コア物質への糖鎖付加方法
【課題】 グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に、その水溶性に左右されることなく高効率的に付加する方法を提供すること。
【解決手段】 少なくとも以下の３つの工程を含んでなることを特徴とする。
工程Ａ： キシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程Ｂ： コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程Ｃ： 工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
【解決手段】 少なくとも以下の３つの工程を含んでなることを特徴とする。
工程Ａ： キシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程Ｂ： コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程Ｃ： 工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に効率的に付加する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学の進歩に伴い、外来遺伝子を組み込んだ大腸菌に異種タンパク質を生産させることは今や困難なことではない。しかしながら、真核生物が生産するタンパク質は大半のものが糖鎖の付加を伴うのに対し、大腸菌が生産するタンパク質は糖鎖の付加を伴わないため、真核生物に大腸菌が生産したタンパク質を投与した場合、そのタンパク質には糖鎖が付加されていないことに起因して、真核生物が生産するタンパク質とは違って十分な機能を示さないといった現象や生体内における安定性に欠けるといった現象が見られることがある。このような問題を解決するために、糖鎖を持つタンパク質を動物細胞に生産させることも行われているが、動物細胞を用いた異種タンパク質の生産は大腸菌を用いたそれよりも困難であったりコストが高くついたりするのが一般的である。従って、大腸菌が生産するタンパク質のように糖鎖を持たない物質に糖鎖を付加する方法がこれまでにも検討されている。例えば特許文献１では、プロテオグリカンのコアタンパク質とグリコサミノグリカン糖鎖の結合部位にあるキシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）に作用する糖加水分解酵素であるエンド−β−キシロシダーゼを用いた糖鎖転移反応を利用して人工的にプロテオグリカンを合成する方法が提案されており、その実施例では、もとのプロテオグリカンにあったグルコサミノグリカン糖鎖を人工ペプチドに転移させることに成功している。
【特許文献１】特開２００３−３３９３９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特許文献１に記載の方法は、エンド−β−キシロシダーゼの糖加水分解酵素としての本来の機能の副反応（逆反応）を利用するという点において独創的なものであり、一定の評価を受けている。しかしながら、この方法では、糖鎖の付加対象となるコア物質（アクセプター）の水酸基と水との間で競争反応が起こるので、水中に高濃度にコア物質を存在させなければ糖鎖の付加を効率的に行うことができず、このため高濃度に水に溶解できない物質、例えば、疎水性化合物やタンパク質などへの糖鎖の付加は困難であるといった問題を有する。
そこで本発明は、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に、その水溶性に左右されることなく高効率的に付加する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特許文献１に記載の方法のようにエンド−β−キシロシダーゼを用いて直接的に糖鎖をコア物質に付加するのではなく、糖鎖にアルキニル基としてプロパルギル基を導入するとともにコア物質にアジド基を導入し、両者をクリックケミストリー（ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と称される１，２，３−トリアゾールユニットを形成する１，３−双極子付加反応に付すことにより、コア物質の水溶性に左右されることなく、糖鎖をコア物質に高効率的に付加できることを知見した。
【０００５】
上記の点に鑑みてなされた本発明のコア物質への糖鎖付加方法は、請求項１記載の通り、少なくとも以下の３つの工程を含んでなることを特徴とする。
工程Ａ： キシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程Ｂ： コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程Ｃ： 工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
また、請求項２記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、糖タンパク質がプロテオグリカンであり、糖鎖がグリコサミノグリカン糖鎖であることを特徴とする。
また、請求項３記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、糖ペプチドがプロテオグリカンのタンパク質分解酵素による分解生成物であるペプチドグリカンであることを特徴とする。
また、請求項４記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、アルキニル基含有アルコールがプロパルギルアルコールであることを特徴とする。
また、請求項５記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、工程Ａで得るアルキニル基含有糖鎖が一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘは１個以上の糖残基を表し、ｍは１〜６の整数を表す）で表されることを特徴とする。
また、請求項６記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、工程Ｂで得るアジド基含有物質が下記の一般式（１）で表されることを特徴とする。
【０００６】
【化５】
【０００７】
［式中、ＹはＯ，Ｓ，ＮＨのいずれかを表し、Ｚはコア物質を表し、ｎは１以上の整数を表す］
【０００８】
また、請求項７記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、工程Ｃで得る糖鎖付加物質が下記の一般式（２）で表されることを特徴とする。
【０００９】
【化６】
【００１０】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【００１１】
また、本発明のアルキニル基含有糖鎖は、請求項８記載の通り、一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘとｍは前記と同義である）で表されることを特徴とする。
また、本発明のアジド基含有物質は、請求項９記載の通り、下記の一般式（１）で表されることを特徴とする。
【００１２】
【化７】
【００１３】
［式中、Ｙ，Ｚ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【００１４】
また、本発明の糖鎖付加物質は、請求項１０記載の通り、下記の一般式（２）で表されることを特徴とする。
【００１５】
【化８】
【００１６】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に、その水溶性に左右されることなく高効率的に付加する方法を提供することができ、例えば、医薬品となる糖鎖を持つ物質の糖鎖を持たない物質からの効率的な製造を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のコア物質への糖鎖付加方法は、少なくとも以下の３つの工程を含んでなることを特徴とするものである。
工程Ａ： キシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程Ｂ： コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程Ｃ： 工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
以下、本発明のコア物質への糖鎖付加方法を工程ごとに説明する。
【００１９】
（工程Ａ）
工程Ａは、キシロシルセリン結合を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程である。
【００２０】
キシロシルセリン結合を有する糖タンパク質としては、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸などの硫酸化多糖からなるグリコサミノグリカン糖鎖がコアタンパク質に結合したプロテオグリカンが挙げられる。プロテオグリカンは、サケ軟骨由来のコンドロイチン硫酸を持つものを始め、種々の構造を有するものが知られている。グリコサミノグリカン糖鎖は、４糖からなる結合領域（−ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）を介し、コアタンパク質のグリコサミノグリカン糖鎖結合コンセンサス配列（−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−）中のセリン残基の水酸基に共有結合したものであり、本発明におけるコア物質への付加対象となる糖鎖である。キシロシルセリン結合を有する糖タンパク質のタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドとしては、例えば、プロテオグリカンのタンパク質分解酵素による分解生成物であるペプチドグリカン（コアタンパク質が酵素分解されて２〜２０個程度のアミノ酸残基からなるペプチド化したもの）が挙げられる。ペプチドグリカンは、糖鎖転移反応を効率的に起こさせることができ、また、目的とするアルキニル基含有糖鎖の精製が容易であるといった利点を有する。プロテオグリカンからペプチドグリカンを得るために用いることができるタンパク質分解酵素としては、例えば、アクチナーゼが挙げられる。
【００２１】
工程Ａにおいて用いるエンド−β−キシロシダーゼは、特許文献１にも記載されている、プロテオグリカンのコアタンパク質とグリコサミノグリカン糖鎖の結合部位にあるキシロシルセリン結合に作用する糖加水分解酵素であり、例えば、ホタテ貝中陽腺由来のものが知られている（高垣啓一ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５４−８６０，１９９０．など）。工程Ａにおけるエンド−β−キシロシダーゼを用いた糖鎖転移反応条件としては、例えば、キシロシルセリン結合を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、過剰量のアルキニル基含有アルコールの存在下、ｐＨ４．５〜５．５の水溶液中、３６℃〜３８℃にて１時間〜５日間インキュベートするといった条件が挙げられる。このような糖鎖転移反応条件を採用することにより、糖鎖の還元末端にアルキニル基が導入されたアルキニル基含有糖鎖を効率的に得ることができる。このようにして得られるアルキニル基含有糖鎖としては、例えば、一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘとｍは前記と同義である）で表されるものが挙げられる（アルキニル基含有アルコールがプロパルギルアルコールであってコア物質への付加対象となる糖鎖がグリコサミノグリカン糖鎖の場合には一般式：Ｘ’−ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨで表される（Ｘ’は繰り返し２糖単位を表す））。糖鎖のアクセプターをアルキニル基含有アルコールとする利点としては、例えば、アルキニル基含有アルコールは高濃度に水に溶解できるので糖鎖転移反応を効率的に起こさせることができること、糖鎖に反応性が高いアルキニル基を導入することができることで後の工程でコア物質との結合を効率的に行わせることができることが挙げられる。また、糖鎖のアクセプターをタンパク質やペプチドとした場合には糖加水分解酵素の純度が低いとそこに混入するタンパク質分解酵素の作用でアクセプターの酵素分解が起こってしまい目的物が得られないことがあるが、糖鎖のアクセプターをアルキニル基含有アルコールとした場合には糖加水分解酵素の純度が低くてもこのような問題が起こらないことも利点として挙げられる。
【００２２】
（工程Ｂ）
工程Ｂは、コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程である。コア物質へのアジド基の導入は、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドや１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの存在下でコア物質と４−アジド安息香酸を反応させることで行うことができる。この場合、コア物質としては、例えば、４−アジド安息香酸と反応してエステル結合やチオエステル結合やアミド結合を生成することができる水酸基やチオール基やアミノ基を少なくとも１個有する、合成高分子化合物を含む有機化合物やタンパク質やペプチドなどが挙げられる。このようにして得られるアジド基含有物質としては、例えば、下記の一般式（１）で表されるものが挙げられる。
【００２３】
【化９】
【００２４】
［式中、Ｙ，Ｚ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【００２５】
（工程Ｃ）
工程Ｃは、工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程である。この工程は、クリックケミストリー（ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と称される公知の１，３−双極子付加反応に付すことにより行うことができる（Ｗａｒｒｅｎ Ｇ．Ｌｅｗｉｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：１０５３−１０５７．２００２．など）。このようにして得られる糖鎖付加物質としては、例えば、下記の一般式（２）で表されるものが挙げられる。
【００２６】
【化１０】
【００２７】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ、ｎはそれぞれ前記と同義である］
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００２９】
実施例１：合成高分子化合物への糖鎖付加
（工程Ａ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００３０】
【化１１】
【００３１】
特許第３７３１１５０号公報に記載の方法に従ってサケ鼻軟骨から調製したプロテオグリカン２００ｍｇとアクチナーゼ（アクチナーゼＥ：科研製薬社製）２０ｍｇを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ塩化カルシウム含有，ｐＨ８．０）２０ｍＬ中で３７℃にて２４時間インキュベートして得たコンドロイチン６硫酸を持つペプチドグリカン（１）（平均分子量２万：昭和電工社製のサイズ排除クロマトグラフィーＳｈｏｄｅｘ ＯＨ ｐａｃｋ ＳＢ−８０３ ＨＱによりプルランスタンダードを用いて算出）の２重量％水溶液７０μＬに、プロパルギルアルコール６５μＬと０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）９７μＬを加え、次いで、高垣啓一らの前掲の文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５４−８６０，１９９０．）に従って精製したホタテ貝中陽腺由来のエンド−β−キシロシダーゼ１１μｇを加えて３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、反応液を凍結乾燥し、その残渣を蒸留水１００μＬに溶解した。得られた溶解液をカートリッジカラム（Ｃ１８−Ｓｅｐ−Ｐａｃ：ウォーターズ社製）に供し、溶出溶媒として水２ｍＬを用いて粗精製を行った。次いで、得られた溶出液をそのままサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水３ｍＬを用いて目的とするプロパルギル基含有糖鎖（２）を含む溶出液を得、これを凍結乾燥することで目的とするプロパルギル基含有糖鎖（２）を得た。
【００３２】
プロパルギル基含有糖鎖（２）のデータ
・ ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）；３２９４，２９３３，２０９３，１５７８，１４１２，１３５６，１１５１，１０７７，１０２６，９３１，７０４ｃｍ−１
・ 白色粉末
【００３３】
（工程Ｂ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００３４】
【化１２】
【００３５】
コア物質としての平均分子量５５０のポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（３）１００ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）と４−アジド安息香酸（４）８９ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し、さらに４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１７ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）１１２ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２４時間攪拌した。その後、反応液を０℃に冷却し、メタノール０．５ｍＬを加え、５分間攪拌してから減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルムを用いて抽出し、有機層を２Ｍ塩酸水溶液で洗浄した後、さらに水で洗浄し、硫酸マグネシウムを加えて乾燥してから減圧濃縮した。得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出溶媒としてクロロホルム：メタノール＝２０：１の混合溶媒１００ｍＬを用いて目的とするアジド基含有物質（５）を含む溶出液を得、これを減圧濃縮することで目的とするアジド基含有物質（５）を定量的に得た。
【００３６】
アジド基含有物質（５）のデータ
・ １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．４６（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｍ，２Ｈ），３．６９−３．６４（ｍ，４２Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧＯＭｅ）
・ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ｍ／ｚ 平均分子量６９５）
・ 黄土色オイル状物質
【００３７】
（工程Ｃ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００３８】
【化１３】
【００３９】
Ｗａｒｒｅｎ Ｇ．Ｌｅｗｉｓらの前掲の文献（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：１０５３−１０５７．２００２．）に従い、窒素気流下にて、工程Ａで得たプロパルギル基含有糖鎖（２）の２重量％水溶液４０μＬに、工程Ｂで得たアジド基含有物質（５）の１８０μＭジメチルスルフォキシド溶液１０μＬ、１０ｍＭ硫酸銅水溶液１５μＬ、リガンドとして１ｍＭジイソプロピルアミン水溶液１５μＬを順に加え、３７℃にて１２時間インキュベートした。その後、反応液を凍結乾燥し、その残渣を蒸留水１００μＬに溶解した。得られた溶解液をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１の混合溶媒３ｍＬを用いて粗精製を行った。得られた溶出液を凍結乾燥し、その残渣を蒸留水１００μＬに溶解した。得られた溶解液をカートリッジカラム（Ｃ１８−Ｓｅｐ−Ｐａｃ：ウォーターズ社製）に供し、溶出溶媒として水２ｍＬを用いて未反応のプロパルギル基含有糖鎖（２）を溶出させて除去した後、溶出溶媒として水：メタノール＝１：１の混合溶媒２ｍＬを用いて目的とする糖鎖付加物質（６）を含む溶出液を得、これを減圧濃縮することで目的とする糖鎖付加物質（６）を得た（アジド基含有物質（５）を基にした収率：１００％）。
【００４０】
糖鎖付加物質（６）のデータ
・ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ｍ／ｚ 平均分子量８７００
・ １Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝８．７１（ｓ），８．５０（ｓ），８．３８（ｓ），８．２４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｐｈ），７.９４（ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ, Ｊ＝１２.０Ｈｚ），７．１７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｐｈ），４．４９（ｂｒ−ｄ），４．４４（ｍ），３．８８（ｍ），３．８６（ｍ），３．７１−３．６９（ｍ），３．６３（ｓ，ＰＥＧＯＣＨ２），３．６１−３．５３（ｍ，ｓｕｇａｒ ｐａｒｔｓ），３．３１（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧＯＭｅ），３．３０−３．２９（ｍ），１.８３（ｓ，ＡｃＮ）
・ セルロースアセテート膜電気泳動後のアルシアンブルー染色に陽性（グルコサミノグリカン糖鎖の存在の検出）
・ 黄土色オイル状物質
【００４１】
比較例１：
特許文献１に記載の方法に従って、コンドロイチン６硫酸を持つペプチドグリカン（１）の２重量％水溶液７０μＬに、コア物質としての平均分子量５５０のポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（３）６５ｍｇと０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）９７μＬを加え、次いで、エンド−β−キシロシダーゼ１１μｇを加えて３７℃にて２４時間インキュベートしたが、糖鎖転移反応は起こらず、目的とする糖鎖付加物質は得られなかった。
【００４２】
【化１４】
【００４３】
実施例２：タンパク質への糖鎖付加
（工程Ａ）
実施例１の工程Ａと同様にして目的とするプロパルギル基含有糖鎖（２）を得た。
【００４４】
（工程Ｂ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００４５】
【化１５】
【００４６】
４−アジド安息香酸（４）５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００μＬに溶解し、さらに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）６ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間インキュベートした。得られた溶液をコア物質としてのウシ血清アルブミン（７）の０．１％水溶液１ｍＬに４℃にて滴下し、４℃にて２４時間インキュベートした。その後、遠心分離を行って不溶物を沈殿させ、上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水３ｍＬを用いて目的とするアジド基含有物質（８）を含む溶出液を得、これを凍結乾燥することで目的とするアジド基含有物質（８）を９．４ｍｇ得た。
【００４７】
アジド基含有物質（８）のデータ
・ ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ 分子量６７０８２
・ 白色粉末
【００４８】
（工程Ｃ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００４９】
【化１６】
【００５０】
Ｗａｒｒｅｎ Ｇ．Ｌｅｗｉｓらの前掲の文献（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：１０５３−１０５７．２００２．）に従い、窒素気流下にて、工程Ａで得たプロパルギル基含有糖鎖（２）の２重量％水溶液２０μＬに、工程Ｂで得たアジド基含有物質（８）の０．１重量％水溶液１０μＬ、１０ｍＭ硫酸銅水溶液１５μＬ、リガンドとして１ｍＭジイソプロピルアミン水溶液１５μＬを順に加え、３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、反応液を凍結乾燥し、その残渣を蒸留水１００μＬに溶解した。得られた溶解液をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１の混合溶媒２ｍＬを用いて目的とする糖鎖付加物質（９）を含む溶出液を得、これを凍結乾燥することで目的とする糖鎖付加物質（９）を得た（アジド基含有物質（８）を基にした収率：１００％）。
【００５１】
糖鎖付加物質（９）のデータ
・ 平均分子量８万：昭和電工社製のサイズ排除クロマトグラフィーＳｈｏｄｅｘ ＯＨ ｐａｃｋ ＳＢ−８０３ ＨＱによりプルランスタンダードを用いて算出（主たる糖鎖付加数：単位コア物質あたり２〜３）
・ 上記のサイズ排除クロマトグラフィーを用いた高速液体クロマトグラフィー（溶出液０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液：流速１ｍＬ／分：検出ＵＶ２８０ｎｍ）で保持時間８分
・ 黄白色粉末
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に、その水溶性に左右されることなく高効率的に付加する方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に効率的に付加する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学の進歩に伴い、外来遺伝子を組み込んだ大腸菌に異種タンパク質を生産させることは今や困難なことではない。しかしながら、真核生物が生産するタンパク質は大半のものが糖鎖の付加を伴うのに対し、大腸菌が生産するタンパク質は糖鎖の付加を伴わないため、真核生物に大腸菌が生産したタンパク質を投与した場合、そのタンパク質には糖鎖が付加されていないことに起因して、真核生物が生産するタンパク質とは違って十分な機能を示さないといった現象や生体内における安定性に欠けるといった現象が見られることがある。このような問題を解決するために、糖鎖を持つタンパク質を動物細胞に生産させることも行われているが、動物細胞を用いた異種タンパク質の生産は大腸菌を用いたそれよりも困難であったりコストが高くついたりするのが一般的である。従って、大腸菌が生産するタンパク質のように糖鎖を持たない物質に糖鎖を付加する方法がこれまでにも検討されている。例えば特許文献１では、プロテオグリカンのコアタンパク質とグリコサミノグリカン糖鎖の結合部位にあるキシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）に作用する糖加水分解酵素であるエンド−β−キシロシダーゼを用いた糖鎖転移反応を利用して人工的にプロテオグリカンを合成する方法が提案されており、その実施例では、もとのプロテオグリカンにあったグルコサミノグリカン糖鎖を人工ペプチドに転移させることに成功している。
【特許文献１】特開２００３−３３９３９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特許文献１に記載の方法は、エンド−β−キシロシダーゼの糖加水分解酵素としての本来の機能の副反応（逆反応）を利用するという点において独創的なものであり、一定の評価を受けている。しかしながら、この方法では、糖鎖の付加対象となるコア物質（アクセプター）の水酸基と水との間で競争反応が起こるので、水中に高濃度にコア物質を存在させなければ糖鎖の付加を効率的に行うことができず、このため高濃度に水に溶解できない物質、例えば、疎水性化合物やタンパク質などへの糖鎖の付加は困難であるといった問題を有する。
そこで本発明は、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に、その水溶性に左右されることなく高効率的に付加する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特許文献１に記載の方法のようにエンド−β−キシロシダーゼを用いて直接的に糖鎖をコア物質に付加するのではなく、糖鎖にアルキニル基としてプロパルギル基を導入するとともにコア物質にアジド基を導入し、両者をクリックケミストリー（ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と称される１，２，３−トリアゾールユニットを形成する１，３−双極子付加反応に付すことにより、コア物質の水溶性に左右されることなく、糖鎖をコア物質に高効率的に付加できることを知見した。
【０００５】
上記の点に鑑みてなされた本発明のコア物質への糖鎖付加方法は、請求項１記載の通り、少なくとも以下の３つの工程を含んでなることを特徴とする。
工程Ａ： キシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程Ｂ： コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程Ｃ： 工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
また、請求項２記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、糖タンパク質がプロテオグリカンであり、糖鎖がグリコサミノグリカン糖鎖であることを特徴とする。
また、請求項３記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、糖ペプチドがプロテオグリカンのタンパク質分解酵素による分解生成物であるペプチドグリカンであることを特徴とする。
また、請求項４記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、アルキニル基含有アルコールがプロパルギルアルコールであることを特徴とする。
また、請求項５記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、工程Ａで得るアルキニル基含有糖鎖が一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘは１個以上の糖残基を表し、ｍは１〜６の整数を表す）で表されることを特徴とする。
また、請求項６記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、工程Ｂで得るアジド基含有物質が下記の一般式（１）で表されることを特徴とする。
【０００６】
【化５】
【０００７】
［式中、ＹはＯ，Ｓ，ＮＨのいずれかを表し、Ｚはコア物質を表し、ｎは１以上の整数を表す］
【０００８】
また、請求項７記載の糖鎖付加方法は、請求項１記載の糖鎖付加方法において、工程Ｃで得る糖鎖付加物質が下記の一般式（２）で表されることを特徴とする。
【０００９】
【化６】
【００１０】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【００１１】
また、本発明のアルキニル基含有糖鎖は、請求項８記載の通り、一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘとｍは前記と同義である）で表されることを特徴とする。
また、本発明のアジド基含有物質は、請求項９記載の通り、下記の一般式（１）で表されることを特徴とする。
【００１２】
【化７】
【００１３】
［式中、Ｙ，Ｚ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【００１４】
また、本発明の糖鎖付加物質は、請求項１０記載の通り、下記の一般式（２）で表されることを特徴とする。
【００１５】
【化８】
【００１６】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に、その水溶性に左右されることなく高効率的に付加する方法を提供することができ、例えば、医薬品となる糖鎖を持つ物質の糖鎖を持たない物質からの効率的な製造を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のコア物質への糖鎖付加方法は、少なくとも以下の３つの工程を含んでなることを特徴とするものである。
工程Ａ： キシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程Ｂ： コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程Ｃ： 工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
以下、本発明のコア物質への糖鎖付加方法を工程ごとに説明する。
【００１９】
（工程Ａ）
工程Ａは、キシロシルセリン結合を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程である。
【００２０】
キシロシルセリン結合を有する糖タンパク質としては、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸などの硫酸化多糖からなるグリコサミノグリカン糖鎖がコアタンパク質に結合したプロテオグリカンが挙げられる。プロテオグリカンは、サケ軟骨由来のコンドロイチン硫酸を持つものを始め、種々の構造を有するものが知られている。グリコサミノグリカン糖鎖は、４糖からなる結合領域（−ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−）を介し、コアタンパク質のグリコサミノグリカン糖鎖結合コンセンサス配列（−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−）中のセリン残基の水酸基に共有結合したものであり、本発明におけるコア物質への付加対象となる糖鎖である。キシロシルセリン結合を有する糖タンパク質のタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドとしては、例えば、プロテオグリカンのタンパク質分解酵素による分解生成物であるペプチドグリカン（コアタンパク質が酵素分解されて２〜２０個程度のアミノ酸残基からなるペプチド化したもの）が挙げられる。ペプチドグリカンは、糖鎖転移反応を効率的に起こさせることができ、また、目的とするアルキニル基含有糖鎖の精製が容易であるといった利点を有する。プロテオグリカンからペプチドグリカンを得るために用いることができるタンパク質分解酵素としては、例えば、アクチナーゼが挙げられる。
【００２１】
工程Ａにおいて用いるエンド−β−キシロシダーゼは、特許文献１にも記載されている、プロテオグリカンのコアタンパク質とグリコサミノグリカン糖鎖の結合部位にあるキシロシルセリン結合に作用する糖加水分解酵素であり、例えば、ホタテ貝中陽腺由来のものが知られている（高垣啓一ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５４−８６０，１９９０．など）。工程Ａにおけるエンド−β−キシロシダーゼを用いた糖鎖転移反応条件としては、例えば、キシロシルセリン結合を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、過剰量のアルキニル基含有アルコールの存在下、ｐＨ４．５〜５．５の水溶液中、３６℃〜３８℃にて１時間〜５日間インキュベートするといった条件が挙げられる。このような糖鎖転移反応条件を採用することにより、糖鎖の還元末端にアルキニル基が導入されたアルキニル基含有糖鎖を効率的に得ることができる。このようにして得られるアルキニル基含有糖鎖としては、例えば、一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘとｍは前記と同義である）で表されるものが挙げられる（アルキニル基含有アルコールがプロパルギルアルコールであってコア物質への付加対象となる糖鎖がグリコサミノグリカン糖鎖の場合には一般式：Ｘ’−ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨで表される（Ｘ’は繰り返し２糖単位を表す））。糖鎖のアクセプターをアルキニル基含有アルコールとする利点としては、例えば、アルキニル基含有アルコールは高濃度に水に溶解できるので糖鎖転移反応を効率的に起こさせることができること、糖鎖に反応性が高いアルキニル基を導入することができることで後の工程でコア物質との結合を効率的に行わせることができることが挙げられる。また、糖鎖のアクセプターをタンパク質やペプチドとした場合には糖加水分解酵素の純度が低いとそこに混入するタンパク質分解酵素の作用でアクセプターの酵素分解が起こってしまい目的物が得られないことがあるが、糖鎖のアクセプターをアルキニル基含有アルコールとした場合には糖加水分解酵素の純度が低くてもこのような問題が起こらないことも利点として挙げられる。
【００２２】
（工程Ｂ）
工程Ｂは、コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程である。コア物質へのアジド基の導入は、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドや１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの存在下でコア物質と４−アジド安息香酸を反応させることで行うことができる。この場合、コア物質としては、例えば、４−アジド安息香酸と反応してエステル結合やチオエステル結合やアミド結合を生成することができる水酸基やチオール基やアミノ基を少なくとも１個有する、合成高分子化合物を含む有機化合物やタンパク質やペプチドなどが挙げられる。このようにして得られるアジド基含有物質としては、例えば、下記の一般式（１）で表されるものが挙げられる。
【００２３】
【化９】
【００２４】
［式中、Ｙ，Ｚ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【００２５】
（工程Ｃ）
工程Ｃは、工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程である。この工程は、クリックケミストリー（ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と称される公知の１，３−双極子付加反応に付すことにより行うことができる（Ｗａｒｒｅｎ Ｇ．Ｌｅｗｉｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：１０５３−１０５７．２００２．など）。このようにして得られる糖鎖付加物質としては、例えば、下記の一般式（２）で表されるものが挙げられる。
【００２６】
【化１０】
【００２７】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ、ｎはそれぞれ前記と同義である］
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００２９】
実施例１：合成高分子化合物への糖鎖付加
（工程Ａ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００３０】
【化１１】
【００３１】
特許第３７３１１５０号公報に記載の方法に従ってサケ鼻軟骨から調製したプロテオグリカン２００ｍｇとアクチナーゼ（アクチナーゼＥ：科研製薬社製）２０ｍｇを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（１０ｍＭ塩化カルシウム含有，ｐＨ８．０）２０ｍＬ中で３７℃にて２４時間インキュベートして得たコンドロイチン６硫酸を持つペプチドグリカン（１）（平均分子量２万：昭和電工社製のサイズ排除クロマトグラフィーＳｈｏｄｅｘ ＯＨ ｐａｃｋ ＳＢ−８０３ ＨＱによりプルランスタンダードを用いて算出）の２重量％水溶液７０μＬに、プロパルギルアルコール６５μＬと０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）９７μＬを加え、次いで、高垣啓一らの前掲の文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５４−８６０，１９９０．）に従って精製したホタテ貝中陽腺由来のエンド−β−キシロシダーゼ１１μｇを加えて３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、反応液を凍結乾燥し、その残渣を蒸留水１００μＬに溶解した。得られた溶解液をカートリッジカラム（Ｃ１８−Ｓｅｐ−Ｐａｃ：ウォーターズ社製）に供し、溶出溶媒として水２ｍＬを用いて粗精製を行った。次いで、得られた溶出液をそのままサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水３ｍＬを用いて目的とするプロパルギル基含有糖鎖（２）を含む溶出液を得、これを凍結乾燥することで目的とするプロパルギル基含有糖鎖（２）を得た。
【００３２】
プロパルギル基含有糖鎖（２）のデータ
・ ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）；３２９４，２９３３，２０９３，１５７８，１４１２，１３５６，１１５１，１０７７，１０２６，９３１，７０４ｃｍ−１
・ 白色粉末
【００３３】
（工程Ｂ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００３４】
【化１２】
【００３５】
コア物質としての平均分子量５５０のポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（３）１００ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）と４−アジド安息香酸（４）８９ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し、さらに４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１７ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）１１２ｍｇ（０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２４時間攪拌した。その後、反応液を０℃に冷却し、メタノール０．５ｍＬを加え、５分間攪拌してから減圧濃縮した。得られた残渣をクロロホルムを用いて抽出し、有機層を２Ｍ塩酸水溶液で洗浄した後、さらに水で洗浄し、硫酸マグネシウムを加えて乾燥してから減圧濃縮した。得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出溶媒としてクロロホルム：メタノール＝２０：１の混合溶媒１００ｍＬを用いて目的とするアジド基含有物質（５）を含む溶出液を得、これを減圧濃縮することで目的とするアジド基含有物質（５）を定量的に得た。
【００３６】
アジド基含有物質（５）のデータ
・ １Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝８．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．４６（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｍ，２Ｈ），３．６９−３．６４（ｍ，４２Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧＯＭｅ）
・ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ｍ／ｚ 平均分子量６９５）
・ 黄土色オイル状物質
【００３７】
（工程Ｃ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００３８】
【化１３】
【００３９】
Ｗａｒｒｅｎ Ｇ．Ｌｅｗｉｓらの前掲の文献（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：１０５３−１０５７．２００２．）に従い、窒素気流下にて、工程Ａで得たプロパルギル基含有糖鎖（２）の２重量％水溶液４０μＬに、工程Ｂで得たアジド基含有物質（５）の１８０μＭジメチルスルフォキシド溶液１０μＬ、１０ｍＭ硫酸銅水溶液１５μＬ、リガンドとして１ｍＭジイソプロピルアミン水溶液１５μＬを順に加え、３７℃にて１２時間インキュベートした。その後、反応液を凍結乾燥し、その残渣を蒸留水１００μＬに溶解した。得られた溶解液をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１の混合溶媒３ｍＬを用いて粗精製を行った。得られた溶出液を凍結乾燥し、その残渣を蒸留水１００μＬに溶解した。得られた溶解液をカートリッジカラム（Ｃ１８−Ｓｅｐ−Ｐａｃ：ウォーターズ社製）に供し、溶出溶媒として水２ｍＬを用いて未反応のプロパルギル基含有糖鎖（２）を溶出させて除去した後、溶出溶媒として水：メタノール＝１：１の混合溶媒２ｍＬを用いて目的とする糖鎖付加物質（６）を含む溶出液を得、これを減圧濃縮することで目的とする糖鎖付加物質（６）を得た（アジド基含有物質（５）を基にした収率：１００％）。
【００４０】
糖鎖付加物質（６）のデータ
・ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ ｍ／ｚ 平均分子量８７００
・ １Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝８．７１（ｓ），８．５０（ｓ），８．３８（ｓ），８．２４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｐｈ），７.９４（ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ, Ｊ＝１２.０Ｈｚ），７．１７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｐｈ），４．４９（ｂｒ−ｄ），４．４４（ｍ），３．８８（ｍ），３．８６（ｍ），３．７１−３．６９（ｍ），３．６３（ｓ，ＰＥＧＯＣＨ２），３．６１−３．５３（ｍ，ｓｕｇａｒ ｐａｒｔｓ），３．３１（ｓ，３Ｈ，ＰＥＧＯＭｅ），３．３０−３．２９（ｍ），１.８３（ｓ，ＡｃＮ）
・ セルロースアセテート膜電気泳動後のアルシアンブルー染色に陽性（グルコサミノグリカン糖鎖の存在の検出）
・ 黄土色オイル状物質
【００４１】
比較例１：
特許文献１に記載の方法に従って、コンドロイチン６硫酸を持つペプチドグリカン（１）の２重量％水溶液７０μＬに、コア物質としての平均分子量５５０のポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（３）６５ｍｇと０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）９７μＬを加え、次いで、エンド−β−キシロシダーゼ１１μｇを加えて３７℃にて２４時間インキュベートしたが、糖鎖転移反応は起こらず、目的とする糖鎖付加物質は得られなかった。
【００４２】
【化１４】
【００４３】
実施例２：タンパク質への糖鎖付加
（工程Ａ）
実施例１の工程Ａと同様にして目的とするプロパルギル基含有糖鎖（２）を得た。
【００４４】
（工程Ｂ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００４５】
【化１５】
【００４６】
４−アジド安息香酸（４）５ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００μＬに溶解し、さらに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）６ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間インキュベートした。得られた溶液をコア物質としてのウシ血清アルブミン（７）の０．１％水溶液１ｍＬに４℃にて滴下し、４℃にて２４時間インキュベートした。その後、遠心分離を行って不溶物を沈殿させ、上清をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水３ｍＬを用いて目的とするアジド基含有物質（８）を含む溶出液を得、これを凍結乾燥することで目的とするアジド基含有物質（８）を９．４ｍｇ得た。
【００４７】
アジド基含有物質（８）のデータ
・ ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ 分子量６７０８２
・ 白色粉末
【００４８】
（工程Ｃ）
以下の反応式に示す反応を行った。
【００４９】
【化１６】
【００５０】
Ｗａｒｒｅｎ Ｇ．Ｌｅｗｉｓらの前掲の文献（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：１０５３−１０５７．２００２．）に従い、窒素気流下にて、工程Ａで得たプロパルギル基含有糖鎖（２）の２重量％水溶液２０μＬに、工程Ｂで得たアジド基含有物質（８）の０．１重量％水溶液１０μＬ、１０ｍＭ硫酸銅水溶液１５μＬ、リガンドとして１ｍＭジイソプロピルアミン水溶液１５μＬを順に加え、３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、反応液を凍結乾燥し、その残渣を蒸留水１００μＬに溶解した。得られた溶解液をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、溶出溶媒として水：エタノール＝９：１の混合溶媒２ｍＬを用いて目的とする糖鎖付加物質（９）を含む溶出液を得、これを凍結乾燥することで目的とする糖鎖付加物質（９）を得た（アジド基含有物質（８）を基にした収率：１００％）。
【００５１】
糖鎖付加物質（９）のデータ
・ 平均分子量８万：昭和電工社製のサイズ排除クロマトグラフィーＳｈｏｄｅｘ ＯＨ ｐａｃｋ ＳＢ−８０３ ＨＱによりプルランスタンダードを用いて算出（主たる糖鎖付加数：単位コア物質あたり２〜３）
・ 上記のサイズ排除クロマトグラフィーを用いた高速液体クロマトグラフィー（溶出液０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液：流速１ｍＬ／分：検出ＵＶ２８０ｎｍ）で保持時間８分
・ 黄白色粉末
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、グリコサミノグリカン糖鎖などの糖鎖をコアタンパク質などのコア物質に、その水溶性に左右されることなく高効率的に付加する方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の３つの工程を含んでなることを特徴とするコア物質への糖鎖付加方法。
工程Ａ： キシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程Ｂ： コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程Ｃ： 工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
【請求項２】
糖タンパク質がプロテオグリカンであり、糖鎖がグリコサミノグリカン糖鎖であることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【請求項３】
糖ペプチドがプロテオグリカンのタンパク質分解酵素による分解生成物であるペプチドグリカンであることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【請求項４】
アルキニル基含有アルコールがプロパルギルアルコールであることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【請求項５】
工程Ａで得るアルキニル基含有糖鎖が一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘは１個以上の糖残基を表し、ｍは１〜６の整数を表す）で表されることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【請求項６】
工程Ｂで得るアジド基含有物質が下記の一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【化１】
［式中、ＹはＯ，Ｓ，ＮＨのいずれかを表し、Ｚはコア物質を表し、ｎは１以上の整数を表す］
【請求項７】
工程Ｃで得る糖鎖付加物質が下記の一般式（２）で表されることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【化２】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【請求項８】
一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘとｍは前記と同義である）で表されることを特徴とするアルキニル基含有糖鎖。
【請求項９】
下記の一般式（１）で表されることを特徴とするアジド基含有物質。
【化３】
［式中、Ｙ，Ｚ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【請求項１０】
下記の一般式（２）で表されることを特徴とする糖鎖付加物質。
【化４】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【請求項１】
少なくとも以下の３つの工程を含んでなることを特徴とするコア物質への糖鎖付加方法。
工程Ａ： キシロシルセリン結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ）を有する糖タンパク質および／またはそのタンパク質分解酵素による分解生成物である糖ペプチドに対し、アルキニル基含有アルコールの存在下でエンド−β−キシロシダーゼを用いて糖鎖転移反応を起こさせ、糖鎖の還元末端にアルキニル基を導入してアルキニル基含有糖鎖を得る工程。
工程Ｂ： コア物質にアジド基を導入してアジド基含有物質を得る工程。
工程Ｃ： 工程Ａで得たアルキニル基含有糖鎖と工程Ｂで得たアジド基含有物質を反応させ、両者を結合して糖鎖付加物質を得る工程。
【請求項２】
糖タンパク質がプロテオグリカンであり、糖鎖がグリコサミノグリカン糖鎖であることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【請求項３】
糖ペプチドがプロテオグリカンのタンパク質分解酵素による分解生成物であるペプチドグリカンであることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【請求項４】
アルキニル基含有アルコールがプロパルギルアルコールであることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【請求項５】
工程Ａで得るアルキニル基含有糖鎖が一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘは１個以上の糖残基を表し、ｍは１〜６の整数を表す）で表されることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【請求項６】
工程Ｂで得るアジド基含有物質が下記の一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【化１】
［式中、ＹはＯ，Ｓ，ＮＨのいずれかを表し、Ｚはコア物質を表し、ｎは１以上の整数を表す］
【請求項７】
工程Ｃで得る糖鎖付加物質が下記の一般式（２）で表されることを特徴とする請求項１記載の糖鎖付加方法。
【化２】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【請求項８】
一般式：Ｘ−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（Ｘとｍは前記と同義である）で表されることを特徴とするアルキニル基含有糖鎖。
【請求項９】
下記の一般式（１）で表されることを特徴とするアジド基含有物質。
【化３】
［式中、Ｙ，Ｚ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【請求項１０】
下記の一般式（２）で表されることを特徴とする糖鎖付加物質。
【化４】
［式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｍ，ｎはそれぞれ前記と同義である］
【公開番号】特開２００８−１５０４６４（Ｐ２００８−１５０４６４Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３８９１４（Ｐ２００６−３３８９１４）
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年６月１５日〜１７日 社団法人日本生化学会らの主催の「ＩＵＢＭＢ２００６サテライトシンポジウム エクストラセルラー グリコマトリックス イン ヘルス アンド ディジーズ」において文書をもって発表
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年６月１５日〜１７日 社団法人日本生化学会らの主催の「ＩＵＢＭＢ２００６サテライトシンポジウム エクストラセルラー グリコマトリックス イン ヘルス アンド ディジーズ」において文書をもって発表
【出願人】（５０４２２９２８４）国立大学法人弘前大学 (162)
【Ｆターム（参考）】
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