セネデスムス属に属する微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、および該微細藻類から採取した油分
【課題】炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能の高い微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法の提供。
【解決手段】（１）セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類、（２）（１）記載の微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、（３）（２）記載の油分の製造方法によって製造された油分、（４）（１）記載の微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、（５）（１）記載の微細藻類から得られる燃料、（６）（１）記載の微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法。
【解決手段】（１）セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類、（２）（１）記載の微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、（３）（２）記載の油分の製造方法によって製造された油分、（４）（１）記載の微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、（５）（１）記載の微細藻類から得られる燃料、（６）（１）記載の微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、および該微細藻類から採取した油分に関する。より詳細には、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料と呼称される重質油系または軽質油系の炭化水素を、微細藻類の培養によって製造する方法がいくつか報告されている。
重質油系炭化水素の産生能を有する藻類としては、炭素数３６の炭化水素の産生能をもつ微細藻類ボツリオコッカス ブラウニー（非特許文献１参照。）や炭素数３３の炭化水素の産生能をもつ微細藻類ボツリオコッカス・ブラウニーＡレース（特許文献１参照。）が知られる。
また、軽質油系炭化水素の産生能を有する藻類としては、炭素数１７の炭化水素の産生能をもつ微細藻類Ｎｏｓｔｏｃ ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈａｅｕｍ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ ｔｅｒｅｂｒａｎｓ等（非特許文献１参照。）、炭素数１９の炭化水素の産生能をもつ微細藻類Ｃｏｃｃｏｃｈｌｏｒｉｓ ｅｌａｂｅｎｓ等（非特許文献１参照。）、炭素数１７、１８、１９、および２０の炭化水素の産生能をもつ微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア ＭＢＩＣ１１２０４株（特許文献２参照。）、炭素数１７、１９、２１、および２３の炭化水素の産生能をもつ微細藻類コリシスチス マイナー ＳＡＧ１７．９８株（特許文献２参照。）が知られる。
【０００３】
微細藻類の産生しうる軽質油系炭化水素はディーゼル燃料として産業上有用であり、地球温暖化防止を志向したカーボンニュートラルな燃料としても期待されている。
しかしながら、前記微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体において、軽質油系炭化水素の含有率は通常０．０２５〜０．１２質量％程度であり（非特許文献１参照。）、その炭化水素産生能は必ずしも十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２３４０５５号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１０９５８８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒ．Ｒａｊａ，Ｓ．Ｈｅｍａｉｓｗａｒｙａ，Ｎ．Ａｓｈｏｋ Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｓｒｉｄｈａｒ ａｎｄ Ｒ．Ｒｅｎｇａｓａｍｙ（２００８） Ａ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３４：７７−８８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能の高い微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明は次の構成を採用した。
請求項１記載の発明は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類である。
請求項２記載の発明は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有する微細藻類セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属 ルベッセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）種である。
請求項３記載の発明は、微細藻類セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属 ルベッセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）種 ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９）である。
請求項４記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法である。
請求項５記載の発明は、前記油分が炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むことを特徴とする請求項４記載の油分の製造方法である。
請求項６記載の発明は、請求項４記載の油分の製造方法によって製造された油分。
請求項７記載の発明は、前記油分が炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むことを特徴とする請求項６記載の油分である。
請求項８記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体である。
請求項９記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類から得られる燃料である。
請求項１０記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法である。
【０００８】
なお、本特許請求の範囲および明細書中において、「炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有する」とは、主に炭素数１４、１６、２０、および２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するという意である。また、「油分」とは、疎水性有機化合物からなる液体成分をいう。該疎水性有機化合物としては、脂肪族炭化水素、中性脂肪等が挙げられる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能の高い微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の１８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を使用して得られた分子系統樹を示す図である。
【図２】ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の増殖曲線である。
【図３】ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の海水成分濃度を変化させた培養における増殖曲線である。
【図４】ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の栄養制限培養における増殖曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳しく説明する。
＜セネデスムス属に属する微細藻類＞
本発明におけるセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するものである。
該微細藻類としては、微細藻類セネデスムス属 ルベッセンス種（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）が好ましく、特に、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の藻体中における含有率が高く、容易に培養できる観点から、微細藻類セネデスムス属 ルベッセンス種（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ） ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９）（以下、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株と略称する。）がより好ましい。
【００１２】
ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、発明者が汽水域の海水から単離した緑藻綱クロロコッカム目セネデスムス属ルベッセンス種に属する海洋微細藻類の新規株である。
以下に、該微細藻類の単離方法および該微細藻類のＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を新規株と判定するに至った経緯を説明する。
【００１３】
（単離方法）
ビタミン等を含む栄養塩類｛硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミン（Ｂ１２）０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．０１４ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ｝、および人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）３７ｇ／ｌを蒸留水に上記所定の濃度で溶解した液体培地を作製した。また、ビタミン等を含む栄養塩類および人工海水を前記液体培地と同一の組成で含み、さらに寒天を１．２％（ｗ／ｖ）の濃度となるように添加した寒天培地を作成した。
前記液体培地２ｍｌを含む２４穴のマイクロタイタープレートに、２００２年１１月福岡県遠賀郡芦屋町遠賀川河口干潟より採取した砂を適量添加した。つづいて、１０００ルクス（ｌｘ）の光照射下で静置培養を行い、微細藻類の生育が確認できたウェル中の培養液の一部を分取した。その分取した培養液を前記寒天培地上に接種して、前記光照射条件下で培養することによって、緑色の単細胞藻類ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株が、単菌化（単離）された微細藻類のコロニーとして得られた。
【００１４】
（形態学的性質）
前記寒天培地上で、２５℃、１４日間培養した結果、直径２．０〜５．０ｍｍ程度の緑色のＪＰＣＣ ＧＡ００２４株のコロニーが得られた。コロニーの形状は点状で、隆起の無い半レンズ状であった。周縁は全縁であり、表面はスムーズな形状であった。また、変異によるコロニーの形態の変化は見られず、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化も見られなかった。培養日数が延びるとともにコロニー色が緑色から茶色へと変化することが確認された。
前記コロニー中の海洋微細藻類は、大きさが平均して１０〜２０μｍ程度、中には１００μｍを超す細胞もある緑色の単細胞藻類で、群体を形成せず、栄養細胞には点眼や収縮胞は無く、細胞形は円形であった。浮遊性は無く、細胞表面は滑らかである。栄養細胞は鞭毛を持たず運動性を示さない。また外囲を細胞壁で囲まれ、内部に核が１個、葉緑体が複数存在し、その他ミトコンドリア、ゴルジ体、液胞、油滴等が観察される。葉緑体内にピレノイドが確認される。
【００１５】
（生殖様式）
ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、内細胞を形成せず、２分裂による増殖を行なう。
【００１６】
（生理学・生化学的性状）
・ 培養液：海水を基調とする公知の培養液中で生育する。淡水では極度に生育が鈍い。
・ 光合成：光合成による光独立栄養生育ができる。従属栄養生育は確認されない。
・ 含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、およびその他カロテノイド色素類
・ 貯蔵物質：デンプン、および炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含む油分
・ 生育温度：２０℃〜３５℃（至適温度２５℃）
・ 生育ｐＨ：７．０〜９．０（至適ｐＨ８．０）
・ 細胞内にＮｉｌｅ ｒｅｄで染色される油分を蓄積する。
【００１７】
Ｎｉｌｅ ｒｅｄ染色したＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を蛍光顕微鏡で観察すると、蛍光視野中の藻体において、明るい蛍光発色の領域としてＮｉｌｅ ｒｅｄで発色した油分の存在が確認される。該油分は藻体細胞内の広い領域に蓄積されうる。また、該油分は炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含む。
【００１８】
前述の形態学的性質、生殖様式、および生理学・生化学的性状の点からＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、既存の緑藻網クロロコッカム目に属する藻類であると推定された。さらに、従来公知の方法に従って、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡブロードミニキット５０（株式会社キアゲン社製）を用いて、該ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により、１８Ｓ ｒＤＮＡの領域を増幅させてシークエンス解析を行い、１８Ｓ ｒＤＮＡ領域の塩基配列を決定した。得られた１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。得られた１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を公共のデータベースである日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）と照合して相同性を検索（Ｂｌａｓｔ検索）し、解析ソフトＣｌｕｓｔａｌＷおよび表示ソフトＴｒｅｅｖｉｅｗを用いて系統解析を行なった。その結果得られた系統図を図１に示す。
【００１９】
単離したＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、前記系統樹において、クロロコッカム目に分類され、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ種とクラスターを形成した。ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ種との細胞形態も類似していることから、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株はセネデスムス属ルベッセンス種（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）の藻類であると判断された。
また、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は藻体中に炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含む油分を蓄積しうる。さらに、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体における該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の含有率は、０．６質量％以上に達しうる。
一方、セネデスムス属ルベッセンス種において、該脂肪族炭化水素を含む油分を蓄積する株は、今日まで知られていない。
したがって、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、セネデスムス属ルベッセンス種の新規株であると判断された。
【００２０】
前記ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許微生物寄託センターに寄託された。
【００２１】
＜油分の製造方法＞
本発明における油分の製造方法は、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類を培養する工程を有するものである。本発明にかかる微細藻類を培養し、当該培養工程によって生育させた当該微細藻類を培地中から回収し、得られた微細藻類中に含まれる油分を採取することによって、当該油分を製造することができる。
【００２２】
当該セネデスムス属に属する微細藻類としては、微細藻類セネデスムス属ルベッセンス種が好ましく、特に、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の藻体中における含有率が高く、容易に培養できる観点から、微細藻類セネデスムス属ルベッセンス種ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株がより好ましい。
【００２３】
当該微細藻類を培養する工程としては、セネデスムス属に属する微細藻類を培養できる公知の方法が適用できる。例えば、液体培地を入れた偏平フラスコ等の培養容器に該微細藻類を接種して、藻体が沈殿しない程度に緩やかに攪拌しながら光照射下で通気培養すればよい。
【００２４】
前記液体培地としては当該微細藻類を培養できる液体培地であれば特に制限されず、公知のものが使用できる。例えば、前述のＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を単離する際に用いた、ビタミン等を含む栄養塩類および人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）を含む液体培地が好ましいものとして挙げられる。該人工海水は、天然海水に含まれる塩類を模した塩類である。該人口海水の所定量を蒸留水に溶解することで、天然海水を模した海水成分をもつ水溶液を作製することができる。
【００２５】
前記液体培地における人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）の濃度としては、３７ｇ／ｌを添加した場合を１００％（ｗ／ｖ）（天然海水の塩濃度とほぼ等しい）とした時、１０〜１００％（ｗ／ｖ）が好ましく、３０〜１００％（ｗ／ｖ）がより好ましく、５０〜１００％（ｗ／ｖ）がさらに好ましく、８０〜１００％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。
【００２６】
前記光照射条件としては、培養液中の藻体濃度によって適宜調節すればよく、例えば５００ルクス以上（ｌｘ）が好ましく、１０００〜３００００ルクス（ｌｘ）がより好ましく、１０００〜１００００ルクス（ｌｘ）がさらに好ましく、１０００〜６０００ルクス（ｌｘ）が特に好ましく、１０００〜３０００ルクス（ｌｘ）が最も好ましい。
前記通気培養における通気量としては、当該微細藻類が生育するのに適した公知の通気量が適用でき、例えば、好ましくは１〜５ｖｖｍ、より好ましくは２〜４ｖｖｍ、さらに好ましくは２．５〜３．５ｖｖｍで通気培養することができる。
前記通気培養における培養温度としては、当該微細藻類が生育するのに適した公知の培養温度でよく、通常、２０〜３５℃で行うことが好ましく、２５〜３０℃で行うことがより好ましい。
前記通気培養の期間としては、当該微細藻類が生育する限り培養を継続することができ、通常、１〜４週間で行うことが好ましく、１〜３週間で行うことがより好ましく、１〜２週間で行うことがさらに好ましい。
【００２７】
本発明における油分の製造方法において、当該微細藻類の前記通気培養期間の後に、栄養制限下でさらに培養することが好ましい。該栄養制限下で培養することにより、藻体中に含まれる油分の含有率（乾燥藻体中に含まれる油分の質量％）を高めることができる。したがって、前記通気培養期間に、栄養制限のない培地（栄養培地）で当該微細藻類を生育させて、所望の量まで培養した後に、栄養制限下での培養に切り換えることによって藻体中に含まれる油分の含有率を高めて、当該油分の製造効率を高めることが好ましい。
【００２８】
ここで、前記栄養制限下での培養とは、培地に含まれるビタミン等を含む栄養塩類を通常よりも少なくした培地（栄養制限培地）で培養を行うことである。例えば、前述のＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を単離する際に用いた、ビタミン等を含む栄養塩類および人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）を含む液体培地（栄養液体培地）における該ビタミン等を含む栄養塩類の含有率を１００％（ｗ／ｖ）とした場合、該含有率が１００％（ｗ／ｖ）未満である液体培地（栄養制限液体培地）を用いて培養することが、栄養制限下で培養することにあたる。
【００２９】
前記栄養制限液体培地に含まれるビタミン等を含む栄養塩類の含有率としては、当該微細藻類中の油分の含有率を高める観点から、０〜６０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０〜３０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０〜２０％（ｗ／ｖ）がさらに好ましく、０〜１０％（ｗ／ｖ）が特に好ましく、０％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。
【００３０】
前述の、栄養液体培地から栄養制限液体培地へ切り換える方法としては、特に制限されず、一度に栄養制限培地に切り換えてもよく、漸次切り換えてもよい。前記一度に切り換える方法としては、例えば遠心によって藻体を沈殿させて、上澄み液である栄養液体培地を除去し、つぎに栄養制限液体培地を投入する方法が挙げられる。また、漸次切り換える方法としては、例えば半透膜で隔てた一方の側に藻体を含む栄養液体培地を入れ、他方の側に栄養制限液体培地を入れることで、浸透圧の原理によって藻体を含む液体培地のビタミン等を含む栄養塩類の含有濃度を漸次低下させ、栄養制限液体培地にする方法が挙げられる。
【００３１】
前記栄養制限下での培養の期間は、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、当該微細藻類の油分含有率を高められる期間であればよい。該期間としては、好ましくは３〜３０日、より好ましくは３〜２０日、さらに好ましくは３〜７日で行うことができる。
【００３２】
培養した微細藻類の回収方法としては、公知の方法で行うことができ、例えば培養液を遠心することによって藻体を沈殿させてペレットとして回収する方法、当該微細藻類が通過できない孔をもつフィルターに培養液を通過させてフィルターに残った藻体を回収する方法等が挙げられる。
【００３３】
前記培養方法および回収方法で得られた藻体中に含まれる油分を採取する方法としては、本発明の効果を損なうものでなければ特に制限されない。例えば回収した藻体を有機溶媒中に懸濁することで藻体中に含まれる油分を、該有機溶媒中へ抽出することができる。
該有機溶媒としては、本発明の効果を損なわず、藻体中に含まれる油分を溶解できるものであれば特に制限されず、例えば、ｎ−ヘキサン（以下では、ヘキサンという。）、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ブタノール、クロロホルム等が挙げられる。これらのなかでも、油分の抽出効率の観点から、ヘキサンが好ましい。また、これらの有機溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、該油分の抽出効率を高めるために、該藻体を懸濁した有機溶媒を超音波ホモジナイザー等にかけて、該藻体を物理的に破壊することが好ましい。
【００３４】
前記有機溶媒は、当該油分よりも沸点が低いので、窒素気流の吹きつけ、減圧留去等によって除くことができる。また、再利用も可能である。
また、前記有機溶媒によって抽出した油分は、必要に応じてさらに精製することができる。該精製方法としては、公知の方法で行えばよく、例えばシリカゲルを用いた固相抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留等によって、当該油分に含まれる成分ごとに分取する方法が挙げられる。
【００３５】
前記方法によって製造された油分は、当該微細藻類をＮｉｌｅ ｒｅｄで染色した際に観察される油分を含む。該油分は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むものである。また、該油分は前記炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の他に、トリグリセリド等の中性脂質、リン脂質、遊離脂肪酸、ステロイド化合物、カロテノイド等の光合成色素等も含みうる。
前記炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素は、主に炭素数１４、１６、２０、および２２の直鎖状脂肪族炭化水素であり、より具体的には、テトラデカン、ヘキサデカン、イコサン、およびドコサンである。なお、前記直鎖状脂肪族炭化水素は不飽和結合を含みうる。
【００３６】
＜油分＞
本発明における油分は、本発明にかかる油分の製造方法によって製造されたものである。
当該油分の説明は、前述の油分の製造方法における油分の説明と同様である。
また、当該油分から炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を精製することもできる。
該精製方法としては、特に制限されず、公知の方法で行うことができる。例えば、当該微細藻類からヘキサン抽出した油分をヘキサン等の有機溶媒に溶解し、該溶液にシリカゲルを投入することにより、該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素以外の物質をシリカゲルに吸着させ、該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素のみを溶出させることができる。
なお、当該油分を溶解する有機溶媒としては、前述の油分の製造方法における有機溶媒の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００３７】
＜乾燥藻体＞
本発明における乾燥藻体は、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類を乾燥させたものである。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を乾燥させる方法としては、藻体中の水分を除去できる方法であれば特に制限されない。例えば、藻体を天日干しにする方法、藻体に乾燥空気を吹き付ける方法、藻体を凍結乾燥（フリーズドライ）する方法等が挙げられる。これらのうち、藻体に含まれる成分の分解を抑制できる観点から、凍結乾燥による乾燥方法が好ましい。
【００３８】
＜燃料＞
本発明における燃料は、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類から得られたものである。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を燃料として用いる方法としては、当該微細藻類を燃焼させる方法、当該微細藻類から採取した油分を燃焼させる方法、当該微細藻類から採取した油分から精製した炭化水素１４〜２２の脂肪族炭化水素を燃焼させる方法等が例示できる。
【００３９】
当該微細藻類を燃焼させる場合、燃焼効率を高める観点から、当該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体を用いることが好ましい。該乾燥藻体は、本発明にかかる前記乾燥藻体と同様である。当該微細藻類がＪＰＣＣ ＧＡ００２４株である場合には、その乾燥藻体の有する熱量は、石炭の有する熱量（約６０００ｋｃａｌ／ｋｇ）と同等以上に達しうる。
【００４０】
当該微細藻類から採取した油分を燃焼させる場合、該油分は、本発明にかかる前記油分と同様である。当該微細藻類から採取した油分は可燃性であり、例えばボイラー等の燃料として使用することができる。当該微細藻類がＪＰＣＣ ＧＡ００２４株である場合には、そのヘキサン抽出物（油分）の有する熱量は、８４００ｋｃａｌ／ｋｇ以上に達しうる。
【００４１】
当該微細藻類から採取した油分から精製した炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を燃焼させる場合、該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素は、本発明にかかる前記油分における該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素と同様である。該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素はディーゼルエンジンの燃料として用いることができる。
【００４２】
＜二酸化炭素固定方法＞
本発明における二酸化炭素固定方法は、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類を培養する工程を有するものである。
当該微細藻類が生育する際に行う光合成は、培養液中（大気中）の二酸化炭素を同化する作用がある。すなわち、当該微細藻類を培養することによって、二酸化炭素を固定することができる。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を培養する工程は、本発明にかかる前記油分の製造方法における当該微細藻類の培養方法と同様である。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の炭化水素産生能＞
ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を２４穴ウェルで１２週間培養した後、その藻体をＮｉｌｅ ｒｅｄで染色することにより、藻体中に油分が産生および蓄積されていることを確認した。
【００４５】
具体的には、ビタミン等を含む栄養塩類｛硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミン（Ｂ１２）０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．０１４ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ｝、および人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）３７ｇ／ｌを蒸留水に上記所定の濃度で溶解した栄養液体培地を作製した。次に、該培地２ｍｌを含む２４穴のマイクロタイタープレートに、該ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、１０００ルクス（ｌｘ）の光照射下で、１２週間静置培養した。つづいて、培養液を１．５ｍｌ容のマイクロチューブに移して、１３０００ｒｐｍで遠心することにより藻体をペレットとして回収した。該ペレットに含まれる培地を除くために０．５ｍｌの生理食塩水に懸濁した後、１３０００ｒｐｍの遠心を５分行い、藻体をペレットとして回収した。
つぎに、そのペレットを４５０μｌの生理食塩水に再懸濁して、さらに５０μｌのＮｉｌｅ ｒｅｄ溶液を加えて混合した後、室温で１０分間のインキュベーションを行った。その後、１３０００ｒｐｍの遠心を５分行ってペレットを回収し、余分なＮｉｌｅ ｒｅｄ溶液を洗い流すために該ペレットを１．０ｍｌの生理食塩水へ懸濁してから再度遠心してペレットとして藻体を回収した。得られた藻体を５０μｌの生理食塩水へ懸濁したものを、蛍光顕微鏡によって観察した。その結果、藻体中にＮｉｌｅ ｒｅｄで染色された油分の存在領域を示す黄色の蛍光を発する領域を確認することができた。該蛍光顕微鏡像では、藻体全体に油分が蓄積されている様子が確認された。
なお、前記Ｎｉｌｅ ｒｅｄ溶液は、１ｍｇのＮｉｌｅ ｒｅｄを１０ｍｌのアセトンに溶解し、さらに生理食塩水で４倍に希釈した溶液である。
【００４６】
［実施例２］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株に蓄積される炭化水素の同定＞
実施例１で作製した液体培地と同じ組成の液体培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコにＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量３ｖｖｍで３週間、通気培養を行った。その後、遠心で回収した藻体ペレットを、一晩凍結乾燥した。
得られた乾燥藻体０．１ｇにヘキサン６ｍｌを加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。これを３回行いった。つぎに、該ヘキサン抽出液を遠心し、藻体の残渣を除いたヘキサン抽出溶液約１８ｍｌをＳｅｐ−ｐａｋ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（６ ｃｃ／１ｇ）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製)シリカゲルカラムを用いて、極性物質（遊離脂肪酸、色素を含む）を除去し、脂肪族炭化水素画分を含む１６ｍｌ得た。窒素気流によって乾燥させ、ヘキサン０．５ｍｌに再溶解させたものを試料とした。その試料をガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣＭＳ）によって分析し、試料に含まれる炭化水素を同定した。
【００４７】
使用したガスクロマトグラフ機器は株式会社島津製作所製のＧＣ２０１０であり、使用したカラムはＤＢ−１（カラム長：３０ｍ、カラム内径：０．２５ｍｍ）であり、測定条件（昇温：１００℃（０分）〜３３０℃(１０℃／分、ｈｏｌｄ)、注入温度：３００℃、注入モード：スプリットレス、キャリアガス：Ｈｅ、注入量：１．０μｌ）で行った。
質量分析機器は、電子衝撃（ＥＩ）法によるイオン化を行う、株式会社島津製作所製のＧＣＭＳ−ＱＰ５０５０Ａを使用した。
【００４８】
ＧＣＭＳ分析の結果、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を産生していることが明らかとなった。より具体的には、炭素数１４、１６、２０および２２の直鎖状脂肪族炭化水素が主な成分として確認された。なお、該直鎖状脂肪族炭化水素のなかには、不飽和結合を有するものも含まれることが示唆されたが、その不飽和結合の分子中における位置を特定するには至らなかった。
また、軽油０．１％をヘキサンに溶解した試料を定量用の試料として、ＧＣＭＳチャートにおける当該炭化水素を示す面積比からＪＰＣＣ ＧＡ００２４株が産生する炭化水素量を定量したところ、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体における当該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の含有率は０．６質量％であった。この含有率は、これまでに公知の、軽質油系の脂肪族炭化水素を産生する藻類の含有率（乾燥藻体において、０．０２５〜０．１２質量％；非特許文献１のＴＡＢＬＥ２を参照。）よりも突出して高いものであった。
【００４９】
［実施例３］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の生育速度＞
実施例２と同様にＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を培養し、生育を評価するために培養液の濁度（ＯＤ７５０）を経時的に測定した。その結果を図２に示す。
得られた結果から、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は約２週間の培養期間で、その生育が定常に達することが確認された。また、培養開始後２週間経過した時の藻体を回収して乾燥凍結し、その乾燥藻体の回収量を調べたところ、培養液１ｌあたり０．９６ｇであった。
【００５０】
［実施例４］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の海水要求性＞
実施例１で作製した液体培地の組成のうち、ビタミン等を含む栄養塩類の組成は同一とし、人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）の濃度を変化させた栄養液体培地を５種類作製した。該人口海水の濃度は、０ｇ／ｌで添加した場合を０％とし、以下同様に、１１．１ｇ／ｌ（３０％）、１８．５ｇ／ｌ（５０％）、２９．８ｇ／ｌ（８０％）、３７ｇ／ｌ（１００％）とした。
これらの栄養液体培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコにＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量３ｖｖｍで２週間の通気培養を行った。生育を評価するために培養液の濁度（ＯＤ７５０）を経時的に測定した。その結果を図３に示す。
得られた結果から、２週間の生育期間中、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、人工海水（海水成分）を８０〜１００％含む条件において最も生育が良いことが確認された。また、人工海水（海水成分）濃度が減少するにつれて、生育が減少することが確認された。
このことから、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、海洋性の微細藻類であることが確認された。
【００５１】
［実施例５］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の栄養制限培養によるヘキサン抽出物の量変化＞
実施例１で作製した液体培地の組成のうち、人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）の濃度は同一とし、ビタミン等を含む栄養塩類の組成比は同一のままで、その添加濃度を変化させた栄養制限液体培地を５種類作成した。該ビタミン等を含む栄養塩類の濃度は、｛硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミン（Ｂ１２）０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．０１４ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ｝で添加した場合を１００％とし、その０．２倍量を添加した場合を２０％、その０．１倍量を添加した場合を１０％、添加しなかった場合を０％とした。
これらの栄養制限液体培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコのそれぞれにＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量３ｖｖｍで１１日間の通気培養を行った。生育を評価するために培養液の濁度（ＯＤ７５０）を経時的に測定した。その結果を図４に示す。
【００５２】
培養期間経過後に、表１に示す量の培養液をそれぞれ回収し、遠心して藻体を回収した。その藻体を凍結乾燥して得られた乾燥藻体の質量を測定した。得られた乾燥藻体０．１ｇあたりヘキサン６．０ｍｌを加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。つぎに、該ヘキサン抽出液を遠心し、藻体の残渣を除いたヘキサン抽出溶液を回収した後、溶媒であるヘキサンを減圧留去し、残ったヘキサン抽出物（油分）の質量を測定した。これらの結果を表１に示す。
【００５３】
得られた結果から、１１日間の生育期間中、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、ビタミン等を含む栄養塩類を１００％含む条件において最も生育が良いことが確認された。また、ビタミン等を含む栄養塩類濃度が減少するにつれて、生育が減少することが確認された。藻体の回収量（乾燥藻体の質量）も当然に同様の傾向を示した。
一方、回収した乾燥藻体の単位質量あたりのヘキサン抽出物（油分）の量（乾燥藻体の油分含有率）は、ビタミン等を含む栄養塩類の濃度が０％の時に最も多く、その濃度が高くなるにつれて該ヘキサン抽出物（油分）の量が少なくなることが確認された。その結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
［実施例６］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体の発熱量＞
実施例１で作製した液体培地と同じ組成の液体培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコにＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量３ｖｖｍで３週間の通気培養を行った。その後、遠心で回収した藻体ペレットを一晩凍結乾燥して、０．８ｇの乾燥藻体を得た。
得られた乾燥藻体を試料として、ボンベ型熱量計（株式会社吉田製作所製、型式：１０１３−Ｊ、熱量の計測範囲：４０００〜３３５００Ｊ）で発熱量を測定したところ、６１６０ｋｃａｌ／ｋｇであった。すなわち、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体は、石炭と同等の発熱量をもつことが確認された。
【００５６】
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株から採取した油分の発熱量＞
実施例６と同様の方法で、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体４．０ｇを得た。該得られた乾燥藻体０．１ｇあたりヘキサン６．０ｍｌを加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。つぎに、該ヘキサン抽出液を遠心し、藻体の残渣を除いたヘキサン抽出溶液を回収した後、溶媒であるヘキサンを減圧留去して、ヘキサン抽出物（油分）０．３６０ｇを得た。
得られたヘキサン抽出物（油分）を試料として、ボンベ型熱量計（株式会社吉田製作所製、型式：１０１３−Ｊ、熱量の計測範囲：４０００〜３３５００Ｊ）で発熱量を測定したところ、８４２０ｋｃａｌ／ｋｇであった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明にかかる微細藻類は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能が高いために、ディーゼル燃料の生産に利用可能であり、地球温暖化防止を志向したカーボンニュートラルな燃料としても期待できる。
【受託番号】
【００５８】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、および該微細藻類から採取した油分に関する。より詳細には、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料と呼称される重質油系または軽質油系の炭化水素を、微細藻類の培養によって製造する方法がいくつか報告されている。
重質油系炭化水素の産生能を有する藻類としては、炭素数３６の炭化水素の産生能をもつ微細藻類ボツリオコッカス ブラウニー（非特許文献１参照。）や炭素数３３の炭化水素の産生能をもつ微細藻類ボツリオコッカス・ブラウニーＡレース（特許文献１参照。）が知られる。
また、軽質油系炭化水素の産生能を有する藻類としては、炭素数１７の炭化水素の産生能をもつ微細藻類Ｎｏｓｔｏｃ ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ ｅｒｙｔｈａｅｕｍ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ ｔｅｒｅｂｒａｎｓ等（非特許文献１参照。）、炭素数１９の炭化水素の産生能をもつ微細藻類Ｃｏｃｃｏｃｈｌｏｒｉｓ ｅｌａｂｅｎｓ等（非特許文献１参照。）、炭素数１７、１８、１９、および２０の炭化水素の産生能をもつ微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア ＭＢＩＣ１１２０４株（特許文献２参照。）、炭素数１７、１９、２１、および２３の炭化水素の産生能をもつ微細藻類コリシスチス マイナー ＳＡＧ１７．９８株（特許文献２参照。）が知られる。
【０００３】
微細藻類の産生しうる軽質油系炭化水素はディーゼル燃料として産業上有用であり、地球温暖化防止を志向したカーボンニュートラルな燃料としても期待されている。
しかしながら、前記微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体において、軽質油系炭化水素の含有率は通常０．０２５〜０．１２質量％程度であり（非特許文献１参照。）、その炭化水素産生能は必ずしも十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２３４０５５号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１０９５８８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒ．Ｒａｊａ，Ｓ．Ｈｅｍａｉｓｗａｒｙａ，Ｎ．Ａｓｈｏｋ Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｓｒｉｄｈａｒ ａｎｄ Ｒ．Ｒｅｎｇａｓａｍｙ（２００８） Ａ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３４：７７−８８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能の高い微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明は次の構成を採用した。
請求項１記載の発明は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類である。
請求項２記載の発明は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有する微細藻類セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属 ルベッセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）種である。
請求項３記載の発明は、微細藻類セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属 ルベッセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）種 ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９）である。
請求項４記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法である。
請求項５記載の発明は、前記油分が炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むことを特徴とする請求項４記載の油分の製造方法である。
請求項６記載の発明は、請求項４記載の油分の製造方法によって製造された油分。
請求項７記載の発明は、前記油分が炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むことを特徴とする請求項６記載の油分である。
請求項８記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体である。
請求項９記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類から得られる燃料である。
請求項１０記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法である。
【０００８】
なお、本特許請求の範囲および明細書中において、「炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有する」とは、主に炭素数１４、１６、２０、および２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するという意である。また、「油分」とは、疎水性有機化合物からなる液体成分をいう。該疎水性有機化合物としては、脂肪族炭化水素、中性脂肪等が挙げられる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能の高い微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の１８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を使用して得られた分子系統樹を示す図である。
【図２】ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の増殖曲線である。
【図３】ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の海水成分濃度を変化させた培養における増殖曲線である。
【図４】ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の栄養制限培養における増殖曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳しく説明する。
＜セネデスムス属に属する微細藻類＞
本発明におけるセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するものである。
該微細藻類としては、微細藻類セネデスムス属 ルベッセンス種（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）が好ましく、特に、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の藻体中における含有率が高く、容易に培養できる観点から、微細藻類セネデスムス属 ルベッセンス種（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ） ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９）（以下、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株と略称する。）がより好ましい。
【００１２】
ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、発明者が汽水域の海水から単離した緑藻綱クロロコッカム目セネデスムス属ルベッセンス種に属する海洋微細藻類の新規株である。
以下に、該微細藻類の単離方法および該微細藻類のＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を新規株と判定するに至った経緯を説明する。
【００１３】
（単離方法）
ビタミン等を含む栄養塩類｛硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミン（Ｂ１２）０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．０１４ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ｝、および人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）３７ｇ／ｌを蒸留水に上記所定の濃度で溶解した液体培地を作製した。また、ビタミン等を含む栄養塩類および人工海水を前記液体培地と同一の組成で含み、さらに寒天を１．２％（ｗ／ｖ）の濃度となるように添加した寒天培地を作成した。
前記液体培地２ｍｌを含む２４穴のマイクロタイタープレートに、２００２年１１月福岡県遠賀郡芦屋町遠賀川河口干潟より採取した砂を適量添加した。つづいて、１０００ルクス（ｌｘ）の光照射下で静置培養を行い、微細藻類の生育が確認できたウェル中の培養液の一部を分取した。その分取した培養液を前記寒天培地上に接種して、前記光照射条件下で培養することによって、緑色の単細胞藻類ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株が、単菌化（単離）された微細藻類のコロニーとして得られた。
【００１４】
（形態学的性質）
前記寒天培地上で、２５℃、１４日間培養した結果、直径２．０〜５．０ｍｍ程度の緑色のＪＰＣＣ ＧＡ００２４株のコロニーが得られた。コロニーの形状は点状で、隆起の無い半レンズ状であった。周縁は全縁であり、表面はスムーズな形状であった。また、変異によるコロニーの形態の変化は見られず、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化も見られなかった。培養日数が延びるとともにコロニー色が緑色から茶色へと変化することが確認された。
前記コロニー中の海洋微細藻類は、大きさが平均して１０〜２０μｍ程度、中には１００μｍを超す細胞もある緑色の単細胞藻類で、群体を形成せず、栄養細胞には点眼や収縮胞は無く、細胞形は円形であった。浮遊性は無く、細胞表面は滑らかである。栄養細胞は鞭毛を持たず運動性を示さない。また外囲を細胞壁で囲まれ、内部に核が１個、葉緑体が複数存在し、その他ミトコンドリア、ゴルジ体、液胞、油滴等が観察される。葉緑体内にピレノイドが確認される。
【００１５】
（生殖様式）
ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、内細胞を形成せず、２分裂による増殖を行なう。
【００１６】
（生理学・生化学的性状）
・ 培養液：海水を基調とする公知の培養液中で生育する。淡水では極度に生育が鈍い。
・ 光合成：光合成による光独立栄養生育ができる。従属栄養生育は確認されない。
・ 含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、およびその他カロテノイド色素類
・ 貯蔵物質：デンプン、および炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含む油分
・ 生育温度：２０℃〜３５℃（至適温度２５℃）
・ 生育ｐＨ：７．０〜９．０（至適ｐＨ８．０）
・ 細胞内にＮｉｌｅ ｒｅｄで染色される油分を蓄積する。
【００１７】
Ｎｉｌｅ ｒｅｄ染色したＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を蛍光顕微鏡で観察すると、蛍光視野中の藻体において、明るい蛍光発色の領域としてＮｉｌｅ ｒｅｄで発色した油分の存在が確認される。該油分は藻体細胞内の広い領域に蓄積されうる。また、該油分は炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含む。
【００１８】
前述の形態学的性質、生殖様式、および生理学・生化学的性状の点からＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、既存の緑藻網クロロコッカム目に属する藻類であると推定された。さらに、従来公知の方法に従って、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡブロードミニキット５０（株式会社キアゲン社製）を用いて、該ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により、１８Ｓ ｒＤＮＡの領域を増幅させてシークエンス解析を行い、１８Ｓ ｒＤＮＡ領域の塩基配列を決定した。得られた１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。得られた１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を公共のデータベースである日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）と照合して相同性を検索（Ｂｌａｓｔ検索）し、解析ソフトＣｌｕｓｔａｌＷおよび表示ソフトＴｒｅｅｖｉｅｗを用いて系統解析を行なった。その結果得られた系統図を図１に示す。
【００１９】
単離したＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、前記系統樹において、クロロコッカム目に分類され、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ種とクラスターを形成した。ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ種との細胞形態も類似していることから、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株はセネデスムス属ルベッセンス種（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）の藻類であると判断された。
また、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は藻体中に炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含む油分を蓄積しうる。さらに、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体における該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の含有率は、０．６質量％以上に達しうる。
一方、セネデスムス属ルベッセンス種において、該脂肪族炭化水素を含む油分を蓄積する株は、今日まで知られていない。
したがって、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、セネデスムス属ルベッセンス種の新規株であると判断された。
【００２０】
前記ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許微生物寄託センターに寄託された。
【００２１】
＜油分の製造方法＞
本発明における油分の製造方法は、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類を培養する工程を有するものである。本発明にかかる微細藻類を培養し、当該培養工程によって生育させた当該微細藻類を培地中から回収し、得られた微細藻類中に含まれる油分を採取することによって、当該油分を製造することができる。
【００２２】
当該セネデスムス属に属する微細藻類としては、微細藻類セネデスムス属ルベッセンス種が好ましく、特に、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の藻体中における含有率が高く、容易に培養できる観点から、微細藻類セネデスムス属ルベッセンス種ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株がより好ましい。
【００２３】
当該微細藻類を培養する工程としては、セネデスムス属に属する微細藻類を培養できる公知の方法が適用できる。例えば、液体培地を入れた偏平フラスコ等の培養容器に該微細藻類を接種して、藻体が沈殿しない程度に緩やかに攪拌しながら光照射下で通気培養すればよい。
【００２４】
前記液体培地としては当該微細藻類を培養できる液体培地であれば特に制限されず、公知のものが使用できる。例えば、前述のＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を単離する際に用いた、ビタミン等を含む栄養塩類および人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）を含む液体培地が好ましいものとして挙げられる。該人工海水は、天然海水に含まれる塩類を模した塩類である。該人口海水の所定量を蒸留水に溶解することで、天然海水を模した海水成分をもつ水溶液を作製することができる。
【００２５】
前記液体培地における人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）の濃度としては、３７ｇ／ｌを添加した場合を１００％（ｗ／ｖ）（天然海水の塩濃度とほぼ等しい）とした時、１０〜１００％（ｗ／ｖ）が好ましく、３０〜１００％（ｗ／ｖ）がより好ましく、５０〜１００％（ｗ／ｖ）がさらに好ましく、８０〜１００％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。
【００２６】
前記光照射条件としては、培養液中の藻体濃度によって適宜調節すればよく、例えば５００ルクス以上（ｌｘ）が好ましく、１０００〜３００００ルクス（ｌｘ）がより好ましく、１０００〜１００００ルクス（ｌｘ）がさらに好ましく、１０００〜６０００ルクス（ｌｘ）が特に好ましく、１０００〜３０００ルクス（ｌｘ）が最も好ましい。
前記通気培養における通気量としては、当該微細藻類が生育するのに適した公知の通気量が適用でき、例えば、好ましくは１〜５ｖｖｍ、より好ましくは２〜４ｖｖｍ、さらに好ましくは２．５〜３．５ｖｖｍで通気培養することができる。
前記通気培養における培養温度としては、当該微細藻類が生育するのに適した公知の培養温度でよく、通常、２０〜３５℃で行うことが好ましく、２５〜３０℃で行うことがより好ましい。
前記通気培養の期間としては、当該微細藻類が生育する限り培養を継続することができ、通常、１〜４週間で行うことが好ましく、１〜３週間で行うことがより好ましく、１〜２週間で行うことがさらに好ましい。
【００２７】
本発明における油分の製造方法において、当該微細藻類の前記通気培養期間の後に、栄養制限下でさらに培養することが好ましい。該栄養制限下で培養することにより、藻体中に含まれる油分の含有率（乾燥藻体中に含まれる油分の質量％）を高めることができる。したがって、前記通気培養期間に、栄養制限のない培地（栄養培地）で当該微細藻類を生育させて、所望の量まで培養した後に、栄養制限下での培養に切り換えることによって藻体中に含まれる油分の含有率を高めて、当該油分の製造効率を高めることが好ましい。
【００２８】
ここで、前記栄養制限下での培養とは、培地に含まれるビタミン等を含む栄養塩類を通常よりも少なくした培地（栄養制限培地）で培養を行うことである。例えば、前述のＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を単離する際に用いた、ビタミン等を含む栄養塩類および人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）を含む液体培地（栄養液体培地）における該ビタミン等を含む栄養塩類の含有率を１００％（ｗ／ｖ）とした場合、該含有率が１００％（ｗ／ｖ）未満である液体培地（栄養制限液体培地）を用いて培養することが、栄養制限下で培養することにあたる。
【００２９】
前記栄養制限液体培地に含まれるビタミン等を含む栄養塩類の含有率としては、当該微細藻類中の油分の含有率を高める観点から、０〜６０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０〜３０％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０〜２０％（ｗ／ｖ）がさらに好ましく、０〜１０％（ｗ／ｖ）が特に好ましく、０％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。
【００３０】
前述の、栄養液体培地から栄養制限液体培地へ切り換える方法としては、特に制限されず、一度に栄養制限培地に切り換えてもよく、漸次切り換えてもよい。前記一度に切り換える方法としては、例えば遠心によって藻体を沈殿させて、上澄み液である栄養液体培地を除去し、つぎに栄養制限液体培地を投入する方法が挙げられる。また、漸次切り換える方法としては、例えば半透膜で隔てた一方の側に藻体を含む栄養液体培地を入れ、他方の側に栄養制限液体培地を入れることで、浸透圧の原理によって藻体を含む液体培地のビタミン等を含む栄養塩類の含有濃度を漸次低下させ、栄養制限液体培地にする方法が挙げられる。
【００３１】
前記栄養制限下での培養の期間は、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、当該微細藻類の油分含有率を高められる期間であればよい。該期間としては、好ましくは３〜３０日、より好ましくは３〜２０日、さらに好ましくは３〜７日で行うことができる。
【００３２】
培養した微細藻類の回収方法としては、公知の方法で行うことができ、例えば培養液を遠心することによって藻体を沈殿させてペレットとして回収する方法、当該微細藻類が通過できない孔をもつフィルターに培養液を通過させてフィルターに残った藻体を回収する方法等が挙げられる。
【００３３】
前記培養方法および回収方法で得られた藻体中に含まれる油分を採取する方法としては、本発明の効果を損なうものでなければ特に制限されない。例えば回収した藻体を有機溶媒中に懸濁することで藻体中に含まれる油分を、該有機溶媒中へ抽出することができる。
該有機溶媒としては、本発明の効果を損なわず、藻体中に含まれる油分を溶解できるものであれば特に制限されず、例えば、ｎ−ヘキサン（以下では、ヘキサンという。）、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ブタノール、クロロホルム等が挙げられる。これらのなかでも、油分の抽出効率の観点から、ヘキサンが好ましい。また、これらの有機溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、該油分の抽出効率を高めるために、該藻体を懸濁した有機溶媒を超音波ホモジナイザー等にかけて、該藻体を物理的に破壊することが好ましい。
【００３４】
前記有機溶媒は、当該油分よりも沸点が低いので、窒素気流の吹きつけ、減圧留去等によって除くことができる。また、再利用も可能である。
また、前記有機溶媒によって抽出した油分は、必要に応じてさらに精製することができる。該精製方法としては、公知の方法で行えばよく、例えばシリカゲルを用いた固相抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留等によって、当該油分に含まれる成分ごとに分取する方法が挙げられる。
【００３５】
前記方法によって製造された油分は、当該微細藻類をＮｉｌｅ ｒｅｄで染色した際に観察される油分を含む。該油分は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むものである。また、該油分は前記炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の他に、トリグリセリド等の中性脂質、リン脂質、遊離脂肪酸、ステロイド化合物、カロテノイド等の光合成色素等も含みうる。
前記炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素は、主に炭素数１４、１６、２０、および２２の直鎖状脂肪族炭化水素であり、より具体的には、テトラデカン、ヘキサデカン、イコサン、およびドコサンである。なお、前記直鎖状脂肪族炭化水素は不飽和結合を含みうる。
【００３６】
＜油分＞
本発明における油分は、本発明にかかる油分の製造方法によって製造されたものである。
当該油分の説明は、前述の油分の製造方法における油分の説明と同様である。
また、当該油分から炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を精製することもできる。
該精製方法としては、特に制限されず、公知の方法で行うことができる。例えば、当該微細藻類からヘキサン抽出した油分をヘキサン等の有機溶媒に溶解し、該溶液にシリカゲルを投入することにより、該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素以外の物質をシリカゲルに吸着させ、該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素のみを溶出させることができる。
なお、当該油分を溶解する有機溶媒としては、前述の油分の製造方法における有機溶媒の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００３７】
＜乾燥藻体＞
本発明における乾燥藻体は、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類を乾燥させたものである。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を乾燥させる方法としては、藻体中の水分を除去できる方法であれば特に制限されない。例えば、藻体を天日干しにする方法、藻体に乾燥空気を吹き付ける方法、藻体を凍結乾燥（フリーズドライ）する方法等が挙げられる。これらのうち、藻体に含まれる成分の分解を抑制できる観点から、凍結乾燥による乾燥方法が好ましい。
【００３８】
＜燃料＞
本発明における燃料は、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類から得られたものである。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を燃料として用いる方法としては、当該微細藻類を燃焼させる方法、当該微細藻類から採取した油分を燃焼させる方法、当該微細藻類から採取した油分から精製した炭化水素１４〜２２の脂肪族炭化水素を燃焼させる方法等が例示できる。
【００３９】
当該微細藻類を燃焼させる場合、燃焼効率を高める観点から、当該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体を用いることが好ましい。該乾燥藻体は、本発明にかかる前記乾燥藻体と同様である。当該微細藻類がＪＰＣＣ ＧＡ００２４株である場合には、その乾燥藻体の有する熱量は、石炭の有する熱量（約６０００ｋｃａｌ／ｋｇ）と同等以上に達しうる。
【００４０】
当該微細藻類から採取した油分を燃焼させる場合、該油分は、本発明にかかる前記油分と同様である。当該微細藻類から採取した油分は可燃性であり、例えばボイラー等の燃料として使用することができる。当該微細藻類がＪＰＣＣ ＧＡ００２４株である場合には、そのヘキサン抽出物（油分）の有する熱量は、８４００ｋｃａｌ／ｋｇ以上に達しうる。
【００４１】
当該微細藻類から採取した油分から精製した炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を燃焼させる場合、該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素は、本発明にかかる前記油分における該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素と同様である。該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素はディーゼルエンジンの燃料として用いることができる。
【００４２】
＜二酸化炭素固定方法＞
本発明における二酸化炭素固定方法は、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類を培養する工程を有するものである。
当該微細藻類が生育する際に行う光合成は、培養液中（大気中）の二酸化炭素を同化する作用がある。すなわち、当該微細藻類を培養することによって、二酸化炭素を固定することができる。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記セネデスムス属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を培養する工程は、本発明にかかる前記油分の製造方法における当該微細藻類の培養方法と同様である。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の炭化水素産生能＞
ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を２４穴ウェルで１２週間培養した後、その藻体をＮｉｌｅ ｒｅｄで染色することにより、藻体中に油分が産生および蓄積されていることを確認した。
【００４５】
具体的には、ビタミン等を含む栄養塩類｛硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミン（Ｂ１２）０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．０１４ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ｝、および人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）３７ｇ／ｌを蒸留水に上記所定の濃度で溶解した栄養液体培地を作製した。次に、該培地２ｍｌを含む２４穴のマイクロタイタープレートに、該ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、１０００ルクス（ｌｘ）の光照射下で、１２週間静置培養した。つづいて、培養液を１．５ｍｌ容のマイクロチューブに移して、１３０００ｒｐｍで遠心することにより藻体をペレットとして回収した。該ペレットに含まれる培地を除くために０．５ｍｌの生理食塩水に懸濁した後、１３０００ｒｐｍの遠心を５分行い、藻体をペレットとして回収した。
つぎに、そのペレットを４５０μｌの生理食塩水に再懸濁して、さらに５０μｌのＮｉｌｅ ｒｅｄ溶液を加えて混合した後、室温で１０分間のインキュベーションを行った。その後、１３０００ｒｐｍの遠心を５分行ってペレットを回収し、余分なＮｉｌｅ ｒｅｄ溶液を洗い流すために該ペレットを１．０ｍｌの生理食塩水へ懸濁してから再度遠心してペレットとして藻体を回収した。得られた藻体を５０μｌの生理食塩水へ懸濁したものを、蛍光顕微鏡によって観察した。その結果、藻体中にＮｉｌｅ ｒｅｄで染色された油分の存在領域を示す黄色の蛍光を発する領域を確認することができた。該蛍光顕微鏡像では、藻体全体に油分が蓄積されている様子が確認された。
なお、前記Ｎｉｌｅ ｒｅｄ溶液は、１ｍｇのＮｉｌｅ ｒｅｄを１０ｍｌのアセトンに溶解し、さらに生理食塩水で４倍に希釈した溶液である。
【００４６】
［実施例２］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株に蓄積される炭化水素の同定＞
実施例１で作製した液体培地と同じ組成の液体培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコにＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量３ｖｖｍで３週間、通気培養を行った。その後、遠心で回収した藻体ペレットを、一晩凍結乾燥した。
得られた乾燥藻体０．１ｇにヘキサン６ｍｌを加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。これを３回行いった。つぎに、該ヘキサン抽出液を遠心し、藻体の残渣を除いたヘキサン抽出溶液約１８ｍｌをＳｅｐ−ｐａｋ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（６ ｃｃ／１ｇ）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製)シリカゲルカラムを用いて、極性物質（遊離脂肪酸、色素を含む）を除去し、脂肪族炭化水素画分を含む１６ｍｌ得た。窒素気流によって乾燥させ、ヘキサン０．５ｍｌに再溶解させたものを試料とした。その試料をガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣＭＳ）によって分析し、試料に含まれる炭化水素を同定した。
【００４７】
使用したガスクロマトグラフ機器は株式会社島津製作所製のＧＣ２０１０であり、使用したカラムはＤＢ−１（カラム長：３０ｍ、カラム内径：０．２５ｍｍ）であり、測定条件（昇温：１００℃（０分）〜３３０℃(１０℃／分、ｈｏｌｄ)、注入温度：３００℃、注入モード：スプリットレス、キャリアガス：Ｈｅ、注入量：１．０μｌ）で行った。
質量分析機器は、電子衝撃（ＥＩ）法によるイオン化を行う、株式会社島津製作所製のＧＣＭＳ−ＱＰ５０５０Ａを使用した。
【００４８】
ＧＣＭＳ分析の結果、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を産生していることが明らかとなった。より具体的には、炭素数１４、１６、２０および２２の直鎖状脂肪族炭化水素が主な成分として確認された。なお、該直鎖状脂肪族炭化水素のなかには、不飽和結合を有するものも含まれることが示唆されたが、その不飽和結合の分子中における位置を特定するには至らなかった。
また、軽油０．１％をヘキサンに溶解した試料を定量用の試料として、ＧＣＭＳチャートにおける当該炭化水素を示す面積比からＪＰＣＣ ＧＡ００２４株が産生する炭化水素量を定量したところ、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体における当該炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の含有率は０．６質量％であった。この含有率は、これまでに公知の、軽質油系の脂肪族炭化水素を産生する藻類の含有率（乾燥藻体において、０．０２５〜０．１２質量％；非特許文献１のＴＡＢＬＥ２を参照。）よりも突出して高いものであった。
【００４９】
［実施例３］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の生育速度＞
実施例２と同様にＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を培養し、生育を評価するために培養液の濁度（ＯＤ７５０）を経時的に測定した。その結果を図２に示す。
得られた結果から、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は約２週間の培養期間で、その生育が定常に達することが確認された。また、培養開始後２週間経過した時の藻体を回収して乾燥凍結し、その乾燥藻体の回収量を調べたところ、培養液１ｌあたり０．９６ｇであった。
【００５０】
［実施例４］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の海水要求性＞
実施例１で作製した液体培地の組成のうち、ビタミン等を含む栄養塩類の組成は同一とし、人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）の濃度を変化させた栄養液体培地を５種類作製した。該人口海水の濃度は、０ｇ／ｌで添加した場合を０％とし、以下同様に、１１．１ｇ／ｌ（３０％）、１８．５ｇ／ｌ（５０％）、２９．８ｇ／ｌ（８０％）、３７ｇ／ｌ（１００％）とした。
これらの栄養液体培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコにＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量３ｖｖｍで２週間の通気培養を行った。生育を評価するために培養液の濁度（ＯＤ７５０）を経時的に測定した。その結果を図３に示す。
得られた結果から、２週間の生育期間中、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、人工海水（海水成分）を８０〜１００％含む条件において最も生育が良いことが確認された。また、人工海水（海水成分）濃度が減少するにつれて、生育が減少することが確認された。
このことから、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、海洋性の微細藻類であることが確認された。
【００５１】
［実施例５］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の栄養制限培養によるヘキサン抽出物の量変化＞
実施例１で作製した液体培地の組成のうち、人工海水（千寿製薬（株）製マリンアート・ＳＦ−１）の濃度は同一とし、ビタミン等を含む栄養塩類の組成比は同一のままで、その添加濃度を変化させた栄養制限液体培地を５種類作成した。該ビタミン等を含む栄養塩類の濃度は、｛硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミン（Ｂ１２）０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．０１４ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ｝で添加した場合を１００％とし、その０．２倍量を添加した場合を２０％、その０．１倍量を添加した場合を１０％、添加しなかった場合を０％とした。
これらの栄養制限液体培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコのそれぞれにＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量３ｖｖｍで１１日間の通気培養を行った。生育を評価するために培養液の濁度（ＯＤ７５０）を経時的に測定した。その結果を図４に示す。
【００５２】
培養期間経過後に、表１に示す量の培養液をそれぞれ回収し、遠心して藻体を回収した。その藻体を凍結乾燥して得られた乾燥藻体の質量を測定した。得られた乾燥藻体０．１ｇあたりヘキサン６．０ｍｌを加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。つぎに、該ヘキサン抽出液を遠心し、藻体の残渣を除いたヘキサン抽出溶液を回収した後、溶媒であるヘキサンを減圧留去し、残ったヘキサン抽出物（油分）の質量を測定した。これらの結果を表１に示す。
【００５３】
得られた結果から、１１日間の生育期間中、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株は、ビタミン等を含む栄養塩類を１００％含む条件において最も生育が良いことが確認された。また、ビタミン等を含む栄養塩類濃度が減少するにつれて、生育が減少することが確認された。藻体の回収量（乾燥藻体の質量）も当然に同様の傾向を示した。
一方、回収した乾燥藻体の単位質量あたりのヘキサン抽出物（油分）の量（乾燥藻体の油分含有率）は、ビタミン等を含む栄養塩類の濃度が０％の時に最も多く、その濃度が高くなるにつれて該ヘキサン抽出物（油分）の量が少なくなることが確認された。その結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
［実施例６］
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体の発熱量＞
実施例１で作製した液体培地と同じ組成の液体培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコにＪＰＣＣ ＧＡ００２４株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量３ｖｖｍで３週間の通気培養を行った。その後、遠心で回収した藻体ペレットを一晩凍結乾燥して、０．８ｇの乾燥藻体を得た。
得られた乾燥藻体を試料として、ボンベ型熱量計（株式会社吉田製作所製、型式：１０１３−Ｊ、熱量の計測範囲：４０００〜３３５００Ｊ）で発熱量を測定したところ、６１６０ｋｃａｌ／ｋｇであった。すなわち、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体は、石炭と同等の発熱量をもつことが確認された。
【００５６】
＜ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株から採取した油分の発熱量＞
実施例６と同様の方法で、ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株の乾燥藻体４．０ｇを得た。該得られた乾燥藻体０．１ｇあたりヘキサン６．０ｍｌを加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。つぎに、該ヘキサン抽出液を遠心し、藻体の残渣を除いたヘキサン抽出溶液を回収した後、溶媒であるヘキサンを減圧留去して、ヘキサン抽出物（油分）０．３６０ｇを得た。
得られたヘキサン抽出物（油分）を試料として、ボンベ型熱量計（株式会社吉田製作所製、型式：１０１３−Ｊ、熱量の計測範囲：４０００〜３３５００Ｊ）で発熱量を測定したところ、８４２０ｋｃａｌ／ｋｇであった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明にかかる微細藻類は、炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能が高いために、ディーゼル燃料の生産に利用可能であり、地球温暖化防止を志向したカーボンニュートラルな燃料としても期待できる。
【受託番号】
【００５８】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類。
【請求項２】
炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有する微細藻類セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属 ルベッセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）種。
【請求項３】
微細藻類セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属 ルベッセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）種 ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９）。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法。
【請求項５】
前記油分が炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むことを特徴とする請求項４記載の油分の製造方法。
【請求項６】
請求項４記載の油分の製造方法によって製造された油分。
【請求項７】
前記油分が炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むことを特徴とする請求項６記載の油分。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類から得られる燃料。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法。
【請求項１】
炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有するセネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属に属する微細藻類。
【請求項２】
炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素の産生能を有する微細藻類セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属 ルベッセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）種。
【請求項３】
微細藻類セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属 ルベッセンス（ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）種 ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１７４９）。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法。
【請求項５】
前記油分が炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むことを特徴とする請求項４記載の油分の製造方法。
【請求項６】
請求項４記載の油分の製造方法によって製造された油分。
【請求項７】
前記油分が炭素数１４〜２２の脂肪族炭化水素を含むことを特徴とする請求項６記載の油分。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類から得られる燃料。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１８７６４５（Ｐ２０１０−１８７６４５Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３８４７７（Ｐ２００９−３８４７７）
【出願日】平成２１年２月２０日（２００９．２．２０）
【出願人】（０００２１７６８６）電源開発株式会社 (207)
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２０日（２００９．２．２０）
【出願人】（０００２１７６８６）電源開発株式会社 (207)
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
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