ジャガイモの形質転換方法
【課題】形質転換効率が高い、ジャガイモの形質転換方法を提供すること。
【解決手段】約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、約０．１〜約５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、約１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトール、およびカルベニシリン（例、約５０〜約１０００ｍｇ／ｌ）を含む、培地；アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片を、上記培地で培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生することを含む、形質転換されたジャガイモ植物体の作出方法。
【解決手段】約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、約０．１〜約５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、約１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトール、およびカルベニシリン（例、約５０〜約１０００ｍｇ／ｌ）を含む、培地；アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片を、上記培地で培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生することを含む、形質転換されたジャガイモ植物体の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）の形質転換方法およびその培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の遺伝子組換え法には、生物的手法であるアグロバクテウム法、物理的手法であるパーティクルガン法（金粒子にＤＮＡをまぶして細胞に打ち込むパーティクルガンを用いる方法）、エレクトロポレーション法（細胞に電気的に孔を空けてＤＮＡを取り込ませる方法）がある。これらの中でも、最も広く用いられているのが、アグロバクテリウム法であり、ジャガイモへの目的遺伝子の導入にも用いられている。
【０００３】
アグロバクテリウム法による植物の形質転換方法は、目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムを組織片に感染させる第１工程、および感染した組織片を培養して植物体を再生する第２工程を含む。第２工程の培養に用いられる培地としては、植物ホルモン（例、サイトカイニン類、オーキシン類）および抗生物質（例、除菌用の抗生物質、形質転換体の選抜用の抗生物質）等の成分が、形質転換された植物体の再生および選抜に必要な成分として、基本培地に補充されている培地が用いられる。基本培地の例としては、ミオイノシトール等のビタミン類を基本組成として含む、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇにより開発された標準的な植物組織培養培地であるＭＳ培地が挙げられる。アグロバクテリウム法によるジャガイモの形質転換方法では、第２工程の培養に用いられる培地の例として、特許文献１、２、および非特許文献１、２に記載される培地が報告されている。
【０００４】
特許文献１は、上記第２工程において、植物ホルモンとしてナフチル酢酸（本明細書中、ナフタレン酢酸と同義）とベンジルアミノプリンとの組合せ、および抗生物質としてセフォタキシム（商品名：クラフォラン）とカナマイシンまたはハイグロマイシンとの組合せを補充した、ならびに植物ホルモンとしてゼアチンとナフチル酢酸とジベレリン酸との組合せ、および抗生物質としてセフォタキシムとカナマイシンまたはハイグロマイシンとの組合せを補充した、少なくとも２種類のＭＳ培地を併用したことを開示している。具体的には、このような培地として、（ａ）１．６％グルコース、５ｍｇ／ｌナフチル酢酸、０．２ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、２５０ｍｇ／ｌクラフォラン、５０ｍｇ／ｌカナマイシンまたは１ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢおよび０．８％バクトアガーを含むＭＳ培地、ならびに（ｂ）１．６％グルコース、１．４ｍｇ／ｌゼアチン、２０ｍｇ／ｌナフチル酢酸、２０ｍｇ／ｌジベレリン酸、２５０ｍｇ／ｌクラフォラン、５０ｍｇ／ｌカナマイシンまたは３ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢおよび０．８％バクトアガーを含むＭＳ培地を開示している。
【０００５】
特許文献２は、上記第２工程において、植物ホルモンとしてゼアチンとインドール酢酸との組合せ、および抗生物質としてセフォタキシムとカナマイシンとの組合せを補充した、ならびに植物ホルモンを補充せず、かつ抗生物質としてセフォタキシムとカナマイシンとの組合せを補充した、ＭＳ無機塩を含む２種類の培地を併用したことを開示している。具体的には、このような培地として、（ｃ）ＭＳ無機塩、Ｂ５ビタミン、３％スクロース、２ｍｇ／ｌゼアチン、０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、３００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび２．５ｍｇ／ｌゲルライトを含む培地、ならびに（ｄ）ＭＳ無機塩、Ｂ５ビタミン、３％スクロース、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、１００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび２．５ｍｇ／ｌゲルライトを含む培地を開示している。
【０００６】
非特許文献１は、上記第２工程において、植物ホルモンとしてナフチル酢酸とジベレリン酸との組合せ、ならびに抗生物質としてセフォタキシム（商品名：クラフォラン）と異なる濃度のカナマイシンとの組合せを補充した、２種類のＭＳ培地を併用したことを開示している。具体的には、このような培地として、（ｅ）１．６％グルコース、２ｍｇ／ｌのゼアチン、０．０２ｍｇ／ｌナフチル酢酸、０．０２ｍｇ／ｌジベレリン酸、５００ｍｇ／ｌセフォタキシム、５０ｍｇ／ｌカナマイシンおよび０．８％アガーが補充されたＭＳ培地、ならびに（ｆ）上記（ｅ）の培地中のクラフォランの濃度を半分に低減したＭＳ培地を開示している。
【０００７】
非特許文献２は、上記第２工程において、複数の種類の培地、すなわち、植物ホルモンとしてゼアチンとインドール酢酸との組合せ、および抗生物質としてセフォタキシムのみを補充したＭＳ培地、ならびに異なる濃度のカナマイシンを含む上記ＭＳ培地からなる２種類の培地を併用したことを開示している。具体的には、このような培地として、（ｇ）５μＭゼアチン、３μＭインドール酢酸、０．７％アガロースおよび２５０ｍｇ／ｍｌセフォタキシムが補充されたＭＳ培地、（ｈ）１００ｍｇ／ｌカナマイシンが補充された、上記（ｇ）のＭＳ培地、ならびに（ｉ）上記（ｇ）のＭＳ培地において、カナマイシンの濃度を５０ｍｇ/ｌから２０ｍｇ/ｌに徐々に低減させたＭＳ培地を開示している。
【０００８】
しかしながら、上述の（ａ）〜（ｉ）の培地を用いる、アグロバクテリウム法によるジャガイモの形質転換方法は、形質転換効率が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１７３１２８号公報
【特許文献２】特開２００５−１３０７７０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．５，１３２３−１３３０，１９８９
【非特許文献２】Ｎａｒｖａｅｚ-Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９９，Ｎｏ．２４，１５８１８−１５８２１，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、従来の方法に比し、形質転換効率が高い、ジャガイモの形質転換方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、かかる従来技術の問題を解決するために鋭意検討した結果、アグロバクテリウムを感染させたジャガイモから培地上で植物体を再生させる際、所定の濃度の特定の植物ホルモン、所定の濃度の特定のビタミンおよび特定の抗生物質を含む培地を用いることで、ジャガイモの形質転換効率が顕著に向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおりである：
〔１〕０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトールおよびカルベニシリンを含む、培地。
〔２〕カルベニシリンの濃度が５０〜１０００ｍｇ／ｌである、上記〔１〕の培地。
〔３〕アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片を、０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトールおよびカルベニシリンを含む培地で培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生する工程を含む、形質転換されたジャガイモ植物体の作出方法。
〔４〕目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムをジャガイモ組織片に感染させて、前記ジャガイモ組織片を得る工程をさらに含む、上記〔３〕の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ジャガイモの形質転換効率を向上させることができる。したがって、本発明は、目的遺伝子が導入されたジャガイモ形質転換体を効率良く作出することを可能とし、ひいては、工業原料、食用または飼料用として有用な形質を有する形質転換（遺伝子組換え）ジャガイモを容易に得ることができるという利点を有する。
また、本発明によれば、形質転換されたジャガイモ植物体を培養して再生する工程を、１種類の培地のみを用いることにより、簡便に行うことができる。したがって、本発明は、形質転換方法の操作を簡略化できる、および培地調製の負担を軽減できるという利点を有する。
さらに、本発明によれば、アグロバクテリウムのジャガイモ組織片への感染および形質転換されたジャガイモ組織片の培養によるジャガイモ植物体の再生において用いられる複数の培地の成分のうち殆どの成分を共通化できる（培地組成の共通化）。したがって、本発明は、培地調製を簡略化できるという利点を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、形質転換されたジャガイモ植物体の作出方法を提供する。本発明の方法は、形質転換されたジャガイモ組織片を培地で培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生する工程を含む。
【００１６】
本発明の方法で用いられる培地は、植物ホルモンとしてナフタレン酢酸とゼアチンとの組合せ、ビタミンとしてミオイノシトール、および抗生物質としてカルベニシリンを含み得る。本発明の方法では、これらの成分を含む培地を用いることにより、ジャガイモの形質転換効率が向上し、ジャガイモの形質転換体を効率良く得ることが可能となる。本発明はまた、本発明で用いられ得る培地を提供する。
【００１７】
具体的には、本発明の培地中のナフタレン酢酸の濃度は、ジャガイモの形質転換効率を向上し得る濃度である限り特に限定されないが、例えば約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｌであり得る。ナフタレン酢酸を約０．０１ｍｇ／ｌ未満の濃度で使用すると、培養を行っても、組織片からの細胞の増殖が見られない。ナフタレン酢酸を約０．２ｍｇ／ｌを超える濃度で使用すると、カルスの肥大化のみ起こり、芽の分化は見られない。より優れた形質転換効率を達成するという観点からは、本発明の培地中のナフタレン酢酸の濃度は、好ましくは約０．０２〜約０．１ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは、約０．０２〜約０．０６ｍｇ／ｌであり得る。
【００１８】
本発明の培地中のゼアチンの濃度は、ジャガイモの形質転換効率を向上し得る濃度である限り特に限定されないが、例えば約０．１〜約５．０ｍｇ／ｌであり得る。ゼアチンを約０．１ｍｇ／ｌ未満の濃度で使用すると、培養を行っても、組織片からの細胞の増殖が起こりにくい。ゼアチンを約５．０ｍｇ／ｌを超える濃度で使用しても、組織片からの細胞の増殖が起こりにくくなる。より優れた形質転換効率を達成するという観点からは、本発明の培地中のゼアチンの濃度は、好ましくは約０．５〜約２．０ｍｇ／ｌであり得る。
【００１９】
本発明の培地中のミオイノシトールの濃度は、ジャガイモの形質転換効率を向上し得る濃度である限り特に限定されないが、例えば約１５０ｍｇ／ｌ以上であり得る。ミオイノシトールは、ＭＳ培地中に、その基本組成として１００ｍｇ／ｌの濃度で含まれているビタミンである。しかし、１００ｍｇ／ｌの濃度では、ミオイノシトールは、ジャガイモを形質転換し得ないので、ＭＳ培地を基本培地として用いる場合、ＭＳ培地中の濃度を増量する必要がある。より優れた形質転換効率を達成するという観点からは、本発明の培地中のミオイノシトールの濃度は、好ましくは約２００ｍｇ／ｌ以上であり得る。培地中のミオイノシトールの濃度はまた、約５００ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３００ｍｇ／ｌ以下であり得る。ミオイノシトールを約５００ｍｇ／ｌを超える濃度で使用すると、ビタミン量のバランスが崩れ、培養物に悪影響を与え得る。
【００２０】
本発明の培地中のカルベニシリンの濃度は、ジャガイモの形質転換効率を向上し得る濃度である限り特に限定されないが、例えば約５０〜約１０００ｍｇ／ｌであり得る。カルベニシリンを約５０ｍｇ／ｌ未満の濃度で使用すると、アグロバクテリウムの増殖を抑えることが出来ず、アグロバクテリウムにより培養物の枯死が見られるおそれがある。カルベニシリンを約１０００ｍｇ／ｌを超える濃度で使用すると、カルベニシリンの影響で培養物の枯死が見られるおそれがある。より優れた形質転換効率を達成するという観点からは、本発明の培地中のカルベニシリンの濃度は、好ましくは約１００〜約５００ｍｇ／ｌ、より好ましくは約２００〜約５００ｍｇ／ｌであり得る。
【００２１】
本発明の培地は、液状培地または固形培地であり得るが、固形培地が好ましい。本発明の培地は、固形培地である場合、固形化剤として、例えばゲランガム（例、約１〜約４ｇ／ｌ）またはアガロース（例、約５〜約１０ｇ／ｌ）を含み得る。培地のｐＨは、例えば約５．５〜約６．１、好ましくは約５．９であり得る。
【００２２】
本発明の培地はまた、基本培地または基本培地の組成を改良した培地を用いて調製され得る。基本培地の例としては、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ、１９６２、１５：４７３−４９７）およびＷＰＭ培地（Ｌｏｙｄ ａｎｄ ＭｃＣｏｗｎ、Ｐｒｏｐ．Ｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｐ．Ｓｏｃ．、１９８０、３０：４２１−４２７）が挙げられる。したがって、本発明の培地は、基本培地または基本培地の組成を改良した培地を用いて調製される場合、これらの培地中の任意の成分を含み得る。例えば、ＭＳ培地は、無機塩（例、ＮＨ４ＮＯ３、ＫＮＯ３、ＫＨ２ＰＯ４、Ｈ３ＢＯ３、ＭｎＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＫＩ、Ｎａ２ＭｏＯ４、ＣｕＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４、Ｎａ２−ＥＤＴＡ）、ビタミン類（例、ミオイノシト−ル、ニコチン酸、塩酸ピリドキン、塩酸チアミン）、グリシンを含み得るので、本発明の培地は、ＭＳ培地を用いて調製される場合、これらの成分を含み得る。本発明の培地はまた、これらの成分に加えて、スクロースまたはグルコース等の炭素源（例、約１０〜約３０ｇ／ｌ）を含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の培地はさらに、アグロバクテリウムの除菌等の目的のために、カルベニシリン以外の抗生物質として、モキサラクタム、セフォタキシム等のさらなる抗生物質（例、約１０〜約１００００ｍｇ／ｌ）を含んでいてもよい。また、目的遺伝子が導入されている形質転換体を選抜するために、カナマイシン（例、約５０ｍｇ／ｌ）、ハイグロマイシン（例、約５０ｍｇ／ｌ）、アンピシリン（例、約１００ｍｇ／ｌ）、ストレプトマイシン（例、約２００ｍｇ／ｌ）を含んでいてもよい。
【００２４】
形質転換されたジャガイモ組織片の培養条件としては、形質転換されたジャガイモ植物体を再生できる条件である限り特に限定されない。例えば、温度は、１８〜３０℃であり得る。例えば、光強度は、５０〜３００μｍｏｌ／ｍ２／ｓであり得る。
【００２５】
本発明の方法では、アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片が用いられ得る。このような組織片は、ジャガイモ組織片に、目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムを感染させることにより入手できる。目的遺伝子としては、産業的に優れた形質を付与し得る遺伝子、研究対象となり得る遺伝子等、種々の遺伝子を使用できる。
【００２６】
本発明の方法の対象とする植物としては、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）であればその品種は限定されない。このようなジャガイモの品種としては、例えば、Ｄｉｓｉｒｅｅ（デジレ）、ベロリナ、トヨシロ、男爵薯、メークィン、Ｓａｃｏ（米国品種）が挙げられる。このうちＤｉｓｉｒｅｅは遺伝子組換えに関する実験例が多いため好ましい。
【００２７】
本発明の方法で用いられる組織片としては、形質転換後に植物体を再生可能である任意の組織片を使用できる。このような組織片としては、例えば、茎、葉、根、塊茎等の植物組織から得られるものが挙げられる。組織片は、無菌条件下で育成したジャガイモの植物体からピンセットでちぎったり、刃物で切り出すことにより調製できるが、アグロバクテリウムの感染および植物体の再生を効率良く行うためには、茎から得た適当な大きさ（例えば、約５ｍｍ）の組織片を用いることが好ましい。
【００２８】
本発明の方法はまた、形質転換されたジャガイモ組織片を調製する工程を含んでいてもよい。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムをジャガイモ組織片に感染させる第１工程、および形質転換されたジャガイモ組織片を培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生する第２工程を含み得る。
【００２９】
第１工程では、目的遺伝子を含む発現ベクター（形質転換体の選別用のマーカー遺伝子を含んでいてもよい）が導入されたアグロバクテリウムを、ジャガイモ組織片に感染させることにより、形質転換されたジャガイモ組織片が調製される。アグロバクテリウムの感染は、例えば、アグロバクテリウムの培養液中にジャガイモ組織片を浸漬することにより行われ得る。アグロバクテリウムの感染は、組織片の傷口を介して起こる。したがって、第１工程では、植物体から切り出すこと等により調製した、傷口を有する組織片をアグロバクテリウムの培養液中に浸漬することで、組織片の傷口からアグロバクテリウムが感染して、目的遺伝子を含む発現ベクターが組織片の細胞中に導入され得る。アグロバクテリウムの培養液は、アグロバクテリウム懸濁液を、感染用の培地に接種することにより調製できる。感染用の培地としては、例えば、ＭＳ培地またはＷＰＭ培地等の基本培地、あるいは基本培地の組成を改良した培地に、追加の成分を補充したものが挙げられる。追加の成分の例としては、ミオイノシトール（例、培地中の濃度が約１５０ｍｇ／ｌとなるように増量）、スクロースまたはグルコース等の炭素源（例、約１０〜約３０ｇ／ｌ）が挙げられる。追加の成分の別の例としては、植物ホルモンが挙げられる。このような植物ホルモンの例としては、ゼアチン又はベンジルアデニン等のサイトカイニン類（例、約０．０１〜約５．０ｍｇ／ｌ）、ナフタレン酢酸、インドール酪酸又はインドール酢酸等のオーキシン類（例、約０．０１〜約２．０ｍｇ／ｌ）が挙げられる。培地組成の共通化による培地調製の簡略化という観点からは、感染用の培地として、本発明の培地から抗生物質を除いた培地を用いることもできる。
【００３０】
なお、組織片のアグロバクテリウムへの感染は、組織片をアグロバクテリウムの懸濁液に浸漬等した後、この組織片を固体培地上に移して更に数日間、アグロバクテリウムと共存培養することにより、確実となる。共存培養用の培地としては、例えば、ＭＳ培地またはＷＰＭ培地等の基本培地、あるいは基本培地の組成を改良した培地に、追加の成分を補充したものが挙げられる。追加の成分の一例としては、ミオイノシトール（例、培地中の濃度が約１５０ｍｇ／ｌとなるように増量）、スクロースまたはグルコース等の炭素源（例、約１０〜約３０ｇ／ｌ）、アガロース（例、約５〜約１０ｇ／ｌ）又はジェランガム（例、約１〜約４ｇ／ｌ）等の固形化剤が挙げられる。追加の成分の別の例としては、植物ホルモンが挙げられる。このような植物ホルモンの例としては、ゼアチン又はベンジルアデニン等のサイトカイニン類（例、約０．０１〜約５．０ｍｇ／ｌ）、ナフタレン酢酸、インドール酪酸又はインドール酢酸等のオーキシン類（例、約０．０１〜約２．０ｍｇ／ｌ）が挙げられる。また、アセトシリンゴン（例、約１０〜約２００ｍｇ／ｌ）を共存培養用の培地に添加することで、アグロバクテリウムの感染力が上昇する場合もある。培地組成の共通化による培地調製の簡略化という観点からは、共存培養用の培地として、本発明の培地から抗生物質を除いた培地を用いることもできる。
【００３１】
アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片を、０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトールおよびカルベニシリンを含む培地で培養して植物体を再生することにより、ジャガイモの形質転換効率が向上することが明らかとなった。その理由は、以下のように推察される。植物ホルモンとしてナフタレン酢酸およびゼアチンの組合せ、ビタミンとしてミオイノシトールを上記濃度で用いることで、ジャガイモ組織片のカルス化が活性化されやすい状態となり、形質転換効率が向上したものと考えられる。さらに、カルベニシリンを含む培地を使用することで、アグロバクテリウムの増殖を効果的に抑えることが可能となり、また、カルベニシリンは細胞増殖効果を有していることから、細胞の増殖が促進されたと考えられる。したがって、上述の効果が相乗的に作用することにより、形質転換効率が向上したと考えられる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］
以下に示す手順で、マーカー遺伝子ＧＵＳを発現する形質転換ジャガイモを作出した。
【００３４】
（１）組織片の調製
無菌的に育成したジャガイモ（品種：Ｄｉｓｉｒｅｅ）の茎から、５ｍｍ程度の切片を作製し、ナフタレン酢酸を０．０４ｍｇ／ｌ、ゼアチンを１．０ｍｇ／ｌ、ミオイノシトールを２００ｍｇ／ｌとなるよう添加したＭＳ固形培地（３０ｇ/ｌスクロース、０．７％アガロース、ｐＨ５．９）の上に置床し、形質転換する植物材料とした。
【００３５】
（２）形質転換（感染）
マーカー遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を含むアグロバクテリウム懸濁液１ｍｌを、２００ｍｇ／ｌミオイノシトールとなるよう添加したＭＳ液体培地（３０ｇ／ｌスクロース、ｐＨ５．９）１０ｍｌに接種した培養液に、茎切片を１〜２分間浸漬させた。その後、０．０４ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１．０ｍｇ／ｌゼアチン、２００ｍｇ／ｌミオイノシトールとなるよう添加したＭＳ固形培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．７％アガロース、ｐＨ５．９）で２日間共存培養を行った。
【００３６】
（３）植物体の再生
植物の再生用の培地として、０．０４ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１．０ｍｇ／ｌゼアチン、２００ｍｇ／ｌミオイノシトール、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンとなるよう添加したＭＳ固形培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．７％アガロース、、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、ｐＨ５．９）で培養を行い、植物体が得られるまで、２〜３週間ごとに新しい培地に植替え、培養を継続した。
【００３７】
（４）形質転換体の確認
得られた遺伝子組換えジャガイモの葉を、ＧＵＳ染色試薬の入ったチューブに加え、３７℃で一晩インキュベートする。インキュベート後、ＧＵＳ染色試薬と１００％エタノールを入れ替え、葉の色素（クロロフィル）を脱色した。脱色後、遺伝子導入されている個体のＧＵＳ染色を目視で観察することでＧＵＳ遺伝子の導入を確認した。
【００３８】
形質転換効率：形質転換体の個数／組織片の個数（４０個）×１００（％）
評価：◎ 形質転換効率 ２０％以上
○ 形質転換効率 １５％以上２０％未満
△ 形質転換効率 １０％以上１５％未満
× 形質転換効率 １０％未満
【００３９】
［実施例２］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．０２ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４０】
［実施例３］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．０６ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４１】
［実施例４］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．０８ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４２】
［実施例５］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．１ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４３】
［実施例６］
植物体の再生用の培地のゼアチンの濃度を０．５ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４４】
［実施例７］
植物体の再生用の培地のゼアチンの濃度を２．０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４５】
［実施例８］
植物体の再生用の培地のカルベニシリンの濃度を１００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４６】
［実施例９］
植物体の再生用の培地のカルベニシリンの濃度を２００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４７】
［実施例１０］
植物体の再生用の培地のミオイノシトールの濃度を３００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４８】
［比較例１］
植物体の再生用の培地にナフタレン酢酸を添加しない以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４９】
［比較例２］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．３ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５０】
［比較例３］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．６ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５１】
［比較例４］
植物体の再生用の培地のミオイノシトールの濃度を１００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５２】
［比較例５］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをセフォタキシム５０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５３】
［比較例６］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをセフォタキシム１００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５４】
［比較例７］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをセフォタキシム２５０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５５】
［比較例８］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをモキサラクタム２０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５６】
［比較例９］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをモキサラクタム４０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５７】
［比較例１０］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをモキサラクタム１００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５８】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）の形質転換方法およびその培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の遺伝子組換え法には、生物的手法であるアグロバクテウム法、物理的手法であるパーティクルガン法（金粒子にＤＮＡをまぶして細胞に打ち込むパーティクルガンを用いる方法）、エレクトロポレーション法（細胞に電気的に孔を空けてＤＮＡを取り込ませる方法）がある。これらの中でも、最も広く用いられているのが、アグロバクテリウム法であり、ジャガイモへの目的遺伝子の導入にも用いられている。
【０００３】
アグロバクテリウム法による植物の形質転換方法は、目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムを組織片に感染させる第１工程、および感染した組織片を培養して植物体を再生する第２工程を含む。第２工程の培養に用いられる培地としては、植物ホルモン（例、サイトカイニン類、オーキシン類）および抗生物質（例、除菌用の抗生物質、形質転換体の選抜用の抗生物質）等の成分が、形質転換された植物体の再生および選抜に必要な成分として、基本培地に補充されている培地が用いられる。基本培地の例としては、ミオイノシトール等のビタミン類を基本組成として含む、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇにより開発された標準的な植物組織培養培地であるＭＳ培地が挙げられる。アグロバクテリウム法によるジャガイモの形質転換方法では、第２工程の培養に用いられる培地の例として、特許文献１、２、および非特許文献１、２に記載される培地が報告されている。
【０００４】
特許文献１は、上記第２工程において、植物ホルモンとしてナフチル酢酸（本明細書中、ナフタレン酢酸と同義）とベンジルアミノプリンとの組合せ、および抗生物質としてセフォタキシム（商品名：クラフォラン）とカナマイシンまたはハイグロマイシンとの組合せを補充した、ならびに植物ホルモンとしてゼアチンとナフチル酢酸とジベレリン酸との組合せ、および抗生物質としてセフォタキシムとカナマイシンまたはハイグロマイシンとの組合せを補充した、少なくとも２種類のＭＳ培地を併用したことを開示している。具体的には、このような培地として、（ａ）１．６％グルコース、５ｍｇ／ｌナフチル酢酸、０．２ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、２５０ｍｇ／ｌクラフォラン、５０ｍｇ／ｌカナマイシンまたは１ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢおよび０．８％バクトアガーを含むＭＳ培地、ならびに（ｂ）１．６％グルコース、１．４ｍｇ／ｌゼアチン、２０ｍｇ／ｌナフチル酢酸、２０ｍｇ／ｌジベレリン酸、２５０ｍｇ／ｌクラフォラン、５０ｍｇ／ｌカナマイシンまたは３ｍｇ／ｌハイグロマイシンＢおよび０．８％バクトアガーを含むＭＳ培地を開示している。
【０００５】
特許文献２は、上記第２工程において、植物ホルモンとしてゼアチンとインドール酢酸との組合せ、および抗生物質としてセフォタキシムとカナマイシンとの組合せを補充した、ならびに植物ホルモンを補充せず、かつ抗生物質としてセフォタキシムとカナマイシンとの組合せを補充した、ＭＳ無機塩を含む２種類の培地を併用したことを開示している。具体的には、このような培地として、（ｃ）ＭＳ無機塩、Ｂ５ビタミン、３％スクロース、２ｍｇ／ｌゼアチン、０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、３００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび２．５ｍｇ／ｌゲルライトを含む培地、ならびに（ｄ）ＭＳ無機塩、Ｂ５ビタミン、３％スクロース、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、１００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび２．５ｍｇ／ｌゲルライトを含む培地を開示している。
【０００６】
非特許文献１は、上記第２工程において、植物ホルモンとしてナフチル酢酸とジベレリン酸との組合せ、ならびに抗生物質としてセフォタキシム（商品名：クラフォラン）と異なる濃度のカナマイシンとの組合せを補充した、２種類のＭＳ培地を併用したことを開示している。具体的には、このような培地として、（ｅ）１．６％グルコース、２ｍｇ／ｌのゼアチン、０．０２ｍｇ／ｌナフチル酢酸、０．０２ｍｇ／ｌジベレリン酸、５００ｍｇ／ｌセフォタキシム、５０ｍｇ／ｌカナマイシンおよび０．８％アガーが補充されたＭＳ培地、ならびに（ｆ）上記（ｅ）の培地中のクラフォランの濃度を半分に低減したＭＳ培地を開示している。
【０００７】
非特許文献２は、上記第２工程において、複数の種類の培地、すなわち、植物ホルモンとしてゼアチンとインドール酢酸との組合せ、および抗生物質としてセフォタキシムのみを補充したＭＳ培地、ならびに異なる濃度のカナマイシンを含む上記ＭＳ培地からなる２種類の培地を併用したことを開示している。具体的には、このような培地として、（ｇ）５μＭゼアチン、３μＭインドール酢酸、０．７％アガロースおよび２５０ｍｇ／ｍｌセフォタキシムが補充されたＭＳ培地、（ｈ）１００ｍｇ／ｌカナマイシンが補充された、上記（ｇ）のＭＳ培地、ならびに（ｉ）上記（ｇ）のＭＳ培地において、カナマイシンの濃度を５０ｍｇ/ｌから２０ｍｇ/ｌに徐々に低減させたＭＳ培地を開示している。
【０００８】
しかしながら、上述の（ａ）〜（ｉ）の培地を用いる、アグロバクテリウム法によるジャガイモの形質転換方法は、形質転換効率が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１７３１２８号公報
【特許文献２】特開２００５−１３０７７０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．５，１３２３−１３３０，１９８９
【非特許文献２】Ｎａｒｖａｅｚ-Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．９９，Ｎｏ．２４，１５８１８−１５８２１，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、従来の方法に比し、形質転換効率が高い、ジャガイモの形質転換方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、かかる従来技術の問題を解決するために鋭意検討した結果、アグロバクテリウムを感染させたジャガイモから培地上で植物体を再生させる際、所定の濃度の特定の植物ホルモン、所定の濃度の特定のビタミンおよび特定の抗生物質を含む培地を用いることで、ジャガイモの形質転換効率が顕著に向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおりである：
〔１〕０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトールおよびカルベニシリンを含む、培地。
〔２〕カルベニシリンの濃度が５０〜１０００ｍｇ／ｌである、上記〔１〕の培地。
〔３〕アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片を、０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトールおよびカルベニシリンを含む培地で培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生する工程を含む、形質転換されたジャガイモ植物体の作出方法。
〔４〕目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムをジャガイモ組織片に感染させて、前記ジャガイモ組織片を得る工程をさらに含む、上記〔３〕の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ジャガイモの形質転換効率を向上させることができる。したがって、本発明は、目的遺伝子が導入されたジャガイモ形質転換体を効率良く作出することを可能とし、ひいては、工業原料、食用または飼料用として有用な形質を有する形質転換（遺伝子組換え）ジャガイモを容易に得ることができるという利点を有する。
また、本発明によれば、形質転換されたジャガイモ植物体を培養して再生する工程を、１種類の培地のみを用いることにより、簡便に行うことができる。したがって、本発明は、形質転換方法の操作を簡略化できる、および培地調製の負担を軽減できるという利点を有する。
さらに、本発明によれば、アグロバクテリウムのジャガイモ組織片への感染および形質転換されたジャガイモ組織片の培養によるジャガイモ植物体の再生において用いられる複数の培地の成分のうち殆どの成分を共通化できる（培地組成の共通化）。したがって、本発明は、培地調製を簡略化できるという利点を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、形質転換されたジャガイモ植物体の作出方法を提供する。本発明の方法は、形質転換されたジャガイモ組織片を培地で培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生する工程を含む。
【００１６】
本発明の方法で用いられる培地は、植物ホルモンとしてナフタレン酢酸とゼアチンとの組合せ、ビタミンとしてミオイノシトール、および抗生物質としてカルベニシリンを含み得る。本発明の方法では、これらの成分を含む培地を用いることにより、ジャガイモの形質転換効率が向上し、ジャガイモの形質転換体を効率良く得ることが可能となる。本発明はまた、本発明で用いられ得る培地を提供する。
【００１７】
具体的には、本発明の培地中のナフタレン酢酸の濃度は、ジャガイモの形質転換効率を向上し得る濃度である限り特に限定されないが、例えば約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｌであり得る。ナフタレン酢酸を約０．０１ｍｇ／ｌ未満の濃度で使用すると、培養を行っても、組織片からの細胞の増殖が見られない。ナフタレン酢酸を約０．２ｍｇ／ｌを超える濃度で使用すると、カルスの肥大化のみ起こり、芽の分化は見られない。より優れた形質転換効率を達成するという観点からは、本発明の培地中のナフタレン酢酸の濃度は、好ましくは約０．０２〜約０．１ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは、約０．０２〜約０．０６ｍｇ／ｌであり得る。
【００１８】
本発明の培地中のゼアチンの濃度は、ジャガイモの形質転換効率を向上し得る濃度である限り特に限定されないが、例えば約０．１〜約５．０ｍｇ／ｌであり得る。ゼアチンを約０．１ｍｇ／ｌ未満の濃度で使用すると、培養を行っても、組織片からの細胞の増殖が起こりにくい。ゼアチンを約５．０ｍｇ／ｌを超える濃度で使用しても、組織片からの細胞の増殖が起こりにくくなる。より優れた形質転換効率を達成するという観点からは、本発明の培地中のゼアチンの濃度は、好ましくは約０．５〜約２．０ｍｇ／ｌであり得る。
【００１９】
本発明の培地中のミオイノシトールの濃度は、ジャガイモの形質転換効率を向上し得る濃度である限り特に限定されないが、例えば約１５０ｍｇ／ｌ以上であり得る。ミオイノシトールは、ＭＳ培地中に、その基本組成として１００ｍｇ／ｌの濃度で含まれているビタミンである。しかし、１００ｍｇ／ｌの濃度では、ミオイノシトールは、ジャガイモを形質転換し得ないので、ＭＳ培地を基本培地として用いる場合、ＭＳ培地中の濃度を増量する必要がある。より優れた形質転換効率を達成するという観点からは、本発明の培地中のミオイノシトールの濃度は、好ましくは約２００ｍｇ／ｌ以上であり得る。培地中のミオイノシトールの濃度はまた、約５００ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３００ｍｇ／ｌ以下であり得る。ミオイノシトールを約５００ｍｇ／ｌを超える濃度で使用すると、ビタミン量のバランスが崩れ、培養物に悪影響を与え得る。
【００２０】
本発明の培地中のカルベニシリンの濃度は、ジャガイモの形質転換効率を向上し得る濃度である限り特に限定されないが、例えば約５０〜約１０００ｍｇ／ｌであり得る。カルベニシリンを約５０ｍｇ／ｌ未満の濃度で使用すると、アグロバクテリウムの増殖を抑えることが出来ず、アグロバクテリウムにより培養物の枯死が見られるおそれがある。カルベニシリンを約１０００ｍｇ／ｌを超える濃度で使用すると、カルベニシリンの影響で培養物の枯死が見られるおそれがある。より優れた形質転換効率を達成するという観点からは、本発明の培地中のカルベニシリンの濃度は、好ましくは約１００〜約５００ｍｇ／ｌ、より好ましくは約２００〜約５００ｍｇ／ｌであり得る。
【００２１】
本発明の培地は、液状培地または固形培地であり得るが、固形培地が好ましい。本発明の培地は、固形培地である場合、固形化剤として、例えばゲランガム（例、約１〜約４ｇ／ｌ）またはアガロース（例、約５〜約１０ｇ／ｌ）を含み得る。培地のｐＨは、例えば約５．５〜約６．１、好ましくは約５．９であり得る。
【００２２】
本発明の培地はまた、基本培地または基本培地の組成を改良した培地を用いて調製され得る。基本培地の例としては、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ、１９６２、１５：４７３−４９７）およびＷＰＭ培地（Ｌｏｙｄ ａｎｄ ＭｃＣｏｗｎ、Ｐｒｏｐ．Ｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｐ．Ｓｏｃ．、１９８０、３０：４２１−４２７）が挙げられる。したがって、本発明の培地は、基本培地または基本培地の組成を改良した培地を用いて調製される場合、これらの培地中の任意の成分を含み得る。例えば、ＭＳ培地は、無機塩（例、ＮＨ４ＮＯ３、ＫＮＯ３、ＫＨ２ＰＯ４、Ｈ３ＢＯ３、ＭｎＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＫＩ、Ｎａ２ＭｏＯ４、ＣｕＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＦｅＳＯ４、Ｎａ２−ＥＤＴＡ）、ビタミン類（例、ミオイノシト−ル、ニコチン酸、塩酸ピリドキン、塩酸チアミン）、グリシンを含み得るので、本発明の培地は、ＭＳ培地を用いて調製される場合、これらの成分を含み得る。本発明の培地はまた、これらの成分に加えて、スクロースまたはグルコース等の炭素源（例、約１０〜約３０ｇ／ｌ）を含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の培地はさらに、アグロバクテリウムの除菌等の目的のために、カルベニシリン以外の抗生物質として、モキサラクタム、セフォタキシム等のさらなる抗生物質（例、約１０〜約１００００ｍｇ／ｌ）を含んでいてもよい。また、目的遺伝子が導入されている形質転換体を選抜するために、カナマイシン（例、約５０ｍｇ／ｌ）、ハイグロマイシン（例、約５０ｍｇ／ｌ）、アンピシリン（例、約１００ｍｇ／ｌ）、ストレプトマイシン（例、約２００ｍｇ／ｌ）を含んでいてもよい。
【００２４】
形質転換されたジャガイモ組織片の培養条件としては、形質転換されたジャガイモ植物体を再生できる条件である限り特に限定されない。例えば、温度は、１８〜３０℃であり得る。例えば、光強度は、５０〜３００μｍｏｌ／ｍ２／ｓであり得る。
【００２５】
本発明の方法では、アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片が用いられ得る。このような組織片は、ジャガイモ組織片に、目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムを感染させることにより入手できる。目的遺伝子としては、産業的に優れた形質を付与し得る遺伝子、研究対象となり得る遺伝子等、種々の遺伝子を使用できる。
【００２６】
本発明の方法の対象とする植物としては、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）であればその品種は限定されない。このようなジャガイモの品種としては、例えば、Ｄｉｓｉｒｅｅ（デジレ）、ベロリナ、トヨシロ、男爵薯、メークィン、Ｓａｃｏ（米国品種）が挙げられる。このうちＤｉｓｉｒｅｅは遺伝子組換えに関する実験例が多いため好ましい。
【００２７】
本発明の方法で用いられる組織片としては、形質転換後に植物体を再生可能である任意の組織片を使用できる。このような組織片としては、例えば、茎、葉、根、塊茎等の植物組織から得られるものが挙げられる。組織片は、無菌条件下で育成したジャガイモの植物体からピンセットでちぎったり、刃物で切り出すことにより調製できるが、アグロバクテリウムの感染および植物体の再生を効率良く行うためには、茎から得た適当な大きさ（例えば、約５ｍｍ）の組織片を用いることが好ましい。
【００２８】
本発明の方法はまた、形質転換されたジャガイモ組織片を調製する工程を含んでいてもよい。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムをジャガイモ組織片に感染させる第１工程、および形質転換されたジャガイモ組織片を培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生する第２工程を含み得る。
【００２９】
第１工程では、目的遺伝子を含む発現ベクター（形質転換体の選別用のマーカー遺伝子を含んでいてもよい）が導入されたアグロバクテリウムを、ジャガイモ組織片に感染させることにより、形質転換されたジャガイモ組織片が調製される。アグロバクテリウムの感染は、例えば、アグロバクテリウムの培養液中にジャガイモ組織片を浸漬することにより行われ得る。アグロバクテリウムの感染は、組織片の傷口を介して起こる。したがって、第１工程では、植物体から切り出すこと等により調製した、傷口を有する組織片をアグロバクテリウムの培養液中に浸漬することで、組織片の傷口からアグロバクテリウムが感染して、目的遺伝子を含む発現ベクターが組織片の細胞中に導入され得る。アグロバクテリウムの培養液は、アグロバクテリウム懸濁液を、感染用の培地に接種することにより調製できる。感染用の培地としては、例えば、ＭＳ培地またはＷＰＭ培地等の基本培地、あるいは基本培地の組成を改良した培地に、追加の成分を補充したものが挙げられる。追加の成分の例としては、ミオイノシトール（例、培地中の濃度が約１５０ｍｇ／ｌとなるように増量）、スクロースまたはグルコース等の炭素源（例、約１０〜約３０ｇ／ｌ）が挙げられる。追加の成分の別の例としては、植物ホルモンが挙げられる。このような植物ホルモンの例としては、ゼアチン又はベンジルアデニン等のサイトカイニン類（例、約０．０１〜約５．０ｍｇ／ｌ）、ナフタレン酢酸、インドール酪酸又はインドール酢酸等のオーキシン類（例、約０．０１〜約２．０ｍｇ／ｌ）が挙げられる。培地組成の共通化による培地調製の簡略化という観点からは、感染用の培地として、本発明の培地から抗生物質を除いた培地を用いることもできる。
【００３０】
なお、組織片のアグロバクテリウムへの感染は、組織片をアグロバクテリウムの懸濁液に浸漬等した後、この組織片を固体培地上に移して更に数日間、アグロバクテリウムと共存培養することにより、確実となる。共存培養用の培地としては、例えば、ＭＳ培地またはＷＰＭ培地等の基本培地、あるいは基本培地の組成を改良した培地に、追加の成分を補充したものが挙げられる。追加の成分の一例としては、ミオイノシトール（例、培地中の濃度が約１５０ｍｇ／ｌとなるように増量）、スクロースまたはグルコース等の炭素源（例、約１０〜約３０ｇ／ｌ）、アガロース（例、約５〜約１０ｇ／ｌ）又はジェランガム（例、約１〜約４ｇ／ｌ）等の固形化剤が挙げられる。追加の成分の別の例としては、植物ホルモンが挙げられる。このような植物ホルモンの例としては、ゼアチン又はベンジルアデニン等のサイトカイニン類（例、約０．０１〜約５．０ｍｇ／ｌ）、ナフタレン酢酸、インドール酪酸又はインドール酢酸等のオーキシン類（例、約０．０１〜約２．０ｍｇ／ｌ）が挙げられる。また、アセトシリンゴン（例、約１０〜約２００ｍｇ／ｌ）を共存培養用の培地に添加することで、アグロバクテリウムの感染力が上昇する場合もある。培地組成の共通化による培地調製の簡略化という観点からは、共存培養用の培地として、本発明の培地から抗生物質を除いた培地を用いることもできる。
【００３１】
アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片を、０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトールおよびカルベニシリンを含む培地で培養して植物体を再生することにより、ジャガイモの形質転換効率が向上することが明らかとなった。その理由は、以下のように推察される。植物ホルモンとしてナフタレン酢酸およびゼアチンの組合せ、ビタミンとしてミオイノシトールを上記濃度で用いることで、ジャガイモ組織片のカルス化が活性化されやすい状態となり、形質転換効率が向上したものと考えられる。さらに、カルベニシリンを含む培地を使用することで、アグロバクテリウムの増殖を効果的に抑えることが可能となり、また、カルベニシリンは細胞増殖効果を有していることから、細胞の増殖が促進されたと考えられる。したがって、上述の効果が相乗的に作用することにより、形質転換効率が向上したと考えられる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］
以下に示す手順で、マーカー遺伝子ＧＵＳを発現する形質転換ジャガイモを作出した。
【００３４】
（１）組織片の調製
無菌的に育成したジャガイモ（品種：Ｄｉｓｉｒｅｅ）の茎から、５ｍｍ程度の切片を作製し、ナフタレン酢酸を０．０４ｍｇ／ｌ、ゼアチンを１．０ｍｇ／ｌ、ミオイノシトールを２００ｍｇ／ｌとなるよう添加したＭＳ固形培地（３０ｇ/ｌスクロース、０．７％アガロース、ｐＨ５．９）の上に置床し、形質転換する植物材料とした。
【００３５】
（２）形質転換（感染）
マーカー遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を含むアグロバクテリウム懸濁液１ｍｌを、２００ｍｇ／ｌミオイノシトールとなるよう添加したＭＳ液体培地（３０ｇ／ｌスクロース、ｐＨ５．９）１０ｍｌに接種した培養液に、茎切片を１〜２分間浸漬させた。その後、０．０４ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１．０ｍｇ／ｌゼアチン、２００ｍｇ／ｌミオイノシトールとなるよう添加したＭＳ固形培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．７％アガロース、ｐＨ５．９）で２日間共存培養を行った。
【００３６】
（３）植物体の再生
植物の再生用の培地として、０．０４ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１．０ｍｇ／ｌゼアチン、２００ｍｇ／ｌミオイノシトール、５００ｍｇ／ｌカルベニシリンとなるよう添加したＭＳ固形培地（３０ｇ／ｌスクロース、０．７％アガロース、、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、ｐＨ５．９）で培養を行い、植物体が得られるまで、２〜３週間ごとに新しい培地に植替え、培養を継続した。
【００３７】
（４）形質転換体の確認
得られた遺伝子組換えジャガイモの葉を、ＧＵＳ染色試薬の入ったチューブに加え、３７℃で一晩インキュベートする。インキュベート後、ＧＵＳ染色試薬と１００％エタノールを入れ替え、葉の色素（クロロフィル）を脱色した。脱色後、遺伝子導入されている個体のＧＵＳ染色を目視で観察することでＧＵＳ遺伝子の導入を確認した。
【００３８】
形質転換効率：形質転換体の個数／組織片の個数（４０個）×１００（％）
評価：◎ 形質転換効率 ２０％以上
○ 形質転換効率 １５％以上２０％未満
△ 形質転換効率 １０％以上１５％未満
× 形質転換効率 １０％未満
【００３９】
［実施例２］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．０２ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４０】
［実施例３］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．０６ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４１】
［実施例４］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．０８ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４２】
［実施例５］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．１ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４３】
［実施例６］
植物体の再生用の培地のゼアチンの濃度を０．５ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４４】
［実施例７］
植物体の再生用の培地のゼアチンの濃度を２．０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４５】
［実施例８］
植物体の再生用の培地のカルベニシリンの濃度を１００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４６】
［実施例９］
植物体の再生用の培地のカルベニシリンの濃度を２００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４７】
［実施例１０］
植物体の再生用の培地のミオイノシトールの濃度を３００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４８】
［比較例１］
植物体の再生用の培地にナフタレン酢酸を添加しない以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００４９】
［比較例２］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．３ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５０】
［比較例３］
植物体の再生用の培地のナフタレン酢酸の濃度を０．６ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５１】
［比較例４］
植物体の再生用の培地のミオイノシトールの濃度を１００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５２】
［比較例５］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをセフォタキシム５０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５３】
［比較例６］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをセフォタキシム１００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５４】
［比較例７］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをセフォタキシム２５０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５５】
［比較例８］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをモキサラクタム２０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５６】
［比較例９］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをモキサラクタム４０ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５７】
［比較例１０］
植物体の再生用の培地のカルベニシリン５００ｍｇ／ｌをモキサラクタム１００ｍｇ／ｌとした以外は、実施例１と同様にして形質転換体を得た。
【００５８】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトール、およびカルベニシリンを含む、培地。
【請求項２】
カルベニシリンの濃度が５０〜１０００ｍｇ／ｌである、請求項１記載の培地。
【請求項３】
アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片を、０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトール、およびカルベニシリンを含む培地で培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生する工程を含む、形質転換されたジャガイモ植物体の作出方法。
【請求項４】
目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムをジャガイモ組織片に感染させて、前記ジャガイモ組織片を得る工程をさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項１】
０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトール、およびカルベニシリンを含む、培地。
【請求項２】
カルベニシリンの濃度が５０〜１０００ｍｇ／ｌである、請求項１記載の培地。
【請求項３】
アグロバクテリウム法により形質転換されたジャガイモ組織片を、０．０１〜０．２ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸、０．１〜５．０ｍｇ／ｌのゼアチン、１５０ｍｇ／ｌ以上のミオイノシトール、およびカルベニシリンを含む培地で培養して、形質転換されたジャガイモ植物体を再生する工程を含む、形質転換されたジャガイモ植物体の作出方法。
【請求項４】
目的遺伝子を含む発現ベクターが導入されたアグロバクテリウムをジャガイモ組織片に感染させて、前記ジャガイモ組織片を得る工程をさらに含む、請求項３記載の方法。
【公開番号】特開２０１１−１９４５９（Ｐ２０１１−１９４５９Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６８２５７（Ｐ２００９−１６８２５７）
【出願日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（０００１８３４８４）日本製紙株式会社 (981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【出願人】（０００１８３４８４）日本製紙株式会社 (981)
【Ｆターム（参考）】
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