トウモロコシイベントＴＣ１５０７およびそれを検出するための方法
本発明は、害虫抵抗性の遺伝子組換えトウモロコシ植物に関するＤＮＡ組成物である。また、トウモロコシのゲノム中に挿入された組換え構築物のＤＮＡ配列および挿入部位と隣接するＤＮＡ配列に基づくトウモロコシのＴＣ１５０７イベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。上記アッセイを実行する際に有用なキットおよび条件が、提供される。本発明の一局面に従うと、宿主細胞への導入および宿主細胞内での複製が可能であり、そして植物細胞で発現された場合に植物細胞および植物に対して害虫抵抗性を与えるＤＮＡ構築物が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、植物分子生物学の分野に関し、詳しくは、本発明は植物に対して害虫抵抗性を与えるためのＤＮＡ構築物に関する。さらに詳しくは、本発明は害虫抵抗性トウモロコシ植物ＴＣ１５０７と、サンプル中のトウモロコシ植物ＴＣ１５０７ＤＮＡおよびその組成物の存在を検出するためのアッセイとに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、害虫抵抗性トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）植物ＴＣ１５０７（トウモロコシＴＣ１５０７系統もしくはトウモロコシのイベントＴＣ１５０７とも呼ばれる）と、トウモロコシ植物ＴＣ１５０７のＤＮＡ植物発現構築物ならびにトウモロコシ植物ＴＣ１５０７およびその子孫にある導入遺伝子／隣接挿入領域の検出とに関する。
【０００３】
トウモロコシは重要な作物であり、世界中の多くの地域で主要な食糧源となっている。害虫に起因する損害は、化学的農薬等の防御手段の使用にもかかわらず、世界中のトウモロコシ作物損失の主要要因である。この観点から考えると、虫害を制御するために、また従来の化学的農薬の必要性を少なくするために、虫抵抗性がトウモロコシ等の作物に遺伝子組換えによって取り込まれてきた。遺伝子組換え害虫抵抗性作物を生産するために利用されてきた一群の遺伝子は、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂ．ｔ．）のデルタエンドトキシンである。デルタエンドトキシンは、トウモロコシと同様に、綿、ジャガイモ、米、ひまわり等の作物で成功裏に発現されている（Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８、９３９−９４３；Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ．ら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３１３−３２１；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｈ．ら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１１５１−１１５５；Ｔｕら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１１０１−１１０４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０１／１３７３１；およびＢｉｎｇ Ｊ Ｗら（２０００）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ，１４ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｏｌｏ．）。
【０００４】
植物での外来遺伝子の発現は、その植物のゲノム内での外来遺伝子の位置によって影響されることが知られており、このような影響は、おそらくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）もしくは組込部位近傍の転写制御因子（例えば、エンハンサー）の近接性によると考えられる（Ｗｅｉｓｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ ２２：４２１−４７７，１９８８）。同時に、ゲノム内の異なる位置にある導入遺伝子の存在は、異なる方法での植物の全体的な表現系に影響する。このことから、目的とする導入遺伝子の最適な発現によって特徴づけられるイベントを同定するために数多くのイベントをスクリーニングする必要がたびたび生ずる。例えば、導入遺伝子の発現レベルがイベント間で多種多様となり得ることが、植物および他の生物で観察されている。また、空間的または一時的発現パターンの違い（例えば、導入遺伝子構築物に存在する転写制御因子から予想されるパターンとは一致しないと思われる種々の植物組織での導入遺伝子の相対的発現の違い）もあると考えられる。この理由から、何百、何千もの異なるイベントを作り出し、これらのイベントを、商業目的のために所望の導入遺伝子発現レベルを有する単一のイベントについてスクリーニングすることが、一般的である。所望のレベルまたはパターンの導入遺伝子を持つイベントは、従来の育種法を用いた異系交配による他の遺伝的バックグラウンドへの導入遺伝子の遺伝子移入にとって、有用である。そのような交配の子孫は、元の形質転換体の特徴である導入遺伝子発現を維持する。この戦略は、局所的な成長条件に十分適応されるいくつかの種での信頼できる遺伝子発現を確かなものにすることに用いられる。
【０００５】
交配による子孫が目的の導入遺伝子を含むかどうかを判断するために、特定のイベントの存在を検出することが可能であることが、有利であると思われる。また、特定のイベントを検出することは、市販前の承認に必要な規則および遺伝子組換え作物由来食品の表示付けに必要な規則に従う上で、野外での作物の形質モニタリングや環境モニタリングで使用する上で、あるいは収穫された作物に由来する製品のモニタリングをおこなう上で、さらにまた規定もしくは契約条件に制約された当事者のコンプライアンスを確実にする上で、有用である。
【０００６】
限定されるものではないが、核酸プローブを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）等の任意の公知核酸検出方法によって、導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般に、頻繁に使用される遺伝的因子（例えば、プロモーター、ターミネーター、およびマーカー遺伝子）に焦点を当てている。なぜなら、多くのＤＮＡ構築物では、コード領域が互いに置換可能であるからである。その結果、それらの方法は、挿入された非相同ＤＮＡに隣接した隣接ＤＮＡのＤＮＡ配列が知られているにもかかわらず、異なるイベント間、特に同一ＤＮＡ構築物またはかなり類似した構築物を用いて作られるイベント間の違いを識別する上で有用ではないと思われる。例えば、イベント特異的ＰＣＲアッセイが、優良ＧＡＴ−ＺＭ１の検出に関する米国特許第６，３９５，４８５号に開示されている。したがって、イベントＴＣ１５０７の同定のための単純かつ判別可能な方法を有することが求められる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、好ましくは、害虫抵抗性単子葉植物作物の生産および選択のための方法に関する。より詳しくは、植物細胞および植物で発現された場合に昆虫に対する耐性を与えるＤＮＡ構築物が提供される。したがって、本発明の第１の局面によれば、植物細胞および植物で発現された場合に植物細胞に対して害虫抵抗性を与える宿主細胞への導入および該宿主細胞内での複製が可能なＤＮＡ構築物が提供される。ＤＮＡ構築物は、ＰＨＩ８９９９Ａと命名されたＤＮＡ分子から構成され、２つの導入遺伝子発現カセットを含む。第１の発現カセットは、５’非アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から単離された３’ＯＲＦ２５ 転写終結因子を含むＤＮＡ分子（Ｂａｒｋｅｒら（１９８３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２：３３５−３５０）に作用自在に結合したＣＲｙ１Ｆとして同定されるＢ．ｔ．６−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第５，１８８，９６０号および第６，２１８，１８８号）に作用自在に結合したトウモロコシユビキチン（Ｕｂｎｉ−１）遺伝子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．．５：２１３−２１８）の第１のイントロン、５’非翻訳エキソン、およびプロモーターを含むＤＮＡ分子を有する。上記ＤＮＡ構築物の第２の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター由来の３’転写終結因子を含むＤＮＡ分子（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９を参照せよ）に作用自在に結合したホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子をコードするＤＮＡ分子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ．ら（１９８８） Ｇｅｎｅ ７０：２５−３７）に作用自在に結合したＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ分子（Ｏｄｅｌｌ Ｊ．Ｔ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９）を有する。上記ＤＮＡ構築物を含む植物も提供される。
【０００８】
本発明の別の局面によれば、ＴＣ１５０７と表された新規のトウモロコシ植物を動態するために組成物および方法が提供され、該方法はＴＣ１５０７の５’および／または３’隣接配列を特異的に認識する。ＰＣＲ反応で利用された場合、遺伝子組換えイベントＴＣ１５０７に特有の単位複製配列を生ずるＤＮＡ分子が提供される。これらの分子を、
５’−ＧＴＡＧＴＡＣＴＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＣＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号１）；
５’−ＧＣＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号２）；
５’−ＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３’（配列番号２３）；
５’−ＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＴＡＡ−３’（配列番号３）；
５’−ＡＧＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＡＣ−３’（配列番号４）；
５’−ＧＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＴＣ−３’；（配列番号５）
からなる群ならびにそれらの相補体からなる群より選択することが可能である。これらの分子を含むトウモロコシ植物および分子は、本発明の一局面である。さらに、上記イベントＴＣ１５０７の同定のためのそれらのプライマー配列を利用するキットが提供される。
【０００９】
本発明の別の局面は、本明細書に記載したＴＣ１５０７の特異的隣接配列に関し、該配列は生物学的サンプルのＴＣ１５０７に対する特異的な同定方法を開発するのに有用であり得る。より詳しくは、本発明は配列番号２１、配列番号２２、およびＴＣ１５０７の５’／または３’隣接領域に関し、これらは特異的なプライマーおよびプローブの開発に使用し得る。本発明はさらに、そのような特異的プライマーまたはプローブの使用に基づいて生物学的サンプル中のＴＣ１５０７の存在を同定する方法に関する。
【００１０】
本発明の別の局面によれば、サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含むサンプルを、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７から抽出したゲノムＤＮＡによる核酸増幅反応で使用した場合に、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７にとって特徴的な単位複製配列を作るＤＮＡプライマーセットと接触させること、（ｂ）核酸増幅反応を実施することで、単位複製配列を生成すること、ならびに（ｃ）この単位複製配列を検出することを含む。
【００１１】
新規導入遺伝子／隣接挿入領域、配列番号２６、および配列番号２７を含み、また配列番号２６および配列番号２７に対して相同または相補的であるＤＮＡ分子が、本発明の一局面である。
【００１２】
新規導入遺伝子／隣接挿入領域、配列番号２６を含むＤＮＡ配列が本発明の一局面である。トウモロコシ植物ＴＣ１５０７にとって特徴的な単位複製配列産物の生産のためのプライマー配列として有用である、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチドと配列番号２６のトウモロコシ植物ＴＣ１５０７由来のトウモロコシゲノムおよび／または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドとが含まれるＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１３】
また、新規導入遺伝子／隣接挿入領域、配列番号２７を含むＤＮＡ配列が本発明の一局面である。トウモロコシ植物ＴＣ１５０７にとって特徴的な単位複製配列産物の生産のためのプライマー配列として有用である、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチドと配列番号２７のトウモロコシ植物ＴＣ１５０７由来のトウモロコシゲノムおよび／または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドとが含まれるＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１４】
本発明の別の局面によれば、配列番号２６のＤＮＡ配列の導入遺伝子部分の少なくとも１１以上のヌクレオチドまたはそれらの相補体と、配列番号２６の同様の長さのトウモロコシの５’隣接ＤＮＡ配列またはそれらの相補体とを含むＤＮＡ配列が、ＤＮＡ増幅方法でＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生産された単位複製配列は、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７にとって特徴的である。したがって、本発明はまた、配列番号２６に相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生産される単位複製配列を包含する。
【００１５】
本発明の別の局面によれば、配列番号２７のＤＮＡ配列の導入遺伝子部分の少なくとも１１以上のヌクレオチドまたはそれらの相補体と、配列番号２７の同様の長さのトウモロコシの３’隣接ＤＮＡ配列またはそれらの相補体とを含むＤＮＡ配列が、ＤＮＡ増幅方法でＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生産された単位複製配列は、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７にとって特徴的である。したがって、本発明はまた、配列番号２７に相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生産される単位複製配列を包含する。
【００１６】
より詳しくは、ＤＮＡ分子が配列番号１もしくはその相補体および配列番号２もしくはその相補体；配列番号２もしくはその相補体および配列番号２３もしくはその相補体；配列番号３もしくはその相補体および配列番号５もしくはその相補体；配列番号４もしくはその相補体および配列番号５もしくはその相補体として同定されるＤＮＡプライマーセットを含む一対のＤＮＡ分子が、本発明の局面である。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、配列番号１および配列番号２のＤＮＡ分子を含む単位複製配列；配列番号２および配列番号２３のＤＮＡ分子を含む単位複製配列；配列番号３および配列番号５のＤＮＡ分子を含む単位複製配列；ならびに配列番号４および配列番号５のＤＮＡ分子を含む単位複製配列を包含する。
【００１８】
本発明の別の局面によれば、サンプル中のイベントＴＣ１５０７に対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、該方法は、（ａ）トウモロコシ植物から抽出したＤＮＡを含むサンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でトウモロコシのイベントＴＣ１５０７から抽出したＤＮＡとハイブリダイズする一方でストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でコントロールトウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡプローブと接触させること、（ｂ）上記サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件にさらすこと、ならびに（ｃ）ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。より詳しくは、サンプル中のイベントＴＣ１５０７に対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法は、（ａ）トウモロコシ植物から抽出されたＤＮＡを含むサンプルを、そのイベントに特有な配列（例えば連結配列）からなりＤＮＡプローブ分子であって、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７から抽出されるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするＤＮＡプローブ分子と接触させること、（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件にサンプルおよびプローブをさらすこと、ならびに（ｃ）ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出すること、からなる。
【００１９】
さらに、配列番号２４内のＴＣ１５０７特異的領域を検出する生物学的サンプル内のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットおよび方法が提供される。
【００２０】
配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７からなる群より選択される配列または該配列の相補体からなる群より選択されるＴＣ１５０７の少なくとも１つの結合配列を含むＤＮＡ分子が提供され、結合配列は、ゲノムに挿入された非相同ＤＮＡと挿入部位を隣接するトウモロコシ細胞由来のＤＮＡ（すなわち、隣接ＤＮＡ）とのあいだの結合を補い、イベントＴＣ１５０７にとって特徴的である。
【００２１】
本発明の別の局面によれば、害虫抵抗性トウモロコシ植物を生産する方法は、（ａ）害虫抵抗性を与える本発明の発現カセットを含む第１のトウモロコシ親系統と害虫抵抗性が欠如した第２のトウモロコシ親系統とを交配させることで、複数の後代植物を生産すること、ならびに（ｂ）害虫抵抗性である後代植物を選択すること、を含む。そのような方法は、第２のトウモロコシ親系統に対して後代植物を戻し交配することで、害虫抵抗性であるトウモロコシ植物の純粋種を生産するさらなるステップを、任意に含むものであってもよい。
【００２２】
本発明は、害虫抵抗性であるトウモロコシ植物を生産する方法であって、ＤＮＡ構築物ＰＨＩ８９９９Ａ（配列番号２５）によってトウモロコシ植物細胞を形質転換すること、形質転換されたトウモロコシ細胞をトウモロコシ植物に成長させること、害虫抵抗性を示すトウモロコシ植物を選択すること、ならびにトウモロコシ植物を稔性トウモロコシ植物に成長させること、を含む方法を提供する。上記稔性トウモロコシ植物を、自家受粉または適合性のあるトウモロコシ種と交配して、害虫抵抗性の子孫を得ることができる。
【００２３】
本発明はさらに、生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７を同定するためのＤＮＡ検出キットに関する。好ましくは、本発明のキットは、ＰＣＲ同定プロトコルで使用するために、ＴＣ１５０７の５’もしくは３’隣接領域を特異的に認識する第１のプライマーと、ＴＣ１５０７の外来ＤＮＡ内または隣接ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第２のプライマーとを含む。本発明もまた、イベントＴＣ１５０７の特異的領域と８０％ないし１００％の配列同一性を持つ配列に一致または該配列に相補的である配列を有する特異的プローブを含む、生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットを提供する。好ましくは、プローブの配列は、イベントＴＣ１５０７の５’または３’ 隣接領域の一部を含む特異的領域に対応する。
【００２４】
本発明によって包含される方法およびキットを、以下に限定されるものではないが、植物、植物材料、あるいは限定されるものでないが、植物材料を含む、もしくは該植物材料から作られた食物もしくは飼料製品（生または加工済み）等の製品に含まれるイベントＴＣ１５０７を同定すること等の異なる目的のために、用いることができる。さらに、あるいはそれに代わって、本発明の方法およびキットを、遺伝子組換え材料と非遺伝子組換え材料とのあいだの分離を目的として遺伝し組換え植物材料の同定に用いることできる。さらに、あるいはその代わりに、本発明の方法およびキットを、トウモロコシのＴＣ１５０イベントを含む植物材料の品質を決定するのに用いることができる。キットは、上記検出方法を実行するために必要な試薬および材料を含むものであってもよい。
【００２５】
本発明はさらに、ＴＣ１５０７トウモロコシ植物またはその一部に関するもので、該一部として、限定されるものではないが、トウモロコシ植物ＴＣ１５０７およびそれに由来する子孫の花粉、胚珠、栄養細胞、花粉細胞の核、および卵細胞の核が挙げられる。本発明のＤＮＡプライマー分子が特異的単位複製配列産物を与えるトウモロコシ植物および種子ＴＣ１５０７は、本発明の一局面である。
【００２６】
本発明の上記局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付した図面から、よりいっそう明らかになる。
【００２７】
（詳細な説明）
以下の定義および方法は、本発明をより良く定義するために、また本発明の実施に際して当業者を導くために、提供される。特に示さない限り、用語は関連技術分野における当業者の慣例的用法にしたがって理解される。また、分子生物学での共通する用語の定義も、Ｒｉｅｇｅｒら，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、第５版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；およびＬｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に見いだされよう。３７ＣＦＲ１．８２２に記載のＤＮＡ塩基についての命名法が用いられる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現は「限定されるものではないが含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「トウモロコシ（ｃｏｒｎ）」という用語は、ズィーメイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）を意味するもので、トウモロコシの野生種を含むトウモロコシと交配し得るすべての植物種を包含する。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「ＴＣ１５０７特異的」という用語は、植物、植物材料、あるいは限定されるものでないが、植物材料を含む、もしくは該植物材料から作られた食物もしくは飼料製品（生または加工済み）等の製品に含まれるイベントＴＣ１５０７を識別可能に同定することに適したヌクレオチド配列のことをいう。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「害虫抵抗性（ｉｎｓｅｃｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」および「害虫に影響を及ぼす（ｉｍｐａｃｔｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ））」という表現は、昆虫の任意の発育段階での摂食、増殖、および／または行動に変化をもたらすことをいい、昆虫を殺すこと、成長を遅らせること、生殖能を抑制すること等が挙げられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「殺虫活性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」および「殺虫力（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という表現は、数多くのパラメーターによって測定し得る生物または物質（例えば、タンパク質）の活性に言及するために同義的に使われる。上記パラメーターとして、限定されるものではないが、適当な時間にわたって生物および物質に対して給餌および／または暴露した後の害虫致死率、害虫体重減少、害虫忌避性、ならびに害虫の他の行動的および生理的変化が挙げられる。例えば、「殺虫性タンパク質（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」は、単独で、あるいは他のタンパク質と組み合わさって、殺虫活性を示すタンパク質である。
【００３３】
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のことをいう。本明細書中で使用される場合、特定の核酸に関する文脈のなかで用いられる場合、「コードしている（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」または「コードされている（ｅｎｃｏｄｅｄ）」という表現は、特定のタンパク質にヌクレオチド配列が翻訳されるのを導くために必須の情報を上記核酸が含むことを意味する。タンパク質がコードされている核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含むものであってもよく、あるいはそのような介在非翻訳配列が欠けたもの（例えば、ｃＤＮＡにあるようなもの）であってもよい。
【００３４】
遺伝子（ｇｅｎｅ）は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントのことをいい、コード配列の上流にある制御配列（５’非コード配列）および該コード領域の下流にある制御配列（３’非コード配列）が挙げられる。「天然遺伝子（ｎａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ）」は、自然界で見いだされるような遺伝子のことをいい、それ自身の制御配列を有する。「キメラ遺伝子（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅ）は、天然遺伝子ではない任意の遺伝子をいい、自然界では一緒には見いだされない調節配列とコード配列とを含む。したがって、キメラ遺伝子は異なる源に由来する調節配列およびコード配列を含むものであってもよいし、あるいは同一の源に由来する調節配列およびコード配列を含むものであってもよいけれども、自然界で見いだされるものとは異なる様式で配置されている。「内因性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ）」は、生物のゲノム中の本来の位置にある天然遺伝子のことをいう。「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）」とは目的とする位置に通常見いだされてない物質をいう。したがって、「外来ＤＮＡ（ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ）」は、新たに導入された植物の再配列ＤＮＡと組換えＤＮＡとを含むものであってもよい。「外来」遺伝子は、宿主生物で通常見いだされない遺伝子のことをいうが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される。外来遺伝子は、非天然生物に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、形質転換という手段によってゲノムに導入された遺伝子である。組換えＤＮＡが挿入されている植物ゲノム内の部位を、「挿入部位（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）」または「標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）」ということもある。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「挿入ＤＮＡ（ｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡ）」は植物材料を形質転換させるために用いられる発現カセット内の異質ＤＮＡのことをいい、一方「隣接ＤＮＡ（ｆｌａｎｋｉｎｇ ＤＮＡ）」は植物等の生物に天然に存在するゲノムＤＮＡあるいは形質転換イベントに関連したフラグメント等の本来の挿入ＤＮＡ分子にとって異物である形質転換プロセスを介して導入された外来（異質）ＤＮＡのいずれかの存在であり得る。本明細書で用いられる「隣接領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」または「隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、少なくとも２０塩基対、好ましくは少なくとも５０塩基対、さらに最大で５，０００塩基対の配列であり、元の外来挿入ＤＮＡ分子の直上流もしくは隣接して、あるいは直下流もしくは隣接して位置している。外来遺伝子の無秩序な組込みをもたらす形質転換の手順は、各々の形質転換体にとって特徴的かつ固有の異なる隣接領域を含む形質転換体を生ずる。組換えＤＮＡが従来通りの交配を介して植物に導入される場合、その隣接領域は一般に変化しない。形質転換体は、異質挿入ＤＮＡの一断片とゲノムＤＮＡとの間、ゲノムＤＮＡの２断片間、あるいは異質ＤＮＡの２断片間の固有な連結も含む。「連結（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」は、２つの特定のＤＮＡ断片が結合する１つの点である。例えば、挿入ＤＮＡが隣接ＤＮＡと結合するところに連結が存在する。連結点もまた、天然の生物に見いだされるものから改変されるかたちで２つのＤＮＡ断片が互いに結合している形質転換生物に存在する。外来ＤＮＡの無作為な組込みを導く形質転換手順によって、各形質転換体に特有かつ固有の異なる隣接領域を含む形質転換体が得られる。「連結ＤＮＡ（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ＤＮＡ）」とは、連結点を含むＤＮＡのことをいう。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」とは外来種に由来する核酸である核酸のことをいい、あるいは同一種に由来するものであれば、意図的になされるヒトの干渉によって、組成および／またはゲノム遺伝子座が天然の形態から実質的に改変されている核酸のことをいう。例えば、非相同ヌクレオチド配列に作用自在に結合したプロモーターを、ヌクレオチド配列が由来する種とは異なる種から由来するものとすることができ、あるいは同一種に由来するものであるならば、ヌクレオチド配列に作用自在に結合することが自然には見いだされないプロモーターである。非相同タンパク質は、外来種に由来するものであってもよく、あるいはもし同一種に由来するものであるならば、意図的にされるヒトの干渉によって元の形態から実質的に改変される。
【００３７】
「制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、コード配列の上流に位置したヌクレオチド配列（５’非コード配列）、該コード配列内のヌクレオチド配列、あるいは該コード配列内の下流に位置したヌクレオチド配列（３’非コード配列）のことをいい、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、あるいは関連コード配列の翻訳に影響を及ぼす。制御配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができる。
【００３８】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なヌクレオチド配列のことをいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置している。このプロモーター配列は、近位の上流因子とより遠位の上流因子とからなり、後者の因子はしばしばエンハンサーといわれる。したがって、「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、プロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列であって、またプロモーターの不活性因子であってもよく、あるいはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるために挿入された非相同因子であってもよい。プロモーターは、天然遺伝子から該プロモーターの全体が由来するものであってもよく、あるいは自然界で見いだされる異なるプロモーターに由来する異なる因子から構成されるプロモーターであってもよく、あるいは合成ヌクレオチド部分から構成されるものであってもよい。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種で、あるいは成長の異なる段階で、もしくは異なる環境条件に対する応答のなかで、遺伝子発現を指示することが可能であることが、当業者によって理解される。ほとんどの時間でほとんどの細胞で発現される核酸断片を生ずるプロモーターは、一般に「構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と呼ばれる。植物細胞で有用な種々のタイプの新規プロモーターは、常に発見されており、数多くの例がＯｋａｍｕｒｏ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２によるコンパイルで見つかる可能性がある。多くの場合、制御配列は完全には規定されていないことから、異なる長さの核酸が同一のプロモーター活性を持つ可能性があると、さらに認められている。
【００３９】
「翻訳リーダー配列（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列とのあいだに位置したヌクレオチド配列のことをいう。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の完全に処理されたｍＲＮＡ上流に存在する。翻訳リーダー配列は、数多くのパラメーターに作用を及ぼす可能性があり、該パラメーターとして、ｍＲＮＡに対する一次転写産物のプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性、および／または翻訳効率が挙げられる。翻訳リーダー配列の例が記載されている（Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ （１９９５） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：２２５−２３６）。
【００４０】
「３’非コード配列（３’ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、コード配列の下流に位置したヌクレオチド配列のことをいい、ポリアデニル化認識配列とｍＲＮＡプロセッシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼし得る制御シグナルをコードする他の配列とが挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、一般にｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸トラクトの付加に作用することによって特徴づけられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら（１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０によって例示される。
【００４１】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内のコード配列によって定まる特定の順番で配置された複数のアミノ酸からなる鎖である。
【００４２】
ＤＮＡ構築物は、互いに結合したＤＮＡ分子の集合体であり、１つ以上の発現カセットを提供する。ＤＮＡ構築物は、細菌細胞での自己複製が可能となったプラスミドであってもよく、機能性遺伝因子（すなわち、特に、プロモーター、イントロン、リーダー、コード配列、および３’末端領域）を提供するＤＮＡ分子の導入に有用である種々のエンドヌクレアーゼ酵素制限部位を含む。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ分子の直鎖状集合体、例えば１つの発現カセットであってもよい。ＤＮＡ構築物に含まれる発現カセットは、伝令ＲＮＡの転写を生ずるために必須の遺伝因子を含む。発現カセットを、原核細胞もしくは真核細胞で発現するように設計することができる。本発明の発現カセットは、植物細胞で最も好ましく発現するように設計される。
【００４３】
本発明のＤＮＡ分子は、目的とする生物での発現のための発現カセットに提供される。このカセットは、本発明のコード配列に作用自在に結合した５’および３’調節配列を含む。「作用自在に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、結合している核酸配列が隣接し合っており、２つのタンパク質コード領域が連結する必要性がある場合、隣接し、かつ同一リーディングフレームにあることを意味する。作用自在に結合することが意図することは、プロモーターと第２の配列とのあいだの機能的結合を示すことであり、その第２の配列に対応したＤＮＡ配列の転写の開始および実行にプロモーター配列が関与する。上記カセットに、生物に同時形質転換される少なくとも１つの遺伝子を新たに加えることも可能である。あるいは、追加の遺伝子を多重発現カセットまたは多重ＤＮＡ構築物に設けることができる。
【００４４】
発現カセットは、転写の５’から３’方向に、宿主として働く生物で機能的な転写および翻訳開始領域、コード領域、および転写および翻訳終止領域を含む。転写開始領域（すなわち、プロモーター）は、宿主生物に対して天然もしくは類似、あるいは外来もしくは異質であってもよい。さらに、プロモーターは天然の配列もしくはそれにとって代わるものとして合成配列であってもよい。発現カセットは、発現カセット構築物内に５’リーダー配列を含む。そのようなリーダー配列は翻訳を高めるように作用することができる。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子組換え（トランスジェニック、ｔｒａｎｓｇｅｎｅｎｉｃ）」という用語は、非相同核酸の存在によって遺伝子型が変えられた任意の細胞、細胞系統、カルス、組織、植物の一部分、または植物を包含し、そのように改変された遺伝子組換えに加えて、最初の遺伝子組換えから交配または無性生殖によって作られた遺伝子組換えも含まれる。本明細書で使用される「遺伝子組換え」という用語は、従来の植物育種法または自然発生的なイベント（例えば、無作為他家受精、非組換え型ウイルス感染、非組換え型細菌形質転換、非組換え型転位、もしくは偶発突然変異）によって、ゲノム（染色体または染色体外）の変化を含まない。
【００４６】
遺伝子組換え「イベント（ｅｖｅｎｔ）」は、異質ＤＮＡ構築物による植物細胞の形質転換によって生じるもので、目的とする導入遺伝子を含む核酸発現カセット、植物ゲノムへの導入遺伝子の挿入によって生ずる植物集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴づけられる特定の植物の選択が挙げられる。イベントは、表現型の上では、導入遺伝子の発現によって特徴づけられる。遺伝子レベルでは、イベントは、植物の遺伝学的構成の一部である。「イベント」という用語は、形質転換体と異質ＤＮＡを含む他の種とのあいだの外部交配によって生ずる子孫のこともいう。反復親に対する反復戻し交配後でさえ、形質転換された親由来の挿入ＤＮＡおよび隣接ＤＮＡが同一染色体上の位置に、上記交配の後代に存在する。「イベント」という用語は、挿入ＤＮＡ（例えば、自家受粉によって生じた子孫および元の形質転換体）を含む親系統と挿入ＤＮＡを含まない親系統との交配の結果として、目的とする導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る子孫への転移が期待される挿入ＤＮＡに直に隣接した挿入ＤＮＡおよび隣接配列を含む形質転換体に由来するＤＮＡのこともいう。
【００４７】
害虫抵抗性ＴＣ１５０７トウモロコシ植物は、遺伝子組換えＴＣ１５０７トウモロコシ植物から生長したトウモロコシ植物と害虫抵抗性を与える本発明の発現カセットによる形質転換に由来したその後代とからなる第１の親トウモロコシ植物と、害虫抵抗性を持たない第２の親トウモロコシ植物とを一代交配させて複数の第一後代植物を作り、次に、害虫抵抗性の第一後代植物を選択し、この第一後代植物を自家受粉させることで、複数の第２の後代植物を作り、次に第２の後代植物から害虫抵抗性植物を選択することによって、育種することができる。これらのステップは、さらに、害虫抵抗性第一後代植物または害虫抵抗性第二後代植物を第２の親トウモロコシ植物または第３の親トウモロコシ植物と戻し交配することで、害虫耐性であるトウモロコシ植物が得られる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「植物（ｐｌａｎｔ）」という用語は、全ての植物、植物器官（例えば、葉、茎、および根）、種子、植物細胞、およびその子孫について言及するものである。本発明の範囲内であると理解される遺伝子組換え植物の部分は、例えば、本発明のＤＮＡ分子によって事前に形質転換された遺伝子組換え植物およびその子孫に由来する植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚、同様に花、茎、果実、葉、および根を含むことから、少なくとも部分的には遺伝子組換え細胞からなるものも本発明の一局面である。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「植物細胞（ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）という用語は、限定されることなく、種子、懸濁培養、胚、分裂組織細胞領域、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、造胞体、花粉、および花粒粉を包含する。本発明の方法で使用し得る植物の網は、通常、形質転換技術に受け入られる高等植物の種類と同程度に広く、単子葉植物および双子葉植物の両方が挙げられる。
【００５０】
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、核酸断片を宿主生物のゲノムに移して、遺伝的に安定な遺伝的形質を得ることをいう。形質転換核酸断片を含む宿主生物を「遺伝子組換え（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」生物という。植物形質転換法の例として、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（Ｄｅ Ｂｌａｅｒｅら（１９８７） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７）および粒子加速もしくは「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号、本明細書で援用）が挙げられる。別の形質転換方法を以下に開示する。
【００５１】
したがって、本発明の単離ポリヌクレオチドを組換え体構築物、概してＤＮＡ構築物に取り込むことができ、該構築物は宿主細胞への導入および該宿主細胞での複製をおこなうことが可能である。そのような構築物をベクターとすることができ、ベクターは所定の宿主細胞でポリペプチドコード配列の転写および翻訳をおこなうことができる。植物細胞の安定的トランスフェクションまたは遺伝子組換え植物の確立に適したいくつかのベクターが、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら， （１９８５；上掲１９８７） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ （１９８９） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； およびＦｌｅｖｉｎら， （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。一般に、植物発現ベクターとして、例えば、５’および３’制御配列および優性選択可能なマーカーの転写制御下にある１種類以上のクローン化植物遺伝子が挙げられる。そのような植物発現ベクターは、プロモーター制御領域（例えば、誘導もしくは構成的、環境もしくは発生的に制御された、または細胞もしくは組織特異的である発現）、転写開始の開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位、および／あるいはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。
【００５２】
２つの異なる遺伝子組換え植物を交配させて２つの独立して分離する追加された外来遺伝子を含む子孫を生ずることも可能であることも理解される。適当な子孫の自家受粉によって、両方の追加された外来遺伝子に関してホモ接合性である植物を生産することができる。親植物に対する戻し交配と非遺伝子組換え植物との外部交配もまた、栄養生殖のように、考えられる。他の育種法の説明は、異なる形質および作物に関して一般的に用いられており、いくつかの参考文献の１つ、例えばＦｅｈｒ， ｉｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｗｉｌｃｏｓ Ｊ． ｅｄ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ． （１９８７）に見いだすことができる。
【００５３】
「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、もしくは酵素が取り付けられる単離された核酸である。そのようなプローブは、標的核酸の一本の鎖に対して相補的であり、本発明の場合、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７からの単離ＤＮＡの鎖に、トウモロコシ植物に由来もしくは該イベント由来のＤＮＡを含むサンプルに由来するにせよ、相補的である。本発明にもとづくプローブとして、デオキシリボ核酸もしくはリボ核酸のみならず、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用し得るポリアミド類および他のプローブ材料が挙げられる。
【００５４】
「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成するために核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニールされ、次にポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）によって標的ＤＮＡ鎖に沿って延伸される単離された核酸である。本発明のプライマー対とは、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅法によって、標的核酸配列を増幅させる用途のことをいう。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」は、特的ＤＮＡセグメントを増幅させるために用いられる技術である（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，８００，１５９号（本明細書で援用）を見よ）。
【００５５】
プローブおよびプライマーは、操作者が定めたハイブリダイゼーション条件または反応条件で特異的に標的ＤＮＡ配列に結合する十分なヌクレオチド長である。この長さは、一般に選ばれる検出方法で有用である十分な長さである任意の長さであってもよい。一般に、長さが１１ヌクレオチド以上、好ましくは１８ヌクレオチド以上、より好ましくは２２ヌクレオチド以上が用いられる。そのようなプローブおよびプライマーは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明のプローブおよびプライマーは、標的配列と隣接ヌクレオチドのＤＮＡ配列類似性が完全であり、プローブが標的ＤＮＡ配列とは異なっても、標的ＤＮＡＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション能力を従来の方法によって設計することができる。プローブはプライマーとして使用することもできるが、一般に標的ＤＮＡまたはＲＮＡと結合するように設計されており、増幅プロセスでは使用されない。
【００５６】
特異的プライマーを用いて組込み断片を増幅し、生物学的サンプルでのイベントＴＣ１５０７を同定するための「特異的プローブ」として使用し得る単位複製配列を作ることができる。プローブが、該プローブと生物学的サンプルとの結合を可能にする条件下で、その生物学的サンプルの核酸とハイブリダイズする場合、この結合を検出することができるので、生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７の存在を示すことが可能である。そのような結合プローブの同定は、当技術分野で記載されている。特異的プローブは、望ましくは、最適化された条件下で、特異的に、上記イベントの５’または３’隣接領域内の領域にハイブリダイズし、好ましくはそれに隣接した外来ＤＮＡの一部を含む。好ましくは、特異的プローブは、上記イベントの特的領域と、少なくとも８０％、より好ましくは８０％ないし８５％、より好ましくは８５％ないし９０％、特に好ましくは９０％ないし９５％、さらに最も好ましくは９５％ないし１００％同一（または相補的）である。
【００５７】
プローブおよびプライマーを調製および使用するための方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， ｖｏｌ． １−３， ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． １９８９ （以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９」とする）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２ （定期的更新を含む） （以下、「Ａｕｓｕｂｅｌら， １９９２」とする）； およびＩｎｎｉｓら， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えばそのような目的を意図したコンピュータプログラムを用いることによって、既知の配列から得ることができ、該プログラムの例として、ＰＣＲプライマー分析ツールを含むＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖｅｒｓｉｏｎ ６ （Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．， Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）；ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ （ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）； およびＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， (c)１９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．）が挙げられる。さらに、当業者に既知のガイドラインを用いて、配列を視覚的に走査してプライマーを手動で同定することができる。
【００５８】
本明細書で用いられる「キット（ｋｉｔ）」とは、本発明の目的、より詳しくは生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７の同定を実施することを目的とした複数の試薬からなるセットのことをいう。品質管理（例えば、種子ロットの純度）、植物材料のＴＣＶ１５０７イベントの検出、あるいは植物材料を含む材料もしくは該植物材料に由来する材料、例えば限定されるものではないが食品または飼料のために、本発明のキットを用いることができ、またその成分を明確に調節することができる。本明細書で用いられるように「植物材料（ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）とは、植物から得られる材料または植物に由来する材料のことをいう。
【００５９】
本明細書に開示された隣接ＤＮＡおよび挿入配列に基づいたプライマーおよびプローブを、従来の方法（例えば、そのような配列の再クローニングおよびシークエンシング）によって、開示された配列を確認するために（および、もし必要ならば、訂正するために）用いることができる。本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いて、サンプル中での遺伝子組換えイベント由来ＤＮＡの存在を同定することができる。核酸分子またはその断片は、一定の環境で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書中で使用される場合、２つの核酸分子は、２つの核酸分子が逆平行性の二重鎖核酸構造を形成することが可能であるならば、互いに特異的にハイブリダイズすることが可能であると考えられる。
【００６０】
核酸分子は、完全な相補性を他の核酸分子とともに示すならば、この他の核酸分子の「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」であると考えられる。本明細書中で使用される場合、一方の分子の各々のヌクレオチドが他方の分子のヌクレオチドに対して相非的である場合、これらの分子は「完全な相補性（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」を示すと考えられる。２つの分子は、少なくとも従来の「ストリンジェンシーが低い（ｌｏｗ−ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」条件下で互いにアニールしたままであることを許すのに十分な安定性をもって互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」と考えられる。同様に、上記分子は、少なくとも従来の「ストリンジェンシーが高い（ｈｉｇｈ−ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」条件下で互いにアニールしたままであることを許すのに十分な安定性をもって互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」と考えられる。従来のストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９、およびＨａｙｍｅｓら， Ｉｎ： 核酸 ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． （１９８５）に記載されており、したがって完全な相補性からの逸脱は、該逸脱が二重鎖を形成する分子の能力を完全に排除しない限り、許される。プライマーまたはプローブとして役に立つ核酸分子となるように、用いられた特定の溶媒および塩濃度のもとで、安定な二重鎖を形成することが可能であるように、配列が十分に相補的であることのみが求められる。
【００６１】
ハイブリダイゼーション反応では、特異性は一般にハイブリダイゼーション後の洗浄であり、最終洗浄溶液の温度およびイオン強度が重要な要素である。熱融解点（Ｔｍ）は、相補的標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ （１９８４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３８：２６７−２８４の等式、すなわちＴｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／ＬからＴｍを近似させることができ、式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合、％形態はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合、さらにＬは塩基対内のハイブリッドの長さである。各々１％のミスマッチで約１℃、Ｔｍが減少する。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を、所望の同一性の配列に対してハイブリダイズするように調節することができる。例えば、＞９０％同一性を持つ配列が求められた場合、Ｔｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特異的配列およびその相補体のＴｍよりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１、２、３、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、また中程度のストリンジェントな条件では、Ｔｍよりも６、７、８、９、または１０℃でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェントな条件では、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。
【００６２】
上記等式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを用いることで、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化が本質的に記載されていることを理解する。もし所望の度合いのミスマッチによってＴｍが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低くなるならば、より高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての詳しい指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−− Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ 核酸 Ｐｒｏｂｅ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌら， ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見いだされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）を見よ。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、実質的に相同な配列は、ストリンジェンシーが高い条件下で比較されている核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェントな条件は、例えば、約４５℃の６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃で２ｘＳＳＣによる洗浄が当業者に知られており、あるいはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に見いだすことができる。一般に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０ないし８．３で、約１．５ＭＮａイオン未満、通常、約０．０１ないし１．０ＭＮａイオン濃度（あるいは他の塩類）であり、温度は短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃で、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを上回る）に対して少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の脱安定化剤の添加によって達成することが可能である。典型的な低ストリンジェントな条件として、３７℃で、３０ないし３５％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液でハイブリダイゼーションをおこない、５０ないし５５℃で１Ｘないし２ＸＳＳＣ（２０ＸＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）で洗浄することが挙げられる。典型的な高ストリンジェントな条件として、３７℃で、５０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液、でハイブリダイゼーションをおこない、６０ないし６５℃で０．１ＸＳＳＣで洗浄することが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の核酸を、イベントＴＣ１５０７またはその相補体あるいはいずれかの断片に特有の１つ以上の核酸分子に対して、中程度にストリンジェントな条件で、特異的にハイブリダイズさせる。
【００６４】
比較のために配列を位置合わせする方法が当技術分野で周知である。したがって、任意の２つの配列間でのパーセント同一性を決定することは、数学的なアルゴリズムを用いることで達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈら（１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２の局所相同アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３の相同位置合わせアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４−２４４８の類似性検索方法（ｓｅａｒｃｈ−ｆｏｒ−ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−ｍｅｔｈｏｄ）、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７によって改変されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズムである。
【００６５】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータインプリメンテーションを配列同一性の決定のための配列比較に利用することができる。そのようなインプリメンテーションとして、限定されるものではないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．より入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）、ＡＬＩＧＮ ＰＬＵＳプログラム （ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０、著作権１９９７）、およびＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０ （ Ａｃｃｅｌｒｙｓ、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ． ９２１２１、ＵＳＡより入手可能）が挙げられる。これらのプログラムを用いた位置合わせを、デフォルトパラメーターを用いて実行することができる。
【００６６】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ ７３： ２３７−２４４ （１９８８）； Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５： １５１−１５３ （１９８９）； Ｃｏｒｐｅｔ，ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６： １０８８１−９０ （１９８８）； Ｈｕａｎｇ，ら， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８： １５５−６５ （１９９２）、およびＰｅａｒｓｏｎ，ら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４： ３０７−３３１ （１９９４）によって詳しく記載されている。ＡＬＩＧＮおよびＡＬＩＧＮ ＰｌＬＵＳプログラムは、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８）上掲のアルゴリズムにもとづいている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０）上掲のアルゴリズムにもとづいている。データベース類似性検索に使えるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーとして、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のＢＬＡＳＴＸ、タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のＢＬＡＳＴＰ、ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のＴＢＬＡＳＴＮ、ならびにヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のＴＢＬＡＳＴＸが挙げられる。 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ １９， Ａｕｓｕｂｅｌ，ら， Ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９５）を見よ。位置合わせまた、検査によって手動で実行することが可能である。
【００６７】
比較を目的としてギャップ位置合わせ（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＳＴ２．０内）を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９に記載したように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０内）を用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）上掲を見よ。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、各々のプログラム（例えば、ヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質のＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｈｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を見よ。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈にある「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、特定の比較窓全体にわたる最大一致に対して位置合わせした場合に、同一である２つの配列の残基に言及する。配列同一性の割合をタンパク質に関して用いる場合、同一ではない残基位置が保守的アミノ酸置換によってしばしば異なることが認められ、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に対して置換されるので、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なるとき、パーセント配列同一性は置換の保守的な性質を修正するために上方を調整される可能性がある。配列が保守的置換で異なる場合、配列同一性率を上方調整して置換の保守的性質について修正をおこなってもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」または「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」があると言われている。この調整をするための手段は、当業者に周知である。概して、このことは、完全なミスマッチよりはむしろ部分的なものとして保守的置換を採点することを伴い、それによって配列同一性率が増加する。このように、例えば、同一アミノ酸に得点１が与えられ、非保守的置換の得点はゼロであり、保守的置換にゼロないし１の得点があたえられる。保守的置換の採点は、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ （Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にインプリメントされるようにして、計算される。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性の割合（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、比較窓上に最適に位置合わせされた２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、２つの配列の最適位置合わせに対して参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて、比較窓内のポリヌクレオチド配列の一部が付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むものであってもよい。上記割合は、一致した位置の数を得るために、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生ずる位置の数を測定し、比較窓内の位置の全数で一致した位置の数を割り、結果に対して１００を掛けることで配列同一性の割合を求めることによって、計算される。
【００７０】
特定の増幅プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、プライマー対が標的核酸配列のみにハイブリダイズすることを可能とする条件であり、その標的核酸配列に、対応の野生型配列（またはその相補体）を持つプライマーが結合し、好ましくは固有の増幅産物である単位複製配列をＤＮＡ熱増幅反応で生ずる。
【００７１】
「（標的配列に対して）特異的な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ （ａ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））」という表現は、プローブまたはプライマーがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、標的配列を含むサンプル中でその標的配列のみとハイブリダイズすることを示す。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「増幅ＤＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ）または「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」とは、核酸テンプレートの一部である標的核酸配列の核酸増幅の産物のことをいう。例えば、交配の結果生ずるトウモロコシ植物が、本発明のトウモロコシ植物由来の遺伝子組換イベントゲノムＤＮＡを含むかどうかを決定するために、トウモロコシ植物組織サンプルから抽出したＤＮＡを、ＤＮＡプライマー対を用いた核酸増幅法にさらしてもよく、該ＤＮＡプライマー対は、異質挿入ＤＮＡの挿入部位に隣接した隣接配列に由来する第１のプライマーと、ＤＮＡイベントの存在にとって特徴的な単位複製配列を生成するために異質挿入ＤＮＡに由来する第２のプライマーとを含む。あるいは、第２のプライマーが隣接配列に由来するものであってもよい。単位複製配列は一定の長さで、上記イベントに特徴的でもある配列を有する。単位複製配列の長さは、プライマー対とヌクレオチド塩基対とを組み合わせた長さから、ＤＮＡ増幅プロトコルによって生産可能な任意の長さの単位複製配列に至るまでの範囲であってもよい。あるいは、プライマー対は、図１に示すように、約６．２ｋｂの大きさであるＰＨＩ８９９９Ａ発現構築物の挿入ヌクレオチド配列全体を含む単位複製配列を生成するようにして、挿入ＤＮＡの両側で、隣接配列に由来することができる。隣接配列に由来するプライマー対の一つの構成要素を、挿入ＤＮＡ配列から離間して配置してもよく、この離間距離は１塩基対から増幅反応の限界までの範囲、あるいは約２０，０００塩基対とすることができる。「単位複製配列」という用語の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応で形成され得るプライマー二量体を特異的に排除する。
【００７３】
核酸増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を含む当技術分野で公知の種々の核酸増幅法のいずれかによって達成し得る。種々の増幅法が当技術分野で公知であり、また記載されており、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号および第 ４，６８３，２０２号に記載され、またＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｅｄ． Ｉｎｎｉｓら， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、最大で２２ｋｂのゲノムＤＮＡならびに最大で４２ｋｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために、開発された（Ｃｈｅｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：５６９５−５６９９、１９９４）。ＤＮＡ増幅の技術分野で知られている他の方法と同様に、それらの方法を本発明が実施される際に用いることが可能である。特定のＰＣＲプロトコルのいくつかのパラメーターを特定の実験室条件に調整することが必要であり、またわずかに修飾することも可能であり、さらに同様の結果を収集することが可能である。これらの調整は、当業者にとって明らかである。
【００７４】
これらの方法によって生産される単位複製配列は、複数の技術によって検出することが可能であり、該技術として、限定されるものではないが、隣接する隣接ＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするようにＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されるＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ （Ｎｉｋｆｏｒｏｖ，ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２２： ４１６７−４１７５， １９９４）が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、マイクロウエルプレートのウエル内に固定される。目的とする領域のＰＣＲ（挿入配列に１つのプライマーを用い、隣接する隣接領域にも１つ用いる）をおこなった後、単鎖ＰＣＲ産物を固定化オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができ、ＤＮＡポリメラーゼおよび予想される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを用いる単一塩基伸長反応のテンプレートとしての役割を果たす。読み出しは、蛍光またはＥＬＩＳＡをベースとすることが可能である。シグナルは、成功裏になされる増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長による挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７５】
別の検出方法は、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ． Ｐｈａｒｍａ． Ｔｅｃｈ． ００： １８−２４、２０００）に記載されているピロ塩基決定法である。この方法では、隣接ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡ連結にかさなるオリゴヌクレオチドが設計されている。オリゴヌクレオチドは、目的とする領域に由来する単鎖ＰＣＲ産物（挿入配列にプライマーが一つあり、隣接配列にプライマーが１つある）にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸、およびルシフェリンの存在下で、インキュベートされる。ｄＮＴＰは個々に添加され、その取り込みは、測定される光シグナルを生ずる。光シグナルは、成功裏になされる増幅、ハイブリダイゼーション、および単一または多重塩基伸長による導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７６】
Ｃｈｅｎら，（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ９：４９２−４９８， １９９９）に記載されたような蛍光偏光は、本発明の単位複製配列を検出するために用い得る方法である。この方法を用いることで、隣接および挿入ＤＮＡ連結をおおうオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、目的とする領域に由来する単鎖ＰＣＲ産物（挿入ＤＮＡ配列にプライマーが一つあり、隣接ＤＮＡ配列にプライマーが１つある）にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一塩基伸長は、ｄｄＮＴＰの取り込みをもたらす。取り込みは、蛍光光度計を用いた偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、成功裏になされる増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長による導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７７】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量するための方法として記載されており、製造元によって提供される指示書で完全に理解される。手短に言うと、隣接および挿入ＤＮＡ連結に重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列にプライマーが一つあり、隣接ゲノム配列にプライマーが１つある）が耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、循環される。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、ＦＲＥＴプローブ上で消光部分から離れて、切断と蛍光部分の放出とに帰着する。蛍光発光は、成功裏になされる増幅とハイブリダイゼーションとによる隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００７８】
分子指標は、Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４：３０３−３０８、１９９６）に記載されたように、シークエンシングで使用するために記載されている。手短に言うと、隣接および挿入ＤＮＡ連結に重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブの固有の構造が、近接近状態で蛍光および消光部分の２次構造をもたらす。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列にプライマーが一つあり、隣接配列にプライマーが１つある）が耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、循環される。成功裏になされるＰＣＲ増幅の後、ＦＲＥＴプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブの２次構造の除去をもたらし、蛍光および消光部分の空間的分離をもたらす。蛍光シグナルが生ずる。蛍光シグナルは、成功裏になされる増幅およびハイブリダイゼーションによる隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００７９】
アンプリオン内で見いだされる配列に対して特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、単位複製配列がＰＣＲ反応によって生ずることを検出するために用いられるさらに別の方法である。
【００８０】
本発明は、以下の実施例によってさらに定義される。発明の好ましい実施形態を示す一方で、これらの実施例が説明することのみを目的として与えられることが理解されなければならない。上記の考察とこれらの例から、当業者は、本発明の必須特性を確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それをさまざまな用途および状況に適応させるために、発明の種々の変更および修飾をおこなうことができる。このように、発明の種々の変形は、本明細書に例示および記載したものに加えて、前述の説明から当業者にとって明らかである。そのような変形は、添付の請求の範囲の範囲内にあることも意図している。
【００８１】
本明細書中に述べられた前述の参照の各々の開示は、全体として本明細書に援用される。
【実施例】
【００８２】
（実施例１．粒子衝突によるトウモロコシの形質転換とＣｒｙ１Ｆ遺伝子含有遺伝子組換え植物の再生）
ＰＨＩ８９９９Ａと表された６．２ｋｂのＤＮＡ分子（図１参照、配列番号２５）は、アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から単離した３’ＯＲＦ２５転写終結因子（Ｂａｒｋｅｒら（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２：３３５−３５０）に作用自在に結合したＣｒｙ１Ｆと同定されたバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の６−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第５，１８８，９６０号および６，２１８，１８８号）に作用自在に結合したトウモロコシユビキチン（Ｕｂｎｉ−１）遺伝子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８：６７５−６８９およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９９６） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ５：２１３−２１８）のプロモーター、５’非翻訳エキソン、および第１のイントロンを含む第１の導入遺伝子発現カセットと、（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’転写終結因子（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：４９−５９）を含むＤＮＡ分子に作用自在に結合した選択可能なマーカーであるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ．ら（１９８８） Ｇｅｎｅ ７０：２５−３７）に作用自在に結合したカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５プロモーター（Ｏｄｅｌｌ Ｊ． Ｔ．ら（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ８１０−８１２； Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：４９−５９）のＤＮＡ分子を含む第２の導入遺伝子発現カセットとを有し、トウモロコシ胚組織を形質転換するために用いられる。
【００８３】
Ｂ．ｔ Ｃｒｙｓｔ１Ｆトウモロコシ植物は、基本的にＫｌｅｉｎら（１９８７） Ｎａｔｕｒｅ、ＵＫ ３２７（６１１７）：７０−７３に記載されているように、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡが製造したＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（登録商標）ＰＤＳ−１００Ｈｅ粒子ガンを用いた微小発射体ボンバードメントを用いて得た。受粉直後に収穫したトウモロコシ穂から単離した未成熟胚を数日間にわたってカルス誘導培地で培養した。形質転換の日に、タングステン微粒子を精製ＰＨＩ８９９９ＤＮＡ（配列番号２５）で被覆して培養胚への取り込みを促すことで、培養胚での細胞染色体への挿入ＤＮＡの取り込みが行われた。挿入ＰＨＩ８９９９Ａのみが形質転換の過程で使用され、形質転換体へのさらなるプラスミドＤＮＡの取り込みは起こらなかった。ボンバードメント後、選択剤としてグルフォシネートを含むカルス誘導培地に胚を移した。培養中、個々のカルスを物理的に分けておいたところ、外植体の大部分がその選択培地上で死滅した。
【００８４】
生き残って正常なグルフォシネート耐性カルスを生産する胚に対して、推定上の形質転換イベントを表す固有の識別コードを割り当て、新鮮な培地に連続して移した。各々の固有のイベントに由来する組織から植物を再生させ、該植物を温室に移した。分子レベルで分析をおこなうために葉サンプルを採取し、ＰＣＲによる導入遺伝子の有無の確認およびＥＬＩＳＡによるＣｒｙ１Ｆタンパク質の発現について確認をおこなった。次に、植物を、アワノメイガ昆虫を用いた全草バイオアッセイに供した。陽性の植物を近交系とかけ合わせて、最初の形質転換植物から種子を得た。この分野で多数の系統を評価した。イベントＴＣ１５０７を、虫害抵抗性および農学的特性等の優れた特徴の組み合わせに基づいた、独立した遺伝子組み換えイベントの母集団から選択した（Ｂｉｎｇ Ｊ Ｗら（２０００） Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ、１４ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｃｏ．を見よ。なお、この文献を本明細書で援用する）。
【００８５】
（実施例２．バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） Ｃｒｙ１Ｆ トウモロコシＴＣ１５０７系統の遺伝子組換え挿入ＤＮＡに対して５’側の隣接配列を含むヌクレオチドの同定）
イベントＴＣ１５０７内のＰＨＩ８９９Ａ挿入に対して５’側の配列を含んだＤＮＡ断片を同定するために、イベントＴＣ１５０７ゲノムＤＮＡ由来のＳｐｅＩ制限酵素断片をアガロースゲル上でサイズ選択、精製、およびサウザン分析によるスクリーニングをおこなうことで、Ｃｒｙ１Ｆプローブに対するハイブリダイゼーションを確認した。エンリッチされたサイズ選択プラスミド系ゲノムＤＮＡライブラリーを調製するために、ハイブリダイゼーションおよび断片サイズの確認後、目的とする断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（商標）クローニングベクターにクローニングした。Ｃｒｙ１Ｆ遺伝子の一部に相同なプローブを用いて、陽性クローンに対するプラスミドライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを同定し、新たなスクリーニングによって精製し、さらにＣｒｙ１Ｆプローブにハイブリダイズした場合に陽性シグナルをもたらすかを確認した。単離された陽性クローンに含まれるＳｐｅＩ断片の初期３ｋｂを、プライマーウオーキングアプローチを用いて、シークエンシングをおこなった。第１のシークエンシングを開始させるために、クローニングベクターＤＮＡ内の基知の基地の配列に結合するプライマーを設計して目的とするＤＮＡの一部分をシークエンシングした。逆方向に配向した別のプライマーを用いた同一領域にわたる第２のシークエンシングの実行は、第２の鎖の範囲（カバリッジ）を与えた。プライマーウオーキングは、先行する実行から得た配列データを繰り返し用いることによって達成され、新規のプライマーを設計した。このプライマーは、次に、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の挿入遺伝子組換えＤＮＡに対して５’側の隣接領域が得られるまで、目的とするＤＮＡまでさらにシークエンシングの次のラウンドを伸ばすために用いられる。得的配列情報を実施例４に示す。
【００８６】
（実施例３．Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｆトウモロコシ１５０７系統挿入に対して５’側の隣接配列の確認）
Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｆトウモロコシ１５０７系統挿入の５’隣接配列を確認するために、ＰＣＲプライマー対を設計して５’隣接領域から完全長ＰＨＩ８９９９Ａ遺伝子組換え挿入に延びる重複ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を成功裏にＢ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｆトウモロコシ１５０７系統ゲノムＤＮＡから増幅し、単離し、表１に示すように領域１から領域６までのシークエンシングをおこない、実施例２に記載したＳｐｅＩ断片由来の既に決定された配列と一致するか確認した。しかし、完全長挿入の開始に対して直に隣接し、かつ５’側である２３５８ｂｐから２８２９ｂｐまでの領域は、ＰＣＲ増幅にとっては扱いにくく、上記したＳｐｅＩから得た配列よりも大きいことがわかった。この領域とＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＧＣ２Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）を隣接するプライマー対の使用は、Ｂ．ｔ． Ｃｒｙ１ＦトウモロコシＴＣ１５０７系統ゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物の増幅では成功裏になされた。Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＧＣ２システムによる単位複製配列の生産に用いられる増幅条件を表１０に示す。２３５８ｂｐないし２８２９ｂｐの領域にある配列を確認するために用いられるＤＮＡプライマー対は、配列番号１および配列番号２ならびに配列番号２および配列番号２３に挙げられたものである。この領域の配列を表１に記載する（領域７ａ、７ｂ、および８）。
【００８７】
（実施例４．イベントＴＣ１５０７の５’隣接配列。各々の領域を表１に記述する）
（領域１（配列番号２８） トウモロコシゲノム（有意な相同性なし））
１ ＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣ ＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴ ＣＧＴＧＣＣＣＣＴＡ ＣＣＣＣＡＣＣＧＡＣ ＧＴＴＴＡＴＧＧＡＡ
５１ ＧＧＴＧＣＣＡＴＴＣ ＣＡＣＧＧＴＴＣＴＴ ＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣ ＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧ ＴＡＡＡＴＧＧＴＣＧ
１０１ ＧＴＡＡＡＡＴＣＣＧ ＧＴＡＡＡＴＴＴＣＣ ＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴ ＡＣＣＡＧＡＴＴＴＴ ＴＣＣＡＧＣＣＧＴＴ
１５１ ＴＴＣＧＧＡＴＴＴＡ ＴＣＧＧＧＡＴＡＴＡ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ ＧＡＣＧＧＡＡＡＣＧ ＧＡＡＴＡＧＧＴＴＴ
２０１ ＴＴＴＴＴＣＧＡＡＡ ＡＣＧＧＴＡＣＧＧＴ ＡＡＡＣＧＧＴＧＡＧ ＡＣＡＡＡＣＴＴＡＣ ＣＧＴＣＣＧＴＴＴＴ
２５１ ＣＧＴＡＴＴＴＣＴＣ ＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴ ＧＧＴＡＴＡＴＴＣＣ ＣＧＴＡＴＴＴＧＴＣ ＣＣＧＴＡＴＴＴＴＣ
３０１ ＣＣＧＡＣＣＣＡＣＧ ＧＡＣＣＴＧＣＣＡＡ ＴＣＡＡＣＣＡＴＣＡ ＧＣＣＡＧＴＣＡＧＣ ＣＣＡＴＣＣＣＣＡＣ
３５１ ＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣ ＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡ ＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣ ＡＴＧＣＣＣＡＣＧＣ ＡＡＣＧＣＡＡＧＧＣ
４０１ ＡＧＴＡＡＧＧＣＴＧ ＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣ ＡＣＧＣＡＴＴＧＡＣ ＧＣＡＴＧＴＧＧＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣ
４５１ ＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴ ＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧ ＴＧＣＣＧＴＴＧＴＧ ＣＧＡＧＡＣＴＧＴＧ ＡＣＴＧＣＧＡＧＴＧ
５０１ ＧＣＧＧＡＧＴＣＧＧ ＣＧＡＡＣＧＧＣＧＡ ＧＧＣＧＴＣＴＣＣＧ ＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣ ＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧ
５５１ ＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧ ＣＴＧＴＧＡＣＧＧＣ ＧＡＣＴＣＧＧＣＧＡ ＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣ ＴＡＣＣＡＡＧＣＣＣ
６０１ ＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣ ＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴ ＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧ ＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴ ＣＣＣＣＴＧＧＴＣＧ
６５１ ＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣ ＧＣＣＡＧＡＣＣＧ
（領域２（配列番号２９） 記述されていないトウモロコシゲノム配列（相補体））
６７０ ＧＣＣＧＡＡＧＣＡＴＣ ＡＣＧＡＡＡＣＧＣＡ ＣＴＡＡＧＡＣＣＴＣ
７０１ ＧＡＡＧＧＡＧＴＣＡ ＡＡＣＣＡＣＴＣＣＴ ＣＣＧＡＧＧＣＣＴＣ ＧＧＧＧＧＣＴＡＣＡ ＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴ
７５１ ＧＣＧＣＴＣＧＣＧＣ ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＧ ＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧ ＴＡＡＣＣＧＡＧＡＡ ＡＧＧＴＣＧＧＴＣＣ
８０１ ＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡ ＡＡＡＧＴＧＣＧＡＣ ＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣ ＡＡＧＣＧＡＧＴＡＴ ＴＡＡＣＡＣＴＣＡＣ
８５１ ＴＴＴＧＡＧＧＣＴＣ ＧＧＧＧＧＣＴＡＣ
（領域３（配列番号３０） トウモロコシＨｕｃｋ−１レトロトランスポゾンの断片）
８７０ Ｔ ＧＴＣＧＧＧＧＡＣＣ ＡＴＡＡＴＴＡＧＧＧ ＧＴＡＣＣＣＣＣＡＡ
９０１ ＧＡＣＴＣＣＴＡＡＴ ＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴ ＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣ ＡＧＣＡＣＡＡＡＧＣ ＴＧＣＡＡＡＧＧＣＣ
９５１ ＴＧＡＴＧＧＧＴＧＣ ＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡ ＡＧＧＣＴＣＧＧＴＣ ＣＡＣＴＣＡＡＧＧＧ ＡＣＡＣＧＡＴＣＴＣ
１００１ ＧＣＣＴＣＧＣＣＣＧ ＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴ ＣＧＧＧＣＡＡＧＧＧ ＣＧＧＣＣＧＡＣＣＣ ＣＧＡＧＧＡＴＴＣＡ
１０５１ ＣＧＴＣＴＣＧＣＣＣ ＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣ ＴＣＡＡＧＣＧＡＣＧ ＧＧＣＡＣＡＣＣＴＴ ＣＧＧＣＴＣＧＣＣＣ
１１０１ ＧＡＧＧＣＣＣＡＴＴ ＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧ ＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴ ＧＧＣＣＡＧＡＴＣＧ ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣ
１１５１ ＣＧＡＣＣＧＴＡＴＣ ＧＣＡＧＧＡＧＣＡＴ ＴＴＡＡＴＧＣＧＡＧ ＧＡＴＣＧＣＣＴＧＡ ＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣ
１２０１ ＴＧＡＣＧＣＧＣＧＣ ＴＣＴＴＣＡＧＴＣＧ ＡＣＡＧＡＧＣＣＧＡ ＡＧＴＧＡＣＣＧＣＡ ＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣ
１２５１ ＣＧＣＴＣＣＡＣＴＧ ＡＣＣＧＡＣＣＴＧＡ ＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡ ＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧ ＣＧＴＣＧＣＴＣＣＧ
１３０１ ＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣ ＣＡＣＴＣＧＡＣＡＧ ＡＧＴＧＡＧＧＣＴＧ ＡＣＡＧＣＡＧＣＣＡ ＡＧＴＣＣＧＧＣＣＴ
１３５１ ＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴ ＡＧＧＡＡＧＣＴＣＣ ＧＣＣＴＣＧＣＣＣＧ ＡＣＣＣＴＡＧＧＧＣ ＴＣＧＧＡＣＴＣＧＧ
１４０１ ＣＣＴＣＧＧＣＴＣＣ ＧＧＡＡＧＡＣＧＡＣ ＧＡＡＣＴＡＣＧＣＴ ＴＣＧＣＣＣＧＡＣＣ ＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧ
１４５１ ＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴ ＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡ ＡＧＡＣＧＡＣＧＡＡ ＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧ ＣＣＣＧＡＣＣＣＣＡ
１５０１ ＧＧＧＣＴＣＧＧＡＣ ＴＣＧＧＣＣＴＣＧＧ ＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡ ＣＧＡＣＧＡＡＣＴＣ ＣＧＣＣＴＣＧＣＣＣ
１５５１ ＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧ ＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡ ＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣ ＣＧＧＡＡＧＡＣＧＡ ＣＧＡＡＣＴＣＣＧＣ
１６０１ ＣＴＣＧＣＣＣＧＡＣ ＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣ ＧＧＡＣＴＣＡＧＣＣ ＴＣＧＧＣＣＴＣＡＧ ＡＣＧＡＴＧＧＴＣＴ
１６５１ ＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣ ＣＧＡＣＣＣＧＧＧＧ ＣＴＣＧＧＡＣＴＣＧ Ａ
（領域４（配列番号３１） ｃｒｙ１Ｆ遺伝子のフラグメント）
１６８２ ＣＣＴＴＴＣＴＡＴ ＣＧＧＡＣＣＴＴＧＴ
１７０１ ＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴ ＣＴＴＣＧＴＣＣＧＡ ＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧ ＧＣＡＡＴＣＣＴＣＡ ＣＴＡＴＧＴＡＣＴＣ
１７５１ ＧＧＴＣＴＴＡＧＧＧ ＧＡＧＴＧＧＣＣＴＴ ＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴ ＧＧＴＡＣＧＡＡＴＣ ＡＣＡＣＣＣＧＣＡＣ
１８０１ ＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣ ＴＣＣＧＧＧＡＣＣＡ ＴＴＧＡＣＴＣＴＣＴ ＡＧＡＴＧＡＧＡＴＡ ＣＣＡＣＣＴＣＡＡＧ
１８５１ ＡＣＡＡＣＡＧＣＧＧ ＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧ ＡＡＴＧＡＣＴＡＣＴ ＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴ ＧＡＡＴＣＡＴＧＴＴ
１９０１ ＡＣＣＴＴＴＧＴＧＣ ＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧ ＴＧＡＧＡＴＣＴＣＡ ＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴ ＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣ
１９５１ ＡＣＣＡＡＴＧＴＴＣ ＴＣＴＴＧＧＡＣＧＣ ＡＴＣＧＴＡＧＣＧＣ ＴＡＣＣＣＣＣＡＣＡ ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧ
２００１ ＡＴＣＣＡＧＡＧＡＧ ＡＡＴＣＡＣ
（領域５（配列番号３２） 葉緑体ｒｐｏＣ２遺伝子の断片）
２０１７ ＴＣＡＴ ＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡ ＣＴＧＣＡＴＡＴＣＴ ＴＧＣＣＧＡＧＡＴＣ
２０５１ ＣＴＣＡＴＣＣＣＴＡ ＡＡＧＧＴＡＣＴＴＧ ＡＣＡＡＴＡＧＴＡＴ ＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣ ＧＡＴＡＣＡＣＡＡＣ
２１０１ ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡ ＴＡＣＡＡＧＡＡＧＴ ＣＧＡＣＴＡＧＧＴＧ ＧＡＴＴＧＧＴＣＣＧ ＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡ
２１５１ ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣ ＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴ ＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴ ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＡ ＴＴＣＡＴＴＴＴＣＣ
２２０１ ＴＧＡＡＧＡＧＧＣＧ ＧＡＴＡＡＧＡＴＡＴ ＴＡＧＧＴＧＧＣＡＧ ＴＴＴＧＡＴＡＣＣＡ ＣＣＡＧＡＡＡＧＡＧ
２２５１ ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡ ＴＴＣＴＡＡＧＧＡＡ ＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡ ＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧ ＧＧＴＴＴＡＴＧＴＴ
２３０１ ＣＡＡＣＧＧＡＡＡＡ ＡＡＴＴＴＣＴＣＡＡ ＡＡＧＣＡＡＧＧＡＡ ＡＡＧＴＡＴＴ
（領域６（配列番号３３） トウモロコシ葉緑体またはｕｂｉＺＭ１（２）プロモーターの断片）
２３３８ ＧＴＧ ＧＣＴＡＴＴＴＡＴＣ
２３５１ ＴＡＴＣ
（ヌクレオチド２３５５〜２３５８（ＣＧＴ）は領域６を領域７ａに結合）
（領域７ａ（配列番号３４） ｐａｔ遺伝子の断片）
２３５８ ＧＣＡ ＧＣＴＧＡＴＡＴＧＧ ＣＣＧＣＧＧＴＴＴＧ ＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴ ＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡ
２４０１ ＴＴＧＡＧＡＣＧＴＣ ＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣ ＴＴＴＡＧＧＡＣＡＧ ＡＧＣＣＡＣＡＡＡＣ ＡＣＣＡＣＡＡＧＡＧ
２４５１ ＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧ ＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧ ＧＴＴＧＣＡＡＧＡＴ ＡＧＡＴＡＣＣＣＴＴ ＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣ
２５０１ ＴＧＡＧＧＴＴＧＡＧ ＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ ＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣ ＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧ ＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧ
２５５１ ＣＴＡＧＧＡＡＣ
（領域７ｂ（配列番号３５） ｐａｔ遺伝子の断片（相補体））
２５５９ ＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＡＧ ＣＡＡＣＣＡＡＣＣＡ ＡＴＧＧＴＡＴＣＴＡ ＴＣＴＴＧＣＡＡＣＣ
２６０１ ＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣ ＡＴＣＡＡＴＣＣＡＣ ＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧ ＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣ ＴＧＴＣＣＴＡＡＡＧ
２６５１ ＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧ ＡＣＧＴＣＴＣＡＡＴ ＧＴＡＡＴＧＧＴＴＡ ＡＣＧＡＴＡＴＣＡＣ ＡＡＡＣＣＧ
（領域７ｃ（配列番号３６） ｃｒｙ１遺伝子の断片（相補体））
２６９７ ＡＧＡＧ
２７０１ ＡＡＧＡＧＧＧＡＴＣ
（領域８（配列番号３７） ポリリンカーの断片）
２７１２ ＣＧＡＡＧＣＴＴＣ ＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣ ＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣ ＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧ
２７５１ ＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣ ＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣ ＧＧＴＣＧＴＧＣＣＣ ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧ ＡＴＡＡＴＧＡＧＣＡ
２８０１ ＴＴＧＣＡＴＧＴＣＴ ＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡ ＡＡＡＴＴＡＣＣＡ
（領域９（配列番号２５） ＰＨＩ８９９９Ａの完全長挿入）
（実施例５．トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の挿入に対して５’側にある隣接配列の記述）
イベントＴＣ１５０７の５’隣接配列をさらに完全に説明するために、相同性検索を、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋの公的データベース（リリース１２２、２／０１）に対しておこなった。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性検索を実行し、未知の配列に対する相同性を同定する上で特に有用である。公的データベース検索に加えて、二つ一組の位置合わせをＡｌｉｇｎＸ（ＩｎｆｏｒＭａｘ Ｉｎｃ．， Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を用いて実行し、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の隣接配列とＰＨＩ８９９９Ａ遺伝子組換え挿入とのあいだの相同性について調べた。これらの相同性検索の結果を表１に示す。ＴＣ１５０７の５’隣接配列に、挿入に対して最も遠い５’側の塩基１と、完全長ＰＨＩ８９９９Ａ遺伝子組換え挿入の開始点の塩基２８３０とによって番号がつけられている（図１参照）。同一率の値は、分析した配列の長さにわたる完全な一致の割合を示す。
【００８８】
多くの場合、イベントＴＣ１５０７の５’隣接配列による類似性検索が、かなり高い同一率の値に基づいて１つの固有の配列との一致をもたらした。これらの配列は表１に同定されている。加えて、２つ以上の既知の配列よに対して高い類似性を持つＴＣ１５０７の５’ＤＮＡ隣接配列に２つの領域が存在する。領域８７０〜１６８１および２３３８〜２３５４では、単一の一致（ホモログ）が検出できない量配列断片による同一率の得点が十分に高い。これらの領域の各々についての２つの可能性のあるホモログを表１に示す。
【００８９】
非常に類似した配列が、配列の最初の６６９塩基対を除いて全てに関して同定された。一般に、類似性検索の結果は、塩基１６８１に対して５’側にあるトウモロコシゲノム配列との高い相同性を示している。塩基１６８２から２８３０位にあるＰＨＩ８９９９Ａの開始点に至る領域は、形質転換イベントに関連したいくつかのフラグメントを含む。
【００９０】
【表１−１】
【００９１】
【表１−２】
（実施例６：未修飾コントロールトウモロコシ系統内の領域１、２、および３の存在の確認）
トウモロコシＴＣ１５０７を精製する形質転換について用いられる未修飾コントロールトウモロコシ系統に、イベントＴＣ１５０７の５’隣接領域が領域１、２、および３（表１）が存在して、それによってトウモロコシゲノムＤＮＡによって境界が示されるかどうかを判断するために、ＰＣＲ分析を用いた。９通りの異なるＰＣＲ分析を、表３に示すプライマー配列を用いて表２に概説したように、 ＴＣ１５０７および未修飾コントロールトウモロコシＨｉ−ＩＩ系統からから調製したゲノムＤＮＡ上で実施した（Ｈｉ−ＩＩの情報については、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ （１９９４） Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ｅｄ． Ｆｒｅｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｗａｌｂｏｔ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ． ６６３−６７１を参照せよ）。２つの反応が、２５ないし３２４ｂｐの５’隣接領域の領域１内のＤＮＡ（反応Ａ−３００ｂｐ単位複製配列）と２５ないし４８０ｂｐの５’隣接領域の領域１内のＤＮＡ（反応Ｂ−４５６ｂｐ単位複製配列）を増幅するように、設計された。予想される単位複製配列は、Ｈｉ−ＩＩ未修飾トウモロコシ系統およびトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の両方に存在した。１つのＰＣＲプライマー対、反応Ｃ、７５９ないし１１８２ｂｐの５’隣接領域（４２４ｐｂ単位複製配列）の領域２ないし領域３をスパン化し、Ｈｉ−ＩＩおよびＴＣ１５０７の両方で期待される大きさのＰＣＲ産物を再び生成した。反応Ｄ、４１５ないし１１８２ｂｐの５’隣接領域（７６８ｐｂ単位複製配列）の領域１ないし領域３をスパン化し、Ｈｉ−ＩＩおよびＴＣ１５０７の両方で期待される大きさのＰＣＲ産物を再び生成した。反応ＥおよびＦは、ＴＣ１５０７内のＰＨＩ８９９９Ａの完全長挿入のｐａｔ遺伝子領域に対する特異的プライマーとして設計されたことから、未収色Ｈｉ−ＩＩトウモロコシ系統の単位複製配列は期待されない。結果は、ＥおおびＦの反応が共に、ｐａｔ遺伝領域によって形質転換されたトウモロコシ形態に対して特異的であり、期待される単位複製配列を生成し、その一方で未修飾Ｈｉ−ＩＩトウモロコシ系統では単位複製配列が生成されなかった。反応Ｇもまた、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７で３６６ｂｐの単位複製配列を生成し得るプライマー対として設計され、未修飾コントロールトウモロコシ系統では単位複製配列の生成は見られなかった。
【００９２】
反応ＨおよびＩを、遺伝子組換え挿入を５’隣接領域にスパン化し得るＴＣ１５０７に対する特異的プライマー対として設計した。反応ＨおよびＩの両方で、逆方向プライマーが完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入（表１の領域９）のユビキチンプロモーター領域に配置され、順方向プライマーが領域５、ｒｐｏＣ２遺伝子フラグメントに配置された（表１を参照）。反応Ｈおよび反応Ｉの両方は、トウモロコシＴＣ１５０７系統内で単位複製配列を生成し、未修飾コントロールトウモロコシ系統では単位複製配列を生成しなかった。これらの結果は、反応ＨおよびＩの両方が、イベントＴＣ１５０７に対して特異的である。
【００９３】
ＰＣＲ結果は、未記載の配列（領域１）が未修飾トウモロコシ系統Ｈｉ−ＩＩに存在し、領域１、２、および３が未修飾トウモロコシ系統Ｈｉ−ＩＩに隣接している。反応Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤで増幅したＤＮＡ配列は、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の５’隣接領域に特有ではなく、また未処置トウモロコシ系統Ｈｉ−ＩＩにも存在している。
【００９４】
【表２−１】
【００９５】
【表２−２】
【００９６】
【表２−３】
【００９７】
【表３−１】
【００９８】
【表３−２】
（実施例７．トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の挿入遺伝子組換えＤＮＡに対して３’側の隣接配列）
トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入に対して３’側の配列情報の長さを伸ばすのに、２通りの異なるＰＣＲアプローチを用いた。第１のアプローチでは、ＰＣＲプライマー対を、完全長挿入と逆方向ＯＲＦ２５ターミネーターとのあいだの連結をスパン化した産物を増幅するように設計した。逆方向ＯＲＦ２５ターミネーターを示す図１を参照せよ。順方向プライマーを完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入の末端に配置させ、一連の逆方向プライマーを逆方向配列に１００ｂｐ間隔で配置させた。このようにして、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７に存在する逆方向断片の長さを、成功裏になされるＰＣＲ反応に基づいて１００ｂｐ領域内に定めることができた。この方法は、ＯＲＦ２５ターミネーターの大部分を含むがＣｒｙ１Ｆ配列は含まない逆方向断片を示した。この領域からＰＣＲ断片を単離してシークエンシングした。
【００９９】
第２のアプローチでは、ＰＣＲプライマーを、上記したＰＣＲ実験で決定されたように、逆方向ＯＲＦ２５ターミネーター領域から隣接ＤＮＡ配列に入るように設計した。２ないし３つの個々のイベントＴＣ１５０７の植物と未修飾コントロールトウモロコシ系統とから単離したゲノムＤＮＡを、種々の制限酵素を用いて消化し、その後、消化に用いた制限酵素に対して特異的なアダプターに結合させた（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ （登録商標） Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ． およびＤｅｖｏｎら（１９９５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：１６４４−１６４５）。一次ＰＣＲをＯＲＦ２５ターミネーター特異的プライマーと消化ＤＮＡに結合したアダプター配列に対して相同なプライマーとを用いて実施した。反応の特異性を増すために、ネスト化した二次ＰＣＲを別のＯＲ２５ターミネーター特異的プライマーと一次ＰＣＲで使用した各々のプライマーに対して内側である第２のプライマーによりアダプター配列に対して相同な第２のプライマーとを用いて再び実施した。ネスト化ＰＣＲによって生産される産物を、アガロース電気泳動によって分析し、ＴＣ１５０７ＤＮＡに特有な断片を単離してシークエンシングした。断片を、完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入の３’末端にある標的（逆方向）ＯＲＦ２５ターミネーターと完全長挿入内に含まれるＯＲＦ２５ターミネーターとの両方から、増幅した。完全長挿入由来の断片は、完全長挿入内に位置した既知の制限酵素部位に基づいた予測サイズであった。３’逆方向ＯＲＦ２５ターミネーターから作られた断片は、予想外のサイズの断片として現れた。３’逆方向ＯＲＦ２５ターミネーター由来の増幅断片の配列分析は、１０４３ｂｐの隣接ＤＮＡ配列をもたらした。上記一連のゲノムウオーキング実験から結果として得られる配列を、２３４６ｂｐの最終３’隣接配列を持つボーダリングトウモロコシゲノムに、挿入からさらに入れるための、さらなるプライマーの設計に用いた。
【０１００】
ＴＣ１５０７の３’隣接配列を記述するために、相同性検索を、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ公共データベースに対して実施した。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性検索を実行し、特に未知の配列に対する相同性を同定する上で有用である。公共データベースを検索することに加えて、ＳｅｑＭａｎ４．０５（登録商標）、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アラインメントアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）を用いて実行し、ＴＣ１５０７の３’隣接配列とＰＨＩ８９９９Ａ遺伝子組換え挿入とのあいだの相同性を調べた。これらの相同性検索の結果を表１に示す。同一率の値は、分析した配列の長さにわたる完全一致の割合を示す。３’隣接配列についての類似性検索の結果は、トウモロコシの葉緑体ＤＮＡ、ｐａｔ遺伝子の１８８ｂｐフラグメント、および有意な相同性のない２５４ｂｐのＤＮＡ（領域１５、表１）の３つの領域と高い相同性があることを示した。領域１５（表１）を超えた７４９ｂｐ（領域１６）についてもシークエンシングした。領域６について、類似した検索結果はなんら得られなかった。
【０１０１】
コントロールおよびＴＣ１５０７ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ分析は、２５４ｂｐ配列（領域１５、トウモロコシ葉緑体「ＯＲＦ２４１」のフラグメント）がトウモロコシゲノムに存在する。３’隣接領域内の領域１５のＤＮＡ配列は、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７に対して固有ではないが、未修飾コントロールトウモロコシ系統にも存在する。ＴＣ１５０７の３’隣接配列を実施例８に示すとともに、図１に図示する。
【０１０２】
（実施例８．完全長挿入の末端に対して３’側の領域の配列。各々の領域の説明は表１にある）
（領域１０（配列番号３８） ＯＲＦ２５ターミネーター（相補体）の断片）
９０１６ ＣＴＣＡＣ ＴＣＣＧＣＴＴＧＡＴ ＣＴＴＧＧＣＡＡＡＧ ＡＴＡＴＴＴＧＡＣＧ
９０５１ ＣＡＴＴＴＡＴＴＡＧ ＴＡＴＧＴＧＴＴＡＡ ＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧ ＣＡＧＴＧＣＡＧＴＡ ＴＴＴＴＣＴＡＴＴＣ
９１０１ ＧＡＴＣＴＴＴＡＴＧ ＴＡＡＴＴＣＧＴＴＡ ＣＡＡＴＴＡＡＴＡＡ ＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴ ＣＡＧＡＴＴＡＴＴＧ
９１５１ ＡＣＴＧＴＣＡＴＴＴ ＧＴＡＴＣＡＡＡＴＣ ＧＴＧＴＴＴＡＡＴＧ ＧＡＴＡＴＴＴＴＴＡ ＴＴＡＴＡＡＴＡＴＴ
９２０１ ＧＡＴＧＡＴＡＴＣＴ ＣＡＡＴＣＡＡＡＡＣ ＧＴＡＧＡＴＡＡＴＡ ＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡ ＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴ
９２５１ ＴＴＧＣＧＴＣＧＣＡ ＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴ ＣＴＡＴＡＴＧＡＧＡ ＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡ ＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴ
９３０１ ＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡ ＡＣＡＴＡＧＡＣＡＴ ＴＡＡＣＣＣＴＧＡＧ ＡＣＴＧＴＴＧＧＡＣ ＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴ
９３５１ ＡＧＡＴＴＣＣＴＴＣ ＡＴＧＣＡＴＡＧＣＡ ＣＣＴＣＡＴＴＣＴＴ ＧＧＧＧＡＣＡＡＡＡ ＧＣＡＣＧＧＴＴＴＧ
９４０１ ＧＣＣＧＴＴＣＣＡＴ ＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡ ＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧ ＣＴＡＴＡＴＣＣＴＣ ＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣ
９４５１ ＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧ ＧＴＣＣＡＡＴＣＡＡ ＡＴＴＴＧＴＣＣＡＡ ＧＡＡＣＴＣＡＴＧＴ ＴＡＧＴＣＧＣＡＡＣ
９５０１ ＧＡＡＡＣＣＧＧＧＧ ＣＡＴＡＴＧＴＣＧＧ ＧＴＡＴＣＴＣＧＡＧ ＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧ ＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡ
９５５１ ＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡ ＴＣＣＴＴ
（領域１１（配列番号３９）トウモロコシ葉緑体ｒｐｓ１２ｒＲＮＡ遺伝子の断片）
９５６６ ＣＡＡＣＡ ＡＡＡＧＧＧＴＡＣＣ ＴＧＴＡＣＣＣＧＡＡ ＡＣＣＧＡＣＡＣＡＧ
９６０１ ＧＴＧＧＧＴＡＧＧＴ ＡＧＡＧＡＡＴＡＣＣ ＴＡＧＧＧＧＣＧＣＧ ＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴ ＣＴＣＴＡＡＧＧＡＡ
９６５１ ＣＴＣＧＧＣＡＡＡＡ ＴＡＧＣＣＣＣＧＴＡ ＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧ ＡＡＧＧＧＧＴＧＣＣ ＣＣＣ
（ヌクレオチド９６９４〜９６９５（ＣＧ）が領域１１と領域１２とを結合する）
（領域１２（配列番号４０） トウモロコシ葉緑体ゲノムの断片）
９６９６ ＣＴＡＡＣ
９７０１ ＡＡＴＡＡＡＣＧＡＡ ＴＡＣＧＧＴＴＴＡＴ ＧＴＡＴＧＧＡＴＴＣ ＣＧＧＴＡＡＡＡＴＡ ＣＣＧＧＴＡＣＴＣＧ
９７５１ ＡＴＴＴＣＡＴＡＡＧ ＡＧＴＣＧＡＡＴＡＧ ＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡ ＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴ ＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡ
９８０１ ＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡ ＧＴＡＴＣＣＴＡＡＡ ＴＴＡＴＡＣＴＡＡＴ ＣＣＡＣＧＴＡＴＧＡ ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＣ
９８５１ ＴＴＴＣＣＴＴＡＴＣ ＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴ ＡＧＴＧＣＡＡＡＡＡ ＡＡＡＴＴＣＴＡＴＡ ＣＴＧＣＡＣＴＧＣＴ
９９０１ ＣＴＣＴＴＴＴＴＡＣ ＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣ ＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡ ＡＡＧＴＧＡＡＧＴＡ ＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣ
９９５１ ＡＴＡＧＡＴＡＴＴＴ ＧＡＴＣＴＴＧＣＣＴ ＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣ ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴ ＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡ
１０００１ ＡＴＴＴＣＣＡＴＧＡ ＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡ ＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧ ＴＣＣＡＴＴＣＡＴＴ ＧＡＡＣＣＣＴＡＧＴ
１００５１ ＴＣＧＧＧＡＣＴＧＡ ＣＧＧＧＧＣＴＣＧＡ ＡＣＣＣＧＣＡＧＣＴ ＴＣＣＧＣＣＴ
（領域１３（配列番号４１）ｐａｔ遺伝子の断片（相補体））
１００８８ ＧＴＴ ＣＣＴＡＧＣＣＴＴＣ
１０１０１ ＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧ ＣＧＴＡＡＧＣＡＡＴ ＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡ ＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡ ＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣ
１０１５１ ＣＡＡＣＣＡＡＧＧＧ ＴＡＴＣＴＡＴＣＴＴ ＧＣＡＡＣＣＴＣＴＣ ＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡ ＡＴＣＣＡＣＴＣＴＴ
１０２０１ ＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧ ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣ ＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡ ＣＴＧＴＡＧＡＣＧＴ ＣＴＣＡＡＴＧＴＡＡ
１０２５１ ＴＧＧＴＴＡＡＣＧＡ ＴＡＴＣＡＣＡＡＡＣ ＣＧＣＧＧ
（ヌクレオチド１０２７６〜１０２７７（ＡＡ）が領域１３と領域１４とを結合する）
（領域１４（配列番号４２）トウモロコシ葉緑体ＯＲＦ２４１（相補体）の断片）
１０２７８ ＣＡＣ ＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡ ＧＣＡＣＣＴＴＴＴＣ
１０３０１ ＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴ ＡＴＡＣＴＡＧＧＧＧ ＴＴＴＴＴＡＣＴＴＧ ＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡ ＴＧＴＴＣＣＡＴＡＣ
１０３５１ ＴＡＡＡＧＧＡＴ
（領域１５（配列番号４３）トウモロコシゲノム（有意な相同性なし））
１０３５９ ＡＧ ＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣ ＣＧＣＣＡＣＣＧＴＣ ＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴ ＴＣＣＧＧＧＧＡＧＣ
１０４０１ ＣＡＧＡＣＣＧＧＴＣ ＧＡＡＣＣＧＴＧＣＣ ＴＣＣＡＣＴＴＧＣＴ ＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧ ＧＧＡＡＡＡＴＣＡＧ
１０４５１ ＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡ ＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧ ＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣ ＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣ ＴＡＡＧＡＴＡＣＴＴ
１０５０１ ＡＣＴＣＧＣＴＣＣＧ ＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣ ＡＡＴＣＡＴＧＣＣＴ ＧＴＧＧＧＧＡＧＧＴ ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣ
１０５５１ ＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧ ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣ ＣＧＡＧＧＴＣＴＧＣ ＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧ ＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣ
１０６０１ ＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣ ＴＴ
（領域１６（配列番号４４）トウモロコシゲノム）
１０６１３ ＧＧＧＣＧＣＣＣ ＧＡＧＧＣＡＣＣＣＧ ＧＧＧＧＡＴＧＧＡＣ ＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧ
１０６５１ ＣＡＧＣＣＡＣＧＡＣ ＧＡＣＣＣＡＡＧＧＡ ＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴ ＧＣＧＣＡＧＴＣＧＧ ＣＡＣＧＡＧＣＡＡＴ
１０７０１ ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＧ ＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧ ＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡ ＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧ ＴＣＡＣＣＴＣＡＡＣ
１０７５１ ＴＡＣＣＴＣＧＧＣＣ ＧＡＧＧＧＧＴＣＡＡ ＧＴＡＣＣＣＣＣＴＣ ＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣ ＣＧＣＴＣＴＴＣＧＧ
１０８０１ ＡＣＣＧＧＧＡＣＣＣ ＣＧＡＣＧＴＣＣＣＧ ＧＣＣＣＣＧＧＡＴＡ ＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣ ＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣ
１０８５１ ＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣ ＴＴＧＡＣＧＡＣＣＣ ＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣ ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧ ＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣ
１０９０１ ＧＡＧＧＣＡＧＧＣＧ ＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴ ＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣ ＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡ ＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴ
１０９５１ ＣＧＴＣＡＴＣＡＧＧ ＣＧＴＣＴＣＣＧＧＣ ＧＡＣＧＧＣＴＣＣＣ ＴＴＧＧＧＡＧＣＣＣ ＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣ
１１００１ ＴＧＣＣＧＡＣＧＡＣ ＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣ ＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣ ＣＧＡＧＣＣＣＡＣＧ ＴＣＣＧＣＴＣＧＴＧ
１１０５１ ＧＧＣＣＣＧＡＧＣＣ ＴＴＣＴＴＴＧＣＧＴ ＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣ ＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣ ＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡ
１１１０１ ＣＣＣＴＣＣＧＣＧＣ ＡＧＣＴＣＧＧＴＣＣ ＡＣＣＧＣＡＴＣＣＴ ＣＣＧＧＧＡＣＴＧＧ ＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡ
１１１５１ ＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴ ＧＣＣＣＴＡＣＣＴＣ ＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧ ＡＣＧＡＡＡＡＧＴＣ ＴＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
１１２０１ ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＧ ＣＡＡＴＣＴＧＡＣＧ ＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡ ＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧ ＡＴＡＣＴＣＡＣＣＡ
１１２５１ ＧＡＧＡＣＡＣＧＣＡ ＣＣＣＧＣＧＡＴＣＧ ＧＧＡＣＧＣＡＴＴＡ ＡＧＧＧＣＴＧＧＧＡ ＡＡＡＡＧＴＧＣＣＧ
１１３０１ ＧＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴ ＧＣＣＧＴＣＣＡＣＣ ＣＡＣＣＴＧＴＧＧＡ ＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴ
１１３５１ ＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡ Ａ
（実施例９．未修飾コントロールトウモロコシ系統の領域１５の存在の確認）
３’隣接領域の末端上の未記載の領域（表１の領域１５）が、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７を生成するために形質転換で用いられる未修飾コントロールトウモロコシ系統 に存在せず、それによってコーンゲノムＤＮＡとの境界が示されるかどうかを決定するために、ＰＣＲ分析が用いられる。トウモロコシＴＣ１５０７系統と未修飾Ｈｉ−ＨＨコントロールトウモロコシ系統との両方における領域１５の成功裏になされるＰＣＲ増幅によって、領域１５が実際にトウモロコシゲノムＤＮＡに存在することが明らかになった。５通りの異なるＰＣＲ分析を、表８に示すプライマー配列を用いて、トウモロコシＴＣ１５０７系統と未修飾Ｈｉ−ＨＨコントロールトウモロコシ系統とから調製したゲノムＤＮＡ上で、以下の表７に概説したように、実施した。３’隣接領域の領域１５内でのＤＮＡ増幅をおこなうために、３通りの反応を設計した。すなわち、反応Ｌ−１７５ｂｐ単位複製配列を生産、反応Ｍ−１３４ｂｐ単位複製配列を生産、さらに反応Ｎ−１０７ｂｐ単位複製配列を生産。予想される単位複製配列は、未修飾コントロールトウモロコシ系統とトウモロコシＴＣ１５０７系統とのなかに存在した。反応ＪおよびＫを、挿入の末端を３’隣接領域にスパン化し得るＴＣ１５０７に対して特異的プライマーとして設計した。反応Ｊでは、順方向プライマーを、完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入（表１の領域１３）の３’末端上のｐａｔ遺伝子フラグメントに配置し、逆方向プライマーを未定義の領域１５に配置した。反応Ｋでは、順方向プライマーを、完全長挿入の３’末端上の葉緑体仮説タンパク質遺伝子に配置した（表１の領域１４）。また、逆方向プライマーを未定義の領域１５に配置した。反応Ｊおよび反応Ｋの両方とも、トウモロコシ系統ＴＣ１５０７を生産したが、未修飾コントロールトウモロコシ系統では単位複製配列が生産されなかった。このような結果は、反応ＪおよびＫがイベントＴＣ１５０７に対して特異的である。
【０１０３】
ＰＣＲは、ＴＣ１５０７の３’隣接配列の未記載の配列（領域１５）もまた、未修飾Ｈｉ−ＩＩコントロールトウモロコシ系統由来の単離ＤＮＡである。反応Ｌ、Ｍ、およびＮで増幅したＤＮＡ配列は、ＴＣ１５０７の３’隣接領域に対して固有ではないが、未修飾コントロールトウモロコシ系統にも存在する。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
【表５−１】
【０１０６】
【表５−２】
（実施例１０．ＰＣＲプライマー）
ＤＮＡイベント特異的プライマー対を用いて、ＴＣ１５０７に特徴的な単位複製配列を生成した。これらのイベントプライマー対として、限定されるものではないが、配列番号１および配列番号２、配列番号２および配列番号２３、配列番号３および配列番号５、ならびに配列番号４および配列番号５が挙げられる。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応で使用した場合にＴＣ１５０７に対して特異的なＤＮＡ単位複製配列を作る配列番号２６および配列番号２７に由来する任意のプライマー対は、本発明の一局面である。この分析の条件を表９に示すが、ＴＣ１５０７に特徴的な増幅ＤＮＡ分子を生産するためのＤＮＡプライマーまたはその相補体を用いたこれらの方法の任意の修飾は、当技術分野の通常技量の範囲内である。配列番号１、２、および２３によって同定されるＰＣＲプライマーを利用した反応のための好ましい増幅条件を表１０に示す。また、内因性のトウモロコシ遺伝子の増幅のために、コントロールプライマー対（配列番号１０および１１、配列番号１０および１２、配列番号１３および１４、配列番号１４および１５、配列番号５および１６、配列番号５および１７、ならびに配列番号５および１８を含む）を反応条件の内部基準として包含する。さらに含まれるものは、ｐａｔ遺伝子を含む遺伝子組換えイベントで単位複製配列を生産するプライマー対（配列番号６および７、配列番号８および９）とｃｒｙ１Ｆ遺伝子を含む遺伝子組換えイベントで単位複製配列を生産するプライマー対（配列番号１９および２０）とである。
【０１０７】
ＴＣ１５０７イベントの存在について試験するための植物組織ＤＮＡ抽出物の分析は、陽性の組織ＤＮＡ抽出物コントロール（遺伝子組換え配列を含むことが知られているＤＮＡサンプル）を含むべきである。陽性コントロールの成功裏になされる増幅では、標的配列の増幅を可能とする条件下でＰＣＲが実行される。負の、または野生型のＤＮＡ抽出物コントロールでは、提供されたテンプレートＤＮＡが非遺伝子組換え植物から調製されたゲノムＤＮＡもしくは非ＴＣ１５０７遺伝子組換え植物のいずれかであり、これもまた含まれるべきである。さらに、テンプレートトウモロコシＤＮＡ抽出物を含まない負のコントロールは、ＰＣＲプロトコルで使用する試薬および条件の有用な基準である。
【０１０８】
十分な長さのさらなるＤＮＡプライマー分子は、ＤＮＡ増幅法の当業者によって、配列番号２６および配列番号２７から選択することができ、また表９または表１０に示される方法とは異なると思われるが、イベントＴＣ１５０７に特徴的な単位複製配列を生ずる単位複製配列の生産にとって最適化された条件を選択することができる。表９および表１０に示し方法に対する修飾を伴うこれらのＤＮＡプライマー配列の利用は、本発明の範囲内である。ＴＣ１５０７にとって特徴的な配列番号２６および２７に由来する十分な長さの分子の少なくとも１つのＤＮＡプライマー分子は、本発明の一局面である。ＴＣ１５０７単位複製配列のアッセイは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを用いて実施することができ、あるいは当業者に公知の方法および装置によって実施することができる。
【０１０９】
【表６−１】
【０１１０】
【表６−２】
【０１１１】
【表７】
本発明の原理を例示および説明したが、本発明がそのような原理から逸脱することなく構成および詳細を改変することができることは当業者に容易に理解されなければならない。我々は、添付の請求の精神および範囲内である全ての修飾の権利を主張する。
【０１１２】
この明細書で引用した全ての刊行物および公開された特許文献は、各々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に参照によって取り込まれることが示されるのと同程度に、本明細書で援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、遺伝子組換え挿入ＰＨＩ８９９９Ａとともに、その遺伝子組換え挿入を隣接する配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、植物分子生物学の分野に関し、詳しくは、本発明は植物に対して害虫抵抗性を与えるためのＤＮＡ構築物に関する。さらに詳しくは、本発明は害虫抵抗性トウモロコシ植物ＴＣ１５０７と、サンプル中のトウモロコシ植物ＴＣ１５０７ＤＮＡおよびその組成物の存在を検出するためのアッセイとに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、害虫抵抗性トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）植物ＴＣ１５０７（トウモロコシＴＣ１５０７系統もしくはトウモロコシのイベントＴＣ１５０７とも呼ばれる）と、トウモロコシ植物ＴＣ１５０７のＤＮＡ植物発現構築物ならびにトウモロコシ植物ＴＣ１５０７およびその子孫にある導入遺伝子／隣接挿入領域の検出とに関する。
【０００３】
トウモロコシは重要な作物であり、世界中の多くの地域で主要な食糧源となっている。害虫に起因する損害は、化学的農薬等の防御手段の使用にもかかわらず、世界中のトウモロコシ作物損失の主要要因である。この観点から考えると、虫害を制御するために、また従来の化学的農薬の必要性を少なくするために、虫抵抗性がトウモロコシ等の作物に遺伝子組換えによって取り込まれてきた。遺伝子組換え害虫抵抗性作物を生産するために利用されてきた一群の遺伝子は、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂ．ｔ．）のデルタエンドトキシンである。デルタエンドトキシンは、トウモロコシと同様に、綿、ジャガイモ、米、ひまわり等の作物で成功裏に発現されている（Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８、９３９−９４３；Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ．ら（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３１３−３２１；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｈ．ら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１１５１−１１５５；Ｔｕら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１１０１−１１０４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０１／１３７３１；およびＢｉｎｇ Ｊ Ｗら（２０００）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ，１４ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｏｌｏ．）。
【０００４】
植物での外来遺伝子の発現は、その植物のゲノム内での外来遺伝子の位置によって影響されることが知られており、このような影響は、おそらくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）もしくは組込部位近傍の転写制御因子（例えば、エンハンサー）の近接性によると考えられる（Ｗｅｉｓｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ ２２：４２１−４７７，１９８８）。同時に、ゲノム内の異なる位置にある導入遺伝子の存在は、異なる方法での植物の全体的な表現系に影響する。このことから、目的とする導入遺伝子の最適な発現によって特徴づけられるイベントを同定するために数多くのイベントをスクリーニングする必要がたびたび生ずる。例えば、導入遺伝子の発現レベルがイベント間で多種多様となり得ることが、植物および他の生物で観察されている。また、空間的または一時的発現パターンの違い（例えば、導入遺伝子構築物に存在する転写制御因子から予想されるパターンとは一致しないと思われる種々の植物組織での導入遺伝子の相対的発現の違い）もあると考えられる。この理由から、何百、何千もの異なるイベントを作り出し、これらのイベントを、商業目的のために所望の導入遺伝子発現レベルを有する単一のイベントについてスクリーニングすることが、一般的である。所望のレベルまたはパターンの導入遺伝子を持つイベントは、従来の育種法を用いた異系交配による他の遺伝的バックグラウンドへの導入遺伝子の遺伝子移入にとって、有用である。そのような交配の子孫は、元の形質転換体の特徴である導入遺伝子発現を維持する。この戦略は、局所的な成長条件に十分適応されるいくつかの種での信頼できる遺伝子発現を確かなものにすることに用いられる。
【０００５】
交配による子孫が目的の導入遺伝子を含むかどうかを判断するために、特定のイベントの存在を検出することが可能であることが、有利であると思われる。また、特定のイベントを検出することは、市販前の承認に必要な規則および遺伝子組換え作物由来食品の表示付けに必要な規則に従う上で、野外での作物の形質モニタリングや環境モニタリングで使用する上で、あるいは収穫された作物に由来する製品のモニタリングをおこなう上で、さらにまた規定もしくは契約条件に制約された当事者のコンプライアンスを確実にする上で、有用である。
【０００６】
限定されるものではないが、核酸プローブを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）等の任意の公知核酸検出方法によって、導入遺伝子の存在を検出することが可能である。これらの検出方法は、一般に、頻繁に使用される遺伝的因子（例えば、プロモーター、ターミネーター、およびマーカー遺伝子）に焦点を当てている。なぜなら、多くのＤＮＡ構築物では、コード領域が互いに置換可能であるからである。その結果、それらの方法は、挿入された非相同ＤＮＡに隣接した隣接ＤＮＡのＤＮＡ配列が知られているにもかかわらず、異なるイベント間、特に同一ＤＮＡ構築物またはかなり類似した構築物を用いて作られるイベント間の違いを識別する上で有用ではないと思われる。例えば、イベント特異的ＰＣＲアッセイが、優良ＧＡＴ−ＺＭ１の検出に関する米国特許第６，３９５，４８５号に開示されている。したがって、イベントＴＣ１５０７の同定のための単純かつ判別可能な方法を有することが求められる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、好ましくは、害虫抵抗性単子葉植物作物の生産および選択のための方法に関する。より詳しくは、植物細胞および植物で発現された場合に昆虫に対する耐性を与えるＤＮＡ構築物が提供される。したがって、本発明の第１の局面によれば、植物細胞および植物で発現された場合に植物細胞に対して害虫抵抗性を与える宿主細胞への導入および該宿主細胞内での複製が可能なＤＮＡ構築物が提供される。ＤＮＡ構築物は、ＰＨＩ８９９９Ａと命名されたＤＮＡ分子から構成され、２つの導入遺伝子発現カセットを含む。第１の発現カセットは、５’非アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から単離された３’ＯＲＦ２５ 転写終結因子を含むＤＮＡ分子（Ｂａｒｋｅｒら（１９８３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２：３３５−３５０）に作用自在に結合したＣＲｙ１Ｆとして同定されるＢ．ｔ．６−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第５，１８８，９６０号および第６，２１８，１８８号）に作用自在に結合したトウモロコシユビキチン（Ｕｂｎｉ−１）遺伝子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．．５：２１３−２１８）の第１のイントロン、５’非翻訳エキソン、およびプロモーターを含むＤＮＡ分子を有する。上記ＤＮＡ構築物の第２の導入遺伝子発現カセットは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター由来の３’転写終結因子を含むＤＮＡ分子（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９を参照せよ）に作用自在に結合したホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子をコードするＤＮＡ分子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ．ら（１９８８） Ｇｅｎｅ ７０：２５−３７）に作用自在に結合したＣａＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ分子（Ｏｄｅｌｌ Ｊ．Ｔ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：４９−５９）を有する。上記ＤＮＡ構築物を含む植物も提供される。
【０００８】
本発明の別の局面によれば、ＴＣ１５０７と表された新規のトウモロコシ植物を動態するために組成物および方法が提供され、該方法はＴＣ１５０７の５’および／または３’隣接配列を特異的に認識する。ＰＣＲ反応で利用された場合、遺伝子組換えイベントＴＣ１５０７に特有の単位複製配列を生ずるＤＮＡ分子が提供される。これらの分子を、
５’−ＧＴＡＧＴＡＣＴＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＣＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号１）；
５’−ＧＣＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号２）；
５’−ＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＡ−３’（配列番号２３）；
５’−ＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＴＡＡ−３’（配列番号３）；
５’−ＡＧＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＡＣ−３’（配列番号４）；
５’−ＧＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＴＣ−３’；（配列番号５）
からなる群ならびにそれらの相補体からなる群より選択することが可能である。これらの分子を含むトウモロコシ植物および分子は、本発明の一局面である。さらに、上記イベントＴＣ１５０７の同定のためのそれらのプライマー配列を利用するキットが提供される。
【０００９】
本発明の別の局面は、本明細書に記載したＴＣ１５０７の特異的隣接配列に関し、該配列は生物学的サンプルのＴＣ１５０７に対する特異的な同定方法を開発するのに有用であり得る。より詳しくは、本発明は配列番号２１、配列番号２２、およびＴＣ１５０７の５’／または３’隣接領域に関し、これらは特異的なプライマーおよびプローブの開発に使用し得る。本発明はさらに、そのような特異的プライマーまたはプローブの使用に基づいて生物学的サンプル中のＴＣ１５０７の存在を同定する方法に関する。
【００１０】
本発明の別の局面によれば、サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。そのような方法は、（ａ）ＤＮＡを含むサンプルを、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７から抽出したゲノムＤＮＡによる核酸増幅反応で使用した場合に、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７にとって特徴的な単位複製配列を作るＤＮＡプライマーセットと接触させること、（ｂ）核酸増幅反応を実施することで、単位複製配列を生成すること、ならびに（ｃ）この単位複製配列を検出することを含む。
【００１１】
新規導入遺伝子／隣接挿入領域、配列番号２６、および配列番号２７を含み、また配列番号２６および配列番号２７に対して相同または相補的であるＤＮＡ分子が、本発明の一局面である。
【００１２】
新規導入遺伝子／隣接挿入領域、配列番号２６を含むＤＮＡ配列が本発明の一局面である。トウモロコシ植物ＴＣ１５０７にとって特徴的な単位複製配列産物の生産のためのプライマー配列として有用である、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチドと配列番号２６のトウモロコシ植物ＴＣ１５０７由来のトウモロコシゲノムおよび／または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドとが含まれるＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１３】
また、新規導入遺伝子／隣接挿入領域、配列番号２７を含むＤＮＡ配列が本発明の一局面である。トウモロコシ植物ＴＣ１５０７にとって特徴的な単位複製配列産物の生産のためのプライマー配列として有用である、導入遺伝子挿入配列の十分な長さのポリヌクレオチドと配列番号２７のトウモロコシ植物ＴＣ１５０７由来のトウモロコシゲノムおよび／または隣接配列の十分な長さのポリヌクレオチドとが含まれるＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１４】
本発明の別の局面によれば、配列番号２６のＤＮＡ配列の導入遺伝子部分の少なくとも１１以上のヌクレオチドまたはそれらの相補体と、配列番号２６の同様の長さのトウモロコシの５’隣接ＤＮＡ配列またはそれらの相補体とを含むＤＮＡ配列が、ＤＮＡ増幅方法でＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生産された単位複製配列は、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７にとって特徴的である。したがって、本発明はまた、配列番号２６に相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生産される単位複製配列を包含する。
【００１５】
本発明の別の局面によれば、配列番号２７のＤＮＡ配列の導入遺伝子部分の少なくとも１１以上のヌクレオチドまたはそれらの相補体と、配列番号２７の同様の長さのトウモロコシの３’隣接ＤＮＡ配列またはそれらの相補体とを含むＤＮＡ配列が、ＤＮＡ増幅方法でＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを用いて生産された単位複製配列は、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７にとって特徴的である。したがって、本発明はまた、配列番号２７に相同または相補的なＤＮＡプライマーによって生産される単位複製配列を包含する。
【００１６】
より詳しくは、ＤＮＡ分子が配列番号１もしくはその相補体および配列番号２もしくはその相補体；配列番号２もしくはその相補体および配列番号２３もしくはその相補体；配列番号３もしくはその相補体および配列番号５もしくはその相補体；配列番号４もしくはその相補体および配列番号５もしくはその相補体として同定されるＤＮＡプライマーセットを含む一対のＤＮＡ分子が、本発明の局面である。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、配列番号１および配列番号２のＤＮＡ分子を含む単位複製配列；配列番号２および配列番号２３のＤＮＡ分子を含む単位複製配列；配列番号３および配列番号５のＤＮＡ分子を含む単位複製配列；ならびに配列番号４および配列番号５のＤＮＡ分子を含む単位複製配列を包含する。
【００１８】
本発明の別の局面によれば、サンプル中のイベントＴＣ１５０７に対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法であって、該方法は、（ａ）トウモロコシ植物から抽出したＤＮＡを含むサンプルを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でトウモロコシのイベントＴＣ１５０７から抽出したＤＮＡとハイブリダイズする一方でストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でコントロールトウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡプローブと接触させること、（ｂ）上記サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件にさらすこと、ならびに（ｃ）ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。より詳しくは、サンプル中のイベントＴＣ１５０７に対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法は、（ａ）トウモロコシ植物から抽出されたＤＮＡを含むサンプルを、そのイベントに特有な配列（例えば連結配列）からなりＤＮＡプローブ分子であって、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７から抽出されるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするＤＮＡプローブ分子と接触させること、（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件にサンプルおよびプローブをさらすこと、ならびに（ｃ）ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出すること、からなる。
【００１９】
さらに、配列番号２４内のＴＣ１５０７特異的領域を検出する生物学的サンプル内のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットおよび方法が提供される。
【００２０】
配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７からなる群より選択される配列または該配列の相補体からなる群より選択されるＴＣ１５０７の少なくとも１つの結合配列を含むＤＮＡ分子が提供され、結合配列は、ゲノムに挿入された非相同ＤＮＡと挿入部位を隣接するトウモロコシ細胞由来のＤＮＡ（すなわち、隣接ＤＮＡ）とのあいだの結合を補い、イベントＴＣ１５０７にとって特徴的である。
【００２１】
本発明の別の局面によれば、害虫抵抗性トウモロコシ植物を生産する方法は、（ａ）害虫抵抗性を与える本発明の発現カセットを含む第１のトウモロコシ親系統と害虫抵抗性が欠如した第２のトウモロコシ親系統とを交配させることで、複数の後代植物を生産すること、ならびに（ｂ）害虫抵抗性である後代植物を選択すること、を含む。そのような方法は、第２のトウモロコシ親系統に対して後代植物を戻し交配することで、害虫抵抗性であるトウモロコシ植物の純粋種を生産するさらなるステップを、任意に含むものであってもよい。
【００２２】
本発明は、害虫抵抗性であるトウモロコシ植物を生産する方法であって、ＤＮＡ構築物ＰＨＩ８９９９Ａ（配列番号２５）によってトウモロコシ植物細胞を形質転換すること、形質転換されたトウモロコシ細胞をトウモロコシ植物に成長させること、害虫抵抗性を示すトウモロコシ植物を選択すること、ならびにトウモロコシ植物を稔性トウモロコシ植物に成長させること、を含む方法を提供する。上記稔性トウモロコシ植物を、自家受粉または適合性のあるトウモロコシ種と交配して、害虫抵抗性の子孫を得ることができる。
【００２３】
本発明はさらに、生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７を同定するためのＤＮＡ検出キットに関する。好ましくは、本発明のキットは、ＰＣＲ同定プロトコルで使用するために、ＴＣ１５０７の５’もしくは３’隣接領域を特異的に認識する第１のプライマーと、ＴＣ１５０７の外来ＤＮＡ内または隣接ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第２のプライマーとを含む。本発明もまた、イベントＴＣ１５０７の特異的領域と８０％ないし１００％の配列同一性を持つ配列に一致または該配列に相補的である配列を有する特異的プローブを含む、生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットを提供する。好ましくは、プローブの配列は、イベントＴＣ１５０７の５’または３’ 隣接領域の一部を含む特異的領域に対応する。
【００２４】
本発明によって包含される方法およびキットを、以下に限定されるものではないが、植物、植物材料、あるいは限定されるものでないが、植物材料を含む、もしくは該植物材料から作られた食物もしくは飼料製品（生または加工済み）等の製品に含まれるイベントＴＣ１５０７を同定すること等の異なる目的のために、用いることができる。さらに、あるいはそれに代わって、本発明の方法およびキットを、遺伝子組換え材料と非遺伝子組換え材料とのあいだの分離を目的として遺伝し組換え植物材料の同定に用いることできる。さらに、あるいはその代わりに、本発明の方法およびキットを、トウモロコシのＴＣ１５０イベントを含む植物材料の品質を決定するのに用いることができる。キットは、上記検出方法を実行するために必要な試薬および材料を含むものであってもよい。
【００２５】
本発明はさらに、ＴＣ１５０７トウモロコシ植物またはその一部に関するもので、該一部として、限定されるものではないが、トウモロコシ植物ＴＣ１５０７およびそれに由来する子孫の花粉、胚珠、栄養細胞、花粉細胞の核、および卵細胞の核が挙げられる。本発明のＤＮＡプライマー分子が特異的単位複製配列産物を与えるトウモロコシ植物および種子ＴＣ１５０７は、本発明の一局面である。
【００２６】
本発明の上記局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付した図面から、よりいっそう明らかになる。
【００２７】
（詳細な説明）
以下の定義および方法は、本発明をより良く定義するために、また本発明の実施に際して当業者を導くために、提供される。特に示さない限り、用語は関連技術分野における当業者の慣例的用法にしたがって理解される。また、分子生物学での共通する用語の定義も、Ｒｉｅｇｅｒら，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、第５版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；およびＬｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に見いだされよう。３７ＣＦＲ１．８２２に記載のＤＮＡ塩基についての命名法が用いられる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現は「限定されるものではないが含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「トウモロコシ（ｃｏｒｎ）」という用語は、ズィーメイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）を意味するもので、トウモロコシの野生種を含むトウモロコシと交配し得るすべての植物種を包含する。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「ＴＣ１５０７特異的」という用語は、植物、植物材料、あるいは限定されるものでないが、植物材料を含む、もしくは該植物材料から作られた食物もしくは飼料製品（生または加工済み）等の製品に含まれるイベントＴＣ１５０７を識別可能に同定することに適したヌクレオチド配列のことをいう。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「害虫抵抗性（ｉｎｓｅｃｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」および「害虫に影響を及ぼす（ｉｍｐａｃｔｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔ ｐｅｓｔｓ））」という表現は、昆虫の任意の発育段階での摂食、増殖、および／または行動に変化をもたらすことをいい、昆虫を殺すこと、成長を遅らせること、生殖能を抑制すること等が挙げられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「殺虫活性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」および「殺虫力（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という表現は、数多くのパラメーターによって測定し得る生物または物質（例えば、タンパク質）の活性に言及するために同義的に使われる。上記パラメーターとして、限定されるものではないが、適当な時間にわたって生物および物質に対して給餌および／または暴露した後の害虫致死率、害虫体重減少、害虫忌避性、ならびに害虫の他の行動的および生理的変化が挙げられる。例えば、「殺虫性タンパク質（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」は、単独で、あるいは他のタンパク質と組み合わさって、殺虫活性を示すタンパク質である。
【００３３】
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のことをいう。本明細書中で使用される場合、特定の核酸に関する文脈のなかで用いられる場合、「コードしている（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」または「コードされている（ｅｎｃｏｄｅｄ）」という表現は、特定のタンパク質にヌクレオチド配列が翻訳されるのを導くために必須の情報を上記核酸が含むことを意味する。タンパク質がコードされている核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含むものであってもよく、あるいはそのような介在非翻訳配列が欠けたもの（例えば、ｃＤＮＡにあるようなもの）であってもよい。
【００３４】
遺伝子（ｇｅｎｅ）は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントのことをいい、コード配列の上流にある制御配列（５’非コード配列）および該コード領域の下流にある制御配列（３’非コード配列）が挙げられる。「天然遺伝子（ｎａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ）」は、自然界で見いだされるような遺伝子のことをいい、それ自身の制御配列を有する。「キメラ遺伝子（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅ）は、天然遺伝子ではない任意の遺伝子をいい、自然界では一緒には見いだされない調節配列とコード配列とを含む。したがって、キメラ遺伝子は異なる源に由来する調節配列およびコード配列を含むものであってもよいし、あるいは同一の源に由来する調節配列およびコード配列を含むものであってもよいけれども、自然界で見いだされるものとは異なる様式で配置されている。「内因性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ）」は、生物のゲノム中の本来の位置にある天然遺伝子のことをいう。「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）」とは目的とする位置に通常見いだされてない物質をいう。したがって、「外来ＤＮＡ（ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ）」は、新たに導入された植物の再配列ＤＮＡと組換えＤＮＡとを含むものであってもよい。「外来」遺伝子は、宿主生物で通常見いだされない遺伝子のことをいうが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される。外来遺伝子は、非天然生物に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、形質転換という手段によってゲノムに導入された遺伝子である。組換えＤＮＡが挿入されている植物ゲノム内の部位を、「挿入部位（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）」または「標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）」ということもある。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「挿入ＤＮＡ（ｉｎｓｅｒｔ ＤＮＡ）」は植物材料を形質転換させるために用いられる発現カセット内の異質ＤＮＡのことをいい、一方「隣接ＤＮＡ（ｆｌａｎｋｉｎｇ ＤＮＡ）」は植物等の生物に天然に存在するゲノムＤＮＡあるいは形質転換イベントに関連したフラグメント等の本来の挿入ＤＮＡ分子にとって異物である形質転換プロセスを介して導入された外来（異質）ＤＮＡのいずれかの存在であり得る。本明細書で用いられる「隣接領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」または「隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、少なくとも２０塩基対、好ましくは少なくとも５０塩基対、さらに最大で５，０００塩基対の配列であり、元の外来挿入ＤＮＡ分子の直上流もしくは隣接して、あるいは直下流もしくは隣接して位置している。外来遺伝子の無秩序な組込みをもたらす形質転換の手順は、各々の形質転換体にとって特徴的かつ固有の異なる隣接領域を含む形質転換体を生ずる。組換えＤＮＡが従来通りの交配を介して植物に導入される場合、その隣接領域は一般に変化しない。形質転換体は、異質挿入ＤＮＡの一断片とゲノムＤＮＡとの間、ゲノムＤＮＡの２断片間、あるいは異質ＤＮＡの２断片間の固有な連結も含む。「連結（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」は、２つの特定のＤＮＡ断片が結合する１つの点である。例えば、挿入ＤＮＡが隣接ＤＮＡと結合するところに連結が存在する。連結点もまた、天然の生物に見いだされるものから改変されるかたちで２つのＤＮＡ断片が互いに結合している形質転換生物に存在する。外来ＤＮＡの無作為な組込みを導く形質転換手順によって、各形質転換体に特有かつ固有の異なる隣接領域を含む形質転換体が得られる。「連結ＤＮＡ（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ＤＮＡ）」とは、連結点を含むＤＮＡのことをいう。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「非相同（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」とは外来種に由来する核酸である核酸のことをいい、あるいは同一種に由来するものであれば、意図的になされるヒトの干渉によって、組成および／またはゲノム遺伝子座が天然の形態から実質的に改変されている核酸のことをいう。例えば、非相同ヌクレオチド配列に作用自在に結合したプロモーターを、ヌクレオチド配列が由来する種とは異なる種から由来するものとすることができ、あるいは同一種に由来するものであるならば、ヌクレオチド配列に作用自在に結合することが自然には見いだされないプロモーターである。非相同タンパク質は、外来種に由来するものであってもよく、あるいはもし同一種に由来するものであるならば、意図的にされるヒトの干渉によって元の形態から実質的に改変される。
【００３７】
「制御配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、コード配列の上流に位置したヌクレオチド配列（５’非コード配列）、該コード配列内のヌクレオチド配列、あるいは該コード配列内の下流に位置したヌクレオチド配列（３’非コード配列）のことをいい、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、あるいは関連コード配列の翻訳に影響を及ぼす。制御配列として、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができる。
【００３８】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なヌクレオチド配列のことをいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置している。このプロモーター配列は、近位の上流因子とより遠位の上流因子とからなり、後者の因子はしばしばエンハンサーといわれる。したがって、「エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は、プロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列であって、またプロモーターの不活性因子であってもよく、あるいはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるために挿入された非相同因子であってもよい。プロモーターは、天然遺伝子から該プロモーターの全体が由来するものであってもよく、あるいは自然界で見いだされる異なるプロモーターに由来する異なる因子から構成されるプロモーターであってもよく、あるいは合成ヌクレオチド部分から構成されるものであってもよい。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種で、あるいは成長の異なる段階で、もしくは異なる環境条件に対する応答のなかで、遺伝子発現を指示することが可能であることが、当業者によって理解される。ほとんどの時間でほとんどの細胞で発現される核酸断片を生ずるプロモーターは、一般に「構成プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）と呼ばれる。植物細胞で有用な種々のタイプの新規プロモーターは、常に発見されており、数多くの例がＯｋａｍｕｒｏ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２によるコンパイルで見つかる可能性がある。多くの場合、制御配列は完全には規定されていないことから、異なる長さの核酸が同一のプロモーター活性を持つ可能性があると、さらに認められている。
【００３９】
「翻訳リーダー配列（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列とのあいだに位置したヌクレオチド配列のことをいう。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の完全に処理されたｍＲＮＡ上流に存在する。翻訳リーダー配列は、数多くのパラメーターに作用を及ぼす可能性があり、該パラメーターとして、ｍＲＮＡに対する一次転写産物のプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性、および／または翻訳効率が挙げられる。翻訳リーダー配列の例が記載されている（Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ （１９９５） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：２２５−２３６）。
【００４０】
「３’非コード配列（３’ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、コード配列の下流に位置したヌクレオチド配列のことをいい、ポリアデニル化認識配列とｍＲＮＡプロセッシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼし得る制御シグナルをコードする他の配列とが挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、一般にｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸トラクトの付加に作用することによって特徴づけられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら（１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０によって例示される。
【００４１】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内のコード配列によって定まる特定の順番で配置された複数のアミノ酸からなる鎖である。
【００４２】
ＤＮＡ構築物は、互いに結合したＤＮＡ分子の集合体であり、１つ以上の発現カセットを提供する。ＤＮＡ構築物は、細菌細胞での自己複製が可能となったプラスミドであってもよく、機能性遺伝因子（すなわち、特に、プロモーター、イントロン、リーダー、コード配列、および３’末端領域）を提供するＤＮＡ分子の導入に有用である種々のエンドヌクレアーゼ酵素制限部位を含む。あるいは、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ分子の直鎖状集合体、例えば１つの発現カセットであってもよい。ＤＮＡ構築物に含まれる発現カセットは、伝令ＲＮＡの転写を生ずるために必須の遺伝因子を含む。発現カセットを、原核細胞もしくは真核細胞で発現するように設計することができる。本発明の発現カセットは、植物細胞で最も好ましく発現するように設計される。
【００４３】
本発明のＤＮＡ分子は、目的とする生物での発現のための発現カセットに提供される。このカセットは、本発明のコード配列に作用自在に結合した５’および３’調節配列を含む。「作用自在に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、結合している核酸配列が隣接し合っており、２つのタンパク質コード領域が連結する必要性がある場合、隣接し、かつ同一リーディングフレームにあることを意味する。作用自在に結合することが意図することは、プロモーターと第２の配列とのあいだの機能的結合を示すことであり、その第２の配列に対応したＤＮＡ配列の転写の開始および実行にプロモーター配列が関与する。上記カセットに、生物に同時形質転換される少なくとも１つの遺伝子を新たに加えることも可能である。あるいは、追加の遺伝子を多重発現カセットまたは多重ＤＮＡ構築物に設けることができる。
【００４４】
発現カセットは、転写の５’から３’方向に、宿主として働く生物で機能的な転写および翻訳開始領域、コード領域、および転写および翻訳終止領域を含む。転写開始領域（すなわち、プロモーター）は、宿主生物に対して天然もしくは類似、あるいは外来もしくは異質であってもよい。さらに、プロモーターは天然の配列もしくはそれにとって代わるものとして合成配列であってもよい。発現カセットは、発現カセット構築物内に５’リーダー配列を含む。そのようなリーダー配列は翻訳を高めるように作用することができる。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子組換え（トランスジェニック、ｔｒａｎｓｇｅｎｅｎｉｃ）」という用語は、非相同核酸の存在によって遺伝子型が変えられた任意の細胞、細胞系統、カルス、組織、植物の一部分、または植物を包含し、そのように改変された遺伝子組換えに加えて、最初の遺伝子組換えから交配または無性生殖によって作られた遺伝子組換えも含まれる。本明細書で使用される「遺伝子組換え」という用語は、従来の植物育種法または自然発生的なイベント（例えば、無作為他家受精、非組換え型ウイルス感染、非組換え型細菌形質転換、非組換え型転位、もしくは偶発突然変異）によって、ゲノム（染色体または染色体外）の変化を含まない。
【００４６】
遺伝子組換え「イベント（ｅｖｅｎｔ）」は、異質ＤＮＡ構築物による植物細胞の形質転換によって生じるもので、目的とする導入遺伝子を含む核酸発現カセット、植物ゲノムへの導入遺伝子の挿入によって生ずる植物集団の再生、および特定のゲノム位置への挿入によって特徴づけられる特定の植物の選択が挙げられる。イベントは、表現型の上では、導入遺伝子の発現によって特徴づけられる。遺伝子レベルでは、イベントは、植物の遺伝学的構成の一部である。「イベント」という用語は、形質転換体と異質ＤＮＡを含む他の種とのあいだの外部交配によって生ずる子孫のこともいう。反復親に対する反復戻し交配後でさえ、形質転換された親由来の挿入ＤＮＡおよび隣接ＤＮＡが同一染色体上の位置に、上記交配の後代に存在する。「イベント」という用語は、挿入ＤＮＡ（例えば、自家受粉によって生じた子孫および元の形質転換体）を含む親系統と挿入ＤＮＡを含まない親系統との交配の結果として、目的とする導入遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け取る子孫への転移が期待される挿入ＤＮＡに直に隣接した挿入ＤＮＡおよび隣接配列を含む形質転換体に由来するＤＮＡのこともいう。
【００４７】
害虫抵抗性ＴＣ１５０７トウモロコシ植物は、遺伝子組換えＴＣ１５０７トウモロコシ植物から生長したトウモロコシ植物と害虫抵抗性を与える本発明の発現カセットによる形質転換に由来したその後代とからなる第１の親トウモロコシ植物と、害虫抵抗性を持たない第２の親トウモロコシ植物とを一代交配させて複数の第一後代植物を作り、次に、害虫抵抗性の第一後代植物を選択し、この第一後代植物を自家受粉させることで、複数の第２の後代植物を作り、次に第２の後代植物から害虫抵抗性植物を選択することによって、育種することができる。これらのステップは、さらに、害虫抵抗性第一後代植物または害虫抵抗性第二後代植物を第２の親トウモロコシ植物または第３の親トウモロコシ植物と戻し交配することで、害虫耐性であるトウモロコシ植物が得られる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「植物（ｐｌａｎｔ）」という用語は、全ての植物、植物器官（例えば、葉、茎、および根）、種子、植物細胞、およびその子孫について言及するものである。本発明の範囲内であると理解される遺伝子組換え植物の部分は、例えば、本発明のＤＮＡ分子によって事前に形質転換された遺伝子組換え植物およびその子孫に由来する植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚、同様に花、茎、果実、葉、および根を含むことから、少なくとも部分的には遺伝子組換え細胞からなるものも本発明の一局面である。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「植物細胞（ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）という用語は、限定されることなく、種子、懸濁培養、胚、分裂組織細胞領域、カルス組織、葉、根、芽、配偶体、造胞体、花粉、および花粒粉を包含する。本発明の方法で使用し得る植物の網は、通常、形質転換技術に受け入られる高等植物の種類と同程度に広く、単子葉植物および双子葉植物の両方が挙げられる。
【００５０】
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、核酸断片を宿主生物のゲノムに移して、遺伝的に安定な遺伝的形質を得ることをいう。形質転換核酸断片を含む宿主生物を「遺伝子組換え（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」生物という。植物形質転換法の例として、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（Ｄｅ Ｂｌａｅｒｅら（１９８７） Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７）および粒子加速もしくは「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号、本明細書で援用）が挙げられる。別の形質転換方法を以下に開示する。
【００５１】
したがって、本発明の単離ポリヌクレオチドを組換え体構築物、概してＤＮＡ構築物に取り込むことができ、該構築物は宿主細胞への導入および該宿主細胞での複製をおこなうことが可能である。そのような構築物をベクターとすることができ、ベクターは所定の宿主細胞でポリペプチドコード配列の転写および翻訳をおこなうことができる。植物細胞の安定的トランスフェクションまたは遺伝子組換え植物の確立に適したいくつかのベクターが、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら， （１９８５；上掲１９８７） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ （１９８９） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； およびＦｌｅｖｉｎら， （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。一般に、植物発現ベクターとして、例えば、５’および３’制御配列および優性選択可能なマーカーの転写制御下にある１種類以上のクローン化植物遺伝子が挙げられる。そのような植物発現ベクターは、プロモーター制御領域（例えば、誘導もしくは構成的、環境もしくは発生的に制御された、または細胞もしくは組織特異的である発現）、転写開始の開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位、および／あるいはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。
【００５２】
２つの異なる遺伝子組換え植物を交配させて２つの独立して分離する追加された外来遺伝子を含む子孫を生ずることも可能であることも理解される。適当な子孫の自家受粉によって、両方の追加された外来遺伝子に関してホモ接合性である植物を生産することができる。親植物に対する戻し交配と非遺伝子組換え植物との外部交配もまた、栄養生殖のように、考えられる。他の育種法の説明は、異なる形質および作物に関して一般的に用いられており、いくつかの参考文献の１つ、例えばＦｅｈｒ， ｉｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｗｉｌｃｏｓ Ｊ． ｅｄ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ． （１９８７）に見いだすことができる。
【００５３】
「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、もしくは酵素が取り付けられる単離された核酸である。そのようなプローブは、標的核酸の一本の鎖に対して相補的であり、本発明の場合、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７からの単離ＤＮＡの鎖に、トウモロコシ植物に由来もしくは該イベント由来のＤＮＡを含むサンプルに由来するにせよ、相補的である。本発明にもとづくプローブとして、デオキシリボ核酸もしくはリボ核酸のみならず、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用し得るポリアミド類および他のプローブ材料が挙げられる。
【００５４】
「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成するために核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニールされ、次にポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）によって標的ＤＮＡ鎖に沿って延伸される単離された核酸である。本発明のプライマー対とは、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅法によって、標的核酸配列を増幅させる用途のことをいう。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」は、特的ＤＮＡセグメントを増幅させるために用いられる技術である（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，８００，１５９号（本明細書で援用）を見よ）。
【００５５】
プローブおよびプライマーは、操作者が定めたハイブリダイゼーション条件または反応条件で特異的に標的ＤＮＡ配列に結合する十分なヌクレオチド長である。この長さは、一般に選ばれる検出方法で有用である十分な長さである任意の長さであってもよい。一般に、長さが１１ヌクレオチド以上、好ましくは１８ヌクレオチド以上、より好ましくは２２ヌクレオチド以上が用いられる。そのようなプローブおよびプライマーは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明のプローブおよびプライマーは、標的配列と隣接ヌクレオチドのＤＮＡ配列類似性が完全であり、プローブが標的ＤＮＡ配列とは異なっても、標的ＤＮＡＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション能力を従来の方法によって設計することができる。プローブはプライマーとして使用することもできるが、一般に標的ＤＮＡまたはＲＮＡと結合するように設計されており、増幅プロセスでは使用されない。
【００５６】
特異的プライマーを用いて組込み断片を増幅し、生物学的サンプルでのイベントＴＣ１５０７を同定するための「特異的プローブ」として使用し得る単位複製配列を作ることができる。プローブが、該プローブと生物学的サンプルとの結合を可能にする条件下で、その生物学的サンプルの核酸とハイブリダイズする場合、この結合を検出することができるので、生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７の存在を示すことが可能である。そのような結合プローブの同定は、当技術分野で記載されている。特異的プローブは、望ましくは、最適化された条件下で、特異的に、上記イベントの５’または３’隣接領域内の領域にハイブリダイズし、好ましくはそれに隣接した外来ＤＮＡの一部を含む。好ましくは、特異的プローブは、上記イベントの特的領域と、少なくとも８０％、より好ましくは８０％ないし８５％、より好ましくは８５％ないし９０％、特に好ましくは９０％ないし９５％、さらに最も好ましくは９５％ないし１００％同一（または相補的）である。
【００５７】
プローブおよびプライマーを調製および使用するための方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， ｖｏｌ． １−３， ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． １９８９ （以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９」とする）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２ （定期的更新を含む） （以下、「Ａｕｓｕｂｅｌら， １９９２」とする）； およびＩｎｎｉｓら， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えばそのような目的を意図したコンピュータプログラムを用いることによって、既知の配列から得ることができ、該プログラムの例として、ＰＣＲプライマー分析ツールを含むＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖｅｒｓｉｏｎ ６ （Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．， Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）；ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ （ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）； およびＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， (c)１９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓ．）が挙げられる。さらに、当業者に既知のガイドラインを用いて、配列を視覚的に走査してプライマーを手動で同定することができる。
【００５８】
本明細書で用いられる「キット（ｋｉｔ）」とは、本発明の目的、より詳しくは生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７の同定を実施することを目的とした複数の試薬からなるセットのことをいう。品質管理（例えば、種子ロットの純度）、植物材料のＴＣＶ１５０７イベントの検出、あるいは植物材料を含む材料もしくは該植物材料に由来する材料、例えば限定されるものではないが食品または飼料のために、本発明のキットを用いることができ、またその成分を明確に調節することができる。本明細書で用いられるように「植物材料（ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）とは、植物から得られる材料または植物に由来する材料のことをいう。
【００５９】
本明細書に開示された隣接ＤＮＡおよび挿入配列に基づいたプライマーおよびプローブを、従来の方法（例えば、そのような配列の再クローニングおよびシークエンシング）によって、開示された配列を確認するために（および、もし必要ならば、訂正するために）用いることができる。本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を用いて、サンプル中での遺伝子組換えイベント由来ＤＮＡの存在を同定することができる。核酸分子またはその断片は、一定の環境で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書中で使用される場合、２つの核酸分子は、２つの核酸分子が逆平行性の二重鎖核酸構造を形成することが可能であるならば、互いに特異的にハイブリダイズすることが可能であると考えられる。
【００６０】
核酸分子は、完全な相補性を他の核酸分子とともに示すならば、この他の核酸分子の「相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」であると考えられる。本明細書中で使用される場合、一方の分子の各々のヌクレオチドが他方の分子のヌクレオチドに対して相非的である場合、これらの分子は「完全な相補性（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）」を示すと考えられる。２つの分子は、少なくとも従来の「ストリンジェンシーが低い（ｌｏｗ−ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」条件下で互いにアニールしたままであることを許すのに十分な安定性をもって互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」と考えられる。同様に、上記分子は、少なくとも従来の「ストリンジェンシーが高い（ｈｉｇｈ−ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」条件下で互いにアニールしたままであることを許すのに十分な安定性をもって互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」と考えられる。従来のストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９、およびＨａｙｍｅｓら， Ｉｎ： 核酸 ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ． （１９８５）に記載されており、したがって完全な相補性からの逸脱は、該逸脱が二重鎖を形成する分子の能力を完全に排除しない限り、許される。プライマーまたはプローブとして役に立つ核酸分子となるように、用いられた特定の溶媒および塩濃度のもとで、安定な二重鎖を形成することが可能であるように、配列が十分に相補的であることのみが求められる。
【００６１】
ハイブリダイゼーション反応では、特異性は一般にハイブリダイゼーション後の洗浄であり、最終洗浄溶液の温度およびイオン強度が重要な要素である。熱融解点（Ｔｍ）は、相補的標的配列の５０％が完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ （１９８４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３８：２６７−２８４の等式、すなわちＴｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／ＬからＴｍを近似させることができ、式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合、％形態はハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合、さらにＬは塩基対内のハイブリッドの長さである。各々１％のミスマッチで約１℃、Ｔｍが減少する。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を、所望の同一性の配列に対してハイブリダイズするように調節することができる。例えば、＞９０％同一性を持つ配列が求められた場合、Ｔｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特異的配列およびその相補体のＴｍよりも約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１、２、３、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、また中程度のストリンジェントな条件では、Ｔｍよりも６、７、８、９、または１０℃でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェントな条件では、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。
【００６２】
上記等式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを用いることで、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化が本質的に記載されていることを理解する。もし所望の度合いのミスマッチによってＴｍが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低くなるならば、より高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての詳しい指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−− Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ 核酸 Ｐｒｏｂｅ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌら， ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見いだされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）を見よ。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、実質的に相同な配列は、ストリンジェンシーが高い条件下で比較されている核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェントな条件は、例えば、約４５℃の６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃で２ｘＳＳＣによる洗浄が当業者に知られており、あるいはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に見いだすことができる。一般に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０ないし８．３で、約１．５ＭＮａイオン未満、通常、約０．０１ないし１．０ＭＮａイオン濃度（あるいは他の塩類）であり、温度は短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃で、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを上回る）に対して少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の脱安定化剤の添加によって達成することが可能である。典型的な低ストリンジェントな条件として、３７℃で、３０ないし３５％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液でハイブリダイゼーションをおこない、５０ないし５５℃で１Ｘないし２ＸＳＳＣ（２０ＸＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）で洗浄することが挙げられる。典型的な高ストリンジェントな条件として、３７℃で、５０％ホルムアミド、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液、でハイブリダイゼーションをおこない、６０ないし６５℃で０．１ＸＳＳＣで洗浄することが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の核酸を、イベントＴＣ１５０７またはその相補体あるいはいずれかの断片に特有の１つ以上の核酸分子に対して、中程度にストリンジェントな条件で、特異的にハイブリダイズさせる。
【００６４】
比較のために配列を位置合わせする方法が当技術分野で周知である。したがって、任意の２つの配列間でのパーセント同一性を決定することは、数学的なアルゴリズムを用いることで達成することができる。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈら（１９８１） Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２の局所相同アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３の相同位置合わせアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４−２４４８の類似性検索方法（ｓｅａｒｃｈ−ｆｏｒ−ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−ｍｅｔｈｏｄ）、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７によって改変されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズムである。
【００６５】
これらの数学的アルゴリズムのコンピュータインプリメンテーションを配列同一性の決定のための配列比較に利用することができる。そのようなインプリメンテーションとして、限定されるものではないが、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．より入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）、ＡＬＩＧＮ ＰＬＵＳプログラム （ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０、著作権１９９７）、およびＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０ （ Ａｃｃｅｌｒｙｓ、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ． ９２１２１、ＵＳＡより入手可能）が挙げられる。これらのプログラムを用いた位置合わせを、デフォルトパラメーターを用いて実行することができる。
【００６６】
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ ７３： ２３７−２４４ （１９８８）； Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５： １５１−１５３ （１９８９）； Ｃｏｒｐｅｔ，ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６： １０８８１−９０ （１９８８）； Ｈｕａｎｇ，ら， Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８： １５５−６５ （１９９２）、およびＰｅａｒｓｏｎ，ら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４： ３０７−３３１ （１９９４）によって詳しく記載されている。ＡＬＩＧＮおよびＡＬＩＧＮ ＰｌＬＵＳプログラムは、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８）上掲のアルゴリズムにもとづいている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０）上掲のアルゴリズムにもとづいている。データベース類似性検索に使えるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーとして、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のＢＬＡＳＴＸ、タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のＢＬＡＳＴＰ、ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のＴＢＬＡＳＴＮ、ならびにヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のＴＢＬＡＳＴＸが挙げられる。 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ １９， Ａｕｓｕｂｅｌ，ら， Ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９５）を見よ。位置合わせまた、検査によって手動で実行することが可能である。
【００６７】
比較を目的としてギャップ位置合わせ（ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＳＴ２．０内）を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９に記載したように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０内）を用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実行することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）上掲を見よ。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、各々のプログラム（例えば、ヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質のＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｈｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を見よ。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈にある「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、特定の比較窓全体にわたる最大一致に対して位置合わせした場合に、同一である２つの配列の残基に言及する。配列同一性の割合をタンパク質に関して用いる場合、同一ではない残基位置が保守的アミノ酸置換によってしばしば異なることが認められ、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に対して置換されるので、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なるとき、パーセント配列同一性は置換の保守的な性質を修正するために上方を調整される可能性がある。配列が保守的置換で異なる場合、配列同一性率を上方調整して置換の保守的性質について修正をおこなってもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」または「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」があると言われている。この調整をするための手段は、当業者に周知である。概して、このことは、完全なミスマッチよりはむしろ部分的なものとして保守的置換を採点することを伴い、それによって配列同一性率が増加する。このように、例えば、同一アミノ酸に得点１が与えられ、非保守的置換の得点はゼロであり、保守的置換にゼロないし１の得点があたえられる。保守的置換の採点は、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ （Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にインプリメントされるようにして、計算される。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「配列同一性の割合（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、比較窓上に最適に位置合わせされた２つの配列を比較することによって決定された値を意味し、２つの配列の最適位置合わせに対して参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて、比較窓内のポリヌクレオチド配列の一部が付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むものであってもよい。上記割合は、一致した位置の数を得るために、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生ずる位置の数を測定し、比較窓内の位置の全数で一致した位置の数を割り、結果に対して１００を掛けることで配列同一性の割合を求めることによって、計算される。
【００７０】
特定の増幅プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、プライマー対が標的核酸配列のみにハイブリダイズすることを可能とする条件であり、その標的核酸配列に、対応の野生型配列（またはその相補体）を持つプライマーが結合し、好ましくは固有の増幅産物である単位複製配列をＤＮＡ熱増幅反応で生ずる。
【００７１】
「（標的配列に対して）特異的な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ （ａ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））」という表現は、プローブまたはプライマーがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、標的配列を含むサンプル中でその標的配列のみとハイブリダイズすることを示す。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、「増幅ＤＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ）または「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」とは、核酸テンプレートの一部である標的核酸配列の核酸増幅の産物のことをいう。例えば、交配の結果生ずるトウモロコシ植物が、本発明のトウモロコシ植物由来の遺伝子組換イベントゲノムＤＮＡを含むかどうかを決定するために、トウモロコシ植物組織サンプルから抽出したＤＮＡを、ＤＮＡプライマー対を用いた核酸増幅法にさらしてもよく、該ＤＮＡプライマー対は、異質挿入ＤＮＡの挿入部位に隣接した隣接配列に由来する第１のプライマーと、ＤＮＡイベントの存在にとって特徴的な単位複製配列を生成するために異質挿入ＤＮＡに由来する第２のプライマーとを含む。あるいは、第２のプライマーが隣接配列に由来するものであってもよい。単位複製配列は一定の長さで、上記イベントに特徴的でもある配列を有する。単位複製配列の長さは、プライマー対とヌクレオチド塩基対とを組み合わせた長さから、ＤＮＡ増幅プロトコルによって生産可能な任意の長さの単位複製配列に至るまでの範囲であってもよい。あるいは、プライマー対は、図１に示すように、約６．２ｋｂの大きさであるＰＨＩ８９９９Ａ発現構築物の挿入ヌクレオチド配列全体を含む単位複製配列を生成するようにして、挿入ＤＮＡの両側で、隣接配列に由来することができる。隣接配列に由来するプライマー対の一つの構成要素を、挿入ＤＮＡ配列から離間して配置してもよく、この離間距離は１塩基対から増幅反応の限界までの範囲、あるいは約２０，０００塩基対とすることができる。「単位複製配列」という用語の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応で形成され得るプライマー二量体を特異的に排除する。
【００７３】
核酸増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を含む当技術分野で公知の種々の核酸増幅法のいずれかによって達成し得る。種々の増幅法が当技術分野で公知であり、また記載されており、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号および第 ４，６８３，２０２号に記載され、またＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｅｄ． Ｉｎｎｉｓら， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９０に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、最大で２２ｋｂのゲノムＤＮＡならびに最大で４２ｋｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために、開発された（Ｃｈｅｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：５６９５−５６９９、１９９４）。ＤＮＡ増幅の技術分野で知られている他の方法と同様に、それらの方法を本発明が実施される際に用いることが可能である。特定のＰＣＲプロトコルのいくつかのパラメーターを特定の実験室条件に調整することが必要であり、またわずかに修飾することも可能であり、さらに同様の結果を収集することが可能である。これらの調整は、当業者にとって明らかである。
【００７４】
これらの方法によって生産される単位複製配列は、複数の技術によって検出することが可能であり、該技術として、限定されるものではないが、隣接する隣接ＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするようにＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されるＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ （Ｎｉｋｆｏｒｏｖ，ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２２： ４１６７−４１７５， １９９４）が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、マイクロウエルプレートのウエル内に固定される。目的とする領域のＰＣＲ（挿入配列に１つのプライマーを用い、隣接する隣接領域にも１つ用いる）をおこなった後、単鎖ＰＣＲ産物を固定化オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができ、ＤＮＡポリメラーゼおよび予想される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを用いる単一塩基伸長反応のテンプレートとしての役割を果たす。読み出しは、蛍光またはＥＬＩＳＡをベースとすることが可能である。シグナルは、成功裏になされる増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長による挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７５】
別の検出方法は、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ． Ｐｈａｒｍａ． Ｔｅｃｈ． ００： １８−２４、２０００）に記載されているピロ塩基決定法である。この方法では、隣接ＤＮＡおよび挿入ＤＮＡ連結にかさなるオリゴヌクレオチドが設計されている。オリゴヌクレオチドは、目的とする領域に由来する単鎖ＰＣＲ産物（挿入配列にプライマーが一つあり、隣接配列にプライマーが１つある）にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸、およびルシフェリンの存在下で、インキュベートされる。ｄＮＴＰは個々に添加され、その取り込みは、測定される光シグナルを生ずる。光シグナルは、成功裏になされる増幅、ハイブリダイゼーション、および単一または多重塩基伸長による導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７６】
Ｃｈｅｎら，（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ９：４９２−４９８， １９９９）に記載されたような蛍光偏光は、本発明の単位複製配列を検出するために用い得る方法である。この方法を用いることで、隣接および挿入ＤＮＡ連結をおおうオリゴヌクレオチドが設計される。オリゴヌクレオチドは、目的とする領域に由来する単鎖ＰＣＲ産物（挿入ＤＮＡ配列にプライマーが一つあり、隣接ＤＮＡ配列にプライマーが１つある）にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一塩基伸長は、ｄｄＮＴＰの取り込みをもたらす。取り込みは、蛍光光度計を用いた偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、成功裏になされる増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長による導入遺伝子挿入／隣接配列の存在を示す。
【００７７】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量するための方法として記載されており、製造元によって提供される指示書で完全に理解される。手短に言うと、隣接および挿入ＤＮＡ連結に重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列にプライマーが一つあり、隣接ゲノム配列にプライマーが１つある）が耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、循環される。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、ＦＲＥＴプローブ上で消光部分から離れて、切断と蛍光部分の放出とに帰着する。蛍光発光は、成功裏になされる増幅とハイブリダイゼーションとによる隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００７８】
分子指標は、Ｔｙａｎｇｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４：３０３−３０８、１９９６）に記載されたように、シークエンシングで使用するために記載されている。手短に言うと、隣接および挿入ＤＮＡ連結に重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブの固有の構造が、近接近状態で蛍光および消光部分の２次構造をもたらす。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列にプライマーが一つあり、隣接配列にプライマーが１つある）が耐熱性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で、循環される。成功裏になされるＰＣＲ増幅の後、ＦＲＥＴプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブの２次構造の除去をもたらし、蛍光および消光部分の空間的分離をもたらす。蛍光シグナルが生ずる。蛍光シグナルは、成功裏になされる増幅およびハイブリダイゼーションによる隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００７９】
アンプリオン内で見いだされる配列に対して特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、単位複製配列がＰＣＲ反応によって生ずることを検出するために用いられるさらに別の方法である。
【００８０】
本発明は、以下の実施例によってさらに定義される。発明の好ましい実施形態を示す一方で、これらの実施例が説明することのみを目的として与えられることが理解されなければならない。上記の考察とこれらの例から、当業者は、本発明の必須特性を確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、それをさまざまな用途および状況に適応させるために、発明の種々の変更および修飾をおこなうことができる。このように、発明の種々の変形は、本明細書に例示および記載したものに加えて、前述の説明から当業者にとって明らかである。そのような変形は、添付の請求の範囲の範囲内にあることも意図している。
【００８１】
本明細書中に述べられた前述の参照の各々の開示は、全体として本明細書に援用される。
【実施例】
【００８２】
（実施例１．粒子衝突によるトウモロコシの形質転換とＣｒｙ１Ｆ遺伝子含有遺伝子組換え植物の再生）
ＰＨＩ８９９９Ａと表された６．２ｋｂのＤＮＡ分子（図１参照、配列番号２５）は、アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から単離した３’ＯＲＦ２５転写終結因子（Ｂａｒｋｅｒら（１９８３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２：３３５−３５０）に作用自在に結合したＣｒｙ１Ｆと同定されたバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の６−エンドトキシンをコードするＤＮＡ分子（米国特許第５，１８８，９６０号および６，２１８，１８８号）に作用自在に結合したトウモロコシユビキチン（Ｕｂｎｉ−１）遺伝子（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８：６７５−６８９およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ （１９９６） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ５：２１３−２１８）のプロモーター、５’非翻訳エキソン、および第１のイントロンを含む第１の導入遺伝子発現カセットと、（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’転写終結因子（Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：４９−５９）を含むＤＮＡ分子に作用自在に結合した選択可能なマーカーであるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ Ｗ．ら（１９８８） Ｇｅｎｅ ７０：２５−３７）に作用自在に結合したカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５プロモーター（Ｏｄｅｌｌ Ｊ． Ｔ．ら（１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ８１０−８１２； Ｍｉｔｓｕｈａｒａら（１９９６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：４９−５９）のＤＮＡ分子を含む第２の導入遺伝子発現カセットとを有し、トウモロコシ胚組織を形質転換するために用いられる。
【００８３】
Ｂ．ｔ Ｃｒｙｓｔ１Ｆトウモロコシ植物は、基本的にＫｌｅｉｎら（１９８７） Ｎａｔｕｒｅ、ＵＫ ３２７（６１１７）：７０−７３に記載されているように、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡが製造したＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（登録商標）ＰＤＳ−１００Ｈｅ粒子ガンを用いた微小発射体ボンバードメントを用いて得た。受粉直後に収穫したトウモロコシ穂から単離した未成熟胚を数日間にわたってカルス誘導培地で培養した。形質転換の日に、タングステン微粒子を精製ＰＨＩ８９９９ＤＮＡ（配列番号２５）で被覆して培養胚への取り込みを促すことで、培養胚での細胞染色体への挿入ＤＮＡの取り込みが行われた。挿入ＰＨＩ８９９９Ａのみが形質転換の過程で使用され、形質転換体へのさらなるプラスミドＤＮＡの取り込みは起こらなかった。ボンバードメント後、選択剤としてグルフォシネートを含むカルス誘導培地に胚を移した。培養中、個々のカルスを物理的に分けておいたところ、外植体の大部分がその選択培地上で死滅した。
【００８４】
生き残って正常なグルフォシネート耐性カルスを生産する胚に対して、推定上の形質転換イベントを表す固有の識別コードを割り当て、新鮮な培地に連続して移した。各々の固有のイベントに由来する組織から植物を再生させ、該植物を温室に移した。分子レベルで分析をおこなうために葉サンプルを採取し、ＰＣＲによる導入遺伝子の有無の確認およびＥＬＩＳＡによるＣｒｙ１Ｆタンパク質の発現について確認をおこなった。次に、植物を、アワノメイガ昆虫を用いた全草バイオアッセイに供した。陽性の植物を近交系とかけ合わせて、最初の形質転換植物から種子を得た。この分野で多数の系統を評価した。イベントＴＣ１５０７を、虫害抵抗性および農学的特性等の優れた特徴の組み合わせに基づいた、独立した遺伝子組み換えイベントの母集団から選択した（Ｂｉｎｇ Ｊ Ｗら（２０００） Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ、１４ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｃｏ．を見よ。なお、この文献を本明細書で援用する）。
【００８５】
（実施例２．バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） Ｃｒｙ１Ｆ トウモロコシＴＣ１５０７系統の遺伝子組換え挿入ＤＮＡに対して５’側の隣接配列を含むヌクレオチドの同定）
イベントＴＣ１５０７内のＰＨＩ８９９Ａ挿入に対して５’側の配列を含んだＤＮＡ断片を同定するために、イベントＴＣ１５０７ゲノムＤＮＡ由来のＳｐｅＩ制限酵素断片をアガロースゲル上でサイズ選択、精製、およびサウザン分析によるスクリーニングをおこなうことで、Ｃｒｙ１Ｆプローブに対するハイブリダイゼーションを確認した。エンリッチされたサイズ選択プラスミド系ゲノムＤＮＡライブラリーを調製するために、ハイブリダイゼーションおよび断片サイズの確認後、目的とする断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（商標）クローニングベクターにクローニングした。Ｃｒｙ１Ｆ遺伝子の一部に相同なプローブを用いて、陽性クローンに対するプラスミドライブラリーをスクリーニングした。陽性クローンを同定し、新たなスクリーニングによって精製し、さらにＣｒｙ１Ｆプローブにハイブリダイズした場合に陽性シグナルをもたらすかを確認した。単離された陽性クローンに含まれるＳｐｅＩ断片の初期３ｋｂを、プライマーウオーキングアプローチを用いて、シークエンシングをおこなった。第１のシークエンシングを開始させるために、クローニングベクターＤＮＡ内の基知の基地の配列に結合するプライマーを設計して目的とするＤＮＡの一部分をシークエンシングした。逆方向に配向した別のプライマーを用いた同一領域にわたる第２のシークエンシングの実行は、第２の鎖の範囲（カバリッジ）を与えた。プライマーウオーキングは、先行する実行から得た配列データを繰り返し用いることによって達成され、新規のプライマーを設計した。このプライマーは、次に、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の挿入遺伝子組換えＤＮＡに対して５’側の隣接領域が得られるまで、目的とするＤＮＡまでさらにシークエンシングの次のラウンドを伸ばすために用いられる。得的配列情報を実施例４に示す。
【００８６】
（実施例３．Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｆトウモロコシ１５０７系統挿入に対して５’側の隣接配列の確認）
Ｂ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｆトウモロコシ１５０７系統挿入の５’隣接配列を確認するために、ＰＣＲプライマー対を設計して５’隣接領域から完全長ＰＨＩ８９９９Ａ遺伝子組換え挿入に延びる重複ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を成功裏にＢ．ｔ．Ｃｒｙ１Ｆトウモロコシ１５０７系統ゲノムＤＮＡから増幅し、単離し、表１に示すように領域１から領域６までのシークエンシングをおこない、実施例２に記載したＳｐｅＩ断片由来の既に決定された配列と一致するか確認した。しかし、完全長挿入の開始に対して直に隣接し、かつ５’側である２３５８ｂｐから２８２９ｂｐまでの領域は、ＰＣＲ増幅にとっては扱いにくく、上記したＳｐｅＩから得た配列よりも大きいことがわかった。この領域とＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＧＣ２Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）を隣接するプライマー対の使用は、Ｂ．ｔ． Ｃｒｙ１ＦトウモロコシＴＣ１５０７系統ゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物の増幅では成功裏になされた。Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＧＣ２システムによる単位複製配列の生産に用いられる増幅条件を表１０に示す。２３５８ｂｐないし２８２９ｂｐの領域にある配列を確認するために用いられるＤＮＡプライマー対は、配列番号１および配列番号２ならびに配列番号２および配列番号２３に挙げられたものである。この領域の配列を表１に記載する（領域７ａ、７ｂ、および８）。
【００８７】
（実施例４．イベントＴＣ１５０７の５’隣接配列。各々の領域を表１に記述する）
（領域１（配列番号２８） トウモロコシゲノム（有意な相同性なし））
１ ＡＣＴＡＧＴＴＴＣＣ ＴＡＧＣＣＣＧＣＧＴ ＣＧＴＧＣＣＣＣＴＡ ＣＣＣＣＡＣＣＧＡＣ ＧＴＴＴＡＴＧＧＡＡ
５１ ＧＧＴＧＣＣＡＴＴＣ ＣＡＣＧＧＴＴＣＴＴ ＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣ ＣＣＴＡＡＧＧＡＴＧ ＴＡＡＡＴＧＧＴＣＧ
１０１ ＧＴＡＡＡＡＴＣＣＧ ＧＴＡＡＡＴＴＴＣＣ ＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴ ＡＣＣＡＧＡＴＴＴＴ ＴＣＣＡＧＣＣＧＴＴ
１５１ ＴＴＣＧＧＡＴＴＴＡ ＴＣＧＧＧＡＴＡＴＡ ＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡ ＧＡＣＧＧＡＡＡＣＧ ＧＡＡＴＡＧＧＴＴＴ
２０１ ＴＴＴＴＴＣＧＡＡＡ ＡＣＧＧＴＡＣＧＧＴ ＡＡＡＣＧＧＴＧＡＧ ＡＣＡＡＡＣＴＴＡＣ ＣＧＴＣＣＧＴＴＴＴ
２５１ ＣＧＴＡＴＴＴＣＴＣ ＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴ ＧＧＴＡＴＡＴＴＣＣ ＣＧＴＡＴＴＴＧＴＣ ＣＣＧＴＡＴＴＴＴＣ
３０１ ＣＣＧＡＣＣＣＡＣＧ ＧＡＣＣＴＧＣＣＡＡ ＴＣＡＡＣＣＡＴＣＡ ＧＣＣＡＧＴＣＡＧＣ ＣＣＡＴＣＣＣＣＡＣ
３５１ ＡＧＣＴＡＴＧＧＣＣ ＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡ ＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣ ＡＴＧＣＣＣＡＣＧＣ ＡＡＣＧＣＡＡＧＧＣ
４０１ ＡＧＴＡＡＧＧＣＴＧ ＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣ ＡＣＧＣＡＴＴＧＡＣ ＧＣＡＴＧＴＧＧＡＣ ＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣ
４５１ ＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴ ＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧ ＴＧＣＣＧＴＴＧＴＧ ＣＧＡＧＡＣＴＧＴＧ ＡＣＴＧＣＧＡＧＴＧ
５０１ ＧＣＧＧＡＧＴＣＧＧ ＣＧＡＡＣＧＧＣＧＡ ＧＧＣＧＴＣＴＣＣＧ ＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣ ＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧ
５５１ ＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧ ＣＴＧＴＧＡＣＧＧＣ ＧＡＣＴＣＧＧＣＧＡ ＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣ ＴＡＣＣＡＡＧＣＣＣ
６０１ ＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣ ＡＴＣＣＡＴＣＴＣＴ ＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧ ＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴ ＣＣＣＣＴＧＧＴＣＧ
６５１ ＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣ ＧＣＣＡＧＡＣＣＧ
（領域２（配列番号２９） 記述されていないトウモロコシゲノム配列（相補体））
６７０ ＧＣＣＧＡＡＧＣＡＴＣ ＡＣＧＡＡＡＣＧＣＡ ＣＴＡＡＧＡＣＣＴＣ
７０１ ＧＡＡＧＧＡＧＴＣＡ ＡＡＣＣＡＣＴＣＣＴ ＣＣＧＡＧＧＣＣＴＣ ＧＧＧＧＧＣＴＡＣＡ ＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴ
７５１ ＧＣＧＣＴＣＧＣＧＣ ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＧ ＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧ ＴＡＡＣＣＧＡＧＡＡ ＡＧＧＴＣＧＧＴＣＣ
８０１ ＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡ ＡＡＡＧＴＧＣＧＡＣ ＡＡＡＡＧＣＣＴＣＣ ＡＡＧＣＧＡＧＴＡＴ ＴＡＡＣＡＣＴＣＡＣ
８５１ ＴＴＴＧＡＧＧＣＴＣ ＧＧＧＧＧＣＴＡＣ
（領域３（配列番号３０） トウモロコシＨｕｃｋ−１レトロトランスポゾンの断片）
８７０ Ｔ ＧＴＣＧＧＧＧＡＣＣ ＡＴＡＡＴＴＡＧＧＧ ＧＴＡＣＣＣＣＣＡＡ
９０１ ＧＡＣＴＣＣＴＡＡＴ ＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴ ＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣ ＡＧＣＡＣＡＡＡＧＣ ＴＧＣＡＡＡＧＧＣＣ
９５１ ＴＧＡＴＧＧＧＴＧＣ ＧＡＴＴＡＡＧＴＣＡ ＡＧＧＣＴＣＧＧＴＣ ＣＡＣＴＣＡＡＧＧＧ ＡＣＡＣＧＡＴＣＴＣ
１００１ ＧＣＣＴＣＧＣＣＣＧ ＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴ ＣＧＧＧＣＡＡＧＧＧ ＣＧＧＣＣＧＡＣＣＣ ＣＧＡＧＧＡＴＴＣＡ
１０５１ ＣＧＴＣＴＣＧＣＣＣ ＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣ ＴＣＡＡＧＣＧＡＣＧ ＧＧＣＡＣＡＣＣＴＴ ＣＧＧＣＴＣＧＣＣＣ
１１０１ ＧＡＧＧＣＣＣＡＴＴ ＣＴＴＣＧＣＣＧＡＧ ＡＡＧＣＡＡＣＣＴＴ ＧＧＣＣＡＧＡＴＣＧ ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣ
１１５１ ＣＧＡＣＣＧＴＡＴＣ ＧＣＡＧＧＡＧＣＡＴ ＴＴＡＡＴＧＣＧＡＧ ＧＡＴＣＧＣＣＴＧＡ ＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣ
１２０１ ＴＧＡＣＧＣＧＣＧＣ ＴＣＴＴＣＡＧＴＣＧ ＡＣＡＧＡＧＣＣＧＡ ＡＧＴＧＡＣＣＧＣＡ ＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣ
１２５１ ＣＧＣＴＣＣＡＣＴＧ ＡＣＣＧＡＣＣＴＧＡ ＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡ ＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧ ＣＧＴＣＧＣＴＣＣＧ
１３０１ ＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣ ＣＡＣＴＣＧＡＣＡＧ ＡＧＴＧＡＧＧＣＴＧ ＡＣＡＧＣＡＧＣＣＡ ＡＧＴＣＣＧＧＣＣＴ
１３５１ ＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴ ＡＧＧＡＡＧＣＴＣＣ ＧＣＣＴＣＧＣＣＣＧ ＡＣＣＣＴＡＧＧＧＣ ＴＣＧＧＡＣＴＣＧＧ
１４０１ ＣＣＴＣＧＧＣＴＣＣ ＧＧＡＡＧＡＣＧＡＣ ＧＡＡＣＴＡＣＧＣＴ ＴＣＧＣＣＣＧＡＣＣ ＣＣＡＧＧＧＣＴＴＧ
１４５１ ＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴ ＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡ ＡＧＡＣＧＡＣＧＡＡ ＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧ ＣＣＣＧＡＣＣＣＣＡ
１５０１ ＧＧＧＣＴＣＧＧＡＣ ＴＣＧＧＣＣＴＣＧＧ ＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡ ＣＧＡＣＧＡＡＣＴＣ ＣＧＣＣＴＣＧＣＣＣ
１５５１ ＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧ ＣＴＣＧＧＡＣＴＣＡ ＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣ ＣＧＧＡＡＧＡＣＧＡ ＣＧＡＡＣＴＣＣＧＣ
１６０１ ＣＴＣＧＣＣＣＧＡＣ ＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣ ＧＧＡＣＴＣＡＧＣＣ ＴＣＧＧＣＣＴＣＡＧ ＡＣＧＡＴＧＧＴＣＴ
１６５１ ＣＣＧＣＣＴＣＧＣＣ ＣＧＡＣＣＣＧＧＧＧ ＣＴＣＧＧＡＣＴＣＧ Ａ
（領域４（配列番号３１） ｃｒｙ１Ｆ遺伝子のフラグメント）
１６８２ ＣＣＴＴＴＣＴＡＴ ＣＧＧＡＣＣＴＴＧＴ
１７０１ ＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴ ＣＴＴＣＧＴＣＣＧＡ ＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧ ＧＣＡＡＴＣＣＴＣＡ ＣＴＡＴＧＴＡＣＴＣ
１７５１ ＧＧＴＣＴＴＡＧＧＧ ＧＡＧＴＧＧＣＣＴＴ ＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴ ＧＧＴＡＣＧＡＡＴＣ ＡＣＡＣＣＣＧＣＡＣ
１８０１ ＡＴＴＣＡＧＧＡＡＣ ＴＣＣＧＧＧＡＣＣＡ ＴＴＧＡＣＴＣＴＣＴ ＡＧＡＴＧＡＧＡＴＡ ＣＣＡＣＣＴＣＡＡＧ
１８５１ ＡＣＡＡＣＡＧＣＧＧ ＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧ ＡＡＴＧＡＣＴＡＣＴ ＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴ ＧＡＡＴＣＡＴＧＴＴ
１９０１ ＡＣＣＴＴＴＧＴＧＣ ＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧ ＴＧＡＧＡＴＣＴＣＡ ＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴ ＣＡＴＧＧＡＧＡＧＣ
１９５１ ＡＣＣＡＡＴＧＴＴＣ ＴＣＴＴＧＧＡＣＧＣ ＡＴＣＧＴＡＧＣＧＣ ＴＡＣＣＣＣＣＡＣＡ ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧ
２００１ ＡＴＣＣＡＧＡＧＡＧ ＡＡＴＣＡＣ
（領域５（配列番号３２） 葉緑体ｒｐｏＣ２遺伝子の断片）
２０１７ ＴＣＡＴ ＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡ ＣＴＧＣＡＴＡＴＣＴ ＴＧＣＣＧＡＧＡＴＣ
２０５１ ＣＴＣＡＴＣＣＣＴＡ ＡＡＧＧＴＡＣＴＴＧ ＡＣＡＡＴＡＧＴＡＴ ＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣ ＧＡＴＡＣＡＣＡＡＣ
２１０１ ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡ ＴＡＣＡＡＧＡＡＧＴ ＣＧＡＣＴＡＧＧＴＧ ＧＡＴＴＧＧＴＣＣＧ ＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡ
２１５１ ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣ ＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴ ＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴ ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＡ ＴＴＣＡＴＴＴＴＣＣ
２２０１ ＴＧＡＡＧＡＧＧＣＧ ＧＡＴＡＡＧＡＴＡＴ ＴＡＧＧＴＧＧＣＡＧ ＴＴＴＧＡＴＡＣＣＡ ＣＣＡＧＡＡＡＧＡＧ
２２５１ ＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡ ＴＴＣＴＡＡＧＧＡＡ ＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡ ＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧ ＧＧＴＴＴＡＴＧＴＴ
２３０１ ＣＡＡＣＧＧＡＡＡＡ ＡＡＴＴＴＣＴＣＡＡ ＡＡＧＣＡＡＧＧＡＡ ＡＡＧＴＡＴＴ
（領域６（配列番号３３） トウモロコシ葉緑体またはｕｂｉＺＭ１（２）プロモーターの断片）
２３３８ ＧＴＧ ＧＣＴＡＴＴＴＡＴＣ
２３５１ ＴＡＴＣ
（ヌクレオチド２３５５〜２３５８（ＣＧＴ）は領域６を領域７ａに結合）
（領域７ａ（配列番号３４） ｐａｔ遺伝子の断片）
２３５８ ＧＣＡ ＧＣＴＧＡＴＡＴＧＧ ＣＣＧＣＧＧＴＴＴＧ ＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴ ＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡ
２４０１ ＴＴＧＡＧＡＣＧＴＣ ＴＡＣＡＧＴＧＡＡＣ ＴＴＴＡＧＧＡＣＡＧ ＡＧＣＣＡＣＡＡＡＣ ＡＣＣＡＣＡＡＧＡＧ
２４５１ ＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧ ＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧ ＧＴＴＧＣＡＡＧＡＴ ＡＧＡＴＡＣＣＣＴＴ ＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣ
２５０１ ＴＧＡＧＧＴＴＧＡＧ ＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧ ＣＴＧＧＴＡＴＴＧＣ ＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧ ＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧ
２５５１ ＣＴＡＧＧＡＡＣ
（領域７ｂ（配列番号３５） ｐａｔ遺伝子の断片（相補体））
２５５９ ＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＡＧ ＣＡＡＣＣＡＡＣＣＡ ＡＴＧＧＴＡＴＣＴＡ ＴＣＴＴＧＣＡＡＣＣ
２６０１ ＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣ ＡＴＣＡＡＴＣＣＡＣ ＴＣＴＴＧＴＧＧＴＧ ＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣ ＴＧＴＣＣＴＡＡＡＧ
２６５１ ＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧ ＡＣＧＴＣＴＣＡＡＴ ＧＴＡＡＴＧＧＴＴＡ ＡＣＧＡＴＡＴＣＡＣ ＡＡＡＣＣＧ
（領域７ｃ（配列番号３６） ｃｒｙ１遺伝子の断片（相補体））
２６９７ ＡＧＡＧ
２７０１ ＡＡＧＡＧＧＧＡＴＣ
（領域８（配列番号３７） ポリリンカーの断片）
２７１２ ＣＧＡＡＧＣＴＴＣ ＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣ ＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣ ＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧ
２７５１ ＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣ ＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣ ＧＧＴＣＧＴＧＣＣＣ ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＧ ＡＴＡＡＴＧＡＧＣＡ
２８０１ ＴＴＧＣＡＴＧＴＣＴ ＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡ ＡＡＡＴＴＡＣＣＡ
（領域９（配列番号２５） ＰＨＩ８９９９Ａの完全長挿入）
（実施例５．トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の挿入に対して５’側にある隣接配列の記述）
イベントＴＣ１５０７の５’隣接配列をさらに完全に説明するために、相同性検索を、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋの公的データベース（リリース１２２、２／０１）に対しておこなった。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性検索を実行し、未知の配列に対する相同性を同定する上で特に有用である。公的データベース検索に加えて、二つ一組の位置合わせをＡｌｉｇｎＸ（ＩｎｆｏｒＭａｘ Ｉｎｃ．， Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を用いて実行し、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の隣接配列とＰＨＩ８９９９Ａ遺伝子組換え挿入とのあいだの相同性について調べた。これらの相同性検索の結果を表１に示す。ＴＣ１５０７の５’隣接配列に、挿入に対して最も遠い５’側の塩基１と、完全長ＰＨＩ８９９９Ａ遺伝子組換え挿入の開始点の塩基２８３０とによって番号がつけられている（図１参照）。同一率の値は、分析した配列の長さにわたる完全な一致の割合を示す。
【００８８】
多くの場合、イベントＴＣ１５０７の５’隣接配列による類似性検索が、かなり高い同一率の値に基づいて１つの固有の配列との一致をもたらした。これらの配列は表１に同定されている。加えて、２つ以上の既知の配列よに対して高い類似性を持つＴＣ１５０７の５’ＤＮＡ隣接配列に２つの領域が存在する。領域８７０〜１６８１および２３３８〜２３５４では、単一の一致（ホモログ）が検出できない量配列断片による同一率の得点が十分に高い。これらの領域の各々についての２つの可能性のあるホモログを表１に示す。
【００８９】
非常に類似した配列が、配列の最初の６６９塩基対を除いて全てに関して同定された。一般に、類似性検索の結果は、塩基１６８１に対して５’側にあるトウモロコシゲノム配列との高い相同性を示している。塩基１６８２から２８３０位にあるＰＨＩ８９９９Ａの開始点に至る領域は、形質転換イベントに関連したいくつかのフラグメントを含む。
【００９０】
【表１−１】
【００９１】
【表１−２】
（実施例６：未修飾コントロールトウモロコシ系統内の領域１、２、および３の存在の確認）
トウモロコシＴＣ１５０７を精製する形質転換について用いられる未修飾コントロールトウモロコシ系統に、イベントＴＣ１５０７の５’隣接領域が領域１、２、および３（表１）が存在して、それによってトウモロコシゲノムＤＮＡによって境界が示されるかどうかを判断するために、ＰＣＲ分析を用いた。９通りの異なるＰＣＲ分析を、表３に示すプライマー配列を用いて表２に概説したように、 ＴＣ１５０７および未修飾コントロールトウモロコシＨｉ−ＩＩ系統からから調製したゲノムＤＮＡ上で実施した（Ｈｉ−ＩＩの情報については、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ （１９９４） Ｔｈｅ Ｍａｉｚｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、ｅｄ． Ｆｒｅｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｗａｌｂｏｔ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ． ６６３−６７１を参照せよ）。２つの反応が、２５ないし３２４ｂｐの５’隣接領域の領域１内のＤＮＡ（反応Ａ−３００ｂｐ単位複製配列）と２５ないし４８０ｂｐの５’隣接領域の領域１内のＤＮＡ（反応Ｂ−４５６ｂｐ単位複製配列）を増幅するように、設計された。予想される単位複製配列は、Ｈｉ−ＩＩ未修飾トウモロコシ系統およびトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の両方に存在した。１つのＰＣＲプライマー対、反応Ｃ、７５９ないし１１８２ｂｐの５’隣接領域（４２４ｐｂ単位複製配列）の領域２ないし領域３をスパン化し、Ｈｉ−ＩＩおよびＴＣ１５０７の両方で期待される大きさのＰＣＲ産物を再び生成した。反応Ｄ、４１５ないし１１８２ｂｐの５’隣接領域（７６８ｐｂ単位複製配列）の領域１ないし領域３をスパン化し、Ｈｉ−ＩＩおよびＴＣ１５０７の両方で期待される大きさのＰＣＲ産物を再び生成した。反応ＥおよびＦは、ＴＣ１５０７内のＰＨＩ８９９９Ａの完全長挿入のｐａｔ遺伝子領域に対する特異的プライマーとして設計されたことから、未収色Ｈｉ−ＩＩトウモロコシ系統の単位複製配列は期待されない。結果は、ＥおおびＦの反応が共に、ｐａｔ遺伝領域によって形質転換されたトウモロコシ形態に対して特異的であり、期待される単位複製配列を生成し、その一方で未修飾Ｈｉ−ＩＩトウモロコシ系統では単位複製配列が生成されなかった。反応Ｇもまた、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７で３６６ｂｐの単位複製配列を生成し得るプライマー対として設計され、未修飾コントロールトウモロコシ系統では単位複製配列の生成は見られなかった。
【００９２】
反応ＨおよびＩを、遺伝子組換え挿入を５’隣接領域にスパン化し得るＴＣ１５０７に対する特異的プライマー対として設計した。反応ＨおよびＩの両方で、逆方向プライマーが完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入（表１の領域９）のユビキチンプロモーター領域に配置され、順方向プライマーが領域５、ｒｐｏＣ２遺伝子フラグメントに配置された（表１を参照）。反応Ｈおよび反応Ｉの両方は、トウモロコシＴＣ１５０７系統内で単位複製配列を生成し、未修飾コントロールトウモロコシ系統では単位複製配列を生成しなかった。これらの結果は、反応ＨおよびＩの両方が、イベントＴＣ１５０７に対して特異的である。
【００９３】
ＰＣＲ結果は、未記載の配列（領域１）が未修飾トウモロコシ系統Ｈｉ−ＩＩに存在し、領域１、２、および３が未修飾トウモロコシ系統Ｈｉ−ＩＩに隣接している。反応Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤで増幅したＤＮＡ配列は、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の５’隣接領域に特有ではなく、また未処置トウモロコシ系統Ｈｉ−ＩＩにも存在している。
【００９４】
【表２−１】
【００９５】
【表２−２】
【００９６】
【表２−３】
【００９７】
【表３−１】
【００９８】
【表３−２】
（実施例７．トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の挿入遺伝子組換えＤＮＡに対して３’側の隣接配列）
トウモロコシのイベントＴＣ１５０７の完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入に対して３’側の配列情報の長さを伸ばすのに、２通りの異なるＰＣＲアプローチを用いた。第１のアプローチでは、ＰＣＲプライマー対を、完全長挿入と逆方向ＯＲＦ２５ターミネーターとのあいだの連結をスパン化した産物を増幅するように設計した。逆方向ＯＲＦ２５ターミネーターを示す図１を参照せよ。順方向プライマーを完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入の末端に配置させ、一連の逆方向プライマーを逆方向配列に１００ｂｐ間隔で配置させた。このようにして、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７に存在する逆方向断片の長さを、成功裏になされるＰＣＲ反応に基づいて１００ｂｐ領域内に定めることができた。この方法は、ＯＲＦ２５ターミネーターの大部分を含むがＣｒｙ１Ｆ配列は含まない逆方向断片を示した。この領域からＰＣＲ断片を単離してシークエンシングした。
【００９９】
第２のアプローチでは、ＰＣＲプライマーを、上記したＰＣＲ実験で決定されたように、逆方向ＯＲＦ２５ターミネーター領域から隣接ＤＮＡ配列に入るように設計した。２ないし３つの個々のイベントＴＣ１５０７の植物と未修飾コントロールトウモロコシ系統とから単離したゲノムＤＮＡを、種々の制限酵素を用いて消化し、その後、消化に用いた制限酵素に対して特異的なアダプターに結合させた（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ （登録商標） Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ． およびＤｅｖｏｎら（１９９５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：１６４４−１６４５）。一次ＰＣＲをＯＲＦ２５ターミネーター特異的プライマーと消化ＤＮＡに結合したアダプター配列に対して相同なプライマーとを用いて実施した。反応の特異性を増すために、ネスト化した二次ＰＣＲを別のＯＲ２５ターミネーター特異的プライマーと一次ＰＣＲで使用した各々のプライマーに対して内側である第２のプライマーによりアダプター配列に対して相同な第２のプライマーとを用いて再び実施した。ネスト化ＰＣＲによって生産される産物を、アガロース電気泳動によって分析し、ＴＣ１５０７ＤＮＡに特有な断片を単離してシークエンシングした。断片を、完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入の３’末端にある標的（逆方向）ＯＲＦ２５ターミネーターと完全長挿入内に含まれるＯＲＦ２５ターミネーターとの両方から、増幅した。完全長挿入由来の断片は、完全長挿入内に位置した既知の制限酵素部位に基づいた予測サイズであった。３’逆方向ＯＲＦ２５ターミネーターから作られた断片は、予想外のサイズの断片として現れた。３’逆方向ＯＲＦ２５ターミネーター由来の増幅断片の配列分析は、１０４３ｂｐの隣接ＤＮＡ配列をもたらした。上記一連のゲノムウオーキング実験から結果として得られる配列を、２３４６ｂｐの最終３’隣接配列を持つボーダリングトウモロコシゲノムに、挿入からさらに入れるための、さらなるプライマーの設計に用いた。
【０１００】
ＴＣ１５０７の３’隣接配列を記述するために、相同性検索を、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ公共データベースに対して実施した。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性検索を実行し、特に未知の配列に対する相同性を同定する上で有用である。公共データベースを検索することに加えて、ＳｅｑＭａｎ４．０５（登録商標）、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アラインメントアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）を用いて実行し、ＴＣ１５０７の３’隣接配列とＰＨＩ８９９９Ａ遺伝子組換え挿入とのあいだの相同性を調べた。これらの相同性検索の結果を表１に示す。同一率の値は、分析した配列の長さにわたる完全一致の割合を示す。３’隣接配列についての類似性検索の結果は、トウモロコシの葉緑体ＤＮＡ、ｐａｔ遺伝子の１８８ｂｐフラグメント、および有意な相同性のない２５４ｂｐのＤＮＡ（領域１５、表１）の３つの領域と高い相同性があることを示した。領域１５（表１）を超えた７４９ｂｐ（領域１６）についてもシークエンシングした。領域６について、類似した検索結果はなんら得られなかった。
【０１０１】
コントロールおよびＴＣ１５０７ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ分析は、２５４ｂｐ配列（領域１５、トウモロコシ葉緑体「ＯＲＦ２４１」のフラグメント）がトウモロコシゲノムに存在する。３’隣接領域内の領域１５のＤＮＡ配列は、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７に対して固有ではないが、未修飾コントロールトウモロコシ系統にも存在する。ＴＣ１５０７の３’隣接配列を実施例８に示すとともに、図１に図示する。
【０１０２】
（実施例８．完全長挿入の末端に対して３’側の領域の配列。各々の領域の説明は表１にある）
（領域１０（配列番号３８） ＯＲＦ２５ターミネーター（相補体）の断片）
９０１６ ＣＴＣＡＣ ＴＣＣＧＣＴＴＧＡＴ ＣＴＴＧＧＣＡＡＡＧ ＡＴＡＴＴＴＧＡＣＧ
９０５１ ＣＡＴＴＴＡＴＴＡＧ ＴＡＴＧＴＧＴＴＡＡ ＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧ ＣＡＧＴＧＣＡＧＴＡ ＴＴＴＴＣＴＡＴＴＣ
９１０１ ＧＡＴＣＴＴＴＡＴＧ ＴＡＡＴＴＣＧＴＴＡ ＣＡＡＴＴＡＡＴＡＡ ＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴ ＣＡＧＡＴＴＡＴＴＧ
９１５１ ＡＣＴＧＴＣＡＴＴＴ ＧＴＡＴＣＡＡＡＴＣ ＧＴＧＴＴＴＡＡＴＧ ＧＡＴＡＴＴＴＴＴＡ ＴＴＡＴＡＡＴＡＴＴ
９２０１ ＧＡＴＧＡＴＡＴＣＴ ＣＡＡＴＣＡＡＡＡＣ ＧＴＡＧＡＴＡＡＴＡ ＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡ ＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴ
９２５１ ＴＴＧＣＧＴＣＧＣＡ ＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴ ＣＴＡＴＡＴＧＡＧＡ ＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡ ＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴ
９３０１ ＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡ ＡＣＡＴＡＧＡＣＡＴ ＴＡＡＣＣＣＴＧＡＧ ＡＣＴＧＴＴＧＧＡＣ ＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴ
９３５１ ＡＧＡＴＴＣＣＴＴＣ ＡＴＧＣＡＴＡＧＣＡ ＣＣＴＣＡＴＴＣＴＴ ＧＧＧＧＡＣＡＡＡＡ ＧＣＡＣＧＧＴＴＴＧ
９４０１ ＧＣＣＧＴＴＣＣＡＴ ＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡ ＡＣＧＡＧＣＴＴＴＧ ＣＴＡＴＡＴＣＣＴＣ ＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣ
９４５１ ＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧ ＧＴＣＣＡＡＴＣＡＡ ＡＴＴＴＧＴＣＣＡＡ ＧＡＡＣＴＣＡＴＧＴ ＴＡＧＴＣＧＣＡＡＣ
９５０１ ＧＡＡＡＣＣＧＧＧＧ ＣＡＴＡＴＧＴＣＧＧ ＧＴＡＴＣＴＣＧＡＧ ＣＴＣＧＣＧＡＡＡＧ ＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡ
９５５１ ＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡ ＴＣＣＴＴ
（領域１１（配列番号３９）トウモロコシ葉緑体ｒｐｓ１２ｒＲＮＡ遺伝子の断片）
９５６６ ＣＡＡＣＡ ＡＡＡＧＧＧＴＡＣＣ ＴＧＴＡＣＣＣＧＡＡ ＡＣＣＧＡＣＡＣＡＧ
９６０１ ＧＴＧＧＧＴＡＧＧＴ ＡＧＡＧＡＡＴＡＣＣ ＴＡＧＧＧＧＣＧＣＧ ＡＧＡＣＡＡＣＴＣＴ ＣＴＣＴＡＡＧＧＡＡ
９６５１ ＣＴＣＧＧＣＡＡＡＡ ＴＡＧＣＣＣＣＧＴＡ ＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧ ＡＡＧＧＧＧＴＧＣＣ ＣＣＣ
（ヌクレオチド９６９４〜９６９５（ＣＧ）が領域１１と領域１２とを結合する）
（領域１２（配列番号４０） トウモロコシ葉緑体ゲノムの断片）
９６９６ ＣＴＡＡＣ
９７０１ ＡＡＴＡＡＡＣＧＡＡ ＴＡＣＧＧＴＴＴＡＴ ＧＴＡＴＧＧＡＴＴＣ ＣＧＧＴＡＡＡＡＴＡ ＣＣＧＧＴＡＣＴＣＧ
９７５１ ＡＴＴＴＣＡＴＡＡＧ ＡＧＴＣＧＡＡＴＡＧ ＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡ ＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴ ＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡ
９８０１ ＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡ ＧＴＡＴＣＣＴＡＡＡ ＴＴＡＴＡＣＴＡＡＴ ＣＣＡＣＧＴＡＴＧＡ ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＣ
９８５１ ＴＴＴＣＣＴＴＡＴＣ ＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴ ＡＧＴＧＣＡＡＡＡＡ ＡＡＡＴＴＣＴＡＴＡ ＣＴＧＣＡＣＴＧＣＴ
９９０１ ＣＴＣＴＴＴＴＴＡＣ ＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣ ＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡ ＡＡＧＴＧＡＡＧＴＡ ＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣ
９９５１ ＡＴＡＧＡＴＡＴＴＴ ＧＡＴＣＴＴＧＣＣＴ ＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣ ＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴ ＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡ
１０００１ ＡＴＴＴＣＣＡＴＧＡ ＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡ ＧＡＴＧＡＡＴＴＴＧ ＴＣＣＡＴＴＣＡＴＴ ＧＡＡＣＣＣＴＡＧＴ
１００５１ ＴＣＧＧＧＡＣＴＧＡ ＣＧＧＧＧＣＴＣＧＡ ＡＣＣＣＧＣＡＧＣＴ ＴＣＣＧＣＣＴ
（領域１３（配列番号４１）ｐａｔ遺伝子の断片（相補体））
１００８８ ＧＴＴ ＣＣＴＡＧＣＣＴＴＣ
１０１０１ ＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧ ＣＧＴＡＡＧＣＡＡＴ ＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡ ＧＣＡＣＣＣＴＣＡＡ ＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣ
１０１５１ ＣＡＡＣＣＡＡＧＧＧ ＴＡＴＣＴＡＴＣＴＴ ＧＣＡＡＣＣＴＣＴＣ ＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡ ＡＴＣＣＡＣＴＣＴＴ
１０２０１ ＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧ ＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣ ＣＴＡＡＡＧＴＴＣＡ ＣＴＧＴＡＧＡＣＧＴ ＣＴＣＡＡＴＧＴＡＡ
１０２５１ ＴＧＧＴＴＡＡＣＧＡ ＴＡＴＣＡＣＡＡＡＣ ＣＧＣＧＧ
（ヌクレオチド１０２７６〜１０２７７（ＡＡ）が領域１３と領域１４とを結合する）
（領域１４（配列番号４２）トウモロコシ葉緑体ＯＲＦ２４１（相補体）の断片）
１０２７８ ＣＡＣ ＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡ ＧＣＡＣＣＴＴＴＴＣ
１０３０１ ＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴ ＡＴＡＣＴＡＧＧＧＧ ＴＴＴＴＴＡＣＴＴＧ ＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡ ＴＧＴＴＣＣＡＴＡＣ
１０３５１ ＴＡＡＡＧＧＡＴ
（領域１５（配列番号４３）トウモロコシゲノム（有意な相同性なし））
１０３５９ ＡＧ ＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣ ＣＧＣＣＡＣＣＧＴＣ ＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴ ＴＣＣＧＧＧＧＡＧＣ
１０４０１ ＣＡＧＡＣＣＧＧＴＣ ＧＡＡＣＣＧＴＧＣＣ ＴＣＣＡＣＴＴＧＣＴ ＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧ ＧＧＡＡＡＡＴＣＡＧ
１０４５１ ＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡ ＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧ ＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣ ＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣ ＴＡＡＧＡＴＡＣＴＴ
１０５０１ ＡＣＴＣＧＣＴＣＣＧ ＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣ ＡＡＴＣＡＴＧＣＣＴ ＧＴＧＧＧＧＡＧＧＴ ＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣ
１０５５１ ＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧ ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣ ＣＧＡＧＧＴＣＴＧＣ ＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧ ＧＣＴＴＣＧＧＴＡＣ
１０６０１ ＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣ ＴＴ
（領域１６（配列番号４４）トウモロコシゲノム）
１０６１３ ＧＧＧＣＧＣＣＣ ＧＡＧＧＣＡＣＣＣＧ ＧＧＧＧＡＴＧＧＡＣ ＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧ
１０６５１ ＣＡＧＣＣＡＣＧＡＣ ＧＡＣＣＣＡＡＧＧＡ ＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴ ＧＣＧＣＡＧＴＣＧＧ ＣＡＣＧＡＧＣＡＡＴ
１０７０１ ＡＧＴＴＣＴＣＧＧＧ ＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧ ＣＴＴＧＧＣＣＴＧＡ ＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧ ＴＣＡＣＣＴＣＡＡＣ
１０７５１ ＴＡＣＣＴＣＧＧＣＣ ＧＡＧＧＧＧＴＣＡＡ ＧＴＡＣＣＣＣＣＴＣ ＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣ ＣＧＣＴＣＴＴＣＧＧ
１０８０１ ＡＣＣＧＧＧＡＣＣＣ ＣＧＡＣＧＴＣＣＣＧ ＧＣＣＣＣＧＧＡＴＡ ＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣ ＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣ
１０８５１ ＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣ ＴＴＧＡＣＧＡＣＣＣ ＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣ ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧ ＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣ
１０９０１ ＧＡＧＧＣＡＧＧＣＧ ＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴ ＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣ ＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡ ＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴ
１０９５１ ＣＧＴＣＡＴＣＡＧＧ ＣＧＴＣＴＣＣＧＧＣ ＧＡＣＧＧＣＴＣＣＣ ＴＴＧＧＧＡＧＣＣＣ ＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣ
１１００１ ＴＧＣＣＧＡＣＧＡＣ ＧＡＡＧＣＣＴＴＴＣ ＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣ ＣＧＡＧＣＣＣＡＣＧ ＴＣＣＧＣＴＣＧＴＧ
１１０５１ ＧＧＣＣＣＧＡＧＣＣ ＴＴＣＴＴＴＧＣＧＴ ＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣ ＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣ ＴＣＣＧＣＧＧＴＧＡ
１１１０１ ＣＣＣＴＣＣＧＣＧＣ ＡＧＣＴＣＧＧＴＣＣ ＡＣＣＧＣＡＴＣＣＴ ＣＣＧＧＧＡＣＴＧＧ ＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡ
１１１５１ ＧＧＣＴＴＧＴＧＡＴ ＧＣＣＣＴＡＣＣＴＣ ＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧ ＡＣＧＡＡＡＡＧＴＣ ＴＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
１１２０１ ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＧ ＣＡＡＴＣＴＧＡＣＧ ＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡ ＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧ ＡＴＡＣＴＣＡＣＣＡ
１１２５１ ＧＡＧＡＣＡＣＧＣＡ ＣＣＣＧＣＧＡＴＣＧ ＧＧＡＣＧＣＡＴＴＡ ＡＧＧＧＣＴＧＧＧＡ ＡＡＡＡＧＴＧＣＣＧ
１１３０１ ＧＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴ ＧＣＣＧＴＣＣＡＣＣ ＣＡＣＣＴＧＴＧＧＡ ＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴ
１１３５１ ＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡ Ａ
（実施例９．未修飾コントロールトウモロコシ系統の領域１５の存在の確認）
３’隣接領域の末端上の未記載の領域（表１の領域１５）が、トウモロコシのイベントＴＣ１５０７を生成するために形質転換で用いられる未修飾コントロールトウモロコシ系統 に存在せず、それによってコーンゲノムＤＮＡとの境界が示されるかどうかを決定するために、ＰＣＲ分析が用いられる。トウモロコシＴＣ１５０７系統と未修飾Ｈｉ−ＨＨコントロールトウモロコシ系統との両方における領域１５の成功裏になされるＰＣＲ増幅によって、領域１５が実際にトウモロコシゲノムＤＮＡに存在することが明らかになった。５通りの異なるＰＣＲ分析を、表８に示すプライマー配列を用いて、トウモロコシＴＣ１５０７系統と未修飾Ｈｉ−ＨＨコントロールトウモロコシ系統とから調製したゲノムＤＮＡ上で、以下の表７に概説したように、実施した。３’隣接領域の領域１５内でのＤＮＡ増幅をおこなうために、３通りの反応を設計した。すなわち、反応Ｌ−１７５ｂｐ単位複製配列を生産、反応Ｍ−１３４ｂｐ単位複製配列を生産、さらに反応Ｎ−１０７ｂｐ単位複製配列を生産。予想される単位複製配列は、未修飾コントロールトウモロコシ系統とトウモロコシＴＣ１５０７系統とのなかに存在した。反応ＪおよびＫを、挿入の末端を３’隣接領域にスパン化し得るＴＣ１５０７に対して特異的プライマーとして設計した。反応Ｊでは、順方向プライマーを、完全長ＰＨＩ８９９９Ａ挿入（表１の領域１３）の３’末端上のｐａｔ遺伝子フラグメントに配置し、逆方向プライマーを未定義の領域１５に配置した。反応Ｋでは、順方向プライマーを、完全長挿入の３’末端上の葉緑体仮説タンパク質遺伝子に配置した（表１の領域１４）。また、逆方向プライマーを未定義の領域１５に配置した。反応Ｊおよび反応Ｋの両方とも、トウモロコシ系統ＴＣ１５０７を生産したが、未修飾コントロールトウモロコシ系統では単位複製配列が生産されなかった。このような結果は、反応ＪおよびＫがイベントＴＣ１５０７に対して特異的である。
【０１０３】
ＰＣＲは、ＴＣ１５０７の３’隣接配列の未記載の配列（領域１５）もまた、未修飾Ｈｉ−ＩＩコントロールトウモロコシ系統由来の単離ＤＮＡである。反応Ｌ、Ｍ、およびＮで増幅したＤＮＡ配列は、ＴＣ１５０７の３’隣接領域に対して固有ではないが、未修飾コントロールトウモロコシ系統にも存在する。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
【表５−１】
【０１０６】
【表５−２】
（実施例１０．ＰＣＲプライマー）
ＤＮＡイベント特異的プライマー対を用いて、ＴＣ１５０７に特徴的な単位複製配列を生成した。これらのイベントプライマー対として、限定されるものではないが、配列番号１および配列番号２、配列番号２および配列番号２３、配列番号３および配列番号５、ならびに配列番号４および配列番号５が挙げられる。これらのプライマー対に加えて、ＤＮＡ増幅反応で使用した場合にＴＣ１５０７に対して特異的なＤＮＡ単位複製配列を作る配列番号２６および配列番号２７に由来する任意のプライマー対は、本発明の一局面である。この分析の条件を表９に示すが、ＴＣ１５０７に特徴的な増幅ＤＮＡ分子を生産するためのＤＮＡプライマーまたはその相補体を用いたこれらの方法の任意の修飾は、当技術分野の通常技量の範囲内である。配列番号１、２、および２３によって同定されるＰＣＲプライマーを利用した反応のための好ましい増幅条件を表１０に示す。また、内因性のトウモロコシ遺伝子の増幅のために、コントロールプライマー対（配列番号１０および１１、配列番号１０および１２、配列番号１３および１４、配列番号１４および１５、配列番号５および１６、配列番号５および１７、ならびに配列番号５および１８を含む）を反応条件の内部基準として包含する。さらに含まれるものは、ｐａｔ遺伝子を含む遺伝子組換えイベントで単位複製配列を生産するプライマー対（配列番号６および７、配列番号８および９）とｃｒｙ１Ｆ遺伝子を含む遺伝子組換えイベントで単位複製配列を生産するプライマー対（配列番号１９および２０）とである。
【０１０７】
ＴＣ１５０７イベントの存在について試験するための植物組織ＤＮＡ抽出物の分析は、陽性の組織ＤＮＡ抽出物コントロール（遺伝子組換え配列を含むことが知られているＤＮＡサンプル）を含むべきである。陽性コントロールの成功裏になされる増幅では、標的配列の増幅を可能とする条件下でＰＣＲが実行される。負の、または野生型のＤＮＡ抽出物コントロールでは、提供されたテンプレートＤＮＡが非遺伝子組換え植物から調製されたゲノムＤＮＡもしくは非ＴＣ１５０７遺伝子組換え植物のいずれかであり、これもまた含まれるべきである。さらに、テンプレートトウモロコシＤＮＡ抽出物を含まない負のコントロールは、ＰＣＲプロトコルで使用する試薬および条件の有用な基準である。
【０１０８】
十分な長さのさらなるＤＮＡプライマー分子は、ＤＮＡ増幅法の当業者によって、配列番号２６および配列番号２７から選択することができ、また表９または表１０に示される方法とは異なると思われるが、イベントＴＣ１５０７に特徴的な単位複製配列を生ずる単位複製配列の生産にとって最適化された条件を選択することができる。表９および表１０に示し方法に対する修飾を伴うこれらのＤＮＡプライマー配列の利用は、本発明の範囲内である。ＴＣ１５０７にとって特徴的な配列番号２６および２７に由来する十分な長さの分子の少なくとも１つのＤＮＡプライマー分子は、本発明の一局面である。ＴＣ１５０７単位複製配列のアッセイは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、ＭＪ Ｅｎｇｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９７００、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを用いて実施することができ、あるいは当業者に公知の方法および装置によって実施することができる。
【０１０９】
【表６−１】
【０１１０】
【表６−２】
【０１１１】
【表７】
本発明の原理を例示および説明したが、本発明がそのような原理から逸脱することなく構成および詳細を改変することができることは当業者に容易に理解されなければならない。我々は、添付の請求の精神および範囲内である全ての修飾の権利を主張する。
【０１１２】
この明細書で引用した全ての刊行物および公開された特許文献は、各々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に参照によって取り込まれることが示されるのと同程度に、本明細書で援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、遺伝子組換え挿入ＰＨＩ８９９９Ａとともに、その遺伝子組換え挿入を隣接する配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２１として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２２として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項３】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２４として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２６として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項５】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２７として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項６】
ＴＣ１５０７特異的領域を検出する生物学的サンプル内のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットであって、該キットは、少なくとも第１のプライマーを備え、該第１のプライマーが配列番号２１内の配列または配列番号２２内の配列を認識する、キット。
【請求項７】
配列番号２５内の配列を認識する少なくとも第２のプライマーを、さらに備える、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
配列番号２２内の配列を認識する少なくとも第２のプライマーを、さらに含む、請求項６に記載のキット。
【請求項９】
前記第１のプライマーが配列番号２１内の配列を認識する、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
前記第１のプライマーが配列番号２２内の配列を認識する、請求項６に記載のキット。
【請求項１１】
前記少なくとも第１および第２のプライマーがそれぞれ配列番号１の配列および配列番号２の配列を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１２】
前記少なくとも第１および第２のプライマーがそれぞれ配列番号２の配列および配列番号２３の配列を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１３】
前記少なくとも第１および第２のプライマーがそれぞれ配列番号３の配列および配列番号５の配列を含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１４】
前記少なくとも第１および第２のプライマーがそれぞれ配列番号４の配列および配列番号５の配列を含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１５】
トウモロコシのイベントＴＣ１５０７およびその子孫のジャンクションＤＮＡに対して特異的なＤＮＡ検出キットであって、配列番号２６に対して相同的または相補的であるＤＮＡ検出法で機能するのに十分な長さの隣接ＤＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を備える、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１６】
トウモロコシのイベントＴＣ１５０７およびその子孫のジャンクションＤＮＡに対して特異的なＤＮＡ検出キットであって、配列番号２７に対して相同的または相補的であるＤＮＡ検出法で機能するのに十分な長さの隣接ＤＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を備える、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１７】
生物学的サンプル内のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットであって、それと隣接する配列番号２１および配列２５とハイブリダイズする配列を含む特異的プローブを備える、キット。
【請求項１８】
生物学的サンプル内のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットであって、それと隣接する配列番号２２および配列２５とハイブリダイズする配列を含む特異的プローブを備える、キット。
【請求項１９】
ＤＮＡ検出キットであって、該キットは、以下：トウモロコシのイベントＴＣ１５０７およびその子孫に対して特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能する配列番号２６または配列番号２７に対して相同または相補的な十分な長さの隣接ヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を備える、ＤＮＡ検出キット。
【請求項２０】
ＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡ構築物は、以下：第１の発現カセットおよび第２の発現カセットを含み、作用可能な連結で該第１の発現カセットが、
（ａ）トウモロコシユビキチンプロモーター；
（ｂ）トウモロコシユビキチン遺伝子の５’非翻訳エキソンと；
（ｃ）トウモロコシユビキチンイントロン；
（ｄ）Ｃｒｙ１ＦコードＤＮＡ分子；および
（ｅ）３’ＯＲＦ２５転写終結因子を含み、作用可能な連結で該第２の発現カセットが、
（ｉ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；
（ｉｉ）ｐａｔコードＤＮＡ分子；および
（ｉｉｉ）（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’転写終結因子を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＤＮＡ構築物を含む、植物。
【請求項２２】
前記植物がトウモロコシ植物である、請求項２１の植物。
【請求項２３】
生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７を同定するための方法であって、該方法は、配列番号２１および配列番号２２内の配列を特異的に認識するプローブまたは第１のプライマーを用いてＴＣ１５０７特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
少なくとも２種類のプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応を使用して前記生物学的サンプル中に存在する核酸からＤＮＡフラグメントを増幅する工程をさらに包含し、前記第１のプライマーが配列番号２１または配列番号２２内の配列を認識し、そして第２のプライマーが配列番号２２または配列番号２５内の配列を認識する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のプライマーが配列番号２１内の配列を認識し、前記第２のプライマーが配列番号２５内の配列を認識する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のプライマーが配列番号２２内の配列を認識し、前記第２のプライマーが配列番号２２内の配列を認識する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーがそれぞれ、配列番号２の配列および配列番号１の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーがそれぞれ、配列番号２の配列および配列番号２３の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーがそれぞれ、配列番号３の配列および配列番号５の配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーがそれぞれ、配列番号４の配列および配列番号５の配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ＴＣ１５０７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約９１２ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＣ１５０７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約８４４ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＣ１５０７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約３４２ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ＴＣ１５０７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約２５２ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）ＤＮＡプライマー分子である配列番号１および配列番号２を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を実行して、それによってＤＮＡ単位複製配列分子を生成する工程；および
（ｅ）該ＤＮＡ単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該ＤＮＡ増幅反応での該ＤＮＡ単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）ＤＮＡプライマー分子である配列番号２および配列番号２３を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を実行して、それによってＤＮＡ単位複製配列分子を生成する工程；および
（ｅ）該ＤＮＡ単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該ＤＮＡ増幅反応での該ＤＮＡ単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）ＤＮＡプライマー分子である配列番号３および配列番号５を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を実行して、それによってＤＮＡ単位複製配列分子を生成する工程；および
（ｅ）該ＤＮＡ単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該ＤＮＡ増幅反応での該ＤＮＡ単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）ＤＮＡプライマー分子である配列番号４および配列番号５を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を実行して、それによってＤＮＡ単位複製配列分子を生成する工程；および
（ｅ）該ＤＮＡ単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該ＤＮＡ増幅反応での該ＤＮＡ単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離ＤＮＡ。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４１】
請求項３７に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４２】
請求項３８に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４３】
サンプル中のＴＣ１５０７イベントに対応するＤＮＡの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．トウモロコシＤＮＡを含むサンプルと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でトウモロコシのイベントＴＣ１５０７に由来するＤＮＡとハイブリダイズし、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＴＣ１５０７でないトウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；
ｂ．該サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；ならびに
ｃ．該ＤＮＡに対する該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションの検出が該ＴＣ１５０７イベントの存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
配列番号１、２、３、４、５、２３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群よりなる群より選択される配列またはその相補体を含む、単離ＤＮＡヌクレオチドプライマー配列。
【請求項４５】
配列番号１、２、３、４、５、および２３からなる群より選択される配列またはその相補体を含む、請求項４４に記載の単離ＤＮＡヌクレオチドプライマー。
【請求項４６】
一対のＤＮＡ分子であって、該一対のＤＮＡ分子は、以下：第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子とを含み、ここで、該ＤＮＡ分子が、ＴＣ１５０７トウモロコシ植物またはその子孫から抽出されたＤＮＡにとって特徴的であるＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するために十分な長さの、配列番号２６の隣接ヌクレオチドまたはその相補体である、一対のＤＮＡ分子。
【請求項４７】
一対のＤＮＡ分子であって、該一対のＤＮＡ分子は、以下：第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子とを含み、ここで、該ＤＮＡ分子が、ＴＣ１５０７トウモロコシ植物またはその子孫から抽出されたＤＮＡにとって特徴的であるＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するために十分な長さの、配列番号２７の隣接ヌクレオチドまたはその相補体である、一対のＤＮＡ分子。
【請求項４８】
配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群より選択される配列またはその相補体を含むジャンクション配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４９】
種子サンプル中で、配列番号２１または配列番号２２内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いて、ＴＣ１５０７特異的領域を検出する工程を包含する、種子純度を確認するための方法。
【請求項５０】
イベントＴＣ１５０７の存在について種子をスクリーニングする方法であって、１つの種子ロットのサンプル中で、配列番号２１または配列番号２２内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いて、ＴＣ１５０７特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
【請求項５１】
害虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部分であって、ここで、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそのそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するＤＮＡが、該植物のゲノムの一部分を形成する、害虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部分。
【請求項５２】
請求項５１に記載の害虫抵抗性トウモロコシ植物の後代植物であって、ここで、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するＤＮＡが、該植物のゲノムの一部分を形成する、後代植物。
【請求項５３】
請求項５１または５２に記載の植物の種子。
【請求項５４】
害虫抵抗性トウモロコシ植物を生産するための方法であって、該方法は、請求項５１または５２に記載の植物を用いて育種する工程、ならびに配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列について分析することによって子孫を選択する工程、を包含する方法。
【請求項５５】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡならびにそれらの相補体からなる群より選択される配列を含む、単離ＤＮＡ配列。
【請求項５６】
一対の単離ＤＮＡ配列であって、その各々が、少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、かつＤＮＡ増幅手順で一緒に使用される場合、イベントＴＣ１５０７にとって特徴的な単位複製配列を生産する、一対の単離ＤＮＡ配列。
【請求項５７】
各々が配列番号２６から選択される、請求項５６に記載の一対の単離ＤＮＡ配列。
【請求項５８】
各々が配列番号２７から選択される、請求項５６に記載の一対の単離ＤＮＡ配列。
【請求項５９】
トウモロコシ組織へのＴＣ１５０７イベント挿入の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）プライマー対の各メンバーが、該ＴＣ１５０７イベント挿入にとって特徴的な配列の反対側にある、配列番号２６または配列番号２７由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを、各々、含むプライマー対を選択する工程；
（ｂ）該トウモロコシ組織のサンプルと該プライマー対とを接触させる工程；および
（ｃ）ＤＮＡ増幅を実行し、そして単位複製配列について分析する工程、
を包含する、方法。
【請求項６０】
前記プライマー対が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
トウモロコシ組織へのイベントＴＣ１５０７挿入の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で該トウモロコシ組織のサンプルと、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される１つ以上のＤＮＡ配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；
（ｂ）該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；ならびに
（ｃ）該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程、
包含する、方法。
【請求項６２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される１つ以上のＤＮＡ配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを備える、ＤＮＡ検出キット。
【請求項６３】
ＤＮＡ検出キットであって、該ＤＮＡ検出キットは、プライマー対を備え、該プライマーは、配列番号２６および配列番号２７由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを各々含み、ここで、各々が、ＴＣ１５０７イベント挿入にとって特徴的な配列の反対側にある、ＤＮＡ検出キット。
【請求項６４】
前記プライマー対が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される、請求項６１に記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項６５】
生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットであって、配列番号２４内のＴＣ１５０７特異的領域を検出する、キット。
【請求項６６】
生物学的サンプル中のＴＣ１５０７を同定するための方法であって、配列番号２４内のＴＣ１５０７特異的領域を検出する、方法。
【請求項１】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２１として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２２として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項３】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２４として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２６として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項５】
単離ＤＮＡ分子であって、配列番号２７として同定されたヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項６】
ＴＣ１５０７特異的領域を検出する生物学的サンプル内のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットであって、該キットは、少なくとも第１のプライマーを備え、該第１のプライマーが配列番号２１内の配列または配列番号２２内の配列を認識する、キット。
【請求項７】
配列番号２５内の配列を認識する少なくとも第２のプライマーを、さらに備える、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
配列番号２２内の配列を認識する少なくとも第２のプライマーを、さらに含む、請求項６に記載のキット。
【請求項９】
前記第１のプライマーが配列番号２１内の配列を認識する、請求項６に記載のキット。
【請求項１０】
前記第１のプライマーが配列番号２２内の配列を認識する、請求項６に記載のキット。
【請求項１１】
前記少なくとも第１および第２のプライマーがそれぞれ配列番号１の配列および配列番号２の配列を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１２】
前記少なくとも第１および第２のプライマーがそれぞれ配列番号２の配列および配列番号２３の配列を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項１３】
前記少なくとも第１および第２のプライマーがそれぞれ配列番号３の配列および配列番号５の配列を含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１４】
前記少なくとも第１および第２のプライマーがそれぞれ配列番号４の配列および配列番号５の配列を含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１５】
トウモロコシのイベントＴＣ１５０７およびその子孫のジャンクションＤＮＡに対して特異的なＤＮＡ検出キットであって、配列番号２６に対して相同的または相補的であるＤＮＡ検出法で機能するのに十分な長さの隣接ＤＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を備える、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１６】
トウモロコシのイベントＴＣ１５０７およびその子孫のジャンクションＤＮＡに対して特異的なＤＮＡ検出キットであって、配列番号２７に対して相同的または相補的であるＤＮＡ検出法で機能するのに十分な長さの隣接ＤＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を備える、ＤＮＡ検出キット。
【請求項１７】
生物学的サンプル内のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットであって、それと隣接する配列番号２１および配列２５とハイブリダイズする配列を含む特異的プローブを備える、キット。
【請求項１８】
生物学的サンプル内のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットであって、それと隣接する配列番号２２および配列２５とハイブリダイズする配列を含む特異的プローブを備える、キット。
【請求項１９】
ＤＮＡ検出キットであって、該キットは、以下：トウモロコシのイベントＴＣ１５０７およびその子孫に対して特異的なＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能する配列番号２６または配列番号２７に対して相同または相補的な十分な長さの隣接ヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を備える、ＤＮＡ検出キット。
【請求項２０】
ＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡ構築物は、以下：第１の発現カセットおよび第２の発現カセットを含み、作用可能な連結で該第１の発現カセットが、
（ａ）トウモロコシユビキチンプロモーター；
（ｂ）トウモロコシユビキチン遺伝子の５’非翻訳エキソンと；
（ｃ）トウモロコシユビキチンイントロン；
（ｄ）Ｃｒｙ１ＦコードＤＮＡ分子；および
（ｅ）３’ＯＲＦ２５転写終結因子を含み、作用可能な連結で該第２の発現カセットが、
（ｉ）ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；
（ｉｉ）ｐａｔコードＤＮＡ分子；および
（ｉｉｉ）（ＣａＭＶ）３５Ｓ由来の３’転写終結因子を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
請求項２０に記載のＤＮＡ構築物を含む、植物。
【請求項２２】
前記植物がトウモロコシ植物である、請求項２１の植物。
【請求項２３】
生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７を同定するための方法であって、該方法は、配列番号２１および配列番号２２内の配列を特異的に認識するプローブまたは第１のプライマーを用いてＴＣ１５０７特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
少なくとも２種類のプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応を使用して前記生物学的サンプル中に存在する核酸からＤＮＡフラグメントを増幅する工程をさらに包含し、前記第１のプライマーが配列番号２１または配列番号２２内の配列を認識し、そして第２のプライマーが配列番号２２または配列番号２５内の配列を認識する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のプライマーが配列番号２１内の配列を認識し、前記第２のプライマーが配列番号２５内の配列を認識する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のプライマーが配列番号２２内の配列を認識し、前記第２のプライマーが配列番号２２内の配列を認識する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーがそれぞれ、配列番号２の配列および配列番号１の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーがそれぞれ、配列番号２の配列および配列番号２３の配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーがそれぞれ、配列番号３の配列および配列番号５の配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーがそれぞれ、配列番号４の配列および配列番号５の配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ＴＣ１５０７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約９１２ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＣ１５０７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約８４４ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＣ１５０７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約３４２ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ＴＣ１５０７ ＰＣＲ同定プロトコルを用いて、約２５２ｂｐのフラグメントを増幅する工程を包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）ＤＮＡプライマー分子である配列番号１および配列番号２を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を実行して、それによってＤＮＡ単位複製配列分子を生成する工程；および
（ｅ）該ＤＮＡ単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該ＤＮＡ増幅反応での該ＤＮＡ単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）ＤＮＡプライマー分子である配列番号２および配列番号２３を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を実行して、それによってＤＮＡ単位複製配列分子を生成する工程；および
（ｅ）該ＤＮＡ単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該ＤＮＡ増幅反応での該ＤＮＡ単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）ＤＮＡプライマー分子である配列番号３および配列番号５を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を実行して、それによってＤＮＡ単位複製配列分子を生成する工程；および
（ｅ）該ＤＮＡ単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該ＤＮＡ増幅反応での該ＤＮＡ単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
生物学的サンプル中のトウモロコシのイベントＴＣ１５０７またはその子孫の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該生物学的サンプルからＤＮＡサンプルを抽出する工程；
（ｂ）ＤＮＡプライマー分子である配列番号４および配列番号５を提供する工程；
（ｃ）ＤＮＡ増幅反応条件を提供する工程；
（ｄ）該ＤＮＡ増幅反応を実行して、それによってＤＮＡ単位複製配列分子を生成する工程；および
（ｅ）該ＤＮＡ単位複製配列分子を検出する工程であって、ここで、該ＤＮＡ増幅反応での該ＤＮＡ単位複製配列分子の検出がトウモロコシのイベントＴＣ１５０７の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３５に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離ＤＮＡ。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４１】
請求項３７に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４２】
請求項３８に記載の方法によって生産された単位複製配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４３】
サンプル中のＴＣ１５０７イベントに対応するＤＮＡの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．トウモロコシＤＮＡを含むサンプルと、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でトウモロコシのイベントＴＣ１５０７に由来するＤＮＡとハイブリダイズし、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＴＣ１５０７でないトウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；
ｂ．該サンプルおよびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；ならびに
ｃ．該ＤＮＡに対する該プローブのハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、ハイブリダイゼーションの検出が該ＴＣ１５０７イベントの存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
配列番号１、２、３、４、５、２３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群よりなる群より選択される配列またはその相補体を含む、単離ＤＮＡヌクレオチドプライマー配列。
【請求項４５】
配列番号１、２、３、４、５、および２３からなる群より選択される配列またはその相補体を含む、請求項４４に記載の単離ＤＮＡヌクレオチドプライマー。
【請求項４６】
一対のＤＮＡ分子であって、該一対のＤＮＡ分子は、以下：第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子とを含み、ここで、該ＤＮＡ分子が、ＴＣ１５０７トウモロコシ植物またはその子孫から抽出されたＤＮＡにとって特徴的であるＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するために十分な長さの、配列番号２６の隣接ヌクレオチドまたはその相補体である、一対のＤＮＡ分子。
【請求項４７】
一対のＤＮＡ分子であって、該一対のＤＮＡ分子は、以下：第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子とを含み、ここで、該ＤＮＡ分子が、ＴＣ１５０７トウモロコシ植物またはその子孫から抽出されたＤＮＡにとって特徴的であるＤＮＡプライマーまたはプローブとして機能するために十分な長さの、配列番号２７の隣接ヌクレオチドまたはその相補体である、一対のＤＮＡ分子。
【請求項４８】
配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群より選択される配列またはその相補体を含むジャンクション配列を含む、単離ＤＮＡ分子。
【請求項４９】
種子サンプル中で、配列番号２１または配列番号２２内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いて、ＴＣ１５０７特異的領域を検出する工程を包含する、種子純度を確認するための方法。
【請求項５０】
イベントＴＣ１５０７の存在について種子をスクリーニングする方法であって、１つの種子ロットのサンプル中で、配列番号２１または配列番号２２内の配列を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いて、ＴＣ１５０７特異的領域を検出する工程を包含する、方法。
【請求項５１】
害虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部分であって、ここで、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそのそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するＤＮＡが、該植物のゲノムの一部分を形成する、害虫抵抗性トウモロコシ植物、またはその一部分。
【請求項５２】
請求項５１に記載の害虫抵抗性トウモロコシ植物の後代植物であって、ここで、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するＤＮＡが、該植物のゲノムの一部分を形成する、後代植物。
【請求項５３】
請求項５１または５２に記載の植物の種子。
【請求項５４】
害虫抵抗性トウモロコシ植物を生産するための方法であって、該方法は、請求項５１または５２に記載の植物を用いて育種する工程、ならびに配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列について分析することによって子孫を選択する工程、を包含する方法。
【請求項５５】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７からなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡならびにそれらの相補体からなる群より選択される配列を含む、単離ＤＮＡ配列。
【請求項５６】
一対の単離ＤＮＡ配列であって、その各々が、少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、かつＤＮＡ増幅手順で一緒に使用される場合、イベントＴＣ１５０７にとって特徴的な単位複製配列を生産する、一対の単離ＤＮＡ配列。
【請求項５７】
各々が配列番号２６から選択される、請求項５６に記載の一対の単離ＤＮＡ配列。
【請求項５８】
各々が配列番号２７から選択される、請求項５６に記載の一対の単離ＤＮＡ配列。
【請求項５９】
トウモロコシ組織へのＴＣ１５０７イベント挿入の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）プライマー対の各メンバーが、該ＴＣ１５０７イベント挿入にとって特徴的な配列の反対側にある、配列番号２６または配列番号２７由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを、各々、含むプライマー対を選択する工程；
（ｂ）該トウモロコシ組織のサンプルと該プライマー対とを接触させる工程；および
（ｃ）ＤＮＡ増幅を実行し、そして単位複製配列について分析する工程、
を包含する、方法。
【請求項６０】
前記プライマー対が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
トウモロコシ組織へのイベントＴＣ１５０７挿入の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で該トウモロコシ組織のサンプルと、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される１つ以上のＤＮＡ配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブとを接触させる工程；
（ｂ）該サンプルおよびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；ならびに
（ｃ）該プローブのハイブリダイゼーションについて分析する工程、
包含する、方法。
【請求項６２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される１つ以上のＤＮＡ配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを備える、ＤＮＡ検出キット。
【請求項６３】
ＤＮＡ検出キットであって、該ＤＮＡ検出キットは、プライマー対を備え、該プライマーは、配列番号２６および配列番号２７由来の少なくとも１０個のヌクレオチドを各々含み、ここで、各々が、ＴＣ１５０７イベント挿入にとって特徴的な配列の反対側にある、ＤＮＡ検出キット。
【請求項６４】
前記プライマー対が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７ならびにそれらの相補体からなる群より選択される、請求項６１に記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項６５】
生物学的サンプル中のイベントＴＣ１５０７を同定するためのキットであって、配列番号２４内のＴＣ１５０７特異的領域を検出する、キット。
【請求項６６】
生物学的サンプル中のＴＣ１５０７を同定するための方法であって、配列番号２４内のＴＣ１５０７特異的領域を検出する、方法。
【図１】
【公表番号】特表２００６−５２５０２８（Ｐ２００６−５２５０２８Ａ）
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１４２０１（Ｐ２００６−５１４２０１）
【出願日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９４４７
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（３９８０５２９４４）ダウ・アグロサイエンシーズ・エルエルシー (3)
【出願人】（５０５４００１１８）イー．アイ． デュ ポン デ ヌムール アンド カンパニー (8)
【出願人】（５００３２２１９２）パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１３５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９４４７
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（３９８０５２９４４）ダウ・アグロサイエンシーズ・エルエルシー (3)
【出願人】（５０５４００１１８）イー．アイ． デュ ポン デ ヌムール アンド カンパニー (8)
【出願人】（５００３２２１９２）パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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