本発明は、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチドおよびＰＥＧ部分間の複合体を提供する。複合体は、ペプチドおよび修飾基の間に介在されると共に、共有結合された無処置グリコシルリンク基を介してリンクされている。複合体は、グリコシル化および未グリコシル化ペプチドの両方から、グリコシルトランスフェラーゼの作用により形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、修飾糖質部分をペプチド上のアミノ酸またはグリコシル残基のいずれかに結合する。この複合体を含む医薬品配合物がまた提供されている。複合体の調製方法もまた本発明の範囲内である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
式、
【化１】

（式中、
Ｄは、−ＯＨおよびＲ^１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル−Ｒ^１から選択されるメンバーであり、
Ｒ^１は、直鎖ポリ（エチレングリコール）残基および分岐ポリ（エチレングリコール）残基から選択されるメンバーを含む部分であり、および
Ｍは、Ｈ、金属および単一の陰電荷から選択されるメンバーであり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ここで、ＤがＯＨであるときＧはＲ^１−Ｌ−であり、およびＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルであるときＤはＲ^１−Ｌ−ＮＨ−である）
を有する修飾シアル残基を含むグリコシルリンカーを含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）グリコシル部分、
【化２】

を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
式、
【化３】

を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
前記ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌへ転移させる酵素に、前記転移に適切な条件で接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
Ｌ−Ｒ^１が、式、
【化４】

（式中、
ａは、０〜２０から選択される整数である）
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ^１が、
【化５】

（式中、
ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑは、０〜２０から選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ^１が、
【化６】

（式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ^１が、
【化７】

（式中、
ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシルリンカーが、式、
【化８】

を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド複合体が、
【化９】

（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である）
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチド複合体が、少なくとも１つの前記グリコシルリンカーを含み、ここで、前記グリコシルリンカーの各々は、以下の式、
【化１０】

（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数である）
から独立して選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチド複合体が、
【化１１】

【化１２】

（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数であり、および
式中、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない）
から選択される式に基づく前記グリコシルリンカーの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチド複合体が、
【化１３】

【化１４】

（式中、ＡＡは前記ペプチド複合体のアミノ酸残基であり、およびｔは、０および１から選択される整数であり、および
式中、Ｇを含まないシアリル部分の０および２つから選択されるメンバーがない）
から選択される式に基づく少なくとも１つの前記グリコシルリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、セリンおよびスレオニンから選択されるアミノ酸残基を介して結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アスパラギン残基であるアミノ酸残基を介して結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アスパラギン残基が、Ｎ１５２、Ｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記因子ＶＩＩａペプチドが生理活性因子ＶＩＩａペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを好適な宿主において発現させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主が哺乳類発現系である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
それを必要とする対象における状態を処置する方法であって、前記状態は前記対象における易感染性凝固効力により特徴付けられ、前記対象における前記状態の回復に有効な量の、請求項１に記載の方法により産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項１９】
ある量の、請求項１に記載の方法により産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を前記哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における凝固効力を増強させる方法。
【請求項２０】
式、
【化１５】

（式中、
Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７またはＯＲ^７であり、
式中、
Ｒ^７は、Ｈ、置換または非置換アルキルまたは置換または非置換ヘテロアルキルを表し、
Ｒ^３およびＲ^４は、Ｈ、置換または非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９から独立して選択されるメンバーであり、
式中、
Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキルまたはシアル酸から独立して選択され、
Ｒ^１６およびＲ^１７は、独立して選択される高分子アームであり、
Ｘ^２およびＸ^４は、高分子部分Ｒ^１６およびＲ^１７をＣに結合する、独立して選択されるリンケージ断片であり、
Ｘ^５は非反応性基であり、および
Ｌ^ａはリンカー基である）
を有する修飾シアリル残基を含むグリコシルリンカーを含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体の製造方法であって、
（ａ）グリコシル部分、
【化１６】

を含む因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを、
式、
【化１７】

を有するＰＥＧ−シアル酸ドナー部分と、
ＰＥＧ−シアル酸を前記グリコシル部分のＧａｌへ転移させる酵素に、前記転移に適切な条件で接触させるステップを含む、方法。
【請求項２１】
部分、
【化１８】

が、
【化１９】

（式中、
ｅ、ｆ、ｍおよびｎは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑは、０〜２０から選択される整数である）
から選択されるメンバーである式を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
部分、
【化２０】

が、
【化２１】

（式中、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、および
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である）
から選択されるメンバーである式を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記グリコシルリンカーが式、
【化２２】

を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体が式、
【化２３】

（式中、
ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基であり、
ｔは、０および１から選択される整数であり、および
Ｒ^１５は修飾シアリル部分である）
を有する少なくとも１つのグリコシルリンカーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記グリコシルリンカーが、前記因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドに、アスパラギン残基であるアミノ酸残基を介して結合されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記アスパラギン残基が、Ｎ１５２、Ｎ３２２およびこれらの組み合わせから選択されるメンバーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記因子ＶＩＩａペプチドが生理活性因子ＶＩＩａペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチドを好適な宿主において発現させるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記宿主が哺乳類発現系である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
それを必要とする対象における状態を処置する方法であって、前記状態は前記対象における易感染性凝固効力により特徴付けられ、前記対象における前記状態の回復に有効な量の、請求項２０に記載の方法により産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
ある量の、請求項２０に記載の方法により産生された因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド複合体を前記哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物における凝固効力を増強させる方法。
【請求項３３】
ａ）シアリダーゼ、
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ、エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼから選択されるメンバーである酵素、
ｃ）修飾糖質／修飾シアリル残基、
ｄ）因子ＶＩＩ／因子ＶＩＩａペプチド
を組み合わせて、前記因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体を合成するステップを含む、因子ＶＩＩまたは因子ＶＩＩａペプチド複合体の合成方法。
【請求項３４】
前記組み合わせるステップが、１０時間未満の時間である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
キャッピングステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図３Ｇ】

【図３Ｈ】

【図３Ｉ】

【図３Ｊ】

【図３Ｋ】

【図３Ｌ】

【図３Ｍ】

【図３Ｎ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１３Ｃ】

【図１３Ｄ】

【図１３Ｅ】

【図１３Ｆ】

【図１３Ｇ】

【図１３Ｈ】

【図１３Ｉ】

【図１３Ｊ】

【図１３Ｋ】

【図１３Ｌ】

【図１３Ｍ】

【図１３Ｎ】

【図１３Ｏ】

【図１３Ｐ】

【図１３Ｑ】

【図１３Ｒ】

【図１３Ｓ】

【図１３Ｔ】

【図１３Ｕ】

【図１３Ｖ】

【図１３Ｗ】

【図１３Ｘ】

【図１３Ｙ】

【図１３Ｚ】

【図１３ＡＡ】

【図１３ＢＢ】

【図１３ＣＣ】

【公表番号】特表２００９−５１５５０８（Ｐ２００９−５１５５０８Ａ）
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２７２１２（Ｐ２００８−５２７２１２）
【出願日】平成１８年８月２１日（２００６．８．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２６４９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２２５１２
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０００６２２５４）ネオス　テクノロジーズ　インコーポレイテッド (19)
【Ｆターム（参考）】