タンパク質のリフォールディング剤
【課題】 高純度のタンパク質を生産性良く生産できるリフォールディング剤およびリフォールディング方法を提供する。
【解決手段】 アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸、該プロトン酸の塩および該プロトン酸のアルキルエステルからなる群から選ばれる１種以上であって、該プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４である化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤である。
【解決手段】 アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸、該プロトン酸の塩および該プロトン酸のアルキルエステルからなる群から選ばれる１種以上であって、該プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４である化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディング剤に関し、詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻すリフォールディング剤およびリフォールディング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００３】
工業的にも、遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されてきた。ベクター技術の開発によって大腸菌や酵母の菌体内で、標的とするタンパク質を大量に産生させる技術が、少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されておらず、不活性な封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディをアンフォールディングし、さらにリフォールディング（巻き戻し）することが必要である。
【０００４】
この種のリフォールディングは、大腸菌や酵母による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【０００５】
古くから良く用いられているリフォールディング操作は透析法と希釈法である。 透析法は、透析に供することで予め添加されたタンパク質変性剤（アンフォールディング剤：例えば塩酸グアニジンおよび／または尿素など）を徐々に希釈して緩衝液等に置き換え、機能のある蛋白質立体構造へとリフォールディングする方法である。本方法の応用例として、タンパク質変性剤濃度を、さらにゆっくりと減少させることで、機能のあるタンパク質立体構造へのリフォールディングの収率を上げる段階的希釈法が知られている
（例えば、非特許文献１）。
しかし、透析法は、外液にタンパク質溶液の百倍以上の容積が通常必要になり、また数日の時間を必要とするので、産業上実用的ではない。
【０００６】
希釈法は、透析法と比べて、比較的短時間で終わり容積も比較的少なくて済むので広く用いられている。希釈法は、タンパク質変性剤（アンフォールディング剤）を加えたアンフォールディングされたタンパク質溶液を、緩衝液などで過剰に希釈することで、アンフォールディング状態から機能のあるタンパク質立体構造へとタンパク質をリフォールディングする方法である。希釈法はタンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディングする最も簡便で低コストの方法であるが、リフォールディングの収率が悪く（例えば、非特許文献２）、大希釈をするので収量が少ないのが現状である。
【０００７】
リフォールディングに吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンでアンフォールディングさせたタンパク質やチオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にそのリフォールディングが起こる（非特許文献３）。しかし、この方法では、リフォールディングは必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では満足できる結果が得られないのが通常である。構造が壊れたタンパク質のリフォールディングを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質のリフォールディングが起こることも報告されている（非特許文献４）。しかし、これらは、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャぺロンを用いる場合は、それがある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。
【０００８】
カラム上の固定物質として、リフォールディングを促進するタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液でアンフォールディングしたＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、アンフォールディング剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質のリフォールディングが起こる（非特許文献５）。本法の適用がこのタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑でコスト高となることは同じである。
【０００９】
人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤でアンフォールディングしたタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程でタンパク質がリフォールディングするとの報告（非特許文献６〜８）もある。しかし、この方法は、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂ 等で成功しているに過ぎない。しかも、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。
【非特許文献１】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｍａｒ １４；２７８（１１）：８９７９−８９８７．
【非特許文献２】Ｊ ＩｍＭｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９８ Ｏｃｔ １；２１９（１−２）：１１９−１２９．
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６（１９８７）３１３５−３１４１
【非特許文献４】Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４（１９９７）３５７６−３５７８
【非特許文献５】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ（Ｊａｐａｎ Ｅｄ．）Ｖｏｌ．３（２００１）６−７
【非特許文献６】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． Ｖｏｌ．１１７（１９９５）２３７３−２３７４
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７１（１９９６）３４７８−３４８７
【非特許文献８】ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． Ｖｏｌ．４８６（２０００）１３１−１３５
【非特許文献９】Ｌ，Ｐａｕｌｉｎｇ，“Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｏｎｄ”，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９６０）
【非特許文献１０】化学大辞典縮刷版第６巻（昭和３８年）化学同人２３８−２３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のようにさまざまなリフォールディング方法が提案されてきているが、アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングする際に、依然としてタンパク質を大希釈することによる収量の低下や、純度が低いといった課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは以上の問題点を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明はアンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸、該プロトン酸の塩および該プロトン酸のアルキルエステルからなる群から選ばれる１種以上であって、該プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４である化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のリフォールディング剤を使用するリフォールディング方法は、工程中でタンパク質を大希釈をしないので従来よりも生産性が飛躍的に向上する。また従来よりもリフォールディング効果が高いため、高純度のタンパク質を大量に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のリフォールディング剤は、変性剤でアンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸、該プロトン酸の塩および該プロトン酸のアルキルエステルからなる群から選ばれる１種以上であって、該プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４である化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤である。
【００１４】
本発明において、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸における酸解離定数とは、１分子中に解離するプロトンを複数有する場合は、第１酸解離定数（ｐＫａ１）が０．５（モル／Ｌ）以上であることを意味する。
【００１５】
ｐＫａが０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸としては；無機リン酸［例えばリン酸（ｐＫａ＝２．１５、ピロリン酸（ｐＫａ＝０．８）など］、；カルボン酸［蟻酸（ｐＫａ＝３．５５）および酢酸（ｐＫａ＝４．５６）など］；ホウ酸（ｐＫａ＝９．２４）；ケイ酸（ｐＫａ＝９．８６）；および、炭酸（ｐＫａ＝６．３５）などが挙げられる。
【００１６】
本発明における化合物（Ａ）は、プロトン酸もしくは化合物（Ａ）を構成するプロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４、好ましくは０．９０〜１．５４である化合物（Ａ）である。
本発明における電気陰性度とは、Ｐａｕｌｉｎｇが提唱した電気陰性度であり、分子内の結合にあずかる原子がが電子を引きつける能力のことを言う。異なる２原子から成る場合Ａ−Ｂにおいて、ＡとＢの電気陰性度の差が大きいほど電子は一方の原子に引きつけられ、結合Ａ−Ｂのイオン性は増大する。（非特許文献９、非特許文献１０参照）
【００１７】
本発明における電気陰性度の差（Δχ）とは、プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)の電気陰性度（χａ）と、該酸素原子の最近接原子（ｂ)の電気陰性度（χｂ）との差であり、下記式で表されるものである。
Δχ ＝ χａ − χｂ
【００１８】
プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ）とは、例えば下記一般式（２）で示されるプロトン酸の場合は酸素原子Ｏ1である。また、該酸素原子の最近接原子（ｂ)とは、一般式（２）では炭素原子Ｃ1である
【００１９】
【化２】
【００２０】
他の例では、例えば下記一般式（３）で示されるプロトン酸の場合は例えばプロトン酸の水酸基の酸素原子は酸素原子Ｏ2である。また、該酸素原子の最近接原子（ｂ)とは、一般式（３）では炭素原子Ｃ2である
【００２１】
【化３】
【００２２】
本発明において、上記の範囲の電気陰性度の差を満たす化合物としては、水酸基の酸素原子（ａ）に最近接する原子（ｂ）が、Ｐ（リン原子：Ｐ−ＯのΔχ＝１．２５）、Ｃ（炭素原子：Ｃ−ＯのΔχ＝０．８９）、Ｂ（ホウ素原子：Ｂ−ＯのΔχ＝１．４０）またはＳｉ（ケイ素原子：Ｓｉ−ＯのΔχ＝１．５４）などである化合物が挙げられる。
【００２３】
本発明において、上記の範囲の酸解離定数を満たすプロトン酸、該プロトン酸の塩もしくは該プロトン酸のアルキルエステルであって、かつ、上記の範囲の電気陰性度の差を満たす化合物（Ａ）としては、下記一般式（１）で示される基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレートアニオン基（−ＣＯＯ-）およびエステル基（−ＣＯＯ−）からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物、ホウ酸、ホウ酸塩、ホウ酸エステル、ケイ酸、ケイ酸塩、並びに炭酸などが挙げられる
【００２４】
【化４】
【００２５】
一般式（１）で示される基を有する化合物（Ａ１）としては、無機リン酸、アルキルリン酸エステル、糖リン酸エステルおよびこれらの塩が挙げられ、いずれもΔχ＝１．２５である。
無機リン酸およびその塩としては、リン酸（ｐＫａ＝２．１５）、次亜リン酸、亜リン酸、次リン酸、ピロリン酸（ｐＫａ＝０．８）、ピロ亜リン酸、メタリン酸、トリポリリン酸（ｐＫａ＝２．０）、ポリリン酸、およびこれらの塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、および４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
無機リン酸塩の具体例としては、リン酸１水素２ナトリウム塩、リン酸２水素１ナトリウム塩、リン酸１水素２カリウム塩、リン酸２水素１カリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸テトラメチルアンモニウム塩、リン酸テトラエチルアンモニウム塩、リン酸トリエチルアミン塩およびリン酸トリエタノールアミン塩などのリン酸塩；
亜リン酸ナトリウム、亜リン酸カリウム、亜リン酸アンモニウム塩、亜リン酸テトラメチルアンモニウム塩、亜リン酸テトラエチルアンモニウム塩、亜リン酸トリエチルアミン塩および亜リン酸トリエタノールアミン塩などの亜リン酸塩；ピロリン酸ナトリウム塩、ピロリン酸カリウム塩、ピロリン酸テトラメチルアンモニウム塩、ピロリン酸テトラエチルアンモニウム塩、ピロリン酸トリエチルアミン塩およびピロリン酸トリエタノールアミン塩などのピロリン酸塩；などが挙げられる。
【００２６】
アルキルリン酸エステルおよびそれらの塩としては以下のものが挙げられる。
（１）炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル：
メチルリン酸エステル、エチルリン酸エステル、プロピルリン酸エステル、２−プロピルリン酸エステル、ブチルリン酸エステル、２−ブチルリン酸エステル、ｔ−ブチルリン酸エステル、ペンチルリン酸エステル、ヘキシルリン酸エステル、シクロヘキシルリン酸エステル、オクチルリン酸エステル、ノニルリン酸エステルおよびデシルリン酸エステルなど；
（２）炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルピロリン酸エステル：
メチルピロリン酸エステル、エチルピロリン酸エステル、プロピルピロリン酸エステル、２−プロピルピロリン酸エステル、ブチルピロリン酸エステル、２−ブチルピロリン酸エステル、ｔ−ブチルピロリン酸エステル、ペンチルピロリン酸エステル、ヘキシルピロリン酸エステル、シクロヘキシルピロリン酸エステル、オクチルピロリン酸エステル、ノニルピロリン酸エステルおよびデシルピロリン酸エステルなど；
（３）炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルトリポリリン酸エステル：
メチルトリポリリン酸エステル、エチルトリポリリン酸エステル、プロピルトリポリリン酸エステル、２−プロピルトリポリリン酸エステル、ブチルトリポリリン酸エステル、２−ブチルトリポリリン酸エステル、ｔ−ブチルトリポリリン酸エステル、ペンチルトリポリリン酸エステル、ヘキシルトリポリリン酸エステル、シクロヘキシルトリポリリン酸エステル、オクチルトリポリリン酸エステル、ノニルトリポリリン酸エステルおよびデシルトリポリリン酸エステルなど；
（４）上記アルキルリン酸エステルの塩：
塩としては、前述と同様の塩が挙げられる。
【００２７】
糖リン酸エステルおよびそれらの塩としては、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）および環状アデノシンモノリン酸（ｃ−ＡＭＰ）とそのナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩などが挙げられる。
【００２８】
カルボキシル基を有する化合物（Ａ２）としては、カルボン酸およびエーテルカルボン酸などが挙げられる。
【００２９】
（Ａ２）のうちのカルボン酸としては、炭素数１〜３６（カルボニル基の炭素原子も含む。以下同様）の脂肪族カルボン酸および芳香族カルボン酸などが挙げられる。
【００３０】
カルボン酸のうちの脂肪族カルボン酸としては；
炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸（蟻酸（ｐＫａ＝３．５５）、酢酸（ｐＫａ＝４．５６）、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族オキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）； 炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）およびそれらのモノアルキルエステル；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；並びに、３価以上（好ましくは３〜１２価）の脂肪族多価カルボン酸（クエン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸など）；などが挙げられる。
【００３１】
カルボン酸のうちの芳香族カルボン酸としては；
炭素数７〜３６の芳香族モノカルボン酸（安息香酸、桂皮酸、ヒドロキシ安息香酸など）；炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；炭素数９〜３６の芳香族トリカルボン酸およびテトラカルボン酸（トリメリット酸、ピロメリット酸など）；が挙げられる。
【００３２】
その他のカルボン酸としては、上記の脂肪族不飽和モノもしくはジカルボン酸を必須構成単量体とする重合体（例えば、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、アクリル酸／アクリル酸アルキルエステル共重合体など：数平均分子量５００〜５０，０００）が挙げられる。
【００３３】
カルボン酸としては、さらに、上記のジカルボン酸または３価以上の多価カルボン酸の部分アルキル（アルキル基としては炭素数１〜１２のもの）エステル：例えば、シュウ酸モノメチル、コハク酸モノメチル、マレイン酸モノメチル、シュウ酸モノエチル、クエン酸モノメチル、クエン酸ジメチルなどが挙げられる。
【００３４】
（Ａ２）のうちのエーテルカルボン酸としては、一般式（４）で示される化合物が挙げられる。
Ｒ1−Ｏ−（Ｒ2Ｏ）p−Ｒ3ＣＯＯＨ （４）
【００３５】
式中、Ｒ1は炭素数１〜３６の炭化水素基、Ｒ2は炭素数２〜４のアルキレン基、Ｒ3は炭素数１〜３のアルキレン基、ｐは１〜５０の整数を表す。
Ｒ1としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基およびデシル基などが挙げられる。
Ｒ2としては、エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，４−ブチレン基などが挙げられる。Ｒ3としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基が挙げられる。ｐは好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜４である。
【００３６】
エーテルカルボン酸の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンオクチルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンノニルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンデシルヒドロキシエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンドデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンオクチルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンノニルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンドデシルエーテルカルボン酸などが挙げられる。
【００３７】
カルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ａ３）としては、上記カルボン酸もしくはエーテルカルボン酸の塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、および４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
【００３８】
カルボン酸塩の具体例としては、上記の炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸塩（蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族オキシモノカルボン酸塩（グリコール酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウムなど）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸塩（シュウ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、グルタル酸ナトリウムなど）；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸塩（マレイン酸ナトリウムなど）；上記のジカルボン酸または３価以上の多価カルボン酸の部分アルキルエステルの塩（シュウ酸モノメチルナトリウム、コハク酸モノメチルナトリウム、マレイン酸モノメチルカリウム、シュウ酸モノエチルナトリウム、クエン酸モノメチルナトリウム、クエン酸ジメチルナトリウムなど）；が挙げられる。
エーテルカルボン酸塩としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオクチルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルヒドロキシエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンオクチルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンノニルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンドデシルエーテルカルボン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３９】
エステル基（−ＣＯＯ−）を有する化合物（Ａ４）としては、カルボン酸アルキルエステルおよびカルボン酸のアルキレンオキサイド付加物などが挙げられる。
カルボン酸アルキルエステルを構成するカルボン酸としては、上記（Ａ２）のカルボン酸が挙げられる。
カルボン酸アルキルエステルの具体例としては；
炭素数１〜１２のアルキル基を有する脂肪族モノカルボン酸アルキルエステル（アルキル基として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基もしくはデシル基などを有するカルボン酸エステル：例えば、蟻酸メチル、酢酸メチル、蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ステアリン酸メチルおよびステアリン酸ｎ−ブチルなど）； 炭素数１〜１２のアルキル基を有する脂肪族ジカルボン酸ジアルキルエステル（アルキルとして上記アルキル基を有するもの：例えば、シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、マレイン酸ジメチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチルおよびアジピン酸ジメチルなど）；並びに、炭素数１〜１２のアルキル基を有する３価以上の脂肪族多価カルボン酸の全てのカルボキシル基がエステル化されているもの（アルキルとして上記アルキル基を有するもの：例えば、クエン酸トリメチルおよびエチレンジアミン四酢酸テトラメチルなど）；などが挙げられる。
【００４０】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物としては、上記の（Ａ２）で挙げたカルボン酸に炭素数２〜４のアルキレンオキサイド１〜５０モル付加物などが挙げられる。
アルキレンオキサイドとしては、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）、プロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）およびブチレンオキサイドが挙げられる。
【００４１】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物の具体例としては；
モノカルボン酸のＥＯ付加物（ギ酸ＥＯ１〜１０モル付加物、酢酸ＥＯ１〜１０モル付加物、プロピオン酸ＥＯ１０モル付加物、酪酸ＥＯ１〜１０モル付加物、カプロン酸ＥＯ２〜２０モル付加物、ラウリル酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；オキシカルボン酸のＥＯ付加物（グリコール酸ＥＯ１〜２０モル付加物、乳酸ＥＯ１〜２０モル付加物、酒石酸ＰＯ１〜５モル付加物など）；脂肪族多価カルボン酸のＥＯ付加物（シュウ酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マロン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、コハク酸ＥＯ１〜２０モル付加物、グルタル酸ＥＯ１〜２０モル付加物、クエン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マレイン酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；芳香族カルボン酸のＥＯ付加物（フタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物、テレフタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物など）；が挙げられる。
【００４２】
本発明の化合物（Ａ）のうち、ホウ酸、ホウ酸塩およびホウ酸エステルとしては、ホウ酸、メタホウ酸、テトラホウ酸およびそれらの金属塩（アルカリ金属塩たとえばＬｉ，ＮａおよびＫ塩、アルカリ土類金属たとえばＣａおよびＭｇ塩、その他元素たとえばＺｎ，Ａｌの塩など）、アミン塩（アルキルアミン塩たとえばメチルアミン、ジメチルアミン塩、アルカノ−ルアミン塩たとえばトリエタノ−ルアミン塩など）、アンモニウム塩（メタホウ酸アンモニウム、テトラホウ酸アンモニウム、五ホウ酸アンモニウム、八ホウ酸アンモニウムなど）、酸化ホウ素、ホウ素錯化合物｛［(Ｃ2Ｈ5Ｏ）4Ｂ］H など｝，ホウ酸エステル（ホウ酸モノメチル、ホウ酸ジメチル、ホウ酸トリメチル、ホウ酸モノエチル、ホウ酸ジエチル、ホウ酸トリエチル、ホウ酸モノフェニル、ホウ酸ジフェニル、ホウ酸トリフェニル等）などが挙げられる。
本発明の化合物（Ａ）のうち、ケイ酸またはその塩としては、ケイ酸、メタケイ酸およびそれらの金属塩（例えば、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム、アルミノケイ酸マグネシウム、ケイ酸カルシウムなど）が挙げられる。
【００４３】
化合物（Ａ）のうち、リフォールディング効果の観点から優れているのは（Ａ１）、（Ａ２）および（Ａ３）であり、（Ａ１）のうちでさらに好ましいものはリン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸およびこれらの塩である。
【００４４】
本発明におけるアンフォールディングされたタンパク質とは、いかなる方法でアンフォールディングされたタンパク質でもよいが、リフォールディング効果の観点から好ましいのは塩酸グアニジンおよび／または尿素でアンフォールディングされたタンパク質であり、通常０．５モル／Ｌ以上の濃度の塩酸グアニジンおよび／または尿素水溶液中でアンフォールディングされたタンパク質である。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールを加えてアンフォールディングされたタンパク質であってもよい。
【００４５】
本発明のリフォールディング方法は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法であり、該タンパク質を上記の化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤で処理する工程を含むことを特徴とするリフォールディング方法である。
化合物（Ａ）のＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４、好ましくは０．９０〜１．５４であることによりアンフォールディングされたタンパク質の構造を正常な構造に戻す作用がある。（Δχ）が０．８７未満または１．５４を超えるとリフォールディング効果が乏しい。
上記範囲のΔχの化合物を用いることで初めて高いリフォールディング効果（アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングすることができる割合）と高純度のタンパク質を得ることができる。
本発明における化合物（Ａ）は、上記範囲のΔχを有する構造であることにより、
タンパク質との特異的な水素結合が形成されやすくなり、リフォールディング効果が高くなるものと推定される。
【００４６】
本発明のリフォールディング方法は、リフォールディング剤で処理する工程において、さらに界面活性剤、ｐＨ調整剤および酵素安定化剤から選ばれる少なくとも１つを添加してもよい。
界面活性剤としては、下記の非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤または両性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の添加はタンパク質の凝集抑制の観点から好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加物［炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールおよびオレイルアルコールなど）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル付加物など］、炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物、ポリプロピレングリコールＥＯ付加物およびポリエチレングリコールＰＯ付加物、プルロニック型界面活性剤、および脂肪酸ＡＯ付加物、多価アルコール型非イオン性界面活性剤などが挙げられる。
カチオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤
およびアミン塩型カチオンカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
アニオン性界面活性剤としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する、エーテルカルボン酸またはその塩、硫酸エステルもしくはエーテル硫酸エステルおよびそれらの塩、スルホン酸塩、スルホコハク酸塩、脂肪酸塩、アシル化アミノ酸塩、並びに天然由来のカルボン酸およびその塩（たとえばケノデオキシコール酸、コール酸、デオキシコール酸など）が挙げられる。
両性界面活性剤としては、ベタイン型両性界面活性剤およびアミノ酸型両性界面活性剤が挙げられる。
界面活性剤としては、上記の他に特公昭５７−３９６７８号公報記載の界面活性剤が挙げられる。
【００４７】
ｐＨ調整剤としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、およびリン酸緩衝剤（例えば、リン酸１水素２ナトリウム＋塩酸水溶液、またはリン酸２水素１ナトリウム＋水酸化ナトリウム水溶液）などが挙げられる。
なお、リン酸緩衝剤を使用する場合は、リン酸緩衝剤がリン酸塩であるため本発明における（Ａ）と重複するが、前述のようにリン酸緩衝剤の添加濃度は高くても０．０５モル／Ｌであるので、（Ａ）とリン酸緩衝剤とを併用する場合は（Ａ）の系内濃度は０．２〜５．９５モル／Ｌであることが好ましい。
【００４８】
酵素安定化剤としては還元剤、ポリオール類、金属イオン、キレート試薬などが挙げられる。
還元剤としては２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、アスコルビン酸、還元型グルタチオンおよびシステインなどが挙げられる。
ポリオール類としてはグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトールおよびマンニトールなどが挙げられる。
金属イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げらる。
キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）およびグリコール
エーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。
【００４９】
界面活性剤の添加量は、（Ａ）の添加量に対し、通常２０％以下、リフォールディング効果の観点から、好ましくは０．００１〜２０％、さらに好ましくは０．０１〜５％である。
ｐＨ調整剤の添加量は、（Ａ）の添加量に対し通常１００％以下、リフォールディング効果の観点から０．０１〜１００％が好ましく、０．１〜３０重量％がさらに好ましい。
酵素安定化剤の添加量は、（Ａ）の添加量に対し通常１０％以下、リフォールディング効果の観点から０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜１％がさらに好ましい。なお、酵素安定化剤がカルボン酸である場合は、その使用量は本発明の化合物（Ａ）の使用量に合計される。
【００５０】
本発明のリフォールディング方法において、化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤で処理する工程における系中の化合物（Ａ）の濃度は０．０１〜６モル／Ｌが好ましい。好ましくは０．０２〜６モル／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜５モル／Ｌである。
リフォールディング工程における系中の（Ａ）の濃度を０．０１〜６モル／Ｌにすることでより高いリフォールディング効果（アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングすることができる割合）と高純度のタンパク質を得ることができる。
本発明における化合物（Ａ）は、系中での濃度が０．０１モル／Ｌになると、化合物（Ａ）とタンパク質との特異的な水素結合が形成されやすくなるための平衡濃度に達するものと推定される。
また、系中の（Ａ）の濃度が６モル／Ｌを超える濃度になると、系の粘度が高くなり易いため、後工程のタンパク質の産生工程におけるタンパク質の分離精製のし易さの観点から好ましくない。
なお、本発明における「該タンパク質をリフォールディング剤で処理する工程」とは、該タンパク質とリフォールディング剤とを不均一部分が無くなる程度に撹拌・混合する工程であり、その後、リフォールディングをより充分に進めるために必要により一定時間静置することも含まれる。静置時間は例えば１〜５０時間である。
【００５１】
本発明のリフォールディング方法において、（Ａ）を含むリフォールディング剤で処理する工程におけるタンパク質の系中の濃度は、好ましくは０．２〜３０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜２０ｍｇ／ｍＬである。０．２ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
また、（Ａ）の、タンパク質の重量に対する添加量（重量）は、タンパク質１００部に対して好ましくは１０〜３，０００部、リフォールディング効果の観点からさらに好ましくは３０〜２，０００部である。
【００５２】
本発明のタンパク質の産生方法は、上記のリフォールディング方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法である。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また大希釈を行う必要がないため高い収量を得ることができる。
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素または組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってでタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程；インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤および２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．２〜６モル／Ｌの濃度になるように（Ａ）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とする正常なタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００５３】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌およびバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳf９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、ならびに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００５４】
組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００５５】
溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特願２００５−１１９１３３記載の溶菌剤による処理が好ましい。
【００５６】
アンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素およびこれらの併用などが挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールなどを加えてもよい。
【００５７】
タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【００５８】
本発明のタンパク質は、上記のタンパク質産生方法で得られたタンパク質である。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質および核酸などが挙げられる。
【００５９】
酵素としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。
加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００６０】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第VIII因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、
カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
【００６１】
＜実施例＞
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。下記の実施例１〜７および比較例１〜３の方法でリフォールディングを行いタンパク質を得た。得られたタンパク質の酵素活性を測定した。
【００６２】
実施例１
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、１０ｍｇのリパーゼ（「リリパーゼ」ナガセケムテックス社製：以下、同様のものを使用）および６モル／Ｌ塩酸グアニジン（和光純薬製：以下、同様のものを使用）水溶液を１ｍｌ加えて、室温で１晩放置しリパーゼをアンフォールディングさせた。このアンフォールディングされたタンパク質溶液に１．２モル／Ｌトリポリリン酸ナトリウム（和光純薬製）を５ｍｌ加えて（系中の化合物（Ａ）の濃度＝１．０モル／Ｌ）、室温で１晩放置してリフォールディングを行った。
（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６３】
実施例２
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに０．２４モル／Ｌトリポリリン酸ナトリウム（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６４】
実施例３
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに１．２モル／Ｌ酢酸ナトリウム塩（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６５】
実施例４
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに０．６モル／Ｌ酢酸ナトリウム（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６６】
実施例５
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに０．６モル／Ｌリン酸塩（リン酸１水素２ナトリウム：リン酸２水素ナトリウム＝１：１モル比）（ともに和光純薬製：以下、同様のものを使用）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６７】
実施例６
加えるリン酸塩を、６モル／Ｌリン酸塩５ｍＬとした（系中の化合物（Ａ）の濃度＝５モル／Ｌ）こと以外は実施例１と同様にしてリフォールディングを行った。
（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６８】
実施例７
［ホウ酸塩によるリフォールディング］
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに１．２モル／Ｌメタホウ酸塩（メタホウ酸ナトリウム）（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６９】
比較例１
［稀釈法によるリフォールディング］
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、１０ｍｇのリパーゼ「リリパーゼ」および６モル／Ｌ塩酸グアニジン水溶液を１ｍｌ加えて、室温で１晩放置しリパーゼを十分アンフォールディングさせた。２１０ｍｌ容の滅菌瓶に上記酵素溶液１ｍｌと、０．１モル／Ｌ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）２００ｍｌを入れ軽くかき混ぜ室温で１晩放置した。
（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．０５ｍｇ／ｍＬ）
【００７０】
比較例２
［透析法によるリフォールディング］
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、１０ｍｇのリパーゼ「リリパーゼ」および６モル／Ｌ塩酸グアニジン水溶液を１ｍｌ加えて、室温で１晩放置しリパーゼを十分アンフォールディングさせた。上記酵素溶液１ｍｌを透析装置に入れ、０．１モル／Ｌ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）を徐々に加え、徐々に希釈していきリフォールディングをおこなった。２００ｍｌのＴｒｉｓバッファーを加えたところで終了した。
（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．０５ｍｇ／ｍＬ）
【００７１】
比較例３
［硫酸塩によるリフォールディング］
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに１．２モル／Ｌ硫酸塩（硫酸ナトリウム）（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００７２】
＜酵素活性の測定＞
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、０．１モル／Ｌ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）２ｍｌと実施例１〜７または比較例１〜３で得られたタンパク質溶液を５μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。さらに３．５ミリモル／Ｌｐ−ニトロフェニル酢酸塩溶液を１ｍｌ加え、加水分解生成物であるｐ−ニトロフェノールの吸光度（４００ｎｍ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で３分毎に１２分間測定し、時間に対する吸光度の増加割合から加水分解反応の初速度を算出した。
また実施例１〜７または比較例１〜３のそれぞれのタンパク質濃度と同濃度の天然リパーゼ水溶液を調製し、それらを用いて上記と同様にｐ−ニトロフェニル酢酸塩の加水分解反応の初速度を算出した。
実施例１〜７および比較例１〜３の酵素活性（％）を以下の式で算出した。
酵素活性（％）＝［実施例および比較例で得られたタンパク質を使用した場合の初速度／天然リパーゼを使用した場合の初速度］×１００
【００７３】
＜タンパク質の生産性の評価＞
タンパク質の生産性を以下の指標で定義し、評価した。結果を表１に示す。
生産性指標
＝リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度（ｍｇ／ｍＬ）×酵素活性（％）
【００７４】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のリフォールディング剤およびリフォールディング方法を用いると、有用な各種のタンパク質を、高純度で、かつ効率よく産生することができる。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質および核酸などが挙げられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディング剤に関し、詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻すリフォールディング剤およびリフォールディング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００３】
工業的にも、遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されてきた。ベクター技術の開発によって大腸菌や酵母の菌体内で、標的とするタンパク質を大量に産生させる技術が、少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されておらず、不活性な封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディをアンフォールディングし、さらにリフォールディング（巻き戻し）することが必要である。
【０００４】
この種のリフォールディングは、大腸菌や酵母による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング率の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【０００５】
古くから良く用いられているリフォールディング操作は透析法と希釈法である。 透析法は、透析に供することで予め添加されたタンパク質変性剤（アンフォールディング剤：例えば塩酸グアニジンおよび／または尿素など）を徐々に希釈して緩衝液等に置き換え、機能のある蛋白質立体構造へとリフォールディングする方法である。本方法の応用例として、タンパク質変性剤濃度を、さらにゆっくりと減少させることで、機能のあるタンパク質立体構造へのリフォールディングの収率を上げる段階的希釈法が知られている
（例えば、非特許文献１）。
しかし、透析法は、外液にタンパク質溶液の百倍以上の容積が通常必要になり、また数日の時間を必要とするので、産業上実用的ではない。
【０００６】
希釈法は、透析法と比べて、比較的短時間で終わり容積も比較的少なくて済むので広く用いられている。希釈法は、タンパク質変性剤（アンフォールディング剤）を加えたアンフォールディングされたタンパク質溶液を、緩衝液などで過剰に希釈することで、アンフォールディング状態から機能のあるタンパク質立体構造へとタンパク質をリフォールディングする方法である。希釈法はタンパク質を機能のある立体構造へとリフォールディングする最も簡便で低コストの方法であるが、リフォールディングの収率が悪く（例えば、非特許文献２）、大希釈をするので収量が少ないのが現状である。
【０００７】
リフォールディングに吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンでアンフォールディングさせたタンパク質やチオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にそのリフォールディングが起こる（非特許文献３）。しかし、この方法では、リフォールディングは必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では満足できる結果が得られないのが通常である。構造が壊れたタンパク質のリフォールディングを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質のリフォールディングが起こることも報告されている（非特許文献４）。しかし、これらは、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。特に、分子シャぺロンを用いる場合は、それがある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。
【０００８】
カラム上の固定物質として、リフォールディングを促進するタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液でアンフォールディングしたＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、アンフォールディング剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質のリフォールディングが起こる（非特許文献５）。本法の適用がこのタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑でコスト高となることは同じである。
【０００９】
人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤でアンフォールディングしたタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程でタンパク質がリフォールディングするとの報告（非特許文献６〜８）もある。しかし、この方法は、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ Ｂ 等で成功しているに過ぎない。しかも、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。
【非特許文献１】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｍａｒ １４；２７８（１１）：８９７９−８９８７．
【非特許文献２】Ｊ ＩｍＭｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９８ Ｏｃｔ １；２１９（１−２）：１１９−１２９．
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６（１９８７）３１３５−３１４１
【非特許文献４】Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４（１９９７）３５７６−３５７８
【非特許文献５】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ（Ｊａｐａｎ Ｅｄ．）Ｖｏｌ．３（２００１）６−７
【非特許文献６】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． Ｖｏｌ．１１７（１９９５）２３７３−２３７４
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７１（１９９６）３４７８−３４８７
【非特許文献８】ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． Ｖｏｌ．４８６（２０００）１３１−１３５
【非特許文献９】Ｌ，Ｐａｕｌｉｎｇ，“Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｏｎｄ”，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９６０）
【非特許文献１０】化学大辞典縮刷版第６巻（昭和３８年）化学同人２３８−２３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のようにさまざまなリフォールディング方法が提案されてきているが、アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングする際に、依然としてタンパク質を大希釈することによる収量の低下や、純度が低いといった課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは以上の問題点を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明はアンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸、該プロトン酸の塩および該プロトン酸のアルキルエステルからなる群から選ばれる１種以上であって、該プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４である化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のリフォールディング剤を使用するリフォールディング方法は、工程中でタンパク質を大希釈をしないので従来よりも生産性が飛躍的に向上する。また従来よりもリフォールディング効果が高いため、高純度のタンパク質を大量に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のリフォールディング剤は、変性剤でアンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸、該プロトン酸の塩および該プロトン酸のアルキルエステルからなる群から選ばれる１種以上であって、該プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４である化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤である。
【００１４】
本発明において、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸における酸解離定数とは、１分子中に解離するプロトンを複数有する場合は、第１酸解離定数（ｐＫａ１）が０．５（モル／Ｌ）以上であることを意味する。
【００１５】
ｐＫａが０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸としては；無機リン酸［例えばリン酸（ｐＫａ＝２．１５、ピロリン酸（ｐＫａ＝０．８）など］、；カルボン酸［蟻酸（ｐＫａ＝３．５５）および酢酸（ｐＫａ＝４．５６）など］；ホウ酸（ｐＫａ＝９．２４）；ケイ酸（ｐＫａ＝９．８６）；および、炭酸（ｐＫａ＝６．３５）などが挙げられる。
【００１６】
本発明における化合物（Ａ）は、プロトン酸もしくは化合物（Ａ）を構成するプロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４、好ましくは０．９０〜１．５４である化合物（Ａ）である。
本発明における電気陰性度とは、Ｐａｕｌｉｎｇが提唱した電気陰性度であり、分子内の結合にあずかる原子がが電子を引きつける能力のことを言う。異なる２原子から成る場合Ａ−Ｂにおいて、ＡとＢの電気陰性度の差が大きいほど電子は一方の原子に引きつけられ、結合Ａ−Ｂのイオン性は増大する。（非特許文献９、非特許文献１０参照）
【００１７】
本発明における電気陰性度の差（Δχ）とは、プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)の電気陰性度（χａ）と、該酸素原子の最近接原子（ｂ)の電気陰性度（χｂ）との差であり、下記式で表されるものである。
Δχ ＝ χａ − χｂ
【００１８】
プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ）とは、例えば下記一般式（２）で示されるプロトン酸の場合は酸素原子Ｏ1である。また、該酸素原子の最近接原子（ｂ)とは、一般式（２）では炭素原子Ｃ1である
【００１９】
【化２】
【００２０】
他の例では、例えば下記一般式（３）で示されるプロトン酸の場合は例えばプロトン酸の水酸基の酸素原子は酸素原子Ｏ2である。また、該酸素原子の最近接原子（ｂ)とは、一般式（３）では炭素原子Ｃ2である
【００２１】
【化３】
【００２２】
本発明において、上記の範囲の電気陰性度の差を満たす化合物としては、水酸基の酸素原子（ａ）に最近接する原子（ｂ）が、Ｐ（リン原子：Ｐ−ＯのΔχ＝１．２５）、Ｃ（炭素原子：Ｃ−ＯのΔχ＝０．８９）、Ｂ（ホウ素原子：Ｂ−ＯのΔχ＝１．４０）またはＳｉ（ケイ素原子：Ｓｉ−ＯのΔχ＝１．５４）などである化合物が挙げられる。
【００２３】
本発明において、上記の範囲の酸解離定数を満たすプロトン酸、該プロトン酸の塩もしくは該プロトン酸のアルキルエステルであって、かつ、上記の範囲の電気陰性度の差を満たす化合物（Ａ）としては、下記一般式（１）で示される基、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレートアニオン基（−ＣＯＯ-）およびエステル基（−ＣＯＯ−）からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物、ホウ酸、ホウ酸塩、ホウ酸エステル、ケイ酸、ケイ酸塩、並びに炭酸などが挙げられる
【００２４】
【化４】
【００２５】
一般式（１）で示される基を有する化合物（Ａ１）としては、無機リン酸、アルキルリン酸エステル、糖リン酸エステルおよびこれらの塩が挙げられ、いずれもΔχ＝１．２５である。
無機リン酸およびその塩としては、リン酸（ｐＫａ＝２．１５）、次亜リン酸、亜リン酸、次リン酸、ピロリン酸（ｐＫａ＝０．８）、ピロ亜リン酸、メタリン酸、トリポリリン酸（ｐＫａ＝２．０）、ポリリン酸、およびこれらの塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、および４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
無機リン酸塩の具体例としては、リン酸１水素２ナトリウム塩、リン酸２水素１ナトリウム塩、リン酸１水素２カリウム塩、リン酸２水素１カリウム塩、リン酸アンモニウム塩、リン酸テトラメチルアンモニウム塩、リン酸テトラエチルアンモニウム塩、リン酸トリエチルアミン塩およびリン酸トリエタノールアミン塩などのリン酸塩；
亜リン酸ナトリウム、亜リン酸カリウム、亜リン酸アンモニウム塩、亜リン酸テトラメチルアンモニウム塩、亜リン酸テトラエチルアンモニウム塩、亜リン酸トリエチルアミン塩および亜リン酸トリエタノールアミン塩などの亜リン酸塩；ピロリン酸ナトリウム塩、ピロリン酸カリウム塩、ピロリン酸テトラメチルアンモニウム塩、ピロリン酸テトラエチルアンモニウム塩、ピロリン酸トリエチルアミン塩およびピロリン酸トリエタノールアミン塩などのピロリン酸塩；などが挙げられる。
【００２６】
アルキルリン酸エステルおよびそれらの塩としては以下のものが挙げられる。
（１）炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルリン酸エステル：
メチルリン酸エステル、エチルリン酸エステル、プロピルリン酸エステル、２−プロピルリン酸エステル、ブチルリン酸エステル、２−ブチルリン酸エステル、ｔ−ブチルリン酸エステル、ペンチルリン酸エステル、ヘキシルリン酸エステル、シクロヘキシルリン酸エステル、オクチルリン酸エステル、ノニルリン酸エステルおよびデシルリン酸エステルなど；
（２）炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルピロリン酸エステル：
メチルピロリン酸エステル、エチルピロリン酸エステル、プロピルピロリン酸エステル、２−プロピルピロリン酸エステル、ブチルピロリン酸エステル、２−ブチルピロリン酸エステル、ｔ−ブチルピロリン酸エステル、ペンチルピロリン酸エステル、ヘキシルピロリン酸エステル、シクロヘキシルピロリン酸エステル、オクチルピロリン酸エステル、ノニルピロリン酸エステルおよびデシルピロリン酸エステルなど；
（３）炭素数１〜１２のアルキル基を有するアルキルトリポリリン酸エステル：
メチルトリポリリン酸エステル、エチルトリポリリン酸エステル、プロピルトリポリリン酸エステル、２−プロピルトリポリリン酸エステル、ブチルトリポリリン酸エステル、２−ブチルトリポリリン酸エステル、ｔ−ブチルトリポリリン酸エステル、ペンチルトリポリリン酸エステル、ヘキシルトリポリリン酸エステル、シクロヘキシルトリポリリン酸エステル、オクチルトリポリリン酸エステル、ノニルトリポリリン酸エステルおよびデシルトリポリリン酸エステルなど；
（４）上記アルキルリン酸エステルの塩：
塩としては、前述と同様の塩が挙げられる。
【００２７】
糖リン酸エステルおよびそれらの塩としては、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン１リン酸（ＡＭＰ）および環状アデノシンモノリン酸（ｃ−ＡＭＰ）とそのナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩などが挙げられる。
【００２８】
カルボキシル基を有する化合物（Ａ２）としては、カルボン酸およびエーテルカルボン酸などが挙げられる。
【００２９】
（Ａ２）のうちのカルボン酸としては、炭素数１〜３６（カルボニル基の炭素原子も含む。以下同様）の脂肪族カルボン酸および芳香族カルボン酸などが挙げられる。
【００３０】
カルボン酸のうちの脂肪族カルボン酸としては；
炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸（蟻酸（ｐＫａ＝３．５５）、酢酸（ｐＫａ＝４．５６）、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ベラルゴン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、２−エチルヘキサン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸、メタクリル酸、オレイン酸など）；炭素数３〜３６の脂肪族オキシモノカルボン酸（グリコール酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸など）； 炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸など）およびそれらのモノアルキルエステル；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマール酸、イタコン酸など）；並びに、３価以上（好ましくは３〜１２価）の脂肪族多価カルボン酸（クエン酸、ブタンテトラカルボン酸、シクロペンタンテトラカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸など）；などが挙げられる。
【００３１】
カルボン酸のうちの芳香族カルボン酸としては；
炭素数７〜３６の芳香族モノカルボン酸（安息香酸、桂皮酸、ヒドロキシ安息香酸など）；炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸など）；炭素数９〜３６の芳香族トリカルボン酸およびテトラカルボン酸（トリメリット酸、ピロメリット酸など）；が挙げられる。
【００３２】
その他のカルボン酸としては、上記の脂肪族不飽和モノもしくはジカルボン酸を必須構成単量体とする重合体（例えば、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、アクリル酸／アクリル酸アルキルエステル共重合体など：数平均分子量５００〜５０，０００）が挙げられる。
【００３３】
カルボン酸としては、さらに、上記のジカルボン酸または３価以上の多価カルボン酸の部分アルキル（アルキル基としては炭素数１〜１２のもの）エステル：例えば、シュウ酸モノメチル、コハク酸モノメチル、マレイン酸モノメチル、シュウ酸モノエチル、クエン酸モノメチル、クエン酸ジメチルなどが挙げられる。
【００３４】
（Ａ２）のうちのエーテルカルボン酸としては、一般式（４）で示される化合物が挙げられる。
Ｒ1−Ｏ−（Ｒ2Ｏ）p−Ｒ3ＣＯＯＨ （４）
【００３５】
式中、Ｒ1は炭素数１〜３６の炭化水素基、Ｒ2は炭素数２〜４のアルキレン基、Ｒ3は炭素数１〜３のアルキレン基、ｐは１〜５０の整数を表す。
Ｒ1としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基およびデシル基などが挙げられる。
Ｒ2としては、エチレン基、１，２−プロピレン基、１，３−プロピレン基、１，２−ブチレン基、１，４−ブチレン基などが挙げられる。Ｒ3としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基が挙げられる。ｐは好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜４である。
【００３６】
エーテルカルボン酸の具体例としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンオクチルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンノニルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンデシルヒドロキシエーテルカルボン酸、ポリオキシエチレンドデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンオクチルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンノニルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンデシルエーテルカルボン酸、ポリオキシプロピレンドデシルエーテルカルボン酸などが挙げられる。
【００３７】
カルボキシレートアニオン基を有する化合物（Ａ３）としては、上記カルボン酸もしくはエーテルカルボン酸の塩が挙げられる。
塩としてはアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）、アンモニウム塩、アミン塩（１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩）、および４級アンモニウム塩（テトラアルキルアンモニウム塩など）が挙げられる。
【００３８】
カルボン酸塩の具体例としては、上記の炭素数１〜３６の脂肪族飽和モノカルボン酸塩（蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、カプロン酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族不飽和モノカルボン酸（アクリル酸ナトリウムなど）；炭素数３〜３６の脂肪族オキシモノカルボン酸塩（グリコール酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウムなど）；炭素数２〜３６の脂肪族飽和ジカルボン酸塩（シュウ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、グルタル酸ナトリウムなど）；炭素数４〜３６の脂肪族不飽和ジカルボン酸塩（マレイン酸ナトリウムなど）；上記のジカルボン酸または３価以上の多価カルボン酸の部分アルキルエステルの塩（シュウ酸モノメチルナトリウム、コハク酸モノメチルナトリウム、マレイン酸モノメチルカリウム、シュウ酸モノエチルナトリウム、クエン酸モノメチルナトリウム、クエン酸ジメチルナトリウムなど）；が挙げられる。
エーテルカルボン酸塩としては、ポリオキシエチレンヘキシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオクチルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンデシルヒドロキシエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンヘキシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンオクチルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンノニルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンデシルエーテルカルボン酸ナトリウム、ポリオキシプロピレンドデシルエーテルカルボン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００３９】
エステル基（−ＣＯＯ−）を有する化合物（Ａ４）としては、カルボン酸アルキルエステルおよびカルボン酸のアルキレンオキサイド付加物などが挙げられる。
カルボン酸アルキルエステルを構成するカルボン酸としては、上記（Ａ２）のカルボン酸が挙げられる。
カルボン酸アルキルエステルの具体例としては；
炭素数１〜１２のアルキル基を有する脂肪族モノカルボン酸アルキルエステル（アルキル基として、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、２−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基もしくはデシル基などを有するカルボン酸エステル：例えば、蟻酸メチル、酢酸メチル、蟻酸エチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ステアリン酸メチルおよびステアリン酸ｎ−ブチルなど）； 炭素数１〜１２のアルキル基を有する脂肪族ジカルボン酸ジアルキルエステル（アルキルとして上記アルキル基を有するもの：例えば、シュウ酸ジメチル、コハク酸ジメチル、マレイン酸ジメチル、シュウ酸ジエチル、コハク酸ジエチルおよびアジピン酸ジメチルなど）；並びに、炭素数１〜１２のアルキル基を有する３価以上の脂肪族多価カルボン酸の全てのカルボキシル基がエステル化されているもの（アルキルとして上記アルキル基を有するもの：例えば、クエン酸トリメチルおよびエチレンジアミン四酢酸テトラメチルなど）；などが挙げられる。
【００４０】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物としては、上記の（Ａ２）で挙げたカルボン酸に炭素数２〜４のアルキレンオキサイド１〜５０モル付加物などが挙げられる。
アルキレンオキサイドとしては、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）、プロピレンオキサイド（以下、ＰＯと略記）およびブチレンオキサイドが挙げられる。
【００４１】
カルボン酸のアルキレンオキサイド付加物の具体例としては；
モノカルボン酸のＥＯ付加物（ギ酸ＥＯ１〜１０モル付加物、酢酸ＥＯ１〜１０モル付加物、プロピオン酸ＥＯ１０モル付加物、酪酸ＥＯ１〜１０モル付加物、カプロン酸ＥＯ２〜２０モル付加物、ラウリル酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；オキシカルボン酸のＥＯ付加物（グリコール酸ＥＯ１〜２０モル付加物、乳酸ＥＯ１〜２０モル付加物、酒石酸ＰＯ１〜５モル付加物など）；脂肪族多価カルボン酸のＥＯ付加物（シュウ酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マロン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、コハク酸ＥＯ１〜２０モル付加物、グルタル酸ＥＯ１〜２０モル付加物、クエン酸ＥＯ１〜２０モル付加物、マレイン酸ＥＯ１〜２０モル付加物など）；芳香族カルボン酸のＥＯ付加物（フタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物、テレフタル酸ＥＯ１〜３０モル付加物など）；が挙げられる。
【００４２】
本発明の化合物（Ａ）のうち、ホウ酸、ホウ酸塩およびホウ酸エステルとしては、ホウ酸、メタホウ酸、テトラホウ酸およびそれらの金属塩（アルカリ金属塩たとえばＬｉ，ＮａおよびＫ塩、アルカリ土類金属たとえばＣａおよびＭｇ塩、その他元素たとえばＺｎ，Ａｌの塩など）、アミン塩（アルキルアミン塩たとえばメチルアミン、ジメチルアミン塩、アルカノ−ルアミン塩たとえばトリエタノ−ルアミン塩など）、アンモニウム塩（メタホウ酸アンモニウム、テトラホウ酸アンモニウム、五ホウ酸アンモニウム、八ホウ酸アンモニウムなど）、酸化ホウ素、ホウ素錯化合物｛［(Ｃ2Ｈ5Ｏ）4Ｂ］H など｝，ホウ酸エステル（ホウ酸モノメチル、ホウ酸ジメチル、ホウ酸トリメチル、ホウ酸モノエチル、ホウ酸ジエチル、ホウ酸トリエチル、ホウ酸モノフェニル、ホウ酸ジフェニル、ホウ酸トリフェニル等）などが挙げられる。
本発明の化合物（Ａ）のうち、ケイ酸またはその塩としては、ケイ酸、メタケイ酸およびそれらの金属塩（例えば、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム、アルミノケイ酸マグネシウム、ケイ酸カルシウムなど）が挙げられる。
【００４３】
化合物（Ａ）のうち、リフォールディング効果の観点から優れているのは（Ａ１）、（Ａ２）および（Ａ３）であり、（Ａ１）のうちでさらに好ましいものはリン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸およびこれらの塩である。
【００４４】
本発明におけるアンフォールディングされたタンパク質とは、いかなる方法でアンフォールディングされたタンパク質でもよいが、リフォールディング効果の観点から好ましいのは塩酸グアニジンおよび／または尿素でアンフォールディングされたタンパク質であり、通常０．５モル／Ｌ以上の濃度の塩酸グアニジンおよび／または尿素水溶液中でアンフォールディングされたタンパク質である。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールを加えてアンフォールディングされたタンパク質であってもよい。
【００４５】
本発明のリフォールディング方法は、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法であり、該タンパク質を上記の化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤で処理する工程を含むことを特徴とするリフォールディング方法である。
化合物（Ａ）のＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４、好ましくは０．９０〜１．５４であることによりアンフォールディングされたタンパク質の構造を正常な構造に戻す作用がある。（Δχ）が０．８７未満または１．５４を超えるとリフォールディング効果が乏しい。
上記範囲のΔχの化合物を用いることで初めて高いリフォールディング効果（アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングすることができる割合）と高純度のタンパク質を得ることができる。
本発明における化合物（Ａ）は、上記範囲のΔχを有する構造であることにより、
タンパク質との特異的な水素結合が形成されやすくなり、リフォールディング効果が高くなるものと推定される。
【００４６】
本発明のリフォールディング方法は、リフォールディング剤で処理する工程において、さらに界面活性剤、ｐＨ調整剤および酵素安定化剤から選ばれる少なくとも１つを添加してもよい。
界面活性剤としては、下記の非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤または両性界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の添加はタンパク質の凝集抑制の観点から好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加物［炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールおよびオレイルアルコールなど）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル付加物など］、炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物、ポリプロピレングリコールＥＯ付加物およびポリエチレングリコールＰＯ付加物、プルロニック型界面活性剤、および脂肪酸ＡＯ付加物、多価アルコール型非イオン性界面活性剤などが挙げられる。
カチオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤
およびアミン塩型カチオンカチオン性界面活性剤などが挙げられる。
アニオン性界面活性剤としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する、エーテルカルボン酸またはその塩、硫酸エステルもしくはエーテル硫酸エステルおよびそれらの塩、スルホン酸塩、スルホコハク酸塩、脂肪酸塩、アシル化アミノ酸塩、並びに天然由来のカルボン酸およびその塩（たとえばケノデオキシコール酸、コール酸、デオキシコール酸など）が挙げられる。
両性界面活性剤としては、ベタイン型両性界面活性剤およびアミノ酸型両性界面活性剤が挙げられる。
界面活性剤としては、上記の他に特公昭５７−３９６７８号公報記載の界面活性剤が挙げられる。
【００４７】
ｐＨ調整剤としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、およびリン酸緩衝剤（例えば、リン酸１水素２ナトリウム＋塩酸水溶液、またはリン酸２水素１ナトリウム＋水酸化ナトリウム水溶液）などが挙げられる。
なお、リン酸緩衝剤を使用する場合は、リン酸緩衝剤がリン酸塩であるため本発明における（Ａ）と重複するが、前述のようにリン酸緩衝剤の添加濃度は高くても０．０５モル／Ｌであるので、（Ａ）とリン酸緩衝剤とを併用する場合は（Ａ）の系内濃度は０．２〜５．９５モル／Ｌであることが好ましい。
【００４８】
酵素安定化剤としては還元剤、ポリオール類、金属イオン、キレート試薬などが挙げられる。
還元剤としては２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、アスコルビン酸、還元型グルタチオンおよびシステインなどが挙げられる。
ポリオール類としてはグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトールおよびマンニトールなどが挙げられる。
金属イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げらる。
キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）およびグリコール
エーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。
【００４９】
界面活性剤の添加量は、（Ａ）の添加量に対し、通常２０％以下、リフォールディング効果の観点から、好ましくは０．００１〜２０％、さらに好ましくは０．０１〜５％である。
ｐＨ調整剤の添加量は、（Ａ）の添加量に対し通常１００％以下、リフォールディング効果の観点から０．０１〜１００％が好ましく、０．１〜３０重量％がさらに好ましい。
酵素安定化剤の添加量は、（Ａ）の添加量に対し通常１０％以下、リフォールディング効果の観点から０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜１％がさらに好ましい。なお、酵素安定化剤がカルボン酸である場合は、その使用量は本発明の化合物（Ａ）の使用量に合計される。
【００５０】
本発明のリフォールディング方法において、化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤で処理する工程における系中の化合物（Ａ）の濃度は０．０１〜６モル／Ｌが好ましい。好ましくは０．０２〜６モル／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜５モル／Ｌである。
リフォールディング工程における系中の（Ａ）の濃度を０．０１〜６モル／Ｌにすることでより高いリフォールディング効果（アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングすることができる割合）と高純度のタンパク質を得ることができる。
本発明における化合物（Ａ）は、系中での濃度が０．０１モル／Ｌになると、化合物（Ａ）とタンパク質との特異的な水素結合が形成されやすくなるための平衡濃度に達するものと推定される。
また、系中の（Ａ）の濃度が６モル／Ｌを超える濃度になると、系の粘度が高くなり易いため、後工程のタンパク質の産生工程におけるタンパク質の分離精製のし易さの観点から好ましくない。
なお、本発明における「該タンパク質をリフォールディング剤で処理する工程」とは、該タンパク質とリフォールディング剤とを不均一部分が無くなる程度に撹拌・混合する工程であり、その後、リフォールディングをより充分に進めるために必要により一定時間静置することも含まれる。静置時間は例えば１〜５０時間である。
【００５１】
本発明のリフォールディング方法において、（Ａ）を含むリフォールディング剤で処理する工程におけるタンパク質の系中の濃度は、好ましくは０．２〜３０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜２０ｍｇ／ｍＬである。０．２ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
また、（Ａ）の、タンパク質の重量に対する添加量（重量）は、タンパク質１００部に対して好ましくは１０〜３，０００部、リフォールディング効果の観点からさらに好ましくは３０〜２，０００部である。
【００５２】
本発明のタンパク質の産生方法は、上記のリフォールディング方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法である。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また大希釈を行う必要がないため高い収量を得ることができる。
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素または組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってでタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程；インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤および２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．２〜６モル／Ｌの濃度になるように（Ａ）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：懸濁液から目的とする正常なタンパク質をカラムクロマトグラフィーなどによって分離して取り出す。
【００５３】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌およびバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳf９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、ならびに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００５４】
組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００５５】
溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特願２００５−１１９１３３記載の溶菌剤による処理が好ましい。
【００５６】
アンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素およびこれらの併用などが挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールなどを加えてもよい。
【００５７】
タンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としてはシリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド、ビニルポリマーなどが挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等があり入手可能である。
【００５８】
本発明のタンパク質は、上記のタンパク質産生方法で得られたタンパク質である。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質および核酸などが挙げられる。
【００５９】
酵素としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。
加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。
酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。
転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。
合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。
脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００６０】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第VIII因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、
カルシトニン等が挙げられる。
ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。
核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。
【００６１】
＜実施例＞
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。下記の実施例１〜７および比較例１〜３の方法でリフォールディングを行いタンパク質を得た。得られたタンパク質の酵素活性を測定した。
【００６２】
実施例１
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、１０ｍｇのリパーゼ（「リリパーゼ」ナガセケムテックス社製：以下、同様のものを使用）および６モル／Ｌ塩酸グアニジン（和光純薬製：以下、同様のものを使用）水溶液を１ｍｌ加えて、室温で１晩放置しリパーゼをアンフォールディングさせた。このアンフォールディングされたタンパク質溶液に１．２モル／Ｌトリポリリン酸ナトリウム（和光純薬製）を５ｍｌ加えて（系中の化合物（Ａ）の濃度＝１．０モル／Ｌ）、室温で１晩放置してリフォールディングを行った。
（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６３】
実施例２
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに０．２４モル／Ｌトリポリリン酸ナトリウム（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６４】
実施例３
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに１．２モル／Ｌ酢酸ナトリウム塩（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６５】
実施例４
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに０．６モル／Ｌ酢酸ナトリウム（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６６】
実施例５
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに０．６モル／Ｌリン酸塩（リン酸１水素２ナトリウム：リン酸２水素ナトリウム＝１：１モル比）（ともに和光純薬製：以下、同様のものを使用）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６７】
実施例６
加えるリン酸塩を、６モル／Ｌリン酸塩５ｍＬとした（系中の化合物（Ａ）の濃度＝５モル／Ｌ）こと以外は実施例１と同様にしてリフォールディングを行った。
（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６８】
実施例７
［ホウ酸塩によるリフォールディング］
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに１．２モル／Ｌメタホウ酸塩（メタホウ酸ナトリウム）（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００６９】
比較例１
［稀釈法によるリフォールディング］
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、１０ｍｇのリパーゼ「リリパーゼ」および６モル／Ｌ塩酸グアニジン水溶液を１ｍｌ加えて、室温で１晩放置しリパーゼを十分アンフォールディングさせた。２１０ｍｌ容の滅菌瓶に上記酵素溶液１ｍｌと、０．１モル／Ｌ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）２００ｍｌを入れ軽くかき混ぜ室温で１晩放置した。
（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．０５ｍｇ／ｍＬ）
【００７０】
比較例２
［透析法によるリフォールディング］
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、１０ｍｇのリパーゼ「リリパーゼ」および６モル／Ｌ塩酸グアニジン水溶液を１ｍｌ加えて、室温で１晩放置しリパーゼを十分アンフォールディングさせた。上記酵素溶液１ｍｌを透析装置に入れ、０．１モル／Ｌ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）を徐々に加え、徐々に希釈していきリフォールディングをおこなった。２００ｍｌのＴｒｉｓバッファーを加えたところで終了した。
（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．０５ｍｇ／ｍＬ）
【００７１】
比較例３
［硫酸塩によるリフォールディング］
１．２モル／Ｌトリポリリン酸塩のかわりに１．２モル／Ｌ硫酸塩（硫酸ナトリウム）（和光純薬製）を加えること以外は実施例１と同様の方法でリフォールディングをおこなった。（リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度＝１．７ｍｇ／ｍＬ）
【００７２】
＜酵素活性の測定＞
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、０．１モル／Ｌ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）２ｍｌと実施例１〜７または比較例１〜３で得られたタンパク質溶液を５μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。さらに３．５ミリモル／Ｌｐ−ニトロフェニル酢酸塩溶液を１ｍｌ加え、加水分解生成物であるｐ−ニトロフェノールの吸光度（４００ｎｍ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で３分毎に１２分間測定し、時間に対する吸光度の増加割合から加水分解反応の初速度を算出した。
また実施例１〜７または比較例１〜３のそれぞれのタンパク質濃度と同濃度の天然リパーゼ水溶液を調製し、それらを用いて上記と同様にｐ−ニトロフェニル酢酸塩の加水分解反応の初速度を算出した。
実施例１〜７および比較例１〜３の酵素活性（％）を以下の式で算出した。
酵素活性（％）＝［実施例および比較例で得られたタンパク質を使用した場合の初速度／天然リパーゼを使用した場合の初速度］×１００
【００７３】
＜タンパク質の生産性の評価＞
タンパク質の生産性を以下の指標で定義し、評価した。結果を表１に示す。
生産性指標
＝リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度（ｍｇ／ｍＬ）×酵素活性（％）
【００７４】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のリフォールディング剤およびリフォールディング方法を用いると、有用な各種のタンパク質を、高純度で、かつ効率よく産生することができる。
本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質および核酸などが挙げられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸、該プロトン酸の塩および該プロトン酸のアルキルエステルからなる群から選ばれる１種以上であって、該プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４である化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤。
【請求項２】
化合物（Ａ）が、一般式（１）で示される基、カルボキシル基、カルボキシレート基およびエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物である請求項１記載のリフォールディング剤。
【化１】
【請求項３】
化合物（Ａ）が、無機リン酸、アルキルリン酸エステル、糖リン酸エステル、カルボン酸、カルボン酸アルキルエステル、エーテルカルボン酸およびそれらの塩からなる群から選ばれる１種以上である請求項１または２記載のリフォールディング剤。
【請求項４】
無機リン酸がモノリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸であり、糖リン酸エステルがアデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸またはアデノシン１リン酸であり、カルボン酸がギ酸、酢酸またはプロピオン酸である請求項３記載のリフォールディング剤。
【請求項５】
化合物（Ａ）が、ホウ酸、ホウ酸塩、ホウ酸エステル、ケイ酸、ケイ酸塩および炭酸からなる群から選ばれる１種以上である請求項１記載のリフォールディング剤。
【請求項６】
アンフォールディングされたタンパク質が、塩酸グアニジンおよび／または尿素でアンフォールディングされたタンパク質である請求項１〜５のいずれか記載のリフォールディング剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のリフォールディング剤で処理する工程を含むことを特徴とする、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法。
【請求項８】
リフォールディング剤で処理する工程において、さらに界面活性剤、ｐＨ調整剤および酵素安定剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を使用する請求項７記載のリフォールディング方法。
【請求項９】
リフォールディング剤で処理する工程における系中の（Ａ）の濃度が０．０１〜６モル／Ｌである請求項７または８記載のリフォールディング方法。
【請求項１０】
リフォールディング剤で処理する工程における系中のタンパク質の濃度が０．２〜３０ｍｇ／ｍＬである請求項７〜９いずれか記載のリフォールディング方法。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか記載のリフォールディング方法を含むタンパク質の産生方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の産生方法で得られたタンパク質。
【請求項１】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング剤であり、酸解離定数（ｐＫａ）が０．５（モル／Ｌ）以上のプロトン酸、該プロトン酸の塩および該プロトン酸のアルキルエステルからなる群から選ばれる１種以上であって、該プロトン酸の水酸基の酸素原子（ａ)と該酸素原子の最近接原子（ｂ)とのＰａｕｌｉｎｇ電気陰性度の差（Δχ）が０．８７〜１．５４である化合物（Ａ）からなるリフォールディング剤。
【請求項２】
化合物（Ａ）が、一般式（１）で示される基、カルボキシル基、カルボキシレート基およびエステル基からなる群から選ばれる１種以上の基を有する化合物である請求項１記載のリフォールディング剤。
【化１】
【請求項３】
化合物（Ａ）が、無機リン酸、アルキルリン酸エステル、糖リン酸エステル、カルボン酸、カルボン酸アルキルエステル、エーテルカルボン酸およびそれらの塩からなる群から選ばれる１種以上である請求項１または２記載のリフォールディング剤。
【請求項４】
無機リン酸がモノリン酸、ピロリン酸またはポリリン酸であり、糖リン酸エステルがアデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸またはアデノシン１リン酸であり、カルボン酸がギ酸、酢酸またはプロピオン酸である請求項３記載のリフォールディング剤。
【請求項５】
化合物（Ａ）が、ホウ酸、ホウ酸塩、ホウ酸エステル、ケイ酸、ケイ酸塩および炭酸からなる群から選ばれる１種以上である請求項１記載のリフォールディング剤。
【請求項６】
アンフォールディングされたタンパク質が、塩酸グアニジンおよび／または尿素でアンフォールディングされたタンパク質である請求項１〜５のいずれか記載のリフォールディング剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載のリフォールディング剤で処理する工程を含むことを特徴とする、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法。
【請求項８】
リフォールディング剤で処理する工程において、さらに界面活性剤、ｐＨ調整剤および酵素安定剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を使用する請求項７記載のリフォールディング方法。
【請求項９】
リフォールディング剤で処理する工程における系中の（Ａ）の濃度が０．０１〜６モル／Ｌである請求項７または８記載のリフォールディング方法。
【請求項１０】
リフォールディング剤で処理する工程における系中のタンパク質の濃度が０．２〜３０ｍｇ／ｍＬである請求項７〜９いずれか記載のリフォールディング方法。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか記載のリフォールディング方法を含むタンパク質の産生方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の産生方法で得られたタンパク質。
【公開番号】特開２００７−１２６３９２（Ｐ２００７−１２６３９２Ａ）
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２０２１２（Ｐ２００５−３２０２１２）
【出願日】平成１７年１１月２日（２００５．１１．２）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２日（２００５．１１．２）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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