タウフィラメント線維化を阻害または逆転させるための方法
タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させる方法を提供する。これらの方法は、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させる薬剤組成物を投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで特定の神経障害を治療するために使用することができる。好ましい組成物には、３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウムが含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させるための方法に関する。本発明は、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させる薬剤組成物を投与することによってｉｎ ｖｉｖｏである種の神経障害を治療するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
微小管結合タンパク質タウは、細胞骨格の維持に寄与すると考えられている可溶性のサイトゾルタンパク質である（例えば、非特許文献１および２参照）。しかし、多くの病態では、タウタンパク質は、未知の細胞の状態によって誘発され自己会合して線維状構造となる（例えば、非特許文献３参照）。これらのタウの線維状の形態は、様々な神経変性障害、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）（例えば、非特許文献４、５および６参照）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）（例えば、非特許文献７参照）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）（例えば、非特許文献８参照）、ピック病（ＰＤ）（例えば、非特許文献９参照）、ダウン症候群（例えば、非特許文献１０参照）、前頭側頭骨痴呆および染色体１７に関連したパーキンソン症（ＦＴＤＰ−１７）（例えば、非特許文献１１参照）において見出すことができる。これらの神経変性障害のための効果的な治療法の特定の必要性が依然として存在している。
【０００３】
神経突起プラーク、神経原線維変化および神経間質糸は、タウタンパク質の線維状神経細胞内封入を含むアルツハイマー病（ＡＤ）の顕著に特徴的な病変である（例えば、非特許文献１２参照）。タウフィラメントは記憶の保持に関わる脳領域内で形成され、かつその発現が痴呆の程度によく相関するので、疾患進行の強固な目印として現れてきた（例えば、非特許文献１３および１４参照）。タウフィラメントは、ピック病および大脳皮質基底核変性を含む他の神経変性タウオパシーにおいても発現し、影響を受ける神経集団は疾患によって決まる（例えば、非特許文献１５参照）。したがって、タウフィラメント形成は、変性ニューロンの特徴である細胞骨格解体の開始の前触れとなるものであり、様々な発作に対するニューロンの基礎的な病理生物学的応答を表すことができる。
【０００４】
特定の神経変性障害とタウ遺伝子における変異との間の直接的な関連を確立することによって、遺伝子研究は、これらの知見を拡大してきた（例えば、非特許文献１６参照）。これらの常染色体優性痴呆、例えばＦＴＤＰ−１７は、複数の部類に分けられる。第１の部類は、タウタンパク質をコードする配列内の点変異からなる。第２の部類は、これらの障害の不溶性タウ沈着物中に見られる交互的にスプライスされたタウアイソフォームの分布に影響を及ぼすイントロン変異からなる。生じた「タウオパシー」のそれぞれで、ＦＴＤＰ−１７変異Ｐ３０１Ｌ遺伝子を有する遺伝子導入マウスと同様に（例えば、非特許文献１７および１８参照）、フィラメント状タウ封入が蓄積する（例えば、非特許文献１６参照）。これらの知見は、正常な神経機能におけるタウタンパク質の重要性を際立たせるものであり、かつ、タウ構造の変化が、フィラメント形成および神経変性に直接つながりうることを示している。
【０００５】
実際、ヤツメウナギの網様体脊髄路ニューロンにおいて、単にヒトタウを過剰発現するだけで、フィラメントの蓄積と、結果としての神経細胞死とを推進するのに十分である（例えば、非特許文献１９参照）。ヤツメウナギ系において、ニューロンは臨界量のタウフィラメントが存在する限り機能し続ける。神経線維プロトマーＮＦ１８０などの他の重合性タンパク質の過剰発現も、フィラメント形成を招くが、しかし神経変性はもたらさない（例えば、非特許文献２０参照）。これらのデータは、タウタンパク質の線維状形態への集合が、罹患ニューロンにおいて、変性を悪化させるか、または潜在的にそれを媒介する、タウの機能の毒性の獲得をもたらすことを示唆している。
【０００６】
精製した組換えタウ調製物は、生理学的濃度（低マイクロモル）と温度（例えば、非特許文献２１参照）では自発的には重合しないので、これらの知見をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認することがなされてきた。しかし、５０から１００μＭの濃度で脂肪酸を加えることによって、直鎖状の形態を有するタウフィラメントを全長タウタンパク質からの数時間で効率的に形成させることができる（例えば、非特許文献２１および２２参照）。これらの薬剤は、ミセルを形成し、タウタンパク質に負に荷電した表面をもたらすことによって作用する。接種実験に基づくと、脂肪酸誘発合成による直鎖状フィラメントは、ＡＤ中に見られる対になった螺旋状フィラメント（ＰＨＦ）と密接に関係があり、単一のヘミフィラメントと対応しているようである（例えば、非特許文献２１参照）。このパラダイムを用いると、タウ線維化の速度とその程度はＣ末端切断および残基Ｓ３９６／４０４でのリン酸化反応模倣の影響を受けることが分かった。Ｐ３０１Ｌなどの既知のＦＴＤＰ−１７部位での点変異は、タウフィラメント形成を著しく促進することも分かった（例えば、非特許文献２３および２４参照）。したがって、フィラメント形成および疾患に付随するタウ改変またはタウ変異の多くは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタウ線維化を加速することを示すといえる。
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願第０９／９１９，４７５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，００１，３３１号明細書
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【非特許文献７】Feany et al., Am. J. Pathol. 146: 1388 (1995)
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【非特許文献６８】Langer et al. (1990)
【非特許文献６９】the U.S. Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in animals, and, more particularly, in humans
【非特許文献７０】"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin
【非特許文献７１】Gamblin et al., Biochemistry 39: 14203-14210 (2000)
【非特許文献７２】Carmel et al., Biol. Chem. 271: 32789-32795 (1996)
【非特許文献７３】King et al., J. Neurochem 74: 1749-1757 (2000)
【非特許文献７４】Snyder et al., Biophys 67: 1216-1228 (1994)
【非特許文献７５】Evans et al., Proc. Natl.Acad. Sci U.S.A. 92: 763-767 (1995))
【非特許文献７６】Goldsbury et al., J. Struct. Biol. 130: 352-362 (2000)
【非特許文献７７】Masel et al., Biophys. Chem. 88: 47-59 (2000)
【非特許文献７８】Wilson et al., J. Biol. Chem. 270: 24306-24314 (1995)
【非特許文献７９】Naiki et al., Methods Enzymol 309: 305-318 (1999)
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
同時係属中の米国特許（特許文献１参照）に記載の方法を用いて、タウプロトマーに対して亜化学量論濃度（ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）で、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させる比較的低分子量の特異的なリガンド（一般に約４００ダルトン未満）が特定されている。本出願と同一の譲受人が所有するこの同時係属中の出願の全体を参照により本明細書に組み込む。これらのリガンドまたは阻害剤は、タウフィラメントがそこで形成されるアルツハイマー病を含む特定の神経障害または病態をｉｎ ｖｉｖｏで治療的に処置するために使用することができる。
【０００９】
一つの実施形態では、本発明は、
脳内のタウ線維化を阻害する方法を必要とする患者を特定するステップと、
その患者に、薬理学上有効な量のタウ線維化の阻害剤であって、以下の一般式の化合物（式Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は独立に、１個から６個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ４は独立に、１個から６個の炭素原子を有する第２の脂肪族基または１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換の脂肪族基である）
である阻害剤を投与するステップと
を含む患者の脳内のタンパク質タウの集合を調節する方法を提供する。
【００１２】
好ましい一つの実施形態では、阻害剤は次式（式ＩＩ）
【００１３】
【化２】
【００１４】
を有する３−（２−ヒドロキシエチル）−２−｛２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（Ｎ７４４）である。
【００１５】
一つの実施形態では、上記患者はヒトである。一般に阻害剤は、通常の技術を用いて決定することができる有効量で投与する。一般に、阻害剤を１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇの範囲から選択される量で投与する。一つの実施形態では、少なくとも１週間にわたる期間反復して投与を実施する。一つの実施形態では、少なくとも１カ月にわたる期間反復して投与を実施する。一つの実施形態では、少なくとも３カ月にわたる期間反復して投与を実施する。一つの実施形態では、少なくとも１年にわたる期間反復して投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも月１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも週１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも１日１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも週に１回、少なくとも１カ月間投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも１日に１回、少なくとも１カ月間投与を実施する。
【００１６】
アルツハイマー病は、部分的には、微小管会合タンパク質タウから構成されるフィラメントの神経細胞内蓄積によって定義される。動物モデルによる研究によれば、機能の毒性獲得はニューロン中のタウ線維化を伴うので、そのプロセスの選択性薬理学的阻害剤は神経変性を遅延させる可能性があることが示唆されている。本発明は、式Ｉのタウ線維化の小分子阻害剤を提供する。
【００１７】
【化３】
【００１８】
式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は独立に、１個から６個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ４は独立に、１個から６個の炭素原子を有する第２の脂肪族基または１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換の脂肪族基である。好ましい実施形態では、本発明は、タウ線維化の阻害剤、３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（本明細書ではＮ７４４と称する）も提供する。これを式ＩＩに示す。
【００１９】
【化４】
【００２０】
Ｎ７４４は、平面状でありかつ炭化水素リンカーの側面に位置する２つの芳香族環からなる点で、染料のコンゴレッドファミリーに広く関連するベンゼナミン誘導体である。生理的ｐＨで正に荷電していると予測されている。
【００２１】
Ｎ７４４は、３００ｎＭ未満のＩＣ５０を有するタウに対して亜化学量論濃度で、全長４回反復タウタンパク質のアラキドン酸誘発の線維化を阻害する。タウプロトマーに対する化学量論量の濃度で、成熟した合成フィラメントに加えられた場合、Ｎ７４４はタウ脱凝集も促進する。脱凝集は一次速度論に従い、フィラメント数の安定した減少を伴う。これはＮ７４４が、限定的なフィラメントの切断を伴って、タウ分子の末端方向の損失（ｅｎｄｗｉｓｅ ｌｏｓｓ）を促進することを示唆している。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのその活性のため、Ｎ７４４は疾患の細胞モデルでのタウ仮説のテストに有用である。
【００２２】
本明細書で提示したデータは、タウ線維化を、タウプロトマーに対して亜化学量論濃度で、かつ＞１００倍モル過剰の脂肪酸誘導物質の存在下で作用する式Ｉの化合物、具体的にはＮ７４４である小さいリガンド（＜４００Ｄａ）によって阻害することができることを示している。これらのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでタウフィラメント形成に拮抗する、さらにはその形成を逆転させることの実行可能性を裏付けている。
【００２３】
本発明は、このような調節を必要とする哺乳動物脳内のタンパク質タウの集合を調節する方法であって、その哺乳動物に薬学上許容可能な担体中で薬剤有効量のタウ線維化阻害剤を投与することを含む方法を含む。本発明の目的では、「タンパク質タウの集合を調節する」という用語は、これらに限定されないが、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させること、および／またはタウフィラメント形成または線維化の速度を抑制することを含む。
【００２４】
タウタンパク質は、集合して、コンゴレッドおよびチオフラビンＳなどの組織化学的染料と結合可能な線状のフィラメントとなる。これは、タウタンパク質が、伸長したβシート構造の特徴の「アミロイド」の沈着物と重合することを示唆している（例えば、非特許文献２５および２６参照）。断片タウタンパク質と全長タウタンパク質の両方とｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるリガンドの媒介した集合反応に基づくと、線維化は、微小管反復領域中に位置する短い疎水性配列によって媒介されるようである（例えば、非特許文献２４および２７参照）。しかし、この領域外での配列は、線維化の動力学とフィラメント内でのプロトマーの構造の両方に著しく影響を及ぼす（例えば、非特許文献２４および２８参照）。したがって、他のタンパク質から誘導されたアミロイド原線維とほぼ類似性を維持しているにもかかわらず、全長タウタンパク質のフィラメントは、潜在的にユニークな、重合阻害剤に結合するためのファルマコフォアを提供する。
【００２５】
Ｎ７４４は、精製された組換えｈｔａｕ４０からの脂肪酸媒介によるフィラメントの形成を阻害するようである。小分子がアミロイド原線維形成に拮抗する能力はすでに報告されている（例えば、非特許文献２９および３０参照）。これらの阻害剤は集合の様々な段階で作用して、有効モノマー濃度を低下させるか、フィラメント末端での成長を阻止するか、あるいはフィラメント切断の速度を増大させるとみなされている（例えば、非特許文献３１参照）。Ｎ７４４の場合、タウ集合アッセイにこれを含めると、総タウフィラメント質量（これは合計長さに比例している）の濃度依存的な低下を導く。この効果に関するＩＣ５０は約３００ｎＭであった。単位長さ当たり質量値を７４．６ｋＤａ／ｎｍと仮定すると（例えば、非特許文献３２参照）、４μＭタウの約４０％がフィラメント形態へ転換され（例えば、非特許文献３３参照）、ＤＭＳＯ媒体だけを含む対照反応では１１１ｎｍの数平均フィラメント長さ（図１Ａ）から、フィラメント数濃度の推定として約１０ｎＭが得られる。したがって、Ｎ７４４はタウ線維化を、タウプロトマーに対して亜化学量論濃度で阻害するが、この濃度はフィラメントしたがって核の最終濃度よりずっと高い。
【００２６】
合計フィラメント数と長さの阻害についてのＩＣ５０値が非常に類似していたので、アラキドン酸を介した核形成の阻害は、ＩＣ５０近傍でのＮ７４４活性に大きく寄与するようである。しかし、合計タウプロトマーに対する化学量論的に近接した濃度では、Ｎ７４４のフィラメント長さ分布に対する効果は明白になる。さらに、化学量論濃度のＮ７４４での成熟したフィラメントを処理すると、一次速度式でのフィラメント脱凝集、指数分布に近似したフィラメント長さの維持およびフィラメント数の着実な減少をもたらす。これらの特徴は漸進的な末端方向の脱凝集と一致し、フィラメントの長さ方向に沿った破局的なフィラメント切断とは一致しない（例えば、非特許文献３４参照）。フィラメント長さ分布のＮ７４４を介した減少とあいまって、これらのデータは、化学量論濃度のＮ７４４が原線維タウと非原線維タウとの間の平衡に影響を及ぼし、それによってフィラメント末端からのタウの解離が支配的となることを示唆している。新たな平衡の結果として、４μＭ ｈｔａｕ４０の線維化はもはや支持されなかった。
【００２７】
組換えモノマーからのタウ線維化の経路は完全には明らかでないが、一般的スキーム（スキームＩ）に従うことによる他のアミロイドの経路と一致するようである。
【００２８】
【化５】
【００２９】
ここで、Ｕは折り畳まれていない状態を表し、Ｉは二量体などの二次構造またはオリゴマー構造を含むことができる中間形態を表し（例えば、非特許文献３５参照）、Ｎはその形成が律速的である核を表し、Ｆは複数であってよく、かつプロトフィラメントを含むフィラメント形態を表す（例えば、非特許文献３６参照）。成熟したフィラメントは、最終的に、恐らくそのＵ形態および１形態にある非原線維タンパク質との平衡に達する。これは集合体の臨界濃度に反映されている。アラキドン酸は、折り畳まれていないタウと相互作用してアニオン性のミセルを形成することによってこの経路を加速する（例えば、非特許文献３３参照）。得られる複合体は非常に速やかに核形成し、誘導物質の非存在下では通常ほとんどフィラメントをもたらさないか、もたらしてもわずかな低いミクロモルのタウ濃度で大量のフィラメントを生成する。（例えば、非特許文献２１および３３参照）。他のアミロイド形成タンパク質であるα−シヌクレインを用いた実験では（例えば、非特許文献３７参照）、アニオン性のミセルは、部分的に折り畳まれた中間形態に好都合なように平衡をシフトさせ、集合の時間の遅れを短縮させ、集合の見掛けの一次速度を増大させ、かつ、ミセルの非存在下で行われる反応に比較して平衡での臨界濃度を低下させることによって、線維化を誘発するようである。タウのミセルを介した線維化がこれらの特徴を保持すると仮定すると、Ｎ７４４はアラキドン酸の作用に拮抗するようである。Ｎ７４４はタウフィラメント核形成を阻害する、そして集合体の臨界濃度を上昇させるようである。この挙動は多分アラキドン酸ミセル化の直接阻害から誘導されるものではない。その理由は、Ｎ７４４は正に荷電し、アニオン性のミセルと多分相互作用することができるが、タウ線維化の阻害についてのそのＩＣ５０は＜０．０１％のアラキドン酸のモル濃度だからである。実際、拡散したカチオンであるそうしたＮ７４４は一般に、アニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度を低下させる（例えば、非特許文献３８参照）。
【００３０】
Ｎ７４４とコンゴレッドとの間の構造的な類似性による、より可能性のある機構が提案されている。Ｎ７４４と同様に、コンゴレッドは平面状の芳香族染料であり、その結合化学量論と光学特性（複屈折）に基づくと、すべてアミロイド原線維の長さに沿って結合すると考えられる（例えば、非特許文献３９参照）。しかし、コンゴレッドは球状タンパク質、および部分的に折り畳まれた中間体の二次的構造要素にも結合する（例えば、非特許文献４０参照）。トランスサイレチンに作用するフルフェナム酸、またはチューブリンに作用するコルヒチンなどの球状モノマーに結合できる化合物は、本明細書でタウタンパク質について述べたものと類似した凝集の亜化学量論での阻害をもたらすことができる（例えば、非特許文献４１および４２参照）。後者の例では、凝集の亜化学量論での阻害および脱集合の促進はフィラメント極性に依存する。ここで、集合および薬物作用は、主に一方の末端で起こり、脱集合はその反対側の末端で進行する（例えば、非特許文献４３参照）。接種実験はタウフィラメントが成長極性を有することと一致するので（例えば、非特許文献２１参照）、今のところこの機構を排除することはできない。しかし、組換えタウモノマーは大部分ランダムコイルであるので（例えば、非特許文献４４参照）、Ｎ７４４がこの形でタウと相互作用することはなさそうである。むしろ、コンゴレッドについて示唆されているように（例えば、非特許文献４０参照）、Ｎ７４４は、集合能力のある中間体と結合して集合能力のない凝集体を形成する可能性がある。得られる平衡のシフトは中間体の有効濃度を低下させ、より遅いフィラメント核形成をもたらすと予想される。フィラメント核形成速度とタンパク質濃度との関係については次の式が提案されている。
ｄＣ／ｄｔ＝ｋｎ（Ｐｉ）ｎ
ここで、Ｃはフィラメントの数濃度であり、ｋｎは核形成速度定数であり、Ｐｉは集合能力のある中間体の濃度であり、ｎは核の中の分子の数である（例えば、非特許文献４５参照）。したがって、小さいＮ７４４を介した集合能力のある中間体の濃度の変化は、核形成速度に対して大きな非線形的な影響があることが予測される。Ｎ７４４濃度に対するタウフィラメント核形成の協同的阻害（１．６から１．８のヒル係数が観察される）はこの関係からきている可能性がある。線維化能力のない中間体への平衡における阻害剤媒介シフトも、線維化速度を低下させ、平衡での非原線維プロトマーの量を増大させることが予想される（例えば、非特許文献４６参照）。Ｎ７４４によって誘発される末端方向の脱凝集と、新たな平衡へのアプローチの一次速度はこのモデルと一致する。
【００３１】
神経原線維損傷の空間的および時間的分布と、神経細胞損失および痴呆の重症度との間の密接な関係はＡＤの進行におけるタウ線維化の中心的役割を示唆している（例えば、非特許文献４７、４８および４９参照）。この仮説は、Ａβ沈着物の非存在下での神経原線維損傷の進行を特徴とし、かつタウ遺伝子における変異と遺伝子的に関連している、家族性神経原線維痴呆の発見によって著しく強固なものになってきている（例えば、非特許文献５０および５１参照）。タウ線維化が、機能の毒性獲得（ｔｏｘｉｃ ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（すなわち、フィラメント自体によって引き起こされた代謝破壊または毒性）または機能の損失（すなわち、フィラメント中へのタウの隔離による正常なタウ機能への干渉）を表すのかはまだ確認されていない。家族性神経原線維痴呆に関連するタウ突然変異体の機能的特徴についての研究は不確かなものである。これらの突然変異体のいくつかは細胞培養で微小管結合の減少を示すが（例えば、非特許文献５２および５３参照）、これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフィラメントを形成する傾向の増大も示す（例えば、非特許文献５４および２３参照）。大部分の家族性神経原線維痴呆の遺伝の常染色体優性モード（例えば、非特許文献５５参照）は、作用の「機能の獲得」モードを示唆しており（それを必要とはしないが）、複数のタウをベースとした機構がＡＤおよび家族性神経原線維痴呆に見られる神経変性に寄与することができる。この問題へのＮ７４４を用いた薬理学的アプローチによってタウ線維化の神経変性への寄与を明らかにすることができる。作用のその亜化学量論モードは、タウ線維化の阻害が、神経突起損傷に付随して見られる高いタウ濃度でも実施可能であることを示唆している（例えば、非特許文献５６参照）。
【００３２】
形態学およびプロトマー化学量論に基づけば、アラキドン酸処理で誘発される合成タウフィラメントは疾患の早期に見られる直線状のフィラメントに類似しており（例えば、非特許文献５７参照）、標準的な対になった螺旋状フィラメント（ＰＨＦ）からなる１つのヘミフィラメントに相当している（例えば、非特許文献２１および３２参照）。これらの形態学の中での、プロトマー構造の明らかな共通性は、Ｎ７４４が、タウオパシー的神経原線維変性の種々の細胞および動物モデルにおいてタウ線維化を調節するのに有用であることを示唆している。
【００３３】
染料３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（Ｎ７４４）（式ＩＩ）ならびに類似の化合物は、精製された組換えｈｔａｕ４０からの直線状フィラメントの脂肪酸媒介形成を阻害することを見出した。
【００３４】
本発明での使用に適した阻害剤は一般式（式Ｉ）の化合物である。
【００３５】
【化６】
【００３６】
式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は独立に、１個から６個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ４は独立に、１個から６個の炭素原子を有する第２の脂肪族基または１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換の脂肪族基である。
【００３７】
好ましい一実施形態では、阻害剤は次式（式ＩＩ）
【００３８】
【化７】
【００３９】
を有する３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル）−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（Ｎ７４４）である。
【００４０】
上記の式Ｉでは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５は独立に１個から６個の炭素原子を有するアルキル基である。そうしたアルキルまたは脂肪族基の例はメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルであり、直鎖基と分枝基の両方を含む。アルキル基はメチルまたはエチルであることが好ましく、メチルであることがより好ましい。
【００４１】
上記の式Ｉでは、Ｒ２およびＲ４は独立に１個から６個の炭素原子を有するアルキルまたは脂肪族基、あるいは１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換アルキルまたは脂肪族基である。このようなアルキルまたは脂肪族基の例はメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシル基であり、直鎖基と分枝基の両方を含む。アルキル基はメチルまたはエチルであることが好ましく、メチルであることがより好ましい。このようなヒドロキシル置換アルキルまたは脂肪族基の例はヒドロキシル置換メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシルであり、直鎖基と分枝基の両方を含む。ヒドロキシル置換アルキル基は−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＨ基であり、式中、ｎは０から５の整数、より好ましくはｎは１であることが好ましい。
【００４２】
式Ｉの阻害剤は、同時係属中の米国特許（特許文献１参照）に記載のものと本質的に同じ方法を用いて同定した。これらの阻害剤は、タウフィラメントの形成または線維化を阻害および／または逆転させる特異的な比較的低分子量のリガンドである。本出願と同一譲人であるこの同時係属中の出願の全体を参照により本明細書に組み込む。これらのリガンドまたは阻害剤は、タウフィラメントがそこで形成されるアルツハイマー病を含む特定の神経障害または病態を治療的に処理するために使用することができる。
【００４３】
特に好ましい一つの実施形態では、哺乳動物はヒトである。一般に阻害剤は、従来の技術を用いて投与できる有効量で投与する。一般に、阻害剤は１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇの範囲から選択される量で投与する。
【００４４】
一つの実施形態では、少なくとも１週間にわたる期間、本発明の阻害剤を反復して投与する。一つの実施形態では、少なくとも１カ月にわたる期間反復して投与を実施する。一実施形態では、少なくとも３カ月にわたる期間反復して投与を実施する。一つの実施形態では、少なくとも１年にわたる期間反復して投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも月１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも週１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも１日１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも週に１回、少なくとも１カ月間投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも１日に１回、少なくとも１カ月間投与を実施する。
【００４５】
本発明のこの態様は、タウ線維化に関連する様々な疾患および障害の治療および／または予防を提供する。本発明は、有効量の本発明の治療薬を対象に投与することによって治療（および予防）する方法を提供する。好ましい態様では、その治療薬は実質的に精製されたものである。患者または対象は好ましくは、これらに限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ等を含む動物であり、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００４６】
様々な送達系が知られており、これらを本発明の治療薬を投与するために用いることができる。そうした送達系には、例えば、リポソーム中への封入、微小粒子、マイクロカプセル、治療薬を発現できる組換え細胞（例えば、非特許文献５８参照）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築等が含まれる。導入方法には、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外および経口経路が含まれる。治療薬は、輸液またはボーラス注入、上皮または粘膜皮膚壁（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通した吸収を含む任意の好都合な経路で投与することができ、他の生物学的活性薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身であっても局所であってもよい。さらに、本発明の薬剤組成物を、脳室内およびくも膜下腔内注入を含む任意の適切な経路で、中枢神経系に導入することが望ましい。脳室内注入は、例えばリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって使い易くすることができる。エアロゾル化剤を含む調合物を用いた経肺投与も使用することができる（例えば吸入器または噴霧器）。
【００４７】
具体的な実施形態では、本発明の薬剤組成物は、脳などの治療を要する領域へ局所的に投与することが望ましい。これは、限定されるものではないが、例えば、外科手術時での局部注入、局所使用（例えば創傷包帯）、注射、カテーテル、座剤または埋め込み（例えば、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）の膜または線維などの膜を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン状材料から形成された埋め込み材）等によって実現することができる。一つの実施形態では、脳などの酸化によって損傷を受ける組織の部位（または元の部位）に直接注入して投与を行うことができる。他の実施形態では、薬を小胞、特にリポソームで送達することができる（例えば、非特許文献５９および６０参照）。
【００４８】
さらに他の実施形態では、治療薬を放出制御系で送達することができる。一つの実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、非特許文献６１、６２および６３参照）。他の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（例えば、非特許文献６４、６５、６６および６７参照）。総説として考察されている他の放出制御系も使用することができる（例えば、非特許文献６８参照）。
【００４９】
一般に、本発明の阻害剤は典型的には薬学上許容可能な担体を用いて投与する。「薬学上許容可能な」という用語は、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認されているか、あるいは米国薬局方（例えば、非特許文献６９参照）に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、補助剤、賦形剤または治療薬をそれと一緒に投与する媒体を指す。このような薬剤用担体は、水、あるいは油、動物、植物または合成由来のものを含む、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の油類などの滅菌液体であってよい。水は、薬剤組成物を静脈内に投与する場合に適した担体である。食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は液状担体として、特に注入可能な溶液用に使用することもできる。適切な薬剤用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。所望により、治療薬は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨバッファー剤も含むことができる。これらの治療薬は液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出徐放製剤等の形態をとることができる。治療薬は、トリグリセリドなどの従来の結合剤または担体を用いて座剤として製剤することができる。経口製剤には、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的担体を含むことができる。適切な薬剤担体の例は、文献（例えば、非特許文献７０参照）に記載されている。このような治療薬は、患者への適切な投与を提供するために妥当な量の担体と一緒に、治療有効量の活性成分を、好ましくは精製した形で含む。製剤は投与の様式に適合したものでなければならない。
【００５０】
好ましい実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬剤組成物として通常の手順で製剤される。一般に、静脈内投与のための組成物は殺菌した等張性水性バッファーの溶液である。必要であれば、組成物は、可溶化剤および注入部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局部麻酔薬も含むことができる。一般に、構成成分は、別々に提供するか、あるいは単位剤形中に一緒に混ぜて、例えば活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェイなどの密封容器中の凍結乾燥粉末または水分を含まない濃縮物として提供する。組成物を輸液で投与する場合、滅菌した薬剤グレードの水または生理食塩水を含む輸液用瓶で組成物を分注することができる。組成物を注入で投与する場合、投与する前に構成成分を混合できるように、滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００５１】
本発明の治療薬の有効な量は、タウ関連障害または状態の性質、および障害または状態の段階に依存する。有効な量は標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、以下に述べるようなものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイを任意選択で用いて、最適の投与量範囲を特定する助けとすることができる。製剤で用いるための正確な用量は投与の経路に依存することになり、保健医療医の判断および各患者の状況によって決定されなければならない。しかし、適切な投与量範囲は約１０ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日である。効果的な用量はｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から推定することができる。本発明は、本発明の治療薬の１つまたは複数の構成成分を充填された１つまたは複数の容器を含む薬剤のパックまたはキットも提供する。
【００５２】
一つの実施形態では、患者の脳内タンパク質タウの集合を調節するための方法は、脳内のタウ線維化を阻害する方法を必要とする患者を特定するステップと、薬理学上有効な量の本明細書で定義の式ＩまたはＩＩのタウ線維化の阻害剤を患者に投与するステップとを含む。
【００５３】
一つの実施形態では、上記特定は、患者でのタウの突然変異体ゲノムサブタイプを特定することに基づく。一般に、これらの突然変異体サブタイプはタウタンパク質線維化の増大を伴う。文献（例えば、非特許文献３参照）の総説を参照されたい。他の実施形態では、その特定はアルツハイマー病の診断以外のものである。この実施形態では、その特定は、これらに限定されないが、ピック病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性および家族型前頭側頭骨痴呆、ならびに染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症などのタウ線維化を伴う他の障害の診断である。
【００５４】
以下の実施例は本発明の方法および組成物を説明し例示する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであって、範囲においても趣旨においてもそれを限定するものではない。別段の指定のない限り、すべての割合は重量ベースである。当分野の技術者は、実施例で記載の材料、条件および方法の変更形態を用いることができることを容易に理解されよう。
【実施例】
【００５５】
一般的実験手順
材料。組換えポリヒスチジン−タグを付けたｈｔａｕ４０を上記したようにして発現させ精製した（例えば、非特許文献７１および７２参照）。ヒトＡβ１〜４０（Ｂａｃｈｅｍ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）をＤＭＳＯ（５００μＭ）中に溶解させ、超音波処理し（室温で３０分間）、使用前にろ過した（０．２μＭカットオフ）。ヒトアミリン（Ｂａｃｈｅｍ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）のストック溶液を水（２５０μＭ）中で調製した。アラキドン酸（Ｆｌｕｋａ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を１００％エタノール中に溶解し、使用するまでアルゴンガス中に−８０℃で保存した。タウ線維化阻害剤、３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（Ｎｅｕｒｏｎａｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；Ｅｖａｎｓｔｏｎ，ＩＬ）をＤＭＳＯ（１０ｍＭストック）中に溶解し、−２０℃で保存した。
【００５６】
タウ凝集。精製した組換えｈｔａｕ４０を、上記したようにして（例えば、非特許文献２１、２２および７３参照）重合させた。標準的条件下で、４μＭ（最終濃度）ｈｔａｕ４０を室温かまたは３７℃で、集合バッファー（１０ｍＭ ４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジンエタンスルホン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＤＴＴ）中でアラキドン酸とインキュベートした。アラキドン酸（７５〜１００μＭ）を加えて線維化を誘発させ、これを３時間から６時間継続し、以下に説明するようにして電子顕微鏡で分析した。存在する場合、凝集アッセイにおけるＮ７４４最終濃度は０．１２〜４．１μＭで変化させた（最大４．７μＭのＮ７４４の最終濃度を脱凝集アッセイで使用した（以下参照））。対照反応を、すべての反応において５％（体積／体積）以下に限定したＤＭＳＯ媒体について標準化した。
【００５７】
タウ脱凝集。精製したｈｔａｕ４０（４μＭ）の溶液を上記の標準的な条件下で３．５時間重合させ、次いで２つの別々の管に分割した。一方の管には４．７μＭの最終濃度でＮ７４４を受け、他方の管にはＤＭＳＯ媒体だけを受けた。０、１、３、５、９、１２および１９時間インキュベーションした後、それぞれのサンプルから一定分量を取り出し、以下で説明する電子顕微鏡アッセイにかけた。対照（Ｎ７４４が存在しない）反応を、すべての反応において５．７％（体積／体積）未満に保持したＤＭＳＯ媒体について標準化した。。
【００５８】
透過電子顕微鏡法。一定分量（５０μｌ）の凝集および脱凝集反応物を取り出し、グルタルアルデヒド（２％）で固定し、３００メッシュのフォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）／カーボンコーティングした銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｆｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）上で吸着させた（１分間）。得られたグリッドを水で洗浄し、２％酢酸ウラニル（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し（１分間）、再度水で洗浄し、ブロッティングして乾燥し、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＣＭ１２顕微鏡で、６５ｋＶで動作させて観察した。各実験条件からの３つから５つのランダムな画像を２２，０００×の倍率でフイルムに記録し、デジタル化し、較正し、上記したようにして（例えば、非特許文献７３参照）フィラメント長さおよび数を定量化するためにＯｐｔｉｍａｓ６．５１に取り込んだ。個々のフィラメントを、その長軸が５０ｎｍを超えるすべての物体と規定する。フィラメントを手作業でカウントした。フィラメントの数を、合計フィラメント長さと合計フィラメント数の両方について、平均±標準偏差として記録する。長さ分布を２５ｎｍ（集合）または５０ｎｍ（脱集合）のワイドビンで定量化した。
【００５９】
Ａβ１〜４０凝集。Ａβストック溶液を、凝集バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノコエタンスルホン酸、ｐＨ６．２；最終体積３００μｌ）中で２０μＭの最終濃度に希釈して凝集を開始させた。Ａβ凝集によってもたらされた濁度を、Ｎ７４４の存在下（４．１μＭ最終濃度）および非存在下で、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６４０Ｂ分光光度計における４００ｎｍでの時間の関数として、ＤＭＳＯ媒体ブランクと対比してモニターした（例えば、非特許文献７４および７５参照）。各読取りの前にキュベットを渦巻混合させた。合計ＤＭＳＯ媒体濃度をサンプル間で制御した。６％（体積／体積）は超えなかった。
【００６０】
アミリン凝集。４．１μＭ Ｎ７４４の存在下または非存在下で、ペプチドを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．３中に５０μＭの最終濃度まで希釈して凝集を開始させた（例えば、非特許文献７６参照）。０、１、３、５、７および２４時間後に一定分量を取り出し、上記のようにしてＥＭ用に調製した。合計ＤＭＳＯ媒体濃度は５％（体積／体積）を超えなかった。
【００６１】
分析方法。吸収によってタウタンパク質濃度を２８０ｎｍで測定した（例えば、非特許文献７２参照）。別段の言及のない限り、線形回帰分析からの誤差はすべて９５％信頼限界である。
【００６２】
（実施例１）
タウ線維化の阻害。タウ線維化の化学的拮抗物質を特定するため、小分子のライブラリを、蛍光アッセイを用いて、生理学的条件に近似した条件下でアラキドン酸（５０μＭ）によって誘発されるｈｔａｕ４０（２μＭ）集合に対する阻害活性についてスクリーニングした（例えば、非特許文献２２参照）。Ｎ７４４の構造、Ｎ７４４はスクリーニングによって特定された阻害剤であるが、その構造を式Ｉに示す。それは荷電した分子（生理的ｐＨで）であり、平面状の芳香族染料であるコンゴレッドファミリーの化合物に幅広く関連している。
【００６３】
標準的条件下でアラキドン酸（７５μＭ）によって誘発されるｈｔａｕ４０（４μＭ）の線維化に拮抗するためのＮ７４４の能力を透過電子顕微鏡法で試験した（例えば、非特許文献２１参照）。一般に、ｈｔａｕ４０プロトマーの約５０％がこれらの条件下でフィラメント中に取り込まれる。ＤＭＳＯ媒体単独の存在下では、ｈｔａｕ４０は重合して直線状の形態を有する非常に多くのフィラメントを形成した（図１Ａ）。しかし、Ｎ７４４の存在下では（４．１μＭ；タウプロトマーに対して約１：１モル化学量論量）、すべてのフィラメントの合計数かまたは合計長さに反映されているように、線維化は著しく阻害されていた（図１Ｂ）。０．１２４μＭから４．１μＭの間でＮ７４４濃度を変化させることにより、阻害された合計フィラメント長さにより測定されるフィラメント形成で、２９４±２３ｎＭのＩＣ５０と１．８４±０．１４の傾き（Ｈｉｌｌ ｓｌｏｐｅ）として阻害活性が類別されることが分かった（図２）。これらのデータによって、Ｎ７４４がタウ線維化の有力な阻害剤であり、タウプロトマーおよびアラキドン酸誘導物質に対して亜化学量論濃度で活性であることが確認された。
【００６４】
（実施例２）
阻害機構。タウ線維化は核形成相および伸長相によって特徴づけされる。これらの２つの相に対するＮ７４４の影響を識別するために、フィラメント長さ分布を阻害剤濃度の関数として測定し、ＤＭＳＯ媒体だけを含む対照反応と比較した。対照反応で形成された多数のフィラメントは指数長さ分布をとった（図３）。この分布は低Ｎ７４４濃度（すなわち、ＩＣ５０近傍；図３）で維持されたが、形成されたフィラメントの数は対照反応に対して減少した（図２）。Ｎ７４４濃度が増大してｈｔａｕ４０プロトマー対するモル化学量論量に近似しても、フィラメント数のさらなる減少が観察された（図２）。これらのデータは、Ｎ７４４の主要な作用が、タウフィラメント核形成を阻害することであることを示唆している。確かに、タウフィラメント数の阻害についての用量反応曲線は、合計フィラメント長さの阻害についての用量反応曲線とほぼ同じである（図２）。それにも関わらず、化学量論濃度でのＮ７４４は、フィラメント長さ分布もＤＭＳＯ媒体対照に対してより短い長さの方へシフトさせた（図３）。したがって、Ｎ７４４は亜化学量論濃度でタウフィラメント核形成を阻害できると思われるが、その濃度がタウプロトマー対するモル化学量論量に近似するにしたがって、核形成と伸長の両方を阻害することができる。
【００６５】
（実施例３）
Ｎ７４４はタウフィラメント脱凝集を促進する。Ｎ７４４が化学量論濃度近傍で、タウフィラメントの伸長を阻害する能力を有することは、成熟したフィラメントを不安定化させることも可能であることを示唆している。この仮説を検証するため、ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、３．５時間かけてアラキドン酸（７５μＭ）と重合させ、続いて、等量の一定分量をＮ７４４（４．７μＭ）またはＤＭＳＯ媒体単独で処理し、フィラメント数と長さを電子顕微鏡で１９時間かけて「追跡」して測定した。Ｎ７４４の非存在下では、合計ｈｔａｕ４０フィラメント長さはこの期間で２３±４％減少した（図４）。実験パラダイムにおいて、サンプル希釈は６％だけであったので、ＤＭＳＯ単独では、これらの濃度でタウフィラメントを不安定化させると思われる。これに対して、Ｎ７４４（４．７μＭ）を加えると、合計フィラメント長さのより迅速な減少がもたらされ、その結果１９時間のうちに合計フィラメント長さの８７±１３％が失われた。これらの条件下で、フィラメント損失の初期速度は一次崩壊としてよくモデル化された（ｒ２＝０．９８１；ｋ＝０．１２±０．０１ｈ−１）（図４）。これらのデータは、Ｎ７４４が、成熟フィラメントを不安定化させ、０．１０±０．０２ｈ−１の正味速度（すなわち、希釈およびＤＭＳＯ効果を補正した速度）での一次速度式で合計フィラメント長さを減少させることができることを示唆している。
【００６６】
（実施例４）
脱凝集の機構。フィラメントの脱凝集は、Ｎ７４４の促進するランダムフィラメント切断によって、または末端方向の解重合を促進することによってもたらされる（例えば、非特許文献７７参照）。平衡における線状タンパク質集合体の末端方向解重合の動力学的特徴は、ポリマーの長さ分布によって決まる（例えば、非特許文献３４参照）。長さが指数分布をとるタウフィラメントについては（例えば、非特許文献７１および７８参照）、解離速度は一次であると予測されている（例えば、非特許文献３４参照）。さらに、フィラメントの脱集合は、徐々に短縮されるフィラメント長さの指数分布を維持しながら進行すると予測されている（例えば、非特許文献３４参照）。
【００６７】
一次のリガンド誘発フィラメント解重合の観察から、ランダムなフィラメント切断の促進によるよりは、Ｎ７４４がフィラメント末端からのタウプロトマーの逐次的な放出を促進したことが示唆される。この仮説を確認するために、タウポリマーの長さ分布を、予め集合させたタウフィラメントをＮ７４４（４．７μＭ）またはＤＭＳＯ媒体単独で処理した後、時間の関数として（１９時間）試験した。時間０では、Ｎ７４４処理したものと対照反応の両方が同じタウフィラメント長さの指数分布を示した。末端方向の解重合モデルに一致して、フィラメントが、対照反応に対してより短い長さにシフトしたので（時間０および１９時間のみについて示されている；図５）、指数フィラメント長さ分布はＮ７４４媒介解重合反応を通して維持された。さらに、Ｎ７４４媒介解重合は、５０ｎｍ超の長さのフィラメントの数の緩慢な減少を伴った（時間０および１９時間のみについて示されている；図５）。これはランダムな切断媒介解重合モデルに一致しなかった。これらのデータを合わせると、成熟した合成タウフィラメントを化学量論濃度のＮ７４４で処理すると、末端方向のフィラメント解凝集が促進されることを示唆している。
【００６８】
（実施例５）
タウ線維化拮抗の選択性。他の染料が、Ａβおよびインスリンから形成されたものを含む様々なアミロイド凝集物と低いミクロモル濃度で結合することが分かっている（例えば、特許文献２参照）。線維化阻害活性がアミロイド結合を伴ったかどうかを検証するために、Ｎ７４４のＡβ１〜４０の集合を阻害する能力を試験した。リガンドの非存在下では、Ａβ１〜４０（２０μＭ）は約８０分間の遅れの後で自発的に重合した。上述した一次動力学モデル（例えば、非特許文献７９参照）を用いて反応データをプロットして光学密度対時間の線形半対数プロットが得られ、１３６±３分間の集合半減期を示した（図６）。Ａβ１〜４０プロトマー（４．１μＭ）に関して亜化学量論量の濃度のＮ７４４の存在は、Ａβ１〜４０集合動力学を穏やかに変えただけであった（ｔ１／２＝１５３±３分間；図６）。これは、Ｎ７４４がこうした条件下ではＡβ１〜４０の集合に対してほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【００６９】
他のアミロイド形成タンパク質であるアミリン（例えば、非特許文献７６参照）に対するＮ７４４の活性も試験した。定性的電子顕微鏡分析によれば、４．１μＭのＮ７４４が存在しても５０μＭアミリンの線維化は２４時間にわたって調節されなかった（図６）。これらのデータは、異なるタンパク質プロトマーから形成されたポリマー構造（すなわち、伸長したβシート）の類似性にも関わらず、亜化学量論濃度で目標選択的阻害活性を有するＮ７４４などの小リガンドを選択することが可能なことを明確にしている。
【００７０】
本出願を通して、様々な特許、刊行物、書籍ならびに核酸およびアミノ酸配列を引用した。これらの特許、刊行物、書籍および配列それぞれの全体を参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】Ｎ７４４がタウ線維化を阻害することを示す図である。Ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、撹拌なしで３７℃、３．５時間アラキドン酸（７５μＭ）とともにインキュベートした。次いで一定分量を酢酸ウラニルで染色し、実施例で述べるようにして透過型電子顕微鏡で観察した。図１Ａは、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）媒体対照の存在下、ｈｔａｕ４０は１１１±６（標準偏差）ｎｍの数平均長さを有する多くのフィラメントを形成したことを示す。
【図１Ｂ】Ｎ７４４がタウ線維化を阻害することを示す図である。Ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、撹拌なしで３７℃、３．５時間アラキドン酸（７５μＭ）とともにインキュベートした。次いで一定分量を酢酸ウラニルで染色し、実施例で述べるようにして透過型電子顕微鏡で観察した。図１Ｂは、４．１μＭ Ｎ７４４の存在下、タウ線維化は著しく阻害されたことを示す。
【図２】Ｎ７４４が亜化学量論濃度でタウ線維化を阻害することを示す図である。Ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、様々な濃度（０、０．１２、０．４１、１．２および４．１μＭ）のＮ７４４の存在下で、アラキドン酸（７５μＭ）とともにインキュベートした（３７℃で３．５時間）。次いで、一定分量を透過電子顕微鏡法で２２，０００倍の倍率で検査した。長さが≧５０ｎｍのすべてのフィラメントを２つの負の値から測定し、合計して合計フィラメント長さ（黒□記号）および合計フィラメント数（□記号）対Ｎ７４４濃度をヒルプロット形式でプロットした。ここで、Ｙは対照フィラメント長さまたはフィラメント数の割合である。各線はデータポイントの線形回帰分析を表す。合計フィラメント長さと合計フィラメント数の両方Ｎ７４４の存在下で減少する。ＩＣ５０値はそれぞれ２９４±２３および２７２±１７ｎＭである。ヒルプロットの両方は正の傾きを有しており、それぞれ１．８４±０．１４および１．６１±０．１０の値である。
【図３】Ｎ７４４がタウフィラメント核形成と伸長の両方を阻害することを示す図である。Ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、ＤＭＳＯ媒体単独（黒□）、または０．１２（□）、０．４１（黒○）、１．２（〇）および４．１（黒△）μＭのＮ７４４の存在下でインキュベートし（３７℃で３時間）、次いで、透過電子顕微鏡法で２２，０００倍の倍率で調べた。次いで≧５０ｎｍの長さのフィラメントの長さと数をデジタル画像から判定し、合計してプロットした。各データポイントは、連続した長さ間隔（２５ｎｍビン）に分離した３つから５つの負の値で分析したすべてのフィラメントの割合（３７２２、２９７２、１２４８、３７９、および９２でそれぞれ個別に測定したフィラメントからそれぞれを誘導）を表し、他方、各線は、データポイントの指数分布への最良適合の線を表す。低い濃度のＮ７４４（≦４１０ｎＭ）では、長さ分布はＤＭＳＯ媒体対照とそれほど違いはなかった。これは、こうした条件下では、Ｎ７４４はフィラメント伸長を調節しなかったことを示唆している。対照的に、さらにＮ７４４濃度を上げると（≧１．２μＭ）、長さ分布の著しい短縮がもたらされる。これは、こうしたより高い濃度でフィラメント伸長が阻害されたことを示唆している。
【図４】Ｎ７４４媒介脱凝集の時間発展を示す図である。ｈｔａｕ４０（４μＭ）とアラキドン酸（７５μＭ）から調製した（３７℃で３時間）フィラメントを、２つの等しいプールに分割し、ＤＭＳＯ媒体単独（黒□）、または４．７μＭ Ｎ７４４（□）の存在下で１９時間、さらにインキュベートした。各反応物の一定分量を、０、１、３、５、９、１２および１９時間でグルタルアルデヒドを加えて停止させた。≧５０ｎｍの長さのフィラメントを定量性電子顕微鏡検査で分析した。各データポイントはフィールド当たりの合計フィラメント長さ±標準偏差（ｎ＝５観察点）を表す。ＤＭＳＯ媒体単独の存在下で、合計タウフィラメント長さは０．０２２±０．００５ｈ−１の一次速度で時間とともに徐々に減少する。しかしＮ７４４の存在下では、フィールド当たりの合計フィラメント長さは０．１２±０．０１ｈ−１の初期一次速度、ＤＭＳＯ媒体単独について補正した場合０．１０±０．０２ｈ−１の正味速度で減少した。４．７μＭのＮ７４４の存在下で１９時間インキュベーションした後、合計フィラメント長さは、対照だけの媒体中で観察されたものより１３±２％減少した。
【図５Ａ】Ｎ７４４媒介脱凝集の間のフィラメントの長さ分布を示す図である。図３で示した実験から得られる≧５０ｎｍのｈｔａｕ４０フィラメントの相対的長さ分布を計算しプロットした。各データポイントは、連続した長さ間隔（５０ｎｍビン）に分離した５つのフィールドで分析したすべてのフィラメントの割合を表し、他方、各線はデータポイントの指数分布への最良適合の線を表す。０時間（図５Ａ、上の図）では、ＤＭＳＯ媒体対照単独（黒□）および４．７μＭ Ｎ７４４（□）での処理についての長さ分布に差はなかった。
【図５Ｂ】Ｎ７４４媒介脱凝集の間のフィラメントの長さ分布を示す図である。図３で示した実験から得られる≧５０ｎｍのｈｔａｕ４０フィラメントの相対的長さ分布を計算しプロットした。各データポイントは、連続した長さ間隔（５０ｎｍビン）に分離した５つのフィールドで分析したすべてのフィラメントの割合を表し、他方、各線はデータポイントの指数分布への最良適合の線を表す。しかし、フィールド当たりの合計フィラメント長さは時間とともに減少し、その結果１９時間では（図５Ｂ、下の図）、ＤＭＳＯ対照単独（黒○）に対して、Ｎ７４４処理した一定分量（〇）の各ビンは著しく少ないフィラメントしか存在しなかった。フィラメント数が連続的に減少しながら指数分布が維持されていることは、タウフィラメントの末端方向の脱凝集と合致し、ランダムなフィラメント切断とは合致しない。
【図６Ａ】Ｎ７４４がタウ線維化対して選択的であることを示す図である。図６Ａでは、Ａβ１〜４０（アミロイドβペプチド）（２０μＭ）を、ＤＭＳＯ媒体単独（黒○）または４．１μＭ Ｎ７４４（〇）の存在下、集合バッファー中でインキュベートし、続いて４００ｎｍの吸光度で５時間吸収させた。得られたデータはＮａｉｋｉとＧｅｊｙｏの一次速度式モデル（例えば、非特許文献７９参照）を用いてプロットした。ここで、Ａｔは時間ｔでの吸収であり、Ａ∞は平衡において達成された（＞５時間）最大吸収である。各実線はデータポイントの線形回帰分析を表し、点線および破線はＮ７４４の存在下および非存在下でのｔ１／２にそれぞれ対応する。２つの曲線の近似性は、これらの条件下では、Ｎ７４４がＡβ１〜４０線維化の程度または半減期をそれほど調節しなかったことを示している。
【図６Ｂ】Ｎ７４４がタウ線維化対して選択的であることを示す図である。第２のアミロイド形成タンパク質のアミリンを、ＤＭＳＯ媒体（図６Ｂ）の存在下でインキュベートした。２４時間にわたって一定分量を取り出し、透過電子顕微鏡法で画像化した。集合プロセスの開始後３時間でとった画像を示す。Ｎ７４４はこれらの条件下で、アミリン集合を妨害しなかった。これらのデータを合わせると、Ｎ７４４は、亜化学量論濃度でアッセイした場合、タウタンパク質に対して選択的であることが示唆している。
【図６Ｃ】Ｎ７４４がタウ線維化対して選択的であることを示す図である。第２のアミロイド形成タンパク質のアミリンを、４．１μＭ Ｎ７４４（図６Ｃ）の存在下でインキュベートした。２４時間にわたって一定分量を取り出し、透過電子顕微鏡法で画像化した。集合プロセスの開始後３時間でとった画像を示す。Ｎ７４４はこれらの条件下で、アミリン集合を妨害しなかった。これらのデータを合わせると、Ｎ７４４は、亜化学量論濃度でアッセイした場合、タウタンパク質に対して選択的であることが示唆している。図６Ｃ中のバーは５００ｎｍを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させるための方法に関する。本発明は、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させる薬剤組成物を投与することによってｉｎ ｖｉｖｏである種の神経障害を治療するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
微小管結合タンパク質タウは、細胞骨格の維持に寄与すると考えられている可溶性のサイトゾルタンパク質である（例えば、非特許文献１および２参照）。しかし、多くの病態では、タウタンパク質は、未知の細胞の状態によって誘発され自己会合して線維状構造となる（例えば、非特許文献３参照）。これらのタウの線維状の形態は、様々な神経変性障害、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）（例えば、非特許文献４、５および６参照）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）（例えば、非特許文献７参照）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）（例えば、非特許文献８参照）、ピック病（ＰＤ）（例えば、非特許文献９参照）、ダウン症候群（例えば、非特許文献１０参照）、前頭側頭骨痴呆および染色体１７に関連したパーキンソン症（ＦＴＤＰ−１７）（例えば、非特許文献１１参照）において見出すことができる。これらの神経変性障害のための効果的な治療法の特定の必要性が依然として存在している。
【０００３】
神経突起プラーク、神経原線維変化および神経間質糸は、タウタンパク質の線維状神経細胞内封入を含むアルツハイマー病（ＡＤ）の顕著に特徴的な病変である（例えば、非特許文献１２参照）。タウフィラメントは記憶の保持に関わる脳領域内で形成され、かつその発現が痴呆の程度によく相関するので、疾患進行の強固な目印として現れてきた（例えば、非特許文献１３および１４参照）。タウフィラメントは、ピック病および大脳皮質基底核変性を含む他の神経変性タウオパシーにおいても発現し、影響を受ける神経集団は疾患によって決まる（例えば、非特許文献１５参照）。したがって、タウフィラメント形成は、変性ニューロンの特徴である細胞骨格解体の開始の前触れとなるものであり、様々な発作に対するニューロンの基礎的な病理生物学的応答を表すことができる。
【０００４】
特定の神経変性障害とタウ遺伝子における変異との間の直接的な関連を確立することによって、遺伝子研究は、これらの知見を拡大してきた（例えば、非特許文献１６参照）。これらの常染色体優性痴呆、例えばＦＴＤＰ−１７は、複数の部類に分けられる。第１の部類は、タウタンパク質をコードする配列内の点変異からなる。第２の部類は、これらの障害の不溶性タウ沈着物中に見られる交互的にスプライスされたタウアイソフォームの分布に影響を及ぼすイントロン変異からなる。生じた「タウオパシー」のそれぞれで、ＦＴＤＰ−１７変異Ｐ３０１Ｌ遺伝子を有する遺伝子導入マウスと同様に（例えば、非特許文献１７および１８参照）、フィラメント状タウ封入が蓄積する（例えば、非特許文献１６参照）。これらの知見は、正常な神経機能におけるタウタンパク質の重要性を際立たせるものであり、かつ、タウ構造の変化が、フィラメント形成および神経変性に直接つながりうることを示している。
【０００５】
実際、ヤツメウナギの網様体脊髄路ニューロンにおいて、単にヒトタウを過剰発現するだけで、フィラメントの蓄積と、結果としての神経細胞死とを推進するのに十分である（例えば、非特許文献１９参照）。ヤツメウナギ系において、ニューロンは臨界量のタウフィラメントが存在する限り機能し続ける。神経線維プロトマーＮＦ１８０などの他の重合性タンパク質の過剰発現も、フィラメント形成を招くが、しかし神経変性はもたらさない（例えば、非特許文献２０参照）。これらのデータは、タウタンパク質の線維状形態への集合が、罹患ニューロンにおいて、変性を悪化させるか、または潜在的にそれを媒介する、タウの機能の毒性の獲得をもたらすことを示唆している。
【０００６】
精製した組換えタウ調製物は、生理学的濃度（低マイクロモル）と温度（例えば、非特許文献２１参照）では自発的には重合しないので、これらの知見をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認することがなされてきた。しかし、５０から１００μＭの濃度で脂肪酸を加えることによって、直鎖状の形態を有するタウフィラメントを全長タウタンパク質からの数時間で効率的に形成させることができる（例えば、非特許文献２１および２２参照）。これらの薬剤は、ミセルを形成し、タウタンパク質に負に荷電した表面をもたらすことによって作用する。接種実験に基づくと、脂肪酸誘発合成による直鎖状フィラメントは、ＡＤ中に見られる対になった螺旋状フィラメント（ＰＨＦ）と密接に関係があり、単一のヘミフィラメントと対応しているようである（例えば、非特許文献２１参照）。このパラダイムを用いると、タウ線維化の速度とその程度はＣ末端切断および残基Ｓ３９６／４０４でのリン酸化反応模倣の影響を受けることが分かった。Ｐ３０１Ｌなどの既知のＦＴＤＰ−１７部位での点変異は、タウフィラメント形成を著しく促進することも分かった（例えば、非特許文献２３および２４参照）。したがって、フィラメント形成および疾患に付随するタウ改変またはタウ変異の多くは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタウ線維化を加速することを示すといえる。
【０００７】
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【特許文献２】米国特許第６，００１，３３１号明細書
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【非特許文献７０】"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin
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【非特許文献７２】Carmel et al., Biol. Chem. 271: 32789-32795 (1996)
【非特許文献７３】King et al., J. Neurochem 74: 1749-1757 (2000)
【非特許文献７４】Snyder et al., Biophys 67: 1216-1228 (1994)
【非特許文献７５】Evans et al., Proc. Natl.Acad. Sci U.S.A. 92: 763-767 (1995))
【非特許文献７６】Goldsbury et al., J. Struct. Biol. 130: 352-362 (2000)
【非特許文献７７】Masel et al., Biophys. Chem. 88: 47-59 (2000)
【非特許文献７８】Wilson et al., J. Biol. Chem. 270: 24306-24314 (1995)
【非特許文献７９】Naiki et al., Methods Enzymol 309: 305-318 (1999)
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
同時係属中の米国特許（特許文献１参照）に記載の方法を用いて、タウプロトマーに対して亜化学量論濃度（ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）で、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させる比較的低分子量の特異的なリガンド（一般に約４００ダルトン未満）が特定されている。本出願と同一の譲受人が所有するこの同時係属中の出願の全体を参照により本明細書に組み込む。これらのリガンドまたは阻害剤は、タウフィラメントがそこで形成されるアルツハイマー病を含む特定の神経障害または病態をｉｎ ｖｉｖｏで治療的に処置するために使用することができる。
【０００９】
一つの実施形態では、本発明は、
脳内のタウ線維化を阻害する方法を必要とする患者を特定するステップと、
その患者に、薬理学上有効な量のタウ線維化の阻害剤であって、以下の一般式の化合物（式Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は独立に、１個から６個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ４は独立に、１個から６個の炭素原子を有する第２の脂肪族基または１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換の脂肪族基である）
である阻害剤を投与するステップと
を含む患者の脳内のタンパク質タウの集合を調節する方法を提供する。
【００１２】
好ましい一つの実施形態では、阻害剤は次式（式ＩＩ）
【００１３】
【化２】
【００１４】
を有する３−（２−ヒドロキシエチル）−２−｛２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（Ｎ７４４）である。
【００１５】
一つの実施形態では、上記患者はヒトである。一般に阻害剤は、通常の技術を用いて決定することができる有効量で投与する。一般に、阻害剤を１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇの範囲から選択される量で投与する。一つの実施形態では、少なくとも１週間にわたる期間反復して投与を実施する。一つの実施形態では、少なくとも１カ月にわたる期間反復して投与を実施する。一つの実施形態では、少なくとも３カ月にわたる期間反復して投与を実施する。一つの実施形態では、少なくとも１年にわたる期間反復して投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも月１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも週１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも１日１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも週に１回、少なくとも１カ月間投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも１日に１回、少なくとも１カ月間投与を実施する。
【００１６】
アルツハイマー病は、部分的には、微小管会合タンパク質タウから構成されるフィラメントの神経細胞内蓄積によって定義される。動物モデルによる研究によれば、機能の毒性獲得はニューロン中のタウ線維化を伴うので、そのプロセスの選択性薬理学的阻害剤は神経変性を遅延させる可能性があることが示唆されている。本発明は、式Ｉのタウ線維化の小分子阻害剤を提供する。
【００１７】
【化３】
【００１８】
式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は独立に、１個から６個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ４は独立に、１個から６個の炭素原子を有する第２の脂肪族基または１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換の脂肪族基である。好ましい実施形態では、本発明は、タウ線維化の阻害剤、３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（本明細書ではＮ７４４と称する）も提供する。これを式ＩＩに示す。
【００１９】
【化４】
【００２０】
Ｎ７４４は、平面状でありかつ炭化水素リンカーの側面に位置する２つの芳香族環からなる点で、染料のコンゴレッドファミリーに広く関連するベンゼナミン誘導体である。生理的ｐＨで正に荷電していると予測されている。
【００２１】
Ｎ７４４は、３００ｎＭ未満のＩＣ５０を有するタウに対して亜化学量論濃度で、全長４回反復タウタンパク質のアラキドン酸誘発の線維化を阻害する。タウプロトマーに対する化学量論量の濃度で、成熟した合成フィラメントに加えられた場合、Ｎ７４４はタウ脱凝集も促進する。脱凝集は一次速度論に従い、フィラメント数の安定した減少を伴う。これはＮ７４４が、限定的なフィラメントの切断を伴って、タウ分子の末端方向の損失（ｅｎｄｗｉｓｅ ｌｏｓｓ）を促進することを示唆している。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのその活性のため、Ｎ７４４は疾患の細胞モデルでのタウ仮説のテストに有用である。
【００２２】
本明細書で提示したデータは、タウ線維化を、タウプロトマーに対して亜化学量論濃度で、かつ＞１００倍モル過剰の脂肪酸誘導物質の存在下で作用する式Ｉの化合物、具体的にはＮ７４４である小さいリガンド（＜４００Ｄａ）によって阻害することができることを示している。これらのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでタウフィラメント形成に拮抗する、さらにはその形成を逆転させることの実行可能性を裏付けている。
【００２３】
本発明は、このような調節を必要とする哺乳動物脳内のタンパク質タウの集合を調節する方法であって、その哺乳動物に薬学上許容可能な担体中で薬剤有効量のタウ線維化阻害剤を投与することを含む方法を含む。本発明の目的では、「タンパク質タウの集合を調節する」という用語は、これらに限定されないが、タウフィラメント形成または線維化を阻害および／または逆転させること、および／またはタウフィラメント形成または線維化の速度を抑制することを含む。
【００２４】
タウタンパク質は、集合して、コンゴレッドおよびチオフラビンＳなどの組織化学的染料と結合可能な線状のフィラメントとなる。これは、タウタンパク質が、伸長したβシート構造の特徴の「アミロイド」の沈着物と重合することを示唆している（例えば、非特許文献２５および２６参照）。断片タウタンパク質と全長タウタンパク質の両方とｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるリガンドの媒介した集合反応に基づくと、線維化は、微小管反復領域中に位置する短い疎水性配列によって媒介されるようである（例えば、非特許文献２４および２７参照）。しかし、この領域外での配列は、線維化の動力学とフィラメント内でのプロトマーの構造の両方に著しく影響を及ぼす（例えば、非特許文献２４および２８参照）。したがって、他のタンパク質から誘導されたアミロイド原線維とほぼ類似性を維持しているにもかかわらず、全長タウタンパク質のフィラメントは、潜在的にユニークな、重合阻害剤に結合するためのファルマコフォアを提供する。
【００２５】
Ｎ７４４は、精製された組換えｈｔａｕ４０からの脂肪酸媒介によるフィラメントの形成を阻害するようである。小分子がアミロイド原線維形成に拮抗する能力はすでに報告されている（例えば、非特許文献２９および３０参照）。これらの阻害剤は集合の様々な段階で作用して、有効モノマー濃度を低下させるか、フィラメント末端での成長を阻止するか、あるいはフィラメント切断の速度を増大させるとみなされている（例えば、非特許文献３１参照）。Ｎ７４４の場合、タウ集合アッセイにこれを含めると、総タウフィラメント質量（これは合計長さに比例している）の濃度依存的な低下を導く。この効果に関するＩＣ５０は約３００ｎＭであった。単位長さ当たり質量値を７４．６ｋＤａ／ｎｍと仮定すると（例えば、非特許文献３２参照）、４μＭタウの約４０％がフィラメント形態へ転換され（例えば、非特許文献３３参照）、ＤＭＳＯ媒体だけを含む対照反応では１１１ｎｍの数平均フィラメント長さ（図１Ａ）から、フィラメント数濃度の推定として約１０ｎＭが得られる。したがって、Ｎ７４４はタウ線維化を、タウプロトマーに対して亜化学量論濃度で阻害するが、この濃度はフィラメントしたがって核の最終濃度よりずっと高い。
【００２６】
合計フィラメント数と長さの阻害についてのＩＣ５０値が非常に類似していたので、アラキドン酸を介した核形成の阻害は、ＩＣ５０近傍でのＮ７４４活性に大きく寄与するようである。しかし、合計タウプロトマーに対する化学量論的に近接した濃度では、Ｎ７４４のフィラメント長さ分布に対する効果は明白になる。さらに、化学量論濃度のＮ７４４での成熟したフィラメントを処理すると、一次速度式でのフィラメント脱凝集、指数分布に近似したフィラメント長さの維持およびフィラメント数の着実な減少をもたらす。これらの特徴は漸進的な末端方向の脱凝集と一致し、フィラメントの長さ方向に沿った破局的なフィラメント切断とは一致しない（例えば、非特許文献３４参照）。フィラメント長さ分布のＮ７４４を介した減少とあいまって、これらのデータは、化学量論濃度のＮ７４４が原線維タウと非原線維タウとの間の平衡に影響を及ぼし、それによってフィラメント末端からのタウの解離が支配的となることを示唆している。新たな平衡の結果として、４μＭ ｈｔａｕ４０の線維化はもはや支持されなかった。
【００２７】
組換えモノマーからのタウ線維化の経路は完全には明らかでないが、一般的スキーム（スキームＩ）に従うことによる他のアミロイドの経路と一致するようである。
【００２８】
【化５】
【００２９】
ここで、Ｕは折り畳まれていない状態を表し、Ｉは二量体などの二次構造またはオリゴマー構造を含むことができる中間形態を表し（例えば、非特許文献３５参照）、Ｎはその形成が律速的である核を表し、Ｆは複数であってよく、かつプロトフィラメントを含むフィラメント形態を表す（例えば、非特許文献３６参照）。成熟したフィラメントは、最終的に、恐らくそのＵ形態および１形態にある非原線維タンパク質との平衡に達する。これは集合体の臨界濃度に反映されている。アラキドン酸は、折り畳まれていないタウと相互作用してアニオン性のミセルを形成することによってこの経路を加速する（例えば、非特許文献３３参照）。得られる複合体は非常に速やかに核形成し、誘導物質の非存在下では通常ほとんどフィラメントをもたらさないか、もたらしてもわずかな低いミクロモルのタウ濃度で大量のフィラメントを生成する。（例えば、非特許文献２１および３３参照）。他のアミロイド形成タンパク質であるα−シヌクレインを用いた実験では（例えば、非特許文献３７参照）、アニオン性のミセルは、部分的に折り畳まれた中間形態に好都合なように平衡をシフトさせ、集合の時間の遅れを短縮させ、集合の見掛けの一次速度を増大させ、かつ、ミセルの非存在下で行われる反応に比較して平衡での臨界濃度を低下させることによって、線維化を誘発するようである。タウのミセルを介した線維化がこれらの特徴を保持すると仮定すると、Ｎ７４４はアラキドン酸の作用に拮抗するようである。Ｎ７４４はタウフィラメント核形成を阻害する、そして集合体の臨界濃度を上昇させるようである。この挙動は多分アラキドン酸ミセル化の直接阻害から誘導されるものではない。その理由は、Ｎ７４４は正に荷電し、アニオン性のミセルと多分相互作用することができるが、タウ線維化の阻害についてのそのＩＣ５０は＜０．０１％のアラキドン酸のモル濃度だからである。実際、拡散したカチオンであるそうしたＮ７４４は一般に、アニオン性界面活性剤の臨界ミセル濃度を低下させる（例えば、非特許文献３８参照）。
【００３０】
Ｎ７４４とコンゴレッドとの間の構造的な類似性による、より可能性のある機構が提案されている。Ｎ７４４と同様に、コンゴレッドは平面状の芳香族染料であり、その結合化学量論と光学特性（複屈折）に基づくと、すべてアミロイド原線維の長さに沿って結合すると考えられる（例えば、非特許文献３９参照）。しかし、コンゴレッドは球状タンパク質、および部分的に折り畳まれた中間体の二次的構造要素にも結合する（例えば、非特許文献４０参照）。トランスサイレチンに作用するフルフェナム酸、またはチューブリンに作用するコルヒチンなどの球状モノマーに結合できる化合物は、本明細書でタウタンパク質について述べたものと類似した凝集の亜化学量論での阻害をもたらすことができる（例えば、非特許文献４１および４２参照）。後者の例では、凝集の亜化学量論での阻害および脱集合の促進はフィラメント極性に依存する。ここで、集合および薬物作用は、主に一方の末端で起こり、脱集合はその反対側の末端で進行する（例えば、非特許文献４３参照）。接種実験はタウフィラメントが成長極性を有することと一致するので（例えば、非特許文献２１参照）、今のところこの機構を排除することはできない。しかし、組換えタウモノマーは大部分ランダムコイルであるので（例えば、非特許文献４４参照）、Ｎ７４４がこの形でタウと相互作用することはなさそうである。むしろ、コンゴレッドについて示唆されているように（例えば、非特許文献４０参照）、Ｎ７４４は、集合能力のある中間体と結合して集合能力のない凝集体を形成する可能性がある。得られる平衡のシフトは中間体の有効濃度を低下させ、より遅いフィラメント核形成をもたらすと予想される。フィラメント核形成速度とタンパク質濃度との関係については次の式が提案されている。
ｄＣ／ｄｔ＝ｋｎ（Ｐｉ）ｎ
ここで、Ｃはフィラメントの数濃度であり、ｋｎは核形成速度定数であり、Ｐｉは集合能力のある中間体の濃度であり、ｎは核の中の分子の数である（例えば、非特許文献４５参照）。したがって、小さいＮ７４４を介した集合能力のある中間体の濃度の変化は、核形成速度に対して大きな非線形的な影響があることが予測される。Ｎ７４４濃度に対するタウフィラメント核形成の協同的阻害（１．６から１．８のヒル係数が観察される）はこの関係からきている可能性がある。線維化能力のない中間体への平衡における阻害剤媒介シフトも、線維化速度を低下させ、平衡での非原線維プロトマーの量を増大させることが予想される（例えば、非特許文献４６参照）。Ｎ７４４によって誘発される末端方向の脱凝集と、新たな平衡へのアプローチの一次速度はこのモデルと一致する。
【００３１】
神経原線維損傷の空間的および時間的分布と、神経細胞損失および痴呆の重症度との間の密接な関係はＡＤの進行におけるタウ線維化の中心的役割を示唆している（例えば、非特許文献４７、４８および４９参照）。この仮説は、Ａβ沈着物の非存在下での神経原線維損傷の進行を特徴とし、かつタウ遺伝子における変異と遺伝子的に関連している、家族性神経原線維痴呆の発見によって著しく強固なものになってきている（例えば、非特許文献５０および５１参照）。タウ線維化が、機能の毒性獲得（ｔｏｘｉｃ ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（すなわち、フィラメント自体によって引き起こされた代謝破壊または毒性）または機能の損失（すなわち、フィラメント中へのタウの隔離による正常なタウ機能への干渉）を表すのかはまだ確認されていない。家族性神経原線維痴呆に関連するタウ突然変異体の機能的特徴についての研究は不確かなものである。これらの突然変異体のいくつかは細胞培養で微小管結合の減少を示すが（例えば、非特許文献５２および５３参照）、これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフィラメントを形成する傾向の増大も示す（例えば、非特許文献５４および２３参照）。大部分の家族性神経原線維痴呆の遺伝の常染色体優性モード（例えば、非特許文献５５参照）は、作用の「機能の獲得」モードを示唆しており（それを必要とはしないが）、複数のタウをベースとした機構がＡＤおよび家族性神経原線維痴呆に見られる神経変性に寄与することができる。この問題へのＮ７４４を用いた薬理学的アプローチによってタウ線維化の神経変性への寄与を明らかにすることができる。作用のその亜化学量論モードは、タウ線維化の阻害が、神経突起損傷に付随して見られる高いタウ濃度でも実施可能であることを示唆している（例えば、非特許文献５６参照）。
【００３２】
形態学およびプロトマー化学量論に基づけば、アラキドン酸処理で誘発される合成タウフィラメントは疾患の早期に見られる直線状のフィラメントに類似しており（例えば、非特許文献５７参照）、標準的な対になった螺旋状フィラメント（ＰＨＦ）からなる１つのヘミフィラメントに相当している（例えば、非特許文献２１および３２参照）。これらの形態学の中での、プロトマー構造の明らかな共通性は、Ｎ７４４が、タウオパシー的神経原線維変性の種々の細胞および動物モデルにおいてタウ線維化を調節するのに有用であることを示唆している。
【００３３】
染料３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（Ｎ７４４）（式ＩＩ）ならびに類似の化合物は、精製された組換えｈｔａｕ４０からの直線状フィラメントの脂肪酸媒介形成を阻害することを見出した。
【００３４】
本発明での使用に適した阻害剤は一般式（式Ｉ）の化合物である。
【００３５】
【化６】
【００３６】
式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は独立に、１個から６個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ４は独立に、１個から６個の炭素原子を有する第２の脂肪族基または１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換の脂肪族基である。
【００３７】
好ましい一実施形態では、阻害剤は次式（式ＩＩ）
【００３８】
【化７】
【００３９】
を有する３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル）−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（Ｎ７４４）である。
【００４０】
上記の式Ｉでは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５は独立に１個から６個の炭素原子を有するアルキル基である。そうしたアルキルまたは脂肪族基の例はメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルであり、直鎖基と分枝基の両方を含む。アルキル基はメチルまたはエチルであることが好ましく、メチルであることがより好ましい。
【００４１】
上記の式Ｉでは、Ｒ２およびＲ４は独立に１個から６個の炭素原子を有するアルキルまたは脂肪族基、あるいは１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換アルキルまたは脂肪族基である。このようなアルキルまたは脂肪族基の例はメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシル基であり、直鎖基と分枝基の両方を含む。アルキル基はメチルまたはエチルであることが好ましく、メチルであることがより好ましい。このようなヒドロキシル置換アルキルまたは脂肪族基の例はヒドロキシル置換メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシルであり、直鎖基と分枝基の両方を含む。ヒドロキシル置換アルキル基は−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＨ基であり、式中、ｎは０から５の整数、より好ましくはｎは１であることが好ましい。
【００４２】
式Ｉの阻害剤は、同時係属中の米国特許（特許文献１参照）に記載のものと本質的に同じ方法を用いて同定した。これらの阻害剤は、タウフィラメントの形成または線維化を阻害および／または逆転させる特異的な比較的低分子量のリガンドである。本出願と同一譲人であるこの同時係属中の出願の全体を参照により本明細書に組み込む。これらのリガンドまたは阻害剤は、タウフィラメントがそこで形成されるアルツハイマー病を含む特定の神経障害または病態を治療的に処理するために使用することができる。
【００４３】
特に好ましい一つの実施形態では、哺乳動物はヒトである。一般に阻害剤は、従来の技術を用いて投与できる有効量で投与する。一般に、阻害剤は１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇの範囲から選択される量で投与する。
【００４４】
一つの実施形態では、少なくとも１週間にわたる期間、本発明の阻害剤を反復して投与する。一つの実施形態では、少なくとも１カ月にわたる期間反復して投与を実施する。一実施形態では、少なくとも３カ月にわたる期間反復して投与を実施する。一つの実施形態では、少なくとも１年にわたる期間反復して投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも月１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも週１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも１日１回投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも週に１回、少なくとも１カ月間投与を実施する。他の実施形態では、少なくとも１日に１回、少なくとも１カ月間投与を実施する。
【００４５】
本発明のこの態様は、タウ線維化に関連する様々な疾患および障害の治療および／または予防を提供する。本発明は、有効量の本発明の治療薬を対象に投与することによって治療（および予防）する方法を提供する。好ましい態様では、その治療薬は実質的に精製されたものである。患者または対象は好ましくは、これらに限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ等を含む動物であり、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００４６】
様々な送達系が知られており、これらを本発明の治療薬を投与するために用いることができる。そうした送達系には、例えば、リポソーム中への封入、微小粒子、マイクロカプセル、治療薬を発現できる組換え細胞（例えば、非特許文献５８参照）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築等が含まれる。導入方法には、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外および経口経路が含まれる。治療薬は、輸液またはボーラス注入、上皮または粘膜皮膚壁（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通した吸収を含む任意の好都合な経路で投与することができ、他の生物学的活性薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身であっても局所であってもよい。さらに、本発明の薬剤組成物を、脳室内およびくも膜下腔内注入を含む任意の適切な経路で、中枢神経系に導入することが望ましい。脳室内注入は、例えばリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって使い易くすることができる。エアロゾル化剤を含む調合物を用いた経肺投与も使用することができる（例えば吸入器または噴霧器）。
【００４７】
具体的な実施形態では、本発明の薬剤組成物は、脳などの治療を要する領域へ局所的に投与することが望ましい。これは、限定されるものではないが、例えば、外科手術時での局部注入、局所使用（例えば創傷包帯）、注射、カテーテル、座剤または埋め込み（例えば、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）の膜または線維などの膜を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン状材料から形成された埋め込み材）等によって実現することができる。一つの実施形態では、脳などの酸化によって損傷を受ける組織の部位（または元の部位）に直接注入して投与を行うことができる。他の実施形態では、薬を小胞、特にリポソームで送達することができる（例えば、非特許文献５９および６０参照）。
【００４８】
さらに他の実施形態では、治療薬を放出制御系で送達することができる。一つの実施形態では、ポンプを使用することができる（例えば、非特許文献６１、６２および６３参照）。他の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（例えば、非特許文献６４、６５、６６および６７参照）。総説として考察されている他の放出制御系も使用することができる（例えば、非特許文献６８参照）。
【００４９】
一般に、本発明の阻害剤は典型的には薬学上許容可能な担体を用いて投与する。「薬学上許容可能な」という用語は、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認されているか、あるいは米国薬局方（例えば、非特許文献６９参照）に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、補助剤、賦形剤または治療薬をそれと一緒に投与する媒体を指す。このような薬剤用担体は、水、あるいは油、動物、植物または合成由来のものを含む、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の油類などの滅菌液体であってよい。水は、薬剤組成物を静脈内に投与する場合に適した担体である。食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は液状担体として、特に注入可能な溶液用に使用することもできる。適切な薬剤用賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。所望により、治療薬は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨバッファー剤も含むことができる。これらの治療薬は液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出徐放製剤等の形態をとることができる。治療薬は、トリグリセリドなどの従来の結合剤または担体を用いて座剤として製剤することができる。経口製剤には、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的担体を含むことができる。適切な薬剤担体の例は、文献（例えば、非特許文献７０参照）に記載されている。このような治療薬は、患者への適切な投与を提供するために妥当な量の担体と一緒に、治療有効量の活性成分を、好ましくは精製した形で含む。製剤は投与の様式に適合したものでなければならない。
【００５０】
好ましい実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬剤組成物として通常の手順で製剤される。一般に、静脈内投与のための組成物は殺菌した等張性水性バッファーの溶液である。必要であれば、組成物は、可溶化剤および注入部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局部麻酔薬も含むことができる。一般に、構成成分は、別々に提供するか、あるいは単位剤形中に一緒に混ぜて、例えば活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェイなどの密封容器中の凍結乾燥粉末または水分を含まない濃縮物として提供する。組成物を輸液で投与する場合、滅菌した薬剤グレードの水または生理食塩水を含む輸液用瓶で組成物を分注することができる。組成物を注入で投与する場合、投与する前に構成成分を混合できるように、滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【００５１】
本発明の治療薬の有効な量は、タウ関連障害または状態の性質、および障害または状態の段階に依存する。有効な量は標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、以下に述べるようなものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイを任意選択で用いて、最適の投与量範囲を特定する助けとすることができる。製剤で用いるための正確な用量は投与の経路に依存することになり、保健医療医の判断および各患者の状況によって決定されなければならない。しかし、適切な投与量範囲は約１０ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日である。効果的な用量はｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から推定することができる。本発明は、本発明の治療薬の１つまたは複数の構成成分を充填された１つまたは複数の容器を含む薬剤のパックまたはキットも提供する。
【００５２】
一つの実施形態では、患者の脳内タンパク質タウの集合を調節するための方法は、脳内のタウ線維化を阻害する方法を必要とする患者を特定するステップと、薬理学上有効な量の本明細書で定義の式ＩまたはＩＩのタウ線維化の阻害剤を患者に投与するステップとを含む。
【００５３】
一つの実施形態では、上記特定は、患者でのタウの突然変異体ゲノムサブタイプを特定することに基づく。一般に、これらの突然変異体サブタイプはタウタンパク質線維化の増大を伴う。文献（例えば、非特許文献３参照）の総説を参照されたい。他の実施形態では、その特定はアルツハイマー病の診断以外のものである。この実施形態では、その特定は、これらに限定されないが、ピック病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性および家族型前頭側頭骨痴呆、ならびに染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症などのタウ線維化を伴う他の障害の診断である。
【００５４】
以下の実施例は本発明の方法および組成物を説明し例示する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであって、範囲においても趣旨においてもそれを限定するものではない。別段の指定のない限り、すべての割合は重量ベースである。当分野の技術者は、実施例で記載の材料、条件および方法の変更形態を用いることができることを容易に理解されよう。
【実施例】
【００５５】
一般的実験手順
材料。組換えポリヒスチジン−タグを付けたｈｔａｕ４０を上記したようにして発現させ精製した（例えば、非特許文献７１および７２参照）。ヒトＡβ１〜４０（Ｂａｃｈｅｍ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）をＤＭＳＯ（５００μＭ）中に溶解させ、超音波処理し（室温で３０分間）、使用前にろ過した（０．２μＭカットオフ）。ヒトアミリン（Ｂａｃｈｅｍ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）のストック溶液を水（２５０μＭ）中で調製した。アラキドン酸（Ｆｌｕｋａ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を１００％エタノール中に溶解し、使用するまでアルゴンガス中に−８０℃で保存した。タウ線維化阻害剤、３−（２−ヒドロキシエチル）−２−［２−［［３−（２−ヒドロキシエチル）−５−メトキシ−２−ベンゾチアゾリリデン］メチル］−１−ブテニル］−５−メトキシベンゾチアゾリウム（Ｎｅｕｒｏｎａｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；Ｅｖａｎｓｔｏｎ，ＩＬ）をＤＭＳＯ（１０ｍＭストック）中に溶解し、−２０℃で保存した。
【００５６】
タウ凝集。精製した組換えｈｔａｕ４０を、上記したようにして（例えば、非特許文献２１、２２および７３参照）重合させた。標準的条件下で、４μＭ（最終濃度）ｈｔａｕ４０を室温かまたは３７℃で、集合バッファー（１０ｍＭ ４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジンエタンスルホン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＤＴＴ）中でアラキドン酸とインキュベートした。アラキドン酸（７５〜１００μＭ）を加えて線維化を誘発させ、これを３時間から６時間継続し、以下に説明するようにして電子顕微鏡で分析した。存在する場合、凝集アッセイにおけるＮ７４４最終濃度は０．１２〜４．１μＭで変化させた（最大４．７μＭのＮ７４４の最終濃度を脱凝集アッセイで使用した（以下参照））。対照反応を、すべての反応において５％（体積／体積）以下に限定したＤＭＳＯ媒体について標準化した。
【００５７】
タウ脱凝集。精製したｈｔａｕ４０（４μＭ）の溶液を上記の標準的な条件下で３．５時間重合させ、次いで２つの別々の管に分割した。一方の管には４．７μＭの最終濃度でＮ７４４を受け、他方の管にはＤＭＳＯ媒体だけを受けた。０、１、３、５、９、１２および１９時間インキュベーションした後、それぞれのサンプルから一定分量を取り出し、以下で説明する電子顕微鏡アッセイにかけた。対照（Ｎ７４４が存在しない）反応を、すべての反応において５．７％（体積／体積）未満に保持したＤＭＳＯ媒体について標準化した。。
【００５８】
透過電子顕微鏡法。一定分量（５０μｌ）の凝集および脱凝集反応物を取り出し、グルタルアルデヒド（２％）で固定し、３００メッシュのフォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）／カーボンコーティングした銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｆｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）上で吸着させた（１分間）。得られたグリッドを水で洗浄し、２％酢酸ウラニル（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し（１分間）、再度水で洗浄し、ブロッティングして乾燥し、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＣＭ１２顕微鏡で、６５ｋＶで動作させて観察した。各実験条件からの３つから５つのランダムな画像を２２，０００×の倍率でフイルムに記録し、デジタル化し、較正し、上記したようにして（例えば、非特許文献７３参照）フィラメント長さおよび数を定量化するためにＯｐｔｉｍａｓ６．５１に取り込んだ。個々のフィラメントを、その長軸が５０ｎｍを超えるすべての物体と規定する。フィラメントを手作業でカウントした。フィラメントの数を、合計フィラメント長さと合計フィラメント数の両方について、平均±標準偏差として記録する。長さ分布を２５ｎｍ（集合）または５０ｎｍ（脱集合）のワイドビンで定量化した。
【００５９】
Ａβ１〜４０凝集。Ａβストック溶液を、凝集バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノコエタンスルホン酸、ｐＨ６．２；最終体積３００μｌ）中で２０μＭの最終濃度に希釈して凝集を開始させた。Ａβ凝集によってもたらされた濁度を、Ｎ７４４の存在下（４．１μＭ最終濃度）および非存在下で、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６４０Ｂ分光光度計における４００ｎｍでの時間の関数として、ＤＭＳＯ媒体ブランクと対比してモニターした（例えば、非特許文献７４および７５参照）。各読取りの前にキュベットを渦巻混合させた。合計ＤＭＳＯ媒体濃度をサンプル間で制御した。６％（体積／体積）は超えなかった。
【００６０】
アミリン凝集。４．１μＭ Ｎ７４４の存在下または非存在下で、ペプチドを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．３中に５０μＭの最終濃度まで希釈して凝集を開始させた（例えば、非特許文献７６参照）。０、１、３、５、７および２４時間後に一定分量を取り出し、上記のようにしてＥＭ用に調製した。合計ＤＭＳＯ媒体濃度は５％（体積／体積）を超えなかった。
【００６１】
分析方法。吸収によってタウタンパク質濃度を２８０ｎｍで測定した（例えば、非特許文献７２参照）。別段の言及のない限り、線形回帰分析からの誤差はすべて９５％信頼限界である。
【００６２】
（実施例１）
タウ線維化の阻害。タウ線維化の化学的拮抗物質を特定するため、小分子のライブラリを、蛍光アッセイを用いて、生理学的条件に近似した条件下でアラキドン酸（５０μＭ）によって誘発されるｈｔａｕ４０（２μＭ）集合に対する阻害活性についてスクリーニングした（例えば、非特許文献２２参照）。Ｎ７４４の構造、Ｎ７４４はスクリーニングによって特定された阻害剤であるが、その構造を式Ｉに示す。それは荷電した分子（生理的ｐＨで）であり、平面状の芳香族染料であるコンゴレッドファミリーの化合物に幅広く関連している。
【００６３】
標準的条件下でアラキドン酸（７５μＭ）によって誘発されるｈｔａｕ４０（４μＭ）の線維化に拮抗するためのＮ７４４の能力を透過電子顕微鏡法で試験した（例えば、非特許文献２１参照）。一般に、ｈｔａｕ４０プロトマーの約５０％がこれらの条件下でフィラメント中に取り込まれる。ＤＭＳＯ媒体単独の存在下では、ｈｔａｕ４０は重合して直線状の形態を有する非常に多くのフィラメントを形成した（図１Ａ）。しかし、Ｎ７４４の存在下では（４．１μＭ；タウプロトマーに対して約１：１モル化学量論量）、すべてのフィラメントの合計数かまたは合計長さに反映されているように、線維化は著しく阻害されていた（図１Ｂ）。０．１２４μＭから４．１μＭの間でＮ７４４濃度を変化させることにより、阻害された合計フィラメント長さにより測定されるフィラメント形成で、２９４±２３ｎＭのＩＣ５０と１．８４±０．１４の傾き（Ｈｉｌｌ ｓｌｏｐｅ）として阻害活性が類別されることが分かった（図２）。これらのデータによって、Ｎ７４４がタウ線維化の有力な阻害剤であり、タウプロトマーおよびアラキドン酸誘導物質に対して亜化学量論濃度で活性であることが確認された。
【００６４】
（実施例２）
阻害機構。タウ線維化は核形成相および伸長相によって特徴づけされる。これらの２つの相に対するＮ７４４の影響を識別するために、フィラメント長さ分布を阻害剤濃度の関数として測定し、ＤＭＳＯ媒体だけを含む対照反応と比較した。対照反応で形成された多数のフィラメントは指数長さ分布をとった（図３）。この分布は低Ｎ７４４濃度（すなわち、ＩＣ５０近傍；図３）で維持されたが、形成されたフィラメントの数は対照反応に対して減少した（図２）。Ｎ７４４濃度が増大してｈｔａｕ４０プロトマー対するモル化学量論量に近似しても、フィラメント数のさらなる減少が観察された（図２）。これらのデータは、Ｎ７４４の主要な作用が、タウフィラメント核形成を阻害することであることを示唆している。確かに、タウフィラメント数の阻害についての用量反応曲線は、合計フィラメント長さの阻害についての用量反応曲線とほぼ同じである（図２）。それにも関わらず、化学量論濃度でのＮ７４４は、フィラメント長さ分布もＤＭＳＯ媒体対照に対してより短い長さの方へシフトさせた（図３）。したがって、Ｎ７４４は亜化学量論濃度でタウフィラメント核形成を阻害できると思われるが、その濃度がタウプロトマー対するモル化学量論量に近似するにしたがって、核形成と伸長の両方を阻害することができる。
【００６５】
（実施例３）
Ｎ７４４はタウフィラメント脱凝集を促進する。Ｎ７４４が化学量論濃度近傍で、タウフィラメントの伸長を阻害する能力を有することは、成熟したフィラメントを不安定化させることも可能であることを示唆している。この仮説を検証するため、ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、３．５時間かけてアラキドン酸（７５μＭ）と重合させ、続いて、等量の一定分量をＮ７４４（４．７μＭ）またはＤＭＳＯ媒体単独で処理し、フィラメント数と長さを電子顕微鏡で１９時間かけて「追跡」して測定した。Ｎ７４４の非存在下では、合計ｈｔａｕ４０フィラメント長さはこの期間で２３±４％減少した（図４）。実験パラダイムにおいて、サンプル希釈は６％だけであったので、ＤＭＳＯ単独では、これらの濃度でタウフィラメントを不安定化させると思われる。これに対して、Ｎ７４４（４．７μＭ）を加えると、合計フィラメント長さのより迅速な減少がもたらされ、その結果１９時間のうちに合計フィラメント長さの８７±１３％が失われた。これらの条件下で、フィラメント損失の初期速度は一次崩壊としてよくモデル化された（ｒ２＝０．９８１；ｋ＝０．１２±０．０１ｈ−１）（図４）。これらのデータは、Ｎ７４４が、成熟フィラメントを不安定化させ、０．１０±０．０２ｈ−１の正味速度（すなわち、希釈およびＤＭＳＯ効果を補正した速度）での一次速度式で合計フィラメント長さを減少させることができることを示唆している。
【００６６】
（実施例４）
脱凝集の機構。フィラメントの脱凝集は、Ｎ７４４の促進するランダムフィラメント切断によって、または末端方向の解重合を促進することによってもたらされる（例えば、非特許文献７７参照）。平衡における線状タンパク質集合体の末端方向解重合の動力学的特徴は、ポリマーの長さ分布によって決まる（例えば、非特許文献３４参照）。長さが指数分布をとるタウフィラメントについては（例えば、非特許文献７１および７８参照）、解離速度は一次であると予測されている（例えば、非特許文献３４参照）。さらに、フィラメントの脱集合は、徐々に短縮されるフィラメント長さの指数分布を維持しながら進行すると予測されている（例えば、非特許文献３４参照）。
【００６７】
一次のリガンド誘発フィラメント解重合の観察から、ランダムなフィラメント切断の促進によるよりは、Ｎ７４４がフィラメント末端からのタウプロトマーの逐次的な放出を促進したことが示唆される。この仮説を確認するために、タウポリマーの長さ分布を、予め集合させたタウフィラメントをＮ７４４（４．７μＭ）またはＤＭＳＯ媒体単独で処理した後、時間の関数として（１９時間）試験した。時間０では、Ｎ７４４処理したものと対照反応の両方が同じタウフィラメント長さの指数分布を示した。末端方向の解重合モデルに一致して、フィラメントが、対照反応に対してより短い長さにシフトしたので（時間０および１９時間のみについて示されている；図５）、指数フィラメント長さ分布はＮ７４４媒介解重合反応を通して維持された。さらに、Ｎ７４４媒介解重合は、５０ｎｍ超の長さのフィラメントの数の緩慢な減少を伴った（時間０および１９時間のみについて示されている；図５）。これはランダムな切断媒介解重合モデルに一致しなかった。これらのデータを合わせると、成熟した合成タウフィラメントを化学量論濃度のＮ７４４で処理すると、末端方向のフィラメント解凝集が促進されることを示唆している。
【００６８】
（実施例５）
タウ線維化拮抗の選択性。他の染料が、Ａβおよびインスリンから形成されたものを含む様々なアミロイド凝集物と低いミクロモル濃度で結合することが分かっている（例えば、特許文献２参照）。線維化阻害活性がアミロイド結合を伴ったかどうかを検証するために、Ｎ７４４のＡβ１〜４０の集合を阻害する能力を試験した。リガンドの非存在下では、Ａβ１〜４０（２０μＭ）は約８０分間の遅れの後で自発的に重合した。上述した一次動力学モデル（例えば、非特許文献７９参照）を用いて反応データをプロットして光学密度対時間の線形半対数プロットが得られ、１３６±３分間の集合半減期を示した（図６）。Ａβ１〜４０プロトマー（４．１μＭ）に関して亜化学量論量の濃度のＮ７４４の存在は、Ａβ１〜４０集合動力学を穏やかに変えただけであった（ｔ１／２＝１５３±３分間；図６）。これは、Ｎ７４４がこうした条件下ではＡβ１〜４０の集合に対してほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【００６９】
他のアミロイド形成タンパク質であるアミリン（例えば、非特許文献７６参照）に対するＮ７４４の活性も試験した。定性的電子顕微鏡分析によれば、４．１μＭのＮ７４４が存在しても５０μＭアミリンの線維化は２４時間にわたって調節されなかった（図６）。これらのデータは、異なるタンパク質プロトマーから形成されたポリマー構造（すなわち、伸長したβシート）の類似性にも関わらず、亜化学量論濃度で目標選択的阻害活性を有するＮ７４４などの小リガンドを選択することが可能なことを明確にしている。
【００７０】
本出願を通して、様々な特許、刊行物、書籍ならびに核酸およびアミノ酸配列を引用した。これらの特許、刊行物、書籍および配列それぞれの全体を参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】Ｎ７４４がタウ線維化を阻害することを示す図である。Ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、撹拌なしで３７℃、３．５時間アラキドン酸（７５μＭ）とともにインキュベートした。次いで一定分量を酢酸ウラニルで染色し、実施例で述べるようにして透過型電子顕微鏡で観察した。図１Ａは、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）媒体対照の存在下、ｈｔａｕ４０は１１１±６（標準偏差）ｎｍの数平均長さを有する多くのフィラメントを形成したことを示す。
【図１Ｂ】Ｎ７４４がタウ線維化を阻害することを示す図である。Ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、撹拌なしで３７℃、３．５時間アラキドン酸（７５μＭ）とともにインキュベートした。次いで一定分量を酢酸ウラニルで染色し、実施例で述べるようにして透過型電子顕微鏡で観察した。図１Ｂは、４．１μＭ Ｎ７４４の存在下、タウ線維化は著しく阻害されたことを示す。
【図２】Ｎ７４４が亜化学量論濃度でタウ線維化を阻害することを示す図である。Ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、様々な濃度（０、０．１２、０．４１、１．２および４．１μＭ）のＮ７４４の存在下で、アラキドン酸（７５μＭ）とともにインキュベートした（３７℃で３．５時間）。次いで、一定分量を透過電子顕微鏡法で２２，０００倍の倍率で検査した。長さが≧５０ｎｍのすべてのフィラメントを２つの負の値から測定し、合計して合計フィラメント長さ（黒□記号）および合計フィラメント数（□記号）対Ｎ７４４濃度をヒルプロット形式でプロットした。ここで、Ｙは対照フィラメント長さまたはフィラメント数の割合である。各線はデータポイントの線形回帰分析を表す。合計フィラメント長さと合計フィラメント数の両方Ｎ７４４の存在下で減少する。ＩＣ５０値はそれぞれ２９４±２３および２７２±１７ｎＭである。ヒルプロットの両方は正の傾きを有しており、それぞれ１．８４±０．１４および１．６１±０．１０の値である。
【図３】Ｎ７４４がタウフィラメント核形成と伸長の両方を阻害することを示す図である。Ｈｔａｕ４０（４μＭ）を、ＤＭＳＯ媒体単独（黒□）、または０．１２（□）、０．４１（黒○）、１．２（〇）および４．１（黒△）μＭのＮ７４４の存在下でインキュベートし（３７℃で３時間）、次いで、透過電子顕微鏡法で２２，０００倍の倍率で調べた。次いで≧５０ｎｍの長さのフィラメントの長さと数をデジタル画像から判定し、合計してプロットした。各データポイントは、連続した長さ間隔（２５ｎｍビン）に分離した３つから５つの負の値で分析したすべてのフィラメントの割合（３７２２、２９７２、１２４８、３７９、および９２でそれぞれ個別に測定したフィラメントからそれぞれを誘導）を表し、他方、各線は、データポイントの指数分布への最良適合の線を表す。低い濃度のＮ７４４（≦４１０ｎＭ）では、長さ分布はＤＭＳＯ媒体対照とそれほど違いはなかった。これは、こうした条件下では、Ｎ７４４はフィラメント伸長を調節しなかったことを示唆している。対照的に、さらにＮ７４４濃度を上げると（≧１．２μＭ）、長さ分布の著しい短縮がもたらされる。これは、こうしたより高い濃度でフィラメント伸長が阻害されたことを示唆している。
【図４】Ｎ７４４媒介脱凝集の時間発展を示す図である。ｈｔａｕ４０（４μＭ）とアラキドン酸（７５μＭ）から調製した（３７℃で３時間）フィラメントを、２つの等しいプールに分割し、ＤＭＳＯ媒体単独（黒□）、または４．７μＭ Ｎ７４４（□）の存在下で１９時間、さらにインキュベートした。各反応物の一定分量を、０、１、３、５、９、１２および１９時間でグルタルアルデヒドを加えて停止させた。≧５０ｎｍの長さのフィラメントを定量性電子顕微鏡検査で分析した。各データポイントはフィールド当たりの合計フィラメント長さ±標準偏差（ｎ＝５観察点）を表す。ＤＭＳＯ媒体単独の存在下で、合計タウフィラメント長さは０．０２２±０．００５ｈ−１の一次速度で時間とともに徐々に減少する。しかしＮ７４４の存在下では、フィールド当たりの合計フィラメント長さは０．１２±０．０１ｈ−１の初期一次速度、ＤＭＳＯ媒体単独について補正した場合０．１０±０．０２ｈ−１の正味速度で減少した。４．７μＭのＮ７４４の存在下で１９時間インキュベーションした後、合計フィラメント長さは、対照だけの媒体中で観察されたものより１３±２％減少した。
【図５Ａ】Ｎ７４４媒介脱凝集の間のフィラメントの長さ分布を示す図である。図３で示した実験から得られる≧５０ｎｍのｈｔａｕ４０フィラメントの相対的長さ分布を計算しプロットした。各データポイントは、連続した長さ間隔（５０ｎｍビン）に分離した５つのフィールドで分析したすべてのフィラメントの割合を表し、他方、各線はデータポイントの指数分布への最良適合の線を表す。０時間（図５Ａ、上の図）では、ＤＭＳＯ媒体対照単独（黒□）および４．７μＭ Ｎ７４４（□）での処理についての長さ分布に差はなかった。
【図５Ｂ】Ｎ７４４媒介脱凝集の間のフィラメントの長さ分布を示す図である。図３で示した実験から得られる≧５０ｎｍのｈｔａｕ４０フィラメントの相対的長さ分布を計算しプロットした。各データポイントは、連続した長さ間隔（５０ｎｍビン）に分離した５つのフィールドで分析したすべてのフィラメントの割合を表し、他方、各線はデータポイントの指数分布への最良適合の線を表す。しかし、フィールド当たりの合計フィラメント長さは時間とともに減少し、その結果１９時間では（図５Ｂ、下の図）、ＤＭＳＯ対照単独（黒○）に対して、Ｎ７４４処理した一定分量（〇）の各ビンは著しく少ないフィラメントしか存在しなかった。フィラメント数が連続的に減少しながら指数分布が維持されていることは、タウフィラメントの末端方向の脱凝集と合致し、ランダムなフィラメント切断とは合致しない。
【図６Ａ】Ｎ７４４がタウ線維化対して選択的であることを示す図である。図６Ａでは、Ａβ１〜４０（アミロイドβペプチド）（２０μＭ）を、ＤＭＳＯ媒体単独（黒○）または４．１μＭ Ｎ７４４（〇）の存在下、集合バッファー中でインキュベートし、続いて４００ｎｍの吸光度で５時間吸収させた。得られたデータはＮａｉｋｉとＧｅｊｙｏの一次速度式モデル（例えば、非特許文献７９参照）を用いてプロットした。ここで、Ａｔは時間ｔでの吸収であり、Ａ∞は平衡において達成された（＞５時間）最大吸収である。各実線はデータポイントの線形回帰分析を表し、点線および破線はＮ７４４の存在下および非存在下でのｔ１／２にそれぞれ対応する。２つの曲線の近似性は、これらの条件下では、Ｎ７４４がＡβ１〜４０線維化の程度または半減期をそれほど調節しなかったことを示している。
【図６Ｂ】Ｎ７４４がタウ線維化対して選択的であることを示す図である。第２のアミロイド形成タンパク質のアミリンを、ＤＭＳＯ媒体（図６Ｂ）の存在下でインキュベートした。２４時間にわたって一定分量を取り出し、透過電子顕微鏡法で画像化した。集合プロセスの開始後３時間でとった画像を示す。Ｎ７４４はこれらの条件下で、アミリン集合を妨害しなかった。これらのデータを合わせると、Ｎ７４４は、亜化学量論濃度でアッセイした場合、タウタンパク質に対して選択的であることが示唆している。
【図６Ｃ】Ｎ７４４がタウ線維化対して選択的であることを示す図である。第２のアミロイド形成タンパク質のアミリンを、４．１μＭ Ｎ７４４（図６Ｃ）の存在下でインキュベートした。２４時間にわたって一定分量を取り出し、透過電子顕微鏡法で画像化した。集合プロセスの開始後３時間でとった画像を示す。Ｎ７４４はこれらの条件下で、アミリン集合を妨害しなかった。これらのデータを合わせると、Ｎ７４４は、亜化学量論濃度でアッセイした場合、タウタンパク質に対して選択的であることが示唆している。図６Ｃ中のバーは５００ｎｍを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳内のタウ線維化を阻害する方法を必要とする患者を特定するステップと、
前記患者に、薬理学上有効な量のタウ線維化の阻害剤であって、一般式Ｉの化合物、
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は独立に、１個から６個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ４は独立に、１個から６個の炭素原子を有する第２の脂肪族基または１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換の脂肪族基である）
またはそれらの薬学上許容可能な塩である阻害剤を投与するステップと
を含む患者の脳内のタンパク質タウの集合を調節することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ３およびＲ５はメチル基であり、Ｒ２およびＲ４は２−ヒドロキシエチル基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者はヒトであり、前記薬理学上有効な量は１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者はヒトであり、前記薬理学上有効な量は１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物の脳内でのタウフィラメントの生成を阻害するかまたは逆転させる方法であって、
脳内のタウ線維化を阻害するための方法を必要とする哺乳動物を特定するステップと、
前記哺乳動物に、薬理学上有効な量の式ＩＩ
【化２】
またはそれらの薬学上許容可能な塩のタウ線維化の阻害剤を投与するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記哺乳動物はヒトであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記薬理学上有効な量は１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記薬理学上有効な量は１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１】
脳内のタウ線維化を阻害する方法を必要とする患者を特定するステップと、
前記患者に、薬理学上有効な量のタウ線維化の阻害剤であって、一般式Ｉの化合物、
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５は独立に、１個から６個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Ｒ２およびＲ４は独立に、１個から６個の炭素原子を有する第２の脂肪族基または１個から６個の炭素原子を有するヒドロキシル置換の脂肪族基である）
またはそれらの薬学上許容可能な塩である阻害剤を投与するステップと
を含む患者の脳内のタンパク質タウの集合を調節することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ３およびＲ５はメチル基であり、Ｒ２およびＲ４は２−ヒドロキシエチル基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者はヒトであり、前記薬理学上有効な量は１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者はヒトであり、前記薬理学上有効な量は１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物の脳内でのタウフィラメントの生成を阻害するかまたは逆転させる方法であって、
脳内のタウ線維化を阻害するための方法を必要とする哺乳動物を特定するステップと、
前記哺乳動物に、薬理学上有効な量の式ＩＩ
【化２】
またはそれらの薬学上許容可能な塩のタウ線維化の阻害剤を投与するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記哺乳動物はヒトであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記薬理学上有効な量は１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記薬理学上有効な量は１日当たり約１０ｍｇから約１０００ｍｇであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【公表番号】特表２００７−５２４６１７（Ｐ２００７−５２４６１７Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７４９２（Ｐ２００６−５１７４９２）
【出願日】平成１６年６月２１日（２００４．６．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９８２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１２７２５
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５０４０４１２１７）ニューロナーティクス インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２１日（２００４．６．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９８２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１２７２５
【国際公開日】平成１６年１２月２９日（２００４．１２．２９）
【出願人】（５０４０４１２１７）ニューロナーティクス インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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