トランスポータータンパク質とアダプタータンパク質を共発現させたトランスジェニック卵母細胞
【課題】本発明は、輸送活性の高いトランスジェニック卵母細胞、及び該トランスジェニック卵母細胞を用いた、被験物質の輸送を評価するための高感度の実験系を提供することを目的とする。
【解決手段】１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【解決手段】１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞、及び該トランスジェニック卵母細胞を用いた、トランスポーターの被験物質に対するトランスポーター活性を高感度で評価する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の医薬品開発においては、候補化合物の分子サイズの増加に伴い、化合物の物理化学的特性（特に脂溶性等）に起因して、さまざまなタンパク質等に結合しやすい性質の化合物が多く合成される傾向にある。これら候補化合物の薬物輸送を評価する際にも、なるべくトランスポーター自身による輸送活性の高い実験系を構築することによって、化合物の細胞膜への吸着や結合と、細胞内部への輸送とを明確に区分することが望まれる。そのため、近年、製薬企業をはじめとする多くの研究グループが薬物を輸送するトランスポーターに注目している。
【０００３】
トランスポーターは、薬物の生体膜透過に寄与することで、薬物の吸収、分布、排泄に直接関与する。従って、基質となる薬物がトランスポーターによって輸送されるか否かは、薬物の吸収、分布、排泄等の体内動態を決定する重要な因子の一つである。また、肝臓等においては、薬物トランスポーターによる濃縮的な取り込みや排泄が基質薬物の細胞内非結合型濃度の大小を決定するため、トランスポーターによる認識性が、薬物代謝酵素に対する阻害効果の大小とも関連することが示唆されている。このように、ある薬物がトランスポーターによって輸送されるか否かを、簡便かつ正確に計測する実験系の確立は、新規医薬品の開発や既存医薬品の適正使用において重要な課題である。
【０００４】
トランスポーターによる輸送を計測する簡便な系として、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた実験系が確立されている。従来までに、上記のトランスポーターの輸送機能の評価系としては、第１の場所でトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製するステップと、第１の場所から離れた第２の場所にトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を輸送するステップとを含み、好ましくは、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞が、多様なヒト又は動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡ又はｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入することにより調製され、さらなる態様では、少なくとも１つの容器及びその容器に配置された少なくとも１個のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を含む培養系が提供される、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を提供する方法（例えば、特許文献１参照）や、 (ａ)１の薬物に対する一対のトランスポータータンパク質とエクスポータータンパク質とを細胞表面に共発現し、局在領域がオーバーラップしていない卵母細胞を用意する、(ｂ)該卵母細胞を、それぞれの局在領域に接触する細胞外液が、互いに接触しないように設計されたチャンバーにセットする、(ｃ)薬物を該卵母細胞のトランスポータータンパク質の局在領域に接触する細胞外液に添加する、(ｄ)一定時間後、トランスポータータンパク質の局在領域に接触している細胞外液又はエクスポータータンパク質の局在領域に接触している細胞外液を回収する、(ｅ)回収した外液中の薬物の量を測定すること、を含む、トランスポーターとしての有機アニオントランスポーター２（ＯＡＴＰ２）とエクスポータータンパク質としての多剤耐性蛋白質（ＭＲＰ２）等を対象とした、細胞における薬物の動態を簡便かつ容易にin vitroで検出するための方法、ならびに該方法に適した細胞及び細胞実験用チャンバー（例えば、特許文献２参照）が提案されている。
【０００５】
また、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のゲノム配列から予測されるＮａ+依存性トランスポーターｃＤＮＡについてアフリカツメガエルの卵母細胞発現系で高親和性コリン取り込み活性を調べることにより、線虫高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡ（ｃｈｏ−１）を同定し、このｃＤＮＡとの塩基配列の相同性を指標にラット脊髄からラット高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡ（ＣＨＴ１）や、ヒトゲノムからヒト高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡをクローニングする、生理的に重要である高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらを利用した高親和性コリントランスポーター活性促進物質のスクリーニング方法（例えば、特許文献３参照）や、生体を構成する種々の正常細胞並びに種々の腫瘍細胞などの病態関連異常細胞の生存及び増殖に必須な栄養素であるアミノ酸の細胞内への輸送を媒介するアミノ酸トランスポーター分子であって、特に正常細胞に比べ腫瘍細胞に特異的に発現の見られる新規アミノ酸トランスポーター分子を同定、単離し、該分子の生物活性及び／又は該分子の発現を阻害する薬剤を同定することにより、腫瘍（癌）等の種々の病態を治療することができる薬剤を提供する方法（例えば、特許文献４参照）や、ショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のｃＤＮＡライブラリーより、アフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた際のグルタミン酸の取り込みを指標とした、新規グルタミン酸トランスポーターをコードするｃＤＮＡの同定及びグルタミン酸トランスポーター活性阻害物質のスクリーニング方法（例えば、特許文献５参照）等が知られている。
【０００６】
一方、ヒトＨＥＫ２９３細胞において、アダプタータンパク質であるＰＤＺＫ１と、トランスポータータンパク質であるＯＣＴＮ２を共発現させたところ、ＯＣＴＮ２（Ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｔｉｏｎ／ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−２）の輸送機能が向上したことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ヒトＨＥＫ２９３細胞以外の細胞における、ＰＤＺＫ１のＯＣＴＮ２への影響は知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３０４５０１号公報
【特許文献２】特開２００５−２２４１９０号公報
【特許文献３】特開２００１−１３６９７６号公報
【特許文献４】特開２０００−１５７２８６号公報
【特許文献５】特開平１０−９９０８３号公報
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｐｈｒｍａｃｏｌ．６７（３）：７３４−７４３，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アフリカツメガエル卵母細胞は、外来遺伝子のｃＲＮＡを卵母細胞内に注入することによって、遺伝子産物を細胞内又は表面に発現させることのできる簡便な実験系であり、多くの分子生物学的研究に汎用されている。しかしながら一般に、外来ｃＲＮＡを翻訳する効率には限界があるため、注入するｃＲＮＡ量は、通常、卵母細胞１個当り２５−５０ｎｇ以内に抑えられている。よって、この系を使ってトランスポーター遺伝子産物を発現させ、その輸送機能を評価しようとする場合でも、注入できるｃＲＮＡ量に限界があるために、その遺伝子産物量やそこから得られる輸送活性にも限界があった。本発明の課題は、輸送活性の高いトランスジェニック卵母細胞、及び該トランスジェニック卵母細胞を用いた、被験物質の輸送を評価するための高感度の実験系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アフリカツメガエルの卵母細胞を利用した輸送活性の評価系において、トランスポーターの輸送機能や細胞内での局在の制御機構であるＰＤＺ（ＰＳＤ−９５，Ｄｌｇ，ＺＯ−１）ドメインを有するアダプタータンパク質群（ＰＤＺＫ１，ＩＫＥＰＰ，ＮＨＥＲＦ１，ＮＨＥＲＦ２）と、トランスポーターとを共発現させることにより、上記課題を解決し得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（２）１種のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び２種のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種のトランスポータータンパク質及び２種のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（３）２種のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、２種のトランスポータータンパク質及び１種のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（４）トランスポータータンパク質をコードする核酸が、有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター及びペプチドトランスポーターからなる群から選ばれるトランスポータータンパク質をコードする核酸である上記（１）〜（３）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（５）トランスポータータンパク質をコードする核酸が、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２、ＯＡＴＰ−Ａ及びＳＬＣ２６Ａ３から選ばれるトランスポータータンパク質をコードする核酸である上記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（６）アダプタータンパク質をコードする核酸が、ＰＤＺドメインを有するアダプタータンパク質をコードする核酸である上記（１）〜（５）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（７）アダプタータンパク質をコードする核酸が、ＰＤＺＫ１、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２及びＩＫＥＰＰから選ばれるアダプタータンパク質をコードする核酸である上記（１）〜（６）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（８）アダプタータンパク質をコードする核酸として、ＰＤＺＫ１をコードする核酸を少なくとも含む上記（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（９）核酸がｃＲＮＡである上記（１）〜（８）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（１０）ＯＡＴＰ−Ａトランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＡＴＰ−Ａトランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質と、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（１１）ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質と、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（１２）ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＳＬＣ２６Ａ３トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質と、ＳＬＣ２６Ａ３トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（１３）ＯＣＴＮ１トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＥＰＴ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ１トランスポータータンパク質と、ＰＥＰＴ２トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞に関する。
【００１１】
また本発明は、（１４）１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードするｃＲＮＡと、１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードするｃＲＮＡとをアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクションにより導入し、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現させることを特徴とするトランスジェニック卵母細胞の製造方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（１５）上記（１）〜（１３）のいずれか記載のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法；標識化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標識化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ(Ａ)、トランスジェニック卵母細胞への標識化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定するステップ(Ｂ)、測定結果を評価するステップ(Ｃ)や、（１６）上記（１）〜（１３）のいずれか記載のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法；標的化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標的化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ（Ａ’）、トランスジェニック卵母細胞への標的化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標的化合物の排出の程度を測定するステップ（Ｂ’）、測定結果を評価するステップ（Ｃ’）に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、輸送活性の高いトランスジェニック卵母細胞、及び該トランスジェニック卵母細胞を用いた、被験物質の輸送を評価するための高感度の実験系を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のトランスジェニック卵母細胞は、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現している限り特に制限はされない。
【００１５】
本発明に用いるアフリカツメガエルの卵母細胞は、アフリカツメガエルの卵母細胞である限り特に制限はされず、例えばＮＡＳＣＯ、Ｆｔ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ５３５３８などから入手することができる。
【００１６】
本発明に用いるトランスポータータンパク質の種類としては、そのトランスポータータンパク質をコードする核酸をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、その卵母細胞内で発現し、その発現産物であるタンパク質がトランスポーター活性を発揮し得る限り、特に制限されるものではないが、薬物動態に関連するトランスポーターであることが好ましく、薬物動態に関連するトランスポーターとしては、有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター、ペプチドトランスポーター、糖トランスポーター、アミノ酸トランスポーター、ヌクレオシドトランスポーター、小腸上皮細胞刷子縁膜トランスポーター、その他のＳＬＣ（Ｓｏｌｕｔｅ Ｃａｒｒｉｅｒ）ファミリートランスポーター、ＡＢＣトランスポーター等を挙げることができるが、少なくとも有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター、ペプチドトランスポーター、糖トランスポーター、ＳＬＣファミリートランスポーターを含むことが好ましい。
【００１７】
上記有機アニオントランスポーターとしては、例えばＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、ＯＡＴ４、ＯＡＴＰ−Ａ、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅ、ＯＡＴＰ−８、ＰＧＴ、ＯＡＴ−Ｋ１、ＮＰＴ１、ＭＣＴ１、ＡＥ２等を挙げることができ、有機カチオントランスポーターとしては、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ３、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＯＣＴＮ３等を挙げることができ、ペプチドトランスポーターとしては、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２等を挙げることができ、アミノ酸トランスポーターとしては、ＬＡＴ、ＣＡＴ、ＥＡＡＴ等を挙げることができ、神経伝達物質トランスポーターとしては、ＧＡＴ１、ＧＡＴ２、ＮＥＴ１、ＳＥＲＴ等を挙げることができ、胆汁酸トランスポーターとしては、ＮＴＣＰ、ＡＳＢＴ等を挙げることができ、ＡＢＣトランスポーターとしては、ＭＤＲ１、ＭＲＰ２等を挙げることができ、ヌクレオシドトランスポーターとしては、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２等を挙げることができ、糖トランスポーターとしては、ＳＧＬＴ１等を挙げることができ、ＳＬＣファミリートランスポーターとしては、ＳＬＣ２６Ａ３等を挙げることができる。これらの中でも少なくとも、薬物輸送に関して特に重要なトランスポーターとしては、オリゴペプチドトランスポーターＰＥＰＴ１、モノカルボン酸トランスポーターＭＣＴ１、有機アニオントランスポーターＮＰＴ１、ＯＡＴＰ−Ａ、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅ、ＯＡＴＰ−８、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３及びＡＥ２、並びに有機カチオントランスポーターＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２及びＯＣＴＮ３を具体的に挙げることができる。
【００１８】
以下の表１〜３に、上述したトランスポーターを含む、従来報告されているトランスポーターの種類、名称、遺伝子バンクにおけるアクセッションナンバー、報告文献名、組織分布、輸送する基質の一覧表を示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
本発明に用いるトランスポータータンパク質は、１種類であってもよいが、より優れた輸送活性（例えば輸送速度）を得る観点や、よりインビボの環境に近づけ得るという観点から、２種類以上を併用することが好ましく、より具体的には、本願明細書に具体的に例示されたトランスポータータンパク質から選ばれる２種以上のトランスポータータンパク質を用いることが好ましく、ＯＣＴＮ２とＳＬＣ２６Ａ３の組み合わせ、ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２の組み合わせがより好ましい。
【００２３】
２種以上のトランスポータータンパク質を併用することによる、輸送活性向上の作用機作については、２種以上のトランスポータータンパク質を併用することにより、併用したいずれかのトランスポーターの活性が、そのトランスポーターを単独で用いた場合に比べて向上している限り特に制限されないが、例えば、２種以上のトランスポータータンパク質が、それぞれの基質を輸送することによって生じる膜内外間の電荷の偏りを互いに低減する２種以上のトランスポータータンパク質であることが好ましい。具体的には、例えば、ＳＬＣ２６Ａ３とＯＣＴＮ２は、以下のように膜内外間の電荷の偏りを互いに低減させることにより、互いのトランスポーター活性を向上させるものと考えられる。
ＳＬＣ２６Ａ３は、２個のＣｌ−を細胞内に取り込むと同時に１個のＨＣＯ３−細胞外に排出する（合計１個のマイナス電荷が細胞内に入る）。一方、ＯＣＴＮ２によるカルニチン輸送はＮａ＋依存的であり、カルニチンはプラスとマイナスの電荷をそれぞれ一つずつ持つ両極性化合物であることから、ＯＣＴＮ２は、カルニチンを細胞内に取り込むと、合計１個のプラスの電荷が細胞内に入ると考えられる。従って、ＳＬＣ２６Ａ３をＯＣＴＮ２と同時に導入すると、ＯＣＴＮ２がカルニチンを取り込む際に生じる１個のプラス電荷が、ＳＬＣ２６Ａ３が取り込む１個のマイナス電荷によって打ち消されると考えられる。同様の電荷の打消しは、ＰＥＰＴ２とＯＣＴＮ１の組み合わせでも見られると考えられる。
【００２４】
トランスポータータンパク質の由来としては、そのトランスポータータンパク質をコードする核酸をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、その卵母細胞内で発現し、その発現産物であるタンパク質がトランスポーター活性を発揮し得る限り、特に制限されるものではないが、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウス等を挙げることができ、好ましくはヒト、サル、イヌ、ラット、マウス等を挙げることができる。トランスポータータンパク質を複数種用いるときに、それぞれのトランスポータータンパク質の由来は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００２５】
本発明に用いるトランスポータータンパク質をコードする核酸の種類としては、そのトランスポータータンパク質をコードする核酸をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、その卵母細胞内で発現し、その発現産物であるタンパク質がトランスポーター活性を発揮し得る限り、特に制限されるものではないが、具体的には、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡを挙げることができ、より高い形質転換効率を得る観点から、ｃＲＮＡを特に好ましく挙げることができる。
【００２６】
本発明に用いるアダプタータンパク質の種類としては、本発明に用いるいずれかのトランスポータータンパク質をコードする核酸と共にアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、〔１〕その卵母細胞内で発現し、かつ、〔２〕アダプタータンパク質をコードする核酸を単独で導入した場合と比べて、卵母細胞のトランスポーター活性が上昇するようなものである限り、特に制限はされるものではないが、ＰＤＺドメインを有するアダプタータンパク質を好ましく挙げることができ、より具体的には、ＰＤＺＫ１、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２、ＩＫＥＰＰをさらに好ましく挙げることができる。
【００２７】
ここで、ＰＤＺドメインとは、ＰＳＤ−９５，Ｄｌｇ，ＺＯ−１と呼ばれる３つのタンパク質が共通して持つアミノ酸８０〜９０個からなる構造ユニットであり、このドメインがトランスポーターのＣ末端に位置するアミノ酸を認識して結合することが知られている。ＰＤＺドメインのコンセンサス配列はＮＣＢＩにも記載されている（ＮＣＢＩ Ｎｏ．ｃｄ００９９２）。
本発明において、ＰＤＺドメインを有するアダプタータンパク質とは、上記ＰＤＺドメインのコンセンサス配列（ＮＣＢＩ Ｎｏ．ｃｄ００９９２）に対して相同性３０％以上、好ましくは３３％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは３６％以上、最も好ましくは３７％以上のアミノ酸配列を有するアダプタータンパク質をいう。
【００２８】
本発明に用いるアダプタータンパク質は、１種類であってもよいが、より優れた輸送活性促進効果を得る観点から、２種類以上併用することが好ましく、具体的にはＰＤＺＫ１、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２及びＩＫＥＰＰから選ばれる２種以上のアダプタータンパク質を用いることがより好ましく、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２及びＩＫＥＰＰから選ばれる１種又は２種以上のアダプタータンパク質と、ＰＤＺＫ１とを併用することがさらに好ましく、ＰＤＺＫ１とＮＨＥＲＦ１の組み合わせが特に好ましい。
【００２９】
本発明に用いるアダプタータンパク質をコードする核酸の種類としては、本発明に用いるいずれかのトランスポータータンパク質をコードする核酸と共にアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、〔１〕その卵母細胞内で発現し、かつ、〔２〕アダプタータンパク質をコードする核酸を単独で導入した場合と比べて、卵母細胞のトランスポーター活性が上昇するようなものである限り、特に制限はされるものではないが、具体的には、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡを挙げることができ、より高い形質転換効率を得る観点から、ｃＲＮＡを特に好ましく挙げることができる。
【００３０】
本発明に用いるトランスポータータンパク質をコードする核酸やアダプタータンパク質をコードする核酸は、例えば前述の表１〜３に記載されたアクセッション番号等を参照して所望のトランスポータータンパク質やアダプタータンパク質の配列情報を入手し、該配列情報に基づいて適当なプライマーを作製し、例えば所望の生物のＤＮＡライブラリー等のテンプレートを入手又は作製して、ＰＣＲ反応を行うこと等によって入手することができる。核酸を作製するための実験プロトコールとしては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２００１等に記載された方法を利用することができる。
【００３１】
本発明のトランスジェニック卵母細胞を作製する方法としては、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸と、１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸とをアフリカツメガエルの卵母細胞に導入し、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現させる方法である限り特に制限されず、任意の既知の技法を用いることができるが、形質転換効率が優れていることから、本発明に用いるトランスポータータンパク質をコードする核酸及びアダプタータンパク質をコードする核酸をアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクションにより導入する方法を好ましく挙げることができる。マイクロインジェクションによる核酸の導入は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ I−III，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．１９９４や、Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，１０，１−１２などに記載の標準的な方法により行うことができる。
【００３２】
アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するトランスポータータンパク質をコードする核酸の量は、アフリカツメガエルの卵母細胞へ導入可能な範囲であれば特に制限されず、何種類のトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、何種類のアダプタータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、どのような種類の核酸を用いるかという点等により左右されるため、一概に言うことはできないが、例えば核酸の種類がｃＲＮＡである場合、トランスポータータンパク質１種類につき、該トランスポータータンパク質をコードするｃＲＮＡを２〜４８ｎｇ用いることが好ましく、２〜３０ｎｇ用いることがより好ましく、３〜２０ｎｇ用いることがさらに好ましく、３〜１０ｎｇ用いることがさらにより好ましく、４〜６ｎｇ用いることがよりさらに好ましい。トランスポータータンパク質の種類が２種以上である場合、トランスポータータンパク質をコードするｃＲＮＡは合計で、４〜４８ｎｇ用いることが好ましく、６〜４０ｎｇ用いることがより好ましく、６〜３０ｎｇ用いることがさらに好ましく、８〜２０ｎｇ用いることがさらにより好ましい。
【００３３】
また、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するアダプタータンパク質をコードする核酸の量は、アフリカツメガエルの卵母細胞へ導入可能な範囲であれば特に制限されず、何種類のアダプタータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、何種類のトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、どのような種類の核酸を用いるかという点等により左右されるため、一概に言うことはできないが、例えば核酸の種類がｃＲＮＡである場合、アダプタータンパク質１種類につき、該アダプタータンパク質をコードするｃＲＮＡを２〜４８ｎｇ用いることが好ましく、２〜３０ｎｇ用いることがより好ましく、３〜２０ｎｇ用いることがさらに好ましく、３〜１０ｎｇ用いることがさらにより好ましく、４〜６ｎｇ用いることがよりさらに好ましい。アダプタータンパク質の種類が２種以上である場合、アダプタータンパク質をコードするｃＲＮＡは合計で、４〜４８ｎｇ用いることが好ましく、６〜４０ｎｇ用いることがより好ましく、６〜３０ｎｇ用いることがさらに好ましく、８〜２０ｎｇ用いることがさらにより好ましい。
【００３４】
また、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するトランスポータータンパク質をコードする核酸の量と、アダプタータンパク質をコードする核酸の量との合計量は、アフリカツメガエルの卵母細胞へ導入可能な範囲であれば特に制限されず、何種類のアダプタータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、何種類のトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、どのような種類の核酸を用いるかという点等により左右されるため、一概に言うことはできないが、例えば核酸の種類がｃＲＮＡである場合、合計４〜５０ｎｇ用いることが好ましく、６〜４０ｎｇ用いることがより好ましく、８〜４０ｎｇ用いることがさらに好ましく、１０〜３０ｎｇ用いることがさらにより好ましい。アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するトランスポータータンパク質をコードする核酸の量と、アダプタータンパク質をコードする核酸の量との合計量が５０ｎｇを超えると、アフリカツメガエルの卵母細胞を形質転換することは困難である。
【００３５】
また、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するトランスポータータンパク質をコードする核酸の量と、アダプタータンパク質をコードする核酸の量との比率は、トランスポータータンパク質をコードする核酸を単独で用いた場合と比較して、トランスポーター活性の促進が見られる限り特に制限はなく、何種類のトランスポータータンパク質やアダプタータンパク質を用いるかという点等により左右されるため一概に言うことはできないが、トランスポータータンパク質をコードする核酸の量：アダプタータンパク質をコードする核酸の量を、好ましくは１：５〜５：１、より好ましくは１：３〜３：１、さらに好ましくは１：２〜２：１、さらにより好ましくは２：３〜３：２とすることができる。
【００３６】
本発明の薬物動態の検出方法は、本発明のトランスジェニック卵母細胞を用いる方法であれば特に制限はされないが、本発明のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法を好ましく挙げることができる。
・標識化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標識化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ（Ａ）
・トランスジェニック卵母細胞への標識化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定するステップ（Ｂ）
・測定結果を評価するステップ（Ｃ）
【００３７】
ステップ（Ａ）の標識化合物としては、例えば、動態を調べたい薬物等の化合物を標識したものや、動態を調べたい薬物等の化合物の代謝産物を標識したものを用いることができる。標識に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素、スピン試薬などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕、〔５９Ｆｅ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
【００３８】
ステップ（Ａ）における、「標識化合物と本発明のトランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションする」は、標識化合物と、本発明のトランスジェニック卵母細胞とを接触させ、標識化合物が本発明のトランスジェニック卵母細胞に取り込まれ得る条件下でインキュベーションする限り特に制限されず、例えば適当な卵母細胞用バッファーに標識化合物を溶解し、その溶解液に本発明のトランスジェニック細胞を浸して一定時間インキュベーションすることを好ましく挙げることができる。
【００３９】
また、ステップ（Ａ）における、「標識化合物を細胞内に含有させた本発明のトランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションする」は、細胞内に標識化合物を含有させた本発明のトランスジェニック卵母細胞と、バッファーとを接触させ、該標識化合物が本発明のトランスジェニック卵母細胞外へ排出され得る条件下でインキュベーションする限り特に制限されず、例えば適当な方法で標識化合物を細胞内に含有させた本発明のトランスジェニック卵母細胞を、適当な卵母細胞用バッファーに浸して一定時間インキュベーションすることを好ましく挙げることができる。
標識化合物をトランスジェニック卵母細胞に含有させる方法としては、標識化合物をトランスジェニック卵母細胞に含有させることができ、かつ、そのトランスジェニック卵母細胞に含有させた標識化合物の量を把握することができる方法であれば特に制限されないが、操作が簡便である点、及び含有させた標識化合物の量を把握することが容易である点から、標識化合物をトランスジェニック卵母細胞に注入する方法を好ましく挙げることができる。
【００４０】
ステップ(Ｂ)における、トランスジェニック卵母細胞への標識化合物の取込みの程度を測定する方法としては、特に制限されず、用いた標識剤に合わせて適当な方法を選択することができる。具体的には、例えば標識剤として放射性同位元素を用いた場合は液体シンチレーションカウンター等を、標識剤として蛍光物質等を用いた場合はフルオロメーター等を用いて、トランスジェニック卵母細胞内の標識化合物の量を測定することによって、トランスジェニック卵母細胞への取り込みの程度を測定することができる。また、標識化合物の質量スペクトルが知られていれば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等を用いて、トランスジェニック卵母細胞内の標識化合物の量を測定することによって、トランスジェニック卵母細胞への取り込みの程度を測定することができる。
なお、トランスジェニック卵母細胞内の標識化合物の量を測定する際には、トランスジェニック卵母細胞の周りに付着した標識化合物を除去するために、トランスジェニック卵母細胞を適当なバッファーで洗浄することが好ましい。
【００４１】
ステップ（Ｂ）における、トランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定する方法としては、特に制限されず、用いた標識剤に合わせて適当な方法を選択することができる。具体的には、例えば液体シンチレーションカウンター、フルオロメーター等を用いて、インキュベーション後バッファー中の標識化合物の量を測定することによって、トランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定することができる。測定する際には、トランスジェニック卵母細胞の周りに付着した標識化合物も、トランスジェニック卵母細胞から排出された標識化合物としてカウントするために、トランスジェニック卵母細胞を適当なバッファーで洗浄し、その洗浄後のバッファーを前述のインキュベーション後のバッファーに加えて、その中の標識化合物の量を測定することが好ましい。
【００４２】
なお、動態を調べたい化合物が、トランスジェニック卵母細胞内に存在しない化合物である場合は、標識していないその化合物を、本発明における標識化合物に代えて、本発明の方法に使用することもできる。本発明においては、そのような化合物も、便宜上標識化合物に含める。
【００４３】
ステップ（Ｃ）における、測定結果を評価するステップとしては、特に制限されないが、例えば、薬物動態の検出方法に用いたトランスジェニック卵母細胞に導入したトランスポータータンパク質が、用いた標識化合物を認識して輸送するかどうかを評価したり、用いた標識化合物をどの程度輸送するのかを、他のトランスポータータンパク質を導入したトランスジェニック卵母細胞を用いたデータと比較することにより評価すること等を挙げることができる。
【００４４】
また、本発明の薬物動態の検出方法に含まれる別の好ましい態様として、以下のステップを含む薬物動態の検出方法を挙げることができる。
・標的化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標的化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ（Ａ’）
・トランスジェニック卵母細胞への標的化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標的化合物の排出の程度を測定するステップ（Ｂ’）
・測定結果を評価するステップ（Ｃ’）
【００４５】
ここで、標的化合物とは、動態を調べたい薬物等の化合物や、動態を調べたい薬物等の化合物の代謝産物を意味する。また、前述のステップ（Ａ’）、（Ｂ’）、（Ｃ’）は、ステップ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）における標識化合物を、標的化合物に置き換えた場合と同様であるが、ステップ（Ｂ’）においては標的化合物を標識に頼らずに測定する必要がある。このような測定は、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等を用いるなどして行うことができる。
【００４６】
本発明における被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング法は、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞を用いる方法であれば特に制限はされないが、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞への被験物質の取込みの程度を測定することにより、被験物質を輸送するトランスポーターを同定する方法や、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞からの被験物質の排出の程度を測定することにより、被験物質を輸送するトランスポーターを同定する方法を好ましく挙げることができる。
【００４７】
また、本発明におけるトランスポーターを認識する物質のスクリーニング法は、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞を用いる方法であれば特に制限されないが、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞への被験物質の取込みの程度を測定することにより、トランスポーターに認識される物質を同定する方法や、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞からの被験物質の排出の程度を測定することにより、トランスポーターに認識される物質を同定する方法を好ましく挙げることができる。
【００４８】
さらに、本発明におけるトランスポーターの被験物質に対するトランスポーター活性を評価する方法は、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞を用いる方法であれば特に制限されないが、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞への被験物質の取込みの程度を測定することにより、トランスポーターの被験物質に対するトランスポーター活性を評価する方法や、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞からの被験物質の排出の程度を測定することにより、トランスポーターの被験物質に対するトランスポーター活性を評価する方法を好ましく挙げることができる。
【００４９】
本発明のスクリーニング法や評価法における、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞への被験物質の取込みの程度を測定する手段は、被験物質の取込みの程度を測定し得る限り特に制限されず、前述の薬物動態の検出方法におけるのと同様の方法を用いることができる。
【００５０】
本発明のトランスジェニック卵母細胞においては、トランスポータータンパク質とアダプタータンパク質を共発現させることによって、導入したトランスポータータンパク質のトランスポーター活性が向上している。トランスポーター活性の向上の詳細な作用機作は不明であるが、アダプタータンパク質が共発現することによって、トランスポータータンパク質が細胞膜上で安定化する結果、より多くのトランスポータータンパク質が細胞膜上に発現し、より十分なトランスポーター活性をより長時間発揮することによるものと考えられる。
【００５１】
本発明のトランスジェニック卵母細胞は、導入したトランスポータータンパク質のトランスポーター活性が向上しているため、トランスポータータンパク質を単独で導入して得られたトランスジェニック卵母細胞に比べて、被験物質の輸送を評価するための実験系に用いた場合に、より高感度な実験系が得られる。
【００５２】
また、トランスポータータンパク質に加えてアダプタータンパク質を共発現させると、トランスポータータンパク質の核酸とアダプタータンパク質の核酸を合計したとしても、トランスポータータンパク質の核酸を単独で導入する場合に比べて、より少ない核酸量でより高いトランスポーター活性を得ることができる。このことは、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いる場合は以下のような理由により特に有利な効果をもたらす。アフリカツメガエルの卵母細胞は、卵母細胞１個当たりに導入可能な核酸量（例えばｃＲＮＡ量）は、２５〜５０ｎｇであるとされている。そのため、アフリカツメガエルの卵母細胞へ、２以上のトランスポーターの導入をするとした場合、トランスポーター１つ当たりについて導入し得る核酸量の上限はかなり少量に限られてしまい、いずれのトランスポーターについても中途半端な活性しか得られず、実用性の低い実験系しか得られない。しかし、本発明のように、アダプタータンパクを共発現させることにより、２つ以上のトランスポーターを導入した場合であっても、それぞれのトランスポーターについて十分なトランスポーター活性を得ることが可能となったことによって、対象とする臓器や細胞に共通して発現する複数のトランスポーターを１個の卵母細胞に発現させるなどして、対象とする臓器や細胞におけるある特定の基質の輸送を実用的なレベルで一度に評価することが可能となり、従来のものより、インビボに近いインビトロ系の人工細胞（ヒト又は動物の細胞に模した細胞）を構築することが可能となった。
【００５３】
また、上述のように、本発明では、アダプタータンパクを共発現させることにより、１つのトランスポータータンパク質について導入する核酸が少量で済むようになった。そのため、本発明では、アダプタータンパクを１種ではなく、２種以上導入することも可能となり、その結果、より高いトランスポーター活性を得ることができるようになった。
【００５４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５５】
１.トランスポーター及びＰＤＺアダプターのｃＲＮＡの合成
トランスポーター及びＰＤＺアダプターのｃＲＮＡを合成する際に用いるトランスポーター及びＰＤＺアダプターのｃＤＮＡの作製又は入手を行った。以下の表４に、ｃＤＮＡを作製又は入手したトランスポーターの名称と、該トランスポーターの作製方法又は入手方法に関する情報を示す。
【００５６】
【表４】
【００５７】
また、以下の表５に、ｃＤＮＡを作製又は入手したアダプターの名称と、該アダプターの作製方法又は入手方法に関する情報を示す。
【００５８】
【表５】
【００５９】
以下の表６に記載されたトランスポーターのｃＤＮＡを組み込んだプラスミドベクター、及び、表７に記載されたＰＤＺアダプターのｃＤＮＡを組み込んだプラスミドベクターを、それぞれの表に記載された制限酵素で処理して直鎖状にした後、ＱＩＡ Ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、トランスポーター及びＰＤＺアダプターのｃＤＮＡの精製を行った。
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
得られたｃＤＮＡ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡ Ｍａｘｘ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ｃＲＮＡの合成を行った後、Ｒｉｂｏ ｍ７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＲＮＡの５’末端をキャッピングした。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応の際に残った鋳型ＤＮＡを除くために、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを、５’末端がキャッピングされたｃＲＮＡに加えてＤＮａｓｅ処理を行った。その後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡの精製を行った。なお、Ｋｉｔ使用の際には、付属の標準プロトコールに従って操作した。
【００６３】
２．卵母細胞の採取
アフリカツメガエルを氷水中に３０分〜１時間静置し、冬眠状態にさせた。アフリカツメガエルの腹部の表皮をピンセットで摘んで切開した後、薄皮と筋層を切開して卵母細胞を摘出し、後述の組成のＯＲ２で洗浄した。次いで、卵母細胞をＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０ｍＬ（２．０ｍｇ／ｍＬ，ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ＯＲ２）に浸漬し、１８℃、１８０ｒｐｍで３０分間振盪してＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ処理した。その後、卵母細胞をＯＲ２で５回以上洗い、最後に、ＯＲ２を後述の組成のＭＢＳ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｒｔｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で置換した。Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ処理では、濾胞細胞層を取り除き切れなかった卵母細胞は、実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下、ＭＢＳ中でピンセットを用いて取り除いた。
【００６４】
[ＯＲ２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ ７．５）の組成]
ＮａＣｌ ８２．５ｍＭ
ＫＣｌ ２．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １．０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ５．０ｍＭ
１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整
調製後、１２１℃，２０ｍｉｎオートクレーブ
【００６５】
[ＭＢＳ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｒｔｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐＨ７．４）の組成]
ＮａＣｌ ８８ｍＭ
ＫＣｌ １ｍＭ
Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ ０．３３ｍＭ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．４１ｍＭ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８２ ｍＭ
ＮａＨＣＯ３ ２．４ｍＭ
ＨＥＰＥＳ １０．０ｍＭ
１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整
調製後、１２１℃，２０ｍｉｎオートクレーブ
【実施例２】
【００６６】
３．アダプター分子ＰＤＺＫ１共発現系における輸送活性の経時的変化
（１）上記２．で採取したアフリカツメガエル卵母細胞に、上記１．で得られたＯＣＴＮ２ｃＲＮＡとＰＤＺＫ１ｃＲＮＡを同時に導入した。具体的には、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）をＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで希釈し、６５℃で５分間加熱処理して熱変性させた後、氷上で３分間冷却してｃＲＮＡ溶液を得た。濾胞細胞層を取り除いた卵母細胞に、ｍｉｃｒｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて前述のｃＲＮＡ溶液を注入した。この卵母細胞を、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を加えたＭＢＳ中、１８℃で培養し、トランスジェニック卵母細胞を得た。
ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）に代えて、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）単独をｃＲＮＡとして用いて、同様の操作を行い、トランスジェニック卵母細胞を得た。
【００６７】
（２）これら２種のトランスジェニック卵母細胞を用いて、ｃＲＮＡの導入から３日後及び７日後における、カルニチンの取り込みを測定した。具体的には、測定対象となる卵母細胞を２４ｗｅｌｌプレートに１０個／ｗｅｌｌ以上とり、後述の組成のＮＤ９６（ｐＨ７．４）で置換した。２５℃中で３０分間プレインキュベーションした後、放射性標識化合物〔３Ｈ〕で標識したカルニチンを１μＭとなるように添加したＮＤ９６（ｐＨ７．４，２５℃）５００μＬ／ｗｅｌｌに置換することで取り込み実験を開始した。一定時間後、氷冷したＮＤ９６で卵母細胞を５回洗浄し、取り込みを終了させた。卵母細胞は２個ずつシンチレーションバイアルに入れ、５％ＳＤＳを１００μＬずつ加えることで卵母細胞を可溶化し、１日静置させた後に、液体シンチレーションカクテル（Ｃｌｅａｓｏｎ Ｉ；Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製）を加え液体シンチレーションカウンター（Ａｌｏｋａ社製）により放射活性を測定した。カルニチン量の測定は、各試験区について５〜１０連で行った。
【００６８】
[ＮＤ９６ （ｐＨ ７．４）の組成]
ＮａＣｌ ９６ｍＭ
ＫＣｌ ２ｍＭ
ＣａＣｌ２ １．８ｍＭ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ
１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整
調製後、１２１℃，２０ｍｉｎオートクレーブ
【００６９】
ｃＲＮＡの導入から３日後におけるカルニチンの平均取り込み量を１００％として、ｃＲＮＡの導入から７日後におけるカルニチンの平均取り込み量を、それぞれのトランスジェニック細胞について算出した。その結果を図１に示す。
ＯＣＴＮ２単独では、３日後の取り込みに比べ７日後も同程度の取り込み活性であるのに対し、ＯＣＴＮ２とＰＤＺＫ１との共発現系では７日後において３日後よりもむしろ高い活性が認められたことから、アダプター分子であるＰＤＺＫ１が共存することによって、ＯＣＴＮ２活性が次第に高まることが示された。
なお、図１のグラフにおいては、導入したＯＣＴＮ２トランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＣＴＮ２トランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだカルニチン量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００７０】
４．ＰＤＺＫ１をＯＣＴＮ２と共発現させることによる、ＯＣＴＮ２トランスポーター活性への影響
導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００７１】
得られたこれら５種の卵母細胞について、上記３．（２）と同様の方法により、カルニチンの取り込みを測定した。ｃＲＮＡ又は精製水の導入から９０分までのカルニチン取り込みの経時的変化を図２に示す。
ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独で注入した場合や、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独で注入した場合は、精製水を注入した場合に比べ、顕著な取り込みの上昇は見られなかったのに対し、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を共に注入した場合には、極めて高い取り込みが見られ、その取り込みは、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）を単独で注入した場合よりも顕著に高いものであった。このことから、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡに加えてＰＤＺＫ１ｃＲＮＡを卵母細胞内に導入することによって、用いるＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ量がわずかであっても、多量のＯＣＴＮ２ｃＲＮＡを単独で導入した場合と同様の輸送活性（トランスポーター活性）が得られることが示された。
【００７２】
５．ＹＦＰ融合ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡの合成及び発現細胞の観察
上記１．で用いたＯＣＴＮ２遺伝子をｐＥＹＦＰ−Ｃ１ベクターに組み込んだ後、インサート（ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２）部分をさらにｐｃＤＮＡ３に組み替えた。得られたベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、上記１．と同様の方法によって、ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡを作製した。このＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を、上記２．で得られたアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞を、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を加えたＭＢＳ中、１８℃で培養し、トランスジェニック卵母細胞を得た。
【００７３】
ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）に代えて、ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独をｃＲＮＡとして用いて、同様の操作を行い、トランスジェニック卵母細胞を得た。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００７４】
これら３種の卵母細胞について、それぞれｃＲＮＡ注入から３日間の培養を行った。培養後の卵毋細胞をそれぞれ前述のＭＢＳ中に浸し、卵母細胞が生きている状態のままで、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ５１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ社製）を用いて、卵母細胞表面のＹＦＰの蛍光を検出した。その結果を図３に示す。
ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡと共にＰＤＺＫ１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞は、ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡを単独で注入した卵母細胞と比較して、かなり強い蛍光強度を示すことが確認され、ＰＤＺＫ１はＯＣＴＮ２の細胞膜上での安定化に寄与していることが示唆された。
【００７５】
６．ＰＤＺＫ１をＰＥＰＴ１と共発現させることによる、ＰＥＰＴ１トランスポーター活性への影響
ＰＤＺＫ１をトランスポーターと共発現させることによる、トランスポーターの輸送活性の向上が、ＯＣＴＮ２以外のトランスポーターについても観察されるかどうかを調べるために、ＰＥＰＴ１トランスポーターを用いて以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＰＥＰＴ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＰＥＰＴ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００７６】
得られたこれら４種の卵母細胞について、ＰＥＰＴ１の基質であるグリシルサルコシン（Ｇｌｙ−Ｓａｒ）の取り込みを測定し、Ｃ／Ｍ比率（卵母細胞に取り込まれた量を、添加した薬物濃度で除した値）を算出した。グリシルサルコシンの取り込みは、上記３．（２）において、放射性標識化合物〔３Ｈ〕で標識したカルニチン１μＭを用いる代わりに、グリシルサルコシン２５０ｎＭを用いて同様の操作を行うことによって測定した。ｃＲＮＡ又は精製水の導入から９０分までのＣ／Ｍ比率の経時的変化を図４に示す。図４の結果から、ＰＥＰＴ１のｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合、グリシルサルコシンの取り込みは、水を注入した場合よりも高い値を示したが、さらにＰＤＺＫ１のｃＲＮＡ（５ｎｇ）をＰＥＰＴ１のｃＲＮＡと同時に注入したところ、グリシルサルコシンの取り込みは、ＰＥＰＴ１単独を注入した場合に比べて上昇した。すなわち、ＰＥＰＴ１を用いた場合も、ＯＣＴＮ２を用いた場合と同様に、ＰＤＺＫ１を共存させることにより、輸送活性の顕著な上昇が見られた。一方、ＰＤＺＫ１のｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合には、水を注入した場合と比べて取り込みの上昇はほとんど見られなかった。
【００７７】
７．ＰＤＺＫ１を共存させることによる、ＰＥＰＴ２の輸送活性測定感度への影響
ＰＤＺＫ１をトランスポーターと共発現させた場合に、基質の輸送活性が向上するだけでなく、基質輸送活性の測定における測定感度も上昇するかどうかを確認するために以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００７８】
得られたこれら４種の卵母細胞について、ＰＥＰＴ２の基質であるグリシルサルコシン（Ｇｌｙ−Ｓａｒ）の取り込みを測定した。グリシルサルコシンの取り込みは、上記６．と同様の方法を用いた。 ｃＲＮＡ又は精製水の導入から９０分までのグリシルサルコシンの取り込みの経時的変化を図５に示す。図５の結果から、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合は、グリシルサルコシンの取り込みは、水を注入した場合よりもわずかに高い値を示したに過ぎなかったが、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）をＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）と同時に注入したところ、グリシルサルコシンの取り込みは、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合に比べて大きく上昇した。すなわち、ＰＥＰＴ２を用いた場合も、ＯＣＴＮ２を用いた場合と同様に、ＰＤＺＫ１を共存させることにより、輸送活性の顕著な上昇が見られた。
【００７９】
８．ＰＤＺＫ１を共存させることによる、ＯＣＴＮ１の輸送活性測定感度への影響
上記７．と同様のＰＤＺＫ１による影響が、ＯＣＴＮ１に対しても見られるかどうかを確認するために以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。
【００８０】
得られたこれら２種の卵母細胞について、ＯＣＴＮ１の基質である有機カチオンテトラエチルアンモニウム（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ：ＴＥＡ）の取り込みを、基質濃度を変化させて検討した。その結果を図６に示す。図６の結果からわかるように、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を同時に注入した場合は、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独で注入した場合に比べ、輸送のＶｍａｘが上昇し、Ｋｍには変化がなかった。この結果は、ＰＤＺＫ１を共存させるとＯＣＴＮ１による有機カチオン輸送が上昇すること、輸送の上昇は主に輸送キャパシティーの変化に起因し、親和性にはあまり影響を与えないことを示す。
なお、図６のグラフにおいては、導入したＯＣＴＮ１トランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＣＴＮ１トランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだＴＥＡ量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００８１】
９．ＰＤＺＫ１を共存させること、又はさらに別のアダプターも併用することによる、ＯＡＴＰ−Ａの輸送活性測定感度への影響
上記７．と同様のＰＤＺＫ１による影響がＯＡＴＰ−Ａに対しても見られるか、及び、ＰＤＺＫ１以外にもアダプターを併用した場合の影響はどのようなものかを確認するために以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞や、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）の３種のｃＲＮＡを併用したトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。
【００８２】
得られたこれら３種の卵母細胞について、ＯＡＴＰ−Ａの基質であるタウロコール酸（ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ：ＴＣＡ）の取り込みを測定した。その結果を図７に示す。図７から分かるように、ＯＡＴＰ−Ａ（５ｎｇ）ｃＲＮＡを単独で注入した時に比べ、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とを同時に注入すると、ＯＡＴＰ−Ａによるタウロコール酸の取り込みのＫｍにはそれほど大きな変化はない一方でＶｍａｘは上昇した。このことから、ＰＤＺＫ１はＯＡＴＰ−Ａの輸送を促進し、その効果はＯＣＴＮ１のケースと同様、主にＶｍａｘの上昇に起因することが示された。
また、ＯＡＴＰ−Ａ、ＰＤＺＫ１及びＮＨＥＲＦ１の３種を共発現させた場合のＯＡＴＰ−ＡによるＴＣＡの輸送は、ＯＡＴＰ−Ａ単独の場合や、ＯＡＴＰ−Ａ及びＰＤＺＫ１を併用した場合よりもさらに高く、Ｖｍａｘが上昇していた。
なお、図７のグラフにおいては、導入したＯＡＴＰ−Ａトランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＡＴＰ−ＡトランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだＴＣＡ量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００８３】
１０．複数のアダプターを共存させることによる、輸送測定感度への影響
（１）複数のアダプターを共存させることによる、輸送測定感度への影響を調べるために、以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した（ＯＣＴＮ２ ａｌｏｎｅ）。また、導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＰＤＺＫ１）、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＮＨＥＲＦ１）、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＮＨＥＲＦ２）、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＰＤＺＫ２）、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＰＤＺＫ１＆ＮＨＥＲＦ１）についても同様の方法により作製した。ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１及びＮＨＥＲＦ２はいずれも、ＰＤＺＫ１と同様に、ＰＤＺドメインを有するタンパク質として知られている。
【００８４】
得られたこれら６種の卵母細胞について、上記３．（２）と同様の方法により、カルニチンの取り込みを測定した。その実験結果を図８に示す。図８の結果から分かるように、ＯＣＴＮ２ ａｌｏｎｅのカルニチン取り込みに比べ、＋ＰＤＺＫ１では顕著な取り込み上昇が見られたのに対し、＋ＰＤＺＫ２、＋ＮＨＥＲＦ１、＋ＮＨＥＲＦ２では取り込みの促進は見られず、輸送促進効果はＰＤＺＫ１特異的であることが示された。一方、＋ＰＤＺＫ１＆ＮＨＥＲＦ１では、ＯＣＴＮ２ ａｌｏｎｅや＋ＰＤＺＫ１と比べて、ＯＣＴＮ２によるカルニチン取り込みが顕著に高かった。
なお、図８のグラフにおいては、導入したＯＣＴＮ２トランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＣＴＮ２トランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだカルニチン量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００８５】
（２）さらに、取り込みの時間推移を検討することにより、図８に示す結果を確認した。
図８の実験で用いたトランスジェニック卵母細胞以外のトランスジェニック卵母細胞として、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とを用いたトランスジェニック卵母細胞を用意した。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００８６】
これらの６種の卵母細胞について上記３．（２）と同様の方法により、カルニチンの取り込みを測定した。その実験結果を図９に示す。図９の結果から分かるように、水を注入した場合に比べ、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を注入した場合や、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を共に注入した場合には、カルニチン取り込みはほとんど上昇せず、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合にも取り込み活性はさほど顕著ではなかった。これに対し、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を３つ同時に注入した場合のカルニチンの取り込みは、ＯＣＴＮ２単独やＯＣＴＮ２＋ＰＤＺＫ１共発現に比べても顕著に高かった。従って、ＰＤＺＫ１とＮＨＥＲＦ１を同時にＯＣＴＮ２と共発現させると、ＰＤＺＫ１だけをＯＣＴＮ２と共発現させた場合より、さらに高い基質輸送活性が得られることが示された。
【００８７】
１１．アダプターと複数のトランスポーターを共存させることによる、輸送測定感度への影響
（１）前述の結果に示されているように、ＰＤＺＫ１を共存させることにより、わずか５ｎｇのトランスポーターｃＲＮＡの注入で、トランスポーターｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合よりも顕著に高い輸送活性をアフリカツメガエル卵母細胞で再現することができる。このことは、一つの卵母細胞に複数のトランスポーターを同時に発現させ、かつ、それらの複数のトランスポーターについて十分な活性を得ることを可能にする。肝臓、腎臓、小腸、脳など種々の臓器細胞には複数のトランスポーター遺伝子が同時に発現し、薬物動態に関与していることから、このような複数のトランスポーター遺伝子発現系は、より生理的な系に近い実験系である。
そこで、トランスポーターとしてＯＣＴＮ２とＳＬＣ２６Ａ３とを併用し、ＯＣＴＮ２とＰＤＺＫ１とＳＬＣ２６Ａ３の３者を同時に発現させた（注入にはそれぞれ５ｎｇのｃＲＮＡ量を使用）。トランスジェニック卵母細胞の作製方法は、前述の方法にしたがった。得られたトランスジェニック卵母細胞についてＯＣＴＮ２によるカルニチン取り込みを測定した。その結果を図１０に示す。図１０の結果から分かるように、ＯＣＴＮ２単独やＯＣＴＮ２＋ＳＬＣ２６Ａ３による輸送に比べ、ＯＣＴＮ２、ＰＤＺＫ１、ＳＬＣ２６Ａ３を３者で共発現させた時に、最も顕著な輸送活性が見られた。
なお、図１０のグラフにおいては、導入したＯＣＴＮ２トランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＣＴＮ２トランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだカルニチン量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００８８】
この輸送促進の原因として考えられる仮説を図１１に示す。ＳＬＣ２６Ａ３は、２個のＣｌ−を細胞内に取り込むと同時に１個のＨＣＯ３−細胞外に排出する（合計１個のマイナス電荷が細胞内に入る）。一方、ＯＣＴＮ２によるカルニチン輸送はＮａ＋依存的であり、カルニチンはプラスとマイナスの電荷をそれぞれ一つずつ持つ両極性化合物であることから、合計１個のプラスの電荷が細胞内に入ると考えられる。従って、ＳＬＣ２６Ａ３をＯＣＴＮ２と同時に導入することによって、そのプラス電荷が打ち消されることが推測される。この仮説を検証する目的で、ＳＬＣ２６Ａ３の代わりにＳＬＣ２６Ａ６を同時に発現させると、輸送促進は見られなかった（図１０）。図１１に示すように、ＳＬＣ２６Ａ６は、１個のＣｌ−を細胞内に取り込むと同時に２個のＨＣＯ３−細胞外に排出するため、ＯＣＴＮ２が取り込むプラスの電荷が打ち消されない結果、取り込み促進が見られないばかりか、ＯＣＴＮ２を単独発現した場合と比べて取り込みの低下が見られたものと考えられる。
【００８９】
（２）上記１１．（１）における、ＯＣＴＮ２とＳＬＣ２６Ａ３に代えて、ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２をトランスポーターとして用い、上記１１．（１）と同様の実験を行った。ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２とＰＤＺＫ１の３者を同時に発現させる際に注入に用いたｃＲＮＡはそれぞれ５ｎｇであった。得られたトランスジェニック卵母細胞について、ＯＣＴＮ１の基質であるＴＥＡの取り込みを測定した。ＴＥＡの濃度は、２０ｍＭのものと、１０μＭのものの２種類を用いた。また、比較として、ＰＤＺＫ１を単独で注入して得られたトランスジェニック卵母細胞のＴＥＡの取り込みも測定した。その結果を図１２に示す。また、図１３には、ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２とＰＤＺＫ１の３者を同時に発現させた場合のその概念図を示す。
図１２から分かるように、ＴＥＡの濃度の違いは、ＯＣＴＮ１による取り込み量（基質濃度で除した値；μＬ／ｏｏｃｙｔｅで表示）の違いにはほとんど影響を与えなかった。
一方、図６に記載されているように、ＯＣＴＮ１によるＴＥＡ輸送のＫｍは１００〜２００μＭであり、２０ｍＭではＯＣＴＮ１が完全に飽和するはずである。にもかかわらず、図１２に示されるとおり、ＯＣＴＮ１による輸送活性が２０ｍＭでも顕著に認められたことは、ＯＣＴＮ１がＰＥＰＴ２やＰＤＺＫ１と共発現することで、その輸送キャパシティーが上昇することを示唆している。ＯＣＴＮ１はプロトンＨ＋と有機カチオンの交換輸送系として働くのに対し、ＰＥＰＴ２はＨ＋と基質の共輸送体である。従ってＰＥＰＴ２が存在することにより、Ｈ＋が細胞内へ入り、そのＨ＋との交換輸送によってＴＥＡが細胞内に入ること、ＰＤＺＫ１が両方のトランスポーターと相互作用することにより、両者を近接させることを示唆する。ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２はともに腎臓の近位尿細管刷子縁膜上に共発現していることから、生理的にも図１３のような複合体による輸送系が存在していると考えられる。アフリカツメガエル卵母細胞におけるこのような実験系は、ＰＤＺＫ１を共存させることによって、それぞれの少ないｃＲＮＡ量を注入することで手軽に作成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後及び７日後におけるカルニチン（１μＭ）取り込み（９０分間、ｐＨ７．４）を測定した。また、それぞれの条件下での３日後の値を１００％として示してある。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ （Ｎ＝５−１０）。＊は３日後と比べて有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【図２】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、及び水を注入した卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後におけるカルニチン（１μＭ）の取り込みの時間推移（ｐＨ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝５−１０）。
【図３】ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、及び水を注入した卵母細胞のそれぞれの卵母細胞表面の共焦点顕微鏡観察写真である。
【図４】ＰＥＰＴ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＥＰＴ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、水を注入した卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後におけるグリシルサルコシンの取り込みの時間推移（ｐＨ６．０）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝９−１２）。
【図５】ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、水を注入した卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後におけるグリシルサルコシンの取り込みの時間推移（ｐＨ６．０）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１２）。
【図６】ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後における種々の濃度のＴＥＡの取り込みの時間推移（ｐＨ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１０）。
【図７】ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１（５ｎｇ）の３種のｃＲＮＡを併用したトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡの注入から３日後における種々の濃度のＴＣＡの取り込みの時間推移（ｐＨ ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１０）。
【図８】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡの注入から３日後におけるカルニチンの取り込み（ｐＨ ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１０）。
【図９】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とを用いたトランスジェニック卵母細胞、水を注入した卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡの注入から３日後におけるカルニチンの取り込み（ｐＨ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１２）。
【図１０】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＳＬＣ２６Ａ３ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、及びＳＬＣ２６Ａ３ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＳＬＣ２６Ａ６ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、及びＳＬＣ２６Ａ６ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡの注入から３日後におけるカルニチンの取り込み（ｐＨ ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝５−１０）。
【図１１】本発明の、ＯＣＴＮ２とＰＤＺＫ１とＳＬＣ２６Ａ３を共発現した実験系におけるトランスポーターどうしのカップリング効果の概念を示す図である。
【図１２】ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とを用いたトランスジェニック卵母細胞、及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞について、ｃＲＮＡの注入から３日後におけるＴＥＡ（１０μＭ及び２０ｍＭ）の取り込み（ｐＨ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝５−１０）。
【図１３】本発明の、ＯＣＴＮ１とＰＤＺＫ１とＰＥＰＴ２を共発現した実験系におけるトランスポーターどうしのカップリング効果の概念を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞、及び該トランスジェニック卵母細胞を用いた、トランスポーターの被験物質に対するトランスポーター活性を高感度で評価する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の医薬品開発においては、候補化合物の分子サイズの増加に伴い、化合物の物理化学的特性（特に脂溶性等）に起因して、さまざまなタンパク質等に結合しやすい性質の化合物が多く合成される傾向にある。これら候補化合物の薬物輸送を評価する際にも、なるべくトランスポーター自身による輸送活性の高い実験系を構築することによって、化合物の細胞膜への吸着や結合と、細胞内部への輸送とを明確に区分することが望まれる。そのため、近年、製薬企業をはじめとする多くの研究グループが薬物を輸送するトランスポーターに注目している。
【０００３】
トランスポーターは、薬物の生体膜透過に寄与することで、薬物の吸収、分布、排泄に直接関与する。従って、基質となる薬物がトランスポーターによって輸送されるか否かは、薬物の吸収、分布、排泄等の体内動態を決定する重要な因子の一つである。また、肝臓等においては、薬物トランスポーターによる濃縮的な取り込みや排泄が基質薬物の細胞内非結合型濃度の大小を決定するため、トランスポーターによる認識性が、薬物代謝酵素に対する阻害効果の大小とも関連することが示唆されている。このように、ある薬物がトランスポーターによって輸送されるか否かを、簡便かつ正確に計測する実験系の確立は、新規医薬品の開発や既存医薬品の適正使用において重要な課題である。
【０００４】
トランスポーターによる輸送を計測する簡便な系として、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた実験系が確立されている。従来までに、上記のトランスポーターの輸送機能の評価系としては、第１の場所でトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を調製するステップと、第１の場所から離れた第２の場所にトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を輸送するステップとを含み、好ましくは、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞が、多様なヒト又は動物の膜タンパク質をコードするｃＲＮＡ又はｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入することにより調製され、さらなる態様では、少なくとも１つの容器及びその容器に配置された少なくとも１個のトランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を含む培養系が提供される、トランスジェニックアフリカツメガエル卵母細胞を提供する方法（例えば、特許文献１参照）や、 (ａ)１の薬物に対する一対のトランスポータータンパク質とエクスポータータンパク質とを細胞表面に共発現し、局在領域がオーバーラップしていない卵母細胞を用意する、(ｂ)該卵母細胞を、それぞれの局在領域に接触する細胞外液が、互いに接触しないように設計されたチャンバーにセットする、(ｃ)薬物を該卵母細胞のトランスポータータンパク質の局在領域に接触する細胞外液に添加する、(ｄ)一定時間後、トランスポータータンパク質の局在領域に接触している細胞外液又はエクスポータータンパク質の局在領域に接触している細胞外液を回収する、(ｅ)回収した外液中の薬物の量を測定すること、を含む、トランスポーターとしての有機アニオントランスポーター２（ＯＡＴＰ２）とエクスポータータンパク質としての多剤耐性蛋白質（ＭＲＰ２）等を対象とした、細胞における薬物の動態を簡便かつ容易にin vitroで検出するための方法、ならびに該方法に適した細胞及び細胞実験用チャンバー（例えば、特許文献２参照）が提案されている。
【０００５】
また、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のゲノム配列から予測されるＮａ+依存性トランスポーターｃＤＮＡについてアフリカツメガエルの卵母細胞発現系で高親和性コリン取り込み活性を調べることにより、線虫高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡ（ｃｈｏ−１）を同定し、このｃＤＮＡとの塩基配列の相同性を指標にラット脊髄からラット高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡ（ＣＨＴ１）や、ヒトゲノムからヒト高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡをクローニングする、生理的に重要である高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらを利用した高親和性コリントランスポーター活性促進物質のスクリーニング方法（例えば、特許文献３参照）や、生体を構成する種々の正常細胞並びに種々の腫瘍細胞などの病態関連異常細胞の生存及び増殖に必須な栄養素であるアミノ酸の細胞内への輸送を媒介するアミノ酸トランスポーター分子であって、特に正常細胞に比べ腫瘍細胞に特異的に発現の見られる新規アミノ酸トランスポーター分子を同定、単離し、該分子の生物活性及び／又は該分子の発現を阻害する薬剤を同定することにより、腫瘍（癌）等の種々の病態を治療することができる薬剤を提供する方法（例えば、特許文献４参照）や、ショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のｃＤＮＡライブラリーより、アフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた際のグルタミン酸の取り込みを指標とした、新規グルタミン酸トランスポーターをコードするｃＤＮＡの同定及びグルタミン酸トランスポーター活性阻害物質のスクリーニング方法（例えば、特許文献５参照）等が知られている。
【０００６】
一方、ヒトＨＥＫ２９３細胞において、アダプタータンパク質であるＰＤＺＫ１と、トランスポータータンパク質であるＯＣＴＮ２を共発現させたところ、ＯＣＴＮ２（Ｏｒｇａｎｉｃ ｃａｔｉｏｎ／ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−２）の輸送機能が向上したことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ヒトＨＥＫ２９３細胞以外の細胞における、ＰＤＺＫ１のＯＣＴＮ２への影響は知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３０４５０１号公報
【特許文献２】特開２００５−２２４１９０号公報
【特許文献３】特開２００１−１３６９７６号公報
【特許文献４】特開２０００−１５７２８６号公報
【特許文献５】特開平１０−９９０８３号公報
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｐｈｒｍａｃｏｌ．６７（３）：７３４−７４３，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アフリカツメガエル卵母細胞は、外来遺伝子のｃＲＮＡを卵母細胞内に注入することによって、遺伝子産物を細胞内又は表面に発現させることのできる簡便な実験系であり、多くの分子生物学的研究に汎用されている。しかしながら一般に、外来ｃＲＮＡを翻訳する効率には限界があるため、注入するｃＲＮＡ量は、通常、卵母細胞１個当り２５−５０ｎｇ以内に抑えられている。よって、この系を使ってトランスポーター遺伝子産物を発現させ、その輸送機能を評価しようとする場合でも、注入できるｃＲＮＡ量に限界があるために、その遺伝子産物量やそこから得られる輸送活性にも限界があった。本発明の課題は、輸送活性の高いトランスジェニック卵母細胞、及び該トランスジェニック卵母細胞を用いた、被験物質の輸送を評価するための高感度の実験系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アフリカツメガエルの卵母細胞を利用した輸送活性の評価系において、トランスポーターの輸送機能や細胞内での局在の制御機構であるＰＤＺ（ＰＳＤ−９５，Ｄｌｇ，ＺＯ−１）ドメインを有するアダプタータンパク質群（ＰＤＺＫ１，ＩＫＥＰＰ，ＮＨＥＲＦ１，ＮＨＥＲＦ２）と、トランスポーターとを共発現させることにより、上記課題を解決し得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、（１）１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（２）１種のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び２種のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種のトランスポータータンパク質及び２種のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（３）２種のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、２種のトランスポータータンパク質及び１種のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（４）トランスポータータンパク質をコードする核酸が、有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター及びペプチドトランスポーターからなる群から選ばれるトランスポータータンパク質をコードする核酸である上記（１）〜（３）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（５）トランスポータータンパク質をコードする核酸が、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２、ＯＡＴＰ−Ａ及びＳＬＣ２６Ａ３から選ばれるトランスポータータンパク質をコードする核酸である上記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（６）アダプタータンパク質をコードする核酸が、ＰＤＺドメインを有するアダプタータンパク質をコードする核酸である上記（１）〜（５）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（７）アダプタータンパク質をコードする核酸が、ＰＤＺＫ１、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２及びＩＫＥＰＰから選ばれるアダプタータンパク質をコードする核酸である上記（１）〜（６）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（８）アダプタータンパク質をコードする核酸として、ＰＤＺＫ１をコードする核酸を少なくとも含む上記（１）〜（７）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（９）核酸がｃＲＮＡである上記（１）〜（８）のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞や、（１０）ＯＡＴＰ−Ａトランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＡＴＰ−Ａトランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質と、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（１１）ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質と、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（１２）ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＳＬＣ２６Ａ３トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質と、ＳＬＣ２６Ａ３トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞や、（１３）ＯＣＴＮ１トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＥＰＴ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ１トランスポータータンパク質と、ＰＥＰＴ２トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞に関する。
【００１１】
また本発明は、（１４）１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードするｃＲＮＡと、１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードするｃＲＮＡとをアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクションにより導入し、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現させることを特徴とするトランスジェニック卵母細胞の製造方法に関する。
【００１２】
さらに本発明は、（１５）上記（１）〜（１３）のいずれか記載のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法；標識化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標識化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ(Ａ)、トランスジェニック卵母細胞への標識化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定するステップ(Ｂ)、測定結果を評価するステップ(Ｃ)や、（１６）上記（１）〜（１３）のいずれか記載のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法；標的化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標的化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ（Ａ’）、トランスジェニック卵母細胞への標的化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標的化合物の排出の程度を測定するステップ（Ｂ’）、測定結果を評価するステップ（Ｃ’）に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、輸送活性の高いトランスジェニック卵母細胞、及び該トランスジェニック卵母細胞を用いた、被験物質の輸送を評価するための高感度の実験系を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のトランスジェニック卵母細胞は、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現している限り特に制限はされない。
【００１５】
本発明に用いるアフリカツメガエルの卵母細胞は、アフリカツメガエルの卵母細胞である限り特に制限はされず、例えばＮＡＳＣＯ、Ｆｔ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ５３５３８などから入手することができる。
【００１６】
本発明に用いるトランスポータータンパク質の種類としては、そのトランスポータータンパク質をコードする核酸をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、その卵母細胞内で発現し、その発現産物であるタンパク質がトランスポーター活性を発揮し得る限り、特に制限されるものではないが、薬物動態に関連するトランスポーターであることが好ましく、薬物動態に関連するトランスポーターとしては、有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター、ペプチドトランスポーター、糖トランスポーター、アミノ酸トランスポーター、ヌクレオシドトランスポーター、小腸上皮細胞刷子縁膜トランスポーター、その他のＳＬＣ（Ｓｏｌｕｔｅ Ｃａｒｒｉｅｒ）ファミリートランスポーター、ＡＢＣトランスポーター等を挙げることができるが、少なくとも有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター、ペプチドトランスポーター、糖トランスポーター、ＳＬＣファミリートランスポーターを含むことが好ましい。
【００１７】
上記有機アニオントランスポーターとしては、例えばＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、ＯＡＴ４、ＯＡＴＰ−Ａ、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅ、ＯＡＴＰ−８、ＰＧＴ、ＯＡＴ−Ｋ１、ＮＰＴ１、ＭＣＴ１、ＡＥ２等を挙げることができ、有機カチオントランスポーターとしては、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ３、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＯＣＴＮ３等を挙げることができ、ペプチドトランスポーターとしては、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２等を挙げることができ、アミノ酸トランスポーターとしては、ＬＡＴ、ＣＡＴ、ＥＡＡＴ等を挙げることができ、神経伝達物質トランスポーターとしては、ＧＡＴ１、ＧＡＴ２、ＮＥＴ１、ＳＥＲＴ等を挙げることができ、胆汁酸トランスポーターとしては、ＮＴＣＰ、ＡＳＢＴ等を挙げることができ、ＡＢＣトランスポーターとしては、ＭＤＲ１、ＭＲＰ２等を挙げることができ、ヌクレオシドトランスポーターとしては、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２等を挙げることができ、糖トランスポーターとしては、ＳＧＬＴ１等を挙げることができ、ＳＬＣファミリートランスポーターとしては、ＳＬＣ２６Ａ３等を挙げることができる。これらの中でも少なくとも、薬物輸送に関して特に重要なトランスポーターとしては、オリゴペプチドトランスポーターＰＥＰＴ１、モノカルボン酸トランスポーターＭＣＴ１、有機アニオントランスポーターＮＰＴ１、ＯＡＴＰ−Ａ、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅ、ＯＡＴＰ−８、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３及びＡＥ２、並びに有機カチオントランスポーターＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２及びＯＣＴＮ３を具体的に挙げることができる。
【００１８】
以下の表１〜３に、上述したトランスポーターを含む、従来報告されているトランスポーターの種類、名称、遺伝子バンクにおけるアクセッションナンバー、報告文献名、組織分布、輸送する基質の一覧表を示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
本発明に用いるトランスポータータンパク質は、１種類であってもよいが、より優れた輸送活性（例えば輸送速度）を得る観点や、よりインビボの環境に近づけ得るという観点から、２種類以上を併用することが好ましく、より具体的には、本願明細書に具体的に例示されたトランスポータータンパク質から選ばれる２種以上のトランスポータータンパク質を用いることが好ましく、ＯＣＴＮ２とＳＬＣ２６Ａ３の組み合わせ、ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２の組み合わせがより好ましい。
【００２３】
２種以上のトランスポータータンパク質を併用することによる、輸送活性向上の作用機作については、２種以上のトランスポータータンパク質を併用することにより、併用したいずれかのトランスポーターの活性が、そのトランスポーターを単独で用いた場合に比べて向上している限り特に制限されないが、例えば、２種以上のトランスポータータンパク質が、それぞれの基質を輸送することによって生じる膜内外間の電荷の偏りを互いに低減する２種以上のトランスポータータンパク質であることが好ましい。具体的には、例えば、ＳＬＣ２６Ａ３とＯＣＴＮ２は、以下のように膜内外間の電荷の偏りを互いに低減させることにより、互いのトランスポーター活性を向上させるものと考えられる。
ＳＬＣ２６Ａ３は、２個のＣｌ−を細胞内に取り込むと同時に１個のＨＣＯ３−細胞外に排出する（合計１個のマイナス電荷が細胞内に入る）。一方、ＯＣＴＮ２によるカルニチン輸送はＮａ＋依存的であり、カルニチンはプラスとマイナスの電荷をそれぞれ一つずつ持つ両極性化合物であることから、ＯＣＴＮ２は、カルニチンを細胞内に取り込むと、合計１個のプラスの電荷が細胞内に入ると考えられる。従って、ＳＬＣ２６Ａ３をＯＣＴＮ２と同時に導入すると、ＯＣＴＮ２がカルニチンを取り込む際に生じる１個のプラス電荷が、ＳＬＣ２６Ａ３が取り込む１個のマイナス電荷によって打ち消されると考えられる。同様の電荷の打消しは、ＰＥＰＴ２とＯＣＴＮ１の組み合わせでも見られると考えられる。
【００２４】
トランスポータータンパク質の由来としては、そのトランスポータータンパク質をコードする核酸をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、その卵母細胞内で発現し、その発現産物であるタンパク質がトランスポーター活性を発揮し得る限り、特に制限されるものではないが、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウス等を挙げることができ、好ましくはヒト、サル、イヌ、ラット、マウス等を挙げることができる。トランスポータータンパク質を複数種用いるときに、それぞれのトランスポータータンパク質の由来は同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００２５】
本発明に用いるトランスポータータンパク質をコードする核酸の種類としては、そのトランスポータータンパク質をコードする核酸をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、その卵母細胞内で発現し、その発現産物であるタンパク質がトランスポーター活性を発揮し得る限り、特に制限されるものではないが、具体的には、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡを挙げることができ、より高い形質転換効率を得る観点から、ｃＲＮＡを特に好ましく挙げることができる。
【００２６】
本発明に用いるアダプタータンパク質の種類としては、本発明に用いるいずれかのトランスポータータンパク質をコードする核酸と共にアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、〔１〕その卵母細胞内で発現し、かつ、〔２〕アダプタータンパク質をコードする核酸を単独で導入した場合と比べて、卵母細胞のトランスポーター活性が上昇するようなものである限り、特に制限はされるものではないが、ＰＤＺドメインを有するアダプタータンパク質を好ましく挙げることができ、より具体的には、ＰＤＺＫ１、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２、ＩＫＥＰＰをさらに好ましく挙げることができる。
【００２７】
ここで、ＰＤＺドメインとは、ＰＳＤ−９５，Ｄｌｇ，ＺＯ−１と呼ばれる３つのタンパク質が共通して持つアミノ酸８０〜９０個からなる構造ユニットであり、このドメインがトランスポーターのＣ末端に位置するアミノ酸を認識して結合することが知られている。ＰＤＺドメインのコンセンサス配列はＮＣＢＩにも記載されている（ＮＣＢＩ Ｎｏ．ｃｄ００９９２）。
本発明において、ＰＤＺドメインを有するアダプタータンパク質とは、上記ＰＤＺドメインのコンセンサス配列（ＮＣＢＩ Ｎｏ．ｃｄ００９９２）に対して相同性３０％以上、好ましくは３３％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは３６％以上、最も好ましくは３７％以上のアミノ酸配列を有するアダプタータンパク質をいう。
【００２８】
本発明に用いるアダプタータンパク質は、１種類であってもよいが、より優れた輸送活性促進効果を得る観点から、２種類以上併用することが好ましく、具体的にはＰＤＺＫ１、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２及びＩＫＥＰＰから選ばれる２種以上のアダプタータンパク質を用いることがより好ましく、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２及びＩＫＥＰＰから選ばれる１種又は２種以上のアダプタータンパク質と、ＰＤＺＫ１とを併用することがさらに好ましく、ＰＤＺＫ１とＮＨＥＲＦ１の組み合わせが特に好ましい。
【００２９】
本発明に用いるアダプタータンパク質をコードする核酸の種類としては、本発明に用いるいずれかのトランスポータータンパク質をコードする核酸と共にアフリカツメガエルの卵母細胞に導入した場合に、〔１〕その卵母細胞内で発現し、かつ、〔２〕アダプタータンパク質をコードする核酸を単独で導入した場合と比べて、卵母細胞のトランスポーター活性が上昇するようなものである限り、特に制限はされるものではないが、具体的には、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡを挙げることができ、より高い形質転換効率を得る観点から、ｃＲＮＡを特に好ましく挙げることができる。
【００３０】
本発明に用いるトランスポータータンパク質をコードする核酸やアダプタータンパク質をコードする核酸は、例えば前述の表１〜３に記載されたアクセッション番号等を参照して所望のトランスポータータンパク質やアダプタータンパク質の配列情報を入手し、該配列情報に基づいて適当なプライマーを作製し、例えば所望の生物のＤＮＡライブラリー等のテンプレートを入手又は作製して、ＰＣＲ反応を行うこと等によって入手することができる。核酸を作製するための実験プロトコールとしては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２００１等に記載された方法を利用することができる。
【００３１】
本発明のトランスジェニック卵母細胞を作製する方法としては、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸と、１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸とをアフリカツメガエルの卵母細胞に導入し、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現させる方法である限り特に制限されず、任意の既知の技法を用いることができるが、形質転換効率が優れていることから、本発明に用いるトランスポータータンパク質をコードする核酸及びアダプタータンパク質をコードする核酸をアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクションにより導入する方法を好ましく挙げることができる。マイクロインジェクションによる核酸の導入は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ I−III，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｄ．１９９４や、Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，１０，１−１２などに記載の標準的な方法により行うことができる。
【００３２】
アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するトランスポータータンパク質をコードする核酸の量は、アフリカツメガエルの卵母細胞へ導入可能な範囲であれば特に制限されず、何種類のトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、何種類のアダプタータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、どのような種類の核酸を用いるかという点等により左右されるため、一概に言うことはできないが、例えば核酸の種類がｃＲＮＡである場合、トランスポータータンパク質１種類につき、該トランスポータータンパク質をコードするｃＲＮＡを２〜４８ｎｇ用いることが好ましく、２〜３０ｎｇ用いることがより好ましく、３〜２０ｎｇ用いることがさらに好ましく、３〜１０ｎｇ用いることがさらにより好ましく、４〜６ｎｇ用いることがよりさらに好ましい。トランスポータータンパク質の種類が２種以上である場合、トランスポータータンパク質をコードするｃＲＮＡは合計で、４〜４８ｎｇ用いることが好ましく、６〜４０ｎｇ用いることがより好ましく、６〜３０ｎｇ用いることがさらに好ましく、８〜２０ｎｇ用いることがさらにより好ましい。
【００３３】
また、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するアダプタータンパク質をコードする核酸の量は、アフリカツメガエルの卵母細胞へ導入可能な範囲であれば特に制限されず、何種類のアダプタータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、何種類のトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、どのような種類の核酸を用いるかという点等により左右されるため、一概に言うことはできないが、例えば核酸の種類がｃＲＮＡである場合、アダプタータンパク質１種類につき、該アダプタータンパク質をコードするｃＲＮＡを２〜４８ｎｇ用いることが好ましく、２〜３０ｎｇ用いることがより好ましく、３〜２０ｎｇ用いることがさらに好ましく、３〜１０ｎｇ用いることがさらにより好ましく、４〜６ｎｇ用いることがよりさらに好ましい。アダプタータンパク質の種類が２種以上である場合、アダプタータンパク質をコードするｃＲＮＡは合計で、４〜４８ｎｇ用いることが好ましく、６〜４０ｎｇ用いることがより好ましく、６〜３０ｎｇ用いることがさらに好ましく、８〜２０ｎｇ用いることがさらにより好ましい。
【００３４】
また、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するトランスポータータンパク質をコードする核酸の量と、アダプタータンパク質をコードする核酸の量との合計量は、アフリカツメガエルの卵母細胞へ導入可能な範囲であれば特に制限されず、何種類のアダプタータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、何種類のトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入するかという点や、どのような種類の核酸を用いるかという点等により左右されるため、一概に言うことはできないが、例えば核酸の種類がｃＲＮＡである場合、合計４〜５０ｎｇ用いることが好ましく、６〜４０ｎｇ用いることがより好ましく、８〜４０ｎｇ用いることがさらに好ましく、１０〜３０ｎｇ用いることがさらにより好ましい。アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するトランスポータータンパク質をコードする核酸の量と、アダプタータンパク質をコードする核酸の量との合計量が５０ｎｇを超えると、アフリカツメガエルの卵母細胞を形質転換することは困難である。
【００３５】
また、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入するトランスポータータンパク質をコードする核酸の量と、アダプタータンパク質をコードする核酸の量との比率は、トランスポータータンパク質をコードする核酸を単独で用いた場合と比較して、トランスポーター活性の促進が見られる限り特に制限はなく、何種類のトランスポータータンパク質やアダプタータンパク質を用いるかという点等により左右されるため一概に言うことはできないが、トランスポータータンパク質をコードする核酸の量：アダプタータンパク質をコードする核酸の量を、好ましくは１：５〜５：１、より好ましくは１：３〜３：１、さらに好ましくは１：２〜２：１、さらにより好ましくは２：３〜３：２とすることができる。
【００３６】
本発明の薬物動態の検出方法は、本発明のトランスジェニック卵母細胞を用いる方法であれば特に制限はされないが、本発明のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法を好ましく挙げることができる。
・標識化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標識化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ（Ａ）
・トランスジェニック卵母細胞への標識化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定するステップ（Ｂ）
・測定結果を評価するステップ（Ｃ）
【００３７】
ステップ（Ａ）の標識化合物としては、例えば、動態を調べたい薬物等の化合物を標識したものや、動態を調べたい薬物等の化合物の代謝産物を標識したものを用いることができる。標識に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素、スピン試薬などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕、〔５９Ｆｅ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
【００３８】
ステップ（Ａ）における、「標識化合物と本発明のトランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションする」は、標識化合物と、本発明のトランスジェニック卵母細胞とを接触させ、標識化合物が本発明のトランスジェニック卵母細胞に取り込まれ得る条件下でインキュベーションする限り特に制限されず、例えば適当な卵母細胞用バッファーに標識化合物を溶解し、その溶解液に本発明のトランスジェニック細胞を浸して一定時間インキュベーションすることを好ましく挙げることができる。
【００３９】
また、ステップ（Ａ）における、「標識化合物を細胞内に含有させた本発明のトランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションする」は、細胞内に標識化合物を含有させた本発明のトランスジェニック卵母細胞と、バッファーとを接触させ、該標識化合物が本発明のトランスジェニック卵母細胞外へ排出され得る条件下でインキュベーションする限り特に制限されず、例えば適当な方法で標識化合物を細胞内に含有させた本発明のトランスジェニック卵母細胞を、適当な卵母細胞用バッファーに浸して一定時間インキュベーションすることを好ましく挙げることができる。
標識化合物をトランスジェニック卵母細胞に含有させる方法としては、標識化合物をトランスジェニック卵母細胞に含有させることができ、かつ、そのトランスジェニック卵母細胞に含有させた標識化合物の量を把握することができる方法であれば特に制限されないが、操作が簡便である点、及び含有させた標識化合物の量を把握することが容易である点から、標識化合物をトランスジェニック卵母細胞に注入する方法を好ましく挙げることができる。
【００４０】
ステップ(Ｂ)における、トランスジェニック卵母細胞への標識化合物の取込みの程度を測定する方法としては、特に制限されず、用いた標識剤に合わせて適当な方法を選択することができる。具体的には、例えば標識剤として放射性同位元素を用いた場合は液体シンチレーションカウンター等を、標識剤として蛍光物質等を用いた場合はフルオロメーター等を用いて、トランスジェニック卵母細胞内の標識化合物の量を測定することによって、トランスジェニック卵母細胞への取り込みの程度を測定することができる。また、標識化合物の質量スペクトルが知られていれば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等を用いて、トランスジェニック卵母細胞内の標識化合物の量を測定することによって、トランスジェニック卵母細胞への取り込みの程度を測定することができる。
なお、トランスジェニック卵母細胞内の標識化合物の量を測定する際には、トランスジェニック卵母細胞の周りに付着した標識化合物を除去するために、トランスジェニック卵母細胞を適当なバッファーで洗浄することが好ましい。
【００４１】
ステップ（Ｂ）における、トランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定する方法としては、特に制限されず、用いた標識剤に合わせて適当な方法を選択することができる。具体的には、例えば液体シンチレーションカウンター、フルオロメーター等を用いて、インキュベーション後バッファー中の標識化合物の量を測定することによって、トランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定することができる。測定する際には、トランスジェニック卵母細胞の周りに付着した標識化合物も、トランスジェニック卵母細胞から排出された標識化合物としてカウントするために、トランスジェニック卵母細胞を適当なバッファーで洗浄し、その洗浄後のバッファーを前述のインキュベーション後のバッファーに加えて、その中の標識化合物の量を測定することが好ましい。
【００４２】
なお、動態を調べたい化合物が、トランスジェニック卵母細胞内に存在しない化合物である場合は、標識していないその化合物を、本発明における標識化合物に代えて、本発明の方法に使用することもできる。本発明においては、そのような化合物も、便宜上標識化合物に含める。
【００４３】
ステップ（Ｃ）における、測定結果を評価するステップとしては、特に制限されないが、例えば、薬物動態の検出方法に用いたトランスジェニック卵母細胞に導入したトランスポータータンパク質が、用いた標識化合物を認識して輸送するかどうかを評価したり、用いた標識化合物をどの程度輸送するのかを、他のトランスポータータンパク質を導入したトランスジェニック卵母細胞を用いたデータと比較することにより評価すること等を挙げることができる。
【００４４】
また、本発明の薬物動態の検出方法に含まれる別の好ましい態様として、以下のステップを含む薬物動態の検出方法を挙げることができる。
・標的化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標的化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ（Ａ’）
・トランスジェニック卵母細胞への標的化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標的化合物の排出の程度を測定するステップ（Ｂ’）
・測定結果を評価するステップ（Ｃ’）
【００４５】
ここで、標的化合物とは、動態を調べたい薬物等の化合物や、動態を調べたい薬物等の化合物の代謝産物を意味する。また、前述のステップ（Ａ’）、（Ｂ’）、（Ｃ’）は、ステップ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）における標識化合物を、標的化合物に置き換えた場合と同様であるが、ステップ（Ｂ’）においては標的化合物を標識に頼らずに測定する必要がある。このような測定は、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等を用いるなどして行うことができる。
【００４６】
本発明における被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング法は、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞を用いる方法であれば特に制限はされないが、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞への被験物質の取込みの程度を測定することにより、被験物質を輸送するトランスポーターを同定する方法や、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞からの被験物質の排出の程度を測定することにより、被験物質を輸送するトランスポーターを同定する方法を好ましく挙げることができる。
【００４７】
また、本発明におけるトランスポーターを認識する物質のスクリーニング法は、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞を用いる方法であれば特に制限されないが、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞への被験物質の取込みの程度を測定することにより、トランスポーターに認識される物質を同定する方法や、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞からの被験物質の排出の程度を測定することにより、トランスポーターに認識される物質を同定する方法を好ましく挙げることができる。
【００４８】
さらに、本発明におけるトランスポーターの被験物質に対するトランスポーター活性を評価する方法は、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞を用いる方法であれば特に制限されないが、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞への被験物質の取込みの程度を測定することにより、トランスポーターの被験物質に対するトランスポーター活性を評価する方法や、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞からの被験物質の排出の程度を測定することにより、トランスポーターの被験物質に対するトランスポーター活性を評価する方法を好ましく挙げることができる。
【００４９】
本発明のスクリーニング法や評価法における、上記本発明のトランスジェニック卵母細胞への被験物質の取込みの程度を測定する手段は、被験物質の取込みの程度を測定し得る限り特に制限されず、前述の薬物動態の検出方法におけるのと同様の方法を用いることができる。
【００５０】
本発明のトランスジェニック卵母細胞においては、トランスポータータンパク質とアダプタータンパク質を共発現させることによって、導入したトランスポータータンパク質のトランスポーター活性が向上している。トランスポーター活性の向上の詳細な作用機作は不明であるが、アダプタータンパク質が共発現することによって、トランスポータータンパク質が細胞膜上で安定化する結果、より多くのトランスポータータンパク質が細胞膜上に発現し、より十分なトランスポーター活性をより長時間発揮することによるものと考えられる。
【００５１】
本発明のトランスジェニック卵母細胞は、導入したトランスポータータンパク質のトランスポーター活性が向上しているため、トランスポータータンパク質を単独で導入して得られたトランスジェニック卵母細胞に比べて、被験物質の輸送を評価するための実験系に用いた場合に、より高感度な実験系が得られる。
【００５２】
また、トランスポータータンパク質に加えてアダプタータンパク質を共発現させると、トランスポータータンパク質の核酸とアダプタータンパク質の核酸を合計したとしても、トランスポータータンパク質の核酸を単独で導入する場合に比べて、より少ない核酸量でより高いトランスポーター活性を得ることができる。このことは、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いる場合は以下のような理由により特に有利な効果をもたらす。アフリカツメガエルの卵母細胞は、卵母細胞１個当たりに導入可能な核酸量（例えばｃＲＮＡ量）は、２５〜５０ｎｇであるとされている。そのため、アフリカツメガエルの卵母細胞へ、２以上のトランスポーターの導入をするとした場合、トランスポーター１つ当たりについて導入し得る核酸量の上限はかなり少量に限られてしまい、いずれのトランスポーターについても中途半端な活性しか得られず、実用性の低い実験系しか得られない。しかし、本発明のように、アダプタータンパクを共発現させることにより、２つ以上のトランスポーターを導入した場合であっても、それぞれのトランスポーターについて十分なトランスポーター活性を得ることが可能となったことによって、対象とする臓器や細胞に共通して発現する複数のトランスポーターを１個の卵母細胞に発現させるなどして、対象とする臓器や細胞におけるある特定の基質の輸送を実用的なレベルで一度に評価することが可能となり、従来のものより、インビボに近いインビトロ系の人工細胞（ヒト又は動物の細胞に模した細胞）を構築することが可能となった。
【００５３】
また、上述のように、本発明では、アダプタータンパクを共発現させることにより、１つのトランスポータータンパク質について導入する核酸が少量で済むようになった。そのため、本発明では、アダプタータンパクを１種ではなく、２種以上導入することも可能となり、その結果、より高いトランスポーター活性を得ることができるようになった。
【００５４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５５】
１.トランスポーター及びＰＤＺアダプターのｃＲＮＡの合成
トランスポーター及びＰＤＺアダプターのｃＲＮＡを合成する際に用いるトランスポーター及びＰＤＺアダプターのｃＤＮＡの作製又は入手を行った。以下の表４に、ｃＤＮＡを作製又は入手したトランスポーターの名称と、該トランスポーターの作製方法又は入手方法に関する情報を示す。
【００５６】
【表４】
【００５７】
また、以下の表５に、ｃＤＮＡを作製又は入手したアダプターの名称と、該アダプターの作製方法又は入手方法に関する情報を示す。
【００５８】
【表５】
【００５９】
以下の表６に記載されたトランスポーターのｃＤＮＡを組み込んだプラスミドベクター、及び、表７に記載されたＰＤＺアダプターのｃＤＮＡを組み込んだプラスミドベクターを、それぞれの表に記載された制限酵素で処理して直鎖状にした後、ＱＩＡ Ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、トランスポーター及びＰＤＺアダプターのｃＤＮＡの精製を行った。
【００６０】
【表６】
【００６１】
【表７】
【００６２】
得られたｃＤＮＡ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡ Ｍａｘｘ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ｃＲＮＡの合成を行った後、Ｒｉｂｏ ｍ７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＲＮＡの５’末端をキャッピングした。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応の際に残った鋳型ＤＮＡを除くために、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを、５’末端がキャッピングされたｃＲＮＡに加えてＤＮａｓｅ処理を行った。その後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡの精製を行った。なお、Ｋｉｔ使用の際には、付属の標準プロトコールに従って操作した。
【００６３】
２．卵母細胞の採取
アフリカツメガエルを氷水中に３０分〜１時間静置し、冬眠状態にさせた。アフリカツメガエルの腹部の表皮をピンセットで摘んで切開した後、薄皮と筋層を切開して卵母細胞を摘出し、後述の組成のＯＲ２で洗浄した。次いで、卵母細胞をＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０ｍＬ（２．０ｍｇ／ｍＬ，ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ＯＲ２）に浸漬し、１８℃、１８０ｒｐｍで３０分間振盪してＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ処理した。その後、卵母細胞をＯＲ２で５回以上洗い、最後に、ＯＲ２を後述の組成のＭＢＳ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｒｔｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で置換した。Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ処理では、濾胞細胞層を取り除き切れなかった卵母細胞は、実体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下、ＭＢＳ中でピンセットを用いて取り除いた。
【００６４】
[ＯＲ２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ ７．５）の組成]
ＮａＣｌ ８２．５ｍＭ
ＫＣｌ ２．０ｍＭ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １．０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ５．０ｍＭ
１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整
調製後、１２１℃，２０ｍｉｎオートクレーブ
【００６５】
[ＭＢＳ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｒｔｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐＨ７．４）の組成]
ＮａＣｌ ８８ｍＭ
ＫＣｌ １ｍＭ
Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ ０．３３ｍＭ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．４１ｍＭ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８２ ｍＭ
ＮａＨＣＯ３ ２．４ｍＭ
ＨＥＰＥＳ １０．０ｍＭ
１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整
調製後、１２１℃，２０ｍｉｎオートクレーブ
【実施例２】
【００６６】
３．アダプター分子ＰＤＺＫ１共発現系における輸送活性の経時的変化
（１）上記２．で採取したアフリカツメガエル卵母細胞に、上記１．で得られたＯＣＴＮ２ｃＲＮＡとＰＤＺＫ１ｃＲＮＡを同時に導入した。具体的には、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）をＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで希釈し、６５℃で５分間加熱処理して熱変性させた後、氷上で３分間冷却してｃＲＮＡ溶液を得た。濾胞細胞層を取り除いた卵母細胞に、ｍｉｃｒｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて前述のｃＲＮＡ溶液を注入した。この卵母細胞を、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を加えたＭＢＳ中、１８℃で培養し、トランスジェニック卵母細胞を得た。
ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）に代えて、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）単独をｃＲＮＡとして用いて、同様の操作を行い、トランスジェニック卵母細胞を得た。
【００６７】
（２）これら２種のトランスジェニック卵母細胞を用いて、ｃＲＮＡの導入から３日後及び７日後における、カルニチンの取り込みを測定した。具体的には、測定対象となる卵母細胞を２４ｗｅｌｌプレートに１０個／ｗｅｌｌ以上とり、後述の組成のＮＤ９６（ｐＨ７．４）で置換した。２５℃中で３０分間プレインキュベーションした後、放射性標識化合物〔３Ｈ〕で標識したカルニチンを１μＭとなるように添加したＮＤ９６（ｐＨ７．４，２５℃）５００μＬ／ｗｅｌｌに置換することで取り込み実験を開始した。一定時間後、氷冷したＮＤ９６で卵母細胞を５回洗浄し、取り込みを終了させた。卵母細胞は２個ずつシンチレーションバイアルに入れ、５％ＳＤＳを１００μＬずつ加えることで卵母細胞を可溶化し、１日静置させた後に、液体シンチレーションカクテル（Ｃｌｅａｓｏｎ Ｉ；Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社製）を加え液体シンチレーションカウンター（Ａｌｏｋａ社製）により放射活性を測定した。カルニチン量の測定は、各試験区について５〜１０連で行った。
【００６８】
[ＮＤ９６ （ｐＨ ７．４）の組成]
ＮａＣｌ ９６ｍＭ
ＫＣｌ ２ｍＭ
ＣａＣｌ２ １．８ｍＭ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ １ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ
１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整
調製後、１２１℃，２０ｍｉｎオートクレーブ
【００６９】
ｃＲＮＡの導入から３日後におけるカルニチンの平均取り込み量を１００％として、ｃＲＮＡの導入から７日後におけるカルニチンの平均取り込み量を、それぞれのトランスジェニック細胞について算出した。その結果を図１に示す。
ＯＣＴＮ２単独では、３日後の取り込みに比べ７日後も同程度の取り込み活性であるのに対し、ＯＣＴＮ２とＰＤＺＫ１との共発現系では７日後において３日後よりもむしろ高い活性が認められたことから、アダプター分子であるＰＤＺＫ１が共存することによって、ＯＣＴＮ２活性が次第に高まることが示された。
なお、図１のグラフにおいては、導入したＯＣＴＮ２トランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＣＴＮ２トランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだカルニチン量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００７０】
４．ＰＤＺＫ１をＯＣＴＮ２と共発現させることによる、ＯＣＴＮ２トランスポーター活性への影響
導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００７１】
得られたこれら５種の卵母細胞について、上記３．（２）と同様の方法により、カルニチンの取り込みを測定した。ｃＲＮＡ又は精製水の導入から９０分までのカルニチン取り込みの経時的変化を図２に示す。
ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独で注入した場合や、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独で注入した場合は、精製水を注入した場合に比べ、顕著な取り込みの上昇は見られなかったのに対し、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を共に注入した場合には、極めて高い取り込みが見られ、その取り込みは、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）を単独で注入した場合よりも顕著に高いものであった。このことから、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡに加えてＰＤＺＫ１ｃＲＮＡを卵母細胞内に導入することによって、用いるＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ量がわずかであっても、多量のＯＣＴＮ２ｃＲＮＡを単独で導入した場合と同様の輸送活性（トランスポーター活性）が得られることが示された。
【００７２】
５．ＹＦＰ融合ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡの合成及び発現細胞の観察
上記１．で用いたＯＣＴＮ２遺伝子をｐＥＹＦＰ−Ｃ１ベクターに組み込んだ後、インサート（ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２）部分をさらにｐｃＤＮＡ３に組み替えた。得られたベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、上記１．と同様の方法によって、ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡを作製した。このＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を、上記２．で得られたアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞を、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を加えたＭＢＳ中、１８℃で培養し、トランスジェニック卵母細胞を得た。
【００７３】
ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）に代えて、ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独をｃＲＮＡとして用いて、同様の操作を行い、トランスジェニック卵母細胞を得た。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００７４】
これら３種の卵母細胞について、それぞれｃＲＮＡ注入から３日間の培養を行った。培養後の卵毋細胞をそれぞれ前述のＭＢＳ中に浸し、卵母細胞が生きている状態のままで、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ５１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ社製）を用いて、卵母細胞表面のＹＦＰの蛍光を検出した。その結果を図３に示す。
ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡと共にＰＤＺＫ１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞は、ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡを単独で注入した卵母細胞と比較して、かなり強い蛍光強度を示すことが確認され、ＰＤＺＫ１はＯＣＴＮ２の細胞膜上での安定化に寄与していることが示唆された。
【００７５】
６．ＰＤＺＫ１をＰＥＰＴ１と共発現させることによる、ＰＥＰＴ１トランスポーター活性への影響
ＰＤＺＫ１をトランスポーターと共発現させることによる、トランスポーターの輸送活性の向上が、ＯＣＴＮ２以外のトランスポーターについても観察されるかどうかを調べるために、ＰＥＰＴ１トランスポーターを用いて以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＰＥＰＴ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＰＥＰＴ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００７６】
得られたこれら４種の卵母細胞について、ＰＥＰＴ１の基質であるグリシルサルコシン（Ｇｌｙ−Ｓａｒ）の取り込みを測定し、Ｃ／Ｍ比率（卵母細胞に取り込まれた量を、添加した薬物濃度で除した値）を算出した。グリシルサルコシンの取り込みは、上記３．（２）において、放射性標識化合物〔３Ｈ〕で標識したカルニチン１μＭを用いる代わりに、グリシルサルコシン２５０ｎＭを用いて同様の操作を行うことによって測定した。ｃＲＮＡ又は精製水の導入から９０分までのＣ／Ｍ比率の経時的変化を図４に示す。図４の結果から、ＰＥＰＴ１のｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合、グリシルサルコシンの取り込みは、水を注入した場合よりも高い値を示したが、さらにＰＤＺＫ１のｃＲＮＡ（５ｎｇ）をＰＥＰＴ１のｃＲＮＡと同時に注入したところ、グリシルサルコシンの取り込みは、ＰＥＰＴ１単独を注入した場合に比べて上昇した。すなわち、ＰＥＰＴ１を用いた場合も、ＯＣＴＮ２を用いた場合と同様に、ＰＤＺＫ１を共存させることにより、輸送活性の顕著な上昇が見られた。一方、ＰＤＺＫ１のｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合には、水を注入した場合と比べて取り込みの上昇はほとんど見られなかった。
【００７７】
７．ＰＤＺＫ１を共存させることによる、ＰＥＰＴ２の輸送活性測定感度への影響
ＰＤＺＫ１をトランスポーターと共発現させた場合に、基質の輸送活性が向上するだけでなく、基質輸送活性の測定における測定感度も上昇するかどうかを確認するために以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００７８】
得られたこれら４種の卵母細胞について、ＰＥＰＴ２の基質であるグリシルサルコシン（Ｇｌｙ−Ｓａｒ）の取り込みを測定した。グリシルサルコシンの取り込みは、上記６．と同様の方法を用いた。 ｃＲＮＡ又は精製水の導入から９０分までのグリシルサルコシンの取り込みの経時的変化を図５に示す。図５の結果から、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合は、グリシルサルコシンの取り込みは、水を注入した場合よりもわずかに高い値を示したに過ぎなかったが、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）をＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）と同時に注入したところ、グリシルサルコシンの取り込みは、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合に比べて大きく上昇した。すなわち、ＰＥＰＴ２を用いた場合も、ＯＣＴＮ２を用いた場合と同様に、ＰＤＺＫ１を共存させることにより、輸送活性の顕著な上昇が見られた。
【００７９】
８．ＰＤＺＫ１を共存させることによる、ＯＣＴＮ１の輸送活性測定感度への影響
上記７．と同様のＰＤＺＫ１による影響が、ＯＣＴＮ１に対しても見られるかどうかを確認するために以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。
【００８０】
得られたこれら２種の卵母細胞について、ＯＣＴＮ１の基質である有機カチオンテトラエチルアンモニウム（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ：ＴＥＡ）の取り込みを、基質濃度を変化させて検討した。その結果を図６に示す。図６の結果からわかるように、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を同時に注入した場合は、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独で注入した場合に比べ、輸送のＶｍａｘが上昇し、Ｋｍには変化がなかった。この結果は、ＰＤＺＫ１を共存させるとＯＣＴＮ１による有機カチオン輸送が上昇すること、輸送の上昇は主に輸送キャパシティーの変化に起因し、親和性にはあまり影響を与えないことを示す。
なお、図６のグラフにおいては、導入したＯＣＴＮ１トランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＣＴＮ１トランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだＴＥＡ量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００８１】
９．ＰＤＺＫ１を共存させること、又はさらに別のアダプターも併用することによる、ＯＡＴＰ−Ａの輸送活性測定感度への影響
上記７．と同様のＰＤＺＫ１による影響がＯＡＴＰ−Ａに対しても見られるか、及び、ＰＤＺＫ１以外にもアダプターを併用した場合の影響はどのようなものかを確認するために以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した。また、導入するｃＲＮＡとして、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞や、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）の３種のｃＲＮＡを併用したトランスジェニック卵母細胞についても同様の方法により作製した。
【００８２】
得られたこれら３種の卵母細胞について、ＯＡＴＰ−Ａの基質であるタウロコール酸（ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ：ＴＣＡ）の取り込みを測定した。その結果を図７に示す。図７から分かるように、ＯＡＴＰ−Ａ（５ｎｇ）ｃＲＮＡを単独で注入した時に比べ、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とを同時に注入すると、ＯＡＴＰ−Ａによるタウロコール酸の取り込みのＫｍにはそれほど大きな変化はない一方でＶｍａｘは上昇した。このことから、ＰＤＺＫ１はＯＡＴＰ−Ａの輸送を促進し、その効果はＯＣＴＮ１のケースと同様、主にＶｍａｘの上昇に起因することが示された。
また、ＯＡＴＰ−Ａ、ＰＤＺＫ１及びＮＨＥＲＦ１の３種を共発現させた場合のＯＡＴＰ−ＡによるＴＣＡの輸送は、ＯＡＴＰ−Ａ単独の場合や、ＯＡＴＰ−Ａ及びＰＤＺＫ１を併用した場合よりもさらに高く、Ｖｍａｘが上昇していた。
なお、図７のグラフにおいては、導入したＯＡＴＰ−Ａトランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＡＴＰ−ＡトランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだＴＣＡ量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００８３】
１０．複数のアダプターを共存させることによる、輸送測定感度への影響
（１）複数のアダプターを共存させることによる、輸送測定感度への影響を調べるために、以下の実験を行った。
導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いること以外は、上記３．（１）と同様の方法により、トランスジェニック卵母細胞を作製した（ＯＣＴＮ２ ａｌｏｎｅ）。また、導入するｃＲＮＡとして、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＰＤＺＫ１）、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＮＨＥＲＦ１）、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＮＨＥＲＦ２）、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＰＤＺＫ２）、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞（＋ＰＤＺＫ１＆ＮＨＥＲＦ１）についても同様の方法により作製した。ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１及びＮＨＥＲＦ２はいずれも、ＰＤＺＫ１と同様に、ＰＤＺドメインを有するタンパク質として知られている。
【００８４】
得られたこれら６種の卵母細胞について、上記３．（２）と同様の方法により、カルニチンの取り込みを測定した。その実験結果を図８に示す。図８の結果から分かるように、ＯＣＴＮ２ ａｌｏｎｅのカルニチン取り込みに比べ、＋ＰＤＺＫ１では顕著な取り込み上昇が見られたのに対し、＋ＰＤＺＫ２、＋ＮＨＥＲＦ１、＋ＮＨＥＲＦ２では取り込みの促進は見られず、輸送促進効果はＰＤＺＫ１特異的であることが示された。一方、＋ＰＤＺＫ１＆ＮＨＥＲＦ１では、ＯＣＴＮ２ ａｌｏｎｅや＋ＰＤＺＫ１と比べて、ＯＣＴＮ２によるカルニチン取り込みが顕著に高かった。
なお、図８のグラフにおいては、導入したＯＣＴＮ２トランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＣＴＮ２トランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだカルニチン量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００８５】
（２）さらに、取り込みの時間推移を検討することにより、図８に示す結果を確認した。
図８の実験で用いたトランスジェニック卵母細胞以外のトランスジェニック卵母細胞として、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とを用いたトランスジェニック卵母細胞を用意した。また、対照として、ｃＲＮＡ溶液５０ｎＬに代えて精製水を５０ｎＬ注入した卵母細胞も作製した。
【００８６】
これらの６種の卵母細胞について上記３．（２）と同様の方法により、カルニチンの取り込みを測定した。その実験結果を図９に示す。図９の結果から分かるように、水を注入した場合に比べ、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を注入した場合や、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を共に注入した場合には、カルニチン取り込みはほとんど上昇せず、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合にも取り込み活性はさほど顕著ではなかった。これに対し、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を３つ同時に注入した場合のカルニチンの取り込みは、ＯＣＴＮ２単独やＯＣＴＮ２＋ＰＤＺＫ１共発現に比べても顕著に高かった。従って、ＰＤＺＫ１とＮＨＥＲＦ１を同時にＯＣＴＮ２と共発現させると、ＰＤＺＫ１だけをＯＣＴＮ２と共発現させた場合より、さらに高い基質輸送活性が得られることが示された。
【００８７】
１１．アダプターと複数のトランスポーターを共存させることによる、輸送測定感度への影響
（１）前述の結果に示されているように、ＰＤＺＫ１を共存させることにより、わずか５ｎｇのトランスポーターｃＲＮＡの注入で、トランスポーターｃＲＮＡ（５ｎｇ）を単独で注入した場合よりも顕著に高い輸送活性をアフリカツメガエル卵母細胞で再現することができる。このことは、一つの卵母細胞に複数のトランスポーターを同時に発現させ、かつ、それらの複数のトランスポーターについて十分な活性を得ることを可能にする。肝臓、腎臓、小腸、脳など種々の臓器細胞には複数のトランスポーター遺伝子が同時に発現し、薬物動態に関与していることから、このような複数のトランスポーター遺伝子発現系は、より生理的な系に近い実験系である。
そこで、トランスポーターとしてＯＣＴＮ２とＳＬＣ２６Ａ３とを併用し、ＯＣＴＮ２とＰＤＺＫ１とＳＬＣ２６Ａ３の３者を同時に発現させた（注入にはそれぞれ５ｎｇのｃＲＮＡ量を使用）。トランスジェニック卵母細胞の作製方法は、前述の方法にしたがった。得られたトランスジェニック卵母細胞についてＯＣＴＮ２によるカルニチン取り込みを測定した。その結果を図１０に示す。図１０の結果から分かるように、ＯＣＴＮ２単独やＯＣＴＮ２＋ＳＬＣ２６Ａ３による輸送に比べ、ＯＣＴＮ２、ＰＤＺＫ１、ＳＬＣ２６Ａ３を３者で共発現させた時に、最も顕著な輸送活性が見られた。
なお、図１０のグラフにおいては、導入したＯＣＴＮ２トランスポーター以外の輸送の影響を排除するため、ＯＣＴＮ２トランスポーターのｃＲＮＡを用いないこと以外は同様の方法で作製した卵母細胞を対照群として作製し、その対照群が取り込んだカルニチン量を差し引くことによって、補整した数値を用いている。
【００８８】
この輸送促進の原因として考えられる仮説を図１１に示す。ＳＬＣ２６Ａ３は、２個のＣｌ−を細胞内に取り込むと同時に１個のＨＣＯ３−細胞外に排出する（合計１個のマイナス電荷が細胞内に入る）。一方、ＯＣＴＮ２によるカルニチン輸送はＮａ＋依存的であり、カルニチンはプラスとマイナスの電荷をそれぞれ一つずつ持つ両極性化合物であることから、合計１個のプラスの電荷が細胞内に入ると考えられる。従って、ＳＬＣ２６Ａ３をＯＣＴＮ２と同時に導入することによって、そのプラス電荷が打ち消されることが推測される。この仮説を検証する目的で、ＳＬＣ２６Ａ３の代わりにＳＬＣ２６Ａ６を同時に発現させると、輸送促進は見られなかった（図１０）。図１１に示すように、ＳＬＣ２６Ａ６は、１個のＣｌ−を細胞内に取り込むと同時に２個のＨＣＯ３−細胞外に排出するため、ＯＣＴＮ２が取り込むプラスの電荷が打ち消されない結果、取り込み促進が見られないばかりか、ＯＣＴＮ２を単独発現した場合と比べて取り込みの低下が見られたものと考えられる。
【００８９】
（２）上記１１．（１）における、ＯＣＴＮ２とＳＬＣ２６Ａ３に代えて、ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２をトランスポーターとして用い、上記１１．（１）と同様の実験を行った。ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２とＰＤＺＫ１の３者を同時に発現させる際に注入に用いたｃＲＮＡはそれぞれ５ｎｇであった。得られたトランスジェニック卵母細胞について、ＯＣＴＮ１の基質であるＴＥＡの取り込みを測定した。ＴＥＡの濃度は、２０ｍＭのものと、１０μＭのものの２種類を用いた。また、比較として、ＰＤＺＫ１を単独で注入して得られたトランスジェニック卵母細胞のＴＥＡの取り込みも測定した。その結果を図１２に示す。また、図１３には、ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２とＰＤＺＫ１の３者を同時に発現させた場合のその概念図を示す。
図１２から分かるように、ＴＥＡの濃度の違いは、ＯＣＴＮ１による取り込み量（基質濃度で除した値；μＬ／ｏｏｃｙｔｅで表示）の違いにはほとんど影響を与えなかった。
一方、図６に記載されているように、ＯＣＴＮ１によるＴＥＡ輸送のＫｍは１００〜２００μＭであり、２０ｍＭではＯＣＴＮ１が完全に飽和するはずである。にもかかわらず、図１２に示されるとおり、ＯＣＴＮ１による輸送活性が２０ｍＭでも顕著に認められたことは、ＯＣＴＮ１がＰＥＰＴ２やＰＤＺＫ１と共発現することで、その輸送キャパシティーが上昇することを示唆している。ＯＣＴＮ１はプロトンＨ＋と有機カチオンの交換輸送系として働くのに対し、ＰＥＰＴ２はＨ＋と基質の共輸送体である。従ってＰＥＰＴ２が存在することにより、Ｈ＋が細胞内へ入り、そのＨ＋との交換輸送によってＴＥＡが細胞内に入ること、ＰＤＺＫ１が両方のトランスポーターと相互作用することにより、両者を近接させることを示唆する。ＯＣＴＮ１とＰＥＰＴ２はともに腎臓の近位尿細管刷子縁膜上に共発現していることから、生理的にも図１３のような複合体による輸送系が存在していると考えられる。アフリカツメガエル卵母細胞におけるこのような実験系は、ＰＤＺＫ１を共存させることによって、それぞれの少ないｃＲＮＡ量を注入することで手軽に作成することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後及び７日後におけるカルニチン（１μＭ）取り込み（９０分間、ｐＨ７．４）を測定した。また、それぞれの条件下での３日後の値を１００％として示してある。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ （Ｎ＝５−１０）。＊は３日後と比べて有意差あり（ｐ＜０．０５）。
【図２】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（２５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、及び水を注入した卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後におけるカルニチン（１μＭ）の取り込みの時間推移（ｐＨ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝５−１０）。
【図３】ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＹＦＰ−ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、及び水を注入した卵母細胞のそれぞれの卵母細胞表面の共焦点顕微鏡観察写真である。
【図４】ＰＥＰＴ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＥＰＴ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、水を注入した卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後におけるグリシルサルコシンの取り込みの時間推移（ｐＨ６．０）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝９−１２）。
【図５】ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、水を注入した卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後におけるグリシルサルコシンの取り込みの時間推移（ｐＨ６．０）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１２）。
【図６】ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡ又は水の注入から３日後における種々の濃度のＴＥＡの取り込みの時間推移（ｐＨ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１０）。
【図７】ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＡＴＰ−ＡｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１（５ｎｇ）の３種のｃＲＮＡを併用したトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡの注入から３日後における種々の濃度のＴＣＡの取り込みの時間推移（ｐＨ ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１０）。
【図８】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡの注入から３日後におけるカルニチンの取り込み（ｐＨ ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１０）。
【図９】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＮＨＥＲＦ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とを用いたトランスジェニック卵母細胞、水を注入した卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡの注入から３日後におけるカルニチンの取り込み（ｐＨ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝８−１２）。
【図１０】ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＳＬＣ２６Ａ３ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、及びＳＬＣ２６Ａ３ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）及びＳＬＣ２６Ａ６ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞、ＯＣＴＮ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、ＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）、及びＳＬＣ２６Ａ６ｃＲＮＡ（５ｎｇ）を用いたトランスジェニック卵母細胞のそれぞれについて、ｃＲＮＡの注入から３日後におけるカルニチンの取り込み（ｐＨ ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝５−１０）。
【図１１】本発明の、ＯＣＴＮ２とＰＤＺＫ１とＳＬＣ２６Ａ３を共発現した実験系におけるトランスポーターどうしのカップリング効果の概念を示す図である。
【図１２】ＯＣＴＮ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とＰＥＰＴ２ｃＲＮＡ（５ｎｇ）とを用いたトランスジェニック卵母細胞、及びＰＤＺＫ１ｃＲＮＡ（５ｎｇ）単独を用いたトランスジェニック卵母細胞について、ｃＲＮＡの注入から３日後におけるＴＥＡ（１０μＭ及び２０ｍＭ）の取り込み（ｐＨ７．４）を測定した。Ｍｅａｎ±ＳＥＭ（Ｎ＝５−１０）。
【図１３】本発明の、ＯＣＴＮ１とＰＤＺＫ１とＰＥＰＴ２を共発現した実験系におけるトランスポーターどうしのカップリング効果の概念を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項２】
１種のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び２種のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種のトランスポータータンパク質及び２種のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項３】
２種のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、２種のトランスポータータンパク質及び１種のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項４】
トランスポータータンパク質をコードする核酸が、有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター及びペプチドトランスポーターからなる群から選ばれるトランスポータータンパク質をコードする核酸である請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項５】
トランスポータータンパク質をコードする核酸が、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２、ＯＡＴＰ−Ａ及びＳＬＣ２６Ａ３から選ばれるトランスポータータンパク質をコードする核酸である請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項６】
アダプタータンパク質をコードする核酸が、ＰＤＺドメインを有するアダプタータンパク質をコードする核酸である請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項７】
アダプタータンパク質をコードする核酸が、ＰＤＺＫ１、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２及びＩＫＥＰＰから選ばれるアダプタータンパク質をコードする核酸である請求項１〜６のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項８】
アダプタータンパク質をコードする核酸として、ＰＤＺＫ１をコードする核酸を少なくとも含む請求項１〜７のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項９】
核酸がｃＲＮＡである請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１０】
ＯＡＴＰ−Ａトランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＡＴＰ−Ａトランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質と、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１１】
ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質と、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１２】
ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＳＬＣ２６Ａ３トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質と、ＳＬＣ２６Ａ３トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１３】
ＯＣＴＮ１トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＥＰＴ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ１トランスポータータンパク質と、ＰＥＰＴ２トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１４】
１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードするｃＲＮＡと、１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードするｃＲＮＡとをアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクションにより導入し、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現させることを特徴とするトランスジェニック卵母細胞の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか記載のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法。
標識化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標識化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ(Ａ)
トランスジェニック卵母細胞への標識化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定するステップ(Ｂ)
測定結果を評価するステップ(Ｃ)
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか記載のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法。
標的化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標的化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ（Ａ’）
トランスジェニック卵母細胞への標的化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標的化合物の排出の程度を測定するステップ（Ｂ’）
測定結果を評価するステップ（Ｃ’）
【請求項１】
１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項２】
１種のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び２種のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、１種のトランスポータータンパク質及び２種のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項３】
２種のトランスポータータンパク質をコードする核酸及び１種のアダプタータンパク質をコードする核酸が導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、２種のトランスポータータンパク質及び１種のアダプタータンパク質を共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項４】
トランスポータータンパク質をコードする核酸が、有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター及びペプチドトランスポーターからなる群から選ばれるトランスポータータンパク質をコードする核酸である請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項５】
トランスポータータンパク質をコードする核酸が、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２、ＯＡＴＰ−Ａ及びＳＬＣ２６Ａ３から選ばれるトランスポータータンパク質をコードする核酸である請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項６】
アダプタータンパク質をコードする核酸が、ＰＤＺドメインを有するアダプタータンパク質をコードする核酸である請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項７】
アダプタータンパク質をコードする核酸が、ＰＤＺＫ１、ＰＤＺＫ２、ＮＨＥＲＦ１、ＮＨＥＲＦ２及びＩＫＥＰＰから選ばれるアダプタータンパク質をコードする核酸である請求項１〜６のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項８】
アダプタータンパク質をコードする核酸として、ＰＤＺＫ１をコードする核酸を少なくとも含む請求項１〜７のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項９】
核酸がｃＲＮＡである請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１０】
ＯＡＴＰ−Ａトランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＡＴＰ−Ａトランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質と、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１１】
ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質と、ＮＨＥＲＦ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１２】
ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＳＬＣ２６Ａ３トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ２トランスポータータンパク質と、ＳＬＣ２６Ａ３トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１３】
ＯＣＴＮ１トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＥＰＴ２トランスポータータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡと、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質をコードする３〜２０ｎｇのｃＲＮＡとが導入されたアフリカツメガエルの卵母細胞であって、ＯＣＴＮ１トランスポータータンパク質と、ＰＥＰＴ２トランスポータータンパク質と、ＰＤＺＫ１アダプタータンパク質とを共発現しているトランスジェニック卵母細胞。
【請求項１４】
１種又は２種以上のトランスポータータンパク質をコードするｃＲＮＡと、１種又は２種以上のアダプタータンパク質をコードするｃＲＮＡとをアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクションにより導入し、１種又は２種以上のトランスポータータンパク質及び１種又は２種以上のアダプタータンパク質を共発現させることを特徴とするトランスジェニック卵母細胞の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか記載のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法。
標識化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標識化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ(Ａ)
トランスジェニック卵母細胞への標識化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標識化合物の排出の程度を測定するステップ(Ｂ)
測定結果を評価するステップ(Ｃ)
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか記載のトランスジェニック卵母細胞における薬物の動態をインビトロで検出する、以下のステップを含む薬物動態の検出方法。
標的化合物と前記トランスジェニック卵母細胞とを接触させた状態でインキュベーションするか、又は、標的化合物を細胞内に含有させた前記トランスジェニック卵母細胞とバッファーとを接触させた状態でインキュベーションするステップ（Ａ’）
トランスジェニック卵母細胞への標的化合物の取込みの程度、又はトランスジェニック卵母細胞からの標的化合物の排出の程度を測定するステップ（Ｂ’）
測定結果を評価するステップ（Ｃ’）
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−８６２９３（Ｐ２００８−８６２９３Ａ）
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７３４５２（Ｐ２００６−２７３４５２）
【出願日】平成１８年１０月４日（２００６．１０．４）
【出願人】（５０２１３３０６６）株式会社ジェノメンブレン (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月４日（２００６．１０．４）
【出願人】（５０２１３３０６６）株式会社ジェノメンブレン (7)
【Ｆターム（参考）】
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