サバイビン由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチド
【課題】癌の免疫療法に使用しうる癌ワクチン及び抗癌剤を提供する。
【解決手段】以下に示されるアミノ酸配列：Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trpを含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチドを提供する。また、特定のアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基に置換され、及び／又は上記配列に示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチドを提供する。
【解決手段】以下に示されるアミノ酸配列：Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trpを含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチドを提供する。また、特定のアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基に置換され、及び／又は上記配列に示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチドを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬという）を誘導することができるペプチドに関する。
また本発明は、前記ペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤に関する。
更に本発明は、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するための前記ペプチドの使用、得られたＣＴＬ及び前記ＣＴＬを含む抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における免疫学と分子生物学の進歩は、腫瘍免疫の進歩に多大の影響を与えている。ヒトでインフルエンザウイルス感染が起きた場合に、その感染に対して免疫が成立して感染症から離脱するという事象は以下の細胞性免疫により説明することができる。インフルエンザウイルスに感染した上皮細胞は、その細胞表面にある主要組織適合抗原複合体ＨＬＡ分子上にウイルスゲノム由来の９〜１０のポリペプチドを提示する。このＨＬＡ−ウイルスペプチド複合体を提示する感染細胞は強烈なアロジェニック反応を惹起し、感染細胞は末梢血中に存在するＣＤ８陽性ＣＴＬにより特異的に認識され、積極的に排除される。この細胞性免疫のメカニズムは自己の細胞が腫瘍化して生じた癌細胞に対しても同様に働くと理解される。このことは、ベルギーのThierry Boonらによる悪性黒色腫からの腫瘍抗原ＭＡＧＥ遺伝子の単離により証明された（例えば、非特許文献１参照）。
Ｔ細胞が認識する癌抗原の同定方法としては、Ｔ細胞を用いてヒト癌由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法が既に開発されており、この方法を用いて前記のＭＡＧＥ遺伝子が単離された。それ以後、悪性黒色腫を初めとした癌細胞表面上のクラスＩ分子に提示されてＴ細胞に認識される癌由来癌抗原ペプチドが複数同定され、これらのいくつかを用いた臨床治験が開始されており、既に一定の成果が得られている。例えば、癌患者の血清中に存在する抗体により認識される分子として食道癌より同定されたＮＹ−ＥＳＯ−１分子は、その合成ペプチドがＣＴＬの誘導能を有することが認識されている（例えば、非特許文献２及び３参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Van der Bruggenら、Science, 254, 1643-1647 (1991)
【非特許文献２】Chen, YT.ら，Proc. Natl. Acad. USA, 94, 1914-1918 (1997)
【非特許文献３】Jager, E.ら，J. Exp. Med., 187, 265-270(1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、臨床的に癌の大部分を占める大腸癌、胃癌、乳癌、肺癌、膀胱癌等の上皮癌では癌抗原がほとんど同定されておらず、癌抗原を標的とした免疫療法は確立されていない。そこで本発明は、癌の免疫療法に使用しうる癌ワクチン及び抗癌剤を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、免疫学的なヒト癌拒絶が主にＣＴＬ、特にＣＤ８（＋）ＣＴＬにより担われていることに着目した。ＣＤ８（＋）ＣＴＬは癌細胞上の主要組織適合抗原複合体（ヒトではＨＬＡ）と当該ＨＬＡ上に提示された癌抗原ペプチドとからなる複合体を認識して活性化する。そして、活性化されたＣＴＬはその細胞表面上のＴ細胞抗原レセプターを介して癌細胞を認識し、これを攻撃する。したがって、癌抗原ペプチドが同定されれば、これを癌ワクチン及び抗癌剤として使用し、ＣＴＬを効率的に誘導して、癌を予防及び治療することができる。
サバイビン（Survivin）はアポトーシスインヒビター（ＩＡＰ）ファミリーに属するタンパク質であり、強い抗アポトーシス能を有する。サバイビンは肺癌、膀胱癌等の多くの癌で発現するが、正常組織での発現は胎児組織と成人胸腺、精巣等に限られていることが報告されている（Ambrosini, G.ら，Nat. Med., 3, 917-921 (1997)）。
本発明者等は、種々のサバイビン由来のペプチドについて癌抗原性、すなわちＣＴＬ誘導能について鋭意検討を重ね、ＣＴＬを誘導することができる特定のペプチドを見出している（特開２００２−２８４７９７）。本発明者等がさらに検討を重ねたところ、サバイビン遺伝子によりコードされる１４２個からなるアミノ酸配列内にもＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフが存在し、このなかの特定のペプチドがＣＴＬを誘導することができることを見いだした。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基に置換され、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド；
（３）前記（１）又は（２）のペプチドを含む癌ワクチン；
（４）前記（１）又は（２）のペプチドを含む抗癌剤；
（５）癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための前記（１）又は（２）のペプチド使用；
（６）前記（１）又は（２）のペプチドにより誘導された細胞傷害性Ｔ細胞及び、
（７）前記（６）の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のペプチドは、本発明のペプチドを提示していると考えられるＨＬＡ−Ａ２４陽性サバイビン陽性の癌細胞を傷害するＣＴＬを誘導することができる。ＨＬＡ−Ａ２４の発現率は高く、欧米人では２０〜３０％、日本人では５０％以上が陽性である。したがって、本発明の癌抗原ペプチドは世界中で、さまざまな種類のサバイビン陽性の悪性腫瘍に対して有用な癌ワクチン及び抗癌剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のペプチドは、以下の配列：
Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp（配列番号１）
で示されるアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチドである。
前記本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する活性を保持する範囲内で、適宜改変されていてもよい。ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数及び位置は、癌抗原ペプチドとしての活性を有する限り任意であるが、通常、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合するペプチドの長さが８〜１１アミノ酸であることから、１個から数個の範囲が好ましい。
当該置換に係るアミノ酸残基の改変においては、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に対する結合モチーフ構造を有するペプチドにおける第２位及び／又はＣ末端のアミノ酸残基の置換が好ましい。
このような本発明の置換に係るペプチドの具体的な態様としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２位及び／又はＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが挙げられる。
前記置換においては、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の結合モチーフ構造を保持するアミノ酸残基への置換が好ましい。すなわち本発明の置換に係るペプチドの好ましい態様としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基に置換され、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが挙げられる。
【０００８】
本発明のペプチドの同定は、以下の工程：
（１）ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩであるＨＬＡ−Ａ２４の
結合モチーフに対応する配列を有するサバイビン由来ペプチドを提供する工程、
（２）前記のペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４を発現する抗原提示細胞に添加しＨＬＡ−Ａ２４により前記ペプチドを提示している抗原提示細胞を得る工程、
（３）前記抗原提示細胞でＴ細胞を刺激してＣＴＬを誘導する工程、及び、
（４）誘導されたＣＴＬの癌細胞傷害能を測定する工程、
を含む方法により行うことができる。
本発明のペプチドはアミノ酸数が１０と小さいので、一般的なアミノ酸の化学合成法、例えばＦｍｏｃ法により合成することができる。市販のアミノ酸合成装置を使用して合成することもできる。また、本発明のペプチドはサバイビンに由来するので、癌患者の癌細胞から文献（Suzuki, K.ら，J. Immunol., 163, 2783-2791 (1999)）に記載の方法に従いサバイビンを単離して、該当するペプチドを得ることもできる。
【０００９】
本発明のペプチドを使用して癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導することができる。誘導されたＣＴＬは癌細胞を認識して、これを攻撃する。したがって、本発明のペプチドは癌ワクチン及び抗癌剤として使用することができる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤を適用しうる癌は、本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している癌細胞からなる癌、例えば上皮癌である。上皮癌としては、肺癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、乳癌等が挙げられる。また、サバイビンを発現している非上皮癌、例えば腎細胞癌、肝細胞癌、悪性リンパ腫、骨肉腫、滑膜肉腫等が挙げられる。
本発明のペプチドを癌ワクチン及び抗癌剤として使用する場合、本発明のペプチドは、それ自身で又は補助剤と共に使用することができ、更に医薬的に許容しうる担体を適宜含有させることができる。
補助剤としては、免疫応答の強化を目的とするアジュバント、例えばフロイドの不完全（完全）アジュバント、アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
医薬的に許容しうる担体としては、例えばＰＢＳ、蒸留水等の希釈剤、生理食塩水等が挙げられる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、当該技術分野において周知の方法により、液剤、油剤、エマルジョン、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、固形剤等の形態にすることができる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、その使用形態に応じて経口、非経口又は経皮投与することができる。例えば、静注投与、筋注投与、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。本発明のペプチドの投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたり最大で５〜１０ｍｇである。例えば、成人癌患者に皮下注射により使用する場合、１週間あたり０．１〜１０ｍｇであり、好ましくは１００〜１０００μｇである。
【００１０】
また、本発明のペプチドを、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するために使用することができる。誘導は、例えば文献（Nabeta, Y.ら，Jpn. J. Cancer Res, 91, 616-621 (2000)）に記載の方法に従い行うことができる。
具体的には以下の工程：
ＨＬＡ−Ａ２４を発現している細胞を提供する工程、
前記細胞に本発明のペプチドを添加して、ＨＬＡ−Ａ２４上に提示させる工程、
前記ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している細胞でＴ細胞を刺激し、前記Ｔ細胞を癌細胞標的ＣＴＬへ誘導する工程、
を含む方法を使用することができる。
ＨＬＡ−Ａ２４を発現する細胞は癌患者から採取したものでもよいが、非ＨＬＡ−Ａ２４発現細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４をコードする遺伝子を導入して作成してもよい。
得られたＣＴＬは癌細胞を標的とするので、これを抗癌剤として使用することができる。この場合、前記の本発明のペプチドを含む抗癌剤と同様に、適宜医薬的に許容しうる担体を含み、かつ種々の形態をとることができる。
本発明のＣＴＬを含む抗癌剤は、本発明のペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤と同様に非経口投与することができる。
本発明のＣＴＬの投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたり最大で５×１０9個である。例えば、成人癌患者に静脈内注射により使用する場合、１週間あたり１×１０7個〜５×１０9個であり、好ましくは１×１０8個〜１×１０9個である。
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１１】
実施例1 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドの製造
以下のアミノ酸配列：
Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp（配列番号１）
を有するペプチドを合成した。ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキジカルボニル（Ｆｍｏｃ）戦略に基づいて固相同時多重ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８（島津製作所）を使用して合成し、次いでＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Millipore）により精製した。ペプチドの純度及び同一性は、それぞれ分析用ＨＰＬＣ及び質量分析により測定した。ペプチドを、ジメチルスルホキシド中に濃度１．５ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【００１２】
実施例２ 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドのＨＬＡ−Ａ２４結合性
Ｔ２−Ａ２４細胞はヒトリンパ芽球様細胞Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入して発現させた細胞株である。この細胞の細胞表面には低レベルのＨＬＡ−Ａ２４分子が発現しており、ＨＬＡ−Ａ２４特異的単クローン抗体とFlow cytometerを用いて検出することができる。発現レベルは、mean fluorescence intensity（ＭＦＩ）として定量化される。この細胞に試験管内で合成ペプチドを添加すると、添加したペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子と結合する場合、結合親和性と相関して細胞表面ＨＬＡ−Ａ２４発現レベルが増加する。この実験系を用いて、実施例１で製造した本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチド（サバイビンＣペプチド）のＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を解析した。
Ｔ２−Ａ２４細胞にサバイビンＣペプチドまたはＨＬＡ−Ａ２４と結合することが既に証明されている３種類のペプチド（サイトメガロウイルスＣＭＶ−ｐｐ６５由来ペプチド、エイズウイルスＨＩＶ−ｅｎｖ由来ペプチド、サバイビン２Ｂペプチド）、ＨＬＡ−Ａ２４とは結合しないペプチド（ＶＳＶウイルス由来ＶＳＶ８ペプチド）の各ペプチドを終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。その直後の細胞表面ＨＬＡ−Ａ２４発現レベルを単クローン抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体とで染色し、Flow cytometer (FACScan, Becton Dickinson)で解析した。発現レベルはＭＦＩ値によって定量化し、
（ＭＦＩ shift）＝（ペプチド添加後のＭＦＩ値）−（ペプチド添加前のＭＦＩ値）
として、発現変化の程度を定量化した。
図１に示すように、本発明のサバイビンＣペプチドは、ＨＩＶ−ｅｎｖペプチドにほぼ匹敵する程度の結合親和性を有している。
【００１３】
実施例３ 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドを用いたＣＴＬのin vitro誘導
ヒトの末梢血とフィコール・コンレイ密度勾配中で遠心分離して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を集め、次いで接着細胞と非接着細胞とに分離した。接着細胞をＡＩＭ−Ｖ（Gibco Co.）中、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Novartis Pharma ceuticals）及び１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（小野薬品）と共にインキュベートした。この細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。非接着細胞をＡＩＭ−Ｖ中、３０〜１００ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−２（味の素）と共にインキュベートした。５〜６日目に、本発明のペプチド（終濃度３０μｇ／ｍｌ）をＡＰＣに添加し、放射線を照射した後、このＡＰＣと自家非接着細胞から分離したＣＤ８陽性細胞とを、ＩＬ−２（武田薬品工業）を終濃度５０〜１００ＩＵ／ｍｌで添加したＡＩＭ−Ｖ培養液中で共培養した。１４日目以後はＴ細胞マイトジェンであるＰＨＡで刺激した自家ＰＨＡブラスト（ＰＨＡ刺激Ｔ細胞）に本発明のペプチド（終濃度３０μｇ／ｍｌ）を添加し、放射線を照射した細胞をＡＰＣとして用い、７日毎にＣＤ８陽性細胞を刺激した。刺激毎に、培養に５０〜１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培地を追加した。２８日目（４回刺激後）のＣＴＬを以下の活性試験に使用した。
【００１４】
実施例４ 本発明のペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害性
（１）試験方法
ＣＴＬの細胞傷害能を51Ｃｒ細胞傷害試験により評価した。ＣＴＬの標的細胞を１００μＣｉのクロム酸ナトリウム（51Ｃｒ）を用いて３７℃で２時間標識し、洗浄し、再懸濁した。試験ペプチドが提示された標識標的細胞は、前記の標的細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を51Ｃｒで標識し、３０μｇ／ｍｌの試験ペプチドと室温で２時間インキュベートすることにより得た。エフェクター細胞（ＣＴＬ）をＶ字底マイクロタイタープレートCostar3894（Corning Incorporated）の各ウェルに入れ、ここに前記標識標的細胞を濃度５×１０3細胞／ウェルで添加し、容量０．２ｍｌとした。６時間のインキュベート後、０．１ｍｌの上清を集め、自動化ガンマカウンター（LKB Wallac）により51Ｃｒの放出を測定した。測定は３重に行い標準偏差を計算した。特異的細胞傷害能の百分率は、特異的51Ｃｒ放出の百分率を下記の式：
［（実験値）−（自発的放出値）／（最大放出値）−（自発的放出値）］×１００
を用いて計算することにより決定した。自発的放出値は、標的細胞をエフェクター細胞の非存在下で単独インキュベートしたときの放出値より得た。最大放出値は界面活性剤である１０％Nonidet-P40（ナカライケミカルCo.）と共にインキュベートしたときの最大放出量により得た。
【００１５】
（２）ＣＴＬのペプチド特異的細胞傷害性
１名のＨＬＡ−Ａ２４陽性の乳癌患者Ａの末梢血を用いて、実施例３と同様の方法により本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導した。
ＣＴＬの標的細胞として、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を持っていないＴ２細胞株（ＡＴＣＣより入手）にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入し、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面に発現させたＴ２−Ａ２４細胞と、同じくＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を持っていないＣ１Ｒ細胞株（ＡＴＣＣより入手）にＨＬＡ−Ａ３１０１遺伝子を導入したＣ１Ｒ−Ａ３１細胞、ＨＬＡを全く発現していないＫ５６２細胞を用いた。前記（１）の試験法にしたがい、各標的細胞に試験ペプチドを添加して標的細胞上にペプチドを提示させ、これを試験に使用した。試験ペプチドには、本発明のサバイビンＣペプチドの他に、ＨＬＡ−Ａ２４によって提示される滑膜肉腫抗原ＳＹＴ−ＳＳＸペプチドを用いた。
ＣＴＬの51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を図２−Ａに示す。縦軸は標的細胞の融解の百分率を、横軸は図に示した各標的細胞におけるＥ／Ｔ比（エフェクター細胞（ＣＴＬ）／標的細胞）を示す。本発明のペプチド（サバイビンＣ）により誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４を発現しているＴ２−Ａ２４細胞にサバイビンＣペプチドを添加した標的細胞（Ａ２４＋ＳＵＶｗｉｌｄ）のみを傷害し、ペプチドを何も添加しない細胞（Ｔ２Ａ２４， Ｃ１ＲＡ３１）、ＳＹＴ−ＳＳＸペプチドを添加した細胞（Ｔ２Ａ２４＋ＳＹＴ）、ＨＬＡ−Ａ２４を発現していないＣ１Ｒ−Ａ３１細胞にサバイビンＣペプチドを添加した細胞（Ａ３１＋ＳＵＶｗｉｌｄ）、ＨＬＡを発現していないＫ５６２細胞はほとんど傷害しなかった。
これらの結果は、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビンＣペプチドを細胞表面に有する細胞を特異的に認識し、高い細胞傷害活性を発揮することを示している。
【００１６】
（３）本発明のペプチドで誘導されたＣＴＬの癌細胞傷害性
前記（２）の乳癌患者Ａの末梢血から本発明のペプチドによって誘導されたＣＴＬについて、さまざまなヒト癌細胞を標的として細胞傷害性を試験した。標的細胞として用いた４種類の癌細胞株はいずれもサバイビン蛋白を発現している癌細胞株であるが、ＨＭＣ２細胞とＨＭＣ１細胞は細胞表面にＨＬＡ−Ａ２４を発現している癌細胞株で、ＭＣＦ７細胞とＫ５６２細胞はＨＬＡ−Ａ２４陰性の癌細胞株である。51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を図２−Ｂに示す。試験は１種の標的細胞につき、３つのＥ／Ｔ比（１０、３及び１）で行った。本発明のペプチドで誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌細胞株だけを傷害した。
次に前記（２）とは別のＨＬＡ−Ａ２４陽性の口腔癌患者Ｂの末梢血を用いて、実施例３と同様の方法により本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導した。このＣＴＬについて、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌細胞とＨＬＡ−Ａ２４陰性の癌細胞とを標的として細胞傷害性を試験した。標的細胞として用いた３種類の癌細胞株はいずれもサバイビン蛋白を発現している癌細胞株である。ＯＳＣ２０細胞はＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を持っていない口腔扁平上皮癌細胞株で、ＯＳＣ２０Ａ２４細胞はＯＳＣ２０細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入して発現させた細胞株である。51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を図３に示す。試験は１種の標的細胞につき、３つのＥ／Ｔ比（３０、１０及び３）の条件で行った。本発明のペプチドで誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌細胞株だけを傷害した。
これらの実験より、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、細胞外からサバイビンＣペプチドを添加した細胞だけでなく、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつ細胞内でサバイビンを発現している癌細胞を特異的に認識し、高い細胞傷害性を発揮することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のサバイビンＣペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との結合性を試験した結果を表すグラフである。
【図２】本発明のサバイビンＣペプチドを用いて誘導した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）についての標的細胞傷害試験の結果を示すグラフである。図Ａと図Ｂとは、同じ癌患者から誘導されたＣＴＬを用いて試験された。
【図３】本発明のサバイビンＣペプチドを用いて図２とは別の癌患者末梢血から誘導した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）についての標的細胞傷害試験の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬという）を誘導することができるペプチドに関する。
また本発明は、前記ペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤に関する。
更に本発明は、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するための前記ペプチドの使用、得られたＣＴＬ及び前記ＣＴＬを含む抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年における免疫学と分子生物学の進歩は、腫瘍免疫の進歩に多大の影響を与えている。ヒトでインフルエンザウイルス感染が起きた場合に、その感染に対して免疫が成立して感染症から離脱するという事象は以下の細胞性免疫により説明することができる。インフルエンザウイルスに感染した上皮細胞は、その細胞表面にある主要組織適合抗原複合体ＨＬＡ分子上にウイルスゲノム由来の９〜１０のポリペプチドを提示する。このＨＬＡ−ウイルスペプチド複合体を提示する感染細胞は強烈なアロジェニック反応を惹起し、感染細胞は末梢血中に存在するＣＤ８陽性ＣＴＬにより特異的に認識され、積極的に排除される。この細胞性免疫のメカニズムは自己の細胞が腫瘍化して生じた癌細胞に対しても同様に働くと理解される。このことは、ベルギーのThierry Boonらによる悪性黒色腫からの腫瘍抗原ＭＡＧＥ遺伝子の単離により証明された（例えば、非特許文献１参照）。
Ｔ細胞が認識する癌抗原の同定方法としては、Ｔ細胞を用いてヒト癌由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法が既に開発されており、この方法を用いて前記のＭＡＧＥ遺伝子が単離された。それ以後、悪性黒色腫を初めとした癌細胞表面上のクラスＩ分子に提示されてＴ細胞に認識される癌由来癌抗原ペプチドが複数同定され、これらのいくつかを用いた臨床治験が開始されており、既に一定の成果が得られている。例えば、癌患者の血清中に存在する抗体により認識される分子として食道癌より同定されたＮＹ−ＥＳＯ−１分子は、その合成ペプチドがＣＴＬの誘導能を有することが認識されている（例えば、非特許文献２及び３参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Van der Bruggenら、Science, 254, 1643-1647 (1991)
【非特許文献２】Chen, YT.ら，Proc. Natl. Acad. USA, 94, 1914-1918 (1997)
【非特許文献３】Jager, E.ら，J. Exp. Med., 187, 265-270(1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、臨床的に癌の大部分を占める大腸癌、胃癌、乳癌、肺癌、膀胱癌等の上皮癌では癌抗原がほとんど同定されておらず、癌抗原を標的とした免疫療法は確立されていない。そこで本発明は、癌の免疫療法に使用しうる癌ワクチン及び抗癌剤を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、免疫学的なヒト癌拒絶が主にＣＴＬ、特にＣＤ８（＋）ＣＴＬにより担われていることに着目した。ＣＤ８（＋）ＣＴＬは癌細胞上の主要組織適合抗原複合体（ヒトではＨＬＡ）と当該ＨＬＡ上に提示された癌抗原ペプチドとからなる複合体を認識して活性化する。そして、活性化されたＣＴＬはその細胞表面上のＴ細胞抗原レセプターを介して癌細胞を認識し、これを攻撃する。したがって、癌抗原ペプチドが同定されれば、これを癌ワクチン及び抗癌剤として使用し、ＣＴＬを効率的に誘導して、癌を予防及び治療することができる。
サバイビン（Survivin）はアポトーシスインヒビター（ＩＡＰ）ファミリーに属するタンパク質であり、強い抗アポトーシス能を有する。サバイビンは肺癌、膀胱癌等の多くの癌で発現するが、正常組織での発現は胎児組織と成人胸腺、精巣等に限られていることが報告されている（Ambrosini, G.ら，Nat. Med., 3, 917-921 (1997)）。
本発明者等は、種々のサバイビン由来のペプチドについて癌抗原性、すなわちＣＴＬ誘導能について鋭意検討を重ね、ＣＴＬを誘導することができる特定のペプチドを見出している（特開２００２−２８４７９７）。本発明者等がさらに検討を重ねたところ、サバイビン遺伝子によりコードされる１４２個からなるアミノ酸配列内にもＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフが存在し、このなかの特定のペプチドがＣＴＬを誘導することができることを見いだした。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基に置換され、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド；
（３）前記（１）又は（２）のペプチドを含む癌ワクチン；
（４）前記（１）又は（２）のペプチドを含む抗癌剤；
（５）癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための前記（１）又は（２）のペプチド使用；
（６）前記（１）又は（２）のペプチドにより誘導された細胞傷害性Ｔ細胞及び、
（７）前記（６）の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のペプチドは、本発明のペプチドを提示していると考えられるＨＬＡ−Ａ２４陽性サバイビン陽性の癌細胞を傷害するＣＴＬを誘導することができる。ＨＬＡ−Ａ２４の発現率は高く、欧米人では２０〜３０％、日本人では５０％以上が陽性である。したがって、本発明の癌抗原ペプチドは世界中で、さまざまな種類のサバイビン陽性の悪性腫瘍に対して有用な癌ワクチン及び抗癌剤として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のペプチドは、以下の配列：
Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp（配列番号１）
で示されるアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチドである。
前記本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する活性を保持する範囲内で、適宜改変されていてもよい。ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び／又は付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数及び位置は、癌抗原ペプチドとしての活性を有する限り任意であるが、通常、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合するペプチドの長さが８〜１１アミノ酸であることから、１個から数個の範囲が好ましい。
当該置換に係るアミノ酸残基の改変においては、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に対する結合モチーフ構造を有するペプチドにおける第２位及び／又はＣ末端のアミノ酸残基の置換が好ましい。
このような本発明の置換に係るペプチドの具体的な態様としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２位及び／又はＣ末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが挙げられる。
前記置換においては、ＨＬＡ−Ａ２４抗原の結合モチーフ構造を保持するアミノ酸残基への置換が好ましい。すなわち本発明の置換に係るペプチドの好ましい態様としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基に置換され、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチドが挙げられる。
【０００８】
本発明のペプチドの同定は、以下の工程：
（１）ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩであるＨＬＡ−Ａ２４の
結合モチーフに対応する配列を有するサバイビン由来ペプチドを提供する工程、
（２）前記のペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４を発現する抗原提示細胞に添加しＨＬＡ−Ａ２４により前記ペプチドを提示している抗原提示細胞を得る工程、
（３）前記抗原提示細胞でＴ細胞を刺激してＣＴＬを誘導する工程、及び、
（４）誘導されたＣＴＬの癌細胞傷害能を測定する工程、
を含む方法により行うことができる。
本発明のペプチドはアミノ酸数が１０と小さいので、一般的なアミノ酸の化学合成法、例えばＦｍｏｃ法により合成することができる。市販のアミノ酸合成装置を使用して合成することもできる。また、本発明のペプチドはサバイビンに由来するので、癌患者の癌細胞から文献（Suzuki, K.ら，J. Immunol., 163, 2783-2791 (1999)）に記載の方法に従いサバイビンを単離して、該当するペプチドを得ることもできる。
【０００９】
本発明のペプチドを使用して癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導することができる。誘導されたＣＴＬは癌細胞を認識して、これを攻撃する。したがって、本発明のペプチドは癌ワクチン及び抗癌剤として使用することができる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤を適用しうる癌は、本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している癌細胞からなる癌、例えば上皮癌である。上皮癌としては、肺癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、乳癌等が挙げられる。また、サバイビンを発現している非上皮癌、例えば腎細胞癌、肝細胞癌、悪性リンパ腫、骨肉腫、滑膜肉腫等が挙げられる。
本発明のペプチドを癌ワクチン及び抗癌剤として使用する場合、本発明のペプチドは、それ自身で又は補助剤と共に使用することができ、更に医薬的に許容しうる担体を適宜含有させることができる。
補助剤としては、免疫応答の強化を目的とするアジュバント、例えばフロイドの不完全（完全）アジュバント、アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
医薬的に許容しうる担体としては、例えばＰＢＳ、蒸留水等の希釈剤、生理食塩水等が挙げられる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、当該技術分野において周知の方法により、液剤、油剤、エマルジョン、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、固形剤等の形態にすることができる。
本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、その使用形態に応じて経口、非経口又は経皮投与することができる。例えば、静注投与、筋注投与、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。本発明のペプチドの投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたり最大で５〜１０ｍｇである。例えば、成人癌患者に皮下注射により使用する場合、１週間あたり０．１〜１０ｍｇであり、好ましくは１００〜１０００μｇである。
【００１０】
また、本発明のペプチドを、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するために使用することができる。誘導は、例えば文献（Nabeta, Y.ら，Jpn. J. Cancer Res, 91, 616-621 (2000)）に記載の方法に従い行うことができる。
具体的には以下の工程：
ＨＬＡ−Ａ２４を発現している細胞を提供する工程、
前記細胞に本発明のペプチドを添加して、ＨＬＡ−Ａ２４上に提示させる工程、
前記ペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している細胞でＴ細胞を刺激し、前記Ｔ細胞を癌細胞標的ＣＴＬへ誘導する工程、
を含む方法を使用することができる。
ＨＬＡ−Ａ２４を発現する細胞は癌患者から採取したものでもよいが、非ＨＬＡ−Ａ２４発現細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４をコードする遺伝子を導入して作成してもよい。
得られたＣＴＬは癌細胞を標的とするので、これを抗癌剤として使用することができる。この場合、前記の本発明のペプチドを含む抗癌剤と同様に、適宜医薬的に許容しうる担体を含み、かつ種々の形態をとることができる。
本発明のＣＴＬを含む抗癌剤は、本発明のペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤と同様に非経口投与することができる。
本発明のＣＴＬの投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたり最大で５×１０9個である。例えば、成人癌患者に静脈内注射により使用する場合、１週間あたり１×１０7個〜５×１０9個であり、好ましくは１×１０8個〜１×１０9個である。
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１１】
実施例1 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドの製造
以下のアミノ酸配列：
Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp（配列番号１）
を有するペプチドを合成した。ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキジカルボニル（Ｆｍｏｃ）戦略に基づいて固相同時多重ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８（島津製作所）を使用して合成し、次いでＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Millipore）により精製した。ペプチドの純度及び同一性は、それぞれ分析用ＨＰＬＣ及び質量分析により測定した。ペプチドを、ジメチルスルホキシド中に濃度１．５ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【００１２】
実施例２ 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドのＨＬＡ−Ａ２４結合性
Ｔ２−Ａ２４細胞はヒトリンパ芽球様細胞Ｔ２細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入して発現させた細胞株である。この細胞の細胞表面には低レベルのＨＬＡ−Ａ２４分子が発現しており、ＨＬＡ−Ａ２４特異的単クローン抗体とFlow cytometerを用いて検出することができる。発現レベルは、mean fluorescence intensity（ＭＦＩ）として定量化される。この細胞に試験管内で合成ペプチドを添加すると、添加したペプチドがＨＬＡ−Ａ２４分子と結合する場合、結合親和性と相関して細胞表面ＨＬＡ−Ａ２４発現レベルが増加する。この実験系を用いて、実施例１で製造した本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチド（サバイビンＣペプチド）のＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を解析した。
Ｔ２−Ａ２４細胞にサバイビンＣペプチドまたはＨＬＡ−Ａ２４と結合することが既に証明されている３種類のペプチド（サイトメガロウイルスＣＭＶ−ｐｐ６５由来ペプチド、エイズウイルスＨＩＶ−ｅｎｖ由来ペプチド、サバイビン２Ｂペプチド）、ＨＬＡ−Ａ２４とは結合しないペプチド（ＶＳＶウイルス由来ＶＳＶ８ペプチド）の各ペプチドを終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した。その直後の細胞表面ＨＬＡ−Ａ２４発現レベルを単クローン抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体とで染色し、Flow cytometer (FACScan, Becton Dickinson)で解析した。発現レベルはＭＦＩ値によって定量化し、
（ＭＦＩ shift）＝（ペプチド添加後のＭＦＩ値）−（ペプチド添加前のＭＦＩ値）
として、発現変化の程度を定量化した。
図１に示すように、本発明のサバイビンＣペプチドは、ＨＩＶ−ｅｎｖペプチドにほぼ匹敵する程度の結合親和性を有している。
【００１３】
実施例３ 本発明のサバイビン由来癌抗原ペプチドを用いたＣＴＬのin vitro誘導
ヒトの末梢血とフィコール・コンレイ密度勾配中で遠心分離して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を集め、次いで接着細胞と非接着細胞とに分離した。接着細胞をＡＩＭ−Ｖ（Gibco Co.）中、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Novartis Pharma ceuticals）及び１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４（小野薬品）と共にインキュベートした。この細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。非接着細胞をＡＩＭ−Ｖ中、３０〜１００ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−２（味の素）と共にインキュベートした。５〜６日目に、本発明のペプチド（終濃度３０μｇ／ｍｌ）をＡＰＣに添加し、放射線を照射した後、このＡＰＣと自家非接着細胞から分離したＣＤ８陽性細胞とを、ＩＬ−２（武田薬品工業）を終濃度５０〜１００ＩＵ／ｍｌで添加したＡＩＭ−Ｖ培養液中で共培養した。１４日目以後はＴ細胞マイトジェンであるＰＨＡで刺激した自家ＰＨＡブラスト（ＰＨＡ刺激Ｔ細胞）に本発明のペプチド（終濃度３０μｇ／ｍｌ）を添加し、放射線を照射した細胞をＡＰＣとして用い、７日毎にＣＤ８陽性細胞を刺激した。刺激毎に、培養に５０〜１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培地を追加した。２８日目（４回刺激後）のＣＴＬを以下の活性試験に使用した。
【００１４】
実施例４ 本発明のペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害性
（１）試験方法
ＣＴＬの細胞傷害能を51Ｃｒ細胞傷害試験により評価した。ＣＴＬの標的細胞を１００μＣｉのクロム酸ナトリウム（51Ｃｒ）を用いて３７℃で２時間標識し、洗浄し、再懸濁した。試験ペプチドが提示された標識標的細胞は、前記の標的細胞（５×１０5細胞／ｍｌ）を51Ｃｒで標識し、３０μｇ／ｍｌの試験ペプチドと室温で２時間インキュベートすることにより得た。エフェクター細胞（ＣＴＬ）をＶ字底マイクロタイタープレートCostar3894（Corning Incorporated）の各ウェルに入れ、ここに前記標識標的細胞を濃度５×１０3細胞／ウェルで添加し、容量０．２ｍｌとした。６時間のインキュベート後、０．１ｍｌの上清を集め、自動化ガンマカウンター（LKB Wallac）により51Ｃｒの放出を測定した。測定は３重に行い標準偏差を計算した。特異的細胞傷害能の百分率は、特異的51Ｃｒ放出の百分率を下記の式：
［（実験値）−（自発的放出値）／（最大放出値）−（自発的放出値）］×１００
を用いて計算することにより決定した。自発的放出値は、標的細胞をエフェクター細胞の非存在下で単独インキュベートしたときの放出値より得た。最大放出値は界面活性剤である１０％Nonidet-P40（ナカライケミカルCo.）と共にインキュベートしたときの最大放出量により得た。
【００１５】
（２）ＣＴＬのペプチド特異的細胞傷害性
１名のＨＬＡ−Ａ２４陽性の乳癌患者Ａの末梢血を用いて、実施例３と同様の方法により本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導した。
ＣＴＬの標的細胞として、ＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を持っていないＴ２細胞株（ＡＴＣＣより入手）にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入し、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面に発現させたＴ２−Ａ２４細胞と、同じくＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を持っていないＣ１Ｒ細胞株（ＡＴＣＣより入手）にＨＬＡ−Ａ３１０１遺伝子を導入したＣ１Ｒ−Ａ３１細胞、ＨＬＡを全く発現していないＫ５６２細胞を用いた。前記（１）の試験法にしたがい、各標的細胞に試験ペプチドを添加して標的細胞上にペプチドを提示させ、これを試験に使用した。試験ペプチドには、本発明のサバイビンＣペプチドの他に、ＨＬＡ−Ａ２４によって提示される滑膜肉腫抗原ＳＹＴ−ＳＳＸペプチドを用いた。
ＣＴＬの51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を図２−Ａに示す。縦軸は標的細胞の融解の百分率を、横軸は図に示した各標的細胞におけるＥ／Ｔ比（エフェクター細胞（ＣＴＬ）／標的細胞）を示す。本発明のペプチド（サバイビンＣ）により誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４を発現しているＴ２−Ａ２４細胞にサバイビンＣペプチドを添加した標的細胞（Ａ２４＋ＳＵＶｗｉｌｄ）のみを傷害し、ペプチドを何も添加しない細胞（Ｔ２Ａ２４， Ｃ１ＲＡ３１）、ＳＹＴ−ＳＳＸペプチドを添加した細胞（Ｔ２Ａ２４＋ＳＹＴ）、ＨＬＡ−Ａ２４を発現していないＣ１Ｒ−Ａ３１細胞にサバイビンＣペプチドを添加した細胞（Ａ３１＋ＳＵＶｗｉｌｄ）、ＨＬＡを発現していないＫ５６２細胞はほとんど傷害しなかった。
これらの結果は、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビンＣペプチドを細胞表面に有する細胞を特異的に認識し、高い細胞傷害活性を発揮することを示している。
【００１６】
（３）本発明のペプチドで誘導されたＣＴＬの癌細胞傷害性
前記（２）の乳癌患者Ａの末梢血から本発明のペプチドによって誘導されたＣＴＬについて、さまざまなヒト癌細胞を標的として細胞傷害性を試験した。標的細胞として用いた４種類の癌細胞株はいずれもサバイビン蛋白を発現している癌細胞株であるが、ＨＭＣ２細胞とＨＭＣ１細胞は細胞表面にＨＬＡ−Ａ２４を発現している癌細胞株で、ＭＣＦ７細胞とＫ５６２細胞はＨＬＡ−Ａ２４陰性の癌細胞株である。51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を図２−Ｂに示す。試験は１種の標的細胞につき、３つのＥ／Ｔ比（１０、３及び１）で行った。本発明のペプチドで誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌細胞株だけを傷害した。
次に前記（２）とは別のＨＬＡ−Ａ２４陽性の口腔癌患者Ｂの末梢血を用いて、実施例３と同様の方法により本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導した。このＣＴＬについて、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌細胞とＨＬＡ−Ａ２４陰性の癌細胞とを標的として細胞傷害性を試験した。標的細胞として用いた３種類の癌細胞株はいずれもサバイビン蛋白を発現している癌細胞株である。ＯＳＣ２０細胞はＨＬＡ−Ａ２４遺伝子を持っていない口腔扁平上皮癌細胞株で、ＯＳＣ２０Ａ２４細胞はＯＳＣ２０細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子を導入して発現させた細胞株である。51Ｃｒ細胞傷害試験の結果を図３に示す。試験は１種の標的細胞につき、３つのＥ／Ｔ比（３０、１０及び３）の条件で行った。本発明のペプチドで誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌細胞株だけを傷害した。
これらの実験より、本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、細胞外からサバイビンＣペプチドを添加した細胞だけでなく、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつ細胞内でサバイビンを発現している癌細胞を特異的に認識し、高い細胞傷害性を発揮することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のサバイビンＣペプチドとＨＬＡ−Ａ２４分子との結合性を試験した結果を表すグラフである。
【図２】本発明のサバイビンＣペプチドを用いて誘導した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）についての標的細胞傷害試験の結果を示すグラフである。図Ａと図Ｂとは、同じ癌患者から誘導されたＣＴＬを用いて試験された。
【図３】本発明のサバイビンＣペプチドを用いて図２とは別の癌患者末梢血から誘導した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）についての標的細胞傷害試験の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基に置換され、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドを含む癌ワクチン。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のペプチドを含む抗癌剤。
【請求項５】
癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための請求項１又は２に記載のペプチド使用。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のペプチドにより誘導された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤。
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の第２位がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン及びトリプトファンから選択されるアミノ酸残基に置換され、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン及びメチオニンから選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドを含む癌ワクチン。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のペプチドを含む抗癌剤。
【請求項５】
癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための請求項１又は２に記載のペプチド使用。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のペプチドにより誘導された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−８６３８（Ｐ２００６−８６３８Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１９１４７８（Ｐ２００４−１９１４７８）
【出願日】平成１６年６月２９日（２００４．６．２９）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２９日（２００４．６．２９）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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