セイヨウワサビの検出方法
【課題】セイヨウワサビを高感度に検出する方法を提供する。
【解決手段】セイヨウワサビのミロシナーゼに共通な配列を同定し、その塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むプライマーセット又はプローブを作成した。前記プライマーを用い、ミロシナーゼの遺伝子を検出することにより、セイヨウワサビの高感度な検出方法を確立した。
【解決手段】セイヨウワサビのミロシナーゼに共通な配列を同定し、その塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むプライマーセット又はプローブを作成した。前記プライマーを用い、ミロシナーゼの遺伝子を検出することにより、セイヨウワサビの高感度な検出方法を確立した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セイヨウワサビ（学名Ａｒｏｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の検出用プライマー及びプローブ、並びにそれらを用いたセイヨウワサビの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セイヨウワサビは、ワサビダイコン又はホースラディッシュとも呼ばれ、ヨーロッパのフィンランド原産と言われているアブラナ科の多年草である。根は直根で黄白色の外観を呈しており、強い辛味と香気を有し、西洋料理の薬味として欠かせない。また、日本でも粉ワサビ及びチューブやパック入りの加工ワサビ製品は、辛味成分としてこのセイヨウワサビを含んでいるものが多い。
日本において栽培されているセイヨウワサビは、青芽及び赤芽の２つの品種に分類される。この２つの品種は形態的には非常に異なっており、まず出芽はその名前の通り、青芽が緑色、赤芽が淡赤色を呈している。また、外観においては、青芽は草丈が６０〜１３０ｃｍで、葉の形状が長楕円形で束生し、長柄を有している。一方、赤芽は、草丈が１００〜１５０ｃｍで、葉は縮葉がほとんどなく、強健粗剛である。更に、根部においては、青芽の根部はタコ足状になりやすく、側根の肥大が少なく棒状に生育する。一方、赤芽の根部は生育が旺盛で、伸長領域が広く、しかも深くなり、側根の肥大も旺盛である。また、その辛味に関与するシニグリン含量は、青芽が赤芽より優っている。
最近、セイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡが分離された（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０）。ミロシナーゼは西洋ナタネ、ホワイトマスタード、ダイコン、カラシナ、シロイヌナズナなどのアブラナ科の植物に存在し、それぞれ異なるミロシナーゼをもっており、ｃＤＮＡの解析からＭＡ、ＭＢ、ＭＣ、及びＴＧＧの４つのサブタイプに分けることができる。例えば、西洋ナタネは、ＭＡ、ＭＢ、及びＭＣの３種類のミロシナーゼの遺伝子をもっているおり、ＭＢはすべての生活環で発現しているが、ＭＡ及びＭＣは種子でわずかに発現していることが報告されている。今まで分離されたミロシナーゼ遺伝子の多くはＭＢに属するが、例えばハツカダイコンには、ＭＢタイプのミロシナーゼの中にも、ＲＭＢ１とＲＭＢ２の２種類のＭＢが存在することが報告されており、それらのアミノ酸レベルでの相同性は９３％である（非特許文献１）。このようにミロシナーゼ遺伝子は、種間で多様性があり、同じ種でも何種類かのミロシナーゼ遺伝子をもっている。セイヨウワサビは、少なくとも１種類のミロシナーゼを有しているが、ＭＡ、ＭＢ及びＭＣのように異なるタイプのミロシナーゼを有しているのか、またハツカダイコンのように同じタイプでも相同性の異なるミロシナーゼを持っているのか、更に、外観的に異なる青芽と赤芽の２品種が同じミロシナーゼを持っているかについては、明らかでなかった。
一方、市販されている加工ワサビ製品には、辛味成分としてワサビ、からし又はセイヨウワサビを含んでいるものが多い。加工食品は、農林物資の規格化及び品質表示の適正化に関する法律（ＪＡＳ法）により、原材料の表示が義務づけられているが、加工ワサビ製品中のセイヨウワサビの含有を確認するために、セイヨウワサビを特異的に且つ高感度に検出する方法の開発が望まれている。
【非特許文献１】「プラント・アンド・セル・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ ＆ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」（英国）２０００年、第４１巻、第１０号、ｐ．１１０２−１１０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、高感度で、且つ特異的なセイヨウワサビの検出方法を開発するために、鋭意研究を重ね、形態やその性質の異なる青芽及び赤芽の２品種のセイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡを単離し塩基配列を解析した。その結果、この２品種から得られたセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列は、ＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＴＧＧとはタイプの異なる１種類の塩基配列のみであった。すなわち、セイヨウワサビの青芽と赤芽の２品種は形態や性質は異なっているが、同一のミロシナーゼのみを発現していることを見出した。そして、このミロシナーゼをコードする塩基配列に基づいてプライマーを作成し、このプライマーを用いることにより、セイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を、高感度に、且つ特異的に検出する方法を見出した。
本発明はこのような知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、本発明は、（Ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）、又は配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）である第１プライマーと、（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセットに関する。
また、本発明は、（Ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）、又は配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）である第１プライマーと、
（Ｂ）配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（３ｂ）、又は配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセットに関する。
本発明によるセイヨウワサビの検出用プライマーセットの好ましい態様においては前記第１プライマーが、配列番号８又は配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、前記プライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法に関する。
【０００５】
また、本発明は、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブに関する。
また、本発明は、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブに関する。
更に、本発明は前記プローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法に関する。
本明細書では、プラス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるセンスプライマーを第１プライマーと称し、マイナス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるアンチセンスプライマーを第２プライマーと称することがある。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のプライマーセットはセイヨウワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするため、ポリメレース重合反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、ＰＣＲと称する）法により、セイヨウワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを特異的に検出することが可能である。また、本発明のプローブは、セイヨウワサビのｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、他のアブラナ科又はアブラナ科以外の植物のｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡにはハイブリダイズしないため、本発明のプローブを用いた検出方法により、セイヨウワサビのゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを特異的に検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列は１種類のみであり、セイヨウワサビには、青芽及び赤芽の２品種があるが、ともに同じタイプのミロシナーゼのみを有している。本発明のＤＮＡプライマーセット及びプローブは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列を設計の基礎としているが、配列番号３で表される塩基配列のすべての領域から設計されるプライマーやプローブが、セイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を特異的に検出するために有用である。このことは、後述の実施例に示したセイヨウワサビのミロシナーゼのｃＤＮＡの解析より明らかである。すなわち、本発明者はアブラナ科植物のすべてのミロシナーゼを取得可能なプライマーを用いて、青芽及び赤芽の２種のセイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡを取得し、青芽の６クローンと赤芽の７クローンについて、ミロシナーゼの一部のアミノ酸をコードする６６３ｂｐの塩基配列を決定した。その結果、青芽と赤芽から得られた１３クローンは、同一のミロシナーゼをコードする塩基配列のみを有していた。また、取得した１３クローンのｃＤＮＡの塩基配列間では若干の塩基の置換が見られたが、ｃＤＮＡのコンセンサスな塩基配列と他のアブラナ科植物のミロシナーゼをコードする塩基配列を比較したところ、最も相同性の高いシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ）のミロシナーゼ（ＴＧＧ３）をコードする塩基配列でも８０％程度であり、ミロシナーゼをコードする塩基配列は、他のアブラナ科の植物に見られるＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＴＧＧタイプのミロシナーゼと異なるタイプのミロシナーゼであったが、セイヨウワサビの品種間ではよく保存されていた。
【０００８】
更に、取得した６６３ｂｐのｃＤＮＡ配列は、セイヨウワサビのミロシナーゼとしてＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている１７９０ｂｐの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０）ともほぼ一致した。このため、本発明者が取得した６６３ｂｐ以外のミロシナーゼをコードする塩基配列も青芽及び赤芽のセイヨウワサビの品種間では保存されているが、他のアブラナ科植物の有するミロシナーゼをコードする塩基配列とは異なっていると考えられる。そのためセイヨウワサビをコードする塩基配列のすべての領域から設計されるプライマー及びプローブがセイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を特異的に検出するために有用である。
【０００９】
配列表の配列番号１で表される塩基配列は、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする１７９０ｂｐのｃＤＮＡの全長の塩基配列である。また配列番号２で表される塩基配列は、その相補鎖の塩基配列である。更に、配列番号３で表される塩基配列は、青芽と赤芽の２品種から取得したミロシナーゼをコードする６６３ｂｐのｃＤＮＡの塩基配列であり、配列番号４で表される塩基配列はその相補鎖の塩基配列である。配列番号３及び４で表される塩基配列は取得した１３クローンの塩基配列を示しているが、塩基の置換のある位置は混合塩基で示している。混合塩基の記載は、Ｙはチミン又はシトシンを示し、Ｍはアデニン又はシトシンを示し、Ｋはグアニン又はチミンを示し、Ｒはグアニン又はアデニンを示し、Ｓはグアニン又はシトシンを示し、Ｗはアデニン又はチミンを示す。これらの塩基配列から本発明のプライマー及びプローブを作成する場合、混合塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることにより、広い品種のセイヨウワサビを検出することが可能となり、検出感度や検出率が上昇すると考えられる。
【００１０】
本発明のプライマーセットは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡやｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ法により、特異的に検出するためのプライマーのセットであり、センスプライマー（フォワードプライマー）及びアンチセンスプライマー（リバースプライマー）からなる一対のプライマーのセットである。
【００１１】
本発明のプライマーセットの第１プライマーは、配列番号１若しくは配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）若しくは（３ａ）、又は配列番号１若しくは配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）若しくは（４ａ）である。また、第２プライマーは、配列番号２若しくは配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）若しくは（３ｂ）、又は配列番号２若しくは配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）若しくは（４ｂ）である。
【００１２】
本発明のプライマーセットの第１プライマーとして用いるプライマー（１ａ）は、配列番号１で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に第１プライマーとして用いるプライマー（３ａ）は、配列番号３で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。
【００１３】
プライマー（１ａ）においては、配列番号１で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。
【００１４】
プライマー（３ａ）においては、配列番号３で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号３で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（３ａ）の３’末端側は、配列番号３で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、配列番号３で表される塩基配列の３’末端に隣接する配列番号１の塩基配列を含むことができる。
【００１５】
本発明のプライマーセットの第１プライマーとしては、前記のプライマー（１ａ）、及びプライマー（３ａ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（２ａ）、及び前記プライマー（４ａ）を用いることができる。これらのプライマー（２ａ）及びプライマー（４ａ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。
【００１６】
本発明のプライマーセットの第２プライマーとして用いるプライマー（１ｂ）は、配列番号２で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に第１プライマーとして用いるプライマー（３ｂ）は、配列番号４で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。これらの第２プライマーは、１５〜３５塩基を含むことができる。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。
【００１７】
プライマー（１ｂ）においては、配列番号２で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号２で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。
【００１８】
プライマー（３ｂ）においては、配列番号４で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号４で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（３ｂ）の３’末端側は、配列番号４で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、配列番号４で表される塩基配列の３’末端に隣接する配列番号３の塩基配列を含むことができる。
【００１９】
本発明のプライマーセットの第２プライマーとしては、前記のプライマー（１ｂ）、及びプライマー（３ｂ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（２ｂ）、及び前記プライマー（４ｂ）を用いることができる。これらのプライマー（２ｂ）及びプライマー（４ｂ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。
【００２０】
本発明のプライマーセットの第１プライマー及び各第２プライマーの長さは、特に限定されないが、それぞれ１５ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであること好ましく、より好ましくは２０ｍｅｒ〜３５ｍｅｒ、最も好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。
【００２１】
また、配列番号３及び４に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプライマーは、これらの混合塩基を含むディジェネレイテッドプライマーでもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一の配列からなるプライマーでもよい。
【００２２】
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプライマーセットのＤＮＡプライマーのＴｍは、６０〜６８、好ましくは、６５〜６８であることが望ましい。なお、前記Ｔｍを計算する方法は、いくつかの方法が提案されているが、１８ヌクレオチド以上の鎖長である場合、例えば、下記の式（Ｉ）：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ） （Ｉ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により求められる。この式で［Ｎａ＋］＝５０ｍＭで計算すると、１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］は、およそ２１．５９７０９８となりＴｍ値を計算することができる。また、鎖長が１８ヌクレオチドより短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
【００２３】
前記第１プライマー及び第２プライマーは公知の任意の態様で修飾（例えばビオチン化又は発光物質によるラベル化）されていてもよい。例えば、各塩基がビオチン化又は発光物質により標識されていてもよい。また、５’末端が公知の任意の態様で修飾されていてもよい。例えば、標識したプライマーを用いることにより、ＴａｑＭａｎ法などのリアルタイムＰＣＲによる遺伝子の定量を行なうことが可能となる。本発明による前記の第１プライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイド法）によって調製することができる。
【００２４】
本明細書で「ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することができる」とは、第１プライマーと第２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを含む混合液に、セイヨウワサビのミロシナーゼの遺伝子を加え、通常の条件でＤＮＡ増幅工程を行った場合に、ＰＣＲ産物が得られることを意味する。そのため、前記第１プライマーと第２プライマーの組み合わせは、セイヨウワサビのミロシナーゼを特異的に検出可能な組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは第１プライマーが、配列番号８又は９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第２プライマーが配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。また、第１プライマー及び第２プライマーは、１種のプライマーを用いてもよいし、２種以上のプライマー、例えば、プライマー（１ａ）及びプライマー（２ａ）を組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
本発明のプローブは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをハイブリダイズの原理を用いた方法で検出するためのオリゴヌクレオチドである。本発明のプローブには、ＰＣＲに用いる前記第１プライマー及び第２プライマーも含まれる。更に、ＤＮＡプローブのみではなくＲＮＡプローブも含まれる。ＲＮＡプローブの場合は、オリゴヌクレオチドのチミンの代わりにウラシルが含まれる。
【００２６】
本発明のプローブは、（Ａ）配列番号１〜４で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基、最も好ましくは２０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、プローブＡと称する）であるか、又は（Ｂ）前記配列番号１〜４で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、より好ましくは１５ヌクレオチド部分、最も好ましくは２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、プローブＢと称する）である。
【００２７】
本発明のプローブＡは、１０塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションができず、特異性が低くなるためプローブとして有用でない。それぞれのプローブは、少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むため、例えば、その配列番号で表される塩基配列から選択される任意の連続する１０塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることができる。更に、それぞれのプローブは、それぞれの配列番号で表される塩基配列以外に５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列に由来しない塩基配列）が付加されたオリゴヌクレオチドであってもよい。付加される塩基配列は、例えば、タグとして検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列でもよい。また、配列番号１〜４に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプローブは、これらの混合塩基を含むプローブの混合物でもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一のプローブでもよい。
【００２８】
本発明のプローブＢは、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドを含む。１０ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プローブとして機能しなくなるからである。
【００２９】
本発明のプローブの長さの上限はプローブとして機能する長さであれば特に制限されないが、一般的には５００ｍｅｒ以下、より好ましくは３００ｍｅｒ以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが使用される。長いプローブの場合は、セイヨウワサビ以外のミロシナーゼとハイブリダイズする塩基配列を含むこともあるが、ハイブリダイズの条件を厳しくすることによって特異性を挙げることができるため、問題はない。
【００３０】
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプローブのＴｍは、３００〜６８、好ましくは、４５〜６８、より好ましくは、６０〜６８であることが望ましい。
【００３１】
本発明のプローブの標識は特に限定されず、公知の方法で標識することができる。プローブの標識物質としては、従来公知の任意の物質、例えば３２Ｐなどの放射性物質、好ましくは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を用いることができる。この標識物質から信号を発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来公知の任意の方法を用いる。
【００３２】
本発明によるセイヨウワサビの検出方法は、例えば、セイヨウワサビの植物体の品種を同定する方法、及びセイヨウワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法を意味する。セイヨウワサビ（学名Ａｒｏｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の品種としては、例えば、青芽及び赤芽を挙げることができる。
【００３３】
セイヨウワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法は、例えば、セイヨウワサビの根茎をすりつぶした部分を含む加工食品、例えば、練りワサビや粉ワサビの原料にセイヨウワサビが含まれているか否かを検出することができる。
【００３４】
本発明のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法（以下、プライマーセット検出方法と称することがある）によって、セイヨウワサビのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。
【００３５】
本発明のプローブと被検試料を接触させ、プローブに担持した標識からの信号を検出することを特徴とするセイヨウワサビの検出方法（以下、プローブ検出方法と称することがある）により、セイヨウワサビのｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。
【００３６】
本発明の前記プライマーセット検出方法及びプローブ検出方法で用いる「被検試料」は、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードしている塩基配列からなる遺伝子を含有している可能性のあるものであれば特に限定されない。ここで遺伝子とは、特に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ等を挙げることができる。そのため、具体的には「被検試料」はセイヨウワサビの入っている可能性のある加工食品、例えば、ねりワサビ、粉ワサビなどがある。このような加工食品を液状にしたものや、加工食品から核酸を抽出した核酸溶液も含まれる。また、セイヨウワサビの品種を確認する場合は、植物体を構成する細胞を含む分散液や、細胞から抽出した核酸を含む溶液も被検試料となる。
【００３７】
公知の方法によりＤＮＡやＲＮＡを抽出し、被検試料として用いることが可能である。例えばゲノムＤＮＡを抽出する方法は、公知のＤＮＡ抽出法を適用することができ、たとえばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法などが挙げられる。また、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを用いることも可能である。また、ｍＲＮＡを抽出する場合も、公知の方法でＲＮＡを抽出することが可能であり、例えば、塩酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法やＡＧＰＣ変法、或いはＲＮＡが結合するカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出用キットなどを用いることが可能である。
【００３８】
ｍＲＮＡは、プローブと直接ハイブリダイズさせて検出する場合は、ｍＲＮＡのまま使用することが可能である。一方、プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼと被検試料を混合し、ＰＣＲ法により検出する場合は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しなければならない。ｃＤＮＡ合成は、公知の方法を利用することが可能であり、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版［ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行，（２００１）］等に記載の逆転写酵素を用いる逆転写反応により実施できる。逆転写酵素としては、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ又はＡＭＶリバーストランスクリプターゼ等を用いることが可能である。ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーは、ミロシナーゼに特異的なアンチセンスプライマー、例えば、前記第２プライマーを用いることも可能であるし、６ｍｅｒ〜９ｍｅｒのランダムプライマ−を用いてｃＤＮＡを合成することも可能である。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりミロシナーゼをコードする遺伝子配列を検出することができる。
【００３９】
プライマーセットを用いる本発明のプライマーセット検出方法は、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検出工程とからなる。プライマーセット検出方法においては、最初にＤＮＡ増幅工程を行うことが好ましい。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣＲ法を用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１プライマー及び第２プライマーとともに、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に９５℃までの温度で活性を維持することができるＤＮＡポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程では、前記のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被検試料を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実施することができる範囲で容易に決定することができる。この混合液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム）を含有することができる。
【００４０】
プライマーセット検出方法では、前記の混合液を用いてＰＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、例えば（ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃、約１０秒〜２分間）、（ii）１本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃、約３０秒〜３分間）、及び（iii）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃、約３０秒〜５分間）とからなる。
【００４１】
ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を利用する方法、電気泳動後にフィルターに移してサザンブロットハイブリッド法を行う方法、増幅したＤＮＡをそのままフィルターにブロットしてドットブロットハイブリッド法を行う方法、又は、ジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用し、分子量により目的のＰＣＲ産物を検出することができる。
【００４２】
ＰＣＲを行った後に、サザンブロットハイブリッド法、ドットブロットハイブリッド法等でＰＣＲ産物を検出する場合には、プライマーに用いた以外のセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列からなる非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は、化学発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）を用いることができる。
【００４３】
本発明のプローブ検出法は、プローブと被検試料を接触させプローブからの信号を検出することにより、セイヨウワサビの検出を行う。公知の方法で抽出したＤＮＡやＲＮＡを被検試料として、ノザンブロットハイブリダイゼーションやサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、ミロシナーゼをコードするｍＲＮＡやＤＮＡの存在を解析することができる。また本発明のプローブは、慣用のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いることも可能である。
【００４４】
本発明のプローブと、セイヨウワサビの植物体、及びその類縁種の染色体とのハイブリダイゼーション条件は、前記「ストリンジェントな条件」が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件が挙げられる。
【００４５】
また、前記ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃低い温度、好ましくは、２２℃低い温度、より好ましくは、２０℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、６０℃以上、好ましくは、６２℃以上、より好ましくは、６５℃以上等の条件下でのハイブリダイゼーションを行い、より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、１×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃低い温度、より好ましくは、３０℃低い温度、さらに好ましくは、２５℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３０℃以上、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の条件下での洗浄等を行うことができる。
【００４６】
本発明のプライマーセット及びプローブを含むセイヨウワサビを検出するための試薬及びキットを調製することも可能である。前記試薬やキットは、本発明のプライマーセット検出方法やプローブ検出方法により、セイヨウワサビを検出することが可能である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４８】
《遺伝子取得例１：セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするｃＤＮＡの単離》
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成
合成ＤＮＡ機モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いホスホアミダイト法により、
配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマー、
ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＴＲ ＹＭＲ ＡＡＹ ＴＣＲ ＴＡＲ ＴＴＲ ＴＣＮ ＣＣ−３’、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマー、
ＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＡＹ ＴＡＹ ＴＡＹ ＧＴＮ ＡＣＮ ＣＡＲ ＴＡＹ ＧＣ−３’、及び配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー、
ＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＹ ＡＴＨ ＧＴＮ ＧＣＮ ＣＡＹ ＡＡＹ ＣＡ−３’
を合成した。これらのプライマーは、アブラナ科のミロシナーゼに共通の塩基配列を有するプライマーであり、新規のミロシナーゼを取得することが可能である。混合塩基の記載は、Ｙはチミン又はシトシンを示し、Ｍはアデニン又はシトシンを示し、Ｒはグアニン又はアデニンを示し、Ｈはアデニン、シトシン又はチミン、Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンを示す。
【００４９】
（２）ＲＮＡの抽出
セイヨウワサビの２つの品種である青芽及び赤芽からＲＮＡを抽出した。−８０℃に保存されていた茎サンプル１ｇを液体窒素中で粉砕し、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡは、ジエチルピロカーボネイト（ＤＥＰＣ）処理した蒸留水５０μＬに溶解した。
【００５０】
（３）ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲによる増幅
抽出したＲＮＡから、前記ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせ又はＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔを用いてメーカーのプロトコールに従ってｃＤＮＡ合成及びＰＣＲを行なった。逆転写反応は、オリゴｄＴプライマーを用い、３０℃で１０分保持し、その後６０℃で３０分保持することによって行なった。そして９９℃で５分処理することによって、逆転写酵素を不活化した。逆転写反応終了後の反応液にＰＣＲ試薬を加え、９４℃で２分保持した後に、ＤＮＡ変性９４℃で３０秒、アニーリング４５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で３０秒、伸張反応７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行なった。
【００５１】
（４）ＲＴ−ＰＣＲ産物の解析
得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。赤芽のＲＮＡから、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、アニーリング温度が４５℃、５０℃、５５℃の場合に、約４２０ｂｐバンドが確認でき、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするｃＤＮＡのＰＣＲ産物と考えられた。またＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせは、すべてのアニーリング温度において、予想される約７６０ｂｐのＰＣＲ産物が確認できた。一方、青芽のＲＮＡから、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせでは、ＰＣＲ産物が確認できなかったが、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、アニーリング温度が４５℃の場合のみにおいて、予想される約７６０ｂｐのＰＣＲ産物が確認できた。そのため、青芽及び赤芽のセイヨウワサビからＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで得られた約７６０ｂｐのＰＣＲ産物を以下のクローニング及び塩基配列の決定に用いた。
【００５２】
（５）クローニングベクターによるクローニングと塩基配列の決定
ＰＣＲ産物から余ったプライマーを除去し、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、メーカーのプロトコールに従い、プラスミドに導入した。形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドをプラスミド精製キットＡｕｒｕｍ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用い、メーカーのプロトコールに従い精製した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラスミドＤＮＡを選択した。
精製したプラスミドＤＮＡはＤＮＡをＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｙ５．５Ｄｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いメーカーのプロトコールに従って反応させた。この反応産物をＬｏｎｇ−Ｒｅａｄ ＴｏｗｅｒＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで解析し、塩基配列を決定した。
【００５３】
（６）配列の比較
青芽から得られた６クローンの塩基配列及び赤芽から得られた７クローンの６６３ｂｐの塩基配列を比較したところ、クローン間で若干の塩基の置換は見られたが、品種にかかわらず高い相同性を示した。すべてのクローンの塩基配列を配列番号３に示している。クローンによって塩基の置換がある塩基は混合塩基で示しているが、１３クローンのうち６クローンは１００％一致した。得られたコンセンサスな塩基配列を他のアブラナ科の植物であるワサビ、ダイコン、アラビドプシスのミロシナーゼをコードする塩基配列と比較したところ、最も相同性が高いシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ）のミロシナーゼ（ＴＧＧ３）をコードする塩基配列でも８０％程度であった。そのため、決定した６６３ｂｐの塩基配列はセイヨウワサビのミロシナーゼに特異的な配列である。また、得られた塩基配列をＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする全長のｍＲＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０と比較したところ、非常に高い相同性を示した。このため、本発明者が取得した６６３ｂｐ以外のミロシナーゼをコードする塩基配列も青芽及び赤芽のセイヨウワサビの品種間では保存されているが、他のアブラナ科植物の有するミロシナーゼをコードする塩基配列とは異なっていると考えられた。
【００５４】
《実施例１：セイヨウワサビのミロシナーゼのゲノムＤＮＡの検出》
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成
合成ＤＮＡ機モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いホスホアミダイト法により、
Ｓｅｉｗａｓａ１；５’−ＧＴＡ ＴＧＴ ＣＴＡ ＣＧＣ ＣＡＴ ＴＣＣ−３’（配列番号８）、
Ｓｅｉｗａｓａ２；５’−ＧＡＡ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＡＴ Ｇ−３’（配列番号９）、及び
Ｓｅｉｗａｓａ３；５’−ＴＣＡ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣ−３’、
（配列番号１０）を合成した。
【００５５】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
セイヨウワサビの２品種の青芽及び赤芽、他のアブラナ科の植物であるワサビ、及びカイワレダイコン並びにアブラナ科以外の植物であるホウレンソウ及びトウミョウからゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、それぞれの植物体を、葉、茎、及び根茎に分離し、液体窒素で凍結し、−７０℃に保存した。保存したサンプルを液体窒素中で粉砕し、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、キットのプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、滅菌蒸留水５０μＬに溶解した。
【００５６】
（３）ＰＣＲによる増幅
ゲノムＤＮＡ溶解液１０μＬ（１μｇ）に１０×ＰＣＲ緩衝液５μＬ、第１プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、及び第２プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ（ニッポンジーン社）０．５μＬを加え滅菌蒸留水で５０μＬにした。第１プライマーとしてＳｅｉｗａｓａ１、第２プライマーとしてＳｅｉｗａｓａ３の組み合わせ（Ｓｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセット）で反応液を作成した。この反応液を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＴＰ６００（ＴＡＫＡＲＡ）にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイルはＤＮＡ変性９４℃で２分保持し、ＤＮＡ変性９４℃で３０秒、アニーリング６１℃で３０秒、伸張反応７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返した。３０サイクル終了後７２℃で１．５分間保持し、４℃に冷却した。
【００５７】
（４）ＰＣＲ産物の解析
ＰＣＲ反応終了した溶液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。図２に示すように、Ｓｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットを用いた場合、セイヨウワサビの２種類の品種から抽出したＤＮＡからＰＣＲ産物を確認することができた。一方、ワサビ、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウから抽出したＤＮＡを用いた場合は、ＰＣＲ産物を確認することはできなかった。更に、青芽又は赤芽のゲノムＤＮＡからＳｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットで増幅されたＰＣＲ産物を２０倍希釈し、Ｓｅｉｗａｓａ２−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットによってＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を増幅することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のプライマーセット及びプローブを用いたセイヨウワサビの検出方法は、加工ワサビ食品にセイヨウワサビの含有の有無を高感度に検出することが可能である。またセイヨウワサビの品種の同定に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】セイヨウワサビの赤芽及び青芽からミロシナーゼのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲで取得した電気泳動像である。Ｍｙｒ１／Ｍｙｒ２は、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒとＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせを、Ｍｙｒ１／Ｍｙｒ３はＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒとＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせを示している。４５℃、５０℃、５５℃、及び６０℃は、ＰＣＲのアニーリング温度を示している。ＭはＤＮＡマーカー（Ａｌｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｈｉ−ＬｏＴＭ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ５０ｂｐ−１０，０００ｂｐ：株式会社アベテック）を表している。
【図２】ＰＣＲによる、西洋ワサビ赤芽、西洋ワサビ青芽、ワサビ、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウのゲノムＤＮＡからミロシナーゼ遺伝子を検出したアガロース電気泳動像である。ＭＭはＤＮＡマーカー（Ａｌｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｈｉ−ＬｏＴＭ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ５０ｂｐ−１０，０００ｂｐ：株式会社アベテック）を表している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セイヨウワサビ（学名Ａｒｏｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の検出用プライマー及びプローブ、並びにそれらを用いたセイヨウワサビの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セイヨウワサビは、ワサビダイコン又はホースラディッシュとも呼ばれ、ヨーロッパのフィンランド原産と言われているアブラナ科の多年草である。根は直根で黄白色の外観を呈しており、強い辛味と香気を有し、西洋料理の薬味として欠かせない。また、日本でも粉ワサビ及びチューブやパック入りの加工ワサビ製品は、辛味成分としてこのセイヨウワサビを含んでいるものが多い。
日本において栽培されているセイヨウワサビは、青芽及び赤芽の２つの品種に分類される。この２つの品種は形態的には非常に異なっており、まず出芽はその名前の通り、青芽が緑色、赤芽が淡赤色を呈している。また、外観においては、青芽は草丈が６０〜１３０ｃｍで、葉の形状が長楕円形で束生し、長柄を有している。一方、赤芽は、草丈が１００〜１５０ｃｍで、葉は縮葉がほとんどなく、強健粗剛である。更に、根部においては、青芽の根部はタコ足状になりやすく、側根の肥大が少なく棒状に生育する。一方、赤芽の根部は生育が旺盛で、伸長領域が広く、しかも深くなり、側根の肥大も旺盛である。また、その辛味に関与するシニグリン含量は、青芽が赤芽より優っている。
最近、セイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡが分離された（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０）。ミロシナーゼは西洋ナタネ、ホワイトマスタード、ダイコン、カラシナ、シロイヌナズナなどのアブラナ科の植物に存在し、それぞれ異なるミロシナーゼをもっており、ｃＤＮＡの解析からＭＡ、ＭＢ、ＭＣ、及びＴＧＧの４つのサブタイプに分けることができる。例えば、西洋ナタネは、ＭＡ、ＭＢ、及びＭＣの３種類のミロシナーゼの遺伝子をもっているおり、ＭＢはすべての生活環で発現しているが、ＭＡ及びＭＣは種子でわずかに発現していることが報告されている。今まで分離されたミロシナーゼ遺伝子の多くはＭＢに属するが、例えばハツカダイコンには、ＭＢタイプのミロシナーゼの中にも、ＲＭＢ１とＲＭＢ２の２種類のＭＢが存在することが報告されており、それらのアミノ酸レベルでの相同性は９３％である（非特許文献１）。このようにミロシナーゼ遺伝子は、種間で多様性があり、同じ種でも何種類かのミロシナーゼ遺伝子をもっている。セイヨウワサビは、少なくとも１種類のミロシナーゼを有しているが、ＭＡ、ＭＢ及びＭＣのように異なるタイプのミロシナーゼを有しているのか、またハツカダイコンのように同じタイプでも相同性の異なるミロシナーゼを持っているのか、更に、外観的に異なる青芽と赤芽の２品種が同じミロシナーゼを持っているかについては、明らかでなかった。
一方、市販されている加工ワサビ製品には、辛味成分としてワサビ、からし又はセイヨウワサビを含んでいるものが多い。加工食品は、農林物資の規格化及び品質表示の適正化に関する法律（ＪＡＳ法）により、原材料の表示が義務づけられているが、加工ワサビ製品中のセイヨウワサビの含有を確認するために、セイヨウワサビを特異的に且つ高感度に検出する方法の開発が望まれている。
【非特許文献１】「プラント・アンド・セル・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ ＆ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」（英国）２０００年、第４１巻、第１０号、ｐ．１１０２−１１０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、高感度で、且つ特異的なセイヨウワサビの検出方法を開発するために、鋭意研究を重ね、形態やその性質の異なる青芽及び赤芽の２品種のセイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡを単離し塩基配列を解析した。その結果、この２品種から得られたセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列は、ＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＴＧＧとはタイプの異なる１種類の塩基配列のみであった。すなわち、セイヨウワサビの青芽と赤芽の２品種は形態や性質は異なっているが、同一のミロシナーゼのみを発現していることを見出した。そして、このミロシナーゼをコードする塩基配列に基づいてプライマーを作成し、このプライマーを用いることにより、セイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を、高感度に、且つ特異的に検出する方法を見出した。
本発明はこのような知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、本発明は、（Ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）、又は配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）である第１プライマーと、（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセットに関する。
また、本発明は、（Ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）、又は配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）である第１プライマーと、
（Ｂ）配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（３ｂ）、又は配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセットに関する。
本発明によるセイヨウワサビの検出用プライマーセットの好ましい態様においては前記第１プライマーが、配列番号８又は配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
また、本発明は、前記プライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法に関する。
【０００５】
また、本発明は、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブに関する。
また、本発明は、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブに関する。
更に、本発明は前記プローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法に関する。
本明細書では、プラス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるセンスプライマーを第１プライマーと称し、マイナス鎖のＤＮＡに対するプライマーであるアンチセンスプライマーを第２プライマーと称することがある。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のプライマーセットはセイヨウワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするため、ポリメレース重合反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、ＰＣＲと称する）法により、セイヨウワサビのｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを特異的に検出することが可能である。また、本発明のプローブは、セイヨウワサビのｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、他のアブラナ科又はアブラナ科以外の植物のｍＲＮＡ及びゲノムＤＮＡにはハイブリダイズしないため、本発明のプローブを用いた検出方法により、セイヨウワサビのゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡを特異的に検出することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列は１種類のみであり、セイヨウワサビには、青芽及び赤芽の２品種があるが、ともに同じタイプのミロシナーゼのみを有している。本発明のＤＮＡプライマーセット及びプローブは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列を設計の基礎としているが、配列番号３で表される塩基配列のすべての領域から設計されるプライマーやプローブが、セイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を特異的に検出するために有用である。このことは、後述の実施例に示したセイヨウワサビのミロシナーゼのｃＤＮＡの解析より明らかである。すなわち、本発明者はアブラナ科植物のすべてのミロシナーゼを取得可能なプライマーを用いて、青芽及び赤芽の２種のセイヨウワサビからミロシナーゼのｃＤＮＡを取得し、青芽の６クローンと赤芽の７クローンについて、ミロシナーゼの一部のアミノ酸をコードする６６３ｂｐの塩基配列を決定した。その結果、青芽と赤芽から得られた１３クローンは、同一のミロシナーゼをコードする塩基配列のみを有していた。また、取得した１３クローンのｃＤＮＡの塩基配列間では若干の塩基の置換が見られたが、ｃＤＮＡのコンセンサスな塩基配列と他のアブラナ科植物のミロシナーゼをコードする塩基配列を比較したところ、最も相同性の高いシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ）のミロシナーゼ（ＴＧＧ３）をコードする塩基配列でも８０％程度であり、ミロシナーゼをコードする塩基配列は、他のアブラナ科の植物に見られるＭＡ、ＭＢ、ＭＣ及びＴＧＧタイプのミロシナーゼと異なるタイプのミロシナーゼであったが、セイヨウワサビの品種間ではよく保存されていた。
【０００８】
更に、取得した６６３ｂｐのｃＤＮＡ配列は、セイヨウワサビのミロシナーゼとしてＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている１７９０ｂｐの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０）ともほぼ一致した。このため、本発明者が取得した６６３ｂｐ以外のミロシナーゼをコードする塩基配列も青芽及び赤芽のセイヨウワサビの品種間では保存されているが、他のアブラナ科植物の有するミロシナーゼをコードする塩基配列とは異なっていると考えられる。そのためセイヨウワサビをコードする塩基配列のすべての領域から設計されるプライマー及びプローブがセイヨウワサビのミロシナーゼ遺伝子を特異的に検出するために有用である。
【０００９】
配列表の配列番号１で表される塩基配列は、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする１７９０ｂｐのｃＤＮＡの全長の塩基配列である。また配列番号２で表される塩基配列は、その相補鎖の塩基配列である。更に、配列番号３で表される塩基配列は、青芽と赤芽の２品種から取得したミロシナーゼをコードする６６３ｂｐのｃＤＮＡの塩基配列であり、配列番号４で表される塩基配列はその相補鎖の塩基配列である。配列番号３及び４で表される塩基配列は取得した１３クローンの塩基配列を示しているが、塩基の置換のある位置は混合塩基で示している。混合塩基の記載は、Ｙはチミン又はシトシンを示し、Ｍはアデニン又はシトシンを示し、Ｋはグアニン又はチミンを示し、Ｒはグアニン又はアデニンを示し、Ｓはグアニン又はシトシンを示し、Ｗはアデニン又はチミンを示す。これらの塩基配列から本発明のプライマー及びプローブを作成する場合、混合塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いることにより、広い品種のセイヨウワサビを検出することが可能となり、検出感度や検出率が上昇すると考えられる。
【００１０】
本発明のプライマーセットは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡやｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ法により、特異的に検出するためのプライマーのセットであり、センスプライマー（フォワードプライマー）及びアンチセンスプライマー（リバースプライマー）からなる一対のプライマーのセットである。
【００１１】
本発明のプライマーセットの第１プライマーは、配列番号１若しくは配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）若しくは（３ａ）、又は配列番号１若しくは配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）若しくは（４ａ）である。また、第２プライマーは、配列番号２若しくは配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）若しくは（３ｂ）、又は配列番号２若しくは配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）若しくは（４ｂ）である。
【００１２】
本発明のプライマーセットの第１プライマーとして用いるプライマー（１ａ）は、配列番号１で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に第１プライマーとして用いるプライマー（３ａ）は、配列番号３で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。
【００１３】
プライマー（１ａ）においては、配列番号１で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。
【００１４】
プライマー（３ａ）においては、配列番号３で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号３で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（３ａ）の３’末端側は、配列番号３で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、配列番号３で表される塩基配列の３’末端に隣接する配列番号１の塩基配列を含むことができる。
【００１５】
本発明のプライマーセットの第１プライマーとしては、前記のプライマー（１ａ）、及びプライマー（３ａ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（２ａ）、及び前記プライマー（４ａ）を用いることができる。これらのプライマー（２ａ）及びプライマー（４ａ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。
【００１６】
本発明のプライマーセットの第２プライマーとして用いるプライマー（１ｂ）は、配列番号２で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。同様に第１プライマーとして用いるプライマー（３ｂ）は、配列番号４で表される塩基配列に含まれる連続する１５塩基又はそれ以上を含む。これらの第２プライマーは、１５〜３５塩基を含むことができる。１５塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、プライマーとハイブリダイズするＤＮＡとの特異性が低下し、プライマーとして有用でないからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。
【００１７】
プライマー（１ｂ）においては、配列番号２で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号２で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。
【００１８】
プライマー（３ｂ）においては、配列番号４で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列以外に、５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号４で表される塩基配列に由来しない塩基配列）を含むことができる。例えば、プライマー（３ｂ）の３’末端側は、配列番号４で表される塩基配列に由来する連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるか、あるいは、配列番号４で表される塩基配列の３’末端に隣接する配列番号３の塩基配列を含むことができる。
【００１９】
本発明のプライマーセットの第２プライマーとしては、前記のプライマー（１ｂ）、及びプライマー（３ｂ）だけではなく、それらの変異体に相当する前記プライマー（２ｂ）、及び前記プライマー（４ｂ）を用いることができる。これらのプライマー（２ｂ）及びプライマー（４ｂ）は、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは２０ヌクレオチドの部分を含んでいる。１５ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合は、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プライマーとして十分機能しなくなるからである。一方、プライマーの長さの上限はＰＣＲプライマーとして機能する長さであれば特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、最も好ましくは３０塩基以下である。
【００２０】
本発明のプライマーセットの第１プライマー及び各第２プライマーの長さは、特に限定されないが、それぞれ１５ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであること好ましく、より好ましくは２０ｍｅｒ〜３５ｍｅｒ、最も好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。
【００２１】
また、配列番号３及び４に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプライマーは、これらの混合塩基を含むディジェネレイテッドプライマーでもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一の配列からなるプライマーでもよい。
【００２２】
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプライマーセットのＤＮＡプライマーのＴｍは、６０〜６８、好ましくは、６５〜６８であることが望ましい。なお、前記Ｔｍを計算する方法は、いくつかの方法が提案されているが、１８ヌクレオチド以上の鎖長である場合、例えば、下記の式（Ｉ）：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ） （Ｉ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブプライマー中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）により求められる。この式で［Ｎａ＋］＝５０ｍＭで計算すると、１６．６ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］は、およそ２１．５９７０９８となりＴｍ値を計算することができる。また、鎖長が１８ヌクレオチドより短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
【００２３】
前記第１プライマー及び第２プライマーは公知の任意の態様で修飾（例えばビオチン化又は発光物質によるラベル化）されていてもよい。例えば、各塩基がビオチン化又は発光物質により標識されていてもよい。また、５’末端が公知の任意の態様で修飾されていてもよい。例えば、標識したプライマーを用いることにより、ＴａｑＭａｎ法などのリアルタイムＰＣＲによる遺伝子の定量を行なうことが可能となる。本発明による前記の第１プライマー及び第２プライマーは、通常のＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミダイド法）によって調製することができる。
【００２４】
本明細書で「ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することができる」とは、第１プライマーと第２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを含む混合液に、セイヨウワサビのミロシナーゼの遺伝子を加え、通常の条件でＤＮＡ増幅工程を行った場合に、ＰＣＲ産物が得られることを意味する。そのため、前記第１プライマーと第２プライマーの組み合わせは、セイヨウワサビのミロシナーゼを特異的に検出可能な組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは第１プライマーが、配列番号８又は９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第２プライマーが配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。また、第１プライマー及び第２プライマーは、１種のプライマーを用いてもよいし、２種以上のプライマー、例えば、プライマー（１ａ）及びプライマー（２ａ）を組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
本発明のプローブは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをハイブリダイズの原理を用いた方法で検出するためのオリゴヌクレオチドである。本発明のプローブには、ＰＣＲに用いる前記第１プライマー及び第２プライマーも含まれる。更に、ＤＮＡプローブのみではなくＲＮＡプローブも含まれる。ＲＮＡプローブの場合は、オリゴヌクレオチドのチミンの代わりにウラシルが含まれる。
【００２６】
本発明のプローブは、（Ａ）配列番号１〜４で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列において、連続する少なくとも１０塩基、より好ましくは１５塩基、最も好ましくは２０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、プローブＡと称する）であるか、又は（Ｂ）前記配列番号１〜４で表される塩基配列のいずれか１つの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、より好ましくは１５ヌクレオチド部分、最も好ましくは２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド（以下、プローブＢと称する）である。
【００２７】
本発明のプローブＡは、１０塩基未満の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションができず、特異性が低くなるためプローブとして有用でない。それぞれのプローブは、少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むため、例えば、その配列番号で表される塩基配列から選択される任意の連続する１０塩基以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることができる。更に、それぞれのプローブは、それぞれの配列番号で表される塩基配列以外に５’側及び／又は３’側に任意の塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列に由来しない塩基配列）が付加されたオリゴヌクレオチドであってもよい。付加される塩基配列は、例えば、タグとして検出用オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列でもよい。また、配列番号１〜４に記載された塩基配列には、Ｙ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、及びＷの混合塩基が含まれている。これは、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードする遺伝子に置換が存在することを示しているが、本発明のプローブは、これらの混合塩基を含むプローブの混合物でもよいし、いずれかの塩基のみを含む単一のプローブでもよい。
【００２８】
本発明のプローブＢは、それぞれの配列番号で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドを含む。１０ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチド部分しか含まない場合、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズしない可能性が高く、プローブとして機能しなくなるからである。
【００２９】
本発明のプローブの長さの上限はプローブとして機能する長さであれば特に制限されないが、一般的には５００ｍｅｒ以下、より好ましくは３００ｍｅｒ以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが使用される。長いプローブの場合は、セイヨウワサビ以外のミロシナーゼとハイブリダイズする塩基配列を含むこともあるが、ハイブリダイズの条件を厳しくすることによって特異性を挙げることができるため、問題はない。
【００３０】
前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件等が挙げられる。本発明のプローブのＴｍは、３００〜６８、好ましくは、４５〜６８、より好ましくは、６０〜６８であることが望ましい。
【００３１】
本発明のプローブの標識は特に限定されず、公知の方法で標識することができる。プローブの標識物質としては、従来公知の任意の物質、例えば３２Ｐなどの放射性物質、好ましくは非放射性物質（酵素、蛍光色素、発光物質、ビオチン等）を用いることができる。この標識物質から信号を発生させ、更にその信号を測定する方法も、従来公知の任意の方法を用いる。
【００３２】
本発明によるセイヨウワサビの検出方法は、例えば、セイヨウワサビの植物体の品種を同定する方法、及びセイヨウワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法を意味する。セイヨウワサビ（学名Ａｒｏｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の品種としては、例えば、青芽及び赤芽を挙げることができる。
【００３３】
セイヨウワサビの植物体由来部分の存在の有無を検出する方法は、例えば、セイヨウワサビの根茎をすりつぶした部分を含む加工食品、例えば、練りワサビや粉ワサビの原料にセイヨウワサビが含まれているか否かを検出することができる。
【００３４】
本発明のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法（以下、プライマーセット検出方法と称することがある）によって、セイヨウワサビのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。
【００３５】
本発明のプローブと被検試料を接触させ、プローブに担持した標識からの信号を検出することを特徴とするセイヨウワサビの検出方法（以下、プローブ検出方法と称することがある）により、セイヨウワサビのｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡを検出することが可能である。
【００３６】
本発明の前記プライマーセット検出方法及びプローブ検出方法で用いる「被検試料」は、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードしている塩基配列からなる遺伝子を含有している可能性のあるものであれば特に限定されない。ここで遺伝子とは、特に限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ等を挙げることができる。そのため、具体的には「被検試料」はセイヨウワサビの入っている可能性のある加工食品、例えば、ねりワサビ、粉ワサビなどがある。このような加工食品を液状にしたものや、加工食品から核酸を抽出した核酸溶液も含まれる。また、セイヨウワサビの品種を確認する場合は、植物体を構成する細胞を含む分散液や、細胞から抽出した核酸を含む溶液も被検試料となる。
【００３７】
公知の方法によりＤＮＡやＲＮＡを抽出し、被検試料として用いることが可能である。例えばゲノムＤＮＡを抽出する方法は、公知のＤＮＡ抽出法を適用することができ、たとえばフェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法などが挙げられる。また、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットを用いることも可能である。また、ｍＲＮＡを抽出する場合も、公知の方法でＲＮＡを抽出することが可能であり、例えば、塩酸グアニジンフェノールクロロホルム（ＡＧＰＣ）法やＡＧＰＣ変法、或いはＲＮＡが結合するカラムを用いた市販のＲＮＡ抽出用キットなどを用いることが可能である。
【００３８】
ｍＲＮＡは、プローブと直接ハイブリダイズさせて検出する場合は、ｍＲＮＡのまま使用することが可能である。一方、プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼと被検試料を混合し、ＰＣＲ法により検出する場合は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しなければならない。ｃＤＮＡ合成は、公知の方法を利用することが可能であり、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版［ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行，（２００１）］等に記載の逆転写酵素を用いる逆転写反応により実施できる。逆転写酵素としては、ＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ又はＡＭＶリバーストランスクリプターゼ等を用いることが可能である。ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーは、ミロシナーゼに特異的なアンチセンスプライマー、例えば、前記第２プライマーを用いることも可能であるし、６ｍｅｒ〜９ｍｅｒのランダムプライマ−を用いてｃＤＮＡを合成することも可能である。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりミロシナーゼをコードする遺伝子配列を検出することができる。
【００３９】
プライマーセットを用いる本発明のプライマーセット検出方法は、（１）ＤＮＡ増幅工程と、（２）ＤＮＡ検出工程とからなる。プライマーセット検出方法においては、最初にＤＮＡ増幅工程を行うことが好ましい。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、ＰＣＲ法を用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１プライマー及び第２プライマーとともに、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に９５℃までの温度で活性を維持することができるＤＮＡポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用いることができる。本発明のＤＮＡ増幅工程では、前記のプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被検試料を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅工程を実施することができる範囲で容易に決定することができる。この混合液は場合により、緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、ゼラチン）、又は塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム）を含有することができる。
【００４０】
プライマーセット検出方法では、前記の混合液を用いてＰＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、例えば（ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９５℃、約１０秒〜２分間）、（ii）１本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃、約３０秒〜３分間）、及び（iii）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃、約３０秒〜５分間）とからなる。
【００４１】
ＤＮＡ検査工程としては、ゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を利用する方法、電気泳動後にフィルターに移してサザンブロットハイブリッド法を行う方法、増幅したＤＮＡをそのままフィルターにブロットしてドットブロットハイブリッド法を行う方法、又は、ジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることができる。ゲル電気泳動法を行う場合には、例えば、アガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、又はアクリルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用し、分子量により目的のＰＣＲ産物を検出することができる。
【００４２】
ＰＣＲを行った後に、サザンブロットハイブリッド法、ドットブロットハイブリッド法等でＰＣＲ産物を検出する場合には、プライマーに用いた以外のセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする塩基配列からなる非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオチン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は、化学発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）を用いることができる。
【００４３】
本発明のプローブ検出法は、プローブと被検試料を接触させプローブからの信号を検出することにより、セイヨウワサビの検出を行う。公知の方法で抽出したＤＮＡやＲＮＡを被検試料として、ノザンブロットハイブリダイゼーションやサザンブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、ミロシナーゼをコードするｍＲＮＡやＤＮＡの存在を解析することができる。また本発明のプローブは、慣用のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いることも可能である。
【００４４】
本発明のプローブと、セイヨウワサビの植物体、及びその類縁種の染色体とのハイブリダイゼーション条件は、前記「ストリンジェントな条件」が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件が挙げられる。
【００４５】
また、前記ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃低い温度、好ましくは、２２℃低い温度、より好ましくは、２０℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、６０℃以上、好ましくは、６２℃以上、より好ましくは、６５℃以上等の条件下でのハイブリダイゼーションを行い、より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、１×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃低い温度、より好ましくは、３０℃低い温度、さらに好ましくは、２５℃低い温度、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３０℃以上、３７℃以上、４２℃以上、４５℃以上等の条件下での洗浄等を行うことができる。
【００４６】
本発明のプライマーセット及びプローブを含むセイヨウワサビを検出するための試薬及びキットを調製することも可能である。前記試薬やキットは、本発明のプライマーセット検出方法やプローブ検出方法により、セイヨウワサビを検出することが可能である。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４８】
《遺伝子取得例１：セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするｃＤＮＡの単離》
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成
合成ＤＮＡ機モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いホスホアミダイト法により、
配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマー、
ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＴＲ ＹＭＲ ＡＡＹ ＴＣＲ ＴＡＲ ＴＴＲ ＴＣＮ ＣＣ−３’、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドセンスプライマー、
ＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＡＹ ＴＡＹ ＴＡＹ ＧＴＮ ＡＣＮ ＣＡＲ ＴＡＹ ＧＣ−３’、及び配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー、
ＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＹ ＡＴＨ ＧＴＮ ＧＣＮ ＣＡＹ ＡＡＹ ＣＡ−３’
を合成した。これらのプライマーは、アブラナ科のミロシナーゼに共通の塩基配列を有するプライマーであり、新規のミロシナーゼを取得することが可能である。混合塩基の記載は、Ｙはチミン又はシトシンを示し、Ｍはアデニン又はシトシンを示し、Ｒはグアニン又はアデニンを示し、Ｈはアデニン、シトシン又はチミン、Ｎは、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンを示す。
【００４９】
（２）ＲＮＡの抽出
セイヨウワサビの２つの品種である青芽及び赤芽からＲＮＡを抽出した。−８０℃に保存されていた茎サンプル１ｇを液体窒素中で粉砕し、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡは、ジエチルピロカーボネイト（ＤＥＰＣ）処理した蒸留水５０μＬに溶解した。
【００５０】
（３）ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲによる増幅
抽出したＲＮＡから、前記ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせ又はＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔを用いてメーカーのプロトコールに従ってｃＤＮＡ合成及びＰＣＲを行なった。逆転写反応は、オリゴｄＴプライマーを用い、３０℃で１０分保持し、その後６０℃で３０分保持することによって行なった。そして９９℃で５分処理することによって、逆転写酵素を不活化した。逆転写反応終了後の反応液にＰＣＲ試薬を加え、９４℃で２分保持した後に、ＤＮＡ変性９４℃で３０秒、アニーリング４５℃、５０℃、５５℃又は６０℃で３０秒、伸張反応７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返すことによってＰＣＲ反応を行なった。
【００５１】
（４）ＲＴ−ＰＣＲ産物の解析
得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。赤芽のＲＮＡから、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、アニーリング温度が４５℃、５０℃、５５℃の場合に、約４２０ｂｐバンドが確認でき、セイヨウワサビのミロシナーゼをコードするｃＤＮＡのＰＣＲ産物と考えられた。またＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせは、すべてのアニーリング温度において、予想される約７６０ｂｐのＰＣＲ産物が確認できた。一方、青芽のＲＮＡから、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせでは、ＰＣＲ産物が確認できなかったが、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで、アニーリング温度が４５℃の場合のみにおいて、予想される約７６０ｂｐのＰＣＲ産物が確認できた。そのため、青芽及び赤芽のセイヨウワサビからＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒ及びＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせで得られた約７６０ｂｐのＰＣＲ産物を以下のクローニング及び塩基配列の決定に用いた。
【００５２】
（５）クローニングベクターによるクローニングと塩基配列の決定
ＰＣＲ産物から余ったプライマーを除去し、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、メーカーのプロトコールに従い、プラスミドに導入した。形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドをプラスミド精製キットＡｕｒｕｍ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用い、メーカーのプロトコールに従い精製した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断し、目的の長さのフラグメントを含んだプラスミドＤＮＡを選択した。
精製したプラスミドＤＮＡはＤＮＡをＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｙ５．５Ｄｙｅ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いメーカーのプロトコールに従って反応させた。この反応産物をＬｏｎｇ−Ｒｅａｄ ＴｏｗｅｒＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで解析し、塩基配列を決定した。
【００５３】
（６）配列の比較
青芽から得られた６クローンの塩基配列及び赤芽から得られた７クローンの６６３ｂｐの塩基配列を比較したところ、クローン間で若干の塩基の置換は見られたが、品種にかかわらず高い相同性を示した。すべてのクローンの塩基配列を配列番号３に示している。クローンによって塩基の置換がある塩基は混合塩基で示しているが、１３クローンのうち６クローンは１００％一致した。得られたコンセンサスな塩基配列を他のアブラナ科の植物であるワサビ、ダイコン、アラビドプシスのミロシナーゼをコードする塩基配列と比較したところ、最も相同性が高いシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｉｓ）のミロシナーゼ（ＴＧＧ３）をコードする塩基配列でも８０％程度であった。そのため、決定した６６３ｂｐの塩基配列はセイヨウワサビのミロシナーゼに特異的な配列である。また、得られた塩基配列をＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているセイヨウワサビのミロシナーゼをコードする全長のｍＲＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８２２７１０と比較したところ、非常に高い相同性を示した。このため、本発明者が取得した６６３ｂｐ以外のミロシナーゼをコードする塩基配列も青芽及び赤芽のセイヨウワサビの品種間では保存されているが、他のアブラナ科植物の有するミロシナーゼをコードする塩基配列とは異なっていると考えられた。
【００５４】
《実施例１：セイヨウワサビのミロシナーゼのゲノムＤＮＡの検出》
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの合成
合成ＤＮＡ機モデル３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社）を用いホスホアミダイト法により、
Ｓｅｉｗａｓａ１；５’−ＧＴＡ ＴＧＴ ＣＴＡ ＣＧＣ ＣＡＴ ＴＣＣ−３’（配列番号８）、
Ｓｅｉｗａｓａ２；５’−ＧＡＡ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＡＴ Ｇ−３’（配列番号９）、及び
Ｓｅｉｗａｓａ３；５’−ＴＣＡ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣ−３’、
（配列番号１０）を合成した。
【００５５】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出
セイヨウワサビの２品種の青芽及び赤芽、他のアブラナ科の植物であるワサビ、及びカイワレダイコン並びにアブラナ科以外の植物であるホウレンソウ及びトウミョウからゲノムＤＮＡを抽出した。具体的には、それぞれの植物体を、葉、茎、及び根茎に分離し、液体窒素で凍結し、−７０℃に保存した。保存したサンプルを液体窒素中で粉砕し、Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、キットのプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡは、滅菌蒸留水５０μＬに溶解した。
【００５６】
（３）ＰＣＲによる増幅
ゲノムＤＮＡ溶解液１０μＬ（１μｇ）に１０×ＰＣＲ緩衝液５μＬ、第１プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、及び第２プライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ）０．２μＬ、Ｇｅｎｅ Ｔａｑ（ニッポンジーン社）０．５μＬを加え滅菌蒸留水で５０μＬにした。第１プライマーとしてＳｅｉｗａｓａ１、第２プライマーとしてＳｅｉｗａｓａ３の組み合わせ（Ｓｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセット）で反応液を作成した。この反応液を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＴＰ６００（ＴＡＫＡＲＡ）にセットし、ＰＣＲ反応を行った。反応のプロファイルはＤＮＡ変性９４℃で２分保持し、ＤＮＡ変性９４℃で３０秒、アニーリング６１℃で３０秒、伸張反応７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返した。３０サイクル終了後７２℃で１．５分間保持し、４℃に冷却した。
【００５７】
（４）ＰＣＲ産物の解析
ＰＣＲ反応終了した溶液を１．５％アガロースゲルで電気泳動した。図２に示すように、Ｓｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットを用いた場合、セイヨウワサビの２種類の品種から抽出したＤＮＡからＰＣＲ産物を確認することができた。一方、ワサビ、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウから抽出したＤＮＡを用いた場合は、ＰＣＲ産物を確認することはできなかった。更に、青芽又は赤芽のゲノムＤＮＡからＳｅｉｗａｓａ１−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットで増幅されたＰＣＲ産物を２０倍希釈し、Ｓｅｉｗａｓａ２−Ｓｅｉｗａｓａ３プライマーセットによってＰＣＲを行い、特異的なＰＣＲ産物を増幅することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のプライマーセット及びプローブを用いたセイヨウワサビの検出方法は、加工ワサビ食品にセイヨウワサビの含有の有無を高感度に検出することが可能である。またセイヨウワサビの品種の同定に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】セイヨウワサビの赤芽及び青芽からミロシナーゼのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲで取得した電気泳動像である。Ｍｙｒ１／Ｍｙｒ２は、ＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒとＭＹＲ２ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせを、Ｍｙｒ１／Ｍｙｒ３はＭＹＲ１ ｐｒｉｍｅｒとＭＹＲ３ ｐｒｉｍｅｒの組み合わせを示している。４５℃、５０℃、５５℃、及び６０℃は、ＰＣＲのアニーリング温度を示している。ＭはＤＮＡマーカー（Ａｌｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｈｉ−ＬｏＴＭ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ５０ｂｐ−１０，０００ｂｐ：株式会社アベテック）を表している。
【図２】ＰＣＲによる、西洋ワサビ赤芽、西洋ワサビ青芽、ワサビ、カイワレダイコン、ホウレンソウ、及びトウミョウのゲノムＤＮＡからミロシナーゼ遺伝子を検出したアガロース電気泳動像である。ＭＭはＤＮＡマーカー（Ａｌｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｈｉ−ＬｏＴＭ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ５０ｂｐ−１０，０００ｂｐ：株式会社アベテック）を表している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）、又は配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）である第１プライマーと、
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセット。
【請求項２】
（Ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）、又は配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）である第１プライマーと、
（Ｂ）配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（３ｂ）、又は配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセット。
【請求項３】
前記第１プライマーが、配列番号８又は配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法。
【請求項５】
配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブ。
【請求項６】
配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブ。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のプローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とするセイヨウワサビの検出方法。
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（１ａ）、又は配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ａ）である第１プライマーと、
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（１ｂ）、又は配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（２ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセット。
【請求項２】
（Ａ）配列番号３で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（３ａ）、又は配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ａ）である第１プライマーと、
（Ｂ）配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー（３ｂ）、又は配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分を含むＤＮＡプライマー（４ｂ）である第２プライマーとの組み合わせからなり、ポリメレース重合反応用のプライマーとして機能することのできる、セイヨウワサビ検出用プライマーセット。
【請求項３】
前記第１プライマーが、配列番号８又は配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第２プライマーが、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセット、被検試料及びＤＮＡポリメラーゼを含む混合液を用いてＤＮＡ増幅工程を行い、得られた反応液のＤＮＡ検査工程を行うことを特徴とする、セイヨウワサビの検出方法。
【請求項５】
配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブ。
【請求項６】
配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分、又は配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分、を含むオリゴヌクレオチドに標識を担持することを特徴とするセイヨウワサビ検出用プローブ。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のプローブと被検試料を接触させ、前記標識からの信号を検出することを特徴とするセイヨウワサビの検出方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２１５５１０（Ｐ２００７−２１５５１０Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４１５３０（Ｐ２００６−４１５３０）
【出願日】平成１８年２月１７日（２００６．２．１７）
【出願人】（０００１１６２９７）ヱスビー食品株式会社 (40)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１７日（２００６．２．１７）
【出願人】（０００１１６２９７）ヱスビー食品株式会社 (40)
【Ｆターム（参考）】
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