トキシン−アンチトキシン複合体の形成を指標とする抗生物質のスクリーニング方法
【課題】 細菌の中毒モジュールを構成する多くのトキシン−アンチトキシン複合体の立体構造は未だ明らかでないため、アンチトキシンがどのようにしてトキシンの毒性を抑制しているのか不明である。
【解決手段】 細菌のトキシン及びアンチトキシンタンパク質と、候補化合物とを接触させて、トキシン−アンチトキシン複合体が形成されるか否かを検出する。前記複合体の形成を阻害する候補化合物は、前記細菌の増殖阻害剤であることが示唆される。
【解決手段】 細菌のトキシン及びアンチトキシンタンパク質と、候補化合物とを接触させて、トキシン−アンチトキシン複合体が形成されるか否かを検出する。前記複合体の形成を阻害する候補化合物は、前記細菌の増殖阻害剤であることが示唆される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の細胞死に関与する因子を用いる抗生物質のスクリーニング方法に関し、より詳細には、トキシン及びアンチトキシン複合体の形成を指標とする抗生物質のスクリーニング方法及びこれに用いるポリペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
真正細菌及び古細菌は、トキシン−アンチトキシンタンパク質の対をコードする遺伝的因子を有し、これは中毒モジュール(addiction module)として知られている。当初は、低コピープラスミドの維持システムのように、プラスミドの脱落に伴う細胞死をコントロールするものとして提唱された。この機構は、１つのオペロンにコードされている不安定なアンチトキシンタンパク質と、安定なトキシンタンパク質に依存する。プラスミドを保持する細胞内では、アンチトキシンはトキシンと安定な複合体を形成することによってトキシンの毒性を中和している。プラスミドが脱落すると構造的に不安定なアンチトキシンが宿主プロテアーゼによって分解され、宿主細菌はトキシンの細胞毒性によって細胞死に至る。最近の報告では潜在的な細菌染色体の中毒モジュールは、利他的な自殺因子としてよりもむしろ栄養的及び／又は環境的ストレスにさらされたときに細胞全体的な翻訳レベルを調節する機能を有することが示されている。しかしながら別の報告では、大腸菌やその他の病原性細菌の染色体に存在するｍａｚＥＦシステムによって、いくつかの抗生物質がこの自殺システムを介して間接的に細胞死を起こすことが知られている。これらの抗生物質は、例えば、転写や翻訳の阻害剤、及びチミンの欠乏を引き起こす葉酸代謝阻害剤である（例えば、非特許文献１参照）。また菌血症や重大な院内感染を引き起こす多くの腸球菌は、多剤薬剤耐性を有することが知られているが、この多剤薬剤耐性を維持するプラスミドｐＲＵＭの安定性は、Ｔｘｅ−Ａｘｅというトキシン−アンチトキシンによって調節されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
ゲノム解析の結果によれば、大腸菌染色体はトキシンの配列類似性に基づいて現在までに６種類の独立したアンチトキシン−トキシン対を有する。１つのクラスは、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ及びＣｈｐＢＩ−ＣｈｐＢＫ対からなり、第二のクラスは、ＲｅｌＢ−ＲｅｌＥ、ＤｉｎＪ−ＹａｆＱ及びＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ対を含む。ＹａｆＮ−ＹａｆＱの潜在的な中毒モジュールは第三のクラスを構成することが示唆されている。これらの染色体トキシンのうち、ＲｅｌＥとＭａｚＦが広範に調べられている。ＲｅｌＥはコドン依存的なエンド型リボヌクレアーゼであり、リボソームのＡ−部位と相互作用して活性を示す。あるいは、リボソームの内因性エンドヌクレアーゼ活性刺激因子として働く。このトキシンは、真核生物のナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊(nonsense-mediated mRNA decay)のような遺伝子発現の品質管理に関与しているのかもしれない。ＭａｚＦは、ＡＣＡ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼであって、リボソームとは独立して働く。しかしながら、ＭａｚＦがＲｅｌＥのようにリボソームのＡ−部位で作用することを示唆するデータもある。
【０００４】
Ｘ線結晶構造解析によって得られた大腸菌のＭａｚＦ−ＭａｚＥ及びシュードモナス・ホリコシのＲｅｌＥ−ＲｅｌＢの２つのシステム由来のトキシン−アンチトキシン対の構造を調べると、それぞれのトキシン−アンチトキシン複合体の各構成因子は、構造的に類似しておらず、また形成するオリゴマーの数も異なることが見出された。ＭａｚＦトキシンは２量体を形成し、構造的にＫｉｄやＣｃｄＢプラスミドトキシンと類似する。これらの２量体はＭａｚＥアンチトキシンとヘテロ６量体を形成する（ＭａｚＦ２−ＭａｚＥ２−ＭａｚＦ２）。ＭａｚＥアンチトキシンはその保存されたトリプトファン残基を用いて、ＭａｚＦトキシンの活性中心と相互作用することで、ＲＮＡ基質の接近を阻止すると思われる。一方、ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ複合体は２つのヘテロ２量体からなる４量体（ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ）２を形成する。非球状構造のＲｅｌＢは、ＲｅｌＥ表面の機能的に重要なアルギニン残基のクラスターを覆い隠している。
【０００５】
大腸菌染色体上のＹｅｆＭ−ＹｏｅＢアンチトキシン−トキシンモジュールは、腸球菌(Enterococcus faecium)のｐＲＵＭ多剤耐性プラスミド上に存在するＡｘｅ（アンチトキシン）−Ｔｘｅ（トキシン）対との相同性に基づいて同定されたものである（非特許文献２参照）。他の中毒モジュールと同様に、ＹｏｅＢトキシンは塩基性タンパク質（１０ｋＤａ）であり、一方、ＹｅｆＭアンチトキシンは構造的に折りたたまれていない酸性タンパク質（１１ｋＤａ）であると報告されている。このｙｅｆＭ−ｙｏｅＢ遺伝子カセットは１つのアンチトキシン−トキシンモジュールとして機能する（例えば、非特許文献３参照）。ＹｏｅＢトキシンは、ｍＲＮＡを切断すること、さらに宿主のＡＴＰ依存性プロテアーゼであるＬｏｎの過剰発現がＹｏｅＢ依存的にｍＲＮＡの分解を活性化することからＬｏｎプロテアーゼによるＹｅｆＭの分解がＹｏｅＢを活性化すると考えられる（例えば、非特許文献４参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Engelberg-Kulka, H. et al., Trends Microbiol. (2004) Vol.12, pp.66-71
【非特許文献２】Grady, R., and Hayes, F., Mol Microbiol. (2003) Vol. 47, pp.1419-1432
【非特許文献３】Cherny, I., and Gazit, E., J. Biol. Chem. (2004) Vol.279, pp.8252-8261
【非特許文献４】Christensen, S.K. et al., Mol. Microbiol. (2004) Vol.51, pp.1705-1717
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、多くのトキシン−アンチトキシン複合体の結合様式は未だ明らかでないため、アンチトキシンがどのようにトキシンの毒性を抑制しているのかは不明である。本発明は、かかるトキシン−アンチトキシン複合体の立体構造を解析することによって、アンチトキシンによるトキシンの毒性抑制機構を明らかにし、これらの知見に基づいて細菌の増殖を阻害しうる抗生物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、トキシン−アンチトキシンの１つである大腸菌のＹｏｅＢ−ＹｅｆＭタンパク質の立体構造を解析することにより、ＹｏｅＢトキシンは、非典型的なリボヌクレアーゼの構造を示し、アンチトキシンであるＹｅｆＭと結合することによって推定活性中心の立体配座の変化を引き起こすことを見出した。また、ＹｅｆＭアンチトキシンのＣ末端側の２つのα−ヘリックス領域がＹｏｅＢタンパク質との相互作用に関与し、特徴的なヘテロ三量体複合体を形成することも明らかにした。これらの知見及び構造的に類似するいくつかのトキシン−アンチトキシンの比較解析に基づいて、大腸菌のＹｏｅＢ−ＹｅｆＭファミリーに属する中毒モジュールを用いた新規な抗生物質のスクリーニング方法が提供される。
【０００９】
すなわち、本発明の抗生物質のスクリーニング方法は、細菌の染色体又はプラスミドＤＮＡにコードされたトキシン及びアンチトキシンタンパク質と、候補化合物とを接触させて、トキシン−アンチトキシン複合体が形成されるか否かを検出することを含み、前記複合体の形成を阻害する候補化合物が、前記細菌の増殖阻害剤であることを示唆することを特徴とする。前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質は、ＭａｚＥ−ＭａｚＦファミリー、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢファミリー、又はＹａｆＮ−ＹａｆＱファミリーから選択される一対の中毒モジュールタンパク質であることが好ましい。さらに好ましくは、前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質は、それぞれ大腸菌のＹｏｅＢ及びＹｅｆＭタンパク質、若しくはその相同体、又はその誘導体である。また、好ましい実施形態において、前記相同体には、シュードモナス・フルオレッセンスのＰｆｌ−Ｋ及びＰｆｌ−Ｉ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡｔｕ−Ｋ及びＡｔｕ−Ｉ、エンテロコッカス・ファシエンスｐＲＵＭプラスミド由来のＴｘｅ及びＡｘｅ、ミコバクテリウム・ツベルキュロシスのＭｔｕ−Ｋ及びＭｔｕ−Ｉ、シュードモナス・プチダのＰｐｕ−Ｋ及びＰｐｕ−Ｉ、並びにスタフィロコッカス・オーレオスのＳａｕ−Ｋ及びＳａｕ−Ｉ等のタンパク質対が含まれることを特徴とする。
【００１０】
別の観点において、本発明の抗生物質のスクリーニング方法は、（ａ）細菌のトキシン及び／又はアンチトキシンの三次元立体構造座標を用意し、前記トキシン及び／又はアンチトキシンの三次元立体構造又はその部分を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、（ｂ）前記三次元立体構造に基づいて、前記トキシン又はアンチトキシンに結合する候補化合物を設計又は選択する工程、（ｃ）前記設計又は選択された候補化合物を合成又は取得する工程、及び（ｄ）前記候補化合物が前記トキシン−アンチトキシン複合体の形成を阻害するか否かを調べるために前記候補化合物と前記トキシン及びアンチトキシンとを接触させる工程、を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明はさらに異なる観点において、配列番号１に示したアミノ酸配列の５１〜８３番目のアミノ酸残基からなる単離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドの１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ大腸菌のＹｏｅＢタンパク質と結合してリボヌクレアーゼ活性を阻害する作用を有するポリペプチド誘導体を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、従来の方法とは全く異なる観点からの抗生物質のスクリーニング方法を提供するものであり、新規な作用機構に基づく新規な抗生物質を提供することができる。現在、院内感染などの原因となっている多剤耐性菌の多くは、トキシン−アンチトキシン機構を用いて抗生物質耐性遺伝子をそのプラスミド上に維持保守しているため、本発明の方法により選択された抗生物質はこれらの多剤耐性菌を効果的に治療できる可能性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
[定義]
本明細書において、用語「トキシン(toxin)」、及び「アンチトキシン(antitoxin)」とは、細菌の染色体又はプラスミドＤＮＡにコードされたタンパク質からなる毒素、及び抗毒素のことを意味する。アンチトキシンは解毒剤(antidote)と呼ばれる場合もある。これらのタンパク質のアミノ酸配列、及びそれらをコードする遺伝子配列はすでに公知であり、例えば、アンチトキシンタンパク質としては、大腸菌のＹｅｆＭ（Swiss-ProtのACCESSION No.P69346、配列番号１）、シュードモナス・フルオレッセンスのＰｆｌ−Ｉ（配列番号２）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡｔｕ−Ｉ（配列番号３）、エンテロコッカス・ファシエンスｐＲＵＭプラスミド由来のＡｘｅ（配列番号４）、ミコバクテリウム・ツベルキュロシスのＭｔｕ−Ｉ（配列番号５）、シュードモナス・プチダのＰｐｕ−Ｉ（配列番号６）、スタフィロコッカス・オーレオスのＳａｕ−Ｉ（配列番号７）、サルモネラ・タイフィムリウムのＳｔｙ−Ｉ（配列番号８）及びエンテロバクテリアファージＰ１のＰｈｄ（配列番号９）等が挙げられる。トキシンタンパク質としては、大腸菌のＹｏｅＢ（Swiss-ProtのACCESSION No.P69348、配列番号１０）、シュードモナス・フルオレッセンスのＰｆｌ−Ｋ（配列番号１１）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡｔｕ−Ｋ（配列番号１２）、エンテロコッカス・ファシエンスｐＲＵＭプラスミド由来のＴｘｅ（配列番号１３）、ミコバクテリウム・ツベルキュロシスのＭｔｕ−Ｋ（配列番号１４）、シュードモナス・プチダのＰｐｕ−Ｋ（配列番号１５）、スタフィロコッカス・オーレオスのＳａｕ−Ｋ（配列番号１６）、及び大腸菌のＥＹａｆＱ（配列番号１７）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
「相同体(homologue)」とは、１次構造又は立体構造に相同性のあるタンパク質群のことをいい、例えば、１次構造の相同性が少なくとも３０％、好ましくは５０％、より好ましくは７０％以上のタンパク質である。タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、当該配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。また、一次構造上の相同性が低くても、立体構造が高度に類似しているタンパク質も存在することが知られている。このようなタンパク質同士の立体構造の相同性は、例えば、ＤＡＬＩサーバを用いて検索することができる(Holm, L., and Sander, C., Nucl. Acids Res. (1998) Vol.26, pp.316-319参照)。
【００１５】
本明細書において、「誘導体(derivative)」とは、タンパク質の一部のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はポリペプチドであって、元のタンパク質と実質的に同一の機能を有するものをいう。
【００１６】
また、「抗生物質」とは、従来より微生物が産生し他の微生物の増殖を抑制する物質と定義されていたが、本明細書ではそのような天然物を起源とするものだけでなく全合成物をも含む。
【００１７】
[トキシン−アンチトキシン複合体の結晶化とＸ線結晶構造解析による立体構造の決定]
タンパク質の立体構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像を基に、該タンパク質の立体構造を明らかにしていくものである（Blundell, T.L.及びJohnson,L.N., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, p.1-565, (1976) Academic Press, New York）。
【００１８】
結晶化は、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加し、または溶媒量を蒸発等によって減少させる等の操作によって、タンパク質が溶液状態から非溶液状態になる場合において、ある特定の条件において結晶として析出する性質を利用している。結晶化には高純度に精製されたタンパク質が必要である。また、結晶化する条件として、タンパク質濃度、塩濃度、水素イオン濃度(ｐＨ)、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子が関与している。さらには、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法として、バッチ法、透析法、蒸気拡散法などの結晶化の手法が数多く存在している（Blundell, T.L.及びJohnson,L.N., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, p.59-82, (1976) Academic Press, New York）。例えば、蒸気拡散法は、気相を通じて拡散によって揮発性の溶媒や沈殿剤が移動するようなしくみである。タンパク質溶液が沈殿剤溶液とのあいだで蒸気拡散することにより、タンパク質濃度と沈殿剤濃度が共に高まって過飽和の領域で結晶化が起こる。タンパク質溶液の液滴をどうつくるかによって、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法等の方法がある。このようにＸ線結晶解析に適したタンパク質の結晶を得るには、それぞれのタンパク質において、高純度のタンパク質を得ることと、結晶化における種々の因子や結晶化法を最適化する検討が必要になる。特に高純度のタンパク質の調製は結晶化を成功させるための重要な因子である。このために、クローン化した遺伝子を効率的かつ安定に発現させることにより迅速かつ均一なタンパク質を調製することが重要である。
【００１９】
このようにして得たトキシン−アンチトキシン複合体の結晶の構造を当業者に知られたＸ線結晶構造解析技術を用いて解析する。類縁タンパク質の立体構造が未知であり、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能な本発明のような立体構造決定においては、重原子置換法又は多波長異常分散法(ＭＡＤ法)が適用され得る。本発明の一つの実施態様において、Ｘ線結晶解析は、ＭＡＤ法であり、これに用いられるＸ線は、シンクロトロン放射光から得られる０．３〜３．０Åの波長である。ＭＡＤ法は、入射Ｘ線エネルギー近傍の吸収端をもつ重原子同型置換結晶から、複数の波長によるＸ線回折データを得る方法である。Ｘ線と該重原子の電子殻のエネルギーによる干渉によって、そのＸ線の散乱に差を生じ、これによってタンパク質の構造解析に必須な位相問題を解決することができる。この方法の原理はすでに古くから知られていたが、波長可変であるシンクロトロン放射光の出現によって始めてタンパク質の構造決定に使用されるようになり、ヘンドリクソンらがこの方法によって初めてタンパク質の構造解析に成功した（Hendrickson W.A. et al., Proteins 4, 77-88, 1988及び、Hendrickson W.A. et al., EMBO J.5, 1665-1672, 1990参照）。
【００２０】
シンクロトロン放射光とは、蓄積リングに打ち込まれた電子を磁場によって加速して得られる放射光であり、通常のＸ線発生装置よりも極めて強いエネルギーを有する。理研播磨研究所の第三世代大型放射光設備 ＳＰｒｉｎｇ−８（８ＧｅＶ）等が使用可能である。
【００２１】
測定した回折画像データは、プログラムＨＫＬ２０００（HKL corporation）又は同様な画像処理プログラムを用いて、反射強度データに処理される。天然型結晶の反射強度データ、複数波長での重原子置換結晶の反射強度データから、上述のＭＡＤ法によりタンパク質に結合した重原子の位置を、ＳＯＬＶＥ、ＳＨＡＲＰ若しくはＣＣＰ４又は同様の回折データ解析プログラムを用いて、決定及び精密化することにより初期位相が決定される。決定された初期位相は、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ）、ＲＥＳＯＬＶＥ又は同様な位相改良プログラム（電子密度改良プログラム）を用いた溶媒平滑化法に従って、信頼性の高い位相へと改良される。
【００２２】
トキシン−アンチトキシン複合体の立体構造モデルは、プログラムＯやＡＲＰ／ｗＡＲＰ等により３次元グラフィックス上に表示した電子密度図から、以下の手順で構築し得る。まず、一般にはらせん構造をしている電子密度を選び出し、その部分から主鎖（ポリペプチド鎖）を置いていき、そこから順次主鎖を伸ばしていく。ある程度主鎖の同定を進めたところで、側鎖の同定も同時に行う。アミノ酸配列と側鎖に相当する電子密度を照らし合わせることによって、アミノ酸番号を同定する。セレノメチオニン置換タンパク質を用いた多波長異常分散法の場合、セレンの位置、すなわちメチオニンの位置が既に明らかになっているので、アミノ酸配列と照らし合わせることで、簡単にどのメチオニンかを同定することができる。順次この作業を繰り返すことにより、トキシン−アンチトキシン複合体のすべてのアミノ酸残基を相当する電子密度に適合させ、複合体全体の初期立体構造モデルを構築する。構築された立体構造モデルは、それを出発モデル構造として、構造精密化プログラムであるＣＮＳやＲＥＦＭＡＣ等の精密化プロトコルに従って、立体構造を記述する三次元座標が精密化される。精密化の進行状況や分子モデルのチェックは、以下の指標により確認することができる。信頼度因子（Ｒ因子）は、回折強度測定で得られた結晶構造因子の絶対値と分子モデルから計算した結晶構造因子の絶対値の一致度を示す尺度であり、精密化が正常に進行すると小さな値となる。また、タンパク質の主鎖の二面角を計算しそれらをプロットしてそれらの値が許容される領域にあるかどうかを確認する方法（ラマチャンドランプロット）も用いられる。
【００２３】
このようにして本発明にかかるトキシン−アンチトキシン複合体の３次元原子座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）が得られる。１つの実施形態として得られた大腸菌のＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体、及びＹｏｅＢ単独の原子座標は、プロテインデータバンク（PDB, Protein Data Bank, The Research Collaboratory for Structual Bioinformatics (RCSB)が運営、http://www.rcsb.org/pdb/参照）に複合体：２Ａ６Ｑ、ＹｏｅＢ（ＰＥＧ）：２Ａ６Ｒ、及びＹｏｅＢ（イソプロパノール）：２Ａ６ＳなるＩＤコードとして登録(deposit)され、本明細書中でこのデータを援用する。なお、これらの原子座標は、本発明者らにより２００５年７月４日にＰＤＢに仮登録されており、本願出願時においては未公開である。
【００２４】
[トキシン−アンチトキシン複合体の立体構造モデルを表示するコンピュータシステム]
本発明によるトキシン−アンチトキシン複合体の結晶から得られる原子座標を、分子の３次元構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はそのコンピュータの記憶媒体に入力することで、トキシン−アンチトキシン複合体の３次元的な構造を詳細に表現することが可能になる。
【００２５】
コンピュータの記憶媒体としては、トキシン−アンチトキシン複合体の原子座標をコンピュータの該プログラム上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フレキシブルディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープ等の半永久的な記憶媒体でも良い。
【００２６】
上記メモリ又は記憶媒体と電気的に連絡するプロセッサによってトキシン−アンチトキシン複合体の少なくとも一部を表す三次元立体構造モデルが生成される。このようなプロセッサ（プログラム）としては、ＱＵＡＮＴＡ(Molecular Simulations社)、ＳＹＢＹＬ(Molecular Modeling Software社)、等が利用できる。この際に用いられるコンピュータは、例えば、シリコングラフィックス社によって供給されているワークステーションＯＣＴＡＮＥ等が好適であるが、これに限定されるものではなく、適当なプログラムが動作するように調整されているコンピュータであればよい。
【００２７】
[立体構造モデルを用いた抗生物質のスクリーニング]
本発明が提供するトキシン及びアンチトキシンタンパク質又はそれらの複合体の原子座標のすべて又は一部を、分子の立体構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はその記憶媒体に入力することで、トキシン又はアンチトキシンの何れかと結合し、複合体の形成を阻害する化合物を同定、検索、評価又は設計することが可能となる。化合物は、天然物化合物、合成化合物の何れでもよく、高分子化合物、低分子化合物の何れでもよい。
【００２８】
このような方法は、まず候補化合物と、トキシン及びアンチトキシンタンパク質又はそれらの複合体とをコンピュータモデルにより表示し、視覚的観察によりトキシン又はアンチトキシンタンパク質の特定の部位に良く適合する形状又は化学構造をもつ結合化合物（リード化合物）を見つけ出す段階が含まれる。分子モデルを作成、表示するためには、前記ＱＵＡＮＴＡやＳＹＢＹＬ等のプログラムが利用できる。更に、トキシン又はアンチトキシンタンパク質の特定の部位との親和性、反発力、及び立体的障害等を推定するための種々のコンピュータプログラムが使用できる。これらのプログラムの例としては、例えば、生体高分子についてエネルギー的に好適な結合部位を決定するためのＧＲＩＤ(Goodford, P. J., (1985) J. Med. Chem., 28, p.849-857)、機能的結合部位を探索するためのＭＣＳＳ(Miranker, A., et al., (1991) Proteins: Structure, Function and Genetics, 11, p.29-34)、あるいは高分子とリガンドとの相互作用を幾何学的に解析し、自動的にドッキングさせるＡＵＴＯＤＯＣＫ(Goodsell, D. S., et al., (1990) PROTEINS: Structure, Function and Genetics,8, 195-202)、及びＤＯＣＫ(Kuntz, I.D., et al., (1982) J. Mol. Biol. 161, 269-288)等が挙げられる。
【００２９】
[トキシン−アンチトキシン複合体形成を指標とする抗生物質のスクリーニング]
本発明の抗生物質のスクリーニング方法は、トキシン及びアンチトキシンタンパク質のそれぞれ特定の領域が結合（相互作用）して複合体を形成することによってトキシンタンパク質のリボヌクレアーゼ活性を抑制すること、及びこの複合体の形成を阻害することによって細菌細胞内でのトキシンタンパク質の毒性が発現され、細菌の増殖を抑制又は細胞死を引き起こすという知見に基づくものである。すなわち、トキシンとアンチトキシンとの結合を阻害する化合物は細菌の増殖を抑制する抗生物質として利用することができる。
【００３０】
従って、１つの実施形態として、本発明の抗生物質のスクリーニング方法は、細菌のトキシン及びアンチトキシンタンパク質と、候補化合物とを接触させて、前記トキシン−アンチトキシン複合体が形成されるか否かを検出することを含み、前記複合体の形成を阻害する候補化合物が、前記細菌の増殖阻害剤であることが示唆される。候補化合物とは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、多糖、脂質、又はその他の有機化合物若しくは無機化合物でありうる。これらは化学合成された化合物ライブラリー又は細菌、カビ、放線菌などの培養物中の化合物からなる生物学的混合物であっても良い。
【００３１】
本実施形態において使用するトキシン及びアンチトキシンタンパク質は、例えば、図１に示したＹｅｆＭ−ＹｏｅＢファミリーに属する典型的なアンチトキシン（Ａ）及びトキシンタンパク質（Ｂ）である。図１には、これらのアミノ酸配列を並列化して示すと共に、（Ａ）にはＹｅｆＭの２つの単量体の、（Ｂ）にはＹｏｅＢのそれぞれの二次構造を模式的に示した。配列上部の長方形はα−ヘリックス構造を、矢印はβ−シート構造を、実線はランダムコイル構造を、そして破線は無秩序な領域を示す。その下に薄い青色で示した「ｘ」は、ＹｅｆＭとＹｏｅＢとの結合に関与するアミノ酸残基であり、配列の上部に示した「ｄ」は、それぞれのタンパク質の２量体化に関与するアミノ酸残基である。
【００３２】
さらに、本実施形態におけるトキシン−アンチトキシン複合体は、複合体の形成に関与する結合領域を含み、その他のタンパク質やポリペプチドとの融合タンパク質であってもよい。好ましい実施形態において、当該融合タンパク質は、タグペプチド及び／又はレポータータンパク質等を含む。本明細書において、タグペプチドとは、トキシン又はアンチトキシンタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加されたアミノ酸配列であって、該融合タンパク質をアフィニティー精製したり、ウエスタンブロッティング検出する場合の手がかりとなる配列である。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴｒｘＡ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Streptag（商品名））、及びヒスチジンタグ等が挙げられる。
【００３３】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、可溶性の酵素タンパク質であって、この遺伝子配列の下流にフレームを合わせて目的遺伝子を組み込むとＧＳＴとの融合タンパク質として発現させることができる。このための組換えベクターｐＧＥＸはアマシャムファルマシアバイオテック社から市販されている。ＧＳＴのタンパク質部分を特異的に認識する抗体や、グルタチオンと結合する性質を利用してアフィニティー精製や酵素免疫染色に利用されている。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、大腸菌のマルトース結合タンパク質であり、ＭＢＰとの融合タンパク質はアミロースやアガロースゲルに吸着させた後、過剰のマルトースで遊離して精製できる。また、抗ＭＢＰ抗体を使用することもできる。チオレドキシン（ＴｒｘＡ）は、酸化還元反応を触媒する大腸菌のタンパク質であり、機能性の一対のチオール基によって金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。このための担体として、例えばThioBond（商品名）Resin(Invitorogen社製)等が市販されている。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）はClostridium cellulovoransとCellulomonas fimi由来のセルロース結合ドメイン配列で、セルロースに特異的に結合する性質を有し、セルロースやキチンなどの不活性な担体に化学的な修飾を行うことなく固定させることができる。ストレプトアビジン結合ペプチドとして、例えば、Strep-tagIIと呼ばれる８個のアミノ酸からなるペプチドが知られており、StrepTactin（商品名）やStreptavidine（商品名）に選択的に結合させて精製することができる。ヒスチジンタグは、連続した又は近傍に配された少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチドが好ましい。ヒスチジンタグは、二価の金属原子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティーマトリックスにしっかりと結合し、容易に精製することができる。
【００３４】
本発明において用いられるレポータータンパク質は、融合タンパク質として検出が容易なものであれば特に限定されるものではないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等を挙げることができる。
【００３５】
トキシンとアンチトキシンが複合体を形成するか否かを検出するための１つの実施形態として、プルダウンアッセイがある。この方法は、まず、候補化合物の存在下においてトキシンタンパク質とアンチトキシンタンパク質とを接触させる工程である。これらの混合物は、通常は生体内に近い条件、例えば、２０〜４０℃で５分〜数時間、好ましくは１０分〜１時間程度インキュベートする。次に、トキシンタンパク質、及びアンチトキシンタンパク質の何れかを固相の担体に吸着させ、適当な洗浄液で洗浄することにより非結合成分を洗い流す。担体としては、固体または不溶性材料（例えば、ろ過、沈殿、磁性分離などによりタンパク質混合物から分離することができる材料）であって、タンパク質の非特異的な吸着が少ない物が好ましく、例としては、ビーズ（例えば、アガロース、セファロース、セファデックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、テフロン（登録商標）、孔調節ガラス（ＣＰＧ））、薄膜（例えば、セルロース、ニトロセルロースポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ナイロン、ガラス繊維、及びテフロン（登録商標）製）のような平坦担体、ガラスプレート、金属プレート、シリコンウエハ、及びマイクロタイタープレート等を含む。タンパク質を固相担体に吸着させるためには種々の方法がある。例えば、トキシンタンパク質、及びアンチトキシンタンパク質の何れかに対する抗体を固定化したビーズなどを用いても良い。好ましくは、上述した融合トキシン又はアンチトキシンタンパク質中のタグペプチド等を介して固相担体に吸着させることができる。最後に、固相担体に吸着したタンパク質を回収し、固相担体から他の一方のタンパク質を溶出するか或いは固相担体上で直接、他の一方のタンパク質を検出する。検出には特異的な抗体を用いたイムノアッセイや、上述した融合トキシン又はアンチトキシンタンパク質中のレポータータンパク質の活性を測定することによる行うことができる。
【００３６】
典型的な１つの方法としてＧＳＴ−プルダウンアッセイがあり、ＧＳＴと融合したトキシンタンパク質及びアンチトキシンタンパク質の何れか一方のタンパク質をコードする遺伝子を、例えばＩＰＴＧで発現誘導が可能な発現ベクターにクローン化する。ＩＰＴＧを添加することによって、この融合タンパク質は、通常、細菌細胞内で発現され、グルタチオン−アガロースビーズ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。他の一方のタンパク質は、精製されたものでも、あるいは細胞のライセートの何れでもよく、また、放射性同位元素で標識されていてもよい。このＧＳＴ融合タンパク質と、他の一方のタンパク質とを、候補化合物の存在下、グルタチオンアガロースビーズと共にインキュベートし、ビーズから回収したタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング、オートラジオグラフィー、又は上記レポータータンパク質の酵素活性等により検出する。
【００３７】
他の１つの方法としては、前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質を発現するプラスミドにより形質転換された形質転換体を用意し、前記形質転換体と前記候補化合物とを接触させて前記形質転換体が増殖するか否かを検出することができる。例えば、腸球菌の多剤耐性プラスミドにコードされているＡｘｅ−Ｔｘｅ遺伝子モジュールを大腸菌の発現ベクターにクローン化して大腸菌を形質転換する。候補化合物を添加した培養液中で該形質転換体を培養し、増殖するか否かを検出する。このような方法により、形質転換体大腸菌を用いてＡｘｅ−Ｔｘｅ複合体の形成を阻害する候補化合物をスクリーニングすることができる。得られた結合化合物は該形質転換体のみならず、多剤耐性を示す多くの院内感染菌の中でＴｘｅトキシンを活性化してその増殖を抑制するため抗生物質として利用できる可能性が高い。
【実施例１】
【００３８】
本発明は、以下に示した大腸菌のＹｏｅＢトキシン及びＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体の立体構造解析の実施例に基づいてより詳細に説明されるが、本発明の範囲はこれ等の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
[タンパク質の発現と精製]
完全長のｙｅｆＭ及びｙｏｅＢをコードするＤＮＡは、大腸菌Ｋ−１２株のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、それぞれｐＥＴ−２８ａ及びｐＥＴ−１１ａベクター（ノバジェン社）のＴ７プロモータの制御下にサブクローン化した。完全長のＹｅｆＭタンパク質及びＮ末端切断型（１０〜９２番目のアミノ酸残基を含む）は、Ｎ末端に付加したヒスチジンタグとヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を持つものを発現させた。ＹｏｅＢはタグ付加なしに発現させた。これらの２つのベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に同時形質転換し、アンチトキシン−トキシン複合体を産生させた。細胞を溶菌した後、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体のオリゴマーをＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーで精製し、そのときＹｅｆＭのヒスチジンタグは３Ｃプロテアーゼで分解除去した。ヘパリン−セファロース及びＱ−セファロースを用いた逐次的なカラムクロマトグラフィーによって、高純度に精製されたトキシン−アンチトキシン複合体が得られた。セレノメチオニン標識（Ｓｅ−Ｍｅｔ）したＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体も上記と同様の方法により発現させ精製した。
【００４０】
ＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢタンパク質は、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ複合体がＹｅｆＭのヒスチジンタグを介して予め固定化されたＮｉ２＋キレーティングカラムから、６Ｍ塩酸グアニジンを含む緩衝液により抽出した。変性したＹｏｅＢ画分を０．５ｍｇ／ｍｌに調整し、続いて２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに対して４℃でゆっくりと透析した。ヒスチジンタグ付加ＹｅｆＭアンチトキシン単体（アミノ酸残基１０〜９２）は単独で発現させ、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーで精製した。ヒスチジンタグを除去した後、さらにＱ−セファロースカラムを用いて精製した。
【００４１】
[結晶化と構造解析]
天然型及びＳｅ−Ｍｅｔ導入ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体（２１ｍｇ／ｍｌ）の結晶は、シッティングドロップ法により２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのＤＴＴを含むリザーバー溶液に対して２０℃にて成長させた。天然型及びＳｅ−Ｍｅｔ結晶は、一つの結晶学的２回回転軸のゆがみに依存するが、Ｐ６４又はＰ３１の空間群に属し、ａ＝ｂ＝８８．４５Å、ｃ＝１３５．１５Åの単位格子を有する六方晶系の結晶が０．２×０．２×０．６ｍｍの典型的な大きさまで成長し、２．０２Åの分解能を示した。これらの結晶は、Ｐ６４空間群中に２つのアンチトキシン−トキシンヘテロ３量体複合体を含むか、又はＰ３１の空間群中に４つの該複合体を含む。結晶の凍結保護は、グリセリンを終濃度で３０容量％添加して行った。
【００４２】
ハンギングドロップ法により、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）、０．２ＭのＣＨ３ＣＯＯＮＨ４及び３０容量％のイソプロパノールを含むリザーバー溶液に対して４℃で蒸気拡散させるか、又は１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）、０．２ＭのＭｇＣｌ２、及び２０容量％のＰＥＧ８０００を含むリザーバー溶液に対して２０℃で蒸気拡散させることにより、２種類のＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢ結晶が成長した。イソプロパノール条件から得られた斜方晶系の結晶は、０．４×０．２×０．２ｍｍの典型的な大きさまで成長し、非対称単位当り４つの分子を含む、Ｐ２１の空間群、及びａ＝２８．９７Å、ｂ＝６０．９９Å、ｃ＝９８．５６Å、β＝９８．０３°の単位格子を有し、１．７７Åの分解能で回折された。結晶の凍結保護は、グリセリンを終濃度で２０容量％添加して行った。ＰＥＧ条件から得られた針状結晶は、０．０５×０．０５×０．２ｍｍの典型的な大きさまで成長し、非対称単位当り６つの分子を含む、Ｃ２の空間群、及びａ＝１６３．９０Å、ｂ＝４３．１４Å、ｃ＝９８．３７Å、β＝１１８．４９°の単位格子を有し、２．０５Åの分解能で回折された。結晶の凍結保護は、グリセリンを終濃度で２５容量％添加して行った。
【００４３】
ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体の天然型（Ｐ６４）とＳｅ−Ｍｅｔ型（Ｐ３１）の両方の結晶についてＳＰｒｉｎｇ−８ビームライン４１ＸＵで回折データを収集し、ＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢ結晶についてはフォトンファクトリーのビームラインＢＬ−５で収集した。すべてのデータはＨＫＬ２０００プログラムパッケージで処理した。ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体中の観測できる２５ヶ所のセレニウム位地は、プログラムＳｎＢで同定され、多重同形置換／異常散乱法を用いた方法によってＭＬＰＨＡＲＥで計算し、２．３Åの分解能の実験的な位相が得られた。ＤＭで計算された密度修飾により、高品質の電子密度マップが得られた。部分的モデル（非対称単位の５０％の残基）は、ＡＲＰ／ｗＡＲＰで自動的に構築し、残りの構造はプログラムＯを用いて手動で完成させた。ＣＮＳにより繰り返し精密化を行った。天然型ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体の最終精密化モデルは、非対称単位中の２つのヘテロ３量体に対してＹｏｅＢ（１〜８４の全ての残基）と、ＹｅｆＭホモダイマー（分子Ａ及びＣについて１０〜９２の残基とＮ末端クローニング人工産物の３残基；分子Ｂ及びＤについて１０〜６５の残基とＮ末端クローニング人工産物の３残基）、及び１５３個の水分子からなる。
【００４４】
２種類の結晶型からのＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢの構造は、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体からのＹｏｅＢ構造を検索モデルとして用いて、ＣＮＳにより分子置換法により決定された。イソプロパノール結晶型に対するＰＣ−精密化相関係数は４８．９％であり、ＰＥＧ結晶型については５６．９％であった。ＣＮＳを用いた厳密な構造精密化とＰｏｗｅｌ最小化により、ＹｏｅＢの３つのＣ末端残基について、複合体とＹｅｆＭ非結合型との間で明確な違いが認められた。イソプロパノール結晶型についての最終精密化モデルは４つのＹｏｅＢ分子（１〜８４番目の全ての残基、但し、分子ＡとＤは８４番目の残基を欠失）、３１４個の水分子及び６個のイソプロパノール分子からなり、１９．５％のワーキングＲ因子と、２２．３％の自由Ｒ値を与えた。ＰＥＧ結晶型についての最終精密化モデルは６つのＹｏｅＢ分子（１〜８４番目の全ての残基、但し、分子Ｃは８４番目の残基を欠失）、３４０個の水分子及び２個の水和マグネシウムイオンからなる。
【００４５】
[ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体及びＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢタンパク質の立体構造決定についての所見]
大腸菌Ｋ１２株由来のｙｏｅＢ遺伝子を含むｐＥＴ−１１ａベクターで種々の大腸菌株をカルシウム法による形質転換を行ったところ、下記の表に示したように大腸菌Ｂ由来株ではコロニーが形成されず、導入することができなかった。これは、ｐＥＴベクターの漏出性の遺伝子発現により、Ｂ株由来の大腸菌の生育が阻害されたものと考えられる。漏出性発現はおそらく宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写によるであろう。
【００４６】
【表１】
【００４７】
従って、ｙｅｆＭ及びｙｏｅＢを含む２つのｐＥＴベクターの同時導入により形質転換体が生育することができた。これらのデータは、大腸菌のＢ由来株はＹｅｆＭ−ＹｏｅＢと同属のアンチトキシン−トキシン遺伝子を持っていないか、又はその発現量が極めて低いためにｐＥＴベクターからのトキシンの漏出性発現を抑制することができないと考えられる。
【００４８】
質量分析によれば、精製された組換えＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体は、ＹｅｆＭの１０〜９２番目のアミノ酸からなるより短い翻訳産物を含む。ＹｅｆＭの推測された最初の９アミノ酸残基は、図１に示した関連するアンチトキシンの何れにも類似せず、これら９アミノ酸残基をコードするＤＮＡにはシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）様配列が存在することから、短縮型は完全長ＹｅｆＭと機能的に同等であると思われる。ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体の構造は、多波長異常散乱法を用いたＸ線回折により２．０５Åの分解能で決定された。イソプロパノール及びＰＥＧ結晶化条件から得られた２種類のＹｅｆＭを含まないＹｏｅＢ結晶型の構造は、それぞれ１．７７及び２．０５Åの分解能で決定された。これらの結晶学的解析統計値を表２に示した。
【００４９】
【表２】
【００５０】
[ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ三量体の構造]
ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ三量体は１つのＹｏｅＢと、２つのＹｅｆＭを含む（図２参照）。図２は、立体構造を形成したＣ末端と無秩序なＣ末端を持つ非対称なＹｅｆＭホモダイマーがＹｏｅＢモノマーに結合したリボン図を、ＹｅｆＭのＮ末端側の２回回転軸に垂直な方向から示したものである。それぞれのモノマーのＮ及びＣ末端及び二次構造を表示した（＃は、無秩序なＣ末端を有するＹｅｆＭプロトマーを示す）。ゲルろ過実験によれば、この複合体の溶液中での形態は分子量約３０ｋＤａであることが示され、ヘテロ三量体構造と化学量論的に一致する。非対称的なＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ三量体は伸長した形（６０×３５×３５Å）である。２つのＹｅｆＭ単量体のＮ末端領域は対称的な２量体を形成する（図２のＳ１からＨ３及びＳ１♯からＨ３＃参照）。１つのＹｅｆＭのＣ末端領域（Ｈ４からＳ４）がＮ末端側の２量体から伸長して球状のＹｏｅＢ単量体と排他的に結合している（図２参照）。もう一つのＹｅｆＭのＣ末端領域は構造的に無秩序である。ＹｅｆＭホモ２量体とＹｏｅＢとの結合間溶媒排除面積は３３００Å２である。
【００５１】
[複合体中のＹｏｅＢリボヌクレアーゼフォールド]
ＹｏｅＢは、５つのβ−シート鎖と２つのα−ヘリックスからなり、全体が３０×３０×２０Åのコンパクトな球状の構造を形成する（図２参照）。図３Ａは、ＹｅｆＭ結合又は非結合型のＹｏｅＢ及びバルナーゼ（Barnase）並びにリボヌクレアーゼＳａのα炭素を重ね合わせて表示したものである。低いＺ−スコアと低い配列の同一性にもかかわらず、ＤＡＬＩサーバを用いた立体構造相同性検索によれば、ＹｏｅＢはストレプトミセス・オーレオファシエンス由来のリボヌクレアーゼＳａ（ＰＤＢコード１ＲＧＥ、根二乗平均偏差（ｒｍｓｄ）＝２．６Å、５３個の均等なα−炭素対、６％の配列同一性、Ｚ−スコア＝２．７）、及びバチルス・アミロリキファシエンス由来のバルナーゼ(Barnase)（ＰＤＢコード１Ｂ２０、ｒｍｓｄ＝２．１Å、５２個の均等なα−炭素対、１３％の配列同一性、Ｚ−スコア＝２．７）に対して構造類似性を有することが明らかとなった（図３Ａ）。分子全体の大きさが異なるにもかかわらず、これらのタンパク質の間ではβ−シートの相対的な配向が極めて類似していた。図１Ｂに示した複数のトキシンのアミノ酸配列を比較すると、他の系統発生学的に関連するトキシンも構造的に類似していることが確認される。ところが、アミノ酸配列に基づく比較ではＹｏｅＢ及びその相同体トキシンがリボヌクレアーゼフォールドを含むことを予測することができなかった。本発明者らの見出したＹｏｅＢの立体構造は、これまでに決定されている微生物リボヌクレアーゼの構造に比べて、推定活性部位からＣ末端ペプチド領域を欠失したコンパクトなフォールド（折りたたみ構造）を有することが明らかとなった。
【００５２】
微生物のリボヌクレアーゼの反応機構は、一般的酸塩基触媒基としてヒスチジン及びグルタミン酸残基が関与するが、一方、アルギニン残基は反応性リン酸との結合に重要である。図４は、ＹｏｅＢと結合したＹｅｆＭホモダイマーの配列の保存性（Ａ）、ＹｅｆＭペプチドと結合したＹｏｅＢモノマー（Ｂ）、ＹｅｆＭホモダイマー（Ｃ）、及びＹｏｅＢモノマー（Ｄ及びＥ）の表面静電ポテンシャルを示す。ＹｏｅＢ表面におけるこのトキシンファミリーの相同性検索の結果、いくつかの高度に保存された残基がクラスターを形成してＹｅｆＭとの結合により隠されることが明らかとなった（図４Ｂ参照）。この領域には、リボヌクレアーゼ活性に潜在的に必要な残基が集中しているが、リン酸結合候補である不変のＡｒｇ６５を除いて局所的に変動している（図３Ａ参照）。一般的塩基残基であるグルタミン酸の典型的な位置は、ねじれたβ−シートの内部に位置する（図３Ａ参照）。しかしながら、ＹｏｅＢ構造においては、Ｓｅｒ５７がこの位置を占め、保存されたグルタミン酸（Ｇｌｕ４６）は隣接鎖であるＳ２シートに側鎖が溶媒と接して存在する（図３Ａ参照）。さらに、一般的酸候補であるＨｉｓ８３を含むＹｏｅＢのＣ末端の３つのアミノ酸の立体配座は後方に折りたたまれている。これらの変動の結果、微生物リボヌクレアーゼに見られる典型的な一般的酸塩基基間の距離（約２１Å）よりも、約３倍も大きくなっている（図３Ａ参照）。
【００５３】
[ＹｅｆＭ２量体のＮ末端側の対称構造とＣ末端側の柔軟なペプチド]
ＹｅｆＭホモ２量体は、２つの伸長したＣ末端領域（１つは一定の構造を有し、他は無秩序な）と共にＮ末端側の球状の構造を形成する（図２参照）。２量体のＮ末端側の領域は全体で３５×３５×５０Åの大きさの対称構造を形成する。１つの疎水的なコア（芯）は、６つのβ−鎖（Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３−Ｓ３＃−Ｓ２＃−Ｓ１＃）からなり、それぞれの単量体からの２つのα−ヘリックス（Ｈ１、Ｈ２及びＨ１＃、Ｈ２＃）によって連結されている。それぞれの単量体からのＨ３ヘリックスもまた疎水的な相互作用に関与している。２つのＨ３ヘリックスは、６５°の角度で交差し、平行なコイルドコイル構造とは異なり、この配置によってそれぞれのヘリックスから突き出したＴｙｒ５４残基の大きな芳香族側鎖を収容する中央の空間が形成される（図５Ａ参照）。ＹｅｆＭのホモ２量体の形成により覆い隠される溶媒排除面積は２６７０Å２である。ＹｅｆＭ単量体の２つのＮ末端領域を重ね合わせると５４個の等価なα−炭素のペアについて１．４Åのｒｍｓｄを与えた。このＮ末端領域と構造的に相同な他のタンパク質は検索により見出されなかった。図１Ａに示した一次構造の比較から、このアンチトキシンファミリーの他のメンバーはＹｅｆＭと同じホモ２量体構造をとることが示唆される。ＹｅｆＭ分子表面におけるこのアンチトキシンファミリーの配列相同性を示すと、ＹｏｅＢモノマーと結合する領域において高度に保存されていることが分かった（図４Ａ参照）。単離されたＹｅｆＭの表面静電特性を計算すると、有意な配列保存性を示す塩基性部分（図４Ａ及び４Ｃの円内）を除いて、Ｎ末端の２量体は高度に酸性であることが分かる（図４Ｃ）。ＹｏｅＢとの結合表面は酸性のＨ３ヘリックスとＣ末端、及び中性のＨ４ヘリックスによって形成される（図４Ｃ参照）。
【００５４】
[非対称性のＹｅｆＭによるＹｏｅＢの認識]
ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体において、ＹｅｆＭ２量体の１つのＣ末端ペプチドはＹｏｅＢとの結合に関与しているが、もう１つは溶媒中に突き出ている（図１Ａ及び図２参照）。この違いは、Ｈ３ヘリックスの端からＣ末端までのポリペプチド領域は、結合相手がないときはランダムコイルとなることを示し、ＹｏｅＢとの結合に際して無秩序から秩序への移行が行われている。
【００５５】
図５は、ＹｏｅＢのＳ２−Ｓ３ループ領域と結合したＹｅｆＭのＨ３ヘリックスのコイルドコイル領域（Ａ及びＢ）、ＹｏｅＢの疎水性の窪んだ表面に結合したＹｅｆＭの両親媒性Ｈ４ヘリックス（Ｃ）、並びにＹｏｅＢの背部表面上のＹｅｆＭのＳ４β−鎖からＣ末端領域を示す。ＹｅｆＭ２量体のＮ末端側の対称性と自由なＣ末端は、理論的には第二のＹｏｅＢを収容できるかもしれないが、１つのＹｏｅＢ単量体の結合は第二のＨ４＃領域の立体構造を形成させない。Ｈ３コイルドコイル領域の末端を調べると、ＹｏｅＢに対するＨ４ヘリックス形成はＮ末端側２量体の２回回転軸に向かって１７°傾いていることが分かる（図５Ｂ参照）。従って、２つのＨ４ヘリックスの配向は平行にならないため、他のＹｏｅＢ結合によるＨ４＃ヘリックスの形成は立体的に邪魔される。その結果、ＹｏｅＢと結合しないＨ４＃領域は無秩序となり、Ｈ４は構造を形成してＨ３ヘリックスに対して８０°の角度で配向する（図５Ａ及び５Ｃ参照）。Ｈ４ヘリックスの形成はＨ３コイルドコイル領域がＹｏｅＢと結合するのと同時に起こるであろう。Ｈ３及びＨ４ヘリックスによって形成されるＬ型ターンは、Ｌｅｕ６３、Ｌｅｕ６４、Ａｌａ７０、Ｌｅｕ７３及びＭｅｔ７４からなる局所的な疎水性のクラスターによって保持される（図５Ｃ参照）。Ｈ３＃ヘリックスの無秩序な端にあるＬｅｕ６３＃の側鎖もまたこの疎水性相互作用に寄与する（図５Ｂ）。結論として、ＹｏｅＢモノマーに対して非対称的なＹｅｆＭ２量体の構成は、２：１複合体の形成に必須である。
【００５６】
ＹｅｆＭ２量体によるＹｏｅＢモノマーの認識は２つの部位で起こる。主要な部位は、ＹｏｅＢのＳ２−Ｓ３ループを引っ掛けるＹｅｆＭのＬ型ターンである（隠された溶媒排除面積＝２３００Å２、図５Ｃ）。Ｓ２−Ｓ３ループはＹｅｆＭのＬ型ターンを安定化するＬｅｕ４８とＬｅｕ５２残基を含む。ＹｏｅＢはねじれたβ−鎖によって形成される窪んだ表面を提供し、ここには疎水性の残基（Ｐｈｅ５５、Ｖａｌ６７、Ｌｅｕ７６、及びＡｌａ７８）が露出されている。ここに、系統的に保存されているＬｅｕ７３、Ｍｅｔ７４、Ｉｌｅ７７及びＬｅｕ８０残基を提示する両性のＨ４ヘリックスとの間でかなり多くの分子間ファンデアワールス相互作用が存在する（図１Ａ及び図５Ｃ参照）。広範囲にわたる疎水性相互作用に加えて、Ｈ３ヘリックス上のＳｅｒ５６及びＴｈｒ６０の側鎖はＳ２−Ｓ３ループ中の主鎖の残基と水素結合を形成する。Ｈ３＃ヘリックスはＨ３ヘリックスを安定化するだけでなくＹｏｅＢとの結合にも寄与している（図５Ａ及び図５Ｂ）。Ｔｙｒ６２＃残基はＹｏｅＢｎｏＨｉｓ５０及びＡｓｎ５１の側鎖と相互作用する（図５Ｂ参照）。
【００５７】
ＹｅｆＭのＣ末端領域の残りは、ＹｏｅＢの背後を横切り、広範囲で接触する伸長したβ−鎖となっている（隠された溶媒排除面積＝１０００Å２、図５Ｄ）。ＹｅｆＭのＨ４ヘリックスの８６〜８８番目の残基は、連続したβ−鎖を形成するＹｏｅＢのＳ１β−鎖と隣接する。ＹｏｅＢの背面表面は３つのＮ末端二次構造（Ｓ１、Ｈ１及びＨ２）によって構成される（図５Ｄ）。疎水性残基（Ｌｅｕ３、Ｉｌｅ４、Ｔｒｐ５、Ｔｒｐ１０及びＴｙｒ１３）はこの領域の中心に位置し、塩基性残基（Ｌｙｓ２、Ｌｙｓ２１、Ｌｙｓ２５、Ｌｙｓ３２及びＡｒｇ３５、図４Ｅ）に囲まれている。ＹｅｆＭのＩｌｅ９０及びＩｌｅ９１の側鎖がこの疎水性パッチをファンデアワールス接触により相補し、酸性残基（Ｃ末端のカルボキシル基と共にＧｌｕ８７、Ａｓｐ８９及びＧｌｕ９２）が水素結合及び塩橋によりこれらの塩基性を中和している（図５Ｄ）。
【００５８】
[ＹｏｅＢのＣ末端尾部の立体配座の変化]
ＹｅｆＭ非結合ＹｏｅＢ構造の決定によって、ＹｅｆＭとの結合によりＹｏｅＢのＣ末端の３つの残基の機能的な立体配座の変化が明らかとなった。図６Ａは、ＹｅｆＭと結合したＹｏｅＢ活性中心の立体配座を示したものである。３つの残基のペプチド領域は、リボヌクレアーゼＳａなどの微生物リボヌクレアーゼの活性中心に見られる立体配座へと明らかに変化している（図３Ａ）。この３つのＣ末端アミノ酸を除けば、イソプロパノール及びＰＥＧ結晶の両方から得られたＹｅｆＭ非結合ＹｏｅＢ構造は基本的にＹｅｆＭ結合型と同一である（平均ｒｍｓｄ＝０．６７Å、１〜８１番目のα−炭素対、ｎ＝１０分子）。
【００５９】
図６Ｂは、ＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢの立体配座を示す。ＹｅｆＭの構造をＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢ構造と重ね合わせると、ＹｏｅＢのＨｉｓ８３のイミダゾール基とＹｏｅＢのＣ末端のＴｙｒ８４の位置が、それぞれＹｅｆＭのＴｙｒ６２の側鎖及びＨ４ヘリックスによって占められていることが分かる（図６Ｂ）。ＹｅｆＭ非存在下ではＹｏｅＢのＴｙｒ８２の側鎖はＡｒｇ８１の側鎖の近くに並置しており、Ｔｙｒ１５によって支持されている（図６Ｂ）。複合体の構造中では、ＹｏｅＢのＴｙｒ８２の位置がＹｏｅＢのＨｉｓ８３残基に向けて変化し、Ｈｉｓ８３は反対側へ移動している（図６Ａ）。その結果、ＹｏｅＢのＴｙｒ８２がＹｅｆＭのＴｙｒ６２の芳香環と積層する。このチロシン残基の積層は、それぞれの水酸基と相手方の主鎖のカルボニル基との２つの水素結合によって安定化される（ＯＨ／Ｔｙｒ８２／ＹｏｅＢとＯ／Ｔｙｒ６２／ＹｅｆＭ、及びＯＨ／Ｔｙｒ６２／ＹｅｆＭとＯ／Ｇｌｕ６３／ＹｏｅＢ）（図６Ａ）。この積層する相互作用下において、ＹｅｆＭのＧｌｕ５９の側鎖はＹｏｅＢのＡｒｇ６５の側鎖と対をなす水素結合を形成し、その結果三層構造が形成される（図４Ｃ、４Ｄ及び６Ａ参照）。微生物リボヌクレアーゼにおいてこの位置（Ａｒｇ６５）に相当するアルギニン残基は反応性のヌクレオチドリン酸基との結合に決定的に重要である。興味深いことに、系統発生学的に保存されたＹｅｆＭのＧｌｕ５９残基は該リン酸基を擬態しているように思われる（図６Ａ）。Ｇｌｕ５９の導入と安定化の結果、触媒反応の一般的塩基候補である近傍のＹｏｅＢのＧｌｕ４６残基が立体的な反発により立体配座の変化を強いられる（図３Ａ）。
【００６０】
反転したＹｏｅＢのＨｉｓ８３側鎖は、ＹｏｅＢファミリーの中で高度に保存されているＡｓｐ１２と水素結合を形成する（図６Ａ）。Ｈｉｓ８３のイミダゾール環はＹｅｆＭのＡｒｇ７２のグアニジウム基とＹｏｅＢのＡｒｇ８１の脂肪族部分の間に挟まれている。Ａｒｇ８１のグアニジウム基は近傍のＹｏｅＢのＴｙｒ１５と積層し、少し曲がった４層構造となって安定化する（図４Ｃ、４Ｄ及び６Ａ）。ＹｏｅＢの表面には反転したＨｉｓ８３がＹｅｆＭアンチトキシンと相互作用して安定化するための空間がある。ＹｏｅＢのＨｉｓ８３の主鎖は、ＹｅｆＭのＨ３とＨ４ヘリックスの間の連結部につながれ、Ｈｉｓ８３のアミノ基及びカルボニル基は、それぞれＹｅｆＭのＡｓｎ６９及びＳｅｒ６６の側鎖と水素結合する（図６Ａ）。
【００６１】
複合体中においては、ＹｏｅＢのＣ末端Ｔｙｒ８４は溶媒中に突き出し、Ｔｙｒ８２の端近くに存在して、ＹｅｆＭと接触することなくＹｏｅＢのＧｌｕ６３側鎖と水素結合している（図６Ａ）。ＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢの構造は、Ａｒｇ８１のカルボニル基、並びにＧｌｕ８、Ａｓｐ１２及びＣ末端のカルボキシル基により構成されるＣ末端の背面の極めて負電荷なポケットを形成する（図４Ｄ）。ＰＥＧ結晶型からのＹｏｅＢ構造は、このポケットに６水和マグネシウムイオンを有し、酸性の環境を中和している（図６Ｂ）。複合体型では、ＹｅｆＭのＡｒｇ７２とＹｏｅＢのＨｉｓ８３がこのポケットの酸性電荷を相補しているため（図４Ｃ及び４Ｄ）、この負に荷電した環境もヘテロ３量体形成によって誘導される立体配座の変化に寄与していることが示唆される。従って、ＹｏｅＢによる安定化とＹｏｅＢ触媒部位の直接的障害の組み合わされた効果が、この複合体の構造を支持しており、これらの分子機構は該トキシン−アンチトキシンファミリーの間で保存されていることを示唆する。
【００６２】
[生化学的方法を用いたＹｅｆＭ及びＹｏｅＢタンパク質の結合と毒性抑制の相関に関する解析]
ＹｅｆＭのＣ末端領域へのＹｏｅＢ結合を生化学的に解析するために、野生型ＹｏｅＢとＧＳＴ融合ＹｅｆＭ欠質変異体を用いてＧＳＴ−プルダウンアッセイと毒性抑制テストを行った（図７Ａ及び７Ｂ参照）。すなわち、野生型及び切断型変異体をコードするｙｅｆＭのＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＥＸ−６ｐ−１（アマシャム社）にサブクローン化し、塩基配列を確認した。これらのＧＳＴ−ＹｅｆＭ融合タンパク質及びＧＳＴを大腸菌ＢＬ２１株で発現させ、グルタチオンセファロースで精製した。１５μｌ容量の樹脂に固定化された各ＧＳＴ融合タンパク質は、５０μｌの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５，２５０ｍＭのＮａＣｌ）中で、リフォールドされたＹｏｅＢ（１００μｇ）を加え平衡化し、４℃で１時間インキュベートし、同緩衝液で３回洗浄した。樹脂に結合したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルー染色で可視化した（図７Ｂ、レーン１：ＹｏｅＢ無添加のＧＳＴ、レーン２：ＹｏｅＢ添加のＧＳＴ、レーン３〜１２：各レーンの上部に表示したように、ＧＳＴと融合した野生型及び切断型ＹｅｆＭ変異体にＧＳＴを添加したもの）。
【００６３】
ＹｏｅＢの毒性テストのために、ＰＣＲにより作製したｙｏｅＢ変異体の全ての構築物をｐＥＴ−１１ａベクター（ノバジェン社）にクローン化した。作製した種々のプラスミドを２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にてＢＬ２１株及びＢＬ２１（ＤＥ３）株へ形質転換した。切断型ｙｅｆＭ変異体を用いた抑制試験のために、野生型ｙｏｅＢ遺伝子をｐＡＣＹＣベクター（Ｐ１５Ａオリジン）のＴ７プロモータの制御下に再クローン化した。２つのプラスミド、すなわち、ｐＡＣＹＣ中の野生型ｙｏｅＢと、ｐＧＥＸ−６ｐ−１中の野生型又は変異体ｙｅｆＭを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上にてＢＬ２１株へ同時形質転換した。３７℃にて１２時間インキュベートし、生存度を評価した。図７Ａは、Ｎ末端にＧＳＴ−タグを融合させた野生型及び切断型ＹｅｆＭの模式図と、ｙｏｅＢとの同時形質転換による生存度を○又は×で示したものである。同時形質転換により生存するもの（○印）は、ＹｏｅＢの毒性を抑制すると考えられる。
【００６４】
ＹｅｆＭのＣ末端領域はＹｏｅＢと結合し（図７Ｂのレーン１０参照）、ＹｏｅＢの毒性を抑制した（図７Ａ）。一方、ＹｅｆＭのＮ末端側の断片は、ＹｏｅＢと結合せず（図７Ｂ、レーン５及び６参照）、またＹｏｅＢの毒性も抑制しなかった。ＹｅｆＭのＨ４ヘリックス（６７〜８３番目のアミノ酸残基）はＹｏｅＢに対する弱い親和性を示したが（図７Ｂ，レーン１２、野生型の４５％）、ＹｏｅＢの毒性は抑制しなかった（図７Ａ参照）。しかしながら、Ｈ４ヘリックスを含むＣ末端側領域のより大きな断片はＹｏｅＢと結合し、ＹｏｅＢの毒性中和に十分であった（図７Ａ、図７Ｂ、レーン９及び１１参照）。興味深いことに、ＹｅｆＭ７３ＣについてはＹｏｅＢとの結合もコロニーの形成も検出できなかった（図７Ｂ、レーン８）。これは、Ｈ４ヘリックスの６７〜７３番目のアミノ酸残基がＹｏｅＢとの結合及び毒性抑制に必須であることを示唆する。これらの知見は、ＹｅｆＭのＨ３ヘリックスからＨ４ヘリックスまでのＬ型ターンがＹｏｅＢの活性部位と直接結合しているという複合体の構造と一致している。
【００６５】
[ＹｏｅＢのリボヌクレアーゼ活性及び基質特異性]
試験管内におけるＹｏｅＢのリボヌクレアーゼ活性及びＹｅｆＭによるその阻害は、次のようにして測定した。Ｔ７プロモータとｙｅｆＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅によって得た。ｙｅｆＭのｍＲＮＡはT7-MEGAshortscriptキット（アンビオン社）を用いて試験管内で合成した。消化反応混合液（１０μｌ）は、約３５０塩基のｙｅｆＭｍＲＮＡ基質３２０ｎｇと、異なる量のＹｏｅＢ及び／又はＹｅｆＭと、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）とを含む。反応は、３７℃で１時間行い、１０μｌのシークエンシングロードバッファーを添加することによって停止した。サンプルを９５℃で３分間インキュベートした後、ＴＢＥバッファーと共に２μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１．２％未変性アガロースゲルで電気泳動を行った。図７Ｃのレーン１は対照；レーン２〜４は、ＲＮＡとそれぞれ５、２．５又は１μＭのＹｏｅＢ；レーン５はＲＮＡと１μＭのＹｅｆＭ；レーン６〜８はＲＮＡと１μＭのＹｏｅＢと、それぞれ１、２又は３μＭのＹｅｆＭとをインキュベートしたものである。図７Ｃに示したように、試験管内で合成されたＲＮＡは折りたたまれたＹｏｅＢとインキュベートすることによってより小さな断片に分解された（レーン２〜４）が、等モル量のＹｅｆＭ（１０〜９２アミノ酸残基）の添加によりＲＮＡの分解がほとんど阻害された（図７Ｃ、レーン６〜８）。ＹｅｆＭ単独ではＲＮＡ分解に影響なく（図７Ｃ、レーン５）、また、Ｍｇ２＋の存在も活性に影響を与えなかった。これらの結果は、ＹｏｅＢは細胞質におけるリボヌクレアーゼであり、ＹｅｆＭはＹｏｅＢのリボヌクレアーゼ活性を阻害するアンチトキシンとして作用することを示している。
【００６６】
ＹｏｅＢの酵素活性に必須な残基を同定するために、上記結晶構造に基づいて部位特異的変位導入を行った。ＹｏｅＢの毒性がそのリボヌクレアーゼ活性と関連しているならば、酵素活性を減弱する変異体は形質転換大腸菌株の生存度を評価することによって確認できるであろう。その結果、ＹｏｅＢの毒性にとってＧｌｕ４６、Ａｒｇ６５、Ｈｉｓ８３及びＴｙｒ８４残基が必要であることが分かった。５つの変異体酵素のリボヌクレアーゼ活性を測定したところ、Ｒ６５Ａ及びＨ８３Ｑ変異体は完全にリボヌクレアーゼ活性を消失していた（図７Ｄ、レーン５〜８）。この表現型及び立体構造上の特性から考えて、Ａｒｇ６５はリン酸基との結合に関与し、Ｈｉｓ８３は触媒反応における一般的酸として機能しているであろう。Ｙ８４Ｆ及びＹ８４Ａ変異体は、リボヌクレアーゼ活性がそれぞれ減弱及び消失しており（図７Ｄ、レーン９〜１２）、ＹｏｅＢの末端残基が触媒機構に必須であることを示す。Ｅ４６Ａ変異体は低い活性を保持するが、Ｇｌｕ４６はおそらく反応の一般的塩基として作用する（図７Ｄ、レーン３及び４）。他のリボヌクレアーゼについての変位導入実験においても、この一般的塩基の他のアミノ酸への置換は低い活性を保持することが報告されており、この反応の第一段階であるプロトン脱離反応は隣接する残基によって部分的に代替されると思われる。
【００６７】
ＹｏｅＢがＲＮＡを切断する正確な配列を決定するために、ＹｏｅＢにより分解されたｍＲＮＡを用いてプライマー伸長実験を行った（図７Ｅ及び７Ｆ）。切断は、主としてアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）ヌクレオチドの３’末端側で起こった。アデニンがグアニンに優先して認識された。ｙｅｆＭのｍＲＮＡ中のＡＧに富む配列（ＳＤ様配列）は特に感受性が高かった（図７Ｆ）。これらの結果より、ＹｏｅＢは試験管内においてプリン塩基特異的なエンドヌクレアーゼであることが結論付けられた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＹｅｆＭ及びＹｏｅＢファミリーのアンチトキシン（Ａ）及びトキシン（Ｂ）のアミノ酸配列の並列化（アライメント）を示す。
【図２】ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ３量体複合体の立体構造を示すリボンモデル図である。
【図３】ＹｏｅＢ及びその類似タンパク質の立体構造を示すモデル図である。
【図４】ＹｅｆＭ及びＹｏｅＢの表面特性を示すモデル図である。
【図５】ＹｅｆＭとＹｏｅＢの間のタンパク質−タンパク質相互作用を示すモデル図である。
【図６】ＹｏｅＢ活性部位のコンフォメーション変化を示すモデル図である。（Ａ）ＹｅｆＭ結合型構造（Ｂ）ＹｅｆＭ非結合型構造。黒と灰色で示したＹｅｆＭは比較のために示した。（Ｃ）ＲＮＡが切断されるときの活性部位のモデル図。
【図７】ＹｏｅＢのヌクレアーゼ活性及びＹｅｆＭの阻害作用を示す模式図及び実験結果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の細胞死に関与する因子を用いる抗生物質のスクリーニング方法に関し、より詳細には、トキシン及びアンチトキシン複合体の形成を指標とする抗生物質のスクリーニング方法及びこれに用いるポリペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
真正細菌及び古細菌は、トキシン−アンチトキシンタンパク質の対をコードする遺伝的因子を有し、これは中毒モジュール(addiction module)として知られている。当初は、低コピープラスミドの維持システムのように、プラスミドの脱落に伴う細胞死をコントロールするものとして提唱された。この機構は、１つのオペロンにコードされている不安定なアンチトキシンタンパク質と、安定なトキシンタンパク質に依存する。プラスミドを保持する細胞内では、アンチトキシンはトキシンと安定な複合体を形成することによってトキシンの毒性を中和している。プラスミドが脱落すると構造的に不安定なアンチトキシンが宿主プロテアーゼによって分解され、宿主細菌はトキシンの細胞毒性によって細胞死に至る。最近の報告では潜在的な細菌染色体の中毒モジュールは、利他的な自殺因子としてよりもむしろ栄養的及び／又は環境的ストレスにさらされたときに細胞全体的な翻訳レベルを調節する機能を有することが示されている。しかしながら別の報告では、大腸菌やその他の病原性細菌の染色体に存在するｍａｚＥＦシステムによって、いくつかの抗生物質がこの自殺システムを介して間接的に細胞死を起こすことが知られている。これらの抗生物質は、例えば、転写や翻訳の阻害剤、及びチミンの欠乏を引き起こす葉酸代謝阻害剤である（例えば、非特許文献１参照）。また菌血症や重大な院内感染を引き起こす多くの腸球菌は、多剤薬剤耐性を有することが知られているが、この多剤薬剤耐性を維持するプラスミドｐＲＵＭの安定性は、Ｔｘｅ−Ａｘｅというトキシン−アンチトキシンによって調節されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
ゲノム解析の結果によれば、大腸菌染色体はトキシンの配列類似性に基づいて現在までに６種類の独立したアンチトキシン−トキシン対を有する。１つのクラスは、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ及びＣｈｐＢＩ−ＣｈｐＢＫ対からなり、第二のクラスは、ＲｅｌＢ−ＲｅｌＥ、ＤｉｎＪ−ＹａｆＱ及びＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ対を含む。ＹａｆＮ−ＹａｆＱの潜在的な中毒モジュールは第三のクラスを構成することが示唆されている。これらの染色体トキシンのうち、ＲｅｌＥとＭａｚＦが広範に調べられている。ＲｅｌＥはコドン依存的なエンド型リボヌクレアーゼであり、リボソームのＡ−部位と相互作用して活性を示す。あるいは、リボソームの内因性エンドヌクレアーゼ活性刺激因子として働く。このトキシンは、真核生物のナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊(nonsense-mediated mRNA decay)のような遺伝子発現の品質管理に関与しているのかもしれない。ＭａｚＦは、ＡＣＡ配列特異的なエンドリボヌクレアーゼであって、リボソームとは独立して働く。しかしながら、ＭａｚＦがＲｅｌＥのようにリボソームのＡ−部位で作用することを示唆するデータもある。
【０００４】
Ｘ線結晶構造解析によって得られた大腸菌のＭａｚＦ−ＭａｚＥ及びシュードモナス・ホリコシのＲｅｌＥ−ＲｅｌＢの２つのシステム由来のトキシン−アンチトキシン対の構造を調べると、それぞれのトキシン−アンチトキシン複合体の各構成因子は、構造的に類似しておらず、また形成するオリゴマーの数も異なることが見出された。ＭａｚＦトキシンは２量体を形成し、構造的にＫｉｄやＣｃｄＢプラスミドトキシンと類似する。これらの２量体はＭａｚＥアンチトキシンとヘテロ６量体を形成する（ＭａｚＦ２−ＭａｚＥ２−ＭａｚＦ２）。ＭａｚＥアンチトキシンはその保存されたトリプトファン残基を用いて、ＭａｚＦトキシンの活性中心と相互作用することで、ＲＮＡ基質の接近を阻止すると思われる。一方、ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ複合体は２つのヘテロ２量体からなる４量体（ＲｅｌＥ−ＲｅｌＢ）２を形成する。非球状構造のＲｅｌＢは、ＲｅｌＥ表面の機能的に重要なアルギニン残基のクラスターを覆い隠している。
【０００５】
大腸菌染色体上のＹｅｆＭ−ＹｏｅＢアンチトキシン−トキシンモジュールは、腸球菌(Enterococcus faecium)のｐＲＵＭ多剤耐性プラスミド上に存在するＡｘｅ（アンチトキシン）−Ｔｘｅ（トキシン）対との相同性に基づいて同定されたものである（非特許文献２参照）。他の中毒モジュールと同様に、ＹｏｅＢトキシンは塩基性タンパク質（１０ｋＤａ）であり、一方、ＹｅｆＭアンチトキシンは構造的に折りたたまれていない酸性タンパク質（１１ｋＤａ）であると報告されている。このｙｅｆＭ−ｙｏｅＢ遺伝子カセットは１つのアンチトキシン−トキシンモジュールとして機能する（例えば、非特許文献３参照）。ＹｏｅＢトキシンは、ｍＲＮＡを切断すること、さらに宿主のＡＴＰ依存性プロテアーゼであるＬｏｎの過剰発現がＹｏｅＢ依存的にｍＲＮＡの分解を活性化することからＬｏｎプロテアーゼによるＹｅｆＭの分解がＹｏｅＢを活性化すると考えられる（例えば、非特許文献４参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Engelberg-Kulka, H. et al., Trends Microbiol. (2004) Vol.12, pp.66-71
【非特許文献２】Grady, R., and Hayes, F., Mol Microbiol. (2003) Vol. 47, pp.1419-1432
【非特許文献３】Cherny, I., and Gazit, E., J. Biol. Chem. (2004) Vol.279, pp.8252-8261
【非特許文献４】Christensen, S.K. et al., Mol. Microbiol. (2004) Vol.51, pp.1705-1717
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、多くのトキシン−アンチトキシン複合体の結合様式は未だ明らかでないため、アンチトキシンがどのようにトキシンの毒性を抑制しているのかは不明である。本発明は、かかるトキシン−アンチトキシン複合体の立体構造を解析することによって、アンチトキシンによるトキシンの毒性抑制機構を明らかにし、これらの知見に基づいて細菌の増殖を阻害しうる抗生物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、トキシン−アンチトキシンの１つである大腸菌のＹｏｅＢ−ＹｅｆＭタンパク質の立体構造を解析することにより、ＹｏｅＢトキシンは、非典型的なリボヌクレアーゼの構造を示し、アンチトキシンであるＹｅｆＭと結合することによって推定活性中心の立体配座の変化を引き起こすことを見出した。また、ＹｅｆＭアンチトキシンのＣ末端側の２つのα−ヘリックス領域がＹｏｅＢタンパク質との相互作用に関与し、特徴的なヘテロ三量体複合体を形成することも明らかにした。これらの知見及び構造的に類似するいくつかのトキシン−アンチトキシンの比較解析に基づいて、大腸菌のＹｏｅＢ−ＹｅｆＭファミリーに属する中毒モジュールを用いた新規な抗生物質のスクリーニング方法が提供される。
【０００９】
すなわち、本発明の抗生物質のスクリーニング方法は、細菌の染色体又はプラスミドＤＮＡにコードされたトキシン及びアンチトキシンタンパク質と、候補化合物とを接触させて、トキシン−アンチトキシン複合体が形成されるか否かを検出することを含み、前記複合体の形成を阻害する候補化合物が、前記細菌の増殖阻害剤であることを示唆することを特徴とする。前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質は、ＭａｚＥ−ＭａｚＦファミリー、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢファミリー、又はＹａｆＮ−ＹａｆＱファミリーから選択される一対の中毒モジュールタンパク質であることが好ましい。さらに好ましくは、前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質は、それぞれ大腸菌のＹｏｅＢ及びＹｅｆＭタンパク質、若しくはその相同体、又はその誘導体である。また、好ましい実施形態において、前記相同体には、シュードモナス・フルオレッセンスのＰｆｌ−Ｋ及びＰｆｌ−Ｉ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡｔｕ−Ｋ及びＡｔｕ−Ｉ、エンテロコッカス・ファシエンスｐＲＵＭプラスミド由来のＴｘｅ及びＡｘｅ、ミコバクテリウム・ツベルキュロシスのＭｔｕ−Ｋ及びＭｔｕ−Ｉ、シュードモナス・プチダのＰｐｕ−Ｋ及びＰｐｕ−Ｉ、並びにスタフィロコッカス・オーレオスのＳａｕ−Ｋ及びＳａｕ−Ｉ等のタンパク質対が含まれることを特徴とする。
【００１０】
別の観点において、本発明の抗生物質のスクリーニング方法は、（ａ）細菌のトキシン及び／又はアンチトキシンの三次元立体構造座標を用意し、前記トキシン及び／又はアンチトキシンの三次元立体構造又はその部分を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、（ｂ）前記三次元立体構造に基づいて、前記トキシン又はアンチトキシンに結合する候補化合物を設計又は選択する工程、（ｃ）前記設計又は選択された候補化合物を合成又は取得する工程、及び（ｄ）前記候補化合物が前記トキシン−アンチトキシン複合体の形成を阻害するか否かを調べるために前記候補化合物と前記トキシン及びアンチトキシンとを接触させる工程、を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明はさらに異なる観点において、配列番号１に示したアミノ酸配列の５１〜８３番目のアミノ酸残基からなる単離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドの１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ大腸菌のＹｏｅＢタンパク質と結合してリボヌクレアーゼ活性を阻害する作用を有するポリペプチド誘導体を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、従来の方法とは全く異なる観点からの抗生物質のスクリーニング方法を提供するものであり、新規な作用機構に基づく新規な抗生物質を提供することができる。現在、院内感染などの原因となっている多剤耐性菌の多くは、トキシン−アンチトキシン機構を用いて抗生物質耐性遺伝子をそのプラスミド上に維持保守しているため、本発明の方法により選択された抗生物質はこれらの多剤耐性菌を効果的に治療できる可能性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
[定義]
本明細書において、用語「トキシン(toxin)」、及び「アンチトキシン(antitoxin)」とは、細菌の染色体又はプラスミドＤＮＡにコードされたタンパク質からなる毒素、及び抗毒素のことを意味する。アンチトキシンは解毒剤(antidote)と呼ばれる場合もある。これらのタンパク質のアミノ酸配列、及びそれらをコードする遺伝子配列はすでに公知であり、例えば、アンチトキシンタンパク質としては、大腸菌のＹｅｆＭ（Swiss-ProtのACCESSION No.P69346、配列番号１）、シュードモナス・フルオレッセンスのＰｆｌ−Ｉ（配列番号２）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡｔｕ−Ｉ（配列番号３）、エンテロコッカス・ファシエンスｐＲＵＭプラスミド由来のＡｘｅ（配列番号４）、ミコバクテリウム・ツベルキュロシスのＭｔｕ−Ｉ（配列番号５）、シュードモナス・プチダのＰｐｕ−Ｉ（配列番号６）、スタフィロコッカス・オーレオスのＳａｕ−Ｉ（配列番号７）、サルモネラ・タイフィムリウムのＳｔｙ−Ｉ（配列番号８）及びエンテロバクテリアファージＰ１のＰｈｄ（配列番号９）等が挙げられる。トキシンタンパク質としては、大腸菌のＹｏｅＢ（Swiss-ProtのACCESSION No.P69348、配列番号１０）、シュードモナス・フルオレッセンスのＰｆｌ−Ｋ（配列番号１１）、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡｔｕ−Ｋ（配列番号１２）、エンテロコッカス・ファシエンスｐＲＵＭプラスミド由来のＴｘｅ（配列番号１３）、ミコバクテリウム・ツベルキュロシスのＭｔｕ−Ｋ（配列番号１４）、シュードモナス・プチダのＰｐｕ−Ｋ（配列番号１５）、スタフィロコッカス・オーレオスのＳａｕ−Ｋ（配列番号１６）、及び大腸菌のＥＹａｆＱ（配列番号１７）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
「相同体(homologue)」とは、１次構造又は立体構造に相同性のあるタンパク質群のことをいい、例えば、１次構造の相同性が少なくとも３０％、好ましくは５０％、より好ましくは７０％以上のタンパク質である。タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、当該配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。また、一次構造上の相同性が低くても、立体構造が高度に類似しているタンパク質も存在することが知られている。このようなタンパク質同士の立体構造の相同性は、例えば、ＤＡＬＩサーバを用いて検索することができる(Holm, L., and Sander, C., Nucl. Acids Res. (1998) Vol.26, pp.316-319参照)。
【００１５】
本明細書において、「誘導体(derivative)」とは、タンパク質の一部のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はポリペプチドであって、元のタンパク質と実質的に同一の機能を有するものをいう。
【００１６】
また、「抗生物質」とは、従来より微生物が産生し他の微生物の増殖を抑制する物質と定義されていたが、本明細書ではそのような天然物を起源とするものだけでなく全合成物をも含む。
【００１７】
[トキシン−アンチトキシン複合体の結晶化とＸ線結晶構造解析による立体構造の決定]
タンパク質の立体構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像を基に、該タンパク質の立体構造を明らかにしていくものである（Blundell, T.L.及びJohnson,L.N., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, p.1-565, (1976) Academic Press, New York）。
【００１８】
結晶化は、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加し、または溶媒量を蒸発等によって減少させる等の操作によって、タンパク質が溶液状態から非溶液状態になる場合において、ある特定の条件において結晶として析出する性質を利用している。結晶化には高純度に精製されたタンパク質が必要である。また、結晶化する条件として、タンパク質濃度、塩濃度、水素イオン濃度(ｐＨ)、添加する沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的な因子が関与している。さらには、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法として、バッチ法、透析法、蒸気拡散法などの結晶化の手法が数多く存在している（Blundell, T.L.及びJohnson,L.N., PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY, p.59-82, (1976) Academic Press, New York）。例えば、蒸気拡散法は、気相を通じて拡散によって揮発性の溶媒や沈殿剤が移動するようなしくみである。タンパク質溶液が沈殿剤溶液とのあいだで蒸気拡散することにより、タンパク質濃度と沈殿剤濃度が共に高まって過飽和の領域で結晶化が起こる。タンパク質溶液の液滴をどうつくるかによって、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法等の方法がある。このようにＸ線結晶解析に適したタンパク質の結晶を得るには、それぞれのタンパク質において、高純度のタンパク質を得ることと、結晶化における種々の因子や結晶化法を最適化する検討が必要になる。特に高純度のタンパク質の調製は結晶化を成功させるための重要な因子である。このために、クローン化した遺伝子を効率的かつ安定に発現させることにより迅速かつ均一なタンパク質を調製することが重要である。
【００１９】
このようにして得たトキシン−アンチトキシン複合体の結晶の構造を当業者に知られたＸ線結晶構造解析技術を用いて解析する。類縁タンパク質の立体構造が未知であり、その立体構造を利用した分子置換法による構造解析が不可能な本発明のような立体構造決定においては、重原子置換法又は多波長異常分散法(ＭＡＤ法)が適用され得る。本発明の一つの実施態様において、Ｘ線結晶解析は、ＭＡＤ法であり、これに用いられるＸ線は、シンクロトロン放射光から得られる０．３〜３．０Åの波長である。ＭＡＤ法は、入射Ｘ線エネルギー近傍の吸収端をもつ重原子同型置換結晶から、複数の波長によるＸ線回折データを得る方法である。Ｘ線と該重原子の電子殻のエネルギーによる干渉によって、そのＸ線の散乱に差を生じ、これによってタンパク質の構造解析に必須な位相問題を解決することができる。この方法の原理はすでに古くから知られていたが、波長可変であるシンクロトロン放射光の出現によって始めてタンパク質の構造決定に使用されるようになり、ヘンドリクソンらがこの方法によって初めてタンパク質の構造解析に成功した（Hendrickson W.A. et al., Proteins 4, 77-88, 1988及び、Hendrickson W.A. et al., EMBO J.5, 1665-1672, 1990参照）。
【００２０】
シンクロトロン放射光とは、蓄積リングに打ち込まれた電子を磁場によって加速して得られる放射光であり、通常のＸ線発生装置よりも極めて強いエネルギーを有する。理研播磨研究所の第三世代大型放射光設備 ＳＰｒｉｎｇ−８（８ＧｅＶ）等が使用可能である。
【００２１】
測定した回折画像データは、プログラムＨＫＬ２０００（HKL corporation）又は同様な画像処理プログラムを用いて、反射強度データに処理される。天然型結晶の反射強度データ、複数波長での重原子置換結晶の反射強度データから、上述のＭＡＤ法によりタンパク質に結合した重原子の位置を、ＳＯＬＶＥ、ＳＨＡＲＰ若しくはＣＣＰ４又は同様の回折データ解析プログラムを用いて、決定及び精密化することにより初期位相が決定される。決定された初期位相は、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ）、ＲＥＳＯＬＶＥ又は同様な位相改良プログラム（電子密度改良プログラム）を用いた溶媒平滑化法に従って、信頼性の高い位相へと改良される。
【００２２】
トキシン−アンチトキシン複合体の立体構造モデルは、プログラムＯやＡＲＰ／ｗＡＲＰ等により３次元グラフィックス上に表示した電子密度図から、以下の手順で構築し得る。まず、一般にはらせん構造をしている電子密度を選び出し、その部分から主鎖（ポリペプチド鎖）を置いていき、そこから順次主鎖を伸ばしていく。ある程度主鎖の同定を進めたところで、側鎖の同定も同時に行う。アミノ酸配列と側鎖に相当する電子密度を照らし合わせることによって、アミノ酸番号を同定する。セレノメチオニン置換タンパク質を用いた多波長異常分散法の場合、セレンの位置、すなわちメチオニンの位置が既に明らかになっているので、アミノ酸配列と照らし合わせることで、簡単にどのメチオニンかを同定することができる。順次この作業を繰り返すことにより、トキシン−アンチトキシン複合体のすべてのアミノ酸残基を相当する電子密度に適合させ、複合体全体の初期立体構造モデルを構築する。構築された立体構造モデルは、それを出発モデル構造として、構造精密化プログラムであるＣＮＳやＲＥＦＭＡＣ等の精密化プロトコルに従って、立体構造を記述する三次元座標が精密化される。精密化の進行状況や分子モデルのチェックは、以下の指標により確認することができる。信頼度因子（Ｒ因子）は、回折強度測定で得られた結晶構造因子の絶対値と分子モデルから計算した結晶構造因子の絶対値の一致度を示す尺度であり、精密化が正常に進行すると小さな値となる。また、タンパク質の主鎖の二面角を計算しそれらをプロットしてそれらの値が許容される領域にあるかどうかを確認する方法（ラマチャンドランプロット）も用いられる。
【００２３】
このようにして本発明にかかるトキシン−アンチトキシン複合体の３次元原子座標（各原子の空間的な位置関係を示す値）が得られる。１つの実施形態として得られた大腸菌のＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体、及びＹｏｅＢ単独の原子座標は、プロテインデータバンク（PDB, Protein Data Bank, The Research Collaboratory for Structual Bioinformatics (RCSB)が運営、http://www.rcsb.org/pdb/参照）に複合体：２Ａ６Ｑ、ＹｏｅＢ（ＰＥＧ）：２Ａ６Ｒ、及びＹｏｅＢ（イソプロパノール）：２Ａ６ＳなるＩＤコードとして登録(deposit)され、本明細書中でこのデータを援用する。なお、これらの原子座標は、本発明者らにより２００５年７月４日にＰＤＢに仮登録されており、本願出願時においては未公開である。
【００２４】
[トキシン−アンチトキシン複合体の立体構造モデルを表示するコンピュータシステム]
本発明によるトキシン−アンチトキシン複合体の結晶から得られる原子座標を、分子の３次元構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はそのコンピュータの記憶媒体に入力することで、トキシン−アンチトキシン複合体の３次元的な構造を詳細に表現することが可能になる。
【００２５】
コンピュータの記憶媒体としては、トキシン−アンチトキシン複合体の原子座標をコンピュータの該プログラム上に導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フレキシブルディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープ等の半永久的な記憶媒体でも良い。
【００２６】
上記メモリ又は記憶媒体と電気的に連絡するプロセッサによってトキシン−アンチトキシン複合体の少なくとも一部を表す三次元立体構造モデルが生成される。このようなプロセッサ（プログラム）としては、ＱＵＡＮＴＡ(Molecular Simulations社)、ＳＹＢＹＬ(Molecular Modeling Software社)、等が利用できる。この際に用いられるコンピュータは、例えば、シリコングラフィックス社によって供給されているワークステーションＯＣＴＡＮＥ等が好適であるが、これに限定されるものではなく、適当なプログラムが動作するように調整されているコンピュータであればよい。
【００２７】
[立体構造モデルを用いた抗生物質のスクリーニング]
本発明が提供するトキシン及びアンチトキシンタンパク質又はそれらの複合体の原子座標のすべて又は一部を、分子の立体構造を表現するコンピュータ・プログラムが動作するコンピュータ又はその記憶媒体に入力することで、トキシン又はアンチトキシンの何れかと結合し、複合体の形成を阻害する化合物を同定、検索、評価又は設計することが可能となる。化合物は、天然物化合物、合成化合物の何れでもよく、高分子化合物、低分子化合物の何れでもよい。
【００２８】
このような方法は、まず候補化合物と、トキシン及びアンチトキシンタンパク質又はそれらの複合体とをコンピュータモデルにより表示し、視覚的観察によりトキシン又はアンチトキシンタンパク質の特定の部位に良く適合する形状又は化学構造をもつ結合化合物（リード化合物）を見つけ出す段階が含まれる。分子モデルを作成、表示するためには、前記ＱＵＡＮＴＡやＳＹＢＹＬ等のプログラムが利用できる。更に、トキシン又はアンチトキシンタンパク質の特定の部位との親和性、反発力、及び立体的障害等を推定するための種々のコンピュータプログラムが使用できる。これらのプログラムの例としては、例えば、生体高分子についてエネルギー的に好適な結合部位を決定するためのＧＲＩＤ(Goodford, P. J., (1985) J. Med. Chem., 28, p.849-857)、機能的結合部位を探索するためのＭＣＳＳ(Miranker, A., et al., (1991) Proteins: Structure, Function and Genetics, 11, p.29-34)、あるいは高分子とリガンドとの相互作用を幾何学的に解析し、自動的にドッキングさせるＡＵＴＯＤＯＣＫ(Goodsell, D. S., et al., (1990) PROTEINS: Structure, Function and Genetics,8, 195-202)、及びＤＯＣＫ(Kuntz, I.D., et al., (1982) J. Mol. Biol. 161, 269-288)等が挙げられる。
【００２９】
[トキシン−アンチトキシン複合体形成を指標とする抗生物質のスクリーニング]
本発明の抗生物質のスクリーニング方法は、トキシン及びアンチトキシンタンパク質のそれぞれ特定の領域が結合（相互作用）して複合体を形成することによってトキシンタンパク質のリボヌクレアーゼ活性を抑制すること、及びこの複合体の形成を阻害することによって細菌細胞内でのトキシンタンパク質の毒性が発現され、細菌の増殖を抑制又は細胞死を引き起こすという知見に基づくものである。すなわち、トキシンとアンチトキシンとの結合を阻害する化合物は細菌の増殖を抑制する抗生物質として利用することができる。
【００３０】
従って、１つの実施形態として、本発明の抗生物質のスクリーニング方法は、細菌のトキシン及びアンチトキシンタンパク質と、候補化合物とを接触させて、前記トキシン−アンチトキシン複合体が形成されるか否かを検出することを含み、前記複合体の形成を阻害する候補化合物が、前記細菌の増殖阻害剤であることが示唆される。候補化合物とは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、多糖、脂質、又はその他の有機化合物若しくは無機化合物でありうる。これらは化学合成された化合物ライブラリー又は細菌、カビ、放線菌などの培養物中の化合物からなる生物学的混合物であっても良い。
【００３１】
本実施形態において使用するトキシン及びアンチトキシンタンパク質は、例えば、図１に示したＹｅｆＭ−ＹｏｅＢファミリーに属する典型的なアンチトキシン（Ａ）及びトキシンタンパク質（Ｂ）である。図１には、これらのアミノ酸配列を並列化して示すと共に、（Ａ）にはＹｅｆＭの２つの単量体の、（Ｂ）にはＹｏｅＢのそれぞれの二次構造を模式的に示した。配列上部の長方形はα−ヘリックス構造を、矢印はβ−シート構造を、実線はランダムコイル構造を、そして破線は無秩序な領域を示す。その下に薄い青色で示した「ｘ」は、ＹｅｆＭとＹｏｅＢとの結合に関与するアミノ酸残基であり、配列の上部に示した「ｄ」は、それぞれのタンパク質の２量体化に関与するアミノ酸残基である。
【００３２】
さらに、本実施形態におけるトキシン−アンチトキシン複合体は、複合体の形成に関与する結合領域を含み、その他のタンパク質やポリペプチドとの融合タンパク質であってもよい。好ましい実施形態において、当該融合タンパク質は、タグペプチド及び／又はレポータータンパク質等を含む。本明細書において、タグペプチドとは、トキシン又はアンチトキシンタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加されたアミノ酸配列であって、該融合タンパク質をアフィニティー精製したり、ウエスタンブロッティング検出する場合の手がかりとなる配列である。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴｒｘＡ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Streptag（商品名））、及びヒスチジンタグ等が挙げられる。
【００３３】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、可溶性の酵素タンパク質であって、この遺伝子配列の下流にフレームを合わせて目的遺伝子を組み込むとＧＳＴとの融合タンパク質として発現させることができる。このための組換えベクターｐＧＥＸはアマシャムファルマシアバイオテック社から市販されている。ＧＳＴのタンパク質部分を特異的に認識する抗体や、グルタチオンと結合する性質を利用してアフィニティー精製や酵素免疫染色に利用されている。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、大腸菌のマルトース結合タンパク質であり、ＭＢＰとの融合タンパク質はアミロースやアガロースゲルに吸着させた後、過剰のマルトースで遊離して精製できる。また、抗ＭＢＰ抗体を使用することもできる。チオレドキシン（ＴｒｘＡ）は、酸化還元反応を触媒する大腸菌のタンパク質であり、機能性の一対のチオール基によって金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。このための担体として、例えばThioBond（商品名）Resin(Invitorogen社製)等が市販されている。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）はClostridium cellulovoransとCellulomonas fimi由来のセルロース結合ドメイン配列で、セルロースに特異的に結合する性質を有し、セルロースやキチンなどの不活性な担体に化学的な修飾を行うことなく固定させることができる。ストレプトアビジン結合ペプチドとして、例えば、Strep-tagIIと呼ばれる８個のアミノ酸からなるペプチドが知られており、StrepTactin（商品名）やStreptavidine（商品名）に選択的に結合させて精製することができる。ヒスチジンタグは、連続した又は近傍に配された少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチドが好ましい。ヒスチジンタグは、二価の金属原子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティーマトリックスにしっかりと結合し、容易に精製することができる。
【００３４】
本発明において用いられるレポータータンパク質は、融合タンパク質として検出が容易なものであれば特に限定されるものではないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等を挙げることができる。
【００３５】
トキシンとアンチトキシンが複合体を形成するか否かを検出するための１つの実施形態として、プルダウンアッセイがある。この方法は、まず、候補化合物の存在下においてトキシンタンパク質とアンチトキシンタンパク質とを接触させる工程である。これらの混合物は、通常は生体内に近い条件、例えば、２０〜４０℃で５分〜数時間、好ましくは１０分〜１時間程度インキュベートする。次に、トキシンタンパク質、及びアンチトキシンタンパク質の何れかを固相の担体に吸着させ、適当な洗浄液で洗浄することにより非結合成分を洗い流す。担体としては、固体または不溶性材料（例えば、ろ過、沈殿、磁性分離などによりタンパク質混合物から分離することができる材料）であって、タンパク質の非特異的な吸着が少ない物が好ましく、例としては、ビーズ（例えば、アガロース、セファロース、セファデックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、テフロン（登録商標）、孔調節ガラス（ＣＰＧ））、薄膜（例えば、セルロース、ニトロセルロースポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ナイロン、ガラス繊維、及びテフロン（登録商標）製）のような平坦担体、ガラスプレート、金属プレート、シリコンウエハ、及びマイクロタイタープレート等を含む。タンパク質を固相担体に吸着させるためには種々の方法がある。例えば、トキシンタンパク質、及びアンチトキシンタンパク質の何れかに対する抗体を固定化したビーズなどを用いても良い。好ましくは、上述した融合トキシン又はアンチトキシンタンパク質中のタグペプチド等を介して固相担体に吸着させることができる。最後に、固相担体に吸着したタンパク質を回収し、固相担体から他の一方のタンパク質を溶出するか或いは固相担体上で直接、他の一方のタンパク質を検出する。検出には特異的な抗体を用いたイムノアッセイや、上述した融合トキシン又はアンチトキシンタンパク質中のレポータータンパク質の活性を測定することによる行うことができる。
【００３６】
典型的な１つの方法としてＧＳＴ−プルダウンアッセイがあり、ＧＳＴと融合したトキシンタンパク質及びアンチトキシンタンパク質の何れか一方のタンパク質をコードする遺伝子を、例えばＩＰＴＧで発現誘導が可能な発現ベクターにクローン化する。ＩＰＴＧを添加することによって、この融合タンパク質は、通常、細菌細胞内で発現され、グルタチオン−アガロースビーズ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。他の一方のタンパク質は、精製されたものでも、あるいは細胞のライセートの何れでもよく、また、放射性同位元素で標識されていてもよい。このＧＳＴ融合タンパク質と、他の一方のタンパク質とを、候補化合物の存在下、グルタチオンアガロースビーズと共にインキュベートし、ビーズから回収したタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング、オートラジオグラフィー、又は上記レポータータンパク質の酵素活性等により検出する。
【００３７】
他の１つの方法としては、前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質を発現するプラスミドにより形質転換された形質転換体を用意し、前記形質転換体と前記候補化合物とを接触させて前記形質転換体が増殖するか否かを検出することができる。例えば、腸球菌の多剤耐性プラスミドにコードされているＡｘｅ−Ｔｘｅ遺伝子モジュールを大腸菌の発現ベクターにクローン化して大腸菌を形質転換する。候補化合物を添加した培養液中で該形質転換体を培養し、増殖するか否かを検出する。このような方法により、形質転換体大腸菌を用いてＡｘｅ−Ｔｘｅ複合体の形成を阻害する候補化合物をスクリーニングすることができる。得られた結合化合物は該形質転換体のみならず、多剤耐性を示す多くの院内感染菌の中でＴｘｅトキシンを活性化してその増殖を抑制するため抗生物質として利用できる可能性が高い。
【実施例１】
【００３８】
本発明は、以下に示した大腸菌のＹｏｅＢトキシン及びＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体の立体構造解析の実施例に基づいてより詳細に説明されるが、本発明の範囲はこれ等の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
[タンパク質の発現と精製]
完全長のｙｅｆＭ及びｙｏｅＢをコードするＤＮＡは、大腸菌Ｋ−１２株のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、それぞれｐＥＴ−２８ａ及びｐＥＴ−１１ａベクター（ノバジェン社）のＴ７プロモータの制御下にサブクローン化した。完全長のＹｅｆＭタンパク質及びＮ末端切断型（１０〜９２番目のアミノ酸残基を含む）は、Ｎ末端に付加したヒスチジンタグとヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を持つものを発現させた。ＹｏｅＢはタグ付加なしに発現させた。これらの２つのベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に同時形質転換し、アンチトキシン−トキシン複合体を産生させた。細胞を溶菌した後、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体のオリゴマーをＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーで精製し、そのときＹｅｆＭのヒスチジンタグは３Ｃプロテアーゼで分解除去した。ヘパリン−セファロース及びＱ−セファロースを用いた逐次的なカラムクロマトグラフィーによって、高純度に精製されたトキシン−アンチトキシン複合体が得られた。セレノメチオニン標識（Ｓｅ−Ｍｅｔ）したＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体も上記と同様の方法により発現させ精製した。
【００４０】
ＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢタンパク質は、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ複合体がＹｅｆＭのヒスチジンタグを介して予め固定化されたＮｉ２＋キレーティングカラムから、６Ｍ塩酸グアニジンを含む緩衝液により抽出した。変性したＹｏｅＢ画分を０．５ｍｇ／ｍｌに調整し、続いて２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴに対して４℃でゆっくりと透析した。ヒスチジンタグ付加ＹｅｆＭアンチトキシン単体（アミノ酸残基１０〜９２）は単独で発現させ、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーで精製した。ヒスチジンタグを除去した後、さらにＱ−セファロースカラムを用いて精製した。
【００４１】
[結晶化と構造解析]
天然型及びＳｅ−Ｍｅｔ導入ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体（２１ｍｇ／ｍｌ）の結晶は、シッティングドロップ法により２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのＤＴＴを含むリザーバー溶液に対して２０℃にて成長させた。天然型及びＳｅ−Ｍｅｔ結晶は、一つの結晶学的２回回転軸のゆがみに依存するが、Ｐ６４又はＰ３１の空間群に属し、ａ＝ｂ＝８８．４５Å、ｃ＝１３５．１５Åの単位格子を有する六方晶系の結晶が０．２×０．２×０．６ｍｍの典型的な大きさまで成長し、２．０２Åの分解能を示した。これらの結晶は、Ｐ６４空間群中に２つのアンチトキシン−トキシンヘテロ３量体複合体を含むか、又はＰ３１の空間群中に４つの該複合体を含む。結晶の凍結保護は、グリセリンを終濃度で３０容量％添加して行った。
【００４２】
ハンギングドロップ法により、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）、０．２ＭのＣＨ３ＣＯＯＮＨ４及び３０容量％のイソプロパノールを含むリザーバー溶液に対して４℃で蒸気拡散させるか、又は１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）、０．２ＭのＭｇＣｌ２、及び２０容量％のＰＥＧ８０００を含むリザーバー溶液に対して２０℃で蒸気拡散させることにより、２種類のＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢ結晶が成長した。イソプロパノール条件から得られた斜方晶系の結晶は、０．４×０．２×０．２ｍｍの典型的な大きさまで成長し、非対称単位当り４つの分子を含む、Ｐ２１の空間群、及びａ＝２８．９７Å、ｂ＝６０．９９Å、ｃ＝９８．５６Å、β＝９８．０３°の単位格子を有し、１．７７Åの分解能で回折された。結晶の凍結保護は、グリセリンを終濃度で２０容量％添加して行った。ＰＥＧ条件から得られた針状結晶は、０．０５×０．０５×０．２ｍｍの典型的な大きさまで成長し、非対称単位当り６つの分子を含む、Ｃ２の空間群、及びａ＝１６３．９０Å、ｂ＝４３．１４Å、ｃ＝９８．３７Å、β＝１１８．４９°の単位格子を有し、２．０５Åの分解能で回折された。結晶の凍結保護は、グリセリンを終濃度で２５容量％添加して行った。
【００４３】
ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体の天然型（Ｐ６４）とＳｅ−Ｍｅｔ型（Ｐ３１）の両方の結晶についてＳＰｒｉｎｇ−８ビームライン４１ＸＵで回折データを収集し、ＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢ結晶についてはフォトンファクトリーのビームラインＢＬ−５で収集した。すべてのデータはＨＫＬ２０００プログラムパッケージで処理した。ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体中の観測できる２５ヶ所のセレニウム位地は、プログラムＳｎＢで同定され、多重同形置換／異常散乱法を用いた方法によってＭＬＰＨＡＲＥで計算し、２．３Åの分解能の実験的な位相が得られた。ＤＭで計算された密度修飾により、高品質の電子密度マップが得られた。部分的モデル（非対称単位の５０％の残基）は、ＡＲＰ／ｗＡＲＰで自動的に構築し、残りの構造はプログラムＯを用いて手動で完成させた。ＣＮＳにより繰り返し精密化を行った。天然型ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体の最終精密化モデルは、非対称単位中の２つのヘテロ３量体に対してＹｏｅＢ（１〜８４の全ての残基）と、ＹｅｆＭホモダイマー（分子Ａ及びＣについて１０〜９２の残基とＮ末端クローニング人工産物の３残基；分子Ｂ及びＤについて１０〜６５の残基とＮ末端クローニング人工産物の３残基）、及び１５３個の水分子からなる。
【００４４】
２種類の結晶型からのＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢの構造は、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体からのＹｏｅＢ構造を検索モデルとして用いて、ＣＮＳにより分子置換法により決定された。イソプロパノール結晶型に対するＰＣ−精密化相関係数は４８．９％であり、ＰＥＧ結晶型については５６．９％であった。ＣＮＳを用いた厳密な構造精密化とＰｏｗｅｌ最小化により、ＹｏｅＢの３つのＣ末端残基について、複合体とＹｅｆＭ非結合型との間で明確な違いが認められた。イソプロパノール結晶型についての最終精密化モデルは４つのＹｏｅＢ分子（１〜８４番目の全ての残基、但し、分子ＡとＤは８４番目の残基を欠失）、３１４個の水分子及び６個のイソプロパノール分子からなり、１９．５％のワーキングＲ因子と、２２．３％の自由Ｒ値を与えた。ＰＥＧ結晶型についての最終精密化モデルは６つのＹｏｅＢ分子（１〜８４番目の全ての残基、但し、分子Ｃは８４番目の残基を欠失）、３４０個の水分子及び２個の水和マグネシウムイオンからなる。
【００４５】
[ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体及びＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢタンパク質の立体構造決定についての所見]
大腸菌Ｋ１２株由来のｙｏｅＢ遺伝子を含むｐＥＴ−１１ａベクターで種々の大腸菌株をカルシウム法による形質転換を行ったところ、下記の表に示したように大腸菌Ｂ由来株ではコロニーが形成されず、導入することができなかった。これは、ｐＥＴベクターの漏出性の遺伝子発現により、Ｂ株由来の大腸菌の生育が阻害されたものと考えられる。漏出性発現はおそらく宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写によるであろう。
【００４６】
【表１】
【００４７】
従って、ｙｅｆＭ及びｙｏｅＢを含む２つのｐＥＴベクターの同時導入により形質転換体が生育することができた。これらのデータは、大腸菌のＢ由来株はＹｅｆＭ−ＹｏｅＢと同属のアンチトキシン−トキシン遺伝子を持っていないか、又はその発現量が極めて低いためにｐＥＴベクターからのトキシンの漏出性発現を抑制することができないと考えられる。
【００４８】
質量分析によれば、精製された組換えＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体は、ＹｅｆＭの１０〜９２番目のアミノ酸からなるより短い翻訳産物を含む。ＹｅｆＭの推測された最初の９アミノ酸残基は、図１に示した関連するアンチトキシンの何れにも類似せず、これら９アミノ酸残基をコードするＤＮＡにはシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）様配列が存在することから、短縮型は完全長ＹｅｆＭと機能的に同等であると思われる。ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体の構造は、多波長異常散乱法を用いたＸ線回折により２．０５Åの分解能で決定された。イソプロパノール及びＰＥＧ結晶化条件から得られた２種類のＹｅｆＭを含まないＹｏｅＢ結晶型の構造は、それぞれ１．７７及び２．０５Åの分解能で決定された。これらの結晶学的解析統計値を表２に示した。
【００４９】
【表２】
【００５０】
[ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ三量体の構造]
ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ三量体は１つのＹｏｅＢと、２つのＹｅｆＭを含む（図２参照）。図２は、立体構造を形成したＣ末端と無秩序なＣ末端を持つ非対称なＹｅｆＭホモダイマーがＹｏｅＢモノマーに結合したリボン図を、ＹｅｆＭのＮ末端側の２回回転軸に垂直な方向から示したものである。それぞれのモノマーのＮ及びＣ末端及び二次構造を表示した（＃は、無秩序なＣ末端を有するＹｅｆＭプロトマーを示す）。ゲルろ過実験によれば、この複合体の溶液中での形態は分子量約３０ｋＤａであることが示され、ヘテロ三量体構造と化学量論的に一致する。非対称的なＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ三量体は伸長した形（６０×３５×３５Å）である。２つのＹｅｆＭ単量体のＮ末端領域は対称的な２量体を形成する（図２のＳ１からＨ３及びＳ１♯からＨ３＃参照）。１つのＹｅｆＭのＣ末端領域（Ｈ４からＳ４）がＮ末端側の２量体から伸長して球状のＹｏｅＢ単量体と排他的に結合している（図２参照）。もう一つのＹｅｆＭのＣ末端領域は構造的に無秩序である。ＹｅｆＭホモ２量体とＹｏｅＢとの結合間溶媒排除面積は３３００Å２である。
【００５１】
[複合体中のＹｏｅＢリボヌクレアーゼフォールド]
ＹｏｅＢは、５つのβ−シート鎖と２つのα−ヘリックスからなり、全体が３０×３０×２０Åのコンパクトな球状の構造を形成する（図２参照）。図３Ａは、ＹｅｆＭ結合又は非結合型のＹｏｅＢ及びバルナーゼ（Barnase）並びにリボヌクレアーゼＳａのα炭素を重ね合わせて表示したものである。低いＺ−スコアと低い配列の同一性にもかかわらず、ＤＡＬＩサーバを用いた立体構造相同性検索によれば、ＹｏｅＢはストレプトミセス・オーレオファシエンス由来のリボヌクレアーゼＳａ（ＰＤＢコード１ＲＧＥ、根二乗平均偏差（ｒｍｓｄ）＝２．６Å、５３個の均等なα−炭素対、６％の配列同一性、Ｚ−スコア＝２．７）、及びバチルス・アミロリキファシエンス由来のバルナーゼ(Barnase)（ＰＤＢコード１Ｂ２０、ｒｍｓｄ＝２．１Å、５２個の均等なα−炭素対、１３％の配列同一性、Ｚ−スコア＝２．７）に対して構造類似性を有することが明らかとなった（図３Ａ）。分子全体の大きさが異なるにもかかわらず、これらのタンパク質の間ではβ−シートの相対的な配向が極めて類似していた。図１Ｂに示した複数のトキシンのアミノ酸配列を比較すると、他の系統発生学的に関連するトキシンも構造的に類似していることが確認される。ところが、アミノ酸配列に基づく比較ではＹｏｅＢ及びその相同体トキシンがリボヌクレアーゼフォールドを含むことを予測することができなかった。本発明者らの見出したＹｏｅＢの立体構造は、これまでに決定されている微生物リボヌクレアーゼの構造に比べて、推定活性部位からＣ末端ペプチド領域を欠失したコンパクトなフォールド（折りたたみ構造）を有することが明らかとなった。
【００５２】
微生物のリボヌクレアーゼの反応機構は、一般的酸塩基触媒基としてヒスチジン及びグルタミン酸残基が関与するが、一方、アルギニン残基は反応性リン酸との結合に重要である。図４は、ＹｏｅＢと結合したＹｅｆＭホモダイマーの配列の保存性（Ａ）、ＹｅｆＭペプチドと結合したＹｏｅＢモノマー（Ｂ）、ＹｅｆＭホモダイマー（Ｃ）、及びＹｏｅＢモノマー（Ｄ及びＥ）の表面静電ポテンシャルを示す。ＹｏｅＢ表面におけるこのトキシンファミリーの相同性検索の結果、いくつかの高度に保存された残基がクラスターを形成してＹｅｆＭとの結合により隠されることが明らかとなった（図４Ｂ参照）。この領域には、リボヌクレアーゼ活性に潜在的に必要な残基が集中しているが、リン酸結合候補である不変のＡｒｇ６５を除いて局所的に変動している（図３Ａ参照）。一般的塩基残基であるグルタミン酸の典型的な位置は、ねじれたβ−シートの内部に位置する（図３Ａ参照）。しかしながら、ＹｏｅＢ構造においては、Ｓｅｒ５７がこの位置を占め、保存されたグルタミン酸（Ｇｌｕ４６）は隣接鎖であるＳ２シートに側鎖が溶媒と接して存在する（図３Ａ参照）。さらに、一般的酸候補であるＨｉｓ８３を含むＹｏｅＢのＣ末端の３つのアミノ酸の立体配座は後方に折りたたまれている。これらの変動の結果、微生物リボヌクレアーゼに見られる典型的な一般的酸塩基基間の距離（約２１Å）よりも、約３倍も大きくなっている（図３Ａ参照）。
【００５３】
[ＹｅｆＭ２量体のＮ末端側の対称構造とＣ末端側の柔軟なペプチド]
ＹｅｆＭホモ２量体は、２つの伸長したＣ末端領域（１つは一定の構造を有し、他は無秩序な）と共にＮ末端側の球状の構造を形成する（図２参照）。２量体のＮ末端側の領域は全体で３５×３５×５０Åの大きさの対称構造を形成する。１つの疎水的なコア（芯）は、６つのβ−鎖（Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３−Ｓ３＃−Ｓ２＃−Ｓ１＃）からなり、それぞれの単量体からの２つのα−ヘリックス（Ｈ１、Ｈ２及びＨ１＃、Ｈ２＃）によって連結されている。それぞれの単量体からのＨ３ヘリックスもまた疎水的な相互作用に関与している。２つのＨ３ヘリックスは、６５°の角度で交差し、平行なコイルドコイル構造とは異なり、この配置によってそれぞれのヘリックスから突き出したＴｙｒ５４残基の大きな芳香族側鎖を収容する中央の空間が形成される（図５Ａ参照）。ＹｅｆＭのホモ２量体の形成により覆い隠される溶媒排除面積は２６７０Å２である。ＹｅｆＭ単量体の２つのＮ末端領域を重ね合わせると５４個の等価なα−炭素のペアについて１．４Åのｒｍｓｄを与えた。このＮ末端領域と構造的に相同な他のタンパク質は検索により見出されなかった。図１Ａに示した一次構造の比較から、このアンチトキシンファミリーの他のメンバーはＹｅｆＭと同じホモ２量体構造をとることが示唆される。ＹｅｆＭ分子表面におけるこのアンチトキシンファミリーの配列相同性を示すと、ＹｏｅＢモノマーと結合する領域において高度に保存されていることが分かった（図４Ａ参照）。単離されたＹｅｆＭの表面静電特性を計算すると、有意な配列保存性を示す塩基性部分（図４Ａ及び４Ｃの円内）を除いて、Ｎ末端の２量体は高度に酸性であることが分かる（図４Ｃ）。ＹｏｅＢとの結合表面は酸性のＨ３ヘリックスとＣ末端、及び中性のＨ４ヘリックスによって形成される（図４Ｃ参照）。
【００５４】
[非対称性のＹｅｆＭによるＹｏｅＢの認識]
ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢ複合体において、ＹｅｆＭ２量体の１つのＣ末端ペプチドはＹｏｅＢとの結合に関与しているが、もう１つは溶媒中に突き出ている（図１Ａ及び図２参照）。この違いは、Ｈ３ヘリックスの端からＣ末端までのポリペプチド領域は、結合相手がないときはランダムコイルとなることを示し、ＹｏｅＢとの結合に際して無秩序から秩序への移行が行われている。
【００５５】
図５は、ＹｏｅＢのＳ２−Ｓ３ループ領域と結合したＹｅｆＭのＨ３ヘリックスのコイルドコイル領域（Ａ及びＢ）、ＹｏｅＢの疎水性の窪んだ表面に結合したＹｅｆＭの両親媒性Ｈ４ヘリックス（Ｃ）、並びにＹｏｅＢの背部表面上のＹｅｆＭのＳ４β−鎖からＣ末端領域を示す。ＹｅｆＭ２量体のＮ末端側の対称性と自由なＣ末端は、理論的には第二のＹｏｅＢを収容できるかもしれないが、１つのＹｏｅＢ単量体の結合は第二のＨ４＃領域の立体構造を形成させない。Ｈ３コイルドコイル領域の末端を調べると、ＹｏｅＢに対するＨ４ヘリックス形成はＮ末端側２量体の２回回転軸に向かって１７°傾いていることが分かる（図５Ｂ参照）。従って、２つのＨ４ヘリックスの配向は平行にならないため、他のＹｏｅＢ結合によるＨ４＃ヘリックスの形成は立体的に邪魔される。その結果、ＹｏｅＢと結合しないＨ４＃領域は無秩序となり、Ｈ４は構造を形成してＨ３ヘリックスに対して８０°の角度で配向する（図５Ａ及び５Ｃ参照）。Ｈ４ヘリックスの形成はＨ３コイルドコイル領域がＹｏｅＢと結合するのと同時に起こるであろう。Ｈ３及びＨ４ヘリックスによって形成されるＬ型ターンは、Ｌｅｕ６３、Ｌｅｕ６４、Ａｌａ７０、Ｌｅｕ７３及びＭｅｔ７４からなる局所的な疎水性のクラスターによって保持される（図５Ｃ参照）。Ｈ３＃ヘリックスの無秩序な端にあるＬｅｕ６３＃の側鎖もまたこの疎水性相互作用に寄与する（図５Ｂ）。結論として、ＹｏｅＢモノマーに対して非対称的なＹｅｆＭ２量体の構成は、２：１複合体の形成に必須である。
【００５６】
ＹｅｆＭ２量体によるＹｏｅＢモノマーの認識は２つの部位で起こる。主要な部位は、ＹｏｅＢのＳ２−Ｓ３ループを引っ掛けるＹｅｆＭのＬ型ターンである（隠された溶媒排除面積＝２３００Å２、図５Ｃ）。Ｓ２−Ｓ３ループはＹｅｆＭのＬ型ターンを安定化するＬｅｕ４８とＬｅｕ５２残基を含む。ＹｏｅＢはねじれたβ−鎖によって形成される窪んだ表面を提供し、ここには疎水性の残基（Ｐｈｅ５５、Ｖａｌ６７、Ｌｅｕ７６、及びＡｌａ７８）が露出されている。ここに、系統的に保存されているＬｅｕ７３、Ｍｅｔ７４、Ｉｌｅ７７及びＬｅｕ８０残基を提示する両性のＨ４ヘリックスとの間でかなり多くの分子間ファンデアワールス相互作用が存在する（図１Ａ及び図５Ｃ参照）。広範囲にわたる疎水性相互作用に加えて、Ｈ３ヘリックス上のＳｅｒ５６及びＴｈｒ６０の側鎖はＳ２−Ｓ３ループ中の主鎖の残基と水素結合を形成する。Ｈ３＃ヘリックスはＨ３ヘリックスを安定化するだけでなくＹｏｅＢとの結合にも寄与している（図５Ａ及び図５Ｂ）。Ｔｙｒ６２＃残基はＹｏｅＢｎｏＨｉｓ５０及びＡｓｎ５１の側鎖と相互作用する（図５Ｂ参照）。
【００５７】
ＹｅｆＭのＣ末端領域の残りは、ＹｏｅＢの背後を横切り、広範囲で接触する伸長したβ−鎖となっている（隠された溶媒排除面積＝１０００Å２、図５Ｄ）。ＹｅｆＭのＨ４ヘリックスの８６〜８８番目の残基は、連続したβ−鎖を形成するＹｏｅＢのＳ１β−鎖と隣接する。ＹｏｅＢの背面表面は３つのＮ末端二次構造（Ｓ１、Ｈ１及びＨ２）によって構成される（図５Ｄ）。疎水性残基（Ｌｅｕ３、Ｉｌｅ４、Ｔｒｐ５、Ｔｒｐ１０及びＴｙｒ１３）はこの領域の中心に位置し、塩基性残基（Ｌｙｓ２、Ｌｙｓ２１、Ｌｙｓ２５、Ｌｙｓ３２及びＡｒｇ３５、図４Ｅ）に囲まれている。ＹｅｆＭのＩｌｅ９０及びＩｌｅ９１の側鎖がこの疎水性パッチをファンデアワールス接触により相補し、酸性残基（Ｃ末端のカルボキシル基と共にＧｌｕ８７、Ａｓｐ８９及びＧｌｕ９２）が水素結合及び塩橋によりこれらの塩基性を中和している（図５Ｄ）。
【００５８】
[ＹｏｅＢのＣ末端尾部の立体配座の変化]
ＹｅｆＭ非結合ＹｏｅＢ構造の決定によって、ＹｅｆＭとの結合によりＹｏｅＢのＣ末端の３つの残基の機能的な立体配座の変化が明らかとなった。図６Ａは、ＹｅｆＭと結合したＹｏｅＢ活性中心の立体配座を示したものである。３つの残基のペプチド領域は、リボヌクレアーゼＳａなどの微生物リボヌクレアーゼの活性中心に見られる立体配座へと明らかに変化している（図３Ａ）。この３つのＣ末端アミノ酸を除けば、イソプロパノール及びＰＥＧ結晶の両方から得られたＹｅｆＭ非結合ＹｏｅＢ構造は基本的にＹｅｆＭ結合型と同一である（平均ｒｍｓｄ＝０．６７Å、１〜８１番目のα−炭素対、ｎ＝１０分子）。
【００５９】
図６Ｂは、ＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢの立体配座を示す。ＹｅｆＭの構造をＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢ構造と重ね合わせると、ＹｏｅＢのＨｉｓ８３のイミダゾール基とＹｏｅＢのＣ末端のＴｙｒ８４の位置が、それぞれＹｅｆＭのＴｙｒ６２の側鎖及びＨ４ヘリックスによって占められていることが分かる（図６Ｂ）。ＹｅｆＭ非存在下ではＹｏｅＢのＴｙｒ８２の側鎖はＡｒｇ８１の側鎖の近くに並置しており、Ｔｙｒ１５によって支持されている（図６Ｂ）。複合体の構造中では、ＹｏｅＢのＴｙｒ８２の位置がＹｏｅＢのＨｉｓ８３残基に向けて変化し、Ｈｉｓ８３は反対側へ移動している（図６Ａ）。その結果、ＹｏｅＢのＴｙｒ８２がＹｅｆＭのＴｙｒ６２の芳香環と積層する。このチロシン残基の積層は、それぞれの水酸基と相手方の主鎖のカルボニル基との２つの水素結合によって安定化される（ＯＨ／Ｔｙｒ８２／ＹｏｅＢとＯ／Ｔｙｒ６２／ＹｅｆＭ、及びＯＨ／Ｔｙｒ６２／ＹｅｆＭとＯ／Ｇｌｕ６３／ＹｏｅＢ）（図６Ａ）。この積層する相互作用下において、ＹｅｆＭのＧｌｕ５９の側鎖はＹｏｅＢのＡｒｇ６５の側鎖と対をなす水素結合を形成し、その結果三層構造が形成される（図４Ｃ、４Ｄ及び６Ａ参照）。微生物リボヌクレアーゼにおいてこの位置（Ａｒｇ６５）に相当するアルギニン残基は反応性のヌクレオチドリン酸基との結合に決定的に重要である。興味深いことに、系統発生学的に保存されたＹｅｆＭのＧｌｕ５９残基は該リン酸基を擬態しているように思われる（図６Ａ）。Ｇｌｕ５９の導入と安定化の結果、触媒反応の一般的塩基候補である近傍のＹｏｅＢのＧｌｕ４６残基が立体的な反発により立体配座の変化を強いられる（図３Ａ）。
【００６０】
反転したＹｏｅＢのＨｉｓ８３側鎖は、ＹｏｅＢファミリーの中で高度に保存されているＡｓｐ１２と水素結合を形成する（図６Ａ）。Ｈｉｓ８３のイミダゾール環はＹｅｆＭのＡｒｇ７２のグアニジウム基とＹｏｅＢのＡｒｇ８１の脂肪族部分の間に挟まれている。Ａｒｇ８１のグアニジウム基は近傍のＹｏｅＢのＴｙｒ１５と積層し、少し曲がった４層構造となって安定化する（図４Ｃ、４Ｄ及び６Ａ）。ＹｏｅＢの表面には反転したＨｉｓ８３がＹｅｆＭアンチトキシンと相互作用して安定化するための空間がある。ＹｏｅＢのＨｉｓ８３の主鎖は、ＹｅｆＭのＨ３とＨ４ヘリックスの間の連結部につながれ、Ｈｉｓ８３のアミノ基及びカルボニル基は、それぞれＹｅｆＭのＡｓｎ６９及びＳｅｒ６６の側鎖と水素結合する（図６Ａ）。
【００６１】
複合体中においては、ＹｏｅＢのＣ末端Ｔｙｒ８４は溶媒中に突き出し、Ｔｙｒ８２の端近くに存在して、ＹｅｆＭと接触することなくＹｏｅＢのＧｌｕ６３側鎖と水素結合している（図６Ａ）。ＹｅｆＭ非結合型ＹｏｅＢの構造は、Ａｒｇ８１のカルボニル基、並びにＧｌｕ８、Ａｓｐ１２及びＣ末端のカルボキシル基により構成されるＣ末端の背面の極めて負電荷なポケットを形成する（図４Ｄ）。ＰＥＧ結晶型からのＹｏｅＢ構造は、このポケットに６水和マグネシウムイオンを有し、酸性の環境を中和している（図６Ｂ）。複合体型では、ＹｅｆＭのＡｒｇ７２とＹｏｅＢのＨｉｓ８３がこのポケットの酸性電荷を相補しているため（図４Ｃ及び４Ｄ）、この負に荷電した環境もヘテロ３量体形成によって誘導される立体配座の変化に寄与していることが示唆される。従って、ＹｏｅＢによる安定化とＹｏｅＢ触媒部位の直接的障害の組み合わされた効果が、この複合体の構造を支持しており、これらの分子機構は該トキシン−アンチトキシンファミリーの間で保存されていることを示唆する。
【００６２】
[生化学的方法を用いたＹｅｆＭ及びＹｏｅＢタンパク質の結合と毒性抑制の相関に関する解析]
ＹｅｆＭのＣ末端領域へのＹｏｅＢ結合を生化学的に解析するために、野生型ＹｏｅＢとＧＳＴ融合ＹｅｆＭ欠質変異体を用いてＧＳＴ−プルダウンアッセイと毒性抑制テストを行った（図７Ａ及び７Ｂ参照）。すなわち、野生型及び切断型変異体をコードするｙｅｆＭのＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＥＸ−６ｐ−１（アマシャム社）にサブクローン化し、塩基配列を確認した。これらのＧＳＴ−ＹｅｆＭ融合タンパク質及びＧＳＴを大腸菌ＢＬ２１株で発現させ、グルタチオンセファロースで精製した。１５μｌ容量の樹脂に固定化された各ＧＳＴ融合タンパク質は、５０μｌの緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５，２５０ｍＭのＮａＣｌ）中で、リフォールドされたＹｏｅＢ（１００μｇ）を加え平衡化し、４℃で１時間インキュベートし、同緩衝液で３回洗浄した。樹脂に結合したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルー染色で可視化した（図７Ｂ、レーン１：ＹｏｅＢ無添加のＧＳＴ、レーン２：ＹｏｅＢ添加のＧＳＴ、レーン３〜１２：各レーンの上部に表示したように、ＧＳＴと融合した野生型及び切断型ＹｅｆＭ変異体にＧＳＴを添加したもの）。
【００６３】
ＹｏｅＢの毒性テストのために、ＰＣＲにより作製したｙｏｅＢ変異体の全ての構築物をｐＥＴ−１１ａベクター（ノバジェン社）にクローン化した。作製した種々のプラスミドを２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上にてＢＬ２１株及びＢＬ２１（ＤＥ３）株へ形質転換した。切断型ｙｅｆＭ変異体を用いた抑制試験のために、野生型ｙｏｅＢ遺伝子をｐＡＣＹＣベクター（Ｐ１５Ａオリジン）のＴ７プロモータの制御下に再クローン化した。２つのプラスミド、すなわち、ｐＡＣＹＣ中の野生型ｙｏｅＢと、ｐＧＥＸ−６ｐ−１中の野生型又は変異体ｙｅｆＭを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上にてＢＬ２１株へ同時形質転換した。３７℃にて１２時間インキュベートし、生存度を評価した。図７Ａは、Ｎ末端にＧＳＴ−タグを融合させた野生型及び切断型ＹｅｆＭの模式図と、ｙｏｅＢとの同時形質転換による生存度を○又は×で示したものである。同時形質転換により生存するもの（○印）は、ＹｏｅＢの毒性を抑制すると考えられる。
【００６４】
ＹｅｆＭのＣ末端領域はＹｏｅＢと結合し（図７Ｂのレーン１０参照）、ＹｏｅＢの毒性を抑制した（図７Ａ）。一方、ＹｅｆＭのＮ末端側の断片は、ＹｏｅＢと結合せず（図７Ｂ、レーン５及び６参照）、またＹｏｅＢの毒性も抑制しなかった。ＹｅｆＭのＨ４ヘリックス（６７〜８３番目のアミノ酸残基）はＹｏｅＢに対する弱い親和性を示したが（図７Ｂ，レーン１２、野生型の４５％）、ＹｏｅＢの毒性は抑制しなかった（図７Ａ参照）。しかしながら、Ｈ４ヘリックスを含むＣ末端側領域のより大きな断片はＹｏｅＢと結合し、ＹｏｅＢの毒性中和に十分であった（図７Ａ、図７Ｂ、レーン９及び１１参照）。興味深いことに、ＹｅｆＭ７３ＣについてはＹｏｅＢとの結合もコロニーの形成も検出できなかった（図７Ｂ、レーン８）。これは、Ｈ４ヘリックスの６７〜７３番目のアミノ酸残基がＹｏｅＢとの結合及び毒性抑制に必須であることを示唆する。これらの知見は、ＹｅｆＭのＨ３ヘリックスからＨ４ヘリックスまでのＬ型ターンがＹｏｅＢの活性部位と直接結合しているという複合体の構造と一致している。
【００６５】
[ＹｏｅＢのリボヌクレアーゼ活性及び基質特異性]
試験管内におけるＹｏｅＢのリボヌクレアーゼ活性及びＹｅｆＭによるその阻害は、次のようにして測定した。Ｔ７プロモータとｙｅｆＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅によって得た。ｙｅｆＭのｍＲＮＡはT7-MEGAshortscriptキット（アンビオン社）を用いて試験管内で合成した。消化反応混合液（１０μｌ）は、約３５０塩基のｙｅｆＭｍＲＮＡ基質３２０ｎｇと、異なる量のＹｏｅＢ及び／又はＹｅｆＭと、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）とを含む。反応は、３７℃で１時間行い、１０μｌのシークエンシングロードバッファーを添加することによって停止した。サンプルを９５℃で３分間インキュベートした後、ＴＢＥバッファーと共に２μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１．２％未変性アガロースゲルで電気泳動を行った。図７Ｃのレーン１は対照；レーン２〜４は、ＲＮＡとそれぞれ５、２．５又は１μＭのＹｏｅＢ；レーン５はＲＮＡと１μＭのＹｅｆＭ；レーン６〜８はＲＮＡと１μＭのＹｏｅＢと、それぞれ１、２又は３μＭのＹｅｆＭとをインキュベートしたものである。図７Ｃに示したように、試験管内で合成されたＲＮＡは折りたたまれたＹｏｅＢとインキュベートすることによってより小さな断片に分解された（レーン２〜４）が、等モル量のＹｅｆＭ（１０〜９２アミノ酸残基）の添加によりＲＮＡの分解がほとんど阻害された（図７Ｃ、レーン６〜８）。ＹｅｆＭ単独ではＲＮＡ分解に影響なく（図７Ｃ、レーン５）、また、Ｍｇ２＋の存在も活性に影響を与えなかった。これらの結果は、ＹｏｅＢは細胞質におけるリボヌクレアーゼであり、ＹｅｆＭはＹｏｅＢのリボヌクレアーゼ活性を阻害するアンチトキシンとして作用することを示している。
【００６６】
ＹｏｅＢの酵素活性に必須な残基を同定するために、上記結晶構造に基づいて部位特異的変位導入を行った。ＹｏｅＢの毒性がそのリボヌクレアーゼ活性と関連しているならば、酵素活性を減弱する変異体は形質転換大腸菌株の生存度を評価することによって確認できるであろう。その結果、ＹｏｅＢの毒性にとってＧｌｕ４６、Ａｒｇ６５、Ｈｉｓ８３及びＴｙｒ８４残基が必要であることが分かった。５つの変異体酵素のリボヌクレアーゼ活性を測定したところ、Ｒ６５Ａ及びＨ８３Ｑ変異体は完全にリボヌクレアーゼ活性を消失していた（図７Ｄ、レーン５〜８）。この表現型及び立体構造上の特性から考えて、Ａｒｇ６５はリン酸基との結合に関与し、Ｈｉｓ８３は触媒反応における一般的酸として機能しているであろう。Ｙ８４Ｆ及びＹ８４Ａ変異体は、リボヌクレアーゼ活性がそれぞれ減弱及び消失しており（図７Ｄ、レーン９〜１２）、ＹｏｅＢの末端残基が触媒機構に必須であることを示す。Ｅ４６Ａ変異体は低い活性を保持するが、Ｇｌｕ４６はおそらく反応の一般的塩基として作用する（図７Ｄ、レーン３及び４）。他のリボヌクレアーゼについての変位導入実験においても、この一般的塩基の他のアミノ酸への置換は低い活性を保持することが報告されており、この反応の第一段階であるプロトン脱離反応は隣接する残基によって部分的に代替されると思われる。
【００６７】
ＹｏｅＢがＲＮＡを切断する正確な配列を決定するために、ＹｏｅＢにより分解されたｍＲＮＡを用いてプライマー伸長実験を行った（図７Ｅ及び７Ｆ）。切断は、主としてアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）ヌクレオチドの３’末端側で起こった。アデニンがグアニンに優先して認識された。ｙｅｆＭのｍＲＮＡ中のＡＧに富む配列（ＳＤ様配列）は特に感受性が高かった（図７Ｆ）。これらの結果より、ＹｏｅＢは試験管内においてプリン塩基特異的なエンドヌクレアーゼであることが結論付けられた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＹｅｆＭ及びＹｏｅＢファミリーのアンチトキシン（Ａ）及びトキシン（Ｂ）のアミノ酸配列の並列化（アライメント）を示す。
【図２】ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢヘテロ３量体複合体の立体構造を示すリボンモデル図である。
【図３】ＹｏｅＢ及びその類似タンパク質の立体構造を示すモデル図である。
【図４】ＹｅｆＭ及びＹｏｅＢの表面特性を示すモデル図である。
【図５】ＹｅｆＭとＹｏｅＢの間のタンパク質−タンパク質相互作用を示すモデル図である。
【図６】ＹｏｅＢ活性部位のコンフォメーション変化を示すモデル図である。（Ａ）ＹｅｆＭ結合型構造（Ｂ）ＹｅｆＭ非結合型構造。黒と灰色で示したＹｅｆＭは比較のために示した。（Ｃ）ＲＮＡが切断されるときの活性部位のモデル図。
【図７】ＹｏｅＢのヌクレアーゼ活性及びＹｅｆＭの阻害作用を示す模式図及び実験結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の染色体又はプラスミドＤＮＡにコードされたトキシン及びアンチトキシンタンパク質と、候補化合物とを接触させて、トキシン−アンチトキシン複合体が形成されるか否かを検出することを含み、
前記複合体の形成を阻害する候補化合物が、前記細菌の増殖阻害剤であることを示唆することを特徴とする、抗生物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質が、ＭａｚＥ−ＭａｚＦファミリー、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢファミリー、又はＹａｆＮ−ＹａｆＱファミリーから選択される一対の中毒モジュールタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質が、それぞれ大腸菌のＹｏｅＢ及びＹｅｆＭタンパク質、若しくはその相同体、又はその誘導体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記相同体は、シュードモナス・フルオレッセンスのＰｆｌ−Ｋ及びＰｆｌ−Ｉ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡｔｕ−Ｋ及びＡｔｕ−Ｉ、エンテロコッカス・ファシエンスｐＲＵＭプラスミド由来のＴｘｅ及びＡｘｅ、ミコバクテリウム・ツベルキュロシスのＭｔｕ−Ｋ及びＭｔｕ−Ｉ、シュードモナス・プチダのＰｐｕ−Ｋ及びＰｐｕ−Ｉ、並びにスタフィロコッカス・オーレウスのＳａｕ−Ｋ及びＳａｕ−Ｉを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記誘導体は、前記アンチトキシンタンパク質のカルボキシ末端側の２つのα−ヘリックス領域からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、配列番号１に示したアミノ酸配列の５１〜８３番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トキシン−アンチトキシン複合体は、１つのトキシンタンパク質と、２つのアンチトキシンタンパク質からなることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）細菌のトキシン及び／又はアンチトキシンの三次元立体構造座標を用意し、前記トキシン及び／又はアンチトキシンの三次元立体構造又はその部分を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、
（ｂ）前記三次元立体構造に基づいて、前記トキシン又はアンチトキシンに結合する候補化合物を設計又は選択する工程、
（ｃ）前記設計又は選択された候補化合物を合成又は取得する工程、及び
（ｄ）前記候補化合物が前記トキシン−アンチトキシン複合体の形成を阻害するか否かを調べるために前記候補化合物と前記トキシン及びアンチトキシンとを接触させる工程、
を含むことを特徴とする、抗生物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）は、トキシン−アンチトキシン複合体と、アンチトキシンと結合していないトキシンの立体構造を比較して前記候補化合物の結合部位を推定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｄ）は、前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質を発現するプラスミドにより形質転換された形質転換体を用意し、前記形質転換体と前記候補化合物とを接触させて前記形質転換体が増殖するか否かを検出することを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１に示したアミノ酸配列の５１〜８３番目のアミノ酸残基からなる単離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドの１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ大腸菌のＹｏｅＢタンパク質と結合してリボヌクレアーゼ活性を阻害する作用を有するポリペプチド誘導体。
【請求項１】
細菌の染色体又はプラスミドＤＮＡにコードされたトキシン及びアンチトキシンタンパク質と、候補化合物とを接触させて、トキシン−アンチトキシン複合体が形成されるか否かを検出することを含み、
前記複合体の形成を阻害する候補化合物が、前記細菌の増殖阻害剤であることを示唆することを特徴とする、抗生物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質が、ＭａｚＥ−ＭａｚＦファミリー、ＹｅｆＭ−ＹｏｅＢファミリー、又はＹａｆＮ−ＹａｆＱファミリーから選択される一対の中毒モジュールタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質が、それぞれ大腸菌のＹｏｅＢ及びＹｅｆＭタンパク質、若しくはその相同体、又はその誘導体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記相同体は、シュードモナス・フルオレッセンスのＰｆｌ−Ｋ及びＰｆｌ−Ｉ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡｔｕ−Ｋ及びＡｔｕ−Ｉ、エンテロコッカス・ファシエンスｐＲＵＭプラスミド由来のＴｘｅ及びＡｘｅ、ミコバクテリウム・ツベルキュロシスのＭｔｕ−Ｋ及びＭｔｕ−Ｉ、シュードモナス・プチダのＰｐｕ−Ｋ及びＰｐｕ−Ｉ、並びにスタフィロコッカス・オーレウスのＳａｕ−Ｋ及びＳａｕ−Ｉを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記誘導体は、前記アンチトキシンタンパク質のカルボキシ末端側の２つのα−ヘリックス領域からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、配列番号１に示したアミノ酸配列の５１〜８３番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トキシン−アンチトキシン複合体は、１つのトキシンタンパク質と、２つのアンチトキシンタンパク質からなることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）細菌のトキシン及び／又はアンチトキシンの三次元立体構造座標を用意し、前記トキシン及び／又はアンチトキシンの三次元立体構造又はその部分を、コンピュータモデルを用いて構築する工程、
（ｂ）前記三次元立体構造に基づいて、前記トキシン又はアンチトキシンに結合する候補化合物を設計又は選択する工程、
（ｃ）前記設計又は選択された候補化合物を合成又は取得する工程、及び
（ｄ）前記候補化合物が前記トキシン−アンチトキシン複合体の形成を阻害するか否かを調べるために前記候補化合物と前記トキシン及びアンチトキシンとを接触させる工程、
を含むことを特徴とする、抗生物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）は、トキシン−アンチトキシン複合体と、アンチトキシンと結合していないトキシンの立体構造を比較して前記候補化合物の結合部位を推定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｄ）は、前記トキシン及びアンチトキシンタンパク質を発現するプラスミドにより形質転換された形質転換体を用意し、前記形質転換体と前記候補化合物とを接触させて前記形質転換体が増殖するか否かを検出することを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１に示したアミノ酸配列の５１〜８３番目のアミノ酸残基からなる単離されたポリペプチド、又は前記ポリペプチドの１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ大腸菌のＹｏｅＢタンパク質と結合してリボヌクレアーゼ活性を阻害する作用を有するポリペプチド誘導体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−３９３９８（Ｐ２００７−３９３９８Ａ）
【公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２２７０１４（Ｐ２００５−２２７０１４）
【出願日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月４日（２００５．８．４）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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