タンパク質を二段階標識する方法
【課題】タンパク質を二段階標識する方法の提供。
【解決手段】標識対象タンパク質とＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）等との融合タンパク質を得ること、前記融合タンパク質と式（Ｉ）の化合物とを反応させ、式（Ｉ）の化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と融合タンパク質に含まれるＰＹＰ等とを結合させ、次いで、得られたＰＹＰ等が結合された式（Ｉ）の化合物に、式（ＩＩ）の化合物を反応させることにより、式（Ｉ）の化合物のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物のＺ2基とをカップリングさせ、前記対象タンパク質をＸ1で標識する。
【解決手段】標識対象タンパク質とＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）等との融合タンパク質を得ること、前記融合タンパク質と式（Ｉ）の化合物とを反応させ、式（Ｉ）の化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と融合タンパク質に含まれるＰＹＰ等とを結合させ、次いで、得られたＰＹＰ等が結合された式（Ｉ）の化合物に、式（ＩＩ）の化合物を反応させることにより、式（Ｉ）の化合物のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物のＺ2基とをカップリングさせ、前記対象タンパク質をＸ1で標識する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を二段階標識に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物が生きた状態において、生物内のタンパク質などの生体分子の機能を観察するバイオイメージングが注目されている。この生体分子機能の観察は、生体分子を蛍光で標識し、生物内におけるその生体分子の局在や動きを可視化することにより汎用的に行われている。生体分子を蛍光で標識する方法としては、遺伝子工学的手法を用いて、蛍光タンパク質を目的とする生体分子（タンパク質）の融合タンパク質として発現させる方法が一般的である。この蛍光タンパク質は、分子サイズが大きく、また、組織透過性の高い近赤外光蛍光の観測が困難であるなどの不都合がある。そのため、蛍光タンパク質より分子サイズが小さく、かつ、蛍光特性に優れた有機小分子に注目が集まっている。有機小分子を目的タンパク質にラベルする技術として、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（プロメガ株式会社）（例えば非特許文献１参照）およびＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）（例えば非特許文献２参照）を用いたラベル化キットが商品化されている。これらのラベル化法は、目的とする生体分子に融合させたタンパク質の酵素反応を利用して目的とする生体分子を蛍光で標識する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Qureshi,M.H., ら、J. Biol. Chem., 2001, 276, p.46422-8
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, p.9955-9959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のラベル化キットに代表されるように観察対象のタンパク質に融合させるタンパク質は、小型化が図られてきた。しかしながら、観察対象のタンパク質の機能をできるだけ阻害しないという点からは、融合させるタンパク質のさらなる小型化が望まれている。また、バイオイメージングの適用範囲を拡大する点からは、さらなるラベル化技術の開発が望まれている。
【０００５】
そこで、本発明は、生体内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するために使用できる、タンパク質を二段階標識する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、タンパク質を二段階標識する方法であって、
標識対象タンパク質とＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ること、および
前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させ、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と前記融合タンパク質に含まれるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質とを結合させ、次いで、得られたＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質が結合された前記式（Ｉ）で表わされる化合物に、下記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を反応させることにより、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のＺ1基と前記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のＺ2基とをカップリングさせ、その結果、前記対象タンパク質をＸ1で標識することを含む。
【０００７】
【化１】
【０００８】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【０００９】
【化２】
【００１０】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法は、比較的小さなタンパク質であるＰＹＰを利用するため、タンパク質を精度よく標識することができる。また、ＰＹＰは真正細菌由来であるため、ＰＹＰを細胞内で用いた際、ＰＹＰ由来の内在性タンパク質が標識に悪影響を与える可能性は低い。その結果、精度の高い標識が可能である。また、二段階で標識するため、小分子である式（ＩＩ）の化合物を種々変更することにより標識を容易に変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（ａ）は、ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰの反応後のＣＢＢ染色画像を、図１（ｂ）はＰＹＰと化合物ＣＡＴＰの反応後の蛍光画像を示す。
【図２】図２（ａ）は、緩衝液中でのＰＹＰの二段階標識反応後のＣＢＢ染色画像を、図２（ｂ）は緩衝液中でのＰＹＰの二段階標識の蛍光画像を示す。
【図３】図３（ａ）は、細胞溶解液中でのＰＹＰの二段階標識反応後のＣＢＢ染色画像を、図３（ｂ）は細胞溶解液中でのＰＹＰの二段階標識の蛍光画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）は、紅色光合成細菌Ectothiorhodospira halophila（Halorhodospira halophila）から単離された光受容タンパク質である。この紅色光合成細菌は真正細菌であるため、ＰＹＰを細胞内で用いた際、ＰＹＰ由来の内在性タンパク質が標識に悪影響を与える可能性は低い。また、このＰＹＰは、１２５のアミノ酸残基（配列表の配列番号１）により構成されており、比較的小さな（１４ｋＤａ）タンパク質である。このＰＹＰの６９番目のシステイン残基に発色団であるｐ−クマル酸がチオエステル結合を介して結合する。ＰＹＰにはｐ−クマル酸以外、様々な類似体が結合することが知られている（例えば、以下のスキーム１に示す化合物。例えばCordgunkeら、Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1998, 95, pp7396-7401、Koonら、The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271, pp. 31949-31956を参照）。
【００１４】
【化３】
【００１５】
本発明の標識方法においては、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質と標識対象タンパク質とを融合させた融合タンパク質を、式（Ｉ）の化合物またはその塩と反応させ、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩における式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と、前記融合タンパク質におけるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質とを結合させる。次いで、そこへ、式（ＩＩ）の化合物を反応させる。そうすると式（Ｉ）の化合物中のＺ1基が、式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基と反応して結合する（スキーム２中、Ｚ1基とＺ2基は結合してＺ基へ変換されている）。その結果、前記融合タンパク質は式（ＩＩ）の化合物由来のＸ1基で標識される。このＸ1基が蛍光性基である場合には、この式（ＩＩ）の化合物が結合した融合タンパク質はＸ1基由来の蛍光を発する。また、このＸ1基がビオチン由来の基である場合、さらに蛍光を発する官能基（または酵素）とビオチンに結合する部位（例えばアビジン）の両方を有する化合物と反応させ、その結果、式（ＩＩ）の化合物と結合した融合タンパク質は蛍光を発する（スキーム２参照）。このように、本発明の標識方法で用いるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質は、約１４ｋＤａと比較的大きさが小さく、標識対象タンパク質に与える影響は低いという利点がある。さらにＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質や、クマリン誘導体またはクマル酸誘導体は動物細胞内に存在しない物質であるため、標識に与える影響は低いという利点がある。また、蛍光を発する官能基（または酵素）とビオチン由来の基に結合する部位の両方を有する化合物は、官能基の種類を種々変更することができるため、蛍光標識（または酵素標識）の種類を容易に変更することができる。
【００１６】
【化４】
【００１７】
ＰＹＰのアミノ酸配列としては、例えば、配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列が挙げられ、ＰＹＰをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列が挙げられる。
【００１８】
融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得るには、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、そのようなプラスミド若しくはベクターを調製することができる。本発明において、ベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのポリヌクレオチドをいい、プラスミドを含むものをいう。なお、ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。融合タンパク質を発現可能とする配列は、当業者であれば、導入する細胞の種類に応じて適宜選択しうる。プラスミド及びベクターは、融合タンパク質の発現を調節する配列（例えば、発現誘導プロモーターや制御配列）を含んでもよい。
【００１９】
細胞内で融合タンパク質を発現させるには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを用いて、通常の方法に従って行うことができる。
【００２０】
発現した融合タンパク質を単離するには、通常の方法に従って行うことができる。
【００２１】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、前記のように、Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００２２】
【化５】
【００２３】
は、二重結合または三重結合を意味する。
【００２４】
【化６】
【００２５】
また、本発明のタンパク質を二段階標識する方法において用いられる式（ＩＩ）の化合物は、前記のように、Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【００２６】
【化７】
【００２７】
本発明において、蛍光性基とは、可視光線、紫外線、Ｘ線等が照射され、そのエネルギーを吸収することにより電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出する性質を有する基を意味する。具体的には、蛍光性基とは、フルオレセイン、キサンテン色素、シアニン色素、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン等から誘導される基あるいは発光性希土類錯体が挙げられ、フルオレセイン、キサンテン色素から誘導される基が好ましい。
【００２８】
本発明において、Ｚ1のためのリンカーＬ1とは、式（Ａ）の基のクマリン骨格とＺ1基とを、式（Ｂ）の基のベンゼン骨格とＺ1基とを結びつけるための基である。このリンカーＬ1は、式（Ａ）の基中のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基、または式（Ｂ）の基中のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基とが分子間で反応するよう、柔軟かつある程度の長さを有するものが好ましい。柔軟であるためには、リンカーＬ1は、鎖状構造を有するものが好ましい。また、長さについては、リンカーＬ1は、例えば６Å〜２０Å、好ましくは８Å〜１８Å、より好ましくは１０Å〜１６Åの長さを有する。
【００２９】
また、本発明において、Ｚ2のためのリンカーＬ2とは、Ｚ2基とＸ1基とを結びつけるための基である。このリンカーＬ2は、式（Ａ）の基中のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基、または式（Ｂ）の基中のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基とが分子間で反応するよう、柔軟かつある程度の長さを有するものが好ましい。柔軟であるためには、リンカーＬ2は、鎖状構造を有するものが好ましい。また、長さについては、リンカーＬ2は、例えば１Å〜１５Å、好ましくは２Å〜１２Å、より好ましくは２Å〜１０Åの長さを有する。
【００３０】
具体的には、Ｌ1およびＬ2は、例えば、−（ＣＨ2）n1Ｏ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ11（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＯ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＯＮＲ12（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＳＮＲ12（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ11（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ12（ＣＨ2）n2−，−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1Ｓ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯ2（ＣＨ2）n2−等の１以上を組み合わせたものが挙げられる。前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３はそれぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ11およびＲ12は、それぞれ、水素原子または低級アルキル基である。このリンカーＬ1およびＬ2は、本発明のタンパク質を二段階標識する方法における条件下で切断されないリンカーであれば、その構造は限定されない。前記Ｌ1としては、下記式（ａ）または（ｂ）で表わされる基が好ましい。前記Ｌ2としては、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＯ（ＣＨ2）n2−が好ましい。
【００３１】
【化８】
【００３２】
ここで、式（ａ）において、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
式（ｂ）において、ｎ７およびｎ８は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基である。
【００３３】
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ1、Ｒ2、式（Ａ）の基および式（Ｂ）の基は、１か所以上の不斉中心を有することもあり、それゆえ、式（Ｉ）の化合物はラセミ体または純粋な立体異性体として存在してもよい。さらに、式（Ｂ）が二重結合を含有する場合、シス又はトランス異性体として存在しうる。同様に、式（ＩＩ）の化合物において、Ｘ1およびＬ2の基は、１か所以上の不斉中心を有することもあり、それゆえ、式（ＩＩ）の化合物はラセミ体または純粋な立体異性体として存在してもよい。いずれの場合にも、本発明はそれらの混合物及び各異性体を共に包含するものである。
【００３４】
本発明において「低級」は、特に指示がなければ、炭素原子１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個を意味する。
【００３５】
本発明において、「ハロゲン原子」または「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられる。
【００３６】
本発明において、「低級アルキル基」または「低級アルキル」とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、および１−エチル−１−メチルプロピルなどの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００３７】
本発明において、「低級アルコキシ基」または「低級アルコキシ」とは、炭素数１〜６のアルキルオキシ基が挙げられる。具体的には、低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｉ−ペンチルオキシ、ｓｅｃ−ペンチルオキシ、ｔ−ペンチルオキシ、２−メチルブトキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｉ−ヘキシルオキシ、ｔ−ヘキシルオキシ、ｓｅｃ−ヘキシルオキシ、２−メチルペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、１−エチルブチルオキシ、２−エチルブチルオキシ、１，１−ジメチルブチルオキシ、２，２−ジメチルブチルオキシ、３，３−ジメチルブチルオキシ、および１−エチル−１−メチルプロピルオキシなどの直鎖状または分岐状のアルキルオキシ基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のアルキルオキシ基が挙げられる。
【００３８】
本発明において、「アリール基」とは、炭素数６〜１０のものが挙げられる。具体的には、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等を挙げることができ、好適にはフェニル基が挙げられる。
【００３９】
本発明において、「低級アラルキル基」とは、アリール置換された低級アルキル基が挙げられる。具体的には、低級アラルキル基としては、ベンジル（フェニルメチル）、フェネチル（フェニルエチル）、３−フェニルプロピル、１−ナフチルメチル、２−（１−ナフチル）エチル等を挙げることができ、好適にはベンジル基が挙げられる。
【００４０】
本発明において、「ハロゲンで置換された低級アルキル基」としては、例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ブロモメチル、ジブロモメチル、トリブロモメチル、１−フルオロエチル、１−クロロエチル、１−ブロモエチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、１，２−ジフルオロエチル、トルフルオロメチルなどが挙げられる。
【００４１】
本発明において、「低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基」としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、ｉ−プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ等が挙げられる。
【００４２】
本発明において、「ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基」としては、４−ヒドロキシフェニル、４−クロロフェニル、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、２，６−ジクロロフェニル、４−メトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、２−ヒドロキシナフチル等が挙げられる。
【００４３】
本発明において、「ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基」としては、４−ヒフォロキシベンジル、２−クロロベンジル、２−ブロモベンジル、４−メトキシベンジル等が挙げられる。
【００４４】
式（Ｉ）の化合物の塩および式（ＩＩ）の化合物の塩は、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【００４５】
式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００４６】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物および／または式（ＩＩ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。
【００４７】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法における標識対象タンパク質は、特に制限されないが、好ましくは、動物細胞のタンパク質であって、より好ましくは哺乳類のタンパク質であって、さらに好ましくは霊長類のタンパク質であって、さらにより好ましくはヒトのタンパク質である。また、本発明のタンパク質を二段階標識する方法における標識対象タンパク質は、少なくとも１部分が細胞外に存在しうるタンパク質であることが好ましく、膜タンパク質又は分泌されるタンパク質であることがより好ましい。なお、本発明のタンパク質を二段階標識する方法において、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質を融合させる部分は、標的対象タンパク質の細胞外に存在しうる部分であることが好ましい。したがって、本発明は、膜タンパク質を二段階標識する方法を提供しうる。
【００４８】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【００４９】
本発明のタンパク質をタンパク質を二段階標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（Ｉ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜８．５）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。
【００５０】
本発明のタンパク質をタンパク質を二段階標識する方法において、融合タンパク質におけるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質のアミノ酸配列は、
１）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列において、第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までが欠失したアミノ酸配列、
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列、及び、
４）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。なお、配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列は、１５種の紅色細菌（purple bacteria）に存在するＰＹＰのアミノ酸配列である。また、これらの紅色細菌のＰＹＰは、文献［Kumauchi et al. Photochemistry and Photobiology, 2008, 84:956-969］によれば、Ｎ末端の２４〜２７番目のアミノ酸配列を欠失させてもリガンド結合能を示すことが知られている。なお、当業者であれば、同文献図２(a)のマルチプルアライメントを参照してＮ末端の欠失可能部位を容易に判断できる。
【００５１】
標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することの１以上の工程を含む方法、または全ての工程を含む方法により得ることができる。すなわち、融合タンパク質を得ることは、該タンパク質を単離することのみならず、細胞内や生体内で発現させることを含む。
【００５２】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法は、式（Ｉ）の化合物中のＺ1基がビオチンである場合、さらに蛍光を発する官能基とビオチンに結合する部位（例えばアビジン）の両方を有する化合物と反応させる工程を含んでもよい。この反応の結果、融合タンパク質は蛍光を発する官能基に由来する蛍光を発し、従って、融合タンパク質を標識することができる。また、さらに酵素とビオチンに結合する部位（例えばアビジン）との両方を有する化合物と反応させる工程を含んでもよい。この場合、その酵素の作用により蛍光を発する基質と反応させ、蛍光量から酵素を検出する工程をさらに含む。そしてその酵素に基づき、酵素が結合された融合タンパク質、すなわち、標識対象タンパク質を標識することができる。このような酵素としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法において一般に用いられる酵素が挙げられる。
【００５３】
本発明は、また、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩と、式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを含む本発明の方法に用いるための組成物である。
【００５４】
【化９】
【００５５】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００５６】
【化１０】
【００５７】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【００５８】
本発明は、また、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
１）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列、
２）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列において、前記塩基配列がコードするアミノ酸配列のＮ末端の第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までの欠失に相当する塩基配列が欠失した塩基配列、
３）上記１）または２）の塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質が下記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
４）上記１）または２）の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質が下記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。なお、配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列は、それぞれ、配列表の配列番号１〜１２で表されるＰＹＰのアミノ酸配列をコードする塩基配列である。上記２）の塩基配列における５’側塩基配列の欠失については、上述のとおりである。
【００５９】
また、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩と前記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の二段階標識方法用キットである。
【００６０】
本発明のタンパク質の二段階標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００６１】
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、−Ｎ3基、−Ｃ≡ＣＨ基または−ＣＨＯ基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００６２】
【化１１】
【００６３】
が、二重結合を意味する式（Ｉ）の化合物またはその塩が好ましい。
【００６４】
また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
Ｙが、硫黄原子であり、
Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
Ｒ2が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｌ1が、式（ａ）または式（ｂ）で表わされる基であり、
Ｚ1が、−Ｎ3基または−Ｃ≡ＣＨ基であり、
Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
Ｒ5が、ヒドロキシであり、
【００６５】
【化１２】
【００６６】
が、二重結合を意味し、
ここで式（ａ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
式（ｂ）において、
ｎ７およびｎ８は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基である式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩がさらに好ましい。
【００６７】
【化１３】
【００６８】
また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
Ｚ2が−Ｎ3基、−Ｃ≡ＣＨ基、−ＯＮＨ2基または−ＣＯＮＨＮＨ2基であり、Ｌ2が−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＯ（ＣＨ2）n2−であり、Ｘ1が式（ｉ）の基である式（ＩＩ）の化合物またはその塩が好ましい。前記式中、ｎ１およびｎ２はそれぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基である。
【００６９】
【化１４】
【００７０】
また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（ＩＩ）の化合物としては、以下の式で表わされる化合物６−ＣＦＡがより好ましい。
【００７１】
【化１５】
【００７２】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩である。
【００７３】
【化１６】
【００７４】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、−Ｎ3基、−Ｃ≡ＣＨ基または−ＣＨＯ基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００７５】
【化１７】
【００７６】
は、二重結合または三重結合を意味する。
【００７７】
前記式（Ｉ）中、
Ｙが、硫黄原子であり、
Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
Ｒ2が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｌ1が、式（ａ）または式（ｂ）で表わされる基であり、
Ｚ1が、−Ｎ3基または−Ｃ≡ＣＨ基であり、
Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
Ｒ5が、ヒドロキシであり、
【００７８】
【化１８】
【００７９】
が、二重結合を意味し、
ここで式（ａ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
式（ｂ）において、
ｎ７およびｎ８は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基であるのが好ましい。
【００８０】
【化１９】
【００８１】
また、式（ＩＩ）の化合物としては、以下の式で表わされる化合物６−ＣＦＡがより好ましい。これらの好ましい式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物は、本発明におけるタンパク質を二段階標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。
【００８２】
【化２０】
【００８３】
式（Ｉ）の化合物は、例えば、下記スキーム３に従い、製造することができる。なお、出発原料は従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、購入してもよい。
【００８４】
【化２１】
【００８５】
前記式中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００８６】
【化２２】
【００８７】
は、二重結合または三重結合を意味する。
【００８８】
本発明は、さらに、本発明のタンパク質を二段階標識する方法により標的対象タンパク質を標識することを含むバイオイメージング方法を提供しうる。本発明のバイオイメージング方法は、好ましくは、前記標的対象タンパク質を発現する細胞又は組織のイメージングを含む。前記細胞又は組織としては、特に制限されないが、好ましくは、動物の細胞又は組織であって、より好ましくは哺乳類の細胞又は組織であって、さらに好ましくは霊長類の細胞又は組織であって、さらにより好ましくはヒトの細胞又は組織である。
【００８９】
［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＷＳＣＤ・ＨＣｌ：水溶性カルボジイミド：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＭＯＭＣｌ：メトキシメチルクロライド
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＮＢＳ：Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＡＩＢＮ：アゾビスブチロニトリル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＣＥＰ：トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＣＢＢ：クマシーブリリアントブルー
ＤＴＴ：ジチオトレイトール。
【００９０】
［化合物および機器］
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。
【００９１】
ＮＭＲスペクトルは、1Ｈ用には４００ＭＨｚで、13ＮＭＲ用には１００．４ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＡＬ４００装置（日本電子株式会社）で測定した。質量スペクトル（ＥＩ）は、ＣＢＰ１−Ｍ２５−０２５カラムを備えたＳｈｉｍａｚｕ ＧＣＭＳ−ＱＰ２０００（株式会社島津製作所）で電子衝撃モード（７０ｅＶ）で操作して測定した。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＤＸ３０３（日本電子株式会社）測定した。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ−Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ（日本ウォーターズ株式会社）で測定した。蛍光スペクトルは、日立分光蛍光光度計Ｆ−４５００（株式会社日立製作所）を用いて測定した。スリット幅は励起および放射の両方について２．５ｎｍであった。光電子増倍管電圧は７００Ｖであった。蛍光測定前にサンプルはＤＭＳＯ（生化学用グレード、和光純薬工業株式会社）に溶解させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、ＢＷ−３００（富士シリシア化学株式会社）を用いて行った。蛍光イメージングは、ＡＥ−６９３５Ｂ ＶＩＳＩＲＡＹＳ−Ｂを用いて視覚化した。
【実施例１】
【００９２】
化合物ＣＡＴＰの製造
下記化合物ＣＡＴＰを下記スキーム４に従い製造した。
【００９３】
【化２３】
【００９４】
スキーム４において：（ａ）マロン酸ジエチル、ピペリジン／ＥｔＯＨ、（ｂ）ＭＯＭＣｌ、ＤＩＥＡ／ＤＭＦ、（ｃ）ＮＢＳ、ＡＩＢＮ／ＣＣｌ4、（ｄ）１． ２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、ＮａＨ／ＤＭＦ；２． ２Ｎ ＮａＯＨ水溶液；３． ＴＦＡ、（ｅ） チオフェノール、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ／ＤＭＦ。
【００９５】
７−ヒドロキシ−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（１）の製造
２，４−ジヒドロキシ−６−メチルベンズアルデヒド（２．０ｇ）、マロン酸ジエチル（２．２ｍｌ，１４．４ｍｍｏｌ）およびピペリジン（０．３５ｍｌ）をエタノール（２０ｍｌ）に溶解させ、１００℃で２３時間攪拌した。混合物を冷却後、生じた結晶をろ過して単離し、冷エタノール（−２０℃）で洗浄して標題化合物を得た（２．０２ｇ，収率６２％）。
【００９６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.41 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 2.54 (s, 3H), 4.41 (q, J =7.2 Hz, 2H), 6.71 (d, J =7.2 Hz, 1H) 6.76 (d, 1H), 8.71 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.1, 17.9, 60.8, 99.9, 109.3, 110.9, 115.2, 140.6, 146.0, 156.4, 157.9, 163.3, 164.2;
HRMS(EI+) : 計算値248.06、測定値248.06。
【００９７】
７−（メトキシメトキシ）−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（２）の製造
７−ヒドロキシ−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（１）（０．２０ｇ，０．７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．４０ｍｌ，１．８ｍｍｏｌ）およびクロロメチルメチルエーテル（０．０１５ｍｌ，１．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解させ、０℃で２時間攪拌した。溶媒を混合物から除去した後、得られた残渣を１０％クエン酸水溶液（３０ｍＬ）に溶解させ、酢酸エチルで抽出した。得られた有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を減圧留去して標題化合物を得た（０．１８６ｍｇ，収率７９％）。
【００９８】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3); δ 1.41 (t, J = 7.2 Hz, 3H) 2.55 (s, 1H) 3.49 (s, 3H) 4.42 (q, J =7.2 Hz, 2H) 5.23 (s, 2H) 6.82 (d, J =6.0 Hz, 1H) 6.85 (d, J =6.0 Hz,1H) 8.69 (s, 1H) ;
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.3, 18.5, 56.5, 61.7, 94.2, 101.2, 111.7, 113.8, 115.3, 139.8, 145.9, 157.1, 157.9, 162.1, 163.8;
HRMS(EI+) : 計算値292.09, 測定値 292.09。
【００９９】
５−ブロモメチル−７−（メトキシメトキシ）クマリン−３−カルボン酸エチルエステル（３）の製造
７−（メトキシメトキシ）−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（２）（０．５ｇ，１．３ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（０．３６５ｇ，２．１ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（０．０４ｇ，０．２４ｍｍｏｌ）をＣＣｌ4（１５ｍｌ）に溶解させ、９５度で７時間攪拌した。溶媒を混合物から除去した後、得られた残渣をジクロロメタン／酢酸エチル（９７／３）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得た（０．３２７ｇ，収率５２％）。
【０１００】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3); δ 1.42 (t, J = 7.2 Hz, 3H) 3. 50 (s, 3H) 4.42 (q, J =7.2 Hz, 2H) 4.65 (s, 1H) 5.27 (s, 2H) 6.98 (d, J =6.0 Hz, 1H) 7.01 (d, J =6.0 Hz,1H) 8.77 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.3, 27.9, 56.7, 62.0, 94.5, 103.7, 110.7, 114.8, 115.7, 138.1, 144.5, 156.4, 157.9, 161.7, 163.3;
HRMS(EI+) : 計算値 370.01, 測定値 370.00。
【０１０１】
５−（（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（４）の製造
２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エタノール（０．２３３ｇ，１．３ｍｍｏｌ）および 水素化ナトリウム（０．０３８ｇ，１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解させ、室温で１５分間攪拌した。５−ブロモメチル−７−（メトキシメトキシ）クマリン−３−カルボン酸エチルエステル（３）をその混合物へ加え、得られた混合物を室温で１．５時間攪拌した。その後、ＮａＯＨ水溶液（２Ｎ、３ｍｌ）をその混合物へ添加した。２０分後、その混合物を飽和クエン酸水溶液で中和し、ジクロロメタンで中和した。溶媒を除去した後、得られた残渣をＴＦＡ（１０ｍｌ）中に溶解させ、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去した後、０．１％ギ酸を含有するＨ2Ｏ／アセトニトリルで溶出する逆相ＨＰＬＣで得られた残渣を精製し、標題化合物を得た（２１ｍｇ，収率８％）。
【０１０２】
1H-NMR(400 MHz, CDCl3): δ 3.21 (s, 2H) 3.53-3.61 (m, 10H) 6.61 (s,1H) 6.82 (s,1H) 8.86 (s,1H);
MS(ESI+) : 計算値 394.35, 測定値 394.11。
【０１０３】
化合物CATPの製造
５−（（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（４）（１５．５ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（９．６ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ（７．３ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間攪拌した。その後、チオフェノール（０．００３９ｍｌ，０．０３９ｍｍｏｌ）をその混合物に添加し、１時間攪拌した。溶媒を除去した後、得られた残渣をジクロロメタン／メタノール（９８／２）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得た（１７ｍｇ，８９％）。
【０１０４】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.37 (t, J = 4.8 Hz, 2H) 3.60-3.75 (m, 10H) 4.73 (s, 2H) 6.71 (d, J =2.0 Hz, 1H) 7.01 (d, J =2.0 Hz, 1H) 7.46 (m, 5H) 8.68 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 50.5, 69.6, 69.8, 70.1, 70.2, 70.6, 77.0, 70.6, 102.4, 109.6, 114.5, 117.6, 128.3, 129.1, 129.5, 134.9, 140.5, 158.1, 159.2, 163.4, 187.2;
HRMS (FAB+) 計算値 486.14, 測定値 486.13。
【０１０５】
［ＰＹＰのクローニング］
プラスミド（ＰＹＰのＨｉｓタグ融合タンパク質のＤＮＡをコード）を鋳型として、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲ（PrimeSTAR HS DNA Polymerase, タカラバイオ社)によってＨｉｓ−ＰＹＰのＤＮＡを増幅した。前記プラスミドは、アムステルダム大学のK. J. Hellingwerf教授から提供を受けた。前記ＰＹＰは、Ectothiorhodospira halophila（Halorhodospira halophila）由来である。ＰＣＲ断片（インサート）は、２．０％アガロースゲルによる分離後、キット(QIA quick Gel Extraction kit, QIAGEN)を用いて抽出した。大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ−２１ｂ（＋）とインサートをＨｉｎｄｌIIIとＮｄｅI（それぞれタカラバイオ社）で制限酵素処理し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いてｐＥＴ−２１ｂ（＋）にインサートを組み込み、ｐＥＴ−ＰＹＰを作成した。
【０１０６】
【化２４】
【０１０７】
［ＰＹＰの発現・精製］
ｐＥＴ−ＰＹＰを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換後、ＬＢ培地にて培養し、ＯＤ６００が０．６〜０．８Åになるまで３７℃で増殖させた。次に、ＩＰＴＧを終濃度１００μＭになるように加え、２０℃で一晩培養した。培養した大腸菌を集菌し、超音波破砕した後に可溶性画分を抽出した。可溶性画分のＰＹＰは、下記に示す緩衝液を用いて、ＱＩＡＧＥＮ社のプロトコールに従い、Ｎｉ−ＮＴＡカラム(Ni-NTAアガロース、QIAGEN社)により精製した。その後、トリス緩衝液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 8.0)を移動相として、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー(SuperdexTM 75 10/300 GL, GEヘルスケア社)により最終精製した。
【０１０８】
Ｎｉ−ＮＴＡカラムの条件：
結合液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）
洗浄液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）
溶出液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）。
【０１０９】
［ＰＹＰのエンテロキナーゼ処理］
ＨｉｓタグとＰＹＰの間には、プロテアーゼであるエンテロキナーゼにより切断される配列が組み込まれている。Ｈｉｓタグを除去するために、精製したＰＹＰにエンテロキナーゼ(Recombinant Enterokinase, Novagen社)を加え、室温で18時間静置した。静置後、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、ＱＩＡＧＥＮ社）に試料を添加しＨｉｓタグ部位を吸着させることにより、切断後のＰＹＰを精製した。Ｈｉｓタグ部位を除去した試料をベンズアミジンカラム(HiTrap Benzamidine FF, GEヘルスケア)に添加し、プロテアーゼを除去した。精製した試料は限外濾過(VIVASPIN 500, 5000 MWCO PES, sartorius stedim社)によりトリス緩衝液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 8.0)に置換した。
【０１１０】
［ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰの反応］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））中、５μＭのＰＹＰと５０μＭの化合物ＣＡＴＰを３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド分離ゲル）により結果を解析した。その結果得られたＣＢＢ染色画像を図１（ａ）に、蛍光画像を図１（ｂ）に示す。図１（ａ）から、ＰＹＰのバンド（１４ｋＤａ）が確認され、図１（ｂ）から蛍光画像においても、化合物ＣＡＴＰの添加に伴い、その対応する位置に蛍光が確認された。これらのことから、化合物ＣＡＴＰによりＰＹＰを蛍光標識できることが確認された。また、ＤＴＴ（１００ｍＭ）の添加により、化合物ＣＡＴＰにより標識されたＰＹＰのバンドが減少し、蛍光強度も消失したことから、ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰのチオエステル結合が、大過剰のＤＴＴにより加水分解されたことが確認できた。なお、化合物ＣＡＴＰ中のクマリン骨格は、それ自体蛍光を発する。
【０１１１】
［緩衝液中でＰＹＰを化合物ＣＡＴＰと化合物６−ＣＦＡで二段階標識］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））中、５μＭのＰＹＰと１２．５μＭの化合物ＣＡＴＰを３７℃で３０分間反応させた後、１５０μＭの化合物６−ＣＦＡ（６−カルボキシフルオレセインプロパラギルアミン、引用文献（J. Juら J. Org. Chem. 2003年, 第68巻, pp609-612に従い製造）を加え、ＣｕＳＯ4（８．３ｍＭ）およびＴＣＥＰ（８．３ｍＭ）存在下、室温で１時間反応させた。反応終了後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド分離ゲル）により解析した。その結果得られたＣＢＢ染色画像を図２（ａ）に、蛍光画像を図２（ｂ）に示す。図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、化合物６−ＣＦＡとの添加に伴い、ＰＹＰ（１４ｋＤａ）より移動の遅いバンドがＣＢＢ染色画像に確認できた。そしてそのバンドに対応する位置に蛍光が確認できた。これらのことから、ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰが反応し、その後化合物６−ＣＦＡと反応してＰＹＰを特異的に二段階標識できることが確認された。
【０１１２】
［細胞溶解液中でＰＹＰを化合物ＣＡＴＰと化合物６−ＣＦＡで二段階標識］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））に溶かしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解液において、５μＭのＰＹＰと１２．５μＭの化合物ＣＡＴＰを３７℃で３０分間反応させた後、１５０μＭの化合物６−ＣＦＡ（６−カルボキシフルオレセインプロパラギルアミン）を加え、ＣｕＳＯ4（８．３ｍＭ）およびＴＣＥＰ（８．３ｍＭ）存在下、室温で１時間反応させた。反応終了後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド分離ゲル）により解析した。その結果得られたＣＢＢ染色画像を図３（ａ）に、蛍光画像を図３（ｂ）に示す。図３（ａ）および図３（ｂ）に示すように、化合物ＣＡＴＰとＰＹＰ（１４ｋＤａ）を反応させたレーンにおいて、単一の蛍光バンドが確認された。さらに、化合物６−ＣＦＡによる二段階標識後、ＰＹＰ（１４ｋＤａ）より移動の遅い蛍光バンドが検出された。このことから、細胞溶解液中において化合物ＣＡＴＰはＰＹＰを特異的に標識でき、さらに、化合物６−ＣＦＡによる二段階標識が可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法は、細胞イメージング等に適用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１４】
配列番号３０：フォワードプライマー
配列番号３１：リバースプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を二段階標識に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物が生きた状態において、生物内のタンパク質などの生体分子の機能を観察するバイオイメージングが注目されている。この生体分子機能の観察は、生体分子を蛍光で標識し、生物内におけるその生体分子の局在や動きを可視化することにより汎用的に行われている。生体分子を蛍光で標識する方法としては、遺伝子工学的手法を用いて、蛍光タンパク質を目的とする生体分子（タンパク質）の融合タンパク質として発現させる方法が一般的である。この蛍光タンパク質は、分子サイズが大きく、また、組織透過性の高い近赤外光蛍光の観測が困難であるなどの不都合がある。そのため、蛍光タンパク質より分子サイズが小さく、かつ、蛍光特性に優れた有機小分子に注目が集まっている。有機小分子を目的タンパク質にラベルする技術として、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（プロメガ株式会社）（例えば非特許文献１参照）およびＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）（例えば非特許文献２参照）を用いたラベル化キットが商品化されている。これらのラベル化法は、目的とする生体分子に融合させたタンパク質の酵素反応を利用して目的とする生体分子を蛍光で標識する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Qureshi,M.H., ら、J. Biol. Chem., 2001, 276, p.46422-8
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, p.9955-9959
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のラベル化キットに代表されるように観察対象のタンパク質に融合させるタンパク質は、小型化が図られてきた。しかしながら、観察対象のタンパク質の機能をできるだけ阻害しないという点からは、融合させるタンパク質のさらなる小型化が望まれている。また、バイオイメージングの適用範囲を拡大する点からは、さらなるラベル化技術の開発が望まれている。
【０００５】
そこで、本発明は、生体内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するために使用できる、タンパク質を二段階標識する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、タンパク質を二段階標識する方法であって、
標識対象タンパク質とＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ること、および
前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させ、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と前記融合タンパク質に含まれるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質とを結合させ、次いで、得られたＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質が結合された前記式（Ｉ）で表わされる化合物に、下記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を反応させることにより、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のＺ1基と前記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のＺ2基とをカップリングさせ、その結果、前記対象タンパク質をＸ1で標識することを含む。
【０００７】
【化１】
【０００８】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【０００９】
【化２】
【００１０】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法は、比較的小さなタンパク質であるＰＹＰを利用するため、タンパク質を精度よく標識することができる。また、ＰＹＰは真正細菌由来であるため、ＰＹＰを細胞内で用いた際、ＰＹＰ由来の内在性タンパク質が標識に悪影響を与える可能性は低い。その結果、精度の高い標識が可能である。また、二段階で標識するため、小分子である式（ＩＩ）の化合物を種々変更することにより標識を容易に変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（ａ）は、ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰの反応後のＣＢＢ染色画像を、図１（ｂ）はＰＹＰと化合物ＣＡＴＰの反応後の蛍光画像を示す。
【図２】図２（ａ）は、緩衝液中でのＰＹＰの二段階標識反応後のＣＢＢ染色画像を、図２（ｂ）は緩衝液中でのＰＹＰの二段階標識の蛍光画像を示す。
【図３】図３（ａ）は、細胞溶解液中でのＰＹＰの二段階標識反応後のＣＢＢ染色画像を、図３（ｂ）は細胞溶解液中でのＰＹＰの二段階標識の蛍光画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）は、紅色光合成細菌Ectothiorhodospira halophila（Halorhodospira halophila）から単離された光受容タンパク質である。この紅色光合成細菌は真正細菌であるため、ＰＹＰを細胞内で用いた際、ＰＹＰ由来の内在性タンパク質が標識に悪影響を与える可能性は低い。また、このＰＹＰは、１２５のアミノ酸残基（配列表の配列番号１）により構成されており、比較的小さな（１４ｋＤａ）タンパク質である。このＰＹＰの６９番目のシステイン残基に発色団であるｐ−クマル酸がチオエステル結合を介して結合する。ＰＹＰにはｐ−クマル酸以外、様々な類似体が結合することが知られている（例えば、以下のスキーム１に示す化合物。例えばCordgunkeら、Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1998, 95, pp7396-7401、Koonら、The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271, pp. 31949-31956を参照）。
【００１４】
【化３】
【００１５】
本発明の標識方法においては、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質と標識対象タンパク質とを融合させた融合タンパク質を、式（Ｉ）の化合物またはその塩と反応させ、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩における式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と、前記融合タンパク質におけるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質とを結合させる。次いで、そこへ、式（ＩＩ）の化合物を反応させる。そうすると式（Ｉ）の化合物中のＺ1基が、式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基と反応して結合する（スキーム２中、Ｚ1基とＺ2基は結合してＺ基へ変換されている）。その結果、前記融合タンパク質は式（ＩＩ）の化合物由来のＸ1基で標識される。このＸ1基が蛍光性基である場合には、この式（ＩＩ）の化合物が結合した融合タンパク質はＸ1基由来の蛍光を発する。また、このＸ1基がビオチン由来の基である場合、さらに蛍光を発する官能基（または酵素）とビオチンに結合する部位（例えばアビジン）の両方を有する化合物と反応させ、その結果、式（ＩＩ）の化合物と結合した融合タンパク質は蛍光を発する（スキーム２参照）。このように、本発明の標識方法で用いるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質は、約１４ｋＤａと比較的大きさが小さく、標識対象タンパク質に与える影響は低いという利点がある。さらにＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質や、クマリン誘導体またはクマル酸誘導体は動物細胞内に存在しない物質であるため、標識に与える影響は低いという利点がある。また、蛍光を発する官能基（または酵素）とビオチン由来の基に結合する部位の両方を有する化合物は、官能基の種類を種々変更することができるため、蛍光標識（または酵素標識）の種類を容易に変更することができる。
【００１６】
【化４】
【００１７】
ＰＹＰのアミノ酸配列としては、例えば、配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列が挙げられ、ＰＹＰをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列が挙げられる。
【００１８】
融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得るには、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、そのようなプラスミド若しくはベクターを調製することができる。本発明において、ベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのポリヌクレオチドをいい、プラスミドを含むものをいう。なお、ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。融合タンパク質を発現可能とする配列は、当業者であれば、導入する細胞の種類に応じて適宜選択しうる。プラスミド及びベクターは、融合タンパク質の発現を調節する配列（例えば、発現誘導プロモーターや制御配列）を含んでもよい。
【００１９】
細胞内で融合タンパク質を発現させるには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを用いて、通常の方法に従って行うことができる。
【００２０】
発現した融合タンパク質を単離するには、通常の方法に従って行うことができる。
【００２１】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、前記のように、Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００２２】
【化５】
【００２３】
は、二重結合または三重結合を意味する。
【００２４】
【化６】
【００２５】
また、本発明のタンパク質を二段階標識する方法において用いられる式（ＩＩ）の化合物は、前記のように、Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【００２６】
【化７】
【００２７】
本発明において、蛍光性基とは、可視光線、紫外線、Ｘ線等が照射され、そのエネルギーを吸収することにより電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出する性質を有する基を意味する。具体的には、蛍光性基とは、フルオレセイン、キサンテン色素、シアニン色素、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン等から誘導される基あるいは発光性希土類錯体が挙げられ、フルオレセイン、キサンテン色素から誘導される基が好ましい。
【００２８】
本発明において、Ｚ1のためのリンカーＬ1とは、式（Ａ）の基のクマリン骨格とＺ1基とを、式（Ｂ）の基のベンゼン骨格とＺ1基とを結びつけるための基である。このリンカーＬ1は、式（Ａ）の基中のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基、または式（Ｂ）の基中のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基とが分子間で反応するよう、柔軟かつある程度の長さを有するものが好ましい。柔軟であるためには、リンカーＬ1は、鎖状構造を有するものが好ましい。また、長さについては、リンカーＬ1は、例えば６Å〜２０Å、好ましくは８Å〜１８Å、より好ましくは１０Å〜１６Åの長さを有する。
【００２９】
また、本発明において、Ｚ2のためのリンカーＬ2とは、Ｚ2基とＸ1基とを結びつけるための基である。このリンカーＬ2は、式（Ａ）の基中のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基、または式（Ｂ）の基中のＺ1基と式（ＩＩ）の化合物中のＺ2基とが分子間で反応するよう、柔軟かつある程度の長さを有するものが好ましい。柔軟であるためには、リンカーＬ2は、鎖状構造を有するものが好ましい。また、長さについては、リンカーＬ2は、例えば１Å〜１５Å、好ましくは２Å〜１２Å、より好ましくは２Å〜１０Åの長さを有する。
【００３０】
具体的には、Ｌ1およびＬ2は、例えば、−（ＣＨ2）n1Ｏ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ11（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＯ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＯＮＲ12（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＳＮＲ12（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯＮＲ11（ＣＨ2）n3ＣＯＮＲ12（ＣＨ2）n2−，−（ＣＨ2）n1−、−（ＣＨ2）n1Ｓ（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11（ＣＨ2）n2−、−（ＣＨ2）n1ＣＯ2（ＣＨ2）n2−等の１以上を組み合わせたものが挙げられる。前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３はそれぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ11およびＲ12は、それぞれ、水素原子または低級アルキル基である。このリンカーＬ1およびＬ2は、本発明のタンパク質を二段階標識する方法における条件下で切断されないリンカーであれば、その構造は限定されない。前記Ｌ1としては、下記式（ａ）または（ｂ）で表わされる基が好ましい。前記Ｌ2としては、−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＯ（ＣＨ2）n2−が好ましい。
【００３１】
【化８】
【００３２】
ここで、式（ａ）において、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
式（ｂ）において、ｎ７およびｎ８は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基である。
【００３３】
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ1、Ｒ2、式（Ａ）の基および式（Ｂ）の基は、１か所以上の不斉中心を有することもあり、それゆえ、式（Ｉ）の化合物はラセミ体または純粋な立体異性体として存在してもよい。さらに、式（Ｂ）が二重結合を含有する場合、シス又はトランス異性体として存在しうる。同様に、式（ＩＩ）の化合物において、Ｘ1およびＬ2の基は、１か所以上の不斉中心を有することもあり、それゆえ、式（ＩＩ）の化合物はラセミ体または純粋な立体異性体として存在してもよい。いずれの場合にも、本発明はそれらの混合物及び各異性体を共に包含するものである。
【００３４】
本発明において「低級」は、特に指示がなければ、炭素原子１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個を意味する。
【００３５】
本発明において、「ハロゲン原子」または「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられる。
【００３６】
本発明において、「低級アルキル基」または「低級アルキル」とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、および１−エチル−１−メチルプロピルなどの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００３７】
本発明において、「低級アルコキシ基」または「低級アルコキシ」とは、炭素数１〜６のアルキルオキシ基が挙げられる。具体的には、低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｉ−ペンチルオキシ、ｓｅｃ−ペンチルオキシ、ｔ−ペンチルオキシ、２−メチルブトキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｉ−ヘキシルオキシ、ｔ−ヘキシルオキシ、ｓｅｃ−ヘキシルオキシ、２−メチルペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、１−エチルブチルオキシ、２−エチルブチルオキシ、１，１−ジメチルブチルオキシ、２，２−ジメチルブチルオキシ、３，３−ジメチルブチルオキシ、および１−エチル−１−メチルプロピルオキシなどの直鎖状または分岐状のアルキルオキシ基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のアルキルオキシ基が挙げられる。
【００３８】
本発明において、「アリール基」とは、炭素数６〜１０のものが挙げられる。具体的には、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等を挙げることができ、好適にはフェニル基が挙げられる。
【００３９】
本発明において、「低級アラルキル基」とは、アリール置換された低級アルキル基が挙げられる。具体的には、低級アラルキル基としては、ベンジル（フェニルメチル）、フェネチル（フェニルエチル）、３−フェニルプロピル、１−ナフチルメチル、２−（１−ナフチル）エチル等を挙げることができ、好適にはベンジル基が挙げられる。
【００４０】
本発明において、「ハロゲンで置換された低級アルキル基」としては、例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ブロモメチル、ジブロモメチル、トリブロモメチル、１−フルオロエチル、１−クロロエチル、１−ブロモエチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、１，２−ジフルオロエチル、トルフルオロメチルなどが挙げられる。
【００４１】
本発明において、「低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基」としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、ｉ−プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ等が挙げられる。
【００４２】
本発明において、「ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基」としては、４−ヒドロキシフェニル、４−クロロフェニル、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、２，６−ジクロロフェニル、４−メトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、２−ヒドロキシナフチル等が挙げられる。
【００４３】
本発明において、「ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基」としては、４−ヒフォロキシベンジル、２−クロロベンジル、２−ブロモベンジル、４−メトキシベンジル等が挙げられる。
【００４４】
式（Ｉ）の化合物の塩および式（ＩＩ）の化合物の塩は、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【００４５】
式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００４６】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物および／または式（ＩＩ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。
【００４７】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法における標識対象タンパク質は、特に制限されないが、好ましくは、動物細胞のタンパク質であって、より好ましくは哺乳類のタンパク質であって、さらに好ましくは霊長類のタンパク質であって、さらにより好ましくはヒトのタンパク質である。また、本発明のタンパク質を二段階標識する方法における標識対象タンパク質は、少なくとも１部分が細胞外に存在しうるタンパク質であることが好ましく、膜タンパク質又は分泌されるタンパク質であることがより好ましい。なお、本発明のタンパク質を二段階標識する方法において、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質を融合させる部分は、標的対象タンパク質の細胞外に存在しうる部分であることが好ましい。したがって、本発明は、膜タンパク質を二段階標識する方法を提供しうる。
【００４８】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【００４９】
本発明のタンパク質をタンパク質を二段階標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（Ｉ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜８．５）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。
【００５０】
本発明のタンパク質をタンパク質を二段階標識する方法において、融合タンパク質におけるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質のアミノ酸配列は、
１）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列において、第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までが欠失したアミノ酸配列、
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列、及び、
４）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。なお、配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列は、１５種の紅色細菌（purple bacteria）に存在するＰＹＰのアミノ酸配列である。また、これらの紅色細菌のＰＹＰは、文献［Kumauchi et al. Photochemistry and Photobiology, 2008, 84:956-969］によれば、Ｎ末端の２４〜２７番目のアミノ酸配列を欠失させてもリガンド結合能を示すことが知られている。なお、当業者であれば、同文献図２(a)のマルチプルアライメントを参照してＮ末端の欠失可能部位を容易に判断できる。
【００５１】
標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することの１以上の工程を含む方法、または全ての工程を含む方法により得ることができる。すなわち、融合タンパク質を得ることは、該タンパク質を単離することのみならず、細胞内や生体内で発現させることを含む。
【００５２】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法は、式（Ｉ）の化合物中のＺ1基がビオチンである場合、さらに蛍光を発する官能基とビオチンに結合する部位（例えばアビジン）の両方を有する化合物と反応させる工程を含んでもよい。この反応の結果、融合タンパク質は蛍光を発する官能基に由来する蛍光を発し、従って、融合タンパク質を標識することができる。また、さらに酵素とビオチンに結合する部位（例えばアビジン）との両方を有する化合物と反応させる工程を含んでもよい。この場合、その酵素の作用により蛍光を発する基質と反応させ、蛍光量から酵素を検出する工程をさらに含む。そしてその酵素に基づき、酵素が結合された融合タンパク質、すなわち、標識対象タンパク質を標識することができる。このような酵素としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法において一般に用いられる酵素が挙げられる。
【００５３】
本発明は、また、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩と、式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを含む本発明の方法に用いるための組成物である。
【００５４】
【化９】
【００５５】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００５６】
【化１０】
【００５７】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【００５８】
本発明は、また、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
１）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列、
２）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列において、前記塩基配列がコードするアミノ酸配列のＮ末端の第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までの欠失に相当する塩基配列が欠失した塩基配列、
３）上記１）または２）の塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質が下記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
４）上記１）または２）の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質が下記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。なお、配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列は、それぞれ、配列表の配列番号１〜１２で表されるＰＹＰのアミノ酸配列をコードする塩基配列である。上記２）の塩基配列における５’側塩基配列の欠失については、上述のとおりである。
【００５９】
また、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩と前記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の二段階標識方法用キットである。
【００６０】
本発明のタンパク質の二段階標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００６１】
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、−Ｎ3基、−Ｃ≡ＣＨ基または−ＣＨＯ基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００６２】
【化１１】
【００６３】
が、二重結合を意味する式（Ｉ）の化合物またはその塩が好ましい。
【００６４】
また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
Ｙが、硫黄原子であり、
Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
Ｒ2が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｌ1が、式（ａ）または式（ｂ）で表わされる基であり、
Ｚ1が、−Ｎ3基または−Ｃ≡ＣＨ基であり、
Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
Ｒ5が、ヒドロキシであり、
【００６５】
【化１２】
【００６６】
が、二重結合を意味し、
ここで式（ａ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
式（ｂ）において、
ｎ７およびｎ８は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基である式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩がさらに好ましい。
【００６７】
【化１３】
【００６８】
また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
Ｚ2が−Ｎ3基、−Ｃ≡ＣＨ基、−ＯＮＨ2基または−ＣＯＮＨＮＨ2基であり、Ｌ2が−（ＣＨ2）n1ＮＲ11ＣＯ（ＣＨ2）n2−であり、Ｘ1が式（ｉ）の基である式（ＩＩ）の化合物またはその塩が好ましい。前記式中、ｎ１およびｎ２はそれぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基である。
【００６９】
【化１４】
【００７０】
また、本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（ＩＩ）の化合物としては、以下の式で表わされる化合物６−ＣＦＡがより好ましい。
【００７１】
【化１５】
【００７２】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩である。
【００７３】
【化１６】
【００７４】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、−Ｎ3基、−Ｃ≡ＣＨ基または−ＣＨＯ基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００７５】
【化１７】
【００７６】
は、二重結合または三重結合を意味する。
【００７７】
前記式（Ｉ）中、
Ｙが、硫黄原子であり、
Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
Ｒ2が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｌ1が、式（ａ）または式（ｂ）で表わされる基であり、
Ｚ1が、−Ｎ3基または−Ｃ≡ＣＨ基であり、
Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
Ｒ5が、ヒドロキシであり、
【００７８】
【化１８】
【００７９】
が、二重結合を意味し、
ここで式（ａ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
式（ｂ）において、
ｎ７およびｎ８は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基であるのが好ましい。
【００８０】
【化１９】
【００８１】
また、式（ＩＩ）の化合物としては、以下の式で表わされる化合物６−ＣＦＡがより好ましい。これらの好ましい式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物は、本発明におけるタンパク質を二段階標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。
【００８２】
【化２０】
【００８３】
式（Ｉ）の化合物は、例えば、下記スキーム３に従い、製造することができる。なお、出発原料は従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、購入してもよい。
【００８４】
【化２１】
【００８５】
前記式中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【００８６】
【化２２】
【００８７】
は、二重結合または三重結合を意味する。
【００８８】
本発明は、さらに、本発明のタンパク質を二段階標識する方法により標的対象タンパク質を標識することを含むバイオイメージング方法を提供しうる。本発明のバイオイメージング方法は、好ましくは、前記標的対象タンパク質を発現する細胞又は組織のイメージングを含む。前記細胞又は組織としては、特に制限されないが、好ましくは、動物の細胞又は組織であって、より好ましくは哺乳類の細胞又は組織であって、さらに好ましくは霊長類の細胞又は組織であって、さらにより好ましくはヒトの細胞又は組織である。
【００８９】
［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＷＳＣＤ・ＨＣｌ：水溶性カルボジイミド：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＭＯＭＣｌ：メトキシメチルクロライド
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＮＢＳ：Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＡＩＢＮ：アゾビスブチロニトリル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＣＥＰ：トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＣＢＢ：クマシーブリリアントブルー
ＤＴＴ：ジチオトレイトール。
【００９０】
［化合物および機器］
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。
【００９１】
ＮＭＲスペクトルは、1Ｈ用には４００ＭＨｚで、13ＮＭＲ用には１００．４ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＡＬ４００装置（日本電子株式会社）で測定した。質量スペクトル（ＥＩ）は、ＣＢＰ１−Ｍ２５−０２５カラムを備えたＳｈｉｍａｚｕ ＧＣＭＳ−ＱＰ２０００（株式会社島津製作所）で電子衝撃モード（７０ｅＶ）で操作して測定した。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＤＸ３０３（日本電子株式会社）測定した。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ−Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ（日本ウォーターズ株式会社）で測定した。蛍光スペクトルは、日立分光蛍光光度計Ｆ−４５００（株式会社日立製作所）を用いて測定した。スリット幅は励起および放射の両方について２．５ｎｍであった。光電子増倍管電圧は７００Ｖであった。蛍光測定前にサンプルはＤＭＳＯ（生化学用グレード、和光純薬工業株式会社）に溶解させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、ＢＷ−３００（富士シリシア化学株式会社）を用いて行った。蛍光イメージングは、ＡＥ−６９３５Ｂ ＶＩＳＩＲＡＹＳ−Ｂを用いて視覚化した。
【実施例１】
【００９２】
化合物ＣＡＴＰの製造
下記化合物ＣＡＴＰを下記スキーム４に従い製造した。
【００９３】
【化２３】
【００９４】
スキーム４において：（ａ）マロン酸ジエチル、ピペリジン／ＥｔＯＨ、（ｂ）ＭＯＭＣｌ、ＤＩＥＡ／ＤＭＦ、（ｃ）ＮＢＳ、ＡＩＢＮ／ＣＣｌ4、（ｄ）１． ２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、ＮａＨ／ＤＭＦ；２． ２Ｎ ＮａＯＨ水溶液；３． ＴＦＡ、（ｅ） チオフェノール、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ／ＤＭＦ。
【００９５】
７−ヒドロキシ−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（１）の製造
２，４−ジヒドロキシ−６−メチルベンズアルデヒド（２．０ｇ）、マロン酸ジエチル（２．２ｍｌ，１４．４ｍｍｏｌ）およびピペリジン（０．３５ｍｌ）をエタノール（２０ｍｌ）に溶解させ、１００℃で２３時間攪拌した。混合物を冷却後、生じた結晶をろ過して単離し、冷エタノール（−２０℃）で洗浄して標題化合物を得た（２．０２ｇ，収率６２％）。
【００９６】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.41 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 2.54 (s, 3H), 4.41 (q, J =7.2 Hz, 2H), 6.71 (d, J =7.2 Hz, 1H) 6.76 (d, 1H), 8.71 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.1, 17.9, 60.8, 99.9, 109.3, 110.9, 115.2, 140.6, 146.0, 156.4, 157.9, 163.3, 164.2;
HRMS(EI+) : 計算値248.06、測定値248.06。
【００９７】
７−（メトキシメトキシ）−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（２）の製造
７−ヒドロキシ−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（１）（０．２０ｇ，０．７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．４０ｍｌ，１．８ｍｍｏｌ）およびクロロメチルメチルエーテル（０．０１５ｍｌ，１．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解させ、０℃で２時間攪拌した。溶媒を混合物から除去した後、得られた残渣を１０％クエン酸水溶液（３０ｍＬ）に溶解させ、酢酸エチルで抽出した。得られた有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を減圧留去して標題化合物を得た（０．１８６ｍｇ，収率７９％）。
【００９８】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3); δ 1.41 (t, J = 7.2 Hz, 3H) 2.55 (s, 1H) 3.49 (s, 3H) 4.42 (q, J =7.2 Hz, 2H) 5.23 (s, 2H) 6.82 (d, J =6.0 Hz, 1H) 6.85 (d, J =6.0 Hz,1H) 8.69 (s, 1H) ;
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.3, 18.5, 56.5, 61.7, 94.2, 101.2, 111.7, 113.8, 115.3, 139.8, 145.9, 157.1, 157.9, 162.1, 163.8;
HRMS(EI+) : 計算値292.09, 測定値 292.09。
【００９９】
５−ブロモメチル−７−（メトキシメトキシ）クマリン−３−カルボン酸エチルエステル（３）の製造
７−（メトキシメトキシ）−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（２）（０．５ｇ，１．３ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（０．３６５ｇ，２．１ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（０．０４ｇ，０．２４ｍｍｏｌ）をＣＣｌ4（１５ｍｌ）に溶解させ、９５度で７時間攪拌した。溶媒を混合物から除去した後、得られた残渣をジクロロメタン／酢酸エチル（９７／３）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得た（０．３２７ｇ，収率５２％）。
【０１００】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3); δ 1.42 (t, J = 7.2 Hz, 3H) 3. 50 (s, 3H) 4.42 (q, J =7.2 Hz, 2H) 4.65 (s, 1H) 5.27 (s, 2H) 6.98 (d, J =6.0 Hz, 1H) 7.01 (d, J =6.0 Hz,1H) 8.77 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.3, 27.9, 56.7, 62.0, 94.5, 103.7, 110.7, 114.8, 115.7, 138.1, 144.5, 156.4, 157.9, 161.7, 163.3;
HRMS(EI+) : 計算値 370.01, 測定値 370.00。
【０１０１】
５−（（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（４）の製造
２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エタノール（０．２３３ｇ，１．３ｍｍｏｌ）および 水素化ナトリウム（０．０３８ｇ，１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解させ、室温で１５分間攪拌した。５−ブロモメチル−７−（メトキシメトキシ）クマリン−３−カルボン酸エチルエステル（３）をその混合物へ加え、得られた混合物を室温で１．５時間攪拌した。その後、ＮａＯＨ水溶液（２Ｎ、３ｍｌ）をその混合物へ添加した。２０分後、その混合物を飽和クエン酸水溶液で中和し、ジクロロメタンで中和した。溶媒を除去した後、得られた残渣をＴＦＡ（１０ｍｌ）中に溶解させ、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去した後、０．１％ギ酸を含有するＨ2Ｏ／アセトニトリルで溶出する逆相ＨＰＬＣで得られた残渣を精製し、標題化合物を得た（２１ｍｇ，収率８％）。
【０１０２】
1H-NMR(400 MHz, CDCl3): δ 3.21 (s, 2H) 3.53-3.61 (m, 10H) 6.61 (s,1H) 6.82 (s,1H) 8.86 (s,1H);
MS(ESI+) : 計算値 394.35, 測定値 394.11。
【０１０３】
化合物CATPの製造
５−（（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（４）（１５．５ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（９．６ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ（７．３ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間攪拌した。その後、チオフェノール（０．００３９ｍｌ，０．０３９ｍｍｏｌ）をその混合物に添加し、１時間攪拌した。溶媒を除去した後、得られた残渣をジクロロメタン／メタノール（９８／２）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得た（１７ｍｇ，８９％）。
【０１０４】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.37 (t, J = 4.8 Hz, 2H) 3.60-3.75 (m, 10H) 4.73 (s, 2H) 6.71 (d, J =2.0 Hz, 1H) 7.01 (d, J =2.0 Hz, 1H) 7.46 (m, 5H) 8.68 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 50.5, 69.6, 69.8, 70.1, 70.2, 70.6, 77.0, 70.6, 102.4, 109.6, 114.5, 117.6, 128.3, 129.1, 129.5, 134.9, 140.5, 158.1, 159.2, 163.4, 187.2;
HRMS (FAB+) 計算値 486.14, 測定値 486.13。
【０１０５】
［ＰＹＰのクローニング］
プラスミド（ＰＹＰのＨｉｓタグ融合タンパク質のＤＮＡをコード）を鋳型として、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲ（PrimeSTAR HS DNA Polymerase, タカラバイオ社)によってＨｉｓ−ＰＹＰのＤＮＡを増幅した。前記プラスミドは、アムステルダム大学のK. J. Hellingwerf教授から提供を受けた。前記ＰＹＰは、Ectothiorhodospira halophila（Halorhodospira halophila）由来である。ＰＣＲ断片（インサート）は、２．０％アガロースゲルによる分離後、キット(QIA quick Gel Extraction kit, QIAGEN)を用いて抽出した。大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ−２１ｂ（＋）とインサートをＨｉｎｄｌIIIとＮｄｅI（それぞれタカラバイオ社）で制限酵素処理し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いてｐＥＴ−２１ｂ（＋）にインサートを組み込み、ｐＥＴ−ＰＹＰを作成した。
【０１０６】
【化２４】
【０１０７】
［ＰＹＰの発現・精製］
ｐＥＴ−ＰＹＰを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換後、ＬＢ培地にて培養し、ＯＤ６００が０．６〜０．８Åになるまで３７℃で増殖させた。次に、ＩＰＴＧを終濃度１００μＭになるように加え、２０℃で一晩培養した。培養した大腸菌を集菌し、超音波破砕した後に可溶性画分を抽出した。可溶性画分のＰＹＰは、下記に示す緩衝液を用いて、ＱＩＡＧＥＮ社のプロトコールに従い、Ｎｉ−ＮＴＡカラム(Ni-NTAアガロース、QIAGEN社)により精製した。その後、トリス緩衝液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 8.0)を移動相として、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー(SuperdexTM 75 10/300 GL, GEヘルスケア社)により最終精製した。
【０１０８】
Ｎｉ−ＮＴＡカラムの条件：
結合液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）
洗浄液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）
溶出液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）。
【０１０９】
［ＰＹＰのエンテロキナーゼ処理］
ＨｉｓタグとＰＹＰの間には、プロテアーゼであるエンテロキナーゼにより切断される配列が組み込まれている。Ｈｉｓタグを除去するために、精製したＰＹＰにエンテロキナーゼ(Recombinant Enterokinase, Novagen社)を加え、室温で18時間静置した。静置後、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、ＱＩＡＧＥＮ社）に試料を添加しＨｉｓタグ部位を吸着させることにより、切断後のＰＹＰを精製した。Ｈｉｓタグ部位を除去した試料をベンズアミジンカラム(HiTrap Benzamidine FF, GEヘルスケア)に添加し、プロテアーゼを除去した。精製した試料は限外濾過(VIVASPIN 500, 5000 MWCO PES, sartorius stedim社)によりトリス緩衝液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 8.0)に置換した。
【０１１０】
［ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰの反応］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））中、５μＭのＰＹＰと５０μＭの化合物ＣＡＴＰを３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド分離ゲル）により結果を解析した。その結果得られたＣＢＢ染色画像を図１（ａ）に、蛍光画像を図１（ｂ）に示す。図１（ａ）から、ＰＹＰのバンド（１４ｋＤａ）が確認され、図１（ｂ）から蛍光画像においても、化合物ＣＡＴＰの添加に伴い、その対応する位置に蛍光が確認された。これらのことから、化合物ＣＡＴＰによりＰＹＰを蛍光標識できることが確認された。また、ＤＴＴ（１００ｍＭ）の添加により、化合物ＣＡＴＰにより標識されたＰＹＰのバンドが減少し、蛍光強度も消失したことから、ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰのチオエステル結合が、大過剰のＤＴＴにより加水分解されたことが確認できた。なお、化合物ＣＡＴＰ中のクマリン骨格は、それ自体蛍光を発する。
【０１１１】
［緩衝液中でＰＹＰを化合物ＣＡＴＰと化合物６−ＣＦＡで二段階標識］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））中、５μＭのＰＹＰと１２．５μＭの化合物ＣＡＴＰを３７℃で３０分間反応させた後、１５０μＭの化合物６−ＣＦＡ（６−カルボキシフルオレセインプロパラギルアミン、引用文献（J. Juら J. Org. Chem. 2003年, 第68巻, pp609-612に従い製造）を加え、ＣｕＳＯ4（８．３ｍＭ）およびＴＣＥＰ（８．３ｍＭ）存在下、室温で１時間反応させた。反応終了後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド分離ゲル）により解析した。その結果得られたＣＢＢ染色画像を図２（ａ）に、蛍光画像を図２（ｂ）に示す。図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、化合物６−ＣＦＡとの添加に伴い、ＰＹＰ（１４ｋＤａ）より移動の遅いバンドがＣＢＢ染色画像に確認できた。そしてそのバンドに対応する位置に蛍光が確認できた。これらのことから、ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰが反応し、その後化合物６−ＣＦＡと反応してＰＹＰを特異的に二段階標識できることが確認された。
【０１１２】
［細胞溶解液中でＰＹＰを化合物ＣＡＴＰと化合物６−ＣＦＡで二段階標識］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））に溶かしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解液において、５μＭのＰＹＰと１２．５μＭの化合物ＣＡＴＰを３７℃で３０分間反応させた後、１５０μＭの化合物６−ＣＦＡ（６−カルボキシフルオレセインプロパラギルアミン）を加え、ＣｕＳＯ4（８．３ｍＭ）およびＴＣＥＰ（８．３ｍＭ）存在下、室温で１時間反応させた。反応終了後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド分離ゲル）により解析した。その結果得られたＣＢＢ染色画像を図３（ａ）に、蛍光画像を図３（ｂ）に示す。図３（ａ）および図３（ｂ）に示すように、化合物ＣＡＴＰとＰＹＰ（１４ｋＤａ）を反応させたレーンにおいて、単一の蛍光バンドが確認された。さらに、化合物６−ＣＦＡによる二段階標識後、ＰＹＰ（１４ｋＤａ）より移動の遅い蛍光バンドが検出された。このことから、細胞溶解液中において化合物ＣＡＴＰはＰＹＰを特異的に標識でき、さらに、化合物６−ＣＦＡによる二段階標識が可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明のタンパク質を二段階標識する方法は、細胞イメージング等に適用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１４】
配列番号３０：フォワードプライマー
配列番号３１：リバースプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を二段階標識する方法であって、
標識対象タンパク質とＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ること、および
前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させ、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と前記融合タンパク質に含まれるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質とを結合させ、次いで、得られたＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質が結合された前記式（Ｉ）で表わされる化合物に、下記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を反応させることにより、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のＺ1基と前記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のＺ2基とをカップリングさせ、その結果、前記対象タンパク質をＸ1で標識することを含むタンパク質を二段階標識する方法。
【化２５】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【化２６】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【請求項２】
前記融合タンパク質における前記ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質のアミノ酸配列が、
１）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列において、第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までが欠失したアミノ酸配列、
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列、及び、
４）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１記載のタンパク質を二段階標識する方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１又は２記載のタンパク質を二段階標識する方法。
【請求項４】
式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩と、式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを含む請求項１〜３のいずれかの方法に用いるための組成物。
【化２７】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【化２８】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
１）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列、
２）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列において、前記塩基配列がコードするアミノ酸配列のＮ末端の第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までの欠失に相当する塩基配列が欠失した塩基配列、
３）上記１）または２）の塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質が下記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
４）上記１）または２）の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクター。
【化２９】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【化３０】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物と、請求項５に記載のプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質を二段階標識する方法用キット。
【請求項７】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩。
【化３１】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、−Ｎ3基、−Ｃ≡ＣＨ基または−ＣＨＯ基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【化３２】
は、二重結合または三重結合を意味する。
【請求項８】
Ｙが、硫黄原子であり、
Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
Ｒ2が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｌ1が、式（ａ）または式（ｂ）で表わされる基であり、
Ｚ1が、−Ｎ3基または−Ｃ≡ＣＨ基であり、
Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
Ｒ5が、ヒドロキシであり、
【化３３】
が、二重結合を意味し、
ここで式（ａ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
式（ｂ）において、
ｎ７およびｎ８は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基である。
【化３４】
【請求項１】
タンパク質を二段階標識する方法であって、
標識対象タンパク質とＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ること、および
前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させ、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と前記融合タンパク質に含まれるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質とを結合させ、次いで、得られたＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質が結合された前記式（Ｉ）で表わされる化合物に、下記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩を反応させることにより、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩のＺ1基と前記式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩のＺ2基とをカップリングさせ、その結果、前記対象タンパク質をＸ1で標識することを含むタンパク質を二段階標識する方法。
【化２５】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【化２６】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【請求項２】
前記融合タンパク質における前記ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質のアミノ酸配列が、
１）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列において、第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までが欠失したアミノ酸配列、
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列、及び、
４）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１記載のタンパク質を二段階標識する方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１又は２記載のタンパク質を二段階標識する方法。
【請求項４】
式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩と、式（ＩＩ）で表わされる化合物またはその塩とを含む請求項１〜３のいずれかの方法に用いるための組成物。
【化２７】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【化２８】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
１）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列、
２）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列において、前記塩基配列がコードするアミノ酸配列のＮ末端の第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までの欠失に相当する塩基配列が欠失した塩基配列、
３）上記１）または２）の塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質が下記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
４）上記１）または２）の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合しうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクター。
【化２９】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、Ｚ2と反応性の基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【化３０】
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ1は、蛍光性基またはビオチン由来の基であり、
Ｌ2は、Ｚ2のためのリンカーであり、
Ｚ2は、Ｚ1と反応性の基である。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物と、請求項５に記載のプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質を二段階標識する方法用キット。
【請求項７】
一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩。
【化３１】
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ1は、低級アルキル基、ハロゲン置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ2は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｚ1は、−Ｎ3基、−Ｃ≡ＣＨ基または−ＣＨＯ基であり、
Ｌ1は、Ｚ1のためのリンカーであり、
Ｒ3およびＲ4はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、またはハロゲン置換された低級アルキル基であり、
Ｒ5は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
【化３２】
は、二重結合または三重結合を意味する。
【請求項８】
Ｙが、硫黄原子であり、
Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
Ｒ2が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｌ1が、式（ａ）または式（ｂ）で表わされる基であり、
Ｚ1が、−Ｎ3基または−Ｃ≡ＣＨ基であり、
Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
Ｒ5が、ヒドロキシであり、
【化３３】
が、二重結合を意味し、
ここで式（ａ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
式（ｂ）において、
ｎ７およびｎ８は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ11は、水素原子または低級アルキル基である。
【化３４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２０７１３４（Ｐ２０１０−２０７１３４Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５６３０６（Ｐ２００９−５６３０６）
【出願日】平成２１年３月１０日（２００９．３．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、科学技術総合研究委託事業「科学技術連携施策群の効果的・効率的な推進 生体内分子を可視化するナノセンサ分子開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１０日（２００９．３．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、科学技術総合研究委託事業「科学技術連携施策群の効果的・効率的な推進 生体内分子を可視化するナノセンサ分子開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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