シングルパスプロセスによるリポソームの製造
本発明はシングルパス様式でリポソームを製造する方法に関する。この方法は、多孔性デバイスを通して溶液または懸濁液を押し出し、続いてノズルを通して前記懸濁液または溶液を通過させることを含む。前記ノズルを通して懸濁液を通過させると、懸濁液または溶液が微粒化されて液滴になり、これをその後の噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥プロセスにおいて用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシングルパス様式におけるリポソームの製造法に関する。この方法は、脂質を含む溶液または懸濁液を、多孔質デバイスを通して押し出し、続いて前記溶液または懸濁液を、ノズルに通過させることを含む。
【０００２】
リポソームは水分をトラップした閉鎖二重層の脂質ベシクルである。リポソームは、単一の二重層膜により構成される単層ベシクル、または複数の同心二重層により構成される多重膜ベシクル（ＭＬＶ）であり得る。そのサイズに応じて、単層ベシクルはおおざっぱに、粒子サイズが約２５〜１００ｎｍである小単層リポソーム（ＳＵＶ）と、粒子サイズが約１００ｎｍ〜１０μｍの大単層リポソーム（ＬＵＶ）とに分類される。医薬用途に関しては、単層リポソームが多重膜リポソームよりも好適である。
【０００３】
近年、リポソームは薬物を送達するために医薬産業において重要な手段になってきている。疎水性薬物を脂質二重層中に組み入れることにより、この薬物をリポソーム中に配合する。親水性物質はリポソームの水性コア中に封入することにより配合することができる。リポソームは、薬物の身体への持続放出により薬物動態に影響を及ぼすことができるか、または薬物の遊離濃度を制限することにより副作用を軽減する。リガンドをリポソームと結合させるか、またはこれらの電荷を提供することにより、リポソームは目的とされる薬物の所望の作用部位への送達を促進する。薬学的用途に加えて、リポソームは化粧品にもしばしば用いられる。
【０００４】
食品用途に関して、リポソームは食品に風味および栄養素を付与するために用いられ、最近になって、食品を腐敗菌および病原菌の増殖に対して保護するのに役立つ食品抗菌剤を組み入れる能力について研究されてきた。
【０００５】
リポソーム製剤の医薬投与に関して、粒子サイズは重大なパラメータである。非経口投与について最適のサイズ範囲は約７０〜４００ｎｍである。このサイズ範囲内で、リポソームはある標的器官、例えば肝臓、脾臓および骨髄中への生体内分布に有利である。さらに、このサイズ範囲内のリポソームは血液中で良好な安定性を有し、予測可能な薬物放出速度を示す。４００ｎｍより大きいリポソームは凝集する傾向が高い。約５μｍのサイズで、循環中に注入されたリポソームは毛細血管を閉塞させ得る。したがってサイズ分布はリポソームの適用において重要な問題である。
【０００６】
リポソーム懸濁液を製造するために水性系中へ脂質をまず分散するための様々な主要な方法が開発されてきた。通常用いられる方法としては、乾燥脂質膜の所望の水性媒体での水和化（「フィルム法」、「ハンドシェイク法」）または脂質の有機溶媒溶液の水性媒体中への分散（エタノール／エーテル注入）が挙げられる。結果として得られるリポソーム懸濁液は通常、広範囲のサイズ分布および異種ラメラ性を有する。主に、ＭＬＶは初期生成物として観察できる。所望のサイズ範囲および均一性を有するリポソームを製造するために様々なサイズ処理法が開発されてきた。
【０００７】
リポソームは、より大きな多重膜リポソームの超音波処理によりサイズ別に分類することができる。結果として得られるリポソームは約２５〜８０ｎｍのサイズ範囲のＳＵＶである。しかし、狭いサイズ分布は約５０ｎｍより小さいリポソームサイズでのみ達成できる。ＳＵＶは限定された薬物封入能力ならびに望ましくない薬物動態および薬力学的特性を有しているので、超音波処理は薬学的用途に用いられるリポソームについて好適な方法ではない。この方法の他の欠点は、限定された処理体積、長い超音波処理時間、および熱ストレスにより脂質が酸化される可能性があることである。したがって、この方法は通常の工業生産にあまり好適ではない。
【０００８】
あるいは、大多重膜リポソームは高圧法によりサイズ別に分類し、均質化することができる。不連続プロセスでは、リポソーム懸濁液を、高圧（最高約１６０ＭＰａまで）で小オリフィスを通して、例えばＨｕｎｔおよびＰａｐａｈａｄｙｏｐｏｕｌｏｕｓ（米国特許第４，５２９，５６１号）またはＢｒａｎｄｌ等（国際特許出願公開第９６／０５８０８号）により記載されているような「フレンチプレス」装置を用いて押し出す。所望のサイズ分布が達成されるまでこのプロセスを繰り返す。均質化チャンバーまたは均質化ノズルは、例えばドイツ特許第３９０５３５４号または米国特許第６，３３１，３１４号に開示されている高圧ポンプを用いた使用のために特に設計されている。「高圧均質化」は、有機溶媒を使用することなく脂質／水分散液からリポソームを製造するためにも適している（Ｂｒａｎｄｌ，Ｍａｒｔｉｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒｓ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２ｎｄ Ｅｄ．）（１９９３），１，４９−６５）。典型的には、かなり広く多様な分布を有するＳＵＶが得られる。高圧ポンプの使用は、高圧でオリフィスを通る循環を可能にし、さらに大きなバッチサイズの処理を可能にする。さらに、プロセスは不連続方式で行われる。
【０００９】
約１００〜４００ｎｍの所定のサイズおよび狭いサイズ分布を有するＬＵＶを産生するために、均一孔サイズ膜を通してリポソーム懸濁液を押し出すことに基づくサイズ処理法が開発された（Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ １９７９，Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ １９７９）。好ましくは、通常約５０〜２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜をこの方法において用いる。膜孔サイズの選択により、所望のリポソームサイズをあらかじめ決定することが可能になる。均一性が高いリポソームを得るために、膜を通してリポソームを複数回押し出すことができる（Ｃｕｌｌｉｓ 国際特許出願公開第８６／００２３８号、Ｇｏｌｄｂａｃｈ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ａ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ． ＩＩ． Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９３）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃ，１９（９），２６２３−２６３６）。さらに大きなバッチサイズを処理するために、所望のサイズおよび多分散性が達成されるまで、ポンプにより膜を通してリポソーム製剤を押し出して連続的に再循環させることができる（Ｊａｎｏｆｆ、欧州特許出願公開第０４６０７２０号）。一般に、リポソームの多分散性は押し出しサイクル数が増加するとともに減少する。
【００１０】
狭く、明確なサイズ分布の生成物を得、必要な押し出しステップ数を減少させるために、数種の押出膜が従来技術において公知である。クモの巣様構造を有するポリマー膜を押出プロセスに適用することにより、Ｍｏｒａｎｏ等（米国特許第４，９２７，６３７号）は良好な多分散性を達成している。Ｍａｒｔｉｎ等（米国特許第４，７３７，２３２号）は非対称膜を開示し、一方、Ｓｕｄｄｉｔｈ（米国特許第５，５５６，５８０号）はリポソーム押出のために膜の代わりにフリットを使用する。
【００１１】
この方法を最適化するための様々な手段は、押出プロセスに高圧法を用いる。例えば、Ｓａｃｈｓｅ等（ドイツ特許第４３２８３３１号）は一連のスタッガード膜を通した押出に６．５ＭＰａの圧力を使用する。Ｈｉｌｌ等（米国特許第２００５／０２６０２５６号）は支持カセットホルダー中で親水性スクリーン膜を使用することにより押出に最高約５５ＭＰａまでを使用することを可能にしている。
【００１２】
薬物封入リポソームの薬学的用途に適合する必要がある、好適なサイズおよび狭いサイズ分布を有するリポソームの大規模製造のために、通常、高圧均質化または膜押出法のいずれかによるリポソーム材料の繰り返し処理がさらに必要である。したがって、適切なサイズのリポソームを連続して製造するためのシングルパス法は、これらの標準法を用いて実施することができない。
【００１３】
水性リポソーム製剤は通常、工業生産および供給プロセスに必要な長期間にわたって安定ではない。リポソームを保存するための標準法は水性リポソーム製剤の脱水である。脱水は、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥により達成することができ、どちらも懸濁液の微粒化を必要とする。
【００１４】
非経口適用に好適なサイズおよびサイズ分布を有するリポソーム懸濁液を製造するための連続法を提供することが、本発明の基本的な課題であった。かかるリポソーム懸濁液を製造し、その後の乾燥処理のために懸濁液を微粒化する連続法を提供することが本発明の別の課題であった。さらに、確立された標準物質の処理および使用の拡張性が望まれた。
発明の概要
本発明は懸濁液または溶液からリポソームを製造するための連続法を提供する。出発懸濁液または溶液は、好ましくは脂質粒子形態の脂質を含み、好ましくは水性媒体も含む。出発懸濁液中の脂質粒子は不均一なサイズであり、一方、この方法により得られるリポソームは均一なサイズにより特徴づけられる。この方法は、連続様式で、まず多孔質デバイスを通して懸濁液または溶液を押し出し、続いて懸濁液または溶液を、ノズルに通過させることを含む。この方法をシングルパス様式で行い、この場合、懸濁液または溶液を多孔質デバイスおよびノズルに１回だけ通して押し出す。好ましくは、この方法により得られるリポソームは均一なサイズである。本発明の方法により、出発懸濁液の脂質粒子の平均粒子サイズ分布はさらに小さな粒子サイズまで減少する。この方法は、脂質および製造されたリポソームの集団を含む溶液または懸濁液を提供することも含む。
【００１５】
このように、本発明はシングルパス様式でリポソームを製造する方法であって：
（ａ）脂質を含む懸濁液または溶液を提供し、
（ｂ）多孔性デバイスを通してステップ（ａ）の懸濁液または溶液を押し出し、次いで
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記懸濁液または溶液をノズルに通過させ、
（ｄ）場合によって、ステップ（ｃ）後に形成されたリポソームを回収することを含む方法に関する。
【００１６】
この方法は、好適なポンプにより生じる約１２００バールまでの高圧で行うことができる。好適なノズルにより懸濁液または溶液の流れを制限することによって、懸濁液または溶液の圧力は多孔性デバイスの両側でほぼ等しい。好ましくは、これを通してリポソームが押し出される多孔性デバイスは５０〜３００ｎｍ、さらに好ましくは１００〜２００ｎｍの孔サイズを有する。
【００１７】
膜を通した押出またはノズルもしくはオリフィスを通した高圧押出によるリポソームの均質化は従来知られていたが、２つの方法を組み合わせることにより、狭いサイズ分布および５０ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均サイズを有するリポソームの製造に好適な連続プロセスが得られることは予測できなかった。後者の生成物特性は非経口医薬適用におけるリポソームの使用に好適である。確立された押し出し技法によりこのような特性を得るためには、プロセスの連続セットアップを防止するいくつかの押出ステップを行う必要がある。
【００１８】
所定の孔サイズを有する多孔性デバイスを通したリポソームの押出はリポソームのサイズ分別のための限定法として既知である。したがって、続いてリポソームを、ノズルに通過させることによってリポソームのサイズ分布を改善できることはなおさら意外であった。リポソームのサイズ分布は、多分散性指数により特徴づけられる。このように、多分散性指数の減少は、サイズ分布の幅の減少を示唆する。
【００１９】
脂質を含む懸濁液または溶液が多孔性デバイス後に高圧下に維持されるならば、前記懸濁液または溶液を、ノズルに通過させることにより、噴霧／微粒化が可能になる。微粒化懸濁液を、噴霧乾燥または噴霧凍結プロセスにおいて通常行われるやり方で乾燥するかまたは凍結するかのいずれかに好適なデバイスで微粒化を行うことができる。好ましくは、乾燥／凍結は、その内容が参考として本明細書で援用される、２００６年１０月２７日に出願された共有欧州出願番号０６ ０２２ ５３８．０"Ｐｅｒｃｏｌａｔｉｖｅ ｄｒｕｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ"に開示されているパーコレーティブ乾燥により行うことができる。
【００２０】
リポソームを押し出し、噴霧乾燥または噴霧凍結するための連続法であって、脂質を含む出発懸濁液または溶液を、多孔性デバイスを通して押し出し、続いて懸濁液または溶液を、ノズルに通過させ、これにより懸濁液または溶液を微粒化することを含む方法を提供することは本発明のさらなる態様である。
【００２１】
本発明は、導管によりノズルに連結された多孔性デバイスを含む装置をさらに開示する。この装置は本発明により開示されるような方法を実施するのに好適である。
【００２２】
量の値に関連して「約」とは、表示値に基づいて、最大±２０％、好ましくは±１０％の平均偏差を意味する。例えば、約３０モル％のカチオン性脂質の量とは、全脂質／両親媒性物質モル濃度に関して３０モル％±６モル％、好ましくは３０モル％±３モル％のカチオン性脂質を意味する。
【００２３】
「活性化合物」とは、ヒトまたは動物の病気または疾患の診断、予防、または治療に有用な薬物として有用であることの基礎となる特定の生物活性を有する化合物、または化合物の混合物をいう。製剤原料、診断化合物およびワクチンは本発明の活性化合物の重要な例である。
【００２４】
「水性媒体」または「水性液体」は水を含む液状物質である。この物質は単一の液相、または２相もしくは多相系であり、ここで連続相は液体であり、水を含む。連続相が水性である水性懸濁液、分散液またはエマルジョンも水性媒体の例である。コロイド状物質を含む水性媒体は本明細書において以下、水性コロイド分散液または溶液と呼ぶ場合もある。
【００２５】
「低温流体」は、水溶液を凍結させるために必要な温度範囲で液状である物質であり、好ましくは−９０℃より低い温度で適用される。低温流体は低温流体と接触することによりその場で粒子および／またはペレットを凍結させることができる。
【００２６】
「ドレインディスク」とは、隣接する多孔性デバイスの孔サイズよりも大きな孔サイズを有するフィルター様構造を有するデバイスである。
【００２７】
「乾燥」または「脱水」は交換可能に用いられ、蒸発または昇華により水性媒体を除去するプロセスに関する。
【００２８】
「液滴の形成」とは、加圧噴霧、二流体噴霧、遠心分離液滴形成ならびにノズル様、例えばピエゾ液滴形成デバイス、音活性化、磁気および静電液滴形成デバイスなどにより微細粒子またはペレットに物質を変換することをいう。
【００２９】
「親水性賦形剤」とは、親水性特性を有する、薬学的に許容され、薬理学上実質的に不活性な物質を意味する。親水性とは、親水性賦形剤が実質的に水溶性であることを意味する。
【００３０】
本明細書において用いられる場合「均一性」または「均一な」とは粒子集団の狭いサイズ分布を意味する。高いサイズ均一性または狭いサイズ分布は低い多分散性指数により特徴づけられる。
【００３１】
「脂質」とは、水中に不溶性である脂肪、脂質、原形質のアルコール−エーテル可溶性構成要素成分を包含する一般名として通常の意味である。脂質は、脂肪、脂肪油、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質、アミノ脂質、色素脂質、および脂肪酸から構成される。この用語は、天然脂質および合成脂質の両方を包含する。本発明に関連する好適な脂質は：ステロイドおよびステロール、特にコレステロール、リン脂質、例えばホスファチジルおよびホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、ならびにスフィンゴミエリンである。脂肪酸が存在する場合、これらは、最高６個までの二重結合を含む約１２〜２４個の炭素鎖の長さであり得る。脂肪酸はグリセロール由来の骨格と結合する。１つの脂質内の脂肪酸は異なっているか（不斉）、または１つだけ脂肪酸鎖が存在し得る（例えばリゾレシチン）。特に非カチオン性脂質が天然源由来である場合、例えば卵黄、ウシ心臓、脳、もしくは肝臓、または大豆から精製されたレシチン（ホスファチジルコリン）である場合、混合配合物も可能である。
【００３２】
「リポソーム」は様々なサイズおよび構造の人工脂質二重層ベシクルである。単層ベシクルは水性空間を閉じ込めた単一脂質二重層により規定されるリポソームである。対照的に、オリゴまたは多重膜ベシクルはいくつかの膜を含む。典型的には、膜はおおよそ厚さ４ｎｍであり、両親媒性脂質、例えば天然源または合成源のリン脂質から構成される。場合によって、膜特性は、他の脂質、例えばステロールまたはコール酸誘導体を組み入れることにより修飾できる。低相転移温度（すなわち体温以下）を有するリン脂質ベースの特に柔軟な膜を有するリポソームは場合によってはトランスフェルソームと呼ばれる。
【００３３】
二重層膜の直径および数に応じて、リポソームは、多重膜ベシクル（ＭＬＶ、２以上の二重層、典型的には約１５０〜２００ｎｍ以上）、小単層ベシクル（ＳＵＶ、１つの単一二重層、典型的には約１００ｎｍ以下）、多小胞体ベシクル（ＭＶＶ、大ベシクル内の複数のベシクル構造）、および大単層ベシクル（ＬＵＶ、１つの単一二重層、典型的には約１００ｎｍ以上）に分類することもできる。
【００３４】
リポソームの化粧用途に関して、粒子サイズはあまり重要でないパラメータである。経皮投与のサイズ範囲は約７０〜４０００ｎｍである。このサイズ範囲内で、リポソームは真皮および経皮用途の適用に有利である。
【００３５】
本明細書において用いられる「ノズル」は、その中を流体が加速して高速流になる、様々な断面積を有する導管を意味する。流体をノズル中に送る前に高圧状態に圧縮しなければならず、ノズル中で液滴が崩壊して、その結果微粒化される。
【００３６】
「パクリタキセル」（本明細書においては類似体、配合物、および誘導体、例えば、デアセチルパクリタキセル、デアセチル−７−エピパクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール（ドセタキセルの配合物）、パクリタキセルの１０−デスアセチル類似体およびパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル−３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル類似体を包含すると理解すべきである）は当業者に周知の技法（国際特許出願公開第９４／０７８８２号、同第９４／０７８８１号、同第９４／０７８８０号、同第９４／０７８７６号、同第９３／２３５５５号、同第９３／１００７６号；米国特許第５，２９４，６３７号；第５，２８３，２５３号；第５，２７９，９４９号；第５，２７４，１３７号；第５，２０２，４４８号；第５，２００，５３４号；第５，２２９，５２９号；および欧州特許出願公開第５９０，２６７号も参照）を利用して容易に製造できるか、または例えばＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａのＴ７４０２；もしくはＴａｘｕｓ ｙａｎｎａｎｅｎｓｉｓのＴ−１９１２）をはじめとする様々な商業的供給源から得ることができる。パクリタキセルはパクリタキセルの一般的な化学的に入手可能な形態だけでなく、類似体（例えば、前述のようにタキソテール）およびパクリタキセル複合体（例えば、パクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセルデキストラン、またはパクリタキセル−キシロース）も意味すると理解するべきである。
【００３７】
本明細書において用いられる「タキサン」という用語は、微小管作用機構を有し、独自のタキサン環構造および細胞増殖抑制作用に必要な立体特異的な側鎖を含む構造を有する抗腫瘍薬の種類を意味する。「タキサン」という用語には、親水性誘導体、および疎水性誘導体のどちらも包含する様々な既知誘導体が含まれる。タキサン誘導体としては、国際特許出願公開第９９／１８１１３号に記載されているガラクトースおよびマンノース誘導体；国際特許出願公開第９９／１４２０９号に記載されているピペラジノおよび他の誘導体；国際特許出願公開第９９／０９０２１号、国際特許出願公開第９８／２２４５１号、および米国特許第５，８６９，６８０号に記載されているタキサン誘導体；国際特許出願公開第９８／２８２８８号に記載されている６−チオ誘導体；米国特許第５，８２１，２６３号に記載されているスルフェンアミド誘導体；ならびに米国特許第５，４１５，８６９号に記載されているタキソール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「熱感受性」、「温度感受性」または「熱不安定性」とは、物質が噴霧乾燥などの熱により水を蒸発させることに基づく乾燥法に不適合であることを意味する。言い換えると、熱不安定性物質はこのような熱乾燥法により処理される場合、その構造、活性、機能または化学的純度の少なくともいくつかを失って、生成物が薬学的に許容できなくなり得る。
【００３９】
「薬学的に許容される」とは、活性成分の生物活性の効果を妨げず、投与された宿主に対して有毒でない任意の物質を包含することを意味する。
【００４０】
「多分散性」とは、所定の粒子試料における粒子サイズ分布の幅である。多分散性は多分散性指数により特徴づけられる。
【００４１】
「多分散性指数」（ＰＤＩ）は所定のリポソーム試料中の粒子サイズ分布の幅の評価である。ＰＤＩの計算前に、粒子サイズを動的光散乱（ＤＬＳ）により決定する。この技法は、粒子がブラウン運動をするために起こる散乱された光の強度における時間依存性変動を測定する。これらの強度変動の分析により、粒子の拡散係数の決定が可能になり、この拡散係数をサイズ分布に変換する。これらのパラメータの計算は、ＩＳＯ規格文書１３３２１：１９９６ Ｅで定義されている。
【００４２】
「シングルパス様式」または「シングルパスプロセス」とは、処理物質が処理ステップを１回だけ通過する方法をさす。したがって、本発明の方法において用いられる懸濁液、溶液またはリポソームは、本発明において用いられる多孔性デバイスまたはノズルに１回だけ通過する。
【００４３】
本発明において使用される脂質粒子はリポソーム、脂質複合体、固体脂質ナノ粒子、リポプレックス、ニオソーム、ミセルもしくは混合ミセル、オリゴ−もしくは多重膜ベシクルであってもよい。好ましくは、脂質粒子はリポソームである。リポソームがカチオン性リポソームであるのが本発明の最も好適な実施形態である。方法は、両親媒性分子、例えば界面活性剤の結合により形成される粒子を用いることもできる。リポソームと対照的に、これらの構造は、安定性が低く、希釈により分解する傾向がある単層に基づく。ミセルは例えば、その教示が参考として本明細書で援用される国際特許出願公開第０２／０８５３３７号および欧州特許出願公開第７３０ ８６０（Ａ）号に開示されている。
【００４４】
脂質または脂質粒子は、水性媒体を含む懸濁液または溶液で提供される。水以外に、本発明の水性媒体は、水と少なくとも部分的に混和性である１以上のさらなる液体構成要素、好ましくは有機溶媒、さらに好ましくはアルコール（例えばＣ1-4アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびこれらの組み合わせなど）またはケトン（例えばＣ1-4ケトン、例えばアセトン、メチルエチル−ケトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯおよびこれらの組み合わせなど）を含んでもよい。本発明の好適な実施形態において、水性媒体は水または水およびエタノールの混合物である。水とさらなる液体構成要素間の比は好ましくは約９９．９：０．１〜約１０：９０（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは約７０：３０〜約４０：６０（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約８０：２０〜約６０：４０（ｖ／ｖ）である。
【００４５】
前記有機溶媒、好ましくはエタノールを記載された比で、本発明のさらなる実施形態と組み合わせて使用することにより、単層リポソームを生成させるための従来公知の系よりも優れた様々な利点、例えば次のようなものが得られる：
１）この方法の結果、非常に小さく均一なリポソームが得られる；
２）高い脂質濃度（例えば、約１００ｍＭ）を使用して、高い封入効率を容易に達成できる；
３）減少した粘度は流動性の増加につながり、脂質懸濁液または溶液の高い流速を可能にする；
４）有機溶媒の使用は、蒸発プロセスの間の乾燥温度の低下につながる。
【００４６】
本発明により製造されるリポソームは異なるサイズ、ラメラ性および構造を有し得る。好ましくは、本発明の方法により製造されるリポソームは約５０ｎｍ〜約５００ｎｍの平均直径を有する。最も好適なのは、約５０〜約２００ｎｍのサイズである。好ましくは、リポソームは単層リポソームである。
【００４７】
本発明の文脈の中で用いられる懸濁液または溶液、脂質粒子またはリポソームは、中性、アニオン性および／または好ましくはカチオン性脂質を含み得る。カチオン性脂質は好ましくは、全リポソーム形成脂質の少なくとも約３０モル％の量、さらに好ましくは少なくとも４０モル％の量、そして最も好ましくは少なくとも５０モル％の量で含まれる。中性またはアニオン性脂質は、ステロールまたは脂質、例えばコレステロール、リン脂質、リソ脂質、リソリン脂質、スフィンゴ脂質または中性もしくは負の正味電荷を有するペグ化脂質から選択することができる。有用な中性およびアニオン性脂質としてはしたがって：ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（特定の糖に限定されない）、脂肪酸、ステロール、カルボン酸基を含むもの、例えばコレステロール、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、例えばこれらに限定されないが１，２−ジオレイルホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジヘキサデシルホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、１，２−ジアシル−グリセロ−３−ホスホコリン、例えばこれらに限定されないが１，２−ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミチルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリスチルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン、好ましくは卵ＰＣ、大豆ＰＣおよびスフィンゴミエリンが挙げられる。グリセロール骨格と結合した脂肪酸は特定の長さまたは二重結合の数に限定されない。リン脂質は２つの異なる脂肪酸も有し得る。好ましくは、さらなる脂質は室温で液晶状態であり、使用されるカチオン性脂質とこれらが適用される比で混和性である（即ち、均一相を形成することができ、相分離またはドメイン形成が起こらない）。好ましい実施形態において、中性脂質は１，２−ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。さらに、中性および／またはアニオン性脂質はポリ（エチレン）グリコール鎖を含み得る。
【００４８】
カチオン性脂質は好ましくはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＴＡＰ）塩、好ましくは塩化物またはメチル硫酸塩を含む群から選択することができる。ＴＡＰ脂質ファミリーの好適な代表例は、ＤＯＴＡＰ（ジオレオイル−）、ＤＭＴＡＰ（ジミリストイル−）、ＤＰＴＡＰ（ジパルミトイル−）、またはＤＳＴＡＰ（ジステアロイル−）である。本発明の他の有用な脂質としては：ＤＤＡＢ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；１，２−ジアシルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン、（これらに限定されないが：ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイルおよびジステアロイルを包含し；さらに２つの異なるアシル鎖がグリセロール骨格と結合することができる）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、（これらに限定されないが：ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイルおよびジステアロイルを包含し；さらに２つの異なるアシル鎖はグリセロール骨格と結合することができる）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、（これらに限定されないが：ジオレイル、ジミリスチル、ジラウリル、ジパルミチルおよびジステアリルを包含し；さらに２つの異なるアルキル鎖はグリセロール骨格と結合することができる）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ−アセテート（ＤＯＳＰＡ）；β−アラニルコレステロール；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）；ジＣ１４−アミジン；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシルアミノ−プロピオンアミジン；１４Ｄｅａ２；Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）；Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（トリメチルアンモニオ−アセチル）ジエタノールアミンクロリド；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシルエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタン−ジアンモニウムヨージド；Ｓｏｌｏｄｉｎ等（Ｓｏｌｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）により記載されているような１−［２−（アシルオキシ）エチル］２−アルキル（アルケニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド誘導体、例えば１−［２−（９（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−（８（Ｚ）−ヘプタデセニル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、１−［２−（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］−２−ペンタデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＰＴＩＭ）、２，３−ジアルキルオキシプロピル第四アンモニウム化合物誘導体、Ｆｅｌｇｎｅｒ等（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４）により記載されているような第四アミン上にヒドロキシアルキル部分を含むもの、例えば：１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰ）、１，２−ジオレイル−オキシ−プロピル−３−ジメチル−ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−ＨＢ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシペンチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−Ｈｐｅ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシルエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジパルミチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＰＲＩＥ）、１，２−ジステリルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＳＲＩＥ）；Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ等（米国特許第５，４９８，６３３号）により報告されているようなアシルカルニチンのカチオン性エステル；ホスファチジルコリンのカチオン性トリエステル、即ち１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−エチルホスホコリン（ここで、炭化水素鎖は、Ｃ12〜Ｃ24の鎖長を有し、飽和または不飽和および分岐または非分岐鎖あってよい）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、カチオン性脂質は異なっていても、同一であってもよい２つのアシル鎖を含む。
【００４９】
本発明の方法により得られる脂質、好ましくは脂質粒子、およびリポソームを含む出発懸濁液または溶液が活性化合物を含み得ることは、本発明の一態様である。好ましくは、活性化合物は薬学的に活性な化合物である。活性化合物をリポソームおよび／または脂質粒子内に組み入れることができるか、またはリポソームおよび／または脂質粒子と結合させることができる。例えば、リポソームの場合、親水性活性化合物をリポソームの水性内部空間内に封入することができ、一方、親油性活性化合物は通常、膜形成脂質と結合する。脂質ナノ粒子の場合、親油性化合物はまた、かかるナノ粒子のマトリックス内に容易に組み入れられる。
【００５０】
リポソームおよび／または脂質粒子は、活性化合物、特に容易に効率よく送達されない薬学的に活性な化合物、例えば非常に難溶性の化合物、感受性（熱不安定性を含む）活性化合物、ペプチド、タンパク質、および核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドの特に好適な薬物担体である。別の好適な活性化合物群は、コロイド状形態でさらに効率よく送達されるものであり、その理由は、静脈内注射後の生物におけるコロイドの分布は、有効性または副作用に関して化合物の溶液の投与よりも有利であるからである。薬学的に活性な化合物の好適な例としては、これらに限定されないが、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および細胞増殖抑制剤または細胞毒性薬が挙げられる。かかる薬剤の例としては、ドキソルビシン、ミトキサントロン、およびアンホテリシンＢが挙げられる。
【００５１】
本発明の文脈内で用いられるリポソームは疎水性薬物のカプセル化に特に適している。例は、タキサン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ミケラミンＢ、ビンクリスチン、および白金化合物、例えばシスプラチンである。かかる疎水性薬物の好適な例は、パクリタキセル、ドセタキセルおよびカンプトテシンであり、これらは水中の溶解度が低い、および／または熱感受性である。
【００５２】
本発明の特に好適な実施形態において、この方法により得られるリポソームは、ＤＯＴＡＰクロリドの形態で使用されるＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＣおよびパクリタキセルを、好ましくは約５０：４７：３の比で含む。この配合物はＭＢＴ−０２０６またはＥｎｄｏＴＡＧ−１とも称する。ＥｎｄｏＴＡＧ−１は約１０％ｍ／ｍトレハロース二水和物溶液中約１０ｍＭの脂質含量を有する。かかるリポソーム製剤の製造は国際特許出願公開第２００４／００２４６８号に開示されている。
【００５３】
本発明にしたがって得られるリポソームは、経口、経皮、静脈内、気管支内、筋肉内、眼内、皮下および腹腔内投与できる。薬物送達系として、リポソームは、薬物摂取を向上させ、急速に消失する薬物の減少を遅らせ、薬物毒性を減少させることにより、化合物の薬物動態および薬力学的効果を大きく変更できる。これらは癌の治療のための化学療法剤、細菌性、ウイルス性および寄生虫性疾患の治療のための抗菌剤の送達について、そしてワクチン送達用免疫学的アジュバントとしての使用に関しても広く研究されてきた。
【００５４】
リポソーム中に含まれる活性化合物は、化粧目的について有効な化合物でもあり得る。かかる化合物は特にヒトの皮膚または毛髪に対して効果を有する化合物であり得る。化粧目的を有する化合物はリポソームを構成する１以上の脂質であってもよい。
【００５５】
リポソームは様々な点で不安定である。リポソームの物理的構造は熱に対して感受性であるので、高温乾燥法はリポソーム膜の分解、機能の喪失または組み入れられているかもしくは結合した活性化合物の減少につながる。組成に応じて、リポソームは熱に対して化学的に不安定でもあり得る。例えば、ある脂質は水性環境中、高温で急速に加水分解または酸化する。
【００５６】
好ましい実施形態において、脂質または脂質粒子を含む出発懸濁液または溶液は場合によっては親水性賦形剤を含む。有用な親水性賦形剤はモノマー、オリゴマーまたはポリマーであってよく、さらにいくつかの化学的分類の化合物において見いだすことができる。本発明の好適な実施形態のうちの一つによると、親水性賦形剤は、糖類、例えば単糖類、二糖類、オリゴ糖類または多糖類、糖アルコール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、水溶性ポリマーまたはこれらの組み合わせである。
【００５７】
糖類、または炭水化物は、主に炭素、水素、および酸素から構成される化合物として定義される。有用な糖類としては、糖および糖アルコール、オリゴ糖類、水溶性多糖類ならびにこれらの誘導体が挙げられる。本発明の好適な糖類としては、これらに限定されないが、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトペントース、ラフィノース、デキストリン、デキストラン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、キトサン；水溶性セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒプロメロース；アルギネート、可溶性デンプンまたはデンプン画分、キサンタンガム、グアーガム、ペクチン、カラギーン、ガラクトマンナン、ジェランガム、トラガカント（これらの任意の誘導体を包含する）が挙げられる。特に好適な糖類はグルコースおよびトレハロースである。
【００５８】
他の有用な親水性賦形剤は他の化学的分類、例えば水溶性アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質から選択することができる。例えば、グリシンまたは他の天然アミノ酸を使用できる。有用なタンパク質としては、ゼラチン、アルブミン、乳漿タンパク質、大豆タンパク質、または他の食用もしくは植物性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
有用な親水性賦形剤のさらに別の例は、ポリマー、例えば水溶性ポリマー、例えば固体ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、またはポリビニルピロリドンである。
【００６０】
本発明によると、２以上の親水性賦形剤の混合物を使用できる。例えば、いくつかのパラメータ、例えばｐＨ、溶解度および湿潤性を独立して調節する必要があり得る。この場合、第１の親水性賦形剤をコロイド系の基本的担体物質として選択することができ、１以上のさらなる親水性賦形剤を組み入れて、あるｐＨおよび／または湿潤性を得ることができる。
【００６１】
親水性賦形剤、または親水性賦形剤の混合物の水性相中の含量は、水溶性および他の検討事項によって広く変化し、最高約８０重量％までである。さらに好ましくは、約０．１〜約６５重量％である。約３〜約６０重量％、特に約５〜約５０重量％の含量が好ましい。
【００６２】
もちろん、水性媒体はさらなる賦形剤または補助物質（親水性または水溶性であっても、そうでなくてもよい）を含んでもよい。これらの性質および抽出媒の性質に応じて、すなわちこれらの物質が抽出媒中に可溶性であるかどうか、そして抽出媒により抽出されるかどうかによって、かかる物質は乾燥粒子中に含めることができるか、または水および有機溶媒とともに除去することができる。乾燥粒子中に含められる物質は、薬学的に許容されなければならない。
【００６３】
粒子配合物、特に再構成および場合によって非経口投与に使用される粒子配合物において有用であり得るさらなる賦形剤は、一般に製薬科学者に公知である。好適なさらなる賦形剤としては、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、充填剤、凍結乾燥助剤、酸化防止剤、キレート剤、保存料、浸透物質、ｐＨを調節するための酸性またはアルカリ性賦形剤などが挙げられる。
【００６４】
本発明の好適な賦形剤には、安定剤および酸化防止剤が含まれる。酸化防止剤は組み入れられた活性化合物の酸化だけでなく、特に酸化に対して感受性である脂質が使用されるならばコロイドの成分の酸化も防止し得る。有用な化合物としては、例えば、脂溶性酸化防止剤、例えばα−、β−、およびγ−トコフェロール、ユビキノール、リコピン、α−およびβ−カロテン、ノルジヒドログアイアレチン酸、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、デスフェラール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、シリンガ酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ｐ−クマリン酸、フェルラ酸、シナピン酸およびカフェ酸、アスコルビルパルミテート、カルノソール、エスクレチン、エスクリン、フラキセチン、フラキシン、ケルセチン、モリンなどが挙げられる。特に好適なのは、α−トコフェロールおよびエチレンジアミン四酢酸（その薬学的に許容される誘導体を含む）である。他方、コロイド系の構成に化学的に純粋な半合成または合成飽和脂質を用いるならば、酸化防止剤は必要ない。
【００６５】
前述のように、脂質および／または脂質粒子を含む出発懸濁液または溶液を、多孔性デバイスを通して押し出し、続いて連続様式でノズルに通過させることが本発明の一つの態様である。十分小さな直径を有するノズルを利用することにより、多孔性デバイスから押し出された後の懸濁液の流れを制限し、これにより懸濁液を加圧する。多孔性デバイスおよびノズルを順次使用することにより、本発明の方法を実施する場合に多孔性デバイスの両側でほぼ等しく高圧にすることが可能になる。
【００６６】
本発明の方法を行うのに好適な装置を開示することも本発明の一態様である。この装置は、少なくとも１つのノズルならびに脂質を含む懸濁液または溶液を多孔性デバイスおよびノズルに通過させるのに好適な少なくとも１つのポンプに連結された少なくとも１つの多孔性デバイスを含む。
【００６７】
このように、リポソームを製造するための装置であって：
（ｉ）脂質を含む溶液または懸濁液を供給するための容器、
（ｉｉ）多孔性デバイス、
（ｉｉｉ）ノズル、
（ｉｖ）導管により容器（ｉ）を多孔性デバイス（ｉｉ）と連結させるための手段、
（ｖ）圧力を発生させるための手段、ならびに
（ｖｉ）場合によってリポソームを含む溶液または懸濁液を脱水するための手段および
（ｖｉｉ）場合によって得られたリポソームを回収する手段
を含む装置を提供することが本発明のさらなる態様である。
【００６８】
本発明の装置の好適な実施形態図を図１および２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、１つのデバイスにおいてリポソームを製造し、脱水するための装置を示す。
【図２】図２は、リポソームをシングルパス様式で製造するための装置を示す。
【００７０】
本発明の方法によりリポソームを製造するために使用されるか、または本発明の装置の一部である多孔性デバイスは、好ましくは約３００ｎｍ〜約５０ｎｍ、さらに好ましくは約２００ｎｍ〜約１００ｎｍの孔サイズを有する。多孔性デバイスは少なくとも１つの多孔性層を含む。即ち、多孔性デバイスは１つの多孔性層または複数の同一もしくは異なる多孔性層を含み得る。多孔性デバイスは膜、フィルター、フリットまたは孔を含む任意の他の制限デバイスおよびこれらの組み合わせであってよい。デバイスはポリマー物質、金属、ガラス、セラミックまたは任意の他の好適な物質から構成され得る。物質は化学的に不活性で、溶液／懸濁液の構成要素について低吸収性であり、湿潤性であり得る。好適な実施形態において、多孔性デバイスは膜、好ましくはポリカーボネート膜である。もう一つ別の実施形態において、多孔性デバイスは滅菌濾過膜であってよい。Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．（米国）により製造されるポリカーボネート膜は本発明の実施においてうまく機能することが判明している。本発明によると、多孔性デバイスの両側の圧力は好ましくは実質的に同一である。
【００７１】
多孔性デバイスシステムに懸濁液を１回だけ通過させるので、多孔性デバイスは孔の目詰まりのために変える必要はない。目詰まりは一般に脂質組成、純度および濃度などの変数、ならびに使用される圧力および流速に依存する。多孔性デバイスに２回通過させることは本発明の目的ではない。
【００７２】
押出に使用される多孔性デバイス、好ましくは膜は、多孔性デバイスを埋め込んだ少なくとも片面、好ましくは両面上の少なくとも１つのドレインディスクにより支持される。Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．（米国）により製造される、この種類のドレインディスクは本発明の実施においてうまく機能することが判明している。
【００７３】
少なくとも１つのドレインディスクは、特にノズルに連結された多孔性デバイスの面上の少なくとも１つのフリットによりさらに機械的に支持される。このような種類の膜ホルダーは当業者には一般的に周知である。
【００７４】
フリット成分は一般に、圧縮および／または焼結により通常部分的に結合したビーズ様材料から構成される構造部材である。フリット製造において有用な多くの材料には、セラミック、ガラス金属および金属／カーバイドビーズ様材料が含まれ、これらを結合させてフリットにする。金属に対して脂質の親和性は低いので、材料の実質的に全体的な処理量を促進するために金属フリットが好適である。好適な金属フリットはステンレス鋼製のものである。フリットを通るパスは直線的パスではなく、パス壁は変則的である。フリットは、棒状または円盤状をはじめとする多くの形態で製造できる。好適なフリットはＡｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ（ニュージャージー州イーストブランズウィック）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ペンシルバニア州ステートカレッジ）およびＲａｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（マサチューセッツ州ウォーバーン）などの多くの供給源から入手可能である。フリットは孔サイズ範囲全体にわたって不均一な孔サイズを有することを特徴とする。フリット孔サイズ範囲は、フリットを通過するか、またはフリットにより押し出される物質に基づいて実験的に決定することができる。これは、その一部が前記孔サイズ以上および前記孔サイズ以下にある粒子サイズの範囲を規定する。好適な孔サイズは≧１μｍ、好ましくは１〜５０μｍ、さらに好ましくは５〜２０μｍである。
【００７５】
埋め込まれた多孔性デバイス、好ましくはドレインディスクおよび場合によっては少なくとも１つのフリットにより支持される埋め込まれた膜の強度の増加は、膜を通る高い流速の押出を可能にする。多孔性デバイス（好ましくは膜）は閉塞せず、押出ステップの圧力により変形しない。驚くべきことに、膜タイプの押出は膜材料の変形に対する最小耐性により速度を制限されない。
【００７６】
本発明の非常に好適な実施形態を図２に示し、図中、好適な多孔性デバイスの組み立てを示す。特に、この好適な多孔性デバイスは膜、好ましくはドレインディスク（１３）により両面上で支持されるポリカーボネート膜（１４）を含む。さらに、好適な多孔性鎖はさらなる多孔性材料、好ましくはフリットを含み、このフリットはノズルと連結した多孔性デバイスの面上に位置する。
【００７７】
多孔性デバイスを通って押し出した後、脂質／リポソームの懸濁液または溶液を続いてノズルに通過させることは、本発明のさらなる態様である。本発明の方法のこのステップを行うために有用であるか、または本発明の装置の一部であるノズルも当業者には一般的に周知である。これらとしては、例えば、回転ディスクノズル、衝突噴流ノズル、キャピラリーノズル、シングルオリフィスノズル、振動型または拍動型超音波ノズル、二流体ノズル、例えば同軸二流体ノズルなどが挙げられる。本発明の好適な実施形態において、ノズルはオリフィスノズルである。リポソームまたはリポソームの単峰型分布をさらに改善するために用いられるノズルはＳｃｈｌｉｃｋ ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕｎｔｅｒｓｉｅｍａｕ（ドイツ）製造のオリフィスノズル１２１ＶＧ１／４であった。本発明においては、ノズルの好適な孔サイズは約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、さらに好ましくは約０．１ｍｍ〜約０．２ｍｍであるが、さらに大きな孔サイズまたはさらに小さな孔サイズのノズルも使用できる。本発明の装置において、ノズルは、得られたリポソームを脱水するために好適な容器、特に噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥による脱水に適した容器中に含まれ得る。
【００７８】
溶液または懸濁液の流速は、約１ｍｌ／分〜約１０００ｍｌ／分の範囲である。さらに典型的には、本発明の方法により、１０ｍｌ／分〜２００ｍｌ／分、さらに好ましくは約２０ｍｌ／分〜約１００ｍｌ／分の流速を適用して、リポソームを製造した。
【００７９】
別の実施形態によると、多孔性デバイスを通って脂質を含む懸濁液または溶液を押し出すために使用される圧力と、ノズルを通って懸濁液または溶液を通過させるための圧力とは、実質的に同じであり、特に０．５バール〜１２００バール（５×１０４Ｐａ〜１．２×１０８Ｐａ）である。さらに典型的には、５バール〜６００バール（５×１０５Ｐａ〜６×１０７Ｐａ）、好ましくは約１０バール〜約５００バール（１×１０６Ｐａ〜約５×１０７Ｐａ）、さらに好ましくは約２０バール〜約１５０バール（２×１０６Ｐａ〜約１．５×１０７Ｐａ）でリポソームを本発明の方法により製造できる。
【００８０】
脂質／リポソーム懸濁液または溶液を、前述のような本発明の方法において用いられる圧力および流速を用いてポンプ輸送することは、当該分野において一般的に周知の好適な高圧ポンプにより達成できる。ピストンポンプを用いる場合、懸濁液をポンプヘッド自体の中へ吸い込むことができる。外部ポンプデバイスによりフィード貯蔵容器からのフィードストックへの外部ポンプ輸送が可能である。本発明はピストンポンプに限定されず、隔膜ポンプをはじめとする任意の好適なポンプ手段を使用できる。十分な水圧ヘッドを有し、したがって十分な流速および圧力差がある実施形態においては、ポンプは必要ではない。
【００８１】
約１０バール〜約５００バール（１×１０６Ｐａ〜約５×１０７Ｐａ）の圧力を使用することにより、最高約４００ｍＭ脂質までの高い脂質濃度を含む出発懸濁液または溶液を用いてリポソームを製造することが可能になるということは、本発明のもう一つ別の態様である。多孔性デバイス押出のために高圧を使用することにより、高い脂質濃度でも押出多孔性デバイスの目詰まりを防止することができる。ポリカーボネート多孔性デバイスを用いる従来のリポソームサイズ分別技法は７バールより低い圧力を使用し、したがって６０μｍｏｌ／ｍｌの脂質濃度に限定された。本発明のプロセスにおいて、約２０ｍｌ／分以上の急速な押し出し速度は、圧力がさらに高い場合、例えば２０バール〜１５０バール（２×１０６Ｐａ〜１．５×１０７Ｐａ）の範囲の圧力が使用される場合に、高い脂質濃度でも達成される。
【００８２】
本発明の実施形態において記載される本発明の方法は、多孔性デバイスを通って１回押し出し、続いてノズルに通過させることによる、連続した再現性のある様式でのリポソームの急速製造を可能にする。この方法を実施するために使用される圧力が増加すると、このプロセスにより製造されるリポソームのサイズが減少し、サイズ分布が狭くなる。
【００８３】
本発明の方法により製造されるリポソームが、狭いサイズ分布により具体化される高いサイズ均一性を有することは本発明のもう一つ別の態様である。高いサイズ均一性または狭いサイズ分布は低い多分散性指数により特徴づけられる。好ましくは、本発明により製造されるリポソームは、約０．３より低い多分散性指数、さらに好ましくは約０．２より低い多分散性指数、最も好ましくは約０．１より低い多分散性指数により特徴づけられる。リポソームの多分散性（ＰＩ）はＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を用いて光子相関分光法（ＰＣＳ）により決定できる。
【００８４】
本発明のもう一つ別の態様において、さらに長期間リポソームを保存するために、製造後にリポソームを脱水できる。リポソームを脱水するための好適な方法としては、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥が挙げられる。リポソームを含む懸濁液の微粒化による液滴の形成は、両脱水法の最初のステップである。リポソームを減圧下で脱水することもできる。特に好適な実施形態において、２００６年１０月２７日に出願された共有欧州特許出願第０６ ０２２ ５３８．０号"Ｐｅｒｃｏｌａｔｉｖｅ ｄｒｙｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ"に記載されるようにパーコレーティブ乾燥によりリポソームを脱水することができる。
【００８５】
脂質、好ましくは脂質粒子、最も好ましくはリポソームを含む懸濁液または溶液を、好ましくは高圧でノズルに通過させることが本発明の一つの目的であることはすでに記載した。この方法で懸濁液を微粒化し、これにより懸濁液または溶液から液滴を形成できる。
【００８６】
したがって、脂質を含む出発懸濁液または溶液からリポソームを製造し、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥により前記リポソームを脱水することを含む連続法を提供することは本発明のもう一つ別の態様であり、これによりこの方法は脂質を含む懸濁液または溶液を、多孔性デバイスを通して押し出し、続いてこの懸濁液または溶液を、ノズルに通過させ、これにより懸濁液を微粒化して液滴を形成する。
【００８７】
液滴形成後のリポソームの乾燥は、液滴をガス流れ、好ましくは加熱されたガス流れと接触させることにより行うことができ、固体粒子を得る。好ましくは、使用されるガス流れは不活性ガスである。乾燥ガスは、好ましくは、０．１容量％未満、好ましくは０．０５容量％未満の酸素を含む低酸素ガスまたは無酸素ガスである。不活性気体は、酸素と置換するために窒素、二酸化炭素、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンおよびラドンまたは他の不活性ガスをポンプで供給することにより、可燃性の高い溶液を含む加熱乾燥系の安全性を増加させる。これらの系の効果は、酸素を完全に除去すること、または無視できるレベルまで減少させることのいずれかである。本発明の好ましい実施形態において、窒素を不活性気体として使用する。本発明の他の実施形態において、不活性ガスは配合物中に含まれる活性成分および賦形剤を保護する。好ましくは、噴霧乾燥は、噴霧乾燥に適したデバイス中で行う。噴霧乾燥は例えば乾燥塔で行うことができる。脱水されたリポソームをガス流れから分離し、回収する。
【００８８】
本発明の方法を、当業者に不活性噴霧乾燥デバイスとして公知のパススルーまたはループ操作で行うことができる。パススルーまたはループ操作において、不活性ガスを乾燥ガスとして加熱することができる。乾燥ガスを次いで、懸濁液をリポソームとともに含む懸濁液の乾燥器フィードを噴霧乾燥するために使用できる。噴霧乾燥を過剰圧力、標準圧力または不完全真空下で行うことができる。乾燥ガスを用いて許容できる最高システム温度および最大容量で規格に準拠した粉末を産生するならば、有利なプロセス圧力範囲が存在し得る。酸素のシステム中への導入は回避しなければならないので、プラントは好ましくは標準圧力または常圧より０〜２００ｍバール（２×１０４Ｐａ）高い若干超過気圧下で行うことができる。プロセスチャンバー内部の加熱された乾燥ガスは１０℃〜５００℃の温度を示し得るので、乾燥器フィードが乾燥ガスと接触すると溶媒が蒸発する。さらに典型的には、懸濁液を本発明の方法により３０℃〜２５０℃、さらに好ましくは約８０℃〜約２００℃で乾燥した。
【００８９】
乾燥したリポソーム生成物の分離は生成物を排出しながら行うことができる。生成物流れを好適な手段により、例えばフィルターまたはサイクロンを用いて廃ガス流れから分離することができ、場合によって冷却し、必要ならば保護ガス雰囲気下または包装して保存することができる。集塵のために圧力サージクリーニングを備えた表面フィルターを使用する場合、クリーニングは任意の無酸素ガスを用いて、好ましくは予熱された不活性ガスまたは乾燥ガスのスプリット流れを用いて行うことができる。
【００９０】
溶媒を濃縮し、不活性ループを通して処理することにより排気を再循環させることができる。パススルー操作において新鮮な乾燥ガスを繰り返しプロセスチャンバー中に供給し、プロセスチャンバーから出る排ガスを廃棄する。本発明の方法は、ループ操作におけるガス再循環操作で行うこともでき、使用済み乾燥ガスは溶媒を含まない。パススルー操作との違いは、排ガスを乾燥ガスとして再度使用できるような方法でエネルギー入力により再循環し、調節することができることである。調節中、プロセスチャンバー中で蒸発した液体成分を排ガスから部分的に分離して、これらも再循環することができる。過剰な溶媒および不活性ガスを除去しながら、できるだけ完全にガスをリサイクルすることが経済的観点から望ましい。
【００９１】
本発明の乾燥リポソームを製造するための装置の好適な実施形態を図１に示す。
【００９２】
液滴を噴霧凍結ステップで凍結することは、前記液滴を低温流体と接触させることにより行うことができる。低温流体は冷却ガスまたは低温液体であり得る。低温液体は冷却された液体、例えばアルゴン、ヘリウム、水素、窒素、酸素、メタン、二酸化炭素、亜酸化窒素、イソペンタン、ヘキサン、またはエタノールおよび他の流体、例えば炭化水素流体またはこれらの混合物である。本発明の好ましい実施形態において、窒素を低温液体として使用する。液滴が低温流体と接触すると、凍結粒子が形成される。重要な可変操作パラメータとしては、ローター速度、微粒化ガス圧、環状間隙ガス圧、空気体積、溶液スプレー速度およびスプレーガンノズル直径、流動床のスリット幅ならびに入口および出口空気温度が挙げられる。
【００９３】
凍結ステップにより得られる粒子中に含まれるリポソームを、前記粒子を解凍することなく減圧下で脱水できることは本発明の一つの特性である。減圧下で、水および他の溶媒を凍結粒子から昇華により除去する。減圧により熱不安定化合物の乾燥時間を短縮することが可能になる。
【００９４】
リポソームが組み入れられているか、または埋め込まれている固体粒子を得るために、許容できる程度のコロイドの組み入れに有利な親水性賦形剤のコロイド系に対する重量比を選択することが有用である。例えば、水性液体が親水性賦形剤より多くのコロイド系を含むならば、コロイド系の一部は本発明の方法により産生される固体粒子中に組み入れられていないかまたは埋め込まれていなくてもよい。したがって、親水性賦形剤のコロイド系に対する重量比は少なくとも約１、さらに好ましくは少なくとも約２、例えば約３〜約５またはさらにはそれ以上であるのが好適である。一方、非常に高い比は避けるべきである。その理由は、コロイド系の特定の含量にしては粉末体積がかなり大きくなり、したがって再構成後の液体組成物の体積が大きくなるからである。したがって、約５０以上、またはさらには１００以上の比はあまり好ましくない。本発明によると、約５０未満、特に約２０未満の比が特に好適である。
【００９５】
指摘したように、本発明の方法はシングルパス操作で懸濁液中のリポソームの製造および乾燥粉末への変換も可能にする。乾燥粒子は、乾燥粒子中に埋め込まれているかまたは組み入れられているリポソームの担体として作用する親水性賦形剤を含む。この方法は比較的低温で行うことができるので、噴霧乾燥に関連して熱不安定性であるかまたは熱不安定性活性剤を含むリポソームの乾燥および安定化には特に有利である。
【００９６】
本発明の方法により脱水されたリポソームを好適な水性媒体中で再水和することができる。意外にも、リポソームおよび／または脂質粒子を含む懸濁液を製造し、容易に再構成できるような方法で本発明の方法により可能なワンステップ操作でさらに乾燥できることが見いだされた。穏やかな条件、特に水性有機溶液を不活性ガスと組み合わせて用いる低噴霧乾燥温度は、この方法を熱不安定性リポソームの製造および乾燥に関して非常に有用にする。
【００９７】
本発明は、開示された方法により得られた脱水されたリポソームを開示する。これらのリポソームは、水性媒体中、好ましくは製薬用途に好適な媒体中、最も好ましくは注射用水中でのリポソームの再水和後に、約５００ｎｍより小さく、好ましくは約２００ｎｍより小さい平均直径を有する。脱水されたリポソームを水性媒体と単に混合することによりリポソームを再水和することができる。開示された脱水リポソームは再水和後に約０．５より低く、好ましくは約０．２より低く、最も好ましくは約０．１５より低い多分散性指数を有する。リポソームは、約１０μｍ〜約１０００μｍ、好ましくは約５０μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有する乾燥粒子中に含まれ得る。
【００９８】
本発明の方法により得られるリポソーム、乾燥粒子、またはこれを含む粉末を医薬または診断用製剤の製造において用いることができる。粒子が薬物投与形態の全ての要件を満たすならば、そのように使用し、適切な第１包装容器中に直接充填することができる。あるいは、粒子をさらに加工することができる。例えば、粒子をさらなる活性および／または不活性成分、例えば薬学的に許容される担体として混合することができるか、または圧縮して薬物錠剤にすることができる。
【００９９】
リポソームを含む乾燥粒子を、例えば注射用水または他の緩衝系で再構成した後、結果として得られた配合物を非経口（例えば、静脈内または局所領域）注射、経口投与、肺または鼻吸入に用いることができる。溶媒を、製造法において用いる場合、本発明の方法の間に許容限界または検出可能限界以下で抽出され、このことは従来公知の方法よりも特に優れた本発明の利点である。
【０１００】
実施例
次の実施例は本発明およびその好適な実施形態のいくつかを、その範囲を制限することなくさらに説明することを意味する。さらなる実施例および実施形態は、説明から、場合によっては一般的に公知の技術情報と組み合わせて、特にコロイド状薬物担体系の設計および使用ならびに噴霧乾燥、不活性噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥の既知原則と組み合わせて容易に誘導されるであろう。
【０１０１】
リポソームの分析
リポソームの粒子サイズ（Ｚ平均）および多分散性（ＰＩ）を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を用いた光子相関分光法（ＰＣＳ）により分析した。ＤＯＴＡＰ−ＣｌおよびＤＯＰＣの脂質濃度を、２０５ｎｍでＵＶ／ＶＩＳ検出器を用いたＨＰＬＣにより分析した。成分の分離および定量化を、Ｃ１８プレカラムを有するＣ８ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ選択Ｂカラム（２５０×４ｍｍ、５μｍ粒子サイズ）を用いて行った。
【０１０２】
リポソーム製造
合計脂質含量が１０〜４００ｍＭであるカチオン性リポソームを、水性有機相中へのエタノール注入により製造した。ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン−クロリド）およびＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）をどちらもＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、米国）から入手し、エタノール中に溶解させた。１０．５％トレハロース溶液（Ｆｅｒｒｏ Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ，米国）中に最高３０％までの有機物含量で注入すると、多重膜リポソームが自発的に形成された。所定のサイズ分布を有するリポソームを得るために、懸濁液を、１００または２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜ならびに０．１および０．２のオリフィス直径を有するノズルに１回通過させた。
【０１０３】
粒子の分析
残存する水分を、ヘッドスペースオーブンを有するクーロンＫａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定装置（Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｊｅｎａ ＡＧ、ドイツ）により測定した。粒子サイズ分布を、Ｈｅ−Ｎｅレーザービーム装備レーザー回折分析器（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ Ｘ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ドイツ）を用いて測定した。
【０１０４】
実施例１
例えば、Ｍｕｎｄｕｓ等により国際特許出願公開第２００４／００２４６８号で開示されているようなエタノール注入により、１０ｍＭの合計脂質含量を有するカチオン性リポソームを製造した。ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン−クロリド）５ｍＭおよびＤＯＰＣ５ｍＭ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（どちらもＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、米国）から入手）をエタノール中に溶解させた。１０．５％トレハロース溶液（Ｆｅｒｒｏ Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ、米国）中に注入すると、多重膜リポソームが自発的に形成された。
【０１０５】
エタノール注入により製造される水性有機多重膜リポソーム分散液を、ＩＳＣＯ ＤＭ ２６０シリンジポンプを用いてオリフィスノズルに連結された多孔性デバイスを通過させた。適用された流速および結果としての圧力を第１表に表示する。多孔性デバイスは、ポリエステルドレインディスク（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、米国）により両面から支持された２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、米国）と、それに続いて連結されたノズルに面する膜／ドレインディスク面をさらに支持する５μｍの濾過孔を有するステンレス鋼フリットから構成されていた。０．１ｍｍのオリフィス直径を有する１２１ＶＧ１／４ノズル（Ｓｃｈｌｉｃｋ、ドイツ）を使用した。ノズルに通した後にリポソームを集め、分析した。
記載の方法により、異なる脂質濃度、流速および圧力を用いて製造されたリポソームの特性を第１表に示す。
【０１０６】
第１表
【表１】
【０１０７】
実施例２
１００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を用いて実施例１にしたがって方法を行った。異なる流速および圧力を用いて、記載の方法により製造されたリポソームの特性を第２表に示す。
【０１０８】
第２表
【表２】
【０１０９】
実施例３
実施例１にしたがい、０．２ｍｍのオリフィスを有するノズルを用いて方法を行った。異なる脂質濃度、流速および圧力を用いて、記載の方法により製造されたリポソームの特性を第３表に示す。
【０１１０】
第３表
【表３】
【０１１１】
実施例４
水性有機分散液のエタノール濃度を１０％〜３０％［ｗ／ｖ］の間で変える以外は実施例１にしたがって方法を行った。異なるエタノール濃度、流速および圧力を用いて、記載の方法により製造されたリポソームの特性を第４表に示す。
【０１１２】
第４表
【表４】
【０１１３】
実施例５
２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を用いる以外は実施例４にしたがって方法を行った。異なるエタノール濃度、流速および圧力を用いて、記載の方法により製造されたリポソームの特性を第５表に示す。
【０１１４】
第５表
【表５】
【０１１５】
実施例６
２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して水性有機分散液をポンプで供給し、２０ｍｌ／分の流速、１０または３０％［ｗ／ｖ］のエタノール濃度で、０．１ｍｍまたは０．２ｍｍの直径のオリフィスを有するノズルに通過させる以外は、実施例１と同様にして方法を行った。結果としての噴霧圧力は２０〜２２バールであった。
【０１１６】
ノズル（４）を通過させて分散液を微粒化して液滴にした後、液滴を不活性乾燥ガスと乾燥塔（５）（Ｂ−２９０およびＢ−２９５、Ｂｕｃｈｉ（スイス））中で接触させることにより、水分を蒸発させた。得られた乾燥粒子をサイクロン（Ｂｕｃｈｉ、スイス）により不活性ガスから分離した。ヒーター（Ｂｕｃｈｉ Ｂ２９０の機構）を用いて２００℃の入口温度まで乾燥不活性ガス温度を加熱し、その結果出口温度が約７５℃になった。不活性乾燥ガス、ガス状窒素を３８ｍ３／時の一定乾燥体積流速で供給した。分離した固体状のなめらかな粒子は５０〜５００μｍの範囲の粒子サイズを有し、残存水分は３％未満であった。注射用水で再構成した後、リポソーム分散液を得た。結果として得られたリポソームの平均直径および多分散性指数を第６表に示す。デバイスのセットアップを図１に図示する。
【０１１７】
第６表
【表６】
【０１１８】
実施例７
実施例１に記載のトレハロース溶液中にエタノール性脂質溶液を注入することによりリポソームを形成した後、エタノール、またはメタノール、またはアセトンをリポソーム懸濁液に添加して、溶媒の最終濃度４０％［ｗ／ｖ］を得た。結果として得られた分散液を、２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して２０ｍｌ／分の流速でポンプを用いて通過させ、続いて前述のように０．１ｍｍオリフィスノズルに通過させた。
【０１１９】
分散液を微粒化して液滴にした後、前記液滴を、１２０℃の入口温度を使用する以外は実験例６に記載したようにして脱水した。再水和リポソームの特性を前述のように分析した。結果として得られる出口温度、平均サイズおよび多分散性指数を第７表に示す。
【０１２０】
アセトンを共溶媒として使用することにより、わずか４５℃の非常に低い乾燥温度を達成できた。特に、アセトンの使用によっても０．１３の低い多分散性指数が得られた。このように、前述の方法でアセトンを共溶媒として使用することは温度感受性活性剤を含むリポソームの製造に特に有益であると思われる。
【０１２１】
第７表
【表７】
【０１２２】
図の説明
図１：１つのデバイスにおいてリポソームを製造し、脱水するための装置。
（１）シリンジポンプ
（２）多孔性デバイス
（３）入口温度
（４）ノズル
（５）乾燥塔
（６）出口温度
（７）サイクロン
（８）生成物
（９）不活性ループ（場合によって）
図２：リポソームをシングルパス様式で製造するための装置
（１０）ストック溶液
（１１）ポンプ
（１２）フィルターホルダー
（１３）ドレインディスク
（１４）膜、好ましくはポリカーボネート膜
（１５）多孔性物質、好ましくはフリット
（１６）ノズル
【符号の説明】
【０１２３】
１ シリンジポンプ、 ２ 多孔性デバイス、 ３ 入口温度、 ４ ノズル、 ５ 乾燥塔、 ６ 出口温度、 ７ サイクロン、 ８ 生成物、 ９ 不活性ループ（場合によって）、 １０ ストック溶液、 １１ ポンプ、 １２ フィルターホルダー、 １３ ドレインディスク、 １４ 膜、好ましくはポリカーボネート膜、 １５ 多孔性物質、好ましくはフリット、 １６ ノズル
【技術分野】
【０００１】
本発明はシングルパス様式におけるリポソームの製造法に関する。この方法は、脂質を含む溶液または懸濁液を、多孔質デバイスを通して押し出し、続いて前記溶液または懸濁液を、ノズルに通過させることを含む。
【０００２】
リポソームは水分をトラップした閉鎖二重層の脂質ベシクルである。リポソームは、単一の二重層膜により構成される単層ベシクル、または複数の同心二重層により構成される多重膜ベシクル（ＭＬＶ）であり得る。そのサイズに応じて、単層ベシクルはおおざっぱに、粒子サイズが約２５〜１００ｎｍである小単層リポソーム（ＳＵＶ）と、粒子サイズが約１００ｎｍ〜１０μｍの大単層リポソーム（ＬＵＶ）とに分類される。医薬用途に関しては、単層リポソームが多重膜リポソームよりも好適である。
【０００３】
近年、リポソームは薬物を送達するために医薬産業において重要な手段になってきている。疎水性薬物を脂質二重層中に組み入れることにより、この薬物をリポソーム中に配合する。親水性物質はリポソームの水性コア中に封入することにより配合することができる。リポソームは、薬物の身体への持続放出により薬物動態に影響を及ぼすことができるか、または薬物の遊離濃度を制限することにより副作用を軽減する。リガンドをリポソームと結合させるか、またはこれらの電荷を提供することにより、リポソームは目的とされる薬物の所望の作用部位への送達を促進する。薬学的用途に加えて、リポソームは化粧品にもしばしば用いられる。
【０００４】
食品用途に関して、リポソームは食品に風味および栄養素を付与するために用いられ、最近になって、食品を腐敗菌および病原菌の増殖に対して保護するのに役立つ食品抗菌剤を組み入れる能力について研究されてきた。
【０００５】
リポソーム製剤の医薬投与に関して、粒子サイズは重大なパラメータである。非経口投与について最適のサイズ範囲は約７０〜４００ｎｍである。このサイズ範囲内で、リポソームはある標的器官、例えば肝臓、脾臓および骨髄中への生体内分布に有利である。さらに、このサイズ範囲内のリポソームは血液中で良好な安定性を有し、予測可能な薬物放出速度を示す。４００ｎｍより大きいリポソームは凝集する傾向が高い。約５μｍのサイズで、循環中に注入されたリポソームは毛細血管を閉塞させ得る。したがってサイズ分布はリポソームの適用において重要な問題である。
【０００６】
リポソーム懸濁液を製造するために水性系中へ脂質をまず分散するための様々な主要な方法が開発されてきた。通常用いられる方法としては、乾燥脂質膜の所望の水性媒体での水和化（「フィルム法」、「ハンドシェイク法」）または脂質の有機溶媒溶液の水性媒体中への分散（エタノール／エーテル注入）が挙げられる。結果として得られるリポソーム懸濁液は通常、広範囲のサイズ分布および異種ラメラ性を有する。主に、ＭＬＶは初期生成物として観察できる。所望のサイズ範囲および均一性を有するリポソームを製造するために様々なサイズ処理法が開発されてきた。
【０００７】
リポソームは、より大きな多重膜リポソームの超音波処理によりサイズ別に分類することができる。結果として得られるリポソームは約２５〜８０ｎｍのサイズ範囲のＳＵＶである。しかし、狭いサイズ分布は約５０ｎｍより小さいリポソームサイズでのみ達成できる。ＳＵＶは限定された薬物封入能力ならびに望ましくない薬物動態および薬力学的特性を有しているので、超音波処理は薬学的用途に用いられるリポソームについて好適な方法ではない。この方法の他の欠点は、限定された処理体積、長い超音波処理時間、および熱ストレスにより脂質が酸化される可能性があることである。したがって、この方法は通常の工業生産にあまり好適ではない。
【０００８】
あるいは、大多重膜リポソームは高圧法によりサイズ別に分類し、均質化することができる。不連続プロセスでは、リポソーム懸濁液を、高圧（最高約１６０ＭＰａまで）で小オリフィスを通して、例えばＨｕｎｔおよびＰａｐａｈａｄｙｏｐｏｕｌｏｕｓ（米国特許第４，５２９，５６１号）またはＢｒａｎｄｌ等（国際特許出願公開第９６／０５８０８号）により記載されているような「フレンチプレス」装置を用いて押し出す。所望のサイズ分布が達成されるまでこのプロセスを繰り返す。均質化チャンバーまたは均質化ノズルは、例えばドイツ特許第３９０５３５４号または米国特許第６，３３１，３１４号に開示されている高圧ポンプを用いた使用のために特に設計されている。「高圧均質化」は、有機溶媒を使用することなく脂質／水分散液からリポソームを製造するためにも適している（Ｂｒａｎｄｌ，Ｍａｒｔｉｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒｓ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２ｎｄ Ｅｄ．）（１９９３），１，４９−６５）。典型的には、かなり広く多様な分布を有するＳＵＶが得られる。高圧ポンプの使用は、高圧でオリフィスを通る循環を可能にし、さらに大きなバッチサイズの処理を可能にする。さらに、プロセスは不連続方式で行われる。
【０００９】
約１００〜４００ｎｍの所定のサイズおよび狭いサイズ分布を有するＬＵＶを産生するために、均一孔サイズ膜を通してリポソーム懸濁液を押し出すことに基づくサイズ処理法が開発された（Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ １９７９，Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ １９７９）。好ましくは、通常約５０〜２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜をこの方法において用いる。膜孔サイズの選択により、所望のリポソームサイズをあらかじめ決定することが可能になる。均一性が高いリポソームを得るために、膜を通してリポソームを複数回押し出すことができる（Ｃｕｌｌｉｓ 国際特許出願公開第８６／００２３８号、Ｇｏｌｄｂａｃｈ Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｒａｙ−Ｄｒｙｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ａ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ． ＩＩ． Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９３）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃ，１９（９），２６２３−２６３６）。さらに大きなバッチサイズを処理するために、所望のサイズおよび多分散性が達成されるまで、ポンプにより膜を通してリポソーム製剤を押し出して連続的に再循環させることができる（Ｊａｎｏｆｆ、欧州特許出願公開第０４６０７２０号）。一般に、リポソームの多分散性は押し出しサイクル数が増加するとともに減少する。
【００１０】
狭く、明確なサイズ分布の生成物を得、必要な押し出しステップ数を減少させるために、数種の押出膜が従来技術において公知である。クモの巣様構造を有するポリマー膜を押出プロセスに適用することにより、Ｍｏｒａｎｏ等（米国特許第４，９２７，６３７号）は良好な多分散性を達成している。Ｍａｒｔｉｎ等（米国特許第４，７３７，２３２号）は非対称膜を開示し、一方、Ｓｕｄｄｉｔｈ（米国特許第５，５５６，５８０号）はリポソーム押出のために膜の代わりにフリットを使用する。
【００１１】
この方法を最適化するための様々な手段は、押出プロセスに高圧法を用いる。例えば、Ｓａｃｈｓｅ等（ドイツ特許第４３２８３３１号）は一連のスタッガード膜を通した押出に６．５ＭＰａの圧力を使用する。Ｈｉｌｌ等（米国特許第２００５／０２６０２５６号）は支持カセットホルダー中で親水性スクリーン膜を使用することにより押出に最高約５５ＭＰａまでを使用することを可能にしている。
【００１２】
薬物封入リポソームの薬学的用途に適合する必要がある、好適なサイズおよび狭いサイズ分布を有するリポソームの大規模製造のために、通常、高圧均質化または膜押出法のいずれかによるリポソーム材料の繰り返し処理がさらに必要である。したがって、適切なサイズのリポソームを連続して製造するためのシングルパス法は、これらの標準法を用いて実施することができない。
【００１３】
水性リポソーム製剤は通常、工業生産および供給プロセスに必要な長期間にわたって安定ではない。リポソームを保存するための標準法は水性リポソーム製剤の脱水である。脱水は、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥により達成することができ、どちらも懸濁液の微粒化を必要とする。
【００１４】
非経口適用に好適なサイズおよびサイズ分布を有するリポソーム懸濁液を製造するための連続法を提供することが、本発明の基本的な課題であった。かかるリポソーム懸濁液を製造し、その後の乾燥処理のために懸濁液を微粒化する連続法を提供することが本発明の別の課題であった。さらに、確立された標準物質の処理および使用の拡張性が望まれた。
発明の概要
本発明は懸濁液または溶液からリポソームを製造するための連続法を提供する。出発懸濁液または溶液は、好ましくは脂質粒子形態の脂質を含み、好ましくは水性媒体も含む。出発懸濁液中の脂質粒子は不均一なサイズであり、一方、この方法により得られるリポソームは均一なサイズにより特徴づけられる。この方法は、連続様式で、まず多孔質デバイスを通して懸濁液または溶液を押し出し、続いて懸濁液または溶液を、ノズルに通過させることを含む。この方法をシングルパス様式で行い、この場合、懸濁液または溶液を多孔質デバイスおよびノズルに１回だけ通して押し出す。好ましくは、この方法により得られるリポソームは均一なサイズである。本発明の方法により、出発懸濁液の脂質粒子の平均粒子サイズ分布はさらに小さな粒子サイズまで減少する。この方法は、脂質および製造されたリポソームの集団を含む溶液または懸濁液を提供することも含む。
【００１５】
このように、本発明はシングルパス様式でリポソームを製造する方法であって：
（ａ）脂質を含む懸濁液または溶液を提供し、
（ｂ）多孔性デバイスを通してステップ（ａ）の懸濁液または溶液を押し出し、次いで
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記懸濁液または溶液をノズルに通過させ、
（ｄ）場合によって、ステップ（ｃ）後に形成されたリポソームを回収することを含む方法に関する。
【００１６】
この方法は、好適なポンプにより生じる約１２００バールまでの高圧で行うことができる。好適なノズルにより懸濁液または溶液の流れを制限することによって、懸濁液または溶液の圧力は多孔性デバイスの両側でほぼ等しい。好ましくは、これを通してリポソームが押し出される多孔性デバイスは５０〜３００ｎｍ、さらに好ましくは１００〜２００ｎｍの孔サイズを有する。
【００１７】
膜を通した押出またはノズルもしくはオリフィスを通した高圧押出によるリポソームの均質化は従来知られていたが、２つの方法を組み合わせることにより、狭いサイズ分布および５０ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均サイズを有するリポソームの製造に好適な連続プロセスが得られることは予測できなかった。後者の生成物特性は非経口医薬適用におけるリポソームの使用に好適である。確立された押し出し技法によりこのような特性を得るためには、プロセスの連続セットアップを防止するいくつかの押出ステップを行う必要がある。
【００１８】
所定の孔サイズを有する多孔性デバイスを通したリポソームの押出はリポソームのサイズ分別のための限定法として既知である。したがって、続いてリポソームを、ノズルに通過させることによってリポソームのサイズ分布を改善できることはなおさら意外であった。リポソームのサイズ分布は、多分散性指数により特徴づけられる。このように、多分散性指数の減少は、サイズ分布の幅の減少を示唆する。
【００１９】
脂質を含む懸濁液または溶液が多孔性デバイス後に高圧下に維持されるならば、前記懸濁液または溶液を、ノズルに通過させることにより、噴霧／微粒化が可能になる。微粒化懸濁液を、噴霧乾燥または噴霧凍結プロセスにおいて通常行われるやり方で乾燥するかまたは凍結するかのいずれかに好適なデバイスで微粒化を行うことができる。好ましくは、乾燥／凍結は、その内容が参考として本明細書で援用される、２００６年１０月２７日に出願された共有欧州出願番号０６ ０２２ ５３８．０"Ｐｅｒｃｏｌａｔｉｖｅ ｄｒｕｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ"に開示されているパーコレーティブ乾燥により行うことができる。
【００２０】
リポソームを押し出し、噴霧乾燥または噴霧凍結するための連続法であって、脂質を含む出発懸濁液または溶液を、多孔性デバイスを通して押し出し、続いて懸濁液または溶液を、ノズルに通過させ、これにより懸濁液または溶液を微粒化することを含む方法を提供することは本発明のさらなる態様である。
【００２１】
本発明は、導管によりノズルに連結された多孔性デバイスを含む装置をさらに開示する。この装置は本発明により開示されるような方法を実施するのに好適である。
【００２２】
量の値に関連して「約」とは、表示値に基づいて、最大±２０％、好ましくは±１０％の平均偏差を意味する。例えば、約３０モル％のカチオン性脂質の量とは、全脂質／両親媒性物質モル濃度に関して３０モル％±６モル％、好ましくは３０モル％±３モル％のカチオン性脂質を意味する。
【００２３】
「活性化合物」とは、ヒトまたは動物の病気または疾患の診断、予防、または治療に有用な薬物として有用であることの基礎となる特定の生物活性を有する化合物、または化合物の混合物をいう。製剤原料、診断化合物およびワクチンは本発明の活性化合物の重要な例である。
【００２４】
「水性媒体」または「水性液体」は水を含む液状物質である。この物質は単一の液相、または２相もしくは多相系であり、ここで連続相は液体であり、水を含む。連続相が水性である水性懸濁液、分散液またはエマルジョンも水性媒体の例である。コロイド状物質を含む水性媒体は本明細書において以下、水性コロイド分散液または溶液と呼ぶ場合もある。
【００２５】
「低温流体」は、水溶液を凍結させるために必要な温度範囲で液状である物質であり、好ましくは−９０℃より低い温度で適用される。低温流体は低温流体と接触することによりその場で粒子および／またはペレットを凍結させることができる。
【００２６】
「ドレインディスク」とは、隣接する多孔性デバイスの孔サイズよりも大きな孔サイズを有するフィルター様構造を有するデバイスである。
【００２７】
「乾燥」または「脱水」は交換可能に用いられ、蒸発または昇華により水性媒体を除去するプロセスに関する。
【００２８】
「液滴の形成」とは、加圧噴霧、二流体噴霧、遠心分離液滴形成ならびにノズル様、例えばピエゾ液滴形成デバイス、音活性化、磁気および静電液滴形成デバイスなどにより微細粒子またはペレットに物質を変換することをいう。
【００２９】
「親水性賦形剤」とは、親水性特性を有する、薬学的に許容され、薬理学上実質的に不活性な物質を意味する。親水性とは、親水性賦形剤が実質的に水溶性であることを意味する。
【００３０】
本明細書において用いられる場合「均一性」または「均一な」とは粒子集団の狭いサイズ分布を意味する。高いサイズ均一性または狭いサイズ分布は低い多分散性指数により特徴づけられる。
【００３１】
「脂質」とは、水中に不溶性である脂肪、脂質、原形質のアルコール−エーテル可溶性構成要素成分を包含する一般名として通常の意味である。脂質は、脂肪、脂肪油、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質、アミノ脂質、色素脂質、および脂肪酸から構成される。この用語は、天然脂質および合成脂質の両方を包含する。本発明に関連する好適な脂質は：ステロイドおよびステロール、特にコレステロール、リン脂質、例えばホスファチジルおよびホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン、ならびにスフィンゴミエリンである。脂肪酸が存在する場合、これらは、最高６個までの二重結合を含む約１２〜２４個の炭素鎖の長さであり得る。脂肪酸はグリセロール由来の骨格と結合する。１つの脂質内の脂肪酸は異なっているか（不斉）、または１つだけ脂肪酸鎖が存在し得る（例えばリゾレシチン）。特に非カチオン性脂質が天然源由来である場合、例えば卵黄、ウシ心臓、脳、もしくは肝臓、または大豆から精製されたレシチン（ホスファチジルコリン）である場合、混合配合物も可能である。
【００３２】
「リポソーム」は様々なサイズおよび構造の人工脂質二重層ベシクルである。単層ベシクルは水性空間を閉じ込めた単一脂質二重層により規定されるリポソームである。対照的に、オリゴまたは多重膜ベシクルはいくつかの膜を含む。典型的には、膜はおおよそ厚さ４ｎｍであり、両親媒性脂質、例えば天然源または合成源のリン脂質から構成される。場合によって、膜特性は、他の脂質、例えばステロールまたはコール酸誘導体を組み入れることにより修飾できる。低相転移温度（すなわち体温以下）を有するリン脂質ベースの特に柔軟な膜を有するリポソームは場合によってはトランスフェルソームと呼ばれる。
【００３３】
二重層膜の直径および数に応じて、リポソームは、多重膜ベシクル（ＭＬＶ、２以上の二重層、典型的には約１５０〜２００ｎｍ以上）、小単層ベシクル（ＳＵＶ、１つの単一二重層、典型的には約１００ｎｍ以下）、多小胞体ベシクル（ＭＶＶ、大ベシクル内の複数のベシクル構造）、および大単層ベシクル（ＬＵＶ、１つの単一二重層、典型的には約１００ｎｍ以上）に分類することもできる。
【００３４】
リポソームの化粧用途に関して、粒子サイズはあまり重要でないパラメータである。経皮投与のサイズ範囲は約７０〜４０００ｎｍである。このサイズ範囲内で、リポソームは真皮および経皮用途の適用に有利である。
【００３５】
本明細書において用いられる「ノズル」は、その中を流体が加速して高速流になる、様々な断面積を有する導管を意味する。流体をノズル中に送る前に高圧状態に圧縮しなければならず、ノズル中で液滴が崩壊して、その結果微粒化される。
【００３６】
「パクリタキセル」（本明細書においては類似体、配合物、および誘導体、例えば、デアセチルパクリタキセル、デアセチル−７−エピパクリタキセル、ドセタキセル、タキソテール（ドセタキセルの配合物）、パクリタキセルの１０−デスアセチル類似体およびパクリタキセルの３’Ｎ−デスベンゾイル−３’Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル類似体を包含すると理解すべきである）は当業者に周知の技法（国際特許出願公開第９４／０７８８２号、同第９４／０７８８１号、同第９４／０７８８０号、同第９４／０７８７６号、同第９３／２３５５５号、同第９３／１００７６号；米国特許第５，２９４，６３７号；第５，２８３，２５３号；第５，２７９，９４９号；第５，２７４，１３７号；第５，２０２，４４８号；第５，２００，５３４号；第５，２２９，５２９号；および欧州特許出願公開第５９０，２６７号も参照）を利用して容易に製造できるか、または例えばＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａのＴ７４０２；もしくはＴａｘｕｓ ｙａｎｎａｎｅｎｓｉｓのＴ−１９１２）をはじめとする様々な商業的供給源から得ることができる。パクリタキセルはパクリタキセルの一般的な化学的に入手可能な形態だけでなく、類似体（例えば、前述のようにタキソテール）およびパクリタキセル複合体（例えば、パクリタキセル−ＰＥＧ、パクリタキセルデキストラン、またはパクリタキセル−キシロース）も意味すると理解するべきである。
【００３７】
本明細書において用いられる「タキサン」という用語は、微小管作用機構を有し、独自のタキサン環構造および細胞増殖抑制作用に必要な立体特異的な側鎖を含む構造を有する抗腫瘍薬の種類を意味する。「タキサン」という用語には、親水性誘導体、および疎水性誘導体のどちらも包含する様々な既知誘導体が含まれる。タキサン誘導体としては、国際特許出願公開第９９／１８１１３号に記載されているガラクトースおよびマンノース誘導体；国際特許出願公開第９９／１４２０９号に記載されているピペラジノおよび他の誘導体；国際特許出願公開第９９／０９０２１号、国際特許出願公開第９８／２２４５１号、および米国特許第５，８６９，６８０号に記載されているタキサン誘導体；国際特許出願公開第９８／２８２８８号に記載されている６−チオ誘導体；米国特許第５，８２１，２６３号に記載されているスルフェンアミド誘導体；ならびに米国特許第５，４１５，８６９号に記載されているタキソール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「熱感受性」、「温度感受性」または「熱不安定性」とは、物質が噴霧乾燥などの熱により水を蒸発させることに基づく乾燥法に不適合であることを意味する。言い換えると、熱不安定性物質はこのような熱乾燥法により処理される場合、その構造、活性、機能または化学的純度の少なくともいくつかを失って、生成物が薬学的に許容できなくなり得る。
【００３９】
「薬学的に許容される」とは、活性成分の生物活性の効果を妨げず、投与された宿主に対して有毒でない任意の物質を包含することを意味する。
【００４０】
「多分散性」とは、所定の粒子試料における粒子サイズ分布の幅である。多分散性は多分散性指数により特徴づけられる。
【００４１】
「多分散性指数」（ＰＤＩ）は所定のリポソーム試料中の粒子サイズ分布の幅の評価である。ＰＤＩの計算前に、粒子サイズを動的光散乱（ＤＬＳ）により決定する。この技法は、粒子がブラウン運動をするために起こる散乱された光の強度における時間依存性変動を測定する。これらの強度変動の分析により、粒子の拡散係数の決定が可能になり、この拡散係数をサイズ分布に変換する。これらのパラメータの計算は、ＩＳＯ規格文書１３３２１：１９９６ Ｅで定義されている。
【００４２】
「シングルパス様式」または「シングルパスプロセス」とは、処理物質が処理ステップを１回だけ通過する方法をさす。したがって、本発明の方法において用いられる懸濁液、溶液またはリポソームは、本発明において用いられる多孔性デバイスまたはノズルに１回だけ通過する。
【００４３】
本発明において使用される脂質粒子はリポソーム、脂質複合体、固体脂質ナノ粒子、リポプレックス、ニオソーム、ミセルもしくは混合ミセル、オリゴ−もしくは多重膜ベシクルであってもよい。好ましくは、脂質粒子はリポソームである。リポソームがカチオン性リポソームであるのが本発明の最も好適な実施形態である。方法は、両親媒性分子、例えば界面活性剤の結合により形成される粒子を用いることもできる。リポソームと対照的に、これらの構造は、安定性が低く、希釈により分解する傾向がある単層に基づく。ミセルは例えば、その教示が参考として本明細書で援用される国際特許出願公開第０２／０８５３３７号および欧州特許出願公開第７３０ ８６０（Ａ）号に開示されている。
【００４４】
脂質または脂質粒子は、水性媒体を含む懸濁液または溶液で提供される。水以外に、本発明の水性媒体は、水と少なくとも部分的に混和性である１以上のさらなる液体構成要素、好ましくは有機溶媒、さらに好ましくはアルコール（例えばＣ1-4アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびこれらの組み合わせなど）またはケトン（例えばＣ1-4ケトン、例えばアセトン、メチルエチル−ケトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯおよびこれらの組み合わせなど）を含んでもよい。本発明の好適な実施形態において、水性媒体は水または水およびエタノールの混合物である。水とさらなる液体構成要素間の比は好ましくは約９９．９：０．１〜約１０：９０（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは約７０：３０〜約４０：６０（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約８０：２０〜約６０：４０（ｖ／ｖ）である。
【００４５】
前記有機溶媒、好ましくはエタノールを記載された比で、本発明のさらなる実施形態と組み合わせて使用することにより、単層リポソームを生成させるための従来公知の系よりも優れた様々な利点、例えば次のようなものが得られる：
１）この方法の結果、非常に小さく均一なリポソームが得られる；
２）高い脂質濃度（例えば、約１００ｍＭ）を使用して、高い封入効率を容易に達成できる；
３）減少した粘度は流動性の増加につながり、脂質懸濁液または溶液の高い流速を可能にする；
４）有機溶媒の使用は、蒸発プロセスの間の乾燥温度の低下につながる。
【００４６】
本発明により製造されるリポソームは異なるサイズ、ラメラ性および構造を有し得る。好ましくは、本発明の方法により製造されるリポソームは約５０ｎｍ〜約５００ｎｍの平均直径を有する。最も好適なのは、約５０〜約２００ｎｍのサイズである。好ましくは、リポソームは単層リポソームである。
【００４７】
本発明の文脈の中で用いられる懸濁液または溶液、脂質粒子またはリポソームは、中性、アニオン性および／または好ましくはカチオン性脂質を含み得る。カチオン性脂質は好ましくは、全リポソーム形成脂質の少なくとも約３０モル％の量、さらに好ましくは少なくとも４０モル％の量、そして最も好ましくは少なくとも５０モル％の量で含まれる。中性またはアニオン性脂質は、ステロールまたは脂質、例えばコレステロール、リン脂質、リソ脂質、リソリン脂質、スフィンゴ脂質または中性もしくは負の正味電荷を有するペグ化脂質から選択することができる。有用な中性およびアニオン性脂質としてはしたがって：ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（特定の糖に限定されない）、脂肪酸、ステロール、カルボン酸基を含むもの、例えばコレステロール、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、例えばこれらに限定されないが１，２−ジオレイルホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジヘキサデシルホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、１，２−ジアシル−グリセロ−３−ホスホコリン、例えばこれらに限定されないが１，２−ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミチルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリスチルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン、好ましくは卵ＰＣ、大豆ＰＣおよびスフィンゴミエリンが挙げられる。グリセロール骨格と結合した脂肪酸は特定の長さまたは二重結合の数に限定されない。リン脂質は２つの異なる脂肪酸も有し得る。好ましくは、さらなる脂質は室温で液晶状態であり、使用されるカチオン性脂質とこれらが適用される比で混和性である（即ち、均一相を形成することができ、相分離またはドメイン形成が起こらない）。好ましい実施形態において、中性脂質は１，２−ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。さらに、中性および／またはアニオン性脂質はポリ（エチレン）グリコール鎖を含み得る。
【００４８】
カチオン性脂質は好ましくはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＴＡＰ）塩、好ましくは塩化物またはメチル硫酸塩を含む群から選択することができる。ＴＡＰ脂質ファミリーの好適な代表例は、ＤＯＴＡＰ（ジオレオイル−）、ＤＭＴＡＰ（ジミリストイル−）、ＤＰＴＡＰ（ジパルミトイル−）、またはＤＳＴＡＰ（ジステアロイル−）である。本発明の他の有用な脂質としては：ＤＤＡＢ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；１，２−ジアシルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン、（これらに限定されないが：ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイルおよびジステアロイルを包含し；さらに２つの異なるアシル鎖がグリセロール骨格と結合することができる）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、（これらに限定されないが：ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイルおよびジステアロイルを包含し；さらに２つの異なるアシル鎖はグリセロール骨格と結合することができる）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、（これらに限定されないが：ジオレイル、ジミリスチル、ジラウリル、ジパルミチルおよびジステアリルを包含し；さらに２つの異なるアルキル鎖はグリセロール骨格と結合することができる）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）−エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ−アセテート（ＤＯＳＰＡ）；β−アラニルコレステロール；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）；ジＣ１４−アミジン；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシルアミノ−プロピオンアミジン；１４Ｄｅａ２；Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）；Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（トリメチルアンモニオ−アセチル）ジエタノールアミンクロリド；１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシルエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタン−ジアンモニウムヨージド；Ｓｏｌｏｄｉｎ等（Ｓｏｌｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）により記載されているような１−［２−（アシルオキシ）エチル］２−アルキル（アルケニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド誘導体、例えば１−［２−（９（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−（８（Ｚ）−ヘプタデセニル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、１−［２−（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］−２−ペンタデシル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＰＴＩＭ）、２，３−ジアルキルオキシプロピル第四アンモニウム化合物誘導体、Ｆｅｌｇｎｅｒ等（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４）により記載されているような第四アミン上にヒドロキシアルキル部分を含むもの、例えば：１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−ＨＰ）、１，２−ジオレイル−オキシ−プロピル−３−ジメチル−ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−ＨＢ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシペンチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ−Ｈｐｅ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシルエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジパルミチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＰＲＩＥ）、１，２−ジステリルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＳＲＩＥ）；Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ等（米国特許第５，４９８，６３３号）により報告されているようなアシルカルニチンのカチオン性エステル；ホスファチジルコリンのカチオン性トリエステル、即ち１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−エチルホスホコリン（ここで、炭化水素鎖は、Ｃ12〜Ｃ24の鎖長を有し、飽和または不飽和および分岐または非分岐鎖あってよい）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、カチオン性脂質は異なっていても、同一であってもよい２つのアシル鎖を含む。
【００４９】
本発明の方法により得られる脂質、好ましくは脂質粒子、およびリポソームを含む出発懸濁液または溶液が活性化合物を含み得ることは、本発明の一態様である。好ましくは、活性化合物は薬学的に活性な化合物である。活性化合物をリポソームおよび／または脂質粒子内に組み入れることができるか、またはリポソームおよび／または脂質粒子と結合させることができる。例えば、リポソームの場合、親水性活性化合物をリポソームの水性内部空間内に封入することができ、一方、親油性活性化合物は通常、膜形成脂質と結合する。脂質ナノ粒子の場合、親油性化合物はまた、かかるナノ粒子のマトリックス内に容易に組み入れられる。
【００５０】
リポソームおよび／または脂質粒子は、活性化合物、特に容易に効率よく送達されない薬学的に活性な化合物、例えば非常に難溶性の化合物、感受性（熱不安定性を含む）活性化合物、ペプチド、タンパク質、および核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドの特に好適な薬物担体である。別の好適な活性化合物群は、コロイド状形態でさらに効率よく送達されるものであり、その理由は、静脈内注射後の生物におけるコロイドの分布は、有効性または副作用に関して化合物の溶液の投与よりも有利であるからである。薬学的に活性な化合物の好適な例としては、これらに限定されないが、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および細胞増殖抑制剤または細胞毒性薬が挙げられる。かかる薬剤の例としては、ドキソルビシン、ミトキサントロン、およびアンホテリシンＢが挙げられる。
【００５１】
本発明の文脈内で用いられるリポソームは疎水性薬物のカプセル化に特に適している。例は、タキサン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ミケラミンＢ、ビンクリスチン、および白金化合物、例えばシスプラチンである。かかる疎水性薬物の好適な例は、パクリタキセル、ドセタキセルおよびカンプトテシンであり、これらは水中の溶解度が低い、および／または熱感受性である。
【００５２】
本発明の特に好適な実施形態において、この方法により得られるリポソームは、ＤＯＴＡＰクロリドの形態で使用されるＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＣおよびパクリタキセルを、好ましくは約５０：４７：３の比で含む。この配合物はＭＢＴ−０２０６またはＥｎｄｏＴＡＧ−１とも称する。ＥｎｄｏＴＡＧ−１は約１０％ｍ／ｍトレハロース二水和物溶液中約１０ｍＭの脂質含量を有する。かかるリポソーム製剤の製造は国際特許出願公開第２００４／００２４６８号に開示されている。
【００５３】
本発明にしたがって得られるリポソームは、経口、経皮、静脈内、気管支内、筋肉内、眼内、皮下および腹腔内投与できる。薬物送達系として、リポソームは、薬物摂取を向上させ、急速に消失する薬物の減少を遅らせ、薬物毒性を減少させることにより、化合物の薬物動態および薬力学的効果を大きく変更できる。これらは癌の治療のための化学療法剤、細菌性、ウイルス性および寄生虫性疾患の治療のための抗菌剤の送達について、そしてワクチン送達用免疫学的アジュバントとしての使用に関しても広く研究されてきた。
【００５４】
リポソーム中に含まれる活性化合物は、化粧目的について有効な化合物でもあり得る。かかる化合物は特にヒトの皮膚または毛髪に対して効果を有する化合物であり得る。化粧目的を有する化合物はリポソームを構成する１以上の脂質であってもよい。
【００５５】
リポソームは様々な点で不安定である。リポソームの物理的構造は熱に対して感受性であるので、高温乾燥法はリポソーム膜の分解、機能の喪失または組み入れられているかもしくは結合した活性化合物の減少につながる。組成に応じて、リポソームは熱に対して化学的に不安定でもあり得る。例えば、ある脂質は水性環境中、高温で急速に加水分解または酸化する。
【００５６】
好ましい実施形態において、脂質または脂質粒子を含む出発懸濁液または溶液は場合によっては親水性賦形剤を含む。有用な親水性賦形剤はモノマー、オリゴマーまたはポリマーであってよく、さらにいくつかの化学的分類の化合物において見いだすことができる。本発明の好適な実施形態のうちの一つによると、親水性賦形剤は、糖類、例えば単糖類、二糖類、オリゴ糖類または多糖類、糖アルコール、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、水溶性ポリマーまたはこれらの組み合わせである。
【００５７】
糖類、または炭水化物は、主に炭素、水素、および酸素から構成される化合物として定義される。有用な糖類としては、糖および糖アルコール、オリゴ糖類、水溶性多糖類ならびにこれらの誘導体が挙げられる。本発明の好適な糖類としては、これらに限定されないが、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、ガラクトース、マルトトリオース、マルトペントース、ラフィノース、デキストリン、デキストラン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、キトサン；水溶性セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒプロメロース；アルギネート、可溶性デンプンまたはデンプン画分、キサンタンガム、グアーガム、ペクチン、カラギーン、ガラクトマンナン、ジェランガム、トラガカント（これらの任意の誘導体を包含する）が挙げられる。特に好適な糖類はグルコースおよびトレハロースである。
【００５８】
他の有用な親水性賦形剤は他の化学的分類、例えば水溶性アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質から選択することができる。例えば、グリシンまたは他の天然アミノ酸を使用できる。有用なタンパク質としては、ゼラチン、アルブミン、乳漿タンパク質、大豆タンパク質、または他の食用もしくは植物性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
有用な親水性賦形剤のさらに別の例は、ポリマー、例えば水溶性ポリマー、例えば固体ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、またはポリビニルピロリドンである。
【００６０】
本発明によると、２以上の親水性賦形剤の混合物を使用できる。例えば、いくつかのパラメータ、例えばｐＨ、溶解度および湿潤性を独立して調節する必要があり得る。この場合、第１の親水性賦形剤をコロイド系の基本的担体物質として選択することができ、１以上のさらなる親水性賦形剤を組み入れて、あるｐＨおよび／または湿潤性を得ることができる。
【００６１】
親水性賦形剤、または親水性賦形剤の混合物の水性相中の含量は、水溶性および他の検討事項によって広く変化し、最高約８０重量％までである。さらに好ましくは、約０．１〜約６５重量％である。約３〜約６０重量％、特に約５〜約５０重量％の含量が好ましい。
【００６２】
もちろん、水性媒体はさらなる賦形剤または補助物質（親水性または水溶性であっても、そうでなくてもよい）を含んでもよい。これらの性質および抽出媒の性質に応じて、すなわちこれらの物質が抽出媒中に可溶性であるかどうか、そして抽出媒により抽出されるかどうかによって、かかる物質は乾燥粒子中に含めることができるか、または水および有機溶媒とともに除去することができる。乾燥粒子中に含められる物質は、薬学的に許容されなければならない。
【００６３】
粒子配合物、特に再構成および場合によって非経口投与に使用される粒子配合物において有用であり得るさらなる賦形剤は、一般に製薬科学者に公知である。好適なさらなる賦形剤としては、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、充填剤、凍結乾燥助剤、酸化防止剤、キレート剤、保存料、浸透物質、ｐＨを調節するための酸性またはアルカリ性賦形剤などが挙げられる。
【００６４】
本発明の好適な賦形剤には、安定剤および酸化防止剤が含まれる。酸化防止剤は組み入れられた活性化合物の酸化だけでなく、特に酸化に対して感受性である脂質が使用されるならばコロイドの成分の酸化も防止し得る。有用な化合物としては、例えば、脂溶性酸化防止剤、例えばα−、β−、およびγ−トコフェロール、ユビキノール、リコピン、α−およびβ−カロテン、ノルジヒドログアイアレチン酸、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、デスフェラール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、シリンガ酸、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ｐ−クマリン酸、フェルラ酸、シナピン酸およびカフェ酸、アスコルビルパルミテート、カルノソール、エスクレチン、エスクリン、フラキセチン、フラキシン、ケルセチン、モリンなどが挙げられる。特に好適なのは、α−トコフェロールおよびエチレンジアミン四酢酸（その薬学的に許容される誘導体を含む）である。他方、コロイド系の構成に化学的に純粋な半合成または合成飽和脂質を用いるならば、酸化防止剤は必要ない。
【００６５】
前述のように、脂質および／または脂質粒子を含む出発懸濁液または溶液を、多孔性デバイスを通して押し出し、続いて連続様式でノズルに通過させることが本発明の一つの態様である。十分小さな直径を有するノズルを利用することにより、多孔性デバイスから押し出された後の懸濁液の流れを制限し、これにより懸濁液を加圧する。多孔性デバイスおよびノズルを順次使用することにより、本発明の方法を実施する場合に多孔性デバイスの両側でほぼ等しく高圧にすることが可能になる。
【００６６】
本発明の方法を行うのに好適な装置を開示することも本発明の一態様である。この装置は、少なくとも１つのノズルならびに脂質を含む懸濁液または溶液を多孔性デバイスおよびノズルに通過させるのに好適な少なくとも１つのポンプに連結された少なくとも１つの多孔性デバイスを含む。
【００６７】
このように、リポソームを製造するための装置であって：
（ｉ）脂質を含む溶液または懸濁液を供給するための容器、
（ｉｉ）多孔性デバイス、
（ｉｉｉ）ノズル、
（ｉｖ）導管により容器（ｉ）を多孔性デバイス（ｉｉ）と連結させるための手段、
（ｖ）圧力を発生させるための手段、ならびに
（ｖｉ）場合によってリポソームを含む溶液または懸濁液を脱水するための手段および
（ｖｉｉ）場合によって得られたリポソームを回収する手段
を含む装置を提供することが本発明のさらなる態様である。
【００６８】
本発明の装置の好適な実施形態図を図１および２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、１つのデバイスにおいてリポソームを製造し、脱水するための装置を示す。
【図２】図２は、リポソームをシングルパス様式で製造するための装置を示す。
【００７０】
本発明の方法によりリポソームを製造するために使用されるか、または本発明の装置の一部である多孔性デバイスは、好ましくは約３００ｎｍ〜約５０ｎｍ、さらに好ましくは約２００ｎｍ〜約１００ｎｍの孔サイズを有する。多孔性デバイスは少なくとも１つの多孔性層を含む。即ち、多孔性デバイスは１つの多孔性層または複数の同一もしくは異なる多孔性層を含み得る。多孔性デバイスは膜、フィルター、フリットまたは孔を含む任意の他の制限デバイスおよびこれらの組み合わせであってよい。デバイスはポリマー物質、金属、ガラス、セラミックまたは任意の他の好適な物質から構成され得る。物質は化学的に不活性で、溶液／懸濁液の構成要素について低吸収性であり、湿潤性であり得る。好適な実施形態において、多孔性デバイスは膜、好ましくはポリカーボネート膜である。もう一つ別の実施形態において、多孔性デバイスは滅菌濾過膜であってよい。Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．（米国）により製造されるポリカーボネート膜は本発明の実施においてうまく機能することが判明している。本発明によると、多孔性デバイスの両側の圧力は好ましくは実質的に同一である。
【００７１】
多孔性デバイスシステムに懸濁液を１回だけ通過させるので、多孔性デバイスは孔の目詰まりのために変える必要はない。目詰まりは一般に脂質組成、純度および濃度などの変数、ならびに使用される圧力および流速に依存する。多孔性デバイスに２回通過させることは本発明の目的ではない。
【００７２】
押出に使用される多孔性デバイス、好ましくは膜は、多孔性デバイスを埋め込んだ少なくとも片面、好ましくは両面上の少なくとも１つのドレインディスクにより支持される。Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．（米国）により製造される、この種類のドレインディスクは本発明の実施においてうまく機能することが判明している。
【００７３】
少なくとも１つのドレインディスクは、特にノズルに連結された多孔性デバイスの面上の少なくとも１つのフリットによりさらに機械的に支持される。このような種類の膜ホルダーは当業者には一般的に周知である。
【００７４】
フリット成分は一般に、圧縮および／または焼結により通常部分的に結合したビーズ様材料から構成される構造部材である。フリット製造において有用な多くの材料には、セラミック、ガラス金属および金属／カーバイドビーズ様材料が含まれ、これらを結合させてフリットにする。金属に対して脂質の親和性は低いので、材料の実質的に全体的な処理量を促進するために金属フリットが好適である。好適な金属フリットはステンレス鋼製のものである。フリットを通るパスは直線的パスではなく、パス壁は変則的である。フリットは、棒状または円盤状をはじめとする多くの形態で製造できる。好適なフリットはＡｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ（ニュージャージー州イーストブランズウィック）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ペンシルバニア州ステートカレッジ）およびＲａｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（マサチューセッツ州ウォーバーン）などの多くの供給源から入手可能である。フリットは孔サイズ範囲全体にわたって不均一な孔サイズを有することを特徴とする。フリット孔サイズ範囲は、フリットを通過するか、またはフリットにより押し出される物質に基づいて実験的に決定することができる。これは、その一部が前記孔サイズ以上および前記孔サイズ以下にある粒子サイズの範囲を規定する。好適な孔サイズは≧１μｍ、好ましくは１〜５０μｍ、さらに好ましくは５〜２０μｍである。
【００７５】
埋め込まれた多孔性デバイス、好ましくはドレインディスクおよび場合によっては少なくとも１つのフリットにより支持される埋め込まれた膜の強度の増加は、膜を通る高い流速の押出を可能にする。多孔性デバイス（好ましくは膜）は閉塞せず、押出ステップの圧力により変形しない。驚くべきことに、膜タイプの押出は膜材料の変形に対する最小耐性により速度を制限されない。
【００７６】
本発明の非常に好適な実施形態を図２に示し、図中、好適な多孔性デバイスの組み立てを示す。特に、この好適な多孔性デバイスは膜、好ましくはドレインディスク（１３）により両面上で支持されるポリカーボネート膜（１４）を含む。さらに、好適な多孔性鎖はさらなる多孔性材料、好ましくはフリットを含み、このフリットはノズルと連結した多孔性デバイスの面上に位置する。
【００７７】
多孔性デバイスを通って押し出した後、脂質／リポソームの懸濁液または溶液を続いてノズルに通過させることは、本発明のさらなる態様である。本発明の方法のこのステップを行うために有用であるか、または本発明の装置の一部であるノズルも当業者には一般的に周知である。これらとしては、例えば、回転ディスクノズル、衝突噴流ノズル、キャピラリーノズル、シングルオリフィスノズル、振動型または拍動型超音波ノズル、二流体ノズル、例えば同軸二流体ノズルなどが挙げられる。本発明の好適な実施形態において、ノズルはオリフィスノズルである。リポソームまたはリポソームの単峰型分布をさらに改善するために用いられるノズルはＳｃｈｌｉｃｋ ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕｎｔｅｒｓｉｅｍａｕ（ドイツ）製造のオリフィスノズル１２１ＶＧ１／４であった。本発明においては、ノズルの好適な孔サイズは約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、さらに好ましくは約０．１ｍｍ〜約０．２ｍｍであるが、さらに大きな孔サイズまたはさらに小さな孔サイズのノズルも使用できる。本発明の装置において、ノズルは、得られたリポソームを脱水するために好適な容器、特に噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥による脱水に適した容器中に含まれ得る。
【００７８】
溶液または懸濁液の流速は、約１ｍｌ／分〜約１０００ｍｌ／分の範囲である。さらに典型的には、本発明の方法により、１０ｍｌ／分〜２００ｍｌ／分、さらに好ましくは約２０ｍｌ／分〜約１００ｍｌ／分の流速を適用して、リポソームを製造した。
【００７９】
別の実施形態によると、多孔性デバイスを通って脂質を含む懸濁液または溶液を押し出すために使用される圧力と、ノズルを通って懸濁液または溶液を通過させるための圧力とは、実質的に同じであり、特に０．５バール〜１２００バール（５×１０４Ｐａ〜１．２×１０８Ｐａ）である。さらに典型的には、５バール〜６００バール（５×１０５Ｐａ〜６×１０７Ｐａ）、好ましくは約１０バール〜約５００バール（１×１０６Ｐａ〜約５×１０７Ｐａ）、さらに好ましくは約２０バール〜約１５０バール（２×１０６Ｐａ〜約１．５×１０７Ｐａ）でリポソームを本発明の方法により製造できる。
【００８０】
脂質／リポソーム懸濁液または溶液を、前述のような本発明の方法において用いられる圧力および流速を用いてポンプ輸送することは、当該分野において一般的に周知の好適な高圧ポンプにより達成できる。ピストンポンプを用いる場合、懸濁液をポンプヘッド自体の中へ吸い込むことができる。外部ポンプデバイスによりフィード貯蔵容器からのフィードストックへの外部ポンプ輸送が可能である。本発明はピストンポンプに限定されず、隔膜ポンプをはじめとする任意の好適なポンプ手段を使用できる。十分な水圧ヘッドを有し、したがって十分な流速および圧力差がある実施形態においては、ポンプは必要ではない。
【００８１】
約１０バール〜約５００バール（１×１０６Ｐａ〜約５×１０７Ｐａ）の圧力を使用することにより、最高約４００ｍＭ脂質までの高い脂質濃度を含む出発懸濁液または溶液を用いてリポソームを製造することが可能になるということは、本発明のもう一つ別の態様である。多孔性デバイス押出のために高圧を使用することにより、高い脂質濃度でも押出多孔性デバイスの目詰まりを防止することができる。ポリカーボネート多孔性デバイスを用いる従来のリポソームサイズ分別技法は７バールより低い圧力を使用し、したがって６０μｍｏｌ／ｍｌの脂質濃度に限定された。本発明のプロセスにおいて、約２０ｍｌ／分以上の急速な押し出し速度は、圧力がさらに高い場合、例えば２０バール〜１５０バール（２×１０６Ｐａ〜１．５×１０７Ｐａ）の範囲の圧力が使用される場合に、高い脂質濃度でも達成される。
【００８２】
本発明の実施形態において記載される本発明の方法は、多孔性デバイスを通って１回押し出し、続いてノズルに通過させることによる、連続した再現性のある様式でのリポソームの急速製造を可能にする。この方法を実施するために使用される圧力が増加すると、このプロセスにより製造されるリポソームのサイズが減少し、サイズ分布が狭くなる。
【００８３】
本発明の方法により製造されるリポソームが、狭いサイズ分布により具体化される高いサイズ均一性を有することは本発明のもう一つ別の態様である。高いサイズ均一性または狭いサイズ分布は低い多分散性指数により特徴づけられる。好ましくは、本発明により製造されるリポソームは、約０．３より低い多分散性指数、さらに好ましくは約０．２より低い多分散性指数、最も好ましくは約０．１より低い多分散性指数により特徴づけられる。リポソームの多分散性（ＰＩ）はＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を用いて光子相関分光法（ＰＣＳ）により決定できる。
【００８４】
本発明のもう一つ別の態様において、さらに長期間リポソームを保存するために、製造後にリポソームを脱水できる。リポソームを脱水するための好適な方法としては、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥が挙げられる。リポソームを含む懸濁液の微粒化による液滴の形成は、両脱水法の最初のステップである。リポソームを減圧下で脱水することもできる。特に好適な実施形態において、２００６年１０月２７日に出願された共有欧州特許出願第０６ ０２２ ５３８．０号"Ｐｅｒｃｏｌａｔｉｖｅ ｄｒｙｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ"に記載されるようにパーコレーティブ乾燥によりリポソームを脱水することができる。
【００８５】
脂質、好ましくは脂質粒子、最も好ましくはリポソームを含む懸濁液または溶液を、好ましくは高圧でノズルに通過させることが本発明の一つの目的であることはすでに記載した。この方法で懸濁液を微粒化し、これにより懸濁液または溶液から液滴を形成できる。
【００８６】
したがって、脂質を含む出発懸濁液または溶液からリポソームを製造し、噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥により前記リポソームを脱水することを含む連続法を提供することは本発明のもう一つ別の態様であり、これによりこの方法は脂質を含む懸濁液または溶液を、多孔性デバイスを通して押し出し、続いてこの懸濁液または溶液を、ノズルに通過させ、これにより懸濁液を微粒化して液滴を形成する。
【００８７】
液滴形成後のリポソームの乾燥は、液滴をガス流れ、好ましくは加熱されたガス流れと接触させることにより行うことができ、固体粒子を得る。好ましくは、使用されるガス流れは不活性ガスである。乾燥ガスは、好ましくは、０．１容量％未満、好ましくは０．０５容量％未満の酸素を含む低酸素ガスまたは無酸素ガスである。不活性気体は、酸素と置換するために窒素、二酸化炭素、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンおよびラドンまたは他の不活性ガスをポンプで供給することにより、可燃性の高い溶液を含む加熱乾燥系の安全性を増加させる。これらの系の効果は、酸素を完全に除去すること、または無視できるレベルまで減少させることのいずれかである。本発明の好ましい実施形態において、窒素を不活性気体として使用する。本発明の他の実施形態において、不活性ガスは配合物中に含まれる活性成分および賦形剤を保護する。好ましくは、噴霧乾燥は、噴霧乾燥に適したデバイス中で行う。噴霧乾燥は例えば乾燥塔で行うことができる。脱水されたリポソームをガス流れから分離し、回収する。
【００８８】
本発明の方法を、当業者に不活性噴霧乾燥デバイスとして公知のパススルーまたはループ操作で行うことができる。パススルーまたはループ操作において、不活性ガスを乾燥ガスとして加熱することができる。乾燥ガスを次いで、懸濁液をリポソームとともに含む懸濁液の乾燥器フィードを噴霧乾燥するために使用できる。噴霧乾燥を過剰圧力、標準圧力または不完全真空下で行うことができる。乾燥ガスを用いて許容できる最高システム温度および最大容量で規格に準拠した粉末を産生するならば、有利なプロセス圧力範囲が存在し得る。酸素のシステム中への導入は回避しなければならないので、プラントは好ましくは標準圧力または常圧より０〜２００ｍバール（２×１０４Ｐａ）高い若干超過気圧下で行うことができる。プロセスチャンバー内部の加熱された乾燥ガスは１０℃〜５００℃の温度を示し得るので、乾燥器フィードが乾燥ガスと接触すると溶媒が蒸発する。さらに典型的には、懸濁液を本発明の方法により３０℃〜２５０℃、さらに好ましくは約８０℃〜約２００℃で乾燥した。
【００８９】
乾燥したリポソーム生成物の分離は生成物を排出しながら行うことができる。生成物流れを好適な手段により、例えばフィルターまたはサイクロンを用いて廃ガス流れから分離することができ、場合によって冷却し、必要ならば保護ガス雰囲気下または包装して保存することができる。集塵のために圧力サージクリーニングを備えた表面フィルターを使用する場合、クリーニングは任意の無酸素ガスを用いて、好ましくは予熱された不活性ガスまたは乾燥ガスのスプリット流れを用いて行うことができる。
【００９０】
溶媒を濃縮し、不活性ループを通して処理することにより排気を再循環させることができる。パススルー操作において新鮮な乾燥ガスを繰り返しプロセスチャンバー中に供給し、プロセスチャンバーから出る排ガスを廃棄する。本発明の方法は、ループ操作におけるガス再循環操作で行うこともでき、使用済み乾燥ガスは溶媒を含まない。パススルー操作との違いは、排ガスを乾燥ガスとして再度使用できるような方法でエネルギー入力により再循環し、調節することができることである。調節中、プロセスチャンバー中で蒸発した液体成分を排ガスから部分的に分離して、これらも再循環することができる。過剰な溶媒および不活性ガスを除去しながら、できるだけ完全にガスをリサイクルすることが経済的観点から望ましい。
【００９１】
本発明の乾燥リポソームを製造するための装置の好適な実施形態を図１に示す。
【００９２】
液滴を噴霧凍結ステップで凍結することは、前記液滴を低温流体と接触させることにより行うことができる。低温流体は冷却ガスまたは低温液体であり得る。低温液体は冷却された液体、例えばアルゴン、ヘリウム、水素、窒素、酸素、メタン、二酸化炭素、亜酸化窒素、イソペンタン、ヘキサン、またはエタノールおよび他の流体、例えば炭化水素流体またはこれらの混合物である。本発明の好ましい実施形態において、窒素を低温液体として使用する。液滴が低温流体と接触すると、凍結粒子が形成される。重要な可変操作パラメータとしては、ローター速度、微粒化ガス圧、環状間隙ガス圧、空気体積、溶液スプレー速度およびスプレーガンノズル直径、流動床のスリット幅ならびに入口および出口空気温度が挙げられる。
【００９３】
凍結ステップにより得られる粒子中に含まれるリポソームを、前記粒子を解凍することなく減圧下で脱水できることは本発明の一つの特性である。減圧下で、水および他の溶媒を凍結粒子から昇華により除去する。減圧により熱不安定化合物の乾燥時間を短縮することが可能になる。
【００９４】
リポソームが組み入れられているか、または埋め込まれている固体粒子を得るために、許容できる程度のコロイドの組み入れに有利な親水性賦形剤のコロイド系に対する重量比を選択することが有用である。例えば、水性液体が親水性賦形剤より多くのコロイド系を含むならば、コロイド系の一部は本発明の方法により産生される固体粒子中に組み入れられていないかまたは埋め込まれていなくてもよい。したがって、親水性賦形剤のコロイド系に対する重量比は少なくとも約１、さらに好ましくは少なくとも約２、例えば約３〜約５またはさらにはそれ以上であるのが好適である。一方、非常に高い比は避けるべきである。その理由は、コロイド系の特定の含量にしては粉末体積がかなり大きくなり、したがって再構成後の液体組成物の体積が大きくなるからである。したがって、約５０以上、またはさらには１００以上の比はあまり好ましくない。本発明によると、約５０未満、特に約２０未満の比が特に好適である。
【００９５】
指摘したように、本発明の方法はシングルパス操作で懸濁液中のリポソームの製造および乾燥粉末への変換も可能にする。乾燥粒子は、乾燥粒子中に埋め込まれているかまたは組み入れられているリポソームの担体として作用する親水性賦形剤を含む。この方法は比較的低温で行うことができるので、噴霧乾燥に関連して熱不安定性であるかまたは熱不安定性活性剤を含むリポソームの乾燥および安定化には特に有利である。
【００９６】
本発明の方法により脱水されたリポソームを好適な水性媒体中で再水和することができる。意外にも、リポソームおよび／または脂質粒子を含む懸濁液を製造し、容易に再構成できるような方法で本発明の方法により可能なワンステップ操作でさらに乾燥できることが見いだされた。穏やかな条件、特に水性有機溶液を不活性ガスと組み合わせて用いる低噴霧乾燥温度は、この方法を熱不安定性リポソームの製造および乾燥に関して非常に有用にする。
【００９７】
本発明は、開示された方法により得られた脱水されたリポソームを開示する。これらのリポソームは、水性媒体中、好ましくは製薬用途に好適な媒体中、最も好ましくは注射用水中でのリポソームの再水和後に、約５００ｎｍより小さく、好ましくは約２００ｎｍより小さい平均直径を有する。脱水されたリポソームを水性媒体と単に混合することによりリポソームを再水和することができる。開示された脱水リポソームは再水和後に約０．５より低く、好ましくは約０．２より低く、最も好ましくは約０．１５より低い多分散性指数を有する。リポソームは、約１０μｍ〜約１０００μｍ、好ましくは約５０μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有する乾燥粒子中に含まれ得る。
【００９８】
本発明の方法により得られるリポソーム、乾燥粒子、またはこれを含む粉末を医薬または診断用製剤の製造において用いることができる。粒子が薬物投与形態の全ての要件を満たすならば、そのように使用し、適切な第１包装容器中に直接充填することができる。あるいは、粒子をさらに加工することができる。例えば、粒子をさらなる活性および／または不活性成分、例えば薬学的に許容される担体として混合することができるか、または圧縮して薬物錠剤にすることができる。
【００９９】
リポソームを含む乾燥粒子を、例えば注射用水または他の緩衝系で再構成した後、結果として得られた配合物を非経口（例えば、静脈内または局所領域）注射、経口投与、肺または鼻吸入に用いることができる。溶媒を、製造法において用いる場合、本発明の方法の間に許容限界または検出可能限界以下で抽出され、このことは従来公知の方法よりも特に優れた本発明の利点である。
【０１００】
実施例
次の実施例は本発明およびその好適な実施形態のいくつかを、その範囲を制限することなくさらに説明することを意味する。さらなる実施例および実施形態は、説明から、場合によっては一般的に公知の技術情報と組み合わせて、特にコロイド状薬物担体系の設計および使用ならびに噴霧乾燥、不活性噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥の既知原則と組み合わせて容易に誘導されるであろう。
【０１０１】
リポソームの分析
リポソームの粒子サイズ（Ｚ平均）および多分散性（ＰＩ）を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を用いた光子相関分光法（ＰＣＳ）により分析した。ＤＯＴＡＰ−ＣｌおよびＤＯＰＣの脂質濃度を、２０５ｎｍでＵＶ／ＶＩＳ検出器を用いたＨＰＬＣにより分析した。成分の分離および定量化を、Ｃ１８プレカラムを有するＣ８ ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ６０ ＲＰ選択Ｂカラム（２５０×４ｍｍ、５μｍ粒子サイズ）を用いて行った。
【０１０２】
リポソーム製造
合計脂質含量が１０〜４００ｍＭであるカチオン性リポソームを、水性有機相中へのエタノール注入により製造した。ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン−クロリド）およびＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）をどちらもＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、米国）から入手し、エタノール中に溶解させた。１０．５％トレハロース溶液（Ｆｅｒｒｏ Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ，米国）中に最高３０％までの有機物含量で注入すると、多重膜リポソームが自発的に形成された。所定のサイズ分布を有するリポソームを得るために、懸濁液を、１００または２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜ならびに０．１および０．２のオリフィス直径を有するノズルに１回通過させた。
【０１０３】
粒子の分析
残存する水分を、ヘッドスペースオーブンを有するクーロンＫａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定装置（Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｊｅｎａ ＡＧ、ドイツ）により測定した。粒子サイズ分布を、Ｈｅ−Ｎｅレーザービーム装備レーザー回折分析器（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ Ｘ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ドイツ）を用いて測定した。
【０１０４】
実施例１
例えば、Ｍｕｎｄｕｓ等により国際特許出願公開第２００４／００２４６８号で開示されているようなエタノール注入により、１０ｍＭの合計脂質含量を有するカチオン性リポソームを製造した。ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン−クロリド）５ｍＭおよびＤＯＰＣ５ｍＭ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（どちらもＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、米国）から入手）をエタノール中に溶解させた。１０．５％トレハロース溶液（Ｆｅｒｒｏ Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ、米国）中に注入すると、多重膜リポソームが自発的に形成された。
【０１０５】
エタノール注入により製造される水性有機多重膜リポソーム分散液を、ＩＳＣＯ ＤＭ ２６０シリンジポンプを用いてオリフィスノズルに連結された多孔性デバイスを通過させた。適用された流速および結果としての圧力を第１表に表示する。多孔性デバイスは、ポリエステルドレインディスク（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、米国）により両面から支持された２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．、米国）と、それに続いて連結されたノズルに面する膜／ドレインディスク面をさらに支持する５μｍの濾過孔を有するステンレス鋼フリットから構成されていた。０．１ｍｍのオリフィス直径を有する１２１ＶＧ１／４ノズル（Ｓｃｈｌｉｃｋ、ドイツ）を使用した。ノズルに通した後にリポソームを集め、分析した。
記載の方法により、異なる脂質濃度、流速および圧力を用いて製造されたリポソームの特性を第１表に示す。
【０１０６】
第１表
【表１】
【０１０７】
実施例２
１００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を用いて実施例１にしたがって方法を行った。異なる流速および圧力を用いて、記載の方法により製造されたリポソームの特性を第２表に示す。
【０１０８】
第２表
【表２】
【０１０９】
実施例３
実施例１にしたがい、０．２ｍｍのオリフィスを有するノズルを用いて方法を行った。異なる脂質濃度、流速および圧力を用いて、記載の方法により製造されたリポソームの特性を第３表に示す。
【０１１０】
第３表
【表３】
【０１１１】
実施例４
水性有機分散液のエタノール濃度を１０％〜３０％［ｗ／ｖ］の間で変える以外は実施例１にしたがって方法を行った。異なるエタノール濃度、流速および圧力を用いて、記載の方法により製造されたリポソームの特性を第４表に示す。
【０１１２】
第４表
【表４】
【０１１３】
実施例５
２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を用いる以外は実施例４にしたがって方法を行った。異なるエタノール濃度、流速および圧力を用いて、記載の方法により製造されたリポソームの特性を第５表に示す。
【０１１４】
第５表
【表５】
【０１１５】
実施例６
２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して水性有機分散液をポンプで供給し、２０ｍｌ／分の流速、１０または３０％［ｗ／ｖ］のエタノール濃度で、０．１ｍｍまたは０．２ｍｍの直径のオリフィスを有するノズルに通過させる以外は、実施例１と同様にして方法を行った。結果としての噴霧圧力は２０〜２２バールであった。
【０１１６】
ノズル（４）を通過させて分散液を微粒化して液滴にした後、液滴を不活性乾燥ガスと乾燥塔（５）（Ｂ−２９０およびＢ−２９５、Ｂｕｃｈｉ（スイス））中で接触させることにより、水分を蒸発させた。得られた乾燥粒子をサイクロン（Ｂｕｃｈｉ、スイス）により不活性ガスから分離した。ヒーター（Ｂｕｃｈｉ Ｂ２９０の機構）を用いて２００℃の入口温度まで乾燥不活性ガス温度を加熱し、その結果出口温度が約７５℃になった。不活性乾燥ガス、ガス状窒素を３８ｍ３／時の一定乾燥体積流速で供給した。分離した固体状のなめらかな粒子は５０〜５００μｍの範囲の粒子サイズを有し、残存水分は３％未満であった。注射用水で再構成した後、リポソーム分散液を得た。結果として得られたリポソームの平均直径および多分散性指数を第６表に示す。デバイスのセットアップを図１に図示する。
【０１１７】
第６表
【表６】
【０１１８】
実施例７
実施例１に記載のトレハロース溶液中にエタノール性脂質溶液を注入することによりリポソームを形成した後、エタノール、またはメタノール、またはアセトンをリポソーム懸濁液に添加して、溶媒の最終濃度４０％［ｗ／ｖ］を得た。結果として得られた分散液を、２００ｎｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して２０ｍｌ／分の流速でポンプを用いて通過させ、続いて前述のように０．１ｍｍオリフィスノズルに通過させた。
【０１１９】
分散液を微粒化して液滴にした後、前記液滴を、１２０℃の入口温度を使用する以外は実験例６に記載したようにして脱水した。再水和リポソームの特性を前述のように分析した。結果として得られる出口温度、平均サイズおよび多分散性指数を第７表に示す。
【０１２０】
アセトンを共溶媒として使用することにより、わずか４５℃の非常に低い乾燥温度を達成できた。特に、アセトンの使用によっても０．１３の低い多分散性指数が得られた。このように、前述の方法でアセトンを共溶媒として使用することは温度感受性活性剤を含むリポソームの製造に特に有益であると思われる。
【０１２１】
第７表
【表７】
【０１２２】
図の説明
図１：１つのデバイスにおいてリポソームを製造し、脱水するための装置。
（１）シリンジポンプ
（２）多孔性デバイス
（３）入口温度
（４）ノズル
（５）乾燥塔
（６）出口温度
（７）サイクロン
（８）生成物
（９）不活性ループ（場合によって）
図２：リポソームをシングルパス様式で製造するための装置
（１０）ストック溶液
（１１）ポンプ
（１２）フィルターホルダー
（１３）ドレインディスク
（１４）膜、好ましくはポリカーボネート膜
（１５）多孔性物質、好ましくはフリット
（１６）ノズル
【符号の説明】
【０１２３】
１ シリンジポンプ、 ２ 多孔性デバイス、 ３ 入口温度、 ４ ノズル、 ５ 乾燥塔、 ６ 出口温度、 ７ サイクロン、 ８ 生成物、 ９ 不活性ループ（場合によって）、 １０ ストック溶液、 １１ ポンプ、 １２ フィルターホルダー、 １３ ドレインディスク、 １４ 膜、好ましくはポリカーボネート膜、 １５ 多孔性物質、好ましくはフリット、 １６ ノズル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームをシングルパス様式で製造する方法であって：
（ａ）脂質を含む懸濁液または溶液を提供するステップ、
（ｂ）多孔性デバイスを通してステップ（ａ）の懸濁液または溶液を押し出するステップ、続いて
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記懸濁液または溶液を、ノズルに通過させるステップ、
（ｄ）場合によってステップ（ｃ）後に形成されたリポソームを回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）が懸濁液または溶液を微粒化して、液滴を含むリポソームにすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、さらに
（ｄ）ステップ（ｃ）のリポソームを脱水するステップ、および
（ｅ）場合によって（ｄ）後に形成された脱水リポソームを回収するステップ、および
（ｆ）場合によって、ステップ（ｄ）の脱水リポソームを水性媒体中で再水和させるステップ
を含む方法。
【請求項４】
前記脱水ステップ（ｄ）を噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥により行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の懸濁液または溶液が水性媒体を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記水性媒体が、水と少なくとも部分的に混和性である少なくとも１つのさらなる液体構成要素、好ましくは有機溶媒を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記有機溶媒がアルコールまたはケトン、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯもしくはこれらの混合物、好ましくはエタノールである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液が好ましくは脂質粒子を含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液の前記脂質粒子がＭＬＶである、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームの粒子サイズ分布が、ステップ（ａ）の前記懸濁液の前記脂質粒子の粒子サイズ分布と比較して減少している、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが実質的に均一である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが０．３未満、好ましくは０．１未満の多分散性指数を有する、請求項１から１１のいずれか１に項記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１から１２のいずれか１に項記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが単層リポソームである、請求項１から１３までまでのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液が最高４００ｎＭまでの脂質濃度を有する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液が少なくとも１つのカチオン性脂質、好ましくはＤＯＴＡＰを含む、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液および／またはステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが少なくとも１つの活性化合物を含む、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記活性化合物が薬学的に活性な化合物、例えば抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、細胞増殖抑制剤または細胞毒性薬である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
水と前記のさらなる液体構成要素の前記比が約７０：３０〜約４０：６０（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約８０：２０〜約６０：４０（ｖ／ｖ）である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液が親水性賦形剤を含む、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、前記懸濁液または溶液の圧力が多孔性デバイスの両側でほぼ同じである、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）の前記多孔性デバイスが約５０〜約３００ｎｍ、好ましくは約１００〜約２００ｎｍの孔サイズを有する、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記多孔性デバイスが膜、好ましくはポリカーボネート膜である、請求項１から２２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記多孔性デバイス、好ましくは膜が少なくとも１つのドレインディスクにより少なくとも片面から支持されている、請求項１から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記の少なくとも１つのドレインディスクが少なくとも１つのフリットにより支持されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｃ）の前記ノズルがオリフィスノズルである、請求項１から２５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）の前記ノズルが約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍ〜約０．２ｍｍの直径を有する、請求項１から２６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記懸濁液または溶液を、ステップ（ｂ）において前記多孔性デバイスを通して押し出し、続いてステップ（ｃ）において、約１ｍｌ／分〜１０００ｍｌ／分、好ましくは約２０ｍｌ／分〜１００ｍｌ／分の流速でノズルに通過させる、請求項１から２７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記懸濁液または溶液を、ステップ（ｂ）において前記多孔性デバイスを通して押し出し、続いてステップ（ｃ）において、約０．５バール〜１２００バール、好ましくは約５バール〜６００バールの圧力でノズルに通過させる、請求項１から２８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記脱水ステップ（ｄ）を、ガス、好ましくは加熱されたガスの流れを用いて行う、請求項３から２９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ガスが不活性ガス、好ましくは窒素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記脱水ステップ（ｄ）を噴霧乾燥により、好ましくはパススルー操作またはループ操作で行う、請求項３から３１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記脱水ステップ（ｄ）を噴霧凍結乾燥により行い、その際、ステップ（ｃ）において得られるリポソームを低温流体と接触させることにより凍結を達成する、請求項３から２９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記低温流体が冷却ガスまたは低温液体、好ましくは窒素である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記噴霧凍結の結果得られる凍結粒子を続いて好ましくは減圧下で脱水する、請求項３３から３４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１から３５に記載の方法により製造されるリポソーム。
【請求項３７】
請求項３から３６までのいずれか１項に記載の方法により製造される脱水されたリポソームであって、前記の脱水されたリポソームを前記水性媒体と混合することによる水性媒体中での再水和後に、約５００ｎｍ未満、好ましくは約２００ｎｍ未満の平均直径を有するリポソーム。
【請求項３８】
前記脱水リポソームを前記水性媒体と混合することによる水性媒体中での再水和後に、約０．２未満、好ましくは約０．１５未満の多分散性指数を有する、請求項３７に記載の脱水されたリポソーム。
【請求項３９】
約１０μｍ〜約１０００μｍ、好ましくは約５０μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有する乾燥粒子中に含まれる、請求項３７から３８までのいずれか１項に記載の脱水されたリポソーム。
【請求項４０】
医薬品を製造するための、請求項３６から３９までのいずれか１項に記載のリポソームの使用。
【請求項４１】
ノズルに連結された多孔性デバイスを含む、リポソームを製造するための装置。
【請求項４２】
（ｉ）脂質を含む溶液または懸濁液を供給するための容器、
（ｉｉ）多孔性デバイス、
（ｉｉｉ）ノズル、
（ｉｖ）前記容器（ｉ）を多孔性デバイス（ｉｉ）と導管により連結させるための手段、
（ｖ）圧力を発生させるための手段、ならびに
（ｖｉ）場合によって、リポソームを含む前記溶液または懸濁液を脱水するための手段、および
（ｖｉｉ）場合によって、得られたリポソームを回収するための手段
を含む、請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
前記ノズルがオリフィスノズルである、請求項４１または４２に記載の装置。
【請求項４４】
前記ノズルが約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍ〜約０．２ｍｍの直径を有する、請求項４１から４３までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４５】
前記ノズルが脱水のための手段中に含まれる、請求項４１から４４までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４６】
前記多孔性デバイスが５０ｎｍ〜３００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの孔サイズを有する、請求項４１から４５までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４７】
前記多孔性デバイスが膜、好ましくはポリカーボネート膜である、請求項４１から４６までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４８】
前記膜が少なくとも１つのドレインディスクにより少なくとも片面から支持されている、請求項４１から４７までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４９】
前記の少なくとも１つのドレインディスクが少なくとも１つのフリットにより支持されている、請求項４８に記載の装置。
【請求項１】
リポソームをシングルパス様式で製造する方法であって：
（ａ）脂質を含む懸濁液または溶液を提供するステップ、
（ｂ）多孔性デバイスを通してステップ（ａ）の懸濁液または溶液を押し出するステップ、続いて
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記懸濁液または溶液を、ノズルに通過させるステップ、
（ｄ）場合によってステップ（ｃ）後に形成されたリポソームを回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）が懸濁液または溶液を微粒化して、液滴を含むリポソームにすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、さらに
（ｄ）ステップ（ｃ）のリポソームを脱水するステップ、および
（ｅ）場合によって（ｄ）後に形成された脱水リポソームを回収するステップ、および
（ｆ）場合によって、ステップ（ｄ）の脱水リポソームを水性媒体中で再水和させるステップ
を含む方法。
【請求項４】
前記脱水ステップ（ｄ）を噴霧乾燥または噴霧凍結乾燥により行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の懸濁液または溶液が水性媒体を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記水性媒体が、水と少なくとも部分的に混和性である少なくとも１つのさらなる液体構成要素、好ましくは有機溶媒を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記有機溶媒がアルコールまたはケトン、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯもしくはこれらの混合物、好ましくはエタノールである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液が好ましくは脂質粒子を含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液の前記脂質粒子がＭＬＶである、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームの粒子サイズ分布が、ステップ（ａ）の前記懸濁液の前記脂質粒子の粒子サイズ分布と比較して減少している、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが実質的に均一である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが０．３未満、好ましくは０．１未満の多分散性指数を有する、請求項１から１１のいずれか１に項記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１から１２のいずれか１に項記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが単層リポソームである、請求項１から１３までまでのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液が最高４００ｎＭまでの脂質濃度を有する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液が少なくとも１つのカチオン性脂質、好ましくはＤＯＴＡＰを含む、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液および／またはステップ（ｃ）後に得られる前記リポソームが少なくとも１つの活性化合物を含む、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記活性化合物が薬学的に活性な化合物、例えば抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、細胞増殖抑制剤または細胞毒性薬である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
水と前記のさらなる液体構成要素の前記比が約７０：３０〜約４０：６０（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約８０：２０〜約６０：４０（ｖ／ｖ）である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）の前記懸濁液または溶液が親水性賦形剤を含む、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、前記懸濁液または溶液の圧力が多孔性デバイスの両側でほぼ同じである、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）の前記多孔性デバイスが約５０〜約３００ｎｍ、好ましくは約１００〜約２００ｎｍの孔サイズを有する、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記多孔性デバイスが膜、好ましくはポリカーボネート膜である、請求項１から２２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記多孔性デバイス、好ましくは膜が少なくとも１つのドレインディスクにより少なくとも片面から支持されている、請求項１から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記の少なくとも１つのドレインディスクが少なくとも１つのフリットにより支持されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｃ）の前記ノズルがオリフィスノズルである、請求項１から２５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）の前記ノズルが約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍ〜約０．２ｍｍの直径を有する、請求項１から２６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記懸濁液または溶液を、ステップ（ｂ）において前記多孔性デバイスを通して押し出し、続いてステップ（ｃ）において、約１ｍｌ／分〜１０００ｍｌ／分、好ましくは約２０ｍｌ／分〜１００ｍｌ／分の流速でノズルに通過させる、請求項１から２７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記懸濁液または溶液を、ステップ（ｂ）において前記多孔性デバイスを通して押し出し、続いてステップ（ｃ）において、約０．５バール〜１２００バール、好ましくは約５バール〜６００バールの圧力でノズルに通過させる、請求項１から２８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記脱水ステップ（ｄ）を、ガス、好ましくは加熱されたガスの流れを用いて行う、請求項３から２９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ガスが不活性ガス、好ましくは窒素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記脱水ステップ（ｄ）を噴霧乾燥により、好ましくはパススルー操作またはループ操作で行う、請求項３から３１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記脱水ステップ（ｄ）を噴霧凍結乾燥により行い、その際、ステップ（ｃ）において得られるリポソームを低温流体と接触させることにより凍結を達成する、請求項３から２９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記低温流体が冷却ガスまたは低温液体、好ましくは窒素である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記噴霧凍結の結果得られる凍結粒子を続いて好ましくは減圧下で脱水する、請求項３３から３４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１から３５に記載の方法により製造されるリポソーム。
【請求項３７】
請求項３から３６までのいずれか１項に記載の方法により製造される脱水されたリポソームであって、前記の脱水されたリポソームを前記水性媒体と混合することによる水性媒体中での再水和後に、約５００ｎｍ未満、好ましくは約２００ｎｍ未満の平均直径を有するリポソーム。
【請求項３８】
前記脱水リポソームを前記水性媒体と混合することによる水性媒体中での再水和後に、約０．２未満、好ましくは約０．１５未満の多分散性指数を有する、請求項３７に記載の脱水されたリポソーム。
【請求項３９】
約１０μｍ〜約１０００μｍ、好ましくは約５０μｍ〜約５００μｍの平均サイズを有する乾燥粒子中に含まれる、請求項３７から３８までのいずれか１項に記載の脱水されたリポソーム。
【請求項４０】
医薬品を製造するための、請求項３６から３９までのいずれか１項に記載のリポソームの使用。
【請求項４１】
ノズルに連結された多孔性デバイスを含む、リポソームを製造するための装置。
【請求項４２】
（ｉ）脂質を含む溶液または懸濁液を供給するための容器、
（ｉｉ）多孔性デバイス、
（ｉｉｉ）ノズル、
（ｉｖ）前記容器（ｉ）を多孔性デバイス（ｉｉ）と導管により連結させるための手段、
（ｖ）圧力を発生させるための手段、ならびに
（ｖｉ）場合によって、リポソームを含む前記溶液または懸濁液を脱水するための手段、および
（ｖｉｉ）場合によって、得られたリポソームを回収するための手段
を含む、請求項４１に記載の装置。
【請求項４３】
前記ノズルがオリフィスノズルである、請求項４１または４２に記載の装置。
【請求項４４】
前記ノズルが約０．０５ｍｍ〜約１ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍ〜約０．２ｍｍの直径を有する、請求項４１から４３までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４５】
前記ノズルが脱水のための手段中に含まれる、請求項４１から４４までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４６】
前記多孔性デバイスが５０ｎｍ〜３００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの孔サイズを有する、請求項４１から４５までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４７】
前記多孔性デバイスが膜、好ましくはポリカーボネート膜である、請求項４１から４６までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４８】
前記膜が少なくとも１つのドレインディスクにより少なくとも片面から支持されている、請求項４１から４７までのいずれか１項に記載の装置。
【請求項４９】
前記の少なくとも１つのドレインディスクが少なくとも１つのフリットにより支持されている、請求項４８に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５０８３６８（Ｐ２０１０−５０８３６８Ａ）
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３５６０９（Ｐ２００９−５３５６０９）
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００９５３１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５５６２８
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０６１３１０１９）メディゲーネ アクチエンゲゼルシャフト (7)
【氏名又は名称原語表記】ＭｅｄｉＧｅｎｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｌｏｃｈｈａｍｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １１， Ｄ−８２１５２ Ｐｌａｎｅｇｇ／Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【出願人】（５０６１５２６９０）
【氏名又は名称原語表記】Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ
【住所又は居所原語表記】Ｇｅｓｃｈｗｉｓｔｅｒ−Ｓｃｈｏｌｌ−Ｐｌａｔｚ １， Ｄ−８０５３９ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００９５３１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０５５６２８
【国際公開日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５０６１３１０１９）メディゲーネ アクチエンゲゼルシャフト (7)
【氏名又は名称原語表記】ＭｅｄｉＧｅｎｅ ＡＧ
【住所又は居所原語表記】Ｌｏｃｈｈａｍｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １１， Ｄ−８２１５２ Ｐｌａｎｅｇｇ／Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【出願人】（５０６１５２６９０）
【氏名又は名称原語表記】Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ
【住所又は居所原語表記】Ｇｅｓｃｈｗｉｓｔｅｒ−Ｓｃｈｏｌｌ−Ｐｌａｔｚ １， Ｄ−８０５３９ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]