タンパク質翻訳の制御を介する成体ＣＮＳにおける軸索再生の促進
病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生を、（ａ）該ニューロンをタンパク質翻訳の外因性活性化物質の治療有効量と接触させ；（ｂ）該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生の得られた促進を検出することにより促進する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年６月６日に出願され、同一の発明の名称および発明者を有する米国特許出願第６１／０５９，５６８号の優先権を主張する。
【０００２】
本研究は、ＮＩＨグラント番号Ｐ０３０−ＨＤ１８６５５により支援されたものである。米国政府は、本出願に係る任意の特許において権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
本発明の分野は、タンパク質合成を活性化して病変ＣＮＳ軸索の再生および成熟ＣＮＳにおける残された軸索の代償的な再成長を促進することである。
【０００４】
成体哺乳動物ＣＮＳ損傷後の軸索再生の不全は、主として成体ＣＮＳの２種の特性、すなわち、阻害的な外因性環境および成熟ＣＮＳニューロンの内因性再生能の低下に起因すると考えられている（１〜５）。非許容性環境についての数多くの研究により、軸索の再成長の制限に関与する多数の分子プレイヤーおよびシグナリング経路が同定された。それらの機序が軸索再生にとって明らかに重要な外因性障壁に相当するものの、それらの阻害活性を中和しても、インビボで軸索再生の制限された程度が許容されたにすぎない（６、７）。実際、許容性環境、例えば、病変部位に移植された座骨神経移植片により、損傷した成体軸索のほんの一部しか再生させることができない（５、８）。それらの結果は、阻害活性の中和が十分でなく、したがって他の機序、例えばニューロンが本来有する軸策再生能力を制御する機序が軸索再生において重要な役割を果たし得ることを示す。
【０００５】
胚発生の間の軸索成長とは対照的に、成体ＣＮＳニューロンに備わっている再生能を制御する分子機序については、ほとんど知られていない（１、３〜５、９）。発生の間の軸索成長および損傷後の軸索再生を同一または異なる機序が機能させるのかどうか、ならびに発生の過程にわたる軸索成長能の減少の原因が何なのかも知られていない。成体ＣＮＳにおいて活性遮断に応答する構造的可塑性の解剖学的基礎として一過性および持続性両方の軸索発芽が実証されている（１０）。代償機序としての軸索のこの再組織化の理由も、損傷した軸索を再生することができないという点で不明確である。それらの疑問に対する潜在的ヒントは、細胞成長およびサイズを制御する、進化的に保存された分子経路から得られる。あらゆる細胞型において、発生完了時の細胞の過剰増殖を防止するために特異的機序が必要であると考えられている（１１）。それらの分子の多くが有糸核分裂後の成熟ニューロン内で発現されることが多いので、本発明者らは、それらの経路が成体ＣＮＳニューロンにおける再生能の低下の一因になり得るとの仮説をたてた。
【０００６】
視神経損傷モデルにおいて細胞成長制御に関与する種々の経路を試験することにより、本発明者らは、成体網膜神経節細胞（ＲＧＣ）において、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）経路の負の調節物質であるＰＴＥＮ（ホスファターゼ・テンシン・ホモログ）を阻害することで、軸索再生が顕著に促進されることを示す。さらなる研究により、成体ＣＮＳニューロンにおけるｍＴＯＲシグナリングの２工程抑制：発生成熟による第１の抑制、および軸索切断により誘発されたストレス応答による第２の抑制が明らかになった。ｍＴＯＲ活性のそのような阻害および後続の新たなタンパク質合成能の障害は、それらが損傷した軸索を再生することができないことの一因になる。ｍＴＯＲ経路の別の負の調節物質である結節性硬化症複合体１（ＴＳＣ１）の阻害によるこの経路の再活性化も、広範囲にわたる長距離軸策（long-distance axon）の再生に導く。本発明者らの研究は、一般的な成長制御経路がニューロンにおける軸索再生能を調節することを示し、これにより、ＣＮＳ損傷、例えば脊髄損傷、卒中、外傷性脳損傷および緑内障後の軸索再生を促進する新たな方針を提供する。
【０００７】
本出願の優先日後に、Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００８ Ｊｕｌ １６）２８（２９）：７２９３−３０３）により、成体ラットにおいて脊髄損傷後の神経保護治療としてカリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）を使用する小分子タンパク質チロシンホスファターゼの阻害が報告された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再成長（再生および発芽）をインサイチューで促進するための方法および構成物を提供する。一般的な本方法は、（ａ）ニューロンを該ニューロンにおけるタンパク質翻訳の外因性活性化物質の治療有効量と接触させ、これにより該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生を促進する工程；および（ｂ）該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生の得られた促進を検出する工程を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、タンパク質翻訳の活性化物質は：（ａ）ｍＴＯＲ経路活性化物質；（ｂ）ＰＴＥＮ阻害剤；（ｃ）ＴＳＣ１／２阻害剤；（ｄ）Ａｋｔ活性化物質；（ｅ）Ｒａｓ／ＭＥＫ経路活性化物質；または（ｆ）ＰＲＡＳ４０阻害剤である。
【００１０】
特定の実施形態において、タンパク質翻訳の活性化物質は、ＰＴＥＮ阻害剤、例えば、（ａ）カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ））；（ｂ）ジカリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ））；（ｃ）カリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ））；または（ｄ）ジカリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｉｃ））である。
【００１１】
種々の実施形態において、病変は、外傷性損傷、外傷性脳損傷、卒中、急性脊髄損傷またはＣＮＳ変性に起因する。
【００１２】
具体的な実施形態において、病変軸索は、視神経内に存在し、または感覚ニューロンのＣＮＳ軸索であり、または脊髄内に存在する。
【００１３】
具体的な実施形態において、病変軸索は、患者の脊髄内に存在し、阻害剤を該患者に鞘内投与する。
【００１４】
種々の実施形態において、軸索は、感覚ニューロンのＣＮＳ軸索であり、または小脳顆粒ニューロンのＣＮＳ軸索である。
【００１５】
検出工程は、軸索再生の間接または直接アッセイにより行うことができる。
【００１６】
種々の実施形態において、阻害剤を静脈内投与、鞘内投与、経眼投与またはニューロンにおいて局所投与する。
【００１７】
特定の実施形態において、一般的方法は、ニューロンが病変していること、ならびに軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病因に誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有することを決定する前工程をさらに含む。
【００１８】
特定の実施形態において、タンパク質翻訳の活性化物質はＰＴＥＮ阻害剤であり、病変軸索は視神経内に存在し、該阻害剤を経眼投与する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、主題方法に具体的に適合された構成物、例えば、軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病理学的に誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有すると認められた病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生をインサイチューで促進するためのデバイスであって、該ニューロンにおけるタンパク質翻訳の活性化物質の治療有効量の事前に計測された含有量が装填され、主題方法を実施するために具体的に適合されたリザーバーを含むデバイスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の具体的実施形態の詳細な説明
【００２１】
標的ニューロンは病変しており、軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病因により誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有し、これらは、直接的、間接的に検出し、または推定することができる。特定の例において、病変軸索は、脊髄神経節（ＤＲＧ）感覚ニューロン、小脳顆粒ニューロンまたは眼の神経のＣＮＳ軸索である。成熟（すなわち、終末分化した、非胚性の）ニューロンは、インビトロで、または対象もしくは患者内にインサイチューで存在し得る。具体的な実施形態において、対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、ペット、家畜、神経変性またはＣＮＳ損傷のためのげっ歯類または霊長類動物モデルなど）である。
【００２２】
病変は、外傷性損傷、視神経損傷もしくは障害、脳損傷、卒中、慢性神経変性、例えば、神経毒性により惹起されるもの、または神経疾患もしくは障害（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）など）に起因し得る。
【００２３】
一実施形態において、活性化物質は、眼損傷または障害（例えば、中毒性弱視、視神経萎縮症、高次視覚経路の病変、眼球運動の障害、第ＩＩＩ脳神経麻痺、第ＩＶ脳神経麻痺、第ＶＩ脳神経麻痺、核間性眼筋麻痺、注視麻痺、フリーラジカルからの眼損傷など）、または視神経症（例えば、虚血性視神経症、中毒性視神経症、眼性虚血症候群、視神経炎症、視神経の感染、視神経炎、視神経症、鬱血乳頭、乳頭炎、球後神経炎、網膜振盪症、緑内障、黄斑変性、網膜色素変性、網膜剥離、網膜裂孔または網膜円孔、糖尿病性網膜症、医原性網膜症、視神経ドルーゼンなど）を治療するために使用される。
【００２４】
特定の実施形態において、病変は、急性または外傷性損傷、例えば、挫傷、裂傷、急性脊髄損傷などに起因する。具体的な実施形態において、病変ＣＮＳ軸索は、ＣＮＳ白質内に、特に外傷性損傷を受けた白質内に存在する。ある実施形態において、病変の形成から９６、７２、４８、２４または１２時間以内に接触工程を開始する。種々の実施形態において、病変の形成後５、７、１４、３０または６０日を超えて接触工程を開始し、および／または治療を継続する。
【００２５】
活性化物質は、抗炎症剤または抗瘢痕化剤、成長因子または栄養因子などの使用のような他の治療と組み合わせて、他の治療前に、または他の治療に続いて損傷ニューロンに投与することができる。具体的な実施形態において、病変は急性脊髄損傷に起因し、本方法は、ニューロンを、脊髄の炎症を低減するのに十分なメチルプレドニゾロンと接触させることをさらに含む。種々の他の実施形態において、活性化物質は、栄養因子および／または成長因子、例えば、ＮＴ−３（Ｐｉａｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２００６ Ｏｃｔ；２０１（２）：３５９−６７）、イノシン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２００２）９９：９０３１−６；Ｂｅｎｏｗｉｔｚの米国特許第６，５５１，６１２号；Ｂｅｎｏｗｉｔｚの米国特許第６，４４０，４５５号；およびＢｅｎｏｗｉｔｚの米国特許出願公開第２００５０２７７６１４号）、オンコモジュリン（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００６）９：８４３−５２．；Ｂｅｎｏｗｉｔｚの米国特許出願公開第２００５００５４５５８号；Ｂｅｎｏｗｉｔｚの米国特許出願公開第２００５００５９５９４号；およびＢｅｎｏｗｉｔｚの米国特許第６，８５５，６９０号）などと組み合わせて投与する。
【００２６】
本発明者らは、本発明の方法および構成物に対する適合性を、広範囲にわたるタンパク質合成活性化物質において詳細に記載しているが、本明細書に記載および例示されているアッセイを用いることによって、好適な更なる活性化物質を容易に同定することができる。一般に、活性化物質は、タンパク質合成の１種以上の正の調節物質（例えば、ＲｈｅＢ１、Ａｋｔ、Ｒａｓなど）の有効量を増加させ、またはタンパク質合成の１種以上の負の調節物質（例えば、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＲＡＳ４０など）の有効量を阻害する。正の調節物質の増加は、単純に正の調節物質またはそのより活性な変種を活性化物質として利用することにより行うことができる。負の調節物質の阻害は、転写のレベルにおいて（例えば、特異的ｓｉＲＮＡを使用）、または特異的な薬理学的阻害剤で負の調節物質を狙うことにより行うことができる。例示的な好適な活性化物質は：ｍＴＯＲ経路活性化物質、例えば活性ＲｈｅＢ１；ＰＴＥＮ阻害剤、例えば確立されているバナジウム系ＰＴＥＮ阻害剤またはｓｉＲＮＡ；ＴＳＣ１／２阻害剤、例えばＴＳＣ２またはＴＳＣ１用のｓｉＲＮＡ；Ａｋｔ活性化物質、例えば活性Ａｋｔおよびメナジオン；Ｒａｓ／ＭＥＫ経路活性化物質、例えば活性Ｒａｓ；ならびにＰＲＡＳ４０阻害剤、例えばｓｉＲＮＡを含む。更なる好適なタンパク質合成の活性化物質は、本明細書に開示のアッセイおよびプロトコルを使用して容易に同定され、確認され、特性決定される。
【００２７】
特定の実施形態において、活性化物質は、ＰＴＥＮ阻害剤、特にバナジウム系ＰＴＥＮ阻害剤、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋから市販されているものであり、（ａ）カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ））；（ｂ）ジカリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ））；（ｃ）カリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ））；および（ｄ）ジカリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｉｃ））を含む。代替的な好適なＰＴＥＮ阻害剤は、ＷＯ２００５／０９７１１９に記載の式Ｉ−ＸＩＶのＰＴＥＮ阻害化合物；ＵＳ２００７０２９２５３２に記載の、およびＲｏｓｉｖａｔｚ ｅｔ ａｌ．２００６（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１（１２）７８０−７９０）によるバナジウム系ＰＴＥＮ阻害剤；Ｎｉｇｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７０：１１４３−１１４９，２００６）により記載の１，４−ナフトキノン誘導体であるシコニン；ならびにＹｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００７ Ａｐｒ；１７７０（４）：６８７−９３により記載のメナジオン（ビタミンＫ３）を含む。（代替的な好適な阻害剤の同定および確認のための）一般的なスクリーニングおよびＩＣ５０決定のためのＰＴＥＮ阻害アッセイは、当分野、例えばＷＯ２００５／０９７１１９において公知であり；下記の実施例２も参照のこと。
【００２８】
好適なＰＴＥＮ阻害剤は、ＷＯ２００７／０２０３０９８にも記載されており、該文献に開示の引用されている全ての属、下位属および種を含み、該文献に記載の通り、下記のものを含む：
【００２９】
Ｉ）アスコルビン酸系ＰＴＥＮ阻害剤：
【化１】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｘ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ３Ｒ４または（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｘ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ３Ｒ４または（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３を表し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５またはＮＲ５Ｒ６を表し；
ｍは、０から３であり；
ｎは、０から３であり；
Ｘは、ＯまたはＮＲ４を表す］。
式ＩおよびＩａの化合物は、Ｒ１またはＲ２のいずれかにおいてエステル結合を有することができる。
【００３０】
ＩＩ）１，２，３−トリアゾールＰＴＥＮ阻害剤（例えば、ＷＯ０２／３２８９６に記載）：
【化２】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＣＯＸＲ２、ＣＯＲ２、ＳＯ２ＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４またはＮＲ４Ｒ５を表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４またはＮＲ４Ｒ５を表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ６、ＮＨＣＯＲ６、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＲ６Ｒ７またはＮ＝Ｃ（Ｒ６Ｒ７）を表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、ＯまたはＮＲ５を表す］。
【００３１】
式ＩＩの阻害剤は、以下のものを含む：
【化３】
［式中、
Ｒ８は、（ＣＨ２）ｎＸＲ４または（ＣＨ２）ｎＳＲ４を表し；
Ｒ９は、ＮＨＮＨＳＯ２アリール、ＮＨＮＨＣＯ−アリールまたはＮＨＮ＝Ｃ（Ｒ６Ｒ７）を表し；
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯＲ６またはＣＯ２Ｒ６を表す］。
【００３２】
ＩＩＩ）ジアミドＰＴＥＮ阻害剤
【化４】
［式中、
Ａは、５または６員環であり；
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４または（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３；ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４または（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３を表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
ｎは、０〜３であり；
ｍは、０〜３であり；
Ｘは、ＯまたはＮＲ４を表す］。
【００３３】
環Ａは、飽和、不飽和または芳香族であってよく、ＮおよびＯを場合により含むことができる。式ＩＩＩの好ましい化合物は、環Ａが複素環系、特にビシナル置換されているピリジン、ピリミジン、フラザン、イミダゾール、ピラゾール、フラン、チアゾールおよびオキサゾール、ならびにそれらの飽和類縁体から選択される化合物であり；式ＩＩＩの他の好ましい阻害剤は、環Ａが全ての炭素芳香族環、例えば、置換および非置換のフェニル、ならびにそれらの飽和類似体を含む阻害剤である。
【００３４】
式ＩＩＩの阻害剤は、以下のものから選択される環Ａを含むことができる：
【化５】
【００３５】
ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ、ＩＩＩＥから選択される環Ａを含む式ＩＩＩの阻害剤は、以下のものをさらに含むことができる：
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３または（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＦ３、アリール、カルボキシラート、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、シアノ、イソシアナート、アルコキシカルボニルまたはハロアルキルを表し；
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＦ３、アリール、カルボキシラート、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、シアノ、イソシアナート、アルコキシカルボニルまたはハロアルキルを表し；
ｍは、１、２、３である。
【００３６】
特定の実施形態において、アルキルアリールは、式ＩＩＩＦまたはＩＩＩＧから選択される：
【化６】
【００３７】
式ＩＩＩの阻害剤は、以下の式のものであってもよい：
【化７】
［式中、
Ａは、５または６員環であり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＸＲ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３またはＣＨ２（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＸＲ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３またはＣＨ２（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ３、Ｘおよびｎは、式ＩＩＩについて記載されている通りである］。
【００３８】
阻害剤ＩＩＩＨおよびＩＩＩＪの環Ａは、飽和、不飽和または芳香族であってよく、ＣおよびＮにより場合により置換されていてよい。
【化８】
【００３９】
ＩＶ）アリールイミダゾールカルボニルＰＴＥＮ阻害剤：
【化９】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｍＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｍＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３または（ＣＨ２）ｍＸＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５Ｒ６）またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
ｍは、１〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ４を表す］。
【００４０】
式ＩＶの化合物は、以下の式のものであってよい：
【化１０】
［式中、Ｒ７は、ＸＲ４を表す］。
【００４１】
式ＩＶの化合物は、以下の式のものであってもよい：
【化１１】
［式中、
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＸ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３または（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリールを表す］。
【００４２】
式ＩＶＢの化合物は、以下のものから選択されてもよい：
【化１２】
【００４３】
Ｖ）ポリアミドＰＴＥＮ阻害剤
【化１３】
【００４４】
ＶＩ）市販のＰＴＥＮ阻害剤
１．デルタメトリン；（Ｓ）−ａ−シアノ−３フェノキシベンジル（１Ｒ）−シス−３−（２，２ジブロモビニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシラート
２．アレンドロン酸ナトリウム三水和物
３．Ｎ−（９，１０−ジオキソ９，１０−ジヒドロフェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチルプロピオンアミド
４．５−ベンジル−３フリルメチル（１Ｒ，Ｓ）−シス，トランス−クリサンテマート
５．スラミンナトリウム塩；８，８’−［カルボニルビス［イミノ−３，１フェニレンカルボニルイミノ（４−メチル−３，１−フェニレン）カルボニルイミノ］］ビスナトリウム塩、ヘキサナトリウム塩
６．４−メトキシフェナシルブロミド
７．１，４−ジメチルエンドタール；１，４−ジメチル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボン酸
８．カンタリド酸；２，３−ジメチル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３ジカルボン酸
９．スチボグルコン酸ナトリウム；グルコン酸アンチモンナトリウム
１０．３，４−デホスタチン、エチル−
１１．フェンバレラート；ａ−シアノ−３−フェノキシベンジル−ａ（４−クロロフェニル）イソバレラート
１２．α−ナフチルリン酸モノナトリウム塩
１３．β−グリセロリン酸ジナトリウム塩五水和物
１４．エンドタール；７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３ジカルボン酸
１５．シペルメトリン；（Ｒ，Ｓ）−α−シアノ−３−フェノキシベンジル−３（２，２−ジクロロビニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシラート；（１Ｒ）−（Ｒ）シアノ（３−フェノキシフェニル）メチル３−（２，２−ジクロロビニル）−２，２ジメチルシクロプロパンカルボキシラート。
【００４５】
ＶＩＩ）１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンＰＴＥＮ阻害剤
【化１４】
［式中、
Ｒ１は、０、Ｃ１−Ｃ４アルキル、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ２または（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ２を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４またはＮＲ４Ｒ５を表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４またはＮＲ４Ｒ５を表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ６は、各出現時において、水素、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ４Ｒ１０、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＮＨ（ＣＨ２）ｐＣＯ（ＣＨ２）ｑＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐＳＯ２ＸＲ２または（ＣＨ２）ｐＸＳＯ２Ｒ２から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４またはＮＲ８Ｒ９を表し；
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＸＲ２を独立して表し；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐ〜ＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐＳＯ２ＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＸＳＯ２Ｒまたは（ＣＨ２）ｐＳＯ２Ｒ２を独立して表し；
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル Ｒ７＝Ｈ、Ｃ1−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４またはＮＲ８Ｒ９を表し；
ｍは、０または１を独立して表し；
ｎは、１〜５であり；
ｐは、０〜５であり；
ｑは、０〜５であり；
Ｘは、ＯまたはＮＲ３を表し；
Ｚは、ＯまたはＮＲ７である］。
式ＶＩＩの化合物の環中の窒素は、中性であってよい。この窒素は、少なくとも１個のｍが１である場合においてＲ１基に結合している場合、荷電していてもよい（第四級塩）。
【００４６】
阻害剤は、以下のものから選択されてもよい：
【化１５】
【００４７】
ＶＩＩＩ）置換フェナントレン−９−１０−ジオンＰＴＥＮ阻害剤
【化１６】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２またはＣＯＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを独立して表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２−Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、ＣＲ２Ｒ３、Ｏ、ＮＲ４を表す］。
【００４８】
式ＶＩＩＩの阻害剤は、以下の式のものであってよい：
【化１７】
【００４９】
ＩＸ）イサチンＰＴＥＮ阻害剤
【化１８】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２、ＣＯＮＲ５Ｒ６、ＳＯ３Ｒ２またはＳＯ２ＮＲ２Ｒ３を表し；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを独立して表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２−Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸ−Ｒ２（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）＝ＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、ＣＲ２Ｒ３、Ｏ、ＮＲ４を表す］。
【００５０】
式ＩＸの阻害剤は、以下のものから選択されてよい：
【化１９】
【００５１】
Ｘ）置換フェナントレン−９−オールＰＴＥＮ阻害剤
【化２０】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２またはＣＯＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを独立して表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２−Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
ＲＯは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ２、ＣＣＨ２）ｎＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、ＣＲ２Ｒ３、Ｏ、ＮＲ４を表す］。
【００５２】
【化２１】
【００５３】
ＸＩ）置換ナフタレン−１，２−ジオンＰＴＥＮ阻害剤
【化２２】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ３Ｒ４、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、ＣＯＲ２、ＳＯ３−Ｒ２、ＳＯ２Ｎ−Ｒ３Ｒ４、ＮＨＳＯ２−Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ２、ＮＲ３Ｒ４またはＣＯＮＲ３Ｒ４から独立して選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＯＲ２を独立して表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ２を表す］。
【００５４】
式ＸＩの阻害剤は、以下のものから選択されてよい：
【化２３】
【００５５】
ＸＩＩ）置換ナフタレン−１，４−ジオンＰＴＥＮ阻害剤
【化２４】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ３Ｒ４、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、ＣＯＲ２、ＳＯ３Ｒ２、ＳＯ２Ｎ−Ｒ３Ｒ４、ＮＨＳＯ２−Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ２、ＮＲ３Ｒ４またはＣＯＮ−Ｒ３Ｒ４を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＯＲ２を独立して表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ２を表す］。
【００５６】
ＸＩＩＩ）バナダート系ＰＴＥＮ阻害剤
１．カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナダート（Ｖ）
２．ジカリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２カルボキシル）オキソバナダート（Ｖ）
３．ジカリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）
４．モノペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）
５．カリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）
６．ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドロキサミド）ヒドロオキソオキソバナダート
【００５７】
ＸＩＶ）Ｔ１ループ結合エレメント含有ＰＴＥＮ阻害剤
このＰＴＥＮ阻害剤は、顕著にアニオン性の形態（例えば、分子種の少なくとも５％がｐＨ７．４においてアニオンに荷電している）で生理学的ｐＨにおいて存在する基を含有することができる。そのようなアニオン性基は、ＰＴＥＮにそのペプチド構造のＴ１ループにおいて溶解状態で結合することができる。
【００５８】
そのような基の代表例は、以下のものを含む：
【化２５】
［式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ−（アルキル）２から独立して選択され、ここで、アルキルは低級のＣ１−Ｃ４アルキル部分である。点線は、上記の式ＩからＸＩＩＩに記載の化合物の式への連結を表す。それらの基は、標準的分子ドッキング手順によりＴ１ループ空間を満たすそれらの能力についてインシリコでさらに評価することができる。そのようなＴ１ループ結合基は、式Ｉ−ＸＩＩＩの化合物中に取り込むことができる。それらの基の取り込みは、ＰＴＥＮの阻害に対する分子の選択性を付与することができる。ＸＩＶａ−ＸＩＶｄ基の調製は、文献において十分に確立されている。式ＸＩＶｅの化合物は、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ６，Ｎｏ．９，ｐｐ１０４３−１０４６，１９９６に開示の方法により調製することができる。式Ｉ−ＸＩＩＩ中へのそれらの基の取り込みは、当業者により容易に実施可能な標準的合成方法による。適切な出発材料を簡単に利用することによる、そのような取り込みの例は、上記基を取り込むもの、例えば：
【化２６】
への７〜９の変換により説明される。
【００５９】
活性化物質は、好適な薬物送達法および軸索再生の促進に十分な治療プロトコルを使用してニューロンと接触させる。インビトロ法について、活性化物質は、通常、ナノモルまたはマイクロモル濃度において培養培地に添加する。インサイチュー適用について、活性化物質は、経口的に、静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスにより、静脈内注入により、皮下に、筋肉内に、経眼的に（眼内、眼周囲、球後、硝子体内、結膜下、局所に、テノン嚢下投与によるものなど）、頭蓋内、腹腔内、脳室内、鞘内、硬膜外などに投与することができる。
【００６０】
意図される送達経路に応じて、組成物を１種以上の剤形（例えば、液体、軟膏剤、液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、カプセル剤、カプレット、トローチ剤、散剤、顆粒剤、カシェ剤、洗浄剤、座剤、クリーム剤、ミスト、点眼剤、ゲル剤、吸入剤、貼付剤、植込剤、注射剤、注入剤など）で投与することができる。それらの剤形は、結合剤、溶剤、増量剤、可塑剤などを含む種々の他の成分を含むことができる。
【００６１】
具体的な実施形態において、活性化物質は、該活性化物質を収容し、ニューロンのＣＮＳ軸索への送達に具体的に適合された植込デバイスを使用してニューロンと接触させる。デバイスの例は、固体または半固体デバイス、例えば放出制御性の生分解性マトリックス、繊維、ポンプ、ステント、吸着性ゼラチン（例えば、Ｇｅｌｆｏａｍ）などを含む。デバイスには、軸索の再生を促進するのに十分な活性化物質の事前に計測された別々の収容量を装填することができる。特定の実施形態において、デバイスは、好ましくは少なくとも２、５または１０日間の、ナノモルまたはマイクロモル濃度における活性化物質とのニューロンの連続的な接触を提供する。
【００６２】
本発明の方法は、典型的には、軸索の得られた再生を検出するさらなる工程を含む。インビトロ適用について、軸索再生は、軸索再生をアッセイするための定型的に使用される任意の方法、例えば神経突起伸長アッセイにより検出することができる。インサイチュー適用について、軸索再生は、画像化法、例えばＭＲＩを使用して直接的に、または間接的もしくは推論的に、例えば標的神経機能の改善を示す神経学的検査により検出することができる。検出工程は、治療の開始後の任意の時点において、例えば、治療の開始から少なくとも１日後、１週間後、１ヵ月後、３ヵ月後、６ヵ月後などに行うことができる。ある実施形態において、検出工程は、最初の神経学的検査および最初の検査から少なくとも１日後、１週間後または１ヵ月後に実施される後続の神経学的検査を含む。最初の検査と比較して、後続の検査において神経機能が改善されていれば、得られた軸索再生を示す。使用される特異的検出および／または検査方法は、通常、評価されている軸索病変の特定のタイプ（すなわち、外傷、神経変性など）に対する医療の普及している標準のものに基づく。
【００６３】
本発明はまた、活性化物質を溶出し、もしくは活性化物質が含浸されているＣＮＳ植込固体または半固体デバイスを提供する。ＣＮＳ植込デバイスの例は、ポリマーマイクロスフェア（例えば、Ｂｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００５）１１：７６８−７６を参照のこと）またはオブラート（例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．（２００３）４：７７３−８９を参照のこと）、脊髄損傷後の組織再生において使用される生合成植込剤（Ｎｏｖｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．（２００３）６：７１１−５により総説）、生分解性マトリックス（例えば、Ｄｕｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１２５：５９１−６０４を参照のこと）、生分解性繊維（例えば、米国特許第６，５９６，２９６号を参照のこと）、浸透圧ポンプ、ステント、吸着性ゼラチン（例えば、Ｄｏｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．（２００４）１８９：３６１−８を参照のこと）などを含む。好ましいデバイスは、ＣＮＳ植込のため、特別に作製され、適合され、設計され、または指定される。植込デバイスは、神経再生を促進または容易にするために使用される１種以上の追加の薬剤を収容することができる。例えば、一実施形態において、急性脊髄損傷の治療のために使用される植込デバイスは、活性化物質およびメチルプレドニゾロンまたは他の抗炎症剤を収容する。別の実施形態において、植込デバイスは、活性化物質、ならびに神経細胞の生存、成長および／もしくは分化を促進する神経成長因子、栄養因子またはホルモン、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、イノシン、オンコモジュリン、ＮＴ−３などを収容する。
【００６４】
実施例１
タンパク質翻訳の促進による成熟ＣＮＳにおける軸索再生の促進
【００６５】
個々の細胞成長制御遺伝子の生殖細胞系列ノックアウトは、マウスにおいて胚性致死をもたらし、または生存能が低下するので、それらの動物の成体軸索再生試験の有用性を制限する。この問題を避けるため、本発明者らは、成体ＲＧＣにおける特異的遺伝子を条件付きで欠失させるためにＣｒｅリコンビナーゼを発現させるウイルスによる方針を利用した。ＲＧＣにおけるＣｒｅの有効な発現を実証するため、本発明者らは、Ｃｒｅを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−Ｃｒｅ）を、ＰＬＡＰ（（ヒト胎盤アルカリホスファターゼ）活性がＣｒｅの発現に依存するレポーターマウス（Ｒｏｓａ−ＳＴＯＰ−ＰＬＡＰ）において眼の硝子体内に注射した。本発明者らは、ＰＬＡＰ発現がＲＧＣの９０％超において誘導されることを見出し、このことは、ＡＡＶ−Ｃｒｅが成体マウスにおけるＲＧＣ感染に高度に有効であることを示した。視神経離断の完全性は、病変後に逆行性および順行性トレーサーの両方が網膜または上丘（ＳＣ）にそれぞれ到達することができないという観察により確認した。水晶体損傷およびそれに続くマクロファージの活性化がインビボで軸索再生を促進すると報告されているので（９）、注射に使用されるマイクロピペットを水晶体に接触しないように傾けた。本発明者らは、この方法が、抗ＣＤ６８抗体染色により示される通り、硝子体内ＡＡＶ注射後に有意なマクロファージ／ミクログリアの活性化をもたらさないことを確認した。
【００６６】
成体ＲＧＣにおける軸索再生に対する成長制御分子の条件付き欠失の効果を試験するため、本発明者らは、ＡＡＶ−Ｃｒｅを、Ｒｂｆ／ｆ（１２）、Ｐ５３ｆ／ｆ（１２）、Ｓｍａｄ４ｆ／ｆ（１３）、Ｄｉｃｅｒｆ／ｆ（１４）、ＬＫＢ１ｆ／ｆ（１５）およびＰＴＥＮｆ／ｆ（１６）を含む種々の成体ｆｌｏｘｅｄマウスの硝子体内に注射した。ＲＧＣにおける個々の遺伝子の欠失は、インサイチューハイブリダイゼーション実験により確認した。したがって、標準的な視神経挫滅アッセイ（９、１７）をＡＡＶ注射から２週間後に実施した。軸索再生は、病変部位にわたる視神経切片において順行性トレーサーであるコレラトキシンＢ（ＣＴＢ）により標識された軸索線維を検査することによりアッセイした。野生型マウスにおける軸索切断されたＲＧＣの約８０％が損傷後２週間以内に細胞死を受けるので（１８）；神経生存も、抗ＴＵＪ１抗体（ＲＧＣのマーカー）による網膜の全組織標本染色により検査した。
【００６７】
本発明者らは、成長促進経路の負の調節物質の阻害がニューロン生存および／または軸索再生を促進することを見出した。ＰＴＥＮ阻害は、神経生存および軸索再生の両方に対して最も劇的な効果を有した。ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射された全てのＰＴＥＮｆ／ｆ条件突然変異体においてＲＧＣはＲＧＣ生存の有意な増加を示したが、対照ＡＡＶ−ＧＦＰが注射されたＰＴＥＮｆ／ｆ条件突然変異体においては示さなかった。さらに、損傷から１４日後に顕著な長距離軸索再生が観察された。本発明者らは、ＰＴＥＮｆ／ｆマウスの第２の組におけるＡＡＶ−Ｃｒｅ実験、および対照としてのＡＡＶ−ＧＦＰ注射を繰り返し、同様の結果が観察された。それらのデータは、ＰＴＥＮの阻害が損傷した成体ＣＮＳの再生の向上に十分であることを示す。定量的には、対照動物の約２０％と比較して、ＰＴＥＮ欠失ＲＧＣの推定４５％が損傷２週間後に生存した。損傷から２週間後に生存するＲＧＣのうち、約８〜１０％がそれらの病変軸索を病変中心に対して最大０．５ｍｍ遠位まで再生する。本発明者らの知る限り、この再生は、損傷した成体哺乳動物の視神経におけるそのような長距離再生の最初の記載である。重要なことに、それらの再生線維は、経時的に視神経に沿って突起し続けた。損傷から４週間後、いくつかの再生線維は視交叉の区域に拡張した。試験された他のマウス系統の中で、ｐ５３欠失ＲＧＣは、それらのマウスにおいてニューロンの生存能力の有意な増加を示した（損傷したＲＧＣの約５４％が生存した）が、それらのマウスにおける軸索再生の証拠は存在しなかった。Ｐ５３およびＰＴＥＮ欠失の両方が細胞生存を向上させた一方、ＰＴＥＮ欠失のみが軸索再生を促進したので、それらのデータは、ニューロン生存の誘導は軸索再成長（１９）を誘発するのに十分でない場合があることを示す。本発明者らの結果は、ＰＴＥＮ阻害が内因性再生機序に対して作用して損傷後の成体ＣＮＳの成長を促進することを示す。
【００６８】
本発明者らは、ＰＴＥＮが阻害されたＣＮＳ軸索が損傷後に軸索伸長を迅速に再開し得ると仮定した。したがって、本発明者らは、視神経挫滅直後に硝子体内ＣＴＢ注射を実施して軸索を損傷後早期の時点において追跡した。病変部位において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）発現の上方調節により示される通り、挫滅から１から３日後に明白なグリア応答が起きた。これまでの研究（２０）と一致して、ＧＦＡＰ陽性星状膠細胞は病変部位から主として除外され、ＣＳＰＧシグナルは損傷から７日後に低レベルに戻った。病変から１日後、損傷した視神経線維は、対照およびＡＡＶ−Ｃｒｅが注射されたＰＴＥＮｆ／ｆマウスの両方において挫滅部位の近接末端において終結する。しかしながら、損傷から３日後、ＰＴＥＮ欠損ＲＧＣからの軸索発芽が始まってＣＳＰＧ富化病変部位中にマクロファージと一緒に移行し、損傷から７日後にいくつかの線維を病変部位上に見ることができた。対照的に、それらの段階において対照動物において最小の軸索発芽が見られた。電子顕微鏡分析により、野生型状況において変性ＲＧＣ軸索、髄索の壊死およびマクロファージにより占有された損傷部位が可視的であり、再生線維はほとんど可視的でないことを確認した。しかしながら、ＰＴＥＮをＲＧＣにおいて阻害した場合、束として出現することが多い再生性軸索発芽が、損傷から数日後に病変内および病変に対して遠位の両方で見出された。それらの結果は、ＰＴＥＮ阻害により、実際に軸索が病変部位における阻害を克服し、損傷後すみやかに再生することができることを示した。
【００６９】
ＰＴＥＮ欠失は、キャップ依存性タンパク質翻訳開始の調節による細胞成長およびサイズの制御において重要であるＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の活性化をもたらすことが公知である（２１〜２４）。軸索再生は実質的な新たなタンパク質合成を要求するので、本発明者らは、ｍＴＯＲ活性化がＰＴＥＮ欠失ニューロンにおける軸索再成長の原因になり得ると仮定した。ＰＴＥＮおよびＰＩ３キナーゼの種々の形態は、野生型成体ＲＧＣにおいて発現される。タンパク質翻訳に対するその効果を媒介するｍＴＯＲキナーゼの十分に研究されている標的の２種は、リボソームＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）および真核開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）結合タンパク質４Ｅ−ＢＰ１である。ホスホ−Ｓ６Ｋ１は、リボソームタンパク質Ｓ６を順次リン酸化する。これまでの研究は、Ｓ６および４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化をｍＴＯＲ活性化の指標として使用してきた（２５、２６）。リン酸化されたＳ６（ｐ−Ｓ６）の染色により、ｐ−Ｓ６陽性ＲＧＣの割合の劇的な発生依存性減衰が明らかになった。強力なｐ−Ｓ６シグナルは、ほとんどの胚性ニューロン内で見ることができるが、成体ＲＧＣの少数にのみ残留し、このことは、ｍＴＯＲシグナリングが成体ＲＧＣの大部分において下方調節されることを示す。それらの変化は、それらのニューロンの成熟時の全体的な軸索成長能の減少と相関する。
【００７０】
次に本発明者らは、なぜｐ−Ｓ６シグナルを有する成体ＲＧＣのサブセットがそれらの損傷した軸索を依然として再生することができないのか決定することを求めた。ストレス、例えば酸素圧低下の経験時に細胞がｍＴＯＲシグナリングを抑制することにより応答すること（２７〜３０）、すなわち、生存のためにエネルギー恒常性を維持すると提案されている進化的に保存されているストレス応答がこれまでに報告されている。したがって、本発明者らは、軸索切断に起因するストレスが損傷したニューロン内での全体的な翻訳を低減し得ると仮定した。このことを試験するため、本発明者らは、対照および損傷ラットからの精製ＲＧＣにおける新たなタンパク質合成の割合を推定した。対照および損傷ＲＧＣを３５Ｓ−メチオニン／システインとともにインキュベートし、それらの細胞からの抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。全タンパク質内容物に対して正規化された、３５Ｓ−メチオニン／システインが取り込まれたタンパク質を定量し、結果は軸索切断された成体ＲＧＣにおける新たなタンパク質合成の有意な減少を示した。
【００７１】
次に本発明者らは、抗ｐ−Ｓ６抗体による網膜切片の免疫組織化学分析により、神経病変がｍＴＯＲ経路の活性を下方調節するかどうかを試験した。本発明者らの結果は、対照マウスにおいて損傷後全ての検査時点（１、３、７日）において軸索切断が成体ＲＧＣ内に残留するｐ−Ｓ６シグナルをほぼ完全に消滅させることを示し、このことは、軸索切断がｍＴＯＲにより媒介されるシグナルの迅速で持続的な下方調節を誘発すること、およびこの下方調節を阻害することで野生型成体ＣＮＳニューロンにおける再生が促進されることを示す。
【００７２】
これまでの研究により、ストレスを受けた誘導分子Ｒｅｄｄ１／２（発生およびＤＮＡ損傷応答調節遺伝子１／２）の上方調節がストレス下で細胞においてｍＴＯＲの阻害を媒介し得ることが示唆された（２７〜３０）。したがって、本発明者らは、ＦＡＣＳにより精製されたラットＲＧＣに由来するｍＲＮＡを使用する定量リアルタイムＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）により、損傷したニューロンにおけるＲｅｄｄ１／２発現を分析した。軸索切断されたＲＧＣにおいてＲｅｄｄ１／２ｍＲＮＡの有意な変化は見られなかった。陽性対照として、本発明者らは、軸索切断後に上方調節されることが公知の遺伝子Ｇａｄｄ４５ａ（３１）の発現が、損傷試料の同一の組において有意に増加することを見出した。
【００７３】
次に本発明者らは、ＰＴＥＮ阻害が損傷前および損傷後の両方において成体ＲＧＣにおけるｐ−Ｓ６レベルに影響を及ぼすかどうかを試験した。ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射された未損傷ＰＴＥＮｆ／ｆマウスにおいて、抗ホスホ−Ｓ６により染色されたＲＧＣの割合は、野生型またはＡＡＶ−ＧＦＰが注射されたＰＴＥＮｆ／ｆマウスのものと有意に異なることはなかった。しかしながら、ｐ−Ｓ６シグナルの強度が向上して出現し、それらのｐ−Ｓ６陽性ＲＧＣは細胞サイズの増加を示し、このことはニューロンの他のタイプにおけるＰＴＥＮ欠失のこれまでの研究と一致した（３２、３３）。重要なことに、視神経挫滅後、ｐ−Ｓ６陽性ＲＧＣの同様の割合が、ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射されたＰＴＥＮｆ／ｆマウスにおいて損傷から１、３または７日後に残留した。したがって、軸索切断に対するストレス応答にかかわらず、ＰＴＥＮを欠失したそれらの軸索切断されたニューロンは、ｍＴＯＲ活性を未損傷の野生型ニューロンと同様のレベルにおいて依然として有する。再生線維の割合（８〜１０％）は、ｐ−Ｓ６陽性軸索切断されたＲＧＣの割合（８〜１０％）と同様であった。
【００７４】
ｍＴＯＲ経路の活性化が軸索再生を促進するのに十分であるかどうかをさらに検査するため、本発明者らは、ＴＳＣ１ｆ／ｆ条件付きノックアウトマウス（３４）を使用する同様の視神経損傷／再生アッセイを実施した。ＴＳＣ１および２は、ｍＴＯＲシグナリングを負に調節するタンパク質複合体を形成する（３５〜３９）。これまでの報告により、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２のいずれかの損失がｍＴＯＲ経路の構成的な活性化に導くことが示された（３８）。予測される通り、ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射されたＴＳＣ１ｆ／ｆマウスにおいて、強力なｐ−Ｓ６シグナルが軸索切断されたＲＧＣにおいて観察され、損傷後にＲＧＣ生存の有意な向上が存在した。さらに重要なことに、ＴＳＣ１欠失マウスにおいてかなりの軸索再生が観察されたが、ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射された野生型マウスにおいては観察されなかった。ＴＳＣ１欠失マウスにおける軸索再生の程度は、ＰＴＥＮ欠失により誘導されたものよりわずかに弱く、このことは、ＰＴＥＮの他の下流標的、例えばＡｋｔおよびＧＳＫ−３の活性（４０、４１）の変化も再生性成長に関与し得ることを示した。それにもかかわらず、それらの結果は、ｍＴＯＲ経路の活性化がＣＮＳニューロンの生存および軸索再生の両方を促進するのに十分であることを示す。
【００７５】
本発明者らの結果は、軸索切断されたＣＮＳニューロンにおいて、ｍＴＯＲシグナリングの２工程下方調節；発生成熟による第１の調節、および軸索切断により誘発されるストレス応答による第２の調節により、ｍＴＯＲ活性が抑制されることを明らかにする。本発明者らの結果は、ｍＴＯＲシグナリングの正の調節物質の増加またはｍＴＯＲシグナリングの負の調節物質の阻害（例えば、ＴＳＣ１／２またはＰＴＥＮの化学阻害剤による（４２））をＣＮＳ損傷後に一過的に使用してタンパク質合成の下方調節を妨げ、軸索再生および機能回復を促進することができる、損傷後の長距離ＣＮＳ軸索再生を促進する新たな手法を提供する。
【００７６】
実施例２ａ
薬理学的ＰＴＥＮ阻害は成体マウスにおいて病変視神経線維の再生を促進する
【００７７】
本発明者らは、ニューロンＰＴＥＮ活性の薬理学的阻害剤が軸索再生を同様に促進することを実証するために同様の視神経試験を設計し、既に記載されている視神経挫滅のモデルを適合した［Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，１６４６（２００４）］。成体マウス視神経を眼球後部において露出し、挫滅した。成体マウスの損傷直後、代替的ＰＴＥＮ阻害剤の溶液中に段階濃度（表１）または０．１％ＤＭＳＯ（対照）中で浸漬させたＧｅｌｆｏａｍを神経の挫滅部位に対して配置し、試験の最初の６日間につき３日ごとに置き換えた。
【００７８】
【表１】
【００７９】
動物を損傷から２週間後に屠殺し、次いで４％のパラホルムアルデヒドを経心的に潅流させる。視神経を１０μｍで凍結切片化し、抗ＧＡＰ４３抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）により染色して再生軸索を検出する［Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，前掲］。ＤＭＳＯにより処置された対照マウスにおいて、再生はほとんど検出されない。しかしながら、ＰＴＥＮ阻害剤の損傷部位適用は、対照マウスと比較して損傷部位を０．２５ｍｍ超えて計測される軸索再成長および再生軸索数の有意な増加をもたらす。
【００８０】
実施例２ｂ
薬理学的ＰＴＥＮ阻害は、成体マウスにおいて病変視神経線維の再生を促進する。
【００８１】
後続の同様の実験において、本発明者らは、表２のＰＴＥＮ阻害剤を網膜内に注射し、視神経損傷を実施し、ニューロン生存および軸索再生の増加を見出した。
【００８２】
【表２】
【００８３】
実施例３
一般的スクリーニングおよびＩＣ５０決定のための例示的ＰＴＥＮ阻害アッセイ
【００８４】
ＰＴＥＮ阻害剤を、２ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．１ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）ならびに最大３μｇのＰＴＥＮの全タンパク質を収容するウェル当たり２５μｌの全容量で半容量９６ウェルプレートにおいて実施される阻害アッセイにおいて評価する。試験阻害剤候補（ＤＭＳＯ中２５ｍＭの濃縮原液）の少容量をＰＴＥＮ溶液と室温において約１０分間混合し、次いで基質を添加する。次いで、反応混合物を３７℃において２０分間インキュベートする。これに続き、マラカイトグリーン緩衝液（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）の１００μｌのアリコートを添加して暗所で室温において発色させる（この溶液は、脱リン酸化反応も停止させる）。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ分光光度プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して６５０ナノメートルにおける光学密度を計測する。
【００８５】
阻害剤候補の最初のスクリーニング濃度は２５０μＭであり、次いで、阻害剤無しの対照群と比較して５０％超の阻害を有する候補をさらに評価してＩＣ５０値を決定する。ＰＴＥＮは、市販品を購入することができ、または文献方法により調製することができる［すなわち、遺伝子再構成されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＰＴＥＮ融合タンパク質を発現する細菌の細胞抽出物から、この細胞抽出物中のＧＳＴ−ＰＴＥＮをＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に結合させ、このゲルから精製する］。好適なＰＴＥＮ反応基質は、（ａ）公開されている方法（Ｍａｅｈａｍａ ｅｔ ａｌ．２０００，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７９，２４８−２５０）を使用して作出することができ、典型的には最終反応混合物中約５０μＭ（成分濃度に対する）において利用されるＰＩＰ３リン脂質ベシクル（ＰＬＶ）、（ｂ）１００μＭの作業濃度において利用される水溶性ＰＩＰ３ Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴおよび（ｃ）リン酸化チロシン基質の作業濃度が２００μＭである、（ＥＥＥＥＹｐ）ｎ（ｎは２または３である）と設計されたリン酸化ポリグルタミン酸−チロシンペプチド（Ｂｉｏｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む。
【００８６】
潜在的ＰＴＥＮ阻害剤の用量応答を決定するため、１ｎＭから２５０μＭ（最終反応混合物濃度）の範囲の試験化合物の用量を、一般的なＰＴＥＮ阻害アッセイ（前掲）において評価する。実施されたＩＣ５０データを得るため、用量応答アッセイの２つの別個のラウンドを実施する。第１のラウンドにおいて、１ｎＭから２５０μＭの範囲の１０倍段階希釈における阻害剤の存在下でＰＴＥＮ活性を試験する。ＰＴＥＮ活性が劇的に変化する濃度範囲を決定したら、この範囲内の２つの追加の濃度データ点を加え、次いでＰＴＥＮ阻害アッセイを第２のラウンドについて再度実行する。ＰＴＥＮ阻害ＩＣ５０は、ＰＴＥＮ活性（リン酸産生により計測し、未阻害対照試料と比較する）の５０％が見出された阻害剤濃度として表す。データからのＩＣ５０の決定は、Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して行う。
【００８７】
実施例４
ＰＴＥＮ阻害は、ラットにおいて脊髄損傷後の軸索再生を促進する
本動物試験は、脊髄損傷用動物モデルにおいて、ＰＴＥＮ阻害剤ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）およびｂｐＶ（ｐｉｃ）の鞘内投与または静脈内投与により軸索再生を促進することができることを実証する。本動物試験のための方法は、Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００２）２２：７１１１−７１２０）、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ（２００５）１：２９）およびＯｂａｔａ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００４）２４：１０２１１−２２）から適合した。
【００８８】
成体Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（３００〜４００グラム）を訓練し、把握能を計測する指向前足到達（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｆｏｒｅｐａｗ ｒｅａｃｈｉｎｇ）（ＤＦＲ）装置において試験する。Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ．，前掲により詳細が記載されているこの装置は、２つのコンパートメント：Ｐｌｅｘｉｇｌａｓの仕切りにより分離されている、ラット収容用の主コンパートメントおよび食餌用の副コンパートメントからなる箱である。副コンパートメントは、食餌のペレットをそれぞれ保持する等しいサイズのスロットにさらに分割されている。スロットとＰｌｅｘｉｇｌａｓの間には空隙が存在する。この装置は、スロットから食餌ペレットを回収するため、ラットが前肢をＰｌｅｘｉｇｌａｓの仕切りの孔に通して伸ばし、ペレットを把握し、そのペレットを空隙上に持ち上げ、スロットの外に出さなければならないように構成されている。ラットがスロット内でＰｌｅｘｉｇｌａｓの孔に向かって食餌を集めるにすぎない場合、食餌がスロットから空隙に降下し、副コンパートメントの床に落下する。副コンパートメントの床は、ラットが降下する食餌を回収することができるように構成することができ、または床を低くしてラットが降下した食餌に届かないようにすることができる。脊髄損傷の誘導前、ラットを食餌制限し、訓練および試験の前およびその間にわたり１日当たり約３グラムの食餌／１００グラム体重を与える。体重を追跡し、任意の時点においてラットがその元の体重の８０％にも減量していることを確保する。全てのラットを、ラットが課題を学習することができる一方、ラットが試験状況に慣れるよう箱内で２〜３日間行動形成させる。動物を５日間１日当たり２回訓練し、次いで５日間１日当たり２回試験し、術前ＤＦＲデータを収集する。試験時間の間、ラットに５分間与えて課題を完了させ、ラットがこの時間の間に望むほど試行させる。ラットはその元の体重の少なくとも９５％に戻して、ラットが手術を受ける前に健常であることを確保することが要求される。
【００８９】
ラットを対照群または実験群に無作為に割り付ける。偽対照ラットは、病変化を伴わず、ミニ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ型２００１；Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）の配置を伴い、または伴わずに手術手順を受ける。病変対照ラットは、処置を受けず、ビヒクルによる尾静脈注射のみの処置、ミニ浸透圧ポンプ挿入のみの処置、またはビヒクルによるミニ浸透圧ポンプ挿入のみの処置を受ける。イソフルランによる麻酔後、最大露出のため頸髄を曲げるようにラットを手術板上に置く。Ｃ２およびＣ４の間の脊髄の背部を露出して椎弓切除を実施する。後柱を両側で識別し、偽群のラットを除く全てのラットにおいて、縫合針を脊髄に導通させ、後索を単離する。縫合糸を穏やかに持ち上げ、一対の光彩切除用のはさみを使用して後索を両側離断し、これにより後皮質脊髄路（ＣＳＴ）を離断する。後角および中央の灰白交連の可視化により、病変境界の精度を確認する。蛍光逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ（０．９％の生理食塩水中３％；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）中に浸漬された生分解性Ｇｅｌｆｏａｍの綿撒糸を病変部位内に置き、軸索が離断されたニューロンを識別し、病変を確認する。ＰＴＥＮ阻害剤処置または対応する対照処置に指定されたラットに、病変部位に隣接してミニ浸透圧ポンプを植込む。処置群におけるポンプは、１μｌ／時間の速度において７日間作動し、ＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））を５００ｎｇ／μｌの濃度において充填する。重層する筋および皮膚を縫合し、ラットを加熱パッド上に置いて体温を維持する。各ラットにブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）の単回用量を術直後に与えて疼痛を緩和する。
【００９０】
脊髄を病変化して１時間後、尾静脈注射処置群のラットに生理食塩水／ＤＭＳＯビヒクル中１００μｇ／ｋｇのＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））をボーラス注射する。この処置を、病変から１から７日後２４時間ごとに繰り返す。ビヒクルのみの対照ラットは同一の処置を受けるが、生理食塩水／ＤＭＳＯの等容量を尾静脈内に注射する。
【００９１】
ラットを術後２〜５週間の間、１週間当たり２回訓練する。一部のラットを、ラットが早期術後期間のＤＦＲ課題において食餌を把握することができないように深く障害させることができる。この場合、ラットがスロットから副コンパートメントの床上に降下する食餌を主コンパートメント中に集めることができるように装置を構成することができる（Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ．，前掲を参照のこと）。このことは、ＤＦＲ課題の到達の部分を失わないことを確保する。把握障害の重症度は術後期間が増加するにつれて減少し、食餌集めを許容しない装置の構成を徐々に再確立することができる。術後回復期間の終盤までに、全てのラットはＤＦＲ課題を首尾良くある程度実施することができる。術後６週間の間、ラットを５日間１日当たり２回試験し、盲検化された測定者により術後ＤＦＲデータを収集する。術前試験期間同様、ラットに術後試験期間の間に５分間課題を完了させ、ラットがこの時間の間に望むほど試行させる。データを試行の総数および成功した試行の割合について収集する。試行は、ラットがスロット中に到達し、ペレットを移し、またはペレットを副コンパートメントの床上に降下させた場合のみ評点化する。成功した試行は、ラットがペレットを把握し、ペレットを空隙上に持ち上げ、ペレットをＰｌｅｘｉｇｌａｓの仕切りに通して試験装置の主要部内に引っ張った場合に評点化する。
【００９２】
偽手術動物は、術前に実施するのと同様に十分にＤＦＲ課題を術後に実施し、このことは、病変のみがラットのＤＦＲ課題実施能を阻害し、手術手順の他の部分が阻害しないことを実証する。病変およびビヒクル群は、術後の群の全てのうち最も障害を受けた群である。病変およびビヒクル群は、ＤＦＲ課題を約４０％の成功率でしか実施することができない。ＳＰ６００１２５処置群による有意により良好な実施は、脊髄損傷後の機能的回復に対する処置の効果を実証する。
【００９３】
損傷から７週間後、ラットをビオチンデキストランテトラメチルローダミン（ＢＤＴ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の注射のため準備する。一次運動皮質内に注射されるこの蛍光順行性トレーサーは、脊髄の病変部位に対して尾側のＣＳＴ軸索を標識するために使用する。イソフルラン（５％）による麻酔後、ラットを定位固定器内に置き、定位的に決定された合計６つの孔（０．９ｍｍ直径）を前肢に関連する一次運動皮質上の頭蓋内に穿孔する。それらの注射のための前後側（ＡＰ）および内外側（ＭＬ）のブレグマからの座標は、以下の通りである：±０．５ＡＰおよび±３．５ＭＬ；±１．５Ａ／Ｐおよび±２．５ＭＬ；ならびに±２．５ＡＰおよび±１．５ＭＬ。全ての注射は、頭蓋の表面から２．５ｍｍの深さにおいて送達する。１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用してＢＤＴを皮質の第Ｖ層中に両側注射する。各皮質半球内への３回の注射を使用して順行性トレーサー合計１．２μｌを投与する。骨ろう（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を使用して頭蓋の孔を密封し、頭皮を縫合し、ブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）の単回用量を術直後に投与して疼痛を緩和する。トレーサーの注射から３日後にラットを死亡させる。
【００９４】
病変化から７週間および３日後、ラットを抱水クロラール（１０ｍｌ／ｋｇ）により麻酔し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００ｍｌ、次いで０．１Ｍリン酸緩衝液中４％のパラホルムアルデヒド３００ｍｌを経心的に潅流させる。動物を死亡させた後、全ての脳および脊髄を切除し、０．１Ｍリン酸緩衝液溶液中３０％のスクロース中で一晩浸漬する。脳を冠状に切断し、脊髄を凍結ミクロトームにより２０μｍの厚さにおいて水平に切断し、ＰｒｏｂｅＯｎ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）被覆スライド上に封入する。脳および脊髄切片は、Ｎｉｋｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）Ｌａｂｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を使用して検査し、画像はデジタルスチルカメラを使用して記録する。一次運動皮質の前肢対応領域は、定位ＢＤＴ注射部位に基づき識別する。一次運動皮質を全てのラットにおいて検査する。一次運動皮質の第Ｖ層中のＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識ニューロンの存在により、病変化手順の間に背部ＣＳＴ軸索が離断されたことを確認する。後索内に局在する全てのＣＳＴ軸索が術中に離断され、前肢対応領域におけるＣＳＴ軸索だけが離断されないので、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識ニューロンが一次運動皮質にわたり第Ｖ層中で見出される。この標識パターンの唯一の例外は、脳がＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識物質を有しない偽群のラットの脳内である。
【００９５】
病変に対して尾側の脊髄を検査し、通常は背部ＣＳＴにより占有される脊髄の領域を占有するＢＤＴ標識軸索を計数する。各切片について、ＢＤＴ標識軸索の数を病変に対して３ｍｍ間隔の尾側において計数し、損傷に対して１ｍｍ遠位から開始し（すなわち、１ｍｍ、４ｍｍ、７ｍｍなど）、病変部位に対して１９ｍｍ尾側で終了する。ラット前足の神経支配はＣ３における病変から１５．１ｍｍの距離のＴ１に拡張する。したがって、病変に対して１９ｍｍ尾側まで遠くの軸索の分析は、前足に対応する距離全体が試験されることを確保する。各間隔において、ＢＤＴ標識軸索の総数（左右のＣＳＴを合わせる）を５００μｍの長さ（顕微鏡視野の長さ）に沿って計数する。計数される各視野において、焦点面を上下に調整し、単一の連続する軸索が焦点面の外に横断し、同一視野中のさらに下方に再出現する場合、この軸索が二重に計数されないことを確保する。存在するＢＤＴ標識軸索の数を、対照群および実験群について距離のそれぞれ（すなわち、病変部位に対して１、４、７・・・および１９ｍｍ尾側）において検査する。検査間隔の全てにわたり、軸索の平均数は偽群において最高であり、各検査距離において、偽群の標識軸索の平均数は他の群より有意に高い。任意の検査距離において病変群およびビヒクル群の平均間で有意な差異は観察されない。それらの群において、軸索は、損傷に対して短い距離の尾側にのみ見出され、病変に対して１０ｍｍ遠位から最も遠い検査距離まで、組織の全てが軸索を可視的に欠く。病変対照ラットと比較してＰＴＥＮ阻害剤処置群における各距離において有意により標識された軸索は、この処置が脊髄損傷後の軸索再生を促進することを実証する。
【００９６】
実施例５
急性脊髄損傷のためのＰＴＥＮ阻害剤処置後の神経学的転帰の改善
本発明者らのプロトコルをＧｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｓｐｉｎｅ（２００１）２６：５８７−５９８）により記載されたＳｙｇｅｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ａｃｕｔｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔｕｄｙの研究に応用した。このプロトコルは、プロスペクティブな、二重盲検、無作為化および層別化された多施設試験であり、約８００人の患者を、各処置群：プラセボ、低用量ＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））および高用量ＰＴＥＮ阻害剤において少なくとも７２０人に完了させ、評価可能となるように無作為化する。患者を、損傷の重症度の３つの程度（米国脊髄損傷学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｉｎｊｕｒｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）グレードＡ、ＢおよびＣ＋Ｄ）および解剖的損傷の２つのレベル（頸部および胸部）に従って、６つの群に層別化する。７２０／４＝１８０人の患者の各群が２６週目の検査に達し、評価可能になる際、試験を事前に計画を立てた中間分析に続いて行う。患者は、実質的な運動障害を有する少なくとも一方の下肢を有することを要求される。脊髄離断または貫入を有する患者を除外し、それというのも患者が顕著な馬尾、腕神経叢もしくは腰仙骨神経叢、または末梢神経の損傷を有するからである。脊髄を貫通しない銃創は許容される。神経学的計測評価または解釈を妨げるほど重症でない限り、多発外傷は許容される。
【００９７】
全ての患者は、脊髄損傷（ＳＣＩ）後８時間以内に開始するメチルプレドニゾロン（ＭＰＳＳ）の第二次米国脊髄損傷急性期研究（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｕｔｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＮＡＳＣＩＳ ＩＩ））投与計画を受けることになっている。ＭＰＳＳおよびＰＴＥＮ阻害剤の間の任意の考えられる有害な相互作用を避けるため、ＭＰＳＳ投与の完了後まで試験投薬は開始しない。
【００９８】
プラセボ群は、プラセボの初回量、次いで５６日間のプラセボ投与を有する。低用量ＰＴＥＮ阻害剤群は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与される５０ｍｇの初回量を有し、次いで５６日間１０ｍｇ／日で静脈内投与する。高用量ＰＴＥＮ阻害剤群は、２５０ｍｇの初回量を投与し、次いで５６日間５０ｍｇ／日で投与する。
【００９９】
基礎期の神経学的評価は、ＡＩＳおよび詳細な米国脊髄損傷学会（ＡＳＩＡ）の運動ならびに感覚検査の両方を含む。修正ベンゼル分類（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｅｎｚｅｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ならびにＡＳＩＡの運動および感覚検査は、損傷から４、８、１６、２６および５２週間後に実施する。修正ベンゼル分類は基礎期後の計測に使用する。それというのも、この分類は、歩行能を評価し、事実上、ＡＩＳの広範なＤカテゴリーを細分するからである。ほとんどの患者は基礎期において不安定な脊椎骨折を有するので、その時に歩行能を評価することはできない（したがって、異なる基礎期および追跡スケールを使用する）。著しい回復は、基礎期のＡＩＳからの修正ベンゼル分類における少なくとも尺度２に等しい改善として定義される。一次有効性評価は、２６週目において著しい回復を有する患者の割合である。二次有効性評価は、著しい回復の時間経過、および脊髄機能の他の確立した計測（ＡＳＩＡの運動および感覚スコア、障害の相対および絶対感覚レベル、ならびに膀胱および腸の機能の評価）を含む。
【０１００】
実施例６
ラットにおける皮質衝撃損傷後のＰＴＥＮ阻害の効果
本発明者らは、Ｃｈｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．（２００３）３０４：６１７−２３）からの方法を応用し、脳衝撃損傷のラットモデルに対するＰＴＥＮ阻害剤の種々の用量および処置スケジュールの効果を試験する。体重３００から４００ｇの合計６０匹の雄Ｅｖａｎｓラットを、腹腔内（ｉ．ｐ）注射または脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注射される以下の用量：無し（生理食塩水対照群）、０．０１、０．１、１．０および１０．０ｍｇ／ｋｇ／日のＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））の１つに割り付ける。ラットを、１、３、７または１４日間の処置継続期間に、各処置群の４匹のラットおよび各対照群の３匹のラット（すなわち、生理食塩水を１、３、７または１４日間投与）を用いてさらに割り付ける。
【０１０１】
衝撃損傷をもたらす方法の詳細は、これまでに記載されている（Ｃｈｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ（１９９６）１３：３７１−３８３）。簡潔に述べると、ラットの頭部を耳棒および切歯棒により定位フレーム内に固定する。直径１０ｍｍの開頭術を頭頂葉皮質上の頭蓋右側について実施する。８ｍｍの直径を有するインパクターの先端を、脳の曝露表面に対して垂直の開頭部位において、その垂直に対して約４５度の角度で中央に位置させる。この先端が硬膜表面にちょうど到達するまで先端を下げる。次いで、インパクターロッドを収縮させ、先端をさらに３ｍｍ進行させ、衝撃の間に３ｍｍの脳変形を生じさせる。インパクターに適用されるガス圧を１５０ｐｓｉに調節し、約５ｍ／ｓの衝撃速度および約１５０から１６０ｍｓの継続期間を与える。
【０１０２】
ラットを一晩絶食させ、通気型麻酔チャンバー内で１００％酸素中３．５％のイソフルランにより麻酔する。１６ゲージのＴｅｆｌｏｎカテーテルを気管挿管した後、手術準備および衝撃損傷のために１００％酸素中２％のイソフルランをラットに機械的に通気する。衝撃部位から十分に離して左前頭葉内に挿入された３Ｆマイクロセンサ変換器（Ｃｏｄｍａｎ＆Ｓｃｈｕｒｔｌｅｆｆ，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，ＭＡ）により頭蓋内圧（ＩＣＰ）を追跡する。ＩＣＰは、損傷の重症度の計測として衝撃損傷の間に追跡する。直腸温を加熱パッドにより３６．５〜３７．５℃に維持し、直腸サーミスタにより制御する。頭部に向けられる加熱ランプの助けにより、脳の温度を３７℃において一定に保持する。
【０１０３】
ＰＴＥＮ阻害剤の脳室内投与を受けることになっているラットは、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ（２００６）１００：１４２−１４８）により記載された手順を使用してミニポンプ植込物を受ける。簡潔に述べると、ラットを定位フレーム（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｊａ，ＣＡ）内に固定する。ガイドカニューレを左側脳室内に植込む（ブレグマ−０．８ｍｍ、横１．５ｍｍ、硬膜下３．７ｍｍの深さ）。次いで、各カニューレをカテーテルにより、肩胛骨領域内の皮下に植込まれ、薬物を連続的に注入してＡＳ６０１２４５（または対照群についてはビヒクルのみ）の規定の１日用量を達成するように構成されているＡＬＺＥＴ（登録商標）ミニ浸透圧ポンプに連結する。
【０１０４】
腹腔内投与処置群のラットについて、ＰＴＥＮ阻害剤の各用量を、各群について送達される容量が同一になり、ＰＴＥＮ阻害剤の投与量のみが変わるように滅菌０．９％生理食塩水１ｍｌ中で溶解させ、第１の用量を、衝撃損傷後１時間以内に投与する。この後、割り付けられた処置継続時間で１日１回投与する。
【０１０５】
全てのカテーテルを除去し、手術創を縫合した後、ラットを麻酔から覚醒させる。損傷後最初の３日間、ラットを痛覚消失のため酒石酸ブトルファノールにより、１２時間ごと（１日２回）筋肉内投与０．０５ｍｇで処置し、術後感染のリスクを低減するためエンロフロキサシン２．２７％、筋肉内投与０．１ｍｌにより毎日処置する。
【０１０６】
転帰計測は、処置群に対して盲検化された測定者により実施する。衝撃から２週間後、動物を、ケタミン／キシラジン／アセプロマジンの組合せにより深く麻酔し、０．９％生理食塩水、次いで１０％リン酸緩衝ホルムアルデヒドを経心的に潅流する。脳全体を切除し、４％ホルマリン中で固定する。固定された脳を、挫傷、血腫およびヘルニア形成の存在について肉眼検査する。脳を写真撮影し、２ｍｍ間隔において切片化し、次いでパラフィン中で包埋する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色された９μｍの厚さの切片を組織学的検査のために調製する。包埋切片の切断表面上の皮質損傷の最大断面領域を含めるよう特に配慮する。Ｈ＆Ｅにより染色された冠状切片を、ＰａｔｈＳｃａｎ Ｅｎａｂｌｅｒ（Ｍｅｙｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を備えたＰｏｌａｒｏｉｄ Ｓｐｒｉｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してデジタル化する。Ｈ＆Ｅにより染色された各冠状画像における損傷の断面区域を決定し、薄片間の組織の厚さを掛けることにより損傷容量を計測する。このスラブ容量技法は、画像処理プログラムＯｐｔｉｍａｓ５．２（Ｏｐｔｉｍａｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）上で実施する。海馬のＣＡ１およびＣＡ３領域の中央１ｍｍセグメントにおけるニューロンを２００倍の倍率において計数する。ニューロンを核および細胞質の形態により識別し、個々の細胞を正常であるか損傷を受けているかについて計数する。細胞質縮小、好塩基球増加もしくは好酸球増加を有するニューロン、または核細部の損失を有するニューロンを、損傷を受けたものとみなす。計測領域は長さ１ｍｍおよび幅１ｍｍ（セグメントの長軸の両側上で０．５ｍｍ）である。ニューロンの総数および正常と考えられるニューロンの数は、１平方ミリメートル当たりのニューロンとして表現する。
【０１０７】
実施例７
ＰＴＥＮ阻害は、局所性脳虚血の動物モデルにおいて神経再生を促進する
【０１０８】
本試験は、これまでに記載された方法（Ｂｒｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０００）９７：１０５２６−３１）を使用し、局所性脳虚血の動物モデルにおける全身投与されるＰＴＥＮ阻害剤の効果を実証する。体重約２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットをペントバルビタール［６０ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）］により麻酔する。深部体温は、麻酔の継続時間、ウォーターブランケット（ｗａｔｅｒ ｂｌａｎｋｅｔ）および直腸サーミスタ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用することにより定温器により３７℃において維持する。頸動脈を可視化し、右頸動脈を２つの縫合および切開により閉塞する。右眼窩に隣接する吻側の穿頭孔によりＭＣＡの可視化が可能になり、ＭＣＡを鼻動脈に対して遠位で焼灼する。次いで、動物を定位フレーム上に位置させる。この固定されたＭＣＡ病変を包囲する可逆的虚血領域をもたらすため、微細鉗子により提供される牽引を使用して対側頸動脈を１時間閉塞する。ＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））の１μｇ／ｍｌ溶液０．５ｍｌまたはビヒクル対照を、可逆的頸動脈閉塞の開始から１時間、１日、５日または１０日において投与する。損傷度を評価するため、動物を１５日後に死亡させ、脳を切除し、ブレインマトリックスデバイス（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用することにより脳全体にわたる厚さ１ｍｍの連続切片を切断する。次いで、各切片を１５４ｍＭのＮａＣｌ中２％の塩化トリフェニルテトラゾリウム（重量／容量）の溶液中で３７℃において３０分間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒド中で分析まで貯蔵する。損傷度の定量は、コンピュータ化画像分析システム（ＭＣＩＤ，Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅ’ｓ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用することにより決定する。これを達成するため、各切片のデジタル画像を得、テトラゾリウム塩が低減しない、すなわち生存不能な組織である領域の輪郭付けにより損傷の区域の境界を示す。壊死が重症で組織が実際に損失し、したがって境界を直接評価することができない場合については、対側の輪郭を使用して損傷した脳の容量を推定する。梗塞の総容量は、厚さ１ｍｍの連続切片の再構成により算出する。
【０１０９】
参考文献
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１５．Ｎ．Ｂａｒｄｅｅｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１９，１６２（Ｓｅｐ １２，２００２）．
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１７．Ｊ．Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｍ．Ｊ．Ｗｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｒ．Ｂ．Ｃａｍｐｅｎｏｔ，Ｌ．ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５，１１１３（Ｆｅｂ ２，２００５）．
１８．Ｍ．Ｂａｈｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２３，４８３（Ｏｃｔ，２０００）．
１９．Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３３，６８９（Ｆｅｂ ２８，２００２）．
２０．Ｉ．Ｓｅｌｌｅｓ−Ｎａｖａｒｒｏ，Ｂ．Ｅｌｌｅｚａｍ，Ｒ．Ｆａｊａｒｄｏ，Ｍ．Ｌａｔｏｕｒ，Ｌ．ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １６７，２８２（Ｆｅｂ，２００１）．
２１．Ｍ．Ｃｕｌｌｙ，Ｈ．Ｙｏｕ，Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｔ．Ｗ．Ｍａｋ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ６，１８４（Ｍａｒ，２００６）．
２２．Ｄ．Ａ．Ｇｕｅｒｔｉｎ，Ｄ．Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １２，９（Ｊｕｌ，２００７）．
２３．Ｎ．Ｈａｙ，Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８，１９２６（Ａｕｇ １５，２００４）．
２４．Ｊ．Ｌｕｏ，Ｂ．Ｄ．Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｌ．Ｃ．Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ４，２５７（Ｏｃｔ，２００３）．
２５．Ｄ．Ｃ．Ｆｉｎｇａｒ，Ｊ．Ｂｌｅｎｉｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，３１５１（Ａｐｒ １９，２００４）．
２６．Ｄ．Ｈ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１０，１６３（Ｊｕｌ ２６，２００２）．
２７．Ｊ．Ｂｒｕｇａｒｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８，２８９３（Ｄｅｃ １，２００４）．
２８．Ｍ．Ｎ．Ｃｏｒｒａｄｅｔｔｉ，Ｋ．Ｉｎｏｋｉ，Ｋ．Ｌ．Ｇｕａｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０，９７６９（Ｍａｒ １８，２００５）．
２９．Ｊ．Ｈ．Ｒｅｉｌｉｎｇ，Ｅ．Ｈａｆｅｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８，２８７９（Ｄｅｃ １，２００４）．
３０．Ａ．Ｓｏｆｅｒ，Ｋ．Ｌｅｉ，Ｃ．Ｍ．Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｌ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓｅｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５，５８３４（Ｊｕｌ，２００５）．
３１．Ｄ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｖ．Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｔｈａｎｏｓ，Ｌ．Ｉ．Ｂｅｎｏｗｉｔｚ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４，８７２６（Ｏｃｔ ６，２００４）．
３２．Ｓ．Ａ．Ｂａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９，３９６（Ｄｅｃ，２００１）．
３３．Ｃ．Ｈ．Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５０，３７７（Ｍａｙ ４，２００６）．
３４．Ｌ．Ｍｅｉｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７，５５４６（Ｍａｙ ２３，２００７）．
３５．Ａ．Ｇａｒａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，１４５７（Ｊｕｎ，２００３）．
３６．Ｋ．Ｉｎｏｋｉ，Ｔ．Ｚｈｕ，Ｋ．Ｌ．Ｇｕａｎ，Ｃｅｌｌ １１５，５７７（Ｎｏｖ ２６，２００３）．
３７．Ｌ．Ｊ．Ｓａｕｃｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５，５６６（Ｊｕｎ，２００３）．
３８．Ａ．Ｒ．Ｔｅｅ，Ｂ．Ｄ．Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｐ．Ｐ．Ｒｏｕｘ，Ｌ．Ｃ．Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｊ．Ｂｌｅｎｉｓ，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １３，１２５９（Ａｕｇ ５，２００３）．
３９．Ｙ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５，５７８（Ｊｕｎ，２００３）．
４０．Ｄ．Ａ．Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ｒ．Ａｌｅｓｓｉ，Ｐ．Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃｈ，Ｂ．Ａ．Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３７８，７８５（Ｄｅｃ ２１−２８，１９９５）．
４１．Ｗ．Ｙ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５２，９８１（Ｄｅｃ ２１，２００６）．
４２．Ｅ．Ｒｏｓｉｖａｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １，７８０（Ｄｅｃ １５，２００６）．
４３．Ｓ．Ｇ．Ｌｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３，１３２８（Ｓｅｐ，２００６）．
４４．Ｋ．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｍ．Ｌｕｏ，Ｓ．Ｈｉｓｈｅｈ，Ａ．Ｒ．Ｈａｒｖｅｙ，Ｑ．Ｃｕｉ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４，１０８０６（Ｄｅｃ １，２００４）．
【０１１０】
上記の実施例および詳細な説明は説明のために提供されるものであり、限定するためのものではない。あたかも個々の各刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように個別に具体的に指示される通り、本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記発明を、理解を明確にする目的のため説明および実施例により、いくらか詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくある種の変更および改変をさらになすことができることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかである。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年６月６日に出願され、同一の発明の名称および発明者を有する米国特許出願第６１／０５９，５６８号の優先権を主張する。
【０００２】
本研究は、ＮＩＨグラント番号Ｐ０３０−ＨＤ１８６５５により支援されたものである。米国政府は、本出願に係る任意の特許において権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
本発明の分野は、タンパク質合成を活性化して病変ＣＮＳ軸索の再生および成熟ＣＮＳにおける残された軸索の代償的な再成長を促進することである。
【０００４】
成体哺乳動物ＣＮＳ損傷後の軸索再生の不全は、主として成体ＣＮＳの２種の特性、すなわち、阻害的な外因性環境および成熟ＣＮＳニューロンの内因性再生能の低下に起因すると考えられている（１〜５）。非許容性環境についての数多くの研究により、軸索の再成長の制限に関与する多数の分子プレイヤーおよびシグナリング経路が同定された。それらの機序が軸索再生にとって明らかに重要な外因性障壁に相当するものの、それらの阻害活性を中和しても、インビボで軸索再生の制限された程度が許容されたにすぎない（６、７）。実際、許容性環境、例えば、病変部位に移植された座骨神経移植片により、損傷した成体軸索のほんの一部しか再生させることができない（５、８）。それらの結果は、阻害活性の中和が十分でなく、したがって他の機序、例えばニューロンが本来有する軸策再生能力を制御する機序が軸索再生において重要な役割を果たし得ることを示す。
【０００５】
胚発生の間の軸索成長とは対照的に、成体ＣＮＳニューロンに備わっている再生能を制御する分子機序については、ほとんど知られていない（１、３〜５、９）。発生の間の軸索成長および損傷後の軸索再生を同一または異なる機序が機能させるのかどうか、ならびに発生の過程にわたる軸索成長能の減少の原因が何なのかも知られていない。成体ＣＮＳにおいて活性遮断に応答する構造的可塑性の解剖学的基礎として一過性および持続性両方の軸索発芽が実証されている（１０）。代償機序としての軸索のこの再組織化の理由も、損傷した軸索を再生することができないという点で不明確である。それらの疑問に対する潜在的ヒントは、細胞成長およびサイズを制御する、進化的に保存された分子経路から得られる。あらゆる細胞型において、発生完了時の細胞の過剰増殖を防止するために特異的機序が必要であると考えられている（１１）。それらの分子の多くが有糸核分裂後の成熟ニューロン内で発現されることが多いので、本発明者らは、それらの経路が成体ＣＮＳニューロンにおける再生能の低下の一因になり得るとの仮説をたてた。
【０００６】
視神経損傷モデルにおいて細胞成長制御に関与する種々の経路を試験することにより、本発明者らは、成体網膜神経節細胞（ＲＧＣ）において、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）経路の負の調節物質であるＰＴＥＮ（ホスファターゼ・テンシン・ホモログ）を阻害することで、軸索再生が顕著に促進されることを示す。さらなる研究により、成体ＣＮＳニューロンにおけるｍＴＯＲシグナリングの２工程抑制：発生成熟による第１の抑制、および軸索切断により誘発されたストレス応答による第２の抑制が明らかになった。ｍＴＯＲ活性のそのような阻害および後続の新たなタンパク質合成能の障害は、それらが損傷した軸索を再生することができないことの一因になる。ｍＴＯＲ経路の別の負の調節物質である結節性硬化症複合体１（ＴＳＣ１）の阻害によるこの経路の再活性化も、広範囲にわたる長距離軸策（long-distance axon）の再生に導く。本発明者らの研究は、一般的な成長制御経路がニューロンにおける軸索再生能を調節することを示し、これにより、ＣＮＳ損傷、例えば脊髄損傷、卒中、外傷性脳損傷および緑内障後の軸索再生を促進する新たな方針を提供する。
【０００７】
本出願の優先日後に、Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００８ Ｊｕｌ １６）２８（２９）：７２９３−３０３）により、成体ラットにおいて脊髄損傷後の神経保護治療としてカリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）を使用する小分子タンパク質チロシンホスファターゼの阻害が報告された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は、病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再成長（再生および発芽）をインサイチューで促進するための方法および構成物を提供する。一般的な本方法は、（ａ）ニューロンを該ニューロンにおけるタンパク質翻訳の外因性活性化物質の治療有効量と接触させ、これにより該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生を促進する工程；および（ｂ）該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生の得られた促進を検出する工程を含む。
【０００９】
特定の実施形態において、タンパク質翻訳の活性化物質は：（ａ）ｍＴＯＲ経路活性化物質；（ｂ）ＰＴＥＮ阻害剤；（ｃ）ＴＳＣ１／２阻害剤；（ｄ）Ａｋｔ活性化物質；（ｅ）Ｒａｓ／ＭＥＫ経路活性化物質；または（ｆ）ＰＲＡＳ４０阻害剤である。
【００１０】
特定の実施形態において、タンパク質翻訳の活性化物質は、ＰＴＥＮ阻害剤、例えば、（ａ）カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ））；（ｂ）ジカリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ））；（ｃ）カリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ））；または（ｄ）ジカリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｉｃ））である。
【００１１】
種々の実施形態において、病変は、外傷性損傷、外傷性脳損傷、卒中、急性脊髄損傷またはＣＮＳ変性に起因する。
【００１２】
具体的な実施形態において、病変軸索は、視神経内に存在し、または感覚ニューロンのＣＮＳ軸索であり、または脊髄内に存在する。
【００１３】
具体的な実施形態において、病変軸索は、患者の脊髄内に存在し、阻害剤を該患者に鞘内投与する。
【００１４】
種々の実施形態において、軸索は、感覚ニューロンのＣＮＳ軸索であり、または小脳顆粒ニューロンのＣＮＳ軸索である。
【００１５】
検出工程は、軸索再生の間接または直接アッセイにより行うことができる。
【００１６】
種々の実施形態において、阻害剤を静脈内投与、鞘内投与、経眼投与またはニューロンにおいて局所投与する。
【００１７】
特定の実施形態において、一般的方法は、ニューロンが病変していること、ならびに軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病因に誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有することを決定する前工程をさらに含む。
【００１８】
特定の実施形態において、タンパク質翻訳の活性化物質はＰＴＥＮ阻害剤であり、病変軸索は視神経内に存在し、該阻害剤を経眼投与する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、主題方法に具体的に適合された構成物、例えば、軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病理学的に誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有すると認められた病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生をインサイチューで促進するためのデバイスであって、該ニューロンにおけるタンパク質翻訳の活性化物質の治療有効量の事前に計測された含有量が装填され、主題方法を実施するために具体的に適合されたリザーバーを含むデバイスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の具体的実施形態の詳細な説明
【００２１】
標的ニューロンは病変しており、軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病因により誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有し、これらは、直接的、間接的に検出し、または推定することができる。特定の例において、病変軸索は、脊髄神経節（ＤＲＧ）感覚ニューロン、小脳顆粒ニューロンまたは眼の神経のＣＮＳ軸索である。成熟（すなわち、終末分化した、非胚性の）ニューロンは、インビトロで、または対象もしくは患者内にインサイチューで存在し得る。具体的な実施形態において、対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、ペット、家畜、神経変性またはＣＮＳ損傷のためのげっ歯類または霊長類動物モデルなど）である。
【００２２】
病変は、外傷性損傷、視神経損傷もしくは障害、脳損傷、卒中、慢性神経変性、例えば、神経毒性により惹起されるもの、または神経疾患もしくは障害（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）など）に起因し得る。
【００２３】
一実施形態において、活性化物質は、眼損傷または障害（例えば、中毒性弱視、視神経萎縮症、高次視覚経路の病変、眼球運動の障害、第ＩＩＩ脳神経麻痺、第ＩＶ脳神経麻痺、第ＶＩ脳神経麻痺、核間性眼筋麻痺、注視麻痺、フリーラジカルからの眼損傷など）、または視神経症（例えば、虚血性視神経症、中毒性視神経症、眼性虚血症候群、視神経炎症、視神経の感染、視神経炎、視神経症、鬱血乳頭、乳頭炎、球後神経炎、網膜振盪症、緑内障、黄斑変性、網膜色素変性、網膜剥離、網膜裂孔または網膜円孔、糖尿病性網膜症、医原性網膜症、視神経ドルーゼンなど）を治療するために使用される。
【００２４】
特定の実施形態において、病変は、急性または外傷性損傷、例えば、挫傷、裂傷、急性脊髄損傷などに起因する。具体的な実施形態において、病変ＣＮＳ軸索は、ＣＮＳ白質内に、特に外傷性損傷を受けた白質内に存在する。ある実施形態において、病変の形成から９６、７２、４８、２４または１２時間以内に接触工程を開始する。種々の実施形態において、病変の形成後５、７、１４、３０または６０日を超えて接触工程を開始し、および／または治療を継続する。
【００２５】
活性化物質は、抗炎症剤または抗瘢痕化剤、成長因子または栄養因子などの使用のような他の治療と組み合わせて、他の治療前に、または他の治療に続いて損傷ニューロンに投与することができる。具体的な実施形態において、病変は急性脊髄損傷に起因し、本方法は、ニューロンを、脊髄の炎症を低減するのに十分なメチルプレドニゾロンと接触させることをさらに含む。種々の他の実施形態において、活性化物質は、栄養因子および／または成長因子、例えば、ＮＴ−３（Ｐｉａｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２００６ Ｏｃｔ；２０１（２）：３５９−６７）、イノシン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２００２）９９：９０３１−６；Ｂｅｎｏｗｉｔｚの米国特許第６，５５１，６１２号；Ｂｅｎｏｗｉｔｚの米国特許第６，４４０，４５５号；およびＢｅｎｏｗｉｔｚの米国特許出願公開第２００５０２７７６１４号）、オンコモジュリン（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００６）９：８４３−５２．；Ｂｅｎｏｗｉｔｚの米国特許出願公開第２００５００５４５５８号；Ｂｅｎｏｗｉｔｚの米国特許出願公開第２００５００５９５９４号；およびＢｅｎｏｗｉｔｚの米国特許第６，８５５，６９０号）などと組み合わせて投与する。
【００２６】
本発明者らは、本発明の方法および構成物に対する適合性を、広範囲にわたるタンパク質合成活性化物質において詳細に記載しているが、本明細書に記載および例示されているアッセイを用いることによって、好適な更なる活性化物質を容易に同定することができる。一般に、活性化物質は、タンパク質合成の１種以上の正の調節物質（例えば、ＲｈｅＢ１、Ａｋｔ、Ｒａｓなど）の有効量を増加させ、またはタンパク質合成の１種以上の負の調節物質（例えば、ＰＴＥＮ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＲＡＳ４０など）の有効量を阻害する。正の調節物質の増加は、単純に正の調節物質またはそのより活性な変種を活性化物質として利用することにより行うことができる。負の調節物質の阻害は、転写のレベルにおいて（例えば、特異的ｓｉＲＮＡを使用）、または特異的な薬理学的阻害剤で負の調節物質を狙うことにより行うことができる。例示的な好適な活性化物質は：ｍＴＯＲ経路活性化物質、例えば活性ＲｈｅＢ１；ＰＴＥＮ阻害剤、例えば確立されているバナジウム系ＰＴＥＮ阻害剤またはｓｉＲＮＡ；ＴＳＣ１／２阻害剤、例えばＴＳＣ２またはＴＳＣ１用のｓｉＲＮＡ；Ａｋｔ活性化物質、例えば活性Ａｋｔおよびメナジオン；Ｒａｓ／ＭＥＫ経路活性化物質、例えば活性Ｒａｓ；ならびにＰＲＡＳ４０阻害剤、例えばｓｉＲＮＡを含む。更なる好適なタンパク質合成の活性化物質は、本明細書に開示のアッセイおよびプロトコルを使用して容易に同定され、確認され、特性決定される。
【００２７】
特定の実施形態において、活性化物質は、ＰＴＥＮ阻害剤、特にバナジウム系ＰＴＥＮ阻害剤、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋから市販されているものであり、（ａ）カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ））；（ｂ）ジカリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ））；（ｃ）カリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ））；および（ｄ）ジカリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｉｃ））を含む。代替的な好適なＰＴＥＮ阻害剤は、ＷＯ２００５／０９７１１９に記載の式Ｉ−ＸＩＶのＰＴＥＮ阻害化合物；ＵＳ２００７０２９２５３２に記載の、およびＲｏｓｉｖａｔｚ ｅｔ ａｌ．２００６（ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１（１２）７８０−７９０）によるバナジウム系ＰＴＥＮ阻害剤；Ｎｉｇｏｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７０：１１４３−１１４９，２００６）により記載の１，４−ナフトキノン誘導体であるシコニン；ならびにＹｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００７ Ａｐｒ；１７７０（４）：６８７−９３により記載のメナジオン（ビタミンＫ３）を含む。（代替的な好適な阻害剤の同定および確認のための）一般的なスクリーニングおよびＩＣ５０決定のためのＰＴＥＮ阻害アッセイは、当分野、例えばＷＯ２００５／０９７１１９において公知であり；下記の実施例２も参照のこと。
【００２８】
好適なＰＴＥＮ阻害剤は、ＷＯ２００７／０２０３０９８にも記載されており、該文献に開示の引用されている全ての属、下位属および種を含み、該文献に記載の通り、下記のものを含む：
【００２９】
Ｉ）アスコルビン酸系ＰＴＥＮ阻害剤：
【化１】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｘ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ３Ｒ４または（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｘ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＮＲ３Ｒ４または（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３を表し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５またはＮＲ５Ｒ６を表し；
ｍは、０から３であり；
ｎは、０から３であり；
Ｘは、ＯまたはＮＲ４を表す］。
式ＩおよびＩａの化合物は、Ｒ１またはＲ２のいずれかにおいてエステル結合を有することができる。
【００３０】
ＩＩ）１，２，３−トリアゾールＰＴＥＮ阻害剤（例えば、ＷＯ０２／３２８９６に記載）：
【化２】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＣＯＸＲ２、ＣＯＲ２、ＳＯ２ＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４またはＮＲ４Ｒ５を表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ４、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４またはＮＲ４Ｒ５を表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ６、ＮＨＣＯＲ６、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＲ６Ｒ７またはＮ＝Ｃ（Ｒ６Ｒ７）を表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、ＯまたはＮＲ５を表す］。
【００３１】
式ＩＩの阻害剤は、以下のものを含む：
【化３】
［式中、
Ｒ８は、（ＣＨ２）ｎＸＲ４または（ＣＨ２）ｎＳＲ４を表し；
Ｒ９は、ＮＨＮＨＳＯ２アリール、ＮＨＮＨＣＯ−アリールまたはＮＨＮ＝Ｃ（Ｒ６Ｒ７）を表し；
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ６、ＣＯＲ６またはＣＯ２Ｒ６を表す］。
【００３２】
ＩＩＩ）ジアミドＰＴＥＮ阻害剤
【化４】
［式中、
Ａは、５または６員環であり；
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３、ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４または（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３；ＮＨＳＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ３、ＮＲ３Ｒ４または（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ３を表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
ｎは、０〜３であり；
ｍは、０〜３であり；
Ｘは、ＯまたはＮＲ４を表す］。
【００３３】
環Ａは、飽和、不飽和または芳香族であってよく、ＮおよびＯを場合により含むことができる。式ＩＩＩの好ましい化合物は、環Ａが複素環系、特にビシナル置換されているピリジン、ピリミジン、フラザン、イミダゾール、ピラゾール、フラン、チアゾールおよびオキサゾール、ならびにそれらの飽和類縁体から選択される化合物であり；式ＩＩＩの他の好ましい阻害剤は、環Ａが全ての炭素芳香族環、例えば、置換および非置換のフェニル、ならびにそれらの飽和類似体を含む阻害剤である。
【００３４】
式ＩＩＩの阻害剤は、以下のものから選択される環Ａを含むことができる：
【化５】
【００３５】
ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ、ＩＩＩＥから選択される環Ａを含む式ＩＩＩの阻害剤は、以下のものをさらに含むことができる：
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３または（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＦ３、アリール、カルボキシラート、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、シアノ、イソシアナート、アルコキシカルボニルまたはハロアルキルを表し；
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＣＦ３、アリール、カルボキシラート、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、シアノ、イソシアナート、アルコキシカルボニルまたはハロアルキルを表し；
ｍは、１、２、３である。
【００３６】
特定の実施形態において、アルキルアリールは、式ＩＩＩＦまたはＩＩＩＧから選択される：
【化６】
【００３７】
式ＩＩＩの阻害剤は、以下の式のものであってもよい：
【化７】
［式中、
Ａは、５または６員環であり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＸＲ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３またはＣＨ２（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＸＲ３、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３またはＣＨ２（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ３、Ｘおよびｎは、式ＩＩＩについて記載されている通りである］。
【００３８】
阻害剤ＩＩＩＨおよびＩＩＩＪの環Ａは、飽和、不飽和または芳香族であってよく、ＣおよびＮにより場合により置換されていてよい。
【化８】
【００３９】
ＩＶ）アリールイミダゾールカルボニルＰＴＥＮ阻害剤：
【化９】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、（ＣＨ２）ｍＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｍＸＲ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３または（ＣＨ２）ｍＸＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ５、ＮＨＣＯ２Ｒ５、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５Ｒ６）またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
ｍは、１〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ４を表す］。
【００４０】
式ＩＶの化合物は、以下の式のものであってよい：
【化１０】
［式中、Ｒ７は、ＸＲ４を表す］。
【００４１】
式ＩＶの化合物は、以下の式のものであってもよい：
【化１１】
［式中、
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＸ−Ｒ３、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ３、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ３または（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ３を表し；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリールを表す］。
【００４２】
式ＩＶＢの化合物は、以下のものから選択されてもよい：
【化１２】
【００４３】
Ｖ）ポリアミドＰＴＥＮ阻害剤
【化１３】
【００４４】
ＶＩ）市販のＰＴＥＮ阻害剤
１．デルタメトリン；（Ｓ）−ａ−シアノ−３フェノキシベンジル（１Ｒ）−シス−３−（２，２ジブロモビニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシラート
２．アレンドロン酸ナトリウム三水和物
３．Ｎ−（９，１０−ジオキソ９，１０−ジヒドロフェナントレン−２−イル）−２，２−ジメチルプロピオンアミド
４．５−ベンジル−３フリルメチル（１Ｒ，Ｓ）−シス，トランス−クリサンテマート
５．スラミンナトリウム塩；８，８’−［カルボニルビス［イミノ−３，１フェニレンカルボニルイミノ（４−メチル−３，１−フェニレン）カルボニルイミノ］］ビスナトリウム塩、ヘキサナトリウム塩
６．４−メトキシフェナシルブロミド
７．１，４−ジメチルエンドタール；１，４−ジメチル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボン酸
８．カンタリド酸；２，３−ジメチル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３ジカルボン酸
９．スチボグルコン酸ナトリウム；グルコン酸アンチモンナトリウム
１０．３，４−デホスタチン、エチル−
１１．フェンバレラート；ａ−シアノ−３−フェノキシベンジル−ａ（４−クロロフェニル）イソバレラート
１２．α−ナフチルリン酸モノナトリウム塩
１３．β−グリセロリン酸ジナトリウム塩五水和物
１４．エンドタール；７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３ジカルボン酸
１５．シペルメトリン；（Ｒ，Ｓ）−α−シアノ−３−フェノキシベンジル−３（２，２−ジクロロビニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシラート；（１Ｒ）−（Ｒ）シアノ（３−フェノキシフェニル）メチル３−（２，２−ジクロロビニル）−２，２ジメチルシクロプロパンカルボキシラート。
【００４５】
ＶＩＩ）１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオンＰＴＥＮ阻害剤
【化１４】
［式中、
Ｒ１は、０、Ｃ１−Ｃ４アルキル、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｎＳＯ２ＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＳＯ２Ｒ２または（ＣＨ２）ｎＳＯ２Ｒ２を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４またはＮＲ４Ｒ５を表し；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＲ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ４またはＮＲ４Ｒ５を表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ６は、各出現時において、水素、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ４Ｒ１０、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＮＨ（ＣＨ２）ｐＣＯ（ＣＨ２）ｑＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐＳＯ２ＸＲ２または（ＣＨ２）ｐＸＳＯ２Ｒ２から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４またはＮＲ８Ｒ９を表し；
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＸＲ２を独立して表し；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＸＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐ〜ＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＣＯＲ２、（ＣＨ２）ｐＳＯ２ＸＲ２、（ＣＨ２）ｐＸＳＯ２Ｒまたは（ＣＨ２）ｐＳＯ２Ｒ２を独立して表し；
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル Ｒ７＝Ｈ、Ｃ1−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２Ｒ４、ＮＨＳＯ２Ｒ４、ＮＨＣＯ２Ｒ４またはＮＲ８Ｒ９を表し；
ｍは、０または１を独立して表し；
ｎは、１〜５であり；
ｐは、０〜５であり；
ｑは、０〜５であり；
Ｘは、ＯまたはＮＲ３を表し；
Ｚは、ＯまたはＮＲ７である］。
式ＶＩＩの化合物の環中の窒素は、中性であってよい。この窒素は、少なくとも１個のｍが１である場合においてＲ１基に結合している場合、荷電していてもよい（第四級塩）。
【００４６】
阻害剤は、以下のものから選択されてもよい：
【化１５】
【００４７】
ＶＩＩＩ）置換フェナントレン−９−１０−ジオンＰＴＥＮ阻害剤
【化１６】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２またはＣＯＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを独立して表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２−Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、ＣＲ２Ｒ３、Ｏ、ＮＲ４を表す］。
【００４８】
式ＶＩＩＩの阻害剤は、以下の式のものであってよい：
【化１７】
【００４９】
ＩＸ）イサチンＰＴＥＮ阻害剤
【化１８】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２、ＣＯＮＲ５Ｒ６、ＳＯ３Ｒ２またはＳＯ２ＮＲ２Ｒ３を表し；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを独立して表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２−Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＸ−Ｒ２（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）＝ＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、ＣＲ２Ｒ３、Ｏ、ＮＲ４を表す］。
【００５０】
式ＩＸの阻害剤は、以下のものから選択されてよい：
【化１９】
【００５１】
Ｘ）置換フェナントレン−９−オールＰＴＥＮ阻害剤
【化２０】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ５Ｒ６、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、ＣＯＲ２またはＣＯＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを独立して表し；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、ＳＯ２−Ｒ２、ＮＨＳＯ２Ｒ２、ＮＨＣＯＲ２、ＮＨＣＯ２Ｒ２、Ｎ＝ＣＲ２Ｒ３またはＮＲ５Ｒ６を表し；
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
ＲＯは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸ−Ｒ２、ＣＣＨ２）ｎＸ−Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２、ＳＯ２Ｒ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯＲ２を表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、ＣＲ２Ｒ３、Ｏ、ＮＲ４を表す］。
【００５２】
【化２１】
【００５３】
ＸＩ）置換ナフタレン−１，２−ジオンＰＴＥＮ阻害剤
【化２２】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ３Ｒ４、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、ＣＯＲ２、ＳＯ３−Ｒ２、ＳＯ２Ｎ−Ｒ３Ｒ４、ＮＨＳＯ２−Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ２、ＮＲ３Ｒ４またはＣＯＮＲ３Ｒ４から独立して選択され；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＯＲ２を独立して表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ２を表す］。
【００５４】
式ＸＩの阻害剤は、以下のものから選択されてよい：
【化２３】
【００５５】
ＸＩＩ）置換ナフタレン−１，４−ジオンＰＴＥＮ阻害剤
【化２４】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ＮＲ３Ｒ４、ハロゲン、シアノ、アルキル、アルキルアリール、カルボニル、カルボキシ、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ３、ＣＯＲ２、ＳＯ３Ｒ２、ＳＯ２Ｎ−Ｒ３Ｒ４、ＮＨＳＯ２−Ｒ３、ＮＨＣＯ２Ｒ３、ＮＨＣＯＲ３、ＮＨＣＯＣＯ２Ｒ２、ＮＲ３Ｒ４またはＣＯＮ−Ｒ３Ｒ４を表し；
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリールまたはアルキルアリールを表し；
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、アリール、アルキルアリール、（ＣＨ２）ｎＣＯＸＲ２、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＸＲ２または（ＣＨ２）ｎＯＲ２を独立して表し；
ｍは、０〜３であり；
ｎは、０〜３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＲ２を表す］。
【００５６】
ＸＩＩＩ）バナダート系ＰＴＥＮ阻害剤
１．カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナダート（Ｖ）
２．ジカリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２カルボキシル）オキソバナダート（Ｖ）
３．ジカリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）
４．モノペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）
５．カリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）
６．ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルヒドロキサミド）ヒドロオキソオキソバナダート
【００５７】
ＸＩＶ）Ｔ１ループ結合エレメント含有ＰＴＥＮ阻害剤
このＰＴＥＮ阻害剤は、顕著にアニオン性の形態（例えば、分子種の少なくとも５％がｐＨ７．４においてアニオンに荷電している）で生理学的ｐＨにおいて存在する基を含有することができる。そのようなアニオン性基は、ＰＴＥＮにそのペプチド構造のＴ１ループにおいて溶解状態で結合することができる。
【００５８】
そのような基の代表例は、以下のものを含む：
【化２５】
［式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、Ｎ−（アルキル）２から独立して選択され、ここで、アルキルは低級のＣ１−Ｃ４アルキル部分である。点線は、上記の式ＩからＸＩＩＩに記載の化合物の式への連結を表す。それらの基は、標準的分子ドッキング手順によりＴ１ループ空間を満たすそれらの能力についてインシリコでさらに評価することができる。そのようなＴ１ループ結合基は、式Ｉ−ＸＩＩＩの化合物中に取り込むことができる。それらの基の取り込みは、ＰＴＥＮの阻害に対する分子の選択性を付与することができる。ＸＩＶａ−ＸＩＶｄ基の調製は、文献において十分に確立されている。式ＸＩＶｅの化合物は、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ６，Ｎｏ．９，ｐｐ１０４３−１０４６，１９９６に開示の方法により調製することができる。式Ｉ−ＸＩＩＩ中へのそれらの基の取り込みは、当業者により容易に実施可能な標準的合成方法による。適切な出発材料を簡単に利用することによる、そのような取り込みの例は、上記基を取り込むもの、例えば：
【化２６】
への７〜９の変換により説明される。
【００５９】
活性化物質は、好適な薬物送達法および軸索再生の促進に十分な治療プロトコルを使用してニューロンと接触させる。インビトロ法について、活性化物質は、通常、ナノモルまたはマイクロモル濃度において培養培地に添加する。インサイチュー適用について、活性化物質は、経口的に、静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスにより、静脈内注入により、皮下に、筋肉内に、経眼的に（眼内、眼周囲、球後、硝子体内、結膜下、局所に、テノン嚢下投与によるものなど）、頭蓋内、腹腔内、脳室内、鞘内、硬膜外などに投与することができる。
【００６０】
意図される送達経路に応じて、組成物を１種以上の剤形（例えば、液体、軟膏剤、液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、カプセル剤、カプレット、トローチ剤、散剤、顆粒剤、カシェ剤、洗浄剤、座剤、クリーム剤、ミスト、点眼剤、ゲル剤、吸入剤、貼付剤、植込剤、注射剤、注入剤など）で投与することができる。それらの剤形は、結合剤、溶剤、増量剤、可塑剤などを含む種々の他の成分を含むことができる。
【００６１】
具体的な実施形態において、活性化物質は、該活性化物質を収容し、ニューロンのＣＮＳ軸索への送達に具体的に適合された植込デバイスを使用してニューロンと接触させる。デバイスの例は、固体または半固体デバイス、例えば放出制御性の生分解性マトリックス、繊維、ポンプ、ステント、吸着性ゼラチン（例えば、Ｇｅｌｆｏａｍ）などを含む。デバイスには、軸索の再生を促進するのに十分な活性化物質の事前に計測された別々の収容量を装填することができる。特定の実施形態において、デバイスは、好ましくは少なくとも２、５または１０日間の、ナノモルまたはマイクロモル濃度における活性化物質とのニューロンの連続的な接触を提供する。
【００６２】
本発明の方法は、典型的には、軸索の得られた再生を検出するさらなる工程を含む。インビトロ適用について、軸索再生は、軸索再生をアッセイするための定型的に使用される任意の方法、例えば神経突起伸長アッセイにより検出することができる。インサイチュー適用について、軸索再生は、画像化法、例えばＭＲＩを使用して直接的に、または間接的もしくは推論的に、例えば標的神経機能の改善を示す神経学的検査により検出することができる。検出工程は、治療の開始後の任意の時点において、例えば、治療の開始から少なくとも１日後、１週間後、１ヵ月後、３ヵ月後、６ヵ月後などに行うことができる。ある実施形態において、検出工程は、最初の神経学的検査および最初の検査から少なくとも１日後、１週間後または１ヵ月後に実施される後続の神経学的検査を含む。最初の検査と比較して、後続の検査において神経機能が改善されていれば、得られた軸索再生を示す。使用される特異的検出および／または検査方法は、通常、評価されている軸索病変の特定のタイプ（すなわち、外傷、神経変性など）に対する医療の普及している標準のものに基づく。
【００６３】
本発明はまた、活性化物質を溶出し、もしくは活性化物質が含浸されているＣＮＳ植込固体または半固体デバイスを提供する。ＣＮＳ植込デバイスの例は、ポリマーマイクロスフェア（例えば、Ｂｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００５）１１：７６８−７６を参照のこと）またはオブラート（例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．（２００３）４：７７３−８９を参照のこと）、脊髄損傷後の組織再生において使用される生合成植込剤（Ｎｏｖｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．（２００３）６：７１１−５により総説）、生分解性マトリックス（例えば、Ｄｕｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）１２５：５９１−６０４を参照のこと）、生分解性繊維（例えば、米国特許第６，５９６，２９６号を参照のこと）、浸透圧ポンプ、ステント、吸着性ゼラチン（例えば、Ｄｏｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．（２００４）１８９：３６１−８を参照のこと）などを含む。好ましいデバイスは、ＣＮＳ植込のため、特別に作製され、適合され、設計され、または指定される。植込デバイスは、神経再生を促進または容易にするために使用される１種以上の追加の薬剤を収容することができる。例えば、一実施形態において、急性脊髄損傷の治療のために使用される植込デバイスは、活性化物質およびメチルプレドニゾロンまたは他の抗炎症剤を収容する。別の実施形態において、植込デバイスは、活性化物質、ならびに神経細胞の生存、成長および／もしくは分化を促進する神経成長因子、栄養因子またはホルモン、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、イノシン、オンコモジュリン、ＮＴ−３などを収容する。
【００６４】
実施例１
タンパク質翻訳の促進による成熟ＣＮＳにおける軸索再生の促進
【００６５】
個々の細胞成長制御遺伝子の生殖細胞系列ノックアウトは、マウスにおいて胚性致死をもたらし、または生存能が低下するので、それらの動物の成体軸索再生試験の有用性を制限する。この問題を避けるため、本発明者らは、成体ＲＧＣにおける特異的遺伝子を条件付きで欠失させるためにＣｒｅリコンビナーゼを発現させるウイルスによる方針を利用した。ＲＧＣにおけるＣｒｅの有効な発現を実証するため、本発明者らは、Ｃｒｅを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−Ｃｒｅ）を、ＰＬＡＰ（（ヒト胎盤アルカリホスファターゼ）活性がＣｒｅの発現に依存するレポーターマウス（Ｒｏｓａ−ＳＴＯＰ−ＰＬＡＰ）において眼の硝子体内に注射した。本発明者らは、ＰＬＡＰ発現がＲＧＣの９０％超において誘導されることを見出し、このことは、ＡＡＶ−Ｃｒｅが成体マウスにおけるＲＧＣ感染に高度に有効であることを示した。視神経離断の完全性は、病変後に逆行性および順行性トレーサーの両方が網膜または上丘（ＳＣ）にそれぞれ到達することができないという観察により確認した。水晶体損傷およびそれに続くマクロファージの活性化がインビボで軸索再生を促進すると報告されているので（９）、注射に使用されるマイクロピペットを水晶体に接触しないように傾けた。本発明者らは、この方法が、抗ＣＤ６８抗体染色により示される通り、硝子体内ＡＡＶ注射後に有意なマクロファージ／ミクログリアの活性化をもたらさないことを確認した。
【００６６】
成体ＲＧＣにおける軸索再生に対する成長制御分子の条件付き欠失の効果を試験するため、本発明者らは、ＡＡＶ−Ｃｒｅを、Ｒｂｆ／ｆ（１２）、Ｐ５３ｆ／ｆ（１２）、Ｓｍａｄ４ｆ／ｆ（１３）、Ｄｉｃｅｒｆ／ｆ（１４）、ＬＫＢ１ｆ／ｆ（１５）およびＰＴＥＮｆ／ｆ（１６）を含む種々の成体ｆｌｏｘｅｄマウスの硝子体内に注射した。ＲＧＣにおける個々の遺伝子の欠失は、インサイチューハイブリダイゼーション実験により確認した。したがって、標準的な視神経挫滅アッセイ（９、１７）をＡＡＶ注射から２週間後に実施した。軸索再生は、病変部位にわたる視神経切片において順行性トレーサーであるコレラトキシンＢ（ＣＴＢ）により標識された軸索線維を検査することによりアッセイした。野生型マウスにおける軸索切断されたＲＧＣの約８０％が損傷後２週間以内に細胞死を受けるので（１８）；神経生存も、抗ＴＵＪ１抗体（ＲＧＣのマーカー）による網膜の全組織標本染色により検査した。
【００６７】
本発明者らは、成長促進経路の負の調節物質の阻害がニューロン生存および／または軸索再生を促進することを見出した。ＰＴＥＮ阻害は、神経生存および軸索再生の両方に対して最も劇的な効果を有した。ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射された全てのＰＴＥＮｆ／ｆ条件突然変異体においてＲＧＣはＲＧＣ生存の有意な増加を示したが、対照ＡＡＶ−ＧＦＰが注射されたＰＴＥＮｆ／ｆ条件突然変異体においては示さなかった。さらに、損傷から１４日後に顕著な長距離軸索再生が観察された。本発明者らは、ＰＴＥＮｆ／ｆマウスの第２の組におけるＡＡＶ−Ｃｒｅ実験、および対照としてのＡＡＶ−ＧＦＰ注射を繰り返し、同様の結果が観察された。それらのデータは、ＰＴＥＮの阻害が損傷した成体ＣＮＳの再生の向上に十分であることを示す。定量的には、対照動物の約２０％と比較して、ＰＴＥＮ欠失ＲＧＣの推定４５％が損傷２週間後に生存した。損傷から２週間後に生存するＲＧＣのうち、約８〜１０％がそれらの病変軸索を病変中心に対して最大０．５ｍｍ遠位まで再生する。本発明者らの知る限り、この再生は、損傷した成体哺乳動物の視神経におけるそのような長距離再生の最初の記載である。重要なことに、それらの再生線維は、経時的に視神経に沿って突起し続けた。損傷から４週間後、いくつかの再生線維は視交叉の区域に拡張した。試験された他のマウス系統の中で、ｐ５３欠失ＲＧＣは、それらのマウスにおいてニューロンの生存能力の有意な増加を示した（損傷したＲＧＣの約５４％が生存した）が、それらのマウスにおける軸索再生の証拠は存在しなかった。Ｐ５３およびＰＴＥＮ欠失の両方が細胞生存を向上させた一方、ＰＴＥＮ欠失のみが軸索再生を促進したので、それらのデータは、ニューロン生存の誘導は軸索再成長（１９）を誘発するのに十分でない場合があることを示す。本発明者らの結果は、ＰＴＥＮ阻害が内因性再生機序に対して作用して損傷後の成体ＣＮＳの成長を促進することを示す。
【００６８】
本発明者らは、ＰＴＥＮが阻害されたＣＮＳ軸索が損傷後に軸索伸長を迅速に再開し得ると仮定した。したがって、本発明者らは、視神経挫滅直後に硝子体内ＣＴＢ注射を実施して軸索を損傷後早期の時点において追跡した。病変部位において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）発現の上方調節により示される通り、挫滅から１から３日後に明白なグリア応答が起きた。これまでの研究（２０）と一致して、ＧＦＡＰ陽性星状膠細胞は病変部位から主として除外され、ＣＳＰＧシグナルは損傷から７日後に低レベルに戻った。病変から１日後、損傷した視神経線維は、対照およびＡＡＶ−Ｃｒｅが注射されたＰＴＥＮｆ／ｆマウスの両方において挫滅部位の近接末端において終結する。しかしながら、損傷から３日後、ＰＴＥＮ欠損ＲＧＣからの軸索発芽が始まってＣＳＰＧ富化病変部位中にマクロファージと一緒に移行し、損傷から７日後にいくつかの線維を病変部位上に見ることができた。対照的に、それらの段階において対照動物において最小の軸索発芽が見られた。電子顕微鏡分析により、野生型状況において変性ＲＧＣ軸索、髄索の壊死およびマクロファージにより占有された損傷部位が可視的であり、再生線維はほとんど可視的でないことを確認した。しかしながら、ＰＴＥＮをＲＧＣにおいて阻害した場合、束として出現することが多い再生性軸索発芽が、損傷から数日後に病変内および病変に対して遠位の両方で見出された。それらの結果は、ＰＴＥＮ阻害により、実際に軸索が病変部位における阻害を克服し、損傷後すみやかに再生することができることを示した。
【００６９】
ＰＴＥＮ欠失は、キャップ依存性タンパク質翻訳開始の調節による細胞成長およびサイズの制御において重要であるＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の活性化をもたらすことが公知である（２１〜２４）。軸索再生は実質的な新たなタンパク質合成を要求するので、本発明者らは、ｍＴＯＲ活性化がＰＴＥＮ欠失ニューロンにおける軸索再成長の原因になり得ると仮定した。ＰＴＥＮおよびＰＩ３キナーゼの種々の形態は、野生型成体ＲＧＣにおいて発現される。タンパク質翻訳に対するその効果を媒介するｍＴＯＲキナーゼの十分に研究されている標的の２種は、リボソームＳ６キナーゼ１（Ｓ６Ｋ１）および真核開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）結合タンパク質４Ｅ−ＢＰ１である。ホスホ−Ｓ６Ｋ１は、リボソームタンパク質Ｓ６を順次リン酸化する。これまでの研究は、Ｓ６および４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化をｍＴＯＲ活性化の指標として使用してきた（２５、２６）。リン酸化されたＳ６（ｐ−Ｓ６）の染色により、ｐ−Ｓ６陽性ＲＧＣの割合の劇的な発生依存性減衰が明らかになった。強力なｐ−Ｓ６シグナルは、ほとんどの胚性ニューロン内で見ることができるが、成体ＲＧＣの少数にのみ残留し、このことは、ｍＴＯＲシグナリングが成体ＲＧＣの大部分において下方調節されることを示す。それらの変化は、それらのニューロンの成熟時の全体的な軸索成長能の減少と相関する。
【００７０】
次に本発明者らは、なぜｐ−Ｓ６シグナルを有する成体ＲＧＣのサブセットがそれらの損傷した軸索を依然として再生することができないのか決定することを求めた。ストレス、例えば酸素圧低下の経験時に細胞がｍＴＯＲシグナリングを抑制することにより応答すること（２７〜３０）、すなわち、生存のためにエネルギー恒常性を維持すると提案されている進化的に保存されているストレス応答がこれまでに報告されている。したがって、本発明者らは、軸索切断に起因するストレスが損傷したニューロン内での全体的な翻訳を低減し得ると仮定した。このことを試験するため、本発明者らは、対照および損傷ラットからの精製ＲＧＣにおける新たなタンパク質合成の割合を推定した。対照および損傷ＲＧＣを３５Ｓ−メチオニン／システインとともにインキュベートし、それらの細胞からの抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。全タンパク質内容物に対して正規化された、３５Ｓ−メチオニン／システインが取り込まれたタンパク質を定量し、結果は軸索切断された成体ＲＧＣにおける新たなタンパク質合成の有意な減少を示した。
【００７１】
次に本発明者らは、抗ｐ−Ｓ６抗体による網膜切片の免疫組織化学分析により、神経病変がｍＴＯＲ経路の活性を下方調節するかどうかを試験した。本発明者らの結果は、対照マウスにおいて損傷後全ての検査時点（１、３、７日）において軸索切断が成体ＲＧＣ内に残留するｐ−Ｓ６シグナルをほぼ完全に消滅させることを示し、このことは、軸索切断がｍＴＯＲにより媒介されるシグナルの迅速で持続的な下方調節を誘発すること、およびこの下方調節を阻害することで野生型成体ＣＮＳニューロンにおける再生が促進されることを示す。
【００７２】
これまでの研究により、ストレスを受けた誘導分子Ｒｅｄｄ１／２（発生およびＤＮＡ損傷応答調節遺伝子１／２）の上方調節がストレス下で細胞においてｍＴＯＲの阻害を媒介し得ることが示唆された（２７〜３０）。したがって、本発明者らは、ＦＡＣＳにより精製されたラットＲＧＣに由来するｍＲＮＡを使用する定量リアルタイムＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）により、損傷したニューロンにおけるＲｅｄｄ１／２発現を分析した。軸索切断されたＲＧＣにおいてＲｅｄｄ１／２ｍＲＮＡの有意な変化は見られなかった。陽性対照として、本発明者らは、軸索切断後に上方調節されることが公知の遺伝子Ｇａｄｄ４５ａ（３１）の発現が、損傷試料の同一の組において有意に増加することを見出した。
【００７３】
次に本発明者らは、ＰＴＥＮ阻害が損傷前および損傷後の両方において成体ＲＧＣにおけるｐ−Ｓ６レベルに影響を及ぼすかどうかを試験した。ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射された未損傷ＰＴＥＮｆ／ｆマウスにおいて、抗ホスホ−Ｓ６により染色されたＲＧＣの割合は、野生型またはＡＡＶ−ＧＦＰが注射されたＰＴＥＮｆ／ｆマウスのものと有意に異なることはなかった。しかしながら、ｐ−Ｓ６シグナルの強度が向上して出現し、それらのｐ−Ｓ６陽性ＲＧＣは細胞サイズの増加を示し、このことはニューロンの他のタイプにおけるＰＴＥＮ欠失のこれまでの研究と一致した（３２、３３）。重要なことに、視神経挫滅後、ｐ−Ｓ６陽性ＲＧＣの同様の割合が、ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射されたＰＴＥＮｆ／ｆマウスにおいて損傷から１、３または７日後に残留した。したがって、軸索切断に対するストレス応答にかかわらず、ＰＴＥＮを欠失したそれらの軸索切断されたニューロンは、ｍＴＯＲ活性を未損傷の野生型ニューロンと同様のレベルにおいて依然として有する。再生線維の割合（８〜１０％）は、ｐ−Ｓ６陽性軸索切断されたＲＧＣの割合（８〜１０％）と同様であった。
【００７４】
ｍＴＯＲ経路の活性化が軸索再生を促進するのに十分であるかどうかをさらに検査するため、本発明者らは、ＴＳＣ１ｆ／ｆ条件付きノックアウトマウス（３４）を使用する同様の視神経損傷／再生アッセイを実施した。ＴＳＣ１および２は、ｍＴＯＲシグナリングを負に調節するタンパク質複合体を形成する（３５〜３９）。これまでの報告により、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２のいずれかの損失がｍＴＯＲ経路の構成的な活性化に導くことが示された（３８）。予測される通り、ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射されたＴＳＣ１ｆ／ｆマウスにおいて、強力なｐ−Ｓ６シグナルが軸索切断されたＲＧＣにおいて観察され、損傷後にＲＧＣ生存の有意な向上が存在した。さらに重要なことに、ＴＳＣ１欠失マウスにおいてかなりの軸索再生が観察されたが、ＡＡＶ−Ｃｒｅが注射された野生型マウスにおいては観察されなかった。ＴＳＣ１欠失マウスにおける軸索再生の程度は、ＰＴＥＮ欠失により誘導されたものよりわずかに弱く、このことは、ＰＴＥＮの他の下流標的、例えばＡｋｔおよびＧＳＫ−３の活性（４０、４１）の変化も再生性成長に関与し得ることを示した。それにもかかわらず、それらの結果は、ｍＴＯＲ経路の活性化がＣＮＳニューロンの生存および軸索再生の両方を促進するのに十分であることを示す。
【００７５】
本発明者らの結果は、軸索切断されたＣＮＳニューロンにおいて、ｍＴＯＲシグナリングの２工程下方調節；発生成熟による第１の調節、および軸索切断により誘発されるストレス応答による第２の調節により、ｍＴＯＲ活性が抑制されることを明らかにする。本発明者らの結果は、ｍＴＯＲシグナリングの正の調節物質の増加またはｍＴＯＲシグナリングの負の調節物質の阻害（例えば、ＴＳＣ１／２またはＰＴＥＮの化学阻害剤による（４２））をＣＮＳ損傷後に一過的に使用してタンパク質合成の下方調節を妨げ、軸索再生および機能回復を促進することができる、損傷後の長距離ＣＮＳ軸索再生を促進する新たな手法を提供する。
【００７６】
実施例２ａ
薬理学的ＰＴＥＮ阻害は成体マウスにおいて病変視神経線維の再生を促進する
【００７７】
本発明者らは、ニューロンＰＴＥＮ活性の薬理学的阻害剤が軸索再生を同様に促進することを実証するために同様の視神経試験を設計し、既に記載されている視神経挫滅のモデルを適合した［Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，１６４６（２００４）］。成体マウス視神経を眼球後部において露出し、挫滅した。成体マウスの損傷直後、代替的ＰＴＥＮ阻害剤の溶液中に段階濃度（表１）または０．１％ＤＭＳＯ（対照）中で浸漬させたＧｅｌｆｏａｍを神経の挫滅部位に対して配置し、試験の最初の６日間につき３日ごとに置き換えた。
【００７８】
【表１】
【００７９】
動物を損傷から２週間後に屠殺し、次いで４％のパラホルムアルデヒドを経心的に潅流させる。視神経を１０μｍで凍結切片化し、抗ＧＡＰ４３抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）により染色して再生軸索を検出する［Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，前掲］。ＤＭＳＯにより処置された対照マウスにおいて、再生はほとんど検出されない。しかしながら、ＰＴＥＮ阻害剤の損傷部位適用は、対照マウスと比較して損傷部位を０．２５ｍｍ超えて計測される軸索再成長および再生軸索数の有意な増加をもたらす。
【００８０】
実施例２ｂ
薬理学的ＰＴＥＮ阻害は、成体マウスにおいて病変視神経線維の再生を促進する。
【００８１】
後続の同様の実験において、本発明者らは、表２のＰＴＥＮ阻害剤を網膜内に注射し、視神経損傷を実施し、ニューロン生存および軸索再生の増加を見出した。
【００８２】
【表２】
【００８３】
実施例３
一般的スクリーニングおよびＩＣ５０決定のための例示的ＰＴＥＮ阻害アッセイ
【００８４】
ＰＴＥＮ阻害剤を、２ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．１ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）ならびに最大３μｇのＰＴＥＮの全タンパク質を収容するウェル当たり２５μｌの全容量で半容量９６ウェルプレートにおいて実施される阻害アッセイにおいて評価する。試験阻害剤候補（ＤＭＳＯ中２５ｍＭの濃縮原液）の少容量をＰＴＥＮ溶液と室温において約１０分間混合し、次いで基質を添加する。次いで、反応混合物を３７℃において２０分間インキュベートする。これに続き、マラカイトグリーン緩衝液（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）の１００μｌのアリコートを添加して暗所で室温において発色させる（この溶液は、脱リン酸化反応も停止させる）。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ分光光度プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して６５０ナノメートルにおける光学密度を計測する。
【００８５】
阻害剤候補の最初のスクリーニング濃度は２５０μＭであり、次いで、阻害剤無しの対照群と比較して５０％超の阻害を有する候補をさらに評価してＩＣ５０値を決定する。ＰＴＥＮは、市販品を購入することができ、または文献方法により調製することができる［すなわち、遺伝子再構成されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＰＴＥＮ融合タンパク質を発現する細菌の細胞抽出物から、この細胞抽出物中のＧＳＴ−ＰＴＥＮをＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に結合させ、このゲルから精製する］。好適なＰＴＥＮ反応基質は、（ａ）公開されている方法（Ｍａｅｈａｍａ ｅｔ ａｌ．２０００，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７９，２４８−２５０）を使用して作出することができ、典型的には最終反応混合物中約５０μＭ（成分濃度に対する）において利用されるＰＩＰ３リン脂質ベシクル（ＰＬＶ）、（ｂ）１００μＭの作業濃度において利用される水溶性ＰＩＰ３ Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴおよび（ｃ）リン酸化チロシン基質の作業濃度が２００μＭである、（ＥＥＥＥＹｐ）ｎ（ｎは２または３である）と設計されたリン酸化ポリグルタミン酸−チロシンペプチド（Ｂｉｏｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む。
【００８６】
潜在的ＰＴＥＮ阻害剤の用量応答を決定するため、１ｎＭから２５０μＭ（最終反応混合物濃度）の範囲の試験化合物の用量を、一般的なＰＴＥＮ阻害アッセイ（前掲）において評価する。実施されたＩＣ５０データを得るため、用量応答アッセイの２つの別個のラウンドを実施する。第１のラウンドにおいて、１ｎＭから２５０μＭの範囲の１０倍段階希釈における阻害剤の存在下でＰＴＥＮ活性を試験する。ＰＴＥＮ活性が劇的に変化する濃度範囲を決定したら、この範囲内の２つの追加の濃度データ点を加え、次いでＰＴＥＮ阻害アッセイを第２のラウンドについて再度実行する。ＰＴＥＮ阻害ＩＣ５０は、ＰＴＥＮ活性（リン酸産生により計測し、未阻害対照試料と比較する）の５０％が見出された阻害剤濃度として表す。データからのＩＣ５０の決定は、Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して行う。
【００８７】
実施例４
ＰＴＥＮ阻害は、ラットにおいて脊髄損傷後の軸索再生を促進する
本動物試験は、脊髄損傷用動物モデルにおいて、ＰＴＥＮ阻害剤ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）およびｂｐＶ（ｐｉｃ）の鞘内投与または静脈内投与により軸索再生を促進することができることを実証する。本動物試験のための方法は、Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００２）２２：７１１１−７１２０）、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ（２００５）１：２９）およびＯｂａｔａ ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００４）２４：１０２１１−２２）から適合した。
【００８８】
成体Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（３００〜４００グラム）を訓練し、把握能を計測する指向前足到達（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｆｏｒｅｐａｗ ｒｅａｃｈｉｎｇ）（ＤＦＲ）装置において試験する。Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ．，前掲により詳細が記載されているこの装置は、２つのコンパートメント：Ｐｌｅｘｉｇｌａｓの仕切りにより分離されている、ラット収容用の主コンパートメントおよび食餌用の副コンパートメントからなる箱である。副コンパートメントは、食餌のペレットをそれぞれ保持する等しいサイズのスロットにさらに分割されている。スロットとＰｌｅｘｉｇｌａｓの間には空隙が存在する。この装置は、スロットから食餌ペレットを回収するため、ラットが前肢をＰｌｅｘｉｇｌａｓの仕切りの孔に通して伸ばし、ペレットを把握し、そのペレットを空隙上に持ち上げ、スロットの外に出さなければならないように構成されている。ラットがスロット内でＰｌｅｘｉｇｌａｓの孔に向かって食餌を集めるにすぎない場合、食餌がスロットから空隙に降下し、副コンパートメントの床に落下する。副コンパートメントの床は、ラットが降下する食餌を回収することができるように構成することができ、または床を低くしてラットが降下した食餌に届かないようにすることができる。脊髄損傷の誘導前、ラットを食餌制限し、訓練および試験の前およびその間にわたり１日当たり約３グラムの食餌／１００グラム体重を与える。体重を追跡し、任意の時点においてラットがその元の体重の８０％にも減量していることを確保する。全てのラットを、ラットが課題を学習することができる一方、ラットが試験状況に慣れるよう箱内で２〜３日間行動形成させる。動物を５日間１日当たり２回訓練し、次いで５日間１日当たり２回試験し、術前ＤＦＲデータを収集する。試験時間の間、ラットに５分間与えて課題を完了させ、ラットがこの時間の間に望むほど試行させる。ラットはその元の体重の少なくとも９５％に戻して、ラットが手術を受ける前に健常であることを確保することが要求される。
【００８９】
ラットを対照群または実験群に無作為に割り付ける。偽対照ラットは、病変化を伴わず、ミニ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ型２００１；Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）の配置を伴い、または伴わずに手術手順を受ける。病変対照ラットは、処置を受けず、ビヒクルによる尾静脈注射のみの処置、ミニ浸透圧ポンプ挿入のみの処置、またはビヒクルによるミニ浸透圧ポンプ挿入のみの処置を受ける。イソフルランによる麻酔後、最大露出のため頸髄を曲げるようにラットを手術板上に置く。Ｃ２およびＣ４の間の脊髄の背部を露出して椎弓切除を実施する。後柱を両側で識別し、偽群のラットを除く全てのラットにおいて、縫合針を脊髄に導通させ、後索を単離する。縫合糸を穏やかに持ち上げ、一対の光彩切除用のはさみを使用して後索を両側離断し、これにより後皮質脊髄路（ＣＳＴ）を離断する。後角および中央の灰白交連の可視化により、病変境界の精度を確認する。蛍光逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ（０．９％の生理食塩水中３％；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）中に浸漬された生分解性Ｇｅｌｆｏａｍの綿撒糸を病変部位内に置き、軸索が離断されたニューロンを識別し、病変を確認する。ＰＴＥＮ阻害剤処置または対応する対照処置に指定されたラットに、病変部位に隣接してミニ浸透圧ポンプを植込む。処置群におけるポンプは、１μｌ／時間の速度において７日間作動し、ＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））を５００ｎｇ／μｌの濃度において充填する。重層する筋および皮膚を縫合し、ラットを加熱パッド上に置いて体温を維持する。各ラットにブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）の単回用量を術直後に与えて疼痛を緩和する。
【００９０】
脊髄を病変化して１時間後、尾静脈注射処置群のラットに生理食塩水／ＤＭＳＯビヒクル中１００μｇ／ｋｇのＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））をボーラス注射する。この処置を、病変から１から７日後２４時間ごとに繰り返す。ビヒクルのみの対照ラットは同一の処置を受けるが、生理食塩水／ＤＭＳＯの等容量を尾静脈内に注射する。
【００９１】
ラットを術後２〜５週間の間、１週間当たり２回訓練する。一部のラットを、ラットが早期術後期間のＤＦＲ課題において食餌を把握することができないように深く障害させることができる。この場合、ラットがスロットから副コンパートメントの床上に降下する食餌を主コンパートメント中に集めることができるように装置を構成することができる（Ｎａｓｈ ｅｔ ａｌ．，前掲を参照のこと）。このことは、ＤＦＲ課題の到達の部分を失わないことを確保する。把握障害の重症度は術後期間が増加するにつれて減少し、食餌集めを許容しない装置の構成を徐々に再確立することができる。術後回復期間の終盤までに、全てのラットはＤＦＲ課題を首尾良くある程度実施することができる。術後６週間の間、ラットを５日間１日当たり２回試験し、盲検化された測定者により術後ＤＦＲデータを収集する。術前試験期間同様、ラットに術後試験期間の間に５分間課題を完了させ、ラットがこの時間の間に望むほど試行させる。データを試行の総数および成功した試行の割合について収集する。試行は、ラットがスロット中に到達し、ペレットを移し、またはペレットを副コンパートメントの床上に降下させた場合のみ評点化する。成功した試行は、ラットがペレットを把握し、ペレットを空隙上に持ち上げ、ペレットをＰｌｅｘｉｇｌａｓの仕切りに通して試験装置の主要部内に引っ張った場合に評点化する。
【００９２】
偽手術動物は、術前に実施するのと同様に十分にＤＦＲ課題を術後に実施し、このことは、病変のみがラットのＤＦＲ課題実施能を阻害し、手術手順の他の部分が阻害しないことを実証する。病変およびビヒクル群は、術後の群の全てのうち最も障害を受けた群である。病変およびビヒクル群は、ＤＦＲ課題を約４０％の成功率でしか実施することができない。ＳＰ６００１２５処置群による有意により良好な実施は、脊髄損傷後の機能的回復に対する処置の効果を実証する。
【００９３】
損傷から７週間後、ラットをビオチンデキストランテトラメチルローダミン（ＢＤＴ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の注射のため準備する。一次運動皮質内に注射されるこの蛍光順行性トレーサーは、脊髄の病変部位に対して尾側のＣＳＴ軸索を標識するために使用する。イソフルラン（５％）による麻酔後、ラットを定位固定器内に置き、定位的に決定された合計６つの孔（０．９ｍｍ直径）を前肢に関連する一次運動皮質上の頭蓋内に穿孔する。それらの注射のための前後側（ＡＰ）および内外側（ＭＬ）のブレグマからの座標は、以下の通りである：±０．５ＡＰおよび±３．５ＭＬ；±１．５Ａ／Ｐおよび±２．５ＭＬ；ならびに±２．５ＡＰおよび±１．５ＭＬ。全ての注射は、頭蓋の表面から２．５ｍｍの深さにおいて送達する。１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用してＢＤＴを皮質の第Ｖ層中に両側注射する。各皮質半球内への３回の注射を使用して順行性トレーサー合計１．２μｌを投与する。骨ろう（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を使用して頭蓋の孔を密封し、頭皮を縫合し、ブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）の単回用量を術直後に投与して疼痛を緩和する。トレーサーの注射から３日後にラットを死亡させる。
【００９４】
病変化から７週間および３日後、ラットを抱水クロラール（１０ｍｌ／ｋｇ）により麻酔し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００ｍｌ、次いで０．１Ｍリン酸緩衝液中４％のパラホルムアルデヒド３００ｍｌを経心的に潅流させる。動物を死亡させた後、全ての脳および脊髄を切除し、０．１Ｍリン酸緩衝液溶液中３０％のスクロース中で一晩浸漬する。脳を冠状に切断し、脊髄を凍結ミクロトームにより２０μｍの厚さにおいて水平に切断し、ＰｒｏｂｅＯｎ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）被覆スライド上に封入する。脳および脊髄切片は、Ｎｉｋｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）Ｌａｂｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を使用して検査し、画像はデジタルスチルカメラを使用して記録する。一次運動皮質の前肢対応領域は、定位ＢＤＴ注射部位に基づき識別する。一次運動皮質を全てのラットにおいて検査する。一次運動皮質の第Ｖ層中のＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識ニューロンの存在により、病変化手順の間に背部ＣＳＴ軸索が離断されたことを確認する。後索内に局在する全てのＣＳＴ軸索が術中に離断され、前肢対応領域におけるＣＳＴ軸索だけが離断されないので、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識ニューロンが一次運動皮質にわたり第Ｖ層中で見出される。この標識パターンの唯一の例外は、脳がＦｌｕｏｒｏｇｏｌｄ標識物質を有しない偽群のラットの脳内である。
【００９５】
病変に対して尾側の脊髄を検査し、通常は背部ＣＳＴにより占有される脊髄の領域を占有するＢＤＴ標識軸索を計数する。各切片について、ＢＤＴ標識軸索の数を病変に対して３ｍｍ間隔の尾側において計数し、損傷に対して１ｍｍ遠位から開始し（すなわち、１ｍｍ、４ｍｍ、７ｍｍなど）、病変部位に対して１９ｍｍ尾側で終了する。ラット前足の神経支配はＣ３における病変から１５．１ｍｍの距離のＴ１に拡張する。したがって、病変に対して１９ｍｍ尾側まで遠くの軸索の分析は、前足に対応する距離全体が試験されることを確保する。各間隔において、ＢＤＴ標識軸索の総数（左右のＣＳＴを合わせる）を５００μｍの長さ（顕微鏡視野の長さ）に沿って計数する。計数される各視野において、焦点面を上下に調整し、単一の連続する軸索が焦点面の外に横断し、同一視野中のさらに下方に再出現する場合、この軸索が二重に計数されないことを確保する。存在するＢＤＴ標識軸索の数を、対照群および実験群について距離のそれぞれ（すなわち、病変部位に対して１、４、７・・・および１９ｍｍ尾側）において検査する。検査間隔の全てにわたり、軸索の平均数は偽群において最高であり、各検査距離において、偽群の標識軸索の平均数は他の群より有意に高い。任意の検査距離において病変群およびビヒクル群の平均間で有意な差異は観察されない。それらの群において、軸索は、損傷に対して短い距離の尾側にのみ見出され、病変に対して１０ｍｍ遠位から最も遠い検査距離まで、組織の全てが軸索を可視的に欠く。病変対照ラットと比較してＰＴＥＮ阻害剤処置群における各距離において有意により標識された軸索は、この処置が脊髄損傷後の軸索再生を促進することを実証する。
【００９６】
実施例５
急性脊髄損傷のためのＰＴＥＮ阻害剤処置後の神経学的転帰の改善
本発明者らのプロトコルをＧｅｉｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｓｐｉｎｅ（２００１）２６：５８７−５９８）により記載されたＳｙｇｅｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ａｃｕｔｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔｕｄｙの研究に応用した。このプロトコルは、プロスペクティブな、二重盲検、無作為化および層別化された多施設試験であり、約８００人の患者を、各処置群：プラセボ、低用量ＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））および高用量ＰＴＥＮ阻害剤において少なくとも７２０人に完了させ、評価可能となるように無作為化する。患者を、損傷の重症度の３つの程度（米国脊髄損傷学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｉｎｊｕｒｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）グレードＡ、ＢおよびＣ＋Ｄ）および解剖的損傷の２つのレベル（頸部および胸部）に従って、６つの群に層別化する。７２０／４＝１８０人の患者の各群が２６週目の検査に達し、評価可能になる際、試験を事前に計画を立てた中間分析に続いて行う。患者は、実質的な運動障害を有する少なくとも一方の下肢を有することを要求される。脊髄離断または貫入を有する患者を除外し、それというのも患者が顕著な馬尾、腕神経叢もしくは腰仙骨神経叢、または末梢神経の損傷を有するからである。脊髄を貫通しない銃創は許容される。神経学的計測評価または解釈を妨げるほど重症でない限り、多発外傷は許容される。
【００９７】
全ての患者は、脊髄損傷（ＳＣＩ）後８時間以内に開始するメチルプレドニゾロン（ＭＰＳＳ）の第二次米国脊髄損傷急性期研究（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｕｔｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ（ＮＡＳＣＩＳ ＩＩ））投与計画を受けることになっている。ＭＰＳＳおよびＰＴＥＮ阻害剤の間の任意の考えられる有害な相互作用を避けるため、ＭＰＳＳ投与の完了後まで試験投薬は開始しない。
【００９８】
プラセボ群は、プラセボの初回量、次いで５６日間のプラセボ投与を有する。低用量ＰＴＥＮ阻害剤群は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与される５０ｍｇの初回量を有し、次いで５６日間１０ｍｇ／日で静脈内投与する。高用量ＰＴＥＮ阻害剤群は、２５０ｍｇの初回量を投与し、次いで５６日間５０ｍｇ／日で投与する。
【００９９】
基礎期の神経学的評価は、ＡＩＳおよび詳細な米国脊髄損傷学会（ＡＳＩＡ）の運動ならびに感覚検査の両方を含む。修正ベンゼル分類（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂｅｎｚｅｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ならびにＡＳＩＡの運動および感覚検査は、損傷から４、８、１６、２６および５２週間後に実施する。修正ベンゼル分類は基礎期後の計測に使用する。それというのも、この分類は、歩行能を評価し、事実上、ＡＩＳの広範なＤカテゴリーを細分するからである。ほとんどの患者は基礎期において不安定な脊椎骨折を有するので、その時に歩行能を評価することはできない（したがって、異なる基礎期および追跡スケールを使用する）。著しい回復は、基礎期のＡＩＳからの修正ベンゼル分類における少なくとも尺度２に等しい改善として定義される。一次有効性評価は、２６週目において著しい回復を有する患者の割合である。二次有効性評価は、著しい回復の時間経過、および脊髄機能の他の確立した計測（ＡＳＩＡの運動および感覚スコア、障害の相対および絶対感覚レベル、ならびに膀胱および腸の機能の評価）を含む。
【０１００】
実施例６
ラットにおける皮質衝撃損傷後のＰＴＥＮ阻害の効果
本発明者らは、Ｃｈｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．（２００３）３０４：６１７−２３）からの方法を応用し、脳衝撃損傷のラットモデルに対するＰＴＥＮ阻害剤の種々の用量および処置スケジュールの効果を試験する。体重３００から４００ｇの合計６０匹の雄Ｅｖａｎｓラットを、腹腔内（ｉ．ｐ）注射または脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注射される以下の用量：無し（生理食塩水対照群）、０．０１、０．１、１．０および１０．０ｍｇ／ｋｇ／日のＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））の１つに割り付ける。ラットを、１、３、７または１４日間の処置継続期間に、各処置群の４匹のラットおよび各対照群の３匹のラット（すなわち、生理食塩水を１、３、７または１４日間投与）を用いてさらに割り付ける。
【０１０１】
衝撃損傷をもたらす方法の詳細は、これまでに記載されている（Ｃｈｅｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ（１９９６）１３：３７１−３８３）。簡潔に述べると、ラットの頭部を耳棒および切歯棒により定位フレーム内に固定する。直径１０ｍｍの開頭術を頭頂葉皮質上の頭蓋右側について実施する。８ｍｍの直径を有するインパクターの先端を、脳の曝露表面に対して垂直の開頭部位において、その垂直に対して約４５度の角度で中央に位置させる。この先端が硬膜表面にちょうど到達するまで先端を下げる。次いで、インパクターロッドを収縮させ、先端をさらに３ｍｍ進行させ、衝撃の間に３ｍｍの脳変形を生じさせる。インパクターに適用されるガス圧を１５０ｐｓｉに調節し、約５ｍ／ｓの衝撃速度および約１５０から１６０ｍｓの継続期間を与える。
【０１０２】
ラットを一晩絶食させ、通気型麻酔チャンバー内で１００％酸素中３．５％のイソフルランにより麻酔する。１６ゲージのＴｅｆｌｏｎカテーテルを気管挿管した後、手術準備および衝撃損傷のために１００％酸素中２％のイソフルランをラットに機械的に通気する。衝撃部位から十分に離して左前頭葉内に挿入された３Ｆマイクロセンサ変換器（Ｃｏｄｍａｎ＆Ｓｃｈｕｒｔｌｅｆｆ，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，ＭＡ）により頭蓋内圧（ＩＣＰ）を追跡する。ＩＣＰは、損傷の重症度の計測として衝撃損傷の間に追跡する。直腸温を加熱パッドにより３６．５〜３７．５℃に維持し、直腸サーミスタにより制御する。頭部に向けられる加熱ランプの助けにより、脳の温度を３７℃において一定に保持する。
【０１０３】
ＰＴＥＮ阻害剤の脳室内投与を受けることになっているラットは、Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ（２００６）１００：１４２−１４８）により記載された手順を使用してミニポンプ植込物を受ける。簡潔に述べると、ラットを定位フレーム（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｊａ，ＣＡ）内に固定する。ガイドカニューレを左側脳室内に植込む（ブレグマ−０．８ｍｍ、横１．５ｍｍ、硬膜下３．７ｍｍの深さ）。次いで、各カニューレをカテーテルにより、肩胛骨領域内の皮下に植込まれ、薬物を連続的に注入してＡＳ６０１２４５（または対照群についてはビヒクルのみ）の規定の１日用量を達成するように構成されているＡＬＺＥＴ（登録商標）ミニ浸透圧ポンプに連結する。
【０１０４】
腹腔内投与処置群のラットについて、ＰＴＥＮ阻害剤の各用量を、各群について送達される容量が同一になり、ＰＴＥＮ阻害剤の投与量のみが変わるように滅菌０．９％生理食塩水１ｍｌ中で溶解させ、第１の用量を、衝撃損傷後１時間以内に投与する。この後、割り付けられた処置継続時間で１日１回投与する。
【０１０５】
全てのカテーテルを除去し、手術創を縫合した後、ラットを麻酔から覚醒させる。損傷後最初の３日間、ラットを痛覚消失のため酒石酸ブトルファノールにより、１２時間ごと（１日２回）筋肉内投与０．０５ｍｇで処置し、術後感染のリスクを低減するためエンロフロキサシン２．２７％、筋肉内投与０．１ｍｌにより毎日処置する。
【０１０６】
転帰計測は、処置群に対して盲検化された測定者により実施する。衝撃から２週間後、動物を、ケタミン／キシラジン／アセプロマジンの組合せにより深く麻酔し、０．９％生理食塩水、次いで１０％リン酸緩衝ホルムアルデヒドを経心的に潅流する。脳全体を切除し、４％ホルマリン中で固定する。固定された脳を、挫傷、血腫およびヘルニア形成の存在について肉眼検査する。脳を写真撮影し、２ｍｍ間隔において切片化し、次いでパラフィン中で包埋する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色された９μｍの厚さの切片を組織学的検査のために調製する。包埋切片の切断表面上の皮質損傷の最大断面領域を含めるよう特に配慮する。Ｈ＆Ｅにより染色された冠状切片を、ＰａｔｈＳｃａｎ Ｅｎａｂｌｅｒ（Ｍｅｙｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を備えたＰｏｌａｒｏｉｄ Ｓｐｒｉｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してデジタル化する。Ｈ＆Ｅにより染色された各冠状画像における損傷の断面区域を決定し、薄片間の組織の厚さを掛けることにより損傷容量を計測する。このスラブ容量技法は、画像処理プログラムＯｐｔｉｍａｓ５．２（Ｏｐｔｉｍａｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）上で実施する。海馬のＣＡ１およびＣＡ３領域の中央１ｍｍセグメントにおけるニューロンを２００倍の倍率において計数する。ニューロンを核および細胞質の形態により識別し、個々の細胞を正常であるか損傷を受けているかについて計数する。細胞質縮小、好塩基球増加もしくは好酸球増加を有するニューロン、または核細部の損失を有するニューロンを、損傷を受けたものとみなす。計測領域は長さ１ｍｍおよび幅１ｍｍ（セグメントの長軸の両側上で０．５ｍｍ）である。ニューロンの総数および正常と考えられるニューロンの数は、１平方ミリメートル当たりのニューロンとして表現する。
【０１０７】
実施例７
ＰＴＥＮ阻害は、局所性脳虚血の動物モデルにおいて神経再生を促進する
【０１０８】
本試験は、これまでに記載された方法（Ｂｒｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０００）９７：１０５２６−３１）を使用し、局所性脳虚血の動物モデルにおける全身投与されるＰＴＥＮ阻害剤の効果を実証する。体重約２５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットをペントバルビタール［６０ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）］により麻酔する。深部体温は、麻酔の継続時間、ウォーターブランケット（ｗａｔｅｒ ｂｌａｎｋｅｔ）および直腸サーミスタ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用することにより定温器により３７℃において維持する。頸動脈を可視化し、右頸動脈を２つの縫合および切開により閉塞する。右眼窩に隣接する吻側の穿頭孔によりＭＣＡの可視化が可能になり、ＭＣＡを鼻動脈に対して遠位で焼灼する。次いで、動物を定位フレーム上に位置させる。この固定されたＭＣＡ病変を包囲する可逆的虚血領域をもたらすため、微細鉗子により提供される牽引を使用して対側頸動脈を１時間閉塞する。ＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）またはｂｐＶ（ｐｉｃ））の１μｇ／ｍｌ溶液０．５ｍｌまたはビヒクル対照を、可逆的頸動脈閉塞の開始から１時間、１日、５日または１０日において投与する。損傷度を評価するため、動物を１５日後に死亡させ、脳を切除し、ブレインマトリックスデバイス（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用することにより脳全体にわたる厚さ１ｍｍの連続切片を切断する。次いで、各切片を１５４ｍＭのＮａＣｌ中２％の塩化トリフェニルテトラゾリウム（重量／容量）の溶液中で３７℃において３０分間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒド中で分析まで貯蔵する。損傷度の定量は、コンピュータ化画像分析システム（ＭＣＩＤ，Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅ’ｓ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用することにより決定する。これを達成するため、各切片のデジタル画像を得、テトラゾリウム塩が低減しない、すなわち生存不能な組織である領域の輪郭付けにより損傷の区域の境界を示す。壊死が重症で組織が実際に損失し、したがって境界を直接評価することができない場合については、対側の輪郭を使用して損傷した脳の容量を推定する。梗塞の総容量は、厚さ１ｍｍの連続切片の再構成により算出する。
【０１０９】
参考文献
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２．Ｍ．Ｔ．Ｆｉｌｂｉｎ，Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ３６１，１５６５（Ｓｅｐ２９，２００６）．
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１５．Ｎ．Ｂａｒｄｅｅｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１９，１６２（Ｓｅｐ １２，２００２）．
１６．Ｍ．Ｇｒｏｓｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，２１８６（Ｄｅｃ７，２００１）．
１７．Ｊ．Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｍ．Ｊ．Ｗｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｒ．Ｂ．Ｃａｍｐｅｎｏｔ，Ｌ．ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５，１１１３（Ｆｅｂ ２，２００５）．
１８．Ｍ．Ｂａｈｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２３，４８３（Ｏｃｔ，２０００）．
１９．Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ３３，６８９（Ｆｅｂ ２８，２００２）．
２０．Ｉ．Ｓｅｌｌｅｓ−Ｎａｖａｒｒｏ，Ｂ．Ｅｌｌｅｚａｍ，Ｒ．Ｆａｊａｒｄｏ，Ｍ．Ｌａｔｏｕｒ，Ｌ．ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ，Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １６７，２８２（Ｆｅｂ，２００１）．
２１．Ｍ．Ｃｕｌｌｙ，Ｈ．Ｙｏｕ，Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｔ．Ｗ．Ｍａｋ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ６，１８４（Ｍａｒ，２００６）．
２２．Ｄ．Ａ．Ｇｕｅｒｔｉｎ，Ｄ．Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １２，９（Ｊｕｌ，２００７）．
２３．Ｎ．Ｈａｙ，Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８，１９２６（Ａｕｇ １５，２００４）．
２４．Ｊ．Ｌｕｏ，Ｂ．Ｄ．Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｌ．Ｃ．Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ４，２５７（Ｏｃｔ，２００３）．
２５．Ｄ．Ｃ．Ｆｉｎｇａｒ，Ｊ．Ｂｌｅｎｉｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，３１５１（Ａｐｒ １９，２００４）．
２６．Ｄ．Ｈ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１０，１６３（Ｊｕｌ ２６，２００２）．
２７．Ｊ．Ｂｒｕｇａｒｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８，２８９３（Ｄｅｃ １，２００４）．
２８．Ｍ．Ｎ．Ｃｏｒｒａｄｅｔｔｉ，Ｋ．Ｉｎｏｋｉ，Ｋ．Ｌ．Ｇｕａｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０，９７６９（Ｍａｒ １８，２００５）．
２９．Ｊ．Ｈ．Ｒｅｉｌｉｎｇ，Ｅ．Ｈａｆｅｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １８，２８７９（Ｄｅｃ １，２００４）．
３０．Ａ．Ｓｏｆｅｒ，Ｋ．Ｌｅｉ，Ｃ．Ｍ．Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｌ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓｅｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５，５８３４（Ｊｕｌ，２００５）．
３１．Ｄ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｖ．Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｔｈａｎｏｓ，Ｌ．Ｉ．Ｂｅｎｏｗｉｔｚ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４，８７２６（Ｏｃｔ ６，２００４）．
３２．Ｓ．Ａ．Ｂａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２９，３９６（Ｄｅｃ，２００１）．
３３．Ｃ．Ｈ．Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５０，３７７（Ｍａｙ ４，２００６）．
３４．Ｌ．Ｍｅｉｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７，５５４６（Ｍａｙ ２３，２００７）．
３５．Ａ．Ｇａｒａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，１４５７（Ｊｕｎ，２００３）．
３６．Ｋ．Ｉｎｏｋｉ，Ｔ．Ｚｈｕ，Ｋ．Ｌ．Ｇｕａｎ，Ｃｅｌｌ １１５，５７７（Ｎｏｖ ２６，２００３）．
３７．Ｌ．Ｊ．Ｓａｕｃｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５，５６６（Ｊｕｎ，２００３）．
３８．Ａ．Ｒ．Ｔｅｅ，Ｂ．Ｄ．Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｐ．Ｐ．Ｒｏｕｘ，Ｌ．Ｃ．Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｊ．Ｂｌｅｎｉｓ，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １３，１２５９（Ａｕｇ ５，２００３）．
３９．Ｙ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５，５７８（Ｊｕｎ，２００３）．
４０．Ｄ．Ａ．Ｃｒｏｓｓ，Ｄ．Ｒ．Ａｌｅｓｓｉ，Ｐ．Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｃｈ，Ｂ．Ａ．Ｈｅｍｍｉｎｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３７８，７８５（Ｄｅｃ ２１−２８，１９９５）．
４１．Ｗ．Ｙ．Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５２，９８１（Ｄｅｃ ２１，２００６）．
４２．Ｅ．Ｒｏｓｉｖａｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １，７８０（Ｄｅｃ １５，２００６）．
４３．Ｓ．Ｇ．Ｌｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３，１３２８（Ｓｅｐ，２００６）．
４４．Ｋ．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｍ．Ｌｕｏ，Ｓ．Ｈｉｓｈｅｈ，Ａ．Ｒ．Ｈａｒｖｅｙ，Ｑ．Ｃｕｉ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４，１０８０６（Ｄｅｃ １，２００４）．
【０１１０】
上記の実施例および詳細な説明は説明のために提供されるものであり、限定するためのものではない。あたかも個々の各刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように個別に具体的に指示される通り、本明細書において引用される全ての刊行物および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記発明を、理解を明確にする目的のため説明および実施例により、いくらか詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくある種の変更および改変をさらになすことができることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生をインサイチューで促進する方法であって、
（ａ）該ニューロンを該ニューロンにおけるタンパク質翻訳の外因性活性化物質の治療有効量と接触させ、これにより該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生を促進する工程；および
（ｂ）該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生の結果的な促進を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
タンパク質翻訳の活性化物質が：
（ａ）ｍＴＯＲ経路活性化物質；
（ｂ）ＰＴＥＮ阻害剤；
（ｃ）ＴＳＣ１／２阻害剤；
（ｄ）Ａｋｔ活性化物質；
（ｅ）Ｒａｓ／ＭＥＫ経路活性化物質；または
（ｆ）ＰＲＡＳ４０阻害剤
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質翻訳の活性化物質が、
（ａ）カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ））；
（ｂ）ジカリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ））；
（ｃ）カリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ））；または
（ｄ）ジカリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｉｃ））
であるＰＴＥＮ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
病変が外傷性損傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
病変が外傷性脳損傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
病変が卒中に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
病変軸索が視神経内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
病変が急性脊髄損傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
病変軸索が患者の脊髄内に存在し、阻害剤を該患者に鞘内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
軸索が感覚ニューロンのＣＮＳ軸索である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
病変がＣＮＳ変性に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤を静脈内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
阻害剤を鞘内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
阻害剤を経眼投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
阻害剤をニューロンにおいて局所投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
検出工程を軸索再生の間接アッセイにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
検出工程を軸索再生の直接アッセイにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ニューロンが病変していること、ならびに軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病理学的に誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有することを決定する前工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質翻訳の活性化物質がＰＴＥＮ阻害剤であり、病変軸索が視神経内に存在し、該阻害剤を経眼投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病理学的に誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有すると決定された病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生をインサイチューで促進するためのデバイスであって、該ニューロンにおけるタンパク質翻訳の活性化物質の治療有効量の事前に計測された含有量が装填され、請求項１に記載の方法を実施するために具体的に適合されたリザーバーを含むデバイス。
【請求項１】
病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生をインサイチューで促進する方法であって、
（ａ）該ニューロンを該ニューロンにおけるタンパク質翻訳の外因性活性化物質の治療有効量と接触させ、これにより該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生を促進する工程；および
（ｂ）該ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生の結果的な促進を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
タンパク質翻訳の活性化物質が：
（ａ）ｍＴＯＲ経路活性化物質；
（ｂ）ＰＴＥＮ阻害剤；
（ｃ）ＴＳＣ１／２阻害剤；
（ｄ）Ａｋｔ活性化物質；
（ｅ）Ｒａｓ／ＭＥＫ経路活性化物質；または
（ｆ）ＰＲＡＳ４０阻害剤
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質翻訳の活性化物質が、
（ａ）カリウムビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ｂｉｐｙ））；
（ｂ）ジカリウムビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナダート（Ｖ）（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ））；
（ｃ）カリウムビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ））；または
（ｄ）ジカリウムビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナダート（Ｖ）、（ｂｐＶ（ｐｉｃ））
であるＰＴＥＮ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
病変が外傷性損傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
病変が外傷性脳損傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
病変が卒中に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
病変軸索が視神経内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
病変が急性脊髄損傷に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
病変軸索が患者の脊髄内に存在し、阻害剤を該患者に鞘内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
軸索が感覚ニューロンのＣＮＳ軸索である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
病変がＣＮＳ変性に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤を静脈内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
阻害剤を鞘内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
阻害剤を経眼投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
阻害剤をニューロンにおいて局所投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
検出工程を軸索再生の間接アッセイにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
検出工程を軸索再生の直接アッセイにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ニューロンが病変していること、ならびに軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病理学的に誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有することを決定する前工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質翻訳の活性化物質がＰＴＥＮ阻害剤であり、病変軸索が視神経内に存在し、該阻害剤を経眼投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
軸索切断により誘導されたストレスおよび／または病理学的に誘導されたタンパク質翻訳の下方調節を有すると決定された病変成熟中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの生存または該ニューロンにおける軸索再生をインサイチューで促進するためのデバイスであって、該ニューロンにおけるタンパク質翻訳の活性化物質の治療有効量の事前に計測された含有量が装填され、請求項１に記載の方法を実施するために具体的に適合されたリザーバーを含むデバイス。
【公表番号】特表２０１１−５２４３４７（Ｐ２０１１−５２４３４７Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２７２７（Ｐ２０１１−５１２７２７）
【出願日】平成２１年６月６日（２００９．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６５２８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９４３５
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
２．ＰＯＬＡＲＯＩＤ
【出願人】（５９９０８６５８２）チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレイション (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】３００ Ｌｏｎｇｗｏｏｄ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１１５， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月６日（２００９．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６５２８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９４３５
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
２．ＰＯＬＡＲＯＩＤ
【出願人】（５９９０８６５８２）チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレイション (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】３００ Ｌｏｎｇｗｏｏｄ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１１５， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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