スプライス領域アンチセンス組成物および方法
【課題】選択されるタンパク質（５’末端の１〜２５塩基対下流のプレプロセシングされたｍＲＮＡ内の正常スプライスアクセプター連結点）に関する配列に対して標的化されたアンチセンス組成物を提供すること本発明の課題とする。このアンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ不活性であり、そして好ましくは、ホスホロチオネート結合モルホリンオリゴヌクレオチドである。このような標的化は、天然のＲＮＡスプライスプロセシングの阻害に効果的であり、スプライス改変体ｍＲＮＡを生じ、そしてタンパク質の正常 な発現を阻害する。
【解決手段】上記課題は、無電荷のモルホリノ骨格を有するアンチセンス化合物を提供することによって、解決された。
【解決手段】上記課題は、無電荷のモルホリノ骨格を有するアンチセンス化合物を提供することによって、解決された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞内の全長タンパク質の発現を阻害するための治療学的組成物および方法に関し、そして特に、プロセシング前のｍＲＮＡ内の正常スプライスアクセプター連結点の５’末端の１〜約２５塩基下流を有するｍＲＮＡ配列に対して標的化されたアンチセンス組成物に関する。このような標的化は、天然のｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害し、そしてスプライス改変体ｍＲＮＡを産生するのに有効である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのアンチセンス標的化によるタンパク質発現の阻害は、広範な研究の対象である。多くの報告された手順は、ホスホロチオネート結合オリゴヌクレオチドを使用する。このホスホロチオネート結合オリゴヌクレオチドは、荷電した、ネイティブＤＮＡのヌクレアーゼ耐性アナログである。関連するアンチセンス機構は、ＲＮａｓｅの活性に基づく。ＲＮａｓｅは、オリゴマーに結合した標的核酸を切断する。これらの化合物は、高い活性を示すが、これらはまた、高いレベルの副作用（すなわち、非標的ＲＮＡの切断によってか、または非アンチセンス機構（例えば、タンパク質への非特異的な結合）によって）を示す傾向にある。
【０００３】
別のクラスのアンチセンスオリゴマー（ＲＮａｓｅ不活性（ＲＮａｓｅ−ｉｎａｃｔｉｖｅ）と称される）は、結合したＲＮＡの切断を促進せず、そして標的配列を翻訳、プロセシングまたは転写から分子機構を立体的にブロックすることによって作用すると考えられる。これらの化合物は、ホスホロチオネートオリゴマーよりも少ない副作用（例えば、非選択的切断）を生じる傾向にあるが、これは、一般に首尾良い阻害のためにＲＮＡの標的特異的領域（例えば、ＡＵＧ開始コドン）に必要である。
【０００４】
さらに最近、ＲＮａｓｅ不活性オリゴマーによる核（非スプライス）ＲＮＡのスプライスアクセプター連結点の標的化が報告されている。ＫｏｌｅおよびＤｏｍｉｎｓｋｉ（米国特許第５，６６５，５９３号）は、このような異常なスプライシングから生じるβ−サラセミアの改変体と戦うために、β−グロビンＲＮＡのミススプライシングの抑制を報告した。この場合、異常なスプライス連結点は、正常部位の後ろに直接スプライシングするように標的化した。ＲＶ Ｇｉｌｅｓら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．９：２１３〜２２０（１９９９）ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡのミススプライシングを誘導するためのスプライス結合の標的化。各々のこれらの場合において、標的化された領域また、アンチセンスオリゴマーが、プレｍＲＮＡのイントロン／エキソンスプライス連結点にわたる点においていくらか制限される。無電荷の、ＲＮａｓｅ不活性オリゴヌクレオチドの使用によって認められる利点に起因して、標的化におけるさらなる可撓性の実証は、非常に有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、アンチセンス化合物およびこのようなアンチセンス化合物と細胞と接触させることによって、真核細胞におけるプロセシング前のＲＮＡの正常なスプライシングを阻害する、対応する方法を提供する。化合物を、以下によって特徴付ける：
（ａ１）：無電荷のモルホリン骨格；
（ａ２）：１２ヌクレオチド塩基長と２５ヌクレオチド塩基長の間の塩基配列；および
（ａ３）：選択されるタンパク質をコードする選択されるプロセシング前のｍＲＮＡの標的領域に相補的な塩基配列、ここで、標的領域の５’末端は、プロセシング前のｍＲＮＡにおける正常スプライスアクセプター部位の１〜２５塩基下流であり、
そして、以下の性質：
（ｂ１）：真核細胞によって取り込まれる化合物；
（ｂ２）：このような細胞中でプロセシング前のｍＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする化合物；および
（ｂ３）：標的プレｍＲＮＡにハイブリダイズして、正常アクセプタースプライス部位においてスプライシングを防止し、その結果、スプライス機構は、プロセシング前のｍＲＮＡにおける下流スプライスアクセプター部位において進行し、短縮型コード配列を有するｍＲＮＡをプロセスされたスプライス改変体を生じる化合物。
【０００６】
さらに特定の実施形態において、標的領域の５’末端は、正常スプライスアクセプター部位の下流の、２〜２０塩基または２〜１５塩基である。標的化合物の長さは、好ましくは、約１５ヌクレオチド長〜約２０ヌクレオチド長である。
【０００７】
１つの実施形態において、この化合物は、図２ＡＡ〜２ＥＥに示される構造からなる群から選択されるサブユニット間結合を有する。好ましい実施形態において、この結合は、図２Ｂ−Ｂに示されるようなホスホロジアミド結合から選択され、ここでＸ＝ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲ’、Ｙ＝ＯおよびＺ＝Ｏならびに図２Ｂ−Ｂに表されるような代替のホスホロジアミド結合であり、ここで、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ、およびＺ＝Ｏである。Ｒ＝Ｒ’は、標的結合と相互作用しない基である。好ましくは、ＲおよびＲ’は、アルキルおよびポリアルキレンオキシ（例えば、ＰＥＧ；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）またはそれらの混合物から独立して選択される。アルキル／ポリアルキレンオキシ鎖は、好ましくは、遠位の末端で、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキシ、カルボン酸、カルボン酸エステルおよび無機エステル（例えば、ホスホフェートまたはスルホネート）から選択される基によって置換され得る。好ましくは、鎖（置換基とは無関係）は、１〜１２原子長であり、そしてさらに好ましくは、１〜６原子長である。選択される実施形態において、ＲおよびＲ’は、独立して、メチルまたはエチルである。１つの実施形態において、Ｘ＝Ｎ（ＣＨ３）２、Ｙ＝ＯおよびＺ＝Ｏである。
【０００８】
ＮＲＲ’はまた、窒素、炭素、酸素および硫黄から選択される５〜７環原子を有し、そして少なくとも非炭素環原子程多くの炭素環原子を有する窒素ヘテロ環を示し得る。例としては、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、トリアゾール、ピラゾール、ピロール、イソピロール、イミダゾール、オキサソール、イミダゾール、イソキサゾールなどが挙げられる。
【０００９】
下流スプライスアクセプター部位が、複数の正常スプライスアクセプター部位の３塩基の全体である場合、スプライス改変体ｍＲＮＡは、平常にスプライスされた際に、プロセスされたｍＲＮＡの配列を有するフレーム内のコード配列を有する。
【００１０】
タンパク質は、好ましくは、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌ、ｐ５３、インテグリン、カセドリン、テロメラーゼ、ｈＣＧ、レセプタータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、ＨＩＶ ｒｅｖ、ヒト乳頭腫ウイルスおよびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群より選択される。選択される実施形態において、このタンパク質は、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ａｂｌ、ｐ５３、ｈＣＧ−βサブユニット、アンドロゲンレセプタータンパク質およびＨＩＶ−１ ｒｅｖから選択される。
【００１１】
さらなる選択される実施形態において、選択されるタンパク質は、複数の別個の結合領域（多くの転写因子の場合のように）を有し、そして短縮形態コード配列が、このような結合領域が無力である改変体タンパク質をコードする。好ましくは、改変体タンパク質は、ドミナントネガティブなタンパク質である。１つの例は、ヒトｃ−ｍｙｃであり、ここで、改変体タンパク質は、Ｎ末端短縮型ｃ−ｍｙｃである。この実施形態において、使用されるアンチセンス化合物は、本明細書中の配列番号１６〜配列番号３２からなる群から選択される塩基配列を有する。改変体タンパク質はまた、Ｃ末端改変ｃ−ｍｙｃであり、この場合、使用されるアンチセンス化合物は、配列番号３４から選択される連続配列である塩基配列（例えば、配列番号３３）を有する１８マーから２０マーであり得る。
【００１２】
さらなる例示的な実施形態において、選択されるタンパク質およびそのプレｍＲＮＡを標的化する対応するアンチセンス塩基配列は、以下の群から選択される：
（ａ） ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット：配列番号１５から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１４）；
（ｂ） ヒトアンドロゲンレセプター：配列番号９または配列番号１３から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、それぞれ、配列番号８または１２）；
（ｃ） ヒトｐ５３：配列番号３６から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、配列番号３５）；
（ｄ） ヒトａｂｌ：配列番号３８から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、配列番号３７）；および
（ｅ） ＨＩＶ ｒｅｖ：配列番号４１から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、配列番号４０）。
【００１３】
本発明のこれらの目的および他の目的ならびに特徴は、本発明の以下の詳細な説明を、添付の図面と合わせて読む場合、さらに完全に明かになる。
例えば、本願発明は、以下を提供する。
（項目１） アンチセンス化合物であって、該アンチセンス化合物は、無電荷のモルホリン骨格および１２ヌクレオチド塩基長と２５ヌクレオチド塩基長の間の塩基配列を有し、該塩基配列は、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌ、ｐ５３、インテグリン、カセドリン、テロメラーゼ、サイトカイン、キナーゼ、レセプタータンパク質、ｈＣＧ、ＨＩＶ ｒｅｖ、ヒト乳頭腫ウイルスおよびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群から選択されるタンパク質をコードする、選択される、プロセシング前のｍＲＮＡの標的領域に相補的であり、
ここで、該標的領域の５’末端が、該プロセシング前のｍＲＮＡにおける正常スプライスアクセプター部位の１〜２５塩基下流である、アンチセンス化合物。
（項目２） 項目１に記載の化合物であって、サブユニット間の結合が図２ＡＡ〜２ＥＥに示される構造からなる群から選択される、化合物。
（項目３） 前記結合が、図２Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート結合であり、ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、および、Ｚ＝Ｏであるか、あるいは、、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ’、およびＺ＝Ｏであり、そして、ＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である、項目２に記載の化合物。
（項目４） 前記ＲおよびＲ’が、アルキルおよびポリアルキレンオキシまたはそれらの組合わせから独立して選択される部分であり、そして、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル、および、無機エステルから選択される１つ以上の基によって置換され得る、項目３に記載の化合物。
（項目５） 前記ＲおよびＲ’の各々が、置換と無関係で１〜６原子長である、項目４に記載の化合物。
（項目６） 前記ＮＲＲ’が、窒素、炭素、酸素、およびイオウから選択される５〜７個の環原子を有し、かつ非炭素環原子と少なくとも同数の炭素環原子を有する、窒素複素環を示す、項目３に記載の化合物。
（項目７） 前記標的領域の５’末端が、正常スプライスアクセプター部位の１０〜１５塩基下流である、項目６に記載の化合物。
（項目８） 前選択されるタンパク質が、ヒトｃ−ｍｙｃである、項目１に記載の化合物。
（項目９） 前記塩基配列が、配列番号１６〜配列番号３２からなる群から選択される、項目８に記載の化合物。
（項目１０） 前記塩基配列が、配列番号２５である、項目９に記載の化合物。
（項目１１） 前記塩基配列が、配列番号３４から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目８に記載の化合物。
（項目１２） 前記塩基配列が、配列番号３３である、項目１１に記載の化合物。
（項目１３） 前記選択されるタンパク質が、ヒトアンドロゲンレセプターであり、そして前記塩基配列が、配列番号９または配列番号１３から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目１４） 前記塩基配列が、配列番号８または配列番号１２である、項目１３に記載の化合物。
（項目１５） 前記選択されるタンパク質が、ＨＣＧ−βサブユニットであり、そして前記塩基配列が、配列番号１５から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目１６） 前記塩基配列が、配列番号１４である、項目１５に記載の化合物。
（項目１７） 前記選択されるタンパク質が、ヒトｐ５３であり、そして前記塩基配列が、配列番号３６から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目１８） 前記塩基配列が、配列番号３５である、項目１７に記載の化合物。
（項目１９） 前記選択されるタンパク質が、ヒトａｂｌあり、そして前記塩基配列が、配列番号３８から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目２０） 前記塩基配列が、配列番号３７である、項目１９に記載の化合物。
（項目２１） 前記選択されるタンパク質が、ＨＩＶ−１ ｒｅｖあり、そして前記塩基配列が、配列番号４１から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目２２） 前記塩基配列が、配列番号４０である、項目２１に記載の化合物。
（項目２３） 真核生物細胞におけるｍＲＮＡの正常なスプライシングを阻害する方法であって、
アンチセンス化合物であって、無電荷のモルホリン骨格および１２ヌクレオチド塩基長と２５ヌクレオチド塩基長の間の塩基配列を有し、該塩基配列は、選択されるタンパク質をコードする選択される、プロセシング前のｍＲＮＡの標的領域に相補的であり：ここで該標的領域の５’末端は、該プロセシング前のｍＲＮＡにおける正常スプライスアクセプター部位の１〜２５塩基下流であるアンチセンス化合物を、該細胞と接触させる工程、
を包含し、
ここで、該化合物は、該細胞によって取り込まれ、該細胞内で該プロセシング前のｍＲＮＡの該標的領域にハイブリダイズし、そのハイブリダイズされた該化合物が、該正常アクセプタースプライス部位でのスプライシングを防止し、その結果、該スプライス機構は、ｍＲＮＡにおける下流スプライスアクセプター配列に進行し、短縮型コード配列を有するプロセスされたスプライス改変体ｍＲＮＡを産生する、方法。
（項目２４） 項目２３に記載の方法であって、前記タンパク質が、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌ、ｐ５３、インテグリン、カセドリン、テロメラーゼ、ｈＣＧ、レセプタータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、ＨＩＶ ｒｅｖ、ヒト乳頭腫ウイルスおよびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群より選択される、方法。
（項目２５） 項目２４に記載の方法であって、前記化合物が、図２ＡＡ〜２ＥＥに示される構造からなる群から選択されるサブユニット間の結合を有する、方法。
（項目２６） 前記結合が、図２Ｂ−Ｂに示されるとりであり、ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、および、Ｚ＝Ｏ、あるいは、、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ’、およびＺ＝Ｏであり、ＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 前記ＲおよびＲ’が、アルキルおよびポリアルキレンオキシまたはそれらの混合物から独立して選択され、そして、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル、および、無機エステルから選択される１つ以上の基によって置換され得る、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記ＲおよびＲ’が、置換と無関係で１〜１２原子長である、項目２７に記載の方法。
（項目２９） 前記ＮＲＲ’が、窒素、炭素、酸素、およびイオウから選択される５〜７個の環原子を有し、かつ非炭素環原子と少なくとも同数の炭素環原子を有する、窒素複素環を示す、項目２６に記載の方法。
（項目３０） 前記標的領域の５’末端が、正常スプライスアクセプター部位の１０〜１５塩基下流である、項目２３に記載の方法。
（項目３１） 項目２３に記載の方法であって、前記下流スプライスアクセプター部位が、複数の正常スプライスアクセプター部位の３塩基下流の全体であり、その結果該スプライス改変体ｍＲＮＡは、正常にスプライスされた場合、プロセスされたｍＲＮＡの配列を有するフレーム内にコード配列を有する、方法
（項目３２） 項目２３に記載の方法であって、前記選択されるタンパク質が、複数の別個の結合領域を有し、そして前記短縮形態コード配列が、結合領域が無力である改変体タンパク質をコードする、方法。
（項目３３） 前記改変体タンパク質は、ドミナントネガティブなタンパク質である、項目３２に記載の方法。
（項目３４） 前記選択されるタンパク質が、ヒトｃ−ｍｙｃであり、そして該改変体タンパク質が、Ｎ末端短縮型ｃーｍｙｃタンパク質である、項目３３に記載の方法。
（項目３５） 前記アンチセンス化合物が、配列番号１７〜配列番号３２からなる群から選択される塩基配列である、項目３４に記載の方法。
（項目３６） 前記アンチセンス化合物が、塩基配列配列番号２５を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７） 項目２３に記載の方法であって、前記選択されるタンパク質および対応するアンチセンス塩基配列は、以下：
（ａ） ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット：配列番号１５から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；
（ｂ） ヒトアンドロゲンレセプター：配列番号９または配列番号１３から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；
（ｃ） ヒトｃ−ｍｙｃ：配列番号３４から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；
（ｄ） ヒトｐ５３：配列番号３６から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；
（ｅ） ヒトａｂｌ：配列番号３８から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；および
（ｆ） ＨＩＶ ｒｅｖ：配列番号４１から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列、
からなる群から選択される、使用。
（項目３８） 項目３７に記載の方法であって、ここで、前記選択されたタンパク質および対応するアンチセンス塩基配列が、以下：
（ａ）ヒト ヒト絨毛性ゴナドトロピン、βサブユニット：配列番号１４；
（ｂ）ヒト アンドロゲンレセプター：配列番号１２；
（ｃ）ヒト ｃ−ｍｙｃ：配列番号３３；
（ｄ）ヒト ｐ５３：配列番号３５；
（ｅ）ヒト ａｂｌ：配列番号３７；および
（ｆ）ＨＩＶ−１ ｒｅｖ：配列番号４０
からなる群から選択される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ポリマーを形成するための適切な基に結合する５原子（Ａ）、６原子（Ｂ）および７原子（Ｃ−Ｅ）を有する幾つかの好ましいサブユニットを示す。
【図２】図２Ａ−Ａから図２Ｅ−Ｅは、それぞれ、図１のサブユニットＡ−Ｅを使用して構築され、Ａ−Ａ〜Ｅ−Ｅと命名された、例示的なモルホリンオリゴヌクレオチドの繰り返しサブユニットセグメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中に使用される場合、以下の用語は、他の方法で示されない限り、以下の意味を有する：
「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対形成によってＲＮＡ中の標的配列にハイブリダイズして、標的配列内でＲＮＡ：オリゴマーのヘテロ二重鎖（代表的にはｍＲＮＡと共に）を形成することを可能にする、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間（ｓｕｂｕｎｉｔ−ｔｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ）骨格を有するオリゴマーをいう。このオリゴマーは、標的配列に対して正確な配列相補性を有し得るか、または近い相補性を有し得る。これらのアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害し得、そして／またはｍＲＮＡのプロセシングを改変してｍＲＮＡのスプライス改変体を生成し得る。
【００１６】
本明細書中に使用される場合、用語「化合物」、「因子」、「オリゴマー」および「オリゴヌクレオチド」は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して交換可能に使用され得る。
【００１７】
本発明に使用される場合、「モルホリノオリゴマー」は、典型的なポリヌクレオチドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー分子をいい、ここで、このポリマーは、ペントース糖骨格部分（そしてより詳細には、代表的なヌクレオチドおよびヌクレオシドである、ホスホジエステル結合によって連結されるリボース骨格）を欠くが、環窒素を介してカップリングする環窒素を代わりに含む。本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドについての例示的な構造としては、図１Ａ〜Ｅに示されるモルホリノサブユニット型、図２Ａ−Ａ〜２Ｅ−Ｅに示される連結が挙げられる。このような構造は、例えば、Ｈｕｄｚｉａｋら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．６，２６７−２７２（１９９６）ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７，１８７−１９５（１９９７）に記載される。
【００１８】
図１中のサブユニットＡは、１原子リン含有連結を含み、この連結は、図２中のＡ−Ａに示される５原子反復単位骨格を形成し、ここで、このモルホリノ環は、１原子ホスホアミド連結によって連結される。
【００１９】
好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドは、図２Ｂ−Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造で構成され、ここでこの構造は、互いにホスホロジアミデート連結によって共に連結され、１つ目のサブユニットのモルホリノ窒素から隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結し、そしてＰｉおよびＰｊは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基へ結合するのに効果的な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分である。好ましい実施形態において、この連結は、図２Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート連結（ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏ）、および図２Ｂ−Ｂに示される代替のホスホロジアミデート連結（ここで、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ、およびＺ＝Ｏ）から選択される。ＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である。好ましくは、ＲおよびＲ’は、アルキルおよびポリアルキレンオキシ（例えば、ＰＥＧ；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、またはその組合わせから独立して選択される。（このような組合わせの例は、−（ＣＨ２）３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−である）。アルキル／ポリアルキレンオキシ鎖は、好ましくは遠位末端（すなわち、オリゴマー骨格に接続しない末端）において、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｅｓｔｅｒ）、および無機エステル（例えば、ホスフェートまたはスルホネート）から選択される基によって置換され得る。好ましくは、鎖（置換と無関係で）は、１〜１２原子長であり、そしてより好ましくは１〜６原子長である。選択された実施形態において、ＲおよびＲ’は、独立してメチルまたはエチルである。１つの実施形態において、Ｘ＝Ｎ（ＣＨ３）２、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである。ＮＲＲ’はまた、窒素、炭素、酸素、およびイオウから選択される５〜７個の環原子を有し、かつ非炭素環原子と少なくとも同数の炭素環原子を有する、窒素複素環を示し得る。例としては、モルホリン、ピロリジン、リペラジン、およびピリジンが挙げられる。
【００２０】
図１中のサブユニットＣ〜Ｅは、図２中のＣ−Ｃ〜Ｅ−Ｅについて示されるように７原子単位長骨格のために設計されている。構造Ｃにおいて、Ｘ部分は、構造Ｂ中のものと同じであり、そしてＹ部分は、メチレン、イオウ、または好ましくは酸素であり得る。構造Ｄにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、構造Ｂ中のものと同じである。構造Ｅにおいて、Ｘは、構造Ｂ中のものと同じであり、そしてＹは、Ｏ、ＳまたはＮＲである。図１Ａ〜Ｅに示される全てのサブユニットにおいて、ＺはＯまたはＳであり、そしてＰｉまたはＰｊは、アデニン、シトシン、グアニンまたはウラシルである。
【００２１】
「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴマー）は、その骨格がヌクレアーゼ切断を受けにくい分子である。
【００２２】
本明細書中に使用される場合、オリゴマーが生理学的条件下で、実質的に３７℃より高い（好ましくは、少なくとも５０℃、そして代表的には６０℃〜８０℃、またはそれより高い）Ｔｍにおいて、標的にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列についての熱融点（Ｔ［ｍ］）よりも約１０℃、および好ましくは約５０℃低くあるように選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔ［ｍ］は、標的配列の５０％が相補ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。
【００２３】
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平行配置で生じる場合、互いに「相補的」と記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１ポリヌクレオチドの鎖のうちの１つと第２ポリヌクレオチドの鎖のうちの１つとの間で生じ得る場合、別のポリヌクレオチドに対して「相補的」であり得る。相補性（一方のポリヌクレオチドが他方のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に是認された塩基対形成規則に従って、互いに水素結合を形成することが予想される対抗する鎖における塩基の割合に関して定量化可能である。
【００２４】
「ＲＮａｓｅ不活性」または「ＲＮａｓｅ不適格（ＲＮａｓｅ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」であるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログは、ＲＮａｓｅ活性オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート）と異なり、ＲＮａｓｅ独立の機構を介して作用するものである。これらは、標的ＲＮＡ形成、核−細胞質輸送または翻訳を立体的にブロックすることによって機能すると考えられ、従って、「立体的ブロッカー（ｓｔｅｒｉｃ ｂｌｏｃｋｅｒ）」とも呼ばれる。この型としては、例えば、メチルホスホネート、本明細書中に記載されるようなモルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および２’−Ｏ−アリル修飾されたオリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−アルキル修飾されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２５】
「ペプチド核酸」において、オリゴヌクレオチド骨格のデオキシリボースリン酸単位は、ポリアミド連結で置換される。適切な骨格間隔は、２−アミノエチルグリシン単位の使用によって達成され、ヌクレオチド塩基は、メチレンカルボニル基を介して各２−アミノ基に結合する。
【００２６】
「２’−Ｏ−アリル（またはアルキル）修飾されたオリゴヌクレオチド」は、２’ヒドロキシルが、アリルまたはアルキルエーテルに変換されているオリゴリボヌクレオチドである。アルキルエーテルは、代表的にメチルエーテルである。
【００２７】
「アルキル」は、炭素および水素を含む完全に飽和された非環式の一価の基をいい、これは、分枝鎖であっても、直鎖であってもよい。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、およびイソプロピルである。「低級アルキル」は、１〜６炭素原子、好ましくは１〜４炭素原子のアルキル基をいい、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔ−ブチルによって例示される。
【００２８】
「短縮」タンパク質またはコード配列は、一方の末端もしくは両末端から、内部領域から、または上記を組合わせた所から、正常なタンパク質または配列のいくらかの部分が取り除かれている。
【００２９】
アミノ短縮（Ｎ短縮）タンパク質またはカルボキシ短縮（Ｃ短縮）タンパク質は、それぞれ、スプライス改変体ｍＲＮＡの翻訳から生じる、異常もしくは欠失したアミノ末端または異常もしくは欠失したカルボキシ末端を有するタンパク質である。
【００３０】
（ＩＩ．アンチセンス化合物）
本発明に従って、１２〜２５ヌクレオチドを有するアンチセンス化合物（選択されたタンパク質をコードする選択されたプロセシング前ｍＲＮＡの標的領域に相補的である標的化塩基配列を含み、ここで、この標的領域の５’末端は、プロセシング前ｍＲＮＡ中の正常なスプライス受容部位の１〜２５塩基下流、好ましくは２〜２０塩基下流、より好ましくは２〜１５塩基下流である）が、正常なスプライス受容部位においてスプライシングを阻害し、故にスプライス改変体ｍＲＮＡを生成するのに有効であり、翻訳の際に選択されたタンパク質の短縮バージョンまたは他の方法により異常であるバージョンを引き起こすことが発見された。この戦略の利点を、以下に示す。
【００３１】
本発明に利用したアンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化しない化合物である。ＲＮａｓｅ−Ｈ活性オリゴマー（ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが最も顕著な例である）は、標的ｍＲＮＡが切断される機構によって主に作用する。一方、ＲＮａｓｅ不適格オリゴマーは、立体的ブロッキング機構によって作用すると考えられる。このような化合物としては、モルホリノオリゴマー、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、メチルホスホネート、および２’−Ｏ−アルキル修飾オリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−アリル修飾オリゴヌクレオチド（これらの全ては、当該分野で公知である）が挙げられる。本発明の好ましいアンチセンスオリゴマー（化合物）は、モルホリノオリゴマーであり、これは、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に示される形態のモルホリノサブユニットの化合物である。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特徴は、これらの特許に詳述される。モルホリノオリゴマーにおいて、（ｉ）モルホリノ基は、非荷電リン含有連結によって一緒に連結され、１〜３原子長であり、１つ目のサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結し、そして（ｉｉ）モルホリノ基に結合した塩基は、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基へ結合するのに効果的な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分である。プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分は、代表的に、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはチミンである。このようなオリゴマーの調製は、米国特許第５，１８５，４４４（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９３）（これらは、その全体が本明細書によって参考として援用される）に詳細に記載される。参考文献に示されるように、非イオン性連結のいくつかの型が、モルホリノ骨格を構築するために使用され得る。
【００３２】
このようなモルホリノオリゴマーは、ＲＮＡ標的に対する高い結合親和性が示され、そして荷電されていない骨格は、荷電された類似物（例えば、ホスホロチオエート）に対して、細胞への取り込みを支持し、そして非特異的結合相互作用を減少する。これらは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、標的配列の翻訳を阻害する際に有意に改善された活性および選択性を提供することが示されている。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７（２）：６３−７０，Ａｐｒ １９９７を参照のこと。モルホリノオリゴマーは、非常に高いヌクレアーゼ耐性および良好な水溶性を有し、これによってインビボ使用のための良好な候補物である。インビボにおける細胞による効果的な取り込みが、共有に係り、かつ係属中の出願０９／４９３，４２７および対応するＰＣＴ公開ＷＯ ００／４４８９７において実証されている。それらの中に記載されるように、ホスホラミデート連結を有するモルホリノオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡとヘテロ二重鎖を形成し、これは、この二重鎖状態中でヌクレアーゼ分解から保護されている。このような二重鎖は、細胞から排出され、そして標的ＲＮＡは、被験体由来の体液サンプルから後で検出され得る。これらの結果は、モルホリノオリゴマーが、（ｉ）体内の細胞に移動し、そしてそこへ侵入すること、および（ｉｉ）ワトソン−クリック塩基対形成を介して、標的核酸領域に高い親和性で結合することを実証する。
【００３３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的な骨格構造としては、上記のように、図１Ａ−Ｅに示されるβ−モルホリノサブユニット型が挙げられる。ポリヌクレオチドが１つより多くの連結型を有し得ることが、認識される。
【００３４】
好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドは、図２Ｂ−Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造で構成され、ここでこの構造は、ホスホロジアミデート連結によって一緒に連結され、一方のサブユニットのモルホリノ窒素は隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結し、ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的水素結合によるポリヌクレオチド中の塩基へ結合するのに効果的な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分である。好ましい実施形態において、この連結は、図２Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート連結（ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏ）、および図２Ｂ−Ｂに示される代替のホスホロジアミデート連結（ここで、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ、およびＺ＝Ｏ）から選択される。ＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である。好ましくは、ＲおよびＲ’は、アルキルおよびポリアルキレンオキシ（例えば、ＰＥＧ；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、またはその組合わせから独立して選択される。。アルキル／ポリアルキレンオキシ鎖は、好ましくは遠位末端において、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル、および無機エステル（例えば、ホスフェートまたはスルホネート）から選択される基によって置換され得る。好ましくは、鎖（置換と無関係で）は、１〜１２原子長であり、そしてより好ましくは１〜６原子長である。選択された実施形態において、ＲおよびＲ’は、独立してメチルまたはエチルである。１つの実施形態において、Ｘ＝Ｎ（ＣＨ３）２、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである。ＮＲＲ’はまた、窒素、炭素、酸素、およびイオウから選択される５〜７個の環原子を有し、かつ非炭素環原子と少なくとも同数の炭素環原子を有する、窒素複素環を示し得る。例としては、モルホリン、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、トリアゾール、ピラゾール、ピロール、イソピロール、イミダゾール、オキサゾール、イミダゾール、イソキサゾールなどが挙げられる。
【００３５】
アンチセンス化合物の溶解度、および溶液での保存における沈澱に抵抗する化合物の能力は、可溶化部分を用いてオリゴマーを誘導体化する（例えば、親水性オリゴマー、または荷電部分（例えば、荷電アミノ酸または荷電有機酸））ことによってさらに増強され得る。この部分は、アンチセンス化合物に結合し得、かつ化合物が標的配列に結合することを妨害しない、任意の生体適合性親水性部分または荷電部分であり得る。この部分は、周知の誘導体化方法を用いて、アンチセンス化合物に（例えば、５’末端に）化学的に結合され得る。１つの好ましい部分は、規定された長さのオリゴエチレングリコール部分（例えば、トリエチレングリコール）であり、トリエチレングルコールとのカルバメート連結を形成するピペラジン連結基を介して、カーボネート連結を通してアンチセンス化合物の５’末端に共有結合し、ここで、第２のピペラジン窒素は、アンチセンスの５’末端ホスホロジアミデート連結に結合する。あるいは、またはさらに、化合物は、１または少数の荷電骨格連結（例えば、ホスホジエステル連結）を、好ましくは化合物の末端の一方の付近に含むように設計され得る。付加された部分は、好ましくは、水性媒体中で、化合物の溶解度を少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌまで増強するのに効果的である。
【００３６】
この化合物は、実質的に３７℃よりも高いＴｍ（例えば、少なくとも５０℃そして好ましくは６０℃〜８０℃）を有する生理学的な条件下で標的配列にハイブリダイズするように設計される。この化合物は、標的配列に１００％相補的である必要はないが、これは、この標的配列の発現が調節されるように標的配列に安定かつ特異的に結合するために効果的である。良好な特異性と相まって、安定で効果的な結合を可能にするためのオリゴマーの適切な長さは、約８〜４０ヌクレオチド塩基単位、そして好ましくは約１２〜２５塩基単位である。ミスマッチは、存在する場合、ハイブリッド二重鎖の中央領域よりも、ハイブリッド二重鎖の末端領域に向かって不安定性が低くなる。この標的との塩基対特異性が維持されると仮定すると、標的塩基との変性塩基対形成を可能にするオリゴマー塩基もまた意図される。
【００３７】
（ＩＩＩ．標的配列の選択）
（Ａ．ＲＮＡスプライシング：背景）
転写の後の核ＲＮＡのプロセシングは、実質的に全ての生存細胞において観察される。哺乳動物ゲノムは、７〜８のエキソンを含む約１６，０００塩基長の転写物を作製する遺伝子を含む。スプライシングのプロセスは、ｍＲＮＡの長さを平均２，２００塩基まで減少させる。最初の転写物は、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）または前ｍＲＮＡと呼ばれる。ｈｎＲＮＡのプロセシングは、約２０のタンパク質の凝集体を含み、これは集合的にスプライソソームと呼ばれ、これはスプライシングおよび核からのｍＲＮＡの輸送を実行する。スプライソソームは、全ての転写物について共通の方向からスキャンするわけではないようである；イントロンは再現可能な順で除去され得るが、しかし指向された順で除去されない。例えば、イントロン３およびイントロン４が最初に除去され得、続いてイントロン２が除去され得、続いてイントロン１およびイントロン６が除去され得る。イントロン除去の順番には、予想できる先験的な観察はない。プロセシングのための配列の認識は小さく、これは誤差または多数のプロセシング部位が予測され得ると示唆され、そして実際、より多くの遺伝子が研究されるにつれて、ｈｎＲＮＡのプロセシングにおけるより多くのバリエーションが観察されてい「る。
【００３８】
前プロセシングされたｍＲＮＡにおいて、エキソン／イントロン連結部での２塩基の配列モチーフは不変である。上流（５’）スプライス供与体（ＳＤ）連結部は、エキソン−／ＧＴ−イントロンの形態であり、一方下流（３’）スプライス供与体（ＳＡ）連結部は、イントロン−ＡＧ／エキソンの形態である。隣接する塩基は不変ではない；しかし、スプライス受容体ＡＧ配列のすぐ上流の塩基は、約８０％の場合、Ｃである。
【００３９】
イントロン配列認識の現在の理解は以下のようである：
【００４０】
【化１】
括弧の中の数字は、部位における塩基の近似（＜１００％の場合）の割合の利用を示す。イントロン部位の中央における太字のＡは、スプライス供与体由来のＧが、ラリアットと呼ばれる分枝した２’−５’−構造を形成する部位（ブランチ点）である。（ＴＡＣＴＡＡＣ）で示される配列は、酵母において観察されるコンセンサスである。哺乳動物細胞におけるコンセンサス配列は、ＰｙＮＰｙ（８０）Ｐｙ（８７）Ｐｕ（７５）ＡＰｙ（７５）であり、ここでＰｙはピリミジン（Ｕ／ＴまたはＣ）を示し、そしてＰｕはプリン（ＡまたはＧ）を示す。ブランチ点におけるＡは不変であり、そして代表的に、ＡＧ部位の約１２〜５０塩基上流に見出される。ピリミジンリッチな領域（上記に示されていない）はまた、一般にイントロンの３’末付近（ＡＧ部位の約１０〜１５塩基上流）に見出される。
【００４１】
一旦このスプライソソームがラリアットを形成すると、２つのエステル交換反応が起こる：
１）イントロン中のブランチ点Ａの２’−ＯＨからＳＤイントロンＧの５’リン酸、および
２）ＳＤエキソンＧの３’−ＯＨからＳＡエキソンの最初の塩基の５’リン酸。この除去されたイントロンは、多くの場合素早く分解され、そして連結されたエキソンが今や成熟ｍＲＮＡと呼ばれ、これはリボソームによるタンパク質へ翻訳のために核の外に輸送される。
【００４２】
（Ｂ．標的化ストラテジー）
種々のアプローチが、アンチセンスオリゴマーによってｍＲＮＡのプロセシング（スプライシング）の標的化に使われ得る。以下の部位が標的化され得る：
１．ＳＤエキソンのエキソンのみの部分（ＳＤ部位の上流）（ＳＤプロセシングを阻害するため）。
２．ＳＤエキソン／イントロン連結部（ＳＤプロセシングを阻害するため）。
３．イントロン中のラリアット形成部位（ＳＡエキソンの上流のスプライソソームの認識をブロックするため）。
４．ＳＡイントロン／エキソン連結部（ＳＡプロセシングを阻害するため）。
５．ＳＡエキソンのエキソンのみの部分（ＳＡ部位の下流）（ＳＡプロセシングを阻害するため）。
【００４３】
先行技術の方法は、ストラテジー２またはストラテジー４（ＳＤ連結部またはＳＡ連結部の標的化）を利用してきた。例えば、ＲＶ Ｇｉｌｅｓら、前出（ｃ−ｍｙｃ遺伝子におけるスプライス受容体部位にわたるモルホリノアンチセンスオリゴマーが記載される）を参照のこと。
【００４４】
本発明を支持する実験によって、上記の標的化ストラテジー４および標的化ストラテジー５（スプライス受容体を指向する）は、ストラテジー１およびストラテジー２（スプライス供与体を指向する）よりもより確実に効果的であったことが見出された。
【００４５】
例えば、インビボ（動物全体）で標的化されるラットＣＹＰ３Ａ２前ｍＲＮＡを用いた研究が行なわれた。動物を、リン酸緩衝化生理食塩水中の１００μｇのＰＭＯ（図２Ｂ−Ｂを参照のこと。ここでＹ１およびＺは、酸素であり、そしてＸはＮ（ＣＨ３）２である）で腹腔内に注射した。エリスロマイシンＯ−デメチラーゼのミクロソーム代謝の減少した速度がモニターされ、アンチセンス阻害によって引き起こされる予期した表現型を反映した。示されるように、スプライス供与体（ＳＤ）標的化は、スプライス受容体（ＳＡ）ストラテジーよりも効率的ではなかった。
【００４６】
【表１】
ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡに対するオリゴマーアンチセンスを用いる実験を、培養されたラットＮＲＫ細胞において実行し、トリチウム化されたチミジンの取り込みをモニターすることによって細胞ＤＮＡ合成の阻害を評価した。配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｙ００３９６（ラット）およびＪ００１２０（ヒト）に由来し、これはエキソン２の先頭におけるスプライス受容体領域を標的化した（配列番号１は除く。これはスプライス供与体を標的化する）。示されるこのラットおよびヒトの配列は、この領域において高い相同性である。以下の表１において列挙されるオリゴマーを、いくつかの増殖アッセイを使用して、抗増殖効果についてスクリーニングした。２つの種（ラットおよびヒト、それぞれＮＲＫおよびＷＩ−３８）由来の初代線維芽細胞を、スクリーニングのために使用した。表１に示されるデータは、ＮＲＫ細胞を使用した。
【００４７】
２０μＭのＰＭＯ（図２Ｂ−Ｂにおいて示され、ここでＹ１およびＺは、酸素であり、そしてＸは、Ｎ（ＣＨ３）２）である）を使用する［３Ｈ］チミジン組込みアッセイからのデータを、表１に示す。割合は、ビヒクル（Ｈ２Ｏ）コントロールと比較した［３Ｈ］チミジン組込みをいう。従って、数が少なくなるほど、抗増殖効果は大きくなる。試験した全てのオリゴマーが、少なくともいくつかの抗増殖活性を示すことが見出され得る。阻害活性の程度を、３２％のコントロールで、抗増殖薬物であるタキソール（パクリタキセル、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）と都合よく比較した。１０％〜２０％の細胞がこすり落とし負荷手順によって影響されず、従って残余の［３Ｈ］チミジン組込み活性に寄与するので、最も効果的なオリゴマーを含むほとんどまたは全ての細胞は、増殖阻害されたようであった。
【００４８】
【表２】
２つの関係のない配列のオリゴマー（ラットＢＣＬ−２、配列番号４９およびラットＰＣＮＡ−１、配列番号５０）は、アッセイした最も高い濃度（２０μＭ）でＮＲＫ細胞を阻害しない。配列番号２５のミスマッチ配列およびスクランブル配列（それぞれ配列番号４８および配列番号４７）は、２０μＭでＷＩ−３８（ヒト）線維芽細胞の増殖に対していずれの効果もない。
【００４９】
配列番号４５（ヒトｍｙｃ前ｍＲＮＡの第１イントロンの３’スプライス受容体部位にわたる）は、Ｇｉｌｅｓら（１９９９）によって、ｍｙｃ前ｍＲＮＡのミススプライシングを引き起こすことが示された。潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）または潜伏した（ｌａｔｅｎｔ）スプライス受容体（通常のスプライス受容体位置に対して４４ｂｐ遠位である）を使用して、４４ｂｐの欠失を有する異常にスプライシングされたｍＲＮＡを生成した。このミススプライシングされたｍＲＮＡは、開始ＡＵＧを欠失し、そして正常なｍｙｃタンパク質を生成しなかった。
【００５０】
配列番号２５は、イントロン１〜エキソン２の境界に広がっておらず、第１の可能性のある相補的な塩基対は、３’スプライス受容体から１０番目のヌクレオチドである。同様に、配列番号３は、ラットｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ配列におけるスプライス受容体下流の５’末端の１１塩基を有する。データに示されるように、両方の配列は細胞増殖の阻害において効果的であった。配列番号４５について示されたように、これらのオリゴマーが正常なスプライシングを阻害するか否かを決定することは関心深いものであった。従って、ＲＮＡを、陽性コントロールオリゴマー（配列番号４５）および陰性コントロールオリゴマー（配列番号５０）ならびに配列番号２５で処理されたヒト細胞から調製した。次いでこのＲＮＡの構造を、逆転写酵素を使用してＤＮＡコピーを作製し、次いで隣接のＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲを実行することによって分析した（以下の材料および方法を参照のこと）。このＲＴ−ＰＣＲ手順の産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００５１】
未処理の細胞または無関係なオリゴマーで処理した細胞において、使用したプライマーおよびｃ−ｍｙｃヌクレオチド配列から３０４ｂｐのバンドが予測され、そしてこのバンドが観察された。配列番号２５で処理した細胞については、２つのＤＮＡバンドが観察された。上のバンド（これは、未処理の細胞またはネガティブコントロール細胞からのフラグメントと共に移動した）は、使用した取り込み手順によってスクレイプロード（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄ）されなかった１０％〜２０％の細胞からのｍＲＮＡおよび処理細胞中の正しくスプライシングされたｍＲＮＡ画分を表した。より重たく、より低いバンド（ｈｅａｖｉｅｒ ｌｏｗｅｒ ｂａｎｄ）は、ミススプライシングされた４４ｂｐ欠失ｍＲＮＡを表した。
【００５２】
配列番号２５をロードした細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲ手順から２つのバンドを生成した。このうちの１つは、正常にスプライシングされたｍＲＮＡのサイズであり、そして１つはそれより小さいサイズである。それゆえに、配列番号２５は、スプライスアクセプター部位と直接的に重なっていないにもかかわらず、ミススプライシングを生じ得ると結論され得る。無関係なＰＭＯ（配列番号５０）は、未処理の細胞のｍＲＮＡ構造パターンと同一であるｍＲＮＡ構造パターンを提供し、ミススプライシングは配列特異的であることが実証された。
【００５３】
配列番号２５を用いた用量応答研究は、３μＭのＩＣ５０を与えた。この阻害効果は、１０μＭにおいてプラトーに達し始め、そして１０μＭから２０μＭではさらなる変化はほとんど存在しなかった。
【００５４】
Ｍｙｃタンパク質は、細胞周期のＧ０／Ｇ１期からＳ期への移行について関係があり重要であると推定される（ＭＫ Ｍａｔｅｙａｋら，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８：１０３９−４８，１９９７）。従って、ｍｙｃタンパク質レベルが低下した場合、この細胞はＧ１で停止すると予測される。この効果を、Ｔｅｌｆｏｒｄらの方法（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３：１３７−４３，１９９３）を使用して、Ｇ１およびＧ２にある細胞数を決定することによって調べた（材料および方法を参照のこと）。ＲＮＡを加水分解によって欠失した後、ＤＮＡ特異的な蛍光色素である、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）によって細胞を染色した。次いで、細胞毎のＤＮＡ含有量分布をＦＡＣＳ分析によって決定した。ＦＡＣＳ強度プロフィールは、２ＮのＤＮＡ含有量（Ｇ１）および４ＮのＤＮＡ含有量（Ｇ２）に対応する、２つのピークを示す。配列番号２５を有するＰＭＯで処理した細胞は、Ｇ２にある細胞の割合（２１％のビヒクルコントロールと比較して９％）と比較して、Ｇ１にある細胞の割合の増加（６６％のビヒクルコントロールと比較して７９％である）を示した。増殖因子の枯渇によって得た静止細胞のポジティブコントロールによって、８０％の細胞がＧ１にあり、そして８％の細胞がＧ２にあることが示めされた。
【００５５】
抗ｃ−ｍｙｃオリゴマー（配列番号２５）が、アンチセンス機構によってｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡ発現を阻害するさらなる証拠を得るために、レポーター遺伝子モデル系を構築して、１つの遺伝子（ルシフェラーゼ）およびその活性（発光）を直接調べ。ｍｙｃ−ルシフェラーゼレポータープラスミドは、昆虫ルシフェラーゼｃＤＮＡに融合した、全体として２．２−ｋｂである、ヒトｃ−ｍｙｃ ５’領域およびｍｙｃタンパク質の最初の６アミノ酸のコドンを含んでいた（Ｈｕｄｚｉａｋら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１０：１６３−７６（２０００）を参照のこと）。これをＨｅＬａ細胞へトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ産生クローンを選択し、クローンＬ６と命名した。この細胞株に、指定された濃度のＰＭＯをスクレイプロードし、そして再度プレーティングした。２４〜３０時間後、この細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を測定した（材料および方法を参照のこと）。
【００５６】
この結果は、ＩＣ５０が３００ｎＭである、ルシフェラーゼ産生の強い阻害を示した。いくつかのコントロール実験を実施して、ルシフェラーゼ合成の観察された阻害がＰＭＯによる配列特異的阻害であるか否かを決定した。配列番号２５および上記の２つの配列の置換物を（配列番号４７および４８）を比較した。乱雑化（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）したバーションのオリゴマーも、３塩基誤対合のオリゴマーのいずれもが、ルシフェラーゼ産生において効果を持たなかった。他のコントロール実験によって、配列番号２５が、ルシフェラーゼアッセイの３０時間のインキュベーション時間の間、配列相補性薬剤が７０％阻害を与える条件下において、ＨｅＬａ増殖に対して影響を持たず、そして関係のない標的レポーター系（ウサギα−グロビン；Ｊ Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：６３〜７０，１９９７）対して影響を持たなかったことが示しめされた。３〜４連続したグアニン（Ｇ）塩基を含む他の配列を、上記のＮＲＫ細胞増殖アッセイにおいて試験し、そしてこれは、２０μＭまでの濃度で細胞増殖の有意な阻害を与えなかった。
【００５７】
ラットｃ−ｍｙｃのスプライスアクセプター（ＳＡ）領域に関するＰＭＯアンチセンスの「機能フットプリンティング」の評価において、スプライシングの妨害が、ＳＡの−４４位上流からＳＡの＋３６位下流（標的領域の３’末端）までの領域を標的化するＰＭＯを用いて観測された。標的配列が下流に移動するにつれて、より低分子量のタンパク質の割合が、正常なｃ−ｍｙｃと比較して増加することが観測された。
【００５８】
スプライスアクセプター部位の接合部の下流（すなわちエキソン内）を標的化することは、以下に議論した理由によって一般に好ましい。
【００５９】
（ＩＶ．ＳＡ部位での妨害の結果）
結合オリゴマーが、ＳＡでの正常なｍＲＮＡスプライシングを妨害した場合、スプライセオソームは、この領域内のブロックされていない次の最も良好な候補部位に進む。この部位は、１０〜１５塩基上流の短い一続きのピリミジンおよびさらに上流の適切な分岐点を伴った［Ｃ］ＡＧ配列である傾向がある。
【００６０】
得られるプロセシングされたｍＲＮＡは、一般に、正常なスプライスアクセプター部位と選択的（すなわち「クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）」）スプライスアクセプター部位との間の配列が欠失された、スプライス改変体ｍＲＮＡである。得られた改変体タンパク質は、欠失された配列に依存して異なった形態を取る。例えば、この欠失された配列が、複数の３塩基対の全体を含む（つまり、下流のスプライスアクセプター部位は、正常なスプライスアクセプター部位の下流の複数の３塩基の全体を含む）場合、続く配列は、正常な配列とフレームが一致しており、そしてネイティブなタンパク質の短縮化形態が得られる。これは、例えば、以下の実施例Ｃにおいて記載されるようにドミナントネガティブタンパク質の形成を可能にする。しかし、クリプティック部位が正常な部位とのフレームがずれている場合、関連のない「ナンセンス」タンパク質が生成される。非リーディングフレーム配列中の終止コドンの頻繁な発生（２０コドン当たり約１コドン）に起因して、このようなスプライス改変体のｍＲＮＡは、代表的には翻訳の初期終止に至る。
【００６１】
この欠失された配列がＡＵＧ開始部位を含むならば、翻訳は、さらに下流で見出される選択的なＡＵＧ部位で生じ得る。さらに、この選択的部位が通常のＡＵＧ部位のフレームと一致している場合、得られたタンパク質は、ネイティブなタンパク質から幾つかのアミノ酸が欠失されている。この選択的部位がフレームとずれている場合、「ナンセンス」タンパク質（代表的には翻訳の初期で短縮される）を生じる。
【００６２】
１つの実施形態において、以下の実施例Ａおよび実施例Ｂで例示されるように、カルボキシ末端短縮化タンパク質を生成する。別の実施形態において、実施例Ｃおよび実施例Ｄで例示されるように、異常アミノ末端を有するかまたはアミノ末端が欠失されたタンパク質が生成される。後者は、ＡＵＧ翻訳開始部位がｍＲＮＡのエキソン２またはそれ以降のエキソンにある場合に、達成され得る。
【００６３】
従って、所望のタンパク質についてのプレｍＲＮＡ配列が既知である場合、アンチセンス標的が設計され、このタンパク質の所望の領域を改変し得る。好ましくは、このタンパク質の結合ドメインはまた既知であり、この結果、このタンパク質の選択された機能を改変し得る。
【００６４】
以下の工程を使用して、本発明に従って、複数のエキソンを有する遺伝子を標的化し得る：
工程１。問題としているタンパク質の機能ドメインを同定する。科学文献は、これらの情報のほとんどを提供し得る。１つの優れた供給源は、Ｒｏｂｉｎ Ｈｅｓｋｅｔｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９５）による「Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ」である。この中において、癌に関連するタンパク質が概説されており、そしてこれらの機能ドメインがマップされている。同様に、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ」（ＲＥ ＣａｌｌａｒｄおよびＡＪＨ Ｇｅａｒｉｎｇ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）は、サイトカインの機能ドメインを記載する。同じシリーズの他の出版物としては、「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ」、「Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ」、および「Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ」が挙げられる。
工程２。ＧｅｎＢａｎｋまたは類似の核酸データベースを、エキソン／イントロン配列および接合部を含むこの遺伝子配列について検索する。
工程３。好ましいアンチセンス標的は、スプライスアクセプター部位の約３５〜４０下流の塩基の内にある。好ましくは、この標的領域は、ＳＡ接合部から、１〜２５塩基下流の位置、より好ましくは２〜２０塩基下流の位置に、最も好ましくは２〜１５塩基下流の位置に５’末端を有する（配列）（１塩基下流の配列は［Ｃ］ＡＧスプライスアクセプター部位に直接隣接しているが、これと重なっておらず、そして正常なエキソンの第１番目の塩基を含むことを留意すること）。工程４。阻害結果を予測するために、ＳＡの下流にあるエキソンを、クリプティックスプライスアクセプター（すなわち、真のＳＡの下流にある［Ｃ］ＡＧ配列）について検索する。一旦、このような候補部位が位置付けられると、クリプティックＳＡの１２〜５０塩基上流のラリアット形成のための
【００６５】
【化２】
（または類似の）部位を検索する（上で与えられたコンセンサス配列に従って、分岐点Ａのみが保存されなければならず、従って、この配列においては多くの融通があることに留意すること）。好ましくは、また、クリプティックＳＡ部位の１０〜１５塩基上流に短いピリミジンリッチ領域も存在すべきである。
工程５。一旦、可能性があるクリプティックＳＡが同定されると、この使用が真の部位とクリプティック部位との間の塩基数を３で割ることによって「フレームが一致したリーディング」をもたらすか否かを決定する。この商が整数である場合、生じるタンパク質は「フレームが一致して」おり、そしてドミナントネガティブタンパク質である（以下を参照のこと）。
【００６６】
従って、１つの好ましい実施形態において、アンチセンス標的は、スプライシングがクリプティック部位（この使用はフレームが一致したリーディングをもたらす）に指向されるようであるように、選択される。
【実施例】
【００６７】
（Ｖ．標的タンパク質および選択された実施例）
適切な標的タンパク質としては、例えば、転写因子、特に癌遺伝子タンパク質また癌原遺伝子タンパク質（例えば、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌ、およびｐ５３）；マトリックスタンパク質（例えば、インテグリンおよびカテドリン（ｃａｔｈｅｄｒｉｎｓ））；他の腫瘍発現タンパク質（例えば、ｈＣＧ）；テロメアーゼ；レセプタータンパク質；サイトカイン；キナーゼ；およびウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ ｒｅｖ、ヒトパピローマウイルス、およびヒトパルボウイルスＢ１９）が挙げられる。このようなタンパク質の阻害が数多くの治療的な応用を有することが、理解される。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（例えば、細胞分裂および細胞周期の様々な局面で関与するタンパク質（例えば、転写因子）を標的化することによる）抗腫瘍治療；（感染性因子の複製またはその他のウイルス機能にとって必須のタンパク質を標的化することによる）抗ウイルス治療または抗細菌治療；ならびに（その部位での細胞増殖を支持するタンパク質を阻害することによる）再狭窄または他の増殖性疾患の阻害。
【００６８】
転写因子は、代表的には、ＤＮＡ結合領域およびタンパク質−タンパク質結合領域を有する、複数ドメインタンパク質である。これらの領域のうちの１つを妨害することによって、ドミナントネガティブタンパク質を産生し得る。このドミナントネガティブタンパク質は、１つの活性（例えば、タンパク質結合）を保存し、一方で、このタンパク質の適切な機能にとって重要な別の活性（例えば、ＤＮＡ結合）を阻害する（または逆もしかり）ことによってネイティブなタンパク質の活性に対抗する。以下に記載のｃ−ｍｙｃの例を参照のこと。
【００６９】
上で言及したように、上で言及した多くの標的タンパク質の機能ドメインは、広範囲研究されており、そして文献において報告されている。イントロン、エキソン、およびＡＵＧ開始コドンの位置を含む、プレｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースまたは当業者にとって容易に利用可能な他の公開された情報源において見出され得る。
【００７０】
以下は、スプライス改変体ｍＲＮＡを産生するために選択されたタンパク質におけるスプライスアクセプタドメインの下流を標的化したアンチセンスの例である。このｍＲＮＡは、翻訳の際に、特定の変更を有するタンパク質を産生する。
【００７１】
実施例Ａおよび実施例Ｂに例示された１つの実施形態において、カルボキシ末端で断ち切られたタンパク質が作製される。実施例Ｃおよび実施例Ｄに例示した別の実施形態において、異常アミノ末端を有するかまたはアミノ末端が欠失されたタンパク質を生成される。
【００７２】
（Ａ．ヒトアンドロゲンレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ３５８４５、Ｍ３５８４６））
前立腺癌の分子生物学を概観することによって、アンドロゲンの除去が現在の技術水準であることが示されている。本発明に従って、これはアンドロゲンレセプターの不活化によって達成され得る。エキソン２において、この遺伝子の中心を標的化することにより、様々な選択肢が、機能アンドロゲンレセプターの発現を阻害するために利用可能である。エキソン２（配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ３５８４５）またはエキソン３（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ３５８４６）におけるスプライスアクセプターの提案される標的化を示す。
【００７３】
【化３】
このオリゴマー（配列番号８）は、正常なスプライスアクセプター部位の４塩基下流である、塩基４８で始まる配列を標的化する。次の可能なクリプティックスプライス部位は塩基１００に存在する（９７〜９９位のＣＡＧ；８０位のプランチポイント；８７〜９２位の上流のピリミジン領域）。この部位は、正常な部位とは有するフレームがずれており、従って、このタンパク質の初期での終止を生じる。
【００７４】
スプライスアクセプターの１〜約１８塩基下流の５’末端を有する配列を標的化する類似の長さのオリゴマーが使用され得る。これは、以下の配列から選択される約１８連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：５’−ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＴＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＣＣ ＡＡＡ−３’（配列番号９；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３５８４５で与えられる配列の塩基の４５〜８０位に相補的である）。
【００７５】
【化４】
このオリゴマー（配列番号１２）は、正常なスプライスアクセプター部位の６塩基下流の、塩基４９で始まる配列を標的化する。可能なクリプティックスプライス部位は、塩基１４５（１４３〜１４５位のＣＡＧ；１１４位の分岐点Ａ；１２３〜１２７位のピリジン領域）に存在する。この部位は、正常なスプライス部位とフレームが一致しており、従ってネイティブなタンパク質のＣ末端短縮バーションを生じるはずである。
【００７６】
スプライスアクセプターの１〜約１８塩基下流の５’末端を有する配列を標的化する類似の長さのオリゴマーが使用され得る。これは、例えば以下の配列から選択される約１８〜２０の連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：５’−ＡＡＴ ＣＡＴ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＧＣ ＡＣＡ ＧＧＴ
ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＴＣＣ−３’（配列番号１３；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３５８４６で与えられる配列の塩基の４４〜７９位に相補的である）。
【００７７】
（Ｂ．ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βサブユニット）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ００２６６））
ｈＣＧのサブユニットは、ｈＣＧにおいては延長されているＣＯＯＨ端を除いて黄体化ホルモン（ＬＨ）とほとんど同一である。この延長は、この遺伝子のエキソン３の中にある。エキソン３のＳＡ部位を妨害することによって、ｈＣＧは、（両タンパク質で高度に保存されている）ＡＵＧ翻訳開始部位の標的化とは違って、ＬＨを標的化せずに短縮化され得る。
【００７８】
以下の配列を有するオリゴマーは、ＳＡ（１３１８〜１３２０位のＣＡＧ）の近傍の（直接隣接している）エキソン３に結合し、塩基１３２１〜１３３８位の配列を標的化し、そしてこの部位でスプライシングを妨害する：５’−ＣＣＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＣ ＧＣＧ ＧＧＴ−３’（配列番号１４）。
【００７９】
スプライスアクセプターの１３２２位、１３２３位などから約１３４０位の塩基の５’末端を有する配列を標的化する類似の長さのオリゴマーが使用され得る。これは、例えば、以下の配列から選択される約１８〜２０の連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：
５’−ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＧＧ Ｔ−３’
（配列番号１５；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ００２６６で与えられる配列の塩基の１３２１〜１３５７位に相補的である）。
【００８０】
可能性のあるクリプティックＳＡ部位は、塩基１３９３（１３９１〜２のＡＧ；１３７０位または１３７３位の分岐点Ａ；フレームが一致）および塩基１４５８（１４５５〜１４５７のＣＡＧ；１４２７位の分岐点Ａ；フレームがずれる）に存在する。いずれかの部位でのスプライシングは、少なくとも２４のアミノ酸をこのタンパク質から欠失させるが、そして、フレームがずれる部位が使用された場合はおそらくより多く欠失させる。ｈＣＧは腫瘍細胞においてのみ発現されるので、これは、より少ないタンパク質が発現され、そしてこのタンパク質はより短い生物学的半減期を有するという点で治療的に有益である。さらに、短縮化タンパク質は、異常なアミノ酸をＣＯＯＨ末端において有し得、そしておそらく、ｈＣＧに対する免疫応答（ワクチン接種ストラテジーにおいて有用である）を生じる。
【００８１】
（Ｃ．ヒトｃ−ｍｙｃ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ００１２０））
ｃ−ｍｙｃは、細胞の増殖および分化を制御し、そして血管再造形、平滑筋細胞増殖、細胞外マトリックス合成、およびアポトーシスのプロセスに関連する、癌原遺伝子である。ｃ−ｍｙｃの異常発現は、ヒトの癌において頻繁に観察される。ｃ−ｍｙｃの異常発現、構成的発現または過剰発現は、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、白血病、肺癌などを含む多くのヒトの癌に関連する。ｃ−ｍｙｃの阻害が、再狭窄の発生率および重篤度を減少させることもまた実証されてきた。
【００８２】
ｃ−ｍｙｃタンパク質は、この配列のアミン末端部分にＤＮＡ結合ドメインを有し、そしてカルボキシ末端部分にタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを有している。ｃ−ｍｙｃは、カルボキシドメインでＭａｘと結合し、Ｅ−Ｂｏｘとして既知であるＤＮＡ配列（５’−ＣＡＣＧＴＧ−３’）に結合し得るヘテロダイマーを形成することが公知である。ｍｙｃ：ｍａｘがこの様式で結合した場合、この表現型は増殖刺激であり、そしてアポトーシスに至り得る。
【００８３】
ｍｙｃ濃度が低いならば、ｍａｘは、トランス活性化しないホモダイマーを形成する。このｍａｄタンパク質が誘導されるならば、ｍａｘはｍａｄに結合して、ｍａｄ：ｍａｘへテロダイマーを形成し、これは分化を誘導する傾向にあり、そして抗アポトーシス性（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）である。
【００８４】
従って、ｍｙｃを単純に阻害することは、抗アポトーシス性であるｍａｄ：ｍａｘ表現型を生じる傾向がある。しかし、タンパク質−タンパク質結合（カルボキシ末端）ドメインをインタクトなままにしながらｃ−ｍｙｃのＤＮＡ結合（アミン末端）ドメインを阻害した場合は、その結果は、ｍａｘ結合が可能だが、トランス活性化は可能でないドミナントネガティブタンパク質である。好ましい表現型は、増殖刺激作用の欠損であるが、ｍａｄ：ｍａｘの代償的な抗アポトーシス作用は優勢とならない。これは、ｍａｘタンパク質が依然としてｍｙｃのＣＯＯＨドメインに結合して得るからである。
【００８５】
アミン末端ドメインの阻害は、スプライシングの変更を指向するアンチセンス化合物の適切な設計によって達成される。下流に見出されるクリプティック（選択的）ＳＡ部位は以下を含む：
４５４７ 可能な候補；４５５４位の次のＡＵＧは、フレームの外であり、従って、無関係な（「ナンセンス」）タンパク質を産生する（配列番号１３よりさらに下流に標的化されたオリゴによって遮断され得る）
４５７８ 上流にピリミジンがほとんどないことによって、良好ではないＳＡ候補。
４６１７ 良好なＳＡ候補；次の下流にある隣のＡＵＧは４８２１に存在し、このＡＵＧが４５２１で正常なＡＵＧのフレームと一致する。
【００８６】
上記のように、４５０４〜４５０５のスプライスアクセプター部位ＡＧの１０塩基下流のヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｊ００１２０）の塩基４５１５〜４５３４（配列番号２５、５’−ＡＣＧ ＴＴＧ ＡＧＧ
ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣ−３’）に相補的な配列を有するモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）は、この部位における適切なスプライシングおよび正常な４５２１位のＡＵＧ翻訳開始部位の使用を妨害したことが見出された。産生されたｍＲＮＡの分析は、上で示された４６１７部位の使用を示した。正常なＡＵＧの３００塩基下流にある、４８２１位のＡＵＧにおける翻訳開始は、Ｎ末端で１００アミノ酸が欠失したタンパク質を生成する（Ｇｉｌｅｓらによって報告されたとおり）。ｍｙｃのＣＯＯＨ末端に対する抗体の使用は、アンチセンスオリゴマーで処理した細胞由来のこのタンパク質、および実質的にこれより小さいタンパク質を明らかにした。これらのＮ末端短縮化タンパク質はｍａｘに結合するが、しかしＤＮＡには結合しないと予測される。
【００８７】
これらの結果は、プライマー増幅ｍＲＮＡの調査と合せて、４６１７位のクリプティックスプライス部位の使用、ならびにさらに下流の他のクリプティックスプライス部位の使用を実証した。
【００８８】
上記のように、ＳＡの−４４上流からＳＡの＋３６下流（ｄｓ）の領域に標的化されたＰＭＯオリゴマーは、ラットｃ−ｍｙｃにおけるスプライシングの妨害の証拠を示した。約２０塩基のオリゴマー長を想定して、以下のアンチセンス配列をヒトｃ−ｍｙｃの標的化のためにこのように利用し得た：
（表２）
【００８９】
【表３】
ｍｙｃのタンパク質−タンパク質結合（カルボキシ末端）ドメインはまた、以下のように変更され得る。アンチセンス配列５’−ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＣ−３’（配列番号３３）を有するオリゴマーは、塩基６６５４〜６６５５にあるスプライスアクセプターの下流の、塩基６６５６を標的化する。同様に、下流のクリプティックＳＡ部位は、塩基６７０４、６７１０および６７２９で存在する（６７０２〜６７０３位のＡＧ；６７０７〜６７０９位のＣＡＧ；６７２６〜６７２８位のＣＡＧ；６６８４位の分岐点Ａ；６６９０位から始まるピリミジンリッチ領域）。これらのうちで、最初の２つは、フレーム外であり、そして３番目のものはフレーム内である。３番目の部位の使用は、ｍＲＮＡからの７５塩基対の欠失を生じ、ｍｙｃタンパク質のタンパク質−タンパク質結合ドメインにおける２５アミノ酸の欠失を生じると期待される。このタンパク質は、逆のドミナントネガティブである。なぜならば、ＤＮＡ結合は可能であり得るが、ｍｙｃ：ｍａｘトランス活性化は、起きないようである。ｍｙｃの機能は喪失するが、ｍａｄ：ｍａｘヘテロダイマーは優位であり、その結果、分化および抗アポトーシスの表現型が観察される。
【００９０】
上記のように、配列番号３３と比較して徐々にさらに下流へと標的化されたオリゴマーはまた、使用され得る。これは、例えば、以下の配列から選択される約１８〜２０の連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含み得る：
５’−ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＧ ＴＴＣ ＣＴＣ−３’（配列番号３４；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｊ００１２０で与えられた配列の６６５６−９１位の塩基に相補的である）。本発明に従って、上記における初めの２つのクリプティック部位でのスプライシングを阻害するために、十分に下流の遠くへ標的化したオリゴマーは、上記の３番目のクリプティック部位におけるスプライシングを促進するのに有効であり得る。
【００９１】
（Ｄ．ヒトｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ５４１５６））
ｃ−ｍｙｃのように、ｐ５３は非コードエキソン１、大きなイントロン１およびエキソン２のＳＡ部位近傍のＡＵＧ開始コドンを有する。例えば、ＳＡ部位の３塩基下流の塩基１１６９１においてその５’末端を有する領域を標的化したオリゴマー（５’−ＣＣＣ ＧＧＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＣ−３’；配列番号３５）は、ＡＵＧ開始部位での翻訳およびエキソン２の通常のスプライシングを妨害することが期待される。ｃ−ｍｙｃについて上で記載されたように、他の適切なオリゴマーは、ＳＡ部位の１塩基もしくは２塩基下流を標的化されたオリゴマーまたは徐々にさらに下流を標的化されたオリゴマーを含む（例えば、１１６９１位、１１６９２位などの塩基で開始し、そして塩基１１６８９（通常のエキソン２の第１の塩基）と塩基約１１７２５との間の領域の幾つかの部分を標的化する。これは、例えば、以下の配列から選択される約１８〜２０連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：５’−ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＴＧ
ＧＣＡ ＧＴＧ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＣＴＧ−３’（配列番号３６；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ５４１５６で与えられた配列の塩基１１６８９〜１１７２４に相補的である）。
【００９２】
クリプティックＳＡ部位は、塩基１１７６１（１１７５９〜６０のＡＧ）および塩基１１７６５（１１７６２〜１１７６４のＣＡＧ）で利用可能である（１１７３６の分岐点Ａ；１１７５０〜１１７５７の一連のピリジン）。１１７８２位の塩基の次のＡＵＧは、フレームからずれており、これはナンセンスタンパク質を生じる。あるいは、開始はエキソン３からはじまり、ｐ５３のアミノ末端を有さない短縮化ｐ５３型タンパク質を生成し得る。
【００９３】
以下は、スプライスアクセプターの標的化が、本質的に有益である例である。
【００９４】
（Ｅ．ヒトＡｂｌ （ＧｅｎＢａｎｋ ＡＪ１３１４６６））
慢性骨髄性白血病において、ｂｃｒ遺伝子が切れてａｂｌに融合し、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質を形成することから、この遺伝子はアンチセンス阻害の標的である。ａｂｌに関して、融合が様々な位置（すなわち、ａｂｌのエキソン２に融合するｂｃｒの、エキソン１、エキソン２およびエキソン３の後に切断が存在する）で起こり得る。しかし、ａｂｌのスプライスアクセプターを標的化することにより、唯１つのオリゴマーだけが、全てのＣＭＬ患者の処置のために必要である。
【００９５】
ｂｃｒ−ａｂｌ融合点は、塩基３７３−３７４の接合部に存在する。それゆえに、ａｂｌスプライトアクセプターは、この接合部の３塩基下流の以下の配列によって標的化され得る：５’−ＣＴＡ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＧＧ Ｃ−３’（配列番号３７）。
【００９６】
再び、スプライス接合部とこのスプライス接合部の約３５〜４０塩基下流との間の領域を標的化する他のオリゴマーはまた、使用され得る。これは、例えば、以下の配列から選択された約１８〜２０連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：
５’−ＧＣＴ ＣＡＡ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＡ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＴＴ−３’（配列番号３８；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ１３１４６６において与えられる配列の塩基３７４〜４０９に対して相補的である。可能なクリプティックスプライス部位（両方ともフレームがずれている）は、４５３〜４５９位の上流のピリミジン領域、ならびに４２１および５１６〜５１８の分岐点Ａを伴い、５０７〜５１０の上流のピリミジン領域および４８５のＡ分岐点を伴った、４６８〜４７０のＣＡＧモチーフを含む。
【００９７】
（Ｆ．ＨＩＶ−１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ３９１０６））
本実施例は、本発明の方法が特別な利点を提供する状況を例示する；すなわち、標的ウイルスおよび宿主（ヒト）の両方が同じｍＲＮＡ配列を有する遺伝子を発現する場合である。このタンパク質産物は、ウイルスおよび宿主の両方の機能に重要だが、異なる機能をもたらす。
【００９８】
ＨＩＶ−１ ｒｅｖのｍＲＮＡ配列（これは、ウイルスの複製に重要なタンパク質をコードする）（例えば、Ｈ Ｍｉｔｓｕｙａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５３３−１５４３、１９９０を参照のこと）は、宿主でまた生じ、この配列がアンチセンスによって阻害された場合に毒性作用をもたらすることが見出された。具体的には、配列５’−ＴＣＧ ＴＣＧ ＧＴＣ ＴＣＴ ＣＣＧ ＣＴＴ
ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＣＣ−３’（配列番号３９）を有するホスホロチオエートオリゴマーを使用して、ＨＩＶ−１ ｒｅｖを阻害した（Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：４２４４−４２４８、１９８９）。ｒｅｖのこの領域は、ＨＩＶにおいて高度に保存されている；従って、広範な種々のウイルス単離体が阻害され得るように標的化された。
【００９９】
しかし、この２７ｍｅｒの臨床前開発を、連続的な注入によって処置した日和見感染であるように見えた３匹のアカゲザルのうち２匹が、死亡した場合に終了した。過剰の内毒素負荷が疑われたため、内毒素の除去に注意を払って実験を反復した。しかし、２匹のカニクイザル（ｃｙｎａｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）がまた、反復研究における連続注入の８日目および９日目に死亡した。内毒素が効果的に考慮から除かれた場合に、免疫抑制が原因として示唆される。３匹のアカゲザルの白血球（ＷＢＣ）数は、ＨＩＶ−ｒｅｖに対するアンチセンスホスホロチオエートを用いた注入の前に９．５±０．７であり、注入の間に６．９±０．６に低下した。ＲＢＣまたはヘマトクリットにおいては、関連する変化は存在しなかった。さらに、免疫応答に関連する細胞についての表面マーカー研究が影響を受けた；ＣＤ２は、８８から７６に低下し、ＣＤ８は４５から３６に落ち、そしてＣＤ２０は１４から１８に上昇した。
【０１００】
ヒトおよびサルのゲノムにおいて観察されるＨＩＶ−ｒｅｖに相同な領域は、これらの毒性作用にを説明するＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６：２１７０−２１７９（１９９２）に報告された。
【０１０１】
本発明の方法に従って、宿主のプロセスを妨害する可能性の低い代替の配列を選択し得た。本発明によって、ＨＩＶ−ｒｅｖを以下のように抑制し得た。
【０１０２】
このタンパク質は、２つのエキソンによってコードされる：エキソン１、５４３９．．５５６８、７６塩基；およびエキソン２、７８８５．．８１８０、２９６塩基；合計１２４アミノ酸（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ３９１０６）。スプライス連結部（すなわち、正常なエキソン２の最初の塩基）とこのスプライス連結部の約３５〜４０塩基下流との間の領域に標的化されたアンチセンス、ＲＮＡｓｅＨ−インコンピテントオリゴマーは、プレ−ｍＲＮＡのスプライシングを妨害すると予想される。上記のようにスプライスされる場合、標的領域の５’末端は、好ましくはスプライス連結部の１〜約２５塩基下流である。このようなオリゴマーの一例は、配列５’−ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＴＡ ＡＧＧ ＧＴ−３’（配列番号４０）を有する、塩基対７８８５〜７９０４に標的化されたＰＭＯである。他の候補は、配列５’−ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＧＴ ＣＧＧ ＧＴＴ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＧＧ Ｔ−３’（配列番号４１：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３９１０６に与えられる配列の７８８５〜７９２１塩基に相補的）から選択された約１８〜２０の連続ヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む。
【０１０３】
潜在的なスプライスアクセプターについで最も可能性の高い部位は、塩基７９７５であり、ここでＡＧ配列は、ＡＧから約１０塩基を超えて上流の複数のピリミジンに先行される。この潜在的スプライスアクセプターを使用する場合、９０塩基または３０アミノ酸の欠失が生じる。この欠失は、有効なウイルスｒｅｖ遺伝子機能を妨害する。
【０１０４】
（ＶＩ．スプライスアクセプター標的化の効果の分析）
スプライス改変体ｍＲＮＡの生成における、特定のアンチセンス配列の効果を、公知の分析方法によって決定し得る。例えば、コードされた全長タンパク質および短縮タンパク質または他の改変体タンパク質の存在または非存在を、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットのような標準的な技術によってモニターし得る。このタンパク質の特定の領域（すなわち、カルボキシ末端およびアミノ末端）を標的化した抗体もまた使用し得る。
【０１０５】
ｍＲＮＡ構造を、ミススプライシングを誘導したアンチセンスオリゴマーを評価するために分析し得る。核ＲＮＡの回収は、核がイントロン除去部位である場合に、イントロンを含むｈｎＲＮＡを観察するために必要である。核ＲＮＡの調製は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）または「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）のような本に記載される。ｈｎＲＮＡの分析を、ノーザンブロットまたはＳ１マッピングのいずれかによって最良に行う。特定のスプライス改変体成熟ｍＲＮＡの存在を、特定のスプライス改変体（または正常）プロセスｍＲＮＡに生じることが予測される配列を有する選択されたプライマー対を使用するＰＣＲ増幅を実行することによって決定し得る。１つのプライマーは、スプライス部位の上流のＳＤ（スプライスドナー）エキソン内に位置し、そして第二のプライマーは、スプライス部位の下流のＳＡ（スプライスアクセプター）エキソン内に位置する。このオリゴマーは、ＳＡ部位を妨害することから、下流のプライマーは、ＳＡスプライス部位から５０塩基を超えて下流であるべきである。エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルでのＰＣＲ反応物の分析は、オリゴマーによるＳＡ部位のブロックの証拠としての、未処理のコントロール細胞から観察されるバンドよりも小さいサイズの増幅されたバンドを明らかにする。
【０１０６】
（ＶＩＩ．本方法の利点）
本発明は、タンパク質発現の阻害または変更が、非ＲＮＡｓｅコンピテントオリゴマーを使用して、プレ−ｍＲＮＡのコード領域において、スプライスアクセプターの下流領域のアンチセンス標的化によって達成され得ることを実証する。本発明の組成物および方法は、アンチセンス阻害の先行技術の方法を超えるいくつかの利点を有する。ここで、この標的化アンチセンス化合物は、スプライスアクセプター配列にわたり、そしてこの配列にハイブリダイズする（例えば、Ｇｉｌｅｓ、上記で引用；ＫｏｌｅおよびＤｏｍｉｎｓｋｉ、米国特許第５，６６５，５９３号）。
【０１０７】
１つのこのような利点は、エキソン配列がイントロン配列よりも種の間ではるかに高度に保存されている傾向があることである。これは、動物モデルでこのような方法を試験する際に、より大きな予測性を可能にする。
【０１０８】
さらに、オリゴマーは、正確な部位（例えば、スプライスアクセプター連結部またはＡＵＧ開始コドン）に実際に結合するために必要でないため、、標的化のための配列を選択する際に、より大きな自由度が可能になる。従って、本発明は、アンチセンス適用において首尾よく標的化され得る配列の範囲を増大させる。このような自由度は、所望されない副作用（例えば、被験体における非標的タンパク質の不慮の標的化によって引き起こされる副作用）を回避する際に、または感染性因子（例えば、ウイルスまたは細菌）を攻撃する場合に宿主タンパク質を標的化する際に有利であり得る。これを、上記の実施例Ｆにおいて実証する。
【０１０９】
本発明の戦略において、スプライス連結部を直接標的化する方法とは対照的に、ＳＡ部位の下流のエキソンの種々の領域をブロックし得る。これは、正常なＳＡの下流の異なる潜在的なスプライス部位に直接スプライシングすることによって、異なる改変体タンパク質を生成する可能性を広げる。上記のように、特定の改変体タンパク質（例えば、ドミナントネガティブなタンパク質）は、独自の利点を有し得る。従って、アンチセンスを、他のタンパク質を超えて所望の改変体タンパク質を生じる、特定の潜在的なスプライス部位でのスプライシングを促進するために設計し得る。例えば、正常なＳＡ部位に近いより所望されない潜在的スプライス部位は、より下流の部位を好んで妨害し得る。
【０１１０】
設計の自由度のさらなる利点としては、合成の簡便性または増強された結合親和性が挙げられ得る。さらに、エキソン内の完全な標的化の本発明の戦略を使用して、標的ＲＮＡを、核または細胞質のいずれかにおいてアンチセンスオリゴマーによって同定し得、これは分析の目的のために有利であり得る。
【０１１１】
（ＶＩＩＩ．処置方法）
関連する局面において、本発明は、標的タンパク質の発現を阻害または変更することによって疾患状態を処置または予防する方法を含む。このような疾患状態としては、ウイルス感染、細菌感染または真菌感染、癌性腫瘍および細胞増殖によって特徴付けられる他の状態（例えば、再狭窄、過剰増殖性皮膚障害または炎症）が挙げられる。上記のように標的化されたタンパク質は、多くの癌遺伝子、レセプタータンパク質、マトリックスタンパク質、およびウイルスタンパク質を含む転写因子を含む。このようなタンパク質の阻害は、一般に、細胞周期、ウイルス複製、または他の重要な機能の破壊を生じる。
【０１１２】
この方法を、１２〜２５ヌクレオチド長かつ以下を有するアンチセンスオリゴマーを被験体に投与することによって実行する：（ｉ）標的タンパク質をコードする、選択された予めプロセスされたｍＲＮＡの標的領域に相補的な塩基配列であって、ここで、この標的領域の５’末端は、予めプロセスされたｍＲＮＡの正常なスプライスアクセプター部位の１〜２５塩基下流、そして好ましくは、２〜１５塩基下流である、塩基配列、ならびに（ｉｉ）非荷電モルホリノ骨格、好ましくは、図２Ｂ−Ｂに示すようなホスホロジアミデート骨格であって、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、上記で定義された通りである、骨格。好ましくは、この化合物はまた、化合物の溶解度を、好ましくは水性媒体中での２５〜５０ｍｇ／ｍｌの間またはこれより高い溶解度まで増強する部分を含む。一例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。
【０１１３】
一般に、この方法は、適切な薬学的キャリア中の、正常なスプライスアクセプター部位でのスプライシングを妨害するために有効な一定量のアンチセンス因子を被験体に投与し、従って、タンパク質の正常な発現を抑制する工程を包含する。好ましい実施形態において、この方法は、タンパク質のドミナントネガティブな改変体の発現を生じる。この方法の１つの局面において、この被験体はヒト被験体である。
【０１１４】
標的ｍＲＮＡへのアンチセンスオリゴマーの効果的な送達は、本方法の重要な局面である。ＰＭＯは、細胞に効果的に侵入することが示されている（例えば、Ｊ Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：６３〜７０、１９９７および同時係属中かつ共有に係る米国仮出願番号６０／１１７，８４６を参照のこと）。抗ウイルス処置における使用のために、送達の種々の全身的経路（経口および非経口経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内および筋内））ならびに吸入、経皮および局所的な送達を使用し得る。
【０１１５】
代表的には、アンチセンスオリゴマーの１以上の用量を、一般には約１〜２週間の期間の規則的な間隔で投与する。経口投与のための好ましい用量は、約１ｍｇオリゴマー／患者〜約２５ｍｇオリゴマー／患者（体重７０ｋｇに基づく）である。いくつかの場合において、２５ｍｇオリゴマー／患者より多い投与を必要とし得る。ＩＶ投与について、好ましい用量は、約０．５ｍｇオリゴマー／患者〜約１０ｍｇオリゴマー／患者（成人体重７０ｋｇに基づく）である。投薬量は、患者の年齢、健康、性別、サイズおよび体重、投与経路ならびに特定の疾患状態に関するオリゴヌクレオチド因子の効力のような要因によって異なる。感染性因子の処置のために、好ましい投薬量は、代表的には、約０．０１〜１μＭ、そしてより好ましくは約２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーの血中濃度を達成するために必要な投薬量である。この濃度は、種々の方法によって達成し得る；連続的なＩＶ注入による、約０．０５と約０．２ｍｇ／ｋｇ／時間の間の用量が、受容可能であることが見出された。より多いかまたは少ない量のオリゴヌクレオチドを、必要に応じて投与し得る。
【０１１６】
過剰増殖性皮膚障害の処置のために、局所的投与を示す。再狭窄の処置において、罹患した細胞（すなわち、動脈損傷の部位）へのアンチセンスオリゴマーの送達を、推奨する。当該分野で公知の送達方法（例えば、共有に係り、かつ同時係属中の米国仮出願番号０９／４９３，４２７に記載される方法）を使用して、患者の血管形成部位にオリゴマーを送達し得る。好ましくは、このオリゴマーを、血管形成手順と同時に送達する。成人について、推奨される投薬量は、１〜２５μｍｏｌ、好ましくは２〜１５μｍｏｌのアンチセンスオリゴマーの範囲である。処置されるべき組織の表面積に関して、有効用量は、代表的には１ｃｍ２の血管壁当たり３０〜３０００μｇのオリゴマー、そしてより好ましくは約３００〜１５００μｇ／ｃｍ２の範囲である。患者にまた、再狭窄をさらに阻害するために十分な投薬量レベルで、血管形成後に周期的にこの組成物を与え得る。
【０１１７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する有効なインビボ処置レジメンは、投与の頻度および経路、ならびに処置下の被験体の状態によって変化する。所与の経路のために最適な投薬量は、当該分野で公知の方法に従う慣用的な実験によって決定し得る。このようなインビボ治療を、一般に、処置される病気の特定の型に適切な試験によってモニターし、そして用量または処置レジメンにおける対応する調節を、最適な治療結果を達成するためになし得る。
【０１１８】
モルホリノオリゴマーの細胞への侵入およびその標的ＲＮＡ配列への結合を、同時係属中かつ共有に係る米国仮出願番号６０／１１７，８４６（これは、本明細書中で参考として援用される）に示される技術によって確認し得る。インビボで投与する場合、本明細書中に開示する型のモルホリノアンチセンス化合物を、アンチセンス化合物およびそのＲＮＡ相補体からなるヘテロ二重鎖形態で、受容する被験体の尿において検出し得る。これは、アンチセンス化合物が標的組織によって取り込まれ、そして医師が処置方法の有効性（例えば、尿中のヘテロ二重鎖の最大または最大に近いレベルを与える種々の様式の投与および投薬量の有効性）をモニターすることを可能にすることを検証する。
【０１１９】
（ＩＸ．処方物）
モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物を、任意の好都合な生理学的に受容可能なビヒクル中で投与し得る。標準的な薬学的に受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン、トリグリセリドエマルジョン）、湿潤剤、錠剤およびカプセルが挙げられる。適切な生理学的に受容可能なキャリアの選択は、選択された投与の様式に依存して変化することが理解される。
【０１２０】
一般に、活性な化合物に加えて、本発明の薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性な化合物の処理を容易にする、適切な賦形剤および補助剤を含み得る。適切な賦形剤としては、充填剤（例えば、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース調製物、リン酸カルシウム、ならびに結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン）が挙げられる。所望の場合、崩壊剤（例えば、上記のデンプンおよびカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩）を添加し得る。補助剤としては、流量調整剤ならびに潤滑剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、および／あるいはポリエチレングリコール）が挙げられる。
【０１２１】
経口投与のために、糖衣核に、胃液に対して耐性の適切な被覆を提供し得る。胃液に対して耐性な被覆を生成するために、適切なセルロース調製物（例えば、フタル酸アセチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルフタル酸セルロース）の溶液を使用する。濃縮糖溶液を使用し得、これは、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および／もしくは二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。
【０１２２】
経口的に使用され得る他の薬学的調製物としては、ゼラチンからなるプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、およびゼラチンからなる軟質密封カプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤が挙げられる。このプッシュフィットカプセルは、顆粒形態で活性な化合物を含み得、この活性な化合物を、充填剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）および／または潤滑剤（例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム）ならびに必要に応じて安定化剤と混合し得る。軟質カプセルにおいて、活性な化合物を、好ましくは適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）中に溶解させるかまたは懸濁する。さらに、安定化剤を添加し得る。
【０１２３】
直腸的に使用し得る薬学的調製物としては、例えば、坐剤が挙げられ、これは、坐剤基材と活性な化合物との組み合わせからなる。適切な坐剤基材としては、天然もしくは合成のトリグリセリド、パラフィン炭化水素、ポリエチレングリコール、または高級アルカノールが挙げられる。さらに、活性な化合物と基材との組み合わせからなるゼラチン結腸カプセルを使用することが可能である。可能性のある基材材料としては、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素が挙げられる。
【０１２４】
非経口投与のための適切な液体処方物としては、水溶性形態または水分散性形態での活性な化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性な化合物の懸濁液を投与し得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストラン）を含み得る。この懸濁液はまた、安定化剤を含み得る。
【０１２５】
慣用的なキャリアとの投与に加えて、活性成分を、種々の特殊な送達技術によって投与し得る。例えば、本発明の化合物を、リポソーム中にカプセル化して投与し得る。（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０（１２）：１９８０−１９８９、１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２３：１１９、１９９４；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０巻、Ｎｏ．４、５５４−５８４頁、１９９０中のＵｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」；Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２８７−３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７９中のＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、第１４章、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」を参照のこと）。この活性成分は、その溶解度に依存して、水相および脂質層の両方に存在し得るか、または一般にリポソーム懸濁液と呼ばれるものに存在し得る。この脂質層は一般に、リン脂質（例えば、レシチンもしくはスフィンゴミエリン）、ステロイド（例えば、コレステロール）、イオン性界面活性剤（例えば、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、もしくはホスファチジン酸）、および／または他の親水性材料を含む。リポソームの直径は、一般には約１５ｎｍ〜約５ミクロンの範囲である。
【０１２６】
ヒドロゲルをまた、アンチセンスオリゴマー投与のためのビヒクルとして、例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載のように使用し得る。あるいは、ミクロスフェアまたは微粒子にてオリゴヌクレオチドを投与し得る。（例えば、Ｗｕ ＧＹおよびＷｕ ＣＨ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２、このようなビヒクルは、局所的な投与のために、または再狭窄の処置において特に適切である。１９８７を参照のこと）。
【０１２７】
アンチセンスオリゴマーの経皮的送達を、局所的投与のために適合した薬学的に受容可能なキャリアの使用によって達成し得る。モルホリノオリゴマー送達の一例は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／４０８５４に記載される。他の徐放性組成物がまた、本出願の範囲内に意図される。これらは、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態で半透性ポリマー材料を含み得る。
【０１２８】
このような剤形を調製するための方法は公知であるかまたは当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５）を参照のこと。この薬学的調製物を、当業者に公知の手順に従って製造する。例えば、この薬学的調製物を、慣用的な混合、顆粒化、糖衣作製、可溶化または凍結乾燥手順によって作製し得る。使用されるプロセスは、最終的には、使用される活性成分の物理的特性に依存する。
【０１２９】
（材料および方法）
（オリゴマー）
ＰＭＯを、例えば、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：１８７−９５、１９９３；米国特許第５，１８５，４４４号（１９９７）に記載された方法によって、ＡＶＩ ＢｉｏＰｈａｒｍａで合成した。オリゴマーをイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、そして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析法によって純度を分析した。全長産物の量は、一般に＞９０％であった。使用前に、これらを、蒸留水を用いて濃縮ストック溶液として調製し、４℃で貯蔵した。
【０１３０】
（細胞培養）
細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得るか、または本研究室で誘導した。これらの細胞を、グルタミン（２ｍＭ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびハム栄養混合物Ｆ−１２の１：１の混合物中で培養した。透析したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＨｙｃｌｏｎｅ（Ｏｇｄｅｎ、ＵＴ）のいずれかから購入した。ＷＩ−３８細胞およびＨｅＬａ細胞を１０％血清中で培養し、そしてＮＲＫ細胞を４％血清中で培養した。
【０１３１】
（組換えプラスミドおよび細胞株）
ヒトｍｙｃゲノムクローンｐＨＳＲ−１は、Ｍ．ＢｉｓｈｏｐからＡＴＣＣへの寄託物であった。２．２キロベース（ｋｂ）の５’末端を、プライマー中に組み込まれた適切な制限部位を使用するＰＣＲによってルシフェラーゼベクターにクローニングするために適合させた（Ｓｃｈａｒｆ、１９９０）。このルシフェラーゼベクターを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）によって供給されたベクターから、昆虫ルシフェラーゼとのＮ末端融合タンパク質を可能にするために適合させた。プラスミドを、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎプロトコールおよびＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）からの試薬を使用して、ネオマイシン遺伝子／Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選択手順（Ｆ Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４、１９８１）を使用してＨｅＬ細胞に導入した。ウサギα−グロビン−ルシフェラーゼ構物を含む細胞株が記載される（Ｍ Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．６：１６９−７５、１９９６）。
【０１３２】
（［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイ）
細胞をトリプシン処理し、計数し、そして６ウェルの皿に、４００，０００細胞／２ｍｌ／ウェルでプレートした。２日目に、ＰＭＯアンチセンス因子を、所望の濃度まで添加し、そして細胞を、穏やかなかき集め動作を使用してラバーポリスマンに取り出してロードした（ＰＬ ＭｃＮｅｉｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９８：１５５６−６４、１９８４；Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、上記で引用）。細胞懸濁液を、形成された任意の塊を部分的に分解するために１回ピペッティングし、そして１ｍｌを、さらなる１ｍｌ／ウェルの新鮮な培地を含む２４ウェルの皿に移した。ＮＲＫ細胞について、４日目に１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（ＤｕＰｏｎｔ、ＮＥＮ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）（ＮＥＴ−０２７）を各ウェルに添加して、そして６時間後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５％トリクロロ酢酸で沈殿させ、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、０．２Ｎ ＮａＯＨ／０．１％ ＳＤＳで可溶化し、そしてＤＮＡに取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターにおいて定量した。定量化手順は、取り込みのためのインキュベーション期間が１５時間であった点を除いて、ＷＩ−３８と同一であった。一般に、各因子または濃度を、二連でアッセイし、そして値を平均した。この二連は、通常は互いに１０％以内であった。
【０１３３】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ｍｙｃ−ルシフェラーゼＨｅＬａ細胞を、以下の変化を伴って、正常な繊維芽細胞に対するのと類似の様式で取り出してロードした。百万個の細胞を、６ウェルの皿にプレートし、そして２日目に２ｍｌの全容積を別の６ウェルの皿に移した。３０時間後、細胞を収集し、そして記載されるように（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら；１９９６；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７；上記で引用）ルシフェラーゼ光生成についてアッセイした。
【０１３４】
（細胞周期分析）
細胞を、フローサイトメトリーによって、細胞周期の段階について分析した。細胞を、記載のように取り出してロードし、そして２つのウェルを合わせて蛍光活性化細胞識別（ＦＡＣＳ）による分析のために十分な細胞を得るために、１０ｃｍの皿に再プレートした。２日後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、そして少なくとも２時間、冷８０％エタノール中に再懸濁した。固定工程の後、細胞を遠心分離によって収集し、そしてＤＮＡ蛍光色素ヨウ化プロピジウム（Ｔｅｌｆｏｒｄら、上記で引用）で染色した。エタノール処理したペレットを、１ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μｌ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム、１μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ中に再懸濁した。周囲温度での少なくとも１時間の後、細胞懸濁液を、４８８ｎｍの励起波長を用いて、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃ ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）を使用して分析した。データを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）マルチサイクルプログラムソフトウェアを使用して分析した。
【０１３５】
（ｍＲＮＡ逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析）
ｍｙｃＲＮＡスプライシングに対するモルホリノオリゴマーの効果を試験するために、ＨｅＬａ細胞を、６ウェルの皿に、百万細胞／ウェルでプレートした。次の日、２０μＭの最終濃度でオリゴマーを培地に添加して、上記で詳述したように細胞中に取り出してロードした。２４時間後、ロードした細胞をトリプシン処理によって回収し、そしてＲＮＡを調製した。各サンプルのために２つのウェルを合わせた。細胞質（成熟）ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｃｈａｒｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）使用して、「ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ａｎｉｍａｌ
ｃｅｌｌｓ」のための指示に従って、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解手順によって細胞ペレットから抽出した。ＲＮＡを、３０μｌの水で溶出して、約１０〜２０μｇの収量を得た。
【０１３６】
６μｌのＲＮＡ（２〜３μｇ）を、１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）、各１ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸、０．７５μｇ ９−ｍｅｒのランダムプライマーおよび２５０Ｕのモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｍｕＬＶ）ＲＴ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含む最終２０μｌの反応混合物中で逆転写した。酵素の添加後、反応物を２５℃で１０分間、次に４２℃で３０分間インキュベートし、そして９４℃で４分間ポリメラーゼを変性させた。
【０１３７】
エキソン１−エキソン２ＰＣＲを、２工程のネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ手順を使用して実行した。工程１のプライマーは、配列５’−ＣＧＧ ＧＣＡ
ＣＴＴ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＡＣ（配列番号５１）および５’−ＧＧＴ ＣＧＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＧＴ Ｔ（配列番号５２）を有した。１μｇの各プライマーを２０μｌのＲＴ反応物に添加し、そして容積を１×ＰＣＲ緩衝液で１００μｌに調節した。４単位のＡｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）Ｔａｑポリメラーゼを添加し、そして、９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、および７２℃で４０秒の工程を３０サイクル行った。工程２は、プライマー配列５’−ＣＴＣ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＡＧ ＡＣＧ ＣＴＧ Ｇ（配列番号５３）および５’−ＧＡＡ ＧＧＧ ＴＧＴ ＧＡＣ ＣＧＣ ＡＡＣ ＧＴＡ ＧＧＡ Ｇ（配列番号５４）を使用した。工程１の反応混合物（４μｌ）を、２００ｎＭの各三リン酸および１μｇの各プライマーと共に、９６μｌの１×ＰＣＲ緩衝液に添加した。工程２のＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、６８℃で４０秒、および７４℃で３０秒の３０サイクルであった。次いで、アリコートを、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１３８】
【表４】
＊ネイティブ配列、非アンチセンス
Ｉ他に示さない限り、アンチセンス標的は、スプライスアクセプター（ＳＡ）連結部の下流（ｄｓ）である；ＳＤ＝スプライスドナー連結部
（配列表）
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞内の全長タンパク質の発現を阻害するための治療学的組成物および方法に関し、そして特に、プロセシング前のｍＲＮＡ内の正常スプライスアクセプター連結点の５’末端の１〜約２５塩基下流を有するｍＲＮＡ配列に対して標的化されたアンチセンス組成物に関する。このような標的化は、天然のｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害し、そしてスプライス改変体ｍＲＮＡを産生するのに有効である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのアンチセンス標的化によるタンパク質発現の阻害は、広範な研究の対象である。多くの報告された手順は、ホスホロチオネート結合オリゴヌクレオチドを使用する。このホスホロチオネート結合オリゴヌクレオチドは、荷電した、ネイティブＤＮＡのヌクレアーゼ耐性アナログである。関連するアンチセンス機構は、ＲＮａｓｅの活性に基づく。ＲＮａｓｅは、オリゴマーに結合した標的核酸を切断する。これらの化合物は、高い活性を示すが、これらはまた、高いレベルの副作用（すなわち、非標的ＲＮＡの切断によってか、または非アンチセンス機構（例えば、タンパク質への非特異的な結合）によって）を示す傾向にある。
【０００３】
別のクラスのアンチセンスオリゴマー（ＲＮａｓｅ不活性（ＲＮａｓｅ−ｉｎａｃｔｉｖｅ）と称される）は、結合したＲＮＡの切断を促進せず、そして標的配列を翻訳、プロセシングまたは転写から分子機構を立体的にブロックすることによって作用すると考えられる。これらの化合物は、ホスホロチオネートオリゴマーよりも少ない副作用（例えば、非選択的切断）を生じる傾向にあるが、これは、一般に首尾良い阻害のためにＲＮＡの標的特異的領域（例えば、ＡＵＧ開始コドン）に必要である。
【０００４】
さらに最近、ＲＮａｓｅ不活性オリゴマーによる核（非スプライス）ＲＮＡのスプライスアクセプター連結点の標的化が報告されている。ＫｏｌｅおよびＤｏｍｉｎｓｋｉ（米国特許第５，６６５，５９３号）は、このような異常なスプライシングから生じるβ−サラセミアの改変体と戦うために、β−グロビンＲＮＡのミススプライシングの抑制を報告した。この場合、異常なスプライス連結点は、正常部位の後ろに直接スプライシングするように標的化した。ＲＶ Ｇｉｌｅｓら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．９：２１３〜２２０（１９９９）ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡのミススプライシングを誘導するためのスプライス結合の標的化。各々のこれらの場合において、標的化された領域また、アンチセンスオリゴマーが、プレｍＲＮＡのイントロン／エキソンスプライス連結点にわたる点においていくらか制限される。無電荷の、ＲＮａｓｅ不活性オリゴヌクレオチドの使用によって認められる利点に起因して、標的化におけるさらなる可撓性の実証は、非常に有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、アンチセンス化合物およびこのようなアンチセンス化合物と細胞と接触させることによって、真核細胞におけるプロセシング前のＲＮＡの正常なスプライシングを阻害する、対応する方法を提供する。化合物を、以下によって特徴付ける：
（ａ１）：無電荷のモルホリン骨格；
（ａ２）：１２ヌクレオチド塩基長と２５ヌクレオチド塩基長の間の塩基配列；および
（ａ３）：選択されるタンパク質をコードする選択されるプロセシング前のｍＲＮＡの標的領域に相補的な塩基配列、ここで、標的領域の５’末端は、プロセシング前のｍＲＮＡにおける正常スプライスアクセプター部位の１〜２５塩基下流であり、
そして、以下の性質：
（ｂ１）：真核細胞によって取り込まれる化合物；
（ｂ２）：このような細胞中でプロセシング前のｍＲＮＡの標的領域にハイブリダイズする化合物；および
（ｂ３）：標的プレｍＲＮＡにハイブリダイズして、正常アクセプタースプライス部位においてスプライシングを防止し、その結果、スプライス機構は、プロセシング前のｍＲＮＡにおける下流スプライスアクセプター部位において進行し、短縮型コード配列を有するｍＲＮＡをプロセスされたスプライス改変体を生じる化合物。
【０００６】
さらに特定の実施形態において、標的領域の５’末端は、正常スプライスアクセプター部位の下流の、２〜２０塩基または２〜１５塩基である。標的化合物の長さは、好ましくは、約１５ヌクレオチド長〜約２０ヌクレオチド長である。
【０００７】
１つの実施形態において、この化合物は、図２ＡＡ〜２ＥＥに示される構造からなる群から選択されるサブユニット間結合を有する。好ましい実施形態において、この結合は、図２Ｂ−Ｂに示されるようなホスホロジアミド結合から選択され、ここでＸ＝ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲ’、Ｙ＝ＯおよびＺ＝Ｏならびに図２Ｂ−Ｂに表されるような代替のホスホロジアミド結合であり、ここで、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ、およびＺ＝Ｏである。Ｒ＝Ｒ’は、標的結合と相互作用しない基である。好ましくは、ＲおよびＲ’は、アルキルおよびポリアルキレンオキシ（例えば、ＰＥＧ；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）またはそれらの混合物から独立して選択される。アルキル／ポリアルキレンオキシ鎖は、好ましくは、遠位の末端で、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキシ、カルボン酸、カルボン酸エステルおよび無機エステル（例えば、ホスホフェートまたはスルホネート）から選択される基によって置換され得る。好ましくは、鎖（置換基とは無関係）は、１〜１２原子長であり、そしてさらに好ましくは、１〜６原子長である。選択される実施形態において、ＲおよびＲ’は、独立して、メチルまたはエチルである。１つの実施形態において、Ｘ＝Ｎ（ＣＨ３）２、Ｙ＝ＯおよびＺ＝Ｏである。
【０００８】
ＮＲＲ’はまた、窒素、炭素、酸素および硫黄から選択される５〜７環原子を有し、そして少なくとも非炭素環原子程多くの炭素環原子を有する窒素ヘテロ環を示し得る。例としては、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、トリアゾール、ピラゾール、ピロール、イソピロール、イミダゾール、オキサソール、イミダゾール、イソキサゾールなどが挙げられる。
【０００９】
下流スプライスアクセプター部位が、複数の正常スプライスアクセプター部位の３塩基の全体である場合、スプライス改変体ｍＲＮＡは、平常にスプライスされた際に、プロセスされたｍＲＮＡの配列を有するフレーム内のコード配列を有する。
【００１０】
タンパク質は、好ましくは、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌ、ｐ５３、インテグリン、カセドリン、テロメラーゼ、ｈＣＧ、レセプタータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、ＨＩＶ ｒｅｖ、ヒト乳頭腫ウイルスおよびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群より選択される。選択される実施形態において、このタンパク質は、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ａｂｌ、ｐ５３、ｈＣＧ−βサブユニット、アンドロゲンレセプタータンパク質およびＨＩＶ−１ ｒｅｖから選択される。
【００１１】
さらなる選択される実施形態において、選択されるタンパク質は、複数の別個の結合領域（多くの転写因子の場合のように）を有し、そして短縮形態コード配列が、このような結合領域が無力である改変体タンパク質をコードする。好ましくは、改変体タンパク質は、ドミナントネガティブなタンパク質である。１つの例は、ヒトｃ−ｍｙｃであり、ここで、改変体タンパク質は、Ｎ末端短縮型ｃ−ｍｙｃである。この実施形態において、使用されるアンチセンス化合物は、本明細書中の配列番号１６〜配列番号３２からなる群から選択される塩基配列を有する。改変体タンパク質はまた、Ｃ末端改変ｃ−ｍｙｃであり、この場合、使用されるアンチセンス化合物は、配列番号３４から選択される連続配列である塩基配列（例えば、配列番号３３）を有する１８マーから２０マーであり得る。
【００１２】
さらなる例示的な実施形態において、選択されるタンパク質およびそのプレｍＲＮＡを標的化する対応するアンチセンス塩基配列は、以下の群から選択される：
（ａ） ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット：配列番号１５から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１４）；
（ｂ） ヒトアンドロゲンレセプター：配列番号９または配列番号１３から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、それぞれ、配列番号８または１２）；
（ｃ） ヒトｐ５３：配列番号３６から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、配列番号３５）；
（ｄ） ヒトａｂｌ：配列番号３８から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、配列番号３７）；および
（ｅ） ＨＩＶ ｒｅｖ：配列番号４１から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列（例えば、配列番号４０）。
【００１３】
本発明のこれらの目的および他の目的ならびに特徴は、本発明の以下の詳細な説明を、添付の図面と合わせて読む場合、さらに完全に明かになる。
例えば、本願発明は、以下を提供する。
（項目１） アンチセンス化合物であって、該アンチセンス化合物は、無電荷のモルホリン骨格および１２ヌクレオチド塩基長と２５ヌクレオチド塩基長の間の塩基配列を有し、該塩基配列は、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌ、ｐ５３、インテグリン、カセドリン、テロメラーゼ、サイトカイン、キナーゼ、レセプタータンパク質、ｈＣＧ、ＨＩＶ ｒｅｖ、ヒト乳頭腫ウイルスおよびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群から選択されるタンパク質をコードする、選択される、プロセシング前のｍＲＮＡの標的領域に相補的であり、
ここで、該標的領域の５’末端が、該プロセシング前のｍＲＮＡにおける正常スプライスアクセプター部位の１〜２５塩基下流である、アンチセンス化合物。
（項目２） 項目１に記載の化合物であって、サブユニット間の結合が図２ＡＡ〜２ＥＥに示される構造からなる群から選択される、化合物。
（項目３） 前記結合が、図２Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート結合であり、ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、および、Ｚ＝Ｏであるか、あるいは、、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ’、およびＺ＝Ｏであり、そして、ＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である、項目２に記載の化合物。
（項目４） 前記ＲおよびＲ’が、アルキルおよびポリアルキレンオキシまたはそれらの組合わせから独立して選択される部分であり、そして、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル、および、無機エステルから選択される１つ以上の基によって置換され得る、項目３に記載の化合物。
（項目５） 前記ＲおよびＲ’の各々が、置換と無関係で１〜６原子長である、項目４に記載の化合物。
（項目６） 前記ＮＲＲ’が、窒素、炭素、酸素、およびイオウから選択される５〜７個の環原子を有し、かつ非炭素環原子と少なくとも同数の炭素環原子を有する、窒素複素環を示す、項目３に記載の化合物。
（項目７） 前記標的領域の５’末端が、正常スプライスアクセプター部位の１０〜１５塩基下流である、項目６に記載の化合物。
（項目８） 前選択されるタンパク質が、ヒトｃ−ｍｙｃである、項目１に記載の化合物。
（項目９） 前記塩基配列が、配列番号１６〜配列番号３２からなる群から選択される、項目８に記載の化合物。
（項目１０） 前記塩基配列が、配列番号２５である、項目９に記載の化合物。
（項目１１） 前記塩基配列が、配列番号３４から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目８に記載の化合物。
（項目１２） 前記塩基配列が、配列番号３３である、項目１１に記載の化合物。
（項目１３） 前記選択されるタンパク質が、ヒトアンドロゲンレセプターであり、そして前記塩基配列が、配列番号９または配列番号１３から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目１４） 前記塩基配列が、配列番号８または配列番号１２である、項目１３に記載の化合物。
（項目１５） 前記選択されるタンパク質が、ＨＣＧ−βサブユニットであり、そして前記塩基配列が、配列番号１５から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目１６） 前記塩基配列が、配列番号１４である、項目１５に記載の化合物。
（項目１７） 前記選択されるタンパク質が、ヒトｐ５３であり、そして前記塩基配列が、配列番号３６から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目１８） 前記塩基配列が、配列番号３５である、項目１７に記載の化合物。
（項目１９） 前記選択されるタンパク質が、ヒトａｂｌあり、そして前記塩基配列が、配列番号３８から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目２０） 前記塩基配列が、配列番号３７である、項目１９に記載の化合物。
（項目２１） 前記選択されるタンパク質が、ＨＩＶ−１ ｒｅｖあり、そして前記塩基配列が、配列番号４１から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列である、項目１に記載の化合物。
（項目２２） 前記塩基配列が、配列番号４０である、項目２１に記載の化合物。
（項目２３） 真核生物細胞におけるｍＲＮＡの正常なスプライシングを阻害する方法であって、
アンチセンス化合物であって、無電荷のモルホリン骨格および１２ヌクレオチド塩基長と２５ヌクレオチド塩基長の間の塩基配列を有し、該塩基配列は、選択されるタンパク質をコードする選択される、プロセシング前のｍＲＮＡの標的領域に相補的であり：ここで該標的領域の５’末端は、該プロセシング前のｍＲＮＡにおける正常スプライスアクセプター部位の１〜２５塩基下流であるアンチセンス化合物を、該細胞と接触させる工程、
を包含し、
ここで、該化合物は、該細胞によって取り込まれ、該細胞内で該プロセシング前のｍＲＮＡの該標的領域にハイブリダイズし、そのハイブリダイズされた該化合物が、該正常アクセプタースプライス部位でのスプライシングを防止し、その結果、該スプライス機構は、ｍＲＮＡにおける下流スプライスアクセプター配列に進行し、短縮型コード配列を有するプロセスされたスプライス改変体ｍＲＮＡを産生する、方法。
（項目２４） 項目２３に記載の方法であって、前記タンパク質が、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌ、ｐ５３、インテグリン、カセドリン、テロメラーゼ、ｈＣＧ、レセプタータンパク質、サイトカイン、キナーゼ、ＨＩＶ ｒｅｖ、ヒト乳頭腫ウイルスおよびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群より選択される、方法。
（項目２５） 項目２４に記載の方法であって、前記化合物が、図２ＡＡ〜２ＥＥに示される構造からなる群から選択されるサブユニット間の結合を有する、方法。
（項目２６） 前記結合が、図２Ｂ−Ｂに示されるとりであり、ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲまたはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、および、Ｚ＝Ｏ、あるいは、、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ’、およびＺ＝Ｏであり、ＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 前記ＲおよびＲ’が、アルキルおよびポリアルキレンオキシまたはそれらの混合物から独立して選択され、そして、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル、および、無機エステルから選択される１つ以上の基によって置換され得る、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記ＲおよびＲ’が、置換と無関係で１〜１２原子長である、項目２７に記載の方法。
（項目２９） 前記ＮＲＲ’が、窒素、炭素、酸素、およびイオウから選択される５〜７個の環原子を有し、かつ非炭素環原子と少なくとも同数の炭素環原子を有する、窒素複素環を示す、項目２６に記載の方法。
（項目３０） 前記標的領域の５’末端が、正常スプライスアクセプター部位の１０〜１５塩基下流である、項目２３に記載の方法。
（項目３１） 項目２３に記載の方法であって、前記下流スプライスアクセプター部位が、複数の正常スプライスアクセプター部位の３塩基下流の全体であり、その結果該スプライス改変体ｍＲＮＡは、正常にスプライスされた場合、プロセスされたｍＲＮＡの配列を有するフレーム内にコード配列を有する、方法
（項目３２） 項目２３に記載の方法であって、前記選択されるタンパク質が、複数の別個の結合領域を有し、そして前記短縮形態コード配列が、結合領域が無力である改変体タンパク質をコードする、方法。
（項目３３） 前記改変体タンパク質は、ドミナントネガティブなタンパク質である、項目３２に記載の方法。
（項目３４） 前記選択されるタンパク質が、ヒトｃ−ｍｙｃであり、そして該改変体タンパク質が、Ｎ末端短縮型ｃーｍｙｃタンパク質である、項目３３に記載の方法。
（項目３５） 前記アンチセンス化合物が、配列番号１７〜配列番号３２からなる群から選択される塩基配列である、項目３４に記載の方法。
（項目３６） 前記アンチセンス化合物が、塩基配列配列番号２５を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７） 項目２３に記載の方法であって、前記選択されるタンパク質および対応するアンチセンス塩基配列は、以下：
（ａ） ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット：配列番号１５から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；
（ｂ） ヒトアンドロゲンレセプター：配列番号９または配列番号１３から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；
（ｃ） ヒトｃ−ｍｙｃ：配列番号３４から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；
（ｄ） ヒトｐ５３：配列番号３６から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；
（ｅ） ヒトａｂｌ：配列番号３８から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列；および
（ｆ） ＨＩＶ ｒｅｖ：配列番号４１から選択される連続１８ヌクレオチド配列〜連続２０ヌクレオチド配列、
からなる群から選択される、使用。
（項目３８） 項目３７に記載の方法であって、ここで、前記選択されたタンパク質および対応するアンチセンス塩基配列が、以下：
（ａ）ヒト ヒト絨毛性ゴナドトロピン、βサブユニット：配列番号１４；
（ｂ）ヒト アンドロゲンレセプター：配列番号１２；
（ｃ）ヒト ｃ−ｍｙｃ：配列番号３３；
（ｄ）ヒト ｐ５３：配列番号３５；
（ｅ）ヒト ａｂｌ：配列番号３７；および
（ｆ）ＨＩＶ−１ ｒｅｖ：配列番号４０
からなる群から選択される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ポリマーを形成するための適切な基に結合する５原子（Ａ）、６原子（Ｂ）および７原子（Ｃ−Ｅ）を有する幾つかの好ましいサブユニットを示す。
【図２】図２Ａ−Ａから図２Ｅ−Ｅは、それぞれ、図１のサブユニットＡ−Ｅを使用して構築され、Ａ−Ａ〜Ｅ−Ｅと命名された、例示的なモルホリンオリゴヌクレオチドの繰り返しサブユニットセグメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中に使用される場合、以下の用語は、他の方法で示されない限り、以下の意味を有する：
「アンチセンス」は、アンチセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対形成によってＲＮＡ中の標的配列にハイブリダイズして、標的配列内でＲＮＡ：オリゴマーのヘテロ二重鎖（代表的にはｍＲＮＡと共に）を形成することを可能にする、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニット間（ｓｕｂｕｎｉｔ−ｔｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ）骨格を有するオリゴマーをいう。このオリゴマーは、標的配列に対して正確な配列相補性を有し得るか、または近い相補性を有し得る。これらのアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害し得、そして／またはｍＲＮＡのプロセシングを改変してｍＲＮＡのスプライス改変体を生成し得る。
【００１６】
本明細書中に使用される場合、用語「化合物」、「因子」、「オリゴマー」および「オリゴヌクレオチド」は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して交換可能に使用され得る。
【００１７】
本発明に使用される場合、「モルホリノオリゴマー」は、典型的なポリヌクレオチドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー分子をいい、ここで、このポリマーは、ペントース糖骨格部分（そしてより詳細には、代表的なヌクレオチドおよびヌクレオシドである、ホスホジエステル結合によって連結されるリボース骨格）を欠くが、環窒素を介してカップリングする環窒素を代わりに含む。本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドについての例示的な構造としては、図１Ａ〜Ｅに示されるモルホリノサブユニット型、図２Ａ−Ａ〜２Ｅ−Ｅに示される連結が挙げられる。このような構造は、例えば、Ｈｕｄｚｉａｋら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．６，２６７−２７２（１９９６）ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７，１８７−１９５（１９９７）に記載される。
【００１８】
図１中のサブユニットＡは、１原子リン含有連結を含み、この連結は、図２中のＡ−Ａに示される５原子反復単位骨格を形成し、ここで、このモルホリノ環は、１原子ホスホアミド連結によって連結される。
【００１９】
好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドは、図２Ｂ−Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造で構成され、ここでこの構造は、互いにホスホロジアミデート連結によって共に連結され、１つ目のサブユニットのモルホリノ窒素から隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結し、そしてＰｉおよびＰｊは、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基へ結合するのに効果的な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分である。好ましい実施形態において、この連結は、図２Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート連結（ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏ）、および図２Ｂ−Ｂに示される代替のホスホロジアミデート連結（ここで、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ、およびＺ＝Ｏ）から選択される。ＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である。好ましくは、ＲおよびＲ’は、アルキルおよびポリアルキレンオキシ（例えば、ＰＥＧ；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、またはその組合わせから独立して選択される。（このような組合わせの例は、−（ＣＨ２）３（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−である）。アルキル／ポリアルキレンオキシ鎖は、好ましくは遠位末端（すなわち、オリゴマー骨格に接続しない末端）において、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｅｓｔｅｒ）、および無機エステル（例えば、ホスフェートまたはスルホネート）から選択される基によって置換され得る。好ましくは、鎖（置換と無関係で）は、１〜１２原子長であり、そしてより好ましくは１〜６原子長である。選択された実施形態において、ＲおよびＲ’は、独立してメチルまたはエチルである。１つの実施形態において、Ｘ＝Ｎ（ＣＨ３）２、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである。ＮＲＲ’はまた、窒素、炭素、酸素、およびイオウから選択される５〜７個の環原子を有し、かつ非炭素環原子と少なくとも同数の炭素環原子を有する、窒素複素環を示し得る。例としては、モルホリン、ピロリジン、リペラジン、およびピリジンが挙げられる。
【００２０】
図１中のサブユニットＣ〜Ｅは、図２中のＣ−Ｃ〜Ｅ−Ｅについて示されるように７原子単位長骨格のために設計されている。構造Ｃにおいて、Ｘ部分は、構造Ｂ中のものと同じであり、そしてＹ部分は、メチレン、イオウ、または好ましくは酸素であり得る。構造Ｄにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、構造Ｂ中のものと同じである。構造Ｅにおいて、Ｘは、構造Ｂ中のものと同じであり、そしてＹは、Ｏ、ＳまたはＮＲである。図１Ａ〜Ｅに示される全てのサブユニットにおいて、ＺはＯまたはＳであり、そしてＰｉまたはＰｊは、アデニン、シトシン、グアニンまたはウラシルである。
【００２１】
「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴマー）は、その骨格がヌクレアーゼ切断を受けにくい分子である。
【００２２】
本明細書中に使用される場合、オリゴマーが生理学的条件下で、実質的に３７℃より高い（好ましくは、少なくとも５０℃、そして代表的には６０℃〜８０℃、またはそれより高い）Ｔｍにおいて、標的にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列についての熱融点（Ｔ［ｍ］）よりも約１０℃、および好ましくは約５０℃低くあるように選択されたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔ［ｍ］は、標的配列の５０％が相補ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。
【００２３】
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平行配置で生じる場合、互いに「相補的」と記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１ポリヌクレオチドの鎖のうちの１つと第２ポリヌクレオチドの鎖のうちの１つとの間で生じ得る場合、別のポリヌクレオチドに対して「相補的」であり得る。相補性（一方のポリヌクレオチドが他方のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に是認された塩基対形成規則に従って、互いに水素結合を形成することが予想される対抗する鎖における塩基の割合に関して定量化可能である。
【００２４】
「ＲＮａｓｅ不活性」または「ＲＮａｓｅ不適格（ＲＮａｓｅ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」であるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログは、ＲＮａｓｅ活性オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート）と異なり、ＲＮａｓｅ独立の機構を介して作用するものである。これらは、標的ＲＮＡ形成、核−細胞質輸送または翻訳を立体的にブロックすることによって機能すると考えられ、従って、「立体的ブロッカー（ｓｔｅｒｉｃ ｂｌｏｃｋｅｒ）」とも呼ばれる。この型としては、例えば、メチルホスホネート、本明細書中に記載されるようなモルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および２’−Ｏ−アリル修飾されたオリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−アルキル修飾されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２５】
「ペプチド核酸」において、オリゴヌクレオチド骨格のデオキシリボースリン酸単位は、ポリアミド連結で置換される。適切な骨格間隔は、２−アミノエチルグリシン単位の使用によって達成され、ヌクレオチド塩基は、メチレンカルボニル基を介して各２−アミノ基に結合する。
【００２６】
「２’−Ｏ−アリル（またはアルキル）修飾されたオリゴヌクレオチド」は、２’ヒドロキシルが、アリルまたはアルキルエーテルに変換されているオリゴリボヌクレオチドである。アルキルエーテルは、代表的にメチルエーテルである。
【００２７】
「アルキル」は、炭素および水素を含む完全に飽和された非環式の一価の基をいい、これは、分枝鎖であっても、直鎖であってもよい。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、およびイソプロピルである。「低級アルキル」は、１〜６炭素原子、好ましくは１〜４炭素原子のアルキル基をいい、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、およびｔ−ブチルによって例示される。
【００２８】
「短縮」タンパク質またはコード配列は、一方の末端もしくは両末端から、内部領域から、または上記を組合わせた所から、正常なタンパク質または配列のいくらかの部分が取り除かれている。
【００２９】
アミノ短縮（Ｎ短縮）タンパク質またはカルボキシ短縮（Ｃ短縮）タンパク質は、それぞれ、スプライス改変体ｍＲＮＡの翻訳から生じる、異常もしくは欠失したアミノ末端または異常もしくは欠失したカルボキシ末端を有するタンパク質である。
【００３０】
（ＩＩ．アンチセンス化合物）
本発明に従って、１２〜２５ヌクレオチドを有するアンチセンス化合物（選択されたタンパク質をコードする選択されたプロセシング前ｍＲＮＡの標的領域に相補的である標的化塩基配列を含み、ここで、この標的領域の５’末端は、プロセシング前ｍＲＮＡ中の正常なスプライス受容部位の１〜２５塩基下流、好ましくは２〜２０塩基下流、より好ましくは２〜１５塩基下流である）が、正常なスプライス受容部位においてスプライシングを阻害し、故にスプライス改変体ｍＲＮＡを生成するのに有効であり、翻訳の際に選択されたタンパク質の短縮バージョンまたは他の方法により異常であるバージョンを引き起こすことが発見された。この戦略の利点を、以下に示す。
【００３１】
本発明に利用したアンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化しない化合物である。ＲＮａｓｅ−Ｈ活性オリゴマー（ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが最も顕著な例である）は、標的ｍＲＮＡが切断される機構によって主に作用する。一方、ＲＮａｓｅ不適格オリゴマーは、立体的ブロッキング機構によって作用すると考えられる。このような化合物としては、モルホリノオリゴマー、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、メチルホスホネート、および２’−Ｏ−アルキル修飾オリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−アリル修飾オリゴヌクレオチド（これらの全ては、当該分野で公知である）が挙げられる。本発明の好ましいアンチセンスオリゴマー（化合物）は、モルホリノオリゴマーであり、これは、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に示される形態のモルホリノサブユニットの化合物である。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特徴は、これらの特許に詳述される。モルホリノオリゴマーにおいて、（ｉ）モルホリノ基は、非荷電リン含有連結によって一緒に連結され、１〜３原子長であり、１つ目のサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結し、そして（ｉｉ）モルホリノ基に結合した塩基は、塩基特異的水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基へ結合するのに効果的な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分である。プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分は、代表的に、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはチミンである。このようなオリゴマーの調製は、米国特許第５，１８５，４４４（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９３）（これらは、その全体が本明細書によって参考として援用される）に詳細に記載される。参考文献に示されるように、非イオン性連結のいくつかの型が、モルホリノ骨格を構築するために使用され得る。
【００３２】
このようなモルホリノオリゴマーは、ＲＮＡ標的に対する高い結合親和性が示され、そして荷電されていない骨格は、荷電された類似物（例えば、ホスホロチオエート）に対して、細胞への取り込みを支持し、そして非特異的結合相互作用を減少する。これらは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、標的配列の翻訳を阻害する際に有意に改善された活性および選択性を提供することが示されている。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７（２）：６３−７０，Ａｐｒ １９９７を参照のこと。モルホリノオリゴマーは、非常に高いヌクレアーゼ耐性および良好な水溶性を有し、これによってインビボ使用のための良好な候補物である。インビボにおける細胞による効果的な取り込みが、共有に係り、かつ係属中の出願０９／４９３，４２７および対応するＰＣＴ公開ＷＯ ００／４４８９７において実証されている。それらの中に記載されるように、ホスホラミデート連結を有するモルホリノオリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡとヘテロ二重鎖を形成し、これは、この二重鎖状態中でヌクレアーゼ分解から保護されている。このような二重鎖は、細胞から排出され、そして標的ＲＮＡは、被験体由来の体液サンプルから後で検出され得る。これらの結果は、モルホリノオリゴマーが、（ｉ）体内の細胞に移動し、そしてそこへ侵入すること、および（ｉｉ）ワトソン−クリック塩基対形成を介して、標的核酸領域に高い親和性で結合することを実証する。
【００３３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的な骨格構造としては、上記のように、図１Ａ−Ｅに示されるβ−モルホリノサブユニット型が挙げられる。ポリヌクレオチドが１つより多くの連結型を有し得ることが、認識される。
【００３４】
好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドは、図２Ｂ−Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造で構成され、ここでこの構造は、ホスホロジアミデート連結によって一緒に連結され、一方のサブユニットのモルホリノ窒素は隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結し、ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的水素結合によるポリヌクレオチド中の塩基へ結合するのに効果的な、プリン塩基対形成部分またはピリミジン塩基対形成部分である。好ましい実施形態において、この連結は、図２Ｂ−Ｂに示されるホスホロジアミデート連結（ここで、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、またはＮＲＲ’、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏ）、および図２Ｂ−Ｂに示される代替のホスホロジアミデート連結（ここで、Ｘ＝ＯＲ、Ｙ＝ＮＨまたはＮＲ、およびＺ＝Ｏ）から選択される。ＲおよびＲ’は、標的結合を妨害しない基である。好ましくは、ＲおよびＲ’は、アルキルおよびポリアルキレンオキシ（例えば、ＰＥＧ；（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、またはその組合わせから独立して選択される。。アルキル／ポリアルキレンオキシ鎖は、好ましくは遠位末端において、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、チオール、アルカンチオール、ハロゲン、オキソ、カルボン酸、カルボン酸エステル、および無機エステル（例えば、ホスフェートまたはスルホネート）から選択される基によって置換され得る。好ましくは、鎖（置換と無関係で）は、１〜１２原子長であり、そしてより好ましくは１〜６原子長である。選択された実施形態において、ＲおよびＲ’は、独立してメチルまたはエチルである。１つの実施形態において、Ｘ＝Ｎ（ＣＨ３）２、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである。ＮＲＲ’はまた、窒素、炭素、酸素、およびイオウから選択される５〜７個の環原子を有し、かつ非炭素環原子と少なくとも同数の炭素環原子を有する、窒素複素環を示し得る。例としては、モルホリン、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、トリアゾール、ピラゾール、ピロール、イソピロール、イミダゾール、オキサゾール、イミダゾール、イソキサゾールなどが挙げられる。
【００３５】
アンチセンス化合物の溶解度、および溶液での保存における沈澱に抵抗する化合物の能力は、可溶化部分を用いてオリゴマーを誘導体化する（例えば、親水性オリゴマー、または荷電部分（例えば、荷電アミノ酸または荷電有機酸））ことによってさらに増強され得る。この部分は、アンチセンス化合物に結合し得、かつ化合物が標的配列に結合することを妨害しない、任意の生体適合性親水性部分または荷電部分であり得る。この部分は、周知の誘導体化方法を用いて、アンチセンス化合物に（例えば、５’末端に）化学的に結合され得る。１つの好ましい部分は、規定された長さのオリゴエチレングリコール部分（例えば、トリエチレングリコール）であり、トリエチレングルコールとのカルバメート連結を形成するピペラジン連結基を介して、カーボネート連結を通してアンチセンス化合物の５’末端に共有結合し、ここで、第２のピペラジン窒素は、アンチセンスの５’末端ホスホロジアミデート連結に結合する。あるいは、またはさらに、化合物は、１または少数の荷電骨格連結（例えば、ホスホジエステル連結）を、好ましくは化合物の末端の一方の付近に含むように設計され得る。付加された部分は、好ましくは、水性媒体中で、化合物の溶解度を少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌまで増強するのに効果的である。
【００３６】
この化合物は、実質的に３７℃よりも高いＴｍ（例えば、少なくとも５０℃そして好ましくは６０℃〜８０℃）を有する生理学的な条件下で標的配列にハイブリダイズするように設計される。この化合物は、標的配列に１００％相補的である必要はないが、これは、この標的配列の発現が調節されるように標的配列に安定かつ特異的に結合するために効果的である。良好な特異性と相まって、安定で効果的な結合を可能にするためのオリゴマーの適切な長さは、約８〜４０ヌクレオチド塩基単位、そして好ましくは約１２〜２５塩基単位である。ミスマッチは、存在する場合、ハイブリッド二重鎖の中央領域よりも、ハイブリッド二重鎖の末端領域に向かって不安定性が低くなる。この標的との塩基対特異性が維持されると仮定すると、標的塩基との変性塩基対形成を可能にするオリゴマー塩基もまた意図される。
【００３７】
（ＩＩＩ．標的配列の選択）
（Ａ．ＲＮＡスプライシング：背景）
転写の後の核ＲＮＡのプロセシングは、実質的に全ての生存細胞において観察される。哺乳動物ゲノムは、７〜８のエキソンを含む約１６，０００塩基長の転写物を作製する遺伝子を含む。スプライシングのプロセスは、ｍＲＮＡの長さを平均２，２００塩基まで減少させる。最初の転写物は、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）または前ｍＲＮＡと呼ばれる。ｈｎＲＮＡのプロセシングは、約２０のタンパク質の凝集体を含み、これは集合的にスプライソソームと呼ばれ、これはスプライシングおよび核からのｍＲＮＡの輸送を実行する。スプライソソームは、全ての転写物について共通の方向からスキャンするわけではないようである；イントロンは再現可能な順で除去され得るが、しかし指向された順で除去されない。例えば、イントロン３およびイントロン４が最初に除去され得、続いてイントロン２が除去され得、続いてイントロン１およびイントロン６が除去され得る。イントロン除去の順番には、予想できる先験的な観察はない。プロセシングのための配列の認識は小さく、これは誤差または多数のプロセシング部位が予測され得ると示唆され、そして実際、より多くの遺伝子が研究されるにつれて、ｈｎＲＮＡのプロセシングにおけるより多くのバリエーションが観察されてい「る。
【００３８】
前プロセシングされたｍＲＮＡにおいて、エキソン／イントロン連結部での２塩基の配列モチーフは不変である。上流（５’）スプライス供与体（ＳＤ）連結部は、エキソン−／ＧＴ−イントロンの形態であり、一方下流（３’）スプライス供与体（ＳＡ）連結部は、イントロン−ＡＧ／エキソンの形態である。隣接する塩基は不変ではない；しかし、スプライス受容体ＡＧ配列のすぐ上流の塩基は、約８０％の場合、Ｃである。
【００３９】
イントロン配列認識の現在の理解は以下のようである：
【００４０】
【化１】
括弧の中の数字は、部位における塩基の近似（＜１００％の場合）の割合の利用を示す。イントロン部位の中央における太字のＡは、スプライス供与体由来のＧが、ラリアットと呼ばれる分枝した２’−５’−構造を形成する部位（ブランチ点）である。（ＴＡＣＴＡＡＣ）で示される配列は、酵母において観察されるコンセンサスである。哺乳動物細胞におけるコンセンサス配列は、ＰｙＮＰｙ（８０）Ｐｙ（８７）Ｐｕ（７５）ＡＰｙ（７５）であり、ここでＰｙはピリミジン（Ｕ／ＴまたはＣ）を示し、そしてＰｕはプリン（ＡまたはＧ）を示す。ブランチ点におけるＡは不変であり、そして代表的に、ＡＧ部位の約１２〜５０塩基上流に見出される。ピリミジンリッチな領域（上記に示されていない）はまた、一般にイントロンの３’末付近（ＡＧ部位の約１０〜１５塩基上流）に見出される。
【００４１】
一旦このスプライソソームがラリアットを形成すると、２つのエステル交換反応が起こる：
１）イントロン中のブランチ点Ａの２’−ＯＨからＳＤイントロンＧの５’リン酸、および
２）ＳＤエキソンＧの３’−ＯＨからＳＡエキソンの最初の塩基の５’リン酸。この除去されたイントロンは、多くの場合素早く分解され、そして連結されたエキソンが今や成熟ｍＲＮＡと呼ばれ、これはリボソームによるタンパク質へ翻訳のために核の外に輸送される。
【００４２】
（Ｂ．標的化ストラテジー）
種々のアプローチが、アンチセンスオリゴマーによってｍＲＮＡのプロセシング（スプライシング）の標的化に使われ得る。以下の部位が標的化され得る：
１．ＳＤエキソンのエキソンのみの部分（ＳＤ部位の上流）（ＳＤプロセシングを阻害するため）。
２．ＳＤエキソン／イントロン連結部（ＳＤプロセシングを阻害するため）。
３．イントロン中のラリアット形成部位（ＳＡエキソンの上流のスプライソソームの認識をブロックするため）。
４．ＳＡイントロン／エキソン連結部（ＳＡプロセシングを阻害するため）。
５．ＳＡエキソンのエキソンのみの部分（ＳＡ部位の下流）（ＳＡプロセシングを阻害するため）。
【００４３】
先行技術の方法は、ストラテジー２またはストラテジー４（ＳＤ連結部またはＳＡ連結部の標的化）を利用してきた。例えば、ＲＶ Ｇｉｌｅｓら、前出（ｃ−ｍｙｃ遺伝子におけるスプライス受容体部位にわたるモルホリノアンチセンスオリゴマーが記載される）を参照のこと。
【００４４】
本発明を支持する実験によって、上記の標的化ストラテジー４および標的化ストラテジー５（スプライス受容体を指向する）は、ストラテジー１およびストラテジー２（スプライス供与体を指向する）よりもより確実に効果的であったことが見出された。
【００４５】
例えば、インビボ（動物全体）で標的化されるラットＣＹＰ３Ａ２前ｍＲＮＡを用いた研究が行なわれた。動物を、リン酸緩衝化生理食塩水中の１００μｇのＰＭＯ（図２Ｂ−Ｂを参照のこと。ここでＹ１およびＺは、酸素であり、そしてＸはＮ（ＣＨ３）２である）で腹腔内に注射した。エリスロマイシンＯ−デメチラーゼのミクロソーム代謝の減少した速度がモニターされ、アンチセンス阻害によって引き起こされる予期した表現型を反映した。示されるように、スプライス供与体（ＳＤ）標的化は、スプライス受容体（ＳＡ）ストラテジーよりも効率的ではなかった。
【００４６】
【表１】
ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡに対するオリゴマーアンチセンスを用いる実験を、培養されたラットＮＲＫ細胞において実行し、トリチウム化されたチミジンの取り込みをモニターすることによって細胞ＤＮＡ合成の阻害を評価した。配列は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｙ００３９６（ラット）およびＪ００１２０（ヒト）に由来し、これはエキソン２の先頭におけるスプライス受容体領域を標的化した（配列番号１は除く。これはスプライス供与体を標的化する）。示されるこのラットおよびヒトの配列は、この領域において高い相同性である。以下の表１において列挙されるオリゴマーを、いくつかの増殖アッセイを使用して、抗増殖効果についてスクリーニングした。２つの種（ラットおよびヒト、それぞれＮＲＫおよびＷＩ−３８）由来の初代線維芽細胞を、スクリーニングのために使用した。表１に示されるデータは、ＮＲＫ細胞を使用した。
【００４７】
２０μＭのＰＭＯ（図２Ｂ−Ｂにおいて示され、ここでＹ１およびＺは、酸素であり、そしてＸは、Ｎ（ＣＨ３）２）である）を使用する［３Ｈ］チミジン組込みアッセイからのデータを、表１に示す。割合は、ビヒクル（Ｈ２Ｏ）コントロールと比較した［３Ｈ］チミジン組込みをいう。従って、数が少なくなるほど、抗増殖効果は大きくなる。試験した全てのオリゴマーが、少なくともいくつかの抗増殖活性を示すことが見出され得る。阻害活性の程度を、３２％のコントロールで、抗増殖薬物であるタキソール（パクリタキセル、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）と都合よく比較した。１０％〜２０％の細胞がこすり落とし負荷手順によって影響されず、従って残余の［３Ｈ］チミジン組込み活性に寄与するので、最も効果的なオリゴマーを含むほとんどまたは全ての細胞は、増殖阻害されたようであった。
【００４８】
【表２】
２つの関係のない配列のオリゴマー（ラットＢＣＬ−２、配列番号４９およびラットＰＣＮＡ−１、配列番号５０）は、アッセイした最も高い濃度（２０μＭ）でＮＲＫ細胞を阻害しない。配列番号２５のミスマッチ配列およびスクランブル配列（それぞれ配列番号４８および配列番号４７）は、２０μＭでＷＩ−３８（ヒト）線維芽細胞の増殖に対していずれの効果もない。
【００４９】
配列番号４５（ヒトｍｙｃ前ｍＲＮＡの第１イントロンの３’スプライス受容体部位にわたる）は、Ｇｉｌｅｓら（１９９９）によって、ｍｙｃ前ｍＲＮＡのミススプライシングを引き起こすことが示された。潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）または潜伏した（ｌａｔｅｎｔ）スプライス受容体（通常のスプライス受容体位置に対して４４ｂｐ遠位である）を使用して、４４ｂｐの欠失を有する異常にスプライシングされたｍＲＮＡを生成した。このミススプライシングされたｍＲＮＡは、開始ＡＵＧを欠失し、そして正常なｍｙｃタンパク質を生成しなかった。
【００５０】
配列番号２５は、イントロン１〜エキソン２の境界に広がっておらず、第１の可能性のある相補的な塩基対は、３’スプライス受容体から１０番目のヌクレオチドである。同様に、配列番号３は、ラットｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ配列におけるスプライス受容体下流の５’末端の１１塩基を有する。データに示されるように、両方の配列は細胞増殖の阻害において効果的であった。配列番号４５について示されたように、これらのオリゴマーが正常なスプライシングを阻害するか否かを決定することは関心深いものであった。従って、ＲＮＡを、陽性コントロールオリゴマー（配列番号４５）および陰性コントロールオリゴマー（配列番号５０）ならびに配列番号２５で処理されたヒト細胞から調製した。次いでこのＲＮＡの構造を、逆転写酵素を使用してＤＮＡコピーを作製し、次いで隣接のＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲを実行することによって分析した（以下の材料および方法を参照のこと）。このＲＴ−ＰＣＲ手順の産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００５１】
未処理の細胞または無関係なオリゴマーで処理した細胞において、使用したプライマーおよびｃ−ｍｙｃヌクレオチド配列から３０４ｂｐのバンドが予測され、そしてこのバンドが観察された。配列番号２５で処理した細胞については、２つのＤＮＡバンドが観察された。上のバンド（これは、未処理の細胞またはネガティブコントロール細胞からのフラグメントと共に移動した）は、使用した取り込み手順によってスクレイプロード（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄ）されなかった１０％〜２０％の細胞からのｍＲＮＡおよび処理細胞中の正しくスプライシングされたｍＲＮＡ画分を表した。より重たく、より低いバンド（ｈｅａｖｉｅｒ ｌｏｗｅｒ ｂａｎｄ）は、ミススプライシングされた４４ｂｐ欠失ｍＲＮＡを表した。
【００５２】
配列番号２５をロードした細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲ手順から２つのバンドを生成した。このうちの１つは、正常にスプライシングされたｍＲＮＡのサイズであり、そして１つはそれより小さいサイズである。それゆえに、配列番号２５は、スプライスアクセプター部位と直接的に重なっていないにもかかわらず、ミススプライシングを生じ得ると結論され得る。無関係なＰＭＯ（配列番号５０）は、未処理の細胞のｍＲＮＡ構造パターンと同一であるｍＲＮＡ構造パターンを提供し、ミススプライシングは配列特異的であることが実証された。
【００５３】
配列番号２５を用いた用量応答研究は、３μＭのＩＣ５０を与えた。この阻害効果は、１０μＭにおいてプラトーに達し始め、そして１０μＭから２０μＭではさらなる変化はほとんど存在しなかった。
【００５４】
Ｍｙｃタンパク質は、細胞周期のＧ０／Ｇ１期からＳ期への移行について関係があり重要であると推定される（ＭＫ Ｍａｔｅｙａｋら，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８：１０３９−４８，１９９７）。従って、ｍｙｃタンパク質レベルが低下した場合、この細胞はＧ１で停止すると予測される。この効果を、Ｔｅｌｆｏｒｄらの方法（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３：１３７−４３，１９９３）を使用して、Ｇ１およびＧ２にある細胞数を決定することによって調べた（材料および方法を参照のこと）。ＲＮＡを加水分解によって欠失した後、ＤＮＡ特異的な蛍光色素である、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）によって細胞を染色した。次いで、細胞毎のＤＮＡ含有量分布をＦＡＣＳ分析によって決定した。ＦＡＣＳ強度プロフィールは、２ＮのＤＮＡ含有量（Ｇ１）および４ＮのＤＮＡ含有量（Ｇ２）に対応する、２つのピークを示す。配列番号２５を有するＰＭＯで処理した細胞は、Ｇ２にある細胞の割合（２１％のビヒクルコントロールと比較して９％）と比較して、Ｇ１にある細胞の割合の増加（６６％のビヒクルコントロールと比較して７９％である）を示した。増殖因子の枯渇によって得た静止細胞のポジティブコントロールによって、８０％の細胞がＧ１にあり、そして８％の細胞がＧ２にあることが示めされた。
【００５５】
抗ｃ−ｍｙｃオリゴマー（配列番号２５）が、アンチセンス機構によってｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡ発現を阻害するさらなる証拠を得るために、レポーター遺伝子モデル系を構築して、１つの遺伝子（ルシフェラーゼ）およびその活性（発光）を直接調べ。ｍｙｃ−ルシフェラーゼレポータープラスミドは、昆虫ルシフェラーゼｃＤＮＡに融合した、全体として２．２−ｋｂである、ヒトｃ−ｍｙｃ ５’領域およびｍｙｃタンパク質の最初の６アミノ酸のコドンを含んでいた（Ｈｕｄｚｉａｋら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１０：１６３−７６（２０００）を参照のこと）。これをＨｅＬａ細胞へトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ産生クローンを選択し、クローンＬ６と命名した。この細胞株に、指定された濃度のＰＭＯをスクレイプロードし、そして再度プレーティングした。２４〜３０時間後、この細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を測定した（材料および方法を参照のこと）。
【００５６】
この結果は、ＩＣ５０が３００ｎＭである、ルシフェラーゼ産生の強い阻害を示した。いくつかのコントロール実験を実施して、ルシフェラーゼ合成の観察された阻害がＰＭＯによる配列特異的阻害であるか否かを決定した。配列番号２５および上記の２つの配列の置換物を（配列番号４７および４８）を比較した。乱雑化（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）したバーションのオリゴマーも、３塩基誤対合のオリゴマーのいずれもが、ルシフェラーゼ産生において効果を持たなかった。他のコントロール実験によって、配列番号２５が、ルシフェラーゼアッセイの３０時間のインキュベーション時間の間、配列相補性薬剤が７０％阻害を与える条件下において、ＨｅＬａ増殖に対して影響を持たず、そして関係のない標的レポーター系（ウサギα−グロビン；Ｊ Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：６３〜７０，１９９７）対して影響を持たなかったことが示しめされた。３〜４連続したグアニン（Ｇ）塩基を含む他の配列を、上記のＮＲＫ細胞増殖アッセイにおいて試験し、そしてこれは、２０μＭまでの濃度で細胞増殖の有意な阻害を与えなかった。
【００５７】
ラットｃ−ｍｙｃのスプライスアクセプター（ＳＡ）領域に関するＰＭＯアンチセンスの「機能フットプリンティング」の評価において、スプライシングの妨害が、ＳＡの−４４位上流からＳＡの＋３６位下流（標的領域の３’末端）までの領域を標的化するＰＭＯを用いて観測された。標的配列が下流に移動するにつれて、より低分子量のタンパク質の割合が、正常なｃ−ｍｙｃと比較して増加することが観測された。
【００５８】
スプライスアクセプター部位の接合部の下流（すなわちエキソン内）を標的化することは、以下に議論した理由によって一般に好ましい。
【００５９】
（ＩＶ．ＳＡ部位での妨害の結果）
結合オリゴマーが、ＳＡでの正常なｍＲＮＡスプライシングを妨害した場合、スプライセオソームは、この領域内のブロックされていない次の最も良好な候補部位に進む。この部位は、１０〜１５塩基上流の短い一続きのピリミジンおよびさらに上流の適切な分岐点を伴った［Ｃ］ＡＧ配列である傾向がある。
【００６０】
得られるプロセシングされたｍＲＮＡは、一般に、正常なスプライスアクセプター部位と選択的（すなわち「クリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）」）スプライスアクセプター部位との間の配列が欠失された、スプライス改変体ｍＲＮＡである。得られた改変体タンパク質は、欠失された配列に依存して異なった形態を取る。例えば、この欠失された配列が、複数の３塩基対の全体を含む（つまり、下流のスプライスアクセプター部位は、正常なスプライスアクセプター部位の下流の複数の３塩基の全体を含む）場合、続く配列は、正常な配列とフレームが一致しており、そしてネイティブなタンパク質の短縮化形態が得られる。これは、例えば、以下の実施例Ｃにおいて記載されるようにドミナントネガティブタンパク質の形成を可能にする。しかし、クリプティック部位が正常な部位とのフレームがずれている場合、関連のない「ナンセンス」タンパク質が生成される。非リーディングフレーム配列中の終止コドンの頻繁な発生（２０コドン当たり約１コドン）に起因して、このようなスプライス改変体のｍＲＮＡは、代表的には翻訳の初期終止に至る。
【００６１】
この欠失された配列がＡＵＧ開始部位を含むならば、翻訳は、さらに下流で見出される選択的なＡＵＧ部位で生じ得る。さらに、この選択的部位が通常のＡＵＧ部位のフレームと一致している場合、得られたタンパク質は、ネイティブなタンパク質から幾つかのアミノ酸が欠失されている。この選択的部位がフレームとずれている場合、「ナンセンス」タンパク質（代表的には翻訳の初期で短縮される）を生じる。
【００６２】
１つの実施形態において、以下の実施例Ａおよび実施例Ｂで例示されるように、カルボキシ末端短縮化タンパク質を生成する。別の実施形態において、実施例Ｃおよび実施例Ｄで例示されるように、異常アミノ末端を有するかまたはアミノ末端が欠失されたタンパク質が生成される。後者は、ＡＵＧ翻訳開始部位がｍＲＮＡのエキソン２またはそれ以降のエキソンにある場合に、達成され得る。
【００６３】
従って、所望のタンパク質についてのプレｍＲＮＡ配列が既知である場合、アンチセンス標的が設計され、このタンパク質の所望の領域を改変し得る。好ましくは、このタンパク質の結合ドメインはまた既知であり、この結果、このタンパク質の選択された機能を改変し得る。
【００６４】
以下の工程を使用して、本発明に従って、複数のエキソンを有する遺伝子を標的化し得る：
工程１。問題としているタンパク質の機能ドメインを同定する。科学文献は、これらの情報のほとんどを提供し得る。１つの優れた供給源は、Ｒｏｂｉｎ Ｈｅｓｋｅｔｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９５）による「Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ」である。この中において、癌に関連するタンパク質が概説されており、そしてこれらの機能ドメインがマップされている。同様に、「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ」（ＲＥ ＣａｌｌａｒｄおよびＡＪＨ Ｇｅａｒｉｎｇ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）は、サイトカインの機能ドメインを記載する。同じシリーズの他の出版物としては、「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ」、「Ｔｈｅ Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ」、および「Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ」が挙げられる。
工程２。ＧｅｎＢａｎｋまたは類似の核酸データベースを、エキソン／イントロン配列および接合部を含むこの遺伝子配列について検索する。
工程３。好ましいアンチセンス標的は、スプライスアクセプター部位の約３５〜４０下流の塩基の内にある。好ましくは、この標的領域は、ＳＡ接合部から、１〜２５塩基下流の位置、より好ましくは２〜２０塩基下流の位置に、最も好ましくは２〜１５塩基下流の位置に５’末端を有する（配列）（１塩基下流の配列は［Ｃ］ＡＧスプライスアクセプター部位に直接隣接しているが、これと重なっておらず、そして正常なエキソンの第１番目の塩基を含むことを留意すること）。工程４。阻害結果を予測するために、ＳＡの下流にあるエキソンを、クリプティックスプライスアクセプター（すなわち、真のＳＡの下流にある［Ｃ］ＡＧ配列）について検索する。一旦、このような候補部位が位置付けられると、クリプティックＳＡの１２〜５０塩基上流のラリアット形成のための
【００６５】
【化２】
（または類似の）部位を検索する（上で与えられたコンセンサス配列に従って、分岐点Ａのみが保存されなければならず、従って、この配列においては多くの融通があることに留意すること）。好ましくは、また、クリプティックＳＡ部位の１０〜１５塩基上流に短いピリミジンリッチ領域も存在すべきである。
工程５。一旦、可能性があるクリプティックＳＡが同定されると、この使用が真の部位とクリプティック部位との間の塩基数を３で割ることによって「フレームが一致したリーディング」をもたらすか否かを決定する。この商が整数である場合、生じるタンパク質は「フレームが一致して」おり、そしてドミナントネガティブタンパク質である（以下を参照のこと）。
【００６６】
従って、１つの好ましい実施形態において、アンチセンス標的は、スプライシングがクリプティック部位（この使用はフレームが一致したリーディングをもたらす）に指向されるようであるように、選択される。
【実施例】
【００６７】
（Ｖ．標的タンパク質および選択された実施例）
適切な標的タンパク質としては、例えば、転写因子、特に癌遺伝子タンパク質また癌原遺伝子タンパク質（例えば、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ａｂｌ、ｂｃｌ、およびｐ５３）；マトリックスタンパク質（例えば、インテグリンおよびカテドリン（ｃａｔｈｅｄｒｉｎｓ））；他の腫瘍発現タンパク質（例えば、ｈＣＧ）；テロメアーゼ；レセプタータンパク質；サイトカイン；キナーゼ；およびウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ ｒｅｖ、ヒトパピローマウイルス、およびヒトパルボウイルスＢ１９）が挙げられる。このようなタンパク質の阻害が数多くの治療的な応用を有することが、理解される。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（例えば、細胞分裂および細胞周期の様々な局面で関与するタンパク質（例えば、転写因子）を標的化することによる）抗腫瘍治療；（感染性因子の複製またはその他のウイルス機能にとって必須のタンパク質を標的化することによる）抗ウイルス治療または抗細菌治療；ならびに（その部位での細胞増殖を支持するタンパク質を阻害することによる）再狭窄または他の増殖性疾患の阻害。
【００６８】
転写因子は、代表的には、ＤＮＡ結合領域およびタンパク質−タンパク質結合領域を有する、複数ドメインタンパク質である。これらの領域のうちの１つを妨害することによって、ドミナントネガティブタンパク質を産生し得る。このドミナントネガティブタンパク質は、１つの活性（例えば、タンパク質結合）を保存し、一方で、このタンパク質の適切な機能にとって重要な別の活性（例えば、ＤＮＡ結合）を阻害する（または逆もしかり）ことによってネイティブなタンパク質の活性に対抗する。以下に記載のｃ−ｍｙｃの例を参照のこと。
【００６９】
上で言及したように、上で言及した多くの標的タンパク質の機能ドメインは、広範囲研究されており、そして文献において報告されている。イントロン、エキソン、およびＡＵＧ開始コドンの位置を含む、プレｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースまたは当業者にとって容易に利用可能な他の公開された情報源において見出され得る。
【００７０】
以下は、スプライス改変体ｍＲＮＡを産生するために選択されたタンパク質におけるスプライスアクセプタドメインの下流を標的化したアンチセンスの例である。このｍＲＮＡは、翻訳の際に、特定の変更を有するタンパク質を産生する。
【００７１】
実施例Ａおよび実施例Ｂに例示された１つの実施形態において、カルボキシ末端で断ち切られたタンパク質が作製される。実施例Ｃおよび実施例Ｄに例示した別の実施形態において、異常アミノ末端を有するかまたはアミノ末端が欠失されたタンパク質を生成される。
【００７２】
（Ａ．ヒトアンドロゲンレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ３５８４５、Ｍ３５８４６））
前立腺癌の分子生物学を概観することによって、アンドロゲンの除去が現在の技術水準であることが示されている。本発明に従って、これはアンドロゲンレセプターの不活化によって達成され得る。エキソン２において、この遺伝子の中心を標的化することにより、様々な選択肢が、機能アンドロゲンレセプターの発現を阻害するために利用可能である。エキソン２（配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ３５８４５）またはエキソン３（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ３５８４６）におけるスプライスアクセプターの提案される標的化を示す。
【００７３】
【化３】
このオリゴマー（配列番号８）は、正常なスプライスアクセプター部位の４塩基下流である、塩基４８で始まる配列を標的化する。次の可能なクリプティックスプライス部位は塩基１００に存在する（９７〜９９位のＣＡＧ；８０位のプランチポイント；８７〜９２位の上流のピリミジン領域）。この部位は、正常な部位とは有するフレームがずれており、従って、このタンパク質の初期での終止を生じる。
【００７４】
スプライスアクセプターの１〜約１８塩基下流の５’末端を有する配列を標的化する類似の長さのオリゴマーが使用され得る。これは、以下の配列から選択される約１８連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：５’−ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＴＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＣＣ ＡＡＡ−３’（配列番号９；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３５８４５で与えられる配列の塩基の４５〜８０位に相補的である）。
【００７５】
【化４】
このオリゴマー（配列番号１２）は、正常なスプライスアクセプター部位の６塩基下流の、塩基４９で始まる配列を標的化する。可能なクリプティックスプライス部位は、塩基１４５（１４３〜１４５位のＣＡＧ；１１４位の分岐点Ａ；１２３〜１２７位のピリジン領域）に存在する。この部位は、正常なスプライス部位とフレームが一致しており、従ってネイティブなタンパク質のＣ末端短縮バーションを生じるはずである。
【００７６】
スプライスアクセプターの１〜約１８塩基下流の５’末端を有する配列を標的化する類似の長さのオリゴマーが使用され得る。これは、例えば以下の配列から選択される約１８〜２０の連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：５’−ＡＡＴ ＣＡＴ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＧＣ ＡＣＡ ＧＧＴ
ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＴＣＣ−３’（配列番号１３；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３５８４６で与えられる配列の塩基の４４〜７９位に相補的である）。
【００７７】
（Ｂ．ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βサブユニット）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ００２６６））
ｈＣＧのサブユニットは、ｈＣＧにおいては延長されているＣＯＯＨ端を除いて黄体化ホルモン（ＬＨ）とほとんど同一である。この延長は、この遺伝子のエキソン３の中にある。エキソン３のＳＡ部位を妨害することによって、ｈＣＧは、（両タンパク質で高度に保存されている）ＡＵＧ翻訳開始部位の標的化とは違って、ＬＨを標的化せずに短縮化され得る。
【００７８】
以下の配列を有するオリゴマーは、ＳＡ（１３１８〜１３２０位のＣＡＧ）の近傍の（直接隣接している）エキソン３に結合し、塩基１３２１〜１３３８位の配列を標的化し、そしてこの部位でスプライシングを妨害する：５’−ＣＣＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＣ ＧＣＧ ＧＧＴ−３’（配列番号１４）。
【００７９】
スプライスアクセプターの１３２２位、１３２３位などから約１３４０位の塩基の５’末端を有する配列を標的化する類似の長さのオリゴマーが使用され得る。これは、例えば、以下の配列から選択される約１８〜２０の連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：
５’−ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＣＣＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＧＧ Ｔ−３’
（配列番号１５；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ００２６６で与えられる配列の塩基の１３２１〜１３５７位に相補的である）。
【００８０】
可能性のあるクリプティックＳＡ部位は、塩基１３９３（１３９１〜２のＡＧ；１３７０位または１３７３位の分岐点Ａ；フレームが一致）および塩基１４５８（１４５５〜１４５７のＣＡＧ；１４２７位の分岐点Ａ；フレームがずれる）に存在する。いずれかの部位でのスプライシングは、少なくとも２４のアミノ酸をこのタンパク質から欠失させるが、そして、フレームがずれる部位が使用された場合はおそらくより多く欠失させる。ｈＣＧは腫瘍細胞においてのみ発現されるので、これは、より少ないタンパク質が発現され、そしてこのタンパク質はより短い生物学的半減期を有するという点で治療的に有益である。さらに、短縮化タンパク質は、異常なアミノ酸をＣＯＯＨ末端において有し得、そしておそらく、ｈＣＧに対する免疫応答（ワクチン接種ストラテジーにおいて有用である）を生じる。
【００８１】
（Ｃ．ヒトｃ−ｍｙｃ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ００１２０））
ｃ−ｍｙｃは、細胞の増殖および分化を制御し、そして血管再造形、平滑筋細胞増殖、細胞外マトリックス合成、およびアポトーシスのプロセスに関連する、癌原遺伝子である。ｃ−ｍｙｃの異常発現は、ヒトの癌において頻繁に観察される。ｃ−ｍｙｃの異常発現、構成的発現または過剰発現は、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、白血病、肺癌などを含む多くのヒトの癌に関連する。ｃ−ｍｙｃの阻害が、再狭窄の発生率および重篤度を減少させることもまた実証されてきた。
【００８２】
ｃ−ｍｙｃタンパク質は、この配列のアミン末端部分にＤＮＡ結合ドメインを有し、そしてカルボキシ末端部分にタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを有している。ｃ−ｍｙｃは、カルボキシドメインでＭａｘと結合し、Ｅ−Ｂｏｘとして既知であるＤＮＡ配列（５’−ＣＡＣＧＴＧ−３’）に結合し得るヘテロダイマーを形成することが公知である。ｍｙｃ：ｍａｘがこの様式で結合した場合、この表現型は増殖刺激であり、そしてアポトーシスに至り得る。
【００８３】
ｍｙｃ濃度が低いならば、ｍａｘは、トランス活性化しないホモダイマーを形成する。このｍａｄタンパク質が誘導されるならば、ｍａｘはｍａｄに結合して、ｍａｄ：ｍａｘへテロダイマーを形成し、これは分化を誘導する傾向にあり、そして抗アポトーシス性（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）である。
【００８４】
従って、ｍｙｃを単純に阻害することは、抗アポトーシス性であるｍａｄ：ｍａｘ表現型を生じる傾向がある。しかし、タンパク質−タンパク質結合（カルボキシ末端）ドメインをインタクトなままにしながらｃ−ｍｙｃのＤＮＡ結合（アミン末端）ドメインを阻害した場合は、その結果は、ｍａｘ結合が可能だが、トランス活性化は可能でないドミナントネガティブタンパク質である。好ましい表現型は、増殖刺激作用の欠損であるが、ｍａｄ：ｍａｘの代償的な抗アポトーシス作用は優勢とならない。これは、ｍａｘタンパク質が依然としてｍｙｃのＣＯＯＨドメインに結合して得るからである。
【００８５】
アミン末端ドメインの阻害は、スプライシングの変更を指向するアンチセンス化合物の適切な設計によって達成される。下流に見出されるクリプティック（選択的）ＳＡ部位は以下を含む：
４５４７ 可能な候補；４５５４位の次のＡＵＧは、フレームの外であり、従って、無関係な（「ナンセンス」）タンパク質を産生する（配列番号１３よりさらに下流に標的化されたオリゴによって遮断され得る）
４５７８ 上流にピリミジンがほとんどないことによって、良好ではないＳＡ候補。
４６１７ 良好なＳＡ候補；次の下流にある隣のＡＵＧは４８２１に存在し、このＡＵＧが４５２１で正常なＡＵＧのフレームと一致する。
【００８６】
上記のように、４５０４〜４５０５のスプライスアクセプター部位ＡＧの１０塩基下流のヒトｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｊ００１２０）の塩基４５１５〜４５３４（配列番号２５、５’−ＡＣＧ ＴＴＧ ＡＧＧ
ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣ−３’）に相補的な配列を有するモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）は、この部位における適切なスプライシングおよび正常な４５２１位のＡＵＧ翻訳開始部位の使用を妨害したことが見出された。産生されたｍＲＮＡの分析は、上で示された４６１７部位の使用を示した。正常なＡＵＧの３００塩基下流にある、４８２１位のＡＵＧにおける翻訳開始は、Ｎ末端で１００アミノ酸が欠失したタンパク質を生成する（Ｇｉｌｅｓらによって報告されたとおり）。ｍｙｃのＣＯＯＨ末端に対する抗体の使用は、アンチセンスオリゴマーで処理した細胞由来のこのタンパク質、および実質的にこれより小さいタンパク質を明らかにした。これらのＮ末端短縮化タンパク質はｍａｘに結合するが、しかしＤＮＡには結合しないと予測される。
【００８７】
これらの結果は、プライマー増幅ｍＲＮＡの調査と合せて、４６１７位のクリプティックスプライス部位の使用、ならびにさらに下流の他のクリプティックスプライス部位の使用を実証した。
【００８８】
上記のように、ＳＡの−４４上流からＳＡの＋３６下流（ｄｓ）の領域に標的化されたＰＭＯオリゴマーは、ラットｃ−ｍｙｃにおけるスプライシングの妨害の証拠を示した。約２０塩基のオリゴマー長を想定して、以下のアンチセンス配列をヒトｃ−ｍｙｃの標的化のためにこのように利用し得た：
（表２）
【００８９】
【表３】
ｍｙｃのタンパク質−タンパク質結合（カルボキシ末端）ドメインはまた、以下のように変更され得る。アンチセンス配列５’−ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＣ−３’（配列番号３３）を有するオリゴマーは、塩基６６５４〜６６５５にあるスプライスアクセプターの下流の、塩基６６５６を標的化する。同様に、下流のクリプティックＳＡ部位は、塩基６７０４、６７１０および６７２９で存在する（６７０２〜６７０３位のＡＧ；６７０７〜６７０９位のＣＡＧ；６７２６〜６７２８位のＣＡＧ；６６８４位の分岐点Ａ；６６９０位から始まるピリミジンリッチ領域）。これらのうちで、最初の２つは、フレーム外であり、そして３番目のものはフレーム内である。３番目の部位の使用は、ｍＲＮＡからの７５塩基対の欠失を生じ、ｍｙｃタンパク質のタンパク質−タンパク質結合ドメインにおける２５アミノ酸の欠失を生じると期待される。このタンパク質は、逆のドミナントネガティブである。なぜならば、ＤＮＡ結合は可能であり得るが、ｍｙｃ：ｍａｘトランス活性化は、起きないようである。ｍｙｃの機能は喪失するが、ｍａｄ：ｍａｘヘテロダイマーは優位であり、その結果、分化および抗アポトーシスの表現型が観察される。
【００９０】
上記のように、配列番号３３と比較して徐々にさらに下流へと標的化されたオリゴマーはまた、使用され得る。これは、例えば、以下の配列から選択される約１８〜２０の連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含み得る：
５’−ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＧ ＴＴＣ ＣＴＣ−３’（配列番号３４；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｊ００１２０で与えられた配列の６６５６−９１位の塩基に相補的である）。本発明に従って、上記における初めの２つのクリプティック部位でのスプライシングを阻害するために、十分に下流の遠くへ標的化したオリゴマーは、上記の３番目のクリプティック部位におけるスプライシングを促進するのに有効であり得る。
【００９１】
（Ｄ．ヒトｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ５４１５６））
ｃ−ｍｙｃのように、ｐ５３は非コードエキソン１、大きなイントロン１およびエキソン２のＳＡ部位近傍のＡＵＧ開始コドンを有する。例えば、ＳＡ部位の３塩基下流の塩基１１６９１においてその５’末端を有する領域を標的化したオリゴマー（５’−ＣＣＣ ＧＧＡ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＣ−３’；配列番号３５）は、ＡＵＧ開始部位での翻訳およびエキソン２の通常のスプライシングを妨害することが期待される。ｃ−ｍｙｃについて上で記載されたように、他の適切なオリゴマーは、ＳＡ部位の１塩基もしくは２塩基下流を標的化されたオリゴマーまたは徐々にさらに下流を標的化されたオリゴマーを含む（例えば、１１６９１位、１１６９２位などの塩基で開始し、そして塩基１１６８９（通常のエキソン２の第１の塩基）と塩基約１１７２５との間の領域の幾つかの部分を標的化する。これは、例えば、以下の配列から選択される約１８〜２０連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：５’−ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＴＧ
ＧＣＡ ＧＴＧ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＣＴＧ−３’（配列番号３６；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ５４１５６で与えられた配列の塩基１１６８９〜１１７２４に相補的である）。
【００９２】
クリプティックＳＡ部位は、塩基１１７６１（１１７５９〜６０のＡＧ）および塩基１１７６５（１１７６２〜１１７６４のＣＡＧ）で利用可能である（１１７３６の分岐点Ａ；１１７５０〜１１７５７の一連のピリジン）。１１７８２位の塩基の次のＡＵＧは、フレームからずれており、これはナンセンスタンパク質を生じる。あるいは、開始はエキソン３からはじまり、ｐ５３のアミノ末端を有さない短縮化ｐ５３型タンパク質を生成し得る。
【００９３】
以下は、スプライスアクセプターの標的化が、本質的に有益である例である。
【００９４】
（Ｅ．ヒトＡｂｌ （ＧｅｎＢａｎｋ ＡＪ１３１４６６））
慢性骨髄性白血病において、ｂｃｒ遺伝子が切れてａｂｌに融合し、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質を形成することから、この遺伝子はアンチセンス阻害の標的である。ａｂｌに関して、融合が様々な位置（すなわち、ａｂｌのエキソン２に融合するｂｃｒの、エキソン１、エキソン２およびエキソン３の後に切断が存在する）で起こり得る。しかし、ａｂｌのスプライスアクセプターを標的化することにより、唯１つのオリゴマーだけが、全てのＣＭＬ患者の処置のために必要である。
【００９５】
ｂｃｒ−ａｂｌ融合点は、塩基３７３−３７４の接合部に存在する。それゆえに、ａｂｌスプライトアクセプターは、この接合部の３塩基下流の以下の配列によって標的化され得る：５’−ＣＴＡ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＧＧ Ｃ−３’（配列番号３７）。
【００９６】
再び、スプライス接合部とこのスプライス接合部の約３５〜４０塩基下流との間の領域を標的化する他のオリゴマーはまた、使用され得る。これは、例えば、以下の配列から選択された約１８〜２０連続したヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む：
５’−ＧＣＴ ＣＡＡ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＡ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＧＧ ＣＴＴ−３’（配列番号３８；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ１３１４６６において与えられる配列の塩基３７４〜４０９に対して相補的である。可能なクリプティックスプライス部位（両方ともフレームがずれている）は、４５３〜４５９位の上流のピリミジン領域、ならびに４２１および５１６〜５１８の分岐点Ａを伴い、５０７〜５１０の上流のピリミジン領域および４８５のＡ分岐点を伴った、４６８〜４７０のＣＡＧモチーフを含む。
【００９７】
（Ｆ．ＨＩＶ−１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ３９１０６））
本実施例は、本発明の方法が特別な利点を提供する状況を例示する；すなわち、標的ウイルスおよび宿主（ヒト）の両方が同じｍＲＮＡ配列を有する遺伝子を発現する場合である。このタンパク質産物は、ウイルスおよび宿主の両方の機能に重要だが、異なる機能をもたらす。
【００９８】
ＨＩＶ−１ ｒｅｖのｍＲＮＡ配列（これは、ウイルスの複製に重要なタンパク質をコードする）（例えば、Ｈ Ｍｉｔｓｕｙａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５３３−１５４３、１９９０を参照のこと）は、宿主でまた生じ、この配列がアンチセンスによって阻害された場合に毒性作用をもたらすることが見出された。具体的には、配列５’−ＴＣＧ ＴＣＧ ＧＴＣ ＴＣＴ ＣＣＧ ＣＴＴ
ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＣＣ−３’（配列番号３９）を有するホスホロチオエートオリゴマーを使用して、ＨＩＶ−１ ｒｅｖを阻害した（Ｍａｔｓｕｋｕｒａら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：４２４４−４２４８、１９８９）。ｒｅｖのこの領域は、ＨＩＶにおいて高度に保存されている；従って、広範な種々のウイルス単離体が阻害され得るように標的化された。
【００９９】
しかし、この２７ｍｅｒの臨床前開発を、連続的な注入によって処置した日和見感染であるように見えた３匹のアカゲザルのうち２匹が、死亡した場合に終了した。過剰の内毒素負荷が疑われたため、内毒素の除去に注意を払って実験を反復した。しかし、２匹のカニクイザル（ｃｙｎａｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）がまた、反復研究における連続注入の８日目および９日目に死亡した。内毒素が効果的に考慮から除かれた場合に、免疫抑制が原因として示唆される。３匹のアカゲザルの白血球（ＷＢＣ）数は、ＨＩＶ−ｒｅｖに対するアンチセンスホスホロチオエートを用いた注入の前に９．５±０．７であり、注入の間に６．９±０．６に低下した。ＲＢＣまたはヘマトクリットにおいては、関連する変化は存在しなかった。さらに、免疫応答に関連する細胞についての表面マーカー研究が影響を受けた；ＣＤ２は、８８から７６に低下し、ＣＤ８は４５から３６に落ち、そしてＣＤ２０は１４から１８に上昇した。
【０１００】
ヒトおよびサルのゲノムにおいて観察されるＨＩＶ−ｒｅｖに相同な領域は、これらの毒性作用にを説明するＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６：２１７０−２１７９（１９９２）に報告された。
【０１０１】
本発明の方法に従って、宿主のプロセスを妨害する可能性の低い代替の配列を選択し得た。本発明によって、ＨＩＶ−ｒｅｖを以下のように抑制し得た。
【０１０２】
このタンパク質は、２つのエキソンによってコードされる：エキソン１、５４３９．．５５６８、７６塩基；およびエキソン２、７８８５．．８１８０、２９６塩基；合計１２４アミノ酸（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ３９１０６）。スプライス連結部（すなわち、正常なエキソン２の最初の塩基）とこのスプライス連結部の約３５〜４０塩基下流との間の領域に標的化されたアンチセンス、ＲＮＡｓｅＨ−インコンピテントオリゴマーは、プレ−ｍＲＮＡのスプライシングを妨害すると予想される。上記のようにスプライスされる場合、標的領域の５’末端は、好ましくはスプライス連結部の１〜約２５塩基下流である。このようなオリゴマーの一例は、配列５’−ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＴＡ ＡＧＧ ＧＴ−３’（配列番号４０）を有する、塩基対７８８５〜７９０４に標的化されたＰＭＯである。他の候補は、配列５’−ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＧＴ ＣＧＧ ＧＴＴ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＧＧ Ｔ−３’（配列番号４１：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３９１０６に与えられる配列の７８８５〜７９２１塩基に相補的）から選択された約１８〜２０の連続ヌクレオチドの長さを有するオリゴマーを含む。
【０１０３】
潜在的なスプライスアクセプターについで最も可能性の高い部位は、塩基７９７５であり、ここでＡＧ配列は、ＡＧから約１０塩基を超えて上流の複数のピリミジンに先行される。この潜在的スプライスアクセプターを使用する場合、９０塩基または３０アミノ酸の欠失が生じる。この欠失は、有効なウイルスｒｅｖ遺伝子機能を妨害する。
【０１０４】
（ＶＩ．スプライスアクセプター標的化の効果の分析）
スプライス改変体ｍＲＮＡの生成における、特定のアンチセンス配列の効果を、公知の分析方法によって決定し得る。例えば、コードされた全長タンパク質および短縮タンパク質または他の改変体タンパク質の存在または非存在を、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットのような標準的な技術によってモニターし得る。このタンパク質の特定の領域（すなわち、カルボキシ末端およびアミノ末端）を標的化した抗体もまた使用し得る。
【０１０５】
ｍＲＮＡ構造を、ミススプライシングを誘導したアンチセンスオリゴマーを評価するために分析し得る。核ＲＮＡの回収は、核がイントロン除去部位である場合に、イントロンを含むｈｎＲＮＡを観察するために必要である。核ＲＮＡの調製は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）または「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）のような本に記載される。ｈｎＲＮＡの分析を、ノーザンブロットまたはＳ１マッピングのいずれかによって最良に行う。特定のスプライス改変体成熟ｍＲＮＡの存在を、特定のスプライス改変体（または正常）プロセスｍＲＮＡに生じることが予測される配列を有する選択されたプライマー対を使用するＰＣＲ増幅を実行することによって決定し得る。１つのプライマーは、スプライス部位の上流のＳＤ（スプライスドナー）エキソン内に位置し、そして第二のプライマーは、スプライス部位の下流のＳＡ（スプライスアクセプター）エキソン内に位置する。このオリゴマーは、ＳＡ部位を妨害することから、下流のプライマーは、ＳＡスプライス部位から５０塩基を超えて下流であるべきである。エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルでのＰＣＲ反応物の分析は、オリゴマーによるＳＡ部位のブロックの証拠としての、未処理のコントロール細胞から観察されるバンドよりも小さいサイズの増幅されたバンドを明らかにする。
【０１０６】
（ＶＩＩ．本方法の利点）
本発明は、タンパク質発現の阻害または変更が、非ＲＮＡｓｅコンピテントオリゴマーを使用して、プレ−ｍＲＮＡのコード領域において、スプライスアクセプターの下流領域のアンチセンス標的化によって達成され得ることを実証する。本発明の組成物および方法は、アンチセンス阻害の先行技術の方法を超えるいくつかの利点を有する。ここで、この標的化アンチセンス化合物は、スプライスアクセプター配列にわたり、そしてこの配列にハイブリダイズする（例えば、Ｇｉｌｅｓ、上記で引用；ＫｏｌｅおよびＤｏｍｉｎｓｋｉ、米国特許第５，６６５，５９３号）。
【０１０７】
１つのこのような利点は、エキソン配列がイントロン配列よりも種の間ではるかに高度に保存されている傾向があることである。これは、動物モデルでこのような方法を試験する際に、より大きな予測性を可能にする。
【０１０８】
さらに、オリゴマーは、正確な部位（例えば、スプライスアクセプター連結部またはＡＵＧ開始コドン）に実際に結合するために必要でないため、、標的化のための配列を選択する際に、より大きな自由度が可能になる。従って、本発明は、アンチセンス適用において首尾よく標的化され得る配列の範囲を増大させる。このような自由度は、所望されない副作用（例えば、被験体における非標的タンパク質の不慮の標的化によって引き起こされる副作用）を回避する際に、または感染性因子（例えば、ウイルスまたは細菌）を攻撃する場合に宿主タンパク質を標的化する際に有利であり得る。これを、上記の実施例Ｆにおいて実証する。
【０１０９】
本発明の戦略において、スプライス連結部を直接標的化する方法とは対照的に、ＳＡ部位の下流のエキソンの種々の領域をブロックし得る。これは、正常なＳＡの下流の異なる潜在的なスプライス部位に直接スプライシングすることによって、異なる改変体タンパク質を生成する可能性を広げる。上記のように、特定の改変体タンパク質（例えば、ドミナントネガティブなタンパク質）は、独自の利点を有し得る。従って、アンチセンスを、他のタンパク質を超えて所望の改変体タンパク質を生じる、特定の潜在的なスプライス部位でのスプライシングを促進するために設計し得る。例えば、正常なＳＡ部位に近いより所望されない潜在的スプライス部位は、より下流の部位を好んで妨害し得る。
【０１１０】
設計の自由度のさらなる利点としては、合成の簡便性または増強された結合親和性が挙げられ得る。さらに、エキソン内の完全な標的化の本発明の戦略を使用して、標的ＲＮＡを、核または細胞質のいずれかにおいてアンチセンスオリゴマーによって同定し得、これは分析の目的のために有利であり得る。
【０１１１】
（ＶＩＩＩ．処置方法）
関連する局面において、本発明は、標的タンパク質の発現を阻害または変更することによって疾患状態を処置または予防する方法を含む。このような疾患状態としては、ウイルス感染、細菌感染または真菌感染、癌性腫瘍および細胞増殖によって特徴付けられる他の状態（例えば、再狭窄、過剰増殖性皮膚障害または炎症）が挙げられる。上記のように標的化されたタンパク質は、多くの癌遺伝子、レセプタータンパク質、マトリックスタンパク質、およびウイルスタンパク質を含む転写因子を含む。このようなタンパク質の阻害は、一般に、細胞周期、ウイルス複製、または他の重要な機能の破壊を生じる。
【０１１２】
この方法を、１２〜２５ヌクレオチド長かつ以下を有するアンチセンスオリゴマーを被験体に投与することによって実行する：（ｉ）標的タンパク質をコードする、選択された予めプロセスされたｍＲＮＡの標的領域に相補的な塩基配列であって、ここで、この標的領域の５’末端は、予めプロセスされたｍＲＮＡの正常なスプライスアクセプター部位の１〜２５塩基下流、そして好ましくは、２〜１５塩基下流である、塩基配列、ならびに（ｉｉ）非荷電モルホリノ骨格、好ましくは、図２Ｂ−Ｂに示すようなホスホロジアミデート骨格であって、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、上記で定義された通りである、骨格。好ましくは、この化合物はまた、化合物の溶解度を、好ましくは水性媒体中での２５〜５０ｍｇ／ｍｌの間またはこれより高い溶解度まで増強する部分を含む。一例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。
【０１１３】
一般に、この方法は、適切な薬学的キャリア中の、正常なスプライスアクセプター部位でのスプライシングを妨害するために有効な一定量のアンチセンス因子を被験体に投与し、従って、タンパク質の正常な発現を抑制する工程を包含する。好ましい実施形態において、この方法は、タンパク質のドミナントネガティブな改変体の発現を生じる。この方法の１つの局面において、この被験体はヒト被験体である。
【０１１４】
標的ｍＲＮＡへのアンチセンスオリゴマーの効果的な送達は、本方法の重要な局面である。ＰＭＯは、細胞に効果的に侵入することが示されている（例えば、Ｊ Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：６３〜７０、１９９７および同時係属中かつ共有に係る米国仮出願番号６０／１１７，８４６を参照のこと）。抗ウイルス処置における使用のために、送達の種々の全身的経路（経口および非経口経路（例えば、静脈内、皮下、腹腔内および筋内））ならびに吸入、経皮および局所的な送達を使用し得る。
【０１１５】
代表的には、アンチセンスオリゴマーの１以上の用量を、一般には約１〜２週間の期間の規則的な間隔で投与する。経口投与のための好ましい用量は、約１ｍｇオリゴマー／患者〜約２５ｍｇオリゴマー／患者（体重７０ｋｇに基づく）である。いくつかの場合において、２５ｍｇオリゴマー／患者より多い投与を必要とし得る。ＩＶ投与について、好ましい用量は、約０．５ｍｇオリゴマー／患者〜約１０ｍｇオリゴマー／患者（成人体重７０ｋｇに基づく）である。投薬量は、患者の年齢、健康、性別、サイズおよび体重、投与経路ならびに特定の疾患状態に関するオリゴヌクレオチド因子の効力のような要因によって異なる。感染性因子の処置のために、好ましい投薬量は、代表的には、約０．０１〜１μＭ、そしてより好ましくは約２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーの血中濃度を達成するために必要な投薬量である。この濃度は、種々の方法によって達成し得る；連続的なＩＶ注入による、約０．０５と約０．２ｍｇ／ｋｇ／時間の間の用量が、受容可能であることが見出された。より多いかまたは少ない量のオリゴヌクレオチドを、必要に応じて投与し得る。
【０１１６】
過剰増殖性皮膚障害の処置のために、局所的投与を示す。再狭窄の処置において、罹患した細胞（すなわち、動脈損傷の部位）へのアンチセンスオリゴマーの送達を、推奨する。当該分野で公知の送達方法（例えば、共有に係り、かつ同時係属中の米国仮出願番号０９／４９３，４２７に記載される方法）を使用して、患者の血管形成部位にオリゴマーを送達し得る。好ましくは、このオリゴマーを、血管形成手順と同時に送達する。成人について、推奨される投薬量は、１〜２５μｍｏｌ、好ましくは２〜１５μｍｏｌのアンチセンスオリゴマーの範囲である。処置されるべき組織の表面積に関して、有効用量は、代表的には１ｃｍ２の血管壁当たり３０〜３０００μｇのオリゴマー、そしてより好ましくは約３００〜１５００μｇ／ｃｍ２の範囲である。患者にまた、再狭窄をさらに阻害するために十分な投薬量レベルで、血管形成後に周期的にこの組成物を与え得る。
【０１１７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する有効なインビボ処置レジメンは、投与の頻度および経路、ならびに処置下の被験体の状態によって変化する。所与の経路のために最適な投薬量は、当該分野で公知の方法に従う慣用的な実験によって決定し得る。このようなインビボ治療を、一般に、処置される病気の特定の型に適切な試験によってモニターし、そして用量または処置レジメンにおける対応する調節を、最適な治療結果を達成するためになし得る。
【０１１８】
モルホリノオリゴマーの細胞への侵入およびその標的ＲＮＡ配列への結合を、同時係属中かつ共有に係る米国仮出願番号６０／１１７，８４６（これは、本明細書中で参考として援用される）に示される技術によって確認し得る。インビボで投与する場合、本明細書中に開示する型のモルホリノアンチセンス化合物を、アンチセンス化合物およびそのＲＮＡ相補体からなるヘテロ二重鎖形態で、受容する被験体の尿において検出し得る。これは、アンチセンス化合物が標的組織によって取り込まれ、そして医師が処置方法の有効性（例えば、尿中のヘテロ二重鎖の最大または最大に近いレベルを与える種々の様式の投与および投薬量の有効性）をモニターすることを可能にすることを検証する。
【０１１９】
（ＩＸ．処方物）
モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物を、任意の好都合な生理学的に受容可能なビヒクル中で投与し得る。標準的な薬学的に受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン、トリグリセリドエマルジョン）、湿潤剤、錠剤およびカプセルが挙げられる。適切な生理学的に受容可能なキャリアの選択は、選択された投与の様式に依存して変化することが理解される。
【０１２０】
一般に、活性な化合物に加えて、本発明の薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性な化合物の処理を容易にする、適切な賦形剤および補助剤を含み得る。適切な賦形剤としては、充填剤（例えば、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース調製物、リン酸カルシウム、ならびに結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン）が挙げられる。所望の場合、崩壊剤（例えば、上記のデンプンおよびカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩）を添加し得る。補助剤としては、流量調整剤ならびに潤滑剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、および／あるいはポリエチレングリコール）が挙げられる。
【０１２１】
経口投与のために、糖衣核に、胃液に対して耐性の適切な被覆を提供し得る。胃液に対して耐性な被覆を生成するために、適切なセルロース調製物（例えば、フタル酸アセチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルフタル酸セルロース）の溶液を使用する。濃縮糖溶液を使用し得、これは、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および／もしくは二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。
【０１２２】
経口的に使用され得る他の薬学的調製物としては、ゼラチンからなるプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、およびゼラチンからなる軟質密封カプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤が挙げられる。このプッシュフィットカプセルは、顆粒形態で活性な化合物を含み得、この活性な化合物を、充填剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）および／または潤滑剤（例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム）ならびに必要に応じて安定化剤と混合し得る。軟質カプセルにおいて、活性な化合物を、好ましくは適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール）中に溶解させるかまたは懸濁する。さらに、安定化剤を添加し得る。
【０１２３】
直腸的に使用し得る薬学的調製物としては、例えば、坐剤が挙げられ、これは、坐剤基材と活性な化合物との組み合わせからなる。適切な坐剤基材としては、天然もしくは合成のトリグリセリド、パラフィン炭化水素、ポリエチレングリコール、または高級アルカノールが挙げられる。さらに、活性な化合物と基材との組み合わせからなるゼラチン結腸カプセルを使用することが可能である。可能性のある基材材料としては、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素が挙げられる。
【０１２４】
非経口投与のための適切な液体処方物としては、水溶性形態または水分散性形態での活性な化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性な化合物の懸濁液を投与し得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストラン）を含み得る。この懸濁液はまた、安定化剤を含み得る。
【０１２５】
慣用的なキャリアとの投与に加えて、活性成分を、種々の特殊な送達技術によって投与し得る。例えば、本発明の化合物を、リポソーム中にカプセル化して投与し得る。（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０（１２）：１９８０−１９８９、１９９６；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２３：１１９、１９９４；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０巻、Ｎｏ．４、５５４−５８４頁、１９９０中のＵｈｌｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ」；Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２８７−３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７９中のＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、第１４章、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」を参照のこと）。この活性成分は、その溶解度に依存して、水相および脂質層の両方に存在し得るか、または一般にリポソーム懸濁液と呼ばれるものに存在し得る。この脂質層は一般に、リン脂質（例えば、レシチンもしくはスフィンゴミエリン）、ステロイド（例えば、コレステロール）、イオン性界面活性剤（例えば、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、もしくはホスファチジン酸）、および／または他の親水性材料を含む。リポソームの直径は、一般には約１５ｎｍ〜約５ミクロンの範囲である。
【０１２６】
ヒドロゲルをまた、アンチセンスオリゴマー投与のためのビヒクルとして、例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載のように使用し得る。あるいは、ミクロスフェアまたは微粒子にてオリゴヌクレオチドを投与し得る。（例えば、Ｗｕ ＧＹおよびＷｕ ＣＨ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２、このようなビヒクルは、局所的な投与のために、または再狭窄の処置において特に適切である。１９８７を参照のこと）。
【０１２７】
アンチセンスオリゴマーの経皮的送達を、局所的投与のために適合した薬学的に受容可能なキャリアの使用によって達成し得る。モルホリノオリゴマー送達の一例は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／４０８５４に記載される。他の徐放性組成物がまた、本出願の範囲内に意図される。これらは、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態で半透性ポリマー材料を含み得る。
【０１２８】
このような剤形を調製するための方法は公知であるかまたは当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５）を参照のこと。この薬学的調製物を、当業者に公知の手順に従って製造する。例えば、この薬学的調製物を、慣用的な混合、顆粒化、糖衣作製、可溶化または凍結乾燥手順によって作製し得る。使用されるプロセスは、最終的には、使用される活性成分の物理的特性に依存する。
【０１２９】
（材料および方法）
（オリゴマー）
ＰＭＯを、例えば、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：１８７−９５、１９９３；米国特許第５，１８５，４４４号（１９９７）に記載された方法によって、ＡＶＩ ＢｉｏＰｈａｒｍａで合成した。オリゴマーをイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、そして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および質量分析法によって純度を分析した。全長産物の量は、一般に＞９０％であった。使用前に、これらを、蒸留水を用いて濃縮ストック溶液として調製し、４℃で貯蔵した。
【０１３０】
（細胞培養）
細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得るか、または本研究室で誘導した。これらの細胞を、グルタミン（２ｍＭ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびハム栄養混合物Ｆ−１２の１：１の混合物中で培養した。透析したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＨｙｃｌｏｎｅ（Ｏｇｄｅｎ、ＵＴ）のいずれかから購入した。ＷＩ−３８細胞およびＨｅＬａ細胞を１０％血清中で培養し、そしてＮＲＫ細胞を４％血清中で培養した。
【０１３１】
（組換えプラスミドおよび細胞株）
ヒトｍｙｃゲノムクローンｐＨＳＲ−１は、Ｍ．ＢｉｓｈｏｐからＡＴＣＣへの寄託物であった。２．２キロベース（ｋｂ）の５’末端を、プライマー中に組み込まれた適切な制限部位を使用するＰＣＲによってルシフェラーゼベクターにクローニングするために適合させた（Ｓｃｈａｒｆ、１９９０）。このルシフェラーゼベクターを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）によって供給されたベクターから、昆虫ルシフェラーゼとのＮ末端融合タンパク質を可能にするために適合させた。プラスミドを、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎプロトコールおよびＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）からの試薬を使用して、ネオマイシン遺伝子／Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選択手順（Ｆ Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４、１９８１）を使用してＨｅＬ細胞に導入した。ウサギα−グロビン−ルシフェラーゼ構物を含む細胞株が記載される（Ｍ Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．６：１６９−７５、１９９６）。
【０１３２】
（［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイ）
細胞をトリプシン処理し、計数し、そして６ウェルの皿に、４００，０００細胞／２ｍｌ／ウェルでプレートした。２日目に、ＰＭＯアンチセンス因子を、所望の濃度まで添加し、そして細胞を、穏やかなかき集め動作を使用してラバーポリスマンに取り出してロードした（ＰＬ ＭｃＮｅｉｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９８：１５５６−６４、１９８４；Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、上記で引用）。細胞懸濁液を、形成された任意の塊を部分的に分解するために１回ピペッティングし、そして１ｍｌを、さらなる１ｍｌ／ウェルの新鮮な培地を含む２４ウェルの皿に移した。ＮＲＫ細胞について、４日目に１μＣｉの［３Ｈ］チミジン（ＤｕＰｏｎｔ、ＮＥＮ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）（ＮＥＴ−０２７）を各ウェルに添加して、そして６時間後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５％トリクロロ酢酸で沈殿させ、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、０．２Ｎ ＮａＯＨ／０．１％ ＳＤＳで可溶化し、そしてＤＮＡに取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターにおいて定量した。定量化手順は、取り込みのためのインキュベーション期間が１５時間であった点を除いて、ＷＩ−３８と同一であった。一般に、各因子または濃度を、二連でアッセイし、そして値を平均した。この二連は、通常は互いに１０％以内であった。
【０１３３】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ｍｙｃ−ルシフェラーゼＨｅＬａ細胞を、以下の変化を伴って、正常な繊維芽細胞に対するのと類似の様式で取り出してロードした。百万個の細胞を、６ウェルの皿にプレートし、そして２日目に２ｍｌの全容積を別の６ウェルの皿に移した。３０時間後、細胞を収集し、そして記載されるように（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら；１９９６；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７；上記で引用）ルシフェラーゼ光生成についてアッセイした。
【０１３４】
（細胞周期分析）
細胞を、フローサイトメトリーによって、細胞周期の段階について分析した。細胞を、記載のように取り出してロードし、そして２つのウェルを合わせて蛍光活性化細胞識別（ＦＡＣＳ）による分析のために十分な細胞を得るために、１０ｃｍの皿に再プレートした。２日後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、そして少なくとも２時間、冷８０％エタノール中に再懸濁した。固定工程の後、細胞を遠心分離によって収集し、そしてＤＮＡ蛍光色素ヨウ化プロピジウム（Ｔｅｌｆｏｒｄら、上記で引用）で染色した。エタノール処理したペレットを、１ｍｌの１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μｌ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム、１μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ中に再懸濁した。周囲温度での少なくとも１時間の後、細胞懸濁液を、４８８ｎｍの励起波長を用いて、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃ ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）を使用して分析した。データを、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）マルチサイクルプログラムソフトウェアを使用して分析した。
【０１３５】
（ｍＲＮＡ逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析）
ｍｙｃＲＮＡスプライシングに対するモルホリノオリゴマーの効果を試験するために、ＨｅＬａ細胞を、６ウェルの皿に、百万細胞／ウェルでプレートした。次の日、２０μＭの最終濃度でオリゴマーを培地に添加して、上記で詳述したように細胞中に取り出してロードした。２４時間後、ロードした細胞をトリプシン処理によって回収し、そしてＲＮＡを調製した。各サンプルのために２つのウェルを合わせた。細胞質（成熟）ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｃｈａｒｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）使用して、「ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ａｎｉｍａｌ
ｃｅｌｌｓ」のための指示に従って、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解手順によって細胞ペレットから抽出した。ＲＮＡを、３０μｌの水で溶出して、約１０〜２０μｇの収量を得た。
【０１３６】
６μｌのＲＮＡ（２〜３μｇ）を、１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）、各１ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸、０．７５μｇ ９−ｍｅｒのランダムプライマーおよび２５０Ｕのモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｍｕＬＶ）ＲＴ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を含む最終２０μｌの反応混合物中で逆転写した。酵素の添加後、反応物を２５℃で１０分間、次に４２℃で３０分間インキュベートし、そして９４℃で４分間ポリメラーゼを変性させた。
【０１３７】
エキソン１−エキソン２ＰＣＲを、２工程のネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ手順を使用して実行した。工程１のプライマーは、配列５’−ＣＧＧ ＧＣＡ
ＣＴＴ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＡＣ（配列番号５１）および５’−ＧＧＴ ＣＧＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＧＴ Ｔ（配列番号５２）を有した。１μｇの各プライマーを２０μｌのＲＴ反応物に添加し、そして容積を１×ＰＣＲ緩衝液で１００μｌに調節した。４単位のＡｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）Ｔａｑポリメラーゼを添加し、そして、９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、および７２℃で４０秒の工程を３０サイクル行った。工程２は、プライマー配列５’−ＣＴＣ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＡＧ ＡＣＧ ＣＴＧ Ｇ（配列番号５３）および５’−ＧＡＡ ＧＧＧ ＴＧＴ ＧＡＣ ＣＧＣ ＡＡＣ ＧＴＡ ＧＧＡ Ｇ（配列番号５４）を使用した。工程１の反応混合物（４μｌ）を、２００ｎＭの各三リン酸および１μｇの各プライマーと共に、９６μｌの１×ＰＣＲ緩衝液に添加した。工程２のＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒、６８℃で４０秒、および７４℃で３０秒の３０サイクルであった。次いで、アリコートを、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１３８】
【表４】
＊ネイティブ配列、非アンチセンス
Ｉ他に示さない限り、アンチセンス標的は、スプライスアクセプター（ＳＡ）連結部の下流（ｄｓ）である；ＳＤ＝スプライスドナー連結部
（配列表）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１７２５９７（Ｐ２０１１−１７２５９７Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１３１６６８（Ｐ２０１１−１３１６６８）
【出願日】平成２３年６月１３日（２０１１．６．１３）
【分割の表示】特願２００１−５８０３４７（Ｐ２００１−５８０３４７）の分割
【原出願日】平成１３年５月４日（２００１．５．４）
【出願人】（５０１２３７０３９）エイブイアイ バイオファーマ， インコーポレイテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３１６６８（Ｐ２０１１−１３１６６８）
【出願日】平成２３年６月１３日（２０１１．６．１３）
【分割の表示】特願２００１−５８０３４７（Ｐ２００１−５８０３４７）の分割
【原出願日】平成１３年５月４日（２００１．５．４）
【出願人】（５０１２３７０３９）エイブイアイ バイオファーマ， インコーポレイテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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