タンパク質−タンパク質相互作用を解析する方法
本発明は、検定化合物、又は複数の化合物の混合物が、対象の二つのタンパク質間の相互作用を調節するか否かを測定するための方法に関する。前記測定は、その内の一方が、前記第１タンパク質、タンパク質分解分子のための開裂部位と、遺伝子のアクチベーターとを含む二つの組換え分子を使用することによって可能とされる。第２の組換え分子は、前記第２タンパク質と、前記タンパク質分解分子とを含む。もしも前記検定化合物が前記第１タンパク質に結合すれば、反応が開始され、それによって、前記アクチベーターが開裂されて、レポーター遺伝子を活性化する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、対象分子間の相互作用を測定するための方法に関する。詳しくは、本発明は、細胞内におけるレポーター遺伝子の活性化を測定することによって、前記検定化合物と称される特定の物質が、二つ以上の特定の対象タンパク質間の相互作用を調節するか否かの測定に関し、ここで、前記調節又はその不在から、前記活性化、又はその欠如が起こる。前記測定は、トランスフォーム細胞又はトランスフェクション細胞を使用して行われ、これらのトランスフォーム細胞及びトランスフェクション細胞、更に、それらをトランスフォーム又はトランスフェクトするのに使用される薬剤も本発明の特徴を構成する。
【背景技術】
【０００２】
背景と関連技術
レセプターのリガンドの同定によって例示される、タンパク質／タンパク質相互作用の研究が非常に注目されている。所与のレセプターに対する１つ又は複数のリガンドが既知であるとしても、より効果的な、又はより選択性の高いリガンドを同定することには利益がある。以下、このような方法で研究することが可能なクラスのタンパク質の非限定的具体例としてＧＰＣＲについてここでは説明する。
【０００３】
Ｇタンパク質共役レセプター、以後、“ＧＰＣＲ”と言う、は、ヒトに関して知られている最大のクラスの細胞表面レセプターである。ＧＰＣＲによって認識されるリガンドには、ホルモン、神経伝達物質、糖蚤白質、脂質、ヌクレオチド及びイオンが含まれる。それらは、光、嗅覚、フェロモン、及び味覚に対するレセプターとしても作用する。これらの多様な役割からして、それらが、種々の条件下で有用な薬剤を求める鋭意研究の対象となっていることは恐らく驚くべきことではない。その成功率は驚異的である。事実、ハワード（Howard）ほか, Trends Pharmacol. Sci., 22:132-140（2001）は、市販の薬剤の５０％以上がそのようなレセプターに対して作用するものである、と推定している。ここで「ＧＰＣＲ」と称するものは、第７膜貫通型ドメイン（７ＴＭ）構造によって特徴付けられるＧＰＣＲのスーパーファミリーレセプターの任意のメンバーを指す。これらのレセプターの具体例は、非限定的に、クラスＡ又は「ロドプシン様」レセプター、クラスＢ又は「セクレチン様」レセプター、クラスＣ又は「代謝調節型グルタミン酸様」レセプター、Frizzled and Smoothened関連レセプター、接着レセプターファミリー、又はＥＧＦ−７ＴＭ／ＬＮＢ−７ＴＭレセプター、アディポネクチンレセプター及びそれに関連のレセプター、及び、嗅覚、味覚、鋤鼻及びフェロモン関連レセプターを含む化学感受性レセプター、を含む。例として、ヒトのＧＰＣＲスーパーファミリーは、非限定的に、Vassilatisほか Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:4903-4908（2002）、タケダ（Takeda）ほか, FEBS Letters, 520:97-101 （2002）、フレデリックソン（Fredricksson）ほか, Mol. Pharmacol., 63:1256-1272（2003）; グルスマン（Glusman）ほか, Genome Res., 11:685-702 （2001）; 及びゾズーリャ（Zozulya）ほか, Genome Biol., 2:0018.1-0018.12（2001）、を含み、これらの全てをここに参考文献として合体させる。
【０００４】
ＧＰＣＲ機能による作用の機序がある程度明らかにされている。簡単に説明すると、ＧＰＣＲがリガンドに結合すると、高次構造の変化が起こり、細胞生理機能における変化をもたらすカスケードの反応を刺激する。ＧＰＣＲは、細胞内、ヘテロ三量体のグアニンヌクレオチド結合タンパク質、又は“Ｇタンパク質”の活性を変化させることによってシグナルを伝達するものである、と考えられている。リガンドとレセプターとの複合体は、グアニンヌクレオチドの交換と、Ｇタンパク質ヘテロ三量体のα及びβγサブユニットへの解離を刺激する。
【０００５】
ＧＴＰ−結合αサブユニットとβγ二量体との両方が、アデニリルシクラーゼとホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を含む、種々の細胞作動性タンパク質を調節するべく作用することができる。従来のＧＰＣＲの細胞に基づく解析では、レセプター活性を、アデニリルシクラーゼによって作り出されるｃＡＭＰの蓄積などのＧタンパク質調節性作動経路の出力、又は、ＰＬＣ活性によって刺激される細胞内カルシウムの遊離を測定することによってモニタする。
【０００６】
従来のＧタンパク質に基づくシグナル伝達解析は、二つの主要な問題により、いくつかの標的用に開発することが困難であった。
【０００７】
第１に、異なるＧＰＣＲが異なるＧタンパク質調節性シグナル伝達経路に結合し、Ｇタンパク質に基づく解析は、標的レセプターの特定の作用又は経路への共役を強要するために、標的レセプターのＧタンパク質特異性を知っていることに依存するか、若しくは、細胞系の操作（engineering）を必要とする。第２に、全ての細胞は、多数の内在性ＧＰＣＲ、又、その他のシグナル伝達因子を発現する。その結果、測定される作動経路は、標的ＧＰＣＲの他に、他の内在性分子によっても調節されるかもしれず、それによって誤った結果を導く可能性がある。
【０００８】
Ｇタンパク質活性の調節が、リガンド／ＧＰＣＲ結合の唯一の結果であるわけではない。共にここに参考文献として合体させるルットレル（Lu ttrell）ほか, J. Cell Sci., 115:455-465（2002）と、ファーガソン（Ferguson）, Pharmacol., Rev., 53:1-24（2001）、は、ＧＰＣＲシグナルの終結をもたらすその他の活性を検討している。これらの終結プロセスは、過剰な細胞刺激を防止し、細胞外シグナルとそれに対応する細胞内経路との間の一時的な連鎖を強制する。
【０００９】
アゴニストのＧＰＣＲへの結合の場合、ＧＰＣＲ分子のＣ末端のセリンとトレオニン残基がリン酸化される。このリン酸化は、ＧＰＣＲキナーゼ、又は“ＧＲＫ”、ファミリーによって引き起こされる。アゴニスト複合、Ｃ末端リン酸化ＧＰＣＲは、レセプターシグナル伝達を「抑止（arrest）」するアレスチン ファミリーのメンバーと相互作用する。この結合によって、レセプターがＧタンパク質に共役することが抑制され、それによってレセプターが内部移行のために標的化され、その後、分解および／又は再循環が起こる。従って、リガンドのＧＰＣＲへの結合が、ＧＰＣＲとアレスチンタンパク質との間の相互作用を「調節する」ということができる。なぜなら、リガンドのＧＰＣＲへの結合がアレスチンをＧＰＣＲに結合させ、これによって、その活性を調節するからである。以後、「モジュレーター」又はそのいずれかの形態が使用される場合、それは、単純に、本発明の二つのタンパク質が、検定化合物の存在下において、この検定化合物の不在下におけるこれら二つのタンパク質の相互作用との比較において、相互作用する何らかの変化を言うものとする。例えば、前記検定化合物の存在は、二つのタンパク質の相互作用を強化又は促進、あるいはそれを弱化、抑制、又はなんらかの方法、態様又は形態で減少させ、それをその後検出可能とするかもしれない。
【００１０】
この背景情報から、ＧＰＣＲの活性化及び抑制を解析するための別の方法が導かれた。これらの方法は、アレスチンとの相互作用をモニタリングすることを含む。この方法の大きな利点は、Ｇタンパク質経路の知識が不要であることである。
【００１１】
ここに参考文献として合体される、オークレイ（Oakley）ほか, Assay Drug Dev. Technol, 1:21-30（2002）及び米国特許第５，８９１，６４６、及び６，１１０，６９３号は、活性化されたレセプターへの、細胞質の蛍光標識アレスチン分子の再分布が測定される解析について記載している。これらの方法は、アレスチンの再局在化とレセプター活性化を測定するために、細胞の高解像度撮像に依存している。これが複雑な入れ込んだ手続きであることを当業者は認識するであろう。
【００１２】
これらの点を扱ったその他種々の米国特許及び特許出願も発行、出願されている。例えば、ボーン（Bohn）ほかの米国特許第６，５２８，２７１号は、疼痛管理薬剤をスクリーニングする解析を扱っており、ここでは、β−アレスチンのインヒビターが測定されている。第２００４／０００２１１９，２００３／０１５７５５３，２００３／０１４３６２６、及び２００２／０１３２３２７号等の公開米国特許出願も、すべて、ＧＰＣＲに関する種々の形態の解析について記載している。公開出願第２００２／０１０６３７９号は、下記の例に使用される構造物（construct）を記載している。但し、それはここに記載される本発明を教示、示唆するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、特定のタンパク質／タンパク質相互作用のモジュレーターのモニタリングおよび／又は測定のための、より単純な解析を開発することにあり、ここでは、前記タンパク質は、非限定的に、レセプター、特にＧＰＣＲ等の膜結合タンパク質を含む。これがいかにして達成されるかは以下の例から理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
従って、本発明によれば、検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するための方法が提供され、この方法は、前記化合物を、（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部のための開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記細胞内においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ａ）と、（ｉ）前記検定化合物の存在下における前記第１検定タンパク質に対するその相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ｂ）とでトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞に接触させる工程と、前記レポーター遺伝子の活性を、前記化合物が前記タンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かの測定として、測定する工程とを含む。
【００１５】
前記第１検定タンパク質は、膜結合タンパク質、特に、ＧＰＣＲ、等の膜貫通レセプターとすることができる。具体的な膜貫通レセプターとしては、β２−アドレナリン作動性レセプター（ＡＤＲＢ２）、アルギニンバソプレッシンレセプター２（ＡＶＰＲ２）、セロトニンレセプター１ａ（ＨＴＲ１Ａ）、ｍ２ムスカリン性アセチルコリンレセプター（ＣＨＲＭ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター５（ＣＣＲ５）、ドーパミンＤ２レセプター（ＤＲＤ２）、カッパーオピオイドレセプター（ＯＰＲＫ）、又はα１ａ−アドレナリン作動性レセプター（ＡＤＲＡ１Ａ）があるが、但し、いずれの場合においても、本発明がこれらの特定の実施例に限定されるものではないと理解される。例えば、チロシンキナーゼであるインスリン成長因子−１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）等の分子や、エストロゲンレセプター１（ＥＳＲ１）やエストロゲンレセプター２（ＥＳＲ２）等の通常は膜結合型ではないタンパク質がある。前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部は、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼとすることができる。前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質は、ｔＴＡやＧＡＬ４等の転写因子とすることができる。前記第２タンパク質は、アレスチンなどの抑制型タンパク質とすることができる。前記細胞は、真核細胞又は原核細胞とすることができる。前記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどの外来性遺伝子とすることができる。
【００１６】
前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第２検定タンパク質との相互作用を増加させるように改変することができる。そのような改変は、非限定的に、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換することを含む。例えば、前記Ｃ末端領域を、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＲＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ｂ，ＣＣＲ４又はＧＰＣＲのＣ末端をコードするヌクレオチド配列によって置換することができる。
【００１７】
前記方法は、１つ以上の検定化合物を複数の細胞サンプルに接触させる工程を含むことができ、前記サンプルのそれぞれは、前記単数又は複数の検定化合物によって接触され、ここで、前記細胞サンプルのそれぞれが、上述した核酸分子でトランスフォーム又はトランスフェクトされている。そして、前記方法は、前記検定化合物のいずれかが特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するべく前記複数のサンプル中におけるレポーター遺伝子の活性を測定する工程を含むことができる。前記方法は、そのそれぞれがその他すべてと異なる１つの検定化合物を前記サンプルのそれぞれと接触させる工程、又は、前記サンプルのそれぞれを前記複数の検定化合物の混合物と接触させる工程を含むことができる。
【００１８】
別実施例において、検定化合物が単数又は複数の対象のタンパク質相互作用を調節するか否かを測定する方法が提供され、この方法は、前記化合物を複数の細胞サンプルに接触させる工程を含み、前記細胞サンプルのそれぞれが、（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、プロテアーゼのための開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記細胞内においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む第１の核酸分子（ａ）と、（ｉ）前記対象検定化合物の存在下におけるその前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列とを含む第２の核酸分子（ｂ）とを含み、ここで、前記第１検定タンパク質は前記複数のサンプルのそれぞれにおいて他の第１検定タンパク質と異なり、そして、前記方法は、更に、前記複数のサンプルのうちの１つ又は複数における前記レポーター遺伝子の活性を、単数又は複数の対象のタンパク質相互作用の調節の測定として測定する工程を含む。
【００１９】
前記第２検定タンパク質は、各サンプルにおいて異なるもの、又は、各サンプルにおいて同じものとすることができる。前記サンプルのすべてを、共通の容器（receptacle）内で組み合わせることができ、各サンプルは、異なる対の第１及び第２検定タンパク質を含む。或いは、各サンプルを、異なる容器内で検定することができる。所与のサンプル中の前記レポーター遺伝子は、その他のサンプル中のレポーター遺伝子と異なるものとすることができる。検定化合物の前記混合物は、脳脊髄液、尿、血液、血清、膿汁、腹水、滑液、組織抽出物、又は浸出物等の生体試料を含む、又は生体試料内に含まれるもの、とすることができる。
【００２０】
更に別の実施例において、（ｉ）前記第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記細胞中においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ａ）、そして、（ｉ）前記検定化合物の存在下におけるその前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ｂ）とで、トランスフォーム又はトランスフェクトされた組換え細胞が提供される。
【００２１】
前記核酸分子の一方又は両方を、前記細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。前記細胞は、更に、前記レポーター遺伝子によってもトランスフォーム又はトランスフェクトされたものとすることができる。前記第１検定タンパク質は、膜貫通レセプター、特にＧＰＣＲ、等の膜結合タンパク質とすることができる。具体的な膜貫通レセプターは、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、又はＡＤＲＡ１Ａを含む。
【００２２】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部は、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼとすることができる。前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質は、ｔＴＡやＧＡＬ４等の転写因子とすることができる。前記第２タンパク質は、抑制型タンパク質とすることができる。前記細胞は、真核細胞又は原核細胞とすることができる。前記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどの外来性遺伝子とすることができる。前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、たとえば前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換すること等によって、前記第２タンパク質との相互作用を増加させるように改変することができる。前記Ｃ末端領域は、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＲＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ，ＣＣＲ４又はＧＲＰＲのＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列によって置換することができる。
【００２３】
更に別の実施例において、（ｉ）検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、単離核酸分子を提供する。前記検定タンパク質は、膜貫通レセプターのような、膜結合タンパク質である。膜貫通タンパク質の特定タイプはＧＰＣＲである。特定の膜貫通レセプターとして、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ又はＡＤＲＡ１Ａを含む。プロテアーゼ、又はプロテアーゼの一部は、タバコエッチ病核内封入Ａプロテアーゼであり得る。前記レポーター遺伝子を活性化するタンパク質は、ｔＴＡ又はＧＡＬ４等の転写因子であり得る。上記のように、本発明はこれらの特定の実施形態に限定されるとして理解するものではない。
【００２４】
更に別の実施例において、単離核酸分子を含む発現ベクターが提供され、これは、（ｉ）検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含み、更に、プロモーターに操作連結されている。
【００２５】
更に別の実施例において、単離核酸分子が提供され、これは、（ｉ）検定化合物の存在下において別の検定タンパク質とのその相互作用が測定される検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列とを含む。前記検定タンパク質は、アレスチンなどの抑制型タンパク質とすることができる。
【００２６】
また、（ｉ）検定化合物の存在下において別の検定タンパク質とのその相互作用が測定される検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列とを含む単離核酸分子を含む発現ベクターが提供され、前記核酸は、更に、プロモーターに操作連結されている。
【００２７】
更に別の実施例は、以下の発現によって生成される融合タンパク質を含む。
【００２８】
（ｉ）検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列、そして（ｉｉｉ）前記細胞中でのレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、を含み、更に、プロモーターに操作連結されている、単離核酸分子。
【００２９】
または、（ｉ）検定化合物の存在下において別の検定タンパク質とのその相互作用が測定される検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、とを含む、単離核酸分子。
【００３０】
更に別の実施例において、検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するのに有用な検定キットが提供され、これは、以下のそれぞれの分離部分を有する。前記第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む核酸分子（ａ）と、（ｉ）前記検定化合物の存在下における前記第１検定タンパク質とのその相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ｂ）と、前記（ａ）及び（ｂ）のそれぞれを互いに対して分離して保持するための容器手段。
【００３１】
前記第１検定タンパク質は、膜貫通レセプター等の膜結合タンパク質とすることができる。１つの具体的タイプの膜貫通レセプターはＧＰＣＲである。具体的な膜貫通タンパク質は、ＧＰＣＲである。具体的な膜貫通レセプターは、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、又はＡＤＲＡ１Ａを含む。前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部は、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼとすることができる。前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質は、ｔＴＡやＧＡＬ４等の転写因子とすることができる。前記第２タンパク質は、アレスチンなどの抑制型タンパク質とすることができる。前記キットは、更に、レポーター遺伝子をコードする単離核酸分子の別の部分を含むことができる。前記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどをコードすることができる。前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、例えば、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換すること等によって、前記第２検定タンパク質との相互作用を増加させるように改変することができる。前記Ｃ末端領域のヌクレオチド配列を、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＲＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ，ＣＣＲ４又はＧＲＰＲのＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列によって置換することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
尚、ここに記載されるすべての方法又は組成物は、ここに記載されるすべての方法又は組成物に関して実施可能であると理解される。クレームおよび／又は明細書中における「含む（comprising）」という用語との“a”や“an”という単語の使用は、“one”（「１つ」）を意味するかもしれないが、「単数又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１つ以上」として意味とも撞着しないものと理解される。
【００３３】
本発明のこれら及びその他の実施例は、以下の説明及び貼付の図面を参照して考慮されることにより、よりよく判断、理解されるであろう。但し、以下の説明は、本発明の種々の実施例及びその多数の具体的詳細を示すものではあるが、これは限定のためではなく例示のために提供されているものである、ということが理解されるべきである。本発明の本質から逸脱することなく、本発明の範囲内において、多くの置換、変更、追加および／又は再構成が可能であり、本発明は、そのような置換、変更、追加および／又は再構成を含むものである。
【００３４】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、かつ、本発明のいくつかの態様を例示することを意図したものである。本発明は、これらの図面の１つ又は複数をここに提供される具体的実施例の詳細説明と共に参照することによってより良く理解されるであろう。
【００３５】
図１は、一例として、リガンド−レセプター結合を使用する本発明の概念的基礎を図示している。
【００３６】
図２ａ及び２ｂは、アゴニストとアンタゴニストとの両方に対して、本発明による解析の標的の反応が用量依存性であることを示している。
【００３７】
図３は、用量反応曲線が、別の標的と別のアゴニストでも生じることを示している。
【００３８】
図４は、Ｄ２ドーパミンレセプターを使用した、本発明によって得られた結果を図示している。
【００３９】
図５ａ及び５ｂは、二つの分子を同時に研究することが可能であることを示す解析の結果を図示している。
【００４０】
図６は、別の「マルチプレックス」解析、即ち、二つの分子が同時に研究される解析の結果を図示している。
【００４１】
図７は、ＥＧＦＲ活性を測定する解析から得られたデータを示している。
【００４２】
図８は、ヒトＩ型インターフェロンレセプターの活性を測定するように構成された、本発明による解析から得られたデータを示している。
【００４３】
図９は、図７を作り出すのに使用された細胞におけるＩＦＮ−αの用量反応曲線を図示している、図７の結果をより詳細に示している。
【００４４】
図１０は、別の転写因子と別の細胞ラインが使用された別の実施例の結果を示している。
【００４５】
好適実施例の詳細な説明
本発明は、対象物質が、レセプター、例えば、膜貫通レセプター等の膜結合タンパク質などの第１検定タンパク質と、アレスチンファミリーのメンバーなどの第２検定タンパク質との相互作用を調節するか否かを測定するための方法に関する。この方法は、真核細胞又は原核細胞とすることができる細胞を、二つの構造物によってコトランスフォーム又はコトランスフェクトすることを含む。前記第１構造物は、（ｉ）膜貫通レセプターなどの前記第１検定タンパク質と（ｉｉ）プロテアーゼの開裂部位、をコードする配列、そして（ｉｉｉ）レポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードする配列とを含む。前記第２構造物は、（ｉ）前記第１検定タンパク質とのその相互作用が測定される及び／決定される第２検定タンパク質をコードする配列、そして（ｉｉ）前記第１構造物の一部である前記開裂部位に対して作用するのに十分な、プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、を含む。特に好適な実施例において、これらの構造物は、細胞内に安定的に取り込まれる。
【００４６】
本発明の一実施例の特徴が、図１に図示されている。簡単に説明すると、標準技術を使用して、転写因子をコードするＤＮＡを、膜貫通レセプター分子等の研究対象の第１検定タンパク質をコードするＤＮＡに融合させる。この融合は、実験に使用される宿主細胞によって内在性に発現されないプロテアーゼに対する認識開裂部位を含めることによって達成される。
【００４７】
この第１融合タンパク質をコードするＤＮＡは、前記第１検定タンパク質、例えば、前記レセプター、に対して融合された前記転写因子に依存するプロモーター要素の制御下で、それもレポーター遺伝子配列をも含む細胞に導入され、それによって発現される。もしも前記外来性プロテアーゼが存在しないのであれば、前記転写因子は前記第１検定タンパク質に対して係留（tethered）されたまま留まり、核に侵入して前記レポーター遺伝子の発現を刺激することは出来ない。
【００４８】
第２融合タンパク質を作り出すためにも組換え技術を使用することができる。図示されている実施例において、アレスチンファミリーのメンバーをコードするＤＮＡが、前記外来性プロテアーゼをコードするＤＮＡ分子に融合され、これによって、前記第２検定タンパク質、即ち、前記アレスチンファミリーメンバー、を含む第２融合タンパク質が得られる。
【００４９】
次に、解析が行われ、ここで、前記第２融合タンパク質が、前記第１融合タンパク質と共に発現され、検定化合物が、好ましくは、特定の時間、前記細胞と接触される。もしも前記検定化合物が、前記二つの検定タンパク質の相互作用を、例えば、これら第１及び第２検定タンパク質の会合を、刺激、促進又は増強することによって、調節するならば、これによって前記転写因子の遊離が起こり、さらに、この因子が核へと移動して、前記レポーター遺伝子の発現を誘発する。前記レポーター遺伝子の活性が測定される。
【００５０】
別のシステムにおいて、前記二つの検定タンパク質は、前記検定化合物の不在下で相互作用し、検定化合物によってこれら二つの検定タンパク質を解離させ、それらの相互作用を減少又は抑制させることも可能である。そのような場合、前記検定化合物の存在下において、前記細胞中の自由な、機能的に活性である転写因子のレベルが減少し、これによって、タンパク質分解が減少し、レポーター遺伝子の活性の検出可能な減少が起こる。
【００５１】
記載の実施例において、前記第２検定タンパク質である、前記アレスチンタンパク質は、アゴニストの存在下において前記レセプターに結合する。しかし、レセプターは１つのタイプのタンパク質に過ぎないので、前記解析は、レセプター分子の使用に依存せず、又、アゴニスト結合が、関連することが可能な唯一の相互作用であるのでもない。膜貫通タンパク質が注目されることは明らかではあるが、いかなるタンパク質でも十分である。更に、レセプターに対するアゴニストの結合が、解析することが可能な唯一のタイプの結合ではない。本発明によって、アンタゴニスト自身を測定することが可能であり、又、異なるアンタゴニストおよび／又はアゴニストの相対的強度を測定することも可能である。
【００５２】
本発明のその他の詳細は、その課題を製造、使用するための具体的な方法と技術を含むものであり、それらについて以下説明する。
【００５３】
Ｉ．発現構造物とトランスフォーメーション
「ベクター」という用語は、そこでそれが複製することが可能な細胞への導入のためにその中に核酸配列を挿入することが可能なキャリア核酸分子を称するのに使用される。核酸配列は、「外来性」であることができ、これは、それが、その中にベクターが導入される前記細胞に対して異質であること、又は、前記配列が細胞内の配列に対しては同質であるが、宿主細胞核酸内の、その配列が通常は見られない位置にある、ということを意味する。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含む。当業者は、標準組換え技術（例えば、マニアティス（Maniatis）ほか, Molecular Cloning, A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor, 1990）及びオースベル（Ausubel）ほか, 1994, Current Protocols In Molecular Biology（John Wiley & Sons, 1996）ともにここに参考文献として合体させる）によって十分にベクターを構築することができるであろう。
【００５４】
「発現ベクター」という用語は、転写されることが可能なＲＮＡをコードする核酸を含むすべてのタイプの遺伝子構造物を指す。いくつかのケースにおいて、ＲＮＡ分子は、次に、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。他のケースにおいて、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子又はリボザイムの生成において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主細胞中での、操作連結されたコード配列の転写と可能な翻訳とのために必要な核酸配列をいう、種々の「制御配列」を含むことができる。転写と翻訳を制御する制御配列に加えて、ベクターと発現ベクターは、他の機能を果たす、上述したヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５５】
いくつかの実施例において、クローニングと遺伝子伝達用に、プラスミドベクターが考えられる。一般に、宿主細胞に適合する種由来のレプリコンと制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主との関連において使用される。前記ベクターは、一般に、複製部位と、トランスフォーム細胞中において表現型選択を提供することが可能なマーキング配列を坦持する。１つの非限定的具体例において、E. coliが、多くの場合、E. coli種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を使用してトランスフォームされる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンとテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、従って、トランスフォーム細胞を同定するための容易な手段を提供する。前記ｐＢＲプラスミド、又は、その他の細菌性プラスミド、又はファージは、更に、例えば、それ自身のタンパク質の発現のために細菌性組織体によって使用可能なプロモーターも含まなければならないか、あるいは、含むように改変されなければならない。
【００５６】
更に、宿主微生物組織に適合するレプリコンと制御配列を含むファージベクターを、これら宿主との関連において、トランスフォームベクターとして使用することが可能である。例えば、ファージラムダＧＥＭＴＭ−１１を、例えば、E. coli. LE392等の宿主細胞、をトランスフォームするために使用可能な組換えファージベクターを作成するのに利用することができる。
【００５７】
前記発現ベクターを含む、例えば、E. coli等の細菌性宿主細胞は、例えばＬＢ等の様々な適当な培地で成長させることができる。ある種のベクター中における前記組換えタンパク質の発現は、当業者によって理解されるように、宿主細胞を、ある種のプロモーターに対して特異的な物質に接触させることによって、例えば、ＩＰＴＧを培地に添加することや、インキュベーションをより高い温度に切り替える、等、によって誘発させることができる。前記細菌を、更に追加時間、一般に、２時間から２４時間、培養した後、前記細胞を、遠心分離によって収集し、残滓の培地を除去するために洗浄する。
【００５８】
多くの原核生物ベクターも、真核生物宿主細胞をトランスフォームするために使用することができる。しかし、真核生物宿主細胞中でタンパク質を発現する特定の目的のために改変されたベクターを選択することが望ましい。そのような細胞中における調節されたおよび／又は高レベルの発現用に発現システムが構成されている。例えば、共にここに参考文献として合体させる米国特許第５，８７１，９８６及び４，８７９，２３６号に記載され、例えば、INVITROGEN（登録商標）からMAXBAC（登録商標）２．０という名前で、そして、CLONTECH（登録商標）からBACKPACK（登録商標） BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMという名前で購入することが可能な、昆虫細胞／バキュロウイルスシステムによって、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を作り出すことが可能である。
【００５９】
発現システムのその他の例としては、STRATAGENE（登録商標）のCOMPLETE CONTROL（登録商標） Inducible Mammalian Expression Systemがあり、これは、合成エクジソン誘導可能レセプター、又はそのｐＥＴ発現システム、E. coli発現システム、を含む。誘導可能発現システムのもう１つの例は、INVITROGEN（登録商標）から入手可能であり、これは、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）（テトラサイクリン調節発現）システム、全長ＣＭＶプロモーターを使用する誘導可能哺乳動物発現システム、を坦持している。INVITROGEN（登録商標）は、更に、Pichia methanolica発現システムと呼ばれる酵母発現システムを提供しており、これは、メチロトローフ酵母、Pichia methanolica中での組換えタンパク質の高レベル産生用に構成されている。当業者は、核酸配列又は、その同族のポリペプチド、タンパク質、又はペプチド、を作り出すためにいかにして、発現構造物等のベクターを発現させるかを理解するであろう。
【００６０】
調節性シグナル
前記構造物は、プロモーター、ポリＡ配列、等の追加の５’および／又は３’要素を含むことができる。これらの要素は、宿主細胞由来、即ち、宿主細胞と同種のものとすることができ、或いは、それらは、別の源由来、即ち、異種のものとすることができる。
【００６１】
「プロモーター」とは、転写の開始と速度とがそこで制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、ＲＮＡポリメラーゼやその他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合して、核酸配列の特定の転写を開始することができる遺伝子要素を含むことができる。「操作配置」、「操作連結」、「制御下」及び「転写制御下」という文言は、プロモーターが、核酸配列に対して、その配列の転写開始および／又は発現を制御するために正しい機能位置および／又は配向にあることを意味する。
【００６２】
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置決めする作用をする配列を含む。これの最も良く知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジル転移酵素遺伝子のためのプロモーターや、ＳＶ４０後期遺伝子のためのプロモーター等の、ＴＡＴＡボックスが欠如したいくつかのプロモーターにおいて、その開始部位上に位置する別の要素が、それ自身、開始場所の固定に役立つ。追加のプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流側領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流側にも機能要素を含むことが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下」に置くために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、その選択されたプロモーターの「下流側」（即ち、その３’）におく。「上流側」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【００６３】
プロモーター要素間の間隔は多くの場合フレキシブルであるので、要素が反転、又は、互いに対して移動された場合でも、プロモーター機能は保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始める前に、５０ｂｐの距離へと増加させることができる。プロモーターによっては、個々の要素が協働的又は独立的に作用して転写を活性化するように機能することができるようである。プロモーターは、「エンハンサー」と共に使用してもよいし、使用しなくてもよく、「エンハンサー」とは、核酸配列の転写活性に関与するシス作動性の調節配列をいう。
【００６４】
プロモーターは、例えば、コードセグメントおよび／又はエクソンの上流側に位置する５’−非コード配列を単離することによって得られるように、核酸分子と自然に会合したものとすることができる。そのようなプロモーターは、「外来性」と称することができる。同様に、エンハンサーも、核酸分子と自然に会合して、その配列の下流側又は上流側のいずれかに位置するものとすることができる。或いは、コード核酸セグメントを、その自然な環境においては核酸分子と正常には会合しないプロモーターである、組換え又は異種プロモーターの制御下に置くことによってある種の利点が得られる。組換え又は異種エンハンサーは、更に、その自然な環境において核酸分子と正常に会合しないエンハンサーも指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、他のいずれかのウイルス、又は原核又は真核細胞から分離したプロモーター又はエンハンサー、そして「自然発生」でない、即ち、異なる転写調節領域の異なる要素、および／又は発現を変える変異、を含むプロモーター又はエンハンサーを含むことができる。例えば、組換えＤＮＡ構造物に最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステムを含む。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に作り出すことに加えて、配列は、ここに開示される組成物と関連して、組換クローニングおよび／又はＰＣＲ（登録商標）を含む核酸増幅技術を使用することによっても作り出すことができる（ここに参考文献として合体させる米国特許第４，６８３，２０２及び５，９２８，９０６号を参照）。更に、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核オルガネラ内の配列の転写および／又は発現を指令する制御配列も使用することが考えられる。
【００６５】
勿論、発現のために選択された、オルガネラ、細胞タイプ、組織、器官又は、生物内でＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび／又はエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、細胞タイプの組み合わせを知っている（例えば、ここに参考文献として合体させるサムブルック（Sambrook）ほか, 1989を参照）。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質および／又はペプチドの大量生産において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指令するべく、適切な条件下において、構成的、組織特異的、誘導可能および／又は有用なものとすることができる。前記プロモーターは、外来性又は内在性とすることができる。
【００６６】
更に、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、Eukaryotic Promoter Data Base EPDB, www.epd.isb-sib.ch/を参照）も、発現を駆動するために使用することが可能であろう。Ｔ３，Ｔ７又はＳＰ６細胞質発現システムの使用がもう一つの可能な実施例である。真核細胞は、もしも、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部として、又は追加の遺伝子発現構造物として、提供されるのであれば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【００６７】
コード配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要であるかもしれない。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン又は隣接の配列を含む。前記ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルを提供する必要があるかもしれない。当業者は、これを容易に判断して必要なシグナルを提供することが可能であろう。インサート全体が確実に翻訳されるようにするためには、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームに対して「イン・フレーム（in frame）」でなければならないことがよく知られている。前記外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然のもの、又は合成のものとすることができる。適当な転写エンハンサー要素を含ませることによって、発現の効率を高めることができる。
【００６８】
本発明のいくつかの実施例において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を使用して、多重遺伝子群、又は多シストロン性メッセージを作り出す。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存翻訳のリボソーム走査モデルを迂回して、内部部位で翻訳を開始することができる（ペルティエ（Pelletier）およびソーネンバーグ（Sonenberg）, Nature, 334:320-325 （1988））。ピコルナウイルスファミリーの二つのメンバー（ポリオと脳心筋炎）からのＩＲＥＳ要素が、哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳ（マセジャック（Macejak）およびサーノウ（Sarnow）, Nature, 353:90-94 （1991））1991）と共に、記載されている（（ペルティエ（Pelletier）およびソーネンバーグ（Sonenberg）、上述）。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに結合させることができる。それぞれがＩＲＥＳによって分離された、複数のオープンリーディングフレームを同時に転写して、多シストロン性メッセージを作り出すことができる。ＩＲＥＳ要素の性質により、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。１つのメッセージを転写するために１つのプロモーター／エンハンサーを使用して、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる（それぞれをここに参考文献として合体させる米国特許第５，９２５，５６５及び５，９３５，８１９号を参照）。
【００６９】
他のベクター配列要素
ベクターは、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができ、これは、そのいずれもが、ベクターを消化するための標準組換え技術で連結可能な複数の制限酵素部位を含んでいる核酸領域である（例えば、ここに参考文献として合体させるカーボネッリ（Carbonelli）ほか, FEMS Microbiol. Lett. 172 （1）: 75-82 （1999）, レヴェンソン（Levenson）ほか, Hum. Gene Ther. 9（8）: 1233-1236（1988）及びコセア（Cocea）, Biotechniques, 23（5）: 814-816（1997）を参照）。「制限酵素消化」とは、核酸分子内の特定の位置においてのみ作用する酵素による、核酸分子の触媒作用的な開裂をいう。これらの制限酵素の多くは、市販されている。そのような酵素の使用は当業者によって広く理解されている。多くの場合、ベクターは、外来性配列をベクターに結合させることを可能にするためにＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して、線形化（linearized）又は断片化される。「連結（ligation）」とは、互いに対して隣接、又は隣接しないものとすることが可能な、二つの核酸フラグメント間にリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう。制限酵素と連結反応に関連する技術は、組換え技術の当業者にとって周知である。
【００７０】
大半の転写された真核ＲＮＡ分子は、一次転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受けることになる。ゲノム真核配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセッシングを確保するために、ドナーおよび／又はアクセプタースプライシング部位を必要とするかもしれない（例えば、ここに参考文献として合体させるチャンドラー（Chandler）ほか1997を参照）。
【００７１】
本発明の前記ベクター又は構造物は、一般に、少なくとも１つの終止シグナルを含む。「終止シグナル」又は「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特定の終止に関連するＤＮＡ配列を含む。従って、いくつかの実施例において、ＲＮＡ転写物の生成を終止させる終止シグナルが考えられる。所望のメッセージレベルを達成するためにターミネーターが生体内で必要とされるかもしれない。
【００７２】
真核システムにおいて、前記ターミネーター領域は、更に、ポリアデニル化部位を露出させるべく新しい転写物の部位特異的開裂を可能にする特定のＤＮＡ配列を含むことができる。これは、特定の内在性ポリメラーゼに、転写物の３’末端へ、約２００のアデノシン残基（ポリＡ）の伸長を追加するようにシグナル伝達する。このポリＡ尾部によって改変されたＲＮＡ分子は、より安定的であると考えられ、より効率的に翻訳される。従って、真核細胞に関連する他の実施例において、ターミネーターがＲＮＡの開裂のためのシグナルを含むことが好ましく、そのターミネーターシグナルによってメッセージのポリアデニル化が促進されることが更に好ましい。前記ターミネーターおよび／又はポリアデニル化部位要素は、メッセージレベルを高め、カセットからそれを介した他の配列への読取を最小化するように作用することができる。
【００７３】
本発明で使用されることが考えられるターミネーターは、非限定的に、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス性の終止配列、を含む遺伝子の終止配列を含む、ここに記載されている、又は当業者に知られている任意の公知の転写のターミネーターを含む。いくつかの実施例において、前記終止シグナルは、配列切断などによる、翻訳不能および／又は転写不能配列などの、転写可能又は翻訳可能な配列の欠如とすることができる。
【００７４】
発現、特に真核発現において、通常、転写物の適切なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に必須であるとは考えられず、任意のそのような配列を使用することが可能である。好適実施例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含み、これらは共に、簡便かつ容易に入手可能であり、種々の標的細胞において良好に作用することが知られている。ポリアデニル化によって、転写物の安定性を増大させることができ、或いは、細胞質輸送を容易にすることができる。
【００７５】
宿主細胞中においてベクターを良好に増殖させるために、それは、そこで複製を開始させる特定のヌクレオチド配列である、単数又は複数の由来の複製起点（しばしば“ｏｒｉ”と呼ばれる）部位を含むことができる。或いは、宿主細胞が酵母である場合には、自己複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【００７６】
トランスフォーメーション方法
本発明で使用される核酸送達のための適当な方法は、それによって、核酸分子（例えばＤＮＡ）を、ここに記載されているように、又は、当業者に知られているように、細胞に導入することが可能な実質的に全ての方法を含むものと考えられる。そのような方法は、非限定的に、生体外（ex vivo）トランスフェクション（ウィルソン（Wilson）ほか, Science, 244:1344-1346（1989）, ナベル（Nabel）ほか, Science, 244:1342-1344（1989）, 微量注入（ハーラン（Harlan）およびウェイントラウブ（Weintraub）, J. Cell Biol, 101（3）: 1094-1099 （1985）; 米国特許第５，７８９，２１５号、ここに参考文献として合体させる）を含む、注入（ここにそのそれぞれを参考文献として合体させる、米国特許第５，９９４，６２４，５，９８１，２７４，５，９４５，１００，５，７８０，４４８，５，７３６，５２４，５，７０２，９３２，５，６５６，６１０，５，５８９，４６６及びＮｏ．５，５８０，８５９ッ号）、エレクトロポーレーション（米国特許第５，３８４，２５３号、ここに参考文献として合体させる; トゥル‐カパ（Tur-Kapa）ほか, Mol. Cell Biol., 6:716-718（1986）; ポッター（Potter）ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165（1984）、リン酸カルシウム沈殿（グラハム（Gr aham）およびファン・デア・エブ（Van Der Eb）; Virology, 52: 456-467（1973）; Chen（チェン）及びOkayama（オカヤマ）, Mol. Cell Biol., 7（8）: 2745-2752（1987）; リッペ（Rippe）ほか, Mol. Cell Biol., 10:689-695（1990）; ＤＥＡＥデキストラン、その後にポリエチレングリコールの使用（ゴパル（Gopal）, Mol. Cell Biol., 5:1188-190（1985）、直接音波装填（direct sonic loading）（フェッチハイマー（Fechheimer）ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89（17）: 8463-8467（1987）; リポソーム媒介トランスフェクション（ニコラウ（Nicolau）およびセネ（Sene）, Biochem. & Biophys. Acta., 721:185-190 （1982）; フラレー（Fraley）ほか, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76:3348-3352 （1979）; ニコラウ（Nicolau）ほか, Meth. Enzym., 149:157-176（1987）; ワン（Wong）ほか, Gene, 10:879-894 （1980）; カネダ（Kaneda）ほか, Science, 243:375-378 （1989）; カトウ（Kato）ほか, J. Biol. Chem.,266: 3361-3364 （1991）及びレセプター媒介トランスフェクション（ウー（Wu）およびウー（Wu）, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 （1987）; ウー（Wu）およびウー（Wu）, （1988）; プロトプラストのＰＥＧ−媒介トランスフォーメーション（オミラレー（Omirulleh）ほか, Plant Mol. Biol., 21（3）: 415-428（1987）、米国特許第４，６８４，６１１及び４，９５２，５００号、そのそれぞれをここに参考文献として合体させる）、乾燥／抑制媒介ＤＮＡ取り込み(desiccation/inhibition-mediated DNA uptake)（ポトリカス（Potrykus）ほかMol. Gen. Genet., 199（2）: 169-177（1985）およびこれらの方法の任意の組み合わせ、のようなＤＮＡの直接送達を含む。
【００７７】
ＩＩ．解析システムの構成要素
ここに記載の方法と同様、本発明の特徴である生産物も好適実施例を有する。例えば、「三部構造物」即ち、検定タンパク質と、開裂部位と活性化タンパク質とをコードする配列を含む構造物、において、前記検定タンパク質は、好ましくは、ＧＰＣＲファミリーのメンバーなどの膜貫通レセプターなどの膜結合タンパク質である。これらの配列は、それらがコードするタンパク質のＣ末端を、第２タンパク質に対するより良好で強力な相互作用を有するように改変することができる。そのような改変は、例えば、ＧＰＣＲなどの前記検定タンパク質のＣ末端領域を、全てを前に定義した、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＰＬＩ，ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８，ＣＣＲ４又はＧＲＰＲのＣ末端コード領域で置換することを含む。
【００７８】
前記レポーター遺伝子を活性化するタンパク質は、転写因子（例えば、ｔＴＡ、ＧＡＬ４等）等の、核内で作用するタンパク質とすることができ、或いは、それは、他のタンパク質による核内反応へ導く、カスケード反応を開始させる分子とすることができる。当業者には、そのようなカスケード反応は周知であろう。
【００７９】
前記第２構造物は、上述したように、前記第１タンパク質と相互作用して、なんらかの測定可能な現象をもたらすタンパク質をコードする領域を含む。このタンパク質は、前記第１タンパク質の、アクチベーター、インヒビター、より一般的には、「調節物質（modulator）」、とすることができる。特に前記第１タンパク質がＧＰＣＲである場合には、アレスチンファミリーのメンバーが好適であるが、特に前記第１タンパク質がＧＰＣＲでない場合には、他のタンパク質コード領域も使用可能である。これらの二部構造物の第２部分は前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードし、これは、前記第１構造物によってコードされた融合タンパク質から活性化分子を除去するように作用する。
【００８０】
しかし、次の追加の実施例に記載されているように、これらの好適実施例は本発明を限定するものではない。
【００８１】
宿主細胞
ここでの使用において、「細胞」、「細胞ライン」、及び「細胞培養物」という用語は、相互交換可能に使用することができる。これらの用語は全て、更に、その任意又はすべての後続世代であるところの、それらの後代（progeny）も含む。尚、全ての後代は、意図的又は不意の変異によって同じではないかもしれない、と理解される。前記宿主細胞は、一般に、前記第１検定タンパク質とともに、融合タンパク質の一部である転写因子によって活性化されるスクリーニング可能又は選択可能なマーカを発現するように操作（engineered）されたものとされるであろう。
【００８２】
異種核酸配列を発現する意味において、「宿主細胞」は、ベクターを複製することが可能な、および／又は、ベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することが可能な原核又は真核細胞をいう。宿主細胞が核酸分子によって「トランスフェクト」又は「トランスフォーム」される場合、それらは、「操作（engineered）」又は「組換え」細胞、或いは、例えばベクターなどの外来性核酸配列が導入された細胞、呼ばれる。従って、組換え細胞は、組換えによって導入された核酸を含まない自然発生細胞から区別可能である。
【００８３】
多種多様な細胞ライン及び培養物が宿主細胞として利用可能であり、それらは、生体培養物と遺伝物質とのアーカイブとして役立っている組織であるAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）を通じて入手することが可能である（www.atcc.org）。当業者は、適当な宿主を、ベクターのバックボーンと求められる結果とに基づいて決定することができる。例えば、プラスミド又はコスミドを、多くのベクターの複製のために原核宿主細胞に導入することができる。ベクター複製および／又は発現のために利用可能な細胞タイプは、非限定的に、E. coli（例えば、E. coli RR1株, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776（ATTC No. 31537）更に、E. coli W3110（Ｆ−,ラムダ、原栄養体, ATTC No. 273325），DH5α、JM109、及びKC8、等の細菌、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバシラス、Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, 種々のシュードモナス属等の、他の腸内細菌、更に、SURE（登録商標）Competent Cells 及びSOLOPACKTM Gold Cells（STRATAGENE（登録商標），La Jolla）等の多数の市販されている細菌性宿主を含む。いくつかの実施例において、E.coli LE392等の細菌細胞が、ファージウイルス用の宿主細胞として特に考えられる。
【００８４】
ベクターの複製および／又は発現のための宿主細胞の具体例は、非限定的に、HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, CHO, Saos及びPC12を含む。種々の細胞タイプ及び組織由来の多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者に知られている。同様に、ウイルス性ベクターを、真核又は原核宿主細胞、特に、そのベクターの複製又は発現を許容するもの、と使用することができる。
【００８５】
検定タンパク質
本発明は、その物理的相互作用が知られている、又は、推測される、任意の二つのタンパク質の使用を意図している。これらのタンパク質は、融合タンパク質として、すなわち、転写因子に融合された第１検定タンパク質と、この第１融合タンパク質中の開裂部位、前記転写因子を遊離する開裂の部位、を認識するプロテアーゼに融合された第２検定タンパク質、として存在する。これら検定タンパク質／融合物のに必要とされることは、（ａ）第１検定タンパク質が、開裂の前に核内に局所化できないこと、そして（ｂ）プロテアーゼが、第２タンパク質への融合と、第１検定タンパク質の第２検定タンパク質への結合との両方の後でも活性状態に留まる必要があること、のみである。
【００８６】
前記第１構造物に関して、前記第１検定タンパク質は、例えば、自然膜結合タンパク質、又は、標準技術によって、膜結合になるように操作されたもの、とすることができる。前記第１検定タンパク質は、例えば、ＧＰＣＲ類のいずれかのような膜貫通レセプター、あるいは、非限定的に、レセプターチロシンキナーゼ、レセプターセリントレオニンキナーゼ、サイトカインレセプター、等を含む、その他の対象の膜貫通レセプターとすることができる。更に、タンパク質の部分は、全長第１検定タンパク質として同様に作用するであろうことがよく知られているので、第１検定タンパク質のそのような活性部分も、ここでのタンパク質の定義に含まれる。
【００８７】
当業者にとって明らかになるであろうが、本発明は、任意のタンパク質との相互作用を解析するために使用することが可能であり、ＧＰＣＲなどの膜結合レセプターの解析にその範囲が限定されるものではない。例えば、非限定的に、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、例えばＩＧＦ１Ｒ、例えば上皮成長因子（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／Ｎｅｕ又は関連のＲＴＫ；レセプターセリン／トレオニンキナーゼ、例えば、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）レセプター；サイトカインレセプター、例えば、インターロイキン、エリスロポエチン，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のためのインターフェロンファミリーのためのレセプター及びレプチンレセプター：エストロゲンレセプター１（ＥＳＲ１）、 エストロゲンレセプター２（ＥＳＲ２）等の必ずしも自然には膜結合ではないその他のレセプター、を含む他のクラスの膜貫通レセプターの活性が含まれる。それぞれのケースにおいて、前記方法は、対象レセプターを含むキメラタンパク質の発現を指令する改変レセプター構造物によって細胞をトランスフェクションする工程を含み、前記構造物には、プロテアーゼ開裂部位と、それに後続の、転写因子をコードする核酸分子とが付着している。前記細胞は、前述の部位を認識し開裂する前記プロテアーゼに融合された相互作用タンパク質から成るキメラタンパク質の発現を指令する第２構造物と同時トランスフェクションされる。ＥＧＦＲ等のＲＴＫの場合、この相互作用タンパク質は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）等のＳＨ２（Ｓｒｃホモロジードメイン２）含有タンパク質又はその一部、又は、Ｓｒｃホモロジー２ドメイン含有トランスフォームタンパク質１（ＳＨＣ１）から構成することができる。ＴＧＦβ、アクチビン、ＢＭＰレセプターなどのレセプターセリン／トレオニンキナーゼの場合、この相互作用タンパク質は、Ｓｍａｄタンパク質又はその一部とすることができる。インターフェロン−α／β又はインターフェロン−γガンマレセプターなどのサイトカインレセプターの場合、この相互作用タンパク質は、非限定的に、Ｓｔａｔ１，Ｓｔａｔ２等の転写（ＳＴＡＴ）タンパク質、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）タンパク質Ｊａｋ１，Ｊａｋ２又はＴｙｋ２、又はそれらの一部の、シグナルトランスデューサ及び活性化物質とすることができる。それぞれの場合において、前記トランスフェクト細胞は、前記レセプターに融合された前記転写因子によって調節されるレポーター遺伝子を含む。次に、前記トランスフェクト細胞を、特定の期間、検定化合物で処理し、この検定期間の最後に前記レポーター遺伝子の活性を測定する解析を行う。もしも、検定化合物が対象のレセプターを活性化すれば、前記対象レセプターと前記相互作用タンパク質との間の相互作用が刺激され、それによって前記プロテアーゼ部位が開裂し、融合された転写因子が遊離され、これを、レポーター遺伝子活性における増加として測定することが可能となる。
【００８８】
他の可能な検定タンパク質の対としては、抗体−リガンド、酵素−基質、二量化タンパク質、シグナル伝達カスケードの成分、その他周知のタンパク質の対がある。
【００８９】
レポーター
レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質は、検出可能なシグナルをもたらす、遺伝子、発現又は欠如に対する影響を与える任意のタンパク質とすることができる。典型的なタンパク質レポーターは、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（glucuronidase）（ＧＵＳ）又はβ−ガラクトシダーゼ等の酵素を含む。又、グリーン蛍光タンパク質、レッド蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ等の蛍光及び化学発光タンパク質も考えられる。
【００９０】
転写因子とリプレッサ
本発明に拠れば、操作された宿主細胞内でのレポーター遺伝子の発現を活性化するために転写因子が使用される。これら転写因子は、一般に、それらのＤＮＡ結合ドメインの構造に応じて分類され、それらは一般に、（ａ）ジンクフィンガー、（ｂ）へリックス−ターン−へリックス（helix-turn-helix）、（c）ロイシンジッパー（leucine zipper）、（ｄ）へリックス−ループ−へリックス（helix-loop-helix）、又は（ｅ）高移動性グループである。転写因子の活性化ドメインが、転写装置（ＲＮＡポリメラーゼ）の成分又は、その他の調節タンパク質と相互作用し、それによってＤＮＡ結合の効率に影響を与える。
【００９１】
Ｒｅｌ／核内因子 ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）と活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）とが、最もよく研究されている転写因子ファミリーに含まれる。それらは、炎症や腫瘍形成などの病理的結果をもたらす、シグナル伝達経路の重要な成分として同定されている。その他の転写因子ファミリーは、熱ショック／Ｅ２Ｆファミリー、ＰＯＵファミリー及びＡＴＦファミリーを含む。ｔＴＡやＧＡＬ４等の特定の転写因子が本発明の使用に考えられる。
【００９２】
転写因子は、使用可能な１つの分子クラスであるが、前記解析を改造して、測定可能なシグナルがシグナル発生器のダウンレギュレーション又は細胞死である、転写リプレッサ分子の使用を可能にすることもできる。
【００９３】
プロテアーゼ及び開裂部位
プロテアーゼは、特定の部位において他のタンパク質を開裂する十分に特徴付けられている酵素である。１つのファミリー、Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテアーゼは、セリン及びトレオニン残基で開裂する。他のプロテアーゼは、システイン又はチオールプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、アミノペプチダーゼ、ジ及びトリペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、及びペプチジルペプチダーゼを含む。これらの選択は、当業者次第であり、勿論、ここに記載されている分子に限定される必要はない。酵素が触媒ドメインを有し、これらを全長プロテアーゼの代わりに使用することが可能であることはよく知られている。そのようなものも本発明に含まれる。１つの具体的実施例は、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼ又は、その活性部分である。当業者に明らかなように、その他のプロテアーゼの特定の開裂部位も使用可能である。
【００９４】
検定タンパク質の改変
前記第１検定タンパク質は、この解析において前記相互作用タンパク質に対するその結合を増強するように改変することができる。例えば、ある種のＧＰＣＲは、リガンド刺激により、アレスチンにより安定的に、又はより高い親和性で結合し、この増強された相互作用は、別々のドメイン、例えば、Ｃ末端尾部におけるセリンとトレオニン残基のクラスター、によって媒介されることが知られている（オークレイ（Oakley）ほか, J.Biol.Chem. 274:32248-32257,1999及びオークレイ（Oakley）ほか, J.Biol.Chem. 276:19452-19460, 2001）。これを一例として使用して、レセプターなどの膜結合タンパク質の親和性を増加するために、レセプターコード配列自身を、それが結合するタンパク質で改変できることが明らかである。そのような改変の具体例は、上述したもののような、レセプターなどの膜結合タンパク質のＣ末端領域の、それの、結合タンパク質に対してより高い親和性を有するがレセプター機能には影響しない別のレセプターの対応領域との置換を含む、改変である。例１６及び２０は、本発明のこの特徴の実施例を示すものである。
【００９５】
更に、前記第２検定タンパク質を、前記第１検定タンパク質とのその相互作用を増強するべく改変することができる。例えば、前記解析は、アゴニスト−占有ＧＰＣＲに、より安定的に、又は、リン酸化−独立様式で結合することが知られている、アレスチンなどの、第２検定タンパク質の点変異体、切断体又はその他のバリアントを含むことができる（コヴォーア（Kovoor）ほか, J. Biol. Chem., 274: 6831-6834,1999）。
【００９６】
ＩＩＩ．解析形態
上述したように、本発明は、その一実施例において、二つの検定タンパク質の、同じ細胞内で発現された時の、相互作用を評価する簡単な方法を提供する。第１構造物は、上述したように、それ自身、レポーター遺伝子アクチベーターをコードする配列に連結されている、プロテアーゼ又はプロテアーゼ部分のための開裂部位をコードする配列に連結されている第１タンパク質をコードする配列を含む。ここで、「連結」とは、記載した配列が、融合して、全ての要素を含む１つのポリペプチドに翻訳可能な、１つの完全なオープンリーディングフレームを作り出すことを意味する。これらは、別のタンパク質又はペプチドをコードする又はコードしないものとすることができる追加のヌクレオチド配列によって分離されたものであっても、又は分離されないものであってもよい。前記組換え細胞に挿入される第２構造物も、上述した、即ち、それは、第２タンパク質と、前記プロテアーゼ又はプロテアーゼ部分をコードする配列との両方を含む。これらの要素は協働で、標的タンパク質相互作用に対するその作用が追求される候補物質と組み合わされて基本解析形態を構成する。
【００９７】
しかし、本発明は、そのそれぞれが、ここに記載のクラスのタンパク質などの、タンパク質の活性化によって刺激される、異種のレポーター遺伝子を同時に使用することによって、１つ以上の、レセプターなどの膜結合タンパク質を解析するのにも使用することができる。例えば、これは、異なるレセプター構造物及び異なるレポーター遺伝子でトランスフェクトされた細胞を混合すること、又は、各検定レセプターに異なる転写因子を融合し、検定化合物での処理後の各レポーター遺伝子の活性を測定することによって、達成することができる。例えば、対象分子が第１レセプターを活性化するか否か、さらに、第２レセプターとの相互作用によって、副作用が発現されるか否か、を決定することが望ましいかもしれない。そのような場合、例えば、第１レセプターと第１レポーター、ｌａｃＺのような、とをコードする第１細胞ラインと、第２レセプターと第２レポーター、ＧＦＰ等のような、とをコードする第２細胞ラインとを使用することができる。そのようなシステムの好適実施例が、例１７と１８に見られる。前記二つの細胞ラインを混合し、対象の化合物を添加し、一方に対する明確な作用と、他方に対する作用の欠如を求めることができる。
【００９８】
尚、本発明は、一対の相互作用検定タンパク質が検定される解析と、より好ましくは、ここで「マルチプレックス（multiplex）」解析と称するものが使用される解析との両方に関する。そのような解析は、様々な方法で実行可能であるが、いずれの場合でも、一対以上の検定タンパク質が同時に検定される。これは、例えば、そのそれぞれが、各相互作用タンパク質の対を検定するべく、トランスフォーム又はトランスフェクトされている複数の細胞のサンプルを提供することによって達成可能である。これらの異なるトランスフォーム細胞は、１つの容器内で同時に組み合わせ、検定することができ、或いは、各タイプの形質転換体を別々の容器に入れて、その後検定することも可能である。
【００９９】
ここに記載のマルチプレックス解析に使用される前記細胞は、同じであっても、又は同じでなくてもよい。同様に、使用されるレポーターシステムは、各サンプルにおいて同じであっても、又は同じでなくてもよい。前記サンプル又は複数のサンプルが、例えばマイクロアレイのウェルなどの、容器に入れられた後、単数又は複数の化合物を、容器にセットされた複数の相互作用タンパク質の対に対してスクリーニングすることができる。
【０１００】
前記構造物によって発現される前記融合タンパク質も、本発明の特徴である。当業者にとって明らかになるであろう本発明のその他の態様は、前記融合タンパク質を同定することが可能な抗体、更に、タンパク質の存在を測定するための種々のタンパク質に基づく解析、又、遺伝子の発現を測定する、ＰＣＲによる解析などの、ハイブリダイゼーション解析である。
【０１０１】
ＩＶ．キット
ここに記載の組成物のいずれも、キットとして構成することができる。従って、このキットは、本発明の前記ベクター又は細胞のための適当な容器手段と、本発明に使用可能な追加の任意の試薬とを含むものとなる。
【０１０２】
前記キットは、適当に分割された本発明の組成物を含む。これらのキットの構成部分は、水性媒体中又は凍結乾燥状態でパッケージ化することができる。前記キットの容器手段は、一般に、その中に、成分が配置される、好ましくは、適当に分取される、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器又はその他の容器手段を含む。キット中に１つ以上の構成部分が含まれる場合は、このキットは、更に、それらの中にそれらの追加構成部分を別々に入れることが可能な、第２、第３、又はその他追加の容器を含むものとされる。但し、種々の組み合わせの構成部分を１つのバイアル中に含ませることも可能である。本発明のキットは、更に、通常、市販のために、試薬容器を密に封じ込めるための手段を備える。そのような容器は、その中に所望のバイアルが保持される射出成形又は吹出し成形容器を含むことができる。
【０１０３】
前記キットの構成部分が単数又は複数の溶液として提供される場合、その溶液は、水溶液であり、殺菌水溶液が特に好ましい。但し、前記キットの構成部分は、乾燥粉末（単数又は複数）として提供することも可能である。試薬および／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、その粉末は、適当な溶剤の添加によって再構築することができる。前記溶剤も、別の容器手段に入れて提供することも考えられる。
【実施例】
【０１０４】
Ｖ．例
本発明を説明する具体的実施例は、下記の例から理解されるであろう。但し、本発明はこれらに限定されるものと解釈されてはならない。
【０１０５】
例１
標準命名法に 従って、以下“ＡＤＲＢ２”と称するヒトβ２アドレナリンレセプターをコードするＤＮＡを使用して、融合構造物を形成した。そのヌクレオチド配列は、GenBankにおいて、受入番号NM_ 000024（配列識別番号１）で得られる。ここに参考文献として合体させるゴッセン（Gossen）ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 87: 5547-5551（1992）に記載されているテトラサイクリン調節性トランスアクチベーターｔＴＡも使用された。ここに参考文献として合体させるパークス（Parks）ほか, Anal. Biochem., 216: 413-417 （1994）に記載されている、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼに対する認識及び開裂部位をコードする配列が、前記融合コード遺伝子のこれらの配列の間に挿入されている。前記ＣＭＶプロモーター領域を、ＡＤＲＢ２コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、前記ｔＴＡ領域の下流側に配置した。
【０１０６】
先ず、内部ＢａｍＨＩ及びＢｇＩＩＩ制限部位が欠如した形態のＡＤＲＢ２を作り出すことによって融合構造物を調製した。更に、内在性の終止コドンを、ユニークなＢａｍＨＩ部位によって置換した。
【０１０７】
これを行うためにオーバラッピングＰＣＲを使用した。詳述すると、前記コード領域の５’部分を、
gattgaagat ctgccttctt gctggc（配列識別番号２）、及び、
gcagaacttg gaagacctgc ggagtcc（配列識別番号３）によって増幅した。
一方、前記コード領域の３’部分を、
ggactccgca ggtcttccaa gttctgc（配列識別番号４）、及び、
ttcggatcct agcagtgagt catttgt（配列識別番号５）によって増幅した。
【０１０８】
その結果得られたＰＣＲ産物は、２７ヌクレオチドのオーバーラッピング配列を有し、これらを標準アガロースゲル電気泳動によって精製した。これらを互いに混合し、配列識別番号２と配列識別番号５とで増幅した。
【０１０９】
前記内因性の開始コドンがＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位によって置換されるようにｔＴＡのコード領域を改変するのにもＰＣＲが使用された。７アミノ酸配列ENLYFQS（配列識別番号６）によって形成されている前記開裂部位は、ここに参考文献として合体させるパークス（Parks）ほか, Anal. Biochem., 216: 413-417（1994）によって教示されている。７番目のアミノ酸は、Ｐ１’位置として知られており、これを他のアミノ酸と置換することによって、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏによる開裂の効率が減少することが知られている。カプスト（Kapust）ほか, Biochem. Bophys. Res. Commun., 294: 949-955（2002）を参照。
【０１１０】
第７アミノ酸がＴｙｒに変更されたバリアント、及び、それがＬｅｕに変更されたバリアントを作成した。これらによって、天然の高効率部位と比較して、中及び低効率の開裂部位が得られた。
【０１１１】
前記天然高効率部位をコードするＤＮＡ配列を、ｔＴＡコード領域に二つの工程で付加した。簡単に説明すると、
ccggatcctc tagattagat aaaagtaaag tg（配列識別番号７）、及び
gactcgagct agcagtatcc tcgcgccccc taccc（配列識別番号８）、でのＰＣＲによって、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位を５’末端に付加し、ＸｈｏＩ制限部位をｔＴＡコード領域の３’末端に付加した。そして、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位を、ＢａｍＨＩとＸｂａＩ部位の間で下記の配列、
gagaacctgt acttccag（配列識別番号９）に、オリゴヌクレオチドを連結することによって５’末端に付加した。
【０１１２】
このＤＮＡ配列を、以下を使用したＰＣＲによって前記中及び低効率開裂部位をコードするように改変した。
ENLYFQY（配列識別番号１２）の場合は、
ggatccgaga acctgtactt ccagtacaga tta（配列識別番号１０）、及び、
ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc（配列識別番号１１）、そして
ENLYFQL（配列識別番号１４）の場合は、
ggatccgaga acctgtactt ccagctaaga tta（配列識別番号１３）、及び、
ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc（配列識別番号１１）。
【０１１３】
これらのＰＣＲ工程によって、更に、ＢａｍＨＩ制限部位５’が各開裂部位をコードする配列に、そして、ＸｈｏＩ制限部位３’がｔＴＡ終止コドンに導入された。
【０１１４】
このようにして改変されたＡＤＲＢ２コード領域を、前記コード領域のヌクレオチド位置２６０で切断するＰｓｔＩと、ＢａｍＨＩとで消化した。この３’フラグメントを、予めＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化しておいたＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位によって改変されたｔＴＡの前記三つのバリアントと連結し、得られた複合体を、予めＰｓｔＩとＸｈｏＩとで消化しておいたpBlueScript IIにクローニングした。
【０１１５】
再度、
gcggccgcca ccatgaacgg taccgaaggc cca（配列識別番号１５）、及び、
ctggtgggtg gcccggtacc a（配列識別番号１６）を、使用したＰＣＲによって、前記ＡＤＲＢ２コード領域の開始コドンの５’にＮｏｔＩ制限部位が導入された。
【０１１６】
改変ＡＤＲＢ２コード領域の前記５’フラグメントを、ＮｏｔＩとＰｓｔＩとの消化によって単離し、これを、予め消化しておいたＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位ｔＴＡ融合の３’フラグメントの構造物のそれぞれに連結し、融合タンパク質をコードする三つの全長構造物を作成した。
【０１１７】
各構造物を、ＮｏｔＩとＸｈｏＩとで消化し、次に、ＮｏｔＩとＸｈｏＩとで消化された、市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入した。
【０１１８】
例２
第２の構造物も作成し、ここでは、以後“βアレスチン２又はＡＲＲＢ２”と称する（GenBank, NM_004313）（配列識別番号１７）のコード配列を、ＴＥＶタンパク質のＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメイン（即ち、成熟ＮＩａプロテアーゼのアミノ酸１８９−４２４、残基２０４０−２２７９）に連結した。これを行うために、ＡＲＲＢ２をコードするＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ制限部位をその５’末端に付加するように改変した。更に、この配列を、内在性の終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換するように改変した。下記のオリゴヌクレオチド、
caggatcctc tggaatggg gagaaaccg ggacc（配列識別番号１８）、及び、
ggatccgcag agttgatcat catagtcgc（配列識別番号１９）が使用された。得られたＰＣＲ産物を、市販のベクターｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ（Promega）にクローニングした。前記ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクターのマルチクローニング部位は、ＡＲＲＢの開始コドンへのＥｃｏＲＩ部位５’を含む。
【０１１９】
次に、コロジエイ（Kolodziej）ほか, Meth. Enzymol., 194: 508-519（1991）に従って、前記ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域を、前記内在性の開始コドンをＢｇｌＩＩ部位によって置換し、３’末端に、インフルエンザヘマグルチニンエピトープYPYDVPDYA（配列識別番号２０）をコードする配列を挿入し、その後、終止コドンとＮｏｔＩ制限部位とするように改変した。これは、
agatctagct tgtttaaggg accacgtg（配列識別番号２１）、および、
gcggccgctc aagctaac tggaacatca tatgggtacg agtacaccaa ttcattcatg at（配列識別番号２２）、を使用するＰＣＲによって達成された。
【０１２０】
得られた改変ＡＲＲＢ２コード領域をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化し、他方、改変ＴＥＶコード領域を、ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで開裂した。両フラグメントを、市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターに連結し、ＥｒｏＲＩとＮｏｔＩで消化した。
【０１２１】
例３
ＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位ｔ−ＴＡ及びＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞と、ｔＴＡ依存プロモーターの制御下で、安定的にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を取り込んだ、ＨＥＫ−２９３Ｔの誘導体である、「クローン４１」とにトランスフェクトした。約５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、100単位／mlペニシリン、１００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８及び５μｇ／mlプリマイシン（purimycin）を添加したＤＭＥＭ培地中で、２４ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を次の日、５０％のコンフルエンシーにまで増殖させ、次に、０．４μｇのプラスミドＤＮＡ、及び２μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質とその他の物質を含有する専売のトランスフェクション試薬）を使用してトランスフェクトした。この混合物を、１００μｌのＤＭＥＭ培地中で組み合わせ、細胞の添加の前に、室温で１５分間インキュベートした。トランスフェクション細胞を、検定８〜２０時間前に、レセプターのための公知のアゴニストである薬剤を添加することによってインキュベートし、その後、薬剤添加後、１６−２４時間インキュベートした。
【０１２２】
例４
前記細胞内のβ−ガラクトシダーゼのレベルを、先ず、ここに参考文献として合体させるマクグレガー（MacGregor）ほか, Somat. Cell Mol. Genet., 13: 253-265（1987）によって教示されているように、これらの細胞を、発色性物質、即ち、“Ｘ−ｇａｌ”によって染色することによって測定した。培養後、細胞を、カルシウムとマグネシウムを含むＤ−ＰＢＳ中で二回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、その後、追加の二回、それぞれ１０分間、Ｄ−ＰＢＳ、カルシウム及びマグネシウムによって洗浄した。固定された細胞を、予め、カルシウムとマグネシウムとを含むＤ−ＰＢＳ中で、４％ Ｘ−Ｇａｌ保存液の１：４０希釈によって調製しておいた、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％ Ｘ−Ｇａｌ、とインキュベートした。
【０１２３】
前記反応物を、暗所で室温にて３〜４時間から一晩インキュベートした。基質溶液を除去し、細胞を、ガラスカバーグラス下で、モヴィオール（ｍｏｗｉｏｌ）封入剤（１０％ モヴィオール、０．１％ １．４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、２４％グリセロール）で封入した。
【０１２４】
その結果、前記ＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位ｔ−ＴＡプラスミドのみ、又は、ＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼプラスミドのみのいずれによってトランスフェクトされた細胞も、β−ガラクトシダーゼを発現しないことが示された。両プラスミドでトランスフェクトされた小さな割合の細胞は、恐らくは、刺激を受けなかったＡＤＲＢ２とＡＲＲＢ２との間の相互作用の基礎レベルにより、β−ガラクトシダーゼを発現した。約３−５倍の多くの細胞が、共にＡＤＲＢ２アゴニストである、１０μＭイソプロテレノール又は１０μＭのエピネフリンでの処理後、前記レポーター遺伝子を発現した。
【０１２５】
前記細胞をＡＤＲＢ２アンタゴニストのアルプレノロール（１０μＭ）で５分間前処理した時、β−ガラクトシダーゼ発現細胞におけるアゴニスト誘導増加は阻止され、そして、アルプレノロールのみでの処理では明白な効果は無かった。
【０１２６】
これらの結果は、アゴニスト結合とＧＰＣＲ刺激とを、レポーター遺伝子の転写活性化に結びつけることができる、ということを示している。
【０１２７】
例５
細胞中におけるレポーター遺伝子活性のレベルをより正確に定量化し、分析におけるシグナル対バックグランド比を最大化するために一組の実験を行った。これは、β−ガラクトシダーゼ活性のための市販の化学発光解析を使用してレポーター遺伝子誘導のレベルを測定することによって達成された。クローン４１細胞を、ＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構造物、前記高、中または低効率開裂部位のいずれかを含む、及び上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミド、でトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクション後、１μＭのイソプロテレノールで処理しないか、又は２０時間処理し、薬剤添加の２４時間後に発光解析を行った。簡単に説明すると、細胞培養後、培地を除去し、５０μｌの溶解緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を各ウェルに添加した。細胞を、緩やかに攪拌しながら、室温で５分間のインキュベーションによって溶解させた。溶解物を収集し、市販の製品によって分析した。
【０１２８】
全てのケースにおいて、アゴニストでの処理によって、β−ガラクトシダーゼのレベルが増加した。しかし、未処理の細胞でのレポーター遺伝子活性のバックグランドレベルは、中及び高効率部位に対して、低効率開裂部位で最低であった。更に、アゴニスト処理によって、中効率開裂部位での２．８倍と高効率開裂部位での１．２倍に対して、低効率開裂部位でトランスフェクトされた細胞中でのレポーター遺伝子活性は４．８倍の刺激をもたらした。従って、低効率プロテアーゼ開裂部位を使用することによって最高のシグナル対バックグランド比が得られる。
【０１２９】
例６
これらの実験は、レポーター遺伝子発現におけるアゴニスト刺激増加が、アゴニストによるレセプターの結合と活性化に依存することを証明するために構成された。
【０１３０】
これを行うために、そのそれぞれが、アゴニスト イソプロテレノールへの親和性の大幅な低下をもたらす、位置１１３における１つのアミノ酸のＤからＳへの変更を有する前記レセプターの変異体を含んでいることを除いて、上述したプロトコルに従って、前記ＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合タンパク質のバリアントを作成した。ストレーダー（Strader）ほか, J. Biol. Chem. 266: 5-8 （1991）を参照。それぞれ異なる開裂部位をもつ三つの形態の変異体レセプター−ｔＴＡ融合構造物が形成された。
【０１３１】
前記ＡＤＲＢ２−ｔＴＡ、Ｄ１１３Ｓ点変異を含む、及び上述したＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミド、でコトランスフェクトされたクローン４１細胞中でβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルを測定した。これらの活性検定は、上述したものと全く同様に行われた。その結果、アゴニスト、イソプロテレノールは、前記変異ＡＤＲＢ−ｔＴＡ融合構造物を発現する細胞中においてレポーター遺伝子発現を刺激しないことが示された。
【０１３２】
例７
これらの実験は、レポーター遺伝子発現のアゴニスト刺激増加が、ＴＥＶ ＮＩａ−ＰｒｏのＡＲＲＢ２への融合に依存するか否かを調べるために構成された。
【０１３３】
これを行うために、前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構造物と、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミドか、又は、ホスホリパーゼＣのＳＨ２ドメインへの対照ＴＥＶ−ＮＩａ融合物のいずれかとでコトランスフェクトされたクローン４１細胞中でβ−ガラクトシダーゼのレベルを測定した。これらの活性検定は、上述したものとまったく同様に行われた。その結果、レポーター遺伝子発現のアゴニスト刺激増加は、ＴＥＶプロテアーゼがＡＲＲＢ２に融合された場合にのみ検出され、無関係のポリペプチドに融合された場合には検出されないことが示された。
【０１３４】
例８
これらの実験は、遺伝子発現が標的レセプターのアゴニストによって選択的に誘導されるか否か、或いは、それがその他の分子によって刺激することが可能であるか否か、を調べるために構成された。
【０１３５】
ＡＴＰは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞によって内在的に発現される、Ｇタンパク質共役レセプターＰ２Ｙ１及びＰ２Ｙ２に対するアゴニストである。
【０１３６】
前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構造物と上述のアレスチン−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトされ、イソプロテレノール、ＡＴＰで処理された又は処理されない、クローン４１細胞を使用して実験を行った。これらの解析は、上述した通りに行われた。
【０１３７】
その結果、レポーター遺伝子活性の誘導は、標的レセプターの活性化に対して特異的であることが示された。別のＧＰＣＲ経路の刺激は無関係であった。
【０１３８】
例９
前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構造物と上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトされ、種々の量の、アドレナリンレセプターアゴニスト、イソプロテレノール及びエピネフリンのいずれか１つで処理されたクローン４１細胞を使用して１セットの実験を行った。これらの解析は、上述した通りに行われた。図２ａに示されているその結果は、これら二つのリガンドによるレポーター遺伝子発現の刺激の用量−反応曲線を示している。各ポイントは、三つの実験から得られた平均値を表している。
【０１３９】
コトランスフェクションクローン４１細胞を、異なる濃度でアドレナリンレセプターアンタゴニスト、アルプレノロールで１５分間前処理し、その後、１μＭのエピネフリンでの処理を行うという１セットの実験を上述したようにして行った。図２ｂに示されているその結果は、このアンタゴニストの用量−抑制曲線を示している。
【０１４０】
例１０
Ｇタンパク質共役アルギニンバソプレッシンレセプター２（ＡＶＰＲ２）の分析を確立するために類似のセットの構造体を作成した。ＡＶＰＲ２コード領域（GenBank受入番号: NM_000054）（配列識別番号２３）を、プライマー、
gaattcatgc tcatggcgtc caccac（配列識別番号２４）、及び、
ggatcccgat gaagtgtcct tggccag（配列識別番号２５）でＰＣＲを使用して、５’末端にＥｃｏＲＩを配置し、そして終止コドンをＢａｍＨＩ部位によって置換するように改変した。
【０１４１】
前記改変ＡＶＰＲ２コード領域を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断しておいた、上述の三つのＡＤＲＢ２−ｔＴＡ構造物に連結した。これによって、ＡＤＲＢ２の全コード配列がＡＶＰＲ２のコード配列によって置換された。
【０１４２】
クローン４１細胞を、前記低効率開裂部位を含むＡＶＰＲ２−ｔＴＡ融合構造物と、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とによってコトランスフェクトし、種々の濃度（１ｐＭ〜２μＭ）の、［Ａｒｇ８］バソプレッシン、ＡＶＰＲ２のアゴニスト、を使用して解析を行った。図３に示すそのデータは、以前に刊行されたデータ（オークレー（Oakley）ほか, Assay and Drug Development Technologies, 1: 21-30、（2002））と一致する、３．３ｎＭのＥＣ５０をもつ、このアゴニストの用量反応曲線を示している。最大の反応によって、バックグランドレベルに対して、レポーター遺伝子発現の約４０倍の誘導が得られた。
【０１４３】
例１１
Ｇタンパク質共役セロトニンレセプター１ａ（ＨＲＴ１Ａ）の解析を確立するために、類似セットの実験を行った。前記ＨＴＲ１Ａコード領域（Genbank受入番号NM_000524）（配列識別番号２６）を、プライマー、
gaattcatgg atgtgctcag ccctgg（配列識別番号２７）、及び、
ggatccctgg cggcagaact tacac（配列識別番号２８）、でのＰＣＲを使用して、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、終止コドンをＢａｍＨＩ部位によって置換するべく改変した。
【０１４４】
前記改変ＨＴＲ１Ａコード領域を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断された上述のＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物に連結した。これによって、ＡＶＰＲ２の全コード配列が、ＨＴＲ１Ａのコード配列によって置換された。その結果得られた構造体を、以後“ＨＴＲ１Ａ−ｔＴＡ”と称する。
【０１４５】
クローン４１細胞を、前記低効率開裂部位を含むＨＴＲ１Ａ−ｔＴＡ融合構造物と、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合構造物とによってコトランスフェクトし、１０μＭ ８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ ＨＢｒ（ＯＨ−ＤＰＡＴ）、ＨＴＲ１Ａのアゴニスト、更に、１０μＭのセロトニン、ＨＴＲ１Ａの天然アゴニスト、とを使用して解析を行った。これらの解析は上述したようにして行われた。ＯＨ−ＤＰＡＴへの最大の反応によって、バックグランドレベルに対して、レポーター遺伝子発現の６．３倍の誘導が得られ、セロトニンへの最大の反応によって、バックグランドレベルに対して、レポーター遺伝子発現の４．６倍の誘導が得られた。
【０１４６】
例１２
Ｇタンパク質共役ｍ２ムスカリンアセチルコリンレセプター（ＣＨＲＭ２）のための解析を確立するために類似の構造体を作成した。ＣＨＲＭ２コード領域（Genbank受入番号NM_000739）（配列識別番号２９）を、プライマー、
gaattcatga ataactcaac aaactcc（配列識別番号３０）、及び、
agatctcctt gtagcgccta tgttc（配列識別番号３１）、でのＰＣＲを使用して、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、終止コドンをＢｇＩＩＩ部位によって置換するべく改変した。
【０１４７】
前記改変ＣＨＲＭ２コード領域を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断された上述のＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物に連結した。これによって、ＡＶＰＲ２の全コード配列が、ＣＨＲＭ２のコード配列によって置換された。
【０１４８】
クローン４１細胞を、前記高効率開裂部位を含むＣＨＲＭ２−ｔＴＡ融合構造物と、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合構造物によってコトランスフェクトし、ここで、ＡＲＲＢ２−プロテアーゼ融合タンパク質が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターの制御下で発現され、１０μＭのカルバミルコリンＣ１（カルバコール（carbochol））、ＣＨＲＭ２のアゴニスト、を使用して、上述したように解析を行った。カルバコールへの最大の反応によって、バックグランドレベルに対して、レポーター遺伝子発現の７．２倍の誘導が得られた。
【０１４９】
例１３
Ｇタンパク質共役ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター５（ＣＣＲ５）の解析を確立するためにα構造物も作成した。ＣＣＲ５コード領域（Genbank受入番号NM_000579）（配列識別番号３２）を、プライマー、
gcggccgcat ggattatcaa gtgtcaagtc c（配列識別番号３３）、及び、
ggatccctgg cggcagaact tacac（配列識別番号３４）、でのＰＣＲを使用して、５’末端にＮｏｔＩ部位を配置し、終止コドンをＢａｍＨＩ部位によって置換するべく改変した。
【０１５０】
ＣＣＲ５コード領域を、プライマー、
ggtctccaat tcatggatta tcaagtgtca agt（配列識別番号３５）、及び、
gacgacagcc aggtacctat c（配列識別番号３６）、を使用して、それが切断された時に、ＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡと適合するヌクレオチド突出部分を残す、５’末端にＢｓａＩ部位を配置するようにも改変した。
【０１５１】
前記第１の改変コード領域をＣｌａＩとＢａｍＨＩとで切断し、第２のものをＢｓａＩとＣｌａＩとで切断した。これら両フラグメントを、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断しておいた、ＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物に上述したように連結させた。これによって、ＡＶＰＲ２の全コード配列がＣＣＲ５のコード配列によって置換された。
【０１５２】
前記低効率開裂部位を含むＣＣＲ５−ｔＴＡ融合構造物を、上述のＨＥＫ細胞ライン“クローン４１”の誘導体であるが、ＣＭＶプロモーターの制御下で安定的に組み込まれたＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合遺伝子を含む、“クローン３４”細胞にトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌの「Regulated on Activation, Normal T-Cell Expressed and Secreted」（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＲ５に対する公知のアゴニスト、を使用して解析を行った。上述したように測定された、ＲＡＮＴＥＳに対する最大反応によって、バックグランドに対するレポーター遺伝子発現の約４０倍の誘導が得られた。
【０１５３】
例１４
次に、Ｇタンパク質共役ドーパミン２レセプター（ＤＲＤ２）の解析を確立するために一組の構造物を作成した。ＤＲＤ２コード領域（Genbank受入番号NM_000795）（配列識別番号３７）を、プライマー、
gaattcatgg atccactgaa tctgtcc（配列識別番号３８）、及び、
agatctgcag tggaggatct tcagg（配列識別番号３９）、を使用して、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、終止コドンをＢｇＩＩＩ部位によって置換するべく改変した。
【０１５４】
改変されたＤＲＤ２コード領域を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとによって切断された、ＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物に上述したようにして連結した。これによって、ＡＶＰＲ２の全コード配列がＤＲＤ２のコード配列によって置換された。
【０１５５】
クローン４１細胞を、前記中効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構造物と、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、ＤＲＤ２のアゴニスト、を使用して解析を行った。その結果を、上述した解析と同様にして測定した。ドーパミンに対する最大反応によって、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の２．７倍の誘導が得られた。
【０１５６】
例１５
これらの実験は、アゴニスト占有ＧＰＣＲを安定的に結合するアレスチン変異体を使用した解析の増強を証明するように構成された。先ず、β−アレスチン−１（ＡＲＲＢ１）に対するＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの融合物を構築した。ＡＲＲＢ１のコード領域（Genbank受入番号. NM_004041）（配列識別番号４０）を、プライマー、
ggtaccatgg gcgacaaagg gacgcgagtg（配列識別番号４１）、そして、
ggatcctctg ttgttgagct gtggagagcc tgtaccatcc tcctcttc（配列識別番号４２）、での使用したＰＣＲを使用して、５’末端にＡｓｐ７１８部位を配置し、終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換するべく改変した。
【０１５７】
その結果得られた改変ＡＲＲＢ１コード領域を、Ａｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、そして、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断し、他方、上述した改変ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域は、ＢｇＩＩＩとＮｏｔＩで切断した。三つ全部のフラグメントを、Ａｓｐ７１８とＮｏｔＩとで消化しておいた、市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターに連結した。
【０１５８】
クローン４１細胞を、前記中効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構造物と、ＡＲＲＢ１−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、Ｄ２レセプターのアゴニスト、を上述したように使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大の反応で、バックグランドに対するレポーター遺伝子発現の２．１倍の誘導が得られた。
【０１５９】
ＡＲＲＢ１のアミノ酸３８２以後の切断によって、ＧＲＫ−媒介リン酸化と独立した、アゴニスト結合ＧＰＣＲに対する親和性が増大するこが報告されている（コヴォーア エイ（Kovoor A.）ほか，J. Biol. Chem. 274 （11）: 6831-6834 （1999））。本解析におけるそのような「常時活性型のconstitutively active）」アレスチンの使用を示すために、β−アレスチン−１のコード領域を、上述した配列識別番号４１、及び、
ggatccattt gtgtcaagtt ctatgag（配列識別番号４３）、でのＰＣＲを使用して、５’末端にＡｓｐ７１８部位を配置し、アミノ酸３８２のあとにＢａｍＨＩ部位を配置するべく、改変した。
【０１６０】
これによって、全長コード領域よりも３６アミノ酸短いＡＲＲｂ１コード領域が得られる。これによって得られた改変ＡＲＲＢ１コード領域、“ＡＲＲＢ１（Δ３８３）”と称する、を、Ａｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、そしてＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、他方、上述の前記改変ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域をＢｇＩＩＩとＮｏｔＩで切断した。これら三つのフラグメント全部を、市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターに連結し、Ａｓｐ７１８とＮｏｔＩで消化した。
【０１６１】
クローン４１細胞を、前記中効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構造物と、ＡＲＲＢ２（Δ３８３）−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とによってコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、ＤＲＤ２レセプターに対するアゴニスト、を上述したように使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大反応で、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の８．３倍の誘導が得られた。
【０１６２】
前記ＡＲＲＢ２コード領域の同等の切断の作用を調べるために、ＡＲＲＢ２のコード領域を、プライマー、
ggtaccatgg gggagaaacc cgggacc（配列識別番号４４）、及び、
ggatcctgtg gcatagttgg tatc（配列識別番号４５）、でＰＣＲを使用して、５’末端にＡｓｐ７１８部位を配置し、３’末端の８１のヌクレオチドをＢａｍＨＩ部位で置換するように改変した。
【０１６３】
これによって、全長コード領域よりも２７アミノ酸短いＡＲＲＢ２コード領域が得られる。これによって得られた改変ＡＲＲＢ２コード領域を、Ａｓｐ７１８とＢａｍＨＩで切断し、他方、上述の改変ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域をＢｇＩＩＩとＮｏｔＩとで切断した。両フラグメントを、市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターに連結し、ＡｓＰ７１８とＮｏｔＩで消化した。
【０１６４】
クローン４１細胞を、前記中効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構造物と、ＡＲＲＢ２（Δ３８３）−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とによってコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、ＤＲＤ２レセプターに対するアゴニスト、を上述したように使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大反応で、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の２．１倍の誘導が得られた。
【０１６５】
図４に示すこれらの結果は、ＤＲＤ２ドーパミンレセプター解析が、前記アレスチン変異体ＡＲＲＢ１（Δ３８３）を使用して最高のシグナル対バックグランドを示すことを証明している。
【０１６６】
例１６
この組の実験は、相互作用タンパク質に対する親和性を増大させるように構成されたレセプター改変体を使用した解析の増強を証明するために行われた。この例において、検定レセプターのＣ末端尾部ドメインが、高い親和性でアレスチンと結合することが知られているレセプターである、ＡＶＰＲ２からの対応の尾部ドメインによって置換された。これらの例において、前記融合結合部（junction）が、通常、レセプターＣ−末端の推定パルミトイル化部位の直後の位置に対応する、第７膜貫通螺旋の末端における保存ＮＰＸＸＹモチーフの後の１５〜１８のアミノ酸に作られた。
【０１６７】
先ず、ＰＣＲを使用して、前記低効率ＴＥＶ開裂部位とｔＴＡ転写因子の前に、ＡＶＰＲ２からのＣ末端の２９アミノ酸をコードするＤＮＡフラグメントを作成した。このフラグメントは、又、最初の二つのアミノ酸（Ａｌａ，Ａ及びＡｒｇ，Ｒ）が、ＢｓｓＨＩＩ制限部位ＧＣＧＣＧＣによってコードされるようにも構成されている。これは、プライマー、
tgtgcgcgcg gacgcacccc acccagcctg ggt（配列識別番号４６）、及び、
ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc（配列識別番号１１）、によって、上述した低効率開裂部位を有するＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物を増幅することによっ達成された。
【０１６８】
次に、ＤＲＤ２のコード領域を、５’末端にＥｃｏＲＩを配置し、コード領域の最後のアミノ酸（Ｃｙｓ−４４３）の後にＢｓｓＨＩＩ部位を挿入するように改変した。これはプライマー、
gaattcatgg atccactgaa tctgtcc（配列識別番号４７）、及び、
tgtgcgcgcg cagtggagga tcttcaggaa ggc（配列識別番号４８）、でＰＣＲを使用して行われた。
【０１６９】
得られた改変Ｄ２コード領域を、ＥｃｏＲＩとＢｓｓＨＩＩで切断し、その結果得られたＡＶＰＲ２ Ｃ−末端尾部−低効率開裂部位−ｔＴＡフラグメントを、ＢｓｓＨＩＩとＢａｍＨＩで切断した。両フラグメントを、上述したＡＶＰＲ２−低効率開裂部位−ｔＴＡ構造物に連結し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した。
【０１７０】
クローン４１細胞を、前記低効率ＴＥＶ開裂部位を含むＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ融合構造物と、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、ＤＲＤ２レセプターのアゴニスト、を使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大反応によって、バックグランドのレポーター遺伝子発現の約６０倍の誘導が得られた。
【０１７１】
５’末端にＡｓｐ７１８部位を挿入し、Ｃｙｓ−３４１の後にＢｓｓＨＩＩ部位を配置することによって、前記ＡＤＲＢ２レセプターコード領域を改変した構造物を作成した。これは、プライマー、
gcggccgcca ccatgaacgg taccgaaggc cca（配列識別番号４９）、及び、
tgtgcgcgcg cacagaagct cctggaaggc（配列識別番号５０）、でＰＣＲを使用することによって行われた。
【０１７２】
前記改変ＡＤＲＢ２レセプターコード領域を、ＥｃｏＲＩとＢｓｓＨＩＩとで切断し、前記ＡＶＰＲ２ Ｃ−末端尾部−低効率開裂部位−ｔＴＡフラグメントを、ＢｓｓＨＩＩとＢａｍＨＩで切断した。両フラグメントを、上述したＡＶＰＲ２−低効率開裂部位−ｔＴＡ構造物に連結し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した。得られた構造物が“ＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ”である。（前述した米国特許公開出願２００２／０１０６３７９、特に、配列識別番号３を参照）。
【０１７３】
クローン４１細胞を、前記低効率ＴＥＶ開裂部位を含むＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ融合構造物と、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのイソプロテレノール、ＡＤＲＢ２レセプターのアゴニスト、を使用して解析を行った。イソプロテレノールに対する最大反応で、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の約１０倍の誘導が得られた。
【０１７４】
Ｃｙｓ−３４５の後にＢｓｓＨＩＩ部位を配置することによって、カッパーオピオイドレセプター（ＯＰＲＫ：Genbank受入番号: NM_000912）（配列識別番号５１）コード領域を改変した構造物を作成した。これは、プライマー、
ggtctacttg atgaattcct ggcc（配列識別番号５２）、及び、
gcgcgcacag aagtcccgga aacaccg（配列識別番号５３）、でＰＣＲを使用して行われた。
【０１７５】
前記改変ＯＰＲＫレセプターコード領域をＥｃｏＲＩとＢｓｓＨＩＩで切断し、ＡＶＰＲ２ Ｃ−末端尾部−低効率開裂部位−ｔＴＡフラグメントを、ＢｓｓＨＩＩとＸｈｏＩで切断した。両フラグメントを、前記改変ＯＰＲＫレセプター配列を含むプラスミドに連結し、予めＥｃｏＲＩとＸｈｏＩによって消化しておいた、Ａｓｐ７１８（５’）とＸｈｏＩ（３’）でｐｃＤＮＡ３．１＋にクローニングした。
【０１７６】
クローン４１細胞を、前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ融合構造物と、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのＵ−６９５９３、ＯＰＲＫのアゴニスト、を使用して解析を行った。Ｕ−６９５９３に対する最大反応で、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の約１２倍の誘導が得られた。
【０１７７】
例１７
この実験は、マルチプレックス形態を同時に使用して二つの検定レセプターの活性を測定する解析の使用を示すように構成された。
【０１７８】
クローン４１細胞と、ｔＴＡ−依存性プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子の安定的な組み込みを含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ラインである「クローン１Ｈ１０」細胞とのそれぞれを、２４−ウェルの培養皿にプレーティングし、キメラＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ又は上述のＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ融合構造物のそれぞれと、一過性にトランスフェクトした。これら一過性トランスフェクションは、各ウェル当たり、１００μｌの培地と、０．４μgのＤＮＡと、２μｌのＦｕＧｅｎｅ試薬を使用して行われた。２４時間のインキュベーションの後、ＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡを発現するクローン４１細胞とＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡを発現するクローン１Ｈ１０細胞とを、トリプシン処理し、同量で混合し、９６ウェルプレートの１２のウェルに再プレーティングした。三つ組のウェルを、薬剤の添加無しでインキュベートするか、もしくは、１μＭのイソプロテレノール、１μＭのドーパミン、又は１μＭの両アゴニストの混合物、のいずれかで即座に処理した。細胞を、リガンド添加後、約２４時間で、レポーター遺伝子活性について解析した。培地を捨て、細胞を、４０μｌの溶解緩衝液［１００ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ７．８，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］中に溶解し、細胞溶解物を、ベータ−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼ活性について、市販の発光検出用試薬を使用して解析した。
【０１７９】
その結果が図５Ａと５Ｂとに示されている。イソプロテレノールでの処理によって、ベータ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性の約７倍の誘導が起こったのに対して、ルシフェラーゼ活性は変化しないままであった。ドーパミンでの処理によってルシフェラーゼ活性の３．５倍の誘導が起こったのに対して、ベータ−ガラクトシダーゼ活性は変化しないままであった。イソプロテレノールとドーパミン両方での処理は、ベータ−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼ活性の７倍、及び３倍の誘導がそれぞれ起こった。
【０１８０】
例１８
この実験は、マルチプレックス形態を同時に使用して二つの検定レセプターの活性を測定する解析の使用を説明するように構成された。
【０１８１】
クローン４１細胞の誘導体であり、安定的に組み込まれたＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質遺伝子を含む、「クローン３４．９」細胞を、上述したＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合構造物と一過性にトランスフェクトした。これと平行して、ｔＴＡ−依存性プロモーターの制御下で安定的に組み込まれたルシフェラーゼ遺伝子を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ラインである「クローンＨＴＬ５Ｂ８．１」細胞を、上述のＡＤＲＢ−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合構造物と一過性にトランスフェクトした。各ケースにおいて、５ｘ１０５の細胞を、６ウェル皿の各ウェルにプレーティングし、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８、及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ、０．５μgのＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ ＤＮＡと、２．５μｌのＦｕｇｅｎｅ（「クローン３４．９細胞」）で、又は、１００μｌのＤＭＥＭ、０．５μgのＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ ＤＮＡ，０．５μｌのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼＤＮＡ及び５μｇのＦｕｇｅｎｅ（「クローンＨＴＬ ５Ｂ８．１細胞」）で、一過性にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトされた細胞を、約２４時間培養し、次に、トリプシン処理し、等量で混合し、９６ウェルプレートのウェルに再プレーティングした。細胞を、１０μＭ−Ｕ−６９５９３、１０μＭのイソプロテレノール又はこれら両方のアゴニストの１０μＭの混合物、での処理の前に２４時間インキュベートした。各実験条件において１６のウェルを解析した。２４時間後、細胞を溶解し、そしてベータ−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性を上述のように解析した。その結果を図６に示す。Ｕ−６９５９３での処理によって、ベータ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性の約１５倍の誘導が起こったのに対して、ルシフェラーゼ活性は変化しないままであった。イソプロテレノールでの処理ではルシフェラーゼ活性の１４５倍の誘導が行ったのに対して、ベータ−ガラクトシダーゼ活性は変化しないままであった。Ｕ−６９５９３とイソプロテレノールとの両方での処理ではベータ−ガラクトシダーゼとルシフェラーゼ活性の、それぞれ、９倍と１３６倍の誘導が起こった。
【０１８２】
例１９
この例は、本発明の解析における異なる転写因子とプロモーターの使用を示すために行われた。
【０１８３】
ＡＶＰＲ２をコードし、上述したＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏに対する低効率開裂部位を含むアミノ酸リンカーGSENLYFQLR（配列識別番号５４）をコードするＤＮＡ配列にインフレームに融合され、イーストＧＡＬ４タンパク質（GenBank受入番号P04386）（配列識別番号５５）のアミノ酸２−１４７をコードし、その後、リンカー、即ち、配列PELGSASAELTMVF（配列識別番号５６）のリンカーが続き、その後、ネズミ核因子カツパ−Ｂ鎖ｐ６５タンパク質（GenBank受入番号A37932）（配列識別番号５７）のアミノ酸３６８−５４９が続くＤＮＡ配列にインフレーム融合された、融合構造物を作成した。前記ＣＭＶプロモーターを、ＡＶＰＲ２コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＧＡＬ４−ＮＦｋＢ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４と命名した。
【０１８４】
ＨＵＬ ５Ｃ１．１は、市販されているｐＦＲ−ＬＵＣ、ＧＡＬ４上流側活性化配列（ＵＡＳ）の制御下で安定的に組み込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の誘導体である。
【０１８５】
このＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４プラスミドを、上述したβ−アレスチン２−ＴＥＶ Ｎ１ａプロテアーゼと、ＨＵＬ ５Ｃ１．１細胞にコトランスフェクトした。約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を、次の日、５０％のコンフルエンシーに達するまで培養し、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、８５μｌのＤＭＥＭと、０．１μｇのＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−Ｎｉａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４ＤＮＡと、０．１μgのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ Ｎ１ａプロテアーゼＤＮＡと、１μｌのＦｕｇｅｎｅからなる各ウェル当たり１０μｌの混合物で、トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を１０μＭのバソプレッシンでの処理の前に、約１６時間培養した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。これらの条件下において、バソプレッシンでの処理によって、レポーター遺伝子活性の１８０倍の増加が行った。
【０１８６】
例２０
このセットの実験は、相互作用タンパク質の親和性を増加させるように構成された他のレセプター改変体を使用した解析の増強を示すために行われた。この例において、検定レセプターのＣ末端尾部ドメインが、下記のレセプターの１つの対応の尾部ドメインと置換された。即ち、アペリン（ａｐｅｌｉｎ） Ｊレセプター−ＡＧＴＲＬ１（受入番号NM_005161（配列識別番号５８）、ガストリン遊離ペプチドレセプター−ＧＲＰＲ（受入番号NM_005314）（配列識別番号５９）、プロテイナーゼ活性化レセプター２−Ｆ２ＲＬ１（受入番号NM_005242）（配列識別番号６０）、ＣＣＲ４（受入番号NM_005508）（配列識別番号６１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）レセプター４−ＣＸＣＲ４（受入番号NM_003467）（配列識別番号６２）及びインターロイキン８レセプター、ベータ−ＣＸＣＲ２／ＩＬ８ｂ（受入番号NM_001557）（配列識別番号６３）。
【０１８７】
先ず、ＰＣＲを使用して、上述のレセプターのＣ末端尾部をコードするＤＮＡフラグメントを作成した。これらのフラグメントは、最初の二つのアミノ酸（Ａｌａ，Ａ及びＡｒｇ，Ｒ）が、ＢｓｓＨＩＩ制限部位によってコードされるように構成された。
【０１８８】
前記ＡＧＴＲＬ１ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg gccagagcag gtgcgca（配列識別番号６４）、及び、
gaggatccgt caaccacaag ggtctc（配列識別番号６５）、で増幅した。
【０１８９】
。
前記ＧＲＰＲ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg gcctgatcat ccggtct（配列識別番号６６）、及び、
gaggatccga cataccgctc gtgaca（配列識別番号６７）、で増幅した。
【０１９０】
前記Ｆ２ＲＬ１ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgca gtgtccgcac tgtaaagc（配列識別番号６８）、及び、
gaggatccat aggaggtctt aacagt（配列識別番号６９）、で増幅した。
【０１９１】
前記ＣＣＲ４ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg gcctttttgt gctctgc（配列識別番号７０）、及び、
gaggatccca gagcatcatg aagatc（配列識別番号７１）、で増幅した。
【０１９２】
前記ＣＸＣＲ２／ＩＬ８ｂ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg gcttgatcag caagggac（配列識別番号７２）、及び、
gaggatccga gagtagtgga agtgtg（配列識別番号７３）、で増幅した。
【０１９３】
前記ＣＸＣＲ４ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg ggtccagcct caagate（配列識別番号７４）、及び、
gaggatccgc tggagtgaaa acttga（配列識別番号７５）、で増幅した。
【０１９４】
これらのレセプターの改変Ｃ−末端尾部ドメインをコードする得られたＤＮＡフラグメントを、ＢｓｓＨＩＩとＢａｍＨＩで切断し、フラグメントを、ＯＰＲＫレセプターコード領域にインフレームで連結し、前述したＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ発現構造物中で、ＡＶＰＲ２−Ｃ−末端尾部フラグメントと置換した。
【０１９５】
前述したＨＴＬ５Ｂ８．１細胞を、上述した改変ＯＰＲＫコード領域−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ構造物、及びβ−アレスチン２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ融合物のそれぞれで、コトランスフェクトした。１ウェル当り約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、次の日５０％のコンフルエンシーに達するまで増殖させ、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、８５μｌのＤＭＥＭ、０．２５μｇのＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４ ＤＮＡと、０．２５μｇのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼＤＮＡ、及び２.５μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質及びその他の物質を含む専売のトランスフェクション試薬）とからなる、各ウェル当たり１０μｌの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を１０μＭのＵ−６９５９３での処理の前に、約１６時間培養した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。これらの条件下において、Ｕ−６９５９３での処理によって、前記改変ＯＰＲＫレセプターのそれぞれにおいて、レポーター遺伝子活性の下記の相対的増加が生じた。即ち、ＯＰＲＫ−ＡＧＴＲＬ１ Ｃ−末端尾部−３０倍、ＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ Ｃ−末端尾部−３１２倍、ＯＰＲＫ−Ｆ２ＲＬ１ Ｃ−末端尾部−６９．５倍、ＯＰＲＫ−ＣＣＲ４ Ｃ−末端尾部−３．５倍、ＯＰＲＫ−ＣＸＣＲ４ Ｃ−末端尾部−９．３倍、ＯＰＲＫ−ＩＬ８ｂ Ｃ−末端尾部−１１３倍。
【０１９６】
例２１
この実験は、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質を安定的に発現する細胞ラインを作成するように構成された。
【０１９７】
ＥＦ１αプロモーターの制御下でＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質を発現するとともに、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターの制御下でハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドを作成した。
【０１９８】
このプラスミドを、ＨＴＬ５Ｂ８．１にトランスフェクトし、このプラスミドの安定ゲノム組み込みを含むクローンを、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下での培養によって選択した。耐性クローンを単離、及び拡張し、上述したＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡプラスミドのトランスフェクションによってスクリーニングした。この手順を使用して選択された三つの細胞ラインを、“ＨＴＬＡ ４Ｃ２．１０”，“ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６”及び“ＨＴＬＡ ５Ｄ４”と命名した。各ウェルに対して約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８，３μｇ／ｍｌのピューロマイシン、及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、次の日５０％のコンフルエンシーに達するまで増殖させ、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、８５μｌのＤＭＥＭ、０．２５μｇのＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４ ＤＮＡ、０．５μｌのＦｕｇｅｎｅとからなる、各ウェル当たり１０μｌの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を１０μＭのイソプロテレノールでの処理の前に、約１６時間培養した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。これらの条件下において、イソプロテレノールでの処理によって、前記三つの細胞ラインにおいて、レポーター遺伝子活性の、それぞれ、１１２倍（“ＨＴＬＡ ４Ｃ２．１０”）、５６倍（“ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６”）及び１８０倍（“ＨＴＬＡ ５Ｄ４”）のそれぞれ増加が得られた。
【０１９９】
例２２
この実験は、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼと、ＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合タンパク質とを安定的に発現する細胞ラインを作成するように構成された。
【０２００】
前記ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼプラスミドを、上述したＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合タンパク質プラスミドとともに、ＨＴＬ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトし、これらプラスミドの安定ゲノム組み込みを含むクローンを、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下での培養によって選択した。耐性クローンを単離、及び拡張し、１０μＭのイソプロテレノールでの処理によってスクリーニングし、レポーター遺伝子の誘導を上述したように測定した。この手順を使用して選択された三つの細胞ラインを、“ＨＴＬＡＲ １Ｅ４”，“ＨＴＬＡＲ １Ｃ１０”及び“ＨＴＬＡＲ ２Ｇ２”と命名した。イソプロテレノールでの６時間の処理によって、前記三つの細胞ラインにおいて、それぞれ、２０８倍（“ＨＴＬＡＲ １Ｅ４”），１９７倍（“ＨＴＬＡＲ １Ｃ１０”）及び３９０倍（“ＨＴＬＡＲ ２Ｇ２”）のレポーター遺伝子活性の増加が得られた。
【０２０１】
例２３
この実験は、レセプターチロシンキナーゼ上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の活性を測定するための解析の使用を説明するために構成された。
【０２０２】
上述した、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、G enBank受入番号NM_005228（配列識別番号７６）として入手可能な、ヒトＥＧＦＲをコードするＤＮＡを含む第１融合構造物を作成した。これらの配列の間には、上述した、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏのための低効率開裂部位，ＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号７７）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記上皮増殖因子レセプターコード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ｔＴＡ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡと命名する。
【０２０３】
上述した、成熟ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、アミノ酸５３８〜７５９（GenBank受入番号NP_002651.2）（配列識別番号７８）と、アミノ酸２０４０〜２２７９（GenBank受入番号AAA47910）（配列識別番号７９）とにそれぞれ対応する、ヒト ホスホリパーゼＣ ガンマ １の二つの２Ｈ２ドメインをコードするＤＮＡを含む、第２融合構造物を作成した。これらの配列の間には、アミノ酸ＮＳＳＧＧＮＳＧＳ（配列識別番号８０）をコードするリンカーＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記ＰＬＣ−ガンマ ＳＨ２ドメインのコード配列の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ配列の下流側に配置した。この構造物を、ＰＬＣ ガンマ １−ＴＥＶと命名する。
【０２０４】
前記ＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡとＰＬＣ ガンマ １−ＴＥＶの融合構造物を、上述したクローンＨＴＬ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトした。約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を、次の日５０％のコンフルエンシーに達するまで増殖させ、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、１００μｌのＤＭＥＭ、０．４μｇのｐｃＤＮＡ３ ＤＮＡ（「キャリア」ベクターＤＮＡ）、０．０４μｇのＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ ＤＮＡ、０．０４μgのＰＬＣ ガンマ １−ＴＥＶ ＤＮＡ、２μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質及びその他の物質を含む専売のトランスフェクション試薬）とからなる、各ウェル当たり１５μｌの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、特定のレセプターアゴニスト及びインヒビターでの処理の前に、約１６時間培養した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。その結果を図７に示す。
【０２０５】
２．５ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（このリガンドに対するＥＣ８０に対応）の添加によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の１２．３倍の増加が得られたのに対して、１００ｎｇ／ｍｌのヒト形質転換増殖因子−アルファの添加によって１８．３倍の増加が得られた。ヒト上皮増殖因子添加前のチロシンキナーゼインヒビターでの前処理（７０μＭ ＡＧ−４９４；０．３μＭ ＡＧ−１４７８；２ｍＭ ＲＧ−１３００２２）によって、レポーター遺伝子活性の誘導は阻止された。
【０２０６】
例２４
この実験は、ヒトＩ型インターフェロンレセプターの活性を測定するための解析の使用を説明するように構成された。
【０２０７】
上述した、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、GenBank受入番号NM_000629 （配列識別番号８１）として入手可能な、ヒトインターフェロンレセプターＩ（ＩＦＮＡＲ１）（５５７のアミノ酸）をコードするＤＮＡを含む融合構造物を作成した。これらの配列の間には、上述したＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏに対する低効率開裂部位，ＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号８２）コードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記ヒトインターフェロンレセプターＩ（ＩＦＮＡＲ１）コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ｔＴＡ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡと命名する。
【０２０８】
アミノ酸２０４０〜２２７９（GenBank 受入番号AAA47910）（配列識別番号８４）に対応する、上述した、ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列にインフレームに融合された、GenBank受入番号Ｌ４１９４２（配列識別番号８３）として入手可能な、ヒトインターフェロンレセプター２、スプライスバリアント２（ＩＦＮＡＲ２．２）（５１５のアミノ酸）をコードするＤＮＡを使用して第２融合構造物を作成した。これらの配列の間には、アミノ酸配列ＲＳ（Ａｒｇ−Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、ヒトインターフェロンレセプター２（ＩＦＮＡＲ２．２）コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＴＥＶ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶと命名する。
【０２０９】
GenBank受入番号NM_007315（配列識別番号８５）として入手可能なヒト シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）、GenBank受入番号NM_005419（配列識別番号８６）として入手可能なヒト シグナル伝達性転写因子２２（ＳＴＡＴ２）の遺伝子がＣＭＶプロモーター領域の制御下で発現される発現構造物も生成した。これらの構造物を、それぞれ、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１及びＣＭＶ−ＳＴＡＴ２と命名した。
【０２１０】
前記ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡとＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶの融合構造物を、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１とＣＭＶ−ＳＴＡＴ２と共に、上述したＨＴＬ５Ｂ８．１細胞に一過性にトランスフェクトした。約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし及び培養した。２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡ、ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１、及びＣＭＶ−ＳＴＡＴ２ ＤＮＡのそれぞれ１５ｎｇ又は、６０ｎｇの対照ｐｃＤＮＡプラスミドで、各ウェル当たり０．３μｌのＦｕｇｅｎｅと共に、トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、５０００Ｕ／ｍｌのヒトインターフェロン−アルファ又は５０００Ｕ／ｍｌのヒトインターフェロン−ベータでの処理の前、８〜２０時間培養した。インターフェロン添加時、培地を吸引し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、３μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した２９３ ＳＭＦ ＩＩ培地で置換した。インターフェロン処理された細胞を、上述したようにルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を解析する前に、更に１８〜２０時間培養した。結果を図８に示す。５０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−αでの処理によってレポーター遺伝子活性が１５倍増加したのに対して、５０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βでの処理によって１０倍増加した。前記対照プラスミドｐｃＤＮＡ３とトランスフェクトされたＨＴＬ５Ｂ８．１細胞のインターフェロン処理ではレポーター遺伝子活性に効果は無かった。図９は、上述したＩＦＮＡＲ１（ＥＮＬＹＦＱ（Ｌ）−ｔＴａ，ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ，ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２発現構造物でトランスフェクトされたＨＴＬ５Ｂ８．１細胞におけるＩＦＮ−αに対して生成された用量−反応曲線を図示している。
【０２１１】
例２５
この実験は、別の転写因子と別の細胞ラインを使用したヒトＩ型インターフェロンレセプターの活性を測定するための解析の使用を説明すべく構成された。
【０２１２】
上述のＧＡＬ４−ＮＦ−ｋＢ−融合物をコードするＤＮＡ配列にインフレーム融合された、ヒト インターフェロンレセプターＩ（ＩＦＮＡＲ１）をコードするＤＮＡを使用して融合構造物が形成された。これらの配列の間には、上述した、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏに対する低効率開裂部位，ＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号１４）を含む、アミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号８７）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、ヒト インターフェロンレセプターＩ（ＩＦＮＡＲ１）コード領域の上流側に配置し、そして、ポリＡ配列を、ＧＡＬ４−ＮＦ−ｋＢ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ＧＡＬ４−ＮＦ−ｋＢと命名する。
【０２１３】
次に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５つのプラスミド、即ち、ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ＧＡＬ４−ＮＦ−ｋＢ，ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ，ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１，ＣＭＶ−ＳＴＡＴ２、及びｐＦＲ−Ｌｕｃ、ＧＡＬ４−依存プロモーターの制御下でのルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、の混合物と一過性でトランスフェクトした。各ウェル当たり約１．０ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地中でのトランスフェクションの２４時間前、９６ウェルプレートに播種した。次の日、細胞を、各ウェルにつき、１０ｎｇのレポータープラスミド（ｐＦＲ−Ｌｕｃ）と２０ｎｇの上述した発現構造物のそれぞれ、又は、１０ｎｇのレポータープラスミドと８０ｎｇの対照ｐｃＤＮＡ３プラスミドを、各ウェル当たり０．３μｌのＦｕｇｅｎｅと共に、トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、５０００Ｕ／ｍｌのヒト インターフェロン アルファでの処理の前、８〜２０時間培養した。インターフェロン添加時、培地を吸引し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地と置換した。インターフェロン処理された細胞を、上述したようなルシフェラーゼレポーター遺伝子活性について解析する前、更に６時間培養した。結果を図１０に示す。前記レポーター、ＩＦＮＡＲ及びＳＴＡＴ構造物でトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞のＩＦＮ−α処理によってレポーター遺伝子活性が３倍増加したのに対して、前記レポーター及び対照プラスミドでトランスフェクトした細胞のインターフェロン処理ではレポーター遺伝子活性に効果が無かった。
【０２１４】
例２６
この組の実験は、前記相互作用タンパク質に対する検定レセプターの親和性を増加させるように構成されたレセプター改変体を使用する解析の更なる増強を説明すべく行われた。これらの例において、前記検定レセプターと、ＧＲＰＲ（Genbank受入番号NM_005314）（配列識別番号５９）のＣ末端尾部ドメインとの間の融合接合部を、前記第７膜貫通螺旋の端部の保存ＮＰＸＸＹモチーフの後のアミノ酸１７〜２３として作成した。
【０２１５】
先ず、ＰＣＲを使用して、推定パルミトイル化部位の後の二つのアミノ酸から始まるＧＲＰＲからＣ末端４２のアミノ酸をコードするＤＮＡフラグメント（以後、ＧＲＰＲ ４２ａａと称する）を作成した。前記フラグメントは、Ｃ末端尾部の最初のアミノ酸の前に、ＴＣＴＡＧＡのＸｂａＩ制限部位によってコードされる二つのアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｓ及びＡｒｇ，Ｒ）があり、終止コドンが、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣによってコードされる二つのアミノ酸（Ｇｌｙ，Ｇ及びＳｅｒ，Ｓ）によって置換されるように構成された。これは、プライマー、
tctagaggcctgatcatccggtctcac（配列識別番号８８）、及び、
gaggatccgacataccgctcgtgaca（配列識別番号６７）、でＧＲＰＲコード領域を含むプラスミドを増幅することによって達成された。
【０２１６】
次に、ＯＰＲＫ（Genbank受入番号NM_000912）（配列識別番号５１）のコード領域をＰｒｏ−３４７の後に、ＸｂａＩ部位を挿入するように改変した。これは、プライマー、
ggtctacttgatgaattcctggcc（配列識別番号５２）、及び、
tctagatggaaaacagaagtcccggaaac（配列識別番号８９）、でのＰＣＲを使用して行われた。
【０２１７】
更に、ＡＤＲＡ１Ａ（Genbank受入番号NM_000680）（配列識別番号９０）のコード領域を、Ｌｙｓ−３４９の後にＸｂａＩ部位を挿入するように改変した。これは、プライマー、
ctcggatatctaaacagctgcatcaa（配列識別番号９１）、及び、
tctagactttctgcagagacactggattc（配列識別番号９２）、でＰＣＲを使用して行われた。
【０２１８】
更に、ＤＲＤ２（Genbank受入番号NM_000795（配列識別番号３７）のコード領域を、二つのアミノ酸（Ｌｅｕ及びＡｒｇ）とＣｙｓ−３４３の後にＸｂａＩ部位とを挿入するように改変した。これは、プライマー、
gaattcatggatccactgaatctgtcc（配列識別番号３８）、及び、
tctagatcgaaggcagtggaggatcttcagg（配列識別番号９３）、でＰＣＲを使用して行われた。
【０２１９】
前記改変ＯＰＲＫレセプターコード領域をＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで切断し、前記ＧＲＰＲ ４２ａａＣ−末端尾部フラグメントをＸｂａＩとＢａｍＨＩとで切断した。両フラグメントを、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化しておいた、上述した、ＡＶＰＲ２ Ｃ−末端尾部低効率開裂部位ｔＴＡを備えるＯＰＲＫレセプターを含むプラスミドに連結した。
【０２２０】
前記改変ＡＤＲＡ１Ａレセプターコード領域を、ＥｃｏＲＶとＸｂａＩとで切断し、前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物をＸｂａＩとＸｈｏＩとで切断した。両フラグメントを、ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩとで消化しておいた前記ＡＤＲＡ１Ａレセプターを含むプラスミドに連結した。
【０２２１】
前記改変ＤＲＤ２レセプターコード領域を、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで切断し、そして前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物をＸｂａＩとＸｈｏＩとで切断した。両フラグメントを、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化されたｐｃＤＮＡ６プラスミドに連結した。
【０２２２】
上述したＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μＭ Ｕ−６９５９３、ＯＰＲＫのアゴニスト、を使用して解析を行った。Ｕ−６９５９３に対する最大反応によって、レポーター遺伝子活性の約２００倍の増加が得られた。
【０２２３】
ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μのエピネフリン、ＡＤＲＡ１Ａのアゴニスト、を使用して解析を行った。エピネフリンに対する最大反応によって、レポーター遺伝子活性の約１４倍の増加が得られた。
【０２２４】
ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μＭのドーパミン、ＤＲＤ２のアゴニスト、を使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大反応によって、レポーター遺伝子活性の約３０倍の増加が得られた。
【０２２５】
例２７
この組の実験は、相互作用タンパク質に対する親和性を増大させるように構成された異なる組の検定レセプター改変を使用した解析の更なる増強を証明するために行われた。これらの例において、検定レセプターのＣ末端尾部ドメインが、ＧＲＰＲの内在性のＣ末端尾部ドメインの一部と置換された。
【０２２６】
先ず、ＰＣＲを使用して、切断されたＧＲＰＲ尾部をコードするＤＮＡフラグメント、具体的には、Ｇｌｙ−３４３からＡｓｎ−３６５への２３アミノ酸をコードする配列、を作成した。このフラグメントは、Ｃ末端尾部の最初のアミノ酸の前に、ＸｂａＩ制限部位ＴＣＴＡＧＡによってコードされる二つのアミノ酸（Ｓｅｒ，ＳとＡｒｇ，Ｒ）があり、Ｓｅｒ−３６６が、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣによってコードされる二つのアミノ酸（Ｇｌｙ，ＧとＳｅｒ，Ｓ）によって置換されるように構成された。これは、プライマー、
tctagaggcctgatcatccggtctcac（配列識別番号９４）、及び、
cggatccgttggtactcttgagg（配列識別番号９５）、でＧＲＰＲコード領域を含むプラスミドを増幅することによって達成された。
【０２２７】
次に、前記切断されたフラグメント（以下、ＧＲＰＲ ２３ａａ尾部と称する）を、ＸｂａＩとＢａｍＨＩとで切断し、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化した、上述した低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物に挿入した。
【０２２８】
同様に、前記ＧＲＰＲ ２３ａａ尾部フラグメントを、ＸｂａＩとＢａｍＨＩとで切断し、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化した、上述した低効率開裂部位を含むＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物に挿入した。
【０２２９】
ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ２３ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μＭのＵ−６９５９３、ＯＰＲＫのアゴニスト、を使用して解析を行った。Ｕ−６９５９３に対する最大反応によって、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の約１１５倍の誘導が得られた。
【０２３０】
ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ ２３ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μＭのエピネフリン、ＡＤＲＡ１Ａのアゴニスト、を使用して解析を行った。エピネフリンに対する最大反応によって、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の約１０２倍の誘導が得られた。
【０２３１】
例２８
この実験は、レセプター チロシンキナーゼ インスリン様増殖因子−１レセプター（ＩＧＦ１Ｒ）の活性を測定、具体的には、細胞内シグナリングタンパク質ＳＨＣ１（Ｓｒｃホモロジー２ドメイン−含有トランスフォーミングタンパク質１）のリガンド誘導性の補充をモニタリングすることによって測定、するための解析の使用を示すように構成された。
【０２３２】
上述した、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、GenBank受入番号NM_000875（配列識別番号９６）として入手可能な、ヒトＩＧＦ−１ＲをコードするＤＮＡを含む第１融合構造物を作成した。これらの配列の間には、上述した、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏに対する低効率開裂部位，ＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号８２）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記ＩＧＦ１Ｒコード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ｔＴＡ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡと命名する。
【０２３３】
上述した、成熟ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合されたアミノ酸１〜２３８（GenBank受入番号BC014158）（配列識別番号９７）、アミノ酸２０４０〜２２７９（GenBank受入番号AAA47910）（配列識別番号７９）に対応する、ヒトＳＨＣ１のＰＴＢドメインをコードするＤＮＡを含む、第２融合構造物を作成した。これらの配列の間には、アミノ酸ＮＳＧＳ（配列識別番号９８）をコードするリンカーＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記ＳＨＣ１ ＰＴＢドメインコード配列の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ配列の下流側に配置した。この構造物を、ＳＨＣ１−ＴＥＶと命名する。
【０２３４】
前記ＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡとＳＨＣ１−ＴＥＶの融合構造物を、上述したクローンＨＴＬ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトした。約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８、及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を、次の日５０％のコンフルエンシーに達するまで増殖させ、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、１００μｌのＤＭＥＭと、０.２μgのＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ ＤＮＡ、０．２μｇのＳＨＣ１−ＴＥＶ ＤＮＡ、２μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質及びその他の物質を含む専売のトランスフェクション試薬）とからなる、各ウェル当たり１５μｌの混合物で、トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を特定のレセプターアゴニストでの処理の前に、約１６時間培養した。２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。
【０２３５】
１μＭのヒトインスリン様成長因子１の添加によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の９０倍の増加が得られた。
【０２３６】
例２９
この実験は、正常に膜結合しない二つの検定タンパク質の相互作用を測定する解析の使用を説明するように構成された。この例において、前記解析を使用して、核ステロイドホルモンレセプター、ＥＳＲ１（エストロゲンレセプター１またはＥＲアルファ）、及びＥＳＲ２（エストロゲンレセプター２又はＥＲベータ）のリガンド誘導性の二量化を測定した。この例において、ＥＳＲ１は、転写因子ｔＴＡに融合され、他方、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏプロテアーゼの開裂部位を、ＥＳＲ１とｔＴＡ配列の間に挿入する。このＥＳＲ１−ｔＴＡ融合物を、前記膜貫通タンパク質ＣＤ８の前記細胞内、Ｃ−末端への融合によって前記膜に係留させる。ＣＤ８は、本質的に、ＥＳＲ１を細胞膜の細胞質側に係留する不活性足場（scaffold）として作用する。それに融合された転写因子は、ＥＳＲ２とプロテアーゼとの相互作用までは、核に入ることができない。任意の膜貫通タンパク質を使用することが可能であろう。このＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ ＮＩａ Ｐｒｏ開裂−ｔＴＡ融合タンパク質は、ｔＴＡ−依存性レポーター遺伝子を含有する細胞ラインにおいて、ＥＳＲ２とＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏプロテアーゼとから成る第２融合タンパク質と共に、発現される。ＥＳＲ１とＥＳＲ２とのエストロゲン誘導性の二量化は、それによって、膜結合融合物からのｔＴＡ転写因子の遊離を誘因し、これが、その後のレポーター遺伝子活性の誘導によって検出される。
【０２３７】
Genbank受入番号NM_000125（配列識別番号１００）として入手可能な、ヒトＥＳＲ１（５９６のアミノ酸）をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、Genbank受入番号NM_001768（配列識別番号９９）として入手可能な、ヒトＣＤ８遺伝子（２３５のアミノ酸）をコードするＤＮＡを含む融合構造物を作成した。これらの配列の間には、前記アミノ酸配列ＧＲＡ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。次に、これによって得られた構造物を、上述したテトラサイクリン制御トランスアクチベーターｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合する。これらの配列の間には、上述したＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏの低効率開裂部位，ＥＮＬＦＱＬ（配列識別番号１４）を含む、アミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号８２）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを前記ヒトＣＤ８コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ｔＴＡ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡと命名する。
【０２３８】
アミノ酸２０４０〜２２７９（GenBank受入番号AAA47910）（配列識別番号８４）に対応する、上述した、前記ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、Genbank受入番号NM_001437（配列識別番号１０１）で入手可能な、ヒトエストロゲンレセプターベータ（ＥＳＲ２）（５３０のアミノ酸）をコードするＤＮＡを使用して第２融合構造物を作成した。これらの配列の間には、アミノ酸ＲＳ（Ａｒｇ−Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーター領域を、前記ヒトエストロゲンレセプターベータ（ＥＳＲ２）コード配列の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＴＥＶ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＥＳＲ２−ＴＥＶと命名する。
【０２３９】
前記ＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡとＥＳＲ２−ＴＥＶの融合構造物を、ｐＣＤＮＡ３と共に、上述したＨＴＬ５Ｂ８．１細胞に一過性にトランスフェクトした。約２．０ｘ１０４の細胞を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに蒔種し、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した無フェノールＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間のインキュベーション後、細胞を、各ウェル当たり、５ｎｇのＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡと、１５ｎｇのＥＳＲ２−ＴＥＶと、４０ｎｇのｐＣＤＮＡ３との混合物と、０３μｌのＦｕｇｅｎｅと共にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、５０ｎＭ １７−β−エストラジオールでの処理の処理の前、２４時間、血清無しで、１００μｌの無フェノールＤＭＥＭ中でインキュベートした。リガンド処理された細胞を、上述したようにルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を解析する前に、更に１８〜２０時間培養した。５０ｎＭの１７−β−エストラジオールでの処理によって、レポーター遺伝子活性の１６倍の増加が得られた。
【０２４０】
本発明のその他の特徴は、当業者には明らかであろうから、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】一例として、リガンド−レセプター結合を使用する本発明の概念的基礎を示す図。
【図２ａ】アゴニストとアンタゴニストとの両方に対して、本発明による解析の標的の反応が用量依存性であることを示す図。
【図２ｂ】アゴニストとアンタゴニストとの両方に対して、本発明による解析の標的の反応が用量依存性であることを示す図。
【図３】用量反応曲線が、別の標的と別のアゴニストでも生じることを示す図。
【図４】Ｄ２ドーパミンレセプターを使用した、本発明によって得られた結果を示す図。
【図５ａ】二つの分子を同時に研究することが可能であることを示す解析の結果を示す図。
【図５ｂ】二つの分子を同時に研究することが可能であることを示す解析の結果を示す図。
【図６】別の「マルチプレックス」解析、即ち、二つの分子が同時に研究される解析の結果を示す図。
【図７】ＥＧＦＲ活性を測定する解析から得られたデータを示す図。
【図８】ヒトＩ型インターフェロンレセプターの活性を測定するように構成された、本発明による解析から得られたデータを示す図。
【図９】図７を作り出すのに使用された細胞におけるＩＦＮ−αの用量反応曲線を図示し、図７の結果をより詳細に示す図。
【図１０】別の転写因子と別の細胞ラインが使用された別の実施例の結果を示す図。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、対象分子間の相互作用を測定するための方法に関する。詳しくは、本発明は、細胞内におけるレポーター遺伝子の活性化を測定することによって、前記検定化合物と称される特定の物質が、二つ以上の特定の対象タンパク質間の相互作用を調節するか否かの測定に関し、ここで、前記調節又はその不在から、前記活性化、又はその欠如が起こる。前記測定は、トランスフォーム細胞又はトランスフェクション細胞を使用して行われ、これらのトランスフォーム細胞及びトランスフェクション細胞、更に、それらをトランスフォーム又はトランスフェクトするのに使用される薬剤も本発明の特徴を構成する。
【背景技術】
【０００２】
背景と関連技術
レセプターのリガンドの同定によって例示される、タンパク質／タンパク質相互作用の研究が非常に注目されている。所与のレセプターに対する１つ又は複数のリガンドが既知であるとしても、より効果的な、又はより選択性の高いリガンドを同定することには利益がある。以下、このような方法で研究することが可能なクラスのタンパク質の非限定的具体例としてＧＰＣＲについてここでは説明する。
【０００３】
Ｇタンパク質共役レセプター、以後、“ＧＰＣＲ”と言う、は、ヒトに関して知られている最大のクラスの細胞表面レセプターである。ＧＰＣＲによって認識されるリガンドには、ホルモン、神経伝達物質、糖蚤白質、脂質、ヌクレオチド及びイオンが含まれる。それらは、光、嗅覚、フェロモン、及び味覚に対するレセプターとしても作用する。これらの多様な役割からして、それらが、種々の条件下で有用な薬剤を求める鋭意研究の対象となっていることは恐らく驚くべきことではない。その成功率は驚異的である。事実、ハワード（Howard）ほか, Trends Pharmacol. Sci., 22:132-140（2001）は、市販の薬剤の５０％以上がそのようなレセプターに対して作用するものである、と推定している。ここで「ＧＰＣＲ」と称するものは、第７膜貫通型ドメイン（７ＴＭ）構造によって特徴付けられるＧＰＣＲのスーパーファミリーレセプターの任意のメンバーを指す。これらのレセプターの具体例は、非限定的に、クラスＡ又は「ロドプシン様」レセプター、クラスＢ又は「セクレチン様」レセプター、クラスＣ又は「代謝調節型グルタミン酸様」レセプター、Frizzled and Smoothened関連レセプター、接着レセプターファミリー、又はＥＧＦ−７ＴＭ／ＬＮＢ−７ＴＭレセプター、アディポネクチンレセプター及びそれに関連のレセプター、及び、嗅覚、味覚、鋤鼻及びフェロモン関連レセプターを含む化学感受性レセプター、を含む。例として、ヒトのＧＰＣＲスーパーファミリーは、非限定的に、Vassilatisほか Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:4903-4908（2002）、タケダ（Takeda）ほか, FEBS Letters, 520:97-101 （2002）、フレデリックソン（Fredricksson）ほか, Mol. Pharmacol., 63:1256-1272（2003）; グルスマン（Glusman）ほか, Genome Res., 11:685-702 （2001）; 及びゾズーリャ（Zozulya）ほか, Genome Biol., 2:0018.1-0018.12（2001）、を含み、これらの全てをここに参考文献として合体させる。
【０００４】
ＧＰＣＲ機能による作用の機序がある程度明らかにされている。簡単に説明すると、ＧＰＣＲがリガンドに結合すると、高次構造の変化が起こり、細胞生理機能における変化をもたらすカスケードの反応を刺激する。ＧＰＣＲは、細胞内、ヘテロ三量体のグアニンヌクレオチド結合タンパク質、又は“Ｇタンパク質”の活性を変化させることによってシグナルを伝達するものである、と考えられている。リガンドとレセプターとの複合体は、グアニンヌクレオチドの交換と、Ｇタンパク質ヘテロ三量体のα及びβγサブユニットへの解離を刺激する。
【０００５】
ＧＴＰ−結合αサブユニットとβγ二量体との両方が、アデニリルシクラーゼとホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を含む、種々の細胞作動性タンパク質を調節するべく作用することができる。従来のＧＰＣＲの細胞に基づく解析では、レセプター活性を、アデニリルシクラーゼによって作り出されるｃＡＭＰの蓄積などのＧタンパク質調節性作動経路の出力、又は、ＰＬＣ活性によって刺激される細胞内カルシウムの遊離を測定することによってモニタする。
【０００６】
従来のＧタンパク質に基づくシグナル伝達解析は、二つの主要な問題により、いくつかの標的用に開発することが困難であった。
【０００７】
第１に、異なるＧＰＣＲが異なるＧタンパク質調節性シグナル伝達経路に結合し、Ｇタンパク質に基づく解析は、標的レセプターの特定の作用又は経路への共役を強要するために、標的レセプターのＧタンパク質特異性を知っていることに依存するか、若しくは、細胞系の操作（engineering）を必要とする。第２に、全ての細胞は、多数の内在性ＧＰＣＲ、又、その他のシグナル伝達因子を発現する。その結果、測定される作動経路は、標的ＧＰＣＲの他に、他の内在性分子によっても調節されるかもしれず、それによって誤った結果を導く可能性がある。
【０００８】
Ｇタンパク質活性の調節が、リガンド／ＧＰＣＲ結合の唯一の結果であるわけではない。共にここに参考文献として合体させるルットレル（Lu ttrell）ほか, J. Cell Sci., 115:455-465（2002）と、ファーガソン（Ferguson）, Pharmacol., Rev., 53:1-24（2001）、は、ＧＰＣＲシグナルの終結をもたらすその他の活性を検討している。これらの終結プロセスは、過剰な細胞刺激を防止し、細胞外シグナルとそれに対応する細胞内経路との間の一時的な連鎖を強制する。
【０００９】
アゴニストのＧＰＣＲへの結合の場合、ＧＰＣＲ分子のＣ末端のセリンとトレオニン残基がリン酸化される。このリン酸化は、ＧＰＣＲキナーゼ、又は“ＧＲＫ”、ファミリーによって引き起こされる。アゴニスト複合、Ｃ末端リン酸化ＧＰＣＲは、レセプターシグナル伝達を「抑止（arrest）」するアレスチン ファミリーのメンバーと相互作用する。この結合によって、レセプターがＧタンパク質に共役することが抑制され、それによってレセプターが内部移行のために標的化され、その後、分解および／又は再循環が起こる。従って、リガンドのＧＰＣＲへの結合が、ＧＰＣＲとアレスチンタンパク質との間の相互作用を「調節する」ということができる。なぜなら、リガンドのＧＰＣＲへの結合がアレスチンをＧＰＣＲに結合させ、これによって、その活性を調節するからである。以後、「モジュレーター」又はそのいずれかの形態が使用される場合、それは、単純に、本発明の二つのタンパク質が、検定化合物の存在下において、この検定化合物の不在下におけるこれら二つのタンパク質の相互作用との比較において、相互作用する何らかの変化を言うものとする。例えば、前記検定化合物の存在は、二つのタンパク質の相互作用を強化又は促進、あるいはそれを弱化、抑制、又はなんらかの方法、態様又は形態で減少させ、それをその後検出可能とするかもしれない。
【００１０】
この背景情報から、ＧＰＣＲの活性化及び抑制を解析するための別の方法が導かれた。これらの方法は、アレスチンとの相互作用をモニタリングすることを含む。この方法の大きな利点は、Ｇタンパク質経路の知識が不要であることである。
【００１１】
ここに参考文献として合体される、オークレイ（Oakley）ほか, Assay Drug Dev. Technol, 1:21-30（2002）及び米国特許第５，８９１，６４６、及び６，１１０，６９３号は、活性化されたレセプターへの、細胞質の蛍光標識アレスチン分子の再分布が測定される解析について記載している。これらの方法は、アレスチンの再局在化とレセプター活性化を測定するために、細胞の高解像度撮像に依存している。これが複雑な入れ込んだ手続きであることを当業者は認識するであろう。
【００１２】
これらの点を扱ったその他種々の米国特許及び特許出願も発行、出願されている。例えば、ボーン（Bohn）ほかの米国特許第６，５２８，２７１号は、疼痛管理薬剤をスクリーニングする解析を扱っており、ここでは、β−アレスチンのインヒビターが測定されている。第２００４／０００２１１９，２００３／０１５７５５３，２００３／０１４３６２６、及び２００２／０１３２３２７号等の公開米国特許出願も、すべて、ＧＰＣＲに関する種々の形態の解析について記載している。公開出願第２００２／０１０６３７９号は、下記の例に使用される構造物（construct）を記載している。但し、それはここに記載される本発明を教示、示唆するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、特定のタンパク質／タンパク質相互作用のモジュレーターのモニタリングおよび／又は測定のための、より単純な解析を開発することにあり、ここでは、前記タンパク質は、非限定的に、レセプター、特にＧＰＣＲ等の膜結合タンパク質を含む。これがいかにして達成されるかは以下の例から理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
従って、本発明によれば、検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するための方法が提供され、この方法は、前記化合物を、（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部のための開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記細胞内においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ａ）と、（ｉ）前記検定化合物の存在下における前記第１検定タンパク質に対するその相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ｂ）とでトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞に接触させる工程と、前記レポーター遺伝子の活性を、前記化合物が前記タンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かの測定として、測定する工程とを含む。
【００１５】
前記第１検定タンパク質は、膜結合タンパク質、特に、ＧＰＣＲ、等の膜貫通レセプターとすることができる。具体的な膜貫通レセプターとしては、β２−アドレナリン作動性レセプター（ＡＤＲＢ２）、アルギニンバソプレッシンレセプター２（ＡＶＰＲ２）、セロトニンレセプター１ａ（ＨＴＲ１Ａ）、ｍ２ムスカリン性アセチルコリンレセプター（ＣＨＲＭ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター５（ＣＣＲ５）、ドーパミンＤ２レセプター（ＤＲＤ２）、カッパーオピオイドレセプター（ＯＰＲＫ）、又はα１ａ−アドレナリン作動性レセプター（ＡＤＲＡ１Ａ）があるが、但し、いずれの場合においても、本発明がこれらの特定の実施例に限定されるものではないと理解される。例えば、チロシンキナーゼであるインスリン成長因子−１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）等の分子や、エストロゲンレセプター１（ＥＳＲ１）やエストロゲンレセプター２（ＥＳＲ２）等の通常は膜結合型ではないタンパク質がある。前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部は、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼとすることができる。前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質は、ｔＴＡやＧＡＬ４等の転写因子とすることができる。前記第２タンパク質は、アレスチンなどの抑制型タンパク質とすることができる。前記細胞は、真核細胞又は原核細胞とすることができる。前記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどの外来性遺伝子とすることができる。
【００１６】
前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第２検定タンパク質との相互作用を増加させるように改変することができる。そのような改変は、非限定的に、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換することを含む。例えば、前記Ｃ末端領域を、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＲＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８ｂ，ＣＣＲ４又はＧＰＣＲのＣ末端をコードするヌクレオチド配列によって置換することができる。
【００１７】
前記方法は、１つ以上の検定化合物を複数の細胞サンプルに接触させる工程を含むことができ、前記サンプルのそれぞれは、前記単数又は複数の検定化合物によって接触され、ここで、前記細胞サンプルのそれぞれが、上述した核酸分子でトランスフォーム又はトランスフェクトされている。そして、前記方法は、前記検定化合物のいずれかが特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するべく前記複数のサンプル中におけるレポーター遺伝子の活性を測定する工程を含むことができる。前記方法は、そのそれぞれがその他すべてと異なる１つの検定化合物を前記サンプルのそれぞれと接触させる工程、又は、前記サンプルのそれぞれを前記複数の検定化合物の混合物と接触させる工程を含むことができる。
【００１８】
別実施例において、検定化合物が単数又は複数の対象のタンパク質相互作用を調節するか否かを測定する方法が提供され、この方法は、前記化合物を複数の細胞サンプルに接触させる工程を含み、前記細胞サンプルのそれぞれが、（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、プロテアーゼのための開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記細胞内においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む第１の核酸分子（ａ）と、（ｉ）前記対象検定化合物の存在下におけるその前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列とを含む第２の核酸分子（ｂ）とを含み、ここで、前記第１検定タンパク質は前記複数のサンプルのそれぞれにおいて他の第１検定タンパク質と異なり、そして、前記方法は、更に、前記複数のサンプルのうちの１つ又は複数における前記レポーター遺伝子の活性を、単数又は複数の対象のタンパク質相互作用の調節の測定として測定する工程を含む。
【００１９】
前記第２検定タンパク質は、各サンプルにおいて異なるもの、又は、各サンプルにおいて同じものとすることができる。前記サンプルのすべてを、共通の容器（receptacle）内で組み合わせることができ、各サンプルは、異なる対の第１及び第２検定タンパク質を含む。或いは、各サンプルを、異なる容器内で検定することができる。所与のサンプル中の前記レポーター遺伝子は、その他のサンプル中のレポーター遺伝子と異なるものとすることができる。検定化合物の前記混合物は、脳脊髄液、尿、血液、血清、膿汁、腹水、滑液、組織抽出物、又は浸出物等の生体試料を含む、又は生体試料内に含まれるもの、とすることができる。
【００２０】
更に別の実施例において、（ｉ）前記第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記細胞中においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ａ）、そして、（ｉ）前記検定化合物の存在下におけるその前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ｂ）とで、トランスフォーム又はトランスフェクトされた組換え細胞が提供される。
【００２１】
前記核酸分子の一方又は両方を、前記細胞のゲノムに安定的に組み込むことができる。前記細胞は、更に、前記レポーター遺伝子によってもトランスフォーム又はトランスフェクトされたものとすることができる。前記第１検定タンパク質は、膜貫通レセプター、特にＧＰＣＲ、等の膜結合タンパク質とすることができる。具体的な膜貫通レセプターは、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、又はＡＤＲＡ１Ａを含む。
【００２２】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部は、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼとすることができる。前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質は、ｔＴＡやＧＡＬ４等の転写因子とすることができる。前記第２タンパク質は、抑制型タンパク質とすることができる。前記細胞は、真核細胞又は原核細胞とすることができる。前記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどの外来性遺伝子とすることができる。前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、たとえば前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換すること等によって、前記第２タンパク質との相互作用を増加させるように改変することができる。前記Ｃ末端領域は、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＲＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ，ＣＣＲ４又はＧＲＰＲのＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列によって置換することができる。
【００２３】
更に別の実施例において、（ｉ）検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む、単離核酸分子を提供する。前記検定タンパク質は、膜貫通レセプターのような、膜結合タンパク質である。膜貫通タンパク質の特定タイプはＧＰＣＲである。特定の膜貫通レセプターとして、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ又はＡＤＲＡ１Ａを含む。プロテアーゼ、又はプロテアーゼの一部は、タバコエッチ病核内封入Ａプロテアーゼであり得る。前記レポーター遺伝子を活性化するタンパク質は、ｔＴＡ又はＧＡＬ４等の転写因子であり得る。上記のように、本発明はこれらの特定の実施形態に限定されるとして理解するものではない。
【００２４】
更に別の実施例において、単離核酸分子を含む発現ベクターが提供され、これは、（ｉ）検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）前記細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含み、更に、プロモーターに操作連結されている。
【００２５】
更に別の実施例において、単離核酸分子が提供され、これは、（ｉ）検定化合物の存在下において別の検定タンパク質とのその相互作用が測定される検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列とを含む。前記検定タンパク質は、アレスチンなどの抑制型タンパク質とすることができる。
【００２６】
また、（ｉ）検定化合物の存在下において別の検定タンパク質とのその相互作用が測定される検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列とを含む単離核酸分子を含む発現ベクターが提供され、前記核酸は、更に、プロモーターに操作連結されている。
【００２７】
更に別の実施例は、以下の発現によって生成される融合タンパク質を含む。
【００２８】
（ｉ）検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列、そして（ｉｉｉ）前記細胞中でのレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、を含み、更に、プロモーターに操作連結されている、単離核酸分子。
【００２９】
または、（ｉ）検定化合物の存在下において別の検定タンパク質とのその相互作用が測定される検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、とを含む、単離核酸分子。
【００３０】
更に別の実施例において、検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するのに有用な検定キットが提供され、これは、以下のそれぞれの分離部分を有する。前記第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む核酸分子（ａ）と、（ｉ）前記検定化合物の存在下における前記第１検定タンパク質とのその相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、とを含む核酸分子（ｂ）と、前記（ａ）及び（ｂ）のそれぞれを互いに対して分離して保持するための容器手段。
【００３１】
前記第１検定タンパク質は、膜貫通レセプター等の膜結合タンパク質とすることができる。１つの具体的タイプの膜貫通レセプターはＧＰＣＲである。具体的な膜貫通タンパク質は、ＧＰＣＲである。具体的な膜貫通レセプターは、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、ＯＰＲＫ、又はＡＤＲＡ１Ａを含む。前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部は、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼとすることができる。前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質は、ｔＴＡやＧＡＬ４等の転写因子とすることができる。前記第２タンパク質は、アレスチンなどの抑制型タンパク質とすることができる。前記キットは、更に、レポーター遺伝子をコードする単離核酸分子の別の部分を含むことができる。前記レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどをコードすることができる。前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、例えば、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換すること等によって、前記第２検定タンパク質との相互作用を増加させるように改変することができる。前記Ｃ末端領域のヌクレオチド配列を、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＲＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ，ＣＣＲ４又はＧＲＰＲのＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列によって置換することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
尚、ここに記載されるすべての方法又は組成物は、ここに記載されるすべての方法又は組成物に関して実施可能であると理解される。クレームおよび／又は明細書中における「含む（comprising）」という用語との“a”や“an”という単語の使用は、“one”（「１つ」）を意味するかもしれないが、「単数又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１つ以上」として意味とも撞着しないものと理解される。
【００３３】
本発明のこれら及びその他の実施例は、以下の説明及び貼付の図面を参照して考慮されることにより、よりよく判断、理解されるであろう。但し、以下の説明は、本発明の種々の実施例及びその多数の具体的詳細を示すものではあるが、これは限定のためではなく例示のために提供されているものである、ということが理解されるべきである。本発明の本質から逸脱することなく、本発明の範囲内において、多くの置換、変更、追加および／又は再構成が可能であり、本発明は、そのような置換、変更、追加および／又は再構成を含むものである。
【００３４】
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、かつ、本発明のいくつかの態様を例示することを意図したものである。本発明は、これらの図面の１つ又は複数をここに提供される具体的実施例の詳細説明と共に参照することによってより良く理解されるであろう。
【００３５】
図１は、一例として、リガンド−レセプター結合を使用する本発明の概念的基礎を図示している。
【００３６】
図２ａ及び２ｂは、アゴニストとアンタゴニストとの両方に対して、本発明による解析の標的の反応が用量依存性であることを示している。
【００３７】
図３は、用量反応曲線が、別の標的と別のアゴニストでも生じることを示している。
【００３８】
図４は、Ｄ２ドーパミンレセプターを使用した、本発明によって得られた結果を図示している。
【００３９】
図５ａ及び５ｂは、二つの分子を同時に研究することが可能であることを示す解析の結果を図示している。
【００４０】
図６は、別の「マルチプレックス」解析、即ち、二つの分子が同時に研究される解析の結果を図示している。
【００４１】
図７は、ＥＧＦＲ活性を測定する解析から得られたデータを示している。
【００４２】
図８は、ヒトＩ型インターフェロンレセプターの活性を測定するように構成された、本発明による解析から得られたデータを示している。
【００４３】
図９は、図７を作り出すのに使用された細胞におけるＩＦＮ−αの用量反応曲線を図示している、図７の結果をより詳細に示している。
【００４４】
図１０は、別の転写因子と別の細胞ラインが使用された別の実施例の結果を示している。
【００４５】
好適実施例の詳細な説明
本発明は、対象物質が、レセプター、例えば、膜貫通レセプター等の膜結合タンパク質などの第１検定タンパク質と、アレスチンファミリーのメンバーなどの第２検定タンパク質との相互作用を調節するか否かを測定するための方法に関する。この方法は、真核細胞又は原核細胞とすることができる細胞を、二つの構造物によってコトランスフォーム又はコトランスフェクトすることを含む。前記第１構造物は、（ｉ）膜貫通レセプターなどの前記第１検定タンパク質と（ｉｉ）プロテアーゼの開裂部位、をコードする配列、そして（ｉｉｉ）レポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードする配列とを含む。前記第２構造物は、（ｉ）前記第１検定タンパク質とのその相互作用が測定される及び／決定される第２検定タンパク質をコードする配列、そして（ｉｉ）前記第１構造物の一部である前記開裂部位に対して作用するのに十分な、プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、を含む。特に好適な実施例において、これらの構造物は、細胞内に安定的に取り込まれる。
【００４６】
本発明の一実施例の特徴が、図１に図示されている。簡単に説明すると、標準技術を使用して、転写因子をコードするＤＮＡを、膜貫通レセプター分子等の研究対象の第１検定タンパク質をコードするＤＮＡに融合させる。この融合は、実験に使用される宿主細胞によって内在性に発現されないプロテアーゼに対する認識開裂部位を含めることによって達成される。
【００４７】
この第１融合タンパク質をコードするＤＮＡは、前記第１検定タンパク質、例えば、前記レセプター、に対して融合された前記転写因子に依存するプロモーター要素の制御下で、それもレポーター遺伝子配列をも含む細胞に導入され、それによって発現される。もしも前記外来性プロテアーゼが存在しないのであれば、前記転写因子は前記第１検定タンパク質に対して係留（tethered）されたまま留まり、核に侵入して前記レポーター遺伝子の発現を刺激することは出来ない。
【００４８】
第２融合タンパク質を作り出すためにも組換え技術を使用することができる。図示されている実施例において、アレスチンファミリーのメンバーをコードするＤＮＡが、前記外来性プロテアーゼをコードするＤＮＡ分子に融合され、これによって、前記第２検定タンパク質、即ち、前記アレスチンファミリーメンバー、を含む第２融合タンパク質が得られる。
【００４９】
次に、解析が行われ、ここで、前記第２融合タンパク質が、前記第１融合タンパク質と共に発現され、検定化合物が、好ましくは、特定の時間、前記細胞と接触される。もしも前記検定化合物が、前記二つの検定タンパク質の相互作用を、例えば、これら第１及び第２検定タンパク質の会合を、刺激、促進又は増強することによって、調節するならば、これによって前記転写因子の遊離が起こり、さらに、この因子が核へと移動して、前記レポーター遺伝子の発現を誘発する。前記レポーター遺伝子の活性が測定される。
【００５０】
別のシステムにおいて、前記二つの検定タンパク質は、前記検定化合物の不在下で相互作用し、検定化合物によってこれら二つの検定タンパク質を解離させ、それらの相互作用を減少又は抑制させることも可能である。そのような場合、前記検定化合物の存在下において、前記細胞中の自由な、機能的に活性である転写因子のレベルが減少し、これによって、タンパク質分解が減少し、レポーター遺伝子の活性の検出可能な減少が起こる。
【００５１】
記載の実施例において、前記第２検定タンパク質である、前記アレスチンタンパク質は、アゴニストの存在下において前記レセプターに結合する。しかし、レセプターは１つのタイプのタンパク質に過ぎないので、前記解析は、レセプター分子の使用に依存せず、又、アゴニスト結合が、関連することが可能な唯一の相互作用であるのでもない。膜貫通タンパク質が注目されることは明らかではあるが、いかなるタンパク質でも十分である。更に、レセプターに対するアゴニストの結合が、解析することが可能な唯一のタイプの結合ではない。本発明によって、アンタゴニスト自身を測定することが可能であり、又、異なるアンタゴニストおよび／又はアゴニストの相対的強度を測定することも可能である。
【００５２】
本発明のその他の詳細は、その課題を製造、使用するための具体的な方法と技術を含むものであり、それらについて以下説明する。
【００５３】
Ｉ．発現構造物とトランスフォーメーション
「ベクター」という用語は、そこでそれが複製することが可能な細胞への導入のためにその中に核酸配列を挿入することが可能なキャリア核酸分子を称するのに使用される。核酸配列は、「外来性」であることができ、これは、それが、その中にベクターが導入される前記細胞に対して異質であること、又は、前記配列が細胞内の配列に対しては同質であるが、宿主細胞核酸内の、その配列が通常は見られない位置にある、ということを意味する。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含む。当業者は、標準組換え技術（例えば、マニアティス（Maniatis）ほか, Molecular Cloning, A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor, 1990）及びオースベル（Ausubel）ほか, 1994, Current Protocols In Molecular Biology（John Wiley & Sons, 1996）ともにここに参考文献として合体させる）によって十分にベクターを構築することができるであろう。
【００５４】
「発現ベクター」という用語は、転写されることが可能なＲＮＡをコードする核酸を含むすべてのタイプの遺伝子構造物を指す。いくつかのケースにおいて、ＲＮＡ分子は、次に、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。他のケースにおいて、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子又はリボザイムの生成において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主細胞中での、操作連結されたコード配列の転写と可能な翻訳とのために必要な核酸配列をいう、種々の「制御配列」を含むことができる。転写と翻訳を制御する制御配列に加えて、ベクターと発現ベクターは、他の機能を果たす、上述したヌクレオチド配列を含むことができる。
【００５５】
いくつかの実施例において、クローニングと遺伝子伝達用に、プラスミドベクターが考えられる。一般に、宿主細胞に適合する種由来のレプリコンと制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主との関連において使用される。前記ベクターは、一般に、複製部位と、トランスフォーム細胞中において表現型選択を提供することが可能なマーキング配列を坦持する。１つの非限定的具体例において、E. coliが、多くの場合、E. coli種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を使用してトランスフォームされる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンとテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、従って、トランスフォーム細胞を同定するための容易な手段を提供する。前記ｐＢＲプラスミド、又は、その他の細菌性プラスミド、又はファージは、更に、例えば、それ自身のタンパク質の発現のために細菌性組織体によって使用可能なプロモーターも含まなければならないか、あるいは、含むように改変されなければならない。
【００５６】
更に、宿主微生物組織に適合するレプリコンと制御配列を含むファージベクターを、これら宿主との関連において、トランスフォームベクターとして使用することが可能である。例えば、ファージラムダＧＥＭＴＭ−１１を、例えば、E. coli. LE392等の宿主細胞、をトランスフォームするために使用可能な組換えファージベクターを作成するのに利用することができる。
【００５７】
前記発現ベクターを含む、例えば、E. coli等の細菌性宿主細胞は、例えばＬＢ等の様々な適当な培地で成長させることができる。ある種のベクター中における前記組換えタンパク質の発現は、当業者によって理解されるように、宿主細胞を、ある種のプロモーターに対して特異的な物質に接触させることによって、例えば、ＩＰＴＧを培地に添加することや、インキュベーションをより高い温度に切り替える、等、によって誘発させることができる。前記細菌を、更に追加時間、一般に、２時間から２４時間、培養した後、前記細胞を、遠心分離によって収集し、残滓の培地を除去するために洗浄する。
【００５８】
多くの原核生物ベクターも、真核生物宿主細胞をトランスフォームするために使用することができる。しかし、真核生物宿主細胞中でタンパク質を発現する特定の目的のために改変されたベクターを選択することが望ましい。そのような細胞中における調節されたおよび／又は高レベルの発現用に発現システムが構成されている。例えば、共にここに参考文献として合体させる米国特許第５，８７１，９８６及び４，８７９，２３６号に記載され、例えば、INVITROGEN（登録商標）からMAXBAC（登録商標）２．０という名前で、そして、CLONTECH（登録商標）からBACKPACK（登録商標） BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMという名前で購入することが可能な、昆虫細胞／バキュロウイルスシステムによって、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を作り出すことが可能である。
【００５９】
発現システムのその他の例としては、STRATAGENE（登録商標）のCOMPLETE CONTROL（登録商標） Inducible Mammalian Expression Systemがあり、これは、合成エクジソン誘導可能レセプター、又はそのｐＥＴ発現システム、E. coli発現システム、を含む。誘導可能発現システムのもう１つの例は、INVITROGEN（登録商標）から入手可能であり、これは、Ｔ−ＲＥＸ（登録商標）（テトラサイクリン調節発現）システム、全長ＣＭＶプロモーターを使用する誘導可能哺乳動物発現システム、を坦持している。INVITROGEN（登録商標）は、更に、Pichia methanolica発現システムと呼ばれる酵母発現システムを提供しており、これは、メチロトローフ酵母、Pichia methanolica中での組換えタンパク質の高レベル産生用に構成されている。当業者は、核酸配列又は、その同族のポリペプチド、タンパク質、又はペプチド、を作り出すためにいかにして、発現構造物等のベクターを発現させるかを理解するであろう。
【００６０】
調節性シグナル
前記構造物は、プロモーター、ポリＡ配列、等の追加の５’および／又は３’要素を含むことができる。これらの要素は、宿主細胞由来、即ち、宿主細胞と同種のものとすることができ、或いは、それらは、別の源由来、即ち、異種のものとすることができる。
【００６１】
「プロモーター」とは、転写の開始と速度とがそこで制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、ＲＮＡポリメラーゼやその他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合して、核酸配列の特定の転写を開始することができる遺伝子要素を含むことができる。「操作配置」、「操作連結」、「制御下」及び「転写制御下」という文言は、プロモーターが、核酸配列に対して、その配列の転写開始および／又は発現を制御するために正しい機能位置および／又は配向にあることを意味する。
【００６２】
プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置決めする作用をする配列を含む。これの最も良く知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジル転移酵素遺伝子のためのプロモーターや、ＳＶ４０後期遺伝子のためのプロモーター等の、ＴＡＴＡボックスが欠如したいくつかのプロモーターにおいて、その開始部位上に位置する別の要素が、それ自身、開始場所の固定に役立つ。追加のプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。通常、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流側領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流側にも機能要素を含むことが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下」に置くために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、その選択されたプロモーターの「下流側」（即ち、その３’）におく。「上流側」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
【００６３】
プロモーター要素間の間隔は多くの場合フレキシブルであるので、要素が反転、又は、互いに対して移動された場合でも、プロモーター機能は保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーター要素間の間隔は、活性が低下し始める前に、５０ｂｐの距離へと増加させることができる。プロモーターによっては、個々の要素が協働的又は独立的に作用して転写を活性化するように機能することができるようである。プロモーターは、「エンハンサー」と共に使用してもよいし、使用しなくてもよく、「エンハンサー」とは、核酸配列の転写活性に関与するシス作動性の調節配列をいう。
【００６４】
プロモーターは、例えば、コードセグメントおよび／又はエクソンの上流側に位置する５’−非コード配列を単離することによって得られるように、核酸分子と自然に会合したものとすることができる。そのようなプロモーターは、「外来性」と称することができる。同様に、エンハンサーも、核酸分子と自然に会合して、その配列の下流側又は上流側のいずれかに位置するものとすることができる。或いは、コード核酸セグメントを、その自然な環境においては核酸分子と正常には会合しないプロモーターである、組換え又は異種プロモーターの制御下に置くことによってある種の利点が得られる。組換え又は異種エンハンサーは、更に、その自然な環境において核酸分子と正常に会合しないエンハンサーも指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、他のいずれかのウイルス、又は原核又は真核細胞から分離したプロモーター又はエンハンサー、そして「自然発生」でない、即ち、異なる転写調節領域の異なる要素、および／又は発現を変える変異、を含むプロモーター又はエンハンサーを含むことができる。例えば、組換えＤＮＡ構造物に最も一般的に使用されるプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステムを含む。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に作り出すことに加えて、配列は、ここに開示される組成物と関連して、組換クローニングおよび／又はＰＣＲ（登録商標）を含む核酸増幅技術を使用することによっても作り出すことができる（ここに参考文献として合体させる米国特許第４，６８３，２０２及び５，９２８，９０６号を参照）。更に、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核オルガネラ内の配列の転写および／又は発現を指令する制御配列も使用することが考えられる。
【００６５】
勿論、発現のために選択された、オルガネラ、細胞タイプ、組織、器官又は、生物内でＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび／又はエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、細胞タイプの組み合わせを知っている（例えば、ここに参考文献として合体させるサムブルック（Sambrook）ほか, 1989を参照）。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質および／又はペプチドの大量生産において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指令するべく、適切な条件下において、構成的、組織特異的、誘導可能および／又は有用なものとすることができる。前記プロモーターは、外来性又は内在性とすることができる。
【００６６】
更に、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、Eukaryotic Promoter Data Base EPDB, www.epd.isb-sib.ch/を参照）も、発現を駆動するために使用することが可能であろう。Ｔ３，Ｔ７又はＳＰ６細胞質発現システムの使用がもう一つの可能な実施例である。真核細胞は、もしも、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部として、又は追加の遺伝子発現構造物として、提供されるのであれば、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【００６７】
コード配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要であるかもしれない。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン又は隣接の配列を含む。前記ＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルを提供する必要があるかもしれない。当業者は、これを容易に判断して必要なシグナルを提供することが可能であろう。インサート全体が確実に翻訳されるようにするためには、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームに対して「イン・フレーム（in frame）」でなければならないことがよく知られている。前記外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然のもの、又は合成のものとすることができる。適当な転写エンハンサー要素を含ませることによって、発現の効率を高めることができる。
【００６８】
本発明のいくつかの実施例において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を使用して、多重遺伝子群、又は多シストロン性メッセージを作り出す。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存翻訳のリボソーム走査モデルを迂回して、内部部位で翻訳を開始することができる（ペルティエ（Pelletier）およびソーネンバーグ（Sonenberg）, Nature, 334:320-325 （1988））。ピコルナウイルスファミリーの二つのメンバー（ポリオと脳心筋炎）からのＩＲＥＳ要素が、哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳ（マセジャック（Macejak）およびサーノウ（Sarnow）, Nature, 353:90-94 （1991））1991）と共に、記載されている（（ペルティエ（Pelletier）およびソーネンバーグ（Sonenberg）、上述）。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに結合させることができる。それぞれがＩＲＥＳによって分離された、複数のオープンリーディングフレームを同時に転写して、多シストロン性メッセージを作り出すことができる。ＩＲＥＳ要素の性質により、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。１つのメッセージを転写するために１つのプロモーター／エンハンサーを使用して、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる（それぞれをここに参考文献として合体させる米国特許第５，９２５，５６５及び５，９３５，８１９号を参照）。
【００６９】
他のベクター配列要素
ベクターは、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができ、これは、そのいずれもが、ベクターを消化するための標準組換え技術で連結可能な複数の制限酵素部位を含んでいる核酸領域である（例えば、ここに参考文献として合体させるカーボネッリ（Carbonelli）ほか, FEMS Microbiol. Lett. 172 （1）: 75-82 （1999）, レヴェンソン（Levenson）ほか, Hum. Gene Ther. 9（8）: 1233-1236（1988）及びコセア（Cocea）, Biotechniques, 23（5）: 814-816（1997）を参照）。「制限酵素消化」とは、核酸分子内の特定の位置においてのみ作用する酵素による、核酸分子の触媒作用的な開裂をいう。これらの制限酵素の多くは、市販されている。そのような酵素の使用は当業者によって広く理解されている。多くの場合、ベクターは、外来性配列をベクターに結合させることを可能にするためにＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して、線形化（linearized）又は断片化される。「連結（ligation）」とは、互いに対して隣接、又は隣接しないものとすることが可能な、二つの核酸フラグメント間にリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう。制限酵素と連結反応に関連する技術は、組換え技術の当業者にとって周知である。
【００７０】
大半の転写された真核ＲＮＡ分子は、一次転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受けることになる。ゲノム真核配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセッシングを確保するために、ドナーおよび／又はアクセプタースプライシング部位を必要とするかもしれない（例えば、ここに参考文献として合体させるチャンドラー（Chandler）ほか1997を参照）。
【００７１】
本発明の前記ベクター又は構造物は、一般に、少なくとも１つの終止シグナルを含む。「終止シグナル」又は「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特定の終止に関連するＤＮＡ配列を含む。従って、いくつかの実施例において、ＲＮＡ転写物の生成を終止させる終止シグナルが考えられる。所望のメッセージレベルを達成するためにターミネーターが生体内で必要とされるかもしれない。
【００７２】
真核システムにおいて、前記ターミネーター領域は、更に、ポリアデニル化部位を露出させるべく新しい転写物の部位特異的開裂を可能にする特定のＤＮＡ配列を含むことができる。これは、特定の内在性ポリメラーゼに、転写物の３’末端へ、約２００のアデノシン残基（ポリＡ）の伸長を追加するようにシグナル伝達する。このポリＡ尾部によって改変されたＲＮＡ分子は、より安定的であると考えられ、より効率的に翻訳される。従って、真核細胞に関連する他の実施例において、ターミネーターがＲＮＡの開裂のためのシグナルを含むことが好ましく、そのターミネーターシグナルによってメッセージのポリアデニル化が促進されることが更に好ましい。前記ターミネーターおよび／又はポリアデニル化部位要素は、メッセージレベルを高め、カセットからそれを介した他の配列への読取を最小化するように作用することができる。
【００７３】
本発明で使用されることが考えられるターミネーターは、非限定的に、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス性の終止配列、を含む遺伝子の終止配列を含む、ここに記載されている、又は当業者に知られている任意の公知の転写のターミネーターを含む。いくつかの実施例において、前記終止シグナルは、配列切断などによる、翻訳不能および／又は転写不能配列などの、転写可能又は翻訳可能な配列の欠如とすることができる。
【００７４】
発現、特に真核発現において、通常、転写物の適切なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に必須であるとは考えられず、任意のそのような配列を使用することが可能である。好適実施例は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含み、これらは共に、簡便かつ容易に入手可能であり、種々の標的細胞において良好に作用することが知られている。ポリアデニル化によって、転写物の安定性を増大させることができ、或いは、細胞質輸送を容易にすることができる。
【００７５】
宿主細胞中においてベクターを良好に増殖させるために、それは、そこで複製を開始させる特定のヌクレオチド配列である、単数又は複数の由来の複製起点（しばしば“ｏｒｉ”と呼ばれる）部位を含むことができる。或いは、宿主細胞が酵母である場合には、自己複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【００７６】
トランスフォーメーション方法
本発明で使用される核酸送達のための適当な方法は、それによって、核酸分子（例えばＤＮＡ）を、ここに記載されているように、又は、当業者に知られているように、細胞に導入することが可能な実質的に全ての方法を含むものと考えられる。そのような方法は、非限定的に、生体外（ex vivo）トランスフェクション（ウィルソン（Wilson）ほか, Science, 244:1344-1346（1989）, ナベル（Nabel）ほか, Science, 244:1342-1344（1989）, 微量注入（ハーラン（Harlan）およびウェイントラウブ（Weintraub）, J. Cell Biol, 101（3）: 1094-1099 （1985）; 米国特許第５，７８９，２１５号、ここに参考文献として合体させる）を含む、注入（ここにそのそれぞれを参考文献として合体させる、米国特許第５，９９４，６２４，５，９８１，２７４，５，９４５，１００，５，７８０，４４８，５，７３６，５２４，５，７０２，９３２，５，６５６，６１０，５，５８９，４６６及びＮｏ．５，５８０，８５９ッ号）、エレクトロポーレーション（米国特許第５，３８４，２５３号、ここに参考文献として合体させる; トゥル‐カパ（Tur-Kapa）ほか, Mol. Cell Biol., 6:716-718（1986）; ポッター（Potter）ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165（1984）、リン酸カルシウム沈殿（グラハム（Gr aham）およびファン・デア・エブ（Van Der Eb）; Virology, 52: 456-467（1973）; Chen（チェン）及びOkayama（オカヤマ）, Mol. Cell Biol., 7（8）: 2745-2752（1987）; リッペ（Rippe）ほか, Mol. Cell Biol., 10:689-695（1990）; ＤＥＡＥデキストラン、その後にポリエチレングリコールの使用（ゴパル（Gopal）, Mol. Cell Biol., 5:1188-190（1985）、直接音波装填（direct sonic loading）（フェッチハイマー（Fechheimer）ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89（17）: 8463-8467（1987）; リポソーム媒介トランスフェクション（ニコラウ（Nicolau）およびセネ（Sene）, Biochem. & Biophys. Acta., 721:185-190 （1982）; フラレー（Fraley）ほか, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76:3348-3352 （1979）; ニコラウ（Nicolau）ほか, Meth. Enzym., 149:157-176（1987）; ワン（Wong）ほか, Gene, 10:879-894 （1980）; カネダ（Kaneda）ほか, Science, 243:375-378 （1989）; カトウ（Kato）ほか, J. Biol. Chem.,266: 3361-3364 （1991）及びレセプター媒介トランスフェクション（ウー（Wu）およびウー（Wu）, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 （1987）; ウー（Wu）およびウー（Wu）, （1988）; プロトプラストのＰＥＧ−媒介トランスフォーメーション（オミラレー（Omirulleh）ほか, Plant Mol. Biol., 21（3）: 415-428（1987）、米国特許第４，６８４，６１１及び４，９５２，５００号、そのそれぞれをここに参考文献として合体させる）、乾燥／抑制媒介ＤＮＡ取り込み(desiccation/inhibition-mediated DNA uptake)（ポトリカス（Potrykus）ほかMol. Gen. Genet., 199（2）: 169-177（1985）およびこれらの方法の任意の組み合わせ、のようなＤＮＡの直接送達を含む。
【００７７】
ＩＩ．解析システムの構成要素
ここに記載の方法と同様、本発明の特徴である生産物も好適実施例を有する。例えば、「三部構造物」即ち、検定タンパク質と、開裂部位と活性化タンパク質とをコードする配列を含む構造物、において、前記検定タンパク質は、好ましくは、ＧＰＣＲファミリーのメンバーなどの膜貫通レセプターなどの膜結合タンパク質である。これらの配列は、それらがコードするタンパク質のＣ末端を、第２タンパク質に対するより良好で強力な相互作用を有するように改変することができる。そのような改変は、例えば、ＧＰＣＲなどの前記検定タンパク質のＣ末端領域を、全てを前に定義した、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＰＬＩ，ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８，ＣＣＲ４又はＧＲＰＲのＣ末端コード領域で置換することを含む。
【００７８】
前記レポーター遺伝子を活性化するタンパク質は、転写因子（例えば、ｔＴＡ、ＧＡＬ４等）等の、核内で作用するタンパク質とすることができ、或いは、それは、他のタンパク質による核内反応へ導く、カスケード反応を開始させる分子とすることができる。当業者には、そのようなカスケード反応は周知であろう。
【００７９】
前記第２構造物は、上述したように、前記第１タンパク質と相互作用して、なんらかの測定可能な現象をもたらすタンパク質をコードする領域を含む。このタンパク質は、前記第１タンパク質の、アクチベーター、インヒビター、より一般的には、「調節物質（modulator）」、とすることができる。特に前記第１タンパク質がＧＰＣＲである場合には、アレスチンファミリーのメンバーが好適であるが、特に前記第１タンパク質がＧＰＣＲでない場合には、他のタンパク質コード領域も使用可能である。これらの二部構造物の第２部分は前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードし、これは、前記第１構造物によってコードされた融合タンパク質から活性化分子を除去するように作用する。
【００８０】
しかし、次の追加の実施例に記載されているように、これらの好適実施例は本発明を限定するものではない。
【００８１】
宿主細胞
ここでの使用において、「細胞」、「細胞ライン」、及び「細胞培養物」という用語は、相互交換可能に使用することができる。これらの用語は全て、更に、その任意又はすべての後続世代であるところの、それらの後代（progeny）も含む。尚、全ての後代は、意図的又は不意の変異によって同じではないかもしれない、と理解される。前記宿主細胞は、一般に、前記第１検定タンパク質とともに、融合タンパク質の一部である転写因子によって活性化されるスクリーニング可能又は選択可能なマーカを発現するように操作（engineered）されたものとされるであろう。
【００８２】
異種核酸配列を発現する意味において、「宿主細胞」は、ベクターを複製することが可能な、および／又は、ベクターによってコードされる異種遺伝子を発現することが可能な原核又は真核細胞をいう。宿主細胞が核酸分子によって「トランスフェクト」又は「トランスフォーム」される場合、それらは、「操作（engineered）」又は「組換え」細胞、或いは、例えばベクターなどの外来性核酸配列が導入された細胞、呼ばれる。従って、組換え細胞は、組換えによって導入された核酸を含まない自然発生細胞から区別可能である。
【００８３】
多種多様な細胞ライン及び培養物が宿主細胞として利用可能であり、それらは、生体培養物と遺伝物質とのアーカイブとして役立っている組織であるAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）を通じて入手することが可能である（www.atcc.org）。当業者は、適当な宿主を、ベクターのバックボーンと求められる結果とに基づいて決定することができる。例えば、プラスミド又はコスミドを、多くのベクターの複製のために原核宿主細胞に導入することができる。ベクター複製および／又は発現のために利用可能な細胞タイプは、非限定的に、E. coli（例えば、E. coli RR1株, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776（ATTC No. 31537）更に、E. coli W3110（Ｆ−,ラムダ、原栄養体, ATTC No. 273325），DH5α、JM109、及びKC8、等の細菌、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバシラス、Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, 種々のシュードモナス属等の、他の腸内細菌、更に、SURE（登録商標）Competent Cells 及びSOLOPACKTM Gold Cells（STRATAGENE（登録商標），La Jolla）等の多数の市販されている細菌性宿主を含む。いくつかの実施例において、E.coli LE392等の細菌細胞が、ファージウイルス用の宿主細胞として特に考えられる。
【００８４】
ベクターの複製および／又は発現のための宿主細胞の具体例は、非限定的に、HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, COS, CHO, Saos及びPC12を含む。種々の細胞タイプ及び組織由来の多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者に知られている。同様に、ウイルス性ベクターを、真核又は原核宿主細胞、特に、そのベクターの複製又は発現を許容するもの、と使用することができる。
【００８５】
検定タンパク質
本発明は、その物理的相互作用が知られている、又は、推測される、任意の二つのタンパク質の使用を意図している。これらのタンパク質は、融合タンパク質として、すなわち、転写因子に融合された第１検定タンパク質と、この第１融合タンパク質中の開裂部位、前記転写因子を遊離する開裂の部位、を認識するプロテアーゼに融合された第２検定タンパク質、として存在する。これら検定タンパク質／融合物のに必要とされることは、（ａ）第１検定タンパク質が、開裂の前に核内に局所化できないこと、そして（ｂ）プロテアーゼが、第２タンパク質への融合と、第１検定タンパク質の第２検定タンパク質への結合との両方の後でも活性状態に留まる必要があること、のみである。
【００８６】
前記第１構造物に関して、前記第１検定タンパク質は、例えば、自然膜結合タンパク質、又は、標準技術によって、膜結合になるように操作されたもの、とすることができる。前記第１検定タンパク質は、例えば、ＧＰＣＲ類のいずれかのような膜貫通レセプター、あるいは、非限定的に、レセプターチロシンキナーゼ、レセプターセリントレオニンキナーゼ、サイトカインレセプター、等を含む、その他の対象の膜貫通レセプターとすることができる。更に、タンパク質の部分は、全長第１検定タンパク質として同様に作用するであろうことがよく知られているので、第１検定タンパク質のそのような活性部分も、ここでのタンパク質の定義に含まれる。
【００８７】
当業者にとって明らかになるであろうが、本発明は、任意のタンパク質との相互作用を解析するために使用することが可能であり、ＧＰＣＲなどの膜結合レセプターの解析にその範囲が限定されるものではない。例えば、非限定的に、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、例えばＩＧＦ１Ｒ、例えば上皮成長因子（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／Ｎｅｕ又は関連のＲＴＫ；レセプターセリン／トレオニンキナーゼ、例えば、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）レセプター；サイトカインレセプター、例えば、インターロイキン、エリスロポエチン，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のためのインターフェロンファミリーのためのレセプター及びレプチンレセプター：エストロゲンレセプター１（ＥＳＲ１）、 エストロゲンレセプター２（ＥＳＲ２）等の必ずしも自然には膜結合ではないその他のレセプター、を含む他のクラスの膜貫通レセプターの活性が含まれる。それぞれのケースにおいて、前記方法は、対象レセプターを含むキメラタンパク質の発現を指令する改変レセプター構造物によって細胞をトランスフェクションする工程を含み、前記構造物には、プロテアーゼ開裂部位と、それに後続の、転写因子をコードする核酸分子とが付着している。前記細胞は、前述の部位を認識し開裂する前記プロテアーゼに融合された相互作用タンパク質から成るキメラタンパク質の発現を指令する第２構造物と同時トランスフェクションされる。ＥＧＦＲ等のＲＴＫの場合、この相互作用タンパク質は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）等のＳＨ２（Ｓｒｃホモロジードメイン２）含有タンパク質又はその一部、又は、Ｓｒｃホモロジー２ドメイン含有トランスフォームタンパク質１（ＳＨＣ１）から構成することができる。ＴＧＦβ、アクチビン、ＢＭＰレセプターなどのレセプターセリン／トレオニンキナーゼの場合、この相互作用タンパク質は、Ｓｍａｄタンパク質又はその一部とすることができる。インターフェロン−α／β又はインターフェロン−γガンマレセプターなどのサイトカインレセプターの場合、この相互作用タンパク質は、非限定的に、Ｓｔａｔ１，Ｓｔａｔ２等の転写（ＳＴＡＴ）タンパク質、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）タンパク質Ｊａｋ１，Ｊａｋ２又はＴｙｋ２、又はそれらの一部の、シグナルトランスデューサ及び活性化物質とすることができる。それぞれの場合において、前記トランスフェクト細胞は、前記レセプターに融合された前記転写因子によって調節されるレポーター遺伝子を含む。次に、前記トランスフェクト細胞を、特定の期間、検定化合物で処理し、この検定期間の最後に前記レポーター遺伝子の活性を測定する解析を行う。もしも、検定化合物が対象のレセプターを活性化すれば、前記対象レセプターと前記相互作用タンパク質との間の相互作用が刺激され、それによって前記プロテアーゼ部位が開裂し、融合された転写因子が遊離され、これを、レポーター遺伝子活性における増加として測定することが可能となる。
【００８８】
他の可能な検定タンパク質の対としては、抗体−リガンド、酵素−基質、二量化タンパク質、シグナル伝達カスケードの成分、その他周知のタンパク質の対がある。
【００８９】
レポーター
レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質は、検出可能なシグナルをもたらす、遺伝子、発現又は欠如に対する影響を与える任意のタンパク質とすることができる。典型的なタンパク質レポーターは、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（glucuronidase）（ＧＵＳ）又はβ−ガラクトシダーゼ等の酵素を含む。又、グリーン蛍光タンパク質、レッド蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質ルシフェラーゼ、ベータラクタマーゼ、アルカリフォスファターゼ等の蛍光及び化学発光タンパク質も考えられる。
【００９０】
転写因子とリプレッサ
本発明に拠れば、操作された宿主細胞内でのレポーター遺伝子の発現を活性化するために転写因子が使用される。これら転写因子は、一般に、それらのＤＮＡ結合ドメインの構造に応じて分類され、それらは一般に、（ａ）ジンクフィンガー、（ｂ）へリックス−ターン−へリックス（helix-turn-helix）、（c）ロイシンジッパー（leucine zipper）、（ｄ）へリックス−ループ−へリックス（helix-loop-helix）、又は（ｅ）高移動性グループである。転写因子の活性化ドメインが、転写装置（ＲＮＡポリメラーゼ）の成分又は、その他の調節タンパク質と相互作用し、それによってＤＮＡ結合の効率に影響を与える。
【００９１】
Ｒｅｌ／核内因子 ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）と活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）とが、最もよく研究されている転写因子ファミリーに含まれる。それらは、炎症や腫瘍形成などの病理的結果をもたらす、シグナル伝達経路の重要な成分として同定されている。その他の転写因子ファミリーは、熱ショック／Ｅ２Ｆファミリー、ＰＯＵファミリー及びＡＴＦファミリーを含む。ｔＴＡやＧＡＬ４等の特定の転写因子が本発明の使用に考えられる。
【００９２】
転写因子は、使用可能な１つの分子クラスであるが、前記解析を改造して、測定可能なシグナルがシグナル発生器のダウンレギュレーション又は細胞死である、転写リプレッサ分子の使用を可能にすることもできる。
【００９３】
プロテアーゼ及び開裂部位
プロテアーゼは、特定の部位において他のタンパク質を開裂する十分に特徴付けられている酵素である。１つのファミリー、Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテアーゼは、セリン及びトレオニン残基で開裂する。他のプロテアーゼは、システイン又はチオールプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテイナーゼ、アミノペプチダーゼ、ジ及びトリペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、及びペプチジルペプチダーゼを含む。これらの選択は、当業者次第であり、勿論、ここに記載されている分子に限定される必要はない。酵素が触媒ドメインを有し、これらを全長プロテアーゼの代わりに使用することが可能であることはよく知られている。そのようなものも本発明に含まれる。１つの具体的実施例は、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼ又は、その活性部分である。当業者に明らかなように、その他のプロテアーゼの特定の開裂部位も使用可能である。
【００９４】
検定タンパク質の改変
前記第１検定タンパク質は、この解析において前記相互作用タンパク質に対するその結合を増強するように改変することができる。例えば、ある種のＧＰＣＲは、リガンド刺激により、アレスチンにより安定的に、又はより高い親和性で結合し、この増強された相互作用は、別々のドメイン、例えば、Ｃ末端尾部におけるセリンとトレオニン残基のクラスター、によって媒介されることが知られている（オークレイ（Oakley）ほか, J.Biol.Chem. 274:32248-32257,1999及びオークレイ（Oakley）ほか, J.Biol.Chem. 276:19452-19460, 2001）。これを一例として使用して、レセプターなどの膜結合タンパク質の親和性を増加するために、レセプターコード配列自身を、それが結合するタンパク質で改変できることが明らかである。そのような改変の具体例は、上述したもののような、レセプターなどの膜結合タンパク質のＣ末端領域の、それの、結合タンパク質に対してより高い親和性を有するがレセプター機能には影響しない別のレセプターの対応領域との置換を含む、改変である。例１６及び２０は、本発明のこの特徴の実施例を示すものである。
【００９５】
更に、前記第２検定タンパク質を、前記第１検定タンパク質とのその相互作用を増強するべく改変することができる。例えば、前記解析は、アゴニスト−占有ＧＰＣＲに、より安定的に、又は、リン酸化−独立様式で結合することが知られている、アレスチンなどの、第２検定タンパク質の点変異体、切断体又はその他のバリアントを含むことができる（コヴォーア（Kovoor）ほか, J. Biol. Chem., 274: 6831-6834,1999）。
【００９６】
ＩＩＩ．解析形態
上述したように、本発明は、その一実施例において、二つの検定タンパク質の、同じ細胞内で発現された時の、相互作用を評価する簡単な方法を提供する。第１構造物は、上述したように、それ自身、レポーター遺伝子アクチベーターをコードする配列に連結されている、プロテアーゼ又はプロテアーゼ部分のための開裂部位をコードする配列に連結されている第１タンパク質をコードする配列を含む。ここで、「連結」とは、記載した配列が、融合して、全ての要素を含む１つのポリペプチドに翻訳可能な、１つの完全なオープンリーディングフレームを作り出すことを意味する。これらは、別のタンパク質又はペプチドをコードする又はコードしないものとすることができる追加のヌクレオチド配列によって分離されたものであっても、又は分離されないものであってもよい。前記組換え細胞に挿入される第２構造物も、上述した、即ち、それは、第２タンパク質と、前記プロテアーゼ又はプロテアーゼ部分をコードする配列との両方を含む。これらの要素は協働で、標的タンパク質相互作用に対するその作用が追求される候補物質と組み合わされて基本解析形態を構成する。
【００９７】
しかし、本発明は、そのそれぞれが、ここに記載のクラスのタンパク質などの、タンパク質の活性化によって刺激される、異種のレポーター遺伝子を同時に使用することによって、１つ以上の、レセプターなどの膜結合タンパク質を解析するのにも使用することができる。例えば、これは、異なるレセプター構造物及び異なるレポーター遺伝子でトランスフェクトされた細胞を混合すること、又は、各検定レセプターに異なる転写因子を融合し、検定化合物での処理後の各レポーター遺伝子の活性を測定することによって、達成することができる。例えば、対象分子が第１レセプターを活性化するか否か、さらに、第２レセプターとの相互作用によって、副作用が発現されるか否か、を決定することが望ましいかもしれない。そのような場合、例えば、第１レセプターと第１レポーター、ｌａｃＺのような、とをコードする第１細胞ラインと、第２レセプターと第２レポーター、ＧＦＰ等のような、とをコードする第２細胞ラインとを使用することができる。そのようなシステムの好適実施例が、例１７と１８に見られる。前記二つの細胞ラインを混合し、対象の化合物を添加し、一方に対する明確な作用と、他方に対する作用の欠如を求めることができる。
【００９８】
尚、本発明は、一対の相互作用検定タンパク質が検定される解析と、より好ましくは、ここで「マルチプレックス（multiplex）」解析と称するものが使用される解析との両方に関する。そのような解析は、様々な方法で実行可能であるが、いずれの場合でも、一対以上の検定タンパク質が同時に検定される。これは、例えば、そのそれぞれが、各相互作用タンパク質の対を検定するべく、トランスフォーム又はトランスフェクトされている複数の細胞のサンプルを提供することによって達成可能である。これらの異なるトランスフォーム細胞は、１つの容器内で同時に組み合わせ、検定することができ、或いは、各タイプの形質転換体を別々の容器に入れて、その後検定することも可能である。
【００９９】
ここに記載のマルチプレックス解析に使用される前記細胞は、同じであっても、又は同じでなくてもよい。同様に、使用されるレポーターシステムは、各サンプルにおいて同じであっても、又は同じでなくてもよい。前記サンプル又は複数のサンプルが、例えばマイクロアレイのウェルなどの、容器に入れられた後、単数又は複数の化合物を、容器にセットされた複数の相互作用タンパク質の対に対してスクリーニングすることができる。
【０１００】
前記構造物によって発現される前記融合タンパク質も、本発明の特徴である。当業者にとって明らかになるであろう本発明のその他の態様は、前記融合タンパク質を同定することが可能な抗体、更に、タンパク質の存在を測定するための種々のタンパク質に基づく解析、又、遺伝子の発現を測定する、ＰＣＲによる解析などの、ハイブリダイゼーション解析である。
【０１０１】
ＩＶ．キット
ここに記載の組成物のいずれも、キットとして構成することができる。従って、このキットは、本発明の前記ベクター又は細胞のための適当な容器手段と、本発明に使用可能な追加の任意の試薬とを含むものとなる。
【０１０２】
前記キットは、適当に分割された本発明の組成物を含む。これらのキットの構成部分は、水性媒体中又は凍結乾燥状態でパッケージ化することができる。前記キットの容器手段は、一般に、その中に、成分が配置される、好ましくは、適当に分取される、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器又はその他の容器手段を含む。キット中に１つ以上の構成部分が含まれる場合は、このキットは、更に、それらの中にそれらの追加構成部分を別々に入れることが可能な、第２、第３、又はその他追加の容器を含むものとされる。但し、種々の組み合わせの構成部分を１つのバイアル中に含ませることも可能である。本発明のキットは、更に、通常、市販のために、試薬容器を密に封じ込めるための手段を備える。そのような容器は、その中に所望のバイアルが保持される射出成形又は吹出し成形容器を含むことができる。
【０１０３】
前記キットの構成部分が単数又は複数の溶液として提供される場合、その溶液は、水溶液であり、殺菌水溶液が特に好ましい。但し、前記キットの構成部分は、乾燥粉末（単数又は複数）として提供することも可能である。試薬および／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、その粉末は、適当な溶剤の添加によって再構築することができる。前記溶剤も、別の容器手段に入れて提供することも考えられる。
【実施例】
【０１０４】
Ｖ．例
本発明を説明する具体的実施例は、下記の例から理解されるであろう。但し、本発明はこれらに限定されるものと解釈されてはならない。
【０１０５】
例１
標準命名法に 従って、以下“ＡＤＲＢ２”と称するヒトβ２アドレナリンレセプターをコードするＤＮＡを使用して、融合構造物を形成した。そのヌクレオチド配列は、GenBankにおいて、受入番号NM_ 000024（配列識別番号１）で得られる。ここに参考文献として合体させるゴッセン（Gossen）ほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 87: 5547-5551（1992）に記載されているテトラサイクリン調節性トランスアクチベーターｔＴＡも使用された。ここに参考文献として合体させるパークス（Parks）ほか, Anal. Biochem., 216: 413-417 （1994）に記載されている、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼに対する認識及び開裂部位をコードする配列が、前記融合コード遺伝子のこれらの配列の間に挿入されている。前記ＣＭＶプロモーター領域を、ＡＤＲＢ２コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、前記ｔＴＡ領域の下流側に配置した。
【０１０６】
先ず、内部ＢａｍＨＩ及びＢｇＩＩＩ制限部位が欠如した形態のＡＤＲＢ２を作り出すことによって融合構造物を調製した。更に、内在性の終止コドンを、ユニークなＢａｍＨＩ部位によって置換した。
【０１０７】
これを行うためにオーバラッピングＰＣＲを使用した。詳述すると、前記コード領域の５’部分を、
gattgaagat ctgccttctt gctggc（配列識別番号２）、及び、
gcagaacttg gaagacctgc ggagtcc（配列識別番号３）によって増幅した。
一方、前記コード領域の３’部分を、
ggactccgca ggtcttccaa gttctgc（配列識別番号４）、及び、
ttcggatcct agcagtgagt catttgt（配列識別番号５）によって増幅した。
【０１０８】
その結果得られたＰＣＲ産物は、２７ヌクレオチドのオーバーラッピング配列を有し、これらを標準アガロースゲル電気泳動によって精製した。これらを互いに混合し、配列識別番号２と配列識別番号５とで増幅した。
【０１０９】
前記内因性の開始コドンがＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位によって置換されるようにｔＴＡのコード領域を改変するのにもＰＣＲが使用された。７アミノ酸配列ENLYFQS（配列識別番号６）によって形成されている前記開裂部位は、ここに参考文献として合体させるパークス（Parks）ほか, Anal. Biochem., 216: 413-417（1994）によって教示されている。７番目のアミノ酸は、Ｐ１’位置として知られており、これを他のアミノ酸と置換することによって、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏによる開裂の効率が減少することが知られている。カプスト（Kapust）ほか, Biochem. Bophys. Res. Commun., 294: 949-955（2002）を参照。
【０１１０】
第７アミノ酸がＴｙｒに変更されたバリアント、及び、それがＬｅｕに変更されたバリアントを作成した。これらによって、天然の高効率部位と比較して、中及び低効率の開裂部位が得られた。
【０１１１】
前記天然高効率部位をコードするＤＮＡ配列を、ｔＴＡコード領域に二つの工程で付加した。簡単に説明すると、
ccggatcctc tagattagat aaaagtaaag tg（配列識別番号７）、及び
gactcgagct agcagtatcc tcgcgccccc taccc（配列識別番号８）、でのＰＣＲによって、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位を５’末端に付加し、ＸｈｏＩ制限部位をｔＴＡコード領域の３’末端に付加した。そして、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位を、ＢａｍＨＩとＸｂａＩ部位の間で下記の配列、
gagaacctgt acttccag（配列識別番号９）に、オリゴヌクレオチドを連結することによって５’末端に付加した。
【０１１２】
このＤＮＡ配列を、以下を使用したＰＣＲによって前記中及び低効率開裂部位をコードするように改変した。
ENLYFQY（配列識別番号１２）の場合は、
ggatccgaga acctgtactt ccagtacaga tta（配列識別番号１０）、及び、
ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc（配列識別番号１１）、そして
ENLYFQL（配列識別番号１４）の場合は、
ggatccgaga acctgtactt ccagctaaga tta（配列識別番号１３）、及び、
ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc（配列識別番号１１）。
【０１１３】
これらのＰＣＲ工程によって、更に、ＢａｍＨＩ制限部位５’が各開裂部位をコードする配列に、そして、ＸｈｏＩ制限部位３’がｔＴＡ終止コドンに導入された。
【０１１４】
このようにして改変されたＡＤＲＢ２コード領域を、前記コード領域のヌクレオチド位置２６０で切断するＰｓｔＩと、ＢａｍＨＩとで消化した。この３’フラグメントを、予めＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化しておいたＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位によって改変されたｔＴＡの前記三つのバリアントと連結し、得られた複合体を、予めＰｓｔＩとＸｈｏＩとで消化しておいたpBlueScript IIにクローニングした。
【０１１５】
再度、
gcggccgcca ccatgaacgg taccgaaggc cca（配列識別番号１５）、及び、
ctggtgggtg gcccggtacc a（配列識別番号１６）を、使用したＰＣＲによって、前記ＡＤＲＢ２コード領域の開始コドンの５’にＮｏｔＩ制限部位が導入された。
【０１１６】
改変ＡＤＲＢ２コード領域の前記５’フラグメントを、ＮｏｔＩとＰｓｔＩとの消化によって単離し、これを、予め消化しておいたＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位ｔＴＡ融合の３’フラグメントの構造物のそれぞれに連結し、融合タンパク質をコードする三つの全長構造物を作成した。
【０１１７】
各構造物を、ＮｏｔＩとＸｈｏＩとで消化し、次に、ＮｏｔＩとＸｈｏＩとで消化された、市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ３に挿入した。
【０１１８】
例２
第２の構造物も作成し、ここでは、以後“βアレスチン２又はＡＲＲＢ２”と称する（GenBank, NM_004313）（配列識別番号１７）のコード配列を、ＴＥＶタンパク質のＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメイン（即ち、成熟ＮＩａプロテアーゼのアミノ酸１８９−４２４、残基２０４０−２２７９）に連結した。これを行うために、ＡＲＲＢ２をコードするＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ制限部位をその５’末端に付加するように改変した。更に、この配列を、内在性の終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換するように改変した。下記のオリゴヌクレオチド、
caggatcctc tggaatggg gagaaaccg ggacc（配列識別番号１８）、及び、
ggatccgcag agttgatcat catagtcgc（配列識別番号１９）が使用された。得られたＰＣＲ産物を、市販のベクターｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹ（Promega）にクローニングした。前記ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクターのマルチクローニング部位は、ＡＲＲＢの開始コドンへのＥｃｏＲＩ部位５’を含む。
【０１１９】
次に、コロジエイ（Kolodziej）ほか, Meth. Enzymol., 194: 508-519（1991）に従って、前記ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域を、前記内在性の開始コドンをＢｇｌＩＩ部位によって置換し、３’末端に、インフルエンザヘマグルチニンエピトープYPYDVPDYA（配列識別番号２０）をコードする配列を挿入し、その後、終止コドンとＮｏｔＩ制限部位とするように改変した。これは、
agatctagct tgtttaaggg accacgtg（配列識別番号２１）、および、
gcggccgctc aagctaac tggaacatca tatgggtacg agtacaccaa ttcattcatg at（配列識別番号２２）、を使用するＰＣＲによって達成された。
【０１２０】
得られた改変ＡＲＲＢ２コード領域をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化し、他方、改変ＴＥＶコード領域を、ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで開裂した。両フラグメントを、市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターに連結し、ＥｒｏＲＩとＮｏｔＩで消化した。
【０１２１】
例３
ＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位ｔ−ＴＡ及びＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質をコードするプラスミドを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞と、ｔＴＡ依存プロモーターの制御下で、安定的にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を取り込んだ、ＨＥＫ−２９３Ｔの誘導体である、「クローン４１」とにトランスフェクトした。約５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、100単位／mlペニシリン、１００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８及び５μｇ／mlプリマイシン（purimycin）を添加したＤＭＥＭ培地中で、２４ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を次の日、５０％のコンフルエンシーにまで増殖させ、次に、０．４μｇのプラスミドＤＮＡ、及び２μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質とその他の物質を含有する専売のトランスフェクション試薬）を使用してトランスフェクトした。この混合物を、１００μｌのＤＭＥＭ培地中で組み合わせ、細胞の添加の前に、室温で１５分間インキュベートした。トランスフェクション細胞を、検定８〜２０時間前に、レセプターのための公知のアゴニストである薬剤を添加することによってインキュベートし、その後、薬剤添加後、１６−２４時間インキュベートした。
【０１２２】
例４
前記細胞内のβ−ガラクトシダーゼのレベルを、先ず、ここに参考文献として合体させるマクグレガー（MacGregor）ほか, Somat. Cell Mol. Genet., 13: 253-265（1987）によって教示されているように、これらの細胞を、発色性物質、即ち、“Ｘ−ｇａｌ”によって染色することによって測定した。培養後、細胞を、カルシウムとマグネシウムを含むＤ−ＰＢＳ中で二回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、その後、追加の二回、それぞれ１０分間、Ｄ−ＰＢＳ、カルシウム及びマグネシウムによって洗浄した。固定された細胞を、予め、カルシウムとマグネシウムとを含むＤ−ＰＢＳ中で、４％ Ｘ−Ｇａｌ保存液の１：４０希釈によって調製しておいた、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％ Ｘ−Ｇａｌ、とインキュベートした。
【０１２３】
前記反応物を、暗所で室温にて３〜４時間から一晩インキュベートした。基質溶液を除去し、細胞を、ガラスカバーグラス下で、モヴィオール（ｍｏｗｉｏｌ）封入剤（１０％ モヴィオール、０．１％ １．４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、２４％グリセロール）で封入した。
【０１２４】
その結果、前記ＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂部位ｔ−ＴＡプラスミドのみ、又は、ＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼプラスミドのみのいずれによってトランスフェクトされた細胞も、β−ガラクトシダーゼを発現しないことが示された。両プラスミドでトランスフェクトされた小さな割合の細胞は、恐らくは、刺激を受けなかったＡＤＲＢ２とＡＲＲＢ２との間の相互作用の基礎レベルにより、β−ガラクトシダーゼを発現した。約３−５倍の多くの細胞が、共にＡＤＲＢ２アゴニストである、１０μＭイソプロテレノール又は１０μＭのエピネフリンでの処理後、前記レポーター遺伝子を発現した。
【０１２５】
前記細胞をＡＤＲＢ２アンタゴニストのアルプレノロール（１０μＭ）で５分間前処理した時、β−ガラクトシダーゼ発現細胞におけるアゴニスト誘導増加は阻止され、そして、アルプレノロールのみでの処理では明白な効果は無かった。
【０１２６】
これらの結果は、アゴニスト結合とＧＰＣＲ刺激とを、レポーター遺伝子の転写活性化に結びつけることができる、ということを示している。
【０１２７】
例５
細胞中におけるレポーター遺伝子活性のレベルをより正確に定量化し、分析におけるシグナル対バックグランド比を最大化するために一組の実験を行った。これは、β−ガラクトシダーゼ活性のための市販の化学発光解析を使用してレポーター遺伝子誘導のレベルを測定することによって達成された。クローン４１細胞を、ＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構造物、前記高、中または低効率開裂部位のいずれかを含む、及び上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミド、でトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクション後、１μＭのイソプロテレノールで処理しないか、又は２０時間処理し、薬剤添加の２４時間後に発光解析を行った。簡単に説明すると、細胞培養後、培地を除去し、５０μｌの溶解緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．８，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を各ウェルに添加した。細胞を、緩やかに攪拌しながら、室温で５分間のインキュベーションによって溶解させた。溶解物を収集し、市販の製品によって分析した。
【０１２８】
全てのケースにおいて、アゴニストでの処理によって、β−ガラクトシダーゼのレベルが増加した。しかし、未処理の細胞でのレポーター遺伝子活性のバックグランドレベルは、中及び高効率部位に対して、低効率開裂部位で最低であった。更に、アゴニスト処理によって、中効率開裂部位での２．８倍と高効率開裂部位での１．２倍に対して、低効率開裂部位でトランスフェクトされた細胞中でのレポーター遺伝子活性は４．８倍の刺激をもたらした。従って、低効率プロテアーゼ開裂部位を使用することによって最高のシグナル対バックグランド比が得られる。
【０１２９】
例６
これらの実験は、レポーター遺伝子発現におけるアゴニスト刺激増加が、アゴニストによるレセプターの結合と活性化に依存することを証明するために構成された。
【０１３０】
これを行うために、そのそれぞれが、アゴニスト イソプロテレノールへの親和性の大幅な低下をもたらす、位置１１３における１つのアミノ酸のＤからＳへの変更を有する前記レセプターの変異体を含んでいることを除いて、上述したプロトコルに従って、前記ＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合タンパク質のバリアントを作成した。ストレーダー（Strader）ほか, J. Biol. Chem. 266: 5-8 （1991）を参照。それぞれ異なる開裂部位をもつ三つの形態の変異体レセプター−ｔＴＡ融合構造物が形成された。
【０１３１】
前記ＡＤＲＢ２−ｔＴＡ、Ｄ１１３Ｓ点変異を含む、及び上述したＡＤＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミド、でコトランスフェクトされたクローン４１細胞中でβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルを測定した。これらの活性検定は、上述したものと全く同様に行われた。その結果、アゴニスト、イソプロテレノールは、前記変異ＡＤＲＢ−ｔＴＡ融合構造物を発現する細胞中においてレポーター遺伝子発現を刺激しないことが示された。
【０１３２】
例７
これらの実験は、レポーター遺伝子発現のアゴニスト刺激増加が、ＴＥＶ ＮＩａ−ＰｒｏのＡＲＲＢ２への融合に依存するか否かを調べるために構成された。
【０１３３】
これを行うために、前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構造物と、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ発現プラスミドか、又は、ホスホリパーゼＣのＳＨ２ドメインへの対照ＴＥＶ−ＮＩａ融合物のいずれかとでコトランスフェクトされたクローン４１細胞中でβ−ガラクトシダーゼのレベルを測定した。これらの活性検定は、上述したものとまったく同様に行われた。その結果、レポーター遺伝子発現のアゴニスト刺激増加は、ＴＥＶプロテアーゼがＡＲＲＢ２に融合された場合にのみ検出され、無関係のポリペプチドに融合された場合には検出されないことが示された。
【０１３４】
例８
これらの実験は、遺伝子発現が標的レセプターのアゴニストによって選択的に誘導されるか否か、或いは、それがその他の分子によって刺激することが可能であるか否か、を調べるために構成された。
【０１３５】
ＡＴＰは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞によって内在的に発現される、Ｇタンパク質共役レセプターＰ２Ｙ１及びＰ２Ｙ２に対するアゴニストである。
【０１３６】
前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構造物と上述のアレスチン−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトされ、イソプロテレノール、ＡＴＰで処理された又は処理されない、クローン４１細胞を使用して実験を行った。これらの解析は、上述した通りに行われた。
【０１３７】
その結果、レポーター遺伝子活性の誘導は、標的レセプターの活性化に対して特異的であることが示された。別のＧＰＣＲ経路の刺激は無関係であった。
【０１３８】
例９
前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＢ２−ｔＴＡ融合構造物と上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトされ、種々の量の、アドレナリンレセプターアゴニスト、イソプロテレノール及びエピネフリンのいずれか１つで処理されたクローン４１細胞を使用して１セットの実験を行った。これらの解析は、上述した通りに行われた。図２ａに示されているその結果は、これら二つのリガンドによるレポーター遺伝子発現の刺激の用量−反応曲線を示している。各ポイントは、三つの実験から得られた平均値を表している。
【０１３９】
コトランスフェクションクローン４１細胞を、異なる濃度でアドレナリンレセプターアンタゴニスト、アルプレノロールで１５分間前処理し、その後、１μＭのエピネフリンでの処理を行うという１セットの実験を上述したようにして行った。図２ｂに示されているその結果は、このアンタゴニストの用量−抑制曲線を示している。
【０１４０】
例１０
Ｇタンパク質共役アルギニンバソプレッシンレセプター２（ＡＶＰＲ２）の分析を確立するために類似のセットの構造体を作成した。ＡＶＰＲ２コード領域（GenBank受入番号: NM_000054）（配列識別番号２３）を、プライマー、
gaattcatgc tcatggcgtc caccac（配列識別番号２４）、及び、
ggatcccgat gaagtgtcct tggccag（配列識別番号２５）でＰＣＲを使用して、５’末端にＥｃｏＲＩを配置し、そして終止コドンをＢａｍＨＩ部位によって置換するように改変した。
【０１４１】
前記改変ＡＶＰＲ２コード領域を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断しておいた、上述の三つのＡＤＲＢ２−ｔＴＡ構造物に連結した。これによって、ＡＤＲＢ２の全コード配列がＡＶＰＲ２のコード配列によって置換された。
【０１４２】
クローン４１細胞を、前記低効率開裂部位を含むＡＶＰＲ２−ｔＴＡ融合構造物と、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とによってコトランスフェクトし、種々の濃度（１ｐＭ〜２μＭ）の、［Ａｒｇ８］バソプレッシン、ＡＶＰＲ２のアゴニスト、を使用して解析を行った。図３に示すそのデータは、以前に刊行されたデータ（オークレー（Oakley）ほか, Assay and Drug Development Technologies, 1: 21-30、（2002））と一致する、３．３ｎＭのＥＣ５０をもつ、このアゴニストの用量反応曲線を示している。最大の反応によって、バックグランドレベルに対して、レポーター遺伝子発現の約４０倍の誘導が得られた。
【０１４３】
例１１
Ｇタンパク質共役セロトニンレセプター１ａ（ＨＲＴ１Ａ）の解析を確立するために、類似セットの実験を行った。前記ＨＴＲ１Ａコード領域（Genbank受入番号NM_000524）（配列識別番号２６）を、プライマー、
gaattcatgg atgtgctcag ccctgg（配列識別番号２７）、及び、
ggatccctgg cggcagaact tacac（配列識別番号２８）、でのＰＣＲを使用して、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、終止コドンをＢａｍＨＩ部位によって置換するべく改変した。
【０１４４】
前記改変ＨＴＲ１Ａコード領域を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断された上述のＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物に連結した。これによって、ＡＶＰＲ２の全コード配列が、ＨＴＲ１Ａのコード配列によって置換された。その結果得られた構造体を、以後“ＨＴＲ１Ａ−ｔＴＡ”と称する。
【０１４５】
クローン４１細胞を、前記低効率開裂部位を含むＨＴＲ１Ａ−ｔＴＡ融合構造物と、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合構造物とによってコトランスフェクトし、１０μＭ ８−ヒドロキシ−ＤＰＡＴ ＨＢｒ（ＯＨ−ＤＰＡＴ）、ＨＴＲ１Ａのアゴニスト、更に、１０μＭのセロトニン、ＨＴＲ１Ａの天然アゴニスト、とを使用して解析を行った。これらの解析は上述したようにして行われた。ＯＨ−ＤＰＡＴへの最大の反応によって、バックグランドレベルに対して、レポーター遺伝子発現の６．３倍の誘導が得られ、セロトニンへの最大の反応によって、バックグランドレベルに対して、レポーター遺伝子発現の４．６倍の誘導が得られた。
【０１４６】
例１２
Ｇタンパク質共役ｍ２ムスカリンアセチルコリンレセプター（ＣＨＲＭ２）のための解析を確立するために類似の構造体を作成した。ＣＨＲＭ２コード領域（Genbank受入番号NM_000739）（配列識別番号２９）を、プライマー、
gaattcatga ataactcaac aaactcc（配列識別番号３０）、及び、
agatctcctt gtagcgccta tgttc（配列識別番号３１）、でのＰＣＲを使用して、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、終止コドンをＢｇＩＩＩ部位によって置換するべく改変した。
【０１４７】
前記改変ＣＨＲＭ２コード領域を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断された上述のＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物に連結した。これによって、ＡＶＰＲ２の全コード配列が、ＣＨＲＭ２のコード配列によって置換された。
【０１４８】
クローン４１細胞を、前記高効率開裂部位を含むＣＨＲＭ２−ｔＴＡ融合構造物と、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合構造物によってコトランスフェクトし、ここで、ＡＲＲＢ２−プロテアーゼ融合タンパク質が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターの制御下で発現され、１０μＭのカルバミルコリンＣ１（カルバコール（carbochol））、ＣＨＲＭ２のアゴニスト、を使用して、上述したように解析を行った。カルバコールへの最大の反応によって、バックグランドレベルに対して、レポーター遺伝子発現の７．２倍の誘導が得られた。
【０１４９】
例１３
Ｇタンパク質共役ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター５（ＣＣＲ５）の解析を確立するためにα構造物も作成した。ＣＣＲ５コード領域（Genbank受入番号NM_000579）（配列識別番号３２）を、プライマー、
gcggccgcat ggattatcaa gtgtcaagtc c（配列識別番号３３）、及び、
ggatccctgg cggcagaact tacac（配列識別番号３４）、でのＰＣＲを使用して、５’末端にＮｏｔＩ部位を配置し、終止コドンをＢａｍＨＩ部位によって置換するべく改変した。
【０１５０】
ＣＣＲ５コード領域を、プライマー、
ggtctccaat tcatggatta tcaagtgtca agt（配列識別番号３５）、及び、
gacgacagcc aggtacctat c（配列識別番号３６）、を使用して、それが切断された時に、ＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡと適合するヌクレオチド突出部分を残す、５’末端にＢｓａＩ部位を配置するようにも改変した。
【０１５１】
前記第１の改変コード領域をＣｌａＩとＢａｍＨＩとで切断し、第２のものをＢｓａＩとＣｌａＩとで切断した。これら両フラグメントを、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断しておいた、ＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物に上述したように連結させた。これによって、ＡＶＰＲ２の全コード配列がＣＣＲ５のコード配列によって置換された。
【０１５２】
前記低効率開裂部位を含むＣＣＲ５−ｔＴＡ融合構造物を、上述のＨＥＫ細胞ライン“クローン４１”の誘導体であるが、ＣＭＶプロモーターの制御下で安定的に組み込まれたＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合遺伝子を含む、“クローン３４”細胞にトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌの「Regulated on Activation, Normal T-Cell Expressed and Secreted」（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＲ５に対する公知のアゴニスト、を使用して解析を行った。上述したように測定された、ＲＡＮＴＥＳに対する最大反応によって、バックグランドに対するレポーター遺伝子発現の約４０倍の誘導が得られた。
【０１５３】
例１４
次に、Ｇタンパク質共役ドーパミン２レセプター（ＤＲＤ２）の解析を確立するために一組の構造物を作成した。ＤＲＤ２コード領域（Genbank受入番号NM_000795）（配列識別番号３７）を、プライマー、
gaattcatgg atccactgaa tctgtcc（配列識別番号３８）、及び、
agatctgcag tggaggatct tcagg（配列識別番号３９）、を使用して、５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、終止コドンをＢｇＩＩＩ部位によって置換するべく改変した。
【０１５４】
改変されたＤＲＤ２コード領域を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとによって切断された、ＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物に上述したようにして連結した。これによって、ＡＶＰＲ２の全コード配列がＤＲＤ２のコード配列によって置換された。
【０１５５】
クローン４１細胞を、前記中効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構造物と、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、ＤＲＤ２のアゴニスト、を使用して解析を行った。その結果を、上述した解析と同様にして測定した。ドーパミンに対する最大反応によって、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の２．７倍の誘導が得られた。
【０１５６】
例１５
これらの実験は、アゴニスト占有ＧＰＣＲを安定的に結合するアレスチン変異体を使用した解析の増強を証明するように構成された。先ず、β−アレスチン−１（ＡＲＲＢ１）に対するＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの融合物を構築した。ＡＲＲＢ１のコード領域（Genbank受入番号. NM_004041）（配列識別番号４０）を、プライマー、
ggtaccatgg gcgacaaagg gacgcgagtg（配列識別番号４１）、そして、
ggatcctctg ttgttgagct gtggagagcc tgtaccatcc tcctcttc（配列識別番号４２）、での使用したＰＣＲを使用して、５’末端にＡｓｐ７１８部位を配置し、終止コドンをＢａｍＨＩ部位で置換するべく改変した。
【０１５７】
その結果得られた改変ＡＲＲＢ１コード領域を、Ａｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、そして、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切断し、他方、上述した改変ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域は、ＢｇＩＩＩとＮｏｔＩで切断した。三つ全部のフラグメントを、Ａｓｐ７１８とＮｏｔＩとで消化しておいた、市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターに連結した。
【０１５８】
クローン４１細胞を、前記中効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構造物と、ＡＲＲＢ１−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、Ｄ２レセプターのアゴニスト、を上述したように使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大の反応で、バックグランドに対するレポーター遺伝子発現の２．１倍の誘導が得られた。
【０１５９】
ＡＲＲＢ１のアミノ酸３８２以後の切断によって、ＧＲＫ−媒介リン酸化と独立した、アゴニスト結合ＧＰＣＲに対する親和性が増大するこが報告されている（コヴォーア エイ（Kovoor A.）ほか，J. Biol. Chem. 274 （11）: 6831-6834 （1999））。本解析におけるそのような「常時活性型のconstitutively active）」アレスチンの使用を示すために、β−アレスチン−１のコード領域を、上述した配列識別番号４１、及び、
ggatccattt gtgtcaagtt ctatgag（配列識別番号４３）、でのＰＣＲを使用して、５’末端にＡｓｐ７１８部位を配置し、アミノ酸３８２のあとにＢａｍＨＩ部位を配置するべく、改変した。
【０１６０】
これによって、全長コード領域よりも３６アミノ酸短いＡＲＲｂ１コード領域が得られる。これによって得られた改変ＡＲＲＢ１コード領域、“ＡＲＲＢ１（Δ３８３）”と称する、を、Ａｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、そしてＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、他方、上述の前記改変ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域をＢｇＩＩＩとＮｏｔＩで切断した。これら三つのフラグメント全部を、市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターに連結し、Ａｓｐ７１８とＮｏｔＩで消化した。
【０１６１】
クローン４１細胞を、前記中効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構造物と、ＡＲＲＢ２（Δ３８３）−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とによってコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、ＤＲＤ２レセプターに対するアゴニスト、を上述したように使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大反応で、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の８．３倍の誘導が得られた。
【０１６２】
前記ＡＲＲＢ２コード領域の同等の切断の作用を調べるために、ＡＲＲＢ２のコード領域を、プライマー、
ggtaccatgg gggagaaacc cgggacc（配列識別番号４４）、及び、
ggatcctgtg gcatagttgg tatc（配列識別番号４５）、でＰＣＲを使用して、５’末端にＡｓｐ７１８部位を配置し、３’末端の８１のヌクレオチドをＢａｍＨＩ部位で置換するように改変した。
【０１６３】
これによって、全長コード領域よりも２７アミノ酸短いＡＲＲＢ２コード領域が得られる。これによって得られた改変ＡＲＲＢ２コード領域を、Ａｓｐ７１８とＢａｍＨＩで切断し、他方、上述の改変ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏコード領域をＢｇＩＩＩとＮｏｔＩとで切断した。両フラグメントを、市販のｐｃＤＮＡ３発現ベクターに連結し、ＡｓＰ７１８とＮｏｔＩで消化した。
【０１６４】
クローン４１細胞を、前記中効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ｔＴＡ融合構造物と、ＡＲＲＢ２（Δ３８３）−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とによってコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、ＤＲＤ２レセプターに対するアゴニスト、を上述したように使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大反応で、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の２．１倍の誘導が得られた。
【０１６５】
図４に示すこれらの結果は、ＤＲＤ２ドーパミンレセプター解析が、前記アレスチン変異体ＡＲＲＢ１（Δ３８３）を使用して最高のシグナル対バックグランドを示すことを証明している。
【０１６６】
例１６
この組の実験は、相互作用タンパク質に対する親和性を増大させるように構成されたレセプター改変体を使用した解析の増強を証明するために行われた。この例において、検定レセプターのＣ末端尾部ドメインが、高い親和性でアレスチンと結合することが知られているレセプターである、ＡＶＰＲ２からの対応の尾部ドメインによって置換された。これらの例において、前記融合結合部（junction）が、通常、レセプターＣ−末端の推定パルミトイル化部位の直後の位置に対応する、第７膜貫通螺旋の末端における保存ＮＰＸＸＹモチーフの後の１５〜１８のアミノ酸に作られた。
【０１６７】
先ず、ＰＣＲを使用して、前記低効率ＴＥＶ開裂部位とｔＴＡ転写因子の前に、ＡＶＰＲ２からのＣ末端の２９アミノ酸をコードするＤＮＡフラグメントを作成した。このフラグメントは、又、最初の二つのアミノ酸（Ａｌａ，Ａ及びＡｒｇ，Ｒ）が、ＢｓｓＨＩＩ制限部位ＧＣＧＣＧＣによってコードされるようにも構成されている。これは、プライマー、
tgtgcgcgcg gacgcacccc acccagcctg ggt（配列識別番号４６）、及び、
ctcgagagat cctcgcgccc cctacccacc（配列識別番号１１）、によって、上述した低効率開裂部位を有するＡＶＰＲ２−ｔＴＡ構造物を増幅することによっ達成された。
【０１６８】
次に、ＤＲＤ２のコード領域を、５’末端にＥｃｏＲＩを配置し、コード領域の最後のアミノ酸（Ｃｙｓ−４４３）の後にＢｓｓＨＩＩ部位を挿入するように改変した。これはプライマー、
gaattcatgg atccactgaa tctgtcc（配列識別番号４７）、及び、
tgtgcgcgcg cagtggagga tcttcaggaa ggc（配列識別番号４８）、でＰＣＲを使用して行われた。
【０１６９】
得られた改変Ｄ２コード領域を、ＥｃｏＲＩとＢｓｓＨＩＩで切断し、その結果得られたＡＶＰＲ２ Ｃ−末端尾部−低効率開裂部位−ｔＴＡフラグメントを、ＢｓｓＨＩＩとＢａｍＨＩで切断した。両フラグメントを、上述したＡＶＰＲ２−低効率開裂部位−ｔＴＡ構造物に連結し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した。
【０１７０】
クローン４１細胞を、前記低効率ＴＥＶ開裂部位を含むＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ融合構造物と、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのドーパミンＨＣｌ（ドーパミン）、ＤＲＤ２レセプターのアゴニスト、を使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大反応によって、バックグランドのレポーター遺伝子発現の約６０倍の誘導が得られた。
【０１７１】
５’末端にＡｓｐ７１８部位を挿入し、Ｃｙｓ−３４１の後にＢｓｓＨＩＩ部位を配置することによって、前記ＡＤＲＢ２レセプターコード領域を改変した構造物を作成した。これは、プライマー、
gcggccgcca ccatgaacgg taccgaaggc cca（配列識別番号４９）、及び、
tgtgcgcgcg cacagaagct cctggaaggc（配列識別番号５０）、でＰＣＲを使用することによって行われた。
【０１７２】
前記改変ＡＤＲＢ２レセプターコード領域を、ＥｃｏＲＩとＢｓｓＨＩＩとで切断し、前記ＡＶＰＲ２ Ｃ−末端尾部−低効率開裂部位−ｔＴＡフラグメントを、ＢｓｓＨＩＩとＢａｍＨＩで切断した。両フラグメントを、上述したＡＶＰＲ２−低効率開裂部位−ｔＴＡ構造物に連結し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した。得られた構造物が“ＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ”である。（前述した米国特許公開出願２００２／０１０６３７９、特に、配列識別番号３を参照）。
【０１７３】
クローン４１細胞を、前記低効率ＴＥＶ開裂部位を含むＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ融合構造物と、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのイソプロテレノール、ＡＤＲＢ２レセプターのアゴニスト、を使用して解析を行った。イソプロテレノールに対する最大反応で、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の約１０倍の誘導が得られた。
【０１７４】
Ｃｙｓ−３４５の後にＢｓｓＨＩＩ部位を配置することによって、カッパーオピオイドレセプター（ＯＰＲＫ：Genbank受入番号: NM_000912）（配列識別番号５１）コード領域を改変した構造物を作成した。これは、プライマー、
ggtctacttg atgaattcct ggcc（配列識別番号５２）、及び、
gcgcgcacag aagtcccgga aacaccg（配列識別番号５３）、でＰＣＲを使用して行われた。
【０１７５】
前記改変ＯＰＲＫレセプターコード領域をＥｃｏＲＩとＢｓｓＨＩＩで切断し、ＡＶＰＲ２ Ｃ−末端尾部−低効率開裂部位−ｔＴＡフラグメントを、ＢｓｓＨＩＩとＸｈｏＩで切断した。両フラグメントを、前記改変ＯＰＲＫレセプター配列を含むプラスミドに連結し、予めＥｃｏＲＩとＸｈｏＩによって消化しておいた、Ａｓｐ７１８（５’）とＸｈｏＩ（３’）でｐｃＤＮＡ３．１＋にクローニングした。
【０１７６】
クローン４１細胞を、前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ融合構造物と、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ−ＮＩａプロテアーゼ融合物とでコトランスフェクトし、１０μＭのＵ−６９５９３、ＯＰＲＫのアゴニスト、を使用して解析を行った。Ｕ−６９５９３に対する最大反応で、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の約１２倍の誘導が得られた。
【０１７７】
例１７
この実験は、マルチプレックス形態を同時に使用して二つの検定レセプターの活性を測定する解析の使用を示すように構成された。
【０１７８】
クローン４１細胞と、ｔＴＡ−依存性プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子の安定的な組み込みを含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ラインである「クローン１Ｈ１０」細胞とのそれぞれを、２４−ウェルの培養皿にプレーティングし、キメラＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ又は上述のＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡ融合構造物のそれぞれと、一過性にトランスフェクトした。これら一過性トランスフェクションは、各ウェル当たり、１００μｌの培地と、０．４μgのＤＮＡと、２μｌのＦｕＧｅｎｅ試薬を使用して行われた。２４時間のインキュベーションの後、ＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡを発現するクローン４１細胞とＤＲＤ２−ＡＶＰＲ２尾部−ｔＴＡを発現するクローン１Ｈ１０細胞とを、トリプシン処理し、同量で混合し、９６ウェルプレートの１２のウェルに再プレーティングした。三つ組のウェルを、薬剤の添加無しでインキュベートするか、もしくは、１μＭのイソプロテレノール、１μＭのドーパミン、又は１μＭの両アゴニストの混合物、のいずれかで即座に処理した。細胞を、リガンド添加後、約２４時間で、レポーター遺伝子活性について解析した。培地を捨て、細胞を、４０μｌの溶解緩衝液［１００ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ７．８，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００］中に溶解し、細胞溶解物を、ベータ−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼ活性について、市販の発光検出用試薬を使用して解析した。
【０１７９】
その結果が図５Ａと５Ｂとに示されている。イソプロテレノールでの処理によって、ベータ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性の約７倍の誘導が起こったのに対して、ルシフェラーゼ活性は変化しないままであった。ドーパミンでの処理によってルシフェラーゼ活性の３．５倍の誘導が起こったのに対して、ベータ−ガラクトシダーゼ活性は変化しないままであった。イソプロテレノールとドーパミン両方での処理は、ベータ−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼ活性の７倍、及び３倍の誘導がそれぞれ起こった。
【０１８０】
例１８
この実験は、マルチプレックス形態を同時に使用して二つの検定レセプターの活性を測定する解析の使用を説明するように構成された。
【０１８１】
クローン４１細胞の誘導体であり、安定的に組み込まれたＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質遺伝子を含む、「クローン３４．９」細胞を、上述したＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合構造物と一過性にトランスフェクトした。これと平行して、ｔＴＡ−依存性プロモーターの制御下で安定的に組み込まれたルシフェラーゼ遺伝子を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ラインである「クローンＨＴＬ５Ｂ８．１」細胞を、上述のＡＤＲＢ−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合構造物と一過性にトランスフェクトした。各ケースにおいて、５ｘ１０５の細胞を、６ウェル皿の各ウェルにプレーティングし、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８、及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ中で２４時間培養した。細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ、０．５μgのＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ ＤＮＡと、２．５μｌのＦｕｇｅｎｅ（「クローン３４．９細胞」）で、又は、１００μｌのＤＭＥＭ、０．５μgのＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ ＤＮＡ，０．５μｌのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼＤＮＡ及び５μｇのＦｕｇｅｎｅ（「クローンＨＴＬ ５Ｂ８．１細胞」）で、一過性にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトされた細胞を、約２４時間培養し、次に、トリプシン処理し、等量で混合し、９６ウェルプレートのウェルに再プレーティングした。細胞を、１０μＭ−Ｕ−６９５９３、１０μＭのイソプロテレノール又はこれら両方のアゴニストの１０μＭの混合物、での処理の前に２４時間インキュベートした。各実験条件において１６のウェルを解析した。２４時間後、細胞を溶解し、そしてベータ−ガラクトシダーゼ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性を上述のように解析した。その結果を図６に示す。Ｕ−６９５９３での処理によって、ベータ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子活性の約１５倍の誘導が起こったのに対して、ルシフェラーゼ活性は変化しないままであった。イソプロテレノールでの処理ではルシフェラーゼ活性の１４５倍の誘導が行ったのに対して、ベータ−ガラクトシダーゼ活性は変化しないままであった。Ｕ−６９５９３とイソプロテレノールとの両方での処理ではベータ−ガラクトシダーゼとルシフェラーゼ活性の、それぞれ、９倍と１３６倍の誘導が起こった。
【０１８２】
例１９
この例は、本発明の解析における異なる転写因子とプロモーターの使用を示すために行われた。
【０１８３】
ＡＶＰＲ２をコードし、上述したＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏに対する低効率開裂部位を含むアミノ酸リンカーGSENLYFQLR（配列識別番号５４）をコードするＤＮＡ配列にインフレームに融合され、イーストＧＡＬ４タンパク質（GenBank受入番号P04386）（配列識別番号５５）のアミノ酸２−１４７をコードし、その後、リンカー、即ち、配列PELGSASAELTMVF（配列識別番号５６）のリンカーが続き、その後、ネズミ核因子カツパ−Ｂ鎖ｐ６５タンパク質（GenBank受入番号A37932）（配列識別番号５７）のアミノ酸３６８−５４９が続くＤＮＡ配列にインフレーム融合された、融合構造物を作成した。前記ＣＭＶプロモーターを、ＡＶＰＲ２コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＧＡＬ４−ＮＦｋＢ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４と命名した。
【０１８４】
ＨＵＬ ５Ｃ１．１は、市販されているｐＦＲ−ＬＵＣ、ＧＡＬ４上流側活性化配列（ＵＡＳ）の制御下で安定的に組み込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の誘導体である。
【０１８５】
このＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４プラスミドを、上述したβ−アレスチン２−ＴＥＶ Ｎ１ａプロテアーゼと、ＨＵＬ ５Ｃ１．１細胞にコトランスフェクトした。約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を、次の日、５０％のコンフルエンシーに達するまで培養し、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、８５μｌのＤＭＥＭと、０．１μｇのＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−Ｎｉａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４ＤＮＡと、０．１μgのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ Ｎ１ａプロテアーゼＤＮＡと、１μｌのＦｕｇｅｎｅからなる各ウェル当たり１０μｌの混合物で、トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を１０μＭのバソプレッシンでの処理の前に、約１６時間培養した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。これらの条件下において、バソプレッシンでの処理によって、レポーター遺伝子活性の１８０倍の増加が行った。
【０１８６】
例２０
このセットの実験は、相互作用タンパク質の親和性を増加させるように構成された他のレセプター改変体を使用した解析の増強を示すために行われた。この例において、検定レセプターのＣ末端尾部ドメインが、下記のレセプターの１つの対応の尾部ドメインと置換された。即ち、アペリン（ａｐｅｌｉｎ） Ｊレセプター−ＡＧＴＲＬ１（受入番号NM_005161（配列識別番号５８）、ガストリン遊離ペプチドレセプター−ＧＲＰＲ（受入番号NM_005314）（配列識別番号５９）、プロテイナーゼ活性化レセプター２−Ｆ２ＲＬ１（受入番号NM_005242）（配列識別番号６０）、ＣＣＲ４（受入番号NM_005508）（配列識別番号６１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）レセプター４−ＣＸＣＲ４（受入番号NM_003467）（配列識別番号６２）及びインターロイキン８レセプター、ベータ−ＣＸＣＲ２／ＩＬ８ｂ（受入番号NM_001557）（配列識別番号６３）。
【０１８７】
先ず、ＰＣＲを使用して、上述のレセプターのＣ末端尾部をコードするＤＮＡフラグメントを作成した。これらのフラグメントは、最初の二つのアミノ酸（Ａｌａ，Ａ及びＡｒｇ，Ｒ）が、ＢｓｓＨＩＩ制限部位によってコードされるように構成された。
【０１８８】
前記ＡＧＴＲＬ１ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg gccagagcag gtgcgca（配列識別番号６４）、及び、
gaggatccgt caaccacaag ggtctc（配列識別番号６５）、で増幅した。
【０１８９】
。
前記ＧＲＰＲ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg gcctgatcat ccggtct（配列識別番号６６）、及び、
gaggatccga cataccgctc gtgaca（配列識別番号６７）、で増幅した。
【０１９０】
前記Ｆ２ＲＬ１ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgca gtgtccgcac tgtaaagc（配列識別番号６８）、及び、
gaggatccat aggaggtctt aacagt（配列識別番号６９）、で増幅した。
【０１９１】
前記ＣＣＲ４ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg gcctttttgt gctctgc（配列識別番号７０）、及び、
gaggatccca gagcatcatg aagatc（配列識別番号７１）、で増幅した。
【０１９２】
前記ＣＸＣＲ２／ＩＬ８ｂ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg gcttgatcag caagggac（配列識別番号７２）、及び、
gaggatccga gagtagtgga agtgtg（配列識別番号７３）、で増幅した。
【０１９３】
前記ＣＸＣＲ４ Ｃ−末端フラグメントは、プライマー、
tgtgcgcgcg ggtccagcct caagate（配列識別番号７４）、及び、
gaggatccgc tggagtgaaa acttga（配列識別番号７５）、で増幅した。
【０１９４】
これらのレセプターの改変Ｃ−末端尾部ドメインをコードする得られたＤＮＡフラグメントを、ＢｓｓＨＩＩとＢａｍＨＩで切断し、フラグメントを、ＯＰＲＫレセプターコード領域にインフレームで連結し、前述したＯＰＲＫ−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ発現構造物中で、ＡＶＰＲ２−Ｃ−末端尾部フラグメントと置換した。
【０１９５】
前述したＨＴＬ５Ｂ８．１細胞を、上述した改変ＯＰＲＫコード領域−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ構造物、及びβ−アレスチン２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ融合物のそれぞれで、コトランスフェクトした。１ウェル当り約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、次の日５０％のコンフルエンシーに達するまで増殖させ、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、８５μｌのＤＭＥＭ、０．２５μｇのＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４ ＤＮＡと、０．２５μｇのＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼＤＮＡ、及び２.５μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質及びその他の物質を含む専売のトランスフェクション試薬）とからなる、各ウェル当たり１０μｌの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を１０μＭのＵ−６９５９３での処理の前に、約１６時間培養した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。これらの条件下において、Ｕ−６９５９３での処理によって、前記改変ＯＰＲＫレセプターのそれぞれにおいて、レポーター遺伝子活性の下記の相対的増加が生じた。即ち、ＯＰＲＫ−ＡＧＴＲＬ１ Ｃ−末端尾部−３０倍、ＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ Ｃ−末端尾部−３１２倍、ＯＰＲＫ−Ｆ２ＲＬ１ Ｃ−末端尾部−６９．５倍、ＯＰＲＫ−ＣＣＲ４ Ｃ−末端尾部−３．５倍、ＯＰＲＫ−ＣＸＣＲ４ Ｃ−末端尾部−９．３倍、ＯＰＲＫ−ＩＬ８ｂ Ｃ−末端尾部−１１３倍。
【０１９６】
例２１
この実験は、上述したＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質を安定的に発現する細胞ラインを作成するように構成された。
【０１９７】
ＥＦ１αプロモーターの制御下でＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ融合タンパク質を発現するとともに、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターの制御下でハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドを作成した。
【０１９８】
このプラスミドを、ＨＴＬ５Ｂ８．１にトランスフェクトし、このプラスミドの安定ゲノム組み込みを含むクローンを、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下での培養によって選択した。耐性クローンを単離、及び拡張し、上述したＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡプラスミドのトランスフェクションによってスクリーニングした。この手順を使用して選択された三つの細胞ラインを、“ＨＴＬＡ ４Ｃ２．１０”，“ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６”及び“ＨＴＬＡ ５Ｄ４”と命名した。各ウェルに対して約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８，３μｇ／ｍｌのピューロマイシン、及び１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、次の日５０％のコンフルエンシーに達するまで増殖させ、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、８５μｌのＤＭＥＭ、０．２５μｇのＡＶＰＲ２−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ＧＡＬ４ ＤＮＡ、０．５μｌのＦｕｇｅｎｅとからなる、各ウェル当たり１０μｌの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を１０μＭのイソプロテレノールでの処理の前に、約１６時間培養した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。これらの条件下において、イソプロテレノールでの処理によって、前記三つの細胞ラインにおいて、レポーター遺伝子活性の、それぞれ、１１２倍（“ＨＴＬＡ ４Ｃ２．１０”）、５６倍（“ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６”）及び１８０倍（“ＨＴＬＡ ５Ｄ４”）のそれぞれ増加が得られた。
【０１９９】
例２２
この実験は、上述のＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼと、ＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合タンパク質とを安定的に発現する細胞ラインを作成するように構成された。
【０２００】
前記ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＡＲＲＢ２−ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼプラスミドを、上述したＡＤＲＢ２−ＡＶＰＲ２尾部−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ融合タンパク質プラスミドとともに、ＨＴＬ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトし、これらプラスミドの安定ゲノム組み込みを含むクローンを、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下での培養によって選択した。耐性クローンを単離、及び拡張し、１０μＭのイソプロテレノールでの処理によってスクリーニングし、レポーター遺伝子の誘導を上述したように測定した。この手順を使用して選択された三つの細胞ラインを、“ＨＴＬＡＲ １Ｅ４”，“ＨＴＬＡＲ １Ｃ１０”及び“ＨＴＬＡＲ ２Ｇ２”と命名した。イソプロテレノールでの６時間の処理によって、前記三つの細胞ラインにおいて、それぞれ、２０８倍（“ＨＴＬＡＲ １Ｅ４”），１９７倍（“ＨＴＬＡＲ １Ｃ１０”）及び３９０倍（“ＨＴＬＡＲ ２Ｇ２”）のレポーター遺伝子活性の増加が得られた。
【０２０１】
例２３
この実験は、レセプターチロシンキナーゼ上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の活性を測定するための解析の使用を説明するために構成された。
【０２０２】
上述した、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、G enBank受入番号NM_005228（配列識別番号７６）として入手可能な、ヒトＥＧＦＲをコードするＤＮＡを含む第１融合構造物を作成した。これらの配列の間には、上述した、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏのための低効率開裂部位，ＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＧＳＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号７７）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記上皮増殖因子レセプターコード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ｔＴＡ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡと命名する。
【０２０３】
上述した、成熟ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、アミノ酸５３８〜７５９（GenBank受入番号NP_002651.2）（配列識別番号７８）と、アミノ酸２０４０〜２２７９（GenBank受入番号AAA47910）（配列識別番号７９）とにそれぞれ対応する、ヒト ホスホリパーゼＣ ガンマ １の二つの２Ｈ２ドメインをコードするＤＮＡを含む、第２融合構造物を作成した。これらの配列の間には、アミノ酸ＮＳＳＧＧＮＳＧＳ（配列識別番号８０）をコードするリンカーＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記ＰＬＣ−ガンマ ＳＨ２ドメインのコード配列の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ配列の下流側に配置した。この構造物を、ＰＬＣ ガンマ １−ＴＥＶと命名する。
【０２０４】
前記ＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡとＰＬＣ ガンマ １−ＴＥＶの融合構造物を、上述したクローンＨＴＬ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトした。約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を、次の日５０％のコンフルエンシーに達するまで増殖させ、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、１００μｌのＤＭＥＭ、０．４μｇのｐｃＤＮＡ３ ＤＮＡ（「キャリア」ベクターＤＮＡ）、０．０４μｇのＥＧＦＲ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ ＤＮＡ、０．０４μgのＰＬＣ ガンマ １−ＴＥＶ ＤＮＡ、２μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質及びその他の物質を含む専売のトランスフェクション試薬）とからなる、各ウェル当たり１５μｌの混合物でトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、特定のレセプターアゴニスト及びインヒビターでの処理の前に、約１６時間培養した。６時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。その結果を図７に示す。
【０２０５】
２．５ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（このリガンドに対するＥＣ８０に対応）の添加によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の１２．３倍の増加が得られたのに対して、１００ｎｇ／ｍｌのヒト形質転換増殖因子−アルファの添加によって１８．３倍の増加が得られた。ヒト上皮増殖因子添加前のチロシンキナーゼインヒビターでの前処理（７０μＭ ＡＧ−４９４；０．３μＭ ＡＧ−１４７８；２ｍＭ ＲＧ−１３００２２）によって、レポーター遺伝子活性の誘導は阻止された。
【０２０６】
例２４
この実験は、ヒトＩ型インターフェロンレセプターの活性を測定するための解析の使用を説明するように構成された。
【０２０７】
上述した、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、GenBank受入番号NM_000629 （配列識別番号８１）として入手可能な、ヒトインターフェロンレセプターＩ（ＩＦＮＡＲ１）（５５７のアミノ酸）をコードするＤＮＡを含む融合構造物を作成した。これらの配列の間には、上述したＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏに対する低効率開裂部位，ＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号８２）コードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記ヒトインターフェロンレセプターＩ（ＩＦＮＡＲ１）コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ｔＴＡ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡと命名する。
【０２０８】
アミノ酸２０４０〜２２７９（GenBank 受入番号AAA47910）（配列識別番号８４）に対応する、上述した、ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列にインフレームに融合された、GenBank受入番号Ｌ４１９４２（配列識別番号８３）として入手可能な、ヒトインターフェロンレセプター２、スプライスバリアント２（ＩＦＮＡＲ２．２）（５１５のアミノ酸）をコードするＤＮＡを使用して第２融合構造物を作成した。これらの配列の間には、アミノ酸配列ＲＳ（Ａｒｇ−Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、ヒトインターフェロンレセプター２（ＩＦＮＡＲ２．２）コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＴＥＶ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶと命名する。
【０２０９】
GenBank受入番号NM_007315（配列識別番号８５）として入手可能なヒト シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）、GenBank受入番号NM_005419（配列識別番号８６）として入手可能なヒト シグナル伝達性転写因子２２（ＳＴＡＴ２）の遺伝子がＣＭＶプロモーター領域の制御下で発現される発現構造物も生成した。これらの構造物を、それぞれ、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１及びＣＭＶ−ＳＴＡＴ２と命名した。
【０２１０】
前記ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡとＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶの融合構造物を、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１とＣＭＶ−ＳＴＡＴ２と共に、上述したＨＴＬ５Ｂ８．１細胞に一過性にトランスフェクトした。約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし及び培養した。２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡ、ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ、ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１、及びＣＭＶ−ＳＴＡＴ２ ＤＮＡのそれぞれ１５ｎｇ又は、６０ｎｇの対照ｐｃＤＮＡプラスミドで、各ウェル当たり０．３μｌのＦｕｇｅｎｅと共に、トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、５０００Ｕ／ｍｌのヒトインターフェロン−アルファ又は５０００Ｕ／ｍｌのヒトインターフェロン−ベータでの処理の前、８〜２０時間培養した。インターフェロン添加時、培地を吸引し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、３μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した２９３ ＳＭＦ ＩＩ培地で置換した。インターフェロン処理された細胞を、上述したようにルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を解析する前に、更に１８〜２０時間培養した。結果を図８に示す。５０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−αでの処理によってレポーター遺伝子活性が１５倍増加したのに対して、５０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−βでの処理によって１０倍増加した。前記対照プラスミドｐｃＤＮＡ３とトランスフェクトされたＨＴＬ５Ｂ８．１細胞のインターフェロン処理ではレポーター遺伝子活性に効果は無かった。図９は、上述したＩＦＮＡＲ１（ＥＮＬＹＦＱ（Ｌ）−ｔＴａ，ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ，ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２発現構造物でトランスフェクトされたＨＴＬ５Ｂ８．１細胞におけるＩＦＮ−αに対して生成された用量−反応曲線を図示している。
【０２１１】
例２５
この実験は、別の転写因子と別の細胞ラインを使用したヒトＩ型インターフェロンレセプターの活性を測定するための解析の使用を説明すべく構成された。
【０２１２】
上述のＧＡＬ４−ＮＦ−ｋＢ−融合物をコードするＤＮＡ配列にインフレーム融合された、ヒト インターフェロンレセプターＩ（ＩＦＮＡＲ１）をコードするＤＮＡを使用して融合構造物が形成された。これらの配列の間には、上述した、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏに対する低効率開裂部位，ＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号１４）を含む、アミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号８７）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、ヒト インターフェロンレセプターＩ（ＩＦＮＡＲ１）コード領域の上流側に配置し、そして、ポリＡ配列を、ＧＡＬ４−ＮＦ−ｋＢ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ＧＡＬ４−ＮＦ−ｋＢと命名する。
【０２１３】
次に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５つのプラスミド、即ち、ＩＦＮＡＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ＧＡＬ４−ＮＦ−ｋＢ，ＩＦＮＡＲ２．２−ＴＥＶ，ＣＭＶ−ＳＴＡＴ１，ＣＭＶ−ＳＴＡＴ２、及びｐＦＲ−Ｌｕｃ、ＧＡＬ４−依存プロモーターの制御下でのルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド、の混合物と一過性でトランスフェクトした。各ウェル当たり約１．０ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地中でのトランスフェクションの２４時間前、９６ウェルプレートに播種した。次の日、細胞を、各ウェルにつき、１０ｎｇのレポータープラスミド（ｐＦＲ−Ｌｕｃ）と２０ｎｇの上述した発現構造物のそれぞれ、又は、１０ｎｇのレポータープラスミドと８０ｎｇの対照ｐｃＤＮＡ３プラスミドを、各ウェル当たり０．３μｌのＦｕｇｅｎｅと共に、トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、５０００Ｕ／ｍｌのヒト インターフェロン アルファでの処理の前、８〜２０時間培養した。インターフェロン添加時、培地を吸引し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリンを添加したＤＭＥＭ培地と置換した。インターフェロン処理された細胞を、上述したようなルシフェラーゼレポーター遺伝子活性について解析する前、更に６時間培養した。結果を図１０に示す。前記レポーター、ＩＦＮＡＲ及びＳＴＡＴ構造物でトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞のＩＦＮ−α処理によってレポーター遺伝子活性が３倍増加したのに対して、前記レポーター及び対照プラスミドでトランスフェクトした細胞のインターフェロン処理ではレポーター遺伝子活性に効果が無かった。
【０２１４】
例２６
この組の実験は、前記相互作用タンパク質に対する検定レセプターの親和性を増加させるように構成されたレセプター改変体を使用する解析の更なる増強を説明すべく行われた。これらの例において、前記検定レセプターと、ＧＲＰＲ（Genbank受入番号NM_005314）（配列識別番号５９）のＣ末端尾部ドメインとの間の融合接合部を、前記第７膜貫通螺旋の端部の保存ＮＰＸＸＹモチーフの後のアミノ酸１７〜２３として作成した。
【０２１５】
先ず、ＰＣＲを使用して、推定パルミトイル化部位の後の二つのアミノ酸から始まるＧＲＰＲからＣ末端４２のアミノ酸をコードするＤＮＡフラグメント（以後、ＧＲＰＲ ４２ａａと称する）を作成した。前記フラグメントは、Ｃ末端尾部の最初のアミノ酸の前に、ＴＣＴＡＧＡのＸｂａＩ制限部位によってコードされる二つのアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｓ及びＡｒｇ，Ｒ）があり、終止コドンが、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣによってコードされる二つのアミノ酸（Ｇｌｙ，Ｇ及びＳｅｒ，Ｓ）によって置換されるように構成された。これは、プライマー、
tctagaggcctgatcatccggtctcac（配列識別番号８８）、及び、
gaggatccgacataccgctcgtgaca（配列識別番号６７）、でＧＲＰＲコード領域を含むプラスミドを増幅することによって達成された。
【０２１６】
次に、ＯＰＲＫ（Genbank受入番号NM_000912）（配列識別番号５１）のコード領域をＰｒｏ−３４７の後に、ＸｂａＩ部位を挿入するように改変した。これは、プライマー、
ggtctacttgatgaattcctggcc（配列識別番号５２）、及び、
tctagatggaaaacagaagtcccggaaac（配列識別番号８９）、でのＰＣＲを使用して行われた。
【０２１７】
更に、ＡＤＲＡ１Ａ（Genbank受入番号NM_000680）（配列識別番号９０）のコード領域を、Ｌｙｓ−３４９の後にＸｂａＩ部位を挿入するように改変した。これは、プライマー、
ctcggatatctaaacagctgcatcaa（配列識別番号９１）、及び、
tctagactttctgcagagacactggattc（配列識別番号９２）、でＰＣＲを使用して行われた。
【０２１８】
更に、ＤＲＤ２（Genbank受入番号NM_000795（配列識別番号３７）のコード領域を、二つのアミノ酸（Ｌｅｕ及びＡｒｇ）とＣｙｓ−３４３の後にＸｂａＩ部位とを挿入するように改変した。これは、プライマー、
gaattcatggatccactgaatctgtcc（配列識別番号３８）、及び、
tctagatcgaaggcagtggaggatcttcagg（配列識別番号９３）、でＰＣＲを使用して行われた。
【０２１９】
前記改変ＯＰＲＫレセプターコード領域をＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで切断し、前記ＧＲＰＲ ４２ａａＣ−末端尾部フラグメントをＸｂａＩとＢａｍＨＩとで切断した。両フラグメントを、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで消化しておいた、上述した、ＡＶＰＲ２ Ｃ−末端尾部低効率開裂部位ｔＴＡを備えるＯＰＲＫレセプターを含むプラスミドに連結した。
【０２２０】
前記改変ＡＤＲＡ１Ａレセプターコード領域を、ＥｃｏＲＶとＸｂａＩとで切断し、前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物をＸｂａＩとＸｈｏＩとで切断した。両フラグメントを、ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩとで消化しておいた前記ＡＤＲＡ１Ａレセプターを含むプラスミドに連結した。
【０２２１】
前記改変ＤＲＤ２レセプターコード領域を、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで切断し、そして前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物をＸｂａＩとＸｈｏＩとで切断した。両フラグメントを、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化されたｐｃＤＮＡ６プラスミドに連結した。
【０２２２】
上述したＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μＭ Ｕ−６９５９３、ＯＰＲＫのアゴニスト、を使用して解析を行った。Ｕ−６９５９３に対する最大反応によって、レポーター遺伝子活性の約２００倍の増加が得られた。
【０２２３】
ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μのエピネフリン、ＡＤＲＡ１Ａのアゴニスト、を使用して解析を行った。エピネフリンに対する最大反応によって、レポーター遺伝子活性の約１４倍の増加が得られた。
【０２２４】
ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＤＲＤ２−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μＭのドーパミン、ＤＲＤ２のアゴニスト、を使用して解析を行った。ドーパミンに対する最大反応によって、レポーター遺伝子活性の約３０倍の増加が得られた。
【０２２５】
例２７
この組の実験は、相互作用タンパク質に対する親和性を増大させるように構成された異なる組の検定レセプター改変を使用した解析の更なる増強を証明するために行われた。これらの例において、検定レセプターのＣ末端尾部ドメインが、ＧＲＰＲの内在性のＣ末端尾部ドメインの一部と置換された。
【０２２６】
先ず、ＰＣＲを使用して、切断されたＧＲＰＲ尾部をコードするＤＮＡフラグメント、具体的には、Ｇｌｙ−３４３からＡｓｎ−３６５への２３アミノ酸をコードする配列、を作成した。このフラグメントは、Ｃ末端尾部の最初のアミノ酸の前に、ＸｂａＩ制限部位ＴＣＴＡＧＡによってコードされる二つのアミノ酸（Ｓｅｒ，ＳとＡｒｇ，Ｒ）があり、Ｓｅｒ−３６６が、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣによってコードされる二つのアミノ酸（Ｇｌｙ，ＧとＳｅｒ，Ｓ）によって置換されるように構成された。これは、プライマー、
tctagaggcctgatcatccggtctcac（配列識別番号９４）、及び、
cggatccgttggtactcttgagg（配列識別番号９５）、でＧＲＰＲコード領域を含むプラスミドを増幅することによって達成された。
【０２２７】
次に、前記切断されたフラグメント（以下、ＧＲＰＲ ２３ａａ尾部と称する）を、ＸｂａＩとＢａｍＨＩとで切断し、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化した、上述した低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物に挿入した。
【０２２８】
同様に、前記ＧＲＰＲ ２３ａａ尾部フラグメントを、ＸｂａＩとＢａｍＨＩとで切断し、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化した、上述した低効率開裂部位を含むＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ ４２ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物に挿入した。
【０２２９】
ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＯＰＲＫ−ＧＲＰＲ ２３ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μＭのＵ−６９５９３、ＯＰＲＫのアゴニスト、を使用して解析を行った。Ｕ−６９５９３に対する最大反応によって、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の約１１５倍の誘導が得られた。
【０２３０】
ＨＴＬＡ ２Ｃ１１．６細胞を、前記低効率開裂部位を含むＡＤＲＡ１Ａ−ＧＲＰＲ ２３ａａ尾部−ｔＴＡ融合構造物でトランスフェクトし、１０μＭのエピネフリン、ＡＤＲＡ１Ａのアゴニスト、を使用して解析を行った。エピネフリンに対する最大反応によって、バックグランドに対してレポーター遺伝子発現の約１０２倍の誘導が得られた。
【０２３１】
例２８
この実験は、レセプター チロシンキナーゼ インスリン様増殖因子−１レセプター（ＩＧＦ１Ｒ）の活性を測定、具体的には、細胞内シグナリングタンパク質ＳＨＣ１（Ｓｒｃホモロジー２ドメイン−含有トランスフォーミングタンパク質１）のリガンド誘導性の補充をモニタリングすることによって測定、するための解析の使用を示すように構成された。
【０２３２】
上述した、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、GenBank受入番号NM_000875（配列識別番号９６）として入手可能な、ヒトＩＧＦ−１ＲをコードするＤＮＡを含む第１融合構造物を作成した。これらの配列の間には、上述した、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏに対する低効率開裂部位，ＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号１４）を含むアミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号８２）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記ＩＧＦ１Ｒコード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ｔＴＡ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡと命名する。
【０２３３】
上述した、成熟ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合されたアミノ酸１〜２３８（GenBank受入番号BC014158）（配列識別番号９７）、アミノ酸２０４０〜２２７９（GenBank受入番号AAA47910）（配列識別番号７９）に対応する、ヒトＳＨＣ１のＰＴＢドメインをコードするＤＮＡを含む、第２融合構造物を作成した。これらの配列の間には、アミノ酸ＮＳＧＳ（配列識別番号９８）をコードするリンカーＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを、前記ＳＨＣ１ ＰＴＢドメインコード配列の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼ配列の下流側に配置した。この構造物を、ＳＨＣ１−ＴＥＶと命名する。
【０２３４】
前記ＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡとＳＨＣ１−ＴＥＶの融合構造物を、上述したクローンＨＴＬ５Ｂ８．１細胞にトランスフェクトした。約２．５ｘ１０４の細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８、及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。細胞を、次の日５０％のコンフルエンシーに達するまで増殖させ、細胞への添加の前に室温で１５分間インキュベートしておいた、１００μｌのＤＭＥＭと、０.２μgのＩＧＦ１Ｒ−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌｅｕ）−ｔＴＡ ＤＮＡ、０．２μｇのＳＨＣ１−ＴＥＶ ＤＮＡ、２μｌのＦｕｇｅｎｅ（脂質及びその他の物質を含む専売のトランスフェクション試薬）とからなる、各ウェル当たり１５μｌの混合物で、トランスフェクトした。トランスフェクト細胞を特定のレセプターアゴニストでの処理の前に、約１６時間培養した。２４時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を上述したように解析した。
【０２３５】
１μＭのヒトインスリン様成長因子１の添加によって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の９０倍の増加が得られた。
【０２３６】
例２９
この実験は、正常に膜結合しない二つの検定タンパク質の相互作用を測定する解析の使用を説明するように構成された。この例において、前記解析を使用して、核ステロイドホルモンレセプター、ＥＳＲ１（エストロゲンレセプター１またはＥＲアルファ）、及びＥＳＲ２（エストロゲンレセプター２又はＥＲベータ）のリガンド誘導性の二量化を測定した。この例において、ＥＳＲ１は、転写因子ｔＴＡに融合され、他方、ＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏプロテアーゼの開裂部位を、ＥＳＲ１とｔＴＡ配列の間に挿入する。このＥＳＲ１−ｔＴＡ融合物を、前記膜貫通タンパク質ＣＤ８の前記細胞内、Ｃ−末端への融合によって前記膜に係留させる。ＣＤ８は、本質的に、ＥＳＲ１を細胞膜の細胞質側に係留する不活性足場（scaffold）として作用する。それに融合された転写因子は、ＥＳＲ２とプロテアーゼとの相互作用までは、核に入ることができない。任意の膜貫通タンパク質を使用することが可能であろう。このＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ ＮＩａ Ｐｒｏ開裂−ｔＴＡ融合タンパク質は、ｔＴＡ−依存性レポーター遺伝子を含有する細胞ラインにおいて、ＥＳＲ２とＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏプロテアーゼとから成る第２融合タンパク質と共に、発現される。ＥＳＲ１とＥＳＲ２とのエストロゲン誘導性の二量化は、それによって、膜結合融合物からのｔＴＡ転写因子の遊離を誘因し、これが、その後のレポーター遺伝子活性の誘導によって検出される。
【０２３７】
Genbank受入番号NM_000125（配列識別番号１００）として入手可能な、ヒトＥＳＲ１（５９６のアミノ酸）をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、Genbank受入番号NM_001768（配列識別番号９９）として入手可能な、ヒトＣＤ８遺伝子（２３５のアミノ酸）をコードするＤＮＡを含む融合構造物を作成した。これらの配列の間には、前記アミノ酸配列ＧＲＡ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。次に、これによって得られた構造物を、上述したテトラサイクリン制御トランスアクチベーターｔＴＡのアミノ酸３〜３３５をコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合する。これらの配列の間には、上述したＴＥＶ ＮＩａ−Ｐｒｏの低効率開裂部位，ＥＮＬＦＱＬ（配列識別番号１４）を含む、アミノ酸配列ＧＳＥＮＬＹＦＱＬ（配列識別番号８２）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーターを前記ヒトＣＤ８コード領域の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ｔＴＡ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡと命名する。
【０２３８】
アミノ酸２０４０〜２２７９（GenBank受入番号AAA47910）（配列識別番号８４）に対応する、上述した、前記ＴＥＶ ＮＩａプロテアーゼの触媒ドメインをコードするＤＮＡ配列にインフレームで融合された、Genbank受入番号NM_001437（配列識別番号１０１）で入手可能な、ヒトエストロゲンレセプターベータ（ＥＳＲ２）（５３０のアミノ酸）をコードするＤＮＡを使用して第２融合構造物を作成した。これらの配列の間には、アミノ酸ＲＳ（Ａｒｇ−Ｓｅｒ）をコードするＤＮＡ配列が挿入されている。前記ＣＭＶプロモーター領域を、前記ヒトエストロゲンレセプターベータ（ＥＳＲ２）コード配列の上流側に配置し、ポリＡ配列を、ＴＥＶ領域の下流側に配置した。この構造物を、ＥＳＲ２−ＴＥＶと命名する。
【０２３９】
前記ＣＤ８−ＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡとＥＳＲ２−ＴＥＶの融合構造物を、ｐＣＤＮＡ３と共に、上述したＨＴＬ５Ｂ８．１細胞に一過性にトランスフェクトした。約２．０ｘ１０４の細胞を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに蒔種し、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した無フェノールＤＭＥＭ培地中で培養した。２４時間のインキュベーション後、細胞を、各ウェル当たり、５ｎｇのＥＳＲ１−ＴＥＶ−ＮＩａ−Ｐｒｏ開裂（Ｌ）−ｔＴＡと、１５ｎｇのＥＳＲ２−ＴＥＶと、４０ｎｇのｐＣＤＮＡ３との混合物と、０３μｌのＦｕｇｅｎｅと共にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、５０ｎＭ １７−β−エストラジオールでの処理の処理の前、２４時間、血清無しで、１００μｌの無フェノールＤＭＥＭ中でインキュベートした。リガンド処理された細胞を、上述したようにルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を解析する前に、更に１８〜２０時間培養した。５０ｎＭの１７−β−エストラジオールでの処理によって、レポーター遺伝子活性の１６倍の増加が得られた。
【０２４０】
本発明のその他の特徴は、当業者には明らかであろうから、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】一例として、リガンド−レセプター結合を使用する本発明の概念的基礎を示す図。
【図２ａ】アゴニストとアンタゴニストとの両方に対して、本発明による解析の標的の反応が用量依存性であることを示す図。
【図２ｂ】アゴニストとアンタゴニストとの両方に対して、本発明による解析の標的の反応が用量依存性であることを示す図。
【図３】用量反応曲線が、別の標的と別のアゴニストでも生じることを示す図。
【図４】Ｄ２ドーパミンレセプターを使用した、本発明によって得られた結果を示す図。
【図５ａ】二つの分子を同時に研究することが可能であることを示す解析の結果を示す図。
【図５ｂ】二つの分子を同時に研究することが可能であることを示す解析の結果を示す図。
【図６】別の「マルチプレックス」解析、即ち、二つの分子が同時に研究される解析の結果を示す図。
【図７】ＥＧＦＲ活性を測定する解析から得られたデータを示す図。
【図８】ヒトＩ型インターフェロンレセプターの活性を測定するように構成された、本発明による解析から得られたデータを示す図。
【図９】図７を作り出すのに使用された細胞におけるＩＦＮ−αの用量反応曲線を図示し、図７の結果をより詳細に示す図。
【図１０】別の転写因子と別の細胞ラインが使用された別の実施例の結果を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するための方法であって、以下でトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞に、前記化合物を接触させる工程、
（ａ）下記を含む核酸分子、
（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部に対する開裂部位をコードするヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）前記細胞内においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、そして、
（ｂ）下記を含む核酸分子、
（ｉ）前記検定化合物の存在下における、前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、
及び、前記化合物が前記タンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かの測定として、前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、とを含む、
検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するための方法。
【請求項２】
前記第１検定タンパク質が、膜結合タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜結合タンパク質が、膜貫通レセプターである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記膜貫通レセプターが、ＧＰＣＲである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部が、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質が、転写因子である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記転写因子が、ｔＴＡ又はＧＡＬ４である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記前記第２タンパク質が、抑制型タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抑制型タンパク質がアレスチンであり、前記第１タンパク質は膜貫通レセプターである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、真核細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーター遺伝子が、外来性遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記外来性遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼをコードする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第２検定タンパク質との相互作用を増加させるように改変されている請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記改変が、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換することを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃ末端領域の前記ヌクレオチド配列が、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＰＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ，ＣＣＲ４又はＧＲＰＲのＣ末端領域の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列によって置換されている請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上の検定化合物を複数の細胞サンプルに接触させる工程を含み、前記サンプルのそれぞれは、前記単数又は複数の前記化合物によって接触され、ここで、前記細胞サンプルのそれぞれが、（ａ）及び（ｂ）によってトランスフォーム又はトランスフェクトされており、前記化合物のいずれかが前記特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するべく前記複数のサンプル中におけるレポーター遺伝子の活性を測定する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記膜結合タンパク質が、β２−アドレナリン作動性レセプター（ＡＤＲＢ２）、アルギニンバソプレッシンレセプター２（ＡＶＰＲ２）、セロトニンレセプター１ａ（ＨＴＲ１Ａ）、ｍ２ムスカリン性アセチルコリンレセプター（ＣＨＲＭ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター５（ＣＣＲ５）、ドーパミンＤ２レセプター（ＤＲＤ２）、カッパーオピオイドレセプター（ＯＰＲＫ）、又はＡＤＲＡ１Ａである請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
そのそれぞれがその他すべてと異なる１つの検定化合物と、前記サンプルのそれぞれを接触させる工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルのそれぞれを前記検定化合物の混合物と接触させる工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
検定化合物が単数又は複数の対象のタンパク質相互作用を調節するか否かを測定する方法であって、前記検定化合物を複数の細胞サンプルに接触させる工程であって、前記細胞サンプルのそれぞれが、
（ａ）以下を含む第１核酸分子、
（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼのための開裂部位をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉｉ）前記細胞内においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）以下を含む第２核酸分子、
（ｉ）前記対象検定化合物の存在下における前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列、によってトランスフォーム又はトランスフェクトされており、ここで、前記第１検定タンパク質は前記複数のサンプルのそれぞれにおいて他の第１検定タンパク質と異なる、工程、及び、
前記複数のサンプルのうちの１つ又は複数における前記レポーター遺伝子の活性を、単数又は複数の対象タンパク質の相互作用の調節の測定として測定する工程、を含む、
検定化合物が単数又は複数の対象のタンパク質相互作用を調節するか否かを測定する方法。
【請求項２１】
前記第２検定タンパク質が、各サンプルにおいて異なる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２検定タンパク質が、各サンプルにおいて同じである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルのすべてが共通の容器内で組み合わせられ、そして、各サンプルが異なる対の第１検定タンパク質と第２検定タンパク質を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
各サンプルが、異なる容器内で検定される請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
あるサンプル内の前記レポーター遺伝子が、他のサンプル内のレポーター遺伝子と異なる請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物の混合物が、生体試料を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体試料が、脳脊髄液、尿、血液、血清、膿汁、腹水、滑液、組織抽出物、又は浸出物である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）以下を有する核酸分子、
（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉｉ）細胞中においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、そして、
（ｂ）以下を有する核酸分子、
（ｉ）前記検定化合物の存在下におけるその前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、
によってトランスフォーム又はトランスフェクトされている組換え細胞。
【請求項２９】
前記核酸分子の一方又は両方が、前記細胞のゲノムに安定的に組み込みまれている請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３０】
前記細胞が、前記レポーター遺伝子によってトランスフォーム又はトランスフェクトされている請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３１】
前記第１検定タンパク質が、膜結合タンパク質である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３２】
前記膜結合タンパク質が、膜貫通レセプターである請求項３１に記載の組換え細胞。
【請求項３３】
前記膜貫通レセプターが、ＧＰＣＲである請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項３４】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部が、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼである請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３５】
前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質が、転写因子である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３６】
前記膜結合タンパク質が、ＡＤＢＲ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、又はＯＰＲＫである請求項３１に記載の組換え細胞。
【請求項３７】
前記転写因子が、ｔＴＡ又はＧＡＬ４である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３８】
前記前記第２タンパク質が、抑制型タンパク質である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３９】
前記抑制型タンパク質がアレスチンであり、前記第１タンパク質が膜貫通レセプターである請求項３８に記載の組換え細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、真核細胞である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項４１】
前記細胞が、原核細胞である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項４２】
前記レポーター遺伝子が、外来性遺伝子である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項４３】
前記外来性遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼをコードする請求項４２に記載の組換え細胞。
【請求項４４】
前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第２タンパク質との相互作用を増加させるように改変されている請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項４５】
前記改変が、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換することを含む請求項４４に記載の組換え細胞。
【請求項４６】
前記Ｃ末端領域の前記ヌクレオチド配列が、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＰＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ又は ＣＣ４のＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列によって置換されている請求項４４に記載の組換え細胞。
【請求項４７】
（ｉ）検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉｉ）細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
を５’から３’の順番で含む単離核酸分子。
【請求項４８】
前記検定タンパク質が、膜結合タンパク質である請求項４７に記載の単離核酸分子。
【請求項４９】
前記膜結合タンパク質が、膜貫通レセプターである請求項４８に記載の単離核酸分子。
【請求項５０】
前記膜貫通レセプターが、ＧＰＣＲである請求項４９に記載の単離核酸分子。
【請求項５１】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部が、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼである請求項４７に記載の単離核酸分子。
【請求項５２】
前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質が、転写因子である請求項４７に記載の単離核酸分子。
【請求項５３】
前記転写因子が、ｔＴＡ又はＧＡＬ４である請求項５２に記載の単離核酸分子。
【請求項５４】
前記膜結合タンパク質が、ＡＤＢＲ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、又はＯＰＲＫである請求項４８に記載の単離核酸分子。
【請求項５５】
請求項４７に記載の単離核酸分子を含み、プロモーターに操作連結されている発現ベクター。
【請求項５６】
（ｉ）検定化合物の存在下において別の検定タンパク質とのその相互作用が測定される検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉ）開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、
を含む単離核酸分子。
【請求項５７】
前記検定タンパク質が、抑制型タンパク質である請求項５６に記載の単離核酸分子。
【請求項５８】
前記抑制型タンパク質が、アレスチンである請求項５７に記載の単離核酸分子。
【請求項５９】
請求項５６に記載の単離核酸分子を含み、プロモーターに操作連結されている発現ベクター。
【請求項６０】
請求項４７に記載の単離核酸分子の発現によって生成される融合タンパク質。
【請求項６１】
請求項５６に記載の単離核酸分子の発現によって生成される融合タンパク質。
【請求項６２】
検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するのに有用な検定キットであって、
（ａ）以下を含む核酸分子、
（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）以下を含む核酸分子、
（ｉ）前記検定化合物の存在下における前記第１検定タンパク質とのその相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、そして、
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）のそれぞれを互いに対して分離して保持するための容器手段、
それぞれの別部分を含む、検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するのに有用な検定キット。
【請求項６３】
前記第１検定タンパク質が、膜結合タンパク質である請求項６２に記載の検定キット。
【請求項６４】
前記膜結合タンパク質が、膜貫通レセプターである請求項６３に記載の検定キット。
【請求項６５】
前記膜貫通レセプターが、ＧＰＣＲである請求項６４に記載の検定キット。
【請求項６６】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部が、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼである請求項６２に記載の検定キット。
【請求項６７】
前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質が、転写因子である請求項６２に記載の検定キット。
【請求項６８】
前記転写因子が、ｔＴＡ又はＧＡＬ４である請求項６７に記載の検定キット。
【請求項６９】
前記第２タンパク質が、抑制型タンパク質である請求項６２に記載の検定キット。
【請求項７０】
前記抑制型タンパク質がアレスチンであり、前記第１タンパク質が膜貫通レセプターである請求項６９に記載の検定キット。
【請求項７１】
レポーター遺伝子をコードする単離核酸分子の別部分を含む請求項６１に記載の検定キット。
【請求項７２】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼをコードする請求項７１に記載の検定キット。
【請求項７３】
前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第２タンパク質との相互作用を増加させるように改変されている請求項６２に記載の検定キット。
【請求項７４】
前記改変が、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換することを含む請求項７３に記載の検定キット。
【請求項７５】
前記Ｃ末端領域の前記ヌクレオチド配列が、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＲＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ，又はＣＣＲ４をコードするヌクレオチド配列によって置換されている請求項７４に記載の検定キット。
【請求項７６】
前記膜結合タンパク質が、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、又はＯＰＲＫである請求項６３に記載の検定キット。
【請求項１】
検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するための方法であって、以下でトランスフォーム又はトランスフェクトされた細胞に、前記化合物を接触させる工程、
（ａ）下記を含む核酸分子、
（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部に対する開裂部位をコードするヌクレオチド配列、及び
（ｉｉｉ）前記細胞内においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、そして、
（ｂ）下記を含む核酸分子、
（ｉ）前記検定化合物の存在下における、前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、
及び、前記化合物が前記タンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かの測定として、前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、とを含む、
検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するための方法。
【請求項２】
前記第１検定タンパク質が、膜結合タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜結合タンパク質が、膜貫通レセプターである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記膜貫通レセプターが、ＧＰＣＲである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部が、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質が、転写因子である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記転写因子が、ｔＴＡ又はＧＡＬ４である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記前記第２タンパク質が、抑制型タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記抑制型タンパク質がアレスチンであり、前記第１タンパク質は膜貫通レセプターである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、真核細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーター遺伝子が、外来性遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記外来性遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼをコードする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第２検定タンパク質との相互作用を増加させるように改変されている請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記改変が、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換することを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃ末端領域の前記ヌクレオチド配列が、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＰＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ，ＣＣＲ４又はＧＲＰＲのＣ末端領域の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列によって置換されている請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上の検定化合物を複数の細胞サンプルに接触させる工程を含み、前記サンプルのそれぞれは、前記単数又は複数の前記化合物によって接触され、ここで、前記細胞サンプルのそれぞれが、（ａ）及び（ｂ）によってトランスフォーム又はトランスフェクトされており、前記化合物のいずれかが前記特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するべく前記複数のサンプル中におけるレポーター遺伝子の活性を測定する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記膜結合タンパク質が、β２−アドレナリン作動性レセプター（ＡＤＲＢ２）、アルギニンバソプレッシンレセプター２（ＡＶＰＲ２）、セロトニンレセプター１ａ（ＨＴＲ１Ａ）、ｍ２ムスカリン性アセチルコリンレセプター（ＣＨＲＭ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター５（ＣＣＲ５）、ドーパミンＤ２レセプター（ＤＲＤ２）、カッパーオピオイドレセプター（ＯＰＲＫ）、又はＡＤＲＡ１Ａである請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
そのそれぞれがその他すべてと異なる１つの検定化合物と、前記サンプルのそれぞれを接触させる工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルのそれぞれを前記検定化合物の混合物と接触させる工程を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
検定化合物が単数又は複数の対象のタンパク質相互作用を調節するか否かを測定する方法であって、前記検定化合物を複数の細胞サンプルに接触させる工程であって、前記細胞サンプルのそれぞれが、
（ａ）以下を含む第１核酸分子、
（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼのための開裂部位をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉｉ）前記細胞内においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）以下を含む第２核酸分子、
（ｉ）前記対象検定化合物の存在下における前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列、によってトランスフォーム又はトランスフェクトされており、ここで、前記第１検定タンパク質は前記複数のサンプルのそれぞれにおいて他の第１検定タンパク質と異なる、工程、及び、
前記複数のサンプルのうちの１つ又は複数における前記レポーター遺伝子の活性を、単数又は複数の対象タンパク質の相互作用の調節の測定として測定する工程、を含む、
検定化合物が単数又は複数の対象のタンパク質相互作用を調節するか否かを測定する方法。
【請求項２１】
前記第２検定タンパク質が、各サンプルにおいて異なる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２検定タンパク質が、各サンプルにおいて同じである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルのすべてが共通の容器内で組み合わせられ、そして、各サンプルが異なる対の第１検定タンパク質と第２検定タンパク質を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
各サンプルが、異なる容器内で検定される請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
あるサンプル内の前記レポーター遺伝子が、他のサンプル内のレポーター遺伝子と異なる請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物の混合物が、生体試料を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体試料が、脳脊髄液、尿、血液、血清、膿汁、腹水、滑液、組織抽出物、又は浸出物である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）以下を有する核酸分子、
（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉｉ）細胞中においてレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、そして、
（ｂ）以下を有する核酸分子、
（ｉ）前記検定化合物の存在下におけるその前記第１検定タンパク質との相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、
によってトランスフォーム又はトランスフェクトされている組換え細胞。
【請求項２９】
前記核酸分子の一方又は両方が、前記細胞のゲノムに安定的に組み込みまれている請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３０】
前記細胞が、前記レポーター遺伝子によってトランスフォーム又はトランスフェクトされている請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３１】
前記第１検定タンパク質が、膜結合タンパク質である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３２】
前記膜結合タンパク質が、膜貫通レセプターである請求項３１に記載の組換え細胞。
【請求項３３】
前記膜貫通レセプターが、ＧＰＣＲである請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項３４】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部が、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼである請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３５】
前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質が、転写因子である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３６】
前記膜結合タンパク質が、ＡＤＢＲ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、又はＯＰＲＫである請求項３１に記載の組換え細胞。
【請求項３７】
前記転写因子が、ｔＴＡ又はＧＡＬ４である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３８】
前記前記第２タンパク質が、抑制型タンパク質である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項３９】
前記抑制型タンパク質がアレスチンであり、前記第１タンパク質が膜貫通レセプターである請求項３８に記載の組換え細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、真核細胞である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項４１】
前記細胞が、原核細胞である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項４２】
前記レポーター遺伝子が、外来性遺伝子である請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項４３】
前記外来性遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼをコードする請求項４２に記載の組換え細胞。
【請求項４４】
前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第２タンパク質との相互作用を増加させるように改変されている請求項２８に記載の組換え細胞。
【請求項４５】
前記改変が、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換することを含む請求項４４に記載の組換え細胞。
【請求項４６】
前記Ｃ末端領域の前記ヌクレオチド配列が、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＰＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ又は ＣＣ４のＣ末端領域をコードするヌクレオチド配列によって置換されている請求項４４に記載の組換え細胞。
【請求項４７】
（ｉ）検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉｉ）細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
を５’から３’の順番で含む単離核酸分子。
【請求項４８】
前記検定タンパク質が、膜結合タンパク質である請求項４７に記載の単離核酸分子。
【請求項４９】
前記膜結合タンパク質が、膜貫通レセプターである請求項４８に記載の単離核酸分子。
【請求項５０】
前記膜貫通レセプターが、ＧＰＣＲである請求項４９に記載の単離核酸分子。
【請求項５１】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部が、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼである請求項４７に記載の単離核酸分子。
【請求項５２】
前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質が、転写因子である請求項４７に記載の単離核酸分子。
【請求項５３】
前記転写因子が、ｔＴＡ又はＧＡＬ４である請求項５２に記載の単離核酸分子。
【請求項５４】
前記膜結合タンパク質が、ＡＤＢＲ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、又はＯＰＲＫである請求項４８に記載の単離核酸分子。
【請求項５５】
請求項４７に記載の単離核酸分子を含み、プロモーターに操作連結されている発現ベクター。
【請求項５６】
（ｉ）検定化合物の存在下において別の検定タンパク質とのその相互作用が測定される検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び、
（ｉｉ）開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、
を含む単離核酸分子。
【請求項５７】
前記検定タンパク質が、抑制型タンパク質である請求項５６に記載の単離核酸分子。
【請求項５８】
前記抑制型タンパク質が、アレスチンである請求項５７に記載の単離核酸分子。
【請求項５９】
請求項５６に記載の単離核酸分子を含み、プロモーターに操作連結されている発現ベクター。
【請求項６０】
請求項４７に記載の単離核酸分子の発現によって生成される融合タンパク質。
【請求項６１】
請求項５６に記載の単離核酸分子の発現によって生成される融合タンパク質。
【請求項６２】
検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するのに有用な検定キットであって、
（ａ）以下を含む核酸分子、
（ｉ）第１検定タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部の開裂部位をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）細胞内でレポーター遺伝子を活性化するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）以下を含む核酸分子、
（ｉ）前記検定化合物の存在下における前記第１検定タンパク質とのその相互作用が測定される第２検定タンパク質をコードするするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）前記開裂部位に対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの一部をコードするヌクレオチド配列、そして、
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）のそれぞれを互いに対して分離して保持するための容器手段、
それぞれの別部分を含む、検定化合物が対象の特定のタンパク質／タンパク質相互作用を調節するか否かを測定するのに有用な検定キット。
【請求項６３】
前記第１検定タンパク質が、膜結合タンパク質である請求項６２に記載の検定キット。
【請求項６４】
前記膜結合タンパク質が、膜貫通レセプターである請求項６３に記載の検定キット。
【請求項６５】
前記膜貫通レセプターが、ＧＰＣＲである請求項６４に記載の検定キット。
【請求項６６】
前記プロテアーゼ又はプロテアーゼの一部が、タバコエッチ病ウイルス核内封入Ａプロテアーゼである請求項６２に記載の検定キット。
【請求項６７】
前記レポーター遺伝子を活性化する前記タンパク質が、転写因子である請求項６２に記載の検定キット。
【請求項６８】
前記転写因子が、ｔＴＡ又はＧＡＬ４である請求項６７に記載の検定キット。
【請求項６９】
前記第２タンパク質が、抑制型タンパク質である請求項６２に記載の検定キット。
【請求項７０】
前記抑制型タンパク質がアレスチンであり、前記第１タンパク質が膜貫通レセプターである請求項６９に記載の検定キット。
【請求項７１】
レポーター遺伝子をコードする単離核酸分子の別部分を含む請求項６１に記載の検定キット。
【請求項７２】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼをコードする請求項７１に記載の検定キット。
【請求項７３】
前記第１検定タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第２タンパク質との相互作用を増加させるように改変されている請求項６２に記載の検定キット。
【請求項７４】
前記改変が、前記第１検定タンパク質のＣ末端領域のヌクレオチド配列の全部又は一部を、元の配列よりも前記第２検定タンパク質に対する親和性の高いアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって置換することを含む請求項７３に記載の検定キット。
【請求項７５】
前記Ｃ末端領域の前記ヌクレオチド配列が、ＡＶＰＲ２，ＡＧＴＲＬＩ，ＧＲＰＲ，Ｆ２ＲＬ１，ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８Ｂ，又はＣＣＲ４をコードするヌクレオチド配列によって置換されている請求項７４に記載の検定キット。
【請求項７６】
前記膜結合タンパク質が、ＡＤＲＢ２、ＡＶＰＲ２、ＨＴＲ１Ａ、ＣＨＲＭ２、ＣＣＲ５、ＤＲＤ２、又はＯＰＲＫである請求項６３に記載の検定キット。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５２８７１３（Ｐ２００７−５２８７１３Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８９０２（Ｐ２００６−５１８９０２）
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１８８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００７８２２
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【出願人】（５０６００８６２９）センティジェン・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５０６００９３７２）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月９日（２００４．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１８８７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００７８２２
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【出願人】（５０６００８６２９）センティジェン・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５０６００９３７２）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (1)
【Ｆターム（参考）】
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