物:
上記細胞溶解物を0.5〜1mg/mLの全タンパク質にまでOmnia(商標)細胞溶解緩衝液を用いて希釈する。このアッセイに使用する細胞溶解物タンパク質の量は、個々の細胞株におけるキナーゼ酵素の量および活性に応じて変動する。
【0197】
本発明者らは、粗細胞溶解物または粗組織溶解物由来のキナーゼのキナーゼ活性を保持するための有用な反応緩衝液は、50mM Tris、pH 7.5;150mM NaCl;2mM EGTA;30mM NaF;10mM Na4P2O7;100mM Na3VO4;1% Triton X-100;50mM β-グリセロリン酸塩;1mM DTT;Sigma Protease Inhibitorカクテル(カタログ番号 P8340)およびSigma Phosphatase Inhibitorカクテル1(カタログ番号 P2850)を含むことを見出した。
【0198】
キナーゼ混合物(1×ストックを調製する):
適切な量のキナーゼ溶液を1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液を用いて希釈する(例えば、キナーゼ混合物10μL+1×Omnia(商標)キナーゼ反応緩衝液290μL)。
【0199】
キナーゼ対照:
組換えキナーゼ酵素を、細胞溶解物中でのキナーゼの活性を定量するための正の対照として使用することができる。
【0200】
手順:
Omnia(商標)細胞溶解緩衝液中に調製した25-100μgの全タンパク質を含有する細胞溶解物100μLを、抗体をコーティングしたプレートのストリップ中の各試料ウェルに加える。このプレートをAdhesive Plate Cover Stripでシールし、そして室温で2時間インキュベーションする。細胞溶解物を取り除いて捨て、ウェルおよびプレートを200μLの洗浄緩衝液で数回洗浄する。洗浄緩衝液を吸引するかまたは傾瀉する。洗浄と洗浄との間には、プレートを吸収紙上でしっかりとたたくことによってすべての残留液体を取り除く。
【0201】
30μLのキナーゼ混合物を、20μLのキナーゼ活性センサ溶液(100μM)および50μLのATP(2mM)に加える。反応混合物中のキナーゼ活性センサの最終濃度は20μMであり、ATPの最終濃度は1mMである。反応物の最終体積は100μLである。
【0202】
この溶液を30℃で1時間インキュベーションする。このプレートを蛍光プレートリーダー(例えば、Molecular DevicesによるSpectraMax M5(登録商標)またはこれと同等の機器)に移す。蛍光の値を、反応速度論モードで、30℃で5時間まで、360nmの励起波長および485nmの発光波長で30秒毎に各ウェルから読み取る。
【0203】
このアッセイ手順は、IPキナーゼ活性アッセイキット、カタログ番号KNZ7011, Omnia(商標), B-RafについてのPlate IPキットにも記載されている。これを本明細書中に参考として援用する。
【0204】
実施例4:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるAkt3活性の測定
NIH3T3細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでPDGF A/B(50ng/mL、10分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、Akt3活性をアッセイした。PDGF処理した試料は、1.24RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.28RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が4.42という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.28RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 25を使用して、実施例3のアッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図4に示す。
【0205】
実施例5:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるERK1/2活性の測定
NIH3T3細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでPDGF A/B(50ng/mL、10分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、ERK1/2活性をアッセイした。PDGF処理した試料は、1.55RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.27RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が5.7という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.27RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 41を使用して、実施例3のアッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図5に示す。
【0206】
実施例6:PDGF処理したMCF-7細胞または対照MCF-7細胞由来の粗溶解物におけるp70-S6K活性の測定
MCF-7細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでインスリン(100nM、10分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、p70-S6K活性をアッセイした。インスリン処理した試料は、1.13RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.12RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が9.4という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.12RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 42を使用して、アッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。
【0207】
実施例7:PMA処理したHeLa細胞または対照HeLa細胞由来の粗溶解物におけるRSK活性の測定
HeLa細胞を100mmの皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で90%コンフルエントまで増殖させた。次いで、この細胞を、血清を含まない培地中で一晩インキュベーションして休止させ、次いでPMA(200nM、30分)または対照培地で処理した。細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、RSK活性をアッセイした。PMA処理した試料は、3.17RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.64RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が4.95という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.64RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 30を使用して、アッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図7に示す。
【0208】
実施例8:c-SrcでトランスフェクトしたCEF細胞由来の粗溶解物におけるc-Src活性の測定
c-Srcでトランスフェクトしたニワトリ胚線維芽(CEF)細胞溶解液および偽トランスフェクトしたニワトリ胚線維芽(CEF)細胞溶解液を、Thomasら、(1999) J. Biol. Chem., 74:36684-36692に記載されるように調製した。c-SrcでトランスフェクトしたCEF試料は50RFU/秒の反応速度を示したが、他方、対照処理した試料は0.048RFU/秒という明らかに低下した速度を示し、SN比が10.5という劇的な結果をもたらした。他のアッセイ対照グループ(ビーズのみのグループまたはビーズと抗体のみのグループ)もまた0.05RFU/秒よりも小さい反応速度を示した。SEQ ID NO: 48を使用して、実施例3のアッセイ手順で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図8に示す。
【0209】
実施例9:NGF処理したPC12細胞または対照PC12細胞由来の粗溶解物におけるB-Raf活性の測定
PC12細胞を100mmのペトリ皿に播種し、2.5%のウシ胎仔血清および15%のウマ血清を含むDMEM中で増殖させた。次いで、細胞を、NGF(50ng/mL、15分)または対照培地で処理した。細胞溶解物を調製し、B-Raf活性を実施例3に記載したようにアッセイした。NGF処理した処理した試料は、150分のインキュベーションでプラトー(3200RFU)に到達した蛍光シグナルを生成したが、他方、対照グループは、反応開始後240分でプラトーに到達した。活性化したMK2酵素のレベルを測定するために使用したSEQ ID NO: 27とのカスケード反応を使用して、アッセイ手順の節で説明するようにして、活性をアッセイした。結果を図9に示す。
【0210】
実施例10:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるERK1/2活性の測定
NIH3T3細胞を100mmのペトリ皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で増殖させた。次いで、細胞をPDGF(50ng/mL、15分)または対照培地で処理した。次いで、細胞溶解液を調製し、実施例1で説明したようにして、ERK1/2活性をアッセイした。PDGF処理した試料は、335分のインキュベーションでプラトーに到達した3000RFUの蛍光シグナルを生成したが、他方、対照グループは845RFUの蛍光シグナルを生成した。活性化したMK2酵素のレベルを測定するために使用したSEQ ID NO: 27とのカスケード反応を使用して、実施例3で説明したようにして、活性をアッセイした結果を図10に示す。
【0211】
実施例11:PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるMEK1活性の測定
NIH3T3細胞を100mmのペトリ皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で増殖させた。次いで、細胞をPDGF(50ng/mL、15分)または対照培地で処理した。次いで、細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明したようにして、MEK1活性をアッセイした。PDGF処理した試料は、250分のインキュベーションで平坦部プラトーに到達した3650RFUの蛍光シグナルを生成したが、他方、対照グループは1050RFUの蛍光シグナルを生成した。活性化したMK2酵素のレベルを測定するために使用したSEQ ID NO: 27とのカスケード反応を使用して、アッセイ手順の節で説明したようにして、活性をアッセイした。結果を図11に示す。
【0212】
実施例12:アニソマイシン処理したRAW細胞または対照RAW細胞由来の粗溶解物におけるp38 MAPK活性の測定
RAW細胞を100mmのペトリ皿に播種し、10%のウシ胎仔血清を含むDMEM中で増殖させた。次いで、細胞をアニソマイシン(10μg/mL、15分)または対照培地で処理した。次いで、細胞溶解液を調製し、実施例3のアッセイ手順で説明したようにして、p38 MAPK活性をアッセイした。アニソマイシン処理した試料は、60分のインキュベーションでプラトーに到達した3350RFUの蛍光シグナルを生成したが、他方、対照グループは1250RFUの蛍光シグナルを生成した。活性化したMK2酵素のレベルを測定するために使用したSEQ ID NO: 27とのカスケード反応を使用して、アッセイ手順の節で説明したようにして、活性をアッセイした。結果を図12に示す。
【0213】
上記の引用文献の各々を、あたかもそれらの全体が本明細書中に示されたかのように、本明細書中に参考として援用する。
【図面の簡単な説明】
【0214】
【図1】本発明の方法を使用して評価した場合のp38キナーゼのキナーゼ活性を図示する。
【図2】本発明の方法を使用して評価した場合のErk1/2キナーゼのキナーゼ活性を図示する。
【図3】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるAkt1活性を図示する。
【図4】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるAkt3活性を図示する。
【図5】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるERK1/2活性を図示する。
【図6】PDGF処理したMCF-7細胞または対照MCF-7細胞由来の粗溶解物におけるp70-S6K活性を図示する。
【図7】PMA処理したHeLa細胞または対照HeLa細胞由来の粗溶解物におけるRSK活性を図示する。
【図8】c-SrcでトランスフェクトしたCEF細胞由来の粗溶解物におけるc-Src活性を図示する。
【図9】NGF処理したPC12細胞または対照PC12細胞由来の粗溶解物におけるB-Raf活性を図示する。
【図10】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるERK1/2活性を図示する。
【図11】PDGF処理したNIH3T3細胞または対照NIH3T3細胞由来の粗溶解物におけるMEK1活性を図示する。
【図12】アニソマイシン処理したRAW細胞または対照RAW細胞由来の粗溶解物におけるp38 MAPK活性を図示する。
【図13】種々のキナーゼ標的についてのOmniaチロシンキナーゼ組換え体アッセイSN比を図示する。ここで、図の各々についてのキナーゼ認識モチーフは以下のとおりである:図13AはSEQ ID NO: 42(約2.8倍)に対応し;図13BはSEQ ID NO: 43(約2.2倍)に対応し;図13CはSEQ ID NO: 45(約2.4倍)に対応し;図13DはSEQ ID NO: 44(約1.8倍)に対応し;図13EはSEQ ID NO: 46(約8.3倍)に対応し;図13FはSEQ ID NO: 48(約6.8倍)に対応し;図13GはSEQ ID NO: 47(約7.9倍)に対応し;そして図13HはSEQ ID NO: 49(約6.9倍)に対応する。
【図14】Akt/PKBキナーゼについての細胞ベースの(電磁ビーズ捕捉)キナーゼアッセイを図示する。ヒツジ抗マウスIgGを固定化したDynabeads M-280を、Aktマウスモノクローナル抗体(Invitrogen)とともに使用した。2ugの抗Akt mAbを400ugの溶解物に添加し、4℃で一晩インキュベーションした。20ulのDynabeadsを、4℃で2時間各試料に添加し、次いでビーズを3回洗浄した。20uMのAktideを1mM ATPとともに添加し、結果をM5中で5時間読み取った。単離およびキナーゼ活性センサは、選択性および調整可能なシグナルを増加させた。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
特異的キナーゼの活性を測定する方法であって、
固定化結合剤を含む固体または半固体支持体を提供する工程;
固定化結合剤を、該特異的キナーゼを含む試料と接触させて、固定化した特異的キナーゼを形成する工程;
固定化した特異的キナーゼをキナーゼ活性センサと接触させ、接触した特異的キナーゼを形成する工程であって、キナーゼ活性センサが、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチド、およびキレート剤を含む、工程;
接触した特異的キナーゼを、該キナーゼがリン酸供給源および金属イオンの存在下で該ペプチドをリン酸化するのに十分な時間、インキュベーションする工程であって、キナーゼ活性センサが、該金属イオンおよびリン酸化ペプチドと三元複合体を形成して、検出可能なシグナルを発生させる、工程;ならびに
該シグナルを検出して、それにより該特異的キナーゼの活性を測定する工程
を含む、方法。
【請求項2】
結合剤が、抗体またはその機能的断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項3】
支持体が、ガラス、プラスチック、金属、ポリマー粒子、ポリマーゲル、またはポリマー膜である、請求項1記載の方法。
【請求項4】
キナーゼ活性センサが、金属イオンと錯体を形成したときには、増強された蛍光シグナルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項5】
キレート剤が、シグナル伝達部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項6】
シグナル伝達部分が、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセン、またはキサンテンを含む、請求項5記載の方法。
【請求項7】
キレート剤が、キノリンまたはその誘導体、フェナントロリンまたはその誘導体、BAPTA、IDA、DTPAおよびその誘導体を含む、請求項1記載の方法。
【請求項8】
キナーゼ活性センサが、キレート剤から離れたシグナル伝達部分をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項9】
シグナル伝達部分が、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセン、またはキサンテンを含む、請求項8記載の方法。
【請求項10】
固定化した特異的キナーゼをATPと接触させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項11】
金属イオンが、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ga3+、Tb3+、La3+、Pb2+、Hg2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、またはSr2+である、請求項1記載の方法。
【請求項12】
ペプチドが、リン酸化されたときにマグネシウムと錯体を形成するアミノ酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項13】
キナーゼ活性センサが下記式を含む、請求項1記載の方法:
式中、少なくとも1つのR基が-SO2Xであり、Xが-OR''または- NR''R'''であり;
R'がヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり;
R''がC1-6アルキルであり;
R'''が水素またはアルキルであり;かつ
nが1、2、または3である。
【請求項14】
キナーゼ活性センサが、下記式を有するかまたはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である、請求項1記載の方法:
式中、R1が、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R2が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R3が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R4が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R5が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R6が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R7が、水素、アルキル、置換アルキル、カルボニル、または保護基であり;
R8が、水素、アルキル、置換アルキル、カルボニル、または保護基であり;
Lがリンカーであり;かつ
Yが、ペプチドである。
【請求項15】
R2、R3、R4、R5およびR6のうちの少なくとも1つがフルオロフォアである、請求項13記載の方法。
【請求項16】
ペプチドが、SEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 133のうちの少なくとも1つである、請求項1記載の方法。
【請求項17】
(a)結合剤により固定化したキナーゼ、および
(b)リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドと、キレート剤とを含むキナーゼ活性センサ
を含む組成物。
【請求項18】
特異的キナーゼに結合する結合剤と、キナーゼ活性センサとを含む、特異的キナーゼの活性を検出するためのキットであって、該キナーゼ活性センサが、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドとキレート剤とを含む、キット。
【請求項19】
ATPと、キレート剤およびリン酸化ペプチドの両方に対して親和性を有する金属イオンとをさらに含む、請求項18記載のキット。
【請求項1】
特異的キナーゼの活性を測定する方法であって、
固定化結合剤を含む固体または半固体支持体を提供する工程;
固定化結合剤を、該特異的キナーゼを含む試料と接触させて、固定化した特異的キナーゼを形成する工程;
固定化した特異的キナーゼをキナーゼ活性センサと接触させ、接触した特異的キナーゼを形成する工程であって、キナーゼ活性センサが、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチド、およびキレート剤を含む、工程;
接触した特異的キナーゼを、該キナーゼがリン酸供給源および金属イオンの存在下で該ペプチドをリン酸化するのに十分な時間、インキュベーションする工程であって、キナーゼ活性センサが、該金属イオンおよびリン酸化ペプチドと三元複合体を形成して、検出可能なシグナルを発生させる、工程;ならびに
該シグナルを検出して、それにより該特異的キナーゼの活性を測定する工程
を含む、方法。
【請求項2】
結合剤が、抗体またはその機能的断片を含む、請求項1記載の方法。
【請求項3】
支持体が、ガラス、プラスチック、金属、ポリマー粒子、ポリマーゲル、またはポリマー膜である、請求項1記載の方法。
【請求項4】
キナーゼ活性センサが、金属イオンと錯体を形成したときには、増強された蛍光シグナルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項5】
キレート剤が、シグナル伝達部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項6】
シグナル伝達部分が、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセン、またはキサンテンを含む、請求項5記載の方法。
【請求項7】
キレート剤が、キノリンまたはその誘導体、フェナントロリンまたはその誘導体、BAPTA、IDA、DTPAおよびその誘導体を含む、請求項1記載の方法。
【請求項8】
キナーゼ活性センサが、キレート剤から離れたシグナル伝達部分をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項9】
シグナル伝達部分が、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンゾアゾール、ボラポリアザインダセン、またはキサンテンを含む、請求項8記載の方法。
【請求項10】
固定化した特異的キナーゼをATPと接触させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項11】
金属イオンが、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ga3+、Tb3+、La3+、Pb2+、Hg2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、またはSr2+である、請求項1記載の方法。
【請求項12】
ペプチドが、リン酸化されたときにマグネシウムと錯体を形成するアミノ酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項13】
キナーゼ活性センサが下記式を含む、請求項1記載の方法:
式中、少なくとも1つのR基が-SO2Xであり、Xが-OR''または- NR''R'''であり;
R'がヒドロキシ、アミノ、またはチオールであり;
R''がC1-6アルキルであり;
R'''が水素またはアルキルであり;かつ
nが1、2、または3である。
【請求項14】
キナーゼ活性センサが、下記式を有するかまたはその互変異性体、立体異性体もしくは塩である、請求項1記載の方法:
式中、R1が、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R2が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R3が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R4が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R5が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R6が、フルオロフォア、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、カルボキシル、カルボキシルエステル、(カルボキシルエステル)アミノ、(カルボキシルエステル)オキシ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、SO3H、スルホニル、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり;
R7が、水素、アルキル、置換アルキル、カルボニル、または保護基であり;
R8が、水素、アルキル、置換アルキル、カルボニル、または保護基であり;
Lがリンカーであり;かつ
Yが、ペプチドである。
【請求項15】
R2、R3、R4、R5およびR6のうちの少なくとも1つがフルオロフォアである、請求項13記載の方法。
【請求項16】
ペプチドが、SEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 133のうちの少なくとも1つである、請求項1記載の方法。
【請求項17】
(a)結合剤により固定化したキナーゼ、および
(b)リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドと、キレート剤とを含むキナーゼ活性センサ
を含む組成物。
【請求項18】
特異的キナーゼに結合する結合剤と、キナーゼ活性センサとを含む、特異的キナーゼの活性を検出するためのキットであって、該キナーゼ活性センサが、リン酸化を受けることができる少なくとも1つのペプチドとキレート剤とを含む、キット。
【請求項19】
ATPと、キレート剤およびリン酸化ペプチドの両方に対して親和性を有する金属イオンとをさらに含む、請求項18記載のキット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【公表番号】特表2009−523452(P2009−523452A)
【公表日】平成21年6月25日(2009.6.25)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−551537(P2008−551537)
【出願日】平成19年1月18日(2007.1.18)
【国際出願番号】PCT/US2007/060729
【国際公開番号】WO2007/084968
【国際公開日】平成19年7月26日(2007.7.26)
【出願人】(502221282)ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成21年6月25日(2009.6.25)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年1月18日(2007.1.18)
【国際出願番号】PCT/US2007/060729
【国際公開番号】WO2007/084968
【国際公開日】平成19年7月26日(2007.7.26)
【出願人】(502221282)ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【Fターム(参考)】
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