デハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法、塩素化エチレンの浄化剤及び浄化方法
【課題】デハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を調製することができる方法と、この細菌を用いた塩素化エチレン浄化剤と、塩素化エチレン汚染土壌又は地下水の浄化方法を提供する。
【解決手段】デハロコッコイデス属細菌と連鎖菌とを主菌体とするコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程と、嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程のいずれか一方又は両方を行うことによりデハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を得ることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。この培養液よりなる塩素化エチレン浄化剤。この塩素化エチレン浄化剤を用いた土壌及び／又は地下水中の塩素化エチレン浄化方法。
【解決手段】デハロコッコイデス属細菌と連鎖菌とを主菌体とするコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程と、嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程のいずれか一方又は両方を行うことによりデハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を得ることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。この培養液よりなる塩素化エチレン浄化剤。この塩素化エチレン浄化剤を用いた土壌及び／又は地下水中の塩素化エチレン浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩素化エチレン分解菌の１つであるデハロコッコイデス属細菌の培養液の調製方法と、この細菌を用いた塩素化エチレン浄化剤と、塩素化エチレン汚染土壌又は地下水の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
塩素化エチレンに汚染された土壌や地下水の浄化方法として、分解菌の少ないサイトについても迅速に処理できるバイオオーグメンテーション技術が期待されている。バイオオーグメンテーションによる塩素化エチレン処理は、予め培養された塩素化エチレン分解菌を土壌や地下水中に注入して塩素化エチレンを脱塩素するというものである。
【０００３】
バイオオーグメンテーションを日本国内で利用する上では、経済産業省と環境省の「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」の要件を満たす微生物を調整し利用することが望ましく、バイオオーグメンテーションに利用する微生物は「高度に限定された微生物で構成され、その構成が継続的に安定していること」「優占であること」という条件を満たす必要がある。
【０００４】
優占度を上げるための方法として、デハロコッコイデス属細菌が一般の細菌より小型であることを利用して、膜濾過で分画して占有度を上げた培養液を得る調製方法が知られている（特開２００９−２１３４２７）。
【０００５】
しかし、この方法では、デハロコッコイデス属細菌の回収率は、高くても１５％と低いものであった。この原因は、膜濾過で分画する際にデハロコッコイデス属細菌も膜に捕獲されてしまうためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２１３４２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題を解決するものであって、デハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を調製することができる方法と、この細菌を用いた塩素化エチレン浄化剤と、塩素化エチレン汚染土壌又は地下水の浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、デハロコッコイデス属細菌と連鎖菌とを主菌体とするコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程と、嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程のいずれか一方又は両方を行うことによりデハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を得ることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項２のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、請求項１において、第１分画工程の後に第２分画工程を行うことを特徴とするものである。
【００１０】
請求項３のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、請求項１又は２において、該連鎖菌がトリココッカス属細菌であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項４のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記コンソーシアはクエン酸及び／又はクエン酸塩を主炭素成分とする培地を用いて嫌気条件で培養されたものであることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項５の塩素化エチレン浄化剤は、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の調製方法により得られたデハロコッコイデス属細菌培養液よりなるものである。
【００１３】
請求項６の土壌及び／又は地下水中の塩素化エチレン浄化方法は、請求項５に記載の塩素化エチレン浄化剤を土壌及び／又は地下水に添加することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
デハロコッコイデス属細菌とその共生菌として連鎖状の球菌が優位であるトリココッカス属細菌を含むコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程及び／又は嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程でデハロコッコイデス属細菌を全く又は殆ど捕捉することなくトリココッカス属細菌を相当量除去することにより、デハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を高い回収率で得ることができる。
【００１５】
この培養液よりなる浄化剤を用いることにより、塩素化エチレン汚染土壌／地下水に対して高効率でバイオオーグメンテーションを行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１７】
本発明のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、デハロコッコイデス属細菌と連鎖菌とを主菌体とするコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程と、嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程のいずれか一方又は両方を行うことによりデハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を得るものである。
【００１８】
［コンソーシア］
トリココッカス属細菌は、土や川など環境中に広く存在する。トリココッカス属細菌とデハロコッコイデス属細菌を含む土壌や地下水を採取し、適切な培地を用いて嫌気条件で培養することで目的とするコンソーシアを得ることができる。トリココッカス属細菌の割合としては全菌の９５％以上、さらに望ましくは９８％〜９９．５％であることが望ましい。
【００１９】
植種源としての地下水や土壌は、バイオスティミュレーションによる汚染の浄化が進行し且つ浄化の過程において塩素化エチレン分解細菌が顕著に増殖している汚染現場から採取されたものが好ましい。採取した地下水及び／又は土壌を培養容器に収容する。植種源として地下水を用いる場合、そのまま培養容器に投入してもよいが、水等で希釈した後に投入してもよい。また、植種源として土壌を用いる場合、そのまま培養容器に投入し液体培地中に懸濁してもよいが、適当な溶媒（例えば、水）に懸濁した後に培養容器に収容してもよい。
【００２０】
培養容器は、培地に対して安定であることが好ましい。培地に塩素化エチレンを含有させるため、培養容器はガラス製であることが好ましい。
【００２１】
植種源を培養容器に収容した後、有機栄養源としてクエン酸、酵母エキス等が添加される。なお、発明者らは、クエン酸又はクエン酸塩を主要炭素源として継続培養を行うと、トリココッカス属細菌を再現性良く集積できることを見出した。特に培地はクエン酸及びクエン酸塩の少なくとも一方を培養時の濃度として０．１〜２０ｇ／Ｌ含むことが望ましい。また、培地に酵母エキスを培養時の濃度として１〜１０００ｍｇ／Ｌ程度含有させると成長促進効果があり望ましい。ビタミン類を添加しても良い。デハロコッコイデス属細菌の増殖のために、培地に塩素化エチレン類を加える。塩素化エチレンは、ＰＣＥ（テトラクロロエチレン）、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ（ジクロロエチレン）、ＶＣ（塩化ビニル）等を利用でき、培養時の濃度として１〜１００ｍｇ／Ｌ（１０〜１０００μＭ）、特に１〜１０ｍｇ／Ｌ（１０〜１００μＭ）程度含有することが好ましい。培養温度は１５〜３０℃、特に２５〜３０℃が好ましい。培地のｐＨは６．０〜８．５程度の中性域であることが望ましい。静置培養あるいは１０〜１００ｒｐｍ程度の緩速攪拌を行う。デハロコッコイデス属細菌の増殖をさらに促進させるためには分子状水素を添加しても良い。
【００２２】
トリココッカス属細菌は培養条件によって単球菌となったり連鎖状（短鎖状、糸状、塊状を含む）の細胞構造となったりすることが知られている（Int.J.Syst.Evol.Microbiol.(2002),52,1113-1126）。本発明の培養条件では後述するように沈降により単球菌であるデハロコッコイデス属細菌と容易に分離されることから連鎖状のトリココッカス属細菌が優位になっていると推察される。
【００２３】
デハロコッコイデス属細菌は、偏性嫌気性微生物であるため、酸素の存在下では速やかに死滅する。従って、地下水や土壌の採取、移送、培養容器への添加等の一連の操作において、嫌気性条件を保持することが好ましい。培地の環境を嫌気性とするためには、硫化ナトリウム及び塩化第一鉄を培地に添加することが好ましい。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、培地中の硫化ナトリウム及び塩化第一鉄の濃度は、それぞれ５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ程度が好ましい。
培地には嫌気度を調べるための指示薬であるレサズリンが添加されてもよい。
【００２４】
デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、塩素化エチレンがエチレンに分解されるまで培養を行うのが好ましい。塩素化エチレン及びその分解中間物質（例えばシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニル）の検出は、例えば、培養容器中の気相を少量採取し、ガスクロマトグラフィー分析することにより行われる。
【００２５】
培養終了後、培養液を、継代培養用の培地が収容された別の培養容器に移植する。この培地は、先程の添加成分と同様に、クエン酸、酵母エキス、硫化ナトリウム、塩素化エチレン、及び塩化第一鉄を含有するとともに、所定の無機塩類を含有することが好ましい。
【００２６】
継代培養は、塩素化エチレン及び分解中間物質（例えばシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニル）のいずれもが検出されなくなるまで、先程の培養と同様の条件で行われる。このような継代培養を、継続的に行うことにより、トリココッカス属細菌及びデハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアが生成する。デハロコッコイデス属細菌の分離にはコンソーシアをこのまま利用してもよいが、得られたコンソーシアを植種源として大型フラスコや醗酵槽を用いて培養したものを使用することができる。培地や培養方法は先ほどの集積培養と同様の条件でよい。
【００２７】
［デハロコッコイデス属細菌の分離］
培養の攪拌を止め、重力分離（自然沈降で沈殿させること）又は遠心分離により、デハロコッコイデス属細菌とトリココッカス属細菌を分離することができる。デハロコッコイデス属細菌等の単球菌と、連鎖状のトリココッカス属細菌とは、細胞の大きさを利用して容易に分離が可能である。嫌気条件とするため培地成分に塩化鉄と硫化ナトリウムを添加したときは、培地作成段階で硫化鉄が生成するのでトリココッカス属菌を硫化鉄のフロックとともに共沈させても良い。顕微鏡で観察するとトリココッカス属細菌は硫化鉄のフロックと凝集塊を形成しているケースが多く、デハロコッコイデス属細菌より凝集し易い性状も持つと考えられ、これによりトリココッカス属細菌を選択的に分離することができると考えられる。
【００２８】
重力分離又は遠心分離の前に凝集剤を培地に添加してもよい。凝集剤としては、塩鉄、ＰＡＣ、有機ポリマー等を利用することができるが、これに限定されない。凝集剤を用いる場合も連鎖状のトリココッカス属細菌の細胞の大きさによりトリココッカス属細菌が凝集フロックを作りやすい。遠心分離は、連続式、回分式のいずれでもよい。またサイクロンといった簡易装置を利用することもできる。
【００２９】
培養液又は重力分離又は遠心分離の上澄液を大孔径の膜に通水してデハロコッコイデス属細菌とトリココッカス属細菌を分離することもできる。膜の孔径はトリココッカス属細菌を捕獲できてデハロコッコイデスを捕獲しない必要があり、３〜１００μｍ、特に３〜５０μｍが好ましく、５〜２０μｍがより好ましい。大孔径の膜を用いることにより、膜濾過速度も大きいものとなる。大孔径の膜としてはプレフィルターや濾紙或いは不織布でもよく、デハロコッコイデス属細菌と連鎖状のトリココッカス属細菌の細胞長を利用して分離できる方法であれば良い。なお、前述の特開２００９−２１３４２７のように孔径の小さな膜で上澄液を濾過した場合、デハロコッコイデス属細菌も捕獲してしまうのに対して、大孔径の膜で濾過することにより、デハロコッコイデス属細菌を透過させて高回収率にて回収することができる。なお本発明によってデハロコッコイデス属細菌の回収率を８０％以上、特に実質的に９０〜１００％の回収率にて回収することができる。
本発明では、重力分離又は遠心分離による分画方法と、膜を利用した分画方法とは組み合わせて処理することができる。そして、重力分離又は遠心分離をした後に膜濾過することにより高度に分画できる上に、膜寿命を長期化できるので好ましい。
【００３０】
前述した経済産業省と環境省の指針により、コンソーシアを構成する微生物群の中で、相当微生物の占有度が最も高いことが望ましい。占有度はコンソーシア中の他の微生物の種類や量に依存するが、本発明ではデハロコッコイデス属細菌の占有度を２０％以上とすることができ、さらには重力分離又は遠心分離をした後に膜濾過する方式を取ることにより占有度５０％以上を達成することができる。
【００３１】
なお、デハロコッコイデス属細菌培養液よりなる浄化剤は、現場で調製されてもよく、研究所や工場などで調製されてもよい。デハロコッコイデス属細菌は嫌気性菌であるため、培養液の調製工程では、系内を窒素パージするとともにフッ素樹脂等の酸素透過性の低い配管や空気の混入がない気密性の高い遠心分離機や膜ユニット、ポンプを用いることにより嫌気条件を保ち、また培養液タンクはタンク内を窒素パージして密閉することで嫌気条件を維持する必要がある。
【００３２】
このようにして得られた培養液が塩素化エチレンの浄化剤として用いられる。この浄化剤を用いて塩素化エチレン汚染土壌又は地下水を浄化するには、この浄化剤を必要に応じ水で希釈して土壌中に注入したり、汲み上げた地下水に添加した後、この地下水を地中に圧入する。
【実施例】
【００３３】
塩素化エチレンにより汚染された土壌及び地下水の浄化がバイオスティミュレーションにより行われている3箇所の現場から、地下水を採取した。地下水１００ｍＬをそれぞれ容積１５５ｍＬのガラス製バイアルに入れ、下記に示される培地成分を添加し、窒素／二酸化炭素混合（体積比８／２）ガスで気相を置換した。
＜地下水へ添加した培地成分＞
Ｃ３Ｈ４（ＯＨ）（ＣＯＯＨ）３：５００ｍｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ：６ｍｇ／Ｌ
酵母エキス ：１００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ ：５０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ：５０ｍｇ／Ｌ
【００３４】
更に、シスージクロロエチレン（ＤＣＥ）を液中濃度が約１０ｍｇ／Ｌとなるように添加し、同様に塩化ビニル（ＶＣ）を液中濃度が約６ｍｇ／Ｌ程度となるよう添加した後、ポリテトラフルオロエチレンで被覆されたブチルゴム栓によりバイアルを密閉した。
【００３５】
続いて、このバイアルを３０℃の温度下で５０ｒｐｍで緩やかに攪拌しつつ培養を開始した。バイアルの気相２００μＬを定期的に引き抜き、ガスクロマトグラフを用いて塩素化エチレン類の濃度を各々測定した。塩素化エチレン類が検出されなくなったことを確認した後、培地の水相を採取した。採取した水相１ｍＬを、下記に示される組成の合成培地を収容する別のバイアルに植え継いだ。同様の手順で、合成培地への植え継ぎを計５回行う継代培養を行った。なお、地下水Ａ、ＣはＶＣを添加して集積を行い、地下水ＢはＤＣＥを添加して集積を行った。また、地下水Ａ，Ｂは酵母エキスを添加して集積を行い、地下水Ｃは酵母エキスを添加せずに集積した。
＜合成培地の組成＞
Ｃ３Ｈ４（ＯＨ）（ＣＯＯＮａ）３：５００ｍｇ／Ｌ
酵母エキス ：１０ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ：１５ｍｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３ ：２５２０ｍｇ／Ｌ
Ｔｒｉｓ ：２２９０ｍｇ／Ｌ
レサズリン ：１ｍｇ／Ｌ
ＣＤＣＥ ：６ｍｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ：５００ｍｇ／Ｌ
ＮａＣｌ ：５００ｍｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ：２００ｍｇ／Ｌ
ＮＨ４Ｃｌ ：３００ｍｇ／Ｌ
ＫＣｌ ：３００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ ：４８０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ：２００ｍｇ／Ｌ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ：１ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ：１．９ｍｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２ ：０．７ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ：０．０４ｍｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ：０．０６ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ：０．２５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ：０．４４ｍｇ／Ｌ
濃塩酸 ：１μＬ／Ｌ
【００３６】
得られた培養液の細菌相を、１６ＳｒＤＮＡを対象とする末端制限酵素切断断片長多型（Ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：Ｔ−ＲＦＬＰ）解析、デハロコッコイデス属細菌（ＤＨＣ菌）、トリココッカス属細菌（Ｔ菌）および全細菌の１６ＳｒＤＮＡを対象としたリアルタイムＰＣＲ解析により評価した。用いたＤＮＡプライマーを表１及び配列表に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
その結果、全てのサンプルにおいて全細菌に占めるトリココッカス属細菌（Ｔ菌）の割合は９８％以上であり、デハロコッコイデス属細菌（ＤＨＣ菌）の割合は、１％程度であることが判明した（表２）。また、１６ＳｒＤＮＡ由来のＰＣＲ産物よりダイレクトシークエンシングを行い、塩基配列より微生物の同定を行った結果、３試料とも、Ｔｒｉｃｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌であることを確認した。この結果より、少なくともクエン酸を単一炭素原とする培地として集積培養を行うことで、T菌を優占種とするコンソーシアを調整できることがわかった。
【００３９】
【表２】
【００４０】
続いて、得られたコンソーシアを一昼夜、恒温槽内で静置し、トリココッカス属細菌を培地成分由来の硫化鉄のフロックと共に沈降分離した。
【００４１】
また、攪拌停止後の上澄み液をさらに孔径５μｍのＰＶＤＦ膜(Ｄｕｒａｐｏｒｅ：日本ミリポア製)で膜濾過した。
【００４２】
このときの、(ｉ)攪拌停止後の上澄み液と、(ii)上澄み液を膜濾過した濾過液のそれぞれについてＴＲＦＬＰ解析とリアルタイムＰＣＲ解析とを実施した。この結果を表２に示す。
【００４３】
＜(ｉ)の解析結果＞
表２に見られるように攪拌停止前の培養液ではＴ菌の割合が９８％以上でＤＨＣ菌の割合は１％程度であったが、一晩静置して硫化鉄とともにＴ菌を重力沈降せしめた結果、上澄み液中のＴ菌の濃度は攪拌停止前の１〜３％程度となり、全菌に対するＤＨＣ菌の割合は２７〜３８％と上昇した。また、このときＤＨＣ菌の回収率は概ね１００％であった。
【００４４】
＜(ii)の解析結果＞
上澄み液をさらに孔径５μｍの膜で膜濾過した結果、Ｔ菌の割合は著しく低下し、ＤＨＣ菌の割合は５２〜５７％となった。また、膜濾過の前後の培養液中のＤＨＣ菌の濃度はどのサンプルでもほぼ等しく、ＤＨＣ菌が膜に捕捉されることなく概ね１００％の回収率で回収できることがわかった。つまりコンソーシアの中からＤＨＣ菌以外の菌のみを実質的に減量することができた。なお、従来技術（特開２００９−２１３４２７の実施例）では、回収率は１２％程度と非常に低い。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩素化エチレン分解菌の１つであるデハロコッコイデス属細菌の培養液の調製方法と、この細菌を用いた塩素化エチレン浄化剤と、塩素化エチレン汚染土壌又は地下水の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
塩素化エチレンに汚染された土壌や地下水の浄化方法として、分解菌の少ないサイトについても迅速に処理できるバイオオーグメンテーション技術が期待されている。バイオオーグメンテーションによる塩素化エチレン処理は、予め培養された塩素化エチレン分解菌を土壌や地下水中に注入して塩素化エチレンを脱塩素するというものである。
【０００３】
バイオオーグメンテーションを日本国内で利用する上では、経済産業省と環境省の「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」の要件を満たす微生物を調整し利用することが望ましく、バイオオーグメンテーションに利用する微生物は「高度に限定された微生物で構成され、その構成が継続的に安定していること」「優占であること」という条件を満たす必要がある。
【０００４】
優占度を上げるための方法として、デハロコッコイデス属細菌が一般の細菌より小型であることを利用して、膜濾過で分画して占有度を上げた培養液を得る調製方法が知られている（特開２００９−２１３４２７）。
【０００５】
しかし、この方法では、デハロコッコイデス属細菌の回収率は、高くても１５％と低いものであった。この原因は、膜濾過で分画する際にデハロコッコイデス属細菌も膜に捕獲されてしまうためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２１３４２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題を解決するものであって、デハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を調製することができる方法と、この細菌を用いた塩素化エチレン浄化剤と、塩素化エチレン汚染土壌又は地下水の浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、デハロコッコイデス属細菌と連鎖菌とを主菌体とするコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程と、嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程のいずれか一方又は両方を行うことによりデハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を得ることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項２のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、請求項１において、第１分画工程の後に第２分画工程を行うことを特徴とするものである。
【００１０】
請求項３のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、請求項１又は２において、該連鎖菌がトリココッカス属細菌であることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項４のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記コンソーシアはクエン酸及び／又はクエン酸塩を主炭素成分とする培地を用いて嫌気条件で培養されたものであることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項５の塩素化エチレン浄化剤は、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の調製方法により得られたデハロコッコイデス属細菌培養液よりなるものである。
【００１３】
請求項６の土壌及び／又は地下水中の塩素化エチレン浄化方法は、請求項５に記載の塩素化エチレン浄化剤を土壌及び／又は地下水に添加することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
デハロコッコイデス属細菌とその共生菌として連鎖状の球菌が優位であるトリココッカス属細菌を含むコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程及び／又は嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程でデハロコッコイデス属細菌を全く又は殆ど捕捉することなくトリココッカス属細菌を相当量除去することにより、デハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を高い回収率で得ることができる。
【００１５】
この培養液よりなる浄化剤を用いることにより、塩素化エチレン汚染土壌／地下水に対して高効率でバイオオーグメンテーションを行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１７】
本発明のデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法は、デハロコッコイデス属細菌と連鎖菌とを主菌体とするコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程と、嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程のいずれか一方又は両方を行うことによりデハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を得るものである。
【００１８】
［コンソーシア］
トリココッカス属細菌は、土や川など環境中に広く存在する。トリココッカス属細菌とデハロコッコイデス属細菌を含む土壌や地下水を採取し、適切な培地を用いて嫌気条件で培養することで目的とするコンソーシアを得ることができる。トリココッカス属細菌の割合としては全菌の９５％以上、さらに望ましくは９８％〜９９．５％であることが望ましい。
【００１９】
植種源としての地下水や土壌は、バイオスティミュレーションによる汚染の浄化が進行し且つ浄化の過程において塩素化エチレン分解細菌が顕著に増殖している汚染現場から採取されたものが好ましい。採取した地下水及び／又は土壌を培養容器に収容する。植種源として地下水を用いる場合、そのまま培養容器に投入してもよいが、水等で希釈した後に投入してもよい。また、植種源として土壌を用いる場合、そのまま培養容器に投入し液体培地中に懸濁してもよいが、適当な溶媒（例えば、水）に懸濁した後に培養容器に収容してもよい。
【００２０】
培養容器は、培地に対して安定であることが好ましい。培地に塩素化エチレンを含有させるため、培養容器はガラス製であることが好ましい。
【００２１】
植種源を培養容器に収容した後、有機栄養源としてクエン酸、酵母エキス等が添加される。なお、発明者らは、クエン酸又はクエン酸塩を主要炭素源として継続培養を行うと、トリココッカス属細菌を再現性良く集積できることを見出した。特に培地はクエン酸及びクエン酸塩の少なくとも一方を培養時の濃度として０．１〜２０ｇ／Ｌ含むことが望ましい。また、培地に酵母エキスを培養時の濃度として１〜１０００ｍｇ／Ｌ程度含有させると成長促進効果があり望ましい。ビタミン類を添加しても良い。デハロコッコイデス属細菌の増殖のために、培地に塩素化エチレン類を加える。塩素化エチレンは、ＰＣＥ（テトラクロロエチレン）、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ（ジクロロエチレン）、ＶＣ（塩化ビニル）等を利用でき、培養時の濃度として１〜１００ｍｇ／Ｌ（１０〜１０００μＭ）、特に１〜１０ｍｇ／Ｌ（１０〜１００μＭ）程度含有することが好ましい。培養温度は１５〜３０℃、特に２５〜３０℃が好ましい。培地のｐＨは６．０〜８．５程度の中性域であることが望ましい。静置培養あるいは１０〜１００ｒｐｍ程度の緩速攪拌を行う。デハロコッコイデス属細菌の増殖をさらに促進させるためには分子状水素を添加しても良い。
【００２２】
トリココッカス属細菌は培養条件によって単球菌となったり連鎖状（短鎖状、糸状、塊状を含む）の細胞構造となったりすることが知られている（Int.J.Syst.Evol.Microbiol.(2002),52,1113-1126）。本発明の培養条件では後述するように沈降により単球菌であるデハロコッコイデス属細菌と容易に分離されることから連鎖状のトリココッカス属細菌が優位になっていると推察される。
【００２３】
デハロコッコイデス属細菌は、偏性嫌気性微生物であるため、酸素の存在下では速やかに死滅する。従って、地下水や土壌の採取、移送、培養容器への添加等の一連の操作において、嫌気性条件を保持することが好ましい。培地の環境を嫌気性とするためには、硫化ナトリウム及び塩化第一鉄を培地に添加することが好ましい。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、培地中の硫化ナトリウム及び塩化第一鉄の濃度は、それぞれ５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ程度が好ましい。
培地には嫌気度を調べるための指示薬であるレサズリンが添加されてもよい。
【００２４】
デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、塩素化エチレンがエチレンに分解されるまで培養を行うのが好ましい。塩素化エチレン及びその分解中間物質（例えばシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニル）の検出は、例えば、培養容器中の気相を少量採取し、ガスクロマトグラフィー分析することにより行われる。
【００２５】
培養終了後、培養液を、継代培養用の培地が収容された別の培養容器に移植する。この培地は、先程の添加成分と同様に、クエン酸、酵母エキス、硫化ナトリウム、塩素化エチレン、及び塩化第一鉄を含有するとともに、所定の無機塩類を含有することが好ましい。
【００２６】
継代培養は、塩素化エチレン及び分解中間物質（例えばシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニル）のいずれもが検出されなくなるまで、先程の培養と同様の条件で行われる。このような継代培養を、継続的に行うことにより、トリココッカス属細菌及びデハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアが生成する。デハロコッコイデス属細菌の分離にはコンソーシアをこのまま利用してもよいが、得られたコンソーシアを植種源として大型フラスコや醗酵槽を用いて培養したものを使用することができる。培地や培養方法は先ほどの集積培養と同様の条件でよい。
【００２７】
［デハロコッコイデス属細菌の分離］
培養の攪拌を止め、重力分離（自然沈降で沈殿させること）又は遠心分離により、デハロコッコイデス属細菌とトリココッカス属細菌を分離することができる。デハロコッコイデス属細菌等の単球菌と、連鎖状のトリココッカス属細菌とは、細胞の大きさを利用して容易に分離が可能である。嫌気条件とするため培地成分に塩化鉄と硫化ナトリウムを添加したときは、培地作成段階で硫化鉄が生成するのでトリココッカス属菌を硫化鉄のフロックとともに共沈させても良い。顕微鏡で観察するとトリココッカス属細菌は硫化鉄のフロックと凝集塊を形成しているケースが多く、デハロコッコイデス属細菌より凝集し易い性状も持つと考えられ、これによりトリココッカス属細菌を選択的に分離することができると考えられる。
【００２８】
重力分離又は遠心分離の前に凝集剤を培地に添加してもよい。凝集剤としては、塩鉄、ＰＡＣ、有機ポリマー等を利用することができるが、これに限定されない。凝集剤を用いる場合も連鎖状のトリココッカス属細菌の細胞の大きさによりトリココッカス属細菌が凝集フロックを作りやすい。遠心分離は、連続式、回分式のいずれでもよい。またサイクロンといった簡易装置を利用することもできる。
【００２９】
培養液又は重力分離又は遠心分離の上澄液を大孔径の膜に通水してデハロコッコイデス属細菌とトリココッカス属細菌を分離することもできる。膜の孔径はトリココッカス属細菌を捕獲できてデハロコッコイデスを捕獲しない必要があり、３〜１００μｍ、特に３〜５０μｍが好ましく、５〜２０μｍがより好ましい。大孔径の膜を用いることにより、膜濾過速度も大きいものとなる。大孔径の膜としてはプレフィルターや濾紙或いは不織布でもよく、デハロコッコイデス属細菌と連鎖状のトリココッカス属細菌の細胞長を利用して分離できる方法であれば良い。なお、前述の特開２００９−２１３４２７のように孔径の小さな膜で上澄液を濾過した場合、デハロコッコイデス属細菌も捕獲してしまうのに対して、大孔径の膜で濾過することにより、デハロコッコイデス属細菌を透過させて高回収率にて回収することができる。なお本発明によってデハロコッコイデス属細菌の回収率を８０％以上、特に実質的に９０〜１００％の回収率にて回収することができる。
本発明では、重力分離又は遠心分離による分画方法と、膜を利用した分画方法とは組み合わせて処理することができる。そして、重力分離又は遠心分離をした後に膜濾過することにより高度に分画できる上に、膜寿命を長期化できるので好ましい。
【００３０】
前述した経済産業省と環境省の指針により、コンソーシアを構成する微生物群の中で、相当微生物の占有度が最も高いことが望ましい。占有度はコンソーシア中の他の微生物の種類や量に依存するが、本発明ではデハロコッコイデス属細菌の占有度を２０％以上とすることができ、さらには重力分離又は遠心分離をした後に膜濾過する方式を取ることにより占有度５０％以上を達成することができる。
【００３１】
なお、デハロコッコイデス属細菌培養液よりなる浄化剤は、現場で調製されてもよく、研究所や工場などで調製されてもよい。デハロコッコイデス属細菌は嫌気性菌であるため、培養液の調製工程では、系内を窒素パージするとともにフッ素樹脂等の酸素透過性の低い配管や空気の混入がない気密性の高い遠心分離機や膜ユニット、ポンプを用いることにより嫌気条件を保ち、また培養液タンクはタンク内を窒素パージして密閉することで嫌気条件を維持する必要がある。
【００３２】
このようにして得られた培養液が塩素化エチレンの浄化剤として用いられる。この浄化剤を用いて塩素化エチレン汚染土壌又は地下水を浄化するには、この浄化剤を必要に応じ水で希釈して土壌中に注入したり、汲み上げた地下水に添加した後、この地下水を地中に圧入する。
【実施例】
【００３３】
塩素化エチレンにより汚染された土壌及び地下水の浄化がバイオスティミュレーションにより行われている3箇所の現場から、地下水を採取した。地下水１００ｍＬをそれぞれ容積１５５ｍＬのガラス製バイアルに入れ、下記に示される培地成分を添加し、窒素／二酸化炭素混合（体積比８／２）ガスで気相を置換した。
＜地下水へ添加した培地成分＞
Ｃ３Ｈ４（ＯＨ）（ＣＯＯＨ）３：５００ｍｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ：６ｍｇ／Ｌ
酵母エキス ：１００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ ：５０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ：５０ｍｇ／Ｌ
【００３４】
更に、シスージクロロエチレン（ＤＣＥ）を液中濃度が約１０ｍｇ／Ｌとなるように添加し、同様に塩化ビニル（ＶＣ）を液中濃度が約６ｍｇ／Ｌ程度となるよう添加した後、ポリテトラフルオロエチレンで被覆されたブチルゴム栓によりバイアルを密閉した。
【００３５】
続いて、このバイアルを３０℃の温度下で５０ｒｐｍで緩やかに攪拌しつつ培養を開始した。バイアルの気相２００μＬを定期的に引き抜き、ガスクロマトグラフを用いて塩素化エチレン類の濃度を各々測定した。塩素化エチレン類が検出されなくなったことを確認した後、培地の水相を採取した。採取した水相１ｍＬを、下記に示される組成の合成培地を収容する別のバイアルに植え継いだ。同様の手順で、合成培地への植え継ぎを計５回行う継代培養を行った。なお、地下水Ａ、ＣはＶＣを添加して集積を行い、地下水ＢはＤＣＥを添加して集積を行った。また、地下水Ａ，Ｂは酵母エキスを添加して集積を行い、地下水Ｃは酵母エキスを添加せずに集積した。
＜合成培地の組成＞
Ｃ３Ｈ４（ＯＨ）（ＣＯＯＮａ）３：５００ｍｇ／Ｌ
酵母エキス ：１０ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ：１５ｍｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３ ：２５２０ｍｇ／Ｌ
Ｔｒｉｓ ：２２９０ｍｇ／Ｌ
レサズリン ：１ｍｇ／Ｌ
ＣＤＣＥ ：６ｍｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ：５００ｍｇ／Ｌ
ＮａＣｌ ：５００ｍｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ：２００ｍｇ／Ｌ
ＮＨ４Ｃｌ ：３００ｍｇ／Ｌ
ＫＣｌ ：３００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ ：４８０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ：２００ｍｇ／Ｌ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ：１ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ：１．９ｍｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２ ：０．７ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ：０．０４ｍｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３ ：０．０６ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ：０．２５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ：０．４４ｍｇ／Ｌ
濃塩酸 ：１μＬ／Ｌ
【００３６】
得られた培養液の細菌相を、１６ＳｒＤＮＡを対象とする末端制限酵素切断断片長多型（Ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：Ｔ−ＲＦＬＰ）解析、デハロコッコイデス属細菌（ＤＨＣ菌）、トリココッカス属細菌（Ｔ菌）および全細菌の１６ＳｒＤＮＡを対象としたリアルタイムＰＣＲ解析により評価した。用いたＤＮＡプライマーを表１及び配列表に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
その結果、全てのサンプルにおいて全細菌に占めるトリココッカス属細菌（Ｔ菌）の割合は９８％以上であり、デハロコッコイデス属細菌（ＤＨＣ菌）の割合は、１％程度であることが判明した（表２）。また、１６ＳｒＤＮＡ由来のＰＣＲ産物よりダイレクトシークエンシングを行い、塩基配列より微生物の同定を行った結果、３試料とも、Ｔｒｉｃｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌であることを確認した。この結果より、少なくともクエン酸を単一炭素原とする培地として集積培養を行うことで、T菌を優占種とするコンソーシアを調整できることがわかった。
【００３９】
【表２】
【００４０】
続いて、得られたコンソーシアを一昼夜、恒温槽内で静置し、トリココッカス属細菌を培地成分由来の硫化鉄のフロックと共に沈降分離した。
【００４１】
また、攪拌停止後の上澄み液をさらに孔径５μｍのＰＶＤＦ膜(Ｄｕｒａｐｏｒｅ：日本ミリポア製)で膜濾過した。
【００４２】
このときの、(ｉ)攪拌停止後の上澄み液と、(ii)上澄み液を膜濾過した濾過液のそれぞれについてＴＲＦＬＰ解析とリアルタイムＰＣＲ解析とを実施した。この結果を表２に示す。
【００４３】
＜(ｉ)の解析結果＞
表２に見られるように攪拌停止前の培養液ではＴ菌の割合が９８％以上でＤＨＣ菌の割合は１％程度であったが、一晩静置して硫化鉄とともにＴ菌を重力沈降せしめた結果、上澄み液中のＴ菌の濃度は攪拌停止前の１〜３％程度となり、全菌に対するＤＨＣ菌の割合は２７〜３８％と上昇した。また、このときＤＨＣ菌の回収率は概ね１００％であった。
【００４４】
＜(ii)の解析結果＞
上澄み液をさらに孔径５μｍの膜で膜濾過した結果、Ｔ菌の割合は著しく低下し、ＤＨＣ菌の割合は５２〜５７％となった。また、膜濾過の前後の培養液中のＤＨＣ菌の濃度はどのサンプルでもほぼ等しく、ＤＨＣ菌が膜に捕捉されることなく概ね１００％の回収率で回収できることがわかった。つまりコンソーシアの中からＤＨＣ菌以外の菌のみを実質的に減量することができた。なお、従来技術（特開２００９−２１３４２７の実施例）では、回収率は１２％程度と非常に低い。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デハロコッコイデス属細菌と連鎖菌とを主菌体とするコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、
嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程と、
嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程
のいずれか一方又は両方を行うことによりデハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を得ることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。
【請求項２】
請求項１において、第１分画工程の後に第２分画工程を行うことを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、該連鎖菌がトリココッカス属細菌であることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記コンソーシアはクエン酸及び／又はクエン酸塩を主炭素成分とする培地を用いて嫌気条件で培養されたものであることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の調製方法により得られたデハロコッコイデス属細菌培養液よりなる塩素化エチレン浄化剤。
【請求項６】
請求項５に記載の塩素化エチレン浄化剤を土壌及び／又は地下水に添加することを特徴とする土壌及び／又は地下水中の塩素化エチレン浄化方法。
【請求項１】
デハロコッコイデス属細菌と連鎖菌とを主菌体とするコンソーシアを集積培養して作製した嫌気状態の培養液に対して、
嫌気条件で培養液を重力又は遠心力により分離して上澄液を取得する第１分画工程と、
嫌気条件で培養液を孔径３μｍ〜１００μｍの膜で膜濾過して透過液を得る第２分画工程
のいずれか一方又は両方を行うことによりデハロコッコイデス属細菌の占有度の高い培養液を得ることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。
【請求項２】
請求項１において、第１分画工程の後に第２分画工程を行うことを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、該連鎖菌がトリココッカス属細菌であることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記コンソーシアはクエン酸及び／又はクエン酸塩を主炭素成分とする培地を用いて嫌気条件で培養されたものであることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌培養液の調製方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の調製方法により得られたデハロコッコイデス属細菌培養液よりなる塩素化エチレン浄化剤。
【請求項６】
請求項５に記載の塩素化エチレン浄化剤を土壌及び／又は地下水に添加することを特徴とする土壌及び／又は地下水中の塩素化エチレン浄化方法。
【公開番号】特開２０１１−２４４７６９（Ｐ２０１１−２４４７６９Ａ）
【公開日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２３０８５（Ｐ２０１０−１２３０８５）
【出願日】平成２２年５月２８日（２０１０．５．２８）
【出願人】（０００００１０６３）栗田工業株式会社 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２８日（２０１０．５．２８）
【出願人】（０００００１０６３）栗田工業株式会社 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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