サイトメガロウイルスの検出および定量方法
【課題】 一定温度、一段階操作で、迅速にＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを増幅、検出することを特徴とする、ＣＭＶの検出および定量方法の提供。
【解決手段】 ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを、特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを利用し、これらのオリゴヌクレオチドプライマーの組合せからなるＲＮＡ増幅工程を、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて測定する検出法によって、前記課題を解決する。
【解決手段】 ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを、特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを利用し、これらのオリゴヌクレオチドプライマーの組合せからなるＲＮＡ増幅工程を、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて測定する検出法によって、前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定核酸配列を利用したＣＭＶの検出および定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、βヒトヘルペスウイルス科に属する正２０面体ＤＮＡウイルスで日本の成人の９０％が感染している。通常、出産直後に感染するが、不顕性感染が多いので、特に病状は現れない。後天的には、尿、唾液、母乳、精液を感染原とする接触感染と、輸血または臓器移植による医原性感染がある。ＣＭＶは生涯にわたって生体内に潜伏し、宿主の生理的変化によって潜伏感染状態から活性化（再活性化）して回帰発症を繰り返すことが特徴である。悪性腫瘍、ＡＩＤＳ患者、臓器移植患者では、免疫不全状態がＣＭＶ再活性化の起因となり、間質性肺炎、肝炎、網膜炎、脳炎、腎炎が発症することが多い。特に、臓器移植が成功したにも関わらず、その後の間質性肺炎等で命を落とすことは大きな問題となっている。このように、致命的な疾病の原因となるＣＭＶ感染の再活性化の迅速高感度な診断法を確立することは、早期治療のために重要である。
【０００３】
従来、ＣＭＶ感染の診断法としては、患者の生体液からＣＭＶを分離して同定する方法があるが２〜３週間を要し迅速性に欠ける。また、患者血清中の抗ＣＭＶ抗体を検出する血清診断法では、抗体非特異反応が生じる問題や高感度が得にくい、抗体価の変化によりウイルスの消長を捕らえにくい等の欠点がある。
【０００４】
最近、リアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＣＭＶ由来のＤＮＡの検出が可能となっている。これは、ＣＭＶ由来のＤＮＡに特異的なプライマーを用い、ウイルスＤＮＡをＰＣＲにより増幅、検出する方法であり、感度が高いという特徴がある。しかし、ＣＭＶはさまざまな臓器に潜伏感染しているため、ＰＣＲ法でＤＮＡを検出するだけでは、再活性化と潜伏感染の区別がつかない。また、ＣＭＶの再活性化時に発現されるｍＲＮＡを増幅、検出するＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法も考案されているが、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程が必要であり、操作に熟練を要し、検出結果を得るまでに長時間を要する。しかも、微量でもＤＮＡが存在すると、ｍＲＮＡが存在しなくても陽性と判定される危険性がある。
【０００５】
一方、以下の方法が知られている。
ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡに変換した後、反応液を昇降温してＤＮＡを増幅するいわゆるＰＣＲを実施するＲＴ−ＰＣＲ法とは異なり、反応液の昇降温なしにＲＮＡをＲＮＡとして増幅し検出する方法である（例えば特許文献２に記載されたＮＡＳＢＡ法、特許文献３に記載されたＴＭＡ法、特許文献４に記載された増幅・検出法等）。これらの方法では、例えば、その転写によって特定配列のＲＮＡ転写産物を生成する、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成することを含む方法である。
【０００６】
より具体的には、例えば、任意のＲＮＡに存在し、該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る特定配列に対して、（１）その３’端に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、（２）この逆転写によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解し、１本鎖ＤＮＡを生成させ、（３）この１本鎖の３’端に相補的で、それ自身がその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記したプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、（４）この２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させて転写産物（特定配列のＲＮＡ）を生成するのである。ＲＮＡ転写産物は特定配列のＲＮＡであるため、前記（１）の反応における鋳型となり、前記（１）反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（２）以降の反応が進行してＲＮＡ増幅の連鎖反応が引き起こされる。
【０００７】
これら方法の特徴は、ＰＣＲのように反応液を昇降温する必要がなく、またＲＮＡの逆転写とその後の連鎖的増幅反応を分けて実施することがない、という点にある。特許文献１の方法は、特許文献２の方法をＣＭＶ由来のｍＲＮＡの増幅、検出に応用した例である。しかし、この方法は、固相担体に吸着または結合させた捕捉プローブに増幅されたＲＮＡを捕捉させた後、検出用プローブをハイブリダイズさせ、未反応の検出用プローブを分離した後、捕捉プローブ、増幅されたＲＮＡ、検出用プローブの複合体を検出するものであり、迅速性に欠ける。その点において、増幅された特定配列に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（特許文献５に記載）を反応液に共存させ、特定配列又はそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することができる特許文献４に記載の増幅、検出法は一定温度、一段階操作で実施でき、迅速性に優れた定量法である。
【０００８】
しかし、この特許文献４の方法に適したＣＭＶ由来のｍＲＮＡ増幅用のプライマーおよび検出用プローブは知られていない。これは特許文献４の方法が一定温度でｍＲＮＡの増幅、検出を行うために、標的となるｍＲＮＡが高次構造を形成してオリゴヌクレオチドの結合を阻害するため、増幅、検出効率が悪くなると考えられているからである。よって一定温度においても結合効率が低下せず、ｍＲＮＡの増幅および検出を行い得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
【０００９】
【特許文献１】特開平９−２８９９００
【００１０】
【特許文献２】特許第２６５０１５９号
【特許文献３】特許第３２４１７１７号
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号
【特許文献５】特願２０００−１５４４３１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明の目的は、ＣＭＶが感染した細胞から得られた試料に対し、特許文献４のような方法を適用して、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡを増幅、検出することにより、再活性化したＣＭＶ量を一定温度、一段階操作で、迅速に検出、定量可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、ＣＭＶが感染した細胞から得られた試料に対して、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに存在する特定配列について、特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマー（配列番号６、７又は８で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする）及び特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（配列番号３、４又は５で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。ここで第１または第２のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、（１）１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列又は特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、及び、（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）を行うことによるＣＭＶ由来のｍＲＮＡに存在する特定配列の増幅方法である。
本願請求項２の発明は、インターカレーター性蛍光色素で標識された、配列番号９又は１０に示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド（以下オリゴヌクレオチドプローブという）の存在下で請求項１の増幅が実施され、該オリゴヌクレオチドプローブと前記ＲＮＡ転写産物との相補結合によって複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを利用して反応液の蛍光強度を測定することによる、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡの検出および定量方法である。
【００１３】
本願請求項３の発明は、請求項１の増幅方法において、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡを前記特定配列の５’末端で切断する際に、配列番号１又は２で示されるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする増幅方法である。
本願請求項４の発明は、配列番号６、７又は８で示される、塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含む、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
本願請求項５の発明は、配列番号３、４又は５で示される、塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含む、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
本願請求項６の発明は、配列番号９又は１０で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含む、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
本願請求項７の発明は、配列番号１又は２で示されるいずれかの塩基配列からなる、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
本願請求項８の発明は、請求項４、５、６又は７に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドを含有するＣＭＶの検出および定量キットである。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、ＲＮＡをＲＮＡとして増幅する方法を採用することにより、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡを一定温度、一段階操作で、迅速に検出可能である。特に転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させておけば、特定配列又はそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することができる。モニタリングに用いるプローブは、特定配列又はそれに相補的な配列と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドに、該ヌクレオチドが転写産物と相補結合すると結合していない状態と比較して蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素を結合したものであり、本発明を実施するにおいて前記モニタリングは最も好適な形態である。なお、オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識方法は特に限定はないが、リン原子からリンカーを介して結合する方法が望ましい。結合方法としては先ず、オリゴヌクレオチドの鎖内または末端にアミノ基等の官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素にも必要であればオリゴヌクレオチドへ導入した官能基と反応又は結合可能な官能基を導入し、双方の官能基同士を結合させることが例示できる。より詳細には、特許文献５又はＩｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７に記載されている。
【００１６】
本発明は、一定温度で実施することができるが、その温度は３５℃から５０℃（好ましくは４３℃）と比較的低温である。
【００１７】
本発明の実施に当たっては、まずＣＭＶ由来のｍＲＮＡ中に存在する特定配列を決定する。本発明では、ＣＭＶの潜伏状態では発現せず、再活性化時のみ、大量に発現するＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを標的ｍＲＮＡとした。次に、この標的ｍＲＮＡ内の特定配列に基づいて本発明の実施に使用する第１及び第２プライマー等の配列をデザインする。例えば配列番号３〜８で示される塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、実施例において述べるように、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡの増幅用プライマーとして好適な配列の一例を示したものであり、配列番号９又は１０で示される塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、検出用プローブとして特に好適な配列の一例を示したものである。
【００１８】
ここで試料とは、ｍＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明では、ＣＭＶが感染したヒト細胞を材料として、例えば特開平７−５９５７２号等に記載された方法に基づいて調製した試料を使用し、前記例示したようなｍＲＮＡを直接的な増幅・検出対象とすることで、当該試料の由来元であるヒト細胞中のＣＭＶの検出および定量を行うものである。
【００１９】
以下に本願発明を更に具体的に説明する。試料中に、増幅・検出対象としたＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡが存在した場合には、（１）該ｍＲＮＡ中に存在する特定配列を鋳型として、第１のプライマー（特定配列の３’末端領域に相補的配列）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、（２）次いでリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡが分解されて１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、（３）該１本鎖ＤＮＡに対し第２のプライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同的配列で、その５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記標的ＲＮＡ配列と相同的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、（４）該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素存在下で前記特定配列と相同的な配列からなるＲＮＡ転写産物が生成されるが、このＲＮＡ転写産物は特定配列からなるＲＮＡであるため（１）の反応における鋳型となり、結果として上記（１）から（４）の反応はＲＮＡやＤＮＡを生成する際の酵素基質が使い尽くされるか、又は、上記の各種酵素が失活するまで連鎖的に生じることになる。
【００２０】
上記例は第２プライマーとしてその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたものを用いる例（以下第１形態という）である。本発明では、第１プライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加して使用しても良い（以下第２形態という）。第１形態で本発明を実施する場合には、特定配列の増幅効率を高めてその検出感度を向上させるために、前記（１）の反応に先立って、特定配列を含むＲＮＡを特定配列の５’末端で切断しておくことが好ましい（例えば特許文献４参照）。
【００２１】
ＲＮＡを切断する方法としては、例えば、特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を共存させ、後の反応でも使用されるリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させて切断する方法を例示することができる。該オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。ここで、切断用オリゴヌクレオチドの３’末端は、このオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能しないよう、例えばアミノ化等の処理を施しておくことが好ましい。
【００２２】
ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを検出および定量するためには、上記のようにして増幅された特定配列の存在を検出してその存否を確認し、又は、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定する必要がある。特定配列の検出は、例えば一定時間上記反応を行った反応液に対して、特定配列に対して相補的に結合し得る固定化及び標識化プローブを用いるサンドイッチアッセイ法を適用することもできるが、前述したように、特定配列に特異的に結合する、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することが好ましい。またこのプローブは前記（１）から（４）の反応を阻害しないため、その存在下で上記特定配列の増幅を実施して、特定配列の増幅の様子をモニタリングすることが特に好ましい。なお、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ共存下で特定配列の増幅を行う場合には、そのプローブ部分が伸長反応のプライマーとして機能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸やビオチンを付加する等しておくことが好ましい。そして増幅反応中にこのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが特定配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出機によって測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した増幅反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、その存否を確認し、又は、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定することができる。該オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列としては、配列番号９又は１０に示される配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列であることが好ましい。
【００２３】
以上に記載した本発明の方法は、予め検出キットを用意しておくことにより、極めて簡単に実施することが可能である。検出キットは、好ましくは、第１及び第２のプライマー、（第１形態で本発明を実施するのであれば）切断用プライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、これら酵素の基質等の、特定配列を増幅し検出するために必要な全ての試薬を含むものであるが、これら全ての試薬を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
以上の説明のように、本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４３℃）条件下で、増幅反応から検出までを１段階の操作で、短時間に、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを増幅、検出、定量することができる。
【００２５】
本発明では、試料中の標的ＲＮＡ（ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡ）をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便かつ、短時間に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。
一段階操作で、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドの組合せを提供すること、すなわちＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡの増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー、及び検出用のオリゴヌクレオチドプローブの組合せを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＣＭＶの検出および定量方法ならびに検出および定量キットを医療分野に提供する。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。使用する第１のプライマー、第２のプライマー、切断用プライマーの組合せは表１に示した。そのうち最も増幅効率の高かった表１の９番の組合せを実施例に示した。ただし、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２７】
【表１】
実施例１
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００２８】
配列番号９に記載の配列中の５’末端から４番目の塩基（Ｇ）と５番目の塩基（Ｃ）の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素として公知の色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９）を調製した（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７参照）。
実施例２
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて、β２．７ ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行った。
（１）β２．７ ＲＮＡの調製を行った。
β２．７ ＲＮＡとは、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子の塩基配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ１７４０３の１８４８８９番目〜１８７３５９番目の２４７１塩基）中の２１５４塩基の２本鎖ＤＮＡをクローニング後、鋳型としてインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡである。
β２．７ ＲＮＡ（２１５４ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い１．０×１０６コピー／５μｌ〜３０コピー／５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（ｎｅｇａ）にはＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００２９】
（２）以下の組成の反応液２０．０μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３０】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．０ｍＭ 塩化マグネシウム
１００．０ｍＭ 塩化カリウム
１．０ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各１．０μＭの第１のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８）と第２のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５）。なお、第２オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５’末端には配列番号１１（Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター配列）を付加して使用した。
【００３１】
０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２；β２．７ ＲＮＡを第２のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド。３’末端はアミノ化）
６ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１３．０％ ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
１２．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（実施例１で調製したもの）。
【００３２】
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μｌを添加した。
【００３３】
酵素液の組成（反応時の再終濃度）
２．０％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （タカラバイオ（株）製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定した。
【００３４】
酵素添加時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図１に示した。ＲＮＡサンプル濃度は１．０×１０６コピー／３０μｌから３０コピー／３０μｌである。図１より、β２．７ ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファイルが得られ、未知試料中に存在するＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡ量を検出することが可能であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】初期β２．７ ＲＮＡ量１０６コピー／３０μｌから３０コピー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフである。ｃａｌ３０はβ２．７ ＲＮＡ ３０コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾２はβ２．７ ＲＮＡ １０２コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾３はβ２．７ ＲＮＡ １０３コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾４はβ２．７ ＲＮＡ １０４コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾５はβ２．７ ＲＮＡ １０５コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾６はβ２．７ ＲＮＡ １０６コピー/５μＬである。ｎｅｇａはＲＮＡ試料の代わりにＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定核酸配列を利用したＣＭＶの検出および定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、βヒトヘルペスウイルス科に属する正２０面体ＤＮＡウイルスで日本の成人の９０％が感染している。通常、出産直後に感染するが、不顕性感染が多いので、特に病状は現れない。後天的には、尿、唾液、母乳、精液を感染原とする接触感染と、輸血または臓器移植による医原性感染がある。ＣＭＶは生涯にわたって生体内に潜伏し、宿主の生理的変化によって潜伏感染状態から活性化（再活性化）して回帰発症を繰り返すことが特徴である。悪性腫瘍、ＡＩＤＳ患者、臓器移植患者では、免疫不全状態がＣＭＶ再活性化の起因となり、間質性肺炎、肝炎、網膜炎、脳炎、腎炎が発症することが多い。特に、臓器移植が成功したにも関わらず、その後の間質性肺炎等で命を落とすことは大きな問題となっている。このように、致命的な疾病の原因となるＣＭＶ感染の再活性化の迅速高感度な診断法を確立することは、早期治療のために重要である。
【０００３】
従来、ＣＭＶ感染の診断法としては、患者の生体液からＣＭＶを分離して同定する方法があるが２〜３週間を要し迅速性に欠ける。また、患者血清中の抗ＣＭＶ抗体を検出する血清診断法では、抗体非特異反応が生じる問題や高感度が得にくい、抗体価の変化によりウイルスの消長を捕らえにくい等の欠点がある。
【０００４】
最近、リアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＣＭＶ由来のＤＮＡの検出が可能となっている。これは、ＣＭＶ由来のＤＮＡに特異的なプライマーを用い、ウイルスＤＮＡをＰＣＲにより増幅、検出する方法であり、感度が高いという特徴がある。しかし、ＣＭＶはさまざまな臓器に潜伏感染しているため、ＰＣＲ法でＤＮＡを検出するだけでは、再活性化と潜伏感染の区別がつかない。また、ＣＭＶの再活性化時に発現されるｍＲＮＡを増幅、検出するＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法も考案されているが、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程が必要であり、操作に熟練を要し、検出結果を得るまでに長時間を要する。しかも、微量でもＤＮＡが存在すると、ｍＲＮＡが存在しなくても陽性と判定される危険性がある。
【０００５】
一方、以下の方法が知られている。
ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡに変換した後、反応液を昇降温してＤＮＡを増幅するいわゆるＰＣＲを実施するＲＴ−ＰＣＲ法とは異なり、反応液の昇降温なしにＲＮＡをＲＮＡとして増幅し検出する方法である（例えば特許文献２に記載されたＮＡＳＢＡ法、特許文献３に記載されたＴＭＡ法、特許文献４に記載された増幅・検出法等）。これらの方法では、例えば、その転写によって特定配列のＲＮＡ転写産物を生成する、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成することを含む方法である。
【０００６】
より具体的には、例えば、任意のＲＮＡに存在し、該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る特定配列に対して、（１）その３’端に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、（２）この逆転写によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解し、１本鎖ＤＮＡを生成させ、（３）この１本鎖の３’端に相補的で、それ自身がその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記したプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、（４）この２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させて転写産物（特定配列のＲＮＡ）を生成するのである。ＲＮＡ転写産物は特定配列のＲＮＡであるため、前記（１）の反応における鋳型となり、前記（１）反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（２）以降の反応が進行してＲＮＡ増幅の連鎖反応が引き起こされる。
【０００７】
これら方法の特徴は、ＰＣＲのように反応液を昇降温する必要がなく、またＲＮＡの逆転写とその後の連鎖的増幅反応を分けて実施することがない、という点にある。特許文献１の方法は、特許文献２の方法をＣＭＶ由来のｍＲＮＡの増幅、検出に応用した例である。しかし、この方法は、固相担体に吸着または結合させた捕捉プローブに増幅されたＲＮＡを捕捉させた後、検出用プローブをハイブリダイズさせ、未反応の検出用プローブを分離した後、捕捉プローブ、増幅されたＲＮＡ、検出用プローブの複合体を検出するものであり、迅速性に欠ける。その点において、増幅された特定配列に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（特許文献５に記載）を反応液に共存させ、特定配列又はそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することができる特許文献４に記載の増幅、検出法は一定温度、一段階操作で実施でき、迅速性に優れた定量法である。
【０００８】
しかし、この特許文献４の方法に適したＣＭＶ由来のｍＲＮＡ増幅用のプライマーおよび検出用プローブは知られていない。これは特許文献４の方法が一定温度でｍＲＮＡの増幅、検出を行うために、標的となるｍＲＮＡが高次構造を形成してオリゴヌクレオチドの結合を阻害するため、増幅、検出効率が悪くなると考えられているからである。よって一定温度においても結合効率が低下せず、ｍＲＮＡの増幅および検出を行い得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
【０００９】
【特許文献１】特開平９−２８９９００
【００１０】
【特許文献２】特許第２６５０１５９号
【特許文献３】特許第３２４１７１７号
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号
【特許文献５】特願２０００−１５４４３１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明の目的は、ＣＭＶが感染した細胞から得られた試料に対し、特許文献４のような方法を適用して、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡを増幅、検出することにより、再活性化したＣＭＶ量を一定温度、一段階操作で、迅速に検出、定量可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、ＣＭＶが感染した細胞から得られた試料に対して、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに存在する特定配列について、特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマー（配列番号６、７又は８で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする）及び特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（配列番号３、４又は５で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。ここで第１または第２のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、（１）１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列又は特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、及び、（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）を行うことによるＣＭＶ由来のｍＲＮＡに存在する特定配列の増幅方法である。
本願請求項２の発明は、インターカレーター性蛍光色素で標識された、配列番号９又は１０に示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド（以下オリゴヌクレオチドプローブという）の存在下で請求項１の増幅が実施され、該オリゴヌクレオチドプローブと前記ＲＮＡ転写産物との相補結合によって複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを利用して反応液の蛍光強度を測定することによる、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡの検出および定量方法である。
【００１３】
本願請求項３の発明は、請求項１の増幅方法において、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡを前記特定配列の５’末端で切断する際に、配列番号１又は２で示されるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする増幅方法である。
本願請求項４の発明は、配列番号６、７又は８で示される、塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含む、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
本願請求項５の発明は、配列番号３、４又は５で示される、塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含む、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
本願請求項６の発明は、配列番号９又は１０で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含む、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
本願請求項７の発明は、配列番号１又は２で示されるいずれかの塩基配列からなる、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
本願請求項８の発明は、請求項４、５、６又は７に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドを含有するＣＭＶの検出および定量キットである。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、ＲＮＡをＲＮＡとして増幅する方法を採用することにより、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡを一定温度、一段階操作で、迅速に検出可能である。特に転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させておけば、特定配列又はそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することができる。モニタリングに用いるプローブは、特定配列又はそれに相補的な配列と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドに、該ヌクレオチドが転写産物と相補結合すると結合していない状態と比較して蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素を結合したものであり、本発明を実施するにおいて前記モニタリングは最も好適な形態である。なお、オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識方法は特に限定はないが、リン原子からリンカーを介して結合する方法が望ましい。結合方法としては先ず、オリゴヌクレオチドの鎖内または末端にアミノ基等の官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素にも必要であればオリゴヌクレオチドへ導入した官能基と反応又は結合可能な官能基を導入し、双方の官能基同士を結合させることが例示できる。より詳細には、特許文献５又はＩｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７に記載されている。
【００１６】
本発明は、一定温度で実施することができるが、その温度は３５℃から５０℃（好ましくは４３℃）と比較的低温である。
【００１７】
本発明の実施に当たっては、まずＣＭＶ由来のｍＲＮＡ中に存在する特定配列を決定する。本発明では、ＣＭＶの潜伏状態では発現せず、再活性化時のみ、大量に発現するＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを標的ｍＲＮＡとした。次に、この標的ｍＲＮＡ内の特定配列に基づいて本発明の実施に使用する第１及び第２プライマー等の配列をデザインする。例えば配列番号３〜８で示される塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、実施例において述べるように、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡの増幅用プライマーとして好適な配列の一例を示したものであり、配列番号９又は１０で示される塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、検出用プローブとして特に好適な配列の一例を示したものである。
【００１８】
ここで試料とは、ｍＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明では、ＣＭＶが感染したヒト細胞を材料として、例えば特開平７−５９５７２号等に記載された方法に基づいて調製した試料を使用し、前記例示したようなｍＲＮＡを直接的な増幅・検出対象とすることで、当該試料の由来元であるヒト細胞中のＣＭＶの検出および定量を行うものである。
【００１９】
以下に本願発明を更に具体的に説明する。試料中に、増幅・検出対象としたＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡが存在した場合には、（１）該ｍＲＮＡ中に存在する特定配列を鋳型として、第１のプライマー（特定配列の３’末端領域に相補的配列）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、（２）次いでリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡが分解されて１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、（３）該１本鎖ＤＮＡに対し第２のプライマー（標的ＲＮＡの５’末端領域に相同的配列で、その５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により前記標的ＲＮＡ配列と相同的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、（４）該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素存在下で前記特定配列と相同的な配列からなるＲＮＡ転写産物が生成されるが、このＲＮＡ転写産物は特定配列からなるＲＮＡであるため（１）の反応における鋳型となり、結果として上記（１）から（４）の反応はＲＮＡやＤＮＡを生成する際の酵素基質が使い尽くされるか、又は、上記の各種酵素が失活するまで連鎖的に生じることになる。
【００２０】
上記例は第２プライマーとしてその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたものを用いる例（以下第１形態という）である。本発明では、第１プライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加して使用しても良い（以下第２形態という）。第１形態で本発明を実施する場合には、特定配列の増幅効率を高めてその検出感度を向上させるために、前記（１）の反応に先立って、特定配列を含むＲＮＡを特定配列の５’末端で切断しておくことが好ましい（例えば特許文献４参照）。
【００２１】
ＲＮＡを切断する方法としては、例えば、特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を共存させ、後の反応でも使用されるリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させて切断する方法を例示することができる。該オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２に示す配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。ここで、切断用オリゴヌクレオチドの３’末端は、このオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能しないよう、例えばアミノ化等の処理を施しておくことが好ましい。
【００２２】
ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを検出および定量するためには、上記のようにして増幅された特定配列の存在を検出してその存否を確認し、又は、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定する必要がある。特定配列の検出は、例えば一定時間上記反応を行った反応液に対して、特定配列に対して相補的に結合し得る固定化及び標識化プローブを用いるサンドイッチアッセイ法を適用することもできるが、前述したように、特定配列に特異的に結合する、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することが好ましい。またこのプローブは前記（１）から（４）の反応を阻害しないため、その存在下で上記特定配列の増幅を実施して、特定配列の増幅の様子をモニタリングすることが特に好ましい。なお、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ共存下で特定配列の増幅を行う場合には、そのプローブ部分が伸長反応のプライマーとして機能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸やビオチンを付加する等しておくことが好ましい。そして増幅反応中にこのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが特定配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出機によって測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した増幅反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、その存否を確認し、又は、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定することができる。該オリゴヌクレオチドプローブの塩基配列としては、配列番号９又は１０に示される配列中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列であることが好ましい。
【００２３】
以上に記載した本発明の方法は、予め検出キットを用意しておくことにより、極めて簡単に実施することが可能である。検出キットは、好ましくは、第１及び第２のプライマー、（第１形態で本発明を実施するのであれば）切断用プライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、これら酵素の基質等の、特定配列を増幅し検出するために必要な全ての試薬を含むものであるが、これら全ての試薬を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
以上の説明のように、本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは４３℃）条件下で、増幅反応から検出までを１段階の操作で、短時間に、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを増幅、検出、定量することができる。
【００２５】
本発明では、試料中の標的ＲＮＡ（ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡ）をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便かつ、短時間に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。
一段階操作で、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドの組合せを提供すること、すなわちＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡの増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー、及び検出用のオリゴヌクレオチドプローブの組合せを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＣＭＶの検出および定量方法ならびに検出および定量キットを医療分野に提供する。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。使用する第１のプライマー、第２のプライマー、切断用プライマーの組合せは表１に示した。そのうち最も増幅効率の高かった表１の９番の組合せを実施例に示した。ただし、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２７】
【表１】
実施例１
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００２８】
配列番号９に記載の配列中の５’末端から４番目の塩基（Ｇ）と５番目の塩基（Ｃ）の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素として公知の色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９）を調製した（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７参照）。
実施例２
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて、β２．７ ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行った。
（１）β２．７ ＲＮＡの調製を行った。
β２．７ ＲＮＡとは、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子の塩基配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ１７４０３の１８４８８９番目〜１８７３５９番目の２４７１塩基）中の２１５４塩基の２本鎖ＤＮＡをクローニング後、鋳型としてインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡである。
β２．７ ＲＮＡ（２１５４ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ ＤＴＴ）を用い１．０×１０６コピー／５μｌ〜３０コピー／５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（ｎｅｇａ）にはＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００２９】
（２）以下の組成の反応液２０．０μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３０】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．０ｍＭ 塩化マグネシウム
１００．０ｍＭ 塩化カリウム
１．０ｍＭ ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ ＧＴＰ
３．６ｍＭ ＩＴＰ
各１．０μＭの第１のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８）と第２のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５）。なお、第２オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５’末端には配列番号１１（Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター配列）を付加して使用した。
【００３１】
０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２；β２．７ ＲＮＡを第２のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド。３’末端はアミノ化）
６ユニット リボヌクレアーゼ インヒビター（タカラバイオ社製）
１３．０％ ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
１２．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（実施例１で調製したもの）。
【００３２】
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μｌを添加した。
【００３３】
酵素液の組成（反応時の再終濃度）
２．０％ ソルビトール
６．４ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （タカラバイオ（株）製）
１４２ユニット Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ （ＧＩＢＣＯ製）
３．６μｇ 牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定した。
【００３４】
酵素添加時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図１に示した。ＲＮＡサンプル濃度は１．０×１０６コピー／３０μｌから３０コピー／３０μｌである。図１より、β２．７ ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファイルが得られ、未知試料中に存在するＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡ量を検出することが可能であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】初期β２．７ ＲＮＡ量１０６コピー／３０μｌから３０コピー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフである。ｃａｌ３０はβ２．７ ＲＮＡ ３０コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾２はβ２．７ ＲＮＡ １０２コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾３はβ２．７ ＲＮＡ １０３コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾４はβ２．７ ＲＮＡ １０４コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾５はβ２．７ ＲＮＡ １０５コピー/５μＬ、ｃａｌ１０＾６はβ２．７ ＲＮＡ １０６コピー/５μＬである。ｎｅｇａはＲＮＡ試料の代わりにＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、以降ＣＭＶと略す）に由来するｍＲＮＡ内の特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマー及び特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（ここで第１又は第２のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、（１）１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列又は特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、及び、（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）を行い、前期試料中のＣＭＶを増幅する方法において、前記ｍＲＮＡがＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡであり、前記第１のプライマーが配列番号６、７又は８で示されるいずれかの塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２のプライマーが配列番号３、４又は５で示されるいずれかの塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである、ＣＭＶに由来するｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項２】
インターカレーター性蛍光色素で標識された、配列番号９又は１０に示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド（以下オリゴヌクレオチドプローブという）の存在下で請求項１の増幅が実施され、該オリゴヌクレオチドプローブと前記ＲＮＡ転写産物との相補結合によって複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを利用して反応液の蛍光強度を測定することによる、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡの検出および定量方法。
【請求項３】
請求項１のｍＲＮＡの増幅方法において、第２のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡの前記特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの存在下で実施され、該オリゴヌクレオチドが配列番号１又は２に示されるいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１の増幅方法。
【請求項４】
配列番号６、７又は８で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号３、４又は５で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号９又は１０に示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上からなることを特徴とする、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１又は２に示される、いずれかの塩基配列からなることを特徴とするＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項４、５、６又は７に示される、いずれかのオリゴヌクレオチドを含有するＣＭＶの検出および定量キット。
【請求項１】
試料中のサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、以降ＣＭＶと略す）に由来するｍＲＮＡ内の特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマー及び特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（ここで第１又は第２のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、（１）１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列又は特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、及び、（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）を行い、前期試料中のＣＭＶを増幅する方法において、前記ｍＲＮＡがＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡであり、前記第１のプライマーが配列番号６、７又は８で示されるいずれかの塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２のプライマーが配列番号３、４又は５で示されるいずれかの塩基配列又はその相補鎖中の、少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである、ＣＭＶに由来するｍＲＮＡの増幅方法。
【請求項２】
インターカレーター性蛍光色素で標識された、配列番号９又は１０に示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド（以下オリゴヌクレオチドプローブという）の存在下で請求項１の増幅が実施され、該オリゴヌクレオチドプローブと前記ＲＮＡ転写産物との相補結合によって複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを利用して反応液の蛍光強度を測定することによる、ＣＭＶ由来のｍＲＮＡの検出および定量方法。
【請求項３】
請求項１のｍＲＮＡの増幅方法において、第２のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡの前記特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの存在下で実施され、該オリゴヌクレオチドが配列番号１又は２に示されるいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１の増幅方法。
【請求項４】
配列番号６、７又は８で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号３、４又は５で示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号９又は１０に示される、いずれかの塩基配列又はその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上からなることを特徴とする、ＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１又は２に示される、いずれかの塩基配列からなることを特徴とするＣＭＶ由来のβ２．７遺伝子のｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項４、５、６又は７に示される、いずれかのオリゴヌクレオチドを含有するＣＭＶの検出および定量キット。
【図１】
【公開番号】特開２００６−１４６３２（Ｐ２００６−１４６３２Ａ）
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１９４３６７（Ｐ２００４−１９４３６７）
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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