本発明は、プライミングされた１本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡおよび６０℃のインキュベーション温度を用いてＤＮＡ複製アッセイにおいて同一条件下で測定した場合、ＤＮＡポリメラーゼが＞３５塩基／秒であるインビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）プライマー伸長速度を有しおよびアミノ酸配列の配列番号：２または４を含むＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長速度より速い、好熱性ポリメラーゼに関する。本発明はまた、該ポリメラーゼを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明は、本発明に記載のポリメラーゼを含む核酸複製キットに関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサーマス・エガートソニイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）に由来する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、それを製造および単離する方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
好熱性細菌（ここでは「好熱菌」という）は高温で増殖する能力がある。２５〜４０℃の範囲の温度で最も良く増殖する中温菌、または１５〜２０℃で最も良く増殖する好冷性細菌とは違って、好熱菌は５０℃を上回る温度で最も良く増殖する。実際、一部の好熱菌は６５〜７５℃で最も良く増殖する一方、超好熱菌は最高１３０℃の温度で最も良く増殖する（非特許文献１，参照により本開示に含まれる）。
【０００３】
好熱菌は好気性または嫌気性である可能性があり、および、光合成細菌（たとえば、紅色細菌、緑色細菌、および藍藻）、真正細菌（たとえば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、デスルホトマキュラム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、乳酸菌、放線菌、スピロヘータ、およびその他多数の属）、および古細菌（たとえば、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、およびメタン生成菌）を含む幅広い属および種でみられる。したがって、好熱菌が通常見られる環境には大きな幅があるが、これらの範囲のすべてが高温を伴う。
【０００４】
好熱菌は、他の細菌と同様に、ポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶという５種類のＤＮＡポリメラーゼを含む。好熱菌生息地の性質を考えると、これらの酵素は典型的には熱安定性を示し、および一般に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる。ＤＮＡポリメラーゼＩ（「Ｐｏｌ Ｉ」）は最も量の多いポリメラーゼであり、および一般的に、ＤＮＡ複製中に岡崎フラグメントの結合を可能にする修復様反応を含む、ある種のＤＮＡ修復を担う。Ｐｏｌ ＩはＵＶ照射および放射線類似薬によって誘導されるＤＮＡ損傷の修復に必須である。ＤＮＡポリメラーゼＩＩは、ＳＯＳ応答を誘導するＤＮＡ損傷の修復に関与すると考えられている。Ｐｏｌ ＩおよびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの両方を欠く変異体では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩはＵＶに誘導される傷害を修復する。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩは多サブユニットレプリカーゼである。
【０００５】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、分子生物学のいくつかの用途で非常に有用であることがわかっている。そのような用途の一つが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲ法については、たとえば、参照により本開示に含まれる米国特許第４，６８３，１９５号明細書および第４，６８３，２０２号明細書に記載される。ＰＣＲ反応では、標的ＤＮＡの熱変性、反応混合物の冷却と共にテンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーション、およびテンプレート配列と相補的な伸長産物を生じるプライマー伸長の基本的な段階のために、プライマー、テンプレート、およびヌクレオシド三リン酸が適当な緩衝液中でＤＮＡポリメラーゼと混合される。熱変性は反復され、プライマーは反応混合物の冷却と共に伸長産物とアニーリングし、および以前に生じた伸長産物が次のプライマー伸長反応のためのテンプレートとなる。このサイクルが数回反復され、結果として目的核酸配列の指数的増幅が生じる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、酵素活性の損失無しでの反復加熱／冷却サイクルを与える。
【０００６】
いくつかの用途、たとえばロングレンジＰＣＲは、現在利用可能なＰｏｌ Ｉタンパク質（たとえば、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ）のエラー率によって妨げられる。エラー率の低下に加えて、改善した配列識別活性、プライマーミスマッチ許容、および増加した熱安定性を示すＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの使用からいくつかの用途が利益を受ける。たとえば、プライマーミスマッチを許容するＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは縮重プライマーの使用を含むＰＣＲ法に有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Black, Microbiology Principles and Applications, 2d edition, Prentice Hall, New Jersey, 145-146, 1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、真正細菌Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）（Ｔｅｇ）からの新規のＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの単離および特徴づけに一部由来する。ここで開示される通り、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは先行技術のＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ タンパク質と比較して顕著に優れた特徴を有する。
【０００９】
一態様では、本発明は、機能性Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ断片、およびＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの変異体を含む、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を提供する。提供されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質はまた、Ｐｏｌ Ｉ融合タンパク質およびＰｏｌ Ｉキメラタンパク質を含む。さまざまな株のＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）に由来する完全長Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのアミノ酸配列が例示される。コドン最適化されたＴ．エガートソニイが提供される。
【００１０】
一実施形態では、本発明は配列番号：６、１７、１８、１９、２０、２１、２２および２３から成る群から選択されるアミノ酸配列との、９５％より大、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。
【００１１】
コドン最適化されたＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）が提供される（アミノ酸配列の配列番号４４）。
【００１２】
好ましい一実施形態では、本発明は配列番号６のアミノ酸配列との９５％より大、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。また、コドン最適化されたＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）のキメラが提供される（アミノ酸配列の配列番号４４）。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、配列番号：６、１７、１８、１９、２０、２１、２２および２３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。一実施形態では、コドン最適化された形が好ましい（配列番号４４）。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。コドン最適化されたＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）が提供される（アミノ酸配列の配列番号４４）。
【００１５】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質は、いくつかの非常に望ましい特徴を有する。たとえば、一実施形態では、本発明は、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。一実施形態では、本発明は、ＴａｑＤＮＡＰｏｌ Ｉよりも高い忠実度を有するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。一実施形態では、本発明は、ＴａｑＤＮＡＰｏｌ Ｉよりもミスマッチプライマーを効率的に伸長する能力があるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。
【００１６】
好ましい一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、５’−３’エキソヌクレアーゼドメイン、内部３’−５’−エキソヌクレアーゼドメイン（固有のヌクレアーゼ活性の無い構造ドメイン）およびポリメラーゼドメインを含む。一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインはさらに、配列番号：６の残基４３４〜４４８、５５６〜６１５、７５１〜８３０で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むパームサブドメインを含む。
【００１７】
好ましい一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインはさらに、配列番号：４４の残基４３８−４５２、５６０−６１９、７５５−８３４で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むパームサブドメインを含む。
【００１８】
特に好ましい一実施形態では、パームサブドメインは配列番号：６の残基４３４−４４８、５５６−６１５、７５１−８３０で示されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
特に好ましい一実施形態では、パームサブドメインは配列番号：４４の残基４３８−４５２、５６０−６１９、７５５−８３４で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインは、配列番号：６の残基４４９−５５５で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むサムサブドメインを含む。
【００２１】
好ましい一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインは、配列番号：４４の残基４５３−５５９で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むサムサブドメインを含む。
【００２２】
特に好ましい一実施形態では、サムサブドメインは配列番号：６の残基４４９−５５５で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
特に好ましい一実施形態では、サムサブドメインは配列番号：４４の残基４５３−５５９で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインは、配列番号：６の残基６１６−７５０で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むフィンガーサブドメインを含む。
【００２５】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインは、配列番号：４４の残基６２０−７５４で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含むフィンガーサブドメインを含む。
【００２６】
特に好ましい一実施形態では、フィンガーサブドメインは配列番号：６の残基６１６−７５０で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
特に好ましい一実施形態では、フィンガーサブドメインは配列番号：４４の残基６２０−７５４で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質はまた、完全長Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質の機能性断片を含む。一実施形態では、本発明は、完全長Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの機能性断片を含むＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは本質的に完全長Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの機能性断片から成る。好ましい一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：６および好ましくは配列番号４４から成る群から選択されるアミノ酸配列の断片を含む。
【００２９】
好ましい一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：６の残基１−２８８で示されるアミノ酸配列の５’−３’エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：６の残基２９６−４３３で示されるアミノ酸配列の３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、および配列番号：６の残基２８９−８３０で示されるアミノ酸配列のポリメラーゼドメインを含む。一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは本質的に、５’−３’エキソヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインから成る。
【００３０】
好ましい一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：４４の残基５−２９２で示されるアミノ酸配列の５'−３'エキソヌクレアーゼドメイン、配列番号：４４の残基３００−４３７で示されるアミノ酸配列の３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン、および配列番号：４４の残基２９３−８３４で示されるアミノ酸配列のポリメラーゼドメインを含む。一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは本質的に、５’−３’エキソヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインから成る。
【００３１】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインはパームサブドメインを含む。好ましい一実施形態では、パームサブドメインは、配列番号：６の残基４３４−４４８、５５６−６１５および７５１−８３０で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に好ましい一実施形態では、パームサブドメインは、配列番号：６の残基４３４−４４８、５５６−６１５および７５１−８３０で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインはパームサブドメインを含む。好ましい一実施形態では、パームサブドメインは、配列番号：４４の残基４３８−４５２、５６０−６１９および７５５−８３４で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に好ましい一実施形態では、パームサブドメインは、配列番号：４４の残基４３８−４５２、５６０−６１９および７５５−８３４で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインはサムサブドメインを含む。好ましい一実施形態では、サム領域は、配列番号：６の残基４４９−６５０で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に好ましい一実施形態では、サムサブドメインは、配列番号：６の残基４４９−６５０で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインはサムサブドメインを含む。好ましい一実施形態では、サム領域は、配列番号：４４の残基４５３−６５４で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に好ましい一実施形態では、サムサブドメインは、配列番号：４４の残基４５３−６５４で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインはフィンガーサブドメインを含む。好ましい一実施形態では、フィンガーサブドメインは、配列番号：６の残基６１６−７５０で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に好ましい一実施形態では、フィンガーサブドメインは、配列番号：６の残基６１６−７５０で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３６】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのポリメラーゼドメインはフィンガーサブドメインを含む。好ましい一実施形態では、フィンガーサブドメインは、配列番号：４４の残基６２０−７５４で示されるアミノ酸配列との少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む。特に好ましい一実施形態では、フィンガーサブドメインは、配列番号：４４の残基６２０−７５４で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３７】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：６の残基１−２８８で示されるアミノ酸配列を含むＮ末端５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインを本質的に欠く切断ＤＮＡＰｏｌ Ｉであり、該ＤＮＡＰｏｌ Ｉは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。エキソヌクレアーゼ活性を欠く該切断変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは本質的に、配列番号：６の残基２８９から８３０で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３８】
一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：４４の残基５−２９２で示されるアミノ酸配列を含むＮ末端５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインを本質的に欠く切断ＤＮＡＰｏｌ Ｉであり、該ＤＮＡＰｏｌ Ｉは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。エキソヌクレアーゼ活性を欠く該切断変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは本質的に、配列番号：４４の残基２９３から８３４で示されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
一実施形態では、変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは、配列番号：６の６７９位に、グルタミン酸残基をリジンまたはアルギニンといった正に荷電したアミノ酸で置き換える置換を有するアミノ酸配列を含む。ＤＮＡ基質に結合したＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩの三次元構造の分析は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ配列（配列番号：２）における対応する位置（６８１）のグルタミン酸の負電荷が、ＤＮＡ基質におけるプライミング鎖の負に荷電したリン酸骨格と接触することを示している。その接触は静電反発作用を生じ、ポリメラーゼの伸長速度および処理能力を制限する。その位置にグルタミン酸の代わりにリジンを有する変異体は、より速い伸長速度およびより高い処理能力を示している。これらの性質を有する変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは、迅速ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、長い標的配列の増幅といったさまざまな用途に望ましい。
【００４０】
一実施形態では、変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは、配列番号：４４の６８３位に、グルタミン酸残基をリジンまたはアルギニンといった正に荷電したアミノ酸で置き換える置換を有するアミノ酸配列を含む。ＤＮＡ基質に結合したＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩの三次元構造の分析は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ配列（配列番号：２）における対応する位置（６８１）のグルタミン酸の負電荷が、ＤＮＡ基質におけるプライミング鎖の負に荷電したリン酸骨格と接触することを示している。その接触は静電反発作用を生じ、ポリメラーゼの伸長速度および処理能力を制限する。その位置にグルタミン酸の代わりにリジンを有する変異体は、より速い伸長速度およびより高い処理能力を示している。これらの性質を有する変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは、迅速ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、長い標的配列の増幅といったさまざまな用途に望ましい。
【００４１】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質はまた、望ましい性質を有する、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質の変異体を含む。Ｐｏｌ Ｉ変異体には、完全長Ｐｏｌ Ｉ変異体の機能性断片が含まれる。
【００４２】
一実施形態では、変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは、配列番号：６の６１２−６１３位に単一または複合置換を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは、配列番号：４４の６１６−６１７位に単一または複合置換を有するアミノ酸配列を含む。Ｔａｑおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩについて実施されたランダム変異誘発実験は、それらの配列中の対応する位置のアミノ酸残基が、重合基質としてのｒＮＴＰとｄＮＴＰとの間の識別を制御することを示している。それらはまた、ＲＮＡまたはＤＮＡでプライミングされたＤＮＡテンプレート、プライマーの３'末端に塩基ミスマッチを有するテンプレートおよび完全にアニーリングしたプライマーの間、ならびに標識および非標識ｄＮＴＰ基質の間の識別を制御する。これらの位置の置換の性質に基づいて、さまざまな用途のための有用な性質を持ついくつかの変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉが提供されうる。ミスマッチプライマーの伸長に対して識別が向上した変異体は、対立遺伝子特異的ＰＣＲに有用である。標識ｄｄＮＴＰ基質に対する親和性が向上した変異体は、蛍光ＤＮＡ配列決定およびリアルタイムＰＣＲに有用である。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の低下した変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。好ましい一実施形態では、配列番号：６の４３位に対応するＴｅｇＰｏｌ Ｉ変異体のグリシン残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸のどちらかに変異している。別の好ましい一実施形態では、配列番号：４４の４７位に対応するＴｅｇＰｏｌ Ｉ変異体のグリシン残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸のどちらかに変異している。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、配列番号：６の８３０位のＣ末端グリシン残基がグルタミン酸残基で置換されている変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：４４の８３４位のＣ末端グリシン残基がグルタミン酸残基で置換されている変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。Ｃ末端グルタミン酸残基を有する他のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩの三次元構造は、その残基のベータカルボキシル基が、決定的に重要なマグネシウムイオンをポリメラーゼ活性部位に安定化および配位するのに関与していることを示す。その追加のカルボキシル基を提供することは、変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩが連続的ＤＮＡ合成を実施できる有効なマグネシウム濃度を低下させる。マグネシウム濃度の上昇はＤＮＡ増幅ＰＣＲの特異性に負の影響を有するため、より低いマグネシウム濃度で働く能力は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に決定的に重要である。
【００４５】
本発明の別の一実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの変異体は、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩファミリーのＤＮＡポリメラーゼ中の１残基がデオキシおよびジデオキシリボヌクレオチドの間の識別に決定的に重要であるという知識に基づく（テーバー（Ｔａｂｅｒ），Ｓ．，リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ），Ｃ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，Ｊｕｌｙ ３，９２ （１４）： ６３３９−４３，大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩファミリーのＤＮＡポリメラーゼおよび単一残基がデオキシおよびジデオキシリボヌクレオチドの間の識別に決定的に重要である（A single residue and DNA polymerase of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyriboncleotides））。好ましい一実施形態では、Ｐｏｌ Ｉ変異体は、配列番号：６の６６５位に対応する位置の野生型フェニルアラニンの代わりに置換残基を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、置換残基はチロシンである。好ましい一実施形態では、Ｐｏｌ Ｉ変異体は、配列番号：４４の６６９位に対応する位置の野生型フェニルアラニンの代わりに置換残基を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、置換残基はチロシンである。
【００４６】
一実施形態では、変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：６に示されるアミノ酸配列のＮ末端に４個の追加のアミノ酸残基Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ／ＬｙｓおよびＧｌｙを有する。一実施形態では、変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：４４に示されるアミノ酸配列のＮ末端に４個の追加のアミノ酸残基Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ／ＬｙｓおよびＧｌｙを有する。ＤＮＡ基質に結合したＴａｑＤＮＡポリメラーゼの解読された三次元構造に基づき、これらの３個の追加のＮ末端残基は、Ｎ末端ヌクレアーゼドメイン中のＤＮＡ結合部位の一部である。追加のＮ末端アミノ酸の非存在下では、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼはそのＤＮＡ基質に対して弱まった結合親和性および強度を有する。強化されたＤＮＡ基質結合性を有するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ変異体は、配列番号：６に示される野生型配列を有するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉよりも良好な処理能力およびより速い伸長速度を有する。改善された処理能力およびより速い伸長速度は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用途を実施するのに用いられる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの重要な機能的性質である。それらは、より高い感度でより長い標的配列の増幅を可能にし、試料中の必要とするＤＮＡテンプレートを少なくする。この一実施形態における変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの２位の追加のプロリン残基は、先行技術でよく確立されている、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＮ末端アミノ酸残基を安定化する規則に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の内因性細胞質プロテイナーゼによるＮ末端分解に対して組み換えポリメラーゼを安定化する。
【００４７】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質はまた、非Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質部分と融合されたＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を含む、ＤＮＡＰｏｌ Ｉ融合タンパク質を含む。一実施形態では、ＤＮＡＰｏｌ Ｉ融合タンパク質は、本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質のエキソヌクレアーゼドメインを含む。一実施形態では、ＤＮＡＰｏｌ Ｉ融合タンパク質は、本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質のポリメラーゼドメインを含む。本発明のＤＮＡＰｏｌ Ｉ融合タンパク質は、たとえば、精製に備える部分、またはＤＮＡＰｏｌ Ｉ融合タンパク質のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質と比較して変化した熱安定性または変化した触媒活性に寄与する部分を含みうる。
【００４８】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質はまた、別のポリメラーゼの一つ以上のドメインと融合したＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を含む、ＤＮＡＰｏｌ Ｉキメラタンパク質を含む。
【００４９】
一態様では本発明は、本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸は、本発明のＤＮＡＰｏｌ Ｉ融合タンパク質およびＤＮＡＰｏｌ Ｉキメラタンパク質をコードする核酸を含む。好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：５から成る群から選択されるヌクレオチド配列との少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、非常に好ましくは少なくとも約９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列との少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、非常に好ましくは少なくとも約９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。
【００５０】
特に好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：５から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。特に好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。
【００５１】
またここで提供されるのは、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸の複製および発現のためのベクターである。一実施形態では、本発明は、細胞におけるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質の発現のためのＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ発現ベクターを提供する。
【００５２】
またここで提供されるのは、宿主細胞を本発明のベクターで形質転換するための方法、およびそのように形質転換された宿主細胞である。宿主細胞は原核および真核細胞を含む。好ましい一実施形態では、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞である。
【００５３】
一態様では、本発明は、本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを製造および／または単離するための方法を提供する。一実施形態では、方法は天然に存在するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを真正細菌Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）から精製することを含む。別の一実施形態では、方法はＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを組み換え法により製造することおよびＰｏｌ Ｉを単離することを含む。好ましい一実施形態では、方法は細菌をＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ発現ベクターで形質転換することおよびＰｏｌ Ｉタンパク質を形質転換された細菌から単離することを含む。
【００５４】
一態様では、本発明は、核酸増幅のための組成物および方法を提供する。組成物は、本発明の一つ以上のＴｅｇＰｏｌ Ｉタンパク質を含む。方法は、本発明のＴｅｇＰｏｌ Ｉタンパク質を含む増幅反応混合物中でＤＮＡ分子を増幅反応に供することを含む。
【００５５】
好ましい一実施形態では、増幅方法に使用される核酸分子はＤＮＡである。好ましい一実施形態では、ＤＮＡ分子は２本鎖である。別の実施形態では、ＤＮＡ分子は１本鎖である。好ましい一実施形態では、２本鎖ＤＮＡ分子は直鎖ＤＮＡ分子である。別の実施形態では、ＤＮＡ分子は非直鎖、たとえば環状またはスーパーコイルＤＮＡである。
【００５６】
好ましい一実施形態では、増幅方法は、好ましくはＤＮＡであり好ましくは２本鎖である核酸分子を温度サイクルモードによって増幅するのに有用な、熱サイクル増幅法である。好ましい一実施形態では、方法は核酸分子を熱サイクル増幅反応混合物中で熱サイクル増幅反応に供することを含む。熱サイクル増幅反応混合物は、本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を含む。
【００５７】
好ましい一実施形態では、増幅方法はＰＣＲ法である。一実施形態では、方法は縮重ＰＣＲ法である。一実施形態では、方法はリアルタイムＰＣＲ法である。
【００５８】
一実施形態では、本発明は、核酸増幅用の、本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を含む反応混合物を提供する。本発明の好ましい反応混合物はＤＮＡ増幅に有用である。好ましい一実施形態では、反応混合物は熱サイクル増幅反応に有用な熱サイクル反応混合物である。増幅反応混合物は、たとえばｄＮＴＰ、プライマー、緩衝液、および／または安定剤のような、しかしそれらに限定されない、追加の試薬を含みうる。
【００５９】
一実施形態では、本発明は、ヌクレオチド多型を含む相同配列標的の増幅に有用である、ＰＣＲで縮重プライマーを用いて核酸を増幅するための反応混合物を提供する。反応混合物は本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を含む。縮重プライマーを用いるＰＣＲのための反応混合物は、たとえばｄＮＴＰ、縮重プライマー、緩衝液、および／または安定剤といった、しかしそれらに限定されない、追加の試薬を含みうる。
【００６０】
好ましい一実施形態では、反応混合物は本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を含み、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは反応混合物中に、１２０ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは１４０ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは１６０ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは１８０ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは２００ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは４００ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは６００ｐｇ／μＬ以上の濃度で存在する。
【００６１】
好ましい一実施形態では、反応混合物は双性イオン緩衝液を含む。好ましい一実施形態では、双性イオン緩衝液は約ｐＨ７．５−８．９の間のｐＨを有する。好ましい一実施形態では、緩衝液は、有機双性イオン酸および有機双性イオン塩基、カリウムイオン、およびマグネシウムイオンの組み合わせを含む。
【００６２】
特に好ましい一実施形態では、反応混合物は３０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、５９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、リアルタイム産物検出を伴うＰＣＲ反応に有用である、核酸を増幅するための反応混合物を提供する。リアルタイム反応混合物は本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含む。リアルタイムＰＣＲ反応混合物は、ｄＮＴＰ、蛍光プローブ、プライマー、緩衝液、安定剤、核酸結合色素および／または受動参照色素を含むがそれらに限定されない、他の試薬を含みうる。
【００６４】
好ましい一実施形態では、反応混合物はＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含み、熱安定性ＴｅｇポリメラーゼＩは反応混合物中に、１２０ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは１４０ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは１６０ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは１８０ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは２００ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは４００ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは６００ｐｇ／μＬ以上の濃度で存在する。
【００６５】
好ましい一実施形態では、反応混合物は双性イオン緩衝液を含む。好ましい一実施形態では、双性イオン緩衝液は約ｐＨ７．５−８．９の間のｐＨを有する。好ましい一実施形態では、緩衝液は、有機双性イオン酸および有機双性イオン塩基、カリウムイオン、およびマグネシウムイオンの組み合わせを含む。
【００６６】
特に好ましい一実施形態では、反応混合物は、４０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、９０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、４０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、および１００ｍＭソルビトールを含む緩衝液を含む。
【００６７】
別の好ましい一実施形態では、反応混合物は、２５ｍＭＴａｐｓ、０．０５ｍｇ／ｍＬ不凍タンパク質Ｉ、１０．３ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｍＭソルビトール、および０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含む緩衝液を含む。
【００６８】
一態様では、本発明は、ここに開示される核酸増幅反応混合物中にＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含む、核酸増幅反応チューブを提供する。
【００６９】
好ましい一実施形態では、増幅反応チューブは、ここに開示される熱サイクル増幅反応混合物中にＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含む、熱サイクル増幅反応チューブである。
【００７０】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応チューブは、ここで開示されるＰＣＲ反応混合物中にＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩを含む、ＰＣＲ反応チューブである。
【００７１】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応チューブは、ここで開示される変性ＰＣＲ反応混合物中にＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含む、変性ＰＣＲ反応チューブである。
【００７２】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応チューブは、ここで開示されるリアルタイムＰＣＲ反応混合物中にＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含む、リアルタイムＰＣＲ反応チューブである。
【００７３】
一態様では、本発明は、ここで開示されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含む、核酸、好ましくはＤＮＡであり、好ましくは２本鎖のものを増幅するのに有用である核酸増幅キットを提供する。好ましい一実施形態では、増幅キットはここで開示される増幅反応混合物を含む。
【００７４】
好ましい一実施形態では、増幅キットは、核酸、好ましくはＤＮＡであり、好ましくは２本鎖のものを温度サイクルモードによって増幅するのに有用である熱サイクル増幅キットである。熱サイクル増幅キットは、ここで開示されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含む。好ましくは、熱サイクル増幅キットは、ここで開示される熱サイクル増幅反応混合物を含む。
【００７５】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅キットは、核酸、好ましくはＤＮＡであり、好ましくは２本鎖のものをＰＣＲによって増幅するためのＰＣＲキットである。ＰＣＲキットは、ここで開示されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含む。好ましくはＰＣＲキットは、ここで開示されるＰＣＲ反応混合物を含む。
【００７６】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲキットは変性ＰＣＲキットであり、好ましくはここで開示される変性ＰＣＲ反応混合物を含む。
【００７７】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲキットはリアルタイムＰＣＲキットであり、好ましくはここで開示されるリアルタイムＰＣＲ反応混合物を含む。
【００７８】
好ましい一実施形態では、ここで提供される核酸増幅キットは、核酸増幅反応混合物を含み、増幅反応混合物はある量のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを含むため、反応混合物をテンプレートＤＮＡ、それとハイブリダイズ可能なプライマーおよび／またはプローブと混合でき、および任意に適当に希釈できて、負荷された反応混合物を生じ、ここで熱安定性ＤＮＡＰｏｌ Ｉは、ハイブリダイズしたプライマーを伸長することによってＤＮＡテンプレートを増幅する能力を有する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、環境試料から単離されたすべての遺伝的サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）系統（種）内の異なる遺伝子座についての酵素対立遺伝子頻度を提供する。
【図２】図２は、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）遺伝的系統（種）内の遺伝的多様性を提供する。
【図３】図３は系統樹（ＭＬＥＥ分析）を提供する。
【図４ａ】図４ａは、見出されたすべてのサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）特異的系統（種）の株について表現型検査陽性の割合を提供する。単離されたサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）株の、別々の遺伝的系統（種）との関連は、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）特異的参照株の酵素対立遺伝子頻度をマーカーとして用いるＭＬＥＥ分析の結果に基づいて実施した。
【図４ｂ】図４ｂは、見出されたすべてのサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）特異的系統（種）のうち、さらに多くの表現型検査陽性株の割合を提供する。
【図５】図５は、さまざまなサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）遺伝的系統（種）内のチオ硫酸酸化の比を提供する。
【図６】図６は、本発明で考察されるアライメントに用いられた参照配列についてのＮＣＢＩデータベース受入番号を提供する。
【図７ａ】図７ａは、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Ｔｂｒ）、Ｔ．フラブス（Ｔ．ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．フィリフォルミス（Ｔ．ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、Ｔ．アンチラニカイヌス（Ｔ．ａｎｔｉｒａｎｉｋａｉｎｕｓ）、Ｔ．イグニテラエ（Ｔ．ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）、Ｔ．オシマイ（Ｔ．ｏｓｈｉｍａｉ）、Ｔ．スコトダクタス（Ｔ．ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）、および４株のＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）（Ｔｅｇ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子についての核酸配列アライメント比較を提供する。
【図７ｂ】図７ｂは、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Ｔｂｒ）、Ｔ．フラブス（Ｔ．ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．フィリフォルミス（Ｔ．ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、Ｔ．アンチラニカイヌス（Ｔ．ａｎｔｉｒａｎｉｋａｉｎｕｓ）、Ｔ．イグニテラエ（Ｔ．ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）、Ｔ．オシマイ（Ｔ．ｏｓｈｉｍａｉ）、Ｔ．スコトダクタス（Ｔ．ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）、および４株のＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）（Ｔｅｇ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子についての核酸配列アライメント比較を提供する。
【図８】図８は、図７に示される１６ＳｒＲＮＡ遺伝子断片アライメントに基づく系統樹を示す。
【図９】図９は、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、Ｔ．フラブス（Ｔ．ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．フィリフォルミス（Ｔ．ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、および７株のＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）（Ｔｅｇ）のＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＡ）の活性部位モチーフＡおよびＣ間の保存領域についてのアミノ酸配列アライメント比較を提供する。
【図１０】図１０は、図９の保存領域アライメントに基づいて計算された系統樹を提供する。
【図１１ａ】図１１ａは、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Ｔｂｒ）、Ｔ．フラブス（Ｔ．ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．フィリフォルミス（Ｔ．ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、およびＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）（Ｔｅｇ）由来Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列アライメント比較を提供する。
【図１１ｂ】図１１ｂは、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Ｔｂｒ）、Ｔ．フラブス（Ｔ．ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．フィリフォルミス（Ｔ．ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｔｆｌ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）、およびＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）（Ｔｅｇ）由来Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列アライメント比較を提供する。
【図１２】図１２は、図１１のアミノ酸配列アライメントに基づいて計算された系統樹を提供する。
【図１３】図１３は、サーマス・エガートソニイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）由来の完全長ｐｏｌＡ遺伝子をコードする発現ベクターＰＲＩ−ｐＳＯ４の物理地図を提供する。
【図１４】図１４は、４時間の時間経過にわたる、可溶性タンパク質としてのＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ発現の誘導を示す電気泳動像を提供する。
【図１５】図１５は、組み換えＤＮＡポリメラーゼＩのための大スケール精製工程の略図を提示する。
【図１６】図１６は、ブチルセファロースでの疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を提供する。
【図１７】図１７は、ヘパリンセファロースでのリガンドアフィニティクロマトグラフィーによるＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を提供する。
【図１８】図１８は、精製組み換えＴａｑ−およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼに対して、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ単離の精製最終産物を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を提供する。
【図１９】図１９は、ベータ−アクチンＰＣＲ活性アッセイにおける、Ｔｅｇの第一段階酵素希釈物のアガロースゲル分析を提供する。
【図２０】図２０は、三段階ポリメラーゼＰＣＲ活性アッセイにおける第一試験の結果を提供する。図２０は、既知量のＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって生じた終点ＰＣＲ産物に対して、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ濃縮物のさまざまな希釈によって生じた終点ＰＣＲ産物の量を比較する電気泳動像を示す。
【図２１】図２１は、三段階ポリメラーゼＰＣＲ活性アッセイにおける最終試験の結果を示す。図２１は、既知量のＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって生じた終点ＰＣＲ産物に対して、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ濃縮物のさまざまな希釈によって生じた終点ＰＣＲ産物の量を比較する電気泳動像を示す。
【図２２】図２２は、終点ＰＣＲ産物の量の、３種類のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｕｌ）、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｕｌに調整）およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／Ｕｌに調整）についてのＰＣＲアッセイに用いられたポリメラーゼ単位の量に対するプロットを提供する。ＰＣＲ産物の終点量についてのプロット中のデータ点は、図２１の電気泳動像の濃度測定に基づいて計算された。
【図２３】図２３は、同一条件下で発現および精製されたＴｅｇ−、Ｔａｑ−およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼを比較する、ＤＮＡポリメラーゼプライマー伸長速度アッセイの電気泳動像を提供する。
【図２４】図２４は、リアルタイムＰＣＲを用いるＴｅｇ、Ｔａｑ、およびＴｂｒ間の熱安定性データ比較を提供する。
【図２５】図２５は、Ｔｅｇ、Ｔａｑ、およびＴｂｒ間のリアルタイムＰＣＲ増幅比較を提供する。
【図２６】図２６は、Ｇ−ＴおよびＧ−Ｇ塩基対ミスマッチに対するＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの忠実度を示す。
【図２７】図２７は、Ｇ−ＴおよびＧ−Ｇ塩基対ミスマッチに対するＴａｑＤＮＡポリメラーゼの忠実度を示す。
【図２８】図２８は、ＴｅｇおよびＴａｑについてのミスマッチ伸長データを提供する。
【図２９】図２９は、ＴｅｇおよびＴａｑを用いたミスマッチプライマー組み合わせについてのＰＣＲ増幅データを提供する。
【図３０】図３０は、ここで開示される配列を含む表を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸およびＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質
一態様では、本発明はＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を提供する。本発明のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲにおける使用のための適当な、および一部の場合にはよりよい酵素を提供する。ここで示される通り、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは他の一般的に用いられるＤＮＡポリメラーゼＩ酵素に対して、より速い伸長速度、およびより高い忠実度を含む、顕著な長所を提供する。より高い忠実度の酵素は、正しい産物を増幅するのに、および、誤診および／または発現エラーを結果として生じうる、変異の導入を回避するのに必須である。さらに、より速い伸長速度は、ＰＣＲ熱プロトコルに必要な時間を低減し、そのようにして実験効率を高めおよび一般費用を低減するのに決定的に重要である。
【００８１】
本発明は、プライミングされた１本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡおよびインキュベーション温度６０℃を用いてＤＮＡ複製アッセイで同一条件下で測定した場合、ＤＮＡポリメラーゼが＞３５塩基／秒であるｉｎ−ｖｉｔｒｏプライマー伸長速度を有しおよびアミノ酸配列の配列番号：２または４を含むＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長速度に対して少なくとも５塩基／秒より速い、単離および精製された好熱性ポリメラーゼに関する。
【００８２】
別の好ましい一実施形態では、本発明は、ａ）測定すべきポリメラーゼよりもＤＮＡテンプレートが１０倍過剰で存在し、ｂ）反応が等温条件下で（６０℃にて）実施され、ｃ）緩衝液が３０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、５９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５０ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭ酢酸マグネシウムを含み、およびｄ）ｐＨが８．７である条件下で、アミノ酸配列の配列番号：２を含むＤＮＡポリメラーゼのｄＴＴＰ誤取り込みの頻度と比べて、ＤＮＡテンプレート鎖上のＧに向かい合った位置での正しいｄＣＴＰの取り込みに対してｄＴＴＰ誤取り込みがより低頻度である、ＤＮＡポリメラーゼに関する。
【００８３】
別の好ましい一実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ａ）測定すべき酵素が１０倍過剰で存在し、ｂ）反応が等温条件下で実施され、ｃ）緩衝液が３０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、５９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５０ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭ酢酸マグネシウムを含み、およびｄ）ｐＨが８．７である条件下で、アミノ酸配列の配列番号：２を含むＤＮＡポリメラーゼのｄＧＴＰ誤取り込みの頻度と比べて、ＤＮＡテンプレート鎖上のＧに向かい合った位置での正しいｄＣＴＰの取り込みに対してｄＧＴＰ誤取り込みがより低頻度である。
【００８４】
一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは少なくとも一つの内因性エキソヌクレアーゼ活性を有し、ここでＤＮＡポリメラーゼは内因性５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００８５】
別の一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列の配列番号：２を含むＤＮＡポリメラーゼと比べて、テンプレート鎖中のＧ塩基に向かい合った位置にミスマッチＴ塩基を有するプライマーを伸長するためのより高い効率を有する。
【００８６】
好ましい一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：６、１７、１８、１９、２０、２１、２２および２３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは配列番号：４４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８７】
本発明はまた、本発明に記載の精製されたＤＮＡポリメラーゼおよび配列番号：６の完全または部分アミノ酸配列を含むキメラポリメラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関する。本発明は好ましくは、本発明に記載の精製されたＤＮＡポリメラーゼおよび配列番号：４４の完全または部分アミノ酸配列を含むキメラポリメラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関する。
【００８８】
好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号６に記載の精製されたキメラポリメラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関する。好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号４４に記載の精製されたキメラポリメラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関する。
【００８９】
本発明はまた、配列番号：５の任意の完全または部分核酸配列を含むベクターに関する。本発明はまた、配列番号：４３の任意の完全または部分核酸配列を含むベクターに関する。好ましい一実施形態では、本発明は、ヌクレオチドが、発現されたタンパク質が元の活性を保持するようにアライメントされうる、配列番号５に記載の核酸配列を含むベクターに関する。特に好ましい一実施形態では、ベクターは配列番号５に記載の核酸配列を含む。配列番号４３について同様が達成されうる。
【００９０】
本発明はまた、１）アミノ酸配列の配列番号：６、４４、または１７〜２３のうちいずれか一つの全体または一部を含むＤＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸に調節可能に結合するプロモーター領域（ｅｌｅｍｅｎｔ）、２）リボソーム結合部位、３）選択可能な代謝マーカー遺伝子、４）宿主細胞において機能的な複製開始点、および任意に５）ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列転写物の翻訳を促進する３'非翻訳配列領域を含む、請求項１０に記載のベクターに関する。
【００９１】
本発明は、ａ）本発明に記載の好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩ、任意にｂ）反応緩衝液、およびｃ）任意にヌクレオチドを含む核酸複製キットに関する。
【００９２】
好ましい一実施形態では本発明は、ＤＮＡ配列決定キットおよびＤＮＡ増幅キットの群から選択されおよび本発明に記載のポリメラーゼを含む、請求項１２に記載の核酸複製キットに関する。
【００９３】
ここで、下記で図３０に列記するいくつかの核酸およびタンパク質配列を開示する。
【００９４】
本発明のいくつかのＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質は真正細菌サーマス・エガートソニイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）に「由来する」。ここで使用される通り、特定の細菌属または種「の」または「に由来する」遺伝子とは、特定の細菌属または種の直接の、または直接に由来することを意味しない。正確には、その語句は、特定の細菌属または種の内因性遺伝子への特定遺伝子の対応をいう。
【００９５】
Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質は「機能性」ポリメラーゼである。機能性とは、ＤＮＡポリメラーゼが、１本鎖ＤＮＡテンプレート鎖にアニーリングしたプライマーの３’末端を３’−５’方向に伸長する速度（速さ）、たとえばプライマー伸長速度によって特徴づけることができる、ポリメラーゼ活性をいう。好ましい一実施形態では、本発明のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは、同一のプライマー伸長アッセイ条件下でＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩよりも少なくとも５塩基／秒間速い速度でプライマーの３'末端を伸長する能力によって特徴づけられる。特定の実施形態では、本発明のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは、伸長速度が３５塩基／秒と等しいまたは３５塩基／秒より大、より好ましくは４０塩基／秒より大、より好ましくは６０塩基／秒より大、より好ましくは７０塩基／秒より大、および非常に好ましくは８０塩基／秒より大の速度で機能する。Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼの比較される伸長速度は６０℃にて、３０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、５９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ８．７）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ酢酸マグネシウム、２５０μｍｏｌ ｄＡＴＰ、２５０μｍｏｌ ｄＣＴＰ、２５０μｍｏｌ ｄＧＴＰ、２５０μｍｏｌ ｄＴＴＰ、３７５ｎｇ（０．１５ｐｍｏｌ）ｓｓＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（ニューイングランドバイオラブズ社（ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、品番Ｎ４０４０Ｓ）および３ｐｍｏｌのＭ１３リバース配列決定プライマー（配列番号：４１、ニューイングランドバイオラブズ社、品番Ｓ１２３３Ｓ）と１単位の各ＤＮＡポリメラーゼＩを含む２０μｌの反応物中で測定される。反応物中の新たに合成されたプライマー伸長産物の長さは３０秒間隔で合計５分間にわたって測定される。プライマー伸長産物のサイズ（長さ）は、２本鎖参照ＤＮＡ分子（完全長プライマー伸長産物と同一サイズを有するＭ１３ｍｐ１８ ＲＦ Ｉ ＤＮＡ、ニューイングランドバイオラブズ社、品番Ｎ４０１８Ｓ）に対する、１％ＴＥＡＥ−緩衝アガロースゲルでの電気泳動移動度を、比較することによって測定する。
【００９６】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質は「熱安定性」ポリメラーゼである。熱安定性とは、８０℃を上回る温度による非可逆的不活性化に抵抗性であるポリメラーゼをいう。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを５’から３’への方向に伸長することによって、１本鎖ＤＮＡテンプレートに相補的であるＤＮＡ分子の形成を合成する。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、熱不活性化に完全に耐性である必要は必ずしもなく、および、したがって、熱処理はそのＤＮＡポリメラーゼ活性をある程度低下させうる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは典型的には好熱性細菌から単離され、Ｔｅｇが一例である。好ましい一実施形態では、本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩはＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩと同程度に熱安定性であり、およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼＩよりも熱安定性である。
【００９７】
好ましい一実施形態では、本発明のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩと比較して同等な、またはより好ましくはより高い「忠実度」を示す。ここでは、「忠実度」、「ＤＮＡポリメラーゼ忠実度」および「ポリメラーゼ忠実度」とは、プライミング鎖の３’末端での「間違った」ヌクレオチドの取り込みに対して識別するポリメラーゼの能力をいう。「間違った」ヌクレオチドとは、テンプレート鎖中の向かい合った塩基とワトソン／クリック型水素結合を取ることができない塩基を有するヌクレオチドをいう。ポリメラーゼ活性部位での立体構造変化の熱力学制限は「間違った塩基識別」の基礎となる機構を提供する。立体構造的制限は、「非ワトソン−クリック」塩基対のＤＮＡらせん歪みによって強制される。先行技術では、忠実度はしばしば、エラー率の逆数と混同される。ポリメラーゼのエラー率は複雑なパラメーターを表し、複製中にすべて同時に起こる３つの異なる過程の結果に依存する：ミスマッチ塩基の取り込み、ミスマッチ塩基の切り取り（たとえばエキソヌクレアーゼ校正）またはミスマッチ塩基の伸長。忠実度は第一の過程の結果だけを調節する。それはミスマッチ塩基取り込みおよび複製産物中にポリメラーゼ複製エラーを永続的に固定するミスマッチ伸長の協調作用を必要とする。１２種類の可能な塩基ミスマッチ組み合わせのそれぞれが、特定のらせん歪み特徴を有する。したがって、任意のポリメラーゼの合成忠実度は、１２の個別のミスマッチ塩基対忠実度の平均値を含む。Ｇ／Ｔ塩基対は、標準のワトソン／クリック塩基対と比較してＤＮＡ二重らせんに最小の歪みを生じる。Ｇ／Ｇ塩基対は歪みが大きいため、ＤＮＡポリメラーゼが複製中に未完成ＤＮＡ鎖のらせん内にそれを組み込むことはほぼ不可能である。したがってＧ／Ｔ塩基対またはＧ／Ｇ塩基対に対する識別は、１２種類の理論的に可能なミスマッチ塩基対の集団のうち、忠実度の最低および最高端をそれぞれ示す。ＤＮＡポリメラーゼの一般的な忠実度は、その両極の塩基対忠実度の平均として表すことができる。ＰＣＲを基礎とする多数の用途について、３’−５’エキソヌクレアーゼを含むポリメラーゼが用いられる。この３’−５’ヌクレアーゼ活性は、エラーを修正するための校正機能を提供する。忠実度はマッチおよびミスマッチｄＮＴＰ間の競合によって推定されうるが、はるかに便利な方法は、間違ったおよび正しいｄＮＴＰについて挿入の動態を個別の反応で測定することである（エコールズ（Ｅｃｈｏｌｓ）およびグッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ），『ＤＮＡ複製における忠実度機構』（"Ｆｉｄｅｌｔｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ"），Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０：４７７−５１１，１９９１，参照により本開示に含まれる）。Ｋｃａｔ（ｗ）／Ｋｍ（ｗ）のＫｃａｔ（ｒ）／Ｋｍ（ｒ）に対する比は、ここでｒは正しいヌクレオチドの取り込みを表しおよびｗは間違ったヌクレオチドの取り込みを表し、誤挿入効率ｆ（ｉｎｓ）を測定対象の酵素の忠実度はｆ（ｉｎｓ）の逆数である。

Ｋ_cat−酵素１モル当たりの単位時間に産物へ変換された基質の最大モル数
Ｋ_cat／Ｋ_M−酵素ヌクレオチド複合体を産物へ変換する効率
Ｋｍ−Ｖ_max1/2の場合の基質濃度
【００９８】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質は明瞭な「ドメイン」を含む。ここでは、「ドメイン」とは、自己安定化しおよびしばしば残りのタンパク質鎖とは独立して折りたたまれる、全体構造の成分をいう。多数のドメインは、１遺伝子または１遺伝子ファミリーのタンパク質産物に独自ではなく、代わりにさまざまなタンパク質に見られる。ドメインはしばしば、属するタンパク質の生物機能を目立って象徴するため、命名されおよび特定される。
【００９９】
本発明の多数のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質は、少なくとも３つの明瞭なドメイン、特に、Ｎ末端５’−３’ドメイン、内部３’−５’−エキソヌクレアーゼドメイン（ヌクレアーゼ活性を持たない）およびポリメラーゼドメインを含む。ポリメラーゼドメインは典型的にはタンパク質のＣ末端の３分の２に存在し、およびタンパク質のＤＮＡ依存性およびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を担う。Ｎ末端の３分の１部分は５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインを含む。ポリメラーゼドメインのパームサブドメインは、配列番号：６のアミノ酸４３４−４４８、５５６−６１５、７５１−８３０位から成り；ポリメラーゼドメインのサムサブドメインはアミノ酸４４９−５５５位を含み、一方ポリメラーゼドメインのフィンガーサブドメインは残りのアミノ酸６１６位から７５０位までによって形成される。コドンが最適化される場合、ポリメラーゼドメインのパームサブドメインは、配列番号：４４のアミノ酸４３８−４５２、５６０−６１９、７５５−８３４位から成り；ポリメラーゼドメインのサムサブドメインはアミノ酸４５３−５５９位を含み、一方ポリメラーゼドメインのフィンガーサブドメインは残りのアミノ酸６２０位から７５４位までによって形成される。
【０１００】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質は、例示されるアミノ酸配列、または例示される核酸配列によってコードされるものよりも、短くてもまたは長くてもよい。
【０１０１】
本発明に含まれるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質の断片は、好ましくは少なくとも一つの抗原エピトープをＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉと共有し、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉとの少なくとも指示された配列同一性を有し、およびここでさらに定義されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質活性を有する。
【０１０２】
さらに、より完全に概要を下記に示す通り、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質は、たとえば、エピトープまたは精製タグの付加、他の融合配列の付加、または追加のコードおよび非コード配列の解明によって、例示したものより長いものを作ることができる。
【０１０３】
本発明のＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質および核酸は、好ましくは組み換えである。ここではおよび下記でさらに定義される通り、核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらか、またはデオキシ−およびリボヌクレオチドの両方を含む分子をいうことができる。核酸は、センスおよびアンチセンス核酸を含む、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む。そのような核酸はまた、生理的環境においてそのような分子の安定性および半減期を増加させるため、リボース−リン酸骨格に修飾を含みうる。
【０１０４】
核酸は、２本鎖、１本鎖でありうるか、または２本鎖および１本鎖配列の両方の部分を含みうる。当業者に理解される通り、１本鎖の描写（「ワトソン」）はまた他方の鎖の配列（「クリック」）を定義する；したがって、図に示される配列はまた、配列の相補鎖を含む。
【０１０５】
ここでは組み換え核酸の語によって、一般的に、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作による、通常天然には見られない形の、本来ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された、核酸を意味する。したがって、直鎖型の単離されたＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸、または通常結合していないＤＮＡ分子のライゲーションによってｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された発現ベクターは、共に本発明の目的について組み換えと考えられる。一旦組み換え核酸が作製されおよび宿主細胞または生物へ再導入されたら、それは非組み換え的に、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ操作でなく、むしろ宿主細胞のｉｎ ｖｉｖｏ細胞機構を用いて、複製する；しかし、そのような一旦組み換えによって作製された核酸は、以降は非組み換え的に複製するが、本発明の目的についてまだ、組み換えと考えられる。
【０１０６】
同様に、組み換えタンパク質とは、組み換え法を用いて、すなわち上述の通りの組み換え核酸の発現を通じて、作られたタンパク質である。該タンパク質は、通常随伴する一部のまたはすべてのタンパク質および化合物から単離または精製でき、およびしたがって実質的に純粋でありうる。たとえば、単離されたタンパク質は、任意の試料中の総タンパク質の重量で、好ましくは少なくとも約０．５％、より好ましくは少なくとも約５％を構成する、天然状態で通常随伴する物質の少なくとも一部を随伴しない。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質の、重量で少なくとも約７５％を含み、少なくとも約８０％が好ましく、および少なくとも約９０％が特に好ましい。その定義は、Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）由来Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ タンパク質の、別の生物または宿主細胞での産生を含む。タンパク質は、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通じて、通常見られるよりも顕著に高い濃度で作製でき、そのためタンパク質は上昇した濃度レベルで作製される。タンパク質は、下記で考察する通りの、エピトープタグの付加、またはアミノ酸置換、挿入および欠失のように、天然では通常見られない形でありうる。
【０１０７】
一実施形態では、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩのコード配列は、全体または一部が、本分野で公知である化学的方法を用いて合成される（カルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）他，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７：２１５−２３３，１９８０； クレア（Ｃｒｅａ）およびホーン（Ｈｏｒｎ），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：２３３１，１９８０； マテウッチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２１：７１９，１９８０； およびチョウ（Ｃｈｏｗ）およびケンペ（Ｋｅｍｐｅ），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：２８０７−２８１７，１９８１）。本発明の別の実施形態では、タンパク質自体が、完全長ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩアミノ酸配列またはその一部を合成するための化学的方法を用いて作製される。たとえば、ペプチドは、固相法によって合成され、樹脂から切断され、および調製高速液体クロマトグラフィーによって精製されうる（クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ），『タンパク質構造および分子原理』（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ），ＷＨフリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ），ニューヨーク州ニューヨーク，１９８３）。本発明の別の実施形態では、合成ペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定によって確認される（クレイトン、前出）。
【０１０８】
直接ペプチド合成は、さまざまな固相法を用いて実施でき（ロバージュ（Ｒｏｂｅｒｇｅ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４，１９９５）、および自動合成は、たとえば、ＡＢＩ４３１Ａペプチドシンセサイザー（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を用いて取扱説明書に従って達成されうる。さらに、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸配列、またはその任意の部分を、他の配列と化学的方法を用いて結合し、および／または直接合成中に変化し、変異体ポリペプチドを作製しうる。
【０１０９】
いくつかの天然に存在するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質および核酸がここで例示される。これらはサーマス・エガートソニイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）のいくつかの株から得られている。本発明の他の Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質および核酸はいくつかの方法で同定されうる。たとえば、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、ここで例示されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉとのそのパーセント配列同一性によって、またはここで例示されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸とのそのコード核酸のパーセント同一性によって、同定されうる。
【０１１０】
一実施形態では、本発明は、ここで例示されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質との、９５％より大の、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、より好ましくは少なくとも約９９％同一性を有するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を提供する。
【０１１１】
別の一実施形態では、本発明は、ここで例示されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸との少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、より好ましくは少なくとも約９９％同一性を有する核酸配列によってコードされるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質を提供する。
【０１１２】
本分野で公知である通り、いくつかの異なるプログラムを用いて、タンパク質または核酸が既知の配列と配列同一性または類似性を有するかどうか特定することができる。詳細な考察については、Ｄ．マウント（Ｍｏｕｎｔ），『バイオインフォマティクス』（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ），コールド・スプリング・ハーバー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），２００１，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６０８−７を参照。配列同一性および／または類似性は、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ），Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ （１９８１）の局所配列同一性アルゴリズム、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３ （１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施によって（ウィスコンシン・ジェネティクスソフトウェアパッケージ，ジェネティクス・コンピューター・グループ，ウィスコンシン州マディソン市サイエンスドライブ５７５における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ ウィスコンシン・ジェネティクス（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアパッケージ，ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ），ウィスコンシン州マディソン市サイエンスドライブ５７５（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI）、デベロー他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）による最適一致配列プログラムを含むがそれらに限定されない、本発明の分屋で公知である標準的方法を用いて、好ましくはデフォルト設定を用いて、または検査によって、決定される。好ましくは、パーセント同一性はＦａｓｔＤＢによって下記のパラメーターに基づいて計算される：ミスマッチペナルティ１；ギャップペナルティ１；ギャップサイズペナルティ０．３３；および結合ペナルティ３０、『配列比較および分析の最新法』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ），『高分子配列決定および合成：方法と応用精選』（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），ｐｐ １２７−１４９ （１９８８），アラン・Ｒ・リス社（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【０１１３】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは一群の関連配列から複数の配列アライメントを、前進的な対のアライメントを用いて生成する。それはまた、アライメントを生成するのに用いるクラスター関係を示す樹状図をプロットできる。ＰＩＬＥＵＰはフェング（Ｆｅｎｇ）およびドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の前進的アライメント方法の簡易化を用いる；その方法は、ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）によって記載された方法に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルトギャップ重み３．００、デフォルトギャップ長重み０．１０、および加重末端ギャップを含む。
【０１１４】
有用なアルゴリズムの別の一例は、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）およびカーリン（Ｋａｒｌｉｎ）他，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメーターを用い、その大部分がデフォルト値に設定される。調整可能なパラメーターは下記の値を用いて設定される：重なりスパン＝１、重なり画分＝０．１２５、語閾（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ および ＨＳＰ Ｓ２パラメーターは動的値であり、ならびに目的配列が検索されている特定データベースの組成および特定配列の組成に依存してプログラム自身によって決定される；しかし、値は感度を高めるために調整されうる。
【０１１５】
別の有用な アルゴリズムは、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）他 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告された、ギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを用い；閾Ｔパラメーターは９に設定；ギャップ無し伸長を開始する２ヒット法；ギャップ長ｋに１０＋ｋのコストを負荷；Ｘ_uは１６に設定、およびＸ_gはデータベース検索段階で４０に、およびアルゴリズム出力段階で６７に設定する。ギャップ付きアライメントは〜２２ビットに相当するスコアによって開始される。パーセントアミノ酸配列同一性値は、アライメント領域中のより長い配列の、マッチする同一残基数を残基総数で割って決定される。より長い配列とは、アライメント領域中に最多の実際の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されたギャップは無視される）。
【０１１６】
アライメントは、アライメントすべき配列中へのギャップの導入を含みうる。さらに、図に示すタンパク質配列よりも多数のまたは少数のアミノ酸を含む配列については、当然、一実施形態では、配列同一性の割合は、アミノ酸の総数に対する同一アミノ酸の数に基づいて決定される。したがって、一実施形態では、たとえば、図に示すものより短い配列のパーセント配列同一性は、短いほうの配列のアミノ酸の数を用いて決定される。パーセント同一性計算では、挿入、欠失、置換、などといった配列変異のさまざまな現れについては相対重みは割り当てられない。
【０１１７】
一実施形態では、同一性だけが正のスコアが付き（＋１）およびギャップを含むすべての形の配列変異が値０を割り当てられ、配列類似性計算について下記に示す加重スケールまたはパラメーターの必要を回避する。パーセント配列同一性は、たとえば、アライメント領域中のより短い配列の、マッチする同一残基の数を残基総数で割り、および１００を掛けて計算できる。より長い配列とは、アライメント領域中に最多の実際の残基を有するものである。
【０１１８】
同様の方法で、パーセント（％）核酸配列同一性は、ここに例示されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸中のヌクレオチド残基と同一である、候補配列中のヌクレオチド残基の割合として定義される。好ましい方法は、デフォルトパラメーターに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用し、それぞれ１および０．１２５に設定された重なりスパンおよび重なり画分を使用する。
【０１１９】
当業者に理解される通り、本発明の配列は、配列決定エラーを含みうる。すなわち、誤ったヌクレオシド、フレームシフト、未知ヌクレオシド、または他の種類の配列決定エラーが任意の配列に存在しうる；しかし、正しい配列は、ここでのホモロジーおよびストリンジェンシー定義内に入る。
【０１２０】
「核酸」またはオリゴヌクレオチドまたは文法的同等物はここでは、共有結合した少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般的にホスホジエステル結合を含むが、しかし一部の場合には、ここで概略を示す通り、特にアンチセンス核酸またはプローブに関して、たとえば、ホスホラミド(Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) およびその参考文献; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); and Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986))、ホスホロチオエート(Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); and U.S. Patent No. 5,644,048)、ホスホロジチオエート(Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989))、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein,『オリゴヌクレオチド およびアナログ：実践的手法』（Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach）, Oxford University Pressを参照)、およびペプチド核酸骨格および結合(see Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, et al., Nature, 380:207 (1996)を参照, すべて参照により本開示に含まれる))を含む代わりの骨格を有しうる核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸は、陽性骨格を有するもの(Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995))； 非イオン性骨格(U.S. Patent Nos. 5,386,023; 5,637,684; 5,602,240; 5,216,141; and 4,469,863; Kiedrowshi, et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994); チャプター2および3, ASC Symposium Series 580, 『アンチセンス研究における糖修飾』（"Carbohydrate Modifications in Antisense Research"）, Y.S. Sanghui および P. Dan Cook編; Mesmaeker, et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996))およびU.S. Patent Nos. 5,235,033 および 5,034,506, ならびに チャプター6および7, ASC Symposium Series 580, 『アンチセンス研究における糖修飾』（"Carbohydrate Modifications in Antisense Research"）, Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook編に記載されたものを含む非リボース骨格を含む。一つ以上の炭素環糖を含む核酸、および「ロックされた核酸（locked nucleic acids）」もまた核酸の定義に含まれる（Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176を参照）。いくつかの核酸アナログが、Rawls, C & E News, June 2, 1997, page 35に記載される。これらの参考文献のすべてが明示的に参照により本開示に含まれる。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾は、標識といった追加部分の付加を円滑化するため、または生理的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増大させるために実施されうる。さらに、天然に存在する核酸およびアナログの混合物が作製されうる。代替的に、異なる核酸アナログの混合物、および天然に存在する核酸およびアナログの混合物が作製されうる。核酸は、指定される通り１本鎖または２本鎖である可能性があり、または２本鎖または１本鎖配列の両方の部分を含みうる。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡまたは、核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせを含む核酸であるハイブリッド、および、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キササニン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ）、ヒポキササニン（ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニン、などを含む任意の塩基の組み合わせでありうる。
【０１２１】
Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードする核酸に関して、遺伝子コードの縮重のため、そのすべてが本発明のタンパク質をコードする、極めて多数の核酸が作製されうることが当業者に理解される。したがって、特定のアミノ酸配列を同定しているならば、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で一つ以上のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製できる。
【０１２２】
好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：５から成る群から選択されるヌクレオチド配列との、少なくとも約９８％、非常に好ましくは少なくとも約９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。非常に好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列との、少なくとも約９８％、非常に好ましくは少なくとも約９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。
【０１２３】
特に好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：５から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。特に好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。
【０１２４】
一実施形態では、本発明は、ここに記載されるＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質断片をコードするＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸を提供する。
【０１２５】
一部の実施形態では、Ｐｏｌ Ｉ核酸はハイブリダイゼーション試験を通じて同定されうる。したがって、たとえば、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号：５、好ましくは４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列と、または配列番号：５、好ましくは４３から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードするもの、またはその相補鎖、またはその断片またはその相補鎖とハイブリダイズする核酸は、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ核酸と考えられる。高ストリンジェンシー条件が本分野で知られている；たとえばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，『分子クローニング：実験の手引き第３版』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），２００１，コールド・スプリング・ハーバー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； および『分子生物学実験プロトコール』（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），他編を参照，共に参照により本開示に含まれる。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、および異なる状況下では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範なガイドは、ティッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ），『生化学と分子生物学の方法−核酸プローブとのハイブリダイゼーション』（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，『ハイブリダイゼーションの原理の概観と核酸アッセイの戦略』（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ）（１９９３）に見られる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨにて特異的配列について、融点（Ｔ_m）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔ_mとは（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的と相補的であるプローブの５０％が標的配列と平衡にてハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するため、Ｔ_mでは、プローブの５０％が平衡にて占有されている）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０ナトリウムイオン未満、典型的には約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０から８．３にて、および温度が短プローブ（たとえば１０から５０塩基）について少なくとも約３０℃および長プローブ（たとえば５０塩基より大）について少なくとも約６０℃である条件となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドといった不安定化剤の添加によって達成されうる。
【０１２６】
天然起源から一旦単離されれば、たとえば、プラスミドまたは他のベクター内に含まれまたはそこから直鎖核酸セグメントとして切り出されれば、組み換えＰｏｌ Ｉ核酸は、修飾または変異体核酸およびタンパク質を作製するための前駆体核酸として使用されうる。
【０１２７】
本発明の核酸を用いて、さまざまな発現ベクターが作製される。発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに統合されるベクターのどちらでもよい。一般的に、これらの発現ベクターは、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードする核酸と調節可能に結合した、転写および翻訳調節核酸を含む。調節配列の語は、特定の宿主生物において、調節可能に結合したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適した調節配列は、たとえば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【０１２８】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、調節可能に結合している。たとえば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡと調節可能に結合している；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列と調節可能に結合している；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を円滑化するような位置にある場合は、コード配列と調節可能に結合している。別の一例として、調節可能に結合したとは、近接するように結合したＤＮＡ配列、および、分泌リーダーの場合には、近接しておよび読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあるように結合したＤＮＡ配列をいう。しかし、エンハンサーは近接している必要は無い。結合は、便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の方法に従って用いられる。転写および翻訳調節核酸は、一般的に、Ｐｏｌ Ｉタンパク質を発現するために用いられる宿主細胞に適する；たとえば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の転写および翻訳調節核酸配列が、タンパク質をバチルスで発現するために好ましく用いられる。多数の種類の適当な発現ベクター、および適当な調節配列が、さまざまな宿主細胞について本分野で知られている。
【０１２９】
一般的に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列を含みうるがそれらに限定されない。好ましい一実施形態では、調節配列は、プロモーターおよび転写開始および終止配列を含む。
【０１３０】
プロモーター配列は、構成的または誘導性プロモーターをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのどちらでもよい。二つ以上のプロモーター領域（ｅｌｅｍｅｎｔ）を組み合わせるハイブリッドプロモーターもまた本分野で知られており、および本発明において有用である。
【０１３１】
さらに、発現ベクターは追加の領域を含みうる。たとえば、発現ベクターは２個の複製系を持つことが可能であり、それによって２種類の生物で、たとえば発現用に哺乳類または昆虫細胞で、および、クローニングおよび増幅用に原核宿主で、維持されることを可能にする。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも一つの配列、および好ましくは発現構造に隣接する２個の相同配列を含む。組み込みベクターは、ベクターの組み入れに適当な相同配列を選択することによって、宿主細胞の特定の遺伝子座へ方向付けることができる。組み込みベクターの構築は本分野でよく知られている。
【０１３２】
さらに、好ましい一実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は本分野でよく知られており、および使用される宿主細胞によって異なる。
【０１３３】
本発明のＰｏｌ Ｉタンパク質は、Ｐｏｌ Ｉ核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を、該タンパク質の発現を誘導または引き起こすための適当な条件下で培養することによって作製されうる。Ｐｏｌ Ｉタンパク質発現に適当な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なり、および当業者によって通常の実験を通じて容易に確認されうる。たとえば、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用は、宿主細胞の成長および増殖を最適化することを必要とし、一方、誘導性プロモーターの使用は、誘導に適当な増殖条件を必要とする。さらに、一部の実施形態では、採集のタイミングが重要である。たとえば、昆虫細胞発現に用いられるバキュロウイルス系は溶解性ウイルスであり、およびしたがって採集時間選択は産物収量に決定的に重要でありうる。
【０１３４】
適当な宿主細胞は、酵母、細菌、古細菌、真菌、および昆虫、および哺乳類細胞を含み、動物細胞を含む。特に適しているのは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌｏｎａｇａｓｔｅｒ）細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、および ＨｅＬａ細胞、線維芽細胞、シュワン細胞腫細胞株、ＪｕｒｋａｔおよびＢＪＡＢ細胞といった不死化哺乳類骨髄性およびリンパ系細胞株である。
【０１３５】
一実施形態では、Ｐｏｌ Ｉタンパク質は哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現系もまた本分野で知られており、およびレトロウイルス系を含む。哺乳類プロモーターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼに結合、およびＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉのコード配列のｍＲＮＡへの下流（３'）転写を開始する能力のある、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５'末端近くに通常は位置する転写開始領域、および転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがＲＮＡ合成を正しい部位で開始するのを指示すると考えられる。哺乳類プロモーターはまた、典型的にはＴＡＴＡボックスの１００から２００塩基対以内の上流に位置する、上流プロモーター領域（エンハンサー領域）を含む。上流プロモーター領域は、転写が開始される率を決定し、および両方向に作用しうる。哺乳類プロモーターとして特に有用なのは、哺乳類ウイルス遺伝子由来のプロモーターであり、なぜなら該ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現されおよび広い宿主範囲を有するためである。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーターを含む。
【０１３６】
典型的には、哺乳類細胞によって認識される転写終止およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３'側に位置する調節領域であり、およびしたがって、プロモーター領域と共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３'末端は、部位特異的翻訳後切断およびポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０由来のものを含む。
【０１３７】
外来核酸を哺乳類宿主、および他の宿主へ導入する方法は本分野でよく知られており、および使用される宿主細胞によって異なる。方法は、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含む。
【０１３８】
好ましい一実施形態では、Ｐｏｌ Ｉタンパク質は細菌系で発現される。細菌発現系は本分野でよく知られている。
【０１３９】
適当な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼを結合、および、Ｐｏｌ Ｉのコード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始する能力のある、任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、コード配列の５'末端近くに通常は位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例は、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースといった糖代謝酵素由来のプロモーター配列、およびトリプトファンといった生合成酵素由来の配列を含む。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた使用でき、および本分野で知られている。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用であり、たとえば、ｔａｃプロモーターはｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合しおよび転写を開始する能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含みうる。
【０１４０】
機能するプロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が望ましい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、リボソーム結合部位はシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ）（ＳＤ）配列と呼ばれ、および、開始コドン、および開始コドンの３〜１１塩基上流に位置する長さ３〜９塩基の配列を含む。
【０１４１】
発現ベクターはまた、細菌におけるＰｏｌ Ｉタンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列を含みうる。シグナル配列は典型的には、本分野で公知である通り、細胞からのタンパク質の分泌を指示する、疎水性アミノ酸から成るシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地中に（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜の間に位置する細胞膜周辺腔に（グラム陰性細菌）分泌される。
【０１４２】
細菌発現ベクターはまた、形質転換されている菌株の選択を可能にするための、選択可能なマーカー遺伝子を含みうる。適当な選択遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンといった薬物に対して耐性を細菌に与える遺伝子を含む。選択可能なマーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるもののような生合成遺伝子を含む。
【０１４３】
これらの領域が発現ベクターに組み込まれる。細菌用の発現ベクターは本分野でよく知られており、および特に、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）用のベクターを含む。
【０１４４】
細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーションなどといった、本分野でよく知られた方法を用いて、細菌宿主細胞を形質転換する。
【０１４５】
一部の実施形態では、Ｐｏｌ Ｉタンパク質は昆虫細胞で産生される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、および特に、バキュロウイルスを基礎とする発現ベクターは、本分野でよく知られている。
【０１４６】
一実施形態では、Ｐｏｌ Ｉタンパク質は酵母細胞で産生される。酵母発現系は本分野でよく知られており、および、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・アランス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌａｎｓ）および Ｃ．マルトーサ（ｍａｌｔｏｓａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クロイベロマイセス フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）および Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・ギレリモンディ（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）およびＰ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、およびヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のための発現ベクターを含む。酵母における発現のための好ましいプロモーター配列は、誘導性ＧＡＬ１，１０プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、および酸性ホスファターゼ遺伝子由来プロモーターを含む。選択可能な酵母マーカーは、ツニカマイシンに対する耐性を与えるＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７；Ｇ４１８に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；および酵母が銅イオンの存在下で増殖するのを可能にするＣＵＰ１遺伝子を含む。
【０１４７】
好ましい一実施形態では、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは「精製されている」または「単離されている」。ここでは、ＤＮＡＰｏｌ Ｉを精製または単離するとは、試料からの夾雑物の除去をいう。ＤＮＡＰｏｌ Ｉタンパク質は、試料中に他の何の成分が存在するかに応じて、当業者に公知であるさまざまな方法で単離または精製されうる。標準的な精製方法は、電気泳動、分子的方法、免疫学的方法、およびイオン交換、疎水性、親和性クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法、および等電点電気泳動を含む。たとえば、Ｐｏｌ Ｉタンパク質は、標準的な抗Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ抗体カラムを用いて精製されうる。限外ろ過およびダイアフィルトレーション法もまた、タンパク質濃縮と併用して、有用である。適当な精製法の一般的指針については、スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ），Ｒ．，『タンパク質精製』（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ），シュプリンガー・フェアラーク社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ），ニューヨーク州（１９８２）を参照。必要な精製の程度は、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉタンパク質の使用に応じて変化する。一部の場合には精製は不要である。
【０１４８】
好ましい一実施形態では、組み換えＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、中温性細菌宿主細胞で発現され、および７０から８０℃の間の温度での熱処理を通じた宿主細胞タンパク質の除去によって精製される；組み換えＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩのパーセントは、それによって試料中で増大する。単離されたポリペプチドとは、（１）起源細胞から単離される際に通常随伴する、ポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の材料の少なくとも約５０％から分離されており、（２）単離されたポリペプチドが天然で結合しているポリペプチドのすべてまたは一部と（共有または非共有相互作用によって）結合しておらず、（３）天然で結合していないポリペプチドと、（共有または非共有相互作用によって）調節可能に結合している、または（４）天然に存在しない、本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、単離されたポリペプチドは、治療、診断、予防または研究使用に干渉する、天然の環境で見出される他のいかなる夾雑性ポリペプチドまたは他の夾雑物も実質的に含まない。
【０１４９】
ＤＮＡＰｏｌ Ｉ変異体
好ましい一実施形態では、本発明はＰｏｌ Ｉタンパク質変異体を提供する。これらの変異体は、３分類のうち一つ以上に該当する：置換、挿入および欠失変異体。これらの変異体は通常、Ｐｏｌ Ｉタンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの位置特異的変異誘発によってカセットまたはＰＣＲ変異誘発を用いて、または、変異体をコードするＤＮＡを作製するための本分野でよく知られた他の方法によって、およびその後、上記で概説された通り、ＤＮＡを組み換え細胞培養で発現することによって、調製される。しかし、変異体タンパク質断片はまた、確立された方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ合成によって調製されうる。アミノ酸配列変異体は、それらを天然に存在する対立遺伝子または種間Ｐｏｌ Ｉタンパク質と区別する性質である、変異の規定の性質によって特徴づけられる。一実施形態では、変異体は、天然に存在するアナログと同一の質的生物活性を示す。好ましい一実施形態では、改変された特徴を有する変異体が、下記により完全に概説される通り、提供される。
【０１５０】
アミノ酸配列変異を導入するための部位または領域が規定される一方、変異自体は規定される必要が無い。たとえば、任意の部位での変異の性能を最適化するために、ランダム変異誘発を標的コドンまたは領域で実施でき、および発現されたタンパク質変異体を目的活性の最適組み合わせについてスクリーニングできる。既知の配列を有するＤＮＡ中の規定位置で置換変異を実施する方法はよく知られており、たとえば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発である。変異体のスクリーニングは、ここに記載される通り、Ｐｏｌ Ｉ活性を測定するアッセイを用いて実施できる。
【０１５１】
アミノ酸置換は、典型的には単一残基のものである；挿入は通常は約１ないし２０アミノ酸のオーダーであるが、それより顕著に大きい挿入もまた許容されうる。欠失は約１ないし約２０残基の範囲であるが、一部の場合には欠失ははるかに大きい可能性がある。
【０１５２】
置換、欠失、挿入またはその任意の組み合わせが、最終誘導体に到達するために使用されうる。一般的にこれらの変化は、分子の変化を最小化するために、数個のアミノ酸について実施される。しかし、一部の状況では、より大きな変化が許容されうる。Ｐｏｌ Ｉタンパク質の特徴に小さな変化が望まれる場合は、置換が一般的に下記の表に従って実施される：

【０１５３】
機能または免疫学的同一性における実質的な変化が、表Ｉに示されるものよりも保存性が低い置換を選択することによって実施される。たとえば、より顕著に影響しうる置換が実施されうる：変化の部分のポリペプチド骨格の構造、たとえばアルファらせんまたはベータシート構造；標的部位での分子の電荷または疎水性；または側鎖のかさ。ポリペプチドの性質に最大の変化を生じると一般的に予測される置換は、（ａ）親水性残基、たとえばセリルまたはスレオニルが、疎水性残基、たとえばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルを（または、によって）置き換える；（ｂ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基を（または、によって）置き換える；（ｃ）陽性側鎖を有する残基、たとえばリシル、アルギニル、またはヒスチジルが、陰性残基、たとえばグルタミルまたはアスパルチルを（または、によって）置き換える；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、たとえばフェニルアラニンが、側鎖を有しない残基、たとえばグリシンを（または、によって）置き換えるものである。
【０１５４】
一実施形態では、天然に存在するアナログと同一の質的生物活性を示す変異体が提供される。
【０１５５】
好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０および１２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＰｏｌ Ｉタンパク質の活性と比較して上昇したＰｏｌ Ｉ生物活性を示すＰｏｌ Ｉ変異体を提供する。
【０１５６】
別の好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０および１２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＰｏｌ Ｉタンパク質の活性と比較して低下したＰｏｌ Ｉ生物活性を示すＰｏｌ Ｉ変異体を提供する。
【０１５７】
好ましい実施形態では、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、任意の各ドメインまたはドメインの組み合わせに随伴する触媒機能を促進、低減または消去するさまざまな手段によって変化されうる。適当な欠失および位置特異的変異誘発手順は本分野でよく知られている。
【０１５８】
一実施形態では、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の低減した変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。好ましい一実施形態では、ＴｅｇＰｏｌ Ｉ変異体の、配列番号６の４３位に対応するグリシン残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異している。
【０１５９】
一実施形態では、本発明は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の低減した変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。好ましい一実施形態では、ＴｅｇＰｏｌ Ｉ変異体の、配列番号４４の４７位に対応するグリシン残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸に変異している。
【０１６０】
一実施形態では、変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：６の６７９位に、そこのグルタミン酸残基をリジンまたはアルギニンといった正に荷電したアミノ酸で置き換える置換を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：４４の６８３位に、そこのグルタミン酸残基をリジンまたはアルギニンといった正に荷電したアミノ酸で置き換える置換を有するアミノ酸配列を含む。本分野で提供されるＤＮＡ基質に結合したＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩの三次元構造の分析は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ配列の配列番号：２中の対応する位置（６８１）のグルタミン酸の負電荷が、ＤＮＡ基質中のプライミング鎖の負に荷電したリン酸骨格と接触することを示している。その接触は、静電反発作用を生じ、ポリメラーゼの伸長速度および処理能力を制限する。グルタミン酸の代わりにリジンをその位置に有する、本分野で公知であるＴａｑＤＮＡＰｏｌ Ｉの変異体は、より速い伸長速度およびより良好な処理能力を示している。それらの性質を有する変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは、迅速ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、長い標的配列の増幅といったさまざまな用途に望ましい。
【０１６１】
一実施形態では、変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：６の６１２−６１３位に単一または複合置換を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：４４の６１６−６１７位に単一または複合置換を有するアミノ酸配列を含む。Ｔａｑおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩについて先行技術で実施されたランダム変異誘発実験は、それらの配列中の対応する位置のアミノ酸残基が、重合基質としてのｒＮＴＰとｄＮＴＰとの間の識別を制御することを示している。それらはまた、ＲＮＡまたはＤＮＡでプライミングされたＤＮＡテンプレート、プライマーの３'末端に塩基ミスマッチを有するテンプレートおよび完全にアニーリングしたプライマーの間、および標識および非標識ｄＮＴＰ基質の間の識別を制御する。これらの位置の置換の性質に基づいて、さまざまな用途のための有用な性質を持ついくつかの変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉが提供されうる。ミスマッチプライマーの伸長に対して識別が向上した変異体は、対立遺伝子特異的ＰＣＲに有用である。標識ｄｄＮＴＰ基質に対する親和性が向上した変異体は、蛍光ＤＮＡ配列決定およびリアルタイムＰＣＲに有用である。
【０１６２】
一実施形態では、本発明は、ジデオキシリボヌクレオチドの取り込みに対する識別が低下した変異体ＴｅＰｏｌ Ｉを提供する。そのような変異体は、ＤＮＡ配列決定に有用である。好ましい一実施形態では、Ｐｏｌ Ｉ変異体は、配列番号６の６６５位に相当する位置の野生型フェニルアラニンの代わりに置換残基を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、置換残基はチロシンである。同一の変異が配列番号４４に存在するのが好ましい。
【０１６３】
一実施形態では、本発明は、配列番号：６の８３０位のＣ末端グリシン残基がグルタミン酸残基で置換された変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。好ましい一実施形態では、本発明は、配列番号：４４の８３４位のＣ末端グリシン残基がグルタミン酸残基で置換された変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉを提供する。Ｃ末端グルタミン酸残基を有する他のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩの三次元構造は、その残基のベータカルボキシル基は、ポリメラーゼ活性部位において決定的に重要なマグネシウムイオンを安定化および配位するのに関与することを示す。その追加のカルボキシル基を提供することは、変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩが連続的ＤＮＡ合成を実施できる有効なマグネシウム濃度を低下させる。マグネシウム濃度の上昇はＤＮＡ増幅ＰＣＲの特異性に負の影響を有するため、より低いマグネシウム濃度で機能する能力は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に決定的に重要である。
【０１６４】
一実施形態では，変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：６に示されるアミノ酸配列のＮ末端に４個の追加のアミノ酸残基Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ／ＬｙｓおよびＧｌｙを有する。好ましい一実施形態では、変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、配列番号：４４に示されるアミノ酸配列のＮ末端に４個の追加のアミノ酸残基Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ／ＬｙｓおよびＧｌｙを有する。ＤＮＡ基質に結合したＴａｑＤＮＡポリメラーゼの解読された三次元構造に基づき、これらの３個の追加のＮ末端残基は、Ｎ末端ヌクレアーゼドメイン中のＤＮＡ結合部位の一部である。追加のＮ末端アミノ酸の非存在下では、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼはそのＤＮＡ基質に対して弱まった結合親和性および強度を有する。強化されたＤＮＡ基質結合性を有するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ変異体は、配列番号：６に示される野生型配列を有するＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉよりも良好な処理能力およびより速い伸長速度を有する。改善された処理能力およびより速い伸長速度は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用途を実施するのに用いられる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの重要な機能的性質である。それらは、より高い感度でより長い標的配列の増幅を可能にし、試料中の必要とするＤＮＡテンプレートを少なくする。この実施形態における変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの２位における追加のプロリン残基は、先行技術でよく確立されている、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＮ末端アミノ酸残基を安定化する規則に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の内因性細胞質プロテイナーゼによるＮ末端分解に対して組み換えポリメラーゼを安定化する。
【０１６５】
本発明の一部の実施形態では、タンパク質からのアミノ酸の欠失は、コードする遺伝物質中の欠失によって、または変異またはフレームシフトによる翻訳終止コドンの導入によって達成される。別の実施形態では、該タンパク質の一部を除去するために、タンパク質分子のタンパク質分解処理が実施される。さらに別の実施形態では、欠失変異体は、野生型配列を制限消化し、および適当に設計したオリゴマーを目的の活性をコードする消化断片へアニーリングして新しい開始部位を導入することによって構築される。
【０１６６】
一実施形態では、変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、Ｎ末端５’−３’−エキソヌクレアーゼドメインを欠く切断ＤＮＡＰｏｌ Ｉであり、該ＤＮＡＰｏｌ Ｉは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。エキソヌクレアーゼ活性を欠く該切断変異体Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉは本質的に、配列番号：６の残基２８９から８３０で示されるアミノ酸配列を含む。エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉの別の切断形は本質的に、配列番号：４４の残基２９３から８３４で示されるアミノ酸配列を含む。
【０１６７】
Ｐｏｌ Ｉポリペプチドの共有修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有修飾の一つの種類は、Ｐｏｌ Ｉポリペプチドの標的アミノ酸残基を、該ポリペプチドの選択された側鎖またはＮ−またはＣ末端残基と反応できる有機誘導化剤と反応させることを含む。二官能基剤との誘導体化が、より十分に下記で述べられている通りに、たとえば、抗Ｐｏｌ Ｉ抗体を精製するための方法での使用のためにまたはスクリーニングアッセイのために、Ｐｏｌ Ｉを非水溶性担体マトリクスまたは表面と架橋するために有用である。一般的に用いられる架橋剤は、たとえば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば、４−アジドサリチル酸を有するエステル、ホモ二官能性イミドエステル、３，３'−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミドを含み、および、メチル−３−[（ｐ−アジドフェニル）ジチオ]プロピオイミデートのような薬剤を含む。
【０１６８】
他の修飾は、グルタミニルおよびアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化[Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、『タンパク質：構造および分子的性質』（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ），Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．），サンフランシスコ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ．７９−８６ （１９８３）]，Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１６９】
本発明によって考慮されるＤＮＡＰｏｌ Ｉタンパク質の別の種類の共有修飾は、ポリペプチドをさまざまな非タンパク質性高分子の一つ、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンと、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２または４，１７９，３３７に示される方法で結合することを含む。
【０１７０】
ＤＮＡＰｏｌ Ｉ融合タンパク質およびＤＮＡＰｏｌ Ｉキメラタンパク質
本発明の一部の実施形態では、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩのドメインを、「融合タンパク質」を作製するのに使用できる。ここでは、「融合タンパク質」の語は、外来タンパク質断片と結合した目的タンパク質を含むキメラタンパク質をいう。融合パートナーは、宿主細胞で発現される通りの組み換えキメラタンパク質の溶解性を高めることができ、宿主細胞または培養上清からの組み換え融合タンパク質の精製を可能にする親和性タグを提供でき、または両方である。融合パートナーは、塩基誤取り込みを訂正する３'−５'−校正エキソヌクレアーゼ活性またはＤＮＡテンプレートとの結合強度および親和性を改善するための追加のＤＮＡ結合部位といった、親ポリメラーゼには無い新規の望ましい機能を導入しうる。前者の場合のそのような融合パートナーの適した例は、古細菌校正ＤＮＡポリメラーゼの内部３'−５'−エキソヌクレアーゼドメインである。後者の場合の融合パートナーの例は、Ｓｓｏｄ７のような好熱性古細菌由来の小熱安定性ヒストン様タンパク質、またはメタノコッカス・ジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎａｓｃｈｉｉ）由来ＤＮＡトポイソメラーゼの複数ＤＮＡ結合ドメインである。必要に応じて、融合タンパク質は目的タンパク質から、本分野で公知であるさまざまな酵素的または化学的手段によって除去されうる。
【０１７１】
本発明の一部の実施形態では、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは、「キメラタンパク質」を作製するのに使用されうる。ここでは、「キメラタンパク質」および「キメリカルタンパク質」とは、二つ以上の親タンパク質に由来するアミノ酸配列部分を含む単一タンパク質分子をいう。ここでは「一部」の語は、タンパク質をいうのに用いる場合（「任意のタンパク質の一部」のように）、そのタンパク質の断片をいう。断片は、アミノ酸残基３個から、アミノ酸配列全体からアミノ酸１個を引いたものまでのサイズ範囲でありうる。これらの親分子は、遺伝的に異なる起源に由来する類似タンパク質、単一生物に由来する異なるタンパク質、または異なる生物に由来する非類似タンパク質でありうる。
【０１７２】
本発明のＰｏｌ Ｉポリペプチドはまた、別の非相同ポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合されたＰｏｌ Ｉポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾されうる。一実施形態では、そのようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとのＰｏｌ Ｉポリペプチドの融合を含む。好ましい一実施形態では、そのようなタグは下記に示す「フラグタグ」である。エピトープタグは一般的に、Ｐｏｌ Ｉポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。ポリペプチドのそのようなエピトープタグ形の存在は、タグに対する抗体を用いて検出されうる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体を用いる親和性精製によって、またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリクスによって、Ｐｏｌ Ｉポリペプチドが容易に精製されることを可能にする。代替的な一実施形態では、キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との、Ｐｏｌ Ｉポリペプチドとの融合を含みうる。キメラ分子の二価形については、そのような融合は、下記にさらに考察する通り、ＩｇＧ分子のＦｃ領域とでありうる。
【０１７３】
さまざまなタグポリペプチドおよびそのそれぞれの抗体は本分野でよく知られている。例は、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５[フィールド（Ｆｉｅｌｄ）他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）]；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体[エヴァン（Ｅｖａｎ）他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）]；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体[パボルスキー（Ｐａｂｏｒｓｋｙ）他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０）]を含む。他のタグポリペプチドは、フラグペプチド[ホップ（Ｈｏｐｐ）他，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８）]；ＫＴ３エピトープペプチド[マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２）]；チューブリンエピトープペプチド[スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６ （１９９１）]；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[ルッツ・フレイヤームス（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０）]を含む。
【０１７４】
Ｐｏｌ Ｉタンパク質はまた、本分野でよく知られている方法を用いて、融合タンパク質としても作製されうる。したがって、たとえば、モノクローナル抗体の作製のために、目的のエピトープが小さい場合は、Ｐｏｌ Ｉタンパク質をキャリヤータンパク質に融合して免疫原を形成しうる。代替的に、発現を高めるために、または別の理由で、Ｐｏｌ Ｉタンパク質は融合タンパク質として作製されうる。たとえば、Ｐｏｌ Ｉタンパク質がペプチドである場合、該ペプチドをコードする核酸は、発現目的で別の核酸と結合されうる。同様に、本発明のＰｏｌ Ｉタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、などといったタンパク質標識と結合されうる。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明のＰｏｌ Ｉ核酸、および／またはタンパク質、および／または抗体は標識化されている。標識化とはここでは、化合物が、該化合物の検出を可能にするために結合した少なくとも一つの元素、同位体または化合物を有することを意味する。一般的に、標識は４つに分類される：ａ）同位体標識、放射性または安定同位元素でありうる；ｂ）免疫標識、抗体または抗原でありうる；ｃ）着色または蛍光色素；ｄ）磁性部分。標識は任意の位置で化合物に組み込むことができる。
【０１７６】
核酸複製
一態様では、本発明は、核酸分子をＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩを含む複製反応混合物中で複製反応に供することを含む、核酸分子を複製する方法を提供する。
【０１７７】
核酸複製とは、テンプレート核酸分子が完全にまたは一部複製される過程をいう。したがって、核酸複製反応の産物は、複製しているテンプレート核酸分子と完全にまたは一部相補的でありうる。核酸複製は、伸長産物の各位置で、テンプレート核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを組み込んで、テンプレート核酸とハイブリダイズしたプライマーを５'−３'方向へ伸長することによって実施される。プライマーは、たとえば、１本鎖ＤＮＡテンプレートの領域とハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドでありうる。プライマーはまた、たとえば、１本鎖ＤＮＡテンプレートの第２の領域と相補でありおよび自己プライミングできる、１本鎖ＤＮＡテンプレートの一部でありうる。核酸複製反応の範囲内に含まれるのは、等温複製反応、配列決定反応、増幅反応、熱サイクル増幅反応、ＰＣＲ、迅速ＰＣＲ、およびロングレンジＰＣＲである。
【０１７８】
核酸複製反応で複製される核酸は、好ましくはＤＮＡであり、および複製は好ましくは、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が関与する。
【０１７９】
好ましい一実施形態では、ここで提供される反応混合物は、双性イオン緩衝液を含む。好ましい一実施形態では、双性イオン緩衝液は約ｐＨ７．５〜８．９の間のｐＨを有する。好ましい一実施形態では、緩衝液は、有機双性イオン酸および有機双性イオン塩基、カリウムイオン、およびマグネシウムイオンの組み合わせを含む。
【０１８０】
非常に好ましい一実施形態では、ここで提供される反応混合物は、３０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、５９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。
【０１８１】
ここでは核酸複製反応において、プライマー伸長が実施される温度は、好ましくは約６０〜７２℃の間、より好ましくは約６２〜６８℃の間である。
【０１８２】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応でプライマーアニーリングおよびプライマー伸長が実施される温度は、約６０〜７２℃、より好ましくは約６２〜６８℃の間、より好ましくは約６２〜６５℃の間であるが、最適温度は本分野でよく知られている通り、プライマー長、塩基含量、テンプレートとのプライマー相補性の程度、および他の因子によって決定される。
【０１８３】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応で変性が実施される温度は、約９０〜９５℃の間、より好ましくは９２〜９４℃の間である。好ましい熱サイクル増幅方法は、約９０℃ないし約９５℃、より好ましくは９２〜９４℃のピーク温度、および約１０ないし約１００サイクル、より好ましくは約２５ないし約５０サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【０１８４】
核酸増幅
一態様では、本発明は、ここで開示されるＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩを含む増幅反応混合物中で核酸分子を増幅反応に供することを含む、核酸分子を増幅するための方法を提供する。好ましくは、増幅反応は、ここで記載される増幅反応チューブ中で実施される。
【０１８５】
核酸分子は、文献に記載された手動または自動増幅方法のうち任意のものにしたがって増幅されうる。ここでは「増幅」とは、目的ヌクレオチド配列のコピー数を増加するための任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法をいう。増幅された核酸は好ましくはＤＮＡであり、および増幅は好ましくはＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む。より好ましくは、ＤＮＡ増幅は、Ｃ末端にＧｌｙからＧｌｕへのアミノ酸置換およびＮ末端に４個の追加のアミノ酸（Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ）を有する変異体ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩを含む。
【０１８６】
一実施形態では、核酸増幅は、ＤＮＡ分子またはプライマーへのヌクレオチドの取り込みを結果として生じ、それによって、核酸テンプレートと相補的な新しいＤＮＡ分子を形成する。形成されたＤＮＡ分子およびそのテンプレートは、別のＤＮＡ分子を合成するためのテンプレートとして使用されうる。ここでは、一つの増幅反応は、多数回のＤＮＡ複製から成りうる。ＤＮＡ増幅反応は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を含む。一つのＰＣＲ反応は、１０から１００「サイクル」のＤＮＡ分子の変性および合成から成りうる。そのような方法は、ＰＣＲ（参照により本開示に含まれる米国特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２号明細書に記載される通り），鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）（参照により本開示に含まれる米国特許第５，４５５，１６６に記載される通り），および核酸配列基礎型増幅（「ＮＡＳＢＡ」）（参照により本開示に含まれる米国特許第５，４０９，８１８号明細書に記載される通り）を含むがそれらに限定されない。たとえば、増幅は、低減された熱でのＤＮＡ融解の効率増大のためにヘリカーゼさえ使用しうる、ローリングサークル複製系によって達成されうる（ユザコウ（Ｙｕｚｈａｋｏｕ）他，Ｃｅｌｌ ８６：８７７−８８６（１９９６）およびモク（Ｍｏｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６５５８−１６５６５（１９８７）を参照，参照により本開示に含まれる）。
【０１８７】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応で変性が実施される温度は、約９０℃から９５℃より大の間，より好ましくは９２〜９４℃の間である。好ましい熱サイクル増幅方法は、約９０℃ないし９５℃より大、より好ましくは９２〜９４℃のピーク温度、および約１０ないし約１００サイクル、より好ましくは約２５ないし約５０サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【０１８８】
好ましい一実施形態では、（ａ）標的配列の末端が十分に詳細に知られているため、末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが合成されうる、および（ｂ）連鎖反応を開始するために少量の標的配列が利用可能であるならば、ＰＣＲ反応が、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、含まれる反応段階数に対して指数的な量で、少なくとも一つの標的核酸配列を生じるために実施される。連鎖反応の産物は、使用した特定のプライマーの末端に対応する末端を有する別々の核酸２本鎖となる。
【０１８９】
精製形または非精製形の、任意の起源の核酸が、目的の標的核酸配列を含むかまたは含むと考えられるならば、開始核酸として使用されうる。したがって、本工程は、たとえば、ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用でき、そのＤＮＡまたはＲＮＡは１本鎖または２本鎖でありうる。さらに、それぞれの１本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが使用されうる。これらのいずれかの核酸の混合物もまた使用でき、または前の増幅反応から同一のまたは異なるプライマーを用いて生じた核酸もまたそのように使用できる。増幅された核酸は好ましくはＤＮＡである。増幅すべき標的核酸配列は、より大きな分子の一部だけでよく、または、異なる分子として最初は存在しえ、結果として標的配列が核酸全体を構成する。増幅すべき標的配列は、最初に純粋な形で存在する必要は無い：ヒト全ＤＮＡに含まれるβ−グロビン遺伝子の一部、または特定の生物試料の非常に小さい画分だけを構成する特定の微生物に起因する核酸配列の一部といった、複雑な混合物の小さい画分でありうる。開始核酸は、同一のまたは異なりうる、二つ以上の目的の標的核酸配列を含みうる。したがって、本方法は、多量の１つの標的核酸配列を作製するためだけでなく、同一のまたは異なる核酸分子上に位置する複数の標的核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
【０１９０】
核酸は、細菌、酵母、ウイルス、および植物または動物といった高等生物を含む、任意の起源に由来するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびにプラスミドおよびクローン化したＤＮＡまたはＲＮＡを含み、および任意の起源から得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、たとえば、血液または他の液体、またはたとえば絨毛膜絨毛または羊膜細胞といった組織材料から、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，『分子クローニング：実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），（ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））ｐｐ ２８０−２８１（１９８２）によって記載されたようなさまざまな方法によって抽出されうる。
【０１９１】
任意の特異的（すなわち、標的）核酸配列が本方法によって作製されうる。標的配列の両端の十分な数の塩基が十分に詳細に判りさえすれば、目的の配列の異なる鎖とハイブリダイズする、および、一方のプライマーから合成される伸長産物が、テンプレート（相補鎖）から分離される際、規定の長さの核酸への、他方のプライマーの伸長のためのテンプレートとなりうるように配列に沿った相対的位置にハイブリダイズする、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが調製されうる。配列の両端での塩基についての知識が多いほど、プライマーの標的核酸配列に対する特異性は高くなり、および、したがって、該処理の効率は高くなる。プライマーの語は以後、特に、増幅すべき断片の末端配列に関する情報に何らかのあいまいさがある場合は、二つ以上のプライマーをいう可能性があると理解される。たとえば、核酸配列がタンパク質配列情報から推論される場合、遺伝コードの縮重に基づくすべての可能なコドン変異を表す配列を含むプライマーの集合が、各鎖について使用されうる。この集合に由来する１つのプライマーが、増幅すべき目的の配列の末端と相同となる。
【０１９２】
一部の代替的な実施形態では、ランダムプライマー、好ましくはヘキサマーが、テンプレート核酸分子を増幅するために用いられる。そのような実施形態では、増幅される正確な配列はあらかじめ定められていない。
【０１９３】
さらに、単一プライマーを用いる片側増幅が実施されうることが、当業者に理解される。
【０１９４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、たとえば、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法またはその自動化された実施形態といった、任意の適当な方法を用いて調製されうる。そのような自動化された一実施形態では、参照により本開示に含まれるビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８６２ （１９８１）によって記載される通り、ジエチロホスホラミダイトが出発材料として用いられ、および合成されうる。修飾された固相担体上でオリゴヌクレオチドを合成するための一つの方法が、参照により本開示に含まれる米国特許第４，４５８，００６号明細書に記載される。生物起源から単離されているプライマーを用いることもまた可能である（たとえば制限エンドヌクレアーゼ消化物）。
【０１９５】
好ましいプライマーは、約１５〜１００、より好ましくは約２０〜５０、非常に好ましくは約２０〜４０塩基の長さを有する。
【０１９６】
標的核酸配列は、その配列をテンプレートとして含む核酸を用いることによって増幅される。核酸が２本鎖を含む場合、テンプレートとして使用できる前に、別個の段階としてまたはプライマー伸長産物の合成と同時に、核酸の鎖を分離する必要がある。この鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の適当な変性法によって達成されうる。核酸の鎖を分離する１つの物理的方法は、核酸が完全に（＞９９％）変性するまで核酸を加熱することを含む。典型的な熱変性は、約１ないし１０分間の範囲の時間にわたる、約８０℃ないし１０５℃、好ましくは約９０℃から約９８℃、さらにより好ましくは９３℃から９５℃の範囲の温度を含みうる。鎖分離はまた、ヘリカーゼとして知られる酵素の分類からの酵素、または、ヘリカーゼ活性を有しおよびＤＮＡを変性することが知られている酵素ＲｅｃＡによっても誘導されうる。参照により本開示に含まれる、ＲｅｃＡを用いるための方法は、Ｃ．ラディング（Ｒａｄｄｉｎｇ），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：４０５−３７（１９８２）に総説があり、およびヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するのに適した反応条件は、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＸＬＩＩＩ『ＤＮＡ：複製および組み換え』（ＤＮＡ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９７８）によって記載される。
【０１９７】
増幅すべき配列を含む元の核酸が１本鎖である場合、その相補鎖が、オリゴヌクレオチドプライマーをそこに加えることによって合成される。適当な単一プライマーが添加される場合、プライマー、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩ、および下記の４種類のヌクレオチドの存在下で、プライマー伸長産物が合成される。産物は１本鎖核酸と一部相補的となり、および該核酸鎖とハイブリダイズして等しくない長さの鎖の２本鎖を形成し、２本鎖は上記の通り１本鎖へ分離して２本の分離した相補的な１本鎖を生じうる。
【０１９８】
元の核酸が、増幅すべき配列を含む場合、生じるプライマー伸長産物は元の核酸の鎖と完全に相補的となり、および等しい長さの鎖の２本鎖を元の核酸と形成し、１本鎖分子へ分離される。
【０１９９】
核酸鎖の相補鎖が分離される際、核酸が元は２本鎖でも１本鎖でも、該鎖は別の核酸鎖の合成のためのテンプレートとして用いられる準備が出来ている。この合成は任意の適当な方法を用いて実施されうる。一般的に、それは緩衝水溶液中で生じる。一部の好ましい実施形態では、緩衝液ｐＨは約７．５〜８．９である。好ましくは、モル過剰（クローン化した核酸については、通常は約１０００：１プライマー：テンプレート、およびゲノム核酸については、通常は約１０⁶：１プライマー：テンプレート）の２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、分離されたテンプレート鎖を含む緩衝液へ添加される。しかし、当然、ここでの処理が診断用途に用いられる場合は相補鎖の量は未知でありうるため、相補鎖の量に対するプライマーの量を確実に決定することはできない。しかし、実際問題として、添加するプライマーの量は一般的に、増幅すべき配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中に含まれる場合、相補鎖（テンプレート）の量よりモル過剰となる。処理の効率を改善するためにはモル大過剰が好ましい。
【０２００】
ヌクレオシド三リン酸、好ましくはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび／またはｄＵＴＰもまた、適当な量で合成混合物に添加される。
【０２０１】
新規に合成された鎖およびその相補核酸鎖は、２本鎖分子を形成し、それは処理の次の段階で用いられる。次の段階では、２本鎖分子の鎖は上記の手順のうちのいずれかを用いて分離され、１本鎖分子を与える。
【０２０２】
新しい核酸は１本鎖分子上で合成される。上記の条件下で反応が進行するために必要であるならば、追加のポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびプライマーが添加されうる。再び、合成はオリゴヌクレオチドプライマーの一端で開始され、およびテンプレートの１本鎖に沿って進行して、別の核酸を生じる。
【０２０３】
鎖分離および伸長産物合成の段階は、目的の量の特定核酸配列を生じるのに必要な回数反復されうる。生じた特定核酸配列の量は、指数的に増加する。
【０２０４】
２つ以上の特定核酸配列を、最初の核酸、または核酸の混合物から作製することが望まれる場合、適当な数の、異なるオリゴヌクレオチドプライマーが利用される。たとえば、２つの異なる特定核酸配列を作製すべき場合、４つのプライマーが利用される。プライマーのうち２つは特定核酸配列の一方に特異的であり、および残りの２つのプライマーは第２の特定核酸配列に特異的である。この方法で、２つの異なる特定配列のそれぞれが、本処理によって指数的に作製されうる。もちろん、異なるテンプレート核酸配列の末端配列が同一である場合は、プライマー配列は互いに同一となり、およびテンプレート末端配列と相補的となる。
【０２０５】
さらに、上述の通り、代替的な一実施形態では、ランダムプライマー、好ましくはヘキサマーが、テンプレート核酸分子を増幅するのに用いられる。
【０２０６】
さらに、単一プライマーを用いる片側増幅が実施されうる。
【０２０７】
本発明は、各段階後に新しい試薬が添加される段階形式で、または同時実施でき、すべての試薬が最初の段階で、または一部段階的および一部同時に添加され、所定数の段階後に新しい試薬が添加される。たとえば安定剤のような、追加の材料は、必要に応じて添加されうる。目的の量の特定核酸配列を作製するために適当な長さの時間が経過後、反応は、酵素を任意の公知の方法で不活性化することによって、または反応の成分を分離することによって、停止されうる。
【０２０８】
したがって、本発明に記載の核酸分子の増幅では、核酸分子を、好ましくは熱安定性ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩを含む組成物と、適当な増幅反応混合物中で接触させる。
【０２０９】
一実施形態では、本発明は、「ロングレンジＰＣＲ」と一般に呼ばれる方法によって大きい核酸分子を増幅する方法を提供する（バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ），Ｗ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２２１６−２２２０（１９９４）（「バーンズ」）；チェン（Ｃｈｅｎｇ），Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５６９５−５６９９（１９９４），参照により本開示に含まれる）。約５〜６キロベースより大の核酸分子を増幅するのに有用な１つの方法では、標的核酸分子を接触させる組成物は、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩを含むだけでなく、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を示す低濃度の第２のＤＮＡポリメラーゼ（「ｅｘｏ＋」ポリメラーゼ）（好ましくは熱安定性修復型ポリメラーゼ、またはｐｏｌＣαサブユニット）も、濃度を約０．０００２〜２００単位／ミリリットル、好ましくは約０．００２〜１００単位／ｍＬ、より好ましくは約０．００２〜２０単位／ｍＬ、さらにより好ましくは約０．００２〜２．０単位／ｍＬ、および非常に好ましくは濃度を約０．４０単位／ｍＬで含む。本方法での使用に好ましいｅｘｏ＋ポリメラーゼは、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＰｏｌＣ、Ｐｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴまたはＴｌｉ／ＮＥＮＴ（商標）（バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）；米国特許第５，４３６，１４９号明細書、参照により本開示に含まれる）；サーモトガ種由来の熱安定性ポリメラーゼ、たとえばＴｍａＰｏｌ Ｉ（米国特許第５，５１２，４６２号明細書、参照により本開示に含まれる）；およびサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａＰｏｌ Ｉｔａｎａ）から単離されたある種の熱安定性ポリメラーゼおよびその変異体、たとえばＴｎｅ（３'ｅｘｏ＋）である。サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＰｏｌＣ産物もまた好ましい。ロングレンジＰＣＲの考察については、たとえば、参照により明示的に本開示に含まれるデイビーズ（Ｄａｖｉｅｓ）他，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２；１８７： ５１−５を参照。
【０２１０】
核酸配列決定
一態様では、本発明は、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを含む配列決定反応混合物中での配列決定反応に核酸を供することを含む、核酸、好ましくはＤＮＡを配列決定するための方法を提供する。
【０２１１】
好ましくは、使用されるＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは、配列決定反応混合物中の３'末端ジデオキシヌクレオチドを除去できる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【０２１２】
さらに、配列決定については、本発明に記載のＴｅｇ変異体が用いられることが好ましい。本発明に記載のこのＴｅｇＰｏｌ Ｉ変異体は、配列番号６の６６５位に対応する位置に、野生型フェニルアラニンの代わりに置換残基を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、置換残基はチロシンである。配列番号４３中に前記置換を有することもまた好ましい。
【０２１３】
核酸分子は、文献に記載された手動または自動配列決定方法のいずれかに従って配列決定されうる。そのような方法は、ジデオキシ配列決定方法（「サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定」；サンガー（Ｓａｎｇｅｒ），Ｆ．，他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４：４４４−４４８（１９７５）；サンガー（Ｓａｎｇｅｒ），Ｆ．，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７ （１９７７）；米国特許第４，９６２，０２２および５，４９８，５２３，参照により本開示に含まれる）、ならびにＰＣＲに基づく方法およびより複雑なＰＣＲに基づく核酸フィンガープリンティング法によって、たとえばランダム増幅多型ＤＮＡ（「ＲＡＰＤ」）分析（ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ），Ｊ．Ｇ．Ｋ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（２２）：６５３１−６５３５，（１９９０），参照により本開示に含まれる）、任意プライミングＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ Ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）（「ＡＰ−ＰＣＲ」）（ウェルシュ（Ｗｅｌｓｈ），Ｊ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（２４）：７２１３−７２１８，（１９９０），参照により本開示に含まれる）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（「ＤＡＦ」）（カエタノ・アノレス（Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：５５３−５５７，（１９９１），参照により本開示に含まれる）、マイクロサテライトＰＣＲまたはマイクロサテライト領域ＤＮＡ指定増幅（「ＤＡＭＤ」）（ヒース（Ｈｅａｔｈ），Ｄ．Ｄ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（２４）： ５７８２−５７８５，（１９９３），参照により本開示に含まれる）、および増幅断片長多型（「ＡＦＬＰ」）分析（ヴォス（Ｖｏｓ），Ｐ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３（２１）：４４０７−４４１４ （１９９５）；リン（Ｌｉｎ），Ｊ．Ｊ．，他，ＦＯＣＵＳ，１７（２）：６６−７０，（１９９５），参照により本開示に含まれる）を含むがそれらに限定されない。
【０２１４】
配列決定すべき核酸分子をＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩと配列決定反応混合物中で一旦接触させると、配列決定反応は上記で開示される手順または本分野で公知である手順に従って進行しうる。
【０２１５】
キット
一態様では、本発明は、ここで開示される通りのＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩを利用する核酸複製のためのキットを提供する。本発明に記載のキットは、少なくとも、ここで開示される通りの本発明に係るＤＮＡポリメラーゼＩを含む。
【０２１６】
好ましい一実施形態では、核酸増幅キットは、緩衝液、ヌクレオチド、またはここに記載される通りの、ヌクレオチドを含む緩衝液を含む。
【０２１７】
本発明に記載の核酸配列決定キットは、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩおよび好ましくはジデオキシヌクレオチド三リン酸を含む。配列決定キットは、標準的な核酸配列決定手順を実施するために必要な、たとえばピロホスファターゼ、配列決定ゲルを処方するためのアガロースまたはポリアクリルアミド媒体、および配列決定された核酸の検出に必要な他の成分のような、追加の試薬および化合物をさらに含みうる（ＤＮＡ配列決定の方法に関する米国特許第４，９６２，０２０ および ５，４９８，５２３を参照）。
【０２１８】
核酸増幅キットは好ましくは、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩおよびｄＮＴＰを含む。増幅キットは、標準的な核酸増幅手順を実施するために必要な、追加の試薬および化合物をさらに含みうる（ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の方法に関する、米国特許第４，６８３，１９５ および ４，６８３，２０２を参照、参照により本開示に含まれる）。
【０２１９】
別の好ましい実施形態では、本発明の核酸複製キットは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第２のＤＮＡポリメラーゼをさらに含みうる。好ましいのはＰｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴ、Ｔｌｉ／ＶＥＮＴ(、Ｔｍａ、Ｔｎｅ（３’ｅｘｏ＋）、およびその変異体および誘導体である。ＰｏｌＣもまた好ましい。
【０２２０】
一実施形態では、核酸増幅キットは、「縮重プライマー」を用いてＰＣＲ用途を実施するために必要な成分をさらに含みうる。「縮重プライマー」の語は、塩基多型を有するさまざまな相同配列へのアニーリングおよびその増幅を可能にするように、配列中の数箇所でいくつかの選択肢を有するプライマーをいう。
すなわち：
５’−ＴＣＧ ＡＡＴ ＴＣＩ ＣＣＹ ＡＡＹ ＴＧＲ ＣＣＮ Ｔ−３’（配列番号３５）
Ｙ ＝ ピリミジン ＝ Ｃ ／ Ｔ （縮重度＝ ２Ｘ）
Ｒ ＝ プリン ＝ Ａ ／ Ｇ （縮重度 ＝ ２Ｘ）
Ｉ ＝ イノシン ＝ Ｃ ／ Ｇ ／ Ａ ／ Ｔ
Ｎ ＝ ヌクレオチド ＝ Ｃ ／ Ｇ ／ Ａ ／ Ｔ （縮重度 ＝ ４Ｘ）
【０２２１】
縮重プライマー中に設計されうる、アミノ酸の高度に保存された領域またはモチーフの証拠がある；これらの領域は、種間で保存されている可能性がある。縮重プライマーは、次いで、これらの配列を釣り上げるのに使用されうる。この方法で増幅された配列は、次いで、配列が正しいことを確認するために配列決定されうる。それらは次いで、ゲノムライブラリ（原核）またはｃＤＮＡライブラリ（真核）から目的遺伝子を釣り上げるためのプローブとして使用されうる。
【０２２２】
一実施形態では、核酸増幅キットは、「リアルタイムＰＣＲ」用途を実施するために必要な成分をさらに含みうる。「リアルタイムＰＣＲ」の語は、蛍光シグナルの検出および定量に基づく系を表す。このシグナルは、反応中のＰＣＲ産物の量に比例して増加する。各サイクルで蛍光放出の量を記録することによって、ＰＣＲ産物の量における最初の顕著な増加が標的テンプレートの開始量と相関する、指数期の間のＰＣＲ反応を監視することが可能である。核酸標的の開始コピー数が多いほど、蛍光の顕著な増加が早く観察される。３〜１５サイクルの間に測定される、ベースライン値を上回る蛍光の顕著な増加は、蓄積したＰＣＲ産物の検出を示す。成分は、挿入色素、蛍光標識されたプライマーおよびプローブ、およびその誘導体を含むがそれらに限定されない。
【０２２３】
本発明のキットは説明書を含みうる。
【０２２４】
ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を含むベクター、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチドのいずれも、一般的に選択可能なマーカーおよび複製開始点を含むベクターに含まれうる。ベクターは、細菌またはウイルス分子に由来するもののような、適当な転写および／または翻訳調節配列をさらに含む。そのような調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および適当な配列を含む。プロモーターヌクレオチド配列がコード配列の転写を指示する場合、プロモーターヌクレオチド配列はコードＤＮＡ配列と調節可能に結合している。
【０２２５】
本発明の標的ポリペプチドをコードする分子のクローニングに適したベクターの選択は、ベクターが形質転換する宿主細胞、および、該当する場合は、標的ポリペプチドを発現するべき宿主細胞に依存する。適当な宿主細胞は上記で考察されているが、原核生物、酵母などの生物を含む。具体例は、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびサルモネラ属（ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＩ）の細菌、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のメンバー；サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、およびクルベロマイセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母を含む。
【０２２６】
本発明のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩは、非相同タンパク質またはペプチドをコードする配列と組み換えによって結合され、融合タンパク質構造物を生じうる。そのような非相同タンパク質またはペプチドは、たとえば、精製の向上、分泌の増大、または安定性の増大を可能にするために含められうる。たとえば、シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードする核酸配列は、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるように、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩ配列とフレーム内で融合されうる。
【０２２７】
特定ベクターへの挿入、特定発現系または宿主での使用の容易さ（たとえば、制限部位を改変することによる）、などを促進するための、本発明のポリヌクレオチド分子をコードするＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩの改変は、公知でありおよび本発明での使用が考慮されている。ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩポリペプチドの作製のための遺伝子工学的方法は、無細胞発現系、細胞系、宿主細胞、組織、および動物モデルにおけるポリヌクレオチド分子の発現を含む。
【０２２８】
抗体
本発明の新規ポリペプチド、およびそのセグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生じるために使用されうる。抗体の設計および産生のための方法は本分野で知られており、たとえば、『抗体：実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびランド（Ｌａｎｄ）（編），１９８８コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；『モノクローナル 抗体，ハイブリドーマ：生物分析の新次元』（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ），ケネット（Ｋｅｎｎｅｔ）他 （編），１９８０プレナム・プレス社（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。
【実施例】
【０２２９】
例１：新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種−Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）−の「表現型特徴づけ、多座酵素電気泳動」（ＭＬＥＥ）による同定およびアイスランドの地熱部位からの環境分離体の１６Ｓ ｒＲＮＡ系統分析
計１０１検体の天然細菌分離体が、沿岸部（Ｓｎａｅｆｅｌｌｓｎｅｓ、ＯｘａｒｆｊｏｒｄｕｒおよびＲｅｙｋｊａｎｅｓ）、および低地（Ｈｖｅｒａｇｅｒｄｉ）および高地領域（Ｈｖｅｒａｖｅｌｌｉｒ、ＨｒａｆｎｔｉｎｎｕｓｋｅｒおよびＨａｇｏｎｇｕｒ）の両方を含む、アイスランドの８箇所の別々の地熱領域の水および堆積物から単離された。これらの場所は、植生および全体的な物理化学性が多様で、広い範囲のｐＨおよび温度、異なる水分活性および化学組成にわたった。採取から３時間後、試料をＲ２Ａおよび１６０培地上に塗沫し、および７２℃および７８℃にて１〜２日インキュベートした（スキルニスドティル（Ｓｋｉｒｎｉｓｄｏｔｔｉｒ）他２０００ｃ）（リーズナー（Ｒｅａｓｏｎｅｒ）およびゲルドライヒ（Ｇｅｌｄｒｅｉｃｈ）１９８５）。淡黄色のコロニーを取り、および１６０培地上での反復した塗沫によって精製した。増殖および特性検査は液体１６０培地または１６０寒天プレート上で７２℃にて実施した。１６０およびＲ２Ａ培地上で７２および７８℃にて１日インキュベートした後、直径２〜３ｍｍの淡黄色のコロニーが出現した。結果として生じたコロニーを１６０培地上でさらに精製した。
【０２３０】
多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）分析を、１０１検体のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種分離体を別々の遺伝的／分類学的系統と関連づけるために最初に実施した。したがって、この試験は、世界のさまざまな場所で分離された、系統保存機関に寄託された参考株を含んだ。米国イエローストーン国立公園で分離されたサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＹＴ−１株（基準株，ＤＳＭ ６２５）、ニュージーランドで分離されたサーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）Ｗａｉ３３ Ａ．１株（基準株，ＤＳＭ ４６８７，ＡＴＣＣ ４３２８０）、日本で分離されたサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ８株（基準株，ＤＳＭ ５７９，ＡＴＣＣ ２７６３４；旧名はフラボバクテイリウム・サーモフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）であった）、日本で分離されたサーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ＡＴ−６２株（ＤＳＭ ６７４，ＡＴＣＣ ３３９２３）、米国イエローストーン国立公園の温泉から分離されたサーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）ＹＳ３８株（基準株 ＮＣＩＭＢ １２６７６）、米国の人工地熱系から分離されたサーマス属未同定種（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）Ｘ−１株（ＡＴＣＣ ２７９７８）、およびアイスランドの水道湯から分離されたサーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）ＳＥ−１株（基準株 ＡＴＣＣ ５１５３２）。
【０２３１】
多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）は、任意の集団におけるいくつかの酵素の異なる対立遺伝子の分布をマッピングするために用いられる電気泳動法である。遺伝的関係は、共有される対立遺伝子の割合に基づく、遺伝子型の類似性から計算される。ＭＬＥＥは、多数の試料を同時に処理することができる安価な方法である。それはＤＮＡと比較できる：種の分離においてはＤＮＡハイブリダイゼーション、分類学的方法としては、種以下のレベルで非常に高感度であるため、階層分類により適している。ＭＬＥＥ分析のための細胞は下記の方法によって調製された。
【０２３２】
精製後、分離体を一夜６５℃にて１６０培地寒天プレート上で成育し、および掻き取って採集した。細胞をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．０）に懸濁して５ｍｌ中に約１ｇとし、および次いでフレンチプレスで７００ｐｓｉにて破砕した。粗抽出物を２００００ Ｘ ｇ にて３０分間４℃で遠心分離し、および上清を回収し、および−８０℃にて使用まで保存した。使用前に、試料を再び遠心分離し、および清澄な上清を回収した。試料を７．５ ％ （ｗ／ｖ） ポリアクリルアミドゲルで泳動し、および泳動後にゲルを、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）、エステラーゼ（ＥＳＴ）（非特異的）、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ヌクレオシドホスホリラーゼ（ＮＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）および非特異的デヒドロゲナーゼ（ＵＤＨ）についてアッセイした。酵素染色の実証は、０．２Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ８．０）がここでは用いられた以外は別に記載されている（マンチェンコ（Ｍａｎｃｈｅｎｋｏ）１９９４；ペツルスドティル（Ｐｅｔｕｒｓｄｏｔｔｉｒ）他２０００）。各酵素の特徴を示す電気泳動像は、負極移動度の降順に番号を付され、対応する構造遺伝子座にて対立遺伝子と結びつけられた。酵素活性の不在はヌル対立遺伝子が原因とされた。１０個の酵素遺伝子座にわたる対立遺伝子の特徴的な組み合わせ（多座遺伝子型）を電気泳動型（ＥＴ）とした。
【０２３３】
多座酵素電気泳動によって特徴づけられた１０１個のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）株間の遺伝的多様性および系統関係を、作者Ｄｒ．Ｔ．Ｓ．ホイッタム（Ｗｈｉｔｔａｍ）の好意で提供された、コンピューターソフトウェアパッケージＥＴＤＩＶおよびＥＴＣＬＵＳによって分析した。ＥＴまたは分離体のどちらかでの酵素遺伝子座における遺伝的多様性はＥＴまたは分離体での対立遺伝子頻度ｈ＝（１−Σｘｉ２）（ｎ／ｎ−１）から計算され、ここでｘｉは第ｉ番目の対立遺伝子の頻度であり、およびｎはＥＴまたは分離体の数である。平均遺伝的多様性（Ｈ）は、すべての遺伝子座にわたるｈ値の算術平均である。群内多様性ＨＳは、別々の試料採取場所（部分集団）について得られた多様性値の平均として計算された。総遺伝的多様性ＨＴは、全体としての集団について計算された多様性値である。細分された集団については、総多様性ＨＴは、部分集団内の多様性よりも大きくなる。ナイ（Ｎｅｉ）の遺伝子分化係数（ナイ他 １９８３）ＧＳＴを次いで、（ＨＴ−ＨＳ）／ＨＴとしてＥＴＤＩＶソフトウェアを用いて計算した。この係数は、全体の変動のうちどのくらい大きい割合が、部分試料間の分化が原因であるかを示す。参考株を含めた、すべての分離体の平均結合アルゴリズムに基づく樹状図を作成した（図参照）。距離はＥＴのペア間のミスマッチ遺伝子座の割合として測定した。ＥＴのペア間の遺伝的距離は、異なる対立遺伝子が存在した（ミスマッチ）酵素遺伝子座の割合として表し、およびＥＴのクラスター化を、遺伝的距離のマトリクスから、平均結合法（ＵＰＧＭＡ）によって実施した（コーガント（Ｃａｕｇａｎｔ）他 １９８７；ペツルスドティル（Ｐｅｔｕｒｓｄｏｔｔｉｒ）他 ２０００）。ＭＬＥＥ分析の結果を図に要約する。
【０２３４】
１０１検体のアイスランドのサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）株のＭＬＥＥ分析に基づき、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）の７つの別々のおよび遺伝的に高度に分岐した集団が観察された（図を参照）。系統のうち６つは、以前にアイスランドで見つかっている、有効に記載されたサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種の、Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．オシマイ（Ｔ．ｏｓｈｉｍａｉ）、Ｔ．スコトダクタス（Ｔ．ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）、Ｔ・アントラニキアニイ（Ｔ．ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ）および Ｔ．イグニテラエ（Ｔ．ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）に割り当てることができた。Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）および Ｔ．フィリフォルミス（Ｔ．ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）はアイスランドに近縁を持たないように見える。５つの分離体の１つの系統が明らかに新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種を表す。
【０２３５】
表現型分析および生理学的分析を、ＭＬＥＥ分析からの分離体の部分集合について実施した。この分析用に選択された分離体は、同一系統のおよび異なる地理上の領域に由来する、いくつかの異なるクローンを代表するように選択された。
【０２３６】
細胞形態を、１６０培地での増殖後、対数増殖期における位相差顕微鏡によって分析した。コロニー形態を、１６０培地寒天プレート上で１８時間６５℃にて増殖後にすべての株について測定した。すべての株をグラム染色した。
【０２３７】
増殖を温度５０、６５および７８℃にて１６０培地プレート上で調べた。増殖をｐＨ５．０、６．０、８．０、８．７および９．５にて１６０培地寒天プレート上で分析し、およびｐＨはＨＣｌおよびＮａＯＨを用いて調整した。
【０２３８】
塩およびイオン耐容を、０．５、１および２％ＮａＣｌ、５０ ｍＭ ＭｇＳＯ₄、５０ ｍＭ ＣａＳＯ₄、２ ｍＭ ＣｕＳＯ₄、５０ ｍＭ Ｎａ₂ＳＯ₄、５０ ｍＭ Ｎａ₂ＳＯ₃および５０ ｍＭ Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃を加えた１６０培地寒天プレート上で試験した。キレート剤ＥＤＴＡの存在下での増殖を、２および５ｍＭ ＥＤＴＡを加えた１６０培地寒天プレート上で分析した。
【０２３９】
単一炭素源の利用を、以前に記載した通り０．２〜０．４％有機化合物を含む最少培地寒天プレート上で試験した（クリストヤンソン（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ）他 １９９４；ペツルスドティル（Ｐｅｔｕｒｓｄｏｔｔｉｒ）他 １９９６）。増殖性を下記の単一炭素源について調べた：酢酸、アラビノース、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、カゼイン、クエン酸、ギ酸、フルクトース、ガラクトース、グルタミン酸、グルタミン、グルコース、グリセロール、ヒスチジン、アルファ−ケトグルタル酸、ラクトース、ロイシン、リジン、リンゴ酸、マルトース、オルニチン、プロリン、ピルビン酸、ラフィノース、ラムノース、セリン、ソルビトール、コハク酸、スクロース、デンプン、酒石酸、スレオニン、バリン、およびキシロース。
【０２４０】
抗生物質に対する感受性を、１６０培地プレート上で試験した。アンピシリン（１０μｇ）、バシトラシン（１０Ｕ）、クロラムフェニコール（３０μｇ）、ゲンタマイシン（１０μｇ）、ナリジクス酸（３０μｇ）、ペニシリン−Ｇ（１０Ｕ）、リファンピシン（２μｇ）、ストレプトマイシン（１０μｇ）、テトラサイクリン（３０μｇ）およびバンコマイシン（３０μｇ）を含むオキソイド社（Ｏｘｏｉｄ）６ｍｍディスクを用いた。阻止帯の直径を測定し、およびオキソイド社標準値に従って感受性を採点した。増殖性をすべての上記試験について１、３および５日間インキュベーション後に調べた。
【０２４１】
硝酸還元を、マイクロタイタープレートを用いる改変を用い、以前に記載された通り、２および５日齢培養を用いて試験した（スミバート（Ｓｍｉｂｅｒｔ）他１９９４）。細胞形態を、１６０培地での対数増殖期に位相差顕微鏡法によって分析した。
【０２４２】
コロニー形態を、１６０培地寒天プレート上で１８時間増殖後に測定した。新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種系統のコロニーは、特徴的な拡散性コロニー形態を有し、および同一の生息地から採取された多数の他のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種よりも薄い黄色着色を有した。単一桿体が位相差顕微鏡法によって見られた。細胞は長さが２ないし４μｍおよび直径が０．６〜０．８μｍのさまざまなサイズであった。
【０２４３】
新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種系統のプレート上のコロニーについて最適増殖温度は約７０℃であった。プレート上の最大増殖温度は約８４℃であり、および最低増殖温度は４０℃であった。しかし、液体中では、最大増殖温度は８２℃であり、および４２℃未満では増殖は起こらなかった。新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種の全株が、約４．９ないし９．８のｐＨ増殖範囲を有し、ｐＨ最適範囲が広かった。
【０２４４】
塩耐容試験および炭素源利用の結果を図４ａおよび４ｂに示す。新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種系統の全株が、０．５および１％ＮａＣｌで増殖したが、２％塩濃度では増殖しなかった。単一炭素源として試験された３６種類の異なる化合物のうち、すべての新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種株は、酢酸、アラビノース、アルギニン、ギ酸、ガラクトース、グルタミン、グルコース、グリセロール、プロリン、ピルビン酸、ソルビトール、スクロース、デンプン、およびキシランレマゾールブリリアントブルーを利用できた。新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種系統の１株であるＩＴ−２７９５はまた、ヒスチジンおよびロイシンを利用できた。
【０２４５】
すべての新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種株は、リファンピシンおよびナリジクス酸に耐性の試験結果になったが、しかしＩＴ−２７９５株はまたゲンタマイシンに耐性であった（図４ｂ参照）。
【０２４６】
カタラーゼ活性の存在を、３％（ｖ／ｖ）過酸化水素溶液を用いて試験し、およびオキシダーゼ活性を１％（ｗ／ｖ）テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミンの室温での酸化によって測定した（スミバート（Ｓｍｉｂｅｒｔ）およびクリーグ（Ｋｒｉｅｇ）１９９４）。すべての株はグラム陰性であり、および胞子を生じなかった。すべての株の新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種は、オキシダーゼ、カタラーゼおよび硝酸還元について陽性であった。最も特徴的な表現型特性として、５つの新規サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種株のどれもチオ硫酸酸化の能力が無く、一方、同一の生息地から分離されたＴ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．イグニテラエ（Ｔ．ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）、Ｔ．スコトダクタス（Ｔ．ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）、Ｔ．オシマイ（Ｔ．ｏｓｈｉｍａｉ）の株の大多数が、チオ硫酸酸化について陽性試験結果になった（図５参照）。
【０２４７】
系統試験のための株は、ＭＬＥＥ分析によって得られたＵＰＧＭＡクラスター化に基づいて選択された。各系統のいくつかの代表の系統位置は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を系統マーカーとして用いて部分配列決定によって定めた。下記の株を分析した：１６５、２２０、３４６、２１０１、２１０３、２１２０、２１２３、２１２１、２１２６、２１２７、２１３３、２１３５、２７８９、２７９１、２７９５、および６２３０。ＤＮＡは、ダイナビーズＤＮＡダイレクト（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＤＮＡ Ｄｉｒｅｃｔ）キット（ダイナル社（Ｄｙｎａｌ））を用いて取扱説明書に従って単離された。ダイナザイム（ＤｙＮＡｚｙｍｅ）ポリメラーゼ（フィンザイムズ社（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ））を取扱説明書に従って用いることによって、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅を実施した。プライマーセットはＦ９およびＲ１５４４から成った（スキルニスドティル（Ｓｋｉｒｎｉｓｄｏｔｔｉｒ）他、２００１）。反応は下記の通りであった：２５サイクル９５℃にて５０秒、５２℃にて５０秒、および７２℃にて３分間。ＰＣＲ産物の配列決定前に、ＰＣＲ産物を、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮＩ））を用いて取扱説明書に従って精製した。株由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシークエンサーで、ビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）ターミネーターサイクル配列決定迅速反応キットを用いて取扱説明書に従って配列決定した（ＰＥアプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））。プライマーＲ８０５（５’−GACTACCCGGGTATCTAATCC’−３； ８０５−７８５）（配列番号：４２）を配列決定に用いた。ＢＬＡＳＴ検索後、配列を、リボソーム・データベース・プロジェクト（マイダク（Ｍａｉｄａｋ）他 １９９９）から得られたサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）群内の他の配列と、およびドイツのミュンヘン工科大学微生物学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＡＲＢデータベースアライメント（Ｗ．ルドヴィヒ（Ｌｕｄｗｉｇ），ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｉｋｒｏ．ｂｉｏｌｏｇｉｅ．ｔｕ−ｍｕｅｎｃｈｅｎ．ｄｅ／ａｒｂ／ａｂｏｕｔ．ｈｔｍｌ）を用いることによって、手動でアライメントした。ＡＲＢデータベースのフィルターに基づく相同塩基位置を、アライメントに含め、および比較分析に用いた。進化距離を、対類似性から、ジュークス（Ｊｕｋｅｓ）およびカンター（Ｃａｎｔｏｒ）の補正を用いることによって計算した（ジュークス他 １９６９）。距離樹は近隣結合アルゴリズムによって構築した。
【０２４８】
この分析で使用した生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は下記の通りである：サーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）ＳＥ−１（ＡＦ０３２１２７）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種 ＮＭＸ２ Ａ．１（Ｌ０９６６１）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種 ＶｉＩ７（Ｚ１５０６１）、サーマス・アントラニキアニイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ）ＨＮ３−７（Ｙ１８４１１）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種 ａｃ−１（Ｌ３７５２０）、サーマス・イグニテラエ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）ＲＦ−４（Ｙ１８４０６）、ＳＲＩ２４８（ＡＦ２５５５９１）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＹＴ−１（Ｌ０９６６３）、未同定サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＯＰＢ３１（ＡＦ０２７０２０）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種ａｃ−７（Ｌ３７５２２）、未同定サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＯＰＢ３２（ＡＦ０２７０２１）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＹＳＰＩＤ Ａ．１（Ｌ１００７０）、未同定サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＯＰＢ１９（ＡＦ０２７０１９）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＢ−８（Ｘ０７９９８）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ＷＡＩ ３３ Ａ．１（Ｘ５８３４５）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種 ＹＳ３８（Ｚ１５０６２）、Ｔ．オシマイ（Ｔ．ｏｓｈｉｍａｉ）ＳＰＳ−１７（Ｙ１８４１６）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＹＳＰＩＤ Ａ．１（Ｌ１００７０）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＺＨＧＩＢ Ａ．４（Ｌ１００７１）、サーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ＡＴ−６２（Ｌ０９６６０）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種 Ｔｏｋ８ Ａ．１（Ｌ０９６６６）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種 Ｔｏｋ２０ Ａ．１（Ｌ０９６６５）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種 Ｗ２８ Ａ．１（Ｌ１００６８）およびサーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）未同定種 Ｔ３５１（Ｌ０９６７１）。
【０２４９】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列分析の結果として生じた、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）分離体および参照種の系統樹を図８に示す。すべてのサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種の部分１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のアライメントを図７ａおよび７ｂに示す。１６Ｓ ｒＲＮＡ樹状図のパターンは、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）分離体と既知のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種の関連についてのＭＬＥＥ分析の結果、および新規の独立した遺伝的系統の発見を確認した。５つの別々の分離体を含むこの新しい系統は、新規のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種を表す。該新種はグドムンドル・エガートソン（Ｇｕｄｍｕｎｄｕｒ Ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎ）に因んでサーマス・エガートソニイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）と命名された。１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定によると、この新しいサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種に属する分離体２１２３および２７８９は、Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（ＹＳ３８株）およびＴ．イグニテラエ（Ｔ．ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ）（ＲＦ−４株）と非常に近縁であり、それぞれ９８．３％および９７．８％配列類似性を与えた（表１参照）。しかし、ＭＬＥＥ結果に見られる通り、それはＴ．ブロキアヌスとは遺伝的に遠く、異なる対立遺伝子をすべての遺伝子座に有した。分離体の＃２７８９株がサーマス・エガートソニイの基準株として選ばれた（サーマス・エガートソニイＩＴ−２７８９）。
【０２５０】
表１ 異なる遺伝子座についてのサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）系統内の対立遺伝子頻度


【０２５１】
例２：Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）およびその最近縁Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）に由来する部分ｐｏｌＡ遺伝子配列のクローニングおよびサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）参照種の部分ｐｏｌＡ遺伝子配列とのアライメント
ファミリーＩ ＤＮＡポリメラーゼ、別名Ｐｏｌ Ａは、ブレイズワイト（Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ）およびイトー（Ｉｔｏ）（ブレイズワイト他，『ＤＮＡポリメラーゼの収集、アライメント、および系統分類的関係』（Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ，Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｔｉｃ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１ （１９９３） ７８７−８０２．参照により本開示に含まれる）によって示唆された通り、これらのポリメラーゼの活性部位を形成する、保存された配列モチーフを含む。これらのモチーフは、ブロックＡ，ＢおよびＣとしばしば呼ばれる、高度に保存された配列ブロックを含む （ジョイス（Ｊｏｙｃｅ）他，『ＤＮＡ ポリメラーゼにおける機能および構造関係』（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３ （１９９４） ７７７−８２２．，参照により本開示に含まれる）。サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種由来のいくつかのファミリーＡ ＤＮＡポリメラーゼのアライメントを、保存されたブロックＡおよびＣを用いて実施した。これらのモチーフ内の不変アミノ酸残基は、既知のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ポリメラーゼＩコード配列：Ａ−ｆｏｒｗ：５’−GCCGCCGACTACTCCCARATHGARHT−３’（配列番号：３６）およびＣ−ｒｅｖ：３’−CANGTRCTRCTCTACCACAAGCTCCCG−５’（配列番号：３７）からの縮重プライマーを推論することを可能にした。
【０２５２】
縮重ＣＯＤＥＨＯＰプライマー（ローズ（Ｒｏｓｅ）他，『遠縁配列の増幅のためのコンセンサス縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー』（Ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ−ｄｅｇｅｎｅｒｔｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｔａｎｔｌｙ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．） ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６ （１９９８） １６２０−１６３５．，参照により本開示に含まれる）は、さまざまなＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）株および１つのＴ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）分離体（＃１４０株）に由来するＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子（ｐｏｌＡ）の６００ｂｐ長コア断片を増幅することを可能にした。この遺伝子断片は、活性部位モチーフＡおよびＣの間の、Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼの最も保存的な領域を含むコード領域を包含する。
【０２５３】
結果として生じるＰＣＲ産物を１％ＴＡＥゲル上で分離し、および約６００塩基のバンドをゲルから切り出し、およびＧＦＸ，ＰＣＲ ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を取扱説明書に従って用いることによって精製した。５μｌの精製されたＰＣＲ産物を用いて、ＰＣＲで生じた６００ｂｐ断片をＴＯＰＡ−ＴＡベクター（ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングした。ＤＮＡライゲーション、コンピテント細胞形質転換およびコロニー平板播種および増殖のための条件は、取扱説明書に従った。各クローニング実験から数個のコロニーを取り、小スケールプラスミドＤＮＡ精製のための標準的な実験手順を用いて配列決定のためにプラスミドＤＮＡを単離した（マヌアチス（Ｍａｎｕａｔｉｓ）他、本文書に参照される通り）。サイクル配列決定反応は、ビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）ターミネーターサイクル配列決定迅速反応キット（ＰＥアプライド・バイオシステムズ社（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて取扱説明書に従って、Ｍ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いて実施した。
【０２５４】
Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）およびブロキアヌス（ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）由来のｐｏｌＡ遺伝子コア断片の、結果として生じるＤＮＡ配列をベクターＮＴＩソフトウェアパッケージ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバード（Ｃａｒｌｓｂａｄ））を用いてアミノ酸配列に翻訳した。ｐｏｌＡコア領域のこれらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８から２３および配列１７として本文書で参照される。
【０２５５】
ベクターＮＴＩソフトウェアパッケージのクラスタルＷ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ）アルゴリズムを用いて、Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）およびブロキアヌス（ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）部分ｐｏｌＡ配列を、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（配列番号：１６）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） （配列番号：１５）、Ｔ．フラブス（Ｔ．ｆｌａｖｕｓ）（配列番号：１３）、およびＴ．フィリフォルミス（Ｔ．ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（配列番号：１４）のＤＮＡポリメラーゼＩ由来の対応する配列領域とアライメントした。すべての部分サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種ｐｏｌＡアミノ酸配列のアライメントを図９に示す。
【０２５６】
表２は、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種ＤＮＡポリメラーゼの保存されたｐｏｌＡコア領域についての配列多様性分析の結果を示す。Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）および他のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種のｐｏｌＡ領域の間には、最も保存されたｐｏｌＡ領域でさえ、顕著な配列多様性が存在する。この結果はＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）が、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属ＤＮＡポリメラーゼＩファミリーの、独特の新規のメンバー（Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ）をコードすることを示す。Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）のｐｏｌＡ配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列およびＭＬＥＥ ＥＴについてそうであった通り、Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉと最も近縁な配列である。

【０２５７】
さらに、ｐｏｌＡコア領域の種内多様性を判定し、およびそれを最近縁種Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）とのｐｏｌＡ配列の種間多様性と比較するために、５つのＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）株由来の部分ｐｏｌＡ配列を互いに対してアライメントした（表３参照）。

【０２５８】
表３の結果は、５つのＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）株間の平均ｐｏｌＡ配列多様性は０．３％±０．３６％であることを示す。それはｐｏｌＡコア配列の１６６残基当たり１個のアミノ酸置換（０．６％多様性）よりも小である。
【０２５９】
Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）株の５つの別個のｐｏｌＡ配列を、最近縁種Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）の配列に対してアライメントする際、ｐｏｌＡコア配列内の種間多様性は、平均して２．７５％であり、たとえば１６６残基の配列内に４〜５アミノ酸置換である（表５参照）。Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）およびＴ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）間の平均ｐｏｌＡ種間配列多様性は、遺伝的に異なる地理集団に由来する別々のＴ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）株間の種内多様性より約７倍高く、Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）によってコードされるＤＮＡポリメラーゼＩは最近縁種Ｔ．ブロキアヌス（Ｔ．ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）のアナログ酵素とは異なるポリメラーゼであることが確認される。

【０２６０】
例３：Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）に由来する完全なｐｏｌＡ遺伝子配列のクローニングおよびサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）参照種のｐｏｌＡ遺伝子配列とのアライメント
Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）＃２４８株に由来する６００ｂｐ ｐｏｌＡ遺伝子断片のヌクレオチド配列を用いて、ジーンマイニング（ＧＥＮＥＭＩＮＩＮＧ）（商標）と呼ばれるＰＣＲを基礎とした遺伝子ウォーキング法を使用して、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩの完全なコード配列をクローニングした。この方法は、既知の配列の３’末端の下流および既知の配列の５'末端の上流の未知の配列をそれぞれ増幅するための２組のプライマーを用いる。２組のプライマーのそれぞれは、既知のｐｏｌＡ配列から推論された遺伝子特異的プライマーおよび任意３’末端配列を有する反対プライマーを含む。第３のプライマーが両方の組に加えられ、それは任意プライマーの５’末端側半分の配列を含む。この配列はまた、ＰＣＲ産物のクローニングを円滑化する２つの特異な制限部位を含む。３’末端が未知のｐｏｌＡ配列の増幅のためのプライマーセットでは、遺伝子特異的プライマーはフォワードプライマーであった。未知の５’末端のｐｏｌＡの増幅のためのセットでは、遺伝子特異的プライマーはリバースプライマーであった。下記の３つの任意プライマーを使用した：
Arb1: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT-3', (配列番号: 38)
Arb.2: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNACGCC-3, (配列番号: 39)
Arb.3: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'. (配列番号: 40)
【０２６１】
各ＰＣＲは以前に記載された任意プライマーＰＣＲ法に従って２回実施した（カエタノ・アノレス（Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ），『核酸のｉｎ ｖｉｖｏ増幅によるスキャン：新展開および用途』（Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４ （１９９６） １６６８−１６７４，参照により本開示に含まれる）。低いアニーリング温度での１回目（最大１０サイクル）には、遺伝子特異的プライマーと反対の適当な標的配列が見つかれば常に、任意プライマー１および２のどちらでもＰＣＲ断片の集団に組み込まれた。より高いアニーリング温度での２回目には、個別のＰＣＲ産物が任意混合物から増幅された。これらのＰＣＲ産物は、任意プライマー１または２のどちらか一方を一端に、および遺伝子特異的プライマーを反対端に組み込んでいた。
【０２６２】
得られたＰＣＲ産物を次いで、前述の通り、精製し、クローニングし、および配列決定した。前の回に決定された内部配列断片に特異的なネステッドプライマーの組を用いたその後の一連のＰＣＲによって、ｐｏｌＡ遺伝子のより保存度の低い隣接領域が得られた。ｐｏｌＡ遺伝子の完全なコード配列が得られた後、コード配列の５'−および３'−最末端に対する遺伝子特異的プライマーを設計した。このプライマーセットは、次いで、完全なＴｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ遺伝子を１個の断片として増幅するために用いられた。５'末端フォワードプライマーは、唯一のＥｃｏＲＩ制限部位を含んだ。３'末端フォワードプライマーは、唯一のＢｇｌＩＩ制限部位を含んだ。ベクターの唯一の制限部位ＥｃｏＲ−ＩおよびＢａｍＨＩを用いて、完全長ｐｏｌＡ ＰＣＲ産物を、ｐＢＴａｃ−１発現ベクター（べーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ），ペンツブルグ（Ｐｅｎｓｂｅｒｇ））へクローニングし、ｐｏｌＡ遺伝子を有するＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片を蓄積した。結果として生じるＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ発現ベクター−ＰＲＩ−ｐＳＯ４−の物理地図を図１３に示す。選択されたベクターｐＢＴＡＣ−１とは異なる種類の抗生物質耐性マーカー遺伝子、プロモーター配列および複製開始点を含む発現ベクタープラスミドを使用しうることは当業者によく知られている。
【０２６３】
例４：Ｔ．エガートソニイ（Ｔ．ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ）由来の完全なｐｏｌＡ配列の、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）参照種のｐｏｌＡ配列とのアライメント
完全長Ｔｅｇ、Ｔｂｒ、ＴａｑおよびＴｔｈＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、ソフトウェアパッケージ・ベクターＮＴＩ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），カールスバード（Ｃａｒｓｌｂａｄ））のクラスタルＷ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ）アルゴリズムを用いてアライメントした。アライメントの結果を、ＤＮＡ配列アライメントについて表６に、およびアミノ酸配列アライメントについて表７に要約する。完全なアミノ酸配列アライメントを図１１ａおよび１１ｂに示し、および対応する系統樹を図１２に示す。


【０２６４】
Ｔｅｇ ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ配列中のアミノ酸変異の大多数は、Ｎ末端５'−３'−エキソヌクレアーゼドメインに存在する。ポリメラーゼ内では、いくつかの非保存的アミノ酸置換が、ＤＮＡ基質結合、処理能力およびプライマー伸長に関与することが知られている領域で顕著である。以前に既に確立された通り、最高度の配列ホモロジーをＴｅｇＤＮＡポリメラーゼはＴｂｒＤＮＡポリメラーゼと共有するが、完全なｐｏｌＡ配列に対して、保存されたポリメラーゼコア領域よりも低いレベル（９５％）である。ＤＮＡレベル対アミノ酸レベルで配列ホモロジー間に顕著な差は無い。Ｔｅｇ、ＴｂｒおよびＴｔｈＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの配列と対毎にアライメントする場合、ほぼ全く同じ配列多様性（１３〜１４％）を示す。他のサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種の既知ＤＮＡポリメラーゼに対する完全なＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの、配列多様性の観察された程度は、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼがサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩファミリーの新規の独自メンバーであることを確立する。
【０２６５】
例５：ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼＩの発現
ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの発現のためのＰＲＩ−ｐＳＯ４ベクターは、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現するために使用できる発現ベクタープラスミドの一種の具体例である。当業者は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、および酵母菌ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）またはクリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）といった他の宿主生物における、Ｔｅｇ ＤＮＡポリメラーゼの発現に適した非常にさまざまな発現ベクタープラスミドに詳しい。当業者にとって発現宿主の別の可能な選択は、不死化哺乳類細胞株および昆虫細胞株である。特定発現ベクターの選択は、宿主生物およびその遺伝的背景によって制限されおよび規定される。
【０２６６】
１０ｎｇの精製されたＰＲＩ−ｐＳＯ４発現ベクタープラスミドを用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現細胞株Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ），マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））のコンピテント細胞を形質転換した。この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、コード配列が固有大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ分子に一致しない稀なコドンを有する非相同タンパク質の発現に、遺伝的に最適化されている。Ｒｏｓｅｔｔａｇａｍｉ （ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のコンピテント細胞を含む該形質転換キットはノバジェン社から購入した。形質転換手順，細胞増殖，平板播種および組み換えクローンの選択は、取扱説明書に従って実施した。３７℃にて１００μ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ−寒天プレート（テクノバ社（ＴｅｃｈＮｏｖａ））上で２４時間インキュベーション後、直径２〜３ｍｍの単独コロニーを選択した。
【０２６７】
ＰＲＩ−ｐＳＯ４ベクタープラスミド上のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの発現は、トリプトファンシンセターゼおよびβ−ラクタマーゼのための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子に由来するプロモーターの調節配列領域を含むハイブリッドＴＡＣプロモーターによって推進される。このプロモーターからの該遺伝子の転写は、エフェクター分子ＩＰＴＧの存在によって誘導される。液体増殖培地２ｘＹＴ（テクノバ社（ＴｅｃｈＮｏｖａ））中でＩＰＴＧ濃度１ｍＭを用いて、ＰＲＩ−ｐＳＯ４ベクターからのＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ発現を誘導した。使用する正確なプロモーターおよび発現ベクター構築物に応じて、他のエフェクター分子、たとえばラムノースまたはアラビノース、またはＩＰＴＧの他の濃度を使用しうることは当業者に公知の事実である。増殖培地中のエフェクター分子濃度の実験的最適化が、他の発現構造を有するＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの最適発現レベルを達成するために必要である。使用した増殖培地の組成についても同じことが当業者について言える。発現ベクタープラスミドを有する細胞の選択に用いられる抗生物質の選択および濃度もまた当業者によく知られている。使用したベクタープラスミドの正確な性質に応じて、テトラサイクリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコールといった他の抗生物質が使用されうる。
【０２６８】
エフェクター分子（ＩＰＴＧ）が添加された後の、ポリメラーゼの発現を始めさせるためのインキュベーション時間、たとえば誘導時間は、実験的最適化が必要なもう１つのパラメーターである。その目的で、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地５０ｍｌの入った３個のエルレンマイヤーフラスコに、それぞれＰＲＩ−ｐＳＯ４／ＲｏｓｅｔｔａＧａｍｉ−ｐＬｙｓＳ細胞の単独コロニーを接種した。５０ｍｌ培養を振とう機上で３７℃および２５０ｒｐｍにて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養がＯＤ₆₀₀０．７から０．８の密度に達するまでインキュベートした。この時点で、すべての液体培養の１ｍｌ試料を採取し、およびＩＰＴＧを３個の液体培養のうち２個に、終濃度１ｍＭとなるように添加した。培養試料中の細胞を、遠心分離によって採集し、および以降の処理まで−２０℃にて凍結した。残りの培養のインキュベーションを上記条件下で継続した。２時間後、ＩＰＴＧで誘導した第１の培養の細胞を遠心分離によって採集し、および−２０℃にて冷凍保存した。６時間後、第２のＩＰＴＧ誘導培養の細胞を採集した。すべての培養試料からの回収物を、１０μｇ／ｍｌリゾチームを含む１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｘ ｍＭ ＰＭＳＦ中で３０分間３７℃にて溶解した。溶解後、粗溶解物を不溶性画分（沈澱）および可溶性タンパク質画分（上清）へ高速遠心分離（２００００ｇ、２０分間）によって分離した。培養試料由来の両方の画分の部分試料を、等容のＳＤＳ−ゲル負荷緩衝液（バイオラッド社（Ｂｉｏｒａｄ））と混合し、５分間９５℃にて加熱し、および次いでクライテリオン（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（クライテリオン・トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌゲル４〜２０％勾配、バイオラッド社）に負荷した。タンパク質画分の電気泳動分離、および分離されたタンパク質のクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色は、取扱説明書に従って実施した。粗タンパク質画分中のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼタンパク質バンドの検出を円滑にするため、精製ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２μｇ）を電気泳動移動度マーカーとしてゲルに負荷した。誘導時間実験の電気泳動像を図１４に示す。ＩＰＴＧ誘導無しの培養の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ではポリメラーゼは発現されなかった。既に１ｍＭ ＩＰＴＧでの誘導の２時間後、正しいサイズのＴｅｇＤＮＡポリメラーゼバンドが、可溶性タンパク質画分に検出可能である。可溶性細胞画分中のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの量は、誘導の４時間後まで上昇し続ける。いつでもＴｅｇＤＮＡポリメラーゼバンドは不溶性細胞画分において特定できなかった。さらなる実験（データ記載せず）は、誘導の６時間後に、可溶性細胞画分中の発現されたＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの量は飽和したことを実証した。最大１２時間のさらなるインキュベーションは、ＲｏｓｅｔｔａＧａｍｉ細胞における可溶性ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの量を増加も減少もしなかった。次いで、３７℃にて６時間の誘導時間を以降のすべての実験に使用した。
【０２６９】
ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの大スケール精製のためのバイオマスを生産するために、２５０ｍｌフラスコ中での１００ｍｌ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地）前培養に、ＰＲＩ−ｐＳＯ４／ＲｏｓｅｔｔａＧａｍｉ細胞の単独コロニーを接種した。培養を２５０ｒｐｍおよび３７℃にて振とう機上で１６時間にわたって一夜インキュベートした。翌朝、それぞれ１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ培地各１Ｌ（３７℃に調整）の入った２．８リットルのエルレンマイヤーフラスコ４個に、前培養１ｍｌをそれぞれ接種した。これらの１Ｌ培養を３７℃および２５０ｒｐｍにて、ＯＤ₆₀₀が０．６から０．８の密度に達するまで増殖させた。この時、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加えた。誘導後、インキュベーションを同一条件下でさらに６時間継続した。その後、培養フラスコを氷上へ移動した。すべての培養フラスコの細胞を、５００ｍｌボトルで５０００ｒｐｍにて３０分間の遠心分離によって採集した。表８はバイオマス生産からのデータを要約する。

【０２７０】
例６：ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの大スケール精製
ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを精製するための一般的精製手順の概要を図１０に示す。該方法は４つの主な精製段階を用いる。最初に、粗細胞抽出物を７５℃にてインキュベートして、非熱安定性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主タンパク質を変性および除去する。第２に、総核画分を熱処理細胞抽出物から、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いる沈澱によって除去する。第３に、清澄化した上清を、硫酸アンモニウム沈澱によって分画する。第４の段階は、ブチル−セファロースでの疎水性相互作用クロマトグラフィーを含み、および最後の段階は、ヘパリン−セファロース上でのリガンドアフィニティクロマトグラフィーを含む。
【０２７１】
タンパク質抽出のために、前の段階で生産された湿細胞バイオマス２０ｇを、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＤＴＴ および ０．１％ ＰＭＳＦを含む細胞抽出緩衝液２００ｍｌに再懸濁した。粗細胞懸濁液を、超音波ミキサーを低設定（２〜３）（ＩＫＡ Ｔ１８）にて１から２分間ホモジナイズした。ホモジナイズした後、細胞懸濁液を氷上で１０から１５分間冷却して４〜８℃に調整した。
【０２７２】
次に、細胞をマイクロフルイダイザーで、冷却した懸濁液を毛細管に入口圧力１５ｋＰｓｉにて通すことによって破壊した。この段階は、より高い入口圧力３０ｋＰｓｉにてさらに２回実施した。通過の各回の間に、粗細胞抽出物を氷上で冷却した。細胞破壊の効率を、各段階後に、１００Ｘ倍レンズを装備した位相差顕微鏡下で監視した。通常は、マイクロフルイダイザー毛細管を３回通過後、全細胞の＞９０％が溶解した。最終細胞抽出物を氷上で１０分間冷却して４℃とした。
【０２７３】
熱処理のために、粗細胞抽出物を１００ｍｌポリプロピレン（ＰＰ）袋へ注意深く移し、それを次いで熱密封した。密封したＰＰ袋内に補足される空気が最小量となるように注意した。密封したＰＰ袋を、７５℃に調整した水浴に沈め、および４から５分間毎に袋を裏返しながら２０分間インキュベートした。２０分後、粗細胞抽出物入りのＰＰ袋を氷中で１０分間冷却した。次いで、変性したタンパク質画分を細胞抽出物から、２００００ｇ（１２０００ｒｐｍ）４０分間４℃の遠心分離によって除去した。
【０２７４】
次の段階で、核酸画分を、清澄化した細胞抽出物上清から、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて除去した。氷上で５分間にわたって緩やかな連続混合下で、濃縮ＰＥＩ溶液（１０％）をその終濃度が細胞抽出物中で０．１％に達するまで滴加した。ＰＥＩを含む細胞抽出物を、緩やかな連続混合下で２０分間氷上でさらにインキュベートした。２０分後、核酸沈澱を粗細胞抽出物から、２００００ｇ（１２０００ｒｐｍ）４０分間４℃の遠心分離によって分離した。
【０２７５】
遠心分離後、清澄化したＰＥＩ後の上清のイオン強度を、ブチルセファロースでのクロマトグラフィー分離用に細胞抽出物を準備するために調製した。１０分間にわたって、硫酸アンモニウム粉末を少量ずつ、緩やかな連続混合下で、飽和が２７．５％（細胞抽出物１００ｍｌ当たり硫酸アンモニウム１６ｇ）に達するまで加えた。２７．５％硫酸アンモニウム飽和で沈澱するタンパク質画分を分離するため、細胞抽出物を一夜４〜８℃にて１６時間インキュベートし、および次いで翌日２００００ｇ（１２０００ｒｐｍ）４０分間４℃で遠心分離した。ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは上清画分中に可溶のままである。
【０２７６】
次に、清澄化した細胞抽出物の伝導度を、少量の硫酸アンモニウム粉末またはブチルセファロースカラム平衡緩衝液のどちらかを添加することによって、ブチルセファロースカラム平衡緩衝液の伝導度の５〜１０ｍＳ以内に調製した。清澄化した細胞抽出物をカラムに負荷する前に、細胞抽出物を、５００ｍｌレシーバーボトル付きのミレックスＧＳステリカップ０．４５μｍ無菌ＰＥＳフィルターデバイス（ＭｉｌｌｅｘＧＳ−ＳｔｅｒｉＣｕｐ）、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を通して減圧ろ過した。
【０２７７】
第１のクロマトグラフィー分離のために、ベッド直径２ｃｍおよびベッド高１０ｃｍのファストフロー（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ）高置換ブチルセファロース（ＧＥヘルスケア（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））カラムを用いた。このカラムを、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１．２１Ｍ硫酸アンモニウム（たとえば２７．５％飽和）、および１ ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液で平衡化した。
【０２７８】
清澄化細胞抽出物をカラムに、１０ｍｌ／分の定流速で負荷した。その後、カラムを２カラム容（ＣＶ）のカラム平衡緩衝液で洗浄した。
【０２７９】
ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを含む画分は、ブチルセファロースカラムから流速１０ｍｌ／分で、硫酸アンモニウム塩濃度の段階的な低下勾配で溶出された。塩勾配は、さまざまな比のカラム平衡緩衝液および溶出緩衝液を、緩衝液勾配バルブで混合することによって形成された。０．５ＣＶにわたる勾配の第１の区分では、溶出緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度は１．２１Ｍから６６６ｍＭへ低下した。勾配の第２の区分では、溶出は硫酸アンモニウム６６６ｍＭの一定濃度で２ＣＶにわたって続いた。第３の勾配区分では、溶出緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度は、６６０ｍＭからゼロへ２ＣＶにわたって低下した。ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは勾配の第３区分にカラムから溶出する。画分は２ｍｌ量の部分標本として回収された。
【０２８０】
最高濃度のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを含む画分を決定するために、各溶出画分からの試料（１０μｌ）を４〜２０％クライテリオン（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）勾配ゲル（バイオラッド社（Ｂｉｏｒａｄ））でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。正しいサイズのＴｅｇＤＮＡポリメラーゼバンドを同定するために、精製ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２μｇ）をゲル上にマーカーとして負荷した。図１６はブチルセファロースカラムから溶出した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の電気泳動像の例である。
【０２８１】
最高量のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを含む画分をプールした。次に、プールしたＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ画分を、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴを含むヘパリンカラム平衡緩衝液に対して、１２から１６時間にわたって緩衝液を２回交換して透析した。透析後、プールしたＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ画分の伝導度を、カラム平衡緩衝液の伝導度へ調整した。調整されたＴｅｇＤＮＡポリメラーゼプールを次いでファストフロー（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ）ヘパリンセファロースカラム（ベッド高２０ｃｍ；ベッド直径２ｃｍ）に流速７ｍｌ／分で負荷した。試料負荷後、カラムを２ＣＶのヘパリンセファロース平衡緩衝液で洗浄した。
【０２８２】
ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを含む画分を、ヘパリンセファロースカラムから、流速７ｍｌ／分にて塩化カリウム塩濃度の直線増加勾配を用いて溶出した。塩化カリウム勾配は、さまざまな比のカラム平衡緩衝液および溶出緩衝液を、緩衝液勾配バルブで混合することによって形成された。ヘパリンセファロースカラム溶出緩衝液は、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．７５Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴを含んだ。溶出勾配は５ＣＶにわたる５０ ｍＭから７５０ｍＭ ＫＣｌの範囲の１区分で実施された。溶出画分は２ｍｌ量で回収した。ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼは塩化カリウム濃度０．６ないし０．７５Ｍの範囲で溶出した。
【０２８３】
最高濃度のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを含む画分を決定するために、各画分からの試料（１０μｌ）を４〜２０％クライテリオン（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）勾配ゲル（バイオラッド社（Ｂｉｏｒａｄ））でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。正しいサイズのＴｅｇＤＮＡポリメラーゼバンドを同定するために、精製ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２μｇ）をゲル上にマーカーとして負荷した。図１７はヘパリンセファロースカラムから溶出した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の電気泳動像の例である。
【０２８４】
最大量のＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを含む画分をプールし、および、４０ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、２００ ｍＭ ＫＣｌ、１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（シグマ社（ＳＩＧＭＡ））、１％イゲパール（ＩＧＥＰＡＬ）−Ｃ６３０（シグマ社）を含みグリセロールを含まない２Ｘ保存液に対して４８時間にわたって緩衝液を３回交換して透析した。最終の、プールしおよび透析したＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ画分を滅菌ろ過し（０．４５μｍＰＥＳフィルター）および、画分容の無菌のヌクレアーゼフリー９９％グリセロール（シグマ社）と混合して、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５％ツイーン２０、０．５％イゲパール−Ｃ６３０を含む最終保存緩衝液濃度を達成した。
【０２８５】
最終の精製ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼのタンパク質濃度を、ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）のキットを用いて取扱説明書に従って測定した。図１８は、精製された組み換えＴｅｇＤＮＡポリメラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の電気泳動像を、精製された組み換えＴａｑ−およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼの試料と比較して示す。ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの純度は、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼゲル試料のクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色されたタンパク質バンドの濃度測定定量分析による測定で＞９８％と判明した。表９はＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの大スケール精製の結果を要約する。

【０２８６】
例７：精製されたＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの比活性および活性濃度の測定
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの活性を測定するために開発された、非放射性の、ＰＣＲに基づく活性アッセイを用いた。アッセイは、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて増幅された、３５０ｂｐ ＰＣＲ産物（ヒトベータアクチン遺伝子の断片）の終点定量に基づく。すべての反応物の量（各ｄＮＴＰ２５０μｍｏｌ、テンプレートＤＮＡ５０ｎｇ、プライマー４０ｐｍｏｌ、およびマグネシウムイオン２．０ｍＭ）は、ＤＮＡポリメラーゼを除いて、過剰に与えられ、そのため活性ＤＮＡポリメラーゼの量が産物収量の唯一の制限因子となる。各サイクルでのプライマー伸長およびアニーリングの時間は各８秒間の絶対最短値に設定された。サイクルの総数は３０に設定され、ここで指数増幅期が産物飽和の段階に移行する。これらの条件下で、ＰＣＲ産物の終点量は、反応５０μｌ当たり０．２Ｕ〜０．８Ｕの範囲内でＤＮＡポリメラーゼの入力量の線形関数である。市販ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティカ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）；ＧＭＰ−Ｔａｑ）のロットが、製造元によって放射性プライマー伸長アッセイで５Ｕ／ｍｌに調整されているが、本アッセイで酵素標準物質（enzyme calibrator）として用いられた。
【０２８７】
精製されたＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの濃縮ストックから開始して、一連の酵素希釈物を、ポリメラーゼ保存緩衝液で表１０に概要を示す通り調製した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに対するＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの既知のタンパク質濃度を、標的濃度５Ｕ／μｌを含み、希釈の正しい範囲を定めるガイドとして用いた。

【０２８８】
完全な活性アッセイを標的濃度５Ｕ／μｌに近づけるため、酵素希釈物の範囲に狭めて、連続３回のＰＣＲ実験を実施した。１回目のＰＣＲで、反応５０μｌ当たり０．２μｌの各ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ希釈物を２連で、０．２μｌ（たとえば１Ｕ）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較した。反応設定を表１１に示す。反応に用いた１０ＸＴａｑ反応緩衝液は、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌおよび２０ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。アガロースゲル分析の電気泳動像を図１９に示す。ＰＣＲ産物収量の目視検査に基づき、ポリメラーゼ希釈物「１：１５」、「１：２０」および「１：２５」を選択して、２回のＰＣＲ活性測定アッセイを進行した。さらに２つの中間希釈物（「１：１７．５」および「１：２２．５」）を２回目の分析に加えた。

【０２８９】
２回目のＰＣＲアッセイについて、選択された酵素希釈物のそれぞれを、１：５に１ＸＴａｑ反応緩衝液で希釈し、反応各５０μｌへの少量酵素のより正確な投与を可能にした。Ｔａｑポリメラーゼ標準対照を相応に１ＸＴａｑ反応緩衝液で終濃度１Ｕ／μｌに希釈した。２回目のＰＣＲ反応は異なる設定をした。各ポリメラーゼ希釈物は３回の試験反応によって示された。試験反応の各組は、それぞれ０．６μｌ（０．６Ｕ）、０．８μｌ（０．８Ｕ）から１．０μｌ（１．Ｕ）の範囲の、３つの異なる量のＤＮＡポリメラーゼを用いた。Ｔａｑ標準ポリメラーゼを用いた反応を相応して設定した（表１２参照）。終点ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析の電気泳動像を図２０に示す。半定量ＰＣＲ産物収量パターンの目視検査に基づき、ポリメラーゼ希釈物「１：２５」が５Ｕ／μｌ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ標準酵素と最も等価であることが判った。

【０２９０】
確立された希釈係数「１：２５」を用いて、１ｍｌ量の調整されたＴｅｇＤＮＡポリメラーゼを作製し、および最終活性試験に供した。２回目のように、少量酵素の正確な液体操作を確実にするために、試験用のポリメラーゼストック溶液（５Ｕ／μｌ）をさらに１：５に、１ＸＴａｑ反応緩衝液を用いて希釈した。ここでは、各試験の組で４種類の異なるポリメラーゼ量（０．４、０．６、０．８、１．０μｌ）をＰＣＲ反応に加えて、それぞれ反応当たり０．４、０．６、０．８、および１．０単位を与えた。終点ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析の電気泳動像を図２１に示す。
【０２９１】
終点ＰＣＲ産物収量は、ルミイメージャー（ＬｕｍｉＩｍａｇｅｒ）（商標）ゲルスキャナ（ロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティクス社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））の専用ソフトウェアを用いて濃度測定によって測定した。各反応からの特定ＰＣＲ産物バンドのピーク面積を、対応する反応において使用したポリメラーゼの量（単位または容量）に対してプロットした（図２２参照）。その実験で比較した、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ標準物質を含む３種類のＤＮＡポリメラーゼのプロットを示す。
【０２９２】
比較した３種類すべてのポリメラーゼの増幅プロットの傾きは非常に類似しているが、しかしＴｅｇＤＮＡポリメラーゼのプロットは上方へシフトしている。Ｔｅｇ曲線の右側へ０．１ＵでのシフトがＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ活性プロットをＴａｑおよびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼ増幅曲線とアライメントするので、ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの１：２５希釈物の活性濃度は約１５％（５．８Ｕ／μｌ）上昇していることが判明した。濃縮ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの希釈は相応して調整された。活性アッセイの結果を用いて、濃縮ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼストック溶液の活性濃度および総活性を再計算した。結果を表１３に要約する。

【０２９３】
例８：Ｍ１３ｓｓＤＮＡ複製アッセイにおける伸長速度、および熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼの伸長速度は、プライミング（＋）鎖が５’−３’方向へ伸長される時間間隔当たり塩基数（秒当たり塩基）によって測定される。プライマーの伸長を秒当たりごくわずかの塩基によって直接検出することは不可能なので、測定のための反応（重合）時間を延長するために長い１本鎖テンプレート分子が用いられる。この場合、７．２ｋｂ長１本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡテンプレートを用いるＭ１３ファージ複製アッセイを使用して、Ｔｅｇ−、Ｔａｑ−およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼの伸長速度を比較して測定した。
【０２９４】
このアッセイでの臨界パラメーターは、一連の平行反応がさまざまな時間間隔で停止される、完全長２本鎖複製産物（７．２ｋｂ）が検出可能な最初の時点である。テンプレート鎖の塩基数での長さ（７２００）を次いで、秒での最短時間間隔で割って、プライマー伸長速度を計算する（秒当たり塩基）。
【０２９５】
完全長２本鎖複製産物の存在は、反応産物のアガロースゲル上での分離によって視覚化される。完全長複製産物を、Ｍ１３バクテリオファージの開環複製形Ｉ（ＲＦ−Ｉ）（Ｍ１３ｍｐ１８ ＲＦ−Ｉ ＤＮＡ，ニューイングランドバイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を含む参照ＤＮＡマーカー分子のバンドとゲル中で同時に泳動する。１本鎖Ｍ１３ｍｐ１８テンプレートＤＮＡは、すべての反応産物の前を最速で泳動する。部分的に２本鎖の、中間プライマー伸長産物は、明確なバンドを形成するのでなく、１本鎖テンプレートのバンドと完全長２本鎖複製産物のバンドとの間のどこかで拡散した雲状に泳動する（図２３参照）。
【０２９６】
すべてのプライマー伸長反応を２０μｌ量で６０℃にて実施した。反応は、Ｔｅｇ−、Ｔａｑ−、またはＴｂｒＤＮＡポリメラーゼのどれかを１単位、各ｄＮＴＰを２５０μｍｏｌ、０．３ｐｍｏｌのＭ１３リバースプライマー（−４８）２４量体（配列番号：４１；ニューイングランドバイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））でプライミングされたｓｓＭ１３ｍｐ１８を３７５ｎｇ（０．１５ｐｍｏｌ）、および３０ｍＭ ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｘ ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ８．７、５０ｍＭ ＫＣｌおよび２．０ｍＭ酢酸マグネシウムを含む１Ｘ反応緩衝液を含んだ。１本鎖テンプレートＤＮＡは、複製アッセイの前に別のハイブリダイゼーション反応でプライミングされた。プライマーハイブリダイゼーションは１０分間７５℃にて実施し、次いで３０分間室温にてインキュベートした。
【０２９７】
各プライマー伸長反応は、一定の時点でｄＮＴＰ基質の添加によって開始し、および目的の時間間隔経過後にＥＤＴＡの終濃度１０ｍＭとなるような添加によって停止した。１つのＤＮＡポリメラーゼについてのプライマー伸長反応の完全な組は９つの平行反応を含み、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、２４０、２７０および３００秒の反応時間間隔を包含した。
【０２９８】
３種類すべてのサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼについてのプライマー伸長速度アッセイの結果は電気泳動像で図２３に可視化される。２分３０秒、３分および３分３０秒が、完全長７．２ｋｂ複製産物がＴｅｇ−、Ｔａｑ−またはＴｂｒＤＮＡポリメラーゼのどれかについてそれぞれ検出可能になった最初の時点である。それはＴｅｇ−、Ｔａｑ−およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼそれぞれについてプライマー伸長速度として４０塩基／秒、３４．３塩基／秒および４０塩基／秒に変換される。これらの速度はＴｅｇ−およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼのいくつかの異なる精製ロットを用いて再現された。
【０２９９】
ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの伸長速度は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの速度より５塩基／秒速い。この差は顕著には見えないかもしれないが、しかし２つのポリメラーゼが７．２ｋｂテンプレートＤＮＡの複製を完了する際の３０秒間の時間差に繋がる。同一のＤＮＡテンプレートを、４０サイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの際立って最も重要な用途）で増幅すると、この小さな差は、実験の全過程にわたる総時間差２０分間に達する。本発明の当業者にとっては、迅速ＰＣＲサイクリング時間は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの最も望まれる用途特性の１つである。
【０３００】
例９：リアルタイムＰＣＲ用途におけるＴａｑ−およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼの安定性に対するＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの熱安定性
熱安定性は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの最も重要な性能特性の１つである。好熱性微生物由来の起源は、ＰＣＲまたは熱サイクル配列決定反応における不可逆的熱不活性化に対するＤＮＡポリメラーゼの十分な安定性に何ら保証を与えない。多数のＤＮＡポリメラーゼが、新規の機能性またはより良好な性能特性を求めて、好熱性細菌から単離されているが、不十分な熱安定性がそれらのＰＣＲでの有用性を限定している。そのような酵素の例は、ジオバチルス・ステロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔａｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラスマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）およびアクイフェックス・スピーシーズ（Ａｑｕｉｆｅｘ ｓｐｅｃ）種由来のＩ型ＤＮＡポリメラーゼである。そのリストに加えるべき別の一例がここでＴｂｒＤＮＡポリメラーゼによって示される。
【０３０１】
ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を測定するための標準試験は無い。実際の安定性は、試験に用いられる反応条件に依存して大きく変動しうる。希釈水系緩衝液中の純粋な単一酵素は、安定化共溶媒、基質および補因子の存在下よりも低い熱安定性を有する。純粋なＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、９５℃に曝露される際、半減期は５分未満である。「通常の」ＰＣＲ−反応条件下では、ｄＮＴＰ、プライミングされたテンプレートＤＮＡ基質およびポリメラーゼに結合するマグネシウムイオンが、安定化作用を発揮する。実際には、ＰＣＲ条件下での熱安定性だけが当業者に関連がある。
【０３０２】
Ｔａｑ−およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼと比較したＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を試すために、リアルタイムＰＣＲアッセイを選択した。試験は、実際のＰＣＲサイクリングプログラムを開始する前に、９５℃にて最大１５分間のＰＣＲ反応混合物の前インキュベーションを含んだ。リアルタイムＰＣＲは、生じたＰＣＲ産物のリアルタイムでの正確な相対定量を可能にする。リアルタイムＰＣＲアッセイで測定される閾サイクル数（Ｃ_T）は、増幅されたＰＣＲ産物の量の間接指標となる（テンプレートＤＮＡの入力量が一定に保たれる場合）。閾サイクルとは、増幅されたＰＣＲ産物から放出される蛍光がバックグラウンド蛍光のレベルを超える、ＰＣＲ実験中の最初のサイクルである。ＰＣＲ産物の量は、次いで、すべての試験反応中ですべての他の因子が一定に保たれる場合、反応中の利用可能な活性ＤＮＡポリメラーゼ量の直接指標である。したがって、実験中にありうる唯一の変数が、９５℃にて５ないし１０分間の範囲にある前増幅曝露時間であるように、すべての反応は単一のマスターミックスから準備された。
【０３０３】
図２５は、Ｔｅｇ−、Ｔａｑ−およびＴｂｒＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲ実験の正確な反応条件および増幅プロットを示す。９５℃への１５分間曝露さえ、ＰＣＲ性能、たとえばＴｅｇおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼの活性に対して、測定可能な負の影響は無かった。ＴｂｒＤＮＡポリメラーゼは、代わりに、負の影響を受けた。図２４のプロットは、９５℃での曝露時間対Ｃｔ値の２．５サイクル上方シフトを示す。
【０３０４】
例１０：ＤＮＡ合成忠実度ＴｅｇＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡポリメラーゼの合成忠実度とは、プライミング鎖の３’末端での「間違った」ヌクレオチドの取り込みを識別する能力である。「間違った」ヌクレオチドとは、テンプレート鎖の対向塩基とのワトソン／クリック型水素結合を取れない塩基を持つヌクレオチドをいう。ポリメラーゼ活性部位における立体構造変化の熱力学的制限は、「間違った」塩基識別の基礎となる機構を提供する。立体構造的制限は、「非ワトソン−クリック」塩基対のＤＮＡらせん歪みによって強制される。
【０３０５】
科学文献では、忠実度はエラー率の逆数としばしば混同される。ポリメラーゼのエラー率は複雑なパラメーターを表し、複製中にすべて同時に起こる３つの異なる処理の結果に依存する：ミスマッチ塩基の取り込み、ミスマッチ塩基の切り取り（たとえばエキソヌクレアーゼ校正）またはミスマッチ塩基の伸長。忠実度は第一の処理の結果だけを調節する。それはミスマッチ塩基取り込みおよび複製産物中にポリメラーゼ複製エラーを永続的に固定するミスマッチ伸長の協調作用を必要とする。
【０３０６】
１２種類の可能な塩基ミスマッチ組み合わせのそれぞれが、特定のらせん歪み特徴を有する。したがって、任意のポリメラーゼの合成忠実度は、１２の個別のミスマッチ塩基対忠実度の平均値を含む。Ｇ／Ｔ塩基対は、標準のワトソン／クリック塩基対と比較してＤＮＡ二重らせんに最小の歪みを生じる。Ｇ／Ｇ塩基対は歪みが大きいため、ＤＮＡポリメラーゼが複製中に未完成ＤＮＡ鎖のらせん内にそれを組み込むことはほぼ不可能である。したがってＧ／Ｔ塩基対またはＧ／Ｇ塩基対に対する識別は、１２種類の理論的に可能なミスマッチ塩基対の集団のうち、忠実度の最低および最高端をそれぞれ示す。ＤＮＡポリメラーゼの一般的な忠実度は、その両極の塩基対忠実度の平均として表すことができる。
【０３０７】
Ｔｅｇ−およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＧ／Ｔ−およびＧ／Ｇミスマッチ忠実度を、エコールズ（Ｅｃｈｏｌｓ）およびグッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ用に開発された定常状態動態ｄＮＴＰ取り込みアッセイを用いて測定した（エコールズおよびグッドマン，『ＤＮＡ複製における忠実度機構』（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０：４７７−５１１，１９９１，参照により本開示に含まれる）。同一のアッセイを用いて、該論文の著者らはＴａｑＤＮＡポリメラーゼの忠実度を測定するのに成功した。
【０３０８】
該「グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）」アッセイは、図２６に示す、プライミング（＋）鎖上に欠けた３'末端を有する部分２本鎖ＤＮＡテンプレート分子を用いる。プライミング鎖の５'末端は、プライマー伸長産物の検出および定量のために³²Ｐで標識されている。「Ｇ」は、ポリメラーゼによって入ってくるｄＮＴＰ基質とマッチされる必要のある、プライミング鎖の３'末端に隣接するテンプレート塩基を形成する。すべてのアッセイ反応における反応産物は、１塩基伸長されたプライマー鎖（ｎ＋１）であり、それはＰＡＡＧＥによって変性条件下で、伸長されていないＤＮＡテンプレート分子から分離される。
【０３０９】
各ポリメラーゼを、３'の欠けたプライミング鎖のｎ＋１位に、Ｔ／Ｇ、およびＧ／Ｇミスマッチ塩基対をを生じる能力について評価した。２組の反応を、２つの塩基ミスマッチ対のそれぞれについて実施した。第１の組の反応では、マッチするヌクレオチドｄＣＴＰの漸増濃度を用いた。第２の組では、ミスマッチのヌクレオチドの漸増濃度を用いた（ｄＧＴＰまたはｄＴＴＰのどちらか）。他のすべての反応物の濃度を、すべての反応について一定に保った。すべての反応を、３０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、５９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ８．７、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ酢酸マグネシウムを含む２０μｌ中で６０℃にて８分間にわたって実施した。
【０３１０】
反応を、ＥＤＴＡ／ホルムアミド含有試料負荷緩衝液の添加によって停止した。すべての反応産物を、２０％ＴＢＥ緩衝ＰＡＡＧで変性条件（８Ｍ尿素）下で平行して分離した。ゲル内の「ｎ＋１」プライマー伸長産物を、ホスホイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ）（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））によって検出しおよび濃度測定的に定量した。
【０３１１】
図２６および２７は、Ｔｅｇ−（図２６）およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（図２７）についての動態忠実度分析の結果を要約する。各電気泳動像上の明瞭な下側のバンドは、標識化され伸長されていないＤＮＡテンプレートを表し、それはすべての反応において定常状態動態のためにポリメラーゼ酵素より１０倍モル過剰に保たれた。テンプレートバンドの上の薄いバンドはｎ＋１プライマー伸長産物を表し、それを定量した。表１５はＴｅｇ−およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼの忠実度データを要約する。

【０３１２】
Ｇ／ＴミスマッチについてはＴｅｇＤＮＡポリメラーゼの忠実度はＴａｑの忠実度をわずかに上回るだけである一方、ＴｅｇはＧ／Ｇミスマッチについては１０００倍を上回る高い忠実度を示す。これはすべての用途についてＴｅｇＤＮＡポリメラーゼのＴａｑを上回る顕著な利益を表し、校正エキソヌクレアーゼ活性が関与していないためさらにその通りである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライミングされた１本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡおよび６０℃のインキュベーション温度を用いてＤＮＡ複製アッセイにおいて同一条件下で測定した場合、ＤＮＡポリメラーゼが＞３５塩基／秒であるインビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）プライマー伸長速度を有しおよびアミノ酸配列の配列番号：２または４を含むＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長速度より速い、好熱性ポリメラーゼ。
【請求項２】
ａ）測定対象の酵素が１０倍過剰で存在し、
ｂ）反応が等温条件下で実施され、
ｃ）緩衝液が３０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、５９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５０ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭ酢酸マグネシウムを含み、および
ｄ）ｐＨが８．７である
条件下で、アミノ酸配列の配列番号：２を含むＤＮＡポリメラーゼのｄＴＴＰ誤取り込みの頻度と比べて、ＤＮＡテンプレート鎖上のＧに向かい合った位置での正しいｄＣＴＰの取り込みに対してｄＴＴＰ誤取り込みがより低頻度である、請求項１のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
ａ）測定対象の酵素が１０倍過剰で存在する、
ｂ）反応が等温条件下で実施される、
ｃ）緩衝液が３０ｍＭビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、５９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、５０ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭ酢酸マグネシウムを含む、および
ｄ）ｐＨが８．７である
：条件下で、アミノ酸配列の配列番号：２を含むＤＮＡポリメラーゼのｄＧＴＰ誤取り込みの頻度と比べて、ＤＮＡテンプレート鎖上のＧに向かい合った位置での正しいｄＣＴＰの取り込みに対してｄＧＴＰ誤取り込みがより低頻度である、請求項１または２のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼが少なくとも一つの内因性エキソヌクレアーゼ活性を有し、ＤＮＡポリメラーゼが内因性５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
アミノ酸配列の配列番号：２を含むＤＮＡポリメラーゼと比べて、ミスマッチプライマーを伸長するためのより高い効率を有する、請求項１から４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
配列番号：６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、４４および２３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から７に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
請求項１から８の精製されたＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項８】
配列番号：６または４４の完全または部分アミノ酸配列を含む、キメラポリメラーゼ。
【請求項９】
請求項８の精製されたキメラポリメラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項１０】
配列番号：５または４３の任意の完全または部分核酸配列を含むベクター。
【請求項１１】
ａ）アミノ酸配列の配列番号：６、または１７〜２３のいずれか一つの全体または一部を含むＤＮＡポリメラーゼをコードする単離された核酸に調節可能に結合しているプロモーター領域、
ｂ）リボソーム結合部位、
ｃ）選択可能な代謝マーカー遺伝子、
ｄ）宿主細胞において機能的な複製開始点、および任意に
ｅ）ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列転写物の翻訳を促進する３’非翻訳配列領域
を含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
ａ）請求項１から８に記載の好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩ、任意に
ｂ）反応緩衝液、および
ｃ）任意にヌクレオチド
を含む核酸複製キット。
【請求項１３】
ＤＮＡ配列決定キットおよびＤＮＡ増幅キットの群から選択される、請求項１２に記載の核酸複製キット。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４ａ】

【図４ｂ】

【図５】

【図６】

【図７ａ】

【図７ｂ】


【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１ａ】

【図１１ｂ】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【公表番号】特表２０１０−５０５４３４（Ｐ２０１０−５０５４３４Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３１８２９（Ｐ２００９−５３１８２９）
【出願日】平成１９年１０月９日（２００７．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７２４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４３７６５
【国際公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】