コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるブタノールの製造方法
【課 題】効率よくブタノールを生産する微生物、及び微生物を用いて効率よくブタノールを製造する方法を提供する。
【解決手段】コリネ型細菌中で機能する、以下の(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも1つ以上のDNAをコリネ型細菌に導入することを特徴とする、ブタノール生産能を有する形質転換体
(1)アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(2)３-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(3) 3-ヒドロキシブチリル-CoA デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(4)クロトニル-CoA レダクターゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(5)アルデヒド デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(6)アルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA
【解決手段】コリネ型細菌中で機能する、以下の(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも1つ以上のDNAをコリネ型細菌に導入することを特徴とする、ブタノール生産能を有する形質転換体
(1)アセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(2)３-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(3) 3-ヒドロキシブチリル-CoA デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(4)クロトニル-CoA レダクターゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(5)アルデヒド デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA
(6)アルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌中で機能する、以下の(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも1つ以上のDNAをコリネ型細菌に導入することを特徴とする、ブタノール生産能を有する形質転換体。
(1)配列番号1で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号2で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号3で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号4で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号1、2、3又は4で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(2)配列番号5で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号6で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号7で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号8で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号5、6、7又は8で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(3)配列番号9で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号10で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号9又は10で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-ヒドロキシブチリル-CoA デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(4)配列番号11で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号12で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号11又は12で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクロトニル-CoA レダクターゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(5)配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号14で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号17で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号13、14、16又は17で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルデヒド デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(6)配列番号15で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号17で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号15、16又は17で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
【請求項２】
（１）において、配列番号1で表わされる塩基配列からなるDNAが、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来、配列番号2で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号3で表わされる塩基配列からなるDNAが、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来、配列番号4で表わされる塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のアセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、
（２）において、配列番号5で表わされる塩基配列からなるDNAが、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium
acetobutylicum）由来、配列番号6で表わされる塩基配列からなるDNAが、クロストリジウム・ベージェリンキー（Clostridium
beijerinckii）由来、配列番号7で表わされる塩基配列からなるDNAが、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来、配列番号8で表わされる塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の３-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、
（３）において、配列番号9で表わされる塩基配列からなるDNAが、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来、配列番号10で表わされる塩基配列からなるDNAが、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来の3-ヒドロキシブチリル-CoA デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、
（４）において、配列番号11で表わされる塩基配列からなるDNAが、ストレプトミセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）由来、配列番号12で表わされる塩基配列からなるDNAが、ストレプトミセス・ヴィオラセオルバー（Streptomyces violaceoruber）由来のクロトニル-CoA レダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、
（５）において、配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号14で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来、配列番号17で表わされる塩基配列からなるDNAが、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、かつ、
（６）において、配列番号15で表わされる塩基配列からなるDNAが、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来、配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来、配列番号17で表わされる塩基配列からなるDNAが、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）由来のアルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
(1)が、ラルストニア・ユートロファ由来の配列番号1で表わされる塩基配列からなるDNAであり、
(2)が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の配列番号5で表わされる塩基配列からなるDNA又はクロストリジウム・ベージェリンキー由来の配列番号6で表わされる塩基配列からなるDNAであり、
(3)が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の配列番号9で表わされる塩基配列からなるDNAであり、
(4)が、ストレプトミセス・アベルミティリス由来の配列番号11で表わされる塩基配列からなるDNAであり、
(5)が、エシェリヒア・コリ由来の配列番号13又は16で表わされる塩基配列からなるDNAであり、かつ
(6)が、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の配列番号15で表わされる塩基配列からなるDNA又はエシェリヒア・コリ由来の配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNAである
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の形質転換体。
【請求項４】
(1)〜(5)又は(1)〜(6)のDNAをコリネ型細菌に導入することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項５】
コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、及び、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）からなる群より選ばれるものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項６】
コリネバクテリウム・グルタミカムが、コリネバクテリウム・グルタミカムR株（FERM P−１８９７６）、又は、その乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）破壊株である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
Corynebacterium glutamicum But1（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター寄託微生物―受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−４８２）、Corynebacterium glutamicum But2（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター寄託微生物―受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−４８３）、又はCorynebacterium glutamicum But3（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター寄託微生物―受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−４８４）の名称で寄託されている形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の形質転換体により、糖類を含有する培地中でブタノール生成を行なわせる工程と、生成したブタノールを回収する工程とを含むブタノールの製造方法。
【請求項１】
コリネ型細菌中で機能する、以下の(1)〜(6)からなる群より選択される少なくとも1つ以上のDNAをコリネ型細菌に導入することを特徴とする、ブタノール生産能を有する形質転換体。
(1)配列番号1で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号2で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号3で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号4で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号1、2、3又は4で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(2)配列番号5で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号6で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号7で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号8で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号5、6、7又は8で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ３-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(3)配列番号9で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号10で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号9又は10で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3-ヒドロキシブチリル-CoA デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(4)配列番号11で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号12で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号11又は12で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクロトニル-CoA レダクターゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(5)配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号14で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号17で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号13、14、16又は17で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルデヒド デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
(6)配列番号15で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号17で表わされる塩基配列からなるDNA、並びに、配列番号15、16又は17で表わされる塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードするDNAからなる群より選択される少なくとも１種のDNA
【請求項２】
（１）において、配列番号1で表わされる塩基配列からなるDNAが、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来、配列番号2で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号3で表わされる塩基配列からなるDNAが、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来、配列番号4で表わされる塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のアセチル-CoA アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、
（２）において、配列番号5で表わされる塩基配列からなるDNAが、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium
acetobutylicum）由来、配列番号6で表わされる塩基配列からなるDNAが、クロストリジウム・ベージェリンキー（Clostridium
beijerinckii）由来、配列番号7で表わされる塩基配列からなるDNAが、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来、配列番号8で表わされる塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の３-ヒドロキシブチル-CoAデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、
（３）において、配列番号9で表わされる塩基配列からなるDNAが、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来、配列番号10で表わされる塩基配列からなるDNAが、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）由来の3-ヒドロキシブチリル-CoA デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、
（４）において、配列番号11で表わされる塩基配列からなるDNAが、ストレプトミセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）由来、配列番号12で表わされる塩基配列からなるDNAが、ストレプトミセス・ヴィオラセオルバー（Streptomyces violaceoruber）由来のクロトニル-CoA レダクターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、
（５）において、配列番号13で表わされる塩基配列からなるDNA、配列番号14で表わされる塩基配列からなるDNA及び配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来、配列番号17で表わされる塩基配列からなるDNAが、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であり、かつ、
（６）において、配列番号15で表わされる塩基配列からなるDNAが、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来、配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNAが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来、配列番号17で表わされる塩基配列からなるDNAが、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）由来のアルコール デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
(1)が、ラルストニア・ユートロファ由来の配列番号1で表わされる塩基配列からなるDNAであり、
(2)が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の配列番号5で表わされる塩基配列からなるDNA又はクロストリジウム・ベージェリンキー由来の配列番号6で表わされる塩基配列からなるDNAであり、
(3)が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の配列番号9で表わされる塩基配列からなるDNAであり、
(4)が、ストレプトミセス・アベルミティリス由来の配列番号11で表わされる塩基配列からなるDNAであり、
(5)が、エシェリヒア・コリ由来の配列番号13又は16で表わされる塩基配列からなるDNAであり、かつ
(6)が、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の配列番号15で表わされる塩基配列からなるDNA又はエシェリヒア・コリ由来の配列番号16で表わされる塩基配列からなるDNAである
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の形質転換体。
【請求項４】
(1)〜(5)又は(1)〜(6)のDNAをコリネ型細菌に導入することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項５】
コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、及び、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）からなる群より選ばれるものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項６】
コリネバクテリウム・グルタミカムが、コリネバクテリウム・グルタミカムR株（FERM P−１８９７６）、又は、その乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）破壊株である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
Corynebacterium glutamicum But1（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター寄託微生物―受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−４８２）、Corynebacterium glutamicum But2（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター寄託微生物―受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−４８３）、又はCorynebacterium glutamicum But3（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター寄託微生物―受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−４８４）の名称で寄託されている形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の形質転換体により、糖類を含有する培地中でブタノール生成を行なわせる工程と、生成したブタノールを回収する工程とを含むブタノールの製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１８３２５９（Ｐ２００９−１８３２５９Ａ）
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９７９７（Ｐ２００８−２９７９７）
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【Ｆターム（参考）】
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