キレート剤存在下で高安定な変異体及び変異体含有組成物
本発明は、キレート剤に対する安定性が親酵素と比べて改善されたα−アミラーゼの変異体、当該変異体を含む組成物、当該変異体をコード化する核酸、当該変異体を製造する方法、及び、当該変異体を使用する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物。
【請求項２】
前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、８０ｍＭ 塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ中、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」に記載のアッセイで測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記キレート剤が、キレート剤濃度８ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４ｍＭ未満で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ８で測定した場合に、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るクエン酸（citrate）濃度の０．９倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物。
【請求項６】
前記キレート剤が、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るクエン酸濃度の０．７倍未満、例えば０．５倍未満、例えば０．３倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記変異体が、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置195、193、197、198、200、203、206、210、212、213又は243に対応する１又は２以上の位置に、少なくとも２の置換を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記親α−アミラーゼの配列が、位置193の［G、A、S、T又はM］による；位置195の［F，W，Y，L，I又はV］による置換；位置197の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置198の［Q又はN］による；位置200の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置203の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置206の［F，W，Y，N，L，I，V，H，Q，D又はE］による；位置210の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置212の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置213の［G，A，S，T又はM］；又は位置243の［F，W，Y，L，I又はV］による置換のうち、少なくとも１つの置換により修飾される、請求項１〜７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記親α−アミラーゼの配列が、位置193のTによる；位置195のF又はYによる；位置197のF又はLによる；位置198のNによる；位置200のFによる；位置203のFによる；位置206のYによる；位置210のYによる；位置212のV、位置213のA又は位置243のFによる置換のうち、少なくとも１の置換により修飾される、請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記変異体が更に、配列番号６を番号付けに用いて、181、182、183又は184のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記変異体が、配列番号６の成熟ポリペプチドの、位置195、193、197、198、200、203、206、210、212、213又は243に対応する１又は２以上の位置に置換を含むとともに、位置116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447又は458に対応する１又は２以上の位置に置換を含む、請求項１〜１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記変異体が１８時間後、ｐＨ８及び３１℃で、キレート剤の存在下少なくとも６０％の残存活性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る請求項１〜１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記変異体が１８時間後、ｐＨ８及び３１℃で、キレート剤の存在下少なくとも７０％の残存活性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るとともに、前記残存活性が「材料及び方法」の記載に従い測定される、請求項１〜１２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記変異体が、「材料及び方法」の記載に従いＡＭＳＡで測定した場合に、親α−アミラーゼと比較して改善された洗浄性能を有する、請求項１〜１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記キレート剤が、EDTA、MGDA、EGTA、DTPA、DTPMP及びHEDPからなる群より選択される、請求項１〜１４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
ポリペプチドを調製する方法であって、
（ａ）アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を用意し、
（ｂ）配列番号６の成熟ポリペプチドの位置195、197、198、200、203、206、210、212、213又は243に対応する１又は２以上の位置を占める１又は２以上のアミノ酸を選択すると共に、更に位置116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447又は458に対応する１又は２以上の位置を選択し、
（ｃ）前記選択されたアミノ酸残基の置換若しくは欠失、又は前記選択されたアミノ酸残基に隣接する１又は２以上のアミノ酸残基の挿入により前記配列を修飾し、
（ｄ）前記修飾された配列を有する変異ポリペプチドを生成し、
（ｅ）前記変異ポリペプチドをアミラーゼ活性及び安定性について検証し、
（ｆ）アミラーゼ活性を有すると共に、前記親ポリペプチドと比較してキレート剤存在下の安定性が向上した変異ポリペプチドを選択し、
前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、方法。
【請求項１７】
親α−アミラーゼの変異体であって、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に改変を含むと共に、更に116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（i） 前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
（ii） 前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii） 前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体。
【請求項１８】
親α−アミラーゼの変異体であって、181、182、183、又は184のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、更に116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（i） 前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
（ii） 前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii） 前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体。
【請求項１９】
前記変異体が、キレート剤を含む組成物中で、親α−アミラーゼ又は配列番号６と比較して改善された安定性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１７又は１８に記載の変異体。
【請求項２０】
前記変異体が１８時間後、ｐＨ８で、キレート剤の存在下、少なくとも６０％の残存活性をし、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るとともに、前記残存活性が「材料及び方法」の記載に従い測定される、請求項１７〜１９の何れか１項に記載の変異体。
【請求項２１】
前記変異体が、「材料及び方法」の記載に従いＡＭＳＡで測定した場合に、親α−アミラーゼと比較して改善された洗浄性能を有する、請求項１７〜２０の何れか１項に記載の変異体。
【請求項２２】
アミロース分解活性を有する前記変異体が、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２０の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有する、請求項１７〜２１の何れか１項に記載の変異体。
【請求項２３】
アミロース分解活性を有する前記変異体が、（i） 配列番号５、７、９又は１１、１７、１９の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ii） 配列番号５、７、９、１１、１７、１９の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は （iii） （i） 又は （ii） の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より一層好ましくは少なくとも中ないし高ストリンジェンシー条件、最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化される、請求項１７〜２２の何れか１項に記載の変異体。
【請求項２４】
請求項１７〜２３の何れか１項に記載の変異体をコード化する単離ヌクレオチド配列。
【請求項２５】
請求項２４に記載のヌクレオチド配列を含む組換宿主細胞。
【請求項１】
親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物。
【請求項２】
前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、８０ｍＭ 塩化カリウム及び４９ｍＭ ＥＰＰＳ中、２１℃及びｐＨ８．０で測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、「材料及び方法」に記載のアッセイで測定した場合に、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記キレート剤が、キレート剤濃度８ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４ｍＭ未満で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
親α−アミラーゼの変異体を含む組成物であって、前記変異体が、配列番号６に従う番号付けを用いて195、193、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群より選択される１又は２以上の位置に置換を含み、前記組成物が更に少なくとも１のキレート剤を含み、前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ８で測定した場合に、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るクエン酸（citrate）濃度の０．９倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、組成物。
【請求項６】
前記キレート剤が、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るクエン酸濃度の０．７倍未満、例えば０．５倍未満、例えば０．３倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記変異体が、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置195、193、197、198、200、203、206、210、212、213又は243に対応する１又は２以上の位置に、少なくとも２の置換を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記親α−アミラーゼの配列が、位置193の［G、A、S、T又はM］による；位置195の［F，W，Y，L，I又はV］による置換；位置197の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置198の［Q又はN］による；位置200の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置203の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置206の［F，W，Y，N，L，I，V，H，Q，D又はE］による；位置210の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置212の［F，W，Y，L，I又はV］による；位置213の［G，A，S，T又はM］；又は位置243の［F，W，Y，L，I又はV］による置換のうち、少なくとも１つの置換により修飾される、請求項１〜７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記親α−アミラーゼの配列が、位置193のTによる；位置195のF又はYによる；位置197のF又はLによる；位置198のNによる；位置200のFによる；位置203のFによる；位置206のYによる；位置210のYによる；位置212のV、位置213のA又は位置243のFによる置換のうち、少なくとも１の置換により修飾される、請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記変異体が更に、配列番号６を番号付けに用いて、181、182、183又は184のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記変異体が、配列番号６の成熟ポリペプチドの、位置195、193、197、198、200、203、206、210、212、213又は243に対応する１又は２以上の位置に置換を含むとともに、位置116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447又は458に対応する１又は２以上の位置に置換を含む、請求項１〜１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記変異体が１８時間後、ｐＨ８及び３１℃で、キレート剤の存在下少なくとも６０％の残存活性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る請求項１〜１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記変異体が１８時間後、ｐＨ８及び３１℃で、キレート剤の存在下少なくとも７０％の残存活性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るとともに、前記残存活性が「材料及び方法」の記載に従い測定される、請求項１〜１２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記変異体が、「材料及び方法」の記載に従いＡＭＳＡで測定した場合に、親α−アミラーゼと比較して改善された洗浄性能を有する、請求項１〜１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記キレート剤が、EDTA、MGDA、EGTA、DTPA、DTPMP及びHEDPからなる群より選択される、請求項１〜１４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
ポリペプチドを調製する方法であって、
（ａ）アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を用意し、
（ｂ）配列番号６の成熟ポリペプチドの位置195、197、198、200、203、206、210、212、213又は243に対応する１又は２以上の位置を占める１又は２以上のアミノ酸を選択すると共に、更に位置116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447又は458に対応する１又は２以上の位置を選択し、
（ｃ）前記選択されたアミノ酸残基の置換若しくは欠失、又は前記選択されたアミノ酸残基に隣接する１又は２以上のアミノ酸残基の挿入により前記配列を修飾し、
（ｄ）前記修飾された配列を有する変異ポリペプチドを生成し、
（ｅ）前記変異ポリペプチドをアミラーゼ活性及び安定性について検証し、
（ｆ）アミラーゼ活性を有すると共に、前記親ポリペプチドと比較してキレート剤存在下の安定性が向上した変異ポリペプチドを選択し、
前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、方法。
【請求項１７】
親α−アミラーゼの変異体であって、195、197、198、200、203、206、210、212、213、243からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に改変を含むと共に、更に116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群より選択される位置に対応する１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（i） 前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
（ii） 前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii） 前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体。
【請求項１８】
親α−アミラーゼの変異体であって、181、182、183、又は184のアミノ酸領域内に、少なくとも１の、少なくとも２の、又は少なくとも３の欠失を含み、更に195、197、198、200、203、206、210、212、213及び243からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、更に116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447及び458からなる群より選択される１又は２以上の位置に改変を含み、
（ａ）前記改変が各々独立に、
（i） 前記位置の下流側に隣接するアミノ酸の挿入、
（ii） 前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
（iii） 前記位置を占めるアミノ酸の置換であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）各位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に対応する、変異体。
【請求項１９】
前記変異体が、キレート剤を含む組成物中で、親α−アミラーゼ又は配列番号６と比較して改善された安定性を有し、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得る、請求項１７又は１８に記載の変異体。
【請求項２０】
前記変異体が１８時間後、ｐＨ８で、キレート剤の存在下、少なくとも６０％の残存活性をし、前記キレート剤が１０ｍＭ未満の濃度で、２１℃及びｐＨ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭまで低減し得るとともに、前記残存活性が「材料及び方法」の記載に従い測定される、請求項１７〜１９の何れか１項に記載の変異体。
【請求項２１】
前記変異体が、「材料及び方法」の記載に従いＡＭＳＡで測定した場合に、親α−アミラーゼと比較して改善された洗浄性能を有する、請求項１７〜２０の何れか１項に記載の変異体。
【請求項２２】
アミロース分解活性を有する前記変異体が、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２０の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有する、請求項１７〜２１の何れか１項に記載の変異体。
【請求項２３】
アミロース分解活性を有する前記変異体が、（i） 配列番号５、７、９又は１１、１７、１９の成熟ポリペプチドコーディング配列、（ii） 配列番号５、７、９、１１、１７、１９の成熟ポリペプチドコーディング配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は （iii） （i） 又は （ii） の全長相補鎖と、好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中ストリンジェンシー条件、より一層好ましくは少なくとも中ないし高ストリンジェンシー条件、最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコード化される、請求項１７〜２２の何れか１項に記載の変異体。
【請求項２４】
請求項１７〜２３の何れか１項に記載の変異体をコード化する単離ヌクレオチド配列。
【請求項２５】
請求項２４に記載のヌクレオチド配列を含む組換宿主細胞。
【公表番号】特表２０１３−５１９３６５（Ｐ２０１３−５１９３６５Ａ）
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５２３９８（Ｐ２０１２−５５２３９８）
【出願日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１９８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９８５３１
【国際公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１９８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９８５３１
【国際公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
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