グルタミン産生能を有する新規のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株
本発明はｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの新規の菌株、特にＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種（これは、腸管内で生存する、あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏでグルタミン及び必要に応じてアルギニンを産生する能力を有する）に、そして前記菌株を含有する組成物にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでグルタミン及び必要に応じてアルギニンを産生する能力を有する新規のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
グルタミンは、体内で最も豊富なアミノ酸である。それは、組織間の「窒素シャトル（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｈｕｔｔｌｅ）」及び腸細胞、結腸細胞（ｃｏｌｏｎｏｃｙｔｅ）、リンパ球及び増殖細胞の燃料である。グルタミン欠乏患者においては消化管の機能が害され、これは特に、腸管内腔から門脈循環への細菌及び／またはエンドトキシンのトランスロケーションに対する保護が損なわれているためである。グルタミンが欠乏すると、深刻な疾患の及び損傷を受けた患者となり、そして、高頻度の感染や筋肉の消耗の一因となり得る。
【０００３】
グルタミンを腸に投与することにより、あらゆる症状の患者に健康的で有益な効果をもたらしている。集中治療室の多臓器不全患者においてグルタミン投与は、患者における感染症の併発が減少した（Houdijk et al., Lancet, 352:772-776, 1998）。同様の効果が、グルタミンを補充した非経口的栄養を受ける骨髄移植を行った患者において観察された（Ziegler et al., Annals Internal Medicine, 116:821-828, 1992）。他の例は短小腸症候群の患者でみられ、これはグルタミン補給後に吸収能が相当改善した（Byrne et al., Annals of Surgery, 222:243-255, 1995）。化学療法中及び後の経口グルタミン補給も、化学療法が関与する口内炎の持続時間及び重篤度の両方が著しく減少することが示された。経口グルタミンは、集中的癌化学療法の結果として口腔潰瘍発生のハイリスクの多くの患者の快適性を増加する単純及び有用な手段のようであると結論付けられた（Anderson et al., Cancer 1998; 83:1433-9）。激しい運動の後のグルタミンの栄養補給も、感染症の発生、特に、上気道感染を減少している（Castell , Amino acids 2001; 20（1）:49-61）。しかし、免疫抑制に対するグルタミンの正確な効果はいまだ確立されていない。
【０００４】
グルタミンに関する主な技術的な困難性は、加工及び保存中にグルタミンは容易にグルタミン酸（グルタメート）に変化することであり、すなわち、グルタミンは、経口投与を目的とする製剤に組み込むことが困難な比較的不安定な化合物である。さらに、経口投与したグルタミンは、胃の酸性環境ではかなりの割合がグルタミン酸に変化し、そして、決して腸に到達せず、そしてグルタミンとして吸収され得ない。
【０００５】
アルギニンは免疫機能を高め、創傷治癒を助長する。アルギニン投与は、術後の患者及び集中治療下の患者に対して使用される。多くの臨床研究において、アルギニンはＲＮＡ及び魚油のような他の物質と共に投与されている。アルギニン投与は、術後の免疫応答を調節することが指摘されている。Daly, John E., et al. Surgery 112:55-67, 1992では、アルギニン、ＲＮＡ及びオメガ−３−脂肪酸を補足した経腸栄養剤を術後の患者に投与すると、種々のメカニズムを通して免疫防御が改善することを示している。アルギニンは、化学放射線療法及び手術を受けた患者の合併症を軽減し（Tepaske et al., 2001; Lancet 358: 696-701）、そして、患者が集中治療室に滞在する期間を短縮する（Bauer et al., 1995, Critical Case Medicine 23: 436-449）。
【０００６】
生存期間の増加は、アルギニン補給食を摂取させた動物において観察され得た。定量的なコロニー数及び残存している生菌の算出率は、アルギニンを摂取した動物において、移動した生物体を殺す能力がかなり高くなっていることを示している（Adawi, D., et al., 1997, Hepatology 25: 642-647）。
【０００７】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．菌株、すなわちビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、ヒトの大腸、特に母乳育ちの赤ん坊に、たいてい多数存在する。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．由来の細菌は、プロバイオティクス（すなわち、摂取することにより宿主に健康的で有益な効果を提供する生きている細菌）とみなされている。大腸中の多数のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．は、健康的で有益な効果を有すると主張されている。しかし、前記の有益な効果の作用機構はほとんど知られていない。
【０００８】
先行技術
Matteuzzi et al. ［Ann. Microbiol.（Inst. Pasteur）1978; 129 B, 175-181］は異なる生息地由来の多数のビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏ−ｂａｃｔｅｒｉａ）において、培養液中に遊離アミノ酸を放出するそれらの能力について調査した。得られたデータは、Ｂｉｆｉｄｏ−ｂａｃｔｅｒｉａの幾つかの種は増殖に必要な全てのアミノ酸を合成でき、そしてまた、培養液中に前記化合物を放出できることを示した。Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ及びＢ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓは最も優れた生産菌であることが分かり、そして、培養液中に最も一般的に見られるアミノ酸は主にアラニン、バリン及びアスパラギン酸であった。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．は消化管のアミノ酸代謝を担うと推測された。
【０００９】
ＷＯ０１／８３７００（メリーランド大学）は、胃腸障害、新生児壊死性腸炎（ＮＥＣ）及び細菌性敗血症の治療及び予防用の組成物及び方法を開示している。該組成物はグラム（＋）細菌（特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とグルタミンの組み合わせを含有しており、そして、経口的に及び鼻口的に投与されるべきである。該組成物はグラム（−）細菌のような細菌性因子の移動を妨害すると言われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
静脈を経由して投与したグルタミンは非常に効果的だが、高価で煩雑である。グルタミンを投与するより良い方法は、当然、腸内でかなりの量のグルタミンを産生できる能力を有する細菌株を使用することであろう。しかし、これまでに、このような菌株についての記載はない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の要約
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの特定の菌株がヒト大腸内の環境を模倣した増殖培地中でグルタミンを産生できることを驚くべきことに今日発見した。そして、前記の菌株は、哺乳類、特にヒトに対して経口で、または、腸に投与した後にｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生するために使用し得る。菌株によってはアルギニンも産生し得る。
【００１２】
本発明の記載
本発明は、腸管内で生存する能力及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。特に、グルタミンはヒトの大腸で産生される。このような環境で生存するということは、各個体由来の糞便において、異なるサンプリング時に、細菌株が分離されることを意味する。従って、細菌は、しばらくの間、それらの宿主内で明らかに増殖し、そして生存する。本発明のビフィドバクテリウム菌株（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ）は、ｐＨ７以下、特に５．５−６．５の栄養培地で増殖できる。ロゴサ寒天培地（Ｒｏｇｏｓａ ａｇａｒ）はこのような培地の一例であり、もう一つはＭＲＳである。
【００１３】
好ましい側面に従うと、新規の菌株はアンモニアを同化する能力も有する。
【００１４】
本発明は特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する菌株に関する。
【００１５】
特定の側面に従うと、本発明はまた、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで、位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約２８４０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。このような菌株は、例えば、the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに2002年8月23日に寄託された菌株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９（ＤＳＭ １５１５８）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１（ＤＳＭ １５１５９）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６（ＤＳＭ １５１６０）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８（ＤＳＭ １５１６１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９（ＤＳＭ １５１６２）である。
【００１６】
他の側面に従うと、本発明は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約８９５ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株にも関する。好ましい側面に従うと、前記菌株はグルタミン酸を減少させることなくグルタミンを産生できる。
【００１７】
本発明は特に、菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６（これらはthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH に2002年8月23日に寄託され、そして、それぞれ、アクセッション番号ＤＳＭ １５１５９及びＤＳＭ １５１６０が与えられている）、またはこれらの変異株に関する。前記菌株は、グルタミン酸を減少させることなくグルタミンを産生できる。
【００１８】
もう一つの側面に従うと、本発明は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付け、位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約３４２０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株にも関する。好ましい側面に従うと、前記菌株はアルギニン産生能を有する。
【００１９】
本発明は特に以下の菌株（これらは全てthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH に2002年8月23日に寄託され、そして寄託番号が与えられており、それはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２である菌株）、及び、これらの変異株にも関する。前記菌株は、グルタミンに加えてアルギニンも産生できる。
【００２０】
新規の菌株は、全て幼い子供由来の糞便から分離し、そして、ｐＨ７以下の寒天上で培養することにより選択した。該菌株は、その後、リポタイピング及びＲＥＡにより特徴づけられた。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、１以上の本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を担体と組み合わせて含有する組成物である。担体の例は、オートミールかゆ、乳酸発酵食品、イヌリン、ラクツロース、フルクトオリゴ糖、レジスタントスターチ（ｒｅｓｉｓｔｅｎｔ ｓｔａｒｃｈ）、β−グルカン及びグアーガムである。ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖を促進し、そしてグルタミン及びアルギニンのそれぞれの産生量を増加させ、大腸でのアンモニア同化を高めるために、食物繊維も組成物に加えられるべきである。食物繊維は、例えばイヌリン、フルクトオリゴ糖、マルトデキストリン、β−グルカン及びグアーガムである。このように、本発明は、さらに食物繊維を含有する記載したような組成物にも関する。
【００２２】
本発明の組成物（懸濁液、錠剤、カプセル、粉末のような）は経口投与され得る。これらは浣腸剤としても投与され得る。
【００２３】
本発明の組成物は、担体が食品である食品組成物であり得る。グルタミン産生Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、若い子供、年配者、筋肉機能を改善して健康を保つこと及び運動後の免疫低下を回避することを望む運動競技や通常の消費者に与えられ得る。アルギニン産生Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、健康を保ち、そして免疫機能における良くない影響を避けることを望む通常の消費者に与えられ得る。
【００２４】
本発明の組成物は薬学的組成物であり得、ここで、担体は、治療的に許容される担体である。グルタミン産生株は（アルギニン産生株と同様に）、さらに経腸栄養法の様式で使用され得る。
【００２５】
本発明のアンモニアを同化するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、手術及び合併症の後の、あるいは重篤な感染症、中毒のような他の疾患の後の、集中治療下の患者にみられるような一時的な腎不全を有する患者に与えられ得る。このような場合、腎機能が回復することが予測でき、そして、消化官から負荷される窒素を減少させることを目的とする治療により、透析の必要性を回避し得る。アンモニアを同化する菌株は、肝疾患や脳症（例えば、肝炎または中毒あるいはそれに続くアルコール乱用）の患者に投与され得る。消化官からの窒素含有物質の吸収が低下すると、これらの状況において、脳症及び肝機能が改善し得る。アンモニアを同化するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、若い子供、年配者または、アンモニアを尿素に変換する肝臓の働きを妨害する疾患を患っている、または、消化管からの窒素の吸収が増加している消費者（例えば、移植または透析の必要がまだない軽度から中程度の慢性の腎または肝不全患者）に与えられ得る。
【００２６】
特定の側面に従うと、本発明の組成物は１以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株も含有し得る。
【００２７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉの任意の有益な効果に加えて、前記細菌が酸素の有害な影響からビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）を保護し得る。
【００２８】
もう一方の側面に従うと、本発明は、治療での使用のための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する１以上の菌株に関する。
【００２９】
本発明は、多臓器不全及び腸不全を有する集中治療患者を治療するための、化学療法患者及び炎症性疾患を有する患者を予防するための、及び、大手術後に術後投与するための薬剤の調製のための、１以上の菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２；またはこれらの変異株の使用に関する。
【実施例】
【００３０】
実験
菌株の分離
全ての菌株は若い子供（生後１週間〜１年）の糞便から分離した。糞便試料を希釈溶液（０．９％［ｗ／ｖ］ＮａＣｌ、０．１％［ｗ／ｖ］ペプトン、０．１％［ｗ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ８０、０．０２％［ｗ／ｖ］システイン−ＨＣｌ）で連続的に希釈し、次に、ロゴサ寒天平板上に塗抹した。分離株はロゴサ寒天培地（ｐＨ５．４）上でのそれらの増殖能を考慮して選択し、そして、一個体から繰り返し分離した。３７℃で７２時間培養した後、ロゴサ寒天平板から分離株を採取した。これらを、属特異的なＰＣＲ（Roy et al., 2000; FEMS Microbiological Letters 191:17-24）により属レベルまで同定し、次いで、１６Ｓ ｒＤＮＡシークエンスにより種レベルまで同定した（Pettersson et al., 2002; Systematic and Applied Microbiology 23:332-336）。菌株は、サンプリングの間１〜４週間に、同じ個体から少なくとも２回分離され得、これは、菌株が胃腸管（ＧＩ−ｔｒａｃｔ）にコロニーを形成する特定の能力を有することを強く示している。リボタイピング（すなわち、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）である）により菌株を同定し、次いで、ＲＥＡ（すなわち、制限エンドヌクレアーゼ分析）により同定した。
【００３１】
以下の菌株を分離した。：
１）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい（ｓｏｕｒ）”においを発する。
【００３２】
２）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２０；ロゴサ寒天上で増殖でき、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい”においを発する。
【００３３】
３）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい”においを発する。
【００３４】
４）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２２；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい（ｎｉｃｅ）”においを発する。
【００３５】
５）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２３；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい”においを発する。
【００３６】
６）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２４；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい”においを発する。
【００３７】
７）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２５；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００３８】
８）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００３９】
９）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ ＣＵＲＥ ２７；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００４０】
１０）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００４１】
１１）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００４２】
１２）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ３０；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００４３】
グルタミン産生
以下の手順により、ブロスにおけるグルタミン産生について、分離株１−１２を試験した。
【００４４】
試験菌株を、Matteuzzi et al.（Ann. Microbil. （Inst. Pasteur, 1978, 129 B:175-181））により記載された培地を改良した増殖培地（ブロス）中、３７℃で４日間培養した。ブロスは以下から構成された：酢酸ナトリウム、１０ｇ／ｌ；アスコルビン酸、１０ｇ／ｌ；硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、５ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、３ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、３ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３２ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ、０．００７ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、０．０１ｇ／ｌ；酵母エキス、０．５ｇ／ｌ；グルコース、２０ｇ／ｌ；Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍｌ／ｌ。ｐＨは、オートクレーブの前に１Ｍ ＮａＯＨで６．１８−６．２４に調整した。
【００４５】
ブロス中のグルタミン濃度は、細菌の接種前及び試験菌株の増殖後に測定した。増殖後、培養液を遠心分離し、次いで、無菌的にろ過し、その後、細胞のない上清を−８０℃で冷凍した。スルホサリチル酸を添加し、そして水酸化リチウムでｐＨを調整した後に、アミノ酸を自動アナライザー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ２０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分析した。
【００４６】
種々の試験菌株が増殖した後のブロス中のグルタミン及びグルタミン酸濃度の増加を、以下の表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
全ての試験菌株が幾分かのグルタミンを産生したが、１２の試験菌株のうち７菌株だけが比較的多量のグルタミンを産生した（＞２０μｍｏｌ／ｌ）。２菌株（ＣＵＲＥ２１及びＣＵＲＥ２６）を除く全てにおいて、培地中のグルタミン酸のかなりの減少に伴いグルタミンが増加した。細菌を添加していない培地では、グルタミン酸の平均初期濃度は２２３μｍｏｌ／ｌであり、一方、グルタミン含有量は０であった。ＣＵＲＥ２０、ＣＵＲＥ２３及びＣＵＲＥ２４の３菌株は、培地中の全ての利用可能なグルタミン酸を消費し、一方、ＣＵＲＥ２８では２４７μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２９では２２０μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２２では１８７μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ１９では１２８μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ３０では１６０μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２７では１５１μｍｏｌ／ｌ及びＣＵＲＥ２５では４７μｍｏｌ／ｌでグルタミン酸濃度が減少した。これらの細菌がグルタミン酸をグルタミンに変換したかどうか推測し得る。２つの菌株（ＣＵＲＥ２１及びＣＵＲＥ２６）は培地中のグルタミン酸濃度を全く低下させることなくグルタミンを産生した。他の菌株とは対照的に、それらはブロス中のグルタミン酸濃度を高めた。
【００４９】
アルギニン産生
各試験菌株のアミノ酸産生は、Matteuzzi et al.（1978）により記載された培地を改良した増殖培地（ブロス）中、３７℃で４日間試験菌株を増殖させた後に測定した。該ブロスは以下を含む：酢酸ナトリウム、１０ｇ／ｌ；アスコルビン酸、１０ｇ／ｌ；硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、５ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、３ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、３ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３２ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ、０．００７ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、０．０１ｇ／ｌ；酵母エキス、０．５ｇ／ｌ；グルコース、２０ｇ／ｌ；Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍｌ／ｌ。ｐＨは、オートクレーブ処理の前に１Ｍ ＮａＯＨで６．１８−６．２４に調整した。
【００５０】
該ブロス中のアミノ酸濃度は、細菌を接種する前及び試験菌株の増殖後に測定した。増殖後、培養液を遠心分離し、次いで無菌的にろ過し、続いて細胞のない上清を−８０℃で冷凍した。アミノ酸はスルホサリチル酸を添加し、そして水酸化リチウムでｐＨを調整した後に、自動アナライザー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ２０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分析した。
【００５１】
種々の試験菌株の増殖後のブロス中のアルギニン及びシトルリンの濃度の増加を、表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
１２の試験菌株のうち３株では、アルギニン濃度が１０μｍｏｌ／ｌより多く増加した（すなわち、ＣＵＲＥ１９、ＣＵＲＥ２８及びＣＵＲＥ２９）。前記菌株のうち２つは、シトルリンもかなり多量に産生した（＞１００μｍｏｌ／ｌ）（すなわち、ＣＵＲＥ１９及びＣＵＲＥ２８）。シトルリンはアルギニンの脱アミノ化によって、もしくは、ＮＯ−合成酵素及びＮＯ産生のいずれかによって産生される。シトルリン産生はまた、初期段階におけるアルギニン産生を反映する。
【００５４】
また、試験菌株の増殖中、ブロス中に他のアミノ酸も浸透した（表３参照）。ＣＵＲＥ２１はシトルリンまたはアルギニンのいずれも産生しなかったが、多量のアスパラギン酸及びチロシンを産生した。ＣＵＲＥ２６はシトルリンは全く産生しなかったが、非常に少量のアルギニン、及び、広範囲のスペクトルにおいて種々のアミノ酸を産生した。さらに、ＣＵＲＥ２６は、ブロス中のプロリン濃度を増加させた唯一の試験菌株であった。全ての試験菌株はトレオニンを産生した。
【００５５】
【表３】
【００５６】
値は、３つまたは２つのそれぞれの培養物由来の３つまたは２つの試料の平均値を表す。
【００５７】
遺伝子型の同定
ＲＥＡ
菌株は、染色体ＤＮＡの切断パターンについて、制限エンドヌクレアーゼ分析−ＲＥＡ−法（Stahl M, Molin G, Persson A, Ahrne S及びStahl S, International Journal of Systematic Bacteriology, 40:189-193, 1990に従う、及び、さらにJohansson, M-L., et al., International Journal of Systematic Bacteriology, 45:670-675, 1995により開発された方法）により試験した。ＲＥＡについて、以下のように概略を示し得る：本研究に伴う菌株由来の染色体ＤＮＡを準備し、次いで、制限エンドヌクレアーゼにより切断した。０．７５μｇの各ＤＮＡは、１０ユニットのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて、３７℃で４時間それぞれ消化した；各エンドヌクレアーゼは別々に使用した。切断されたＤＮＡ断片は、サブマージ水平型アガロース平板ゲル（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ａｇａｒｏｓｅ ｓｌａｂ ｇｅｌｓ）を使用したゲル電気泳動によりサイズについて分離した。ゲルは１５０ｍｌの０．９％アガロースからなり（超純粋ＤＮＡグレード；低電気浸透（ｌｏｗ ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏ ｏｓｍｏｓｉｓ）；ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＭＤ， ＵＳＡ）、そして平板ゲルとしてキャストされた（１５０×２３５ｍｍ）。０．２μｇの高分子量ＤＮＡマーカー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＭＤ， ＵＳＡ）は、０．５μｇのＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、スタンダードとして使用した。フィコールローディングバッファー（Ｆｉｃｏｌｌ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（２ｇのフィコール、８ｍｌの水、０．２５％のブロムフェノール）中で試料のＤＮＡをアプライすることにより、最小のバンドの歪みと最大の鮮明さを達成した。
【００５８】
約６−８℃で１８時間、４０Ｖの一定圧でゲルを泳動した。泳動中に、バッファー（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ、２３ｍＭ Ｈ３ＰＯ４、２ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、ｐＨ８．３）を再循環させた。その後、ゲルをエチジウムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）で２０分間染色し、次いで蒸留水で汚れを落とし、ＵＶトランスイルミネーター（ＵＶＰ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｇａｂｒｉｅｌ，ＵＳＡ）により３０２ｎｍで可視化し、そして写真を撮った。ゲル電気泳動を行うこの方法では、分子量１．２×１０６に至るまで良好に分散し及び比較的良好に分離されたバンドが得られる。
【００５９】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＲＦＬＰ（リボタイピング）
染色体の調製及び染色体ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析は、先に述べたように行った（Stahl et al., 1990, Stahl et al., 1994）。
【００６０】
プローブはＬ．ｃａｓｅｉ ｓｐｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４２０ｂｐの断片（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで、位置５０６〜９２６）であり、これは、ＰＣＲにより得られ、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により供給される使用説明書に従ったＤＩＧ ＤＮＡ標識技術により標識した。反応に使用したプローブ量は５０ｎｇであった。
【００６１】
サザンブロットハイブリダイゼーション．１μｇの染色体ＤＮＡを１０ＵのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で３７℃で４時間消化した。アガロースゲル電気泳動による制限断片の分離は、Stahl et al., 1994に従って行った。ＤＩＧ−標識分子量ＤＮＡマーカーＩＩ及び分子量ＤＮＡマーカーＶＩは、スタンダードとして使用した（Ｒｏｃｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＤＮＡは、正に帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）上に１２０℃で３０分間ベーキングすることにより固定した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び基質ＣＳＰＧ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）を使用したケモルミネッセント検出は、製造業者により提供される使用説明書に従って行った。ハイブリダイゼーション温度は６８℃であった。試験の結果、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した場合、全ての菌株（ＣＵＲＥ１９、２１、２６、２８及び２９）において、分子量約２８４０ｋｂの１つのシングルバンドが生じた。染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合、菌株ＣＵＲＥ２１及び２６において、分子量約８９５ｋｂのシングル断片上に１６Ｓ ｒＲＮＡに関する遺伝子が存在し、一方、分子量約３２４０ｋｂのもう１つのシングルバンドが、ＣＵＲＥ１９、２８及び２９において得られた。
【００６２】
ｉｎ ｖｉｖｏでの試験
試験１．ラットの大腸炎を誘発するＤＤＳに対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の影響
本研究の目的は、ラットの大腸炎を誘発するＤＤＳ（デキストラン硫酸ナトリウム（Dextran Sodium Sulfate））に対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の効果を比較することであった。
【００６３】
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを６つの群に分け、１つは対照群（細菌を投与しない大腸炎）、そして、５つの群は異なる細菌株（それぞれ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＬＧ１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９）を投与した。大腸炎を誘発する前に、細菌株を７日間経口投与し（０日）、そして、ＤＤＳ（５％ ｗ／ｖとなるよう水に溶解）と組み合わせて連続的に７日間投与した。大腸炎の程度は毎日ＤＡＩ（疾患活動指数（Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ））で決定した。サンプリングは１４日間行い、そして、腸における細菌の移動や量を測定した。
【００６４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ １９を投与した群において、ＤＡＩは、対照群と比較して、４、５、６及び７日目に有意に減少した。さらに、６及び７日後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＬＧ１を受けた群と比較して、Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９を受けた群ではＤＡＩが有意に低下した。対照の大腸炎と比較すると、腸間膜リンパ節への細菌のトランスロケーションは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの肝臓への移動と同様に、全ての群において有意に低下した。
【００６５】
結論として、細菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＬＧ１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９を経口投与すると、ラットにおける実験的な大腸炎でのトランスロケーションを減少することによって、ポジティブな効果を及ぼし得る。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９は、ＤＤＳにより誘発された大腸炎のラットのＤＡＩを向上する上で、最も顕著な効果を示した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９は、投与後６日目及び７日目に、大腸炎を抑制する上で他のものより多少効果的であった。図６を参照のこと。
【００６６】
試験２．経口投与後の胃腸管におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの生存
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを経口投与すると種々のポジティブな効果がもたらされ、例えば、抗生物質が関与した下痢を予防する（D’ Souza et al., 2002, BMJ 324:1361）。
【００６７】
細菌が経口投与で生存し、そして、腸内で生存及び増殖する能力を有する場合に、ポジティブな効果が達成され得る。プロバイオティクスとして使用し得る適切な菌株を見出すために、多数の可能な見込みのありそうな菌株を健康な被験体に経口投与する。糞便中の投与した菌株の割合を測定することにより、高い生存能を有する菌株を同定した。本研究の目的は、ヒトの胃腸管内で生存及び増殖するための優れた能力を有している経口投与が可能な菌株を見出すことである。
【００６８】
本願の構想
４週間、１４のボランティアの被験体に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの約２０の種々の菌株の混合物を飲ませる。全ての菌株は、ヒトまたは乳酸産生食品に生息する代表的な菌株である。糞便の採取は投与前、投与した３週間後、そして、投与後の１週間に行う。細菌フローラは生菌数測定及びＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）；Johansson et al., 1995）により決定する。
【００６９】
結論
選択した菌株（すなわち、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１；及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２）は、経口投与した後、胃腸管を通過して生存し得るという結果を示している。ラットにおける研究はまた、実験的な大腸炎に対してポジティブな効果を発揮する可能性があることも示している。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩでそれそれ切断し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とハイブリダイゼーションすることにより得た菌株ＣＵＲＥ１９、ＣＵＲＥ２１、ＣＵＲＥ２６、ＣＵＲＥ２８及びＣＵＲＥ２９に関して、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）で得た電気泳動パターンの略図である。Ｄｉｇ標識分子量ＤＮＡマーカーＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）及び分子量ＤＮＡマーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）はスタンダードとして使用した。
【図２】図２は、菌株ＣＵＲＥ１９（レーン１）、ＣＵＲＥ２９（レーン２）及びＣＵＲＥ２８（レーン３）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（制限エンドヌクレアーゼ分析、ＲＥＡ）で切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン４）。
【図３】図３は、菌株ＣＵＲＥ１９（レーン２）、ＣＵＲＥ２８（レーン３）及びＣＵＲＥ２９（レーン４）の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン１及び５）。
【図４】図４は、菌株ＣＵＲＥ２１（レーン１）及びＣＵＲＥ２６（レーン２）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＭＤ、ＵＳＡ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン３）。
【図５】図５は、菌株ＣＵＲＥ２１（レーン２）及びＣＵＲＥ２６（レーン３）の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＭＤ、ＵＳＡ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン１及び４）。
【図６】図６．４、５、６及び７日目の疾患活動指数。＊は大腸炎コントロールと比較してｐ＜０．０５を意味する。
【００７１】
【化１】
【００７２】
はＬ．ｇａｓｓｅｒｉと比較してｐ＜０．０５を意味し、＃はＬ．ｐａｒａｃａｓｉｅと比較してｐ＜０．０５を意味する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでグルタミン及び必要に応じてアルギニンを産生する能力を有する新規のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
グルタミンは、体内で最も豊富なアミノ酸である。それは、組織間の「窒素シャトル（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｈｕｔｔｌｅ）」及び腸細胞、結腸細胞（ｃｏｌｏｎｏｃｙｔｅ）、リンパ球及び増殖細胞の燃料である。グルタミン欠乏患者においては消化管の機能が害され、これは特に、腸管内腔から門脈循環への細菌及び／またはエンドトキシンのトランスロケーションに対する保護が損なわれているためである。グルタミンが欠乏すると、深刻な疾患の及び損傷を受けた患者となり、そして、高頻度の感染や筋肉の消耗の一因となり得る。
【０００３】
グルタミンを腸に投与することにより、あらゆる症状の患者に健康的で有益な効果をもたらしている。集中治療室の多臓器不全患者においてグルタミン投与は、患者における感染症の併発が減少した（Houdijk et al., Lancet, 352:772-776, 1998）。同様の効果が、グルタミンを補充した非経口的栄養を受ける骨髄移植を行った患者において観察された（Ziegler et al., Annals Internal Medicine, 116:821-828, 1992）。他の例は短小腸症候群の患者でみられ、これはグルタミン補給後に吸収能が相当改善した（Byrne et al., Annals of Surgery, 222:243-255, 1995）。化学療法中及び後の経口グルタミン補給も、化学療法が関与する口内炎の持続時間及び重篤度の両方が著しく減少することが示された。経口グルタミンは、集中的癌化学療法の結果として口腔潰瘍発生のハイリスクの多くの患者の快適性を増加する単純及び有用な手段のようであると結論付けられた（Anderson et al., Cancer 1998; 83:1433-9）。激しい運動の後のグルタミンの栄養補給も、感染症の発生、特に、上気道感染を減少している（Castell , Amino acids 2001; 20（1）:49-61）。しかし、免疫抑制に対するグルタミンの正確な効果はいまだ確立されていない。
【０００４】
グルタミンに関する主な技術的な困難性は、加工及び保存中にグルタミンは容易にグルタミン酸（グルタメート）に変化することであり、すなわち、グルタミンは、経口投与を目的とする製剤に組み込むことが困難な比較的不安定な化合物である。さらに、経口投与したグルタミンは、胃の酸性環境ではかなりの割合がグルタミン酸に変化し、そして、決して腸に到達せず、そしてグルタミンとして吸収され得ない。
【０００５】
アルギニンは免疫機能を高め、創傷治癒を助長する。アルギニン投与は、術後の患者及び集中治療下の患者に対して使用される。多くの臨床研究において、アルギニンはＲＮＡ及び魚油のような他の物質と共に投与されている。アルギニン投与は、術後の免疫応答を調節することが指摘されている。Daly, John E., et al. Surgery 112:55-67, 1992では、アルギニン、ＲＮＡ及びオメガ−３−脂肪酸を補足した経腸栄養剤を術後の患者に投与すると、種々のメカニズムを通して免疫防御が改善することを示している。アルギニンは、化学放射線療法及び手術を受けた患者の合併症を軽減し（Tepaske et al., 2001; Lancet 358: 696-701）、そして、患者が集中治療室に滞在する期間を短縮する（Bauer et al., 1995, Critical Case Medicine 23: 436-449）。
【０００６】
生存期間の増加は、アルギニン補給食を摂取させた動物において観察され得た。定量的なコロニー数及び残存している生菌の算出率は、アルギニンを摂取した動物において、移動した生物体を殺す能力がかなり高くなっていることを示している（Adawi, D., et al., 1997, Hepatology 25: 642-647）。
【０００７】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．菌株、すなわちビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、ヒトの大腸、特に母乳育ちの赤ん坊に、たいてい多数存在する。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．由来の細菌は、プロバイオティクス（すなわち、摂取することにより宿主に健康的で有益な効果を提供する生きている細菌）とみなされている。大腸中の多数のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．は、健康的で有益な効果を有すると主張されている。しかし、前記の有益な効果の作用機構はほとんど知られていない。
【０００８】
先行技術
Matteuzzi et al. ［Ann. Microbiol.（Inst. Pasteur）1978; 129 B, 175-181］は異なる生息地由来の多数のビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏ−ｂａｃｔｅｒｉａ）において、培養液中に遊離アミノ酸を放出するそれらの能力について調査した。得られたデータは、Ｂｉｆｉｄｏ−ｂａｃｔｅｒｉａの幾つかの種は増殖に必要な全てのアミノ酸を合成でき、そしてまた、培養液中に前記化合物を放出できることを示した。Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ及びＢ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓは最も優れた生産菌であることが分かり、そして、培養液中に最も一般的に見られるアミノ酸は主にアラニン、バリン及びアスパラギン酸であった。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．は消化管のアミノ酸代謝を担うと推測された。
【０００９】
ＷＯ０１／８３７００（メリーランド大学）は、胃腸障害、新生児壊死性腸炎（ＮＥＣ）及び細菌性敗血症の治療及び予防用の組成物及び方法を開示している。該組成物はグラム（＋）細菌（特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とグルタミンの組み合わせを含有しており、そして、経口的に及び鼻口的に投与されるべきである。該組成物はグラム（−）細菌のような細菌性因子の移動を妨害すると言われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
静脈を経由して投与したグルタミンは非常に効果的だが、高価で煩雑である。グルタミンを投与するより良い方法は、当然、腸内でかなりの量のグルタミンを産生できる能力を有する細菌株を使用することであろう。しかし、これまでに、このような菌株についての記載はない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の要約
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの特定の菌株がヒト大腸内の環境を模倣した増殖培地中でグルタミンを産生できることを驚くべきことに今日発見した。そして、前記の菌株は、哺乳類、特にヒトに対して経口で、または、腸に投与した後にｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生するために使用し得る。菌株によってはアルギニンも産生し得る。
【００１２】
本発明の記載
本発明は、腸管内で生存する能力及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。特に、グルタミンはヒトの大腸で産生される。このような環境で生存するということは、各個体由来の糞便において、異なるサンプリング時に、細菌株が分離されることを意味する。従って、細菌は、しばらくの間、それらの宿主内で明らかに増殖し、そして生存する。本発明のビフィドバクテリウム菌株（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ）は、ｐＨ７以下、特に５．５−６．５の栄養培地で増殖できる。ロゴサ寒天培地（Ｒｏｇｏｓａ ａｇａｒ）はこのような培地の一例であり、もう一つはＭＲＳである。
【００１３】
好ましい側面に従うと、新規の菌株はアンモニアを同化する能力も有する。
【００１４】
本発明は特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する菌株に関する。
【００１５】
特定の側面に従うと、本発明はまた、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで、位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約２８４０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に関する。このような菌株は、例えば、the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに2002年8月23日に寄託された菌株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９（ＤＳＭ １５１５８）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１（ＤＳＭ １５１５９）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６（ＤＳＭ １５１６０）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８（ＤＳＭ １５１６１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９（ＤＳＭ １５１６２）である。
【００１６】
他の側面に従うと、本発明は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約８９５ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株にも関する。好ましい側面に従うと、前記菌株はグルタミン酸を減少させることなくグルタミンを産生できる。
【００１７】
本発明は特に、菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６（これらはthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH に2002年8月23日に寄託され、そして、それぞれ、アクセッション番号ＤＳＭ １５１５９及びＤＳＭ １５１６０が与えられている）、またはこれらの変異株に関する。前記菌株は、グルタミン酸を減少させることなくグルタミンを産生できる。
【００１８】
もう一つの側面に従うと、本発明は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付け、位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た、分子サイズ約３４２０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株にも関する。好ましい側面に従うと、前記菌株はアルギニン産生能を有する。
【００１９】
本発明は特に以下の菌株（これらは全てthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH に2002年8月23日に寄託され、そして寄託番号が与えられており、それはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２である菌株）、及び、これらの変異株にも関する。前記菌株は、グルタミンに加えてアルギニンも産生できる。
【００２０】
新規の菌株は、全て幼い子供由来の糞便から分離し、そして、ｐＨ７以下の寒天上で培養することにより選択した。該菌株は、その後、リポタイピング及びＲＥＡにより特徴づけられた。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、１以上の本発明のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を担体と組み合わせて含有する組成物である。担体の例は、オートミールかゆ、乳酸発酵食品、イヌリン、ラクツロース、フルクトオリゴ糖、レジスタントスターチ（ｒｅｓｉｓｔｅｎｔ ｓｔａｒｃｈ）、β−グルカン及びグアーガムである。ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の増殖を促進し、そしてグルタミン及びアルギニンのそれぞれの産生量を増加させ、大腸でのアンモニア同化を高めるために、食物繊維も組成物に加えられるべきである。食物繊維は、例えばイヌリン、フルクトオリゴ糖、マルトデキストリン、β−グルカン及びグアーガムである。このように、本発明は、さらに食物繊維を含有する記載したような組成物にも関する。
【００２２】
本発明の組成物（懸濁液、錠剤、カプセル、粉末のような）は経口投与され得る。これらは浣腸剤としても投与され得る。
【００２３】
本発明の組成物は、担体が食品である食品組成物であり得る。グルタミン産生Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、若い子供、年配者、筋肉機能を改善して健康を保つこと及び運動後の免疫低下を回避することを望む運動競技や通常の消費者に与えられ得る。アルギニン産生Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、健康を保ち、そして免疫機能における良くない影響を避けることを望む通常の消費者に与えられ得る。
【００２４】
本発明の組成物は薬学的組成物であり得、ここで、担体は、治療的に許容される担体である。グルタミン産生株は（アルギニン産生株と同様に）、さらに経腸栄養法の様式で使用され得る。
【００２５】
本発明のアンモニアを同化するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、手術及び合併症の後の、あるいは重篤な感染症、中毒のような他の疾患の後の、集中治療下の患者にみられるような一時的な腎不全を有する患者に与えられ得る。このような場合、腎機能が回復することが予測でき、そして、消化官から負荷される窒素を減少させることを目的とする治療により、透析の必要性を回避し得る。アンモニアを同化する菌株は、肝疾患や脳症（例えば、肝炎または中毒あるいはそれに続くアルコール乱用）の患者に投与され得る。消化官からの窒素含有物質の吸収が低下すると、これらの状況において、脳症及び肝機能が改善し得る。アンモニアを同化するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、若い子供、年配者または、アンモニアを尿素に変換する肝臓の働きを妨害する疾患を患っている、または、消化管からの窒素の吸収が増加している消費者（例えば、移植または透析の必要がまだない軽度から中程度の慢性の腎または肝不全患者）に与えられ得る。
【００２６】
特定の側面に従うと、本発明の組成物は１以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株も含有し得る。
【００２７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉの任意の有益な効果に加えて、前記細菌が酸素の有害な影響からビフィズス菌（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）を保護し得る。
【００２８】
もう一方の側面に従うと、本発明は、治療での使用のための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する１以上の菌株に関する。
【００２９】
本発明は、多臓器不全及び腸不全を有する集中治療患者を治療するための、化学療法患者及び炎症性疾患を有する患者を予防するための、及び、大手術後に術後投与するための薬剤の調製のための、１以上の菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２；またはこれらの変異株の使用に関する。
【実施例】
【００３０】
実験
菌株の分離
全ての菌株は若い子供（生後１週間〜１年）の糞便から分離した。糞便試料を希釈溶液（０．９％［ｗ／ｖ］ＮａＣｌ、０．１％［ｗ／ｖ］ペプトン、０．１％［ｗ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ８０、０．０２％［ｗ／ｖ］システイン−ＨＣｌ）で連続的に希釈し、次に、ロゴサ寒天平板上に塗抹した。分離株はロゴサ寒天培地（ｐＨ５．４）上でのそれらの増殖能を考慮して選択し、そして、一個体から繰り返し分離した。３７℃で７２時間培養した後、ロゴサ寒天平板から分離株を採取した。これらを、属特異的なＰＣＲ（Roy et al., 2000; FEMS Microbiological Letters 191:17-24）により属レベルまで同定し、次いで、１６Ｓ ｒＤＮＡシークエンスにより種レベルまで同定した（Pettersson et al., 2002; Systematic and Applied Microbiology 23:332-336）。菌株は、サンプリングの間１〜４週間に、同じ個体から少なくとも２回分離され得、これは、菌株が胃腸管（ＧＩ−ｔｒａｃｔ）にコロニーを形成する特定の能力を有することを強く示している。リボタイピング（すなわち、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）である）により菌株を同定し、次いで、ＲＥＡ（すなわち、制限エンドヌクレアーゼ分析）により同定した。
【００３１】
以下の菌株を分離した。：
１）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい（ｓｏｕｒ）”においを発する。
【００３２】
２）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２０；ロゴサ寒天上で増殖でき、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい”においを発する。
【００３３】
３）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“すっぱい”においを発する。
【００３４】
４）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２２；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい（ｎｉｃｅ）”においを発する。
【００３５】
５）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２３；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい”においを発する。
【００３６】
６）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２４；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆをある程度まで発酵でき、発酵後は“よい”においを発する。
【００３７】
７）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２５；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００３８】
８）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００３９】
９）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ ＣＵＲＥ ２７；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００４０】
１０）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００４１】
１１）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００４２】
１２）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ３０；ロゴサ寒天上で増殖でき、そして、オートミールかゆを発酵できる。
【００４３】
グルタミン産生
以下の手順により、ブロスにおけるグルタミン産生について、分離株１−１２を試験した。
【００４４】
試験菌株を、Matteuzzi et al.（Ann. Microbil. （Inst. Pasteur, 1978, 129 B:175-181））により記載された培地を改良した増殖培地（ブロス）中、３７℃で４日間培養した。ブロスは以下から構成された：酢酸ナトリウム、１０ｇ／ｌ；アスコルビン酸、１０ｇ／ｌ；硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、５ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、３ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、３ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３２ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ、０．００７ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、０．０１ｇ／ｌ；酵母エキス、０．５ｇ／ｌ；グルコース、２０ｇ／ｌ；Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍｌ／ｌ。ｐＨは、オートクレーブの前に１Ｍ ＮａＯＨで６．１８−６．２４に調整した。
【００４５】
ブロス中のグルタミン濃度は、細菌の接種前及び試験菌株の増殖後に測定した。増殖後、培養液を遠心分離し、次いで、無菌的にろ過し、その後、細胞のない上清を−８０℃で冷凍した。スルホサリチル酸を添加し、そして水酸化リチウムでｐＨを調整した後に、アミノ酸を自動アナライザー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ２０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分析した。
【００４６】
種々の試験菌株が増殖した後のブロス中のグルタミン及びグルタミン酸濃度の増加を、以下の表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
全ての試験菌株が幾分かのグルタミンを産生したが、１２の試験菌株のうち７菌株だけが比較的多量のグルタミンを産生した（＞２０μｍｏｌ／ｌ）。２菌株（ＣＵＲＥ２１及びＣＵＲＥ２６）を除く全てにおいて、培地中のグルタミン酸のかなりの減少に伴いグルタミンが増加した。細菌を添加していない培地では、グルタミン酸の平均初期濃度は２２３μｍｏｌ／ｌであり、一方、グルタミン含有量は０であった。ＣＵＲＥ２０、ＣＵＲＥ２３及びＣＵＲＥ２４の３菌株は、培地中の全ての利用可能なグルタミン酸を消費し、一方、ＣＵＲＥ２８では２４７μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２９では２２０μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２２では１８７μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ１９では１２８μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ３０では１６０μｍｏｌ／ｌ、ＣＵＲＥ２７では１５１μｍｏｌ／ｌ及びＣＵＲＥ２５では４７μｍｏｌ／ｌでグルタミン酸濃度が減少した。これらの細菌がグルタミン酸をグルタミンに変換したかどうか推測し得る。２つの菌株（ＣＵＲＥ２１及びＣＵＲＥ２６）は培地中のグルタミン酸濃度を全く低下させることなくグルタミンを産生した。他の菌株とは対照的に、それらはブロス中のグルタミン酸濃度を高めた。
【００４９】
アルギニン産生
各試験菌株のアミノ酸産生は、Matteuzzi et al.（1978）により記載された培地を改良した増殖培地（ブロス）中、３７℃で４日間試験菌株を増殖させた後に測定した。該ブロスは以下を含む：酢酸ナトリウム、１０ｇ／ｌ；アスコルビン酸、１０ｇ／ｌ；硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、５ｇ／ｌ；リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、３ｇ／ｌ；リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、３ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３２ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ、０．００７ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、０．０１ｇ／ｌ；酵母エキス、０．５ｇ／ｌ；グルコース、２０ｇ／ｌ；Ｔｗｅｅｎ ８０、１ｍｌ／ｌ。ｐＨは、オートクレーブ処理の前に１Ｍ ＮａＯＨで６．１８−６．２４に調整した。
【００５０】
該ブロス中のアミノ酸濃度は、細菌を接種する前及び試験菌株の増殖後に測定した。増殖後、培養液を遠心分離し、次いで無菌的にろ過し、続いて細胞のない上清を−８０℃で冷凍した。アミノ酸はスルホサリチル酸を添加し、そして水酸化リチウムでｐＨを調整した後に、自動アナライザー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ２０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分析した。
【００５１】
種々の試験菌株の増殖後のブロス中のアルギニン及びシトルリンの濃度の増加を、表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
１２の試験菌株のうち３株では、アルギニン濃度が１０μｍｏｌ／ｌより多く増加した（すなわち、ＣＵＲＥ１９、ＣＵＲＥ２８及びＣＵＲＥ２９）。前記菌株のうち２つは、シトルリンもかなり多量に産生した（＞１００μｍｏｌ／ｌ）（すなわち、ＣＵＲＥ１９及びＣＵＲＥ２８）。シトルリンはアルギニンの脱アミノ化によって、もしくは、ＮＯ−合成酵素及びＮＯ産生のいずれかによって産生される。シトルリン産生はまた、初期段階におけるアルギニン産生を反映する。
【００５４】
また、試験菌株の増殖中、ブロス中に他のアミノ酸も浸透した（表３参照）。ＣＵＲＥ２１はシトルリンまたはアルギニンのいずれも産生しなかったが、多量のアスパラギン酸及びチロシンを産生した。ＣＵＲＥ２６はシトルリンは全く産生しなかったが、非常に少量のアルギニン、及び、広範囲のスペクトルにおいて種々のアミノ酸を産生した。さらに、ＣＵＲＥ２６は、ブロス中のプロリン濃度を増加させた唯一の試験菌株であった。全ての試験菌株はトレオニンを産生した。
【００５５】
【表３】
【００５６】
値は、３つまたは２つのそれぞれの培養物由来の３つまたは２つの試料の平均値を表す。
【００５７】
遺伝子型の同定
ＲＥＡ
菌株は、染色体ＤＮＡの切断パターンについて、制限エンドヌクレアーゼ分析−ＲＥＡ−法（Stahl M, Molin G, Persson A, Ahrne S及びStahl S, International Journal of Systematic Bacteriology, 40:189-193, 1990に従う、及び、さらにJohansson, M-L., et al., International Journal of Systematic Bacteriology, 45:670-675, 1995により開発された方法）により試験した。ＲＥＡについて、以下のように概略を示し得る：本研究に伴う菌株由来の染色体ＤＮＡを準備し、次いで、制限エンドヌクレアーゼにより切断した。０．７５μｇの各ＤＮＡは、１０ユニットのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて、３７℃で４時間それぞれ消化した；各エンドヌクレアーゼは別々に使用した。切断されたＤＮＡ断片は、サブマージ水平型アガロース平板ゲル（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ａｇａｒｏｓｅ ｓｌａｂ ｇｅｌｓ）を使用したゲル電気泳動によりサイズについて分離した。ゲルは１５０ｍｌの０．９％アガロースからなり（超純粋ＤＮＡグレード；低電気浸透（ｌｏｗ ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏ ｏｓｍｏｓｉｓ）；ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＭＤ， ＵＳＡ）、そして平板ゲルとしてキャストされた（１５０×２３５ｍｍ）。０．２μｇの高分子量ＤＮＡマーカー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＭＤ， ＵＳＡ）は、０．５μｇのＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、スタンダードとして使用した。フィコールローディングバッファー（Ｆｉｃｏｌｌ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（２ｇのフィコール、８ｍｌの水、０．２５％のブロムフェノール）中で試料のＤＮＡをアプライすることにより、最小のバンドの歪みと最大の鮮明さを達成した。
【００５８】
約６−８℃で１８時間、４０Ｖの一定圧でゲルを泳動した。泳動中に、バッファー（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ、２３ｍＭ Ｈ３ＰＯ４、２ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、ｐＨ８．３）を再循環させた。その後、ゲルをエチジウムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）で２０分間染色し、次いで蒸留水で汚れを落とし、ＵＶトランスイルミネーター（ＵＶＰ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｇａｂｒｉｅｌ，ＵＳＡ）により３０２ｎｍで可視化し、そして写真を撮った。ゲル電気泳動を行うこの方法では、分子量１．２×１０６に至るまで良好に分散し及び比較的良好に分離されたバンドが得られる。
【００５９】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＲＦＬＰ（リボタイピング）
染色体の調製及び染色体ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析は、先に述べたように行った（Stahl et al., 1990, Stahl et al., 1994）。
【００６０】
プローブはＬ．ｃａｓｅｉ ｓｐｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４２０ｂｐの断片（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで、位置５０６〜９２６）であり、これは、ＰＣＲにより得られ、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により供給される使用説明書に従ったＤＩＧ ＤＮＡ標識技術により標識した。反応に使用したプローブ量は５０ｎｇであった。
【００６１】
サザンブロットハイブリダイゼーション．１μｇの染色体ＤＮＡを１０ＵのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で３７℃で４時間消化した。アガロースゲル電気泳動による制限断片の分離は、Stahl et al., 1994に従って行った。ＤＩＧ−標識分子量ＤＮＡマーカーＩＩ及び分子量ＤＮＡマーカーＶＩは、スタンダードとして使用した（Ｒｏｃｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＤＮＡは、正に帯電したナイロン膜（Ｒｏｃｈｅ）上に１２０℃で３０分間ベーキングすることにより固定した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び基質ＣＳＰＧ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）を使用したケモルミネッセント検出は、製造業者により提供される使用説明書に従って行った。ハイブリダイゼーション温度は６８℃であった。試験の結果、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した場合、全ての菌株（ＣＵＲＥ１９、２１、２６、２８及び２９）において、分子量約２８４０ｋｂの１つのシングルバンドが生じた。染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合、菌株ＣＵＲＥ２１及び２６において、分子量約８９５ｋｂのシングル断片上に１６Ｓ ｒＲＮＡに関する遺伝子が存在し、一方、分子量約３２４０ｋｂのもう１つのシングルバンドが、ＣＵＲＥ１９、２８及び２９において得られた。
【００６２】
ｉｎ ｖｉｖｏでの試験
試験１．ラットの大腸炎を誘発するＤＤＳに対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の影響
本研究の目的は、ラットの大腸炎を誘発するＤＤＳ（デキストラン硫酸ナトリウム（Dextran Sodium Sulfate））に対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の効果を比較することであった。
【００６３】
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを６つの群に分け、１つは対照群（細菌を投与しない大腸炎）、そして、５つの群は異なる細菌株（それぞれ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＬＧ１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９）を投与した。大腸炎を誘発する前に、細菌株を７日間経口投与し（０日）、そして、ＤＤＳ（５％ ｗ／ｖとなるよう水に溶解）と組み合わせて連続的に７日間投与した。大腸炎の程度は毎日ＤＡＩ（疾患活動指数（Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ））で決定した。サンプリングは１４日間行い、そして、腸における細菌の移動や量を測定した。
【００６４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ １９を投与した群において、ＤＡＩは、対照群と比較して、４、５、６及び７日目に有意に減少した。さらに、６及び７日後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＬＧ１を受けた群と比較して、Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９を受けた群ではＤＡＩが有意に低下した。対照の大腸炎と比較すると、腸間膜リンパ節への細菌のトランスロケーションは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの肝臓への移動と同様に、全ての群において有意に低下した。
【００６５】
結論として、細菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ８７００：２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＬＧ１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９を経口投与すると、ラットにおける実験的な大腸炎でのトランスロケーションを減少することによって、ポジティブな効果を及ぼし得る。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ２９９ｖ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ３Ｂ１及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９は、ＤＤＳにより誘発された大腸炎のラットのＤＡＩを向上する上で、最も顕著な効果を示した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９は、投与後６日目及び７日目に、大腸炎を抑制する上で他のものより多少効果的であった。図６を参照のこと。
【００６６】
試験２．経口投与後の胃腸管におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及び／またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの生存
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓまたはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを経口投与すると種々のポジティブな効果がもたらされ、例えば、抗生物質が関与した下痢を予防する（D’ Souza et al., 2002, BMJ 324:1361）。
【００６７】
細菌が経口投与で生存し、そして、腸内で生存及び増殖する能力を有する場合に、ポジティブな効果が達成され得る。プロバイオティクスとして使用し得る適切な菌株を見出すために、多数の可能な見込みのありそうな菌株を健康な被験体に経口投与する。糞便中の投与した菌株の割合を測定することにより、高い生存能を有する菌株を同定した。本研究の目的は、ヒトの胃腸管内で生存及び増殖するための優れた能力を有している経口投与が可能な菌株を見出すことである。
【００６８】
本願の構想
４週間、１４のボランティアの被験体に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの約２０の種々の菌株の混合物を飲ませる。全ての菌株は、ヒトまたは乳酸産生食品に生息する代表的な菌株である。糞便の採取は投与前、投与した３週間後、そして、投与後の１週間に行う。細菌フローラは生菌数測定及びＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）；Johansson et al., 1995）により決定する。
【００６９】
結論
選択した菌株（すなわち、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１；及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２）は、経口投与した後、胃腸管を通過して生存し得るという結果を示している。ラットにおける研究はまた、実験的な大腸炎に対してポジティブな効果を発揮する可能性があることも示している。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩでそれそれ切断し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とハイブリダイゼーションすることにより得た菌株ＣＵＲＥ１９、ＣＵＲＥ２１、ＣＵＲＥ２６、ＣＵＲＥ２８及びＣＵＲＥ２９に関して、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）で得た電気泳動パターンの略図である。Ｄｉｇ標識分子量ＤＮＡマーカーＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）及び分子量ＤＮＡマーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）はスタンダードとして使用した。
【図２】図２は、菌株ＣＵＲＥ１９（レーン１）、ＣＵＲＥ２９（レーン２）及びＣＵＲＥ２８（レーン３）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（制限エンドヌクレアーゼ分析、ＲＥＡ）で切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン４）。
【図３】図３は、菌株ＣＵＲＥ１９（レーン２）、ＣＵＲＥ２８（レーン３）及びＣＵＲＥ２９（レーン４）の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン１及び５）。
【図４】図４は、菌株ＣＵＲＥ２１（レーン１）及びＣＵＲＥ２６（レーン２）の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＭＤ、ＵＳＡ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン３）。
【図５】図５は、菌株ＣＵＲＥ２１（レーン２）及びＣＵＲＥ２６（レーン３）の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断することにより得た分離したＤＮＡ断片の写真を示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＭＤ、ＵＳＡ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダードとして使用した（レーン１及び４）。
【図６】図６．４、５、６及び７日目の疾患活動指数。＊は大腸炎コントロールと比較してｐ＜０．０５を意味する。
【００７１】
【化１】
【００７２】
はＬ．ｇａｓｓｅｒｉと比較してｐ＜０．０５を意味し、＃はＬ．ｐａｒａｃａｓｉｅと比較してｐ＜０．０５を意味する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管内で生存する、及び、ｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株。
【請求項２】
アンモニアを同化する能力を有する請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
該菌株がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する請求項１または２に記載の菌株。
【請求項４】
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで染色体ＤＮＡを切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約２８４０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−３のいずれかに記載の菌株。
【請求項５】
ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮＡを切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）でのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約８９５ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−４のいずれかに記載の菌株。
【請求項６】
ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮＡを切断し、アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約３４２０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−４のいずれかに記載の菌株。
【請求項７】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−５のいずれかに記載の菌株。
【請求項８】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−５のいずれかに記載の菌株。
【請求項９】
アルギニン産生能を有する請求項１−４及び６のいずれかに記載の菌株。
【請求項１０】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１１】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１２】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１３】
担体と組み合わせた請求請１−１２のいずれかに記載の１菌株以上のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む組成物。
【請求項１４】
担体がオートミールかゆであることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
食物繊維も含有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
食品組成物であることを特徴とする請求項１３−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的組成物であることを特徴とし、ここで、担体が治療的に許容される担体であることを特徴とする請求項１３−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
１以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株もまた含有することを特徴とする請求項１３−１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
治療に使用するためのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する１以上の菌株。
【請求項２０】
多臓器不全及び腸不全を有する患者の集中治療処理のための、化学療法患者及び炎症性疾患を有する患者における予防のための、または大手術後の術後投与のための薬剤を調製のための、１以上の菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２；または、これらの変異株の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管内で生存する、及び、ｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株。
【請求項２】
アンモニアを同化する能力を有する請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
該菌株がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する請求項１または２に記載の菌株。
【請求項４】
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで染色体ＤＮＡを切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約２８４０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−３のいずれかに記載の菌株。
【請求項５】
ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮＡを切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）でのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約８９５ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−４のいずれかに記載の菌株。
【請求項６】
ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮＡを切断し、アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約３４２０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−４のいずれかに記載の菌株。
【請求項７】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−５のいずれかに記載の菌株。
【請求項８】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−５のいずれかに記載の菌株。
【請求項９】
アルギニン産生能を有する請求項１−４及び６のいずれかに記載の菌株。
【請求項１０】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１１】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１２】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１３】
担体と組み合わせた請求請１−１２のいずれかに記載の１菌株以上のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む組成物。
【請求項１４】
担体がオートミールかゆであることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
食物繊維も含有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
食品組成物であることを特徴とする請求項１３−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的組成物であることを特徴とし、ここで、担体が治療的に許容される担体であることを特徴とする請求項１３−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
１以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株もまた含有することを特徴とする請求項１３−１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
薬剤として使用するための請求項１〜１２のいずれかに記載の１以上の菌株。
【請求項２０】
多臓器不全及び腸不全を有する患者の集中治療処理のための、化学療法患者及び炎症性疾患を有する患者における予防のための、または大手術後の術後投与のための薬剤を調製のための、１以上の菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２；または、同じＲＥＡ−パターンを有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株の使用。
【請求項１】
腸管内で生存する、及び、ｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株。
【請求項２】
アンモニアを同化する能力を有する請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
該菌株がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する請求項１または２に記載の菌株。
【請求項４】
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで染色体ＤＮＡを切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約２８４０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−３のいずれかに記載の菌株。
【請求項５】
ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮＡを切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）でのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約８９５ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−４のいずれかに記載の菌株。
【請求項６】
ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮＡを切断し、アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約３４２０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−４のいずれかに記載の菌株。
【請求項７】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−５のいずれかに記載の菌株。
【請求項８】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−５のいずれかに記載の菌株。
【請求項９】
アルギニン産生能を有する請求項１−４及び６のいずれかに記載の菌株。
【請求項１０】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１１】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１２】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１３】
担体と組み合わせた請求請１−１２のいずれかに記載の１菌株以上のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む組成物。
【請求項１４】
担体がオートミールかゆであることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
食物繊維も含有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
食品組成物であることを特徴とする請求項１３−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的組成物であることを特徴とし、ここで、担体が治療的に許容される担体であることを特徴とする請求項１３−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
１以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株もまた含有することを特徴とする請求項１３−１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
治療に使用するためのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する１以上の菌株。
【請求項２０】
多臓器不全及び腸不全を有する患者の集中治療処理のための、化学療法患者及び炎症性疾患を有する患者における予防のための、または大手術後の術後投与のための薬剤を調製のための、１以上の菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２；または、これらの変異株の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管内で生存する、及び、ｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する能力を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株。
【請求項２】
アンモニアを同化する能力を有する請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
該菌株がＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ種に属する請求項１または２に記載の菌株。
【請求項４】
Ｈｉｎｄ ＩＩＩで染色体ＤＮＡを切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約２８４０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−３のいずれかに記載の菌株。
【請求項５】
ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮＡを切断し、続いてアガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで位置５０６〜９２６）でのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約８９５ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−４のいずれかに記載の菌株。
【請求項６】
ＥｃｏＲＩで染色体ＤＮＡを切断し、アガロースゲル電気泳動により断片を分離し、そして、サザンブロットハイブリダイゼーションを利用して、Ｌ．ｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ ＤＳＭ ２０００８の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＩＧ標識した４２０ｂｐ断片プローブ（Ｅ.ｃｏｌｉ番号付けで５０６〜９２６）とのハイブリダイゼーションにより得た分子サイズ約３４２０ｋｂのシングルＤＮＡ断片上に位置する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１−４のいずれかに記載の菌株。
【請求項７】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−５のいずれかに記載の菌株。
【請求項８】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−５のいずれかに記載の菌株。
【請求項９】
アルギニン産生能を有する請求項１−４及び６のいずれかに記載の菌株。
【請求項１０】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１１】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１２】
菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２、または同一のＲＥＡ−パターンを本質的に有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株である請求項１−４、６及び９のいずれかに記載の菌株。
【請求項１３】
担体と組み合わせた請求請１−１２のいずれかに記載の１菌株以上のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを含む組成物。
【請求項１４】
担体がオートミールかゆであることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
食物繊維も含有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
食品組成物であることを特徴とする請求項１３−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的組成物であることを特徴とし、ここで、担体が治療的に許容される担体であることを特徴とする請求項１３−１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
１以上のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株もまた含有することを特徴とする請求項１３−１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
薬剤として使用するための請求項１〜１２のいずれかに記載の１以上の菌株。
【請求項２０】
多臓器不全及び腸不全を有する患者の集中治療処理のための、化学療法患者及び炎症性疾患を有する患者における予防のための、または大手術後の術後投与のための薬剤を調製のための、１以上の菌株Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ １９、ＤＳＭ １５１５８；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２１、ＤＳＭ １５１５９；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２６、ＤＳＭ １５１６０；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２８、ＤＳＭ １５１６１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＣＵＲＥ ２９、ＤＳＭ １５１６２；または、同じＲＥＡ−パターンを有し、そして、腸管内で生存し及びｉｎ ｖｉｖｏでグルタミンを産生する同じ能力を有するこれらの変異株の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００６−５１６４０５（Ｐ２００６−５１６４０５Ａ）
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２７７６（Ｐ２００６−５０２７７６）
【出願日】平成１６年１月２７日（２００４．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００００９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６７７３１
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０００４５２５７）プロビ エービー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月２７日（２００４．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／００００９８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６７７３１
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５０００４５２５７）プロビ エービー (6)
【Ｆターム（参考）】
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