セファクロルの合成方法
本発明はセファクロルの合成方法に関し、該方法は、反応混合物中で酵素の存在下、７−アミノ−３−クロロセファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）と、活性型Ｄ−フェニルグリシン（ＰＧａ）とを反応させてセファクロルを形成することを含み、７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａの少なくとも一部は、反応の過程において反応混合物に添加される。また本発明は、１０（ｗ／ｗ）％よりも多い量のセファクロル、２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量の７−アミノ−３−クロロセファロスポラン酸、および２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量のＤ−フェニルグリシンを含む水性混合物、ならびにこの水性混合物からセファクロルを回収するための方法にも関する。また本発明は、０．２５０未満である４００ｎｍにおける吸光度（Ａ４００）を有する結晶形態のセファクロルにも関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、７−アミノ−３−クロロ−セファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）を活性型Ｄ−フェニルグリシンと酵素の存在下で反応させることを含むセファクロルの合成方法と、セファクロルを含む水性混合物と、該水性混合物からのセファクロルの回収方法とに関する。
【０００２】
セファクロルの酵素合成方法は、様々な出典から分かっている。ＥＰ５６７３２３号明細書には、０℃と２０℃の間の温度および周囲ｐＨにおいて、７−ＡＣＣＡに対するＤ−フェニルグリシンメチルエステルのモル比が高い（５〜６）場合のセファクロルの酵素合成方法が開示されており、９３％および８８．２％の収率が得られる。β−ラクタム核に対する活性側鎖のモル比が高いと、関連の費用と、酵素合成反応において形成されて最終抗生物質（セファクロル）から分離するのが困難な副産物（例えば、Ｄ−フェニルグリシン）とがこれにより増大されるので望ましくない。
【０００３】
ＥＰ７３００３５号明細書は、セファクロルの酵素合成方法において、７−ＡＣＣＡに対するＤ−フェニルグリシンアミドのモル比を低減することを目的とする。酵素ペニシリンＧアミダーゼをアズラクトンポリマーに固定化することによって、７−ＡＣＣＡに対して９８％および９４％のセファクロルの収率が得られ、この場合の７−ＡＣＣＡに対するＤ−フェニルグリシンアミドのモル比は、２と３の間であった。
【０００４】
７−ＡＣＣＡに対する活性型Ｄ−フェニルグリシンのモル比が約２と３の間である場合、セファクロルの酵素合成反応中に形成される副産物の量はまだ多過ぎであり、その結果反応混合物からセファクロルを回収する間の処理性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の問題が生じること、および／または実質的に純粋な形態のセファクロルを得ることができないことが分かった。
【０００５】
本発明の目的は、７−ＡＣＣＡおよび活性型Ｄ−フェニルグリシンからセファクロルを酵素合成するために、これらの欠点を持たない方法を提供することである。
【０００６】
これは、セファクロルの酵素合成方法により本発明に従って達成され、該方法は、反応混合物中で酵素の存在下、７−アミノ−３−クロロ−セファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）と、活性型Ｄ−フェニルグリシン（ＰＧａ）とを反応させてセファクロルを形成することを含み、７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａは、反応の過程において反応混合物に添加される。
【０００７】
驚くことに、本発明に従うセファクロルの合成方法において生成されるセファクロルの７−ＡＣＣＡに対する量は、反応で使用される７−ＡＣＣＡおよびＰＧａの全ての量が反応の開始時に添加される酵素合成方法の場合よりも多いことが分かった。
【０００８】
驚くことに、本発明に従うセファクロルの合成方法におけるセファクロルの転化率は、９０％よりも高い、好ましくは９２％よりも高い、好ましくは９５％よりも高い、より好ましくは９６％よりも高い場合もあることが分かった。
【０００９】
本明細書において使用される場合、セファクロルの転化率は、反応混合物に添加された７−ＡＣＣＡの総量（モル数）に対して、生成されたセファクロルの量（モル数）と定義される。
【００１０】
セファクロルの収率は、添加された７−ＡＣＣＡの総量（モル数）に対して、反応混合物から回収されたセファクロルの量（モル数）と定義される。
【００１１】
さらに、本発明に従うセファクロルの合成方法では、非常に少量の副産物が形成されることが分かった。反応混合物中の副産物（例えば、Ｄ−フェニルグリシン）の濃度が低い場合、反応混合物から実質的に純粋な形態でセファクロルを回収することが可能であると思われた。実質的に純粋な形態のセファクロルは、少なくとも９４（ｗ／ｗ）％、好ましくは少なくとも９５（ｗ／ｗ）％、好ましくは少なくとも９６（ｗ／ｗ）％、好ましくは少なくとも９７（ｗ／ｗ）％のセファクロル、好ましくは少なくとも９８％ｗ／ｗ）％のセファクロル、好ましくは少なくとも９９％ｗ／ｗ）％のセファクロルを含む生成物と定義することができる。
【００１２】
本発明に従うセファクロルの合成方法では、７−ＡＣＣＡおよびＰＧａは、好ましくは、７−ＡＣＣＡに対して２よりも低い、好ましくは１．８よりも低い、より好ましくは１．５よりも低い、最も好ましくは１．２よりも低いＰＧａのモル比で反応混合物に添加される。７−ＡＣＣＡに対するＰＧａのモル比がこれらの値よりも低く保持されたとき、合成反応中に副産物はほとんど形成されず、セファクロルの回収の間、処理性の問題に出会うことはほとんど全くないことが分かった。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、７−ＡＣＣＡに対するＰＧａのモル比は、反応混合物に添加されたＰＧａのモル数での総量を、反応混合物に添加された７−ＡＣＣＡのモル数での総量で割った値と定義される。
【００１４】
本発明に従うセファクロルの酵素合成方法では、７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａは、反応の過程において反応混合物に添加される。好ましくは、反応混合物に添加すべき７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａの総量の少なくとも一部は、１０分よりも長い、好ましくは２０分よりも長い、好ましくは３０分よりも長い、好ましくは６０分よりも長い、好ましくは９０分よりも長い、そして好ましくは３６０分よりも短い、好ましくは２４０分よりも短い、好ましくは１２０分よりも短い合成反応の過程において、連続または間欠モードで反応混合物に添加される。
【００１５】
本発明に従うセファクロルの合成方法は、好ましくは、ＰＧａが合成反応の過程において反応混合物に添加される方法である。ＰＧａは、固体形態または溶液で反応混合物に添加され得る。
【００１６】
本発明に従う方法で使用されるＰＧａは、Ｄ−フェニルグリシンのアミド、例えば第１級、第２級または第３級アミド、もしくはエステルでよい。好ましくは、ＰＧａは、Ｄ−フェニルグリシンのエステル、例えばＤ−フェニルグリシンの低級アルキル（Ｃ１〜４）エステル、例えばＤ−フェニルグリシンのメチル、エチル、またはイソプロピルエステルである。好ましいのは、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル（ＰＧＭ）であり、最も好ましいのは、塩の形態のＰＧＭ、例えばＰＧＭのギ酸、メタンスルホン酸またはＨＣｌ塩である。他のＤ−フェニルグリシンエステルのギ酸、メタンスルホン酸、またはＨＣｌ塩も使用することができる。
【００１７】
本発明に従う方法において７−ＡＣＣＡをＰＧａと反応させてセファクロルを調製する際、触媒として適切な酵素が使用され得る。このような酵素は、例えば、ペニシリンＧアミダーゼまたはベンジルペニシリンアシラーゼとも呼ばれるペニシリンアシラーゼまたはペニシリンＧアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１１）という総称で知られている酵素である。ペニシリンＧアシラーゼは、ペニシリンの６−アシル基またはセファロスポリンの７−アシル基を加水分解することができる、微生物、特に細菌からの加水分解酵素の群を指す。ペニシリンアシラーゼ酵素は、その基質特異性およびその分子構造の両方に基づいて分類することができ、これは様々な刊行物に記載されており、例えば、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットおよび国際公開第９８／２０１２０号パンフレットが参照される。
【００１８】
ペニシリンアシラーゼ酵素が由来することができる微生物は、例えば、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、特にアセトバクター・パステウリアヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、特にアルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アファノクラジウム属（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、特にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、セファロスポリウム属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、クライベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、マイコプラナ属（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）、プロタミノバクター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、特にプロテウス・レットガリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇａｒｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、特にキサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉｉ）である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、セファクロルの合成方法における酵素は変異酵素である。
【００２０】
ペニシリンアシラーゼの変異体またはアシラーゼ変異体は、既知のどのペニシリンアシラーゼから出発しても作ることができる。変異アシラーゼは、例えば、当該技術分野において知られている組換えＤＮＡ法により、１つのアミノ酸残基を新しい残基に置き換えることによって野生型アシラーゼから誘導される。
【００２１】
本発明に従う方法で使用される変異ペニシリンアシラーゼは、例えば、大腸菌の野生型アシラーゼよりも高いＳ／Ｈ比を有するペニシリンアシラーゼでよい。
【００２２】
本明細書中での定義では、合成／加水分解（Ｓ／Ｈ）比は、酵素反応の間の特定の瞬間における、加水分解生成物に対する合成生成物のモル比と理解される。合成生成物は、活性側鎖およびβ−ラクタム核から形成されるβ−ラクタム抗生物質であると理解される。加水分解生成物は、活性側鎖の対応の酸であると理解される。
【００２３】
Ｓ／Ｈ比は、反応物の濃度、β−ラクタム核に対する活性側鎖のモル比、温度、ｐＨおよび酵素の関数である。理想的な状況では比較実験が実行され、基準酵素、好ましくは大腸菌ＰｅｎＧアシラーゼに対して同一条件下で特定の候補が試験される。どのようにしてＳ／Ｈ比を決定できるかについての詳細な説明は、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットにおいて与えられる。
【００２４】
好ましくは、変異酵素は、大腸菌のペニシリンアシラーゼのβ−サブユニットに相当するβ−サブユニットの２４位においてアミノ酸置換を有する変異ペニシリンアシラーゼである。好ましい実施形態では、国際公開第９８／２０１２０号パンフレットに記載されるように、大腸菌のペニシリンアシラーゼのβ−サブユニットに相当するβ−サブユニットの２４位におけるＬ−フェニル−アラニンは、その位置でＬ−アラニンによって置換されている。この変異は大腸菌からのＰｅｎＧアシラーゼにおいて適用することができるが、他の原料からのＰｅｎＧアシラーゼが用いられてもよい。アミノ酸の位置の番号付けは、大腸菌の野生型ペニシリンＧアシラーゼのアミノ酸配列の番号付けと一致する。
【００２５】
本発明のさらに好ましい実施形態では、酵素は、担体に固定化され得る。固定化された形態では、酵素は、容易に分離および再利用することができる。例えば、国際公開第９２／１２７８２号パンフレットに記載されるように単離され、ＥＰ２２２４６２号明細書および国際公開第９７／０４０８６号パンフレットに記載されるように固定化された大腸菌ペニシリンアシラーゼなど、固定化酵素はそれ自体知られており市販されている。
【００２６】
本発明に従うセファクロルの合成方法は、適切なｐＨで実行され得る。好ましくは、酵素合成反応は、６と８の間、好ましくは６．５と７．７の間、より好ましくは６．８と７．２の間のｐＨで実行される。反応混合物のｐＨは、有機または無機の適切な塩基、もしくは適切な有機または無機酸によって、正確なｐＨ値に調整され得る。
【００２７】
本発明に従うセファクロルの合成方法は、適切な温度で実行され得る。好ましくは、酵素合成反応は、５℃と３５℃の間、好ましくは８℃と２５℃の間、より好ましくは１８℃と２３℃の間の温度で実行される。酵素合成反応は、８℃と１６℃の間、好ましくは９℃と１５℃の間、好ましくは１０℃と１４℃の間の温度で実行されてもよい。
【００２８】
セファクロルの酵素合成方法における反応混合物は、原則として、水性反応混合物である。水性反応混合物は、好ましくは３０体積％未満、より好ましくは２０体積％未満、より好ましくは１０体積％未満、より好ましくは５体積％未満（液体の総体積に対して）の有機溶媒または有機溶媒の混合物を含有することができる。好ましくは、有機溶媒は、１〜７個の炭素原子を有するアルコール、例えば、モノ−アルコール（特に、メタノールまたはエタノール）、ジオール（特に、エチレングリコール）、またはトリオール（特に、グリセロール）である。好ましくは、水性反応混合物は、少なくとも７０体積％の水、より好ましくは少なくとも８０体積％、より好ましくは少なくとも９０体積％、最も好ましくは少なくとも９５体積％の水（液体の総体積に対して）を含有する。
【００２９】
酵素合成反応の最後に、反応混合物の温度は、５℃よりも低い温度、好ましくは４℃よりも低い温度よりも低く、そして好ましくは０℃よりも高い温度まで低下され得る。
【００３０】
酵素合成反応の最後に、形成されたセファクロルは、例えば遠心分離またはろ過によって水性反応混合物から回収され得る。
【００３１】
また本発明は、セファクロル、７−アミノ−３−クロロセファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）およびＤ−フェニルグリシン（ＰＧ）を含む水性混合物にも関し、該水性混合物は、１０（ｗ／ｗ）％よりも多い量のセファクロルと、２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量の７−ＡＣＣＡと、２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量のＰＧとを含む。この水性混合物は、本発明に従うセファクロルの合成方法によって有利に得ることができる。好ましくは、水性混合物は、１２（ｗ／ｗ）％よりも多い、より好ましくは１５（ｗ／ｗ）％よりも多い量のセファクロルを含み、好ましくは、水性混合物中のセファクロルの量は、５０（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは３０（ｗ／ｗ）％よりも少ない。好ましくは、水性混合物は、１．５（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは１（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは０．８（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは０．６（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは０．４（ｗ／ｗ）％よりも少ない量の７−ＡＣＣＡを含む。好ましくは、水性混合物は、１．５（ｗ／ｗ）％よりも少ない、好ましくは１．２（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは１（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは０．８（ｗ／ｗ）％よりも少ない量のＰＧを含む。驚くことに、セファクロルは、処理性の問題がほとんどまたは全くなく、本発明に従う水性混合物から実質的に純粋な形態で容易に回収され得ることが分かった。
【００３２】
また本発明は、例えば遠心分離またはろ過によって、本発明に従う水性混合物からセファクロルを回収するための方法にも関する。好ましくは、セファクロルは、上方で攪拌しながら底部ふるいを通して水性混合物から回収され（例えば、ＮＬ１００６２６７を参照）、セファクロル結晶を含む懸濁液が得られる。
【００３３】
本発明に従う水性混合物、またはセファクロル結晶を含む懸濁液は、０．５と２の間のｐＨに酸性化され、溶解したセファクロルを含む酸性溶液が得られる。０．５と２の間のｐＨへの酸性化は、塩酸、硝酸、および硫酸などの適切な無機酸、またはギ酸、酢酸、およびクエン酸などの適切な有機酸を用いて実行され得る。好ましくは、本明細書に従う水性混合物、またはセファクロル結晶を含む懸濁液を酸性化して、溶解したセファクロルを含む酸性溶液を得るために塩酸が使用される。
【００３４】
本発明に従う水性混合物、または溶解したセファクロルを含む酸性溶液は、４と６の間のｐＨにされ、それによりセファクロル結晶が形成される。本発明に従う水性混合物または溶解したセファクロルを含む酸性溶液を４と６の間のｐＨにするために適切な塩基は、アンモニア、水酸化ナトリウムまたはカリウムなどの無機塩基、もしくはトリエチルアミンまたはグアニジンなどの有機塩基である。好ましくは、溶解したセファクロルを含む酸性溶液を４と６の間のｐＨにするためにアンモニアが使用される。
【００３５】
セファクロルは、任意の適切な形態、通常はセファクロル水和物、例えばセファクロル一水和物の形態で結晶化され得る。
【００３６】
溶解したセファクロルを含む酸性溶液を４と６の間のｐＨにすることによって形成されるセファクロル結晶は、当該技術分野において既知の方法、例えば遠心分離またはろ過によって溶液から分離され、セファクロル結晶を含むウェットケーキが得られる。
【００３７】
セファクロル結晶を含むウェットケーキは、次に、当該技術分野において既知の方法で洗浄および乾燥され得る。
【００３８】
驚くことに、本発明に従う水性混合物からセファクロルを得るための方法によって得られるセファクロル結晶は、低着色のセファクロル結晶をもたらすことが分かった。好ましくは、低着色のセファクロル結晶は、本発明に従うセファクロルの酵素合成方法によって得られる水性混合物から得られる。
【００３９】
本発明の範囲において、セファクロル結晶の低着色とは、４００ｎｍにおける低吸光度、例えば０．２５０未満である４００ｎｍにおける吸光度であると定義され得る。
【００４０】
従って、１つの実施形態では、本発明は、０．５ｇの結晶形態のセファクロルを１０ｍｌの１ＮのＨＣｌ溶液中に溶解した溶液のＡ４００を室温で９０秒後に測定することにより、０．２５０未満、好ましくは０．２００未満、好ましくは０．１５０未満、好ましくは０．１００未満、好ましくは０．０９０未満、好ましくは０．０８０未満、好ましくは０．０７０未満、好ましくは０．０．０６０未満、好ましくは０．０５０未満である４００ｎｍにおける吸光度（Ａ４００）を有する結晶形態のセファクロルに関する。
【００４１】
セファクロルは、錯化剤の存在によって安定化され得る。錯化剤は、合成反応の間に反応混合物に添加されてもよいし、あるいは合成反応が完了した後の反応混合物、または本発明に従う水性混合物に添加されてもよい。また錯化剤は、セファクロルの回収方法の間に添加されてもよい。適切な錯化剤は、ナフタレン、キノリン、アントラキノンスルホン酸またはパラベンであり得る。錯化剤の例は、１−ナフトール、２−ナフトール、２，６−ジヒドロキシナフタレン、およびアントラキノン−１，５−ジスルホン酸でよい。
【００４２】
以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定すると解釈されてはならない。
【実施例】
【００４３】
酵素および固定化
本明細書中で使用されるペニシリンアシラーゼは、国際公開第Ａ−９８／２０１２０号パンフレットに記載されるような大腸菌ＰｅｎＧアシラーゼ変異Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａであった。ＥＰ２２２４６２号明細書および国際公開第９７／０４０８６号パンフレットに記載されるように、ゲル化剤としてゼラチンおよびキトサン、そして架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いて酵素を固定化した。
【００４４】
実施例１
ａ）セファクロルの酵素合成
１７５μｍのふるい底部を有する反応器に、５．０ｇの固定化ＰｅｎＧアシラーゼ変異Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａを入れた。１３．９ｇ（５８．１ｍｍｏｌ）の７−ＡＣＣＡ、０．１ｇの亜硫酸ナトリウムおよび６０ｇの水を２０℃で添加し、ｐＨをアンモニアで７．０に調整した。
【００４５】
別個の容器中で、１２．９ｇ（６３．８ｍｍｏｌ）のＰＧＭのＨＣｌ塩および２１ｇの水を２０℃で混合することによって、ＰＧＭ溶液を調製した。
【００４６】
ＰＧＭ溶液をｔ＝０分からｔ＝１１７分まで一定の速度で反応器中に投与した。最初のＰＧＭ溶液を投与したｔ＝０において酵素縮合反応が開始された。ｐＨをアンモニアにより７．０に保持した。
【００４７】
ｔ＝１５０分において、セファクロル、７−ＡＣＣＡ、ＰＧＭおよびＰＧの濃度は、それぞれ、１７．５（ｗ／ｗ）％、０．３３（ｗ／ｗ）％、０．２３（ｗ／ｗ）％および０．７９（ｗ／ｗ）％であった。
【００４８】
ｔ＝１５０分において、セファクロルへの転化率は、添加した７−ＡＣＣＡに対して９７．０％であり、Ｓ／Ｈ比は９．１であった。
【００４９】
続いて、塩酸溶液によってｐＨを５．３まで低下させた。温度を２℃まで低下させた。
【００５０】
ｂ）セファクロルの回収
上方で攪拌しながら底部ふるいを通して反応器を排出させた。得られたセファクロル懸濁液をガラスフィルタによりろ過した。得られた母液を反応器内に戻した。この順序のステップを５回繰り返した。このようにして、９５％よりも多い固体セファクロルを固体生体触媒から分離した。
【００５１】
セファクロルのウェットケーキおよび母液を合わせ、温度を２℃に保持した。合わせたセファクロルのウェットケーキおよび母液のｐＨを塩酸により０．８まで低下せ、得られた溶液を０．４５μｍフィルタによりろ過した。
【００５２】
結晶化反応容器に、３４ｇの水と、シードとしての１．０ｇのセファクロルとを入れた。３５℃において上記の酸性セファクロル溶液を６０分間で結晶化反応容器中に投与した。ｐＨをアンモニアで５．０に保持した。続いて、３０℃で３０分、２５℃で３０分、および２０℃で６０分というステップで温度を低下させた。懸濁液をガラスフィルタでろ過し、１体積の水および２体積のアセトンによりウェットケーキを洗浄した。乾燥させた後、１５．７ｇのセファクロル一水和物が得られた（純度９９．４％）。
【００５３】
比較例
ａ）セファクロルの酵素合成
１７５μｍのふるい底部を有する反応容器に、５．０ｇの固定化ＰｅｎＧアシラーゼ変異Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａを入れた。１３．９ｇ（５８．１ｍｍｏｌ）の７−ＡＣＣＡ、０．１ｇの亜硫酸ナトリウムおよび８１ｇの水を２０℃で添加し、ｐＨをアンモニアで７．０に調整した。１２．９ｇ（６３．８ｍｍｏｌ）のＰＧＭのＨＣｌ塩を反応器に添加し、酵素縮合反応が開始された。ｐＨをアンモニアで７．０に保持した。非常に粘性のソルベ様の懸濁液が形成された。
【００５４】
ｔ＝１５０分において、セファクロル、７−ＡＣＣＡ、ＰＧＭおよびＰＧの濃度は、それぞれ、１０．５％、４．７１％、０．１１％および３．９６％であった。セファクロルへの転化率は、７−ＡＣＣＡに対して５９％であり、Ｓ／Ｈ比は１．１であった。
【００５５】
続いて、塩酸溶液によってｐＨを５．３まで低下させた。温度を２℃まで低下させた。
【００５６】
ｂ）セファクロルの回収
上方で攪拌しながら底部ふるいを通して反応器を排出させる試みをした。しかしながら、非常に高い粘度のために、セファクロル懸濁液を固定化生体触媒から分離することは不可能であった。
【００５７】
実施例２
ａ）セファクロルの酵素合成
１７５μｍのふるい底部を有する反応容器に、１０．０ｇの固定化ＰｅｎＧアシラーゼ変異Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａを入れた。１３．９ｇ（５８．１ｍｍｏｌ）の７−ＡＣＣＡおよび５２．５ｇの水を１０℃で添加し、ｐＨをアンモニアで７．０に調整した。
【００５８】
別個の容器中で、１６．７ｇ（６３．７ｍｍｏｌ）のＰＧＭのメタンスルホン酸（ＭＳＡ）塩および２０ｇの水を１０℃で混合することによって、ＰＧＭ溶液を調製した。
【００５９】
ＰＧＭ溶液をｔ＝０分からｔ＝９０分まで一定の速度で反応器中に投与した。最初のＰＧＭ溶液を投与したｔ＝０において酵素縮合反応が開始された。ｐＨをアンモニアにより７．０に保持した。温度を１２℃に保持した。ｔ＝１２０分からｔ＝１８０分まで、温度を１２℃から２℃に直線的に低下させた。
【００６０】
ｔ＝１９０分において、セファクロル、７−ＡＣＣＡ、ＰＧＭおよびＰＧの濃度は、それぞれ、１８．１（ｗ／ｗ）％、０．２０（ｗ／ｗ）％、０．０４（ｗ／ｗ）％および０．６４（ｗ／ｗ）％であった。
【００６１】
ｔ＝１９０分において、生成したセファクロルの転化率は、添加した７−ＡＣＣＡに対して９８．０％であり、Ｓ／Ｈ比は１２であった。
【００６２】
続いて、塩酸溶液によってｐＨを５．０まで低下させた。
【００６３】
ｂ）セファクロルの回収
上方で攪拌しながら底部ふるいを通して反応器を排出させた。得られたセファクロル懸濁液をガラスフィルタによりろ過した。得られた母液を反応器内に戻した。この順序のステップを５回繰り返した。次に、２×１０ｍｌの水で酵素を洗浄した。このようにして、９５％以上のセファクロルを固体生体触媒からから分離した。
【００６４】
セファクロルのウェットケーキ、母液および洗浄水を合わせ、温度を２℃に保持した。合わせたセファクロルのウェットケーキおよび母液のｐＨを塩酸により０．５まで低下せ、得られた溶液を０．４５μｍフィルタによりろ過した。
【００６５】
結晶化反応容器に、１０ｇの水を入れた。２５℃において、上記の酸性セファクロル溶液を３０分間で結晶化反応容器中に投与した。ｐＨをアンモニアで５．０に保持した。続いて、懸濁液を１０℃でさらに３０分間攪拌した。懸濁液をガラスフィルタによりろ過し、ウェットケーキを２×１５ｍｌの水および２×１５ｍｌのアセトンで洗浄した。乾燥させた後、１８．３ｇのセファクロル一水和物が得られた（純度９９．６％）。
【００６６】
実施例３
セファクロルの着色
４００ｎｍにおける吸光度を測定することによって、実施例２から得られたセファクロル一水和物の着色を決定した。
【００６７】
０．５ｇのセファクロル一水和物を１０ｍｌの１ＮのＨＣｌ溶液中に溶解させた。パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）５５０Ｓスペクトロメーターにおいて、室温で４００ｎｍにおける吸光度（＝Ａ４００）を、基準溶液としての１ＮのＨＣｌ溶液に対して決定した。Ａ４００は、９０秒後に決定した。実施例２において記載されるように単離および乾燥後に直接測定されたセファクロル一水和物の吸光度は、０．０３６であった。実施例２からのセファクロル一水和物結晶を室温および７０％相対湿度で４週間貯蔵した後、セファクロル一水和物の吸光度は０．０４３であった。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、７−アミノ−３−クロロ−セファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）を活性型Ｄ−フェニルグリシンと酵素の存在下で反応させることを含むセファクロルの合成方法と、セファクロルを含む水性混合物と、該水性混合物からのセファクロルの回収方法とに関する。
【０００２】
セファクロルの酵素合成方法は、様々な出典から分かっている。ＥＰ５６７３２３号明細書には、０℃と２０℃の間の温度および周囲ｐＨにおいて、７−ＡＣＣＡに対するＤ−フェニルグリシンメチルエステルのモル比が高い（５〜６）場合のセファクロルの酵素合成方法が開示されており、９３％および８８．２％の収率が得られる。β−ラクタム核に対する活性側鎖のモル比が高いと、関連の費用と、酵素合成反応において形成されて最終抗生物質（セファクロル）から分離するのが困難な副産物（例えば、Ｄ−フェニルグリシン）とがこれにより増大されるので望ましくない。
【０００３】
ＥＰ７３００３５号明細書は、セファクロルの酵素合成方法において、７−ＡＣＣＡに対するＤ−フェニルグリシンアミドのモル比を低減することを目的とする。酵素ペニシリンＧアミダーゼをアズラクトンポリマーに固定化することによって、７−ＡＣＣＡに対して９８％および９４％のセファクロルの収率が得られ、この場合の７−ＡＣＣＡに対するＤ−フェニルグリシンアミドのモル比は、２と３の間であった。
【０００４】
７−ＡＣＣＡに対する活性型Ｄ−フェニルグリシンのモル比が約２と３の間である場合、セファクロルの酵素合成反応中に形成される副産物の量はまだ多過ぎであり、その結果反応混合物からセファクロルを回収する間の処理性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の問題が生じること、および／または実質的に純粋な形態のセファクロルを得ることができないことが分かった。
【０００５】
本発明の目的は、７−ＡＣＣＡおよび活性型Ｄ−フェニルグリシンからセファクロルを酵素合成するために、これらの欠点を持たない方法を提供することである。
【０００６】
これは、セファクロルの酵素合成方法により本発明に従って達成され、該方法は、反応混合物中で酵素の存在下、７−アミノ−３−クロロ−セファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）と、活性型Ｄ−フェニルグリシン（ＰＧａ）とを反応させてセファクロルを形成することを含み、７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａは、反応の過程において反応混合物に添加される。
【０００７】
驚くことに、本発明に従うセファクロルの合成方法において生成されるセファクロルの７−ＡＣＣＡに対する量は、反応で使用される７−ＡＣＣＡおよびＰＧａの全ての量が反応の開始時に添加される酵素合成方法の場合よりも多いことが分かった。
【０００８】
驚くことに、本発明に従うセファクロルの合成方法におけるセファクロルの転化率は、９０％よりも高い、好ましくは９２％よりも高い、好ましくは９５％よりも高い、より好ましくは９６％よりも高い場合もあることが分かった。
【０００９】
本明細書において使用される場合、セファクロルの転化率は、反応混合物に添加された７−ＡＣＣＡの総量（モル数）に対して、生成されたセファクロルの量（モル数）と定義される。
【００１０】
セファクロルの収率は、添加された７−ＡＣＣＡの総量（モル数）に対して、反応混合物から回収されたセファクロルの量（モル数）と定義される。
【００１１】
さらに、本発明に従うセファクロルの合成方法では、非常に少量の副産物が形成されることが分かった。反応混合物中の副産物（例えば、Ｄ−フェニルグリシン）の濃度が低い場合、反応混合物から実質的に純粋な形態でセファクロルを回収することが可能であると思われた。実質的に純粋な形態のセファクロルは、少なくとも９４（ｗ／ｗ）％、好ましくは少なくとも９５（ｗ／ｗ）％、好ましくは少なくとも９６（ｗ／ｗ）％、好ましくは少なくとも９７（ｗ／ｗ）％のセファクロル、好ましくは少なくとも９８％ｗ／ｗ）％のセファクロル、好ましくは少なくとも９９％ｗ／ｗ）％のセファクロルを含む生成物と定義することができる。
【００１２】
本発明に従うセファクロルの合成方法では、７−ＡＣＣＡおよびＰＧａは、好ましくは、７−ＡＣＣＡに対して２よりも低い、好ましくは１．８よりも低い、より好ましくは１．５よりも低い、最も好ましくは１．２よりも低いＰＧａのモル比で反応混合物に添加される。７−ＡＣＣＡに対するＰＧａのモル比がこれらの値よりも低く保持されたとき、合成反応中に副産物はほとんど形成されず、セファクロルの回収の間、処理性の問題に出会うことはほとんど全くないことが分かった。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、７−ＡＣＣＡに対するＰＧａのモル比は、反応混合物に添加されたＰＧａのモル数での総量を、反応混合物に添加された７−ＡＣＣＡのモル数での総量で割った値と定義される。
【００１４】
本発明に従うセファクロルの酵素合成方法では、７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａは、反応の過程において反応混合物に添加される。好ましくは、反応混合物に添加すべき７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａの総量の少なくとも一部は、１０分よりも長い、好ましくは２０分よりも長い、好ましくは３０分よりも長い、好ましくは６０分よりも長い、好ましくは９０分よりも長い、そして好ましくは３６０分よりも短い、好ましくは２４０分よりも短い、好ましくは１２０分よりも短い合成反応の過程において、連続または間欠モードで反応混合物に添加される。
【００１５】
本発明に従うセファクロルの合成方法は、好ましくは、ＰＧａが合成反応の過程において反応混合物に添加される方法である。ＰＧａは、固体形態または溶液で反応混合物に添加され得る。
【００１６】
本発明に従う方法で使用されるＰＧａは、Ｄ−フェニルグリシンのアミド、例えば第１級、第２級または第３級アミド、もしくはエステルでよい。好ましくは、ＰＧａは、Ｄ−フェニルグリシンのエステル、例えばＤ−フェニルグリシンの低級アルキル（Ｃ１〜４）エステル、例えばＤ−フェニルグリシンのメチル、エチル、またはイソプロピルエステルである。好ましいのは、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル（ＰＧＭ）であり、最も好ましいのは、塩の形態のＰＧＭ、例えばＰＧＭのギ酸、メタンスルホン酸またはＨＣｌ塩である。他のＤ−フェニルグリシンエステルのギ酸、メタンスルホン酸、またはＨＣｌ塩も使用することができる。
【００１７】
本発明に従う方法において７−ＡＣＣＡをＰＧａと反応させてセファクロルを調製する際、触媒として適切な酵素が使用され得る。このような酵素は、例えば、ペニシリンＧアミダーゼまたはベンジルペニシリンアシラーゼとも呼ばれるペニシリンアシラーゼまたはペニシリンＧアシラーゼ（ＥＣ３．５．１．１１）という総称で知られている酵素である。ペニシリンＧアシラーゼは、ペニシリンの６−アシル基またはセファロスポリンの７−アシル基を加水分解することができる、微生物、特に細菌からの加水分解酵素の群を指す。ペニシリンアシラーゼ酵素は、その基質特異性およびその分子構造の両方に基づいて分類することができ、これは様々な刊行物に記載されており、例えば、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットおよび国際公開第９８／２０１２０号パンフレットが参照される。
【００１８】
ペニシリンアシラーゼ酵素が由来することができる微生物は、例えば、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、特にアセトバクター・パステウリアヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、特にアルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、アファノクラジウム属（Ａｐｈａｎｏｃｌａｄｉｕｍ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、特にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、セファロスポリウム属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、クライベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、マイコプラナ属（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）、プロタミノバクター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、特にプロテウス・レットガリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇａｒｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、特にキサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉｉ）である。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、セファクロルの合成方法における酵素は変異酵素である。
【００２０】
ペニシリンアシラーゼの変異体またはアシラーゼ変異体は、既知のどのペニシリンアシラーゼから出発しても作ることができる。変異アシラーゼは、例えば、当該技術分野において知られている組換えＤＮＡ法により、１つのアミノ酸残基を新しい残基に置き換えることによって野生型アシラーゼから誘導される。
【００２１】
本発明に従う方法で使用される変異ペニシリンアシラーゼは、例えば、大腸菌の野生型アシラーゼよりも高いＳ／Ｈ比を有するペニシリンアシラーゼでよい。
【００２２】
本明細書中での定義では、合成／加水分解（Ｓ／Ｈ）比は、酵素反応の間の特定の瞬間における、加水分解生成物に対する合成生成物のモル比と理解される。合成生成物は、活性側鎖およびβ−ラクタム核から形成されるβ−ラクタム抗生物質であると理解される。加水分解生成物は、活性側鎖の対応の酸であると理解される。
【００２３】
Ｓ／Ｈ比は、反応物の濃度、β−ラクタム核に対する活性側鎖のモル比、温度、ｐＨおよび酵素の関数である。理想的な状況では比較実験が実行され、基準酵素、好ましくは大腸菌ＰｅｎＧアシラーゼに対して同一条件下で特定の候補が試験される。どのようにしてＳ／Ｈ比を決定できるかについての詳細な説明は、国際公開第０３／０５５９９８号パンフレットにおいて与えられる。
【００２４】
好ましくは、変異酵素は、大腸菌のペニシリンアシラーゼのβ−サブユニットに相当するβ−サブユニットの２４位においてアミノ酸置換を有する変異ペニシリンアシラーゼである。好ましい実施形態では、国際公開第９８／２０１２０号パンフレットに記載されるように、大腸菌のペニシリンアシラーゼのβ−サブユニットに相当するβ−サブユニットの２４位におけるＬ−フェニル−アラニンは、その位置でＬ−アラニンによって置換されている。この変異は大腸菌からのＰｅｎＧアシラーゼにおいて適用することができるが、他の原料からのＰｅｎＧアシラーゼが用いられてもよい。アミノ酸の位置の番号付けは、大腸菌の野生型ペニシリンＧアシラーゼのアミノ酸配列の番号付けと一致する。
【００２５】
本発明のさらに好ましい実施形態では、酵素は、担体に固定化され得る。固定化された形態では、酵素は、容易に分離および再利用することができる。例えば、国際公開第９２／１２７８２号パンフレットに記載されるように単離され、ＥＰ２２２４６２号明細書および国際公開第９７／０４０８６号パンフレットに記載されるように固定化された大腸菌ペニシリンアシラーゼなど、固定化酵素はそれ自体知られており市販されている。
【００２６】
本発明に従うセファクロルの合成方法は、適切なｐＨで実行され得る。好ましくは、酵素合成反応は、６と８の間、好ましくは６．５と７．７の間、より好ましくは６．８と７．２の間のｐＨで実行される。反応混合物のｐＨは、有機または無機の適切な塩基、もしくは適切な有機または無機酸によって、正確なｐＨ値に調整され得る。
【００２７】
本発明に従うセファクロルの合成方法は、適切な温度で実行され得る。好ましくは、酵素合成反応は、５℃と３５℃の間、好ましくは８℃と２５℃の間、より好ましくは１８℃と２３℃の間の温度で実行される。酵素合成反応は、８℃と１６℃の間、好ましくは９℃と１５℃の間、好ましくは１０℃と１４℃の間の温度で実行されてもよい。
【００２８】
セファクロルの酵素合成方法における反応混合物は、原則として、水性反応混合物である。水性反応混合物は、好ましくは３０体積％未満、より好ましくは２０体積％未満、より好ましくは１０体積％未満、より好ましくは５体積％未満（液体の総体積に対して）の有機溶媒または有機溶媒の混合物を含有することができる。好ましくは、有機溶媒は、１〜７個の炭素原子を有するアルコール、例えば、モノ−アルコール（特に、メタノールまたはエタノール）、ジオール（特に、エチレングリコール）、またはトリオール（特に、グリセロール）である。好ましくは、水性反応混合物は、少なくとも７０体積％の水、より好ましくは少なくとも８０体積％、より好ましくは少なくとも９０体積％、最も好ましくは少なくとも９５体積％の水（液体の総体積に対して）を含有する。
【００２９】
酵素合成反応の最後に、反応混合物の温度は、５℃よりも低い温度、好ましくは４℃よりも低い温度よりも低く、そして好ましくは０℃よりも高い温度まで低下され得る。
【００３０】
酵素合成反応の最後に、形成されたセファクロルは、例えば遠心分離またはろ過によって水性反応混合物から回収され得る。
【００３１】
また本発明は、セファクロル、７−アミノ−３−クロロセファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）およびＤ−フェニルグリシン（ＰＧ）を含む水性混合物にも関し、該水性混合物は、１０（ｗ／ｗ）％よりも多い量のセファクロルと、２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量の７−ＡＣＣＡと、２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量のＰＧとを含む。この水性混合物は、本発明に従うセファクロルの合成方法によって有利に得ることができる。好ましくは、水性混合物は、１２（ｗ／ｗ）％よりも多い、より好ましくは１５（ｗ／ｗ）％よりも多い量のセファクロルを含み、好ましくは、水性混合物中のセファクロルの量は、５０（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは３０（ｗ／ｗ）％よりも少ない。好ましくは、水性混合物は、１．５（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは１（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは０．８（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは０．６（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは０．４（ｗ／ｗ）％よりも少ない量の７−ＡＣＣＡを含む。好ましくは、水性混合物は、１．５（ｗ／ｗ）％よりも少ない、好ましくは１．２（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは１（ｗ／ｗ）％よりも少ない、より好ましくは０．８（ｗ／ｗ）％よりも少ない量のＰＧを含む。驚くことに、セファクロルは、処理性の問題がほとんどまたは全くなく、本発明に従う水性混合物から実質的に純粋な形態で容易に回収され得ることが分かった。
【００３２】
また本発明は、例えば遠心分離またはろ過によって、本発明に従う水性混合物からセファクロルを回収するための方法にも関する。好ましくは、セファクロルは、上方で攪拌しながら底部ふるいを通して水性混合物から回収され（例えば、ＮＬ１００６２６７を参照）、セファクロル結晶を含む懸濁液が得られる。
【００３３】
本発明に従う水性混合物、またはセファクロル結晶を含む懸濁液は、０．５と２の間のｐＨに酸性化され、溶解したセファクロルを含む酸性溶液が得られる。０．５と２の間のｐＨへの酸性化は、塩酸、硝酸、および硫酸などの適切な無機酸、またはギ酸、酢酸、およびクエン酸などの適切な有機酸を用いて実行され得る。好ましくは、本明細書に従う水性混合物、またはセファクロル結晶を含む懸濁液を酸性化して、溶解したセファクロルを含む酸性溶液を得るために塩酸が使用される。
【００３４】
本発明に従う水性混合物、または溶解したセファクロルを含む酸性溶液は、４と６の間のｐＨにされ、それによりセファクロル結晶が形成される。本発明に従う水性混合物または溶解したセファクロルを含む酸性溶液を４と６の間のｐＨにするために適切な塩基は、アンモニア、水酸化ナトリウムまたはカリウムなどの無機塩基、もしくはトリエチルアミンまたはグアニジンなどの有機塩基である。好ましくは、溶解したセファクロルを含む酸性溶液を４と６の間のｐＨにするためにアンモニアが使用される。
【００３５】
セファクロルは、任意の適切な形態、通常はセファクロル水和物、例えばセファクロル一水和物の形態で結晶化され得る。
【００３６】
溶解したセファクロルを含む酸性溶液を４と６の間のｐＨにすることによって形成されるセファクロル結晶は、当該技術分野において既知の方法、例えば遠心分離またはろ過によって溶液から分離され、セファクロル結晶を含むウェットケーキが得られる。
【００３７】
セファクロル結晶を含むウェットケーキは、次に、当該技術分野において既知の方法で洗浄および乾燥され得る。
【００３８】
驚くことに、本発明に従う水性混合物からセファクロルを得るための方法によって得られるセファクロル結晶は、低着色のセファクロル結晶をもたらすことが分かった。好ましくは、低着色のセファクロル結晶は、本発明に従うセファクロルの酵素合成方法によって得られる水性混合物から得られる。
【００３９】
本発明の範囲において、セファクロル結晶の低着色とは、４００ｎｍにおける低吸光度、例えば０．２５０未満である４００ｎｍにおける吸光度であると定義され得る。
【００４０】
従って、１つの実施形態では、本発明は、０．５ｇの結晶形態のセファクロルを１０ｍｌの１ＮのＨＣｌ溶液中に溶解した溶液のＡ４００を室温で９０秒後に測定することにより、０．２５０未満、好ましくは０．２００未満、好ましくは０．１５０未満、好ましくは０．１００未満、好ましくは０．０９０未満、好ましくは０．０８０未満、好ましくは０．０７０未満、好ましくは０．０．０６０未満、好ましくは０．０５０未満である４００ｎｍにおける吸光度（Ａ４００）を有する結晶形態のセファクロルに関する。
【００４１】
セファクロルは、錯化剤の存在によって安定化され得る。錯化剤は、合成反応の間に反応混合物に添加されてもよいし、あるいは合成反応が完了した後の反応混合物、または本発明に従う水性混合物に添加されてもよい。また錯化剤は、セファクロルの回収方法の間に添加されてもよい。適切な錯化剤は、ナフタレン、キノリン、アントラキノンスルホン酸またはパラベンであり得る。錯化剤の例は、１−ナフトール、２−ナフトール、２，６−ジヒドロキシナフタレン、およびアントラキノン−１，５−ジスルホン酸でよい。
【００４２】
以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定すると解釈されてはならない。
【実施例】
【００４３】
酵素および固定化
本明細書中で使用されるペニシリンアシラーゼは、国際公開第Ａ−９８／２０１２０号パンフレットに記載されるような大腸菌ＰｅｎＧアシラーゼ変異Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａであった。ＥＰ２２２４６２号明細書および国際公開第９７／０４０８６号パンフレットに記載されるように、ゲル化剤としてゼラチンおよびキトサン、そして架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いて酵素を固定化した。
【００４４】
実施例１
ａ）セファクロルの酵素合成
１７５μｍのふるい底部を有する反応器に、５．０ｇの固定化ＰｅｎＧアシラーゼ変異Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａを入れた。１３．９ｇ（５８．１ｍｍｏｌ）の７−ＡＣＣＡ、０．１ｇの亜硫酸ナトリウムおよび６０ｇの水を２０℃で添加し、ｐＨをアンモニアで７．０に調整した。
【００４５】
別個の容器中で、１２．９ｇ（６３．８ｍｍｏｌ）のＰＧＭのＨＣｌ塩および２１ｇの水を２０℃で混合することによって、ＰＧＭ溶液を調製した。
【００４６】
ＰＧＭ溶液をｔ＝０分からｔ＝１１７分まで一定の速度で反応器中に投与した。最初のＰＧＭ溶液を投与したｔ＝０において酵素縮合反応が開始された。ｐＨをアンモニアにより７．０に保持した。
【００４７】
ｔ＝１５０分において、セファクロル、７−ＡＣＣＡ、ＰＧＭおよびＰＧの濃度は、それぞれ、１７．５（ｗ／ｗ）％、０．３３（ｗ／ｗ）％、０．２３（ｗ／ｗ）％および０．７９（ｗ／ｗ）％であった。
【００４８】
ｔ＝１５０分において、セファクロルへの転化率は、添加した７−ＡＣＣＡに対して９７．０％であり、Ｓ／Ｈ比は９．１であった。
【００４９】
続いて、塩酸溶液によってｐＨを５．３まで低下させた。温度を２℃まで低下させた。
【００５０】
ｂ）セファクロルの回収
上方で攪拌しながら底部ふるいを通して反応器を排出させた。得られたセファクロル懸濁液をガラスフィルタによりろ過した。得られた母液を反応器内に戻した。この順序のステップを５回繰り返した。このようにして、９５％よりも多い固体セファクロルを固体生体触媒から分離した。
【００５１】
セファクロルのウェットケーキおよび母液を合わせ、温度を２℃に保持した。合わせたセファクロルのウェットケーキおよび母液のｐＨを塩酸により０．８まで低下せ、得られた溶液を０．４５μｍフィルタによりろ過した。
【００５２】
結晶化反応容器に、３４ｇの水と、シードとしての１．０ｇのセファクロルとを入れた。３５℃において上記の酸性セファクロル溶液を６０分間で結晶化反応容器中に投与した。ｐＨをアンモニアで５．０に保持した。続いて、３０℃で３０分、２５℃で３０分、および２０℃で６０分というステップで温度を低下させた。懸濁液をガラスフィルタでろ過し、１体積の水および２体積のアセトンによりウェットケーキを洗浄した。乾燥させた後、１５．７ｇのセファクロル一水和物が得られた（純度９９．４％）。
【００５３】
比較例
ａ）セファクロルの酵素合成
１７５μｍのふるい底部を有する反応容器に、５．０ｇの固定化ＰｅｎＧアシラーゼ変異Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａを入れた。１３．９ｇ（５８．１ｍｍｏｌ）の７−ＡＣＣＡ、０．１ｇの亜硫酸ナトリウムおよび８１ｇの水を２０℃で添加し、ｐＨをアンモニアで７．０に調整した。１２．９ｇ（６３．８ｍｍｏｌ）のＰＧＭのＨＣｌ塩を反応器に添加し、酵素縮合反応が開始された。ｐＨをアンモニアで７．０に保持した。非常に粘性のソルベ様の懸濁液が形成された。
【００５４】
ｔ＝１５０分において、セファクロル、７−ＡＣＣＡ、ＰＧＭおよびＰＧの濃度は、それぞれ、１０．５％、４．７１％、０．１１％および３．９６％であった。セファクロルへの転化率は、７−ＡＣＣＡに対して５９％であり、Ｓ／Ｈ比は１．１であった。
【００５５】
続いて、塩酸溶液によってｐＨを５．３まで低下させた。温度を２℃まで低下させた。
【００５６】
ｂ）セファクロルの回収
上方で攪拌しながら底部ふるいを通して反応器を排出させる試みをした。しかしながら、非常に高い粘度のために、セファクロル懸濁液を固定化生体触媒から分離することは不可能であった。
【００５７】
実施例２
ａ）セファクロルの酵素合成
１７５μｍのふるい底部を有する反応容器に、１０．０ｇの固定化ＰｅｎＧアシラーゼ変異Ｐｈｅ−Ｂ２４−Ａｌａを入れた。１３．９ｇ（５８．１ｍｍｏｌ）の７−ＡＣＣＡおよび５２．５ｇの水を１０℃で添加し、ｐＨをアンモニアで７．０に調整した。
【００５８】
別個の容器中で、１６．７ｇ（６３．７ｍｍｏｌ）のＰＧＭのメタンスルホン酸（ＭＳＡ）塩および２０ｇの水を１０℃で混合することによって、ＰＧＭ溶液を調製した。
【００５９】
ＰＧＭ溶液をｔ＝０分からｔ＝９０分まで一定の速度で反応器中に投与した。最初のＰＧＭ溶液を投与したｔ＝０において酵素縮合反応が開始された。ｐＨをアンモニアにより７．０に保持した。温度を１２℃に保持した。ｔ＝１２０分からｔ＝１８０分まで、温度を１２℃から２℃に直線的に低下させた。
【００６０】
ｔ＝１９０分において、セファクロル、７−ＡＣＣＡ、ＰＧＭおよびＰＧの濃度は、それぞれ、１８．１（ｗ／ｗ）％、０．２０（ｗ／ｗ）％、０．０４（ｗ／ｗ）％および０．６４（ｗ／ｗ）％であった。
【００６１】
ｔ＝１９０分において、生成したセファクロルの転化率は、添加した７−ＡＣＣＡに対して９８．０％であり、Ｓ／Ｈ比は１２であった。
【００６２】
続いて、塩酸溶液によってｐＨを５．０まで低下させた。
【００６３】
ｂ）セファクロルの回収
上方で攪拌しながら底部ふるいを通して反応器を排出させた。得られたセファクロル懸濁液をガラスフィルタによりろ過した。得られた母液を反応器内に戻した。この順序のステップを５回繰り返した。次に、２×１０ｍｌの水で酵素を洗浄した。このようにして、９５％以上のセファクロルを固体生体触媒からから分離した。
【００６４】
セファクロルのウェットケーキ、母液および洗浄水を合わせ、温度を２℃に保持した。合わせたセファクロルのウェットケーキおよび母液のｐＨを塩酸により０．５まで低下せ、得られた溶液を０．４５μｍフィルタによりろ過した。
【００６５】
結晶化反応容器に、１０ｇの水を入れた。２５℃において、上記の酸性セファクロル溶液を３０分間で結晶化反応容器中に投与した。ｐＨをアンモニアで５．０に保持した。続いて、懸濁液を１０℃でさらに３０分間攪拌した。懸濁液をガラスフィルタによりろ過し、ウェットケーキを２×１５ｍｌの水および２×１５ｍｌのアセトンで洗浄した。乾燥させた後、１８．３ｇのセファクロル一水和物が得られた（純度９９．６％）。
【００６６】
実施例３
セファクロルの着色
４００ｎｍにおける吸光度を測定することによって、実施例２から得られたセファクロル一水和物の着色を決定した。
【００６７】
０．５ｇのセファクロル一水和物を１０ｍｌの１ＮのＨＣｌ溶液中に溶解させた。パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）５５０Ｓスペクトロメーターにおいて、室温で４００ｎｍにおける吸光度（＝Ａ４００）を、基準溶液としての１ＮのＨＣｌ溶液に対して決定した。Ａ４００は、９０秒後に決定した。実施例２において記載されるように単離および乾燥後に直接測定されたセファクロル一水和物の吸光度は、０．０３６であった。実施例２からのセファクロル一水和物結晶を室温および７０％相対湿度で４週間貯蔵した後、セファクロル一水和物の吸光度は０．０４３であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応混合物中で酵素の存在下、７−アミノ−３−クロロセファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）と、活性型Ｄ−フェニルグリシン（ＰＧａ）とを反応させてセファクロルを形成することを含む、セファクロルの合成方法であって、７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａが、反応の過程において反応混合物に添加されることを特徴とする方法。
【請求項２】
活性型Ｄ−フェニルグリシン（ＰＧａ）が、反応の過程において反応混合物に添加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
７−ＡＣＣＡおよびＰＧａが、７−ＡＣＣＡに対して２よりも低いＰＧａのモル比で反応混合物に添加されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＧａがＤ−フェニルグリシンのエステルであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が変異酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異酵素が、大腸菌のペニシリンアシラーゼのβ−サブユニットに相当するβ−サブユニットの２４位においてアミノ酸置換を有する変異ペニシリンアシラーゼであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
６と８の間のｐＨで合成反応が実行されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
５℃と３５℃の間の温度で合成反応が実行されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１０（ｗ／ｗ）％よりも多い量のセファクロル、２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量の７−アミノ−３−クロロセファロスポラン酸、および２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量のＤ−フェニルグリシンを含む水性混合物。
【請求項１０】
請求項９に記載の水性混合物からセファクロルを回収することを含む、セファクロルの入手方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記水性混合物を４と６の間のｐＨにすることを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、上方で攪拌しながら底部ふるいを通してセファクロルを回収して、セファクロル結晶を含む懸濁液を得ることを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の水性混合物または請求項１２に記載のセファクロル結晶を含む懸濁液を０．５と２の間のｐＨまで酸性にして、溶解したセファクロルを含む酸性溶液を得ることを含む、セファクロルの入手方法。
【請求項１４】
さらに、溶解したセファクロルを含む前記酸性溶液が、適切な塩基により４と６の間のｐＨにされ、それによりセファクロル結晶が形成されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１０ｍｌの１ＮのＨＣｌ溶液中に溶解された０．５ｇの結晶形態のセファクロルの溶液のＡ４００を、１ＮのＨＣｌ基準溶液に対して室温で９０秒後に測定することによって、０．２５０未満である４００ｎｍにおける吸光度（Ａ４００）を有する結晶形態のセファクロル。
【請求項１】
反応混合物中で酵素の存在下、７−アミノ−３−クロロセファロスポラン酸（７−ＡＣＣＡ）と、活性型Ｄ−フェニルグリシン（ＰＧａ）とを反応させてセファクロルを形成することを含む、セファクロルの合成方法であって、７−ＡＣＣＡおよび／またはＰＧａが、反応の過程において反応混合物に添加されることを特徴とする方法。
【請求項２】
活性型Ｄ−フェニルグリシン（ＰＧａ）が、反応の過程において反応混合物に添加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
７−ＡＣＣＡおよびＰＧａが、７−ＡＣＣＡに対して２よりも低いＰＧａのモル比で反応混合物に添加されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＧａがＤ−フェニルグリシンのエステルであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が変異酵素であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異酵素が、大腸菌のペニシリンアシラーゼのβ−サブユニットに相当するβ−サブユニットの２４位においてアミノ酸置換を有する変異ペニシリンアシラーゼであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
６と８の間のｐＨで合成反応が実行されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
５℃と３５℃の間の温度で合成反応が実行されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１０（ｗ／ｗ）％よりも多い量のセファクロル、２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量の７−アミノ−３−クロロセファロスポラン酸、および２（ｗ／ｗ）％よりも少ない量のＤ−フェニルグリシンを含む水性混合物。
【請求項１０】
請求項９に記載の水性混合物からセファクロルを回収することを含む、セファクロルの入手方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記水性混合物を４と６の間のｐＨにすることを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、上方で攪拌しながら底部ふるいを通してセファクロルを回収して、セファクロル結晶を含む懸濁液を得ることを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の水性混合物または請求項１２に記載のセファクロル結晶を含む懸濁液を０．５と２の間のｐＨまで酸性にして、溶解したセファクロルを含む酸性溶液を得ることを含む、セファクロルの入手方法。
【請求項１４】
さらに、溶解したセファクロルを含む前記酸性溶液が、適切な塩基により４と６の間のｐＨにされ、それによりセファクロル結晶が形成されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１０ｍｌの１ＮのＨＣｌ溶液中に溶解された０．５ｇの結晶形態のセファクロルの溶液のＡ４００を、１ＮのＨＣｌ基準溶液に対して室温で９０秒後に測定することによって、０．２５０未満である４００ｎｍにおける吸光度（Ａ４００）を有する結晶形態のセファクロル。
【公表番号】特表２００８−５２５０４４（Ｐ２００８−５２５０４４Ａ）
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８８１３（Ｐ２００７−５４８８１３）
【出願日】平成１７年１２月２３日（２００５．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５７１５５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９９８４
【国際公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２３日（２００５．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５７１５５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６９９８４
【国際公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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