セルラーゼ及びセロオリゴ糖の製造方法
【課題】セルロース系物質を原料としセルラーゼの存在下で酵素分解することでセロオリゴ糖を選択的に生産する際に、セロオリゴ糖選択率を高めることができるセルラーゼの製造方法、及びこのセルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法を提供。
【解決手段】セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させ、該懸濁液又は水溶液のｐＨを７以上にして３０℃以上に加熱することを含む、β−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。また、該セルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法。
【解決手段】セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させ、該懸濁液又は水溶液のｐＨを７以上にして３０℃以上に加熱することを含む、β−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。また、該セルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロオリゴ糖を効率的に得るためのβ−グルコシダーゼが選択的に抑制されたセルラーゼの製造方法、及びセロオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セロオリゴ糖は、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオースの総称であり、グルコピラノース単位が１〜６個、β−１，４結合した少糖類である。近年、セロオリゴ糖は、他のオリゴ糖と同様に、その生理機能が明らかになりつつあり、機能性食品の新素材として期待されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
一般に、セロオリゴ糖を得る方法としては、セルロース系物質をセルラーゼにより分解する方法が知られている。セルラーゼによるセルロースの分解機構は、（１）まず、セルロース分解酵素の作用で、セルロースからセロビオースを含むセロオリゴ糖が生成する反応、（２）セルロースから直接グルコースを生成する反応、（３）β−グルコシダーゼの作用で、セロオリゴ糖からグルコースが生成する反応が含まれる（非特許文献２）。この反応系において、セロオリゴ糖の生産性を高めるには、セルラーゼに含まれるβ−グルコシダーゼを抑制し、セロオリゴ糖からグルコースへの分解を抑制し、セロオリゴ糖の選択率を高めることが有効である。
【０００４】
従来、セロオリゴ糖の選択率を高めることにより、セロオリゴ糖の生産性を高める検討は、数多くなされてきた（特許文献１〜７）。以下に、既存の技術と本発明の違いについて説明する。特定のセルラーゼを使用し、セルロースを酵素分解することで、セロオリゴ糖の選択率を向上させる方法としては、以下のものが挙げられる。
【０００５】
特許文献１は、セロビブリオ属に属する微生物が生産するセルラーゼの作用により、水性反応液中にてセルロース系物質からセロオリゴ糖を製造する方法において、限外ろ過反応器を組み合わせることにより生成物阻害を解除して、セロオリゴ糖を生成蓄積せしめるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この方法を用いると、限外ろ過により、酵素と生成物を分離し、酵素の活性低下を防ぐことができる。しかし、この方法により得られるセルラーゼは、結晶性のセルロースに作用が小さいことが問題であった。また、非晶性のセルロースを得るために、セルロース系物質を前処理する必要があるため、製造工程が煩雑になる問題があった。
【０００６】
特許文献２には、セルロースをセルラーゼで分解し、セロオリゴ糖を生成させる方法において、予めセルラーゼをｐＨ３．５〜５．０に平衡化した弱酸性陽イオン交換樹脂に接触させることにより、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼを選択的に除去し、かかるβ−グルコシダーゼを除去したセルラーゼをセルロースに接触させるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この製造方法によると、セルロースの酵素分解により、グルコースを低減し、セロオリゴ糖が６０％以上の分解生成物を得ることができる。しかしながら、該製造方法では、セルロース中のβ−グルコシダーゼを除去する工程が必要となり、セロオリゴ糖製造工程が複雑になるという問題があった。また、このセルラーゼ精製工程では、未処理セルラーゼに対し、７５〜１０００倍の陽イオン交換樹脂が必要となるため、セルラーゼ処理量が制限され、セロオリゴ糖の生産性が充分ではなく、セルラーゼ精製コスト、陽イオン交換樹脂の分離精製剤コストが高くなるという問題があった。
【０００７】
特許文献３には、不溶性セルロースまたはセルロース含有物質とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来のセルラーゼを水性媒体中で保温した後、固形画分を分離し、該固形画分に水溶性溶液を加え、セロビオースを得る方法が開示されている。特許文献４には、セルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着し、その後、酵素分解するセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。特許文献５には、セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含みかつ不純物としてβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、β−グルコシダーゼを含む画分を選択的に分離除去することを特徴とするセルラーゼからのβ−グルコシダーゼの分離除去方法が記載されている。これらの製造方法では、セロビオース製造工程に混入するβ-グルコシダーゼを低減することが可能となり、選択的にセロビオースを得ることができる。しかしながら、これらの方法は、固形画分へのセルラーゼ吸着工程および固形画分分離工程が必要となるため、プロセスが複雑となる問題があった。
【０００８】
上述の特許文献２〜５に対して、本発明は、イオン交換樹脂による処理等、セルロースとの分画等の煩雑な工程を経ずに、セルラーゼ懸濁液又は水溶液から、そのままβ−グルコシダーゼを抑制できる点で優れている。
【０００９】
特許文献６には、セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液中の、β−グルコシダーゼ活性と結晶性セルロース分解活性の活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶性セルロース分解活性）が０．３５以下であるセルラーゼの製造方法、及び培養液中のｐＨをｐＨ３．５未満に制御するセルラーゼの製造方法が開示されている。また、特許文献７には、綿実粕を０．１〜１０質量％含有する液体培地にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を接種し、これを培養することにより製造するセルラーゼを含む酵素液の製造方法、及び液体培地が、さらに０．０１〜１０質量％の硫酸アンモニウムを含有するセルラーゼを含む酵素液の製造方法が開示されている。確かに、これらの方法では、培養条件を高度に制御することで、セルロース分解活性が高く、β−グルコシダーゼが低い酵素が得られる。それに対し、本発明は、特別な培養を経ずとも、通常の培養得られたセルラーゼ、又は市販のセルラーゼを処理できるものであり、特許文献６及び特許文献７は、この点で全く異なる。
【００１０】
上記の通り、従来は、セロオリゴ糖を効率的に得るために、セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させ、懸濁液又は水溶液の特定のｐＨにし、特定の温度に加熱する、β−グルコシダーゼ活性を選択的に抑制されたセルラーゼの製造方法、及び該セルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法は知られていなかった。
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５，Ｎｏ２，９１−９７（１９９８）
【非特許文献２】「セルラーゼ」講談社サイエンティフィック発行、９７−１０４（１９８７）
【特許文献１】特開平０１−２５６３９４号公報
【特許文献２】特開平０５−１１５２９３号公報
【特許文献３】特開昭６３−２２６２９４号公報
【特許文献４】特開２００６−２０４２９４号公報
【特許文献５】特開２００６−３４２０６号公報
【特許文献６】特開２００６−２９６３５８号公報
【特許文献７】特開２００７−２１５５０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、セルロース系物質を原料としセルラーゼの存在下で酵素分解することでセロオリゴ糖を選択的に生産する際に、セロオリゴ糖選択率を高めることができるセルラーゼの製造方法、及びこのセルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、セルロース系物質を酵素分解するセロオリゴ糖の製造において、セルラーゼを特定のｐＨ及び特定の温度で加熱することによって、β−グルコシダーゼ活性を選択的に抑制できることを見出し、本発明を達成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の通りである。
【００１４】
（１） セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させ、該懸濁液又は水溶液のｐＨを７以上にして３０℃以上に加熱することを含む、β−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。
（２）０．０１質量％以上のセルロース系物質の共存下において該懸濁液又は水溶液を３０℃以上に加熱する、請求項１に記載のβ−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。
（３）（ｉ）（１）又は（２）に記載の方法によりβ−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼを製造する工程、及び（ｉｉ）上記工程（ｉ）で得られたセルラーゼを用いてセルロース系物質を分解する工程を含む、セロオリゴ糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、セロオリゴ糖選択率が高いセルラーゼを製造することができ、該セルラーゼをセロオリゴ糖の製造に使用することで、セロオリゴ糖を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のセルラーゼは、セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来のものである。
本発明で使用されるセルラーゼ生産菌は、酵素を分泌し、その酵素がセルロース系物質を分解するものであれば、その菌種は特に限定されない。セルラーゼの起源は、例えば、公知のセルラーゼを生産する微生物として以下のものがある。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅ−ｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の「セルラーゼ」（講談社サイエンティフィック発行（１９８７））、「セルロースの事典」（朝倉書店発行（２０００））に記載される菌が生産するセルラーゼを挙げることができるが、セルロースを分解する酵素であれば、上記公知の菌由来の酵素に限らず、新規の菌由来の酵素も、本発明のセルラーゼに含まれる。
【００１７】
上記のうち特に適しているのは、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物である。すなわち、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を接種し、培養することにより、本発明のセルラーゼ活性の高い酵素を製造することができる。
【００１８】
また、本発明におけるセルラーゼ活性は、水溶性セルロース（カルボキシメチルセルロースナトリウム塩）を分解する酵素（ＣＭＣ−ａｓｅ）活性で表すことができ、下記に記す方法で測定することができる。このＣＭＣ−ａｓｅ活性は高い程、セルロースの分解速度、分解率が向上する。また、セロオリゴ糖をグルコースに分解する酵素活性は、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）活性として表すことができる。
【００１９】
本発明は、ＣＭＣ−ａｓｅ活性が高く、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が低く、これらを高度に制御されたセルラーゼを、セルロース系物質の酵素分解に用いることで、セロオリゴ糖の選択率を高めることができるという抜群の効果を奏するものである。
以下にそれぞれの酵素活性について説明する。
【００２０】
本発明におけるβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性とは、セロビオースを分解し、グルコースを生成する酵素活性のことであり、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性（Ｕ／ｍＬ）で定量される。セロオリゴ糖を高収率で得るためには、上述のＣＭＣ−ａｓｅ活性が高く、かつβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が低い酵素液を使用することが効率的である。このβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が低いほど、セロビオース等のセロオリゴ糖の分解が抑制される。好ましい範囲は、８．０Ｕ／ｍＬ以下である。より好ましくは、５．０Ｕ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは、４．０Ｕ／ｍＬ以下であり、特に好ましくは、２．０以下である。
【００２１】
本発明のＣＭＣ−ａｓｅ活性は、セルロースを分解する酵素活性のことであり、基質としてカルボキシメチルセルロースナトリウム塩を分解する酵素活性（Ｕ／ｍＬ）として測定される。このＣＭＣ−ａｓｅ活性が高いほどセルロースの分解が促進されるため好ましい。このため、本発明のセルラーゼは、この活性を有することが必要である。好ましい範囲としては、４．０Ｕ／ｍＬ以上である。より好ましい範囲は、６．０Ｕ／ｍＬ以上であり、さらに好ましい範囲は、８．５Ｕ／ｍＬ以上であり、特に好ましい範囲は、９．５Ｕ／ｍＬ以上である。
【００２２】
以下に本発明のＣＭＣ−ａｓｅ活性、及びβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性の測定方法を示す。
（１）ＣＭＣ−ａｓｅ活性
２０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した１％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液を４８０μｌ用意する。これに適当に希釈した酵素液２０μｌを加え、４０℃で３０分間反応させる。９５℃、１５分間加熱して反応を停止させた後、３，５−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２３】
（２）β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性
２００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した２．０質量％のセロビオース（Ａｌｄｒｉｃｈ製：特級グレード）の基質液０．３ｍｌに酵素液０．３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間反応後、９５℃で１５分間加熱し反応を停止させた後、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせた酵素法試薬であるグルコース定量キット（グルコースCII-テストワコー、和光純薬工業社製）を用いて、反応液中のグルコース濃度を定量する。１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２４】
以下にβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの選択的な抑制方法について説明する。
本発明によるβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法では、セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させる必要がある。ここで用いるセルラーゼは、セルロースの酵素分解に関与する酵素成分以外に、培地成分、賦形剤を含んでいてもよい。また、酵素のような水溶性成分に加えて、水不溶性の成分を含んでいてもよい。セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させる際の濃度は特に限定されないが、続くｐＨ調節、及び加熱処理の効果を高めるためには、少なくとも酵素成分は溶解している方が好ましい。好ましい濃度範囲としては、０．００１質量％以上である。また上限は、９９質量％以下である。より好ましい範囲は、０．１質量％〜３０質量％であり、特に好ましい範囲は０．５質量％〜１０質量％である。
【００２５】
本発明においては、セルラーゼの懸濁液又は水溶液のｐＨは７以上にする必要がある。ｐＨを７以上にすることで、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を抑制できる。ｐＨは高い程、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を低減できるが、ｐＨが高すぎると、ＣＭＣ−ａｓｅで表されるセルラーゼ活性の低下を招く。好ましいｐＨの範囲は１０以下であり、より好ましくは９以下であり、特に好ましくは、８以下である。
【００２６】
ここで懸濁液又は水溶液のｐＨを制御するために、酸、アルカリ、塩類等のｐＨ調製剤を用いることができる。これらの種類については、特に制限はないが、酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等のプロトン酸、ギ酸、酢酸等のカルボン酸等が好適に使用できる。また、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸ニ水素ナトリウム等が好適に使用できる。さらに塩類を併用してもよい。ここで使用される酸、アルカリ、塩類は、例えば「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「食品添加物公定書」（廣川書店発行）にｐＨ調製剤として分類されるものを挙げることができる。上記から選ばれる１種を単独で使用しても、２種以上を併用することも自由である。
【００２７】
また、これらのｐＨ調製剤の濃度についても特に制限はないが、本発明の効果を得るためには、適正な範囲に調整されることが好ましい。好ましくは１ｍＭ〜１０Ｍであり、より好ましくは、１０ｍＭ〜１Ｍであり、特に好ましくは５００ｍＭ以下である。
【００２８】
本発明においては、セルラーゼの懸濁液又は水溶液の加熱温度は、３０℃以上である。加熱温度が高いほど、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの抑制の効果が高くなる。特にその上限は設定されず、上述のｐＨの範囲において、ＣＭＣ−ａｓｅ活性が低下しないように適宜調整されるものである。圧力にも制限はない。但し、加熱処理に要する時間は、セルラーゼが失活しない程度に調整する必要がある。
【００２９】
本発明の製造方法では、セルラーゼに、セルロース系物質を共存させることが好ましい。セルロース系物質を共存させることで、セルラーゼの失活を抑制できる。セルロース系物質の濃度は０．０１質量％以上であればよく、その上限は設定されないが、現実的には、９９質量％以下である。
【００３０】
ここで用いるセルロース系物質としては、水溶性であっても、水不溶性であってもよい。セルロース系物質としては、例えば、木材、竹、麦藁、稲藁、コーンコブ、コットン、ラミー、バガス、ケナフ、ビート、ホヤ、バクテリアセルロース等が挙げられる。また、本発明には、上記の動植物が産生する天然セルロース系物質に加え、天然セルロース系物質を一旦、化学的・物理的に溶解、または膨潤させた後、再生して得られる再生セルロース系物質、およびセルロース系原料を化学的に修飾させたセルロース誘導体系物質を用いてもよい。これらのセルロース系物質は、工業的には、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等の天然セルロース系原料、レーヨン等の再生セルロース、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース等の各種再生セルロース系原料、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、セルロースアセテート、硝酸セルロース、セルロースアセテート・サクシネート、メチルセルロース、エチルセルロース等の各種セルロース誘導体のいずれでもよい。但し、得られるセロオリゴ糖を医薬品、食品、化粧品に用いるには、天然セルロース系原料を使用することがより好ましい。原料としてこれらのうち１種のセルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
【００３１】
上述のようにセルロース系物質を共存させる際には、加熱前に予め、セルラーゼの懸濁液又は水溶液のｐＨを７以下にし、一定時間保存することが好ましい。また、この操作を経ることで、セルラーゼの失活を抑制できる。
【００３２】
また、本発明の製造方法において、加熱操作は、攪拌下であっても、静置でもよい。攪拌状態は、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅが抑制され、セルラーゼ活性が低下しない程度に、適宜調整されるものである。
この加熱処理は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
【００３３】
上述の加熱処理により得られたセルラーゼを主成分とする水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００３４】
上記の方法で精製されたセルラーゼを主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００３５】
以下にセロオリゴ糖の製造方法を説明する。
セルラーゼによるセロオリゴ糖の酵素分解は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、本発明の方法で製造されたセルラーゼを添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。
【００３６】
上記方法において、懸濁方法、攪拌方法、セルラーゼ・基質の添加方法・添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものである。その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲でよい。
【００３７】
本発明で使用するセルロース系物質は、水溶性でも、水不溶性でもよく、その由来は、植物性でも動物性でもよい。それを産生する動植物としては、例えば、木材、竹、麦藁、稲藁、コーンコブ、コットン、ラミー、バガス、ケナフ、ビート、ホヤ、バクテリアセルロース等が挙げられる。また、本発明には、上記の動植物が産生する天然セルロース系物質に加え、天然セルロース系物質を一旦、化学的・物理的に溶解、または膨潤させた後、再生して得られる再生セルロース系物質、およびセルロース系原料を化学的に修飾させたセルロース誘導体系物質を用いてもよい。これらのセルロース系物質は、工業的には、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等の天然セルロース系原料、レーヨン等の再生セルロース、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース等の各種再生セルロース系原料、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等の各種セルロース誘導体のいずれでもよい。但し、得られるセロオリゴ糖を医薬品、食品、化粧品に用いるには、天然セルロース系原料を使用することがより好ましい。原料としてこれらのうち１種のセルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
【００３８】
この酵素反応は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。酵素分解反応において、セロビオースによる生成物阻害を回避するためには、反応系内のセロビオース濃度を、セルラーゼの生成物阻害の影響が出ないように、特定範囲に保つことが、セロオリゴ糖の生産性を向上する上で重要である。反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つ方法としては、限外ろ過、逆浸透ろ過等の膜ろ過により、反応系から生成したセロビオースを抜き出す方法でもよく、活性炭、竹、木材等の乾燥植物粉等の有機多孔質基材、二酸化珪素等の無機多孔質基材等を反応系に導入し、それらにセロビオースを吸着させる方法でもよく、セルロース基質をカラム等に固定化し、セルラーゼを含む反応液を流通させる方法でもよく、セルラーゼを高分子等に固定化し、セルロースを含む反応液を流通させる方法でもよい。
【００３９】
上述の酵素分解により得られたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４０】
上記の方法で精製されたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４１】
上記の精製、乾燥処理時のセロオリゴ糖の媒体としては、水以外に、必要に応じて、有機溶剤等を使用してもよい。ここで使用される有機溶剤にも、特に制限されないが、例えば、医薬品、食品およびそれらの添加剤を製造する工程で使用されるものが好ましく、「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「日本薬局方」、「食品添加物公定書」（いずれも廣川書店発行）に溶剤として分類されるものが挙げられる。水、有機溶剤は、それらを単独で使用しても、２種以上を併用することも自由であり、１種の媒体で一旦分散させた後、その媒体を除去し、異なる媒体に分散させてもよい。
【００４２】
上記の工程を経たセロオリゴ糖の形態には、特に制限はないが、例えば、常温で固体、懸濁液、エマルジョン、シロップ、溶液状で使用できる。固体状セロオリゴ糖の一例としては、粉末、顆粒、ペレット、成形体、積層体、固体分散体等が挙げられる。
【００４３】
本発明の方法により製造されるセロオリゴ糖の用途は、特に制限されないが、例えば、食品、化粧品、医薬品、一般工業製品等の分野で、食品成分、化粧品成分、色素成分、香料成分、医薬品薬効成分、農薬成分、飼料成分、肥料成分、培地成分、分析用試薬成分、および添加剤、中間原料、発酵原料等として使用してもよい。
【００４４】
本発明の方法により製造されるセロオリゴ糖は、食品では、例えば、ゼリー、プリン、ヨーグルト等のゲル、マヨネーズ、ドレッシング、ソース類、たれ類、スープ、野菜加工品等の調味料、カレー、ハヤシ、ミートソース、シチュー、スープ等のレトルト食品、チルド食品、ハンバーグ、ベーコン、ソーセージ、サラミソーセージ、ハム類等の畜産加工品、蒲鉾、ちくわ、魚肉ハム・ソーセージ、揚げ蒲鉾等の水練製品、パン、生麺、乾麺、マカロニ、スパゲッティ、中華饅頭の皮、ケーキミックス、プレミックス、ホワイトソース、餃子・春巻等の皮類などの小麦加工食品、カレー、ソース、スープ、佃煮、ジャムなどの缶詰、瓶詰類、キャンデー、トローチ、錠菓、チョコレート、ビスケット、クッキー、米菓、和洋菓子、洋生菓子、スナック菓子、砂糖菓子、プリンなどの菓子類、フライ類、コロッケ、餃子、中華饅頭等の調理加工品、野菜ペースト、肉のミンチ、果実ペースト、魚介類のペースト等のペースト類などに使用される。また、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ホイップクリーム、練乳、バター、ヨーグルト、チーズ、ホワイトソース等の乳製品、マーガリン、ファットスプレッド、ショートニング等の油脂加工品等に使用される。さらに、コーラ等の炭酸飲料、炭酸入り、アルコール入り、乳製品と混合した果実飲料、果汁又は、果実入り飲料、乳性飲料等の飲料、コーヒー、牛乳、豆乳、ココア牛乳、フルーツ牛乳、ヨーグルト等の乳酸／乳性飲料等、煎茶、ウーロン茶、抹茶、紅茶等の茶飲料等に使用してもよい。
【００４５】
本発明の方法で製造されるセロオリゴ糖は、乳酸菌、乳酸かん菌等の活性化等の腸内有用細菌叢賦活、血中糖濃度、血中インシュリン濃度の低減、血中コレステロールの低減、体脂肪率の低減、脂質・糖質代謝促進機能、便通・便臭改善、抗う触性等の各種生理活性が期待できるため、上記の通常食品用途に加え、生理活性物質として、機能性食品、健康食品、ダイエット食品等の用途で使用してもよい。
【００４６】
また、本発明の方法で製造されるセロオリゴ糖は、高純度であるため、各種セロオリゴ糖誘導体への化学変換原料として使用してもよい。
本発明を実施例などに基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例などにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
［製造例１］
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２８℃、７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金耳をセロビオース １０．０g、ポリペプトン１．０ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4２．０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4１．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．３ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ０．３ｇ、ツイーン８０［半井化学薬品（株）製］ １．０ｍｌ、微量元素液（Ｈ3ＢＯ4 ６ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ２６ｍｇ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ１００ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ４０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ８ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解並びに懸濁した液）１．０ｍｌ、酒石酸 ５０ｍＭ を水１Ｌに溶解および懸濁させ、ｐＨ５．０に調整し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬ分注しオートクレーブ滅菌した培地に接種して、２８℃、６日間振盪培養した。
【００４８】
また、上述の培養方法において、セロビオースをグルコースに変更して、同様に６日間培養した。
これらの培養液を混合し、遠心分離し、１０ｍｌを限外ろ過で１．５ｍｌに濃縮したものを粗酵素液とした。（本粗酵素液のＣＭＣ−ａｓｅは１２．１８Ｕ／ｍＬ、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは２３．９Ｕ／ｍＬであった。）
【００４９】
〔実施例１〜５〕
製造例１で得られた粗酵素液を、ｐＨ７．０、ｐＨ８．１、又はｐＨ９．２の１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３０℃又は６０℃において、３０分間保存した後に、ＣＭＣ−ａｓｅ活性、β-Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を測定した。表１に得られた結果を記す。活性の残存率は以下の式により求めた。活性残存率（％）＝保存後の活性（Ｕ／ｍＬ）／保存前の活性（Ｕ／ｍＬ）×１００。
【００５０】
表１から、ｐＨが７以上に調製された各実施例は、ＣＭＣ−ａｓｅとして４０％以上の活性を維持し、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅとして３０％以下の活性を残存した。
【００５１】
〔比較例１〕
製造例１で得られた粗酵素液を、ｐＨ８．１、１０℃において３０分間保存した後に、実施例と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅとβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの活性残存率を測定した。結果を表１に示す。比較例１は、ＣＭＣ−ａｓｅが維持されたものの、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは大きく低下しなかった。
【００５２】
〔比較例２〕
製造例１で得られた粗酵素液を、ｐＨ６．５、１０℃において３０分間保存した後に、実施例と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅとβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの活性残存率を測定した。結果を表１に示す。
比較例２も、比較例１と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅは維持されたが、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは大きく低下しなかった。
【００５３】
〔比較例３〕
製造例１で得られた粗酵素液を、ｐＨ６．０、５０℃において３０分間保存した後に、実施例と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅとβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの活性残存率を測定した。結果を表１に示す。
比較例３も、比較例１、２と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅは維持されたが、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは大きく低下しなかった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
〔実施例６〕
市販のセルラーゼ（合同酒精製 ＧＯＤＯ−ＴＣＤ）を１質量％濃度で精製水に溶解し、実施例２と同様の操作で、熱処理した後、ＣＭＣ−ａｓｅ活性の残存率、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性の残存率を測定した。ＣＭＣ−ａｓｅの残存率は６１％であり、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの残存率は１２％であった。
【００５６】
〔実施例７〕
実施例２で得られた熱処理後の酵素液４００μＬを５％の結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、セオラスＰＨ−１０１）の１００ｍＭ酢酸緩衝液による分散体を用いて、４０℃で、１８時間酵素分解を行った。酵素分解後はＨＰＬＣにより、糖組成を測定した。その結果、セロビオース濃度は０．１０質量％であり、グルコース濃度は０．０４質量％であり、選択率は７１％（セロビオース濃度（質量％）／（セロビオース濃度（質量％）＋グルコース濃度（質量％）））と高い値を示した。
【００５７】
〔比較例４〕
実施例７と同様の操作において、比較例２の粗酵素液を使用し、酵素反応を行った。その結果、セロビオース濃度は０．１９質量％、グルコース濃度は０．２１質量％であり、選択率は、４７．５％と低い値を示した。
【００５８】
〔実施例８〕
実施例２と同じ熱処理において、１％結晶セルロースを共存させて、実施例２と同様の操作で熱処理を行った。熱処理後は、固形分を遠心分離し、上清について、実施例２と同様の操作で、ＣＭＣ−ａｓｅ活性、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を測定した。ＣＭＣ−ａｓｅ活性の残存率は５２％であり、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性の残存率は１．５％であった。熱処理に、セルロース系物質を共存させることで、ＣＭＣ−ａｓｅの失活が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、セロオリゴ糖を効率的に得るためのβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が選択的に抑制されたセルラーゼの製造方法に関する。この方法で得られたセルラーゼは、セロオリゴ糖の製造に好適に使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロオリゴ糖を効率的に得るためのβ−グルコシダーゼが選択的に抑制されたセルラーゼの製造方法、及びセロオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セロオリゴ糖は、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオースの総称であり、グルコピラノース単位が１〜６個、β−１，４結合した少糖類である。近年、セロオリゴ糖は、他のオリゴ糖と同様に、その生理機能が明らかになりつつあり、機能性食品の新素材として期待されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
一般に、セロオリゴ糖を得る方法としては、セルロース系物質をセルラーゼにより分解する方法が知られている。セルラーゼによるセルロースの分解機構は、（１）まず、セルロース分解酵素の作用で、セルロースからセロビオースを含むセロオリゴ糖が生成する反応、（２）セルロースから直接グルコースを生成する反応、（３）β−グルコシダーゼの作用で、セロオリゴ糖からグルコースが生成する反応が含まれる（非特許文献２）。この反応系において、セロオリゴ糖の生産性を高めるには、セルラーゼに含まれるβ−グルコシダーゼを抑制し、セロオリゴ糖からグルコースへの分解を抑制し、セロオリゴ糖の選択率を高めることが有効である。
【０００４】
従来、セロオリゴ糖の選択率を高めることにより、セロオリゴ糖の生産性を高める検討は、数多くなされてきた（特許文献１〜７）。以下に、既存の技術と本発明の違いについて説明する。特定のセルラーゼを使用し、セルロースを酵素分解することで、セロオリゴ糖の選択率を向上させる方法としては、以下のものが挙げられる。
【０００５】
特許文献１は、セロビブリオ属に属する微生物が生産するセルラーゼの作用により、水性反応液中にてセルロース系物質からセロオリゴ糖を製造する方法において、限外ろ過反応器を組み合わせることにより生成物阻害を解除して、セロオリゴ糖を生成蓄積せしめるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この方法を用いると、限外ろ過により、酵素と生成物を分離し、酵素の活性低下を防ぐことができる。しかし、この方法により得られるセルラーゼは、結晶性のセルロースに作用が小さいことが問題であった。また、非晶性のセルロースを得るために、セルロース系物質を前処理する必要があるため、製造工程が煩雑になる問題があった。
【０００６】
特許文献２には、セルロースをセルラーゼで分解し、セロオリゴ糖を生成させる方法において、予めセルラーゼをｐＨ３．５〜５．０に平衡化した弱酸性陽イオン交換樹脂に接触させることにより、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼを選択的に除去し、かかるβ−グルコシダーゼを除去したセルラーゼをセルロースに接触させるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この製造方法によると、セルロースの酵素分解により、グルコースを低減し、セロオリゴ糖が６０％以上の分解生成物を得ることができる。しかしながら、該製造方法では、セルロース中のβ−グルコシダーゼを除去する工程が必要となり、セロオリゴ糖製造工程が複雑になるという問題があった。また、このセルラーゼ精製工程では、未処理セルラーゼに対し、７５〜１０００倍の陽イオン交換樹脂が必要となるため、セルラーゼ処理量が制限され、セロオリゴ糖の生産性が充分ではなく、セルラーゼ精製コスト、陽イオン交換樹脂の分離精製剤コストが高くなるという問題があった。
【０００７】
特許文献３には、不溶性セルロースまたはセルロース含有物質とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来のセルラーゼを水性媒体中で保温した後、固形画分を分離し、該固形画分に水溶性溶液を加え、セロビオースを得る方法が開示されている。特許文献４には、セルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着し、その後、酵素分解するセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。特許文献５には、セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含みかつ不純物としてβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、β−グルコシダーゼを含む画分を選択的に分離除去することを特徴とするセルラーゼからのβ−グルコシダーゼの分離除去方法が記載されている。これらの製造方法では、セロビオース製造工程に混入するβ-グルコシダーゼを低減することが可能となり、選択的にセロビオースを得ることができる。しかしながら、これらの方法は、固形画分へのセルラーゼ吸着工程および固形画分分離工程が必要となるため、プロセスが複雑となる問題があった。
【０００８】
上述の特許文献２〜５に対して、本発明は、イオン交換樹脂による処理等、セルロースとの分画等の煩雑な工程を経ずに、セルラーゼ懸濁液又は水溶液から、そのままβ−グルコシダーゼを抑制できる点で優れている。
【０００９】
特許文献６には、セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液中の、β−グルコシダーゼ活性と結晶性セルロース分解活性の活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶性セルロース分解活性）が０．３５以下であるセルラーゼの製造方法、及び培養液中のｐＨをｐＨ３．５未満に制御するセルラーゼの製造方法が開示されている。また、特許文献７には、綿実粕を０．１〜１０質量％含有する液体培地にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を接種し、これを培養することにより製造するセルラーゼを含む酵素液の製造方法、及び液体培地が、さらに０．０１〜１０質量％の硫酸アンモニウムを含有するセルラーゼを含む酵素液の製造方法が開示されている。確かに、これらの方法では、培養条件を高度に制御することで、セルロース分解活性が高く、β−グルコシダーゼが低い酵素が得られる。それに対し、本発明は、特別な培養を経ずとも、通常の培養得られたセルラーゼ、又は市販のセルラーゼを処理できるものであり、特許文献６及び特許文献７は、この点で全く異なる。
【００１０】
上記の通り、従来は、セロオリゴ糖を効率的に得るために、セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させ、懸濁液又は水溶液の特定のｐＨにし、特定の温度に加熱する、β−グルコシダーゼ活性を選択的に抑制されたセルラーゼの製造方法、及び該セルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法は知られていなかった。
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５，Ｎｏ２，９１−９７（１９９８）
【非特許文献２】「セルラーゼ」講談社サイエンティフィック発行、９７−１０４（１９８７）
【特許文献１】特開平０１−２５６３９４号公報
【特許文献２】特開平０５−１１５２９３号公報
【特許文献３】特開昭６３−２２６２９４号公報
【特許文献４】特開２００６−２０４２９４号公報
【特許文献５】特開２００６−３４２０６号公報
【特許文献６】特開２００６−２９６３５８号公報
【特許文献７】特開２００７−２１５５０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、セルロース系物質を原料としセルラーゼの存在下で酵素分解することでセロオリゴ糖を選択的に生産する際に、セロオリゴ糖選択率を高めることができるセルラーゼの製造方法、及びこのセルラーゼを用いたセロオリゴ糖の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、セルロース系物質を酵素分解するセロオリゴ糖の製造において、セルラーゼを特定のｐＨ及び特定の温度で加熱することによって、β−グルコシダーゼ活性を選択的に抑制できることを見出し、本発明を達成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の通りである。
【００１４】
（１） セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させ、該懸濁液又は水溶液のｐＨを７以上にして３０℃以上に加熱することを含む、β−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。
（２）０．０１質量％以上のセルロース系物質の共存下において該懸濁液又は水溶液を３０℃以上に加熱する、請求項１に記載のβ−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。
（３）（ｉ）（１）又は（２）に記載の方法によりβ−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼを製造する工程、及び（ｉｉ）上記工程（ｉ）で得られたセルラーゼを用いてセルロース系物質を分解する工程を含む、セロオリゴ糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、セロオリゴ糖選択率が高いセルラーゼを製造することができ、該セルラーゼをセロオリゴ糖の製造に使用することで、セロオリゴ糖を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のセルラーゼは、セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来のものである。
本発明で使用されるセルラーゼ生産菌は、酵素を分泌し、その酵素がセルロース系物質を分解するものであれば、その菌種は特に限定されない。セルラーゼの起源は、例えば、公知のセルラーゼを生産する微生物として以下のものがある。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅ−ｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の「セルラーゼ」（講談社サイエンティフィック発行（１９８７））、「セルロースの事典」（朝倉書店発行（２０００））に記載される菌が生産するセルラーゼを挙げることができるが、セルロースを分解する酵素であれば、上記公知の菌由来の酵素に限らず、新規の菌由来の酵素も、本発明のセルラーゼに含まれる。
【００１７】
上記のうち特に適しているのは、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物である。すなわち、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を接種し、培養することにより、本発明のセルラーゼ活性の高い酵素を製造することができる。
【００１８】
また、本発明におけるセルラーゼ活性は、水溶性セルロース（カルボキシメチルセルロースナトリウム塩）を分解する酵素（ＣＭＣ−ａｓｅ）活性で表すことができ、下記に記す方法で測定することができる。このＣＭＣ−ａｓｅ活性は高い程、セルロースの分解速度、分解率が向上する。また、セロオリゴ糖をグルコースに分解する酵素活性は、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）活性として表すことができる。
【００１９】
本発明は、ＣＭＣ−ａｓｅ活性が高く、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が低く、これらを高度に制御されたセルラーゼを、セルロース系物質の酵素分解に用いることで、セロオリゴ糖の選択率を高めることができるという抜群の効果を奏するものである。
以下にそれぞれの酵素活性について説明する。
【００２０】
本発明におけるβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性とは、セロビオースを分解し、グルコースを生成する酵素活性のことであり、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性（Ｕ／ｍＬ）で定量される。セロオリゴ糖を高収率で得るためには、上述のＣＭＣ−ａｓｅ活性が高く、かつβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が低い酵素液を使用することが効率的である。このβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が低いほど、セロビオース等のセロオリゴ糖の分解が抑制される。好ましい範囲は、８．０Ｕ／ｍＬ以下である。より好ましくは、５．０Ｕ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは、４．０Ｕ／ｍＬ以下であり、特に好ましくは、２．０以下である。
【００２１】
本発明のＣＭＣ−ａｓｅ活性は、セルロースを分解する酵素活性のことであり、基質としてカルボキシメチルセルロースナトリウム塩を分解する酵素活性（Ｕ／ｍＬ）として測定される。このＣＭＣ−ａｓｅ活性が高いほどセルロースの分解が促進されるため好ましい。このため、本発明のセルラーゼは、この活性を有することが必要である。好ましい範囲としては、４．０Ｕ／ｍＬ以上である。より好ましい範囲は、６．０Ｕ／ｍＬ以上であり、さらに好ましい範囲は、８．５Ｕ／ｍＬ以上であり、特に好ましい範囲は、９．５Ｕ／ｍＬ以上である。
【００２２】
以下に本発明のＣＭＣ−ａｓｅ活性、及びβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性の測定方法を示す。
（１）ＣＭＣ−ａｓｅ活性
２０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した１％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液を４８０μｌ用意する。これに適当に希釈した酵素液２０μｌを加え、４０℃で３０分間反応させる。９５℃、１５分間加熱して反応を停止させた後、３，５−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２３】
（２）β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性
２００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した２．０質量％のセロビオース（Ａｌｄｒｉｃｈ製：特級グレード）の基質液０．３ｍｌに酵素液０．３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間反応後、９５℃で１５分間加熱し反応を停止させた後、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせた酵素法試薬であるグルコース定量キット（グルコースCII-テストワコー、和光純薬工業社製）を用いて、反応液中のグルコース濃度を定量する。１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２４】
以下にβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの選択的な抑制方法について説明する。
本発明によるβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法では、セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させる必要がある。ここで用いるセルラーゼは、セルロースの酵素分解に関与する酵素成分以外に、培地成分、賦形剤を含んでいてもよい。また、酵素のような水溶性成分に加えて、水不溶性の成分を含んでいてもよい。セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させる際の濃度は特に限定されないが、続くｐＨ調節、及び加熱処理の効果を高めるためには、少なくとも酵素成分は溶解している方が好ましい。好ましい濃度範囲としては、０．００１質量％以上である。また上限は、９９質量％以下である。より好ましい範囲は、０．１質量％〜３０質量％であり、特に好ましい範囲は０．５質量％〜１０質量％である。
【００２５】
本発明においては、セルラーゼの懸濁液又は水溶液のｐＨは７以上にする必要がある。ｐＨを７以上にすることで、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を抑制できる。ｐＨは高い程、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を低減できるが、ｐＨが高すぎると、ＣＭＣ−ａｓｅで表されるセルラーゼ活性の低下を招く。好ましいｐＨの範囲は１０以下であり、より好ましくは９以下であり、特に好ましくは、８以下である。
【００２６】
ここで懸濁液又は水溶液のｐＨを制御するために、酸、アルカリ、塩類等のｐＨ調製剤を用いることができる。これらの種類については、特に制限はないが、酸としては、塩酸、硫酸、リン酸等のプロトン酸、ギ酸、酢酸等のカルボン酸等が好適に使用できる。また、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化カリウム、リン酸ニ水素ナトリウム等が好適に使用できる。さらに塩類を併用してもよい。ここで使用される酸、アルカリ、塩類は、例えば「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「食品添加物公定書」（廣川書店発行）にｐＨ調製剤として分類されるものを挙げることができる。上記から選ばれる１種を単独で使用しても、２種以上を併用することも自由である。
【００２７】
また、これらのｐＨ調製剤の濃度についても特に制限はないが、本発明の効果を得るためには、適正な範囲に調整されることが好ましい。好ましくは１ｍＭ〜１０Ｍであり、より好ましくは、１０ｍＭ〜１Ｍであり、特に好ましくは５００ｍＭ以下である。
【００２８】
本発明においては、セルラーゼの懸濁液又は水溶液の加熱温度は、３０℃以上である。加熱温度が高いほど、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの抑制の効果が高くなる。特にその上限は設定されず、上述のｐＨの範囲において、ＣＭＣ−ａｓｅ活性が低下しないように適宜調整されるものである。圧力にも制限はない。但し、加熱処理に要する時間は、セルラーゼが失活しない程度に調整する必要がある。
【００２９】
本発明の製造方法では、セルラーゼに、セルロース系物質を共存させることが好ましい。セルロース系物質を共存させることで、セルラーゼの失活を抑制できる。セルロース系物質の濃度は０．０１質量％以上であればよく、その上限は設定されないが、現実的には、９９質量％以下である。
【００３０】
ここで用いるセルロース系物質としては、水溶性であっても、水不溶性であってもよい。セルロース系物質としては、例えば、木材、竹、麦藁、稲藁、コーンコブ、コットン、ラミー、バガス、ケナフ、ビート、ホヤ、バクテリアセルロース等が挙げられる。また、本発明には、上記の動植物が産生する天然セルロース系物質に加え、天然セルロース系物質を一旦、化学的・物理的に溶解、または膨潤させた後、再生して得られる再生セルロース系物質、およびセルロース系原料を化学的に修飾させたセルロース誘導体系物質を用いてもよい。これらのセルロース系物質は、工業的には、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等の天然セルロース系原料、レーヨン等の再生セルロース、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース等の各種再生セルロース系原料、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、セルロースアセテート、硝酸セルロース、セルロースアセテート・サクシネート、メチルセルロース、エチルセルロース等の各種セルロース誘導体のいずれでもよい。但し、得られるセロオリゴ糖を医薬品、食品、化粧品に用いるには、天然セルロース系原料を使用することがより好ましい。原料としてこれらのうち１種のセルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
【００３１】
上述のようにセルロース系物質を共存させる際には、加熱前に予め、セルラーゼの懸濁液又は水溶液のｐＨを７以下にし、一定時間保存することが好ましい。また、この操作を経ることで、セルラーゼの失活を抑制できる。
【００３２】
また、本発明の製造方法において、加熱操作は、攪拌下であっても、静置でもよい。攪拌状態は、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅが抑制され、セルラーゼ活性が低下しない程度に、適宜調整されるものである。
この加熱処理は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
【００３３】
上述の加熱処理により得られたセルラーゼを主成分とする水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００３４】
上記の方法で精製されたセルラーゼを主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００３５】
以下にセロオリゴ糖の製造方法を説明する。
セルラーゼによるセロオリゴ糖の酵素分解は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、本発明の方法で製造されたセルラーゼを添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。
【００３６】
上記方法において、懸濁方法、攪拌方法、セルラーゼ・基質の添加方法・添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものである。その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲でよい。
【００３７】
本発明で使用するセルロース系物質は、水溶性でも、水不溶性でもよく、その由来は、植物性でも動物性でもよい。それを産生する動植物としては、例えば、木材、竹、麦藁、稲藁、コーンコブ、コットン、ラミー、バガス、ケナフ、ビート、ホヤ、バクテリアセルロース等が挙げられる。また、本発明には、上記の動植物が産生する天然セルロース系物質に加え、天然セルロース系物質を一旦、化学的・物理的に溶解、または膨潤させた後、再生して得られる再生セルロース系物質、およびセルロース系原料を化学的に修飾させたセルロース誘導体系物質を用いてもよい。これらのセルロース系物質は、工業的には、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等の天然セルロース系原料、レーヨン等の再生セルロース、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース等の各種再生セルロース系原料、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等の各種セルロース誘導体のいずれでもよい。但し、得られるセロオリゴ糖を医薬品、食品、化粧品に用いるには、天然セルロース系原料を使用することがより好ましい。原料としてこれらのうち１種のセルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
【００３８】
この酵素反応は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。酵素分解反応において、セロビオースによる生成物阻害を回避するためには、反応系内のセロビオース濃度を、セルラーゼの生成物阻害の影響が出ないように、特定範囲に保つことが、セロオリゴ糖の生産性を向上する上で重要である。反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つ方法としては、限外ろ過、逆浸透ろ過等の膜ろ過により、反応系から生成したセロビオースを抜き出す方法でもよく、活性炭、竹、木材等の乾燥植物粉等の有機多孔質基材、二酸化珪素等の無機多孔質基材等を反応系に導入し、それらにセロビオースを吸着させる方法でもよく、セルロース基質をカラム等に固定化し、セルラーゼを含む反応液を流通させる方法でもよく、セルラーゼを高分子等に固定化し、セルロースを含む反応液を流通させる方法でもよい。
【００３９】
上述の酵素分解により得られたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４０】
上記の方法で精製されたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４１】
上記の精製、乾燥処理時のセロオリゴ糖の媒体としては、水以外に、必要に応じて、有機溶剤等を使用してもよい。ここで使用される有機溶剤にも、特に制限されないが、例えば、医薬品、食品およびそれらの添加剤を製造する工程で使用されるものが好ましく、「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「日本薬局方」、「食品添加物公定書」（いずれも廣川書店発行）に溶剤として分類されるものが挙げられる。水、有機溶剤は、それらを単独で使用しても、２種以上を併用することも自由であり、１種の媒体で一旦分散させた後、その媒体を除去し、異なる媒体に分散させてもよい。
【００４２】
上記の工程を経たセロオリゴ糖の形態には、特に制限はないが、例えば、常温で固体、懸濁液、エマルジョン、シロップ、溶液状で使用できる。固体状セロオリゴ糖の一例としては、粉末、顆粒、ペレット、成形体、積層体、固体分散体等が挙げられる。
【００４３】
本発明の方法により製造されるセロオリゴ糖の用途は、特に制限されないが、例えば、食品、化粧品、医薬品、一般工業製品等の分野で、食品成分、化粧品成分、色素成分、香料成分、医薬品薬効成分、農薬成分、飼料成分、肥料成分、培地成分、分析用試薬成分、および添加剤、中間原料、発酵原料等として使用してもよい。
【００４４】
本発明の方法により製造されるセロオリゴ糖は、食品では、例えば、ゼリー、プリン、ヨーグルト等のゲル、マヨネーズ、ドレッシング、ソース類、たれ類、スープ、野菜加工品等の調味料、カレー、ハヤシ、ミートソース、シチュー、スープ等のレトルト食品、チルド食品、ハンバーグ、ベーコン、ソーセージ、サラミソーセージ、ハム類等の畜産加工品、蒲鉾、ちくわ、魚肉ハム・ソーセージ、揚げ蒲鉾等の水練製品、パン、生麺、乾麺、マカロニ、スパゲッティ、中華饅頭の皮、ケーキミックス、プレミックス、ホワイトソース、餃子・春巻等の皮類などの小麦加工食品、カレー、ソース、スープ、佃煮、ジャムなどの缶詰、瓶詰類、キャンデー、トローチ、錠菓、チョコレート、ビスケット、クッキー、米菓、和洋菓子、洋生菓子、スナック菓子、砂糖菓子、プリンなどの菓子類、フライ類、コロッケ、餃子、中華饅頭等の調理加工品、野菜ペースト、肉のミンチ、果実ペースト、魚介類のペースト等のペースト類などに使用される。また、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ホイップクリーム、練乳、バター、ヨーグルト、チーズ、ホワイトソース等の乳製品、マーガリン、ファットスプレッド、ショートニング等の油脂加工品等に使用される。さらに、コーラ等の炭酸飲料、炭酸入り、アルコール入り、乳製品と混合した果実飲料、果汁又は、果実入り飲料、乳性飲料等の飲料、コーヒー、牛乳、豆乳、ココア牛乳、フルーツ牛乳、ヨーグルト等の乳酸／乳性飲料等、煎茶、ウーロン茶、抹茶、紅茶等の茶飲料等に使用してもよい。
【００４５】
本発明の方法で製造されるセロオリゴ糖は、乳酸菌、乳酸かん菌等の活性化等の腸内有用細菌叢賦活、血中糖濃度、血中インシュリン濃度の低減、血中コレステロールの低減、体脂肪率の低減、脂質・糖質代謝促進機能、便通・便臭改善、抗う触性等の各種生理活性が期待できるため、上記の通常食品用途に加え、生理活性物質として、機能性食品、健康食品、ダイエット食品等の用途で使用してもよい。
【００４６】
また、本発明の方法で製造されるセロオリゴ糖は、高純度であるため、各種セロオリゴ糖誘導体への化学変換原料として使用してもよい。
本発明を実施例などに基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例などにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
［製造例１］
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２８℃、７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金耳をセロビオース １０．０g、ポリペプトン１．０ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4２．０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4１．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．３ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ０．３ｇ、ツイーン８０［半井化学薬品（株）製］ １．０ｍｌ、微量元素液（Ｈ3ＢＯ4 ６ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ２６ｍｇ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ１００ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ４０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ８ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解並びに懸濁した液）１．０ｍｌ、酒石酸 ５０ｍＭ を水１Ｌに溶解および懸濁させ、ｐＨ５．０に調整し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬ分注しオートクレーブ滅菌した培地に接種して、２８℃、６日間振盪培養した。
【００４８】
また、上述の培養方法において、セロビオースをグルコースに変更して、同様に６日間培養した。
これらの培養液を混合し、遠心分離し、１０ｍｌを限外ろ過で１．５ｍｌに濃縮したものを粗酵素液とした。（本粗酵素液のＣＭＣ−ａｓｅは１２．１８Ｕ／ｍＬ、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは２３．９Ｕ／ｍＬであった。）
【００４９】
〔実施例１〜５〕
製造例１で得られた粗酵素液を、ｐＨ７．０、ｐＨ８．１、又はｐＨ９．２の１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、３０℃又は６０℃において、３０分間保存した後に、ＣＭＣ−ａｓｅ活性、β-Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を測定した。表１に得られた結果を記す。活性の残存率は以下の式により求めた。活性残存率（％）＝保存後の活性（Ｕ／ｍＬ）／保存前の活性（Ｕ／ｍＬ）×１００。
【００５０】
表１から、ｐＨが７以上に調製された各実施例は、ＣＭＣ−ａｓｅとして４０％以上の活性を維持し、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅとして３０％以下の活性を残存した。
【００５１】
〔比較例１〕
製造例１で得られた粗酵素液を、ｐＨ８．１、１０℃において３０分間保存した後に、実施例と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅとβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの活性残存率を測定した。結果を表１に示す。比較例１は、ＣＭＣ−ａｓｅが維持されたものの、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは大きく低下しなかった。
【００５２】
〔比較例２〕
製造例１で得られた粗酵素液を、ｐＨ６．５、１０℃において３０分間保存した後に、実施例と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅとβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの活性残存率を測定した。結果を表１に示す。
比較例２も、比較例１と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅは維持されたが、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは大きく低下しなかった。
【００５３】
〔比較例３〕
製造例１で得られた粗酵素液を、ｐＨ６．０、５０℃において３０分間保存した後に、実施例と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅとβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの活性残存率を測定した。結果を表１に示す。
比較例３も、比較例１、２と同様に、ＣＭＣ−ａｓｅは維持されたが、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅは大きく低下しなかった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
〔実施例６〕
市販のセルラーゼ（合同酒精製 ＧＯＤＯ−ＴＣＤ）を１質量％濃度で精製水に溶解し、実施例２と同様の操作で、熱処理した後、ＣＭＣ−ａｓｅ活性の残存率、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性の残存率を測定した。ＣＭＣ−ａｓｅの残存率は６１％であり、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの残存率は１２％であった。
【００５６】
〔実施例７〕
実施例２で得られた熱処理後の酵素液４００μＬを５％の結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、セオラスＰＨ−１０１）の１００ｍＭ酢酸緩衝液による分散体を用いて、４０℃で、１８時間酵素分解を行った。酵素分解後はＨＰＬＣにより、糖組成を測定した。その結果、セロビオース濃度は０．１０質量％であり、グルコース濃度は０．０４質量％であり、選択率は７１％（セロビオース濃度（質量％）／（セロビオース濃度（質量％）＋グルコース濃度（質量％）））と高い値を示した。
【００５７】
〔比較例４〕
実施例７と同様の操作において、比較例２の粗酵素液を使用し、酵素反応を行った。その結果、セロビオース濃度は０．１９質量％、グルコース濃度は０．２１質量％であり、選択率は、４７．５％と低い値を示した。
【００５８】
〔実施例８〕
実施例２と同じ熱処理において、１％結晶セルロースを共存させて、実施例２と同様の操作で熱処理を行った。熱処理後は、固形分を遠心分離し、上清について、実施例２と同様の操作で、ＣＭＣ−ａｓｅ活性、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を測定した。ＣＭＣ−ａｓｅ活性の残存率は５２％であり、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性の残存率は１．５％であった。熱処理に、セルロース系物質を共存させることで、ＣＭＣ−ａｓｅの失活が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、セロオリゴ糖を効率的に得るためのβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性が選択的に抑制されたセルラーゼの製造方法に関する。この方法で得られたセルラーゼは、セロオリゴ糖の製造に好適に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させ、該懸濁液又は水溶液のｐＨを７以上にして３０℃以上に加熱することを含む、β−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。
【請求項２】
０．０１質量％以上のセルロース系物質の共存下において該懸濁液又は水溶液を３０℃以上に加熱する、請求項１に記載のβ−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。
【請求項３】
（ｉ）請求項１又は２に記載の方法によりβ−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼを製造する工程、及び（ｉｉ）上記工程（ｉ）で得られたセルラーゼを用いてセルロース系物質を分解する工程を含む、セロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１】
セルラーゼを水系媒体に懸濁又は溶解させ、該懸濁液又は水溶液のｐＨを７以上にして３０℃以上に加熱することを含む、β−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。
【請求項２】
０．０１質量％以上のセルロース系物質の共存下において該懸濁液又は水溶液を３０℃以上に加熱する、請求項１に記載のβ−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼの製造方法。
【請求項３】
（ｉ）請求項１又は２に記載の方法によりβ−グルコシダーゼ活性が抑制されたセルラーゼを製造する工程、及び（ｉｉ）上記工程（ｉ）で得られたセルラーゼを用いてセルロース系物質を分解する工程を含む、セロオリゴ糖の製造方法。
【公開番号】特開２００９−１８９２９３（Ｐ２００９−１８９２９３Ａ）
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２９４７（Ｐ２００８−３２９４７）
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
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