コラーゲンの産生促進用組成物
本発明は１つまたは複数のオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）と組み合わされたステアリドン酸を含む、動物の皮膚に局所適用するための組成物を提供する。好ましくは、組成物はステアリドン酸の供給源としてエキウム油と、オクタデカトリエン酸の供給源としてルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）、小麦胚芽油（パン小麦）、ローズヒップ油（精製、ローザモスクェータ）、ジャカランダ油（ジャカランダミモシフォリア）、および／またはカレンジュラ油（カレンジュラオフィシナリス）のような植物脂質とを含む。本発明の組成物はＩ型コラーゲン分泌物を増加し、かくして特に皮膚のコラーゲン産生を促進するのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本説明は総体的に局所スキンケア組成物に関し、特に、コラーゲンの産生促進を提供するように処方された局所スキンケア組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、酵素のような球状タンパク質のものとはまったく異なった作用である長い、繊維構造のタンパク質の一つである。コラーゲンは動物における結合組織の主要なタンパク質であり、哺乳類における全体の約４０％を作り出す最も豊富なタンパク質である。それは大きな引張強度を備えた、丈夫で非拡張であり、そして軟骨、靱帯および腱の主要成分、並びに骨および歯の主要タンパク質成分である。軟質ケラチンと共に皮膚強度および弾力性に関与し、そしてその劣化は老化を伴う皺を引き起こす。コラーゲンは血管を強化し、組織発達の役割を果たす。コラーゲンは結晶形の眼の角膜および水晶体に存在する。また、美容整形および火傷外科手術で用いられている。
【０００３】
コラーゲンは身体全体の多くの部位で、それぞれが一種として周知である多くの異なった形態で存在する。少なくとも１２種の異なったコラーゲンがあり、Ｉ型コラーゲンが最も豊富にある。Ｉ型コラーゲンの基本的な三重螺旋構造が大部分のその他のコラーゲンタイプの原型である。
【０００４】
その他のタイプのコラーゲンは三重螺旋の長さおよびそれらのアミノ基またはカルボキシル基端末端での球状ドメインの存在または非存在においてＩ型コラーゲンと異なる。Ｉ型コラーゲンは、皮膚、腱、および骨に見られ、Ｉ−III型は皮膚発生および形成において決定的な役割を果たすものとして認識されている。
【０００５】
スキンケア組成物およびコラーゲンの産生を増強するインビトロ投与のための組成物が求められている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、第１の実施形態において、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸を含む、動物、特に哺乳類の皮膚への局所適用のための組成物を提供する。ステアリドン酸の好適な供給源はエキウム属の１つまたはそれ以上の種から抽出した植物油である。好ましい種はＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズ・カース、である。
【０００７】
本発明の別の実施形態では、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸を含む、動物、特に哺乳類の皮膚への局所適用のための組成物を提供する。ステアリドン酸の好適な供給源はエキウム属の１つまたはそれ以上の種から抽出した植物油である。好ましい種はＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズ・カース、である。
【０００８】
好ましくは、植物脂質はオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡ'ｓ）として知られる脂肪酸の部類を含むものである。好適なＣＯＤＴＡ'ｓはカレンディック酸、カタルピック酸、α-エレオステアリック酸、ジャカリック酸、およびプニシック酸である。
【０００９】
ＣＯＤＴＡ'ｓの好適な供給源はカレンジュラ・オフィシナリス（キンセンカ）、カタルパ・オバタ（キササゲ）、アレウリテス・フォルディ（オオアブラギリ）、ジャカンドラ・ミモシフォリア（ジャカランダ、Jacandra mimosifolia）、およびプニカ・グラナタム（ザクロ）である。
【００１０】
エキウム属の１つまたはそれ以上の種は以下の１つまたはそれ以上のものの組合せから選択される。
・ エキウム・アカンソカルプム・スベント
・ エキウム・アキュレアツム・ポイア
・ エキウム・アルビカンス・ラグ・アンド・ロードル
・ エキウム・アングスチフォリウム・ラム
・ エキウム・アレナリウム・グス
・ エキウム・アスペリムム・ラム
・ エキウム・アウベリアヌム・ウェブ・エ・ベルス
・ エキウム・ベセンコールティ・サントス
・ エキウム・ボイッシェリ・スチューデル
・ エキウム・ボネッティ・コインシィ
・ エキウム・ブレビラメ・スプラーキ゜ュ・エ・ヒュチ
・ エキウム・カリシルスム・ウェブ・エクス・ボール
・ エキウム・カンディカンス・エル・フィル： プライド・オブ・マデイラ
・ エキウム・クレティクム・エル
・ エキウム・デカイスネイ・ウェブ
・ エキウム・フラブム・デスフ
・ エキウム・ガディタヌム・ボイス
・ エキウム・ゲンティアノイデス
・ エキウム・ギガンテウム・エル・フィル
・ エキウム・ハンディエンス・スベント
・ エキウム・フミレ・デスフ
・ エキウム・イタリクム・エル：ペイル・バイパーズ−バグロス
・ エキウム・ランツェロッテンセ・レム・エ・ホルツ
・ エキウム・レウコファエウム・ウェブ・エクス・スプラーグ・エ・ヒュチ
・ エキウム・ルシタニクム・エル
・ エキウム・マリアヌム・ボイス
・ エキウム・ネルボスム・ドルリアンド・イン・ダブリュ・ティ・エイトン
・ エキウム・パルビフロルム・モエンチ：スモール・フラワード・バイパーズ−バグ ロス
・ エキウム・パボニアヌム・ボイス
・ エキウム・ピニナナ・ウェブエ・ベルス：ジャイアント・バイパーズ−バグロス
・ エキウム・プランタジネウム・エル：パープル・バイパーズ−バグロス、パターソ ンズ・カース
・ エキウム・プスツラツム・シブス・アンド・スム
・ エキウム・ロスラツム・ランゲ：ラックス・バイパーズ−バグロス
・ エキウム・ルッシクムジェイ・エフ・グメル
・ エキウム・サブリコラ・ポメル
・ エキウム・サルマンチクム・ラグ
・ エキウム・シムプレックス・ディシィ
・ エキウム・ストリクツム・エルエフ
・ エキウム・スベンテニィ・ブラム
・ エキウム・ツベルクラツム・ホフマン・アンドリンク
・ エキウム・ビレスセンス・ディシィ：タワー・オブ・ジュエルズ
・ エキウム・ブルガレ・エル：バイパーズ・バグロス
・ エキウム・ウェッビィ・コインシィ
・ エキウム・ウィルドプレティ・ピアーズ・エクス・フック・フィル
【００１１】
本発明による別の実施形態において、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸を含む組成物を皮膚に局所適用することを含む、皮膚の治療方法を提供する。
【００１２】
本発明による別の実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸を含む組成物を皮膚へ局所適用することを含む、皮膚の治療方法を提供する。
【００１３】
本発明による別の実施形態において、皮膚のコラーゲン産生を促進するように、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸の用法を提供する。
【００１４】
本発明による別の実施形態において、皮膚のコラーゲン産生を促進するように、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸の用法を提供する。
【００１５】
本発明による別の実施形態において、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸または生理学的に容認可能なその派生物、或いは皮膚のコラーゲン産生を促進する薬剤製造のための生理学的に容認可能なその派生物の用法を提供する。
【００１６】
本発明による別の実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸または生理学的に容認可能なその派生物、或いは皮膚のコラーゲン産生を促進する薬剤製造のための生理学的に容認可能なその派生物の用法を提供する。
【００１７】
老化した皮膚を含む皮膚状態を治療するための医薬組成物は、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸または生理学的に容認可能なその派生物、或いは生理学的に容認可能なその派生物、および生理学的に容認可能な担体を含む。
【００１８】
老化した皮膚を含む皮膚状態を治療するための医薬組成物は、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸または生理学的に容認可能なその派生物、或いは生理学的に容認可能なその派生物、および生理学的に容認可能な担体を含む。
【００１９】
好適な実施形態において、エキウム油は、超臨界二酸化炭素抽出処理工程を用いて、植物の種子から抽出される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、３つの異なった希釈剤に処方されたエキウム油で処理されたヒト皮膚線維芽細胞培養物における細胞生存率である。エキウム油はそのまま使用されるか、細胞培養培地、２ｍＭ ＢＳＡまたは２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに希釈されるかのいずれかであった。図示の結果は３ウェル方法であり、そして非処理対照群生存能力の百分率として表されている。各処理についての５本の棒は試験された５つの異なった量の各希釈物、左から右へ、１０（希釈なし）、８、６、３、および１μｌ（最希釈）を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。
【００２１】
【図２】図２は、試験油（第１スクリーン）で処理されたヒト皮膚線維芽細胞培養物における細胞生存率である。試験油は、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ中に１／１０に予め希釈された。図示の結果は３ウェル方法であり、そして非処理対照群生存能力の百分率として表されている。各処理についての５本の棒は試験された５つの異なった量の各油、左から右へ、１０（希釈なし）、８、６、３、および１μｌ（最希釈）を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。
【００２２】
【図３】図３は、試験油（第２スクリーン）で処理されたヒト皮膚線維芽細胞培養物における細胞生存率である。試験油は、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ中に図示のように予め希釈された。図示の結果は３ウェル方法であり、そして非処理対照群生存能力の百分率として表されている。各処理についての５本の棒は試験された５つの異なった量の各油、左から右へ、１０（希釈なし）、８、６、３、および１μｌ（最希釈）を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。
【００２３】
【図４】図４は、試験油混合物の選択された試験油希釈および処方である。エキウム油／試験油混合物は細胞培養培地１００μｌに最終量１０μｌを加えるように処方された。
【００２４】
【図５】図５は、ヒト皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲン分泌物における試験油混合物の効果である。Ｉ型コラーゲンレベルはＥＬＩＳＡ（コスモ・バイオ株式会社、商標）により決定され、そして希釈剤（媒体）のみで処理された培養物のサンプルに見られるレベルの百分率として表される。処理された各培養ウェルの細胞培養培地および細胞培養表面のペプシン消化物が分析された。各棒は複製サンプルの平均値を表す。各試験油の符号化がグラフの右側に示されている。試験油混合物（３：１、エキウム油：試験油比）は図４に詳細に示されるように処方された。
【００２５】
【図６】図６は、エキウム油（Ｅｐｉ６３）希釈物のためのＷＳＴ−１型細胞生存能力アッセイの試験プレートレイアウトおよび吸光度である。図は４５０ｎｍでの吸光度引く６２０ｎｍでの吸光度を表す。プレート２における次のウェルは意外に低い吸光度を与えた： Ａ６、Ｃ２、Ｅ２、Ｅ３、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４ − これらは２ｍＭ ＢＳＡに希釈されたサンプルであり、そして良好な調和性を示される、好適な希釈剤である、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに希釈されたサンプルからの結果として、繰り返す価値を認められなかった。
【００２６】
【図７】図７は、エキウム油（Ｅｐｉ６３）希釈物で処理された細胞培養ウェルについての非処理対照群細胞生存能力の百分率として表された細胞生存能力である。生存細胞数は修正された吸光度（Ａ450nm−Ａ620nm）に直接関係される。非処理対照群培養ウェルの平均吸光度は１４２９．５７であった。
【００２７】
【図８ｐ１】図８ｐ１は、試験油の第１細胞毒性スクリーンからの、プレート１および２についてのプレートレイアウトおよび吸光度である。
【図８ｐ２】図８ｐ２は、試験油の第１細胞毒性スクリーンからの、プレート３および４についてのプレートレイアウトおよび吸光度である。
【００２８】
【図９】図９は、試験油希釈物で処理された細胞培養ウェルのための非処理対照群細胞生存能力を百分率として表す − スクリーンＩ。生存細胞数は修正された吸光度（Ａ450nm−Ａ620nm）に直接関係される。非処理対照群培養ウェルの平均吸光度は１７６４．１７であった。すべての油は２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに１／１０に希釈された。
【００２９】
【図１０】図１０は、試験油の第２細胞毒性スクリーンからのプレートレイアウトおよび吸光度である。プレート１の２つのウェルＧ１およびＨ１（媒体１０μｌ）は、ＷＳＴ−１試薬がこれらのウェルに加えられていないことを示す非常に低い吸光度を与えた。
【００３０】
【図１１】図１１は、試験油希釈物で処理された細胞培養ウェルのための非処理対照群細胞生存能力を百分率として表す − スクリーンII。生存細胞数は修正された吸光度（Ａ450nm−Ａ620nm）に直接関係される。非処理対照群培養ウェルの平均吸光度は１２３５．８であった。すべての油は２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに希釈された。
【００３１】
【図１２】図１２は、エキウム油／試験油混合物の細胞毒性スクリーンからのプレートレイアウトおよび吸光度である。エキウム油／試験油混合物は表３．１に詳述されるように − １０μｌの各油混合物が各ウェル（細胞培養培地量１００μｌ）に加えられた − 処方された。エキウム標識ウェルはエキウム油のみで処理された。
【００３２】
【図１３】図１３は、エキウム油／試験油混合物で処理された細胞培養ウェルのための非処理対照群細胞生存能力を百分率として表す細胞生存能力である。生存細胞数は修正された吸光度（Ａ450nm−Ａ620nm）に直接関係される。非処理対照群培養ウェルの平均吸光度は１５５２．３３であった。すべての油は２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに希釈された。
【００３３】
【図１４】図１４は、Ｉ型コラーゲンのＥＬＩＳＡ定量のプレートレイアウトおよび吸光度である。Ｉ型コラーゲンレベルは、ＥＬＩＳＡキット製造業者（コスモ・バイオ株式会社）の勧告に従って用意された、細胞培養培地サンプルのペプシン消化物（黄色で標識）および組織培養表面のペプシン消化物（緑色で標識）で決定された。Ｉ型コラーゲンの標準濃度がまた与えられそしてＩ型コラーゲン標準曲線のプロットが示されている。各サンプルは個別の細胞培養ウェルによってもたらされる。
【００３４】
【図１５】図１５は、アッセイサンプルにおけるＩ型コラーゲン濃度である。Ｉ型コラーゲン濃度はμｇ／ｍｌで表され、そしてＥＬＩＳＡアッセイの標準曲線から計算された式を用いて決定された。淡青色で表示された油混合物は、所定の組のサンプル（培地または培養表面）について、希釈剤（媒体＝２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ）のみで処理された培養物で観察されるレベルに関してコラーゲン濃度に＞１０％の増加を明示されたサンプルを示す。図の太字は、培養培地と細胞培養表面に付着されたＩ型コラーゲンの両者のレベルを増加された油混合物についてのものである。
【００３５】
【図１６】図１６は、試験油の組成である。ローズヒップ（バラの実、精製品）、ルリジサ、ジャカランダおよびカレンジュラ油は、エキウム（ベース）油付きとそれなしとで組成され、それまでの実験から得たデータに従って、２ｍｌの培養培地に各試験油混合物２００μｌを加えた。用いられた希釈剤は２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ − 培養ウェル内で達成される最大ＤＭＳＯは０．１８％であった。
【００３６】
【図１７】図１７は、複数／１つの試験油合成物で処理されたヒト皮膚線維芽細胞の培養培地における分泌Ｉ型コラーゲンのレベルである。図示のデータは２つの分離された細胞培養ウェルから得られた値によるものである。油はそれらの参照番号（図１６参照）によってＸ軸に表されている。精製ローズヒップ油（Ｅｐｉ２９）とエキウム油（Ｅｐｉ６３）の試験油合成物は培養培地におけるＩ型コラーゲンの最も着実な増加をもたらした。生データは図１９から３０に示されている。
【００３７】
【図１８】図１８は、複数／１つの試験油合成物で処理されたヒト皮膚線維芽細胞から、培養プレートのウェルに付着されたものにおける分泌Ｉ型コラーゲンのレベルである。図示のデータは２つの分離された細胞培養ウェルから得られた値によるものである。油はそれらの参照番号（図１６参照）によってＸ軸に表されている。すべての試験油合成物は媒体処理および非処理対照群に関して培養物に付着されたＩ型コラーゲンのレベルを高めた。ジャカランダ油（Ｅｐｉ６０）を除いて、試験油へのドナー２細胞の反応はドナー１細胞の反応よりも大きかった。生データは図１９から３０に示されている。
【００３８】
【図１９】図１９は、ドナー１ − 培地サンプルのプレートレイアウトおよび吸光度である。隣接する欄で同じ標識を有するサンプルは同じ培養ウェルからの反復サンプルである。同じ欄で同じ標識を有するサンプルは異なった培養ウェルからのものである。吸光度は４５０ｎｍで決定された。
【００３９】
【図２０】図２０は、ドナー１ − 培地サンプルの基準曲線である。
【００４０】
【図２１】図２１は、ドナー１ − 培地サンプルの基準曲線から決定されたＩ型コラーゲン値である。
【００４１】
【図２２】図２２は、ドナー１ − プレート（コラーゲン付着）サンプルのプレートレイアウトおよび生の吸光度データである。隣接する欄で同じ標識を有するサンプルは同じ培養ウェルからの反復サンプルである。同じ欄で同じ標識を有するサンプルは異なった培養ウェルからのものである。吸光度は４５０ｎｍで決定された。
【００４２】
【図２３】図２３は、ドナー１ − プレート（コラーゲン付着）サンプルの基準曲線である。
【００４３】
【図２４】図２４は、ドナー１ − プレート（コラーゲン付着）サンプルの基準曲線から決定されたＩ型コラーゲン値である。
【００４４】
【図２５】図２５は、ドナー２ − 培地サンプルのプレートレイアウトおよび生の吸光度データである。隣接する欄で同じ標識を有するサンプルは同じ培養ウェルからの反復サンプルである。同じ欄で同じ標識を有するサンプルは異なった培養ウェルからのものである。吸光度は４５０ｎｍで決定された。
【００４５】
【図２６】図２６は、ドナー２ − 培地サンプルの基準曲線である。
【００４６】
【図２７】図２７は、培地サンプルの基準曲線から決定されたＩ型コラーゲン値である。
【００４７】
【図２８】図２８は、ドナー２ − プレート（コラーゲン付着）サンプルのプレートレイアウトおよび生の吸光度データである。隣接する欄で同じ標識を有するサンプルは同じ培養ウェルからの反復サンプルである。同じ欄で同じ標識を有するサンプルは異なった培養ウェルからのものである。吸光度は４５０ｎｍで決定された。
【００４８】
【図２９】図２９は、ドナー２ − プレート（コラーゲン付着）サンプルの基準曲線である。
【００４９】
【図３０】図３０は、ドナー２ − プレート（コラーゲン付着）サンプルの基準曲線から決定されたＩ型コラーゲン値である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ステアリドン酸、およびステアリドン酸の源としてのエキウム油が皮膚の外観を改善するように有益に使用できることは以前から知られている。しかしながら、この活性促進におけるステアリドン酸またはエキウム油の生物学的機能は判明していない。
【００５１】
さらに、カレンド酸、カタルプ酸、α‐エレオステアリン酸、ジャカル酸、およびプニカ酸のようなオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）、並びにオクタデカトリエン酸の供給源のような植物脂質は、皮膚再生の役割を有することができることもまた以前から知られている。
【００５２】
この背景に対し、本発明者はコラーゲンのインビトロ産生におけるオクタデカトリエン酸を有するステアリドン酸の合成物の効果を調査することを決定した。
【００５３】
驚くことに、ステアリドン酸の源としてのエキウム油を含むステアリドン酸およびオクタデカトリエン酸の源としての異なった植物脂質を含むオクタデカトリエン酸の合成物は、可溶性コラーゲンおよび接着Ｉ型コラーゲンのレベルを共に増加することにより、ヒト皮膚線維芽細胞培養物におけるＩ型コラーゲン分泌物を増加したことが判明した。これらの合成物のＩ型コラーゲン産生促進の可能性はこれまで確認されていない。
【００５４】
８つの試験油混合物は、細胞培養表面のペプシン消化物における測定可能なＩ型コラーゲン（処理された線維芽細胞を含む細胞培養ウェルの壁および底面に付着した分泌コラーゲンを示す）の量を増加した：ローズヒップ（バラの実、精製品）、ルリヂサ、ジャカランダ、カレンジュラ、ポメグラネイト、ルリヂサ（精製品）、およびベース、エキウム油。これらのデータは添付の図面に示されている。４つの油混合物 − ローズヒップ（精製品）、ルリヂサ、ジャカランダおよびカレンジュラ − は、細胞培養培地における可溶性Ｉ型コラーゲンおよび細胞培養表面における接着Ｉ型コラーゲンを増加したことを確認できる。さらに、ステアリドン酸と組み合わされたジャカル酸（オクタデカトリエン酸）は、ヒト皮膚線維芽細胞により、Ｉ型コラーゲン分泌物を強力に誘導することが判明した。カレンド酸（これもまたオクタデカトリエン酸）はジャカル酸と同様な有効性を有していた。これらの驚くべき結果は予測できず、これらの材料に関する既存情報から自明なものではない。それらはまた、ステアリドン酸およびオクタデカトリエン酸がコラーゲン産生を促進するように相乗効果を保有できることを明示している。
【００５５】
コラーゲン産生を促進することにより、オクタデカトリエン酸およびオクタデカトリエン酸の源としての植物脂質を有する、ステアリドン酸とステアリドン酸の源としてのエキウム油との組合せを含む合成物は、局所化粧品処方として多くの有用性を有する。本発明までは、オクタデカトリエン酸およびオクタデカトリエン酸の源としての植物脂質と組み合わされる、ステアリドン酸とステアリドン酸の源としてのエキウム油との組合せが、皮膚におけるコラーゲン産生を促進するように作用でき、そしてそれ故、皮膚へ適用するための局所処方として好都合に使用できることは、理解されていなかった。
【００５６】
本発明の第１の態様は、１つまたはそれ以上のオクタデガトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）と組み合わされたステアリドン酸を含む、動物の皮膚に局所処方するための合成物を提供する。
【００５７】
ステアリドン酸は、ときにはモロクチン酸と呼ばれるω−３必須脂肪酸である。それは酵素Δ６不飽和酵素によりαリノレン酸から生物学的に合成される。この脂肪酸の天然源は麻、クロフサスグリの実およびエキウムの種子油、およびシアノバクテリアスピルニナである。それは化学式、Ｃ18Ｈ28Ｏ2を有する。
【００５８】
ステアリドン酸は、多くの異なった供給先から化学的に純粋な形で入手できる。例えば、カイマン・ケミカル社（http://www.caymanchem.com/）は製品番号１０００６８５６としてステアリドン酸エチルエステルを供給している。
【００５９】
しかしながら、ステアリドン酸は、植物または種子油抽出物のような、天然源からの抽出物の一部として供給されるこが本発明の組成物にとって好ましい。このような植物または種子油抽出物は広範に利用でき、例えば、ステアリドン酸を含むヘンプ油（麻の種子の油脂）は多種多様な供給先から商業的に入手できる。その他のステアリドン酸の供給源は、これもまた多種多様な供給先から入手可能なクロフサスグリ種子油を含む。
【００６０】
好ましくは、本発明のこの態様の組成物はステアリドン酸の供給源としてエキウム属の種からの植物油抽出物を含む。エキウム属の種のリストは前述の段落００１０に可能なものが与えられており、そこから、適当な抽出物が準備できる。好ましくは、植物油抽出物はＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズカース、からのものである。油抽出物は約１３％のステアドリン酸を含むことが好ましい。
【００６１】
エキウム油は、パープルバイパースビューグロスとしても知られているエキウムプランタギネウムから産生される。この油は多種多様な供給者、例えば、Ｇ４／ＳＳＤリミテッド社（英国 ＬＮ８ ６ＨＦ リンカーンシャー、マーケット・レーズン、フルックンビィ、ビンブルック・ビジネス・パーク、オーフォード・ホール）から入手可能である。Ｇ４／ＳＳＤリミテッド社により製造されたエキウム油は優れたバランス、約、１３％のステアリドン酸（ＳＡ）を含む４５％のｎ−３、１０％のガンマリノレン酸を含む２５％のｎ−６、および１８％のｎ−９脂肪酸を有する必須脂肪酸を有している。エキウム油は、１つの天然種子油だけでは通常見つからない２つの脂肪酸、すなわち、ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）およびステアリドン酸（ＳＡ）を含んでいる。これら２つのＥＦＡｓは長鎖脂肪酸、プロスタグランジンおよびその他の代謝生成物の形成における出発点として重要である。冷搾エキウム油は、天然油を補助保存するのに有益であるだけでなく、良好健康状態の促進における活性成分として有益であることも判明されている抗酸化物質のほとんどを保持する。
【００６２】
ステアリドン酸、およびステアリドン酸の供給源としてのエキウム油に加えて、本発明のこの態様の組成物は１つまたはそれ以上のオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）もまた含む。
【００６３】
「オクタデカトリエン酸」により、組成物がこれらのタイプのポリ不飽和脂肪酸化合物の１つまたはそれ以上を含むことを我々は盛り込む。オクタデカトリエン酸は多様な異なった化学物質供給者、例えば、このような化合物を幅広く供給するシグマ−アルドリッチ社、から容易に入手できる。
【００６４】
好ましくは、組成物はオクタデカトリエン酸の供給源として１つまたはそれ以上の植物脂質を含む。「１つまたはそれ以上の植物脂質」により、組成物が１つまたはそれ以上の異なった植物源から抽出された脂質を含むことを我々は盛り込む。例えば、ステアリドン酸、具体的にはステアリドン酸の供給源としてのエキウム油に加えてボラゴオフィシナリスからの植物脂質を有する本発明の組成物は、本発明のこの態様の組成物であると考えられている。
【００６５】
このような植物脂質は多様な異なった天然源から入手可能である。以下の植物脂質は本発明のこの態様の組成物に使用できるものの例である。シートンズ社（http://www.seatons-uk.co.uk/）から入手可能なローズヒップ油（冷搾、有機質、および精製品）、ポメグラネイト油（シートンズ社製）、桐油（http://www.made-in-china.com/）、ルリジサ油（精製ルリジサ油を含む。シートンズ社製）、麻の実油（シートンズ社製）、亜麻仁油（http://www.bulknaturaloils.com/）、小麦胚芽油（シートンズ社製）、カメリナ油（シートンズ社製）、ジャカランダ油（Ｇ４／ＳＳＤリミテッド社製、詳細は前述）、カレンジュラ油（スプリングデール）。
【００６６】
好ましくは、植物脂質はルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）、小麦胚芽油（パン小麦）、ローズヒップ油（精製、ローザモスクェータ）、ジャカランダ油（ジャカランダミモシフォリア）、および／またはカレンジュラ油（カレンジュラオフィシナリス）である。
【００６７】
好ましくは、オクタデカトリエン酸はカレンド酸、カタルピン酸、α-エレオステアリン酸、ジャカル酸および／またはプニカ酸である。
【００６８】
本発明の特に好適な実施形態は、組成物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズカース、からの植物油抽出物を含み、そして植物脂質がルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）である。本発明の特に好適な別の実施形態は、組成物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズカース、からの植物油抽出物を含み、そして植物脂質が小麦胚芽油（パン小麦）である。
【００６９】
本発明のこの態様の組成物は、ステアリドン酸／オクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）の比率範囲、例えば、１０：１から１：１０、を有することができる。しかしながら、好ましくは、この比率は約１：１、２：１、３：１、４：１または５：１である。もっとも好ましくは、比率は約３：１である。
【００７０】
また、本発明のこの態様の組成物の実施形態として、植物脂質の比率に対する植物油の比率の範囲、たとえば、１０：１から１：１０、を有することができる。しかしながら、好ましくは、この比率は約１：１、２：１、３：１、４：１または５：１の植物脂質に対する植物油抽出物の比である。もっとも好適なのはこの比が約３：１である。
【００７１】
当業者にとって明らかなように、本発明のこの態様の組成物は、コラーゲンの産生の増加における活性成分の効力、適用される組成物の量、および皮膚への局所組成物の使用頻度に基づいて、ステアリドン酸とステアリドン酸の供給源としてのエキウム油、およびオクタデカトリエン酸とオクダデカトリエン酸の供給源としての植物脂質について異なった量の範囲を有することもできる。
以下の実験例の部分は、ガイダンスとして、コラーゲン産生を促進するように作用できるエキウム油抽出物および植物脂質の比率および量の情報を提供する。実験例はまた、コラーゲン製品の組成物の効果を決定する一連のアッセイのためのガイダンスを提供する。例えば、本発明の組成物がエキウム油およびルリジサ油からなる場合、最終組成物においてエキウム油お１０％よびルリヂサ油３．３３％がコラーゲン産生を促進するように作用できることが実験例に示されている。精製ローズヒップ油の場合もまた、エキウム油１０％およびルリヂサ油３．３３％の混合物が使用できる。ジャカランダおよびカレンジュラの場合は、エキウム油１％および植物脂質０．３％が使用できる。
【００７２】
超臨界二酸化炭素は今では抽出に用いられる溶媒として定着している。これはいくつかの理由のためである。それはその高拡散率のせいで総体的に液体溶媒よりも早く固体サンプルに浸透し、そしてその低粘性のせいで溶解溶質を試料マトリックスから迅速に移送することができる。勿論、製品中の溶媒残留物もまた少なくなる。植物抽出物を準備するように用いられるとき、超臨界二酸化炭素抽出処理は０．１%以下の汚染物質を有する抽出物を供給できる。
【００７３】
本発明は、超臨界二酸化炭素抽出処理を用いて原材料から抽出された植物油および植物脂質がその他の方法を用いて抽出された油および脂質よりも増加されたコラーゲン産生をより大きく促進する能力を維持することを確定した。
【００７４】
それ故、本発明のこの態様の別の好適な実施形態は、超臨界二酸化炭素抽出処理を用いて植物の種子から植物油抽出物および植物脂質を抽出する。天然産物からの超臨界二酸化炭素抽出は、多くの異なった会社、たとえば、ボタニクス社（http://botanix.co.uk/index.html）、ナテコ2社（http://www.nateco2.de/index.htm）により遂行できる。
【００７５】
本発明の第１の態様は、動物の皮膚に局所適用するための組成物を提供する。
【００７６】
いくつもの方法があり、そこにおいて本発明の第１の態様による組成物は動物の皮膚に局所性投与するように剤型できる。
【００７７】
かくして、組成物は、組成物を局所性投与できる、粉、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル、経皮貼布、リポソームまたはその他の適当などのような形態に形成し得る。製剤形態は、それ故、皮膚に塗布または散布することにより適用できるものである。本発明の組成物の賦形剤は付与される目的物により十分に容認されるものであるべきであることは明らかである。製剤形態はまた、香料、着色剤、防腐剤のような成分、あるいはさらに生物学的に活性な成分をさらに含むことができる。
【００７８】
皮膚に局所的に適用するために、本発明の組成物は、例えば、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリエキシエチレン・ポリオキシプロピリン化合物、乳化ろうおよび水の１つまたはそれ以上の混合物に懸濁または溶解された活性成分を含む適当な軟膏として剤型できる。互換的に、本発明の組成物は、例えば、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の１つまたはそれ以上の混合物に懸濁または溶解された、適当なローションまたはクリームとして剤型できる。
【００７９】
しかしながら、本発明の組成物は乳化ゲル中の粒子として剤型されるのが好ましい。このような製剤形態は、溶解された本発明の組成物を特に皮膚に容易に効果的に配布することを有利に行えると考えられる。好適な剤型技術は、メルバーン・コスメスーティックス・リミテッド（http://www.malceutics.com/index.html）により用意される「ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」を含む。
【００８０】
本発明の別の態様は、本発明の第１の態様による組成物からなる医薬組成物および薬学的に容認できる賦形剤を提供する。ここにおいて参照されるように「薬学的に容認できる賦形薬」は医薬組成物を剤型するのに有用な、当業者にとって周知のいかなる生理学的賦形薬であってもよい。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明の先に述べた態様による組成物または医薬組成物を皮膚に局所適用することからなる皮膚の治療方法を提供する。
【００８２】
本発明の別の態様は、皮膚のコラーゲン産生を増加するための本発明の前述の態様による組成物または医薬組成物を提供する。
【００８３】
本発明の別の態様は、皮膚のコラーゲン産生を増加するための薬剤として使用する本発明の前述の態様による組成物または医薬組成物を提供する。
【００８４】
上述した本発明のさらなる態様の各々の好適な実施形態は、組成物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズカース、から抽出された植物油を含み、そして植物脂質はルリヂサ油（ボラゴオフィシナリス）および／または小麦胚芽油（パン小麦）である。
【００８５】
実験例１： 線維芽細胞のコラーゲン合成における脂質適用効果を決定するためのインビトロ研究
【００８６】
実験は、ヒト皮膚線維芽細胞培養物におけるＩ型コラーゲン合成の促進においてエキウム油と組み合わせた植物由来の脂質使用の有効性を決定するように行われた。ヒト皮膚線維芽細胞培養物はヒト皮膚の移植片培養から導かれ、表皮の酵素的除去に続いて、皮膚毒性検査のために有用なモデルを用意し、ＵＶ保護剤の降下を決定し、そして真皮内の遺伝子／タンパク質を修正し得る物質を研究した。この研究は、皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲン分泌の促進における植物由来油の範囲の有効性を決定するために遂行された。分泌されたＩ型コラーゲンはＥＬＩＳＡにより細胞培養培地のペプシン消化物および細胞培養表面のペプシン消化物で解析された。
【００８７】
実験的方法：
ヒト皮膚線維芽細胞（もとは正常ヒト胸部真皮の移植片培養物から抽出）は、標準状態で培養された。依頼者により供給された分布域の試験油は、まず、９６ウェルフォーマット、ホルマザンベース、細胞生存アッセイ（このアッセイは、試験油の単回投与を採用して４８時間後の生存を測定した。）を用いて細胞毒性を検査された。このアッセイから、各試験油の最大耐容希釈が選定された。続いて、試験油のエキウム油との混合物（これは基礎油に選定された。）は、試験油１に対してエキウム油３の割合で用意された。これらの試験油／エキウム油混合物は、６ウェルプレートフォーマットアッセイに用いられる前に、また細胞毒性を検査された。細胞は油混合物に３日間曝された。細胞培養培地、細胞および培養プレートはすべて、分析前に、採取されて−８０℃で貯蔵された。培養培地のＩ型コラーゲンの濃度および細胞培養ウェルに付着した分泌型コラーゲンの量を決定するために商用のＥＬＩＳＡキットが用いられた。
【００８８】
詳細な方法：
ヒト皮膚線維芽細胞の培養
ヒト皮膚線維芽細胞は、１０％ＦＣＳ、Ｌグルタミン酸（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭに、３７℃、空気９５％／ＣＯ2５％環境、相対湿度９５％で保存された。細胞毒性およびＩ型コラーゲンアッセイで使用するために、細胞はトリプシン／ＥＤＴＡ処理により採取された。
被検物質
被検物質は依頼者により室温で液体形態で供給された。被検物質はそれらの参照コードと共に次の表１列記されている。
【表１】
試験油の細胞毒性検査
ヒト皮膚線維芽細胞は９６ウェルプレートに１ウェル当り細胞２×１０4個（１００μｌ容量）蒔かれた。４８時間後、培地は交換されそしてウェルは試験油を単独かまたはエキウム油と組み合わされて処理された。細胞は油に４８時間曝され、その期間の最後に、ＷＳＴ−１急速細胞増殖アッセイ（バイオビジョン・インコーポレーテッド社製）を用いて生存細胞数が決定された。ＷＳＴ−１アッセイのために、分析試薬１０μｌを追加する前に、培地は各培養ウェルにおいてリフレッシュされた。細胞は３７℃で２時間培養され、その後、Ａｎｔｈｏｓ Ｈ III（商品名）プレートリーダを用いて、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍでの吸光度が決定された。
Ｉ型コラーゲン分泌物の決定
細胞は６ウェルプレートに１ウェル当り細胞５×１０5個蒔かれた。２４時間後、培地は交換されそして細胞は試験油混合物で処理された。細胞は試験油混合物に７２時間、培地および試験油を毎日リフレッシュして曝された。暴露期間の最後に、培地は細胞培養ウェルから採取されてー８０℃で貯蔵された。細胞はラバーポリスマンで削り取ることによりプレートから採取され、そして採取された細胞および培養皿は共に−８０℃でまた貯蔵された。Ｉ型コラーゲン分泌物は、細胞培養培地サンプルおよび細胞培養ウェル表面のペプシン消化物を共に用いて、ＥＬＩＳＡ（コスモ・バイオ株式会社、日本）により決定された。ＥＬＩＳＡおよびペプシン消化物は業者の取扱説明書に従って実行され、４５０ｎｍでの吸光度はアンソスＨ IIIプレートリーダを用いて決定された。
【００８９】
結 果
ベースのエキウム油は１／１００の最終希釈で − 希釈剤として２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯが選定された − 皮膚線維芽細胞により良好な耐容性を示すことが判明した。続いて、すべての試験油は１／１００−１／１０００の初期希釈で細胞毒性を測定された。１０個の試験油は希釈内で耐性があり、これらはローズヒップ（冷搾）、ローズヒップ（精製）、ポメグラネイト、ルリヂサ、麻、亜麻、小麦胚芽、カルメリナ、ルリヂサ（精製）およびエキウムの種子であった。４つの油は耐性濃度を見つけるために１／１０００−１／１０，０００の範囲にさらに希釈する必要があり、これらの油はロースヒップ（有機）、アブラギリ、ジャカランダおよびカレンジュラであった。次いで、細胞培養に加えられたときに試験油とエキウム油のいずれの耐性濃度も超えない、３：１の割合を有するエキウム／試験油混合物を準備するように、エキウム油および各試験油の希釈度が算出された。すべてのエキウム／試験油混合物は関連した細胞毒性を有していないことが実証され、それ故にＩ型コラーゲン分泌における効果を判定するのに３日の暴露検査ですべて試験された。４つのエキウム／試験油混合物は細胞培養培地および細胞培養プレートに付着したコラーゲンの量において共にＩ型コラーゲンを増加し、その試験油はローズリップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダおよびカレンジュラであった。３つのその他の試験油は培養培地におけるＩ型コラーゲンの増加と関連し（ローズリップ−冷搾、アブラギリおよび小麦胚芽）、４つの油は細胞培養ウェルに付着したコラーゲンの量を増加した（ポメグラネイト、エキウム、ルリヂサー精製およびエキウムの実）。３つの試験油はＩ型コラーゲン分泌に小さな効果を有し（ローズリップ−有機、麻および亜麻）、そして１つはＩ型コラーゲン分泌に明らかな減少を生じた（カルメリナ）。
【００９０】
エキウム油の結果および検討はヒト皮膚線維芽細胞により１／１００までの希釈で良好な耐性があり、エキウム油は細胞培養ウェルにそのまま加えられるかまたは３つの希釈剤 − 標準の細胞培養培地、２ｍＭ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ；ＢＳＡは担体分子として作用できるように選定され、そしてＤＭＳＯは細胞内取込を増強する− −の１つに処方されるかのいずれかであった。１／１０、１／１００および１／１０００の希釈は各希釈剤で用意された。各エキウム油希釈量の範囲は、１０、８、６、３および１μｌを細胞培養培地の１００μｌを含む３連ウェルに加えることで試験された。
【００９１】
図１は、異なったエキウム油調製品で処理された線維芽細胞培養物における相対的生存細胞数を示す。すべての希釈剤における１／１０のエキウム希釈は、期待された範囲内の生存率を有して良好な耐性であった。生のエキウム油は線維芽細胞に対して毒性があった。
【００９２】
これらの結果から、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ希釈剤は、エキウム油との組み合わせで好適であることが判明した。この希釈剤は、線維芽細胞により油の摂取を高める能力を有するように優先的に選定され、そしてその他の個々の油の選別検査における希釈剤として用いられた。エキウム油の１／１０希釈物１０μｌ（最終希釈１／１００に等しい）はそれに続く試験油混合物の分析評価におけるエキウム油の最大許容用量として設定され得ることがまた判明した。
【００９３】
試験油は広範な耐性を示した。２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯでの１／１０の希釈はすべての試験油に用意され、１００μｌの培地を含む細胞培養ウェルに加えられた１−１０μｌの希釈試験油量（１／１００から１／１０００の範囲の最終希釈となる）を用いて最初の細胞毒性検査に用いられた。試験油がこの範囲以上で細胞毒性を示す場合、選別検査は予め１／１００に希釈された試験湯を用いて繰り返された。
【００９４】
試験湯選別検査の結果は図２に示されている。試験油のほとんどは試験された初期希釈範囲内に耐えたが、６つの油は耐用希釈を確認するために再試験された。これらの油はローズヒップ（有機）、ポメグラネイト、アブラギリ、小麦胚芽、ジャカランダおよびカレンジュラであった。第２回の選別検査のデータは図３に示されている。２回の選別検査は各試験油の耐用量を選定するのに十分であった。次いで、これらのデータは、Ｉ型コラーゲン分泌へのそれらの効果を検査されるべきであるエキウム／試験油合成量を計算するのに用いられた。可能な場合には、試験油の適切な希釈を選定するのに伝統的な接近法が用いられた。
【００９５】
試験油の耐用希釈および、エキウム油３に対して試験油１の設定比率を用いて試験油混合物を作成するのに用いられた量は図４に示されている。いくつかの試験油混合物のために、細胞培養ウェル（１００μｌ容量）で達成できるエキウム油の最終希釈が、試験油の細胞毒性の制限のために、１／１００（エキウム油の最大耐用希釈）以下であり、これらの試験油混合物はローズヒップ（有機）、ローズヒップ（冷搾）、アブラギリ、ジャカランダおよびカレンジュラであったことは図４から明らかである。
【００９６】
すべての試験油混合物は最終回の細胞毒性検査を受けた。すべては非毒性であることが判明した（データは図６から１５に示されている）。図３は試験油で処理されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞生存性を示す（第１選別検査）。
【００９７】
試験油は予め２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに１／１０に希釈された。図示の結果は３連ウェルによるものであり、非処理制御生存能力の百分率で表されている。各処理ごとの５本の棒は、試験された各油の５つの異なった量、左から右へ、１０（影なし）、８、６、３および１μｌ（最も濃い影付き）、を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。図３は試験油で処理されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞生存性を示す（第２選別検査）。
【００９８】
試験油は、指示されたように、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに予め希釈された。図示の結果は３連ウェルの平均値であり、非処理制御生存能力の百分率で示されている。各処理の５本の棒は、試験された各油の５つの異なった量、左から右へ、１０（影なし）、８、６、３および１μｌ（最も濃い影付き）、を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。図４は選定された試験湯希釈および試験油混合物の配合組成を示す。エキウム油／試験油混合物は１００μｌの細胞培養培地に１０μｌの最終量で加えられるように組成された。
【００９９】
ローズヒップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダおよびカレンジュラ試験油混合物はすべてヒト皮膚線維芽細胞 によりＩ型コラーゲン分泌物を増加した。細胞培養培地サンプルのペプシン消化物のＥＬＩＳＡ分析は、処理された培養物からのレベルに関して７個の試験油混合物が測定可能な分泌Ｉ型コラーゲンの量を増加することを示した。これらの油は、ローズヒップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダ、カレンジュラ、ローズヒップ（冷搾）、アブラギリおよび小麦胚芽であった。８個の試験油混合物が細胞培養表面のペプシン消化物における測定可能なＩ型コラーゲン（処理された線維芽細胞を含む細胞培養ウェルの壁および底部に付着した分泌されたコラーゲンを指す）の量を増加した。これらの油は、ローズヒップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダ、カレンジュラ、ポメグラネイト、ルリヂサ（精製）、エキウムの種子およびベース、エキウム油であった。
【０１００】
これらのデータは図５に示されている。４つの油混合物 − ローズヒップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダおよびカレンジュラ − は、細胞培養培地における可溶性Ｉ型コラーゲンおよび細胞培養表面における付着Ｉ型コラーゲンを増加したと見ることができる。これら４つの油混合物のうち、ジャカランダが最大の有効性を示し、ジャカランダおよびカレンジュラ混合物もまた、３／１０，０００の最終試験油希釈および９／１０，０００のエキウム希釈を細胞培養ウェルで達成することで非常に効き目があった。
【０１０１】
得られたデータはまた、希釈剤自体（２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ）での処理が非処理制御培養で観察されたレベルに関してＩ型コラーゲン分泌を増加することを示した。このことはＩ型コラーゲン分泌を積極的に調整する培地組成物の摂取を増加する能力を希釈剤にそのまま反映している。
【０１０２】
図５はヒト皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲン分泌への試験油混合物の効果を示している。Ｉ型コラーゲンレベルはＥＬＩＳＡ（コスモ・バイオ株式会社）により決定され、そして希釈剤（媒体）のみで処理された培養からのサンプルに観察されたレベルの百分率で示されている。細胞培養培地および処理された各培養ウェルからの細胞培養表面（プレート）のペプシン消化物が分析された。各棒は複製サンプルの平均値を表している。各試験油の符号はグラフの右側に示されている。試験油混合物（３：１、エキウム油：試験油の比）は図４に詳述されるように策定された。
【０１０３】
ベースのエキウム油と組み合わされたジャカランダ油の結論は、この実験で採用された培養条件下で、ヒト皮膚線維芽細胞によりＩ型コラーゲン分泌を強力に誘導することが分かった。カレンジュラ油はジャカランダ油と同様な効力を有していたが、Ｉ型コラーゲン分泌を増加する効力はあまり大きくなかった。ローズヒップ（精製）およびルリヂサはカレンジュラと同様な効力を有していたが、１０倍以上の最終濃度で試験された。これら４つの油を用いた処理は細胞培養培地および細胞培養ウェルへの付着において共に増加したＩ型コラーゲンと関連していた。その他の油はこれら２つのパラメータの一方または他方における増加と関連していた。
【０１０４】
実験例２： インビトロヒト線維芽細胞によるコラーゲン分泌増加に関する、適用された脂質の能力の調査
【０１０５】
要 旨
ヒト皮膚線維芽細胞の培養におけるコラーゲンのレベルを高める、試験油および試験油化合物の能力の確認。
前述のように、試験油の範囲は、細胞毒性およびそれらのヒト皮膚線維芽細胞の培養におけるコラーゲンのレベル増加の能力を検査された。この研究において、測定可能なコラーゲンのレベル増加に最も大きな有効性を示した、ルリヂサ、精製ローズヒップ、ジャカランダおよびカレンジュラ油を含む試験油は、単体またはベース油、エキウムと組み合わせて再試験された。付着コラーゲンおよび組織培養培地のコラーゲンは共に分析された。２人の別々の個人からのドナー皮膚から抽出された２組のヒト皮膚線維芽細胞培養物が、この研究に用いられた。
得られたデータは、試験油／エキウム油合成物がヒト線維芽細胞培養物における測定可能なコラーゲンの量を増加することを確認した。この効果は媒体単体で処理されたサンプルで観察されたが、媒体もまた培養蜂のコラーゲンレベルを増加できるので、これは驚くべきことではない。
インビトロヒト皮膚線維芽細胞培養物における細胞外のコラーゲンのレベルを増加する試験油の能力は確認された。異なった皮膚ドナーから抽出された線維芽細胞の反応プロフィールにはいくらかの変動はあるが、すべての油は、媒体処理および非処理制御培養に関して、付着コラーゲンのレベルを増加する能力を示した。
【０１０６】
序 論
ヒト皮膚線維芽細胞培養物はヒト皮膚の移植片培養から派生し、表皮の酵素的除去の後に、皮膚細胞毒性検査に有用なモデルを準備し、ＵＶ防護剤の効力を測定し、そして真皮内の遺伝子／タンパク質発現を変形し得る剤を研究した。前述の研究において、皮膚線維芽細胞培養物はコラーゲン分泌におけるテスト項目の効果を調べるために採用された。分泌コラーゲンは培養培地に見られ、そしてまた、細胞が成長する培養容器／ウェルに付着する。ＥＬＩＳＡ特定−Ｉ型コラーゲンはこれら両区画のコラーゲンレベルを定量化するのに使用できる。
【０１０７】
手 順
ヒト皮膚線維芽細胞の培養
ヒト皮膚線維芽細胞培養物は、美容目的で外科的治療中の２人の別々のドナーから得た胸部皮膚サンプルから設定された。線維芽細胞は１０％ ＦＣＳ、Ｌ‐グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭに、３７℃、空気９５％／ＣＯ2５％雰囲気、相対湿度９５%で維持された。Ｉ型コラーゲンアッセイのために、細胞はトリプシン／ＥＤＴＡ処理により採取された。
試験項目による線維芽細胞培養物の処理
試験項目は依頼者により室温で、液体形態で与えられた。試験項目は図１６の細目に従って組み立てられた。細胞は６ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェルで播種された。２４時間後、培地が交換され、細胞は試験油混合物で処理され、２ｍｌの培養培地に最終容量２００μｌとなるように加えられた。すべての処理は２人のドナーの皮膚サンプルから抽出された線維芽細胞培養物で試験された。細胞は試験油混合物に７２時間、培地および試験油を毎日新たにして曝された。４つの培養ウェルは各試験項目または試験項目の組合せで処理されるかまたは、媒体または未処理のまま処理された。暴露期間の終わりに、培地はすべての培養ウェルから採取され、無菌の７ｍｌの試験管に移され、−８０℃で貯蔵された。細胞はラバーポリスマンで削り取ることにより各処理について２つの培養ウェルから採取され、無菌の１．５ｍｌの試験管に移された。採取された細胞および培養皿は−８０℃で貯蔵された。
線維芽細胞培養物における分泌コラーゲンレベルの測定
Ｉ型コラーゲン分泌は、細胞培養培地サンプルおよび細胞培養ウェル表面のペプシン消化物を共に用いて、ＥＬＩＳＡ（コスモ・バイオ株式会社、日本）により決定された。ＥＬＩＳＡおよびペプシン消化物は製造者の指示に従って実施され、Ａｎｔｈｏｓ Ｈ IIIプレートリーダを用いて４５０ｎｍでの吸光度が決定された。
【０１０８】
結果および考察
２人の別々のドナーから抽出した皮膚から立証され、試験油で処理を行われた分泌コラーゲンのレベル増加を示した、皮膚線維芽細胞培養物
ドナー１およびドナー２から抽出された皮膚線維芽細胞培養物は試験油で処理された分泌コラーゲンのレベル増加を示した。各処理並びに最大効力を示した処理に対する反応の大きさにはいくつかのドナー変動があった（特に、培養培地における計測可能なコラーゲンのレベルについて）。皮膚ドナーが異なることから派生されるこのような細胞の生物学的反応の変動は予期されるべきである。最も矛盾のない特徴は、油／油合成物が、媒体処理済および非処理制御物に関して、培養ウェルにおける付着Ｉ型コラーゲンのレベルを増加したことであった。培地区画におけるコラーゲンおよび付着コラーゲン区画のレベルについてのデータは図１７および１８に示されている。
【０１０９】
結 論
皮膚線維芽細胞の培養物における分泌Ｉ型コラーゲンのレベルを増加する試験油の効果は確認された。
【０１１０】
実験例３： ヒト皮膚のコラーゲン産生におけるＳＤＡとの組合せ時のＣＯＤＴＡ'ｓの役割をさらに確立するための研究の予備レポート
【０１１１】
この実験例はヒト皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲン分泌への２試験活性成分合成物の効果の概要結果を提供する。
ヒト皮膚線維芽細胞（元来は正常ヒト胸部皮膚の移植片培養から抽出された）は標準状態で培養された。能動型の２試験合成物（ＳＤＡと組み合わされたときＣＯＤＴＡ'ｓ）は試験を行う前に細胞毒性を最初に検査した。
Ｉ型コラーゲンレベルが決定されそして希釈剤（媒体）のみで処理された培養物からのサンプルに観察されたレベルの百分率として表されている。
細胞培養培地、および各処理された培養ウェルからの細胞培養表面（プレート）のペプシン消化物が共に分析された。
ステアリドン酸ベースと組み合わされるジャカル酸は、採用された培養条件下でヒト皮膚線維芽細胞によりＩ型コラーゲン分泌を強力に誘導することが判明した。増加率２７８％
カレンド酸はジャカル酸と同様な効力を有するが、Ｉ型コラーゲン分泌物増加におけるその有効性はあまり明らかではなかった。増加率１８７％
【０１１２】
本発明は上述の実施形態の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（添付の請求の範囲、ようやく及び図面を含む）に開示された特徴のいかなる新規なもの、またはいかなる新規な組合せ、あるいは開示された方いかなる法またはプロセスの工程のいかなる新規なもの、またはいかなる新規な組合せにも及ぶものである。
【技術分野】
【０００１】
本説明は総体的に局所スキンケア組成物に関し、特に、コラーゲンの産生促進を提供するように処方された局所スキンケア組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、酵素のような球状タンパク質のものとはまったく異なった作用である長い、繊維構造のタンパク質の一つである。コラーゲンは動物における結合組織の主要なタンパク質であり、哺乳類における全体の約４０％を作り出す最も豊富なタンパク質である。それは大きな引張強度を備えた、丈夫で非拡張であり、そして軟骨、靱帯および腱の主要成分、並びに骨および歯の主要タンパク質成分である。軟質ケラチンと共に皮膚強度および弾力性に関与し、そしてその劣化は老化を伴う皺を引き起こす。コラーゲンは血管を強化し、組織発達の役割を果たす。コラーゲンは結晶形の眼の角膜および水晶体に存在する。また、美容整形および火傷外科手術で用いられている。
【０００３】
コラーゲンは身体全体の多くの部位で、それぞれが一種として周知である多くの異なった形態で存在する。少なくとも１２種の異なったコラーゲンがあり、Ｉ型コラーゲンが最も豊富にある。Ｉ型コラーゲンの基本的な三重螺旋構造が大部分のその他のコラーゲンタイプの原型である。
【０００４】
その他のタイプのコラーゲンは三重螺旋の長さおよびそれらのアミノ基またはカルボキシル基端末端での球状ドメインの存在または非存在においてＩ型コラーゲンと異なる。Ｉ型コラーゲンは、皮膚、腱、および骨に見られ、Ｉ−III型は皮膚発生および形成において決定的な役割を果たすものとして認識されている。
【０００５】
スキンケア組成物およびコラーゲンの産生を増強するインビトロ投与のための組成物が求められている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、第１の実施形態において、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸を含む、動物、特に哺乳類の皮膚への局所適用のための組成物を提供する。ステアリドン酸の好適な供給源はエキウム属の１つまたはそれ以上の種から抽出した植物油である。好ましい種はＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズ・カース、である。
【０００７】
本発明の別の実施形態では、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸を含む、動物、特に哺乳類の皮膚への局所適用のための組成物を提供する。ステアリドン酸の好適な供給源はエキウム属の１つまたはそれ以上の種から抽出した植物油である。好ましい種はＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズ・カース、である。
【０００８】
好ましくは、植物脂質はオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡ'ｓ）として知られる脂肪酸の部類を含むものである。好適なＣＯＤＴＡ'ｓはカレンディック酸、カタルピック酸、α-エレオステアリック酸、ジャカリック酸、およびプニシック酸である。
【０００９】
ＣＯＤＴＡ'ｓの好適な供給源はカレンジュラ・オフィシナリス（キンセンカ）、カタルパ・オバタ（キササゲ）、アレウリテス・フォルディ（オオアブラギリ）、ジャカンドラ・ミモシフォリア（ジャカランダ、Jacandra mimosifolia）、およびプニカ・グラナタム（ザクロ）である。
【００１０】
エキウム属の１つまたはそれ以上の種は以下の１つまたはそれ以上のものの組合せから選択される。
・ エキウム・アカンソカルプム・スベント
・ エキウム・アキュレアツム・ポイア
・ エキウム・アルビカンス・ラグ・アンド・ロードル
・ エキウム・アングスチフォリウム・ラム
・ エキウム・アレナリウム・グス
・ エキウム・アスペリムム・ラム
・ エキウム・アウベリアヌム・ウェブ・エ・ベルス
・ エキウム・ベセンコールティ・サントス
・ エキウム・ボイッシェリ・スチューデル
・ エキウム・ボネッティ・コインシィ
・ エキウム・ブレビラメ・スプラーキ゜ュ・エ・ヒュチ
・ エキウム・カリシルスム・ウェブ・エクス・ボール
・ エキウム・カンディカンス・エル・フィル： プライド・オブ・マデイラ
・ エキウム・クレティクム・エル
・ エキウム・デカイスネイ・ウェブ
・ エキウム・フラブム・デスフ
・ エキウム・ガディタヌム・ボイス
・ エキウム・ゲンティアノイデス
・ エキウム・ギガンテウム・エル・フィル
・ エキウム・ハンディエンス・スベント
・ エキウム・フミレ・デスフ
・ エキウム・イタリクム・エル：ペイル・バイパーズ−バグロス
・ エキウム・ランツェロッテンセ・レム・エ・ホルツ
・ エキウム・レウコファエウム・ウェブ・エクス・スプラーグ・エ・ヒュチ
・ エキウム・ルシタニクム・エル
・ エキウム・マリアヌム・ボイス
・ エキウム・ネルボスム・ドルリアンド・イン・ダブリュ・ティ・エイトン
・ エキウム・パルビフロルム・モエンチ：スモール・フラワード・バイパーズ−バグ ロス
・ エキウム・パボニアヌム・ボイス
・ エキウム・ピニナナ・ウェブエ・ベルス：ジャイアント・バイパーズ−バグロス
・ エキウム・プランタジネウム・エル：パープル・バイパーズ−バグロス、パターソ ンズ・カース
・ エキウム・プスツラツム・シブス・アンド・スム
・ エキウム・ロスラツム・ランゲ：ラックス・バイパーズ−バグロス
・ エキウム・ルッシクムジェイ・エフ・グメル
・ エキウム・サブリコラ・ポメル
・ エキウム・サルマンチクム・ラグ
・ エキウム・シムプレックス・ディシィ
・ エキウム・ストリクツム・エルエフ
・ エキウム・スベンテニィ・ブラム
・ エキウム・ツベルクラツム・ホフマン・アンドリンク
・ エキウム・ビレスセンス・ディシィ：タワー・オブ・ジュエルズ
・ エキウム・ブルガレ・エル：バイパーズ・バグロス
・ エキウム・ウェッビィ・コインシィ
・ エキウム・ウィルドプレティ・ピアーズ・エクス・フック・フィル
【００１１】
本発明による別の実施形態において、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸を含む組成物を皮膚に局所適用することを含む、皮膚の治療方法を提供する。
【００１２】
本発明による別の実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸を含む組成物を皮膚へ局所適用することを含む、皮膚の治療方法を提供する。
【００１３】
本発明による別の実施形態において、皮膚のコラーゲン産生を促進するように、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸の用法を提供する。
【００１４】
本発明による別の実施形態において、皮膚のコラーゲン産生を促進するように、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸の用法を提供する。
【００１５】
本発明による別の実施形態において、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸または生理学的に容認可能なその派生物、或いは皮膚のコラーゲン産生を促進する薬剤製造のための生理学的に容認可能なその派生物の用法を提供する。
【００１６】
本発明による別の実施形態において、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸または生理学的に容認可能なその派生物、或いは皮膚のコラーゲン産生を促進する薬剤製造のための生理学的に容認可能なその派生物の用法を提供する。
【００１７】
老化した皮膚を含む皮膚状態を治療するための医薬組成物は、１つまたはそれ以上の植物脂質と組み合わされたステアリドン酸または生理学的に容認可能なその派生物、或いは生理学的に容認可能なその派生物、および生理学的に容認可能な担体を含む。
【００１８】
老化した皮膚を含む皮膚状態を治療するための医薬組成物は、１つまたはそれ以上のＣＯＤＴＡ'ｓと組み合わされたステアリドン酸または生理学的に容認可能なその派生物、或いは生理学的に容認可能なその派生物、および生理学的に容認可能な担体を含む。
【００１９】
好適な実施形態において、エキウム油は、超臨界二酸化炭素抽出処理工程を用いて、植物の種子から抽出される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、３つの異なった希釈剤に処方されたエキウム油で処理されたヒト皮膚線維芽細胞培養物における細胞生存率である。エキウム油はそのまま使用されるか、細胞培養培地、２ｍＭ ＢＳＡまたは２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに希釈されるかのいずれかであった。図示の結果は３ウェル方法であり、そして非処理対照群生存能力の百分率として表されている。各処理についての５本の棒は試験された５つの異なった量の各希釈物、左から右へ、１０（希釈なし）、８、６、３、および１μｌ（最希釈）を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。
【００２１】
【図２】図２は、試験油（第１スクリーン）で処理されたヒト皮膚線維芽細胞培養物における細胞生存率である。試験油は、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ中に１／１０に予め希釈された。図示の結果は３ウェル方法であり、そして非処理対照群生存能力の百分率として表されている。各処理についての５本の棒は試験された５つの異なった量の各油、左から右へ、１０（希釈なし）、８、６、３、および１μｌ（最希釈）を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。
【００２２】
【図３】図３は、試験油（第２スクリーン）で処理されたヒト皮膚線維芽細胞培養物における細胞生存率である。試験油は、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ中に図示のように予め希釈された。図示の結果は３ウェル方法であり、そして非処理対照群生存能力の百分率として表されている。各処理についての５本の棒は試験された５つの異なった量の各油、左から右へ、１０（希釈なし）、８、６、３、および１μｌ（最希釈）を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。
【００２３】
【図４】図４は、試験油混合物の選択された試験油希釈および処方である。エキウム油／試験油混合物は細胞培養培地１００μｌに最終量１０μｌを加えるように処方された。
【００２４】
【図５】図５は、ヒト皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲン分泌物における試験油混合物の効果である。Ｉ型コラーゲンレベルはＥＬＩＳＡ（コスモ・バイオ株式会社、商標）により決定され、そして希釈剤（媒体）のみで処理された培養物のサンプルに見られるレベルの百分率として表される。処理された各培養ウェルの細胞培養培地および細胞培養表面のペプシン消化物が分析された。各棒は複製サンプルの平均値を表す。各試験油の符号化がグラフの右側に示されている。試験油混合物（３：１、エキウム油：試験油比）は図４に詳細に示されるように処方された。
【００２５】
【図６】図６は、エキウム油（Ｅｐｉ６３）希釈物のためのＷＳＴ−１型細胞生存能力アッセイの試験プレートレイアウトおよび吸光度である。図は４５０ｎｍでの吸光度引く６２０ｎｍでの吸光度を表す。プレート２における次のウェルは意外に低い吸光度を与えた： Ａ６、Ｃ２、Ｅ２、Ｅ３、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４ − これらは２ｍＭ ＢＳＡに希釈されたサンプルであり、そして良好な調和性を示される、好適な希釈剤である、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに希釈されたサンプルからの結果として、繰り返す価値を認められなかった。
【００２６】
【図７】図７は、エキウム油（Ｅｐｉ６３）希釈物で処理された細胞培養ウェルについての非処理対照群細胞生存能力の百分率として表された細胞生存能力である。生存細胞数は修正された吸光度（Ａ450nm−Ａ620nm）に直接関係される。非処理対照群培養ウェルの平均吸光度は１４２９．５７であった。
【００２７】
【図８ｐ１】図８ｐ１は、試験油の第１細胞毒性スクリーンからの、プレート１および２についてのプレートレイアウトおよび吸光度である。
【図８ｐ２】図８ｐ２は、試験油の第１細胞毒性スクリーンからの、プレート３および４についてのプレートレイアウトおよび吸光度である。
【００２８】
【図９】図９は、試験油希釈物で処理された細胞培養ウェルのための非処理対照群細胞生存能力を百分率として表す − スクリーンＩ。生存細胞数は修正された吸光度（Ａ450nm−Ａ620nm）に直接関係される。非処理対照群培養ウェルの平均吸光度は１７６４．１７であった。すべての油は２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに１／１０に希釈された。
【００２９】
【図１０】図１０は、試験油の第２細胞毒性スクリーンからのプレートレイアウトおよび吸光度である。プレート１の２つのウェルＧ１およびＨ１（媒体１０μｌ）は、ＷＳＴ−１試薬がこれらのウェルに加えられていないことを示す非常に低い吸光度を与えた。
【００３０】
【図１１】図１１は、試験油希釈物で処理された細胞培養ウェルのための非処理対照群細胞生存能力を百分率として表す − スクリーンII。生存細胞数は修正された吸光度（Ａ450nm−Ａ620nm）に直接関係される。非処理対照群培養ウェルの平均吸光度は１２３５．８であった。すべての油は２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに希釈された。
【００３１】
【図１２】図１２は、エキウム油／試験油混合物の細胞毒性スクリーンからのプレートレイアウトおよび吸光度である。エキウム油／試験油混合物は表３．１に詳述されるように − １０μｌの各油混合物が各ウェル（細胞培養培地量１００μｌ）に加えられた − 処方された。エキウム標識ウェルはエキウム油のみで処理された。
【００３２】
【図１３】図１３は、エキウム油／試験油混合物で処理された細胞培養ウェルのための非処理対照群細胞生存能力を百分率として表す細胞生存能力である。生存細胞数は修正された吸光度（Ａ450nm−Ａ620nm）に直接関係される。非処理対照群培養ウェルの平均吸光度は１５５２．３３であった。すべての油は２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに希釈された。
【００３３】
【図１４】図１４は、Ｉ型コラーゲンのＥＬＩＳＡ定量のプレートレイアウトおよび吸光度である。Ｉ型コラーゲンレベルは、ＥＬＩＳＡキット製造業者（コスモ・バイオ株式会社）の勧告に従って用意された、細胞培養培地サンプルのペプシン消化物（黄色で標識）および組織培養表面のペプシン消化物（緑色で標識）で決定された。Ｉ型コラーゲンの標準濃度がまた与えられそしてＩ型コラーゲン標準曲線のプロットが示されている。各サンプルは個別の細胞培養ウェルによってもたらされる。
【００３４】
【図１５】図１５は、アッセイサンプルにおけるＩ型コラーゲン濃度である。Ｉ型コラーゲン濃度はμｇ／ｍｌで表され、そしてＥＬＩＳＡアッセイの標準曲線から計算された式を用いて決定された。淡青色で表示された油混合物は、所定の組のサンプル（培地または培養表面）について、希釈剤（媒体＝２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ）のみで処理された培養物で観察されるレベルに関してコラーゲン濃度に＞１０％の増加を明示されたサンプルを示す。図の太字は、培養培地と細胞培養表面に付着されたＩ型コラーゲンの両者のレベルを増加された油混合物についてのものである。
【００３５】
【図１６】図１６は、試験油の組成である。ローズヒップ（バラの実、精製品）、ルリジサ、ジャカランダおよびカレンジュラ油は、エキウム（ベース）油付きとそれなしとで組成され、それまでの実験から得たデータに従って、２ｍｌの培養培地に各試験油混合物２００μｌを加えた。用いられた希釈剤は２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ − 培養ウェル内で達成される最大ＤＭＳＯは０．１８％であった。
【００３６】
【図１７】図１７は、複数／１つの試験油合成物で処理されたヒト皮膚線維芽細胞の培養培地における分泌Ｉ型コラーゲンのレベルである。図示のデータは２つの分離された細胞培養ウェルから得られた値によるものである。油はそれらの参照番号（図１６参照）によってＸ軸に表されている。精製ローズヒップ油（Ｅｐｉ２９）とエキウム油（Ｅｐｉ６３）の試験油合成物は培養培地におけるＩ型コラーゲンの最も着実な増加をもたらした。生データは図１９から３０に示されている。
【００３７】
【図１８】図１８は、複数／１つの試験油合成物で処理されたヒト皮膚線維芽細胞から、培養プレートのウェルに付着されたものにおける分泌Ｉ型コラーゲンのレベルである。図示のデータは２つの分離された細胞培養ウェルから得られた値によるものである。油はそれらの参照番号（図１６参照）によってＸ軸に表されている。すべての試験油合成物は媒体処理および非処理対照群に関して培養物に付着されたＩ型コラーゲンのレベルを高めた。ジャカランダ油（Ｅｐｉ６０）を除いて、試験油へのドナー２細胞の反応はドナー１細胞の反応よりも大きかった。生データは図１９から３０に示されている。
【００３８】
【図１９】図１９は、ドナー１ − 培地サンプルのプレートレイアウトおよび吸光度である。隣接する欄で同じ標識を有するサンプルは同じ培養ウェルからの反復サンプルである。同じ欄で同じ標識を有するサンプルは異なった培養ウェルからのものである。吸光度は４５０ｎｍで決定された。
【００３９】
【図２０】図２０は、ドナー１ − 培地サンプルの基準曲線である。
【００４０】
【図２１】図２１は、ドナー１ − 培地サンプルの基準曲線から決定されたＩ型コラーゲン値である。
【００４１】
【図２２】図２２は、ドナー１ − プレート（コラーゲン付着）サンプルのプレートレイアウトおよび生の吸光度データである。隣接する欄で同じ標識を有するサンプルは同じ培養ウェルからの反復サンプルである。同じ欄で同じ標識を有するサンプルは異なった培養ウェルからのものである。吸光度は４５０ｎｍで決定された。
【００４２】
【図２３】図２３は、ドナー１ − プレート（コラーゲン付着）サンプルの基準曲線である。
【００４３】
【図２４】図２４は、ドナー１ − プレート（コラーゲン付着）サンプルの基準曲線から決定されたＩ型コラーゲン値である。
【００４４】
【図２５】図２５は、ドナー２ − 培地サンプルのプレートレイアウトおよび生の吸光度データである。隣接する欄で同じ標識を有するサンプルは同じ培養ウェルからの反復サンプルである。同じ欄で同じ標識を有するサンプルは異なった培養ウェルからのものである。吸光度は４５０ｎｍで決定された。
【００４５】
【図２６】図２６は、ドナー２ − 培地サンプルの基準曲線である。
【００４６】
【図２７】図２７は、培地サンプルの基準曲線から決定されたＩ型コラーゲン値である。
【００４７】
【図２８】図２８は、ドナー２ − プレート（コラーゲン付着）サンプルのプレートレイアウトおよび生の吸光度データである。隣接する欄で同じ標識を有するサンプルは同じ培養ウェルからの反復サンプルである。同じ欄で同じ標識を有するサンプルは異なった培養ウェルからのものである。吸光度は４５０ｎｍで決定された。
【００４８】
【図２９】図２９は、ドナー２ − プレート（コラーゲン付着）サンプルの基準曲線である。
【００４９】
【図３０】図３０は、ドナー２ − プレート（コラーゲン付着）サンプルの基準曲線から決定されたＩ型コラーゲン値である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ステアリドン酸、およびステアリドン酸の源としてのエキウム油が皮膚の外観を改善するように有益に使用できることは以前から知られている。しかしながら、この活性促進におけるステアリドン酸またはエキウム油の生物学的機能は判明していない。
【００５１】
さらに、カレンド酸、カタルプ酸、α‐エレオステアリン酸、ジャカル酸、およびプニカ酸のようなオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）、並びにオクタデカトリエン酸の供給源のような植物脂質は、皮膚再生の役割を有することができることもまた以前から知られている。
【００５２】
この背景に対し、本発明者はコラーゲンのインビトロ産生におけるオクタデカトリエン酸を有するステアリドン酸の合成物の効果を調査することを決定した。
【００５３】
驚くことに、ステアリドン酸の源としてのエキウム油を含むステアリドン酸およびオクタデカトリエン酸の源としての異なった植物脂質を含むオクタデカトリエン酸の合成物は、可溶性コラーゲンおよび接着Ｉ型コラーゲンのレベルを共に増加することにより、ヒト皮膚線維芽細胞培養物におけるＩ型コラーゲン分泌物を増加したことが判明した。これらの合成物のＩ型コラーゲン産生促進の可能性はこれまで確認されていない。
【００５４】
８つの試験油混合物は、細胞培養表面のペプシン消化物における測定可能なＩ型コラーゲン（処理された線維芽細胞を含む細胞培養ウェルの壁および底面に付着した分泌コラーゲンを示す）の量を増加した：ローズヒップ（バラの実、精製品）、ルリヂサ、ジャカランダ、カレンジュラ、ポメグラネイト、ルリヂサ（精製品）、およびベース、エキウム油。これらのデータは添付の図面に示されている。４つの油混合物 − ローズヒップ（精製品）、ルリヂサ、ジャカランダおよびカレンジュラ − は、細胞培養培地における可溶性Ｉ型コラーゲンおよび細胞培養表面における接着Ｉ型コラーゲンを増加したことを確認できる。さらに、ステアリドン酸と組み合わされたジャカル酸（オクタデカトリエン酸）は、ヒト皮膚線維芽細胞により、Ｉ型コラーゲン分泌物を強力に誘導することが判明した。カレンド酸（これもまたオクタデカトリエン酸）はジャカル酸と同様な有効性を有していた。これらの驚くべき結果は予測できず、これらの材料に関する既存情報から自明なものではない。それらはまた、ステアリドン酸およびオクタデカトリエン酸がコラーゲン産生を促進するように相乗効果を保有できることを明示している。
【００５５】
コラーゲン産生を促進することにより、オクタデカトリエン酸およびオクタデカトリエン酸の源としての植物脂質を有する、ステアリドン酸とステアリドン酸の源としてのエキウム油との組合せを含む合成物は、局所化粧品処方として多くの有用性を有する。本発明までは、オクタデカトリエン酸およびオクタデカトリエン酸の源としての植物脂質と組み合わされる、ステアリドン酸とステアリドン酸の源としてのエキウム油との組合せが、皮膚におけるコラーゲン産生を促進するように作用でき、そしてそれ故、皮膚へ適用するための局所処方として好都合に使用できることは、理解されていなかった。
【００５６】
本発明の第１の態様は、１つまたはそれ以上のオクタデガトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）と組み合わされたステアリドン酸を含む、動物の皮膚に局所処方するための合成物を提供する。
【００５７】
ステアリドン酸は、ときにはモロクチン酸と呼ばれるω−３必須脂肪酸である。それは酵素Δ６不飽和酵素によりαリノレン酸から生物学的に合成される。この脂肪酸の天然源は麻、クロフサスグリの実およびエキウムの種子油、およびシアノバクテリアスピルニナである。それは化学式、Ｃ18Ｈ28Ｏ2を有する。
【００５８】
ステアリドン酸は、多くの異なった供給先から化学的に純粋な形で入手できる。例えば、カイマン・ケミカル社（http://www.caymanchem.com/）は製品番号１０００６８５６としてステアリドン酸エチルエステルを供給している。
【００５９】
しかしながら、ステアリドン酸は、植物または種子油抽出物のような、天然源からの抽出物の一部として供給されるこが本発明の組成物にとって好ましい。このような植物または種子油抽出物は広範に利用でき、例えば、ステアリドン酸を含むヘンプ油（麻の種子の油脂）は多種多様な供給先から商業的に入手できる。その他のステアリドン酸の供給源は、これもまた多種多様な供給先から入手可能なクロフサスグリ種子油を含む。
【００６０】
好ましくは、本発明のこの態様の組成物はステアリドン酸の供給源としてエキウム属の種からの植物油抽出物を含む。エキウム属の種のリストは前述の段落００１０に可能なものが与えられており、そこから、適当な抽出物が準備できる。好ましくは、植物油抽出物はＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズカース、からのものである。油抽出物は約１３％のステアドリン酸を含むことが好ましい。
【００６１】
エキウム油は、パープルバイパースビューグロスとしても知られているエキウムプランタギネウムから産生される。この油は多種多様な供給者、例えば、Ｇ４／ＳＳＤリミテッド社（英国 ＬＮ８ ６ＨＦ リンカーンシャー、マーケット・レーズン、フルックンビィ、ビンブルック・ビジネス・パーク、オーフォード・ホール）から入手可能である。Ｇ４／ＳＳＤリミテッド社により製造されたエキウム油は優れたバランス、約、１３％のステアリドン酸（ＳＡ）を含む４５％のｎ−３、１０％のガンマリノレン酸を含む２５％のｎ−６、および１８％のｎ−９脂肪酸を有する必須脂肪酸を有している。エキウム油は、１つの天然種子油だけでは通常見つからない２つの脂肪酸、すなわち、ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）およびステアリドン酸（ＳＡ）を含んでいる。これら２つのＥＦＡｓは長鎖脂肪酸、プロスタグランジンおよびその他の代謝生成物の形成における出発点として重要である。冷搾エキウム油は、天然油を補助保存するのに有益であるだけでなく、良好健康状態の促進における活性成分として有益であることも判明されている抗酸化物質のほとんどを保持する。
【００６２】
ステアリドン酸、およびステアリドン酸の供給源としてのエキウム油に加えて、本発明のこの態様の組成物は１つまたはそれ以上のオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）もまた含む。
【００６３】
「オクタデカトリエン酸」により、組成物がこれらのタイプのポリ不飽和脂肪酸化合物の１つまたはそれ以上を含むことを我々は盛り込む。オクタデカトリエン酸は多様な異なった化学物質供給者、例えば、このような化合物を幅広く供給するシグマ−アルドリッチ社、から容易に入手できる。
【００６４】
好ましくは、組成物はオクタデカトリエン酸の供給源として１つまたはそれ以上の植物脂質を含む。「１つまたはそれ以上の植物脂質」により、組成物が１つまたはそれ以上の異なった植物源から抽出された脂質を含むことを我々は盛り込む。例えば、ステアリドン酸、具体的にはステアリドン酸の供給源としてのエキウム油に加えてボラゴオフィシナリスからの植物脂質を有する本発明の組成物は、本発明のこの態様の組成物であると考えられている。
【００６５】
このような植物脂質は多様な異なった天然源から入手可能である。以下の植物脂質は本発明のこの態様の組成物に使用できるものの例である。シートンズ社（http://www.seatons-uk.co.uk/）から入手可能なローズヒップ油（冷搾、有機質、および精製品）、ポメグラネイト油（シートンズ社製）、桐油（http://www.made-in-china.com/）、ルリジサ油（精製ルリジサ油を含む。シートンズ社製）、麻の実油（シートンズ社製）、亜麻仁油（http://www.bulknaturaloils.com/）、小麦胚芽油（シートンズ社製）、カメリナ油（シートンズ社製）、ジャカランダ油（Ｇ４／ＳＳＤリミテッド社製、詳細は前述）、カレンジュラ油（スプリングデール）。
【００６６】
好ましくは、植物脂質はルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）、小麦胚芽油（パン小麦）、ローズヒップ油（精製、ローザモスクェータ）、ジャカランダ油（ジャカランダミモシフォリア）、および／またはカレンジュラ油（カレンジュラオフィシナリス）である。
【００６７】
好ましくは、オクタデカトリエン酸はカレンド酸、カタルピン酸、α-エレオステアリン酸、ジャカル酸および／またはプニカ酸である。
【００６８】
本発明の特に好適な実施形態は、組成物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズカース、からの植物油抽出物を含み、そして植物脂質がルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）である。本発明の特に好適な別の実施形態は、組成物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズカース、からの植物油抽出物を含み、そして植物脂質が小麦胚芽油（パン小麦）である。
【００６９】
本発明のこの態様の組成物は、ステアリドン酸／オクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）の比率範囲、例えば、１０：１から１：１０、を有することができる。しかしながら、好ましくは、この比率は約１：１、２：１、３：１、４：１または５：１である。もっとも好ましくは、比率は約３：１である。
【００７０】
また、本発明のこの態様の組成物の実施形態として、植物脂質の比率に対する植物油の比率の範囲、たとえば、１０：１から１：１０、を有することができる。しかしながら、好ましくは、この比率は約１：１、２：１、３：１、４：１または５：１の植物脂質に対する植物油抽出物の比である。もっとも好適なのはこの比が約３：１である。
【００７１】
当業者にとって明らかなように、本発明のこの態様の組成物は、コラーゲンの産生の増加における活性成分の効力、適用される組成物の量、および皮膚への局所組成物の使用頻度に基づいて、ステアリドン酸とステアリドン酸の供給源としてのエキウム油、およびオクタデカトリエン酸とオクダデカトリエン酸の供給源としての植物脂質について異なった量の範囲を有することもできる。
以下の実験例の部分は、ガイダンスとして、コラーゲン産生を促進するように作用できるエキウム油抽出物および植物脂質の比率および量の情報を提供する。実験例はまた、コラーゲン製品の組成物の効果を決定する一連のアッセイのためのガイダンスを提供する。例えば、本発明の組成物がエキウム油およびルリジサ油からなる場合、最終組成物においてエキウム油お１０％よびルリヂサ油３．３３％がコラーゲン産生を促進するように作用できることが実験例に示されている。精製ローズヒップ油の場合もまた、エキウム油１０％およびルリヂサ油３．３３％の混合物が使用できる。ジャカランダおよびカレンジュラの場合は、エキウム油１％および植物脂質０．３％が使用できる。
【００７２】
超臨界二酸化炭素は今では抽出に用いられる溶媒として定着している。これはいくつかの理由のためである。それはその高拡散率のせいで総体的に液体溶媒よりも早く固体サンプルに浸透し、そしてその低粘性のせいで溶解溶質を試料マトリックスから迅速に移送することができる。勿論、製品中の溶媒残留物もまた少なくなる。植物抽出物を準備するように用いられるとき、超臨界二酸化炭素抽出処理は０．１%以下の汚染物質を有する抽出物を供給できる。
【００７３】
本発明は、超臨界二酸化炭素抽出処理を用いて原材料から抽出された植物油および植物脂質がその他の方法を用いて抽出された油および脂質よりも増加されたコラーゲン産生をより大きく促進する能力を維持することを確定した。
【００７４】
それ故、本発明のこの態様の別の好適な実施形態は、超臨界二酸化炭素抽出処理を用いて植物の種子から植物油抽出物および植物脂質を抽出する。天然産物からの超臨界二酸化炭素抽出は、多くの異なった会社、たとえば、ボタニクス社（http://botanix.co.uk/index.html）、ナテコ2社（http://www.nateco2.de/index.htm）により遂行できる。
【００７５】
本発明の第１の態様は、動物の皮膚に局所適用するための組成物を提供する。
【００７６】
いくつもの方法があり、そこにおいて本発明の第１の態様による組成物は動物の皮膚に局所性投与するように剤型できる。
【００７７】
かくして、組成物は、組成物を局所性投与できる、粉、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル、経皮貼布、リポソームまたはその他の適当などのような形態に形成し得る。製剤形態は、それ故、皮膚に塗布または散布することにより適用できるものである。本発明の組成物の賦形剤は付与される目的物により十分に容認されるものであるべきであることは明らかである。製剤形態はまた、香料、着色剤、防腐剤のような成分、あるいはさらに生物学的に活性な成分をさらに含むことができる。
【００７８】
皮膚に局所的に適用するために、本発明の組成物は、例えば、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリエキシエチレン・ポリオキシプロピリン化合物、乳化ろうおよび水の１つまたはそれ以上の混合物に懸濁または溶解された活性成分を含む適当な軟膏として剤型できる。互換的に、本発明の組成物は、例えば、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の１つまたはそれ以上の混合物に懸濁または溶解された、適当なローションまたはクリームとして剤型できる。
【００７９】
しかしながら、本発明の組成物は乳化ゲル中の粒子として剤型されるのが好ましい。このような製剤形態は、溶解された本発明の組成物を特に皮膚に容易に効果的に配布することを有利に行えると考えられる。好適な剤型技術は、メルバーン・コスメスーティックス・リミテッド（http://www.malceutics.com/index.html）により用意される「ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」を含む。
【００８０】
本発明の別の態様は、本発明の第１の態様による組成物からなる医薬組成物および薬学的に容認できる賦形剤を提供する。ここにおいて参照されるように「薬学的に容認できる賦形薬」は医薬組成物を剤型するのに有用な、当業者にとって周知のいかなる生理学的賦形薬であってもよい。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明の先に述べた態様による組成物または医薬組成物を皮膚に局所適用することからなる皮膚の治療方法を提供する。
【００８２】
本発明の別の態様は、皮膚のコラーゲン産生を増加するための本発明の前述の態様による組成物または医薬組成物を提供する。
【００８３】
本発明の別の態様は、皮膚のコラーゲン産生を増加するための薬剤として使用する本発明の前述の態様による組成物または医薬組成物を提供する。
【００８４】
上述した本発明のさらなる態様の各々の好適な実施形態は、組成物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズカース、から抽出された植物油を含み、そして植物脂質はルリヂサ油（ボラゴオフィシナリス）および／または小麦胚芽油（パン小麦）である。
【００８５】
実験例１： 線維芽細胞のコラーゲン合成における脂質適用効果を決定するためのインビトロ研究
【００８６】
実験は、ヒト皮膚線維芽細胞培養物におけるＩ型コラーゲン合成の促進においてエキウム油と組み合わせた植物由来の脂質使用の有効性を決定するように行われた。ヒト皮膚線維芽細胞培養物はヒト皮膚の移植片培養から導かれ、表皮の酵素的除去に続いて、皮膚毒性検査のために有用なモデルを用意し、ＵＶ保護剤の降下を決定し、そして真皮内の遺伝子／タンパク質を修正し得る物質を研究した。この研究は、皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲン分泌の促進における植物由来油の範囲の有効性を決定するために遂行された。分泌されたＩ型コラーゲンはＥＬＩＳＡにより細胞培養培地のペプシン消化物および細胞培養表面のペプシン消化物で解析された。
【００８７】
実験的方法：
ヒト皮膚線維芽細胞（もとは正常ヒト胸部真皮の移植片培養物から抽出）は、標準状態で培養された。依頼者により供給された分布域の試験油は、まず、９６ウェルフォーマット、ホルマザンベース、細胞生存アッセイ（このアッセイは、試験油の単回投与を採用して４８時間後の生存を測定した。）を用いて細胞毒性を検査された。このアッセイから、各試験油の最大耐容希釈が選定された。続いて、試験油のエキウム油との混合物（これは基礎油に選定された。）は、試験油１に対してエキウム油３の割合で用意された。これらの試験油／エキウム油混合物は、６ウェルプレートフォーマットアッセイに用いられる前に、また細胞毒性を検査された。細胞は油混合物に３日間曝された。細胞培養培地、細胞および培養プレートはすべて、分析前に、採取されて−８０℃で貯蔵された。培養培地のＩ型コラーゲンの濃度および細胞培養ウェルに付着した分泌型コラーゲンの量を決定するために商用のＥＬＩＳＡキットが用いられた。
【００８８】
詳細な方法：
ヒト皮膚線維芽細胞の培養
ヒト皮膚線維芽細胞は、１０％ＦＣＳ、Ｌグルタミン酸（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭに、３７℃、空気９５％／ＣＯ2５％環境、相対湿度９５％で保存された。細胞毒性およびＩ型コラーゲンアッセイで使用するために、細胞はトリプシン／ＥＤＴＡ処理により採取された。
被検物質
被検物質は依頼者により室温で液体形態で供給された。被検物質はそれらの参照コードと共に次の表１列記されている。
【表１】
試験油の細胞毒性検査
ヒト皮膚線維芽細胞は９６ウェルプレートに１ウェル当り細胞２×１０4個（１００μｌ容量）蒔かれた。４８時間後、培地は交換されそしてウェルは試験油を単独かまたはエキウム油と組み合わされて処理された。細胞は油に４８時間曝され、その期間の最後に、ＷＳＴ−１急速細胞増殖アッセイ（バイオビジョン・インコーポレーテッド社製）を用いて生存細胞数が決定された。ＷＳＴ−１アッセイのために、分析試薬１０μｌを追加する前に、培地は各培養ウェルにおいてリフレッシュされた。細胞は３７℃で２時間培養され、その後、Ａｎｔｈｏｓ Ｈ III（商品名）プレートリーダを用いて、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍでの吸光度が決定された。
Ｉ型コラーゲン分泌物の決定
細胞は６ウェルプレートに１ウェル当り細胞５×１０5個蒔かれた。２４時間後、培地は交換されそして細胞は試験油混合物で処理された。細胞は試験油混合物に７２時間、培地および試験油を毎日リフレッシュして曝された。暴露期間の最後に、培地は細胞培養ウェルから採取されてー８０℃で貯蔵された。細胞はラバーポリスマンで削り取ることによりプレートから採取され、そして採取された細胞および培養皿は共に−８０℃でまた貯蔵された。Ｉ型コラーゲン分泌物は、細胞培養培地サンプルおよび細胞培養ウェル表面のペプシン消化物を共に用いて、ＥＬＩＳＡ（コスモ・バイオ株式会社、日本）により決定された。ＥＬＩＳＡおよびペプシン消化物は業者の取扱説明書に従って実行され、４５０ｎｍでの吸光度はアンソスＨ IIIプレートリーダを用いて決定された。
【００８９】
結 果
ベースのエキウム油は１／１００の最終希釈で − 希釈剤として２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯが選定された − 皮膚線維芽細胞により良好な耐容性を示すことが判明した。続いて、すべての試験油は１／１００−１／１０００の初期希釈で細胞毒性を測定された。１０個の試験油は希釈内で耐性があり、これらはローズヒップ（冷搾）、ローズヒップ（精製）、ポメグラネイト、ルリヂサ、麻、亜麻、小麦胚芽、カルメリナ、ルリヂサ（精製）およびエキウムの種子であった。４つの油は耐性濃度を見つけるために１／１０００−１／１０，０００の範囲にさらに希釈する必要があり、これらの油はロースヒップ（有機）、アブラギリ、ジャカランダおよびカレンジュラであった。次いで、細胞培養に加えられたときに試験油とエキウム油のいずれの耐性濃度も超えない、３：１の割合を有するエキウム／試験油混合物を準備するように、エキウム油および各試験油の希釈度が算出された。すべてのエキウム／試験油混合物は関連した細胞毒性を有していないことが実証され、それ故にＩ型コラーゲン分泌における効果を判定するのに３日の暴露検査ですべて試験された。４つのエキウム／試験油混合物は細胞培養培地および細胞培養プレートに付着したコラーゲンの量において共にＩ型コラーゲンを増加し、その試験油はローズリップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダおよびカレンジュラであった。３つのその他の試験油は培養培地におけるＩ型コラーゲンの増加と関連し（ローズリップ−冷搾、アブラギリおよび小麦胚芽）、４つの油は細胞培養ウェルに付着したコラーゲンの量を増加した（ポメグラネイト、エキウム、ルリヂサー精製およびエキウムの実）。３つの試験油はＩ型コラーゲン分泌に小さな効果を有し（ローズリップ−有機、麻および亜麻）、そして１つはＩ型コラーゲン分泌に明らかな減少を生じた（カルメリナ）。
【００９０】
エキウム油の結果および検討はヒト皮膚線維芽細胞により１／１００までの希釈で良好な耐性があり、エキウム油は細胞培養ウェルにそのまま加えられるかまたは３つの希釈剤 − 標準の細胞培養培地、２ｍＭ ＢＳＡおよび２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ；ＢＳＡは担体分子として作用できるように選定され、そしてＤＭＳＯは細胞内取込を増強する− −の１つに処方されるかのいずれかであった。１／１０、１／１００および１／１０００の希釈は各希釈剤で用意された。各エキウム油希釈量の範囲は、１０、８、６、３および１μｌを細胞培養培地の１００μｌを含む３連ウェルに加えることで試験された。
【００９１】
図１は、異なったエキウム油調製品で処理された線維芽細胞培養物における相対的生存細胞数を示す。すべての希釈剤における１／１０のエキウム希釈は、期待された範囲内の生存率を有して良好な耐性であった。生のエキウム油は線維芽細胞に対して毒性があった。
【００９２】
これらの結果から、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ希釈剤は、エキウム油との組み合わせで好適であることが判明した。この希釈剤は、線維芽細胞により油の摂取を高める能力を有するように優先的に選定され、そしてその他の個々の油の選別検査における希釈剤として用いられた。エキウム油の１／１０希釈物１０μｌ（最終希釈１／１００に等しい）はそれに続く試験油混合物の分析評価におけるエキウム油の最大許容用量として設定され得ることがまた判明した。
【００９３】
試験油は広範な耐性を示した。２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯでの１／１０の希釈はすべての試験油に用意され、１００μｌの培地を含む細胞培養ウェルに加えられた１−１０μｌの希釈試験油量（１／１００から１／１０００の範囲の最終希釈となる）を用いて最初の細胞毒性検査に用いられた。試験油がこの範囲以上で細胞毒性を示す場合、選別検査は予め１／１００に希釈された試験湯を用いて繰り返された。
【００９４】
試験湯選別検査の結果は図２に示されている。試験油のほとんどは試験された初期希釈範囲内に耐えたが、６つの油は耐用希釈を確認するために再試験された。これらの油はローズヒップ（有機）、ポメグラネイト、アブラギリ、小麦胚芽、ジャカランダおよびカレンジュラであった。第２回の選別検査のデータは図３に示されている。２回の選別検査は各試験油の耐用量を選定するのに十分であった。次いで、これらのデータは、Ｉ型コラーゲン分泌へのそれらの効果を検査されるべきであるエキウム／試験油合成量を計算するのに用いられた。可能な場合には、試験油の適切な希釈を選定するのに伝統的な接近法が用いられた。
【００９５】
試験油の耐用希釈および、エキウム油３に対して試験油１の設定比率を用いて試験油混合物を作成するのに用いられた量は図４に示されている。いくつかの試験油混合物のために、細胞培養ウェル（１００μｌ容量）で達成できるエキウム油の最終希釈が、試験油の細胞毒性の制限のために、１／１００（エキウム油の最大耐用希釈）以下であり、これらの試験油混合物はローズヒップ（有機）、ローズヒップ（冷搾）、アブラギリ、ジャカランダおよびカレンジュラであったことは図４から明らかである。
【００９６】
すべての試験油混合物は最終回の細胞毒性検査を受けた。すべては非毒性であることが判明した（データは図６から１５に示されている）。図３は試験油で処理されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞生存性を示す（第１選別検査）。
【００９７】
試験油は予め２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに１／１０に希釈された。図示の結果は３連ウェルによるものであり、非処理制御生存能力の百分率で表されている。各処理ごとの５本の棒は、試験された各油の５つの異なった量、左から右へ、１０（影なし）、８、６、３および１μｌ（最も濃い影付き）、を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。図３は試験油で処理されたヒト皮膚線維芽細胞の細胞生存性を示す（第２選別検査）。
【００９８】
試験油は、指示されたように、２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯに予め希釈された。図示の結果は３連ウェルの平均値であり、非処理制御生存能力の百分率で示されている。各処理の５本の棒は、試験された各油の５つの異なった量、左から右へ、１０（影なし）、８、６、３および１μｌ（最も濃い影付き）、を表している。各ウェルの細胞培養培地量は１００μｌであった。図４は選定された試験湯希釈および試験油混合物の配合組成を示す。エキウム油／試験油混合物は１００μｌの細胞培養培地に１０μｌの最終量で加えられるように組成された。
【００９９】
ローズヒップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダおよびカレンジュラ試験油混合物はすべてヒト皮膚線維芽細胞 によりＩ型コラーゲン分泌物を増加した。細胞培養培地サンプルのペプシン消化物のＥＬＩＳＡ分析は、処理された培養物からのレベルに関して７個の試験油混合物が測定可能な分泌Ｉ型コラーゲンの量を増加することを示した。これらの油は、ローズヒップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダ、カレンジュラ、ローズヒップ（冷搾）、アブラギリおよび小麦胚芽であった。８個の試験油混合物が細胞培養表面のペプシン消化物における測定可能なＩ型コラーゲン（処理された線維芽細胞を含む細胞培養ウェルの壁および底部に付着した分泌されたコラーゲンを指す）の量を増加した。これらの油は、ローズヒップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダ、カレンジュラ、ポメグラネイト、ルリヂサ（精製）、エキウムの種子およびベース、エキウム油であった。
【０１００】
これらのデータは図５に示されている。４つの油混合物 − ローズヒップ（精製）、ルリヂサ、ジャカランダおよびカレンジュラ − は、細胞培養培地における可溶性Ｉ型コラーゲンおよび細胞培養表面における付着Ｉ型コラーゲンを増加したと見ることができる。これら４つの油混合物のうち、ジャカランダが最大の有効性を示し、ジャカランダおよびカレンジュラ混合物もまた、３／１０，０００の最終試験油希釈および９／１０，０００のエキウム希釈を細胞培養ウェルで達成することで非常に効き目があった。
【０１０１】
得られたデータはまた、希釈剤自体（２ｍＭ ＢＳＡ／１．８％ ＤＭＳＯ）での処理が非処理制御培養で観察されたレベルに関してＩ型コラーゲン分泌を増加することを示した。このことはＩ型コラーゲン分泌を積極的に調整する培地組成物の摂取を増加する能力を希釈剤にそのまま反映している。
【０１０２】
図５はヒト皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲン分泌への試験油混合物の効果を示している。Ｉ型コラーゲンレベルはＥＬＩＳＡ（コスモ・バイオ株式会社）により決定され、そして希釈剤（媒体）のみで処理された培養からのサンプルに観察されたレベルの百分率で示されている。細胞培養培地および処理された各培養ウェルからの細胞培養表面（プレート）のペプシン消化物が分析された。各棒は複製サンプルの平均値を表している。各試験油の符号はグラフの右側に示されている。試験油混合物（３：１、エキウム油：試験油の比）は図４に詳述されるように策定された。
【０１０３】
ベースのエキウム油と組み合わされたジャカランダ油の結論は、この実験で採用された培養条件下で、ヒト皮膚線維芽細胞によりＩ型コラーゲン分泌を強力に誘導することが分かった。カレンジュラ油はジャカランダ油と同様な効力を有していたが、Ｉ型コラーゲン分泌を増加する効力はあまり大きくなかった。ローズヒップ（精製）およびルリヂサはカレンジュラと同様な効力を有していたが、１０倍以上の最終濃度で試験された。これら４つの油を用いた処理は細胞培養培地および細胞培養ウェルへの付着において共に増加したＩ型コラーゲンと関連していた。その他の油はこれら２つのパラメータの一方または他方における増加と関連していた。
【０１０４】
実験例２： インビトロヒト線維芽細胞によるコラーゲン分泌増加に関する、適用された脂質の能力の調査
【０１０５】
要 旨
ヒト皮膚線維芽細胞の培養におけるコラーゲンのレベルを高める、試験油および試験油化合物の能力の確認。
前述のように、試験油の範囲は、細胞毒性およびそれらのヒト皮膚線維芽細胞の培養におけるコラーゲンのレベル増加の能力を検査された。この研究において、測定可能なコラーゲンのレベル増加に最も大きな有効性を示した、ルリヂサ、精製ローズヒップ、ジャカランダおよびカレンジュラ油を含む試験油は、単体またはベース油、エキウムと組み合わせて再試験された。付着コラーゲンおよび組織培養培地のコラーゲンは共に分析された。２人の別々の個人からのドナー皮膚から抽出された２組のヒト皮膚線維芽細胞培養物が、この研究に用いられた。
得られたデータは、試験油／エキウム油合成物がヒト線維芽細胞培養物における測定可能なコラーゲンの量を増加することを確認した。この効果は媒体単体で処理されたサンプルで観察されたが、媒体もまた培養蜂のコラーゲンレベルを増加できるので、これは驚くべきことではない。
インビトロヒト皮膚線維芽細胞培養物における細胞外のコラーゲンのレベルを増加する試験油の能力は確認された。異なった皮膚ドナーから抽出された線維芽細胞の反応プロフィールにはいくらかの変動はあるが、すべての油は、媒体処理および非処理制御培養に関して、付着コラーゲンのレベルを増加する能力を示した。
【０１０６】
序 論
ヒト皮膚線維芽細胞培養物はヒト皮膚の移植片培養から派生し、表皮の酵素的除去の後に、皮膚細胞毒性検査に有用なモデルを準備し、ＵＶ防護剤の効力を測定し、そして真皮内の遺伝子／タンパク質発現を変形し得る剤を研究した。前述の研究において、皮膚線維芽細胞培養物はコラーゲン分泌におけるテスト項目の効果を調べるために採用された。分泌コラーゲンは培養培地に見られ、そしてまた、細胞が成長する培養容器／ウェルに付着する。ＥＬＩＳＡ特定−Ｉ型コラーゲンはこれら両区画のコラーゲンレベルを定量化するのに使用できる。
【０１０７】
手 順
ヒト皮膚線維芽細胞の培養
ヒト皮膚線維芽細胞培養物は、美容目的で外科的治療中の２人の別々のドナーから得た胸部皮膚サンプルから設定された。線維芽細胞は１０％ ＦＣＳ、Ｌ‐グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＤＭＥＭに、３７℃、空気９５％／ＣＯ2５％雰囲気、相対湿度９５%で維持された。Ｉ型コラーゲンアッセイのために、細胞はトリプシン／ＥＤＴＡ処理により採取された。
試験項目による線維芽細胞培養物の処理
試験項目は依頼者により室温で、液体形態で与えられた。試験項目は図１６の細目に従って組み立てられた。細胞は６ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェルで播種された。２４時間後、培地が交換され、細胞は試験油混合物で処理され、２ｍｌの培養培地に最終容量２００μｌとなるように加えられた。すべての処理は２人のドナーの皮膚サンプルから抽出された線維芽細胞培養物で試験された。細胞は試験油混合物に７２時間、培地および試験油を毎日新たにして曝された。４つの培養ウェルは各試験項目または試験項目の組合せで処理されるかまたは、媒体または未処理のまま処理された。暴露期間の終わりに、培地はすべての培養ウェルから採取され、無菌の７ｍｌの試験管に移され、−８０℃で貯蔵された。細胞はラバーポリスマンで削り取ることにより各処理について２つの培養ウェルから採取され、無菌の１．５ｍｌの試験管に移された。採取された細胞および培養皿は−８０℃で貯蔵された。
線維芽細胞培養物における分泌コラーゲンレベルの測定
Ｉ型コラーゲン分泌は、細胞培養培地サンプルおよび細胞培養ウェル表面のペプシン消化物を共に用いて、ＥＬＩＳＡ（コスモ・バイオ株式会社、日本）により決定された。ＥＬＩＳＡおよびペプシン消化物は製造者の指示に従って実施され、Ａｎｔｈｏｓ Ｈ IIIプレートリーダを用いて４５０ｎｍでの吸光度が決定された。
【０１０８】
結果および考察
２人の別々のドナーから抽出した皮膚から立証され、試験油で処理を行われた分泌コラーゲンのレベル増加を示した、皮膚線維芽細胞培養物
ドナー１およびドナー２から抽出された皮膚線維芽細胞培養物は試験油で処理された分泌コラーゲンのレベル増加を示した。各処理並びに最大効力を示した処理に対する反応の大きさにはいくつかのドナー変動があった（特に、培養培地における計測可能なコラーゲンのレベルについて）。皮膚ドナーが異なることから派生されるこのような細胞の生物学的反応の変動は予期されるべきである。最も矛盾のない特徴は、油／油合成物が、媒体処理済および非処理制御物に関して、培養ウェルにおける付着Ｉ型コラーゲンのレベルを増加したことであった。培地区画におけるコラーゲンおよび付着コラーゲン区画のレベルについてのデータは図１７および１８に示されている。
【０１０９】
結 論
皮膚線維芽細胞の培養物における分泌Ｉ型コラーゲンのレベルを増加する試験油の効果は確認された。
【０１１０】
実験例３： ヒト皮膚のコラーゲン産生におけるＳＤＡとの組合せ時のＣＯＤＴＡ'ｓの役割をさらに確立するための研究の予備レポート
【０１１１】
この実験例はヒト皮膚線維芽細胞によるＩ型コラーゲン分泌への２試験活性成分合成物の効果の概要結果を提供する。
ヒト皮膚線維芽細胞（元来は正常ヒト胸部皮膚の移植片培養から抽出された）は標準状態で培養された。能動型の２試験合成物（ＳＤＡと組み合わされたときＣＯＤＴＡ'ｓ）は試験を行う前に細胞毒性を最初に検査した。
Ｉ型コラーゲンレベルが決定されそして希釈剤（媒体）のみで処理された培養物からのサンプルに観察されたレベルの百分率として表されている。
細胞培養培地、および各処理された培養ウェルからの細胞培養表面（プレート）のペプシン消化物が共に分析された。
ステアリドン酸ベースと組み合わされるジャカル酸は、採用された培養条件下でヒト皮膚線維芽細胞によりＩ型コラーゲン分泌を強力に誘導することが判明した。増加率２７８％
カレンド酸はジャカル酸と同様な効力を有するが、Ｉ型コラーゲン分泌物増加におけるその有効性はあまり明らかではなかった。増加率１８７％
【０１１２】
本発明は上述の実施形態の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（添付の請求の範囲、ようやく及び図面を含む）に開示された特徴のいかなる新規なもの、またはいかなる新規な組合せ、あるいは開示された方いかなる法またはプロセスの工程のいかなる新規なもの、またはいかなる新規な組合せにも及ぶものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたはそれ以上のオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）と組み合わされたステアリドン酸を含む、動物の皮膚に局所適用するための組成物。
【請求項２】
組成物がステアリドン酸の供給源として植物油抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
植物油抽出物がエキウム属からの種からである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
植物油抽出物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズ・カースからである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
組成物がオクタデカトリエン酸の供給源として１つまたはそれ以上の植物脂質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
植物脂質がルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）、小麦胚芽油（パン小麦）、ローズヒップ油（精製、ローザモスクェータ）、ジャカランダ油（ジャカランダミモシフォリア）、および／またはカレンジュラ油（カレンジュラオフィシナリス）である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
オクタデカトリエン酸がカレンディック酸、カタルピック酸、α-エレオステアリック酸、ジャカリック酸および・またはプニシック酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
組成物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズ・カースから抽出された植物油を含み、植物脂質がルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）および／または小麦胚芽油（パン小麦）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ステアリドン酸／オクタデカトリエン酸の比が約３：１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
植物油抽出物および植物脂質が超臨界二酸化炭素抽出工程を用いて植物種子から抽出される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に容認可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物を皮膚に局所適用することを含む、皮膚処理方法。
【請求項１３】
皮膚のコラーゲン産生を増加するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物の皮膚への使用。
【請求項１４】
皮膚のコラーゲン産生を増加するように薬剤として使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の皮膚への組成物または医薬組成物。
【請求項１】
１つまたはそれ以上のオクタデカトリエン酸（ＣＯＤＴＡｓ）と組み合わされたステアリドン酸を含む、動物の皮膚に局所適用するための組成物。
【請求項２】
組成物がステアリドン酸の供給源として植物油抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
植物油抽出物がエキウム属からの種からである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
植物油抽出物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズ・カースからである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
組成物がオクタデカトリエン酸の供給源として１つまたはそれ以上の植物脂質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
植物脂質がルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）、小麦胚芽油（パン小麦）、ローズヒップ油（精製、ローザモスクェータ）、ジャカランダ油（ジャカランダミモシフォリア）、および／またはカレンジュラ油（カレンジュラオフィシナリス）である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
オクタデカトリエン酸がカレンディック酸、カタルピック酸、α-エレオステアリック酸、ジャカリック酸および・またはプニシック酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
組成物がＬエキウム属：パープルバイパースビューグロス、パターソンズ・カースから抽出された植物油を含み、植物脂質がルリジサ油（ボラゴオフィシナリス）および／または小麦胚芽油（パン小麦）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ステアリドン酸／オクタデカトリエン酸の比が約３：１である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
植物油抽出物および植物脂質が超臨界二酸化炭素抽出工程を用いて植物種子から抽出される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に容認可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物を皮膚に局所適用することを含む、皮膚処理方法。
【請求項１３】
皮膚のコラーゲン産生を増加するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物の皮膚への使用。
【請求項１４】
皮膚のコラーゲン産生を増加するように薬剤として使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の皮膚への組成物または医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ｐ１】
【図８ｐ２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ｐ１】
【図８ｐ２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公表番号】特表２０１１−５２９８７２（Ｐ２０１１−５２９８７２Ａ）
【公表日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２０５８７（Ｐ２０１１−５２０５８７）
【出願日】平成２１年７月３１日（２００９．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１８９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１３０１５
【国際公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【出願人】（５１１０２７０９１）イー・エス・エル・アイ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月３１日（２００９．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１８９１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１３０１５
【国際公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【出願人】（５１１０２７０９１）イー・エス・エル・アイ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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