チオール基を有する刺激応答性磁性微粒子及びその利用
【課題】チオール基結合物質を効率よく固定化すること。
【解決手段】表面が刺激応答性高分子で修飾された磁性微粒子からなる刺激応答性磁性微粒子であり、該磁性微粒子は、多価アルコールまたはポリアルキレンイミンと、鉄酸化物との複合体であり、該刺激応答性高分子は、熱応答性高分子、ｐＨ応答性高分子または光応答性高分子であり、チオール基を含むことを特徴とする、刺激応答性磁性微粒子を用いてチオール基結合物質を固定化する。
【解決手段】表面が刺激応答性高分子で修飾された磁性微粒子からなる刺激応答性磁性微粒子であり、該磁性微粒子は、多価アルコールまたはポリアルキレンイミンと、鉄酸化物との複合体であり、該刺激応答性高分子は、熱応答性高分子、ｐＨ応答性高分子または光応答性高分子であり、チオール基を含むことを特徴とする、刺激応答性磁性微粒子を用いてチオール基結合物質を固定化する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチオール基を含む刺激応答性磁性微粒子に関する。より詳しくは、チオール基結合物質を効率よく固定化でき、保存安定性にも優れたチオール基を含む刺激応答性磁性微粒子、該微粒子を用いたチオール基結合物質の固定化方法および該微粒子を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
リガンドが固定された微粒子を混合液に添加し、目的物質を吸着した後、微粒子を回収し、目的物質を微粒子から分離、回収する方法が知られている。具体的には、ビオチン及びアビジンから選ばれた１種以上が下限臨界溶液温度（以下、「ＬＣＳＴ」と略す。）を有するポリマーを介して磁性微粒子に固定された熱応答性磁性微粒子と磁石の磁力を用いた生体物質の分離方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
リガンドとしてチオール基を固定した担体は、抗体やチオール基含有化合物等を容易に固相化でき、特に生体高分子や細胞等の分離、回収に有用であると考えられる。しかしながら、チオール基固定化担体は、チオール基の反応性が高いため、保存中にチオール基が酸化されてジスルフィド結合を生成し、抗体やチオール基含有化合物等との反応性が低下するなどの問題があり、現在のところ、チオール基を有する磁性微粒子は知られていない。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／０１６５７１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、チオール基結合物質を効率よく固定化することのできるチオール基含有刺激応答性磁性微粒子、さらには、保存安定性に優れたチオール基含有刺激応答性磁性微粒子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、チオール基を含む刺激応答性磁性微粒子の作製に成功し、さらに、保護基で保護されたチオール基を固定した刺激応答性磁性微粒子は、保存安定性に優れ、抗体やチオール基含有化合物等を容易に固相化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
具体的には、本発明は以下を提供する。
【０００６】
［１］ 表面が刺激応答性高分子で修飾された磁性微粒子からなる刺激応答性磁性微粒子であり、該磁性微粒子は、多価アルコールまたはポリアルキレンイミンと、鉄酸化物との複合体であり、該刺激応答性高分子は、熱応答性高分子、ｐＨ応答性高分子または光応答性高分子であり、チオール基を含むことを特徴とする、刺激応答性磁性微粒子。
［２］ チオール基が、刺激応答性高分子に導入された、前記［１］項記載の刺激応答性磁性微粒子。
［３］ チオール基が、保護基で保護された、前記［２］項記載の刺激応答性磁性微粒子。
［４］ チオールの保護基が、ベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基、またはピリジルスルフィド基である、前記［３］項記載の刺激応答性磁性微粒子。
［５］ 前記［１］〜［４］のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子にチオール基結合物質を接触させる工程を含む、チオール基結合物質の固定化方法。
［６］ 前記［１］〜［４］のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子を含む、チオール基結合物質固定化用キット。
［７］ 前記［１］〜［４］のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子とグルタチオンとが、それぞれのチオール基同士でジスルフィド結合することによって固定化された、グルタチオン固定化磁性微粒子。
［８］ 前記［７］項記載のグルタチオン固定化磁性微粒子を含む、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を精製又は検出するためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、チオール基結合物質を効率よく固定化でき、特に、保護基で保護されたチオール基を固定した刺激応答性磁性微粒子は、保存安定性に優れ、抗体やチオール基含有化合物等を容易に固相化できる。また、本発明の磁性微粒子は刺激応答性であるため、刺激により凝集させた後に磁力により回収することができるので、チオール基結合物質の固定化操作が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【０００９】
（磁性粒子）
本発明で用いる磁性微粒子は微粒子状の磁性物質であり、例えば、多価アルコールと、マグネタイト、フェライト、ヘマタイトおよびゲーサイトなどの鉄酸化物とで構成される磁性微粒子が挙げられる。ここで、多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後、多価アルコール構造体を形成する化合物も多価アルコールとして使用できる。磁性微粒子は、例えば、特開２００５−８２５３８公報に記載の、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法に従って製造することができる。
【００１０】
本発明で用いる磁性微粒子はまた、マグネタイト、フェライト、ヘマタイトおよびゲーサイトなどの鉄酸化物とポリアルキレンイミンとで構成される磁性微粒子であってもよい。
ポリアルキレンイミンとしては、ポリエチレンイミンやポリプロピレンイミンなどが挙げられ、ポリエチレンイミンがより好ましい。ポリアルキレンイミンの数平均分子量は好ましくは６００〜７０，０００である。鉄酸化物とポリアルキレンイミンとの複合体は、水中で鉄酸化物とポリアルキレンイミンを混合することによって得ることができる。ｐＨ３〜６で複合体を形成することが好ましく、ｐＨ４〜５であることがより好ましい。
上記のような多価アルコールやポリアルキレンイミンを用いて調製された磁性微粒子は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的物質の分離効率、精製効率を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。
【００１１】
（刺激応答性高分子）
磁性微粒子の表面を修飾する刺激応答性高分子は、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激応答性高分子としては、熱応答性高分子、ｐＨ応答性高分子または光応答性高分子等が挙げられる。刺激としては、熱応答性高分子の場合であれば温度変化であり、光応答性高分子の場合であれば光の照射であり、ｐＨ応答性高分子の場合であれば酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）である。
【００１２】
特に、本発明では、刺激応答性高分子は、温度変化によって凝集及び分散可能な熱応答性高分子であることが好ましい。なお、熱応答性高分子としては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度を有するポリマー（以下、ＵＣＳＴとも称する）が挙げられる。
【００１３】
本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。
【００１４】
本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。
【００１５】
ここで、下限臨界溶液温度は、次のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。
【００１６】
また、上限臨界溶液温度の場合は、次のように決定する。１℃／分の速度で試料を冷却し、下限臨界溶液温度の場合と同様に５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＵＣＳＴとして求める。
【００１７】
また、本発明では、刺激応答性高分子として、ｐＨ変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性高分子が利用できる。ｐＨ応答性高分子が構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における目的物質の変性等による分離効率、精製効率の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることがさらに好ましい。
【００１８】
このようなｐＨ応答性高分子としては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。
【００１９】
また、本発明では、刺激応答性高分子として、光照射によって凝集及び分散可能な光応答性高分子が利用できる。例えば、スピロランをポリイソプロピルアクリルアミドと結合させることにより、光に応答し、凝集収縮を繰り返すポリマーを得ることができる。
【００２０】
刺激応答性高分子による磁性微粒子の表面修飾は、例えば、刺激応答性高分子を磁性微粒子の表面に反応性官能基を介して結合する方法や、磁性微粒子中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行うことができる（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。
また、磁性微粒子がポリアルキレンイミンと鉄酸化物から構成される場合、刺激応答性高分子による磁性微粒子の表面修飾の方法としては、熱応答性高分子自身の、あるいは熱応答性高分子に導入された反応性の官能基と、ポリアルキレンイミンのイミノ基とを反応させて共有結合を形成させる方法などが挙げられる。
【００２１】
（チオール基の導入）
本発明の磁性微粒子はチオール基を含む。チオール基の含有量は後述のチオール基結合物質を十分量固定化できる量であればよい。チオール基は保護基で保護されていてもよい。保存安定性のためには、保護基で保護されたチオール基を含む刺激応答性磁性微粒子を作製し、使用時に脱保護するかあるいはチオール基を持つ化合物と置換反応させることが好ましい。
チオールの保護基としては、ベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基、ピリジルスルフィド基等が挙げられる。
【００２２】
保護チオール基が導入された刺激応答磁性微粒子の調製法としては以下の方法が挙げら
れる。
＜チオール基が刺激応答性高分子に結合している場合＞
まず、保護チオール基を有する刺激応答性高分子を製造する。
その方法としては、刺激応答性高分子中にチオール基を導入後、チオール基を保護する方法と、刺激応答性高分子中に直接保護チオール基を導入する方法がある。前者の方法としては、システインなどのチオール基を有する化合物と刺激応答性高分子に含まれる反応性の基とを反応させた後に、後述するようなチオール基保護用化合物を用いてチオール基を保護する方法が挙げられる。後者の方法としては、後述するような保護チオール基導入用化合物と刺激応答性高分子に含まれる反応性の官能基とを反応させる方法が挙げられる。
このようにして得られた保護チオール基を有する刺激応答性高分子で磁性微粒子の表面を修飾する。
【００２３】
＜チオール基が磁性微粒子に結合している場合＞
まず、保護チオール基を有する磁性微粒子を製造する。
その方法としては、磁性微粒子中にチオール基を導入後、チオール基を保護する方法と、磁性微粒子中に直接保護チオール基を導入する方法がある。前者の方法としては、刺激応答性磁性微粒子を構成する多価アルコールの水酸基やポリアルキレンイミンのイミノ基、またはこれらの基を介して導入されたアミノ基、カルボキシル基などと、システインなどのチオール基を含有する化合物とを反応させた後に、後述するようなチオール基保護用化合物を用いてチオール基を保護する方法が挙げられる。後者の方法としては、刺激応答性磁性微粒子を構成する多価アルコールの水酸基やポリアルキレンイミンのイミノ基、またはこれらの基を介して導入されたアミノ基、カルボキシル基などと、後述するような保護チオール基導入用化合物とを反応させる方法が挙げられる。
このようにして得られた保護チオール基含有磁性微粒子の表面を刺激応答性高分子で修飾する。
【００２４】
保護チオール基を導入するために用いることのできる化合物の例を以下に示す。
略号 ： 化合物名
H-D-Cys(Acm)-OH・HCl ：S-Acetamidomethyl-D-cysteine hydrochloride
H-Cys(Acm)-OH・HCl ：S-Acetamidomethyl-L-cysteine hydrochloride
H-D-Cys(tBu)-OH・HCl ：S-t-Butyl-D-cysteine hydrochloride
H-Cys(tBu)-OH・HCl ：S-t-Butyl-L-cysteine hydrochloride
H-Cys(Bzl)-OH ：S-Benzyl-L-cysteine
H-D-Cys(Bzl)-OH ：S-Benzyl-D-cysteine
H-Cys(Bzl)-OBzl・p-tosylate
：S-Benzyl-L-cysteine benzyl ester hydrochloride・p-tosylate
H-Cys(Bzl)-OEt・HCl ：S-Benzyl-L-cysteine ethyl ester hydrochloride
H-Cys(Bzl)-OMe・HCl ：S-Benzyl-L-cysteine methyl ester hydrochloride
H-Cys(Bzl)-pNA ：S-Benzyl-L-cysteine-naphthylamide
H-D-Cys(Mbzl)-OH ：S-(4-methyl-benzyl)-L-cysteine
H-Cys(Mob)-OH ：S-(4-methoxy-benzyl)-L-cysteine
H-D-Cys(Mob)-OH ：S-(4-methoxy-benzyl)-D-cysteine
H-Cys(StBu)-OH ：S-tert-butylthio-L-cysteine
H-Cys(SO3H)-OH・sodium salt
：S-sulfo-L-cysteine sodium salt
H-Cys(Trt)-OH ：S-trityl-L-cysteine
H-D-Cys(Trt)-OH ：S-trityl-D-cysteine
H-Cys(Trt)-NH2 ：S-trityl-L-cysteine amide
Ac-Cys(Trt)-OH ：N-Acetyl-S-trityl-L-cysteine
Trt-Cys(Trt)-OH ：N-alpha-S-trityl-L-cysteine
Trt-Cys(Trt)-DEA ：N-alpha-S-Bistrityl-L-cysteine diethylamine
(H-Cys-OH・HCl)2 ：L-システイン塩酸塩の2量体
(H-D-Cys-OH・HCl)2 ：D-システイン塩酸塩の2量体
(H-D-Cys-NH2)2・2HCl ：L-cysteine amideの2量体
(H-Cys-OBt)2・2HCl ：L-cysteine butyl esterの2量体
(H-Cys-OEt)2・2HCl ：L-cysteine Ethyl esterの2量体
(H-Cys-OMe)2・2HCl ：L-cysteine methyl esterの2量体
(H-D-Cys-OMe)2・2HCl ：D-cysteine methyl esterの2量体
(Ac-Cys-OH)2 ：N-Acetyl-L-cysteineの2量体
(Ac-Cys-OMe)2 ：N-Acetyl-L-cysteine methyl esterの2量体
(Ac-D-Cys-OMe)2 ：N-Acetyl-D-cysteine methyl esterの2量体
略号なし ：Palmitoyl-Cys((RS)-2,3-di(pamitoyloxyl)-propyl)-OH
略号なし ：N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate
【００２５】
チオール基を保護するために用いることのできる化合物の例を以下に示す。
略号 ： 化合物名
Bzl-Cl ：ベンジルクロリド
Bzl(OMe)-Cl ：メトキシベンジルクロリド
TosOH・H2O ：トルエンスルホニルクロリド
略号なし ：Pyridine-2-thiol
略号なし ：Ｎ−ヒドロキシメチルアセタミド
ScmCl ：carbomethoxysulfenyl chloride
Nps-Cl ：O-Nitrophenylsulfenyl chloride
Npys-Cl ：3-Nitro-2-pyridinesulfenyl chloride
【００２６】
保護されたチオール基を含む磁性微粒子は、脱保護をした後に、チオール基反応物質を固定化するために使用することができる。脱保護剤は、保護基の種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、ジチオトレイトール（略号ＤＴＴ）、水素化ホウ素ナトリウム、２−メルカプトエタノール、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、２−メルカプトエチルアミン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（略号ＴＣＥＰ）が例示できる。
【００２７】
＜チオール基反応物質の固定化方法＞
本発明のチオール基結合物質の固定化方法は、上記チオール基含有刺激応答性磁性微粒子にチオール基結合物質を接触させる工程を含む。
ここで、チオール基反応物質としては、マレイミド基、チオール基、エポキシ基またはハロゲン化アルキル誘導体などを含む物質が挙げられる。これらの物質としては、低分子化合物でもよいし、タンパク質、核酸、糖鎖などの高分子化合物であってもよい。
タンパク質としては、抗体、酵素、サイトカイン、受容体、転写因子などが挙げられる。
タンパク質として抗体を選択し、これを本発明のチオール基含有刺激応答性磁性微粒子に固定化した場合、得られた抗体固定化磁性微粒子は抗原の検出や精製に使用することができ、診断試薬や研究試薬などとして有用である。抗体を固定化する方法としては、抗体にマレイミド基を導入し、該マレイミド基と本発明の磁性微粒子のチオール基を反応させる方法や、抗体を還元型ＩｇＧにし、還元型ＩｇＧのチオール基と本発明の磁性微粒子のチオール基との間でジスルフィド結合を形成させる方法が挙げられる。
固定化は次のようにして行うことができる。すなわち、本発明のチオール基含有刺激応答性磁性微粒子とチオール基反応物質を混合することにより、磁性微粒子にチオール基反応物質を結合させ、熱などの刺激を加えて磁性微粒子を凝集させ、磁石を用いてチオール
基反応物質が固定化された磁性微粒子を回収する。
【００２８】
本発明はまた、上記チオール基含有刺激応答性磁性微粒子を含む、チオール基結合物質固定化用キットを提供する。該キットは磁性微粒子以外の試薬、例えば、固定化反応用のバッファーや磁性微粒子磁集用の磁石を含んでもよい。また、チオール基が保護されている場合、脱保護剤を含んでもよい。
【００２９】
また、グルタチオン自身のチオール基と本発明の磁性微粒子のチオール基との間でジスルフィド結合を形成させることにより、グルタチオンを本発明の磁性微粒子に固定化することもできる。グルタチオンを固定化した磁性微粒子はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（以下、ＧＳＴ融合タンパク質と略記することがある。）の精製や検出に効率よく使用することができ、研究試薬などとして有用である。グルタチオンを固定化した磁性微粒子を用いたＧＳＴ融合タンパク質の精製は次のようにして行うことができる。すなわち、グルタチオンを固定化した磁性微粒子とＧＳＴ融合タンパク質を含む試料を混合することにより、磁性微粒子にＧＳＴ融合タンパク質を結合させ、熱などの刺激を加えて磁性微粒子を凝集させ、磁石を用いてＧＳＴ融合タンパク質が固定化された微粒子を回収する。洗浄後、遊離のグルタチオンを加えて微粒子からＧＳＴ融合タンパク質を溶出させる。
本発明はまた、上記グルタチオン固定化磁性微粒子を含むＧＳＴ融合タンパク質の精製または検出用キットを提供する。当該キットは他の試薬、例えば、反応や洗浄用のバッファーや磁集用の磁石を含んでもよい。また、ＧＳＴ溶出用のグルタチオンを含んでもよい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されることはない。また、実施例、比較例中における物性の測定方法、用いた材料の組成は以下の通りである。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：アクリルアミド、メチレンビスアクリルアミドから作られた１２．５(Ｗ／ｖ)％のポリアクリルアミドゲルを備えた電気泳動装置を用いて、２０ｍＡの電流で電気泳動を行った。電気泳動を行った後、ポリアクリルアミドゲルを０．５重量％のクーマシーブリリアントブルー溶液に浸すことによって、該ゲル中のタンパク質の染色を行った。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う際に、変性処理を行うが、この処理で目的タンパクは、熱応答性高分子表面修飾磁性粒子から外れる。
熱応答性高分子表面修飾磁性微粒子の平均粒径および粒径分布：大塚電子（株）製ＥＬＳ−８０００ＳＤ型「光散乱光度計」によって測定した。
精製水：ミリポア社製純水製造装置「Direct-QTM」によって精製された導電率１８ＭΩｃｍの水。
ＰＢＳバッファー：１０倍濃度の市販のＰＢＳ（８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍＭ
ＫＨ2ＰＯ4、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ニッポンジーン（株）製）を精製水で１／１０（Ｖ／Ｖ）に希釈して用いた。
【００３１】
＜実施例１＞保護されたチオール基を含む磁性微粒子の製造
アミノ基結合−熱応答性高分子表面修飾磁性粒子として、マグナビート（株）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＡｍ Ａｍｉｎｅ（以下、ＴＭ−ＬＡｍと略記する。水溶液の濃度は０．４重量％）を用いた。ＴＭ−ＬＡｍ ５００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、４２℃に加温し、磁気分離操作を行った後、上清を除去し、ホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、ポリサイエンス社製）０．５ｍＬで溶媒置換し、充分に分散させた。一方で、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）ピロピオネート（略号ＳＰＤＰ、同仁化学研究所製）０．５ｍｇをジメチルスルホキシド１００μＬに溶解させた。２つの溶液を混合し、一晩攪拌した。これにＰＢＳバッファー０．５ｍＬを使用し、磁気回
収による洗浄操作を２回行ない、保護されたチオール基を含む熱応答性磁性微粒子（以下、ＴＭ−ＬＰＤＰと略記する。）を得た。
【００３２】
＜実施例２＞保護されていないチオール基を含む磁性微粒子の製造
カルボキシル基結合−熱応答性高分子表面修飾磁性粒子として、マグナビート（株）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＣ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（以下、ＴＭ−ＬＣと略記する。水溶液の濃度は０．４重量％）を用いた。ＴＭ−ＬＣ ０．５ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、４２℃に加温し、磁気分離操作を行った後、上清を除去し、ホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、ポリサイエンス社製）０．５ｍＬで溶媒置換し、充分に分散させた。一方で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（略号ＷＳＣ、同仁化学研究所製）１ｍｇとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（和光純薬工業（株）製）２ｍｇをホウ酸緩衝液０．２ｍＬに溶解させた。２つの溶液を混合し、２時間反応させた。０．５ｍＬのホウ酸緩衝液で２回洗浄操作し、コハク酸イミド活性化Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘを得た。コハク酸イミド活性化Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ０．５ｍＬと、０．５ｍＬのホウ酸緩衝液にシステイン５０ｍｇを溶解させた溶液とを混合し、一晩攪拌した。これに磁気回収による洗浄操作を２回行い（ＰＢＳバッファー０．５ｍＬを使用）、保護基を有しないチオール基を含む磁性微粒子（以下、ＴＭ−ＬＳＨと略記する。）を得た。
【００３３】
＜実施例３＞（磁性微粒子の分散性安定性の評価）
各チオール基を含む磁性粒子の粒径を測定した。
その結果、出発物質のＴＭ−ＬＡｍの平均粒径は８６ｎｍであったが、ＴＭ−ＬＰＤＰの平均粒径は１０３ｎｍであった。また、ＴＭ−ＬＣの粒径は８５ｎｍであったが、ＴＭ−ＬＳＨの平均粒径は１３２０ｎｍであった。
ＴＭ−ＬＳＨに対して、Ｅｌｍａ社製超音波装置Ｅｌｍａｓｏｎｉｃにより超音波分散を行ったところ、粒径が２６０ｎｍまで小さくなったが、予想される１００ｎｍ程度の粒径には至らなかった。これは、チオール基同士が架橋をしてしまっているために、２６０ｎｍ以下の粒径にはならなかったと考えられる。また、粒径の分布を評価した。その結果、保護基を有しているＴＭ−ＬＰＤＰの粒径分布は、出発物質であるＴＭ−ＬＡｍとほぼ変わらないのに対し（図１（a））、保護基を有していない、ＴＭ−ＬＳＨは、粒径分布が広くなっていることがわかる（図１（ｂ））。
【００３４】
＜実施例４＞（磁性微粒子の保存安定性の評価）
ＴＭ−ＬＰＤＰの粒径は、ＥＬＳ−８０００で粒径測定したところ、調製直後は１０３ｎｍであり、１ヶ月後は１０７ｎｍであり、ほとんど変わっていなかった。これに対して、ＴＭ−ＬＳＨの粒径は、調製直後は２６０ｎｍであったが、1ヶ月後は１０１０ｎｍとなってしまい、経時変化が生じていた。
以上より、保護されたチオール基を含む磁性微粒子は、保護基を有しないＳＨ基を含む磁性微粒子と比較して保存安定性に優れることが示された。
【００３５】
＜実施例５＞チオール基を含む磁性微粒子への抗体の結合実験（マレイミド標識抗体との反応）
（マレイミド標識抗体の調製）
ヒト甲状腺刺激ホルモン（略号ＴＳＨ）のβサブユニットに対する抗体（クローン：１５５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．製）１ｍＬを透析膜（Bio-Tech International,Inc.製：分画分子量 ８，０００）に入れ、２００ｍＬのＰＢＳバッファーが入った微量透析装置（Bio-Tech International,Inc.製）中で４℃、３時間透析を行った。２ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ（同仁化学（株）製）を１ｍＬのＰＢＳバッファーに溶解した（５ｍＭ ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ）。透析した抗体４００μＬと５ｍＭ ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳを混合し、Ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ
ＳＩ−３００（ＡＳ ＯＮＥ（株）製）を用いて３０℃、３０分間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。２本のＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５(ＧＥヘルスケア製)をそれぞれＰＢＳバッファー２０ｍＬで平衡化した。１本の平衡化したＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５を２５℃、１０００×ｇ、２分間遠心処理した後に抗体４００μＬを添加し、２５℃、１０００×ｇ、２分間遠心処理した。再度、この操作を繰り返した。これによりマレイミド標識抗体が得られた。
【００３６】
（還元ＴＭ−ＬＰＤＰの調製）
Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＰＤＰ（０．４ｗ/ｖ％）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、０．５Ｍ ＥＤＴＡ(ｐＨ８)（ニッポンジーン（株）製）を２μＬ添加し、混合した。さらに２００ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール、和光純薬工業（株）製）５μＬを添加、混合した後、２５℃で３０分間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。反応終了後、４２℃の恒温槽（ＡＳ ＯＮＥ（株）製）でマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＰＤＰを凝集させ、２分間、磁石（ＭＡＮＧＮＡＳＴＡＮＤ−８（商品名）、マグナビート（株）製）で磁気回収し、上清を除去した。
このマイクロチューブに、１０ｍＭ ＥＤＴＡ含むＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。再度マイクロチューブを４２℃の恒温槽で２分間加熱後、２分間、上記磁石で磁気回収し、上清を除去した。このマイクロチューブに、１０ｍＭ ＥＤＴＡ含むＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させ、還元ＴＭ−ＬＰＤＰを得た。
【００３７】
（還元ＴＭ−ＬＰＤＰとマレイミド標識抗体の反応）
上記で調製した還元ＴＭ−ＬＰＤＰ１００μＬ入りのマイクロチューブにマレイミド標識抗体を１５μＬ加え、４℃、１２時間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。４２℃の恒温槽で、このマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＰＤＰを凝集させ、２分間、上記磁石で磁気回収し、上清を除去した。
このマイクロチューブにＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。これに磁気回収による洗浄操作を２回行い（ＰＢＳバッファー０．５ｍＬを使用）、未反応の抗体を除去した。ＴＭ−ＬＰＤＰへの抗体の結合はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図２レーン１）。
【００３８】
＜実施例６＞
保護されたチオール基を含む磁性微粒子への抗体の結合実験（還元抗体との反応）
（還元ＩｇＧの調製）
ヒト甲状腺刺激ホルモン（略号ＴＳＨ）のβサブユニットに対する抗体（クローン：１５５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．製）１ｍＬを透析膜（Bio-Tech International,Inc.製：分画分子量 ８，０００）に入れ、２００ｍＬのＰＢＳバッファーが入った微量透析装置（Bio-Tech International,Inc.製）中で４℃、３時間透析を行った。
４０ｍｇの２−メルカプトエチルアミン（略号２−ＭＥＡ、和光純薬（株）製）を１ｍＬのＰＢＳバッファーに溶解した（３５０ｍＭ）。透析した抗体４００μＬへ３５０ｍＭ
２−ＭＥＡを１０μＬ添加し、Ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ＳＩ−３００ (ＡＳ ＯＮＥ（株）製)を用いて、３７℃ 、１．５時間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。
２本のＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５(ＧＥヘルスケア製)をＰＢＳバッファー２０ｍＬで平衡化した。１本の平衡化したＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５を２５℃、１０００×ｇ、２分間遠心処理した。遠心処理したＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５に抗体４００μＬを添加し、２５℃、１０００×ｇ、２分間遠心処理した。再度もう１本の平衡化したＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５で抗体 ４００ μＬを遠心処理した。これにより、還元ＩｇＧが得られた。
【００３９】
（ＴＭ−ＬＰＤＰと還元ＩｇＧの反応）
ＴＭ−ＬＰＤＰ（０．４ｗ/ｖ％）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）（ニッポンジーン（株）製）２μＬを添加し、混合した。調製した還元ＩｇＧを１５μＬ加え、４℃、１２時間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。反応終了後、４２℃の恒温槽でマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＰＤＰを凝集させ、２分間、磁石で磁気回収し、上清を除去した。このマイクロチューブにＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。ＰＢＳバッファー１００μＬで、磁気回収し、洗浄を２回行うことで、未反応の抗体を除去した。ＴＭ−ＬＰＤＰへの抗体の結合はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図２のレーン２）。
以上より、保護されたチオール基を含む磁性微粒子を用いると、抗体を容易に固定化できることがわかった。
【００４０】
＜実施例７＞（ＳＨ基を持つ低分子化合物との反応）
（ＴＭ−ＬＰＤＰとグルタチオンとの反応）
ＴＭ−ＬＰＤＰ（０．４ｗ/ｖ％）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、そこに還元型グルタチオン（以下、ＧＳＨと略記する。和光純薬工業（株）製）２ｍｇを含むＰＢＳバッファー１００μＬ溶液を加え、一晩反応させた。４２℃の恒温槽でマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＰＤＰを凝集させ、２分間、磁石で磁気回収し、上清を除去した。このマイクロチューブにＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。これに磁気回収による洗浄操作を２回行ない（ＰＢＳバッファー１００μＬを使用）、未反応のＧＳＨを除去し、Ｔｈｅｒｍａ−ＭａｘにＧＳＨを導入したＴＭ−ＬＧＳＨを調製した（図３）。
【００４１】
（機能評価）
（ＴＭ−ＬＧＳＨと、ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの略号）との反応）（図４）
ＴＭ−ＬＧＳＨ１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、ＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−６Ｈｉｓ ｔａｇｇｅｄ（１μｇ／μＬ）（以下、ＧＳＴ−Ｈｉｓとする。Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を５μＬ加え、室温で３０分インキュベートした。その後、４２℃の恒温槽でマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＧＳＨを凝集させ、２分間、磁石で磁気回収し、上清を除去した。このマイクロチューブにＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。ＰＢＳバッファー１００μＬで洗浄を２回行うことで、未反応のＧＳＴ−Ｈｉｓを除去した。
また、比較としてＧＳＴ融合タンパク質ではないストレプトアビジンを用いて、同様の実験を行った。ＴＭ−ＬＧＳＴへのＧＳＴ−Ｈｉｓの結合はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図５のレーン２）。その結果、ＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−ＨｉｓはＴＭ−ＬＧＳＴのペレットにバンドが濃く出るが（図５レーン３）、ＧＳＴ融合タンパク質ではないストレプトアビジンではペレットにはバンドがなく、上清にバンドが濃く現れた（図５レーン５、６）。以上の結果より、ＴＭ−ＬＧＳＨは特異的にＧＳＴ融合タンパクと結合することが示された。
【００４２】
参考例：コアがポリエチレンイミンとマグネタイトで構成される熱応答性磁性微粒子の調製
（マグネタイトの調製）
２００ｍＬ容のフラスコに、塩化第二鉄・六水和物（１．０ｍｏｌ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．５ｍｏｌ）混合水溶液を１００ｍＬ入れ、メカニカルスターラーで攪拌し、この混合溶液を５０℃に昇温した後、これに２８重量％アンモニア水溶液５．０ｍＬを滴下し、１時間攪拌した。この操作で、平均粒径が約５ｎｍのマグネタイトが得られた。
【００４３】
（マグネタイト−ポリエチレンイミン複合体の調製）
１０重量％マグネタイト水溶液１０ｍＬとポリエチレンイミン５ｇを混合し、超音波処理をしながら、氷浴中で１時間分散処理をした。磁気分離により、過剰なポリエチレンイミンを除去した。１０ｍＬの精製水を添加し再分散後、１ｍＭ 塩酸水溶液で分散液のｐＨを４にすることで、平均粒径が約７０ｎｍのマグネタイト−ポリエチレンイミン複合体を得た。
【００４４】
(熱応答性磁性微粒子の調製)
マグネタイト−ポリエチレンイミン複合体３００ｍｇを１００ｍＭ ＭＥＳバッファー（ＭＥＳ：2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Acid、ｐＨ４．７５）３０ｍＬに分散させた（分散液）。この分散液を超音波により、マグネタイト−ポリエチレンイミン複合体の平均粒径が約７０ｎｍになるように処理した。また、一方でポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリル酸共重合体１００ｍｇを、１００ｍＭ ＭＥＳバッファー１０ｍＬに溶解し、そこへ、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride １００ｍｇを添加し、３０分間反応させた（ポリマー液）。その後、分散液とポリマー液とを混合し、６時間、反応させた後、精製水により２回洗浄を行い、アミノ基を含む熱応答性磁性微粒子を得た。
熱応答性磁性微粒子のアミノ基にチオール基または保護チオール基を含む化合物を反応させることにより、チオール基または保護チオール基を含む、コアがポリエチレンイミンとマグネタイトで構成された熱応答性磁性微粒子を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】磁性微粒子の分散安定性（粒径分布）を示す図。（ａ）がＴＭ−ＬＡｍおよびＴＭ−ＬＰＤＰを示し、（ｂ）がＴＭ−ＬＣ、ＴＭ−ＬＳＨおよび超音波処理後のＴＭ−ＬＳＨを示す。
【図２】ＴＭ−ＬＰＤＰへの抗体の結合を示す図（写真）。レーン１がマレイミド標識抗体、レーン２が還元ＩｇＧを示す。
【図３】保護チオール基を含む磁性微粒子（ＴＭ−ＬＰＤＰ）を用いて、グルタチオンを導入する反応の模式図。
【図４】ＴＭ−ＬＧＳＨとＧＳＴ融合タンパク質との反応の模式図。
【図５】ＧＳＴ融合タンパク質またはストレプトアビジン（対照）の、ＴＭ−ＬＧＳＨへの結合実験の結果を示す図（写真）。
【技術分野】
【０００１】
本発明はチオール基を含む刺激応答性磁性微粒子に関する。より詳しくは、チオール基結合物質を効率よく固定化でき、保存安定性にも優れたチオール基を含む刺激応答性磁性微粒子、該微粒子を用いたチオール基結合物質の固定化方法および該微粒子を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
リガンドが固定された微粒子を混合液に添加し、目的物質を吸着した後、微粒子を回収し、目的物質を微粒子から分離、回収する方法が知られている。具体的には、ビオチン及びアビジンから選ばれた１種以上が下限臨界溶液温度（以下、「ＬＣＳＴ」と略す。）を有するポリマーを介して磁性微粒子に固定された熱応答性磁性微粒子と磁石の磁力を用いた生体物質の分離方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
リガンドとしてチオール基を固定した担体は、抗体やチオール基含有化合物等を容易に固相化でき、特に生体高分子や細胞等の分離、回収に有用であると考えられる。しかしながら、チオール基固定化担体は、チオール基の反応性が高いため、保存中にチオール基が酸化されてジスルフィド結合を生成し、抗体やチオール基含有化合物等との反応性が低下するなどの問題があり、現在のところ、チオール基を有する磁性微粒子は知られていない。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／０１６５７１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、チオール基結合物質を効率よく固定化することのできるチオール基含有刺激応答性磁性微粒子、さらには、保存安定性に優れたチオール基含有刺激応答性磁性微粒子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、チオール基を含む刺激応答性磁性微粒子の作製に成功し、さらに、保護基で保護されたチオール基を固定した刺激応答性磁性微粒子は、保存安定性に優れ、抗体やチオール基含有化合物等を容易に固相化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
具体的には、本発明は以下を提供する。
【０００６】
［１］ 表面が刺激応答性高分子で修飾された磁性微粒子からなる刺激応答性磁性微粒子であり、該磁性微粒子は、多価アルコールまたはポリアルキレンイミンと、鉄酸化物との複合体であり、該刺激応答性高分子は、熱応答性高分子、ｐＨ応答性高分子または光応答性高分子であり、チオール基を含むことを特徴とする、刺激応答性磁性微粒子。
［２］ チオール基が、刺激応答性高分子に導入された、前記［１］項記載の刺激応答性磁性微粒子。
［３］ チオール基が、保護基で保護された、前記［２］項記載の刺激応答性磁性微粒子。
［４］ チオールの保護基が、ベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基、またはピリジルスルフィド基である、前記［３］項記載の刺激応答性磁性微粒子。
［５］ 前記［１］〜［４］のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子にチオール基結合物質を接触させる工程を含む、チオール基結合物質の固定化方法。
［６］ 前記［１］〜［４］のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子を含む、チオール基結合物質固定化用キット。
［７］ 前記［１］〜［４］のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子とグルタチオンとが、それぞれのチオール基同士でジスルフィド結合することによって固定化された、グルタチオン固定化磁性微粒子。
［８］ 前記［７］項記載のグルタチオン固定化磁性微粒子を含む、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を精製又は検出するためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、チオール基結合物質を効率よく固定化でき、特に、保護基で保護されたチオール基を固定した刺激応答性磁性微粒子は、保存安定性に優れ、抗体やチオール基含有化合物等を容易に固相化できる。また、本発明の磁性微粒子は刺激応答性であるため、刺激により凝集させた後に磁力により回収することができるので、チオール基結合物質の固定化操作が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【０００９】
（磁性粒子）
本発明で用いる磁性微粒子は微粒子状の磁性物質であり、例えば、多価アルコールと、マグネタイト、フェライト、ヘマタイトおよびゲーサイトなどの鉄酸化物とで構成される磁性微粒子が挙げられる。ここで、多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後、多価アルコール構造体を形成する化合物も多価アルコールとして使用できる。磁性微粒子は、例えば、特開２００５−８２５３８公報に記載の、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法に従って製造することができる。
【００１０】
本発明で用いる磁性微粒子はまた、マグネタイト、フェライト、ヘマタイトおよびゲーサイトなどの鉄酸化物とポリアルキレンイミンとで構成される磁性微粒子であってもよい。
ポリアルキレンイミンとしては、ポリエチレンイミンやポリプロピレンイミンなどが挙げられ、ポリエチレンイミンがより好ましい。ポリアルキレンイミンの数平均分子量は好ましくは６００〜７０，０００である。鉄酸化物とポリアルキレンイミンとの複合体は、水中で鉄酸化物とポリアルキレンイミンを混合することによって得ることができる。ｐＨ３〜６で複合体を形成することが好ましく、ｐＨ４〜５であることがより好ましい。
上記のような多価アルコールやポリアルキレンイミンを用いて調製された磁性微粒子は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的物質の分離効率、精製効率を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。
【００１１】
（刺激応答性高分子）
磁性微粒子の表面を修飾する刺激応答性高分子は、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激応答性高分子としては、熱応答性高分子、ｐＨ応答性高分子または光応答性高分子等が挙げられる。刺激としては、熱応答性高分子の場合であれば温度変化であり、光応答性高分子の場合であれば光の照射であり、ｐＨ応答性高分子の場合であれば酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）である。
【００１２】
特に、本発明では、刺激応答性高分子は、温度変化によって凝集及び分散可能な熱応答性高分子であることが好ましい。なお、熱応答性高分子としては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度を有するポリマー（以下、ＵＣＳＴとも称する）が挙げられる。
【００１３】
本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。
【００１４】
本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。
【００１５】
ここで、下限臨界溶液温度は、次のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。
【００１６】
また、上限臨界溶液温度の場合は、次のように決定する。１℃／分の速度で試料を冷却し、下限臨界溶液温度の場合と同様に５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＵＣＳＴとして求める。
【００１７】
また、本発明では、刺激応答性高分子として、ｐＨ変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性高分子が利用できる。ｐＨ応答性高分子が構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における目的物質の変性等による分離効率、精製効率の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることがさらに好ましい。
【００１８】
このようなｐＨ応答性高分子としては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。
【００１９】
また、本発明では、刺激応答性高分子として、光照射によって凝集及び分散可能な光応答性高分子が利用できる。例えば、スピロランをポリイソプロピルアクリルアミドと結合させることにより、光に応答し、凝集収縮を繰り返すポリマーを得ることができる。
【００２０】
刺激応答性高分子による磁性微粒子の表面修飾は、例えば、刺激応答性高分子を磁性微粒子の表面に反応性官能基を介して結合する方法や、磁性微粒子中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行うことができる（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。
また、磁性微粒子がポリアルキレンイミンと鉄酸化物から構成される場合、刺激応答性高分子による磁性微粒子の表面修飾の方法としては、熱応答性高分子自身の、あるいは熱応答性高分子に導入された反応性の官能基と、ポリアルキレンイミンのイミノ基とを反応させて共有結合を形成させる方法などが挙げられる。
【００２１】
（チオール基の導入）
本発明の磁性微粒子はチオール基を含む。チオール基の含有量は後述のチオール基結合物質を十分量固定化できる量であればよい。チオール基は保護基で保護されていてもよい。保存安定性のためには、保護基で保護されたチオール基を含む刺激応答性磁性微粒子を作製し、使用時に脱保護するかあるいはチオール基を持つ化合物と置換反応させることが好ましい。
チオールの保護基としては、ベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基、ピリジルスルフィド基等が挙げられる。
【００２２】
保護チオール基が導入された刺激応答磁性微粒子の調製法としては以下の方法が挙げら
れる。
＜チオール基が刺激応答性高分子に結合している場合＞
まず、保護チオール基を有する刺激応答性高分子を製造する。
その方法としては、刺激応答性高分子中にチオール基を導入後、チオール基を保護する方法と、刺激応答性高分子中に直接保護チオール基を導入する方法がある。前者の方法としては、システインなどのチオール基を有する化合物と刺激応答性高分子に含まれる反応性の基とを反応させた後に、後述するようなチオール基保護用化合物を用いてチオール基を保護する方法が挙げられる。後者の方法としては、後述するような保護チオール基導入用化合物と刺激応答性高分子に含まれる反応性の官能基とを反応させる方法が挙げられる。
このようにして得られた保護チオール基を有する刺激応答性高分子で磁性微粒子の表面を修飾する。
【００２３】
＜チオール基が磁性微粒子に結合している場合＞
まず、保護チオール基を有する磁性微粒子を製造する。
その方法としては、磁性微粒子中にチオール基を導入後、チオール基を保護する方法と、磁性微粒子中に直接保護チオール基を導入する方法がある。前者の方法としては、刺激応答性磁性微粒子を構成する多価アルコールの水酸基やポリアルキレンイミンのイミノ基、またはこれらの基を介して導入されたアミノ基、カルボキシル基などと、システインなどのチオール基を含有する化合物とを反応させた後に、後述するようなチオール基保護用化合物を用いてチオール基を保護する方法が挙げられる。後者の方法としては、刺激応答性磁性微粒子を構成する多価アルコールの水酸基やポリアルキレンイミンのイミノ基、またはこれらの基を介して導入されたアミノ基、カルボキシル基などと、後述するような保護チオール基導入用化合物とを反応させる方法が挙げられる。
このようにして得られた保護チオール基含有磁性微粒子の表面を刺激応答性高分子で修飾する。
【００２４】
保護チオール基を導入するために用いることのできる化合物の例を以下に示す。
略号 ： 化合物名
H-D-Cys(Acm)-OH・HCl ：S-Acetamidomethyl-D-cysteine hydrochloride
H-Cys(Acm)-OH・HCl ：S-Acetamidomethyl-L-cysteine hydrochloride
H-D-Cys(tBu)-OH・HCl ：S-t-Butyl-D-cysteine hydrochloride
H-Cys(tBu)-OH・HCl ：S-t-Butyl-L-cysteine hydrochloride
H-Cys(Bzl)-OH ：S-Benzyl-L-cysteine
H-D-Cys(Bzl)-OH ：S-Benzyl-D-cysteine
H-Cys(Bzl)-OBzl・p-tosylate
：S-Benzyl-L-cysteine benzyl ester hydrochloride・p-tosylate
H-Cys(Bzl)-OEt・HCl ：S-Benzyl-L-cysteine ethyl ester hydrochloride
H-Cys(Bzl)-OMe・HCl ：S-Benzyl-L-cysteine methyl ester hydrochloride
H-Cys(Bzl)-pNA ：S-Benzyl-L-cysteine-naphthylamide
H-D-Cys(Mbzl)-OH ：S-(4-methyl-benzyl)-L-cysteine
H-Cys(Mob)-OH ：S-(4-methoxy-benzyl)-L-cysteine
H-D-Cys(Mob)-OH ：S-(4-methoxy-benzyl)-D-cysteine
H-Cys(StBu)-OH ：S-tert-butylthio-L-cysteine
H-Cys(SO3H)-OH・sodium salt
：S-sulfo-L-cysteine sodium salt
H-Cys(Trt)-OH ：S-trityl-L-cysteine
H-D-Cys(Trt)-OH ：S-trityl-D-cysteine
H-Cys(Trt)-NH2 ：S-trityl-L-cysteine amide
Ac-Cys(Trt)-OH ：N-Acetyl-S-trityl-L-cysteine
Trt-Cys(Trt)-OH ：N-alpha-S-trityl-L-cysteine
Trt-Cys(Trt)-DEA ：N-alpha-S-Bistrityl-L-cysteine diethylamine
(H-Cys-OH・HCl)2 ：L-システイン塩酸塩の2量体
(H-D-Cys-OH・HCl)2 ：D-システイン塩酸塩の2量体
(H-D-Cys-NH2)2・2HCl ：L-cysteine amideの2量体
(H-Cys-OBt)2・2HCl ：L-cysteine butyl esterの2量体
(H-Cys-OEt)2・2HCl ：L-cysteine Ethyl esterの2量体
(H-Cys-OMe)2・2HCl ：L-cysteine methyl esterの2量体
(H-D-Cys-OMe)2・2HCl ：D-cysteine methyl esterの2量体
(Ac-Cys-OH)2 ：N-Acetyl-L-cysteineの2量体
(Ac-Cys-OMe)2 ：N-Acetyl-L-cysteine methyl esterの2量体
(Ac-D-Cys-OMe)2 ：N-Acetyl-D-cysteine methyl esterの2量体
略号なし ：Palmitoyl-Cys((RS)-2,3-di(pamitoyloxyl)-propyl)-OH
略号なし ：N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate
【００２５】
チオール基を保護するために用いることのできる化合物の例を以下に示す。
略号 ： 化合物名
Bzl-Cl ：ベンジルクロリド
Bzl(OMe)-Cl ：メトキシベンジルクロリド
TosOH・H2O ：トルエンスルホニルクロリド
略号なし ：Pyridine-2-thiol
略号なし ：Ｎ−ヒドロキシメチルアセタミド
ScmCl ：carbomethoxysulfenyl chloride
Nps-Cl ：O-Nitrophenylsulfenyl chloride
Npys-Cl ：3-Nitro-2-pyridinesulfenyl chloride
【００２６】
保護されたチオール基を含む磁性微粒子は、脱保護をした後に、チオール基反応物質を固定化するために使用することができる。脱保護剤は、保護基の種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、ジチオトレイトール（略号ＤＴＴ）、水素化ホウ素ナトリウム、２−メルカプトエタノール、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、２−メルカプトエチルアミン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（略号ＴＣＥＰ）が例示できる。
【００２７】
＜チオール基反応物質の固定化方法＞
本発明のチオール基結合物質の固定化方法は、上記チオール基含有刺激応答性磁性微粒子にチオール基結合物質を接触させる工程を含む。
ここで、チオール基反応物質としては、マレイミド基、チオール基、エポキシ基またはハロゲン化アルキル誘導体などを含む物質が挙げられる。これらの物質としては、低分子化合物でもよいし、タンパク質、核酸、糖鎖などの高分子化合物であってもよい。
タンパク質としては、抗体、酵素、サイトカイン、受容体、転写因子などが挙げられる。
タンパク質として抗体を選択し、これを本発明のチオール基含有刺激応答性磁性微粒子に固定化した場合、得られた抗体固定化磁性微粒子は抗原の検出や精製に使用することができ、診断試薬や研究試薬などとして有用である。抗体を固定化する方法としては、抗体にマレイミド基を導入し、該マレイミド基と本発明の磁性微粒子のチオール基を反応させる方法や、抗体を還元型ＩｇＧにし、還元型ＩｇＧのチオール基と本発明の磁性微粒子のチオール基との間でジスルフィド結合を形成させる方法が挙げられる。
固定化は次のようにして行うことができる。すなわち、本発明のチオール基含有刺激応答性磁性微粒子とチオール基反応物質を混合することにより、磁性微粒子にチオール基反応物質を結合させ、熱などの刺激を加えて磁性微粒子を凝集させ、磁石を用いてチオール
基反応物質が固定化された磁性微粒子を回収する。
【００２８】
本発明はまた、上記チオール基含有刺激応答性磁性微粒子を含む、チオール基結合物質固定化用キットを提供する。該キットは磁性微粒子以外の試薬、例えば、固定化反応用のバッファーや磁性微粒子磁集用の磁石を含んでもよい。また、チオール基が保護されている場合、脱保護剤を含んでもよい。
【００２９】
また、グルタチオン自身のチオール基と本発明の磁性微粒子のチオール基との間でジスルフィド結合を形成させることにより、グルタチオンを本発明の磁性微粒子に固定化することもできる。グルタチオンを固定化した磁性微粒子はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（以下、ＧＳＴ融合タンパク質と略記することがある。）の精製や検出に効率よく使用することができ、研究試薬などとして有用である。グルタチオンを固定化した磁性微粒子を用いたＧＳＴ融合タンパク質の精製は次のようにして行うことができる。すなわち、グルタチオンを固定化した磁性微粒子とＧＳＴ融合タンパク質を含む試料を混合することにより、磁性微粒子にＧＳＴ融合タンパク質を結合させ、熱などの刺激を加えて磁性微粒子を凝集させ、磁石を用いてＧＳＴ融合タンパク質が固定化された微粒子を回収する。洗浄後、遊離のグルタチオンを加えて微粒子からＧＳＴ融合タンパク質を溶出させる。
本発明はまた、上記グルタチオン固定化磁性微粒子を含むＧＳＴ融合タンパク質の精製または検出用キットを提供する。当該キットは他の試薬、例えば、反応や洗浄用のバッファーや磁集用の磁石を含んでもよい。また、ＧＳＴ溶出用のグルタチオンを含んでもよい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されることはない。また、実施例、比較例中における物性の測定方法、用いた材料の組成は以下の通りである。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：アクリルアミド、メチレンビスアクリルアミドから作られた１２．５(Ｗ／ｖ)％のポリアクリルアミドゲルを備えた電気泳動装置を用いて、２０ｍＡの電流で電気泳動を行った。電気泳動を行った後、ポリアクリルアミドゲルを０．５重量％のクーマシーブリリアントブルー溶液に浸すことによって、該ゲル中のタンパク質の染色を行った。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う際に、変性処理を行うが、この処理で目的タンパクは、熱応答性高分子表面修飾磁性粒子から外れる。
熱応答性高分子表面修飾磁性微粒子の平均粒径および粒径分布：大塚電子（株）製ＥＬＳ−８０００ＳＤ型「光散乱光度計」によって測定した。
精製水：ミリポア社製純水製造装置「Direct-QTM」によって精製された導電率１８ＭΩｃｍの水。
ＰＢＳバッファー：１０倍濃度の市販のＰＢＳ（８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｍＭ
ＫＨ2ＰＯ4、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ニッポンジーン（株）製）を精製水で１／１０（Ｖ／Ｖ）に希釈して用いた。
【００３１】
＜実施例１＞保護されたチオール基を含む磁性微粒子の製造
アミノ基結合−熱応答性高分子表面修飾磁性粒子として、マグナビート（株）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＡｍ Ａｍｉｎｅ（以下、ＴＭ−ＬＡｍと略記する。水溶液の濃度は０．４重量％）を用いた。ＴＭ−ＬＡｍ ５００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、４２℃に加温し、磁気分離操作を行った後、上清を除去し、ホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、ポリサイエンス社製）０．５ｍＬで溶媒置換し、充分に分散させた。一方で、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）ピロピオネート（略号ＳＰＤＰ、同仁化学研究所製）０．５ｍｇをジメチルスルホキシド１００μＬに溶解させた。２つの溶液を混合し、一晩攪拌した。これにＰＢＳバッファー０．５ｍＬを使用し、磁気回
収による洗浄操作を２回行ない、保護されたチオール基を含む熱応答性磁性微粒子（以下、ＴＭ−ＬＰＤＰと略記する。）を得た。
【００３２】
＜実施例２＞保護されていないチオール基を含む磁性微粒子の製造
カルボキシル基結合−熱応答性高分子表面修飾磁性粒子として、マグナビート（株）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＣ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ（以下、ＴＭ−ＬＣと略記する。水溶液の濃度は０．４重量％）を用いた。ＴＭ−ＬＣ ０．５ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、４２℃に加温し、磁気分離操作を行った後、上清を除去し、ホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、ポリサイエンス社製）０．５ｍＬで溶媒置換し、充分に分散させた。一方で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（略号ＷＳＣ、同仁化学研究所製）１ｍｇとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（和光純薬工業（株）製）２ｍｇをホウ酸緩衝液０．２ｍＬに溶解させた。２つの溶液を混合し、２時間反応させた。０．５ｍＬのホウ酸緩衝液で２回洗浄操作し、コハク酸イミド活性化Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘを得た。コハク酸イミド活性化Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ０．５ｍＬと、０．５ｍＬのホウ酸緩衝液にシステイン５０ｍｇを溶解させた溶液とを混合し、一晩攪拌した。これに磁気回収による洗浄操作を２回行い（ＰＢＳバッファー０．５ｍＬを使用）、保護基を有しないチオール基を含む磁性微粒子（以下、ＴＭ−ＬＳＨと略記する。）を得た。
【００３３】
＜実施例３＞（磁性微粒子の分散性安定性の評価）
各チオール基を含む磁性粒子の粒径を測定した。
その結果、出発物質のＴＭ−ＬＡｍの平均粒径は８６ｎｍであったが、ＴＭ−ＬＰＤＰの平均粒径は１０３ｎｍであった。また、ＴＭ−ＬＣの粒径は８５ｎｍであったが、ＴＭ−ＬＳＨの平均粒径は１３２０ｎｍであった。
ＴＭ−ＬＳＨに対して、Ｅｌｍａ社製超音波装置Ｅｌｍａｓｏｎｉｃにより超音波分散を行ったところ、粒径が２６０ｎｍまで小さくなったが、予想される１００ｎｍ程度の粒径には至らなかった。これは、チオール基同士が架橋をしてしまっているために、２６０ｎｍ以下の粒径にはならなかったと考えられる。また、粒径の分布を評価した。その結果、保護基を有しているＴＭ−ＬＰＤＰの粒径分布は、出発物質であるＴＭ−ＬＡｍとほぼ変わらないのに対し（図１（a））、保護基を有していない、ＴＭ−ＬＳＨは、粒径分布が広くなっていることがわかる（図１（ｂ））。
【００３４】
＜実施例４＞（磁性微粒子の保存安定性の評価）
ＴＭ−ＬＰＤＰの粒径は、ＥＬＳ−８０００で粒径測定したところ、調製直後は１０３ｎｍであり、１ヶ月後は１０７ｎｍであり、ほとんど変わっていなかった。これに対して、ＴＭ−ＬＳＨの粒径は、調製直後は２６０ｎｍであったが、1ヶ月後は１０１０ｎｍとなってしまい、経時変化が生じていた。
以上より、保護されたチオール基を含む磁性微粒子は、保護基を有しないＳＨ基を含む磁性微粒子と比較して保存安定性に優れることが示された。
【００３５】
＜実施例５＞チオール基を含む磁性微粒子への抗体の結合実験（マレイミド標識抗体との反応）
（マレイミド標識抗体の調製）
ヒト甲状腺刺激ホルモン（略号ＴＳＨ）のβサブユニットに対する抗体（クローン：１５５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．製）１ｍＬを透析膜（Bio-Tech International,Inc.製：分画分子量 ８，０００）に入れ、２００ｍＬのＰＢＳバッファーが入った微量透析装置（Bio-Tech International,Inc.製）中で４℃、３時間透析を行った。２ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ（同仁化学（株）製）を１ｍＬのＰＢＳバッファーに溶解した（５ｍＭ ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ）。透析した抗体４００μＬと５ｍＭ ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳを混合し、Ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ
ＳＩ−３００（ＡＳ ＯＮＥ（株）製）を用いて３０℃、３０分間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。２本のＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５(ＧＥヘルスケア製)をそれぞれＰＢＳバッファー２０ｍＬで平衡化した。１本の平衡化したＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５を２５℃、１０００×ｇ、２分間遠心処理した後に抗体４００μＬを添加し、２５℃、１０００×ｇ、２分間遠心処理した。再度、この操作を繰り返した。これによりマレイミド標識抗体が得られた。
【００３６】
（還元ＴＭ−ＬＰＤＰの調製）
Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＰＤＰ（０．４ｗ/ｖ％）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、０．５Ｍ ＥＤＴＡ(ｐＨ８)（ニッポンジーン（株）製）を２μＬ添加し、混合した。さらに２００ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール、和光純薬工業（株）製）５μＬを添加、混合した後、２５℃で３０分間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。反応終了後、４２℃の恒温槽（ＡＳ ＯＮＥ（株）製）でマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＰＤＰを凝集させ、２分間、磁石（ＭＡＮＧＮＡＳＴＡＮＤ−８（商品名）、マグナビート（株）製）で磁気回収し、上清を除去した。
このマイクロチューブに、１０ｍＭ ＥＤＴＡ含むＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。再度マイクロチューブを４２℃の恒温槽で２分間加熱後、２分間、上記磁石で磁気回収し、上清を除去した。このマイクロチューブに、１０ｍＭ ＥＤＴＡ含むＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させ、還元ＴＭ−ＬＰＤＰを得た。
【００３７】
（還元ＴＭ−ＬＰＤＰとマレイミド標識抗体の反応）
上記で調製した還元ＴＭ−ＬＰＤＰ１００μＬ入りのマイクロチューブにマレイミド標識抗体を１５μＬ加え、４℃、１２時間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。４２℃の恒温槽で、このマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＰＤＰを凝集させ、２分間、上記磁石で磁気回収し、上清を除去した。
このマイクロチューブにＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。これに磁気回収による洗浄操作を２回行い（ＰＢＳバッファー０．５ｍＬを使用）、未反応の抗体を除去した。ＴＭ−ＬＰＤＰへの抗体の結合はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図２レーン１）。
【００３８】
＜実施例６＞
保護されたチオール基を含む磁性微粒子への抗体の結合実験（還元抗体との反応）
（還元ＩｇＧの調製）
ヒト甲状腺刺激ホルモン（略号ＴＳＨ）のβサブユニットに対する抗体（クローン：１５５マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．製）１ｍＬを透析膜（Bio-Tech International,Inc.製：分画分子量 ８，０００）に入れ、２００ｍＬのＰＢＳバッファーが入った微量透析装置（Bio-Tech International,Inc.製）中で４℃、３時間透析を行った。
４０ｍｇの２−メルカプトエチルアミン（略号２−ＭＥＡ、和光純薬（株）製）を１ｍＬのＰＢＳバッファーに溶解した（３５０ｍＭ）。透析した抗体４００μＬへ３５０ｍＭ
２−ＭＥＡを１０μＬ添加し、Ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ ＳＩ−３００ (ＡＳ ＯＮＥ（株）製)を用いて、３７℃ 、１．５時間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。
２本のＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５(ＧＥヘルスケア製)をＰＢＳバッファー２０ｍＬで平衡化した。１本の平衡化したＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５を２５℃、１０００×ｇ、２分間遠心処理した。遠心処理したＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５に抗体４００μＬを添加し、２５℃、１０００×ｇ、２分間遠心処理した。再度もう１本の平衡化したＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５で抗体 ４００ μＬを遠心処理した。これにより、還元ＩｇＧが得られた。
【００３９】
（ＴＭ−ＬＰＤＰと還元ＩｇＧの反応）
ＴＭ−ＬＰＤＰ（０．４ｗ/ｖ％）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）（ニッポンジーン（株）製）２μＬを添加し、混合した。調製した還元ＩｇＧを１５μＬ加え、４℃、１２時間、３００ｒｐｍでインキュベーションした。反応終了後、４２℃の恒温槽でマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＰＤＰを凝集させ、２分間、磁石で磁気回収し、上清を除去した。このマイクロチューブにＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。ＰＢＳバッファー１００μＬで、磁気回収し、洗浄を２回行うことで、未反応の抗体を除去した。ＴＭ−ＬＰＤＰへの抗体の結合はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図２のレーン２）。
以上より、保護されたチオール基を含む磁性微粒子を用いると、抗体を容易に固定化できることがわかった。
【００４０】
＜実施例７＞（ＳＨ基を持つ低分子化合物との反応）
（ＴＭ−ＬＰＤＰとグルタチオンとの反応）
ＴＭ−ＬＰＤＰ（０．４ｗ/ｖ％）１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、そこに還元型グルタチオン（以下、ＧＳＨと略記する。和光純薬工業（株）製）２ｍｇを含むＰＢＳバッファー１００μＬ溶液を加え、一晩反応させた。４２℃の恒温槽でマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＰＤＰを凝集させ、２分間、磁石で磁気回収し、上清を除去した。このマイクロチューブにＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。これに磁気回収による洗浄操作を２回行ない（ＰＢＳバッファー１００μＬを使用）、未反応のＧＳＨを除去し、Ｔｈｅｒｍａ−ＭａｘにＧＳＨを導入したＴＭ−ＬＧＳＨを調製した（図３）。
【００４１】
（機能評価）
（ＴＭ−ＬＧＳＨと、ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの略号）との反応）（図４）
ＴＭ−ＬＧＳＨ１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、ＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−６Ｈｉｓ ｔａｇｇｅｄ（１μｇ／μＬ）（以下、ＧＳＴ−Ｈｉｓとする。Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を５μＬ加え、室温で３０分インキュベートした。その後、４２℃の恒温槽でマイクロチューブを２分間加熱し、ＴＭ−ＬＧＳＨを凝集させ、２分間、磁石で磁気回収し、上清を除去した。このマイクロチューブにＰＢＳバッファー１００μＬを加え、氷上で冷却して分散させた。ＰＢＳバッファー１００μＬで洗浄を２回行うことで、未反応のＧＳＴ−Ｈｉｓを除去した。
また、比較としてＧＳＴ融合タンパク質ではないストレプトアビジンを用いて、同様の実験を行った。ＴＭ−ＬＧＳＴへのＧＳＴ−Ｈｉｓの結合はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図５のレーン２）。その結果、ＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−ＨｉｓはＴＭ−ＬＧＳＴのペレットにバンドが濃く出るが（図５レーン３）、ＧＳＴ融合タンパク質ではないストレプトアビジンではペレットにはバンドがなく、上清にバンドが濃く現れた（図５レーン５、６）。以上の結果より、ＴＭ−ＬＧＳＨは特異的にＧＳＴ融合タンパクと結合することが示された。
【００４２】
参考例：コアがポリエチレンイミンとマグネタイトで構成される熱応答性磁性微粒子の調製
（マグネタイトの調製）
２００ｍＬ容のフラスコに、塩化第二鉄・六水和物（１．０ｍｏｌ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．５ｍｏｌ）混合水溶液を１００ｍＬ入れ、メカニカルスターラーで攪拌し、この混合溶液を５０℃に昇温した後、これに２８重量％アンモニア水溶液５．０ｍＬを滴下し、１時間攪拌した。この操作で、平均粒径が約５ｎｍのマグネタイトが得られた。
【００４３】
（マグネタイト−ポリエチレンイミン複合体の調製）
１０重量％マグネタイト水溶液１０ｍＬとポリエチレンイミン５ｇを混合し、超音波処理をしながら、氷浴中で１時間分散処理をした。磁気分離により、過剰なポリエチレンイミンを除去した。１０ｍＬの精製水を添加し再分散後、１ｍＭ 塩酸水溶液で分散液のｐＨを４にすることで、平均粒径が約７０ｎｍのマグネタイト−ポリエチレンイミン複合体を得た。
【００４４】
(熱応答性磁性微粒子の調製)
マグネタイト−ポリエチレンイミン複合体３００ｍｇを１００ｍＭ ＭＥＳバッファー（ＭＥＳ：2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Acid、ｐＨ４．７５）３０ｍＬに分散させた（分散液）。この分散液を超音波により、マグネタイト−ポリエチレンイミン複合体の平均粒径が約７０ｎｍになるように処理した。また、一方でポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリル酸共重合体１００ｍｇを、１００ｍＭ ＭＥＳバッファー１０ｍＬに溶解し、そこへ、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride １００ｍｇを添加し、３０分間反応させた（ポリマー液）。その後、分散液とポリマー液とを混合し、６時間、反応させた後、精製水により２回洗浄を行い、アミノ基を含む熱応答性磁性微粒子を得た。
熱応答性磁性微粒子のアミノ基にチオール基または保護チオール基を含む化合物を反応させることにより、チオール基または保護チオール基を含む、コアがポリエチレンイミンとマグネタイトで構成された熱応答性磁性微粒子を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】磁性微粒子の分散安定性（粒径分布）を示す図。（ａ）がＴＭ−ＬＡｍおよびＴＭ−ＬＰＤＰを示し、（ｂ）がＴＭ−ＬＣ、ＴＭ−ＬＳＨおよび超音波処理後のＴＭ−ＬＳＨを示す。
【図２】ＴＭ−ＬＰＤＰへの抗体の結合を示す図（写真）。レーン１がマレイミド標識抗体、レーン２が還元ＩｇＧを示す。
【図３】保護チオール基を含む磁性微粒子（ＴＭ−ＬＰＤＰ）を用いて、グルタチオンを導入する反応の模式図。
【図４】ＴＭ−ＬＧＳＨとＧＳＴ融合タンパク質との反応の模式図。
【図５】ＧＳＴ融合タンパク質またはストレプトアビジン（対照）の、ＴＭ−ＬＧＳＨへの結合実験の結果を示す図（写真）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面が刺激応答性高分子で修飾された磁性微粒子からなる刺激応答性磁性微粒子であり、該磁性微粒子は、多価アルコールまたはポリアルキレンイミンと、鉄酸化物との複合体であり、該刺激応答性高分子は、熱応答性高分子、ｐＨ応答性高分子または光応答性高分子であり、チオール基を含むことを特徴とする、刺激応答性磁性微粒子。
【請求項２】
チオール基が、刺激応答性高分子に導入された、請求項１記載の刺激応答性磁性微粒子。
【請求項３】
チオール基が、保護基で保護された、請求項２記載の刺激応答性磁性微粒子。
【請求項４】
チオールの保護基が、ベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基、またはピリジルスルフィド基である、請求項３記載の刺激応答性磁性微粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子にチオール基結合物質を接触させる工程を含む、チオール基結合物質の固定化方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子を含む、チオール基結合物質固定化用キット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子とグルタチオンとが、それぞれのチオール基同士でジスルフィド結合することによって固定化された、グルタチオン固定化磁性微粒子。
【請求項８】
請求項７記載のグルタチオン固定化磁性微粒子を含む、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を精製又は検出するためのキット。
【請求項１】
表面が刺激応答性高分子で修飾された磁性微粒子からなる刺激応答性磁性微粒子であり、該磁性微粒子は、多価アルコールまたはポリアルキレンイミンと、鉄酸化物との複合体であり、該刺激応答性高分子は、熱応答性高分子、ｐＨ応答性高分子または光応答性高分子であり、チオール基を含むことを特徴とする、刺激応答性磁性微粒子。
【請求項２】
チオール基が、刺激応答性高分子に導入された、請求項１記載の刺激応答性磁性微粒子。
【請求項３】
チオール基が、保護基で保護された、請求項２記載の刺激応答性磁性微粒子。
【請求項４】
チオールの保護基が、ベンジル基、メトキシベンジル基、Ｎ−（アセチル）アミノメチル基、ｔ−ブチル基、メチルベンジル基、３、４−ジメチルベンジル基、トリチル基、ベンズヒドリル基、アセタミドメチル基、カルボメトキシスルフェニル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、エチルカルバモイル基、９−フルオレニルメチル基、またはピリジルスルフィド基である、請求項３記載の刺激応答性磁性微粒子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子にチオール基結合物質を接触させる工程を含む、チオール基結合物質の固定化方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子を含む、チオール基結合物質固定化用キット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の刺激応答性磁性微粒子とグルタチオンとが、それぞれのチオール基同士でジスルフィド結合することによって固定化された、グルタチオン固定化磁性微粒子。
【請求項８】
請求項７記載のグルタチオン固定化磁性微粒子を含む、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を精製又は検出するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１５１５２８（Ｐ２０１０−１５１５２８Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２８１６６（Ｐ２００８−３２８１６６）
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
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