トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するためのトロンビン変異体の使用
本発明は、それを必要とする患者におけるトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法を提供するものであり、該方法は、トロンビン阻害剤に結合することができ、かつ凝固促進活性が低下しているバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの治療有効量の投与を含む。本発明の方法に有用なバリアント型プロトロンビン又はトロンビンとしては、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、すなわちアミノ酸の２１５位及び／又は２１７位がアラニンであるこれらのバリアント等を挙げることができる。また、トロンビン変異体を追加的な活性薬剤、特に、活性化第VII因子又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤などの止血剤と共に投与することを含む方法も提供する。本発明の一実施形態においては、方法は、直接トロンビン阻害剤、特にアルガトロバンが投与された患者の処置に有用である。本発明はさらに、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンの滴定アッセイを用いた、患者の血漿又は全血中の抗凝固剤濃度を定量する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援による研究又は開発
本発明は国立衛生研究所により認められた認可番号ＨＬ４９４１３、ＨＬ５８１４１及びＨＬ７３８１３に基づく政府の支援を受けて発明された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、トロンビン変異体、特にトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ又はＷ２１５Ａを用いた、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法に関する。本発明はまた、患者の血漿又は全血中のトロンビン阻害剤濃度を定量するためのトロンビン変異体の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘパリン、クマリンなどの抗凝固剤は、血栓塞栓症の治療及び予防、並びに輸血及びその後の外科手技中の血液凝固の予防のためにしばしば使用される。しかし、このような薬物（drug）の投与によって、最悪の場合は四肢欠損に至ることもある合併症であるヘパリン起因性血小板減少症−血栓症及びクマリン誘発性皮膚壊死等の合併症を生じることがある。したがって、抗凝固剤を患者に投与する場合、合併症が発症したときに特定の抗凝固剤の作用を逆転させる（reverse）ことができる解毒剤が手元にあることが非常に望ましい。このような合併症としては、外科的切開による傷口における出血性副作用、腹膜、胸膜、心膜及び軟膜の血管領域における出血性副作用等がある。
【０００４】
抗凝固薬剤は一般的に、間接トロンビン阻害剤及び直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）に分類することができる。ヘパリン、デルマタンなどの直接トロンビン阻害剤は、アンチトロンビン（ＡＴ）、ヘパリンコファクターII（ＨＣII）などの内生のトロンビン阻害因子の活性化を触媒することでトロンビンを不活化する。対照的に、ヒルジンなどの直接トロンビン阻害剤の効果は、トロンビンに直接結合することで仲介される。
【０００５】
間接トロンビン阻害剤には、硫酸プロタミンを用いて抗凝固効果を速やかに逆転することができるという利点を有するヘパリンがよく使用される。しかしながら、稀にではあるがプロタミン投与によって重篤な心血管虚脱が生じることがあり（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３）、プロタミンにより誘発される血行動態の不安定化は術後の有害な転帰に関連している（非特許文献４及び非特許文献５）。現在のところ、プロタミンアレルギー患者に対してヘパリンを逆転させる安全な代替方法はない。
【０００６】
従来の抗凝固剤に付随する制限及びリスクから、ＤＴＩの臨床使用が急速に進んでいる。全てのＤＴＩは強力な抗血栓剤であり、大きな出血のリスクは０．７〜１．９％であり、これは未分画ヘパリンに匹敵するかそれよりも小さい値である（非特許文献６）。現在利用可能なＤＴＩとしては、アルガトロバン（ノバスタン（登録商標））、ビバリルジン（アンジオマックス（登録商標））、レピルジン（レフルダン（登録商標））等があり、さらに欧州ではキシメラガトラン（エグザンタ（登録商標））等などがある（非特許文献６）。静脈内ＤＴＩの主な適応症はヘパリン起因性血小板減少症−血栓症であるが、待機的経皮的冠動脈インターベンション、冠動脈バイパス形成手術等の適応症が現在評価中である（非特許文献７及び非特許文献８）。キシメラガトランは深部静脈血栓症を予防するための最初の経口薬である。
【０００７】
しかし、解毒剤が利用できないこと及び信頼性の高い実験モニタリング（laboratory monitoring）がされていないことから、特定のＤＴＩの使用は限定されることがある（非特許文献９）。抗凝固剤を過少量投与すると制御不能なトロンビン生成及び／又は消費性凝固障害を生じることがあり、一方、抗凝固剤を過剰投与すると重篤の出血性素因が引き起こされる。凝血検査は、血液希釈、低体温及び外科的settingsにおけるその他の変動による影響を特に受けやすい（非特許文献１０））。心臓外科患者では、臓器機能不全を同時に有する患者には大量のＤＴＩが使用されるため、出血は重要な懸案事項となり得る。腎機能不全はヒルジンの代謝、及びそれより程度は低いがビバリルジンの代謝に影響を与え、心肺バイパス後の重篤の出血発症が報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２及び非特許文献１３）。
【０００８】
ＤＴＩ（特にヒルジン）に対する様々な解毒剤が過去に実験的に研究されており、例えば、ＤＦＰトロンビン又はベンゾイルトロンビンのようなガンマ−トロンビン標品（（非特許文献１４）；プロトロンビン中間体メイゾトロンビン（特許文献１及び非特許文献１５）などがある。発色基質であるクロモザイムＴＨ（Roche, Mannheim）も、インビボでの有効性についてのデータはないものの、インビトロではメラガトランの潜在的な解毒剤であると考えられている（非特許文献１６）。今日まで、このような標品は毒性が強過ぎるか又は液相で有効でないため、実用上の成功は得られていない。
【特許文献１】米国特許第５８１７３０９号明細書
【非特許文献１】Morel et al. (1987) Anesthesiology, 66:597-604
【非特許文献２】Weiss et al. (1989) New England Journal of Medicine, 320:886-892
【非特許文献３】Panos et al. (2003) European Journal of Cardio-Thoracic Surgery, 24:325-327
【非特許文献４】Kimmel et al. (2002) Anesthesia & Analgesia, 94:1402-1408
【非特許文献５】Welsby et al. (2005) Anesthesiology, 102:308-314
【非特許文献６】Di Nisio et al. (2005) New England Journal of Medicine, 353:1028-1040
【非特許文献７】Lincoff et al. (2004) JAMA, 292:696-703
【非特許文献８】Merry et al. (2004) Annals of Thoracic Surgery, 77:925-931
【非特許文献９】Warkentin et al. (2005) Thrombosis & Haemostasis, 94:958-964
【非特許文献１０】Siegel (2002) New England Journal of Medicine, 347:1030-1034
【非特許文献１１】Nowak et al. (1992) Thrombosis Research, 66:707-715
【非特許文献１２】Koster et al. (2000) Annals of Thoracic Surgery, 69:37-41
【非特許文献１３】Hein et al. (2005) Artificial Organs, 29:507-510
【非特許文献１４】Bruggener et al. (1989) Pharmazie, 44:648-9
【非特許文献１５】Nowak and Bucha (1995) Thromb. Res., 80:317-25
【非特許文献１６】Bodendiek et al. (2000) Hamostaseologie, 23:97-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の制限から、ヘパリン及びＤＴＩの両方を安全かつ効率的に逆転させる改善された方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
インビボ及びインビトロで抗凝固剤の効果を阻害する方法を提供する。特に、それを必要とする患者においてトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法を提供し、この方法は、トロンビン阻害剤に結合することができかつ凝固促進活性が低下しているバリアント型プロトロンビン又はトロンビンを治療有効量投与することを含む。本発明の方法に有用なバリアント型プロトロンビン又はトロンビンとしては、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、すなわち２１５位及び／又は２１７位のアミノ酸がアラニンであるそのバリアント等を挙げることができる。本発明の別の実施形態においては、追加的な活性薬剤、特に止血剤（例えば、活性化第VII因子又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤）と共にトロンビン変異体を投与することを含む方法が提供される。本発明の一実施形態において、本方法は、直接トロンビン阻害剤（特にアルガトロバン）が投与されている患者の治療に有用である。
【００１１】
また、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンの滴定アッセイを用いた、患者の血漿又は全血中の抗凝固剤濃度を定量する方法を提供する。特に、本発明は患者の血漿又は全血中におけるトロンビン阻害剤、特にＤＴＩの濃度を定量する方法を提供する。本方法は、トロンビン阻害剤を含有する血漿又は全血試料を、様々な濃度のトロンビン変異体に個別に添加することができる同体積の試験試料に分けて、各試験試料について凝血開始までの時間（onset to clotting time）を比較することを含む。凝血開始までの時間が最も短い試験試料を選択することで、対応するトロンビン変異体の濃度を用いて血漿又は全血試料中のトロンビン阻害剤濃度を評価することができる。これらの方法に使用するのに好ましいトロンビン変異体としてはＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ又はそのバリアント等を挙げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、インビボ又はインビトロにおける抗凝固剤の効果を阻害する方法を提供する。特に、本発明はそれを必要とする患者におけるトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法を提供し、この方法は、トロンビン阻害剤に結合することができかつ凝固促進活性が低下しているバリアント型プロトロンビン又はトロンビンを治療有効量投与することを含む。本発明の方法に有用なバリアント型プロトロンビン又はトロンビンとしては、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、すなわち２１５位及び／又は２１７位のアミノ酸がアラニンであるそのバリアント等を挙げることができる。また、追加的な活性薬剤、特に止血剤（例えば、活性化第VII因子又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤）と共にトロンビン変異体を投与することを含む方法を提供する。本発明の一実施形態においては、この方法は、直接トロンビン阻害剤、特にアルガトロバンを投与された患者の処置に有効である。
【００１３】
本明細書において「抗凝固剤」とは、インビトロ及び／又はインビボの血栓形成を予防する又は遅延させることができる任意の薬剤を意味する。本明細書において「凝固」とは、血液又は血漿を液相からゲル相へと変化させるフィブリンモノマーのポリマー化のプロセスを意味する。液体血液の凝固は、インビトロ、血管内、又は露出若しくは損傷した組織の表面において起こることもある。インビトロでの血液凝固はゲル化した血液を生じ、これは非凝固血液と本質的に同じ比率で細胞及びその他の血液成分を保持しており、フィブリノーゲン含量の減少とそれに対応するフィブリンの増加だけが異なる。「血餅」とは、液体血液におけるのと同じ比率の血液成分からなり、かつ全ての血液成分を含有する粘性ゲルを意図している。
【００１４】
本明細書において「抗凝固効果を阻害する」とは、抗凝固剤が血栓形成を予防するか又は遅らせる能力を低下させることを意味する。抗凝固剤の抗凝固効果が阻害されているかどうかを調べる方法は、血漿又は全血試料中の血塊の強度及び／又は血塊形成までの時間の長さを測定するアッセイの使用を含む。したがって、本明細書において、抗凝固剤の抗凝固効果を阻害するとは、抗凝固剤の効果を少なくとも部分的に逆転させること、例えば少なくとも５％の逆転、少なくとも１０％の逆転、少なくとも２０％の逆転、少なくとも３０％の逆転、少なくとも４０％の逆転、少なくとも５０％の逆転、少なくとも６０％の逆転、少なくとも７０％の逆転、少なくとも８０％の逆転、少なくとも９０％の逆転、及び最大で１００％を含む逆転を意味する。本明細書において「逆転」とは、血塊形成の開始までの時間の短縮又は血塊強度の増大を意味する。血塊形成の開始及び血塊強度を測定するアッセイは当該技術分野で周知であり、例えば活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））、Thrombinoscope（登録商標）システムを用いたトロンビン生成の連続モニタリング（例えば、後述の実験セクション参照。また、Banez et al. (1980) Am. J. Clin. Pathol.,74:569-574、van den Besselaar et al. (1990) hromb. Haemost.,63:16-23、Kawasaki et al. (2004) Anesthesia & Analgesia, 99:1440-1444及びHemker et al. (2003) Pathophysiology of Haemostasis & Thrombosis, 33:4-15参照。）がある。
【００１５】
本発明の一実施形態では、抗凝固剤の抗凝固効果を阻害するためのバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの使用方法が提供される。ヒトトロンビンは、約５７９成熟アミノ酸（潜在的な対立遺伝子変異（allelic variation）又はＮ末端微小不均一性を受ける）と約４３残基のプレ配列とからなる前駆体ポリペプチドであるプロトロンビンから生成される（Degen et al. (1993) Biochemistry 22:2087）。このプレ配列はプロトロンビンの発現及び分泌の間にタンパク質分解により（proteolytically）除去される。
【００１６】
プロトロンビンはチモーゲン（すなわち不活性なプロテアーゼ）であり、一連のタンパク質切断によって活性化される。切断は少なくとも３箇所で行われる。インビボにおいてプロトロンビンはＶａ因子、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下で第Ｘａ因子によってＲ２７１とＴ２７２残基（Degen et al. (1993) Biochemistry 22:2087に記載の残基番号）の間で切断されてプロトロンビン２及びフラグメント１．２を生じる。プロトロンビンは同じシステムによってＲ３２０とＩ３２１残基の間でさらにタンパク質切断されてメイゾトロンビンを生じる。次いで、このメイゾトロンビンはＲ１５５とＳ１５６の間で自己分解してフラグメント１（１−１５５）及びメイゾトロンビンｄｅｓ１（プロトロンビンの１５６番目の残基からカルボキシ末端に延び、Ｒ３２３で切断されている、ジスルフィド結合したジペプチド）を生成する。最後に、プレトロンビン２のＲ３２０とＩ３２１の間のタンパク質切断によって、又はメイゾトロンビンｄｅｓ１のＲ２７１とＴ２７２の間のタンパク質切断によって、トロンビンが生成される。その後、トロンビンは自身をＴ２８４とＴ２８５の間で自己切断し、成熟Ａ鎖Ｎ末端を生成する。
【００１７】
本明細書において「トロンビン」とは、多機能性プロトロンビン由来酵素を意味する。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンにタンパク質切断することで凝固促進剤として作用する。またトロンビンは、凝血を持続させる凝固第Ｖ、VIII、XI及びXIII因子を活性化して血塊を持続させ、また、血小板トロンビン受容体ＰＡＲ１を活性化して血小板を活性化する。トロンビンの生成及び活性は多くの抗トロンビン機序により制限されている。トロンビンは、血管内皮細胞上の膜内在性タンパク質であるトロンボモジュリン（ＴＭ）に結合するとコンフォメーション変化して凝固促進活性を失い、プロテインＣ（ＰＣ）を活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に変換する活性を獲得する。ＡＰＣはセリンプロテアーゼであり、凝血又は凝固カスケードにおける２つの重要な補因子である活性化ＦＶ（ＦＶａ）及びＦVIII （ＦVIIIａ）を不活化することで、強力な抗凝固剤として作用する。また、ＡＰＣは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の主要な物理的阻害剤であるプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）を不活化し、通常の線溶を促進する。
【００１８】
本明細書において「凝固カスケード」とは、例えばManolin in Wilson et al. (eds): Harrison's Principle of Internal Medicine, 14th Ed. New York. McGraw-Mill, 1998, p. 341に記載されている、相互に交わる３つの酵素経路を指す。この文献の全体を参照により本願に組み込んだものとする。内因系凝固経路は第ＩＸａ因子を形成させ、これが第VIIIａ及び第Ｘ因子、リン脂質並びにＣａ２＋と共に第Ｘａ因子を生じさせる。外因系経路では、組織因子と第VII因子が組み合わさった後、第Ｘａ及びＩＸａ因子が生じる。共通系凝固経路は血液凝固第Ｖ、VIII、IX及びＸ因子と相互作用してプロトロンビンをトロンビン（第ＩＩａ因子）に切断し、トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに切断する。
【００１９】
Degen et al.（Degen et al. (1993) Biochemistry, 22:2087）によるＤＮＡに基づくシステムの他に、アミノ酸に番号を付ける２つの異なるシステムがトロンビンに使用されている。１つ目は、Bode et al.に記載されているキモトリプシノーゲンとのアラインメントに基づくものであり、プロテアーゼの分野で最も広く用いられている番号付けシステムである（Bode et al. (1989) EMBO. J., 8:3467-3475）。２つ目のSadlerによる番号付けスキームでは、トロンビンのＢ鎖はＩ１から始まりＥ２５９までであり、Ａ鎖はＴ１ａ〜Ｒ３６ａのように後ろに「ａ」を付して表される。例えば、Wu et al.はSadlerのスキームに基づいて番号を付けた様々なトロンビン変異体を開示している（Wu et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:6775-6779）。このWu et al.による変異体の残基番号とそれに対応するキモトリプシノーゲンの残基番号及びDegen et al.による残基番号をそれぞれ以下にこの順番で示す：Ｈ４３（５７、３６３）、Ｋ５２（６０ｆ、３７２）、Ｎ５３（６０ｇ、３７３）、Ｒ６２（６７、３８２）、Ｒ６８（７３、３８８）、Ｒ７０（７５、３９０）Ｄ９９（１０２、４１９）及びＳ２０５（１９５、５２５）。
【００２０】
本明細書を通して、トロンビン及びトロンビン変異体のアミノ酸残基への言及には、Bode et al.による番号付けシステムを用いている。しかし、ヒトトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（配列番号１）、ヒトトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ（配列番号２）、及びヒトトロンビン（配列番号３）に対応する配列表についてはsequentialな番号システムを用いた。したがって、Bode et al.のシステムを用いた本明細書に記載のトロンビン及びトロンビン変異体のアミノ酸番号２１５及び２１７は、配列番号１、２、及び３におけるシーケンシャル番号システムではトロンビン及びトロンビン変異体のアミノ酸番号２６３及び２６５に相当する。トロンビンのアミノ酸配列を、Bode et al.のシステムを用いたものと配列番号１、２及び３に用いたシーケンシャル番号システムを用いたものを並べて比較し、表１に示す。表１に記載のように、シーケンシャル番号システムではトロンビンＡ鎖はアミノ酸番号１から始まり、トロンビンＢ鎖はアミノ酸番号３７から始まる。
【００２１】
【表１】
【００２２】
本明細書において「バリアント」又は「バリアント型プロトロンビン又はトロンビン」とは、プロトロンビン又はトロンビンのアミノ酸配列に由来する修飾アミノ酸配列であって、トロンビンの残基番号２１５及び／又は２１７にアミノ酸置換を有するものを意味する。このようなバリアントをトロンビン変異体と呼ぶこともある。通常、本発明の方法に使用するためのこのようなバリアントは、プロトロンビン又はトロンビンのアミノ酸配列に由来しトロンビンの残基番号２１５及び／又は２１７にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。この配列同一性は、本明細書に別途記載の配列アラインメントプログラム及びパラメータを用いて決定される。本発明の方法に使用するための、このような生物学的活性バリアントは、プロトロンビン又はトロンビンとアミノ酸残基が１〜１５個異なるだけでもよく、１〜１０個だけ、例えば６〜１０個、５、４、３、２又はたった１個異なるだけでもよい。
【００２３】
本明細書において「パーセント配列同一性」又は「パーセント配列類似性」とは、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264（Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877で改変）のアルゴリズムを用いて決定される２つの配列間の配列同一性の程度を意味する。このようなアルゴリズムはAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて、参照ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るものである。比較のためのギャップ入りアラインメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータが使用される（http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。その他のアルゴリズム、同等のプログラム、及びデフォルト設定も好適である。「同等のプログラム」とは、目的の任意の２つの配列について、GAP Version 10により作成される対応するアラインメントと比較したときに同じアミノ酸残基マッチ及び同じパーセント配列同一性を有するアラインメントを作成する任意の比較プログラムを意図する。
【００２４】
本発明の方法に使用されるバリアント型プロトロンビン又はトロンビンは生物学的活性を有する。すなわち、本明細書に別途記載しているように、抗凝固剤の抗凝固効果を阻害する望ましい生物学的活性を有する。さらに、このようなバリアント型プロトロンビン又はトロンビンはトロンビン阻害剤（特にＤＴＩ）などの抗凝固剤に結合する特性を呈し、一般的にトロンビンに比べて低下した凝固促進活性を有する。
【００２５】
トロンビン阻害剤（ＤＴＩを含む）などの抗凝固剤へのバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの結合を測定する結合アッセイは当該技術分野で周知である（例えば後述の実験セクション、並びにKelly et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6040-6044、Hosokawa et al. (2001) Biochemical Journal. 354:309-313、Schmitz et al. (1991) Europ. J. Biochem., 195:251-256及びOkamoto et al. (1981) Biochem. & Biophys. Res. Comm., 101:440-446を参照）。本発明の一実施形態においては、バリアント型プロトロンビン及びトロンビンは、ＤＴＩとの結合に利用可能な活性（触媒）部位及びエキソサイトＩの両方を有する。トロンビンの活性部位間隙には２つの突出した挿入ループ（すなわち、６０−ループ及び１４８−ループ）が隣接し、これらのループは基質及び阻害剤と活性部位との相互作用を部分的に制御している（Bode et al. (1989) EMBO J., 8:3467-3475、Le Bonniec et al. (1993) J. Biol. Chem., 268:19055-19061及びLe Bonniec et al. (1992) J. Biol. Chem., 267:19341-19348）。エキソサイトＩ及びIIはトロンビン表面のほぼ反対に位置する電気的陽性部位であり、複数の基質と結合することが知られている（Stubbs and Bode (1993) Thromb. Res., 69:1-58及びBode et al. (1992) Protein Sci., 1:26-471）。例えば、エキソサイトＩはフィブリノーゲン並びにフィブリンＩ及びIIに結合することが知られており（例えばNaski et al. (1990) J. Biol. Chem., 265:13484-13489及びNaski and Shafer (1991) J. Biol. Chem., 266:13003-13010参照）、一方エキソサイトIIはヘパリン及びその他のグリコサミノグリカンに結合することが知られている（Bode et al. (1992) Protein Sci., 1:26-471及びGan et al. (1994) J. Biol. Chem., 269:1301-1305）。
【００２６】
本明細書において「凝固促進剤」とは、可溶性の循環フィブリノーゲンを不溶性の架橋されたフィブリン網に変化させて血液凝固プロセスを開始又は加速させる薬剤を意味する。凝固促進剤の例としては、フィブリノーゲンをフィブリンに切断することができるタンパク質分解活性を有する、天然トロンビン又はそのバリアントを挙げることができる。インビトロにおいて、凝固促進剤は最終的に血餅を生じさせる。インビボにおいて、凝固促進剤は最終的に病的な状態で血栓を生じさせる。本明細書において「血栓」とは、動物又はヒトの病的状態から生じる、血液成分から形成される血管内の凝固塊を意味する。通常、血栓の構成要素の比率は、循環血液の同一成分の組成比とは異なる。血栓はフィブリノーゲンのフィブリンへの切断、血小板の活性化及び架橋されたフィブリン網への血小板の粘着を含む動的プロセス（dynamic process）によってインビボで生じる。
【００２７】
本明細書において低下した凝固促進活性は、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンに対して、そのＰＡ／ＦＣ比率（「相対抗凝固力価（relative anticoagulant potency）」又は「ＲＡＰ」とも呼ばれる）を計算することで決定することができる（例えばDi Cera (1998) Trends Cardiovasc. Med., 8:340-350及びDang et al. (1997) Nat. Biotechnol., 15:146-149参照）。本明細書において「ＰＡ／ＦＣ比率」とは、トロンビンと比較したときに、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンに残っている野生型プロテインＣ活性化（ＰＡ）活性のパーセントとバリアント型プロトロンビン又はトロンビンに残っている野生型フィブリノーゲン凝固（ＦＣ）活性のパーセントとの比率を意味する。１．０より大きいＰＡ／ＦＣ値は、プロテインＣ活性化により生じる残留抗凝固活性と比較して、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンの凝固促進的なフィブリノーゲン切断活性が低下していることを示す。
【００２８】
本発明の一実施形態においては、方法は、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（配列番号１）及びＷ２１５Ａ（配列番号２）又はこれらのバリアント（米国特許第６７０６５１２号参照。その全体を本願に組み込んだものとする）などのバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの使用を含む。これらのトロンビン変異体は、インビトロ及びインビボにおける抗凝固剤／抗血栓剤として以前から研究されている。下記の実験セクションに詳述するように、本発明は、これらのトロンビン変異体が上述した抗凝固剤の抗凝固効果を阻害する生物学的活性を示すという発見に関する。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びＷ２１５Ａは共に、トロンビンと比較して実質的に低下したdフィブリノーゲン切断活性を示し、一方でトロンボモジュリン存在下におけるプロテインＣ活性化能は保存されている。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びＷ２１５Ａは、単体の薬剤として静脈内投与されると、内皮トロンボモジュリンと協調して血漿プロテインＣを活性化し、抗凝固剤として機能する。しかし、これらのトロンビン変異体をＤＴＩなどのトロンビン阻害剤存在下で投与すると、トロンビン変異体はトロンビン阻害剤に直接結合する。この結合により、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びＷ２１５Ａに本来存在する（ＡＰＣ活性化を介した）抗凝固剤としての活性がブロックされる。その結果、内因的に生成された天然トロンビンでＤＴＩに結合しているものの比率を減少させ、血小板及びフィブリノーゲンが活性化される（図１参照）。
【００２９】
本発明の方法に使用するためのトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びＷ２１５Ａのバリアントの例としては、配列番号１に示されるＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのアミノ酸配列及び配列番号２に示されるＷ２１５Ａのアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は２の２６３及び／又は２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するトロンビン変異体を挙げることができる。上記の通り、このようなバリアントは生物学的活性を有し（すなわち、これらは抗凝固剤の抗凝固効果を阻害する）、トロンビン阻害剤（特にＤＴＩ）などの抗凝固剤に結合する特性を示し、通常、トロンビンと比較して低下した凝固促進活性を有する。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、方法は、本明細書に記載のバリアント型プロトロンビン又はトロンビンのいずれかのフラグメントが、生物学的活性を有し（すなわち、これらは抗凝固剤の抗凝固効果を阻害する）、トロンビン阻害剤（特にＤＴＩ）などの抗凝固剤に結合する特性を示し、通常、トロンビンと比較してreduced凝固促進活性を有する限り、そのようなフラグメントの使用を含む。「フラグメント」とは、アミノ酸配列の一部を意図し、通常、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、又は２５０個の連続したアミノ酸を含むか、又は本明細書に記載のバリアント型プロトロンビン又はトロンビンに存在するアミノ酸の総数までのアミノ酸を含む。
【００３１】
本発明の一実施形態においては、方法は抗凝固剤の抗凝固効果を阻害することを含む。抗凝固剤の例はトロンビン阻害剤であり、間接トロンビン阻害剤及びＤＴＩの両方が含まれる。間接トロンビン阻害剤の例としては、ヘパリン、クマリン、デルマタン、及びトロンボモジュリンを挙げることができる。ＤＴＩの例としては、アルガトロバン又はその誘導体若しくはアナログ、ヒルジン又はその組換え若しくは合成誘導体若しくはアナログ、トリペプチドＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの誘導体、クロロメチルケトン誘導体、キシメラガトラン又はその誘導体、代謝産物、若しくはアナログ、トリアビン（Triabin）などのアニオン結合エキソサイト阻害剤、及びＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーを挙げることができる（例えばNoeske-Jungblut et al. (1995) J. Biol. Chem., 270:28629-28634及びJeter et al. (2004) FEBS Letters, 568:10-14参照）。ヒルジンの組換え又は合成の、誘導体又はアナログ（「ヒルログ」）は、特に限定されないが、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン等を挙げることができる。キシメラガトランの代謝産物は特に限定されないが、メラガトラン等を挙げることができる。
【００３２】
特定の実施形態においては、ＤＴＩはアルガトロバンである。アルガトロバンは合成抗凝固剤であって、その効果はトロンビンの触媒ドメイン（活性部位とも呼ばれる）との化学的複合体の形成に基づいている。アルガトロバンが結合するとトロンビンの触媒作用が消失し、それにより血小板の活性化及びフィブリン形成が阻害される。アルガトロバンはアルギニン由来の小さなトロンビン阻害剤であり、その分子量は５２６．６６である。トロンビンへの強い親和性（Ｋｉ値：０．０４μｍｏｌ／ｌ）及び直接的な作用機序から、ヘパリン起因性血小板減少症患者への抗凝固などに臨床応用されている。しかしながら、その有用な効果にも関わらず、アルガトロバンには利用可能な解毒剤がないため、臨床における使用は一部制限されている。そこで、本発明の好ましい実施形態においては、それを必要とする患者にバリアント型プロトロンビン又はトロンビン、特にトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、Ｗ２１５Ａ、及びそのバリアントを投与することを含む、アルガトロバンの抗凝固効果を阻害する方法を提供する。
【００３３】
本発明の別の実施形態においては、ＤＴＩは合成トロンビン阻害剤キシメラガトランである。キシメラガトランは肝臓でその活性型であるメラガトランに代謝される。アルガトロバン同様、メラガトランも触媒部位指向型のトロンビン阻害剤であり、（アルガトロバン、ビバリルジン、及び組換えヒルジンなど従来の静注薬物と対照的に）最初の経口剤型のトロンビン阻害剤である。そこで、本発明の好ましい実施形態においては、それを必要とする患者にバリアント型プロトロンビン又はトロンビン、特にトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、Ｗ２１５Ａ、及びそのバリアントを投与することを含む、キシメラガトラン及び／又はその代謝産物メラガトランの抗凝固効果を阻害する方法を提供する。
【００３４】
上述のように本発明は、それを必要とする患者においてトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法であって、患者に本明細書に記載のトロンビン変異体を治療有効量投与することを含む方法を提供する。「治療有効量」とは、本明細書に別途定義しているように抗凝固剤の抗凝固効果を阻害するのに十分なトロンビン変異体の量を意図する（すなわち、抗凝固剤の効果を少なくとも一部逆転（〜１００％の逆転まで含む）させるのに十分な量）。
【００３５】
本明細書において「患者」とは任意の動物、好ましくはヒトを指し、家畜、農業用動物、又は希少動物を含む。特定の実施形態においてはヒトは成人（１８歳以上）であり、別の実施形態においてはヒトは子供（１８歳未満）である。子供は新生児, 乳児, 幼児、思春期前、又は思秋期後の子供であってもよく、年齢で言うとほぼ出生時、１ヶ月〜約２歳、約１歳〜５歳、約４歳〜約９歳、約８歳〜約１４歳、又は約１３歳〜約１８歳の子供であってもよい。さらに、ヒトは約５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５歳であってもよい。
【００３６】
本発明の方法に使用するためのトロンビン変異体は、薬学的に有用な組成物（例えば薬学的に許容される輸送担体との混合物）の周知の調製方法に従って処方することができる。好適な担体及びその処方については、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A. (ed.), Mack, Easton PA (1980)に記載されている。効果的投与に適した薬学的に許容される組成物を調製するために、そのような組成物は、有効量のトロンビン変異体を単独又は好適な量の輸送担体と一緒に含んでもよい。
【００３７】
本明細書において「薬学的に許容される」とは、生物学的に活性でありながら、それを受容するヒト又は動物の生理にその生存能力に損傷を与える程のダメージを与えないトロンビン変異体又はその他の治療薬剤若しくは治療化合物を意味する。
【００３８】
本発明の方法に使用するために、本明細書に記載のトロンビン変異体は、それ自体を投与してもよく、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。薬として使用する場合、トロンビン変異体の塩は薬学的及び薬理学的に許容されるものであるべきであるが、薬学的に許容されない塩も、遊離活性化合物又はその薬学的に許容される塩を調製するために適宜使用することができ、本発明の範囲から排除されるものではない。このような薬理学的及び薬学的に許容される塩は、本明細書に記載しているように、文献に詳述されている標準的な方法を用いて、本明細書に記載のトロンビン変異体と有機酸又は無機酸との反応により調製することができる。薬学的に許容される塩の例としては、トスグレート（tosglate）、メテンスルホネート（methenesulfurate）アセテート、シトレート、マロネート、タータレート、スクシネート、ベンゾエート等の生理学的に許容されるアニオンから形成される有機酸塩を挙げることができる。無機酸塩は、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩等から形成することができる。また、薬学的に許容される塩はアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として調製することができる（例えばカルボン酸のナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩）。
【００３９】
医薬組成物は、好適な担体、希釈剤、又は滅菌水、生理食塩水、グルコース等の賦形剤との混合物として投与してもよい。組成物は望ましい投与経路及び製剤に応じて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化剤又は粘度増強剤、保存剤、着香料、着色料などの補助剤を含有してもよい
【００４０】
トロンビン変異体を含む医薬組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、種、及び状態、並びに投与経路などの要素を考慮して、医学又は獣医学分野の当業者に周知の用量及び技術で投与することができる。投与経路は、安全かつ治療に有効な投与量で本発明の組成物を動物又はヒトの血液に送達する任意の経路であってよい。投与形態は特に制限されないが、局所、腸内、非経口等の投与経路を挙げることができる。腸内経路の例としては、経口投与及び胃腸投与を挙げることができる。非経口投与の例としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、経粘膜投与等を挙げることができる。その他の投与経路としては、硬膜外投与、鞘内投与等を挙げることができる。
【００４１】
投与に有効な用量及び経路は、化合物の治療域及び性質によって決定され、また、患者の年齢、体重、及び状態などの周知の要素、並びにＬＤ５０及びその他の公知のスクリーニング手法によっても決定され、これらは周知であり、過度な実験を要しない。
【００４２】
本明細書において「用量」とは、動物又はヒトに投与されるバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの量を意味する。受容者への治療薬剤の送達は、ボーラス又は持続性（連続的又は断続的）の送達であってよい。ある用量の送達が一定期間（数分〜数日、数週間、数ヶ月であってもよく、数年の長期間にわたって投与されてもよい）にわたって持続される場合、用量は治療薬剤の重量／患者のｋｇ体重／送達単位時間として表すことができる。
【００４３】
本発明の一実施形態においては、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するために、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンを、それを必要とする患者に約０．１ｎｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｎｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約１ｍｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量でボーラス投与する。あるいは、治療有効量を得るために投与するバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの量は約０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ体重又はそれ以上である。本発明の一態様では、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンはＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ、又はそのバリアントであり、非経口投与、好ましくは静脈内投与される。
【００４４】
本発明の別の実施形態においては、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するために、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンを、それを必要とする患者に約０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ体重／分、又はそれ以上の投与量で持続投与する。本発明の一態様においては、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンはＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ、又はそのバリアントであり、非経口投与、好ましくは静脈内投与される。
【００４５】
本発明のさらに別の実施形態においては、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するために、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンを、それを必要とする患者に０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１１μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１３μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ、１９μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、若しくは１００μｇ／ｍｌ又はそれ以上の血漿濃度を得るのに十分な投与量で投与する。本発明の一態様においては、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンはＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ、又はそのバリアントであり、非経口投与、好ましくは静脈内投与される。
【００４６】
本発明の別の実施形態においては、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンを主要な活性薬剤として、追加的な活性薬剤と一緒にそれを必要とする患者に投与する、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するための併用療法が提供される。このような併用療法の実施は、異なる活性薬剤を単一組成物で投与するか、異なる活性薬剤を別々の組成物で同時に投与するか、又は異なる活性薬剤を順次投与することで行ってもよい。この併用療法には、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンが既に投与されている患者においてその患者の薬物投与計画に別の活性薬剤が追加される状況も含まれ、また、別の人間（例えば、医師又は医療専門家）によってその組合せの個別の成分が患者に投与される場合も含まれる。
【００４７】
この追加的な活性薬剤は、常にではないが一般的に、トロンビン阻害剤の抗凝固効果の阻害に有効な薬剤及び／又はバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの効果を亢進するか増強する薬剤である。好ましい実施形態においては、追加的な活性薬剤は止血剤、すなわち止血を促進する薬剤である。
【００４８】
本明細書において「止血」とは、血管系傷害後の血液循環の整合性を維持する協調的機序を意味する。血管に傷害のない正常な循環では、血小板は活性化されていなく、遊離して循環している。血管の傷害は内皮細胞下組織を露出させ、血小板がそこに粘着することができる。粘着血小板は他の循環血小板を誘引し、予備的な栓を形成する。この栓は毛細管又はその他の小血管の漏出を閉じるのに特に有用である。これらのイベントを一次止血という。通常、一次止血のすぐ後に、連鎖した酵素反応のカスケードを含む二次止血が続き、これにより血漿凝固が起こり、血小板による一次の栓（primary platelet plug）が強化される。したがって、止血剤とは、血管壁の収縮、形成された血液要素の粘着及び凝集、血液又は血漿の凝固などの止血に関わる生理的プロセスのいずれかを促進又は亢進することで出血を遅らせる又は止める任意の薬剤である。
【００４９】
本発明の併用療法での使用に特に好ましい止血剤の例としては、活性化第VII因子 (ＦVIIａ)又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤（ＡＰＣＣ）を挙げることができる。ＦＶＩＩａ及びＡＰＣＣはどちらも、インヒビターが出現した血友病患者の出血を処置するための止血剤として開発された（Scharrer (1999) Haemophilia, 5:253-259；Shapiro et al. (1998) Thromb. Haemost., 80:773-778、Lusher et al. (1980) N. Engl. J. Med., 303:421-425、Sjamsoedin et al. (1981) N. Engl. J. Med., 305:717-21及びNegrier et al. (1997) Thromb. Haemost., 77:1113-1119）。ＡＰＣＣの主要な活性成分はプロトロンビンであり、止血及び血栓成長の両方に寄与する（Akhavan et al. (2000) Thromb. Haemost., 84:989-997及びXi et al. (1989) Thromb. Haemost., 62:788-791）。一方、ＦVIIａの血漿濃度の上昇は、ＴＦ／ＦVIIａ複合体が第IX及び第Ｘ因子を活性化する組織因子（ＴＦ）依存的経路を介して、主にトロンビン生成を増加させると考えられる（Hoffman and Monroe (2001) Thromb. Haemost., 85:958-965）。
【００５０】
また、本発明は、バリアント型プロトロンビン又はトロンビン滴定アッセイを用いた、患者の血漿又は全血中の抗凝固剤濃度を定量する方法を提供する。特に、本発明は患者の血漿又は全血中のトロンビン阻害剤、特にＤＴＩの濃度を定量する方法を提供する。下記の実験セクションに詳述するように、このような方法は全血又は血漿試料における血塊形成の開始と試料中に存在するトロンビン阻害剤及びバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの相対濃度との関係に基づいている。凝血開始までの時間は、トロンビン阻害剤とバリアント型プロトロンビン又はトロンビンのモル比が１．０に近いとき、最も短いと予想される。バリアント型プロトロンビン又はトロンビンが過剰の場合、これらのトロンビン変異体はトロンボモジュリンに結合してプロテインＣを活性化し、凝血開始までの時間が長くなると予想される。
【００５１】
一実施形態において、抗凝固剤濃度を定量する方法は、トロンビン阻害剤、特にＤＴＩの濃度の定量を含む。この方法は、ａ）患者から血漿又は全血試料を採取するステップ；ｂ）血漿又は全血試料にトロンボモジュリンを添加するステップ；ｃ）一連の試験チャンバーに、様々な濃度に上昇させた（increasing concentrations of）トロンビン変異体をロードするステップ；ｄ）各試験チャンバーに血漿又は全血試料を等量添加するステップ；ｅ）各試験チャンバーにおいて血漿又は全血試料の凝血開始までの時間を測定するステップ；ｆ）凝血開始までの時間が最も短い試験チャンバーを選択するステップ；及びｇ）血漿又は血液中の直接トロンビン阻害剤濃度が、選択しなかった試験チャンバーにおけるトロンビン変異体濃度と比較して、選択した試験チャンバーにおけるトロンビン変異体濃度に最も近い濃度であると評価するステップ、を含む。これらの方法に使用するトロンビン変異体としては、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ、又はそのバリアントが好ましい。
【００５２】
本発明に基づく抗凝固剤濃度の定量方法に関して、凝血開始までの時間は、血塊形成の開始を測定するための任意の標準的な試験を用いて測定することができ、そのような試験は当該技術分野で周知であり、例えば、上述のＡＰＴＴ又は活性化凝血時間（ＡＣＴ；Hattersley (1966) J. Am. Med. Assoc., 196:436-440参照）がある。
【００５３】
本明細書において「試験チャンバー」とは、血塊形成の開始について血漿又は全血試料を試験することができる任意の装置又はデバイスを意味し、例えばマルチウェル・ディッシュ、フラスコ、ボトル、スライド等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
以上、本発明について一般的に記述してきたが、本明細書に記載の特定の具体例を参照することでさらによく理解されるであろう。これらの具体例は説明のためだけのものであり、特に明示しない限り、本発明を限定することを意図するものではない。
【００５５】
実験
トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、インビトロ及びインビボにおける抗凝固剤／抗血栓剤としてこれまで研究されてきた。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、触媒ドメインへの二重変異により、血小板活性化及びフィブリノーゲン切断が大きく低下しているが、トロンボモジュリン存在下でプロテインＣを活性化する能力は保持したままである。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ＤＴＩへの親和性を保持しているため、ＤＴＩに対する逆転薬剤として使用し得るであろうと考えられていた。特に、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、間接又は直接トロンビン阻害剤に添加されると、最初にこれらのトロンビン阻害剤と複合体を形成し、トロンビン阻害剤と結合した、内生的に生成した天然トロンビンの程度を低下させ、血小板及びフィブリノーゲンが活性化されると考えられていた（例えば図２参照）。
【００５６】
ビバリルジン（１〜１０μｇ／ｍｌ）、レピルジン（０．１〜５μｇ／ｍｌ）、アルガトロバン（０．５〜１．０μｇ／ｍｌ）、又は未分画ヘパリン（０．２〜０．５Ｕ／ｍｌ）で前処理した血漿及び全血試料中のＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果を評価した。ＤＴＩ又はヘパリンの中和を、本明細書に別途記載している活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））、及びトロンビン生成の持続モニタリング（Trombinoscope（登録商標））を用いて評価した。ヘパリンについては、比較のための標準として硫酸プロタミンを用いた。
【実施例１】
【００５７】
トロンビン阻害剤の効果を逆転するためのトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ/E217Aの使用
材料及び方法
材料
組換えトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを、以前に記述の通りに作製した（Cantwell and Di Cera (2000) Journal of Biological Chemistry, 275: 39827-39830）。可溶性トロンボモジュリンはAsahi Kasei Pharma（Oh-hito, Japan）から贈呈された。組織因子（ＴＦ）はDade-Behring（Innovin（登録商標）、Dade Behring, Marburg, Germany）から購入した。試験した直接トロンビン阻害剤には、アルガトロバン （GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC）、ビバリルジン（アンジオマックス（登録商標）、Medicines Company, Parsippany, NJ）、及びレピルジン（レフルダン（登録商標）、Berlex, Montville, NJ）が含まれる。また、アンチトロンビン依存性間接阻害剤であるヘパリンナトリウム（Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ）についても、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを評価した。ヘパリンの逆転についての標準として硫酸プロタミン（Pharmaceutical Partners, East Schaumburg, IL）を用いた。
【００５８】
トロンビン生成アッセイのための蛍光基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ ＨＣｌ、分子量６１６．０７）はBachem（Switzerland）から入手した。ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン-Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ＣａＣｌ２、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及びＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）はSigma （Sigma, St Louis, MO）から入手した。組織因子を滅菌水１０ｍｌに溶かし、さらに有効な（working）ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で希釈した（１：７５）。１．７５ｍｌのＦｌｕｃａ緩衝ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３５、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）をガラス試験管中の０．２ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ２に添加し、混合した後、３７℃で数分間温めた。使用直前にＤＭＳＯ中の１００ｍＭの蛍光基質をＨＥＰＥＳ−ＣａＣｌ２溶液に５０μｌ添加し、混合して溶解させた。これにより、この緩衝液には２．５ｍＭの基質及び１００ｍＭのＣａＣｌ２が含まれる。
【００５９】
血漿採取のため、機関からの許可及び２週間以内にどのような投薬も受けていない６人のボランティアから書面による説明及び同意を得た後、全血試料（５ｍｌ、３．２％クエン酸三ナトリウム中）を得た。ＡＰＴＴ及びトロンビン生成実験のために、血液を３０００×ｇ、２０分間遠心分離し、乏血小板血漿（ＰＰＰ）を得た。ＰＰＰはすぐに使用したか、又は−２０℃で最大で２日まで保存した。ＴＥＧ（登録商標）を用いた測定には、クエン酸中の全血を、採取から５分以内にカルシウムを再添加（recalcification）して使用した。全ての実験において、組換えトロンビン変異体の終濃度は５μｇ／ｍｌとした。
【００６０】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定
また、トロンビン変異体の効果は、PTT Automate（登録商標）とSTart（登録商標）４機器（Diagnostica Stago, Asnieres, France）を用いて従来のＡＰＴＴアッセイでも評価した。ＡＰＴＴの測定（秒単位）は、乏血小板血漿を使い捨てキュベット（Diagnostica Stago, Parsippany, NJ）に５０マイクロリットルずつ取り、ＡＰＴＴ試薬を加えて３７℃でプレインキュベートした後、試料の測定を繰り返し行った。治療濃度のＤＴＩ（０．５〜１μｇ／ｍｌのアルガトロバン；０．１〜１μｇ／ｍｌのレピルジン；１〜１０μｇ／ｍｌのビバリルジン）、及びヘパリン（０．２〜０．５Ｕ／ｍｌ））を用いて、試料の前処理を行った。トロンビン変異体を添加した後（終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＤＴＩ処置血漿のＡＰＴＴに対するトロンビン変異体の効果を評価した。いくつかの実験で、比較のために、触媒部位をブロックされたトロンビン（クロロメチルケトン（ＦＰＲｃｋ）で飽和されたトロンビン）を１００μｇ／ｍｌで使用した。
【００６１】
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標）, Haemoscope, Niles, IL）を用いて血塊形成の粘弾性測定を評価した。全血試料（１ｍｌ、３．２％クエン酸三ナトリウム中）にＤＴＩ（ビバリルジン５μｇ／ｍｌ、レピルジン１μｇ／ｍｌ、又はアルガトロバン０．５μｇ／ｍｌ）又は０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンのいずれかを添加（spike）した。ＴＥＧ（登録商標）の測定用に、１０μｌの０．４Ｍ ＣａＣｌ２を含む使い捨てカップに試料を３６０μｌずつ取った。各試料にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加（終濃度５μｇ／ｍｌ）した後、ＴＥＧ（登録商標）の変動に対するこのトロンビン変異体の効果を評価した。ＴＥＧ（登録商標）の変動、血塊形成の開始を表す反応時間（分）、及び血塊の強度を表す最大振幅（ｍｍ）を異なる群で比較した（Kawasaki et al. (2004) Anesthesia & Analgesia, 99:1440-1444）。
【００６２】
Thrombinoscope（登録商標）によるトロンビン生成のモニタリング
トロンビン生成のこの複雑な制御を評価するために、Thrombinoscope（登録商標）システムを使用した。このシステムは、多血小板血漿又は乏血小板血漿中におけるトロンビン生成のタイムコースを自動で収集することができる（Hemker et al. (2003) Pathophysiology of Haemostasis & Thrombosis, 33:4-15）。市販の蛍光基質（Ｚ−ＧｌｙＧｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）を用いて内生トロンビンポテンシャルを自動評価する方法は別に詳述されている（Hemker et al. (2003) Pathophysiology of Haemostasis & Thrombosis, 33:4-15）。簡潔には、トロンビン生成実験用に、８０μｌのＰＰＰ及び２０μｌのトロンビン生成トリガーを９６ウェルのマイクロタイタープレート（Microfluor2, Labsystems, Finland）のウェルに添加し、さらに２０μｌの基質−塩化カルシウム緩衝液を添加する。 反応は、３９０ｎｍ（励起波長）及び４６０ｎｍ（発光波長）にセットしたマイクロプレート蛍光光度計（Fluoroskan Ascent, Labsystems, Finland）を用いてモニターする。反応の進行の表示とトロンビン生成のパラメータ（ピークトロンビンレベル）の計算とを行う市販のThrombinoscopeソフトウェア（Synapse B.V）によって、発光は２０秒毎に９０分間記録され、得られたデータは自動的に処理される。トロンビン変異体の効果を、トロンビン変異体（５μｇ／ｍｌ）存在下又は非存在下で治療濃度のＤＴＩ（アルガトロバン０．５〜１μｇ／ｍｌ；レピルジン０．１〜５μｇ／ｍｌ；ビバリルジン１〜１０μｇ／ｍｌ）で前処理したＰＰＰで試験した。さらに、ヘパリン（０．２又は０．５Ｕ／ｍｌ）も評価した。適当な濃度のプロタミンによるヘパリンの逆転を比較のために用いた（ヘパリン１００ユニット（１ｍｇ）毎にプロタミン１ｍｇ）。プロテインＣ活性化に対するトロンビン変異体の効果を評価するために（Regnault et al. (2003) Thrombosis and Haemostasis, 89:208-212）、可溶性トロンボモジュリン（終濃度０．７５μｇ／ｍｌ）を、トロンビン変異体を含有する試料血漿に添加した。
【００６３】
データ分析
各実験は少なくとも３人の異なる人間の試料で行った。トロンビン生成のトレース（Thrombinoscope（登録商標））及びＴＥＧ（登録商標）は、３回行った測定のうち、代表的１セットを示す。統計解析には、対応のあるｔ検定（両側検定）を用いて、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの存在下及び非存在下で測定された変動差を決定した
【００６４】
結果
ＡＰＴＴに対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果
全てのＤＴＩ及びヘパリンは、濃度依存的にＡＰＴＴを延長させる（図３、パネルＡ〜Ｄ）。血漿にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると、ＡＰＴＴ値は正常範囲内にシフトした。活性部位をブロックされたトロンビン（ＦＰＲ−ＴＨ）は、ＤＴＩ又はヘパリンで延長されたＡＰＴＴに対して影響を与えなかった。
【００６５】
ＴＥＧ（登録商標）に対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果
実験に用いた全ての試薬で、反応時間はコントロール値（５．９分）の少なくとも２倍延長された（図４Ａ）。ヘパリンは４５分の期間中に実質的に血塊形成を消失させた。振幅（ｍｍ）で表される血塊の強度は、レピルジン及びビバリルジンではほとんど影響されなかった（minimally affected）が、アルガトロバンで減少した（図４Ｂ）。全てのＤＴＩで、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（５μｇ／ｍｌ）を添加すると、反応時間及び振幅変動の両方が正常に逆転された（図４Ａ、５Ａ）。ヘパリンでは、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａによって反応時間が顕著に短縮された（４５分から１４分、ｐ＜０．０１）が、振幅は硫酸プロタミンと比較して中程度（不完全）の回復を示した（図５Ｂ）。可溶性トロンボモジュリン（０．７５μｇ／ｍｌ）存在下において、５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは開始を遅らせ、血塊強度を低下させた（図５Ａ）。
【００６６】
トロンビン生成に対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果
血漿にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（５μｇ／ｍｌ）を添加すると、トロンビン生成のピークが減少し、この効果は可溶性トロンボモジュリン（０．７５μｇ／ｍｌ）の添加により実質的に増強された（図６Ａ）。ビバリルジン及びレピルジンはトロンビン生成の開始を遅らせたが、ピークレベルは減少させなかった（それぞれ図６Ｂ及び６Ｃ）。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、延長されたトロンビン生成の潜伏期間を短縮する効果を有していた。 血漿にアルガトロバンを添加すると、投与量依存的に、発症が延長し、トロンビン生成のピークが減少した（図６Ｄ）。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると、開始は短縮されたが、ピークトロンビン生成は減少しなかった。しかし、０．５及び１μｇ／ｍｌのアルガトロバンでは、ピークトロンビンレベルが中程度の量（＞１００ｎＭ）になることが観察された（図６Ｄ）。ヘパリン（０．２Ｕ／ｍｌ）存在下ではトロンビン生成は鈍化し、５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ又は２μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを添加すると開始が早まり、硫酸プロタミンだけがトロンビン形成のピークレベルを逆転した。
【００６７】
要約
実験に用いた全てのアンチトロンビン薬剤が濃度依存的にＡＰＴＴを延長させ（４６．６〜１８０秒ｖｓコントロール３６秒）、この延長は５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａで逆転された。ＤＴＩ及びヘパリンは血塊形成の開始を遅らせ（＞１４分ｖｓコントロール５．９分）、ＴＥＧ（登録商標）において血塊強度を減少させた。トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ヘパリン及びＤＴＩによって延長されたＡＰＴＴ、トロンビン生成、及びＴＥＧ（登録商標）の遅延時間を短縮させた。トロンビンの生成量及びその後の血塊形成は、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａによって、ＤＴＩで抗凝固処置した試料においては完全に回復し、ヘパリン処置試料では部分的に回復した。５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ＤＴＩ存在下ではＴＥＧ（登録商標）変動を効果的に逆転したが、ヘパリンに対してはプロタミンと比較して中程度の効果だった。トロンビン生成アッセイでは、５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ビバリルジン及びレピルジンの両方で遅延及びピークトロンビンを回復させた。アルガトロバンに大して、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは遅延を顕著に短縮させたが、ピークトロンビンは減少させなかった。硫酸プロタミンの方がヘパリンの中和に効果的であったが、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの方が遅延は短かった。これらの結果は、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７ＡがＤＴＩを逆転するための薬剤として治療に使用可能であり、ヘパリンによる抗凝固を逆転するための二次治療としても潜在的に使用可能であることを示している。
【００６８】
トロンビンは、止血のための血小板及びフィブリノーゲンの活性化並びに抗凝固因子であるプロテインＣの活性化において重要な生理的役割を果たしている。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは内皮トロンボモジュリン存在下でプロテインＣを活性化し、血小板ＰＡＲ−１、フィブリノーゲン及びアンチトロンビンに対する触媒活性が顕著低下している新規のトロンビン変異体である（Cantwell and Di Cera (2000) Journal of Biological Chemistry, 275:39827-39830及びGruber et al. (2002) Journal of Biological Chemistry, 277:27581-27584）。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、単体薬剤として静脈内投与されると、内皮トロンボモジュリンと協調して血漿プロテインＣを活性化する抗凝固剤として機能する。しかし、ＤＴＩ存在下で投与されると、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａはトロンビン阻害剤に直接結合し、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの本来の抗凝固活性（ＡＰＣ活性化）がＤＴＩによってブロックされる（Linder et al. (1999) Thrombosis Research, 95:117-125）。その結果、損傷部位において、ＤＴＩに結合した、内生的に生成した天然トロンビンの比率が低下し、血小板及びフィブリノーゲンが活性化される（図２参照）。
【００６９】
Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａに関する利用可能なデータから、アミノ末端がＦＰＲＰでカルボキシル末端がヒルジンドデカペプチドに類似のビバリルジンの結合が強く支持されている（Kelly et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6040-6044）。レピルジン及びビバリルジンの作用機序は、トロンビンの触媒ドメイン及びエキソサイトＩへのトロンビン阻害剤の２価の結合である。ＦＰＲｃｋ−結合Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの結晶構造研究は、ビバリルジンのアミノ末端の結合を支持しており、modulateされていないエキソサイトＩはカルボキシル末端のドデカペプチドの結合に利用可能である。ＦＰＲｃｋ−結合天然トロンビンが有効性を示さなかったこと及び本来の抗凝固作用を有していることから、トロンビン変異体の触媒ドメイン及びエキソサイトＩの両方が利用可能であることが、ＤＴＩの逆転に重要であると考えられる（Hosokawa et al. (2001) Biochemical Journal, 354:309-313）。この知見は、アミノ末端のトリペプチドＦＰＲ及びカルボキシル末端のドデカペプチドのどちらもビバリルジンほどのアンチトロンビン効果を示さなかったことから（Kelly et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6040-6044）、２つの異なるトロンビン部位における２価ＤＴＩの結合の向上（Schmitz et al. (1991) European Journal of Biochemistry, 195:251-256）を説明するものである。
【００７０】
対照的に、アルガトロバン、メラガトラン（キシメラガトランの活性型）などの小分子トロンビン阻害剤はトロンビンの活性部位にのみ結合する（Okamoto et al. (1981) Biochemical & Biophysical Research Communications, 101:440-446）。今回のアルガトロバンに関するデータは、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの触媒ドメインに、ＦＰＲｃｋと同様に１価の阻害剤がアクセスできることを示唆している。
【００７１】
ヘパリンは、アンチトロンビン（ＡＴ）によるトロンビン阻害を仲介する。アンチトロンビンは、ＤＴＩと全く（uniquely）異なる内生ＳＥＲＰＩＮである。このグリコサミノグリカンはＡＴのコンフォメーション変化を誘導し（Johnson and Huntington (2003) Biochemistry, 42:8712-8719及びO'Keeffe et al. (2004) Journal of Biological Chemistry, 279:50267-50273）、ＡＴの反応センターループによりトロンビンの触媒部位が不可逆的に阻害される。これらの阻害反応は、トロンビンエキソサイトIIへのヘパリンの結合により支持される。このようなＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａとヘパリンの間のエキソサイト相互作用は、この変異体のエキソサイトが調節されていないために起こるのかも知れない。しかし、ＤＴＩとの相互作用とは対照的に、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ＴＥＧ（登録商標）において、ＡＴ−ヘパリン存在下でピークトロンビン生成をほとんど上昇させず（minimally increased）、血塊強度を一部回復させただけであった。ヘパリン存在下のＷ２１５Ａ／Ｅ２１７ＡによるＡＰＴＴの回復は顕著であったが、ＡＰＴＴの終点はトロンビン生成の初期段階（５〜１０ｎＭ）であり、したがってトロンビンの総量は反映されない（Rand et al. (1996) Blood, 88:3432-3445）。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７ＡはＡＴへの親和性が大きく低下しており（Cantwell and Di Cera (2000) Journal of Biological Chemistry, 275:39827-39830）、他のトロンビン変異体（例えばＥ１９２Ｑ、ｄｅｓＥＴＷ）も、ヘパリンで回復されたＡＴへの親和性の欠失を示している（Le Bonniec et al. (1995) Biochemistry, 34:12241-12248）。今回のデータは、ヘパリン化した血液にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると内生トロンビン生成が少しだけ上昇することを示していた。このことは、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを非常に特異性の高いＤＴＩ逆転薬剤とし、かつＡＴ−ヘパリン複合体の吸着が実際にＡＴ欠乏症及び血栓形成促進状態になることがある（Petaja et al. (1996) Journal of Thoracic & Cardiovascular Surgery, 112:665-671）ことから、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａはインビボの安全性を高める可能性が高いと考えられる。
【００７２】
現在、ヘパリンは心臓手術で使用される主流の抗凝固剤である。凝固はプロタミンで速やかに逆転されるものの、心肺バイパスを使用する心臓手術を受ける患者の３〜５％で重篤な術後出血が起こる（Dacey et al. (1998) Archives of Surgery, 133:442-447）。プロタミンにアレルギーのある患者では重度の有害事象が発現することがあり、ヘパリンを逆転する代わりのプロトコールはない（Williams et al. (1994) Journal of Thoracic & Cardiovascular Surgery, 108:975-983及びStafford-Smith et al. (2005) Anesthesiology, 103:229-240）。もし、今回のデータで実証されたように、手術の終局にＤＴＩを逆転させることができれば、これらの薬剤はヘパリン又はプロタミンが禁忌の場合に使用することができる。
【００７３】
ＤＴＩに関連する心手技後出血は制御が困難な場合が多い。なぜなら、大量の強力なＤＴＩを、強力な抗血小板剤と併用する（Maroo and Lincoff (2004) Seminars in Thrombosis & Hemostasis, 30:329-336）か又は血小板減少症状態で使用する（Dyke et al. (2005) Annals of Thoracic Surgery, 80:299-303））ためである。最近のオフポンプ冠動脈手術におけるビバリルジン及びヘパリン−プロタミンの治験では、どちらの群も同じ程度の術後１２時間の胸腔チューブドレナージ（中央値：７９３ｖｓ８０５ｍｌ）であったが、失血の範囲はビバリルジン群で大きく変化していた（３２０〜４、９０９ｍｌ、ｎ＝５０）（Merry et al. (2004) Annals of Thoracic Surgery, 77:925-931）。過失による過剰投与、（アルガトロバンに対する）肝障害（Swan and Hursting (2000) Pharmacotherapy, 20:318-329）、及び（ビバリルジン及びレピルジンに対する）腎障害（Koster et al. (2000) Annals of Thoracic Surgery, 69:37-41、Robson et al. (2002) Clinical Pharmacology & Therapeutics, 71:433-439及びChew et al. (2005) American Journal of Cardiology, 95:581-585）は全て、出血リスクの増大の原因となる。したがって、ＤＴＩの新規の解毒剤が必要とされていることは明らかである。
【００７４】
出血リスクを減らすために、様々な解毒原理が、特にレピルジンに対して、探索されてきた。ヒルジン及びその合成アナログの中和薬剤として、ジイソプロピルホスホロトロンビン（ＤＩＰトロンビン）又はベンゾイルトロンビンなどのγ−トロンビン標品の使用（Bruggener et al. (1989) Pharmazie, 4:648-649）、及びプロトロンビン中間体であるメイゾトロンビンの使用（Nowak and Bucha (1995) Thrombosis Research, 80:317-325）が提案されてきた。今日まで、これらの標品は毒性が強すぎるか又は液相で効果を発揮しないため、現実的な成功を収めていない。ＤＴＩ関連出血への別のアプローチとして、組換え活性化第VII因子（ノボセブン（登録商標））（Hein et al. (2005) Artificial Organs, 29:507-510及びMalherbe et al. (2004) Anesthesiology, 100:443-445）及びＦＥＩＢＡ又はAutoplex標品（Irani et al. (1995) American Journal of Cardiology, 75:422-423及びElg et al. (2001) Thrombosis Research, 101:159-170）などの止血因子製品の輸血があるが、活性化血漿製品は血栓形成促進性の合併症が付随することがある（Bui et al. (2002) Journal of Thoracic & Cardiovascular Surgery, 124:852-854及びAledort (2004) Journal of Thrombosis & Haemostasis, 2:1700-1708）。したがって、解毒剤の性質は非血栓形成性であることが合理的である。ヘパリナーゼＩがプロタミンに取って変わらなかったのは、低分子ヘパリンが生成されること及び内皮グリコサミノグリカンを分解する可能性があることによるものであろう。逆に、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは静脈内投与されるとプロテインＣを全身で活性化するため、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは安全域を増やすものである。そのため、抗凝固活性（Chu et al. (2001) British Journal of Haematology, 115:392-399）及びプロテインＣ活性化の増強（Slungaard and Key (1994) Journal of Biological Chemistry, 269:25549-25556）を本来発揮するプロタミンによるヘパリンの急速な逆転を比較的安全なものにする。
【００７５】
今回の実験で使用したヘパリン及びＤＴＩの濃度は、ヘパリン（０．５Ｕ／ｍｌ；３．３ｍＭ）、アルガトロバン（０．５〜１．０μｇ／ｍｌ；１〜２μＭ）、ビバリルジン（５〜１０μｇ／ｍｌ；２．３〜４．６μＭ）、及びレピルジン（１μｇ／ｍｌ；０．１４μＭ）の治療範囲である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのモル濃度（５μｇ／ｍｌ又は０．１４μＭ）は、ほとんどの場合、トロンビン阻害剤のモル濃度より低い（Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを３７ｋＤａと仮定）。モル比に加え、トロンビンに対するＫｉ値の相対的差異（レピルジン＞＞ビバリルジン＞アルガトロバン）もＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａへの結合に影響し得る。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、発現が早く、トロンビン生成が十分（ピークトロンビン１００ｎＭ超、図６Ｄ）であるため、インビボで止血を回復させ得る。 非ヒトモデル霊長類においてＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのインビボ血漿濃度は３．７５μｇ／ｍｌに達することもあり（Gruber et al. (2002) Journal of Biological Chemistry, 277:27581-27584）、ヘパリン及びＤＴＩによる抗凝固剤の存在下でも高投与量の計画で安全に使用することができる。
【００７６】
要約すると、本発明の知見は、凝固促進活性が実質的に低下したバリアント型トロンビン及びプロトロンビンを内生トロンビン機能の回復に使用することができることを実証している。とりわけ、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは静脈注射に好適な形態で利用可能であり（Gruber et al. (2002) Journal of Biological Chemistry, 277:27581-27584）、その臨床的有用性を確認するためのインビボにおけるさらなる研究が進行中である。
【実施例２】
【００７７】
患者の血漿又は全血中のＤＴＩを定量するための滴定アッセイ
トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ）を使用した、患者の血漿又は全血中のＤＴＩを定量するアッセイを以下に記載する。Hepcon HMS Plus 6-channel ACT system（Medtronic Perfusion Systems, Minneapolis, MN）に基づき、カートリッジフォーマットを用いて、表２に記載の通り、６チャネルのウェルに所定のレベルのＷＥを予め挿入しておく。
【００７８】
【表２】
【００７９】
ＤＴＩを含む血漿又は全血試料を患者から採取する。これらの試料を、トロンビンの内生阻害剤であるトロンボモジュリン（終濃度０．０３μｇ／ｍｌ）を含むシリンジに入れる。等量の血漿又は全血試料を各ウェルに添加する。各ウェルの試料の凝血開始までの時間を、当業者に周知の方法で、上述したＡＰＴＴ又は活性化凝血時間（ＡＣＴ）を用いて測定する（例えばHattersley (1966) J. Am. Med. Assoc., 196:436-440参照）。
【００８０】
ＤＴＩは、アンチトロンビン又はトロンボモジュリンなどのトロンビンの内生阻害剤よりもずっと早くトロンビン（又はＷＥ）に結合するため（表３参照）。表２において、ｋｏｎはストップトフロー分光法を用いた結合実験から得られた、前定常状態段階におけるα−トロンビンと阻害剤との会合定数であり、ｋｉは阻害定数である。ｋｏｎが大きいほど、阻害剤は速やかにトロンビンに結合する。ｋｉが低いほど、トロンビンの阻害はより選択的かつ 堅固（tight）なものとなる。（例えばElg et al. (1997) Thrombosis Haemostasis,78:1286-1292及びAritomi et al. (1993) Thrombosis Haemostasis, 70:418-422参照）。ＤＴＩに対するＷＥのモル比が１．０に近いほど、凝血開始までの時間は最も短くなることが予想される（図７参照）。ＷＥが過剰の場合、ＷＥはトロンボモジュリンに結合して活性化プロテインＣを活性化し、凝血開始までの時間を長引かせると予想される。逆に、ＤＴＩの方が多く利用可能な場合、存在する全てのＷＥがＤＴＩで飽和され、プロテインＣ活性化はブロックされているものの、過剰のＤＴＩによって凝血開始までの時間が長引くことになる。
【００８１】
【表３】
【００８２】
本明細書中で言及した全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示している。全ての刊行物及び特許出願を、各個別の刊行物及び特許出願が参照により組み込まれることを意図されたものであるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込んだものとする。
【００８３】
前述の発明は、明確な理解のために図示及び例示によりある程度詳細に記載してきたが、添付の請求項の範囲内で特定の変更及び修正を行うことができることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、フィブリノーゲン又はトロンビン阻害剤と野生型トロンビン又は変異体トロンビンＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ）との相互作用を示す図である。図１Ａは、触媒部位がフィブリノーゲンをフィブリンに切断する間に、どのようにトロンビンのエキソサイトＩが初期のフィブリノーゲン結合に必要であるかを示す図である。図１Ｂは、ビバリルジン及びヒルジンがどのようにトロンビンの触媒部位及びエキソサイトＩの両方をブロックするかを示す図である。図１Ｃは、アルガトロバン及びＦＰＲｃｋ（ＰＰＡＣＫ）がどのようにトロンビンの触媒部位だけをブロックするかを示す図である。図１Ｄは、トロンビン触媒ドメインへの２つの変異が、その結果得られた変異体トロンビン（ＷＥ）がフィブリノーゲンを切断する能力及び血小板を活性化する能力をどのように減少させるかを示す図である。図１Ｅは、変異体トロンビン（ＷＥ）がどのようにトロンボモジュリン存在下でプロテインＣを活性化する能力を維持しているをか示す図である。
【図２】図２は、トロンビン変異体が抗凝固剤の効果を逆転することができる機序を示す概略図である。トロンビン変異体は好ましくはＤＴＩに結合し、内生トロンビンがＤＴＩに結合する程度を低下させ、フィブリノーゲンの切断及び血小板の活性化を引き起こす。過剰のトロンビン又はトロンビン変異体が循環中に残ると、トロンボモジュリンとの相互作用によってプロテインＣが活性化される。
【図３】図３は、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７ＡによるＤＴＩの逆転を概略的に描いた図である。様々な濃度の各種ＤＴＩについて、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の平均値を秒単位で示す。図３Ａは５、１０、及び１５μｇ／ｍｌのビバリルジンを示す。図３Ｂは、０．１、１、及び５μｇ／ｍｌのレピルジンを示す。図３Ｃは、０．５及び１μｇ／ｍｌのアルガトロバンを示す。図３Ｄは、０．２及び０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンを示す。アスタリスクは各抗凝固剤レベルにおけるＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを使用した試料と使用していない試料との間の統計的差異を表す。各抗凝固剤レベルで、ＡＰＴＴ値は５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａによって短縮される。活性部位が占有されたトロンビン（ＦＰＲ−ＴＨ）はＡＰＴＴを短縮しない。
【図４】図４は、レピルジュイン（lepirduin）又はヘパリン存在下における血塊形成に対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果を測定するためのトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））によるトレースを示す代表的な図である。図４Ａはレピルジュイン（lepirduin）が血塊形成の反応（遅延）時間（トレース２）を延長させること、及びＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると血塊開始が正常化すること（トレース１）を示す図である。可溶性トロンボモジュリン（０．７５μｇ／ｍｌ）の存在下で、５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは血塊開始を遅らせ、血塊強度を減少させる（トレース３）。図４Ｂは、未分画ヘパリン（０．５Ｕ／ｍｌ）がコントロール（トレース４）と対照的に血塊形成（トレース７）を消失させることを示す図である。５μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンは、発生を完全に回復させ、それより程度は低いが血塊強度も回復させる（トレース５）。５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると、開始が短縮されるが（トレース６）、血塊形成はプロタミン処置試料よりもゆっくりなままである。
【図５】図５は、ビバリルジン、レピルジン、又はアルガトロバン存在下における血塊形成に対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果を測定するためのＴＥＧ（登録商標）によるトレースの代表的な図である。凝血までの反応時間の平均値を分単位で測定した。図５Ａは、ビバリルジン（５μｇ／ｍｌ）、レピルジン（１μｇ／ｍｌ）、又はアルガトロバン（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で反応時間が延長されることを示す図である。各代表的抗凝固剤において、反応時間の値はＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａによって短縮される（＊：ｐ＜０．０１）。コントロール（抗凝固剤なし）とＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを含有するコントロールとで統計的な差はなかったが、可溶性トロンボモジュリン（０．７５μｇ／ｍｌ）を添加すると反応時間が有意に延長された（＃：コントロールに対してｐ＜０．０１）。硫酸プロタミンはヘパリンを逆転させる（§：ヘパリンのみに対してｐ＜０．０１）。図５Ｂは、最大振幅（ｍｍ）の平均値が、アルガトロバン（＊：ｐ＜０．０５）及びヘパリン（＃：ｐ＜０．０１）では減少されたがビバリルジン及びレピルジンでは減少されなかったことを示す図である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると、全てのＤＴＩの振幅が回復したが、ヘパリンは部分的回復のみであった。（§：硫酸プロタミンに対してｐ＜０．０５）。可溶性トロンボモジュリンと共にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加しても振幅は減少した（＊：コントロールに対してｐ＜０．０５）。
【図６】図６は、一連のトロンビン生成曲線を表す図である。図６Ａは、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ、５μｇ／ｍｌ）の添加によって血液血漿中のピークトロンビン生成がわずかに減少し、可溶性トロンボモジュリン（ｒｈｓＴＭ、０．７５μｇ／ｍｌ）の添加では中程度減少したことを示す図である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びトロンボモジュリンの両方を添加するとトロンビン生成はさらに鈍化した。図６Ｂは、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌ、１０μｇ／ｍｌ）により誘導される凝血遅延時間の延長をＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ、５μｇ／ｍｌ）で逆転させることができることを示す図である。図６Ｃは、１及び５μｇ／ｍｌのレピルジンがトロンビン形成を鈍化させること及びＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ、５μｇ／ｍｌ）の添加が発現を短縮し、かつピークトロンビン生成を減少させることを示す図である。図６Ｄは、０．５及び１μｇ／ｍｌのアルガトロバンが発現を延長し、ピークトロンビン生成を減少させることを示す図である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ (WE, ５μｇ／ｍｌ)を添加すると、発現は短縮されたが、減少したトロンビン形成のピークレベルは逆転されなかった。図６Ｅは、０．２Ｕ／ｍｌのヘパリンでトロンビン生成が鈍化されたことを示す図である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ、５μｇ／ｍｌ）を添加すると、凝血開始は短縮されたが、硫酸プロタミンで処置した試料とは対照的に、減少したトロンビン形成のピークレベルは逆転しなかった。
【図７】図７は、全血又は血漿試料の直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）及びＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ）の相対濃度と活性化凝血時間（ＡＣＴ）で測定した血塊形成の開始との関係を示す図である。凝血開始までの時間は、ＤＴＩに対するＷＥのモル比が１．０に近いときに最も短いと予想される。ＷＥが過剰のときは、ＷＥはトロンボモジュリンに結合してプロテインＣを活性化し、凝血開始までの時間が長くなると予想される。
【技術分野】
【０００１】
連邦支援による研究又は開発
本発明は国立衛生研究所により認められた認可番号ＨＬ４９４１３、ＨＬ５８１４１及びＨＬ７３８１３に基づく政府の支援を受けて発明された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、トロンビン変異体、特にトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ又はＷ２１５Ａを用いた、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法に関する。本発明はまた、患者の血漿又は全血中のトロンビン阻害剤濃度を定量するためのトロンビン変異体の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘパリン、クマリンなどの抗凝固剤は、血栓塞栓症の治療及び予防、並びに輸血及びその後の外科手技中の血液凝固の予防のためにしばしば使用される。しかし、このような薬物（drug）の投与によって、最悪の場合は四肢欠損に至ることもある合併症であるヘパリン起因性血小板減少症−血栓症及びクマリン誘発性皮膚壊死等の合併症を生じることがある。したがって、抗凝固剤を患者に投与する場合、合併症が発症したときに特定の抗凝固剤の作用を逆転させる（reverse）ことができる解毒剤が手元にあることが非常に望ましい。このような合併症としては、外科的切開による傷口における出血性副作用、腹膜、胸膜、心膜及び軟膜の血管領域における出血性副作用等がある。
【０００４】
抗凝固薬剤は一般的に、間接トロンビン阻害剤及び直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）に分類することができる。ヘパリン、デルマタンなどの直接トロンビン阻害剤は、アンチトロンビン（ＡＴ）、ヘパリンコファクターII（ＨＣII）などの内生のトロンビン阻害因子の活性化を触媒することでトロンビンを不活化する。対照的に、ヒルジンなどの直接トロンビン阻害剤の効果は、トロンビンに直接結合することで仲介される。
【０００５】
間接トロンビン阻害剤には、硫酸プロタミンを用いて抗凝固効果を速やかに逆転することができるという利点を有するヘパリンがよく使用される。しかしながら、稀にではあるがプロタミン投与によって重篤な心血管虚脱が生じることがあり（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３）、プロタミンにより誘発される血行動態の不安定化は術後の有害な転帰に関連している（非特許文献４及び非特許文献５）。現在のところ、プロタミンアレルギー患者に対してヘパリンを逆転させる安全な代替方法はない。
【０００６】
従来の抗凝固剤に付随する制限及びリスクから、ＤＴＩの臨床使用が急速に進んでいる。全てのＤＴＩは強力な抗血栓剤であり、大きな出血のリスクは０．７〜１．９％であり、これは未分画ヘパリンに匹敵するかそれよりも小さい値である（非特許文献６）。現在利用可能なＤＴＩとしては、アルガトロバン（ノバスタン（登録商標））、ビバリルジン（アンジオマックス（登録商標））、レピルジン（レフルダン（登録商標））等があり、さらに欧州ではキシメラガトラン（エグザンタ（登録商標））等などがある（非特許文献６）。静脈内ＤＴＩの主な適応症はヘパリン起因性血小板減少症−血栓症であるが、待機的経皮的冠動脈インターベンション、冠動脈バイパス形成手術等の適応症が現在評価中である（非特許文献７及び非特許文献８）。キシメラガトランは深部静脈血栓症を予防するための最初の経口薬である。
【０００７】
しかし、解毒剤が利用できないこと及び信頼性の高い実験モニタリング（laboratory monitoring）がされていないことから、特定のＤＴＩの使用は限定されることがある（非特許文献９）。抗凝固剤を過少量投与すると制御不能なトロンビン生成及び／又は消費性凝固障害を生じることがあり、一方、抗凝固剤を過剰投与すると重篤の出血性素因が引き起こされる。凝血検査は、血液希釈、低体温及び外科的settingsにおけるその他の変動による影響を特に受けやすい（非特許文献１０））。心臓外科患者では、臓器機能不全を同時に有する患者には大量のＤＴＩが使用されるため、出血は重要な懸案事項となり得る。腎機能不全はヒルジンの代謝、及びそれより程度は低いがビバリルジンの代謝に影響を与え、心肺バイパス後の重篤の出血発症が報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２及び非特許文献１３）。
【０００８】
ＤＴＩ（特にヒルジン）に対する様々な解毒剤が過去に実験的に研究されており、例えば、ＤＦＰトロンビン又はベンゾイルトロンビンのようなガンマ−トロンビン標品（（非特許文献１４）；プロトロンビン中間体メイゾトロンビン（特許文献１及び非特許文献１５）などがある。発色基質であるクロモザイムＴＨ（Roche, Mannheim）も、インビボでの有効性についてのデータはないものの、インビトロではメラガトランの潜在的な解毒剤であると考えられている（非特許文献１６）。今日まで、このような標品は毒性が強過ぎるか又は液相で有効でないため、実用上の成功は得られていない。
【特許文献１】米国特許第５８１７３０９号明細書
【非特許文献１】Morel et al. (1987) Anesthesiology, 66:597-604
【非特許文献２】Weiss et al. (1989) New England Journal of Medicine, 320:886-892
【非特許文献３】Panos et al. (2003) European Journal of Cardio-Thoracic Surgery, 24:325-327
【非特許文献４】Kimmel et al. (2002) Anesthesia & Analgesia, 94:1402-1408
【非特許文献５】Welsby et al. (2005) Anesthesiology, 102:308-314
【非特許文献６】Di Nisio et al. (2005) New England Journal of Medicine, 353:1028-1040
【非特許文献７】Lincoff et al. (2004) JAMA, 292:696-703
【非特許文献８】Merry et al. (2004) Annals of Thoracic Surgery, 77:925-931
【非特許文献９】Warkentin et al. (2005) Thrombosis & Haemostasis, 94:958-964
【非特許文献１０】Siegel (2002) New England Journal of Medicine, 347:1030-1034
【非特許文献１１】Nowak et al. (1992) Thrombosis Research, 66:707-715
【非特許文献１２】Koster et al. (2000) Annals of Thoracic Surgery, 69:37-41
【非特許文献１３】Hein et al. (2005) Artificial Organs, 29:507-510
【非特許文献１４】Bruggener et al. (1989) Pharmazie, 44:648-9
【非特許文献１５】Nowak and Bucha (1995) Thromb. Res., 80:317-25
【非特許文献１６】Bodendiek et al. (2000) Hamostaseologie, 23:97-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の制限から、ヘパリン及びＤＴＩの両方を安全かつ効率的に逆転させる改善された方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
インビボ及びインビトロで抗凝固剤の効果を阻害する方法を提供する。特に、それを必要とする患者においてトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法を提供し、この方法は、トロンビン阻害剤に結合することができかつ凝固促進活性が低下しているバリアント型プロトロンビン又はトロンビンを治療有効量投与することを含む。本発明の方法に有用なバリアント型プロトロンビン又はトロンビンとしては、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、すなわち２１５位及び／又は２１７位のアミノ酸がアラニンであるそのバリアント等を挙げることができる。本発明の別の実施形態においては、追加的な活性薬剤、特に止血剤（例えば、活性化第VII因子又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤）と共にトロンビン変異体を投与することを含む方法が提供される。本発明の一実施形態において、本方法は、直接トロンビン阻害剤（特にアルガトロバン）が投与されている患者の治療に有用である。
【００１１】
また、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンの滴定アッセイを用いた、患者の血漿又は全血中の抗凝固剤濃度を定量する方法を提供する。特に、本発明は患者の血漿又は全血中におけるトロンビン阻害剤、特にＤＴＩの濃度を定量する方法を提供する。本方法は、トロンビン阻害剤を含有する血漿又は全血試料を、様々な濃度のトロンビン変異体に個別に添加することができる同体積の試験試料に分けて、各試験試料について凝血開始までの時間（onset to clotting time）を比較することを含む。凝血開始までの時間が最も短い試験試料を選択することで、対応するトロンビン変異体の濃度を用いて血漿又は全血試料中のトロンビン阻害剤濃度を評価することができる。これらの方法に使用するのに好ましいトロンビン変異体としてはＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ又はそのバリアント等を挙げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、インビボ又はインビトロにおける抗凝固剤の効果を阻害する方法を提供する。特に、本発明はそれを必要とする患者におけるトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法を提供し、この方法は、トロンビン阻害剤に結合することができかつ凝固促進活性が低下しているバリアント型プロトロンビン又はトロンビンを治療有効量投与することを含む。本発明の方法に有用なバリアント型プロトロンビン又はトロンビンとしては、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、すなわち２１５位及び／又は２１７位のアミノ酸がアラニンであるそのバリアント等を挙げることができる。また、追加的な活性薬剤、特に止血剤（例えば、活性化第VII因子又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤）と共にトロンビン変異体を投与することを含む方法を提供する。本発明の一実施形態においては、この方法は、直接トロンビン阻害剤、特にアルガトロバンを投与された患者の処置に有効である。
【００１３】
本明細書において「抗凝固剤」とは、インビトロ及び／又はインビボの血栓形成を予防する又は遅延させることができる任意の薬剤を意味する。本明細書において「凝固」とは、血液又は血漿を液相からゲル相へと変化させるフィブリンモノマーのポリマー化のプロセスを意味する。液体血液の凝固は、インビトロ、血管内、又は露出若しくは損傷した組織の表面において起こることもある。インビトロでの血液凝固はゲル化した血液を生じ、これは非凝固血液と本質的に同じ比率で細胞及びその他の血液成分を保持しており、フィブリノーゲン含量の減少とそれに対応するフィブリンの増加だけが異なる。「血餅」とは、液体血液におけるのと同じ比率の血液成分からなり、かつ全ての血液成分を含有する粘性ゲルを意図している。
【００１４】
本明細書において「抗凝固効果を阻害する」とは、抗凝固剤が血栓形成を予防するか又は遅らせる能力を低下させることを意味する。抗凝固剤の抗凝固効果が阻害されているかどうかを調べる方法は、血漿又は全血試料中の血塊の強度及び／又は血塊形成までの時間の長さを測定するアッセイの使用を含む。したがって、本明細書において、抗凝固剤の抗凝固効果を阻害するとは、抗凝固剤の効果を少なくとも部分的に逆転させること、例えば少なくとも５％の逆転、少なくとも１０％の逆転、少なくとも２０％の逆転、少なくとも３０％の逆転、少なくとも４０％の逆転、少なくとも５０％の逆転、少なくとも６０％の逆転、少なくとも７０％の逆転、少なくとも８０％の逆転、少なくとも９０％の逆転、及び最大で１００％を含む逆転を意味する。本明細書において「逆転」とは、血塊形成の開始までの時間の短縮又は血塊強度の増大を意味する。血塊形成の開始及び血塊強度を測定するアッセイは当該技術分野で周知であり、例えば活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））、Thrombinoscope（登録商標）システムを用いたトロンビン生成の連続モニタリング（例えば、後述の実験セクション参照。また、Banez et al. (1980) Am. J. Clin. Pathol.,74:569-574、van den Besselaar et al. (1990) hromb. Haemost.,63:16-23、Kawasaki et al. (2004) Anesthesia & Analgesia, 99:1440-1444及びHemker et al. (2003) Pathophysiology of Haemostasis & Thrombosis, 33:4-15参照。）がある。
【００１５】
本発明の一実施形態では、抗凝固剤の抗凝固効果を阻害するためのバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの使用方法が提供される。ヒトトロンビンは、約５７９成熟アミノ酸（潜在的な対立遺伝子変異（allelic variation）又はＮ末端微小不均一性を受ける）と約４３残基のプレ配列とからなる前駆体ポリペプチドであるプロトロンビンから生成される（Degen et al. (1993) Biochemistry 22:2087）。このプレ配列はプロトロンビンの発現及び分泌の間にタンパク質分解により（proteolytically）除去される。
【００１６】
プロトロンビンはチモーゲン（すなわち不活性なプロテアーゼ）であり、一連のタンパク質切断によって活性化される。切断は少なくとも３箇所で行われる。インビボにおいてプロトロンビンはＶａ因子、リン脂質及びカルシウムイオンの存在下で第Ｘａ因子によってＲ２７１とＴ２７２残基（Degen et al. (1993) Biochemistry 22:2087に記載の残基番号）の間で切断されてプロトロンビン２及びフラグメント１．２を生じる。プロトロンビンは同じシステムによってＲ３２０とＩ３２１残基の間でさらにタンパク質切断されてメイゾトロンビンを生じる。次いで、このメイゾトロンビンはＲ１５５とＳ１５６の間で自己分解してフラグメント１（１−１５５）及びメイゾトロンビンｄｅｓ１（プロトロンビンの１５６番目の残基からカルボキシ末端に延び、Ｒ３２３で切断されている、ジスルフィド結合したジペプチド）を生成する。最後に、プレトロンビン２のＲ３２０とＩ３２１の間のタンパク質切断によって、又はメイゾトロンビンｄｅｓ１のＲ２７１とＴ２７２の間のタンパク質切断によって、トロンビンが生成される。その後、トロンビンは自身をＴ２８４とＴ２８５の間で自己切断し、成熟Ａ鎖Ｎ末端を生成する。
【００１７】
本明細書において「トロンビン」とは、多機能性プロトロンビン由来酵素を意味する。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンにタンパク質切断することで凝固促進剤として作用する。またトロンビンは、凝血を持続させる凝固第Ｖ、VIII、XI及びXIII因子を活性化して血塊を持続させ、また、血小板トロンビン受容体ＰＡＲ１を活性化して血小板を活性化する。トロンビンの生成及び活性は多くの抗トロンビン機序により制限されている。トロンビンは、血管内皮細胞上の膜内在性タンパク質であるトロンボモジュリン（ＴＭ）に結合するとコンフォメーション変化して凝固促進活性を失い、プロテインＣ（ＰＣ）を活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に変換する活性を獲得する。ＡＰＣはセリンプロテアーゼであり、凝血又は凝固カスケードにおける２つの重要な補因子である活性化ＦＶ（ＦＶａ）及びＦVIII （ＦVIIIａ）を不活化することで、強力な抗凝固剤として作用する。また、ＡＰＣは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の主要な物理的阻害剤であるプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）を不活化し、通常の線溶を促進する。
【００１８】
本明細書において「凝固カスケード」とは、例えばManolin in Wilson et al. (eds): Harrison's Principle of Internal Medicine, 14th Ed. New York. McGraw-Mill, 1998, p. 341に記載されている、相互に交わる３つの酵素経路を指す。この文献の全体を参照により本願に組み込んだものとする。内因系凝固経路は第ＩＸａ因子を形成させ、これが第VIIIａ及び第Ｘ因子、リン脂質並びにＣａ２＋と共に第Ｘａ因子を生じさせる。外因系経路では、組織因子と第VII因子が組み合わさった後、第Ｘａ及びＩＸａ因子が生じる。共通系凝固経路は血液凝固第Ｖ、VIII、IX及びＸ因子と相互作用してプロトロンビンをトロンビン（第ＩＩａ因子）に切断し、トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに切断する。
【００１９】
Degen et al.（Degen et al. (1993) Biochemistry, 22:2087）によるＤＮＡに基づくシステムの他に、アミノ酸に番号を付ける２つの異なるシステムがトロンビンに使用されている。１つ目は、Bode et al.に記載されているキモトリプシノーゲンとのアラインメントに基づくものであり、プロテアーゼの分野で最も広く用いられている番号付けシステムである（Bode et al. (1989) EMBO. J., 8:3467-3475）。２つ目のSadlerによる番号付けスキームでは、トロンビンのＢ鎖はＩ１から始まりＥ２５９までであり、Ａ鎖はＴ１ａ〜Ｒ３６ａのように後ろに「ａ」を付して表される。例えば、Wu et al.はSadlerのスキームに基づいて番号を付けた様々なトロンビン変異体を開示している（Wu et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:6775-6779）。このWu et al.による変異体の残基番号とそれに対応するキモトリプシノーゲンの残基番号及びDegen et al.による残基番号をそれぞれ以下にこの順番で示す：Ｈ４３（５７、３６３）、Ｋ５２（６０ｆ、３７２）、Ｎ５３（６０ｇ、３７３）、Ｒ６２（６７、３８２）、Ｒ６８（７３、３８８）、Ｒ７０（７５、３９０）Ｄ９９（１０２、４１９）及びＳ２０５（１９５、５２５）。
【００２０】
本明細書を通して、トロンビン及びトロンビン変異体のアミノ酸残基への言及には、Bode et al.による番号付けシステムを用いている。しかし、ヒトトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（配列番号１）、ヒトトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ（配列番号２）、及びヒトトロンビン（配列番号３）に対応する配列表についてはsequentialな番号システムを用いた。したがって、Bode et al.のシステムを用いた本明細書に記載のトロンビン及びトロンビン変異体のアミノ酸番号２１５及び２１７は、配列番号１、２、及び３におけるシーケンシャル番号システムではトロンビン及びトロンビン変異体のアミノ酸番号２６３及び２６５に相当する。トロンビンのアミノ酸配列を、Bode et al.のシステムを用いたものと配列番号１、２及び３に用いたシーケンシャル番号システムを用いたものを並べて比較し、表１に示す。表１に記載のように、シーケンシャル番号システムではトロンビンＡ鎖はアミノ酸番号１から始まり、トロンビンＢ鎖はアミノ酸番号３７から始まる。
【００２１】
【表１】
【００２２】
本明細書において「バリアント」又は「バリアント型プロトロンビン又はトロンビン」とは、プロトロンビン又はトロンビンのアミノ酸配列に由来する修飾アミノ酸配列であって、トロンビンの残基番号２１５及び／又は２１７にアミノ酸置換を有するものを意味する。このようなバリアントをトロンビン変異体と呼ぶこともある。通常、本発明の方法に使用するためのこのようなバリアントは、プロトロンビン又はトロンビンのアミノ酸配列に由来しトロンビンの残基番号２１５及び／又は２１７にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する。この配列同一性は、本明細書に別途記載の配列アラインメントプログラム及びパラメータを用いて決定される。本発明の方法に使用するための、このような生物学的活性バリアントは、プロトロンビン又はトロンビンとアミノ酸残基が１〜１５個異なるだけでもよく、１〜１０個だけ、例えば６〜１０個、５、４、３、２又はたった１個異なるだけでもよい。
【００２３】
本明細書において「パーセント配列同一性」又は「パーセント配列類似性」とは、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264（Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877で改変）のアルゴリズムを用いて決定される２つの配列間の配列同一性の程度を意味する。このようなアルゴリズムはAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて、参照ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るものである。比較のためのギャップ入りアラインメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータが使用される（http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。その他のアルゴリズム、同等のプログラム、及びデフォルト設定も好適である。「同等のプログラム」とは、目的の任意の２つの配列について、GAP Version 10により作成される対応するアラインメントと比較したときに同じアミノ酸残基マッチ及び同じパーセント配列同一性を有するアラインメントを作成する任意の比較プログラムを意図する。
【００２４】
本発明の方法に使用されるバリアント型プロトロンビン又はトロンビンは生物学的活性を有する。すなわち、本明細書に別途記載しているように、抗凝固剤の抗凝固効果を阻害する望ましい生物学的活性を有する。さらに、このようなバリアント型プロトロンビン又はトロンビンはトロンビン阻害剤（特にＤＴＩ）などの抗凝固剤に結合する特性を呈し、一般的にトロンビンに比べて低下した凝固促進活性を有する。
【００２５】
トロンビン阻害剤（ＤＴＩを含む）などの抗凝固剤へのバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの結合を測定する結合アッセイは当該技術分野で周知である（例えば後述の実験セクション、並びにKelly et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6040-6044、Hosokawa et al. (2001) Biochemical Journal. 354:309-313、Schmitz et al. (1991) Europ. J. Biochem., 195:251-256及びOkamoto et al. (1981) Biochem. & Biophys. Res. Comm., 101:440-446を参照）。本発明の一実施形態においては、バリアント型プロトロンビン及びトロンビンは、ＤＴＩとの結合に利用可能な活性（触媒）部位及びエキソサイトＩの両方を有する。トロンビンの活性部位間隙には２つの突出した挿入ループ（すなわち、６０−ループ及び１４８−ループ）が隣接し、これらのループは基質及び阻害剤と活性部位との相互作用を部分的に制御している（Bode et al. (1989) EMBO J., 8:3467-3475、Le Bonniec et al. (1993) J. Biol. Chem., 268:19055-19061及びLe Bonniec et al. (1992) J. Biol. Chem., 267:19341-19348）。エキソサイトＩ及びIIはトロンビン表面のほぼ反対に位置する電気的陽性部位であり、複数の基質と結合することが知られている（Stubbs and Bode (1993) Thromb. Res., 69:1-58及びBode et al. (1992) Protein Sci., 1:26-471）。例えば、エキソサイトＩはフィブリノーゲン並びにフィブリンＩ及びIIに結合することが知られており（例えばNaski et al. (1990) J. Biol. Chem., 265:13484-13489及びNaski and Shafer (1991) J. Biol. Chem., 266:13003-13010参照）、一方エキソサイトIIはヘパリン及びその他のグリコサミノグリカンに結合することが知られている（Bode et al. (1992) Protein Sci., 1:26-471及びGan et al. (1994) J. Biol. Chem., 269:1301-1305）。
【００２６】
本明細書において「凝固促進剤」とは、可溶性の循環フィブリノーゲンを不溶性の架橋されたフィブリン網に変化させて血液凝固プロセスを開始又は加速させる薬剤を意味する。凝固促進剤の例としては、フィブリノーゲンをフィブリンに切断することができるタンパク質分解活性を有する、天然トロンビン又はそのバリアントを挙げることができる。インビトロにおいて、凝固促進剤は最終的に血餅を生じさせる。インビボにおいて、凝固促進剤は最終的に病的な状態で血栓を生じさせる。本明細書において「血栓」とは、動物又はヒトの病的状態から生じる、血液成分から形成される血管内の凝固塊を意味する。通常、血栓の構成要素の比率は、循環血液の同一成分の組成比とは異なる。血栓はフィブリノーゲンのフィブリンへの切断、血小板の活性化及び架橋されたフィブリン網への血小板の粘着を含む動的プロセス（dynamic process）によってインビボで生じる。
【００２７】
本明細書において低下した凝固促進活性は、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンに対して、そのＰＡ／ＦＣ比率（「相対抗凝固力価（relative anticoagulant potency）」又は「ＲＡＰ」とも呼ばれる）を計算することで決定することができる（例えばDi Cera (1998) Trends Cardiovasc. Med., 8:340-350及びDang et al. (1997) Nat. Biotechnol., 15:146-149参照）。本明細書において「ＰＡ／ＦＣ比率」とは、トロンビンと比較したときに、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンに残っている野生型プロテインＣ活性化（ＰＡ）活性のパーセントとバリアント型プロトロンビン又はトロンビンに残っている野生型フィブリノーゲン凝固（ＦＣ）活性のパーセントとの比率を意味する。１．０より大きいＰＡ／ＦＣ値は、プロテインＣ活性化により生じる残留抗凝固活性と比較して、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンの凝固促進的なフィブリノーゲン切断活性が低下していることを示す。
【００２８】
本発明の一実施形態においては、方法は、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（配列番号１）及びＷ２１５Ａ（配列番号２）又はこれらのバリアント（米国特許第６７０６５１２号参照。その全体を本願に組み込んだものとする）などのバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの使用を含む。これらのトロンビン変異体は、インビトロ及びインビボにおける抗凝固剤／抗血栓剤として以前から研究されている。下記の実験セクションに詳述するように、本発明は、これらのトロンビン変異体が上述した抗凝固剤の抗凝固効果を阻害する生物学的活性を示すという発見に関する。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びＷ２１５Ａは共に、トロンビンと比較して実質的に低下したdフィブリノーゲン切断活性を示し、一方でトロンボモジュリン存在下におけるプロテインＣ活性化能は保存されている。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びＷ２１５Ａは、単体の薬剤として静脈内投与されると、内皮トロンボモジュリンと協調して血漿プロテインＣを活性化し、抗凝固剤として機能する。しかし、これらのトロンビン変異体をＤＴＩなどのトロンビン阻害剤存在下で投与すると、トロンビン変異体はトロンビン阻害剤に直接結合する。この結合により、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びＷ２１５Ａに本来存在する（ＡＰＣ活性化を介した）抗凝固剤としての活性がブロックされる。その結果、内因的に生成された天然トロンビンでＤＴＩに結合しているものの比率を減少させ、血小板及びフィブリノーゲンが活性化される（図１参照）。
【００２９】
本発明の方法に使用するためのトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びＷ２１５Ａのバリアントの例としては、配列番号１に示されるＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのアミノ酸配列及び配列番号２に示されるＷ２１５Ａのアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は２の２６３及び／又は２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するトロンビン変異体を挙げることができる。上記の通り、このようなバリアントは生物学的活性を有し（すなわち、これらは抗凝固剤の抗凝固効果を阻害する）、トロンビン阻害剤（特にＤＴＩ）などの抗凝固剤に結合する特性を示し、通常、トロンビンと比較して低下した凝固促進活性を有する。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、方法は、本明細書に記載のバリアント型プロトロンビン又はトロンビンのいずれかのフラグメントが、生物学的活性を有し（すなわち、これらは抗凝固剤の抗凝固効果を阻害する）、トロンビン阻害剤（特にＤＴＩ）などの抗凝固剤に結合する特性を示し、通常、トロンビンと比較してreduced凝固促進活性を有する限り、そのようなフラグメントの使用を含む。「フラグメント」とは、アミノ酸配列の一部を意図し、通常、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、又は２５０個の連続したアミノ酸を含むか、又は本明細書に記載のバリアント型プロトロンビン又はトロンビンに存在するアミノ酸の総数までのアミノ酸を含む。
【００３１】
本発明の一実施形態においては、方法は抗凝固剤の抗凝固効果を阻害することを含む。抗凝固剤の例はトロンビン阻害剤であり、間接トロンビン阻害剤及びＤＴＩの両方が含まれる。間接トロンビン阻害剤の例としては、ヘパリン、クマリン、デルマタン、及びトロンボモジュリンを挙げることができる。ＤＴＩの例としては、アルガトロバン又はその誘導体若しくはアナログ、ヒルジン又はその組換え若しくは合成誘導体若しくはアナログ、トリペプチドＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの誘導体、クロロメチルケトン誘導体、キシメラガトラン又はその誘導体、代謝産物、若しくはアナログ、トリアビン（Triabin）などのアニオン結合エキソサイト阻害剤、及びＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーを挙げることができる（例えばNoeske-Jungblut et al. (1995) J. Biol. Chem., 270:28629-28634及びJeter et al. (2004) FEBS Letters, 568:10-14参照）。ヒルジンの組換え又は合成の、誘導体又はアナログ（「ヒルログ」）は、特に限定されないが、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン等を挙げることができる。キシメラガトランの代謝産物は特に限定されないが、メラガトラン等を挙げることができる。
【００３２】
特定の実施形態においては、ＤＴＩはアルガトロバンである。アルガトロバンは合成抗凝固剤であって、その効果はトロンビンの触媒ドメイン（活性部位とも呼ばれる）との化学的複合体の形成に基づいている。アルガトロバンが結合するとトロンビンの触媒作用が消失し、それにより血小板の活性化及びフィブリン形成が阻害される。アルガトロバンはアルギニン由来の小さなトロンビン阻害剤であり、その分子量は５２６．６６である。トロンビンへの強い親和性（Ｋｉ値：０．０４μｍｏｌ／ｌ）及び直接的な作用機序から、ヘパリン起因性血小板減少症患者への抗凝固などに臨床応用されている。しかしながら、その有用な効果にも関わらず、アルガトロバンには利用可能な解毒剤がないため、臨床における使用は一部制限されている。そこで、本発明の好ましい実施形態においては、それを必要とする患者にバリアント型プロトロンビン又はトロンビン、特にトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、Ｗ２１５Ａ、及びそのバリアントを投与することを含む、アルガトロバンの抗凝固効果を阻害する方法を提供する。
【００３３】
本発明の別の実施形態においては、ＤＴＩは合成トロンビン阻害剤キシメラガトランである。キシメラガトランは肝臓でその活性型であるメラガトランに代謝される。アルガトロバン同様、メラガトランも触媒部位指向型のトロンビン阻害剤であり、（アルガトロバン、ビバリルジン、及び組換えヒルジンなど従来の静注薬物と対照的に）最初の経口剤型のトロンビン阻害剤である。そこで、本発明の好ましい実施形態においては、それを必要とする患者にバリアント型プロトロンビン又はトロンビン、特にトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ、Ｗ２１５Ａ、及びそのバリアントを投与することを含む、キシメラガトラン及び／又はその代謝産物メラガトランの抗凝固効果を阻害する方法を提供する。
【００３４】
上述のように本発明は、それを必要とする患者においてトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法であって、患者に本明細書に記載のトロンビン変異体を治療有効量投与することを含む方法を提供する。「治療有効量」とは、本明細書に別途定義しているように抗凝固剤の抗凝固効果を阻害するのに十分なトロンビン変異体の量を意図する（すなわち、抗凝固剤の効果を少なくとも一部逆転（〜１００％の逆転まで含む）させるのに十分な量）。
【００３５】
本明細書において「患者」とは任意の動物、好ましくはヒトを指し、家畜、農業用動物、又は希少動物を含む。特定の実施形態においてはヒトは成人（１８歳以上）であり、別の実施形態においてはヒトは子供（１８歳未満）である。子供は新生児, 乳児, 幼児、思春期前、又は思秋期後の子供であってもよく、年齢で言うとほぼ出生時、１ヶ月〜約２歳、約１歳〜５歳、約４歳〜約９歳、約８歳〜約１４歳、又は約１３歳〜約１８歳の子供であってもよい。さらに、ヒトは約５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５歳であってもよい。
【００３６】
本発明の方法に使用するためのトロンビン変異体は、薬学的に有用な組成物（例えば薬学的に許容される輸送担体との混合物）の周知の調製方法に従って処方することができる。好適な担体及びその処方については、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A. (ed.), Mack, Easton PA (1980)に記載されている。効果的投与に適した薬学的に許容される組成物を調製するために、そのような組成物は、有効量のトロンビン変異体を単独又は好適な量の輸送担体と一緒に含んでもよい。
【００３７】
本明細書において「薬学的に許容される」とは、生物学的に活性でありながら、それを受容するヒト又は動物の生理にその生存能力に損傷を与える程のダメージを与えないトロンビン変異体又はその他の治療薬剤若しくは治療化合物を意味する。
【００３８】
本発明の方法に使用するために、本明細書に記載のトロンビン変異体は、それ自体を投与してもよく、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。薬として使用する場合、トロンビン変異体の塩は薬学的及び薬理学的に許容されるものであるべきであるが、薬学的に許容されない塩も、遊離活性化合物又はその薬学的に許容される塩を調製するために適宜使用することができ、本発明の範囲から排除されるものではない。このような薬理学的及び薬学的に許容される塩は、本明細書に記載しているように、文献に詳述されている標準的な方法を用いて、本明細書に記載のトロンビン変異体と有機酸又は無機酸との反応により調製することができる。薬学的に許容される塩の例としては、トスグレート（tosglate）、メテンスルホネート（methenesulfurate）アセテート、シトレート、マロネート、タータレート、スクシネート、ベンゾエート等の生理学的に許容されるアニオンから形成される有機酸塩を挙げることができる。無機酸塩は、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩等から形成することができる。また、薬学的に許容される塩はアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として調製することができる（例えばカルボン酸のナトリウム塩、カリウム塩、又はカルシウム塩）。
【００３９】
医薬組成物は、好適な担体、希釈剤、又は滅菌水、生理食塩水、グルコース等の賦形剤との混合物として投与してもよい。組成物は望ましい投与経路及び製剤に応じて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化剤又は粘度増強剤、保存剤、着香料、着色料などの補助剤を含有してもよい
【００４０】
トロンビン変異体を含む医薬組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、種、及び状態、並びに投与経路などの要素を考慮して、医学又は獣医学分野の当業者に周知の用量及び技術で投与することができる。投与経路は、安全かつ治療に有効な投与量で本発明の組成物を動物又はヒトの血液に送達する任意の経路であってよい。投与形態は特に制限されないが、局所、腸内、非経口等の投与経路を挙げることができる。腸内経路の例としては、経口投与及び胃腸投与を挙げることができる。非経口投与の例としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、経粘膜投与等を挙げることができる。その他の投与経路としては、硬膜外投与、鞘内投与等を挙げることができる。
【００４１】
投与に有効な用量及び経路は、化合物の治療域及び性質によって決定され、また、患者の年齢、体重、及び状態などの周知の要素、並びにＬＤ５０及びその他の公知のスクリーニング手法によっても決定され、これらは周知であり、過度な実験を要しない。
【００４２】
本明細書において「用量」とは、動物又はヒトに投与されるバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの量を意味する。受容者への治療薬剤の送達は、ボーラス又は持続性（連続的又は断続的）の送達であってよい。ある用量の送達が一定期間（数分〜数日、数週間、数ヶ月であってもよく、数年の長期間にわたって投与されてもよい）にわたって持続される場合、用量は治療薬剤の重量／患者のｋｇ体重／送達単位時間として表すことができる。
【００４３】
本発明の一実施形態においては、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するために、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンを、それを必要とする患者に約０．１ｎｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｎｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約１ｍｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量でボーラス投与する。あるいは、治療有効量を得るために投与するバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの量は約０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ体重又はそれ以上である。本発明の一態様では、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンはＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ、又はそのバリアントであり、非経口投与、好ましくは静脈内投与される。
【００４４】
本発明の別の実施形態においては、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するために、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンを、それを必要とする患者に約０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１１μｇ、１２μｇ、１３μｇ、１４μｇ、１５μｇ、１６μｇ、１７μｇ、１８μｇ、１９μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ体重／分、又はそれ以上の投与量で持続投与する。本発明の一態様においては、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンはＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ、又はそのバリアントであり、非経口投与、好ましくは静脈内投与される。
【００４５】
本発明のさらに別の実施形態においては、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するために、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンを、それを必要とする患者に０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１１μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１３μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ、１９μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、若しくは１００μｇ／ｍｌ又はそれ以上の血漿濃度を得るのに十分な投与量で投与する。本発明の一態様においては、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンはＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ、又はそのバリアントであり、非経口投与、好ましくは静脈内投与される。
【００４６】
本発明の別の実施形態においては、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンを主要な活性薬剤として、追加的な活性薬剤と一緒にそれを必要とする患者に投与する、トロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害するための併用療法が提供される。このような併用療法の実施は、異なる活性薬剤を単一組成物で投与するか、異なる活性薬剤を別々の組成物で同時に投与するか、又は異なる活性薬剤を順次投与することで行ってもよい。この併用療法には、バリアント型プロトロンビン又はトロンビンが既に投与されている患者においてその患者の薬物投与計画に別の活性薬剤が追加される状況も含まれ、また、別の人間（例えば、医師又は医療専門家）によってその組合せの個別の成分が患者に投与される場合も含まれる。
【００４７】
この追加的な活性薬剤は、常にではないが一般的に、トロンビン阻害剤の抗凝固効果の阻害に有効な薬剤及び／又はバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの効果を亢進するか増強する薬剤である。好ましい実施形態においては、追加的な活性薬剤は止血剤、すなわち止血を促進する薬剤である。
【００４８】
本明細書において「止血」とは、血管系傷害後の血液循環の整合性を維持する協調的機序を意味する。血管に傷害のない正常な循環では、血小板は活性化されていなく、遊離して循環している。血管の傷害は内皮細胞下組織を露出させ、血小板がそこに粘着することができる。粘着血小板は他の循環血小板を誘引し、予備的な栓を形成する。この栓は毛細管又はその他の小血管の漏出を閉じるのに特に有用である。これらのイベントを一次止血という。通常、一次止血のすぐ後に、連鎖した酵素反応のカスケードを含む二次止血が続き、これにより血漿凝固が起こり、血小板による一次の栓（primary platelet plug）が強化される。したがって、止血剤とは、血管壁の収縮、形成された血液要素の粘着及び凝集、血液又は血漿の凝固などの止血に関わる生理的プロセスのいずれかを促進又は亢進することで出血を遅らせる又は止める任意の薬剤である。
【００４９】
本発明の併用療法での使用に特に好ましい止血剤の例としては、活性化第VII因子 (ＦVIIａ)又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤（ＡＰＣＣ）を挙げることができる。ＦＶＩＩａ及びＡＰＣＣはどちらも、インヒビターが出現した血友病患者の出血を処置するための止血剤として開発された（Scharrer (1999) Haemophilia, 5:253-259；Shapiro et al. (1998) Thromb. Haemost., 80:773-778、Lusher et al. (1980) N. Engl. J. Med., 303:421-425、Sjamsoedin et al. (1981) N. Engl. J. Med., 305:717-21及びNegrier et al. (1997) Thromb. Haemost., 77:1113-1119）。ＡＰＣＣの主要な活性成分はプロトロンビンであり、止血及び血栓成長の両方に寄与する（Akhavan et al. (2000) Thromb. Haemost., 84:989-997及びXi et al. (1989) Thromb. Haemost., 62:788-791）。一方、ＦVIIａの血漿濃度の上昇は、ＴＦ／ＦVIIａ複合体が第IX及び第Ｘ因子を活性化する組織因子（ＴＦ）依存的経路を介して、主にトロンビン生成を増加させると考えられる（Hoffman and Monroe (2001) Thromb. Haemost., 85:958-965）。
【００５０】
また、本発明は、バリアント型プロトロンビン又はトロンビン滴定アッセイを用いた、患者の血漿又は全血中の抗凝固剤濃度を定量する方法を提供する。特に、本発明は患者の血漿又は全血中のトロンビン阻害剤、特にＤＴＩの濃度を定量する方法を提供する。下記の実験セクションに詳述するように、このような方法は全血又は血漿試料における血塊形成の開始と試料中に存在するトロンビン阻害剤及びバリアント型プロトロンビン又はトロンビンの相対濃度との関係に基づいている。凝血開始までの時間は、トロンビン阻害剤とバリアント型プロトロンビン又はトロンビンのモル比が１．０に近いとき、最も短いと予想される。バリアント型プロトロンビン又はトロンビンが過剰の場合、これらのトロンビン変異体はトロンボモジュリンに結合してプロテインＣを活性化し、凝血開始までの時間が長くなると予想される。
【００５１】
一実施形態において、抗凝固剤濃度を定量する方法は、トロンビン阻害剤、特にＤＴＩの濃度の定量を含む。この方法は、ａ）患者から血漿又は全血試料を採取するステップ；ｂ）血漿又は全血試料にトロンボモジュリンを添加するステップ；ｃ）一連の試験チャンバーに、様々な濃度に上昇させた（increasing concentrations of）トロンビン変異体をロードするステップ；ｄ）各試験チャンバーに血漿又は全血試料を等量添加するステップ；ｅ）各試験チャンバーにおいて血漿又は全血試料の凝血開始までの時間を測定するステップ；ｆ）凝血開始までの時間が最も短い試験チャンバーを選択するステップ；及びｇ）血漿又は血液中の直接トロンビン阻害剤濃度が、選択しなかった試験チャンバーにおけるトロンビン変異体濃度と比較して、選択した試験チャンバーにおけるトロンビン変異体濃度に最も近い濃度であると評価するステップ、を含む。これらの方法に使用するトロンビン変異体としては、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ若しくはＷ２１５Ａ、又はそのバリアントが好ましい。
【００５２】
本発明に基づく抗凝固剤濃度の定量方法に関して、凝血開始までの時間は、血塊形成の開始を測定するための任意の標準的な試験を用いて測定することができ、そのような試験は当該技術分野で周知であり、例えば、上述のＡＰＴＴ又は活性化凝血時間（ＡＣＴ；Hattersley (1966) J. Am. Med. Assoc., 196:436-440参照）がある。
【００５３】
本明細書において「試験チャンバー」とは、血塊形成の開始について血漿又は全血試料を試験することができる任意の装置又はデバイスを意味し、例えばマルチウェル・ディッシュ、フラスコ、ボトル、スライド等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
以上、本発明について一般的に記述してきたが、本明細書に記載の特定の具体例を参照することでさらによく理解されるであろう。これらの具体例は説明のためだけのものであり、特に明示しない限り、本発明を限定することを意図するものではない。
【００５５】
実験
トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、インビトロ及びインビボにおける抗凝固剤／抗血栓剤としてこれまで研究されてきた。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、触媒ドメインへの二重変異により、血小板活性化及びフィブリノーゲン切断が大きく低下しているが、トロンボモジュリン存在下でプロテインＣを活性化する能力は保持したままである。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ＤＴＩへの親和性を保持しているため、ＤＴＩに対する逆転薬剤として使用し得るであろうと考えられていた。特に、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、間接又は直接トロンビン阻害剤に添加されると、最初にこれらのトロンビン阻害剤と複合体を形成し、トロンビン阻害剤と結合した、内生的に生成した天然トロンビンの程度を低下させ、血小板及びフィブリノーゲンが活性化されると考えられていた（例えば図２参照）。
【００５６】
ビバリルジン（１〜１０μｇ／ｍｌ）、レピルジン（０．１〜５μｇ／ｍｌ）、アルガトロバン（０．５〜１．０μｇ／ｍｌ）、又は未分画ヘパリン（０．２〜０．５Ｕ／ｍｌ）で前処理した血漿及び全血試料中のＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果を評価した。ＤＴＩ又はヘパリンの中和を、本明細書に別途記載している活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））、及びトロンビン生成の持続モニタリング（Trombinoscope（登録商標））を用いて評価した。ヘパリンについては、比較のための標準として硫酸プロタミンを用いた。
【実施例１】
【００５７】
トロンビン阻害剤の効果を逆転するためのトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ/E217Aの使用
材料及び方法
材料
組換えトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを、以前に記述の通りに作製した（Cantwell and Di Cera (2000) Journal of Biological Chemistry, 275: 39827-39830）。可溶性トロンボモジュリンはAsahi Kasei Pharma（Oh-hito, Japan）から贈呈された。組織因子（ＴＦ）はDade-Behring（Innovin（登録商標）、Dade Behring, Marburg, Germany）から購入した。試験した直接トロンビン阻害剤には、アルガトロバン （GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC）、ビバリルジン（アンジオマックス（登録商標）、Medicines Company, Parsippany, NJ）、及びレピルジン（レフルダン（登録商標）、Berlex, Montville, NJ）が含まれる。また、アンチトロンビン依存性間接阻害剤であるヘパリンナトリウム（Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ）についても、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを評価した。ヘパリンの逆転についての標準として硫酸プロタミン（Pharmaceutical Partners, East Schaumburg, IL）を用いた。
【００５８】
トロンビン生成アッセイのための蛍光基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ ＨＣｌ、分子量６１６．０７）はBachem（Switzerland）から入手した。ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン-Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ＣａＣｌ２、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及びＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）はSigma （Sigma, St Louis, MO）から入手した。組織因子を滅菌水１０ｍｌに溶かし、さらに有効な（working）ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で希釈した（１：７５）。１．７５ｍｌのＦｌｕｃａ緩衝ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３５、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）をガラス試験管中の０．２ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ２に添加し、混合した後、３７℃で数分間温めた。使用直前にＤＭＳＯ中の１００ｍＭの蛍光基質をＨＥＰＥＳ−ＣａＣｌ２溶液に５０μｌ添加し、混合して溶解させた。これにより、この緩衝液には２．５ｍＭの基質及び１００ｍＭのＣａＣｌ２が含まれる。
【００５９】
血漿採取のため、機関からの許可及び２週間以内にどのような投薬も受けていない６人のボランティアから書面による説明及び同意を得た後、全血試料（５ｍｌ、３．２％クエン酸三ナトリウム中）を得た。ＡＰＴＴ及びトロンビン生成実験のために、血液を３０００×ｇ、２０分間遠心分離し、乏血小板血漿（ＰＰＰ）を得た。ＰＰＰはすぐに使用したか、又は−２０℃で最大で２日まで保存した。ＴＥＧ（登録商標）を用いた測定には、クエン酸中の全血を、採取から５分以内にカルシウムを再添加（recalcification）して使用した。全ての実験において、組換えトロンビン変異体の終濃度は５μｇ／ｍｌとした。
【００６０】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定
また、トロンビン変異体の効果は、PTT Automate（登録商標）とSTart（登録商標）４機器（Diagnostica Stago, Asnieres, France）を用いて従来のＡＰＴＴアッセイでも評価した。ＡＰＴＴの測定（秒単位）は、乏血小板血漿を使い捨てキュベット（Diagnostica Stago, Parsippany, NJ）に５０マイクロリットルずつ取り、ＡＰＴＴ試薬を加えて３７℃でプレインキュベートした後、試料の測定を繰り返し行った。治療濃度のＤＴＩ（０．５〜１μｇ／ｍｌのアルガトロバン；０．１〜１μｇ／ｍｌのレピルジン；１〜１０μｇ／ｍｌのビバリルジン）、及びヘパリン（０．２〜０．５Ｕ／ｍｌ））を用いて、試料の前処理を行った。トロンビン変異体を添加した後（終濃度５μｇ／ｍｌ）、ＤＴＩ処置血漿のＡＰＴＴに対するトロンビン変異体の効果を評価した。いくつかの実験で、比較のために、触媒部位をブロックされたトロンビン（クロロメチルケトン（ＦＰＲｃｋ）で飽和されたトロンビン）を１００μｇ／ｍｌで使用した。
【００６１】
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））
トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標）, Haemoscope, Niles, IL）を用いて血塊形成の粘弾性測定を評価した。全血試料（１ｍｌ、３．２％クエン酸三ナトリウム中）にＤＴＩ（ビバリルジン５μｇ／ｍｌ、レピルジン１μｇ／ｍｌ、又はアルガトロバン０．５μｇ／ｍｌ）又は０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンのいずれかを添加（spike）した。ＴＥＧ（登録商標）の測定用に、１０μｌの０．４Ｍ ＣａＣｌ２を含む使い捨てカップに試料を３６０μｌずつ取った。各試料にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加（終濃度５μｇ／ｍｌ）した後、ＴＥＧ（登録商標）の変動に対するこのトロンビン変異体の効果を評価した。ＴＥＧ（登録商標）の変動、血塊形成の開始を表す反応時間（分）、及び血塊の強度を表す最大振幅（ｍｍ）を異なる群で比較した（Kawasaki et al. (2004) Anesthesia & Analgesia, 99:1440-1444）。
【００６２】
Thrombinoscope（登録商標）によるトロンビン生成のモニタリング
トロンビン生成のこの複雑な制御を評価するために、Thrombinoscope（登録商標）システムを使用した。このシステムは、多血小板血漿又は乏血小板血漿中におけるトロンビン生成のタイムコースを自動で収集することができる（Hemker et al. (2003) Pathophysiology of Haemostasis & Thrombosis, 33:4-15）。市販の蛍光基質（Ｚ−ＧｌｙＧｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）を用いて内生トロンビンポテンシャルを自動評価する方法は別に詳述されている（Hemker et al. (2003) Pathophysiology of Haemostasis & Thrombosis, 33:4-15）。簡潔には、トロンビン生成実験用に、８０μｌのＰＰＰ及び２０μｌのトロンビン生成トリガーを９６ウェルのマイクロタイタープレート（Microfluor2, Labsystems, Finland）のウェルに添加し、さらに２０μｌの基質−塩化カルシウム緩衝液を添加する。 反応は、３９０ｎｍ（励起波長）及び４６０ｎｍ（発光波長）にセットしたマイクロプレート蛍光光度計（Fluoroskan Ascent, Labsystems, Finland）を用いてモニターする。反応の進行の表示とトロンビン生成のパラメータ（ピークトロンビンレベル）の計算とを行う市販のThrombinoscopeソフトウェア（Synapse B.V）によって、発光は２０秒毎に９０分間記録され、得られたデータは自動的に処理される。トロンビン変異体の効果を、トロンビン変異体（５μｇ／ｍｌ）存在下又は非存在下で治療濃度のＤＴＩ（アルガトロバン０．５〜１μｇ／ｍｌ；レピルジン０．１〜５μｇ／ｍｌ；ビバリルジン１〜１０μｇ／ｍｌ）で前処理したＰＰＰで試験した。さらに、ヘパリン（０．２又は０．５Ｕ／ｍｌ）も評価した。適当な濃度のプロタミンによるヘパリンの逆転を比較のために用いた（ヘパリン１００ユニット（１ｍｇ）毎にプロタミン１ｍｇ）。プロテインＣ活性化に対するトロンビン変異体の効果を評価するために（Regnault et al. (2003) Thrombosis and Haemostasis, 89:208-212）、可溶性トロンボモジュリン（終濃度０．７５μｇ／ｍｌ）を、トロンビン変異体を含有する試料血漿に添加した。
【００６３】
データ分析
各実験は少なくとも３人の異なる人間の試料で行った。トロンビン生成のトレース（Thrombinoscope（登録商標））及びＴＥＧ（登録商標）は、３回行った測定のうち、代表的１セットを示す。統計解析には、対応のあるｔ検定（両側検定）を用いて、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの存在下及び非存在下で測定された変動差を決定した
【００６４】
結果
ＡＰＴＴに対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果
全てのＤＴＩ及びヘパリンは、濃度依存的にＡＰＴＴを延長させる（図３、パネルＡ〜Ｄ）。血漿にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると、ＡＰＴＴ値は正常範囲内にシフトした。活性部位をブロックされたトロンビン（ＦＰＲ−ＴＨ）は、ＤＴＩ又はヘパリンで延長されたＡＰＴＴに対して影響を与えなかった。
【００６５】
ＴＥＧ（登録商標）に対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果
実験に用いた全ての試薬で、反応時間はコントロール値（５．９分）の少なくとも２倍延長された（図４Ａ）。ヘパリンは４５分の期間中に実質的に血塊形成を消失させた。振幅（ｍｍ）で表される血塊の強度は、レピルジン及びビバリルジンではほとんど影響されなかった（minimally affected）が、アルガトロバンで減少した（図４Ｂ）。全てのＤＴＩで、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（５μｇ／ｍｌ）を添加すると、反応時間及び振幅変動の両方が正常に逆転された（図４Ａ、５Ａ）。ヘパリンでは、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａによって反応時間が顕著に短縮された（４５分から１４分、ｐ＜０．０１）が、振幅は硫酸プロタミンと比較して中程度（不完全）の回復を示した（図５Ｂ）。可溶性トロンボモジュリン（０．７５μｇ／ｍｌ）存在下において、５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは開始を遅らせ、血塊強度を低下させた（図５Ａ）。
【００６６】
トロンビン生成に対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果
血漿にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（５μｇ／ｍｌ）を添加すると、トロンビン生成のピークが減少し、この効果は可溶性トロンボモジュリン（０．７５μｇ／ｍｌ）の添加により実質的に増強された（図６Ａ）。ビバリルジン及びレピルジンはトロンビン生成の開始を遅らせたが、ピークレベルは減少させなかった（それぞれ図６Ｂ及び６Ｃ）。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、延長されたトロンビン生成の潜伏期間を短縮する効果を有していた。 血漿にアルガトロバンを添加すると、投与量依存的に、発症が延長し、トロンビン生成のピークが減少した（図６Ｄ）。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると、開始は短縮されたが、ピークトロンビン生成は減少しなかった。しかし、０．５及び１μｇ／ｍｌのアルガトロバンでは、ピークトロンビンレベルが中程度の量（＞１００ｎＭ）になることが観察された（図６Ｄ）。ヘパリン（０．２Ｕ／ｍｌ）存在下ではトロンビン生成は鈍化し、５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ又は２μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを添加すると開始が早まり、硫酸プロタミンだけがトロンビン形成のピークレベルを逆転した。
【００６７】
要約
実験に用いた全てのアンチトロンビン薬剤が濃度依存的にＡＰＴＴを延長させ（４６．６〜１８０秒ｖｓコントロール３６秒）、この延長は５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａで逆転された。ＤＴＩ及びヘパリンは血塊形成の開始を遅らせ（＞１４分ｖｓコントロール５．９分）、ＴＥＧ（登録商標）において血塊強度を減少させた。トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ヘパリン及びＤＴＩによって延長されたＡＰＴＴ、トロンビン生成、及びＴＥＧ（登録商標）の遅延時間を短縮させた。トロンビンの生成量及びその後の血塊形成は、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａによって、ＤＴＩで抗凝固処置した試料においては完全に回復し、ヘパリン処置試料では部分的に回復した。５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ＤＴＩ存在下ではＴＥＧ（登録商標）変動を効果的に逆転したが、ヘパリンに対してはプロタミンと比較して中程度の効果だった。トロンビン生成アッセイでは、５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ビバリルジン及びレピルジンの両方で遅延及びピークトロンビンを回復させた。アルガトロバンに大して、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは遅延を顕著に短縮させたが、ピークトロンビンは減少させなかった。硫酸プロタミンの方がヘパリンの中和に効果的であったが、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの方が遅延は短かった。これらの結果は、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７ＡがＤＴＩを逆転するための薬剤として治療に使用可能であり、ヘパリンによる抗凝固を逆転するための二次治療としても潜在的に使用可能であることを示している。
【００６８】
トロンビンは、止血のための血小板及びフィブリノーゲンの活性化並びに抗凝固因子であるプロテインＣの活性化において重要な生理的役割を果たしている。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは内皮トロンボモジュリン存在下でプロテインＣを活性化し、血小板ＰＡＲ−１、フィブリノーゲン及びアンチトロンビンに対する触媒活性が顕著低下している新規のトロンビン変異体である（Cantwell and Di Cera (2000) Journal of Biological Chemistry, 275:39827-39830及びGruber et al. (2002) Journal of Biological Chemistry, 277:27581-27584）。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、単体薬剤として静脈内投与されると、内皮トロンボモジュリンと協調して血漿プロテインＣを活性化する抗凝固剤として機能する。しかし、ＤＴＩ存在下で投与されると、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａはトロンビン阻害剤に直接結合し、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの本来の抗凝固活性（ＡＰＣ活性化）がＤＴＩによってブロックされる（Linder et al. (1999) Thrombosis Research, 95:117-125）。その結果、損傷部位において、ＤＴＩに結合した、内生的に生成した天然トロンビンの比率が低下し、血小板及びフィブリノーゲンが活性化される（図２参照）。
【００６９】
Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａに関する利用可能なデータから、アミノ末端がＦＰＲＰでカルボキシル末端がヒルジンドデカペプチドに類似のビバリルジンの結合が強く支持されている（Kelly et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6040-6044）。レピルジン及びビバリルジンの作用機序は、トロンビンの触媒ドメイン及びエキソサイトＩへのトロンビン阻害剤の２価の結合である。ＦＰＲｃｋ−結合Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの結晶構造研究は、ビバリルジンのアミノ末端の結合を支持しており、modulateされていないエキソサイトＩはカルボキシル末端のドデカペプチドの結合に利用可能である。ＦＰＲｃｋ−結合天然トロンビンが有効性を示さなかったこと及び本来の抗凝固作用を有していることから、トロンビン変異体の触媒ドメイン及びエキソサイトＩの両方が利用可能であることが、ＤＴＩの逆転に重要であると考えられる（Hosokawa et al. (2001) Biochemical Journal, 354:309-313）。この知見は、アミノ末端のトリペプチドＦＰＲ及びカルボキシル末端のドデカペプチドのどちらもビバリルジンほどのアンチトロンビン効果を示さなかったことから（Kelly et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6040-6044）、２つの異なるトロンビン部位における２価ＤＴＩの結合の向上（Schmitz et al. (1991) European Journal of Biochemistry, 195:251-256）を説明するものである。
【００７０】
対照的に、アルガトロバン、メラガトラン（キシメラガトランの活性型）などの小分子トロンビン阻害剤はトロンビンの活性部位にのみ結合する（Okamoto et al. (1981) Biochemical & Biophysical Research Communications, 101:440-446）。今回のアルガトロバンに関するデータは、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの触媒ドメインに、ＦＰＲｃｋと同様に１価の阻害剤がアクセスできることを示唆している。
【００７１】
ヘパリンは、アンチトロンビン（ＡＴ）によるトロンビン阻害を仲介する。アンチトロンビンは、ＤＴＩと全く（uniquely）異なる内生ＳＥＲＰＩＮである。このグリコサミノグリカンはＡＴのコンフォメーション変化を誘導し（Johnson and Huntington (2003) Biochemistry, 42:8712-8719及びO'Keeffe et al. (2004) Journal of Biological Chemistry, 279:50267-50273）、ＡＴの反応センターループによりトロンビンの触媒部位が不可逆的に阻害される。これらの阻害反応は、トロンビンエキソサイトIIへのヘパリンの結合により支持される。このようなＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａとヘパリンの間のエキソサイト相互作用は、この変異体のエキソサイトが調節されていないために起こるのかも知れない。しかし、ＤＴＩとの相互作用とは対照的に、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、ＴＥＧ（登録商標）において、ＡＴ−ヘパリン存在下でピークトロンビン生成をほとんど上昇させず（minimally increased）、血塊強度を一部回復させただけであった。ヘパリン存在下のＷ２１５Ａ／Ｅ２１７ＡによるＡＰＴＴの回復は顕著であったが、ＡＰＴＴの終点はトロンビン生成の初期段階（５〜１０ｎＭ）であり、したがってトロンビンの総量は反映されない（Rand et al. (1996) Blood, 88:3432-3445）。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７ＡはＡＴへの親和性が大きく低下しており（Cantwell and Di Cera (2000) Journal of Biological Chemistry, 275:39827-39830）、他のトロンビン変異体（例えばＥ１９２Ｑ、ｄｅｓＥＴＷ）も、ヘパリンで回復されたＡＴへの親和性の欠失を示している（Le Bonniec et al. (1995) Biochemistry, 34:12241-12248）。今回のデータは、ヘパリン化した血液にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると内生トロンビン生成が少しだけ上昇することを示していた。このことは、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを非常に特異性の高いＤＴＩ逆転薬剤とし、かつＡＴ−ヘパリン複合体の吸着が実際にＡＴ欠乏症及び血栓形成促進状態になることがある（Petaja et al. (1996) Journal of Thoracic & Cardiovascular Surgery, 112:665-671）ことから、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａはインビボの安全性を高める可能性が高いと考えられる。
【００７２】
現在、ヘパリンは心臓手術で使用される主流の抗凝固剤である。凝固はプロタミンで速やかに逆転されるものの、心肺バイパスを使用する心臓手術を受ける患者の３〜５％で重篤な術後出血が起こる（Dacey et al. (1998) Archives of Surgery, 133:442-447）。プロタミンにアレルギーのある患者では重度の有害事象が発現することがあり、ヘパリンを逆転する代わりのプロトコールはない（Williams et al. (1994) Journal of Thoracic & Cardiovascular Surgery, 108:975-983及びStafford-Smith et al. (2005) Anesthesiology, 103:229-240）。もし、今回のデータで実証されたように、手術の終局にＤＴＩを逆転させることができれば、これらの薬剤はヘパリン又はプロタミンが禁忌の場合に使用することができる。
【００７３】
ＤＴＩに関連する心手技後出血は制御が困難な場合が多い。なぜなら、大量の強力なＤＴＩを、強力な抗血小板剤と併用する（Maroo and Lincoff (2004) Seminars in Thrombosis & Hemostasis, 30:329-336）か又は血小板減少症状態で使用する（Dyke et al. (2005) Annals of Thoracic Surgery, 80:299-303））ためである。最近のオフポンプ冠動脈手術におけるビバリルジン及びヘパリン−プロタミンの治験では、どちらの群も同じ程度の術後１２時間の胸腔チューブドレナージ（中央値：７９３ｖｓ８０５ｍｌ）であったが、失血の範囲はビバリルジン群で大きく変化していた（３２０〜４、９０９ｍｌ、ｎ＝５０）（Merry et al. (2004) Annals of Thoracic Surgery, 77:925-931）。過失による過剰投与、（アルガトロバンに対する）肝障害（Swan and Hursting (2000) Pharmacotherapy, 20:318-329）、及び（ビバリルジン及びレピルジンに対する）腎障害（Koster et al. (2000) Annals of Thoracic Surgery, 69:37-41、Robson et al. (2002) Clinical Pharmacology & Therapeutics, 71:433-439及びChew et al. (2005) American Journal of Cardiology, 95:581-585）は全て、出血リスクの増大の原因となる。したがって、ＤＴＩの新規の解毒剤が必要とされていることは明らかである。
【００７４】
出血リスクを減らすために、様々な解毒原理が、特にレピルジンに対して、探索されてきた。ヒルジン及びその合成アナログの中和薬剤として、ジイソプロピルホスホロトロンビン（ＤＩＰトロンビン）又はベンゾイルトロンビンなどのγ−トロンビン標品の使用（Bruggener et al. (1989) Pharmazie, 4:648-649）、及びプロトロンビン中間体であるメイゾトロンビンの使用（Nowak and Bucha (1995) Thrombosis Research, 80:317-325）が提案されてきた。今日まで、これらの標品は毒性が強すぎるか又は液相で効果を発揮しないため、現実的な成功を収めていない。ＤＴＩ関連出血への別のアプローチとして、組換え活性化第VII因子（ノボセブン（登録商標））（Hein et al. (2005) Artificial Organs, 29:507-510及びMalherbe et al. (2004) Anesthesiology, 100:443-445）及びＦＥＩＢＡ又はAutoplex標品（Irani et al. (1995) American Journal of Cardiology, 75:422-423及びElg et al. (2001) Thrombosis Research, 101:159-170）などの止血因子製品の輸血があるが、活性化血漿製品は血栓形成促進性の合併症が付随することがある（Bui et al. (2002) Journal of Thoracic & Cardiovascular Surgery, 124:852-854及びAledort (2004) Journal of Thrombosis & Haemostasis, 2:1700-1708）。したがって、解毒剤の性質は非血栓形成性であることが合理的である。ヘパリナーゼＩがプロタミンに取って変わらなかったのは、低分子ヘパリンが生成されること及び内皮グリコサミノグリカンを分解する可能性があることによるものであろう。逆に、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは静脈内投与されるとプロテインＣを全身で活性化するため、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは安全域を増やすものである。そのため、抗凝固活性（Chu et al. (2001) British Journal of Haematology, 115:392-399）及びプロテインＣ活性化の増強（Slungaard and Key (1994) Journal of Biological Chemistry, 269:25549-25556）を本来発揮するプロタミンによるヘパリンの急速な逆転を比較的安全なものにする。
【００７５】
今回の実験で使用したヘパリン及びＤＴＩの濃度は、ヘパリン（０．５Ｕ／ｍｌ；３．３ｍＭ）、アルガトロバン（０．５〜１．０μｇ／ｍｌ；１〜２μＭ）、ビバリルジン（５〜１０μｇ／ｍｌ；２．３〜４．６μＭ）、及びレピルジン（１μｇ／ｍｌ；０．１４μＭ）の治療範囲である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのモル濃度（５μｇ／ｍｌ又は０．１４μＭ）は、ほとんどの場合、トロンビン阻害剤のモル濃度より低い（Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを３７ｋＤａと仮定）。モル比に加え、トロンビンに対するＫｉ値の相対的差異（レピルジン＞＞ビバリルジン＞アルガトロバン）もＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａへの結合に影響し得る。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは、発現が早く、トロンビン生成が十分（ピークトロンビン１００ｎＭ超、図６Ｄ）であるため、インビボで止血を回復させ得る。 非ヒトモデル霊長類においてＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのインビボ血漿濃度は３．７５μｇ／ｍｌに達することもあり（Gruber et al. (2002) Journal of Biological Chemistry, 277:27581-27584）、ヘパリン及びＤＴＩによる抗凝固剤の存在下でも高投与量の計画で安全に使用することができる。
【００７６】
要約すると、本発明の知見は、凝固促進活性が実質的に低下したバリアント型トロンビン及びプロトロンビンを内生トロンビン機能の回復に使用することができることを実証している。とりわけ、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは静脈注射に好適な形態で利用可能であり（Gruber et al. (2002) Journal of Biological Chemistry, 277:27581-27584）、その臨床的有用性を確認するためのインビボにおけるさらなる研究が進行中である。
【実施例２】
【００７７】
患者の血漿又は全血中のＤＴＩを定量するための滴定アッセイ
トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ）を使用した、患者の血漿又は全血中のＤＴＩを定量するアッセイを以下に記載する。Hepcon HMS Plus 6-channel ACT system（Medtronic Perfusion Systems, Minneapolis, MN）に基づき、カートリッジフォーマットを用いて、表２に記載の通り、６チャネルのウェルに所定のレベルのＷＥを予め挿入しておく。
【００７８】
【表２】
【００７９】
ＤＴＩを含む血漿又は全血試料を患者から採取する。これらの試料を、トロンビンの内生阻害剤であるトロンボモジュリン（終濃度０．０３μｇ／ｍｌ）を含むシリンジに入れる。等量の血漿又は全血試料を各ウェルに添加する。各ウェルの試料の凝血開始までの時間を、当業者に周知の方法で、上述したＡＰＴＴ又は活性化凝血時間（ＡＣＴ）を用いて測定する（例えばHattersley (1966) J. Am. Med. Assoc., 196:436-440参照）。
【００８０】
ＤＴＩは、アンチトロンビン又はトロンボモジュリンなどのトロンビンの内生阻害剤よりもずっと早くトロンビン（又はＷＥ）に結合するため（表３参照）。表２において、ｋｏｎはストップトフロー分光法を用いた結合実験から得られた、前定常状態段階におけるα−トロンビンと阻害剤との会合定数であり、ｋｉは阻害定数である。ｋｏｎが大きいほど、阻害剤は速やかにトロンビンに結合する。ｋｉが低いほど、トロンビンの阻害はより選択的かつ 堅固（tight）なものとなる。（例えばElg et al. (1997) Thrombosis Haemostasis,78:1286-1292及びAritomi et al. (1993) Thrombosis Haemostasis, 70:418-422参照）。ＤＴＩに対するＷＥのモル比が１．０に近いほど、凝血開始までの時間は最も短くなることが予想される（図７参照）。ＷＥが過剰の場合、ＷＥはトロンボモジュリンに結合して活性化プロテインＣを活性化し、凝血開始までの時間を長引かせると予想される。逆に、ＤＴＩの方が多く利用可能な場合、存在する全てのＷＥがＤＴＩで飽和され、プロテインＣ活性化はブロックされているものの、過剰のＤＴＩによって凝血開始までの時間が長引くことになる。
【００８１】
【表３】
【００８２】
本明細書中で言及した全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示している。全ての刊行物及び特許出願を、各個別の刊行物及び特許出願が参照により組み込まれることを意図されたものであるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込んだものとする。
【００８３】
前述の発明は、明確な理解のために図示及び例示によりある程度詳細に記載してきたが、添付の請求項の範囲内で特定の変更及び修正を行うことができることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、フィブリノーゲン又はトロンビン阻害剤と野生型トロンビン又は変異体トロンビンＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ）との相互作用を示す図である。図１Ａは、触媒部位がフィブリノーゲンをフィブリンに切断する間に、どのようにトロンビンのエキソサイトＩが初期のフィブリノーゲン結合に必要であるかを示す図である。図１Ｂは、ビバリルジン及びヒルジンがどのようにトロンビンの触媒部位及びエキソサイトＩの両方をブロックするかを示す図である。図１Ｃは、アルガトロバン及びＦＰＲｃｋ（ＰＰＡＣＫ）がどのようにトロンビンの触媒部位だけをブロックするかを示す図である。図１Ｄは、トロンビン触媒ドメインへの２つの変異が、その結果得られた変異体トロンビン（ＷＥ）がフィブリノーゲンを切断する能力及び血小板を活性化する能力をどのように減少させるかを示す図である。図１Ｅは、変異体トロンビン（ＷＥ）がどのようにトロンボモジュリン存在下でプロテインＣを活性化する能力を維持しているをか示す図である。
【図２】図２は、トロンビン変異体が抗凝固剤の効果を逆転することができる機序を示す概略図である。トロンビン変異体は好ましくはＤＴＩに結合し、内生トロンビンがＤＴＩに結合する程度を低下させ、フィブリノーゲンの切断及び血小板の活性化を引き起こす。過剰のトロンビン又はトロンビン変異体が循環中に残ると、トロンボモジュリンとの相互作用によってプロテインＣが活性化される。
【図３】図３は、トロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７ＡによるＤＴＩの逆転を概略的に描いた図である。様々な濃度の各種ＤＴＩについて、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の平均値を秒単位で示す。図３Ａは５、１０、及び１５μｇ／ｍｌのビバリルジンを示す。図３Ｂは、０．１、１、及び５μｇ／ｍｌのレピルジンを示す。図３Ｃは、０．５及び１μｇ／ｍｌのアルガトロバンを示す。図３Ｄは、０．２及び０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンを示す。アスタリスクは各抗凝固剤レベルにおけるＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを使用した試料と使用していない試料との間の統計的差異を表す。各抗凝固剤レベルで、ＡＰＴＴ値は５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａによって短縮される。活性部位が占有されたトロンビン（ＦＰＲ−ＴＨ）はＡＰＴＴを短縮しない。
【図４】図４は、レピルジュイン（lepirduin）又はヘパリン存在下における血塊形成に対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果を測定するためのトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））によるトレースを示す代表的な図である。図４Ａはレピルジュイン（lepirduin）が血塊形成の反応（遅延）時間（トレース２）を延長させること、及びＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると血塊開始が正常化すること（トレース１）を示す図である。可溶性トロンボモジュリン（０．７５μｇ／ｍｌ）の存在下で、５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａは血塊開始を遅らせ、血塊強度を減少させる（トレース３）。図４Ｂは、未分画ヘパリン（０．５Ｕ／ｍｌ）がコントロール（トレース４）と対照的に血塊形成（トレース７）を消失させることを示す図である。５μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンは、発生を完全に回復させ、それより程度は低いが血塊強度も回復させる（トレース５）。５μｇ／ｍｌのＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると、開始が短縮されるが（トレース６）、血塊形成はプロタミン処置試料よりもゆっくりなままである。
【図５】図５は、ビバリルジン、レピルジン、又はアルガトロバン存在下における血塊形成に対するＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａの効果を測定するためのＴＥＧ（登録商標）によるトレースの代表的な図である。凝血までの反応時間の平均値を分単位で測定した。図５Ａは、ビバリルジン（５μｇ／ｍｌ）、レピルジン（１μｇ／ｍｌ）、又はアルガトロバン（０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で反応時間が延長されることを示す図である。各代表的抗凝固剤において、反応時間の値はＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａによって短縮される（＊：ｐ＜０．０１）。コントロール（抗凝固剤なし）とＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを含有するコントロールとで統計的な差はなかったが、可溶性トロンボモジュリン（０．７５μｇ／ｍｌ）を添加すると反応時間が有意に延長された（＃：コントロールに対してｐ＜０．０１）。硫酸プロタミンはヘパリンを逆転させる（§：ヘパリンのみに対してｐ＜０．０１）。図５Ｂは、最大振幅（ｍｍ）の平均値が、アルガトロバン（＊：ｐ＜０．０５）及びヘパリン（＃：ｐ＜０．０１）では減少されたがビバリルジン及びレピルジンでは減少されなかったことを示す図である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加すると、全てのＤＴＩの振幅が回復したが、ヘパリンは部分的回復のみであった。（§：硫酸プロタミンに対してｐ＜０．０５）。可溶性トロンボモジュリンと共にＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａを添加しても振幅は減少した（＊：コントロールに対してｐ＜０．０５）。
【図６】図６は、一連のトロンビン生成曲線を表す図である。図６Ａは、Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ、５μｇ／ｍｌ）の添加によって血液血漿中のピークトロンビン生成がわずかに減少し、可溶性トロンボモジュリン（ｒｈｓＴＭ、０．７５μｇ／ｍｌ）の添加では中程度減少したことを示す図である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ及びトロンボモジュリンの両方を添加するとトロンビン生成はさらに鈍化した。図６Ｂは、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌ、１０μｇ／ｍｌ）により誘導される凝血遅延時間の延長をＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ、５μｇ／ｍｌ）で逆転させることができることを示す図である。図６Ｃは、１及び５μｇ／ｍｌのレピルジンがトロンビン形成を鈍化させること及びＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ、５μｇ／ｍｌ）の添加が発現を短縮し、かつピークトロンビン生成を減少させることを示す図である。図６Ｄは、０．５及び１μｇ／ｍｌのアルガトロバンが発現を延長し、ピークトロンビン生成を減少させることを示す図である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ (WE, ５μｇ／ｍｌ)を添加すると、発現は短縮されたが、減少したトロンビン形成のピークレベルは逆転されなかった。図６Ｅは、０．２Ｕ／ｍｌのヘパリンでトロンビン生成が鈍化されたことを示す図である。Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ、５μｇ／ｍｌ）を添加すると、凝血開始は短縮されたが、硫酸プロタミンで処置した試料とは対照的に、減少したトロンビン形成のピークレベルは逆転しなかった。
【図７】図７は、全血又は血漿試料の直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）及びＷ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａ（ＷＥ）の相対濃度と活性化凝血時間（ＡＣＴ）で測定した血塊形成の開始との関係を示す図である。凝血開始までの時間は、ＤＴＩに対するＷＥのモル比が１．０に近いときに最も短いと予想される。ＷＥが過剰のときは、ＷＥはトロンボモジュリンに結合してプロテインＣを活性化し、凝血開始までの時間が長くなると予想される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者におけるトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法であって、治療有効量のトロンビン変異体を前記患者に投与することを含み、前記トロンビン変異体が以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
ａ）配列番号１に示されるトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号１の２６３位及び２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１の２６３位及び２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２に示されるトロンビン変異体Ｗ２１５Ａのアミノ酸配列；
ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号２の２６３位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；及び
ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２の２６３位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列。
【請求項２】
トロンビン阻害剤が直接トロンビン阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
直接トロンビン阻害剤が、アルガトロバン又はその誘導体若しくはアナログ、ヒルジン又はその組換え若しくは合成の誘導体若しくはアナログ、トリペプチドＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの誘導体、クロロメチルケトン誘導体、キシメラガトラン又はその誘導体、代謝産物、若しくはアナログ、アニオン結合エキソサイト阻害剤、及びＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
直接トロンビン阻害剤がアルガトロバンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒルジンの、組換え又は合成の、誘導体又はアナログが、ビバリルジン、レピルジン、及びデシルジンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
キシメラガトランの代謝産物がメラガトランである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
トロンビン阻害剤が間接トロンビン阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
間接トロンビン阻害剤がヘパリン、クマリン、デルマタン、又はトロンボモジュリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
トロンビン変異体が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
トロンビン変異体が配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
トロンビン変異体が患者に非経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
トロンビン変異体が患者に腹腔内、静脈内、皮下、又は筋肉内投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
トロンビン変異体が患者に静脈内投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トロンビン変異体が、体重１ｋｇ当たり約０．１ｎｇ〜約５００ｍｇの投与量で患者に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
トロンビン変異体が、少なくとも３μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分な投与量で患者に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
トロンビン変異体が、３．７５μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分な投与量で患者に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者に止血剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
止血剤が活性化第VII因子又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
トロンビン変異体及び止血剤が同時投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
トロンビン変異体及び止血剤が順次投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
以下のステップを含む、患者の血漿又は全血中の直接トロンビン阻害剤の濃度を定量する方法。
ａ）前記患者から血漿又は全血試料を得るステップ；
ｂ）前記血漿又は全血試料にトロンボモジュリンを添加するステップ；
ｃ）一連の試験チャンバーに、様々な濃度に上昇させたトロンビン変異体をロードするステップ；
ｄ）前記血漿又は全血試料を前記試験チャンバーの各々に等量添加するステップ；
ｅ）前記試験チャンバーの各々における前記血漿又は全血試料の凝血開始までの時間を測定するステップ；
ｆ）凝血開始までの時間が最も短い試験チャンバーを選択するステップ；及び
ｇ）前記血漿又は全血試料中の前記直接トロンビン阻害剤の濃度が、選択しなかった試験チャンバーにおける前記トロンビン変異体の濃度と比較して、選択した試験チャンバーにおける前記トロンビン変異体の濃度に相当する濃度に最も近い濃度であると評価するステップ。
【請求項２２】
トロンビン変異体が、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
ａ）配列番号１に示されるトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号１の２６３位及び２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１の２６３位及び２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２に示されるトロンビン変異体Ｗ２１５Ａのアミノ酸配列；
ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号２の２６３位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；及び
ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２の２６３位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列。
【請求項２３】
トロンビン変異体が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
トロンビン変異体が配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
直接トロンビン阻害が、アルガトロバン又はその誘導体若しくはアナログ、ヒルジン又はその組換え若しくは合成の誘導体若しくはアナログ、トリペプチドＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの誘導体、クロロメチルケトン誘導体、キシメラガトラン又はその誘導体、代謝産物、若しくはアナログ、アニオン結合エキソサイト阻害剤、及びＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
直接トロンビン阻害剤がアルガトロバンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒルジンの組換え又は合成の誘導体又はアナログが、ビバリルジン、レピルジン、及びデシルジンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
キシメラガトランの代謝産物がメラガトランである、請求項２５に記載の方法。
【請求項１】
それを必要とする患者におけるトロンビン阻害剤の抗凝固効果を阻害する方法であって、治療有効量のトロンビン変異体を前記患者に投与することを含み、前記トロンビン変異体が以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
ａ）配列番号１に示されるトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号１の２６３位及び２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１の２６３位及び２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２に示されるトロンビン変異体Ｗ２１５Ａのアミノ酸配列；
ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号２の２６３位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；及び
ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２の２６３位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列。
【請求項２】
トロンビン阻害剤が直接トロンビン阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
直接トロンビン阻害剤が、アルガトロバン又はその誘導体若しくはアナログ、ヒルジン又はその組換え若しくは合成の誘導体若しくはアナログ、トリペプチドＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの誘導体、クロロメチルケトン誘導体、キシメラガトラン又はその誘導体、代謝産物、若しくはアナログ、アニオン結合エキソサイト阻害剤、及びＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
直接トロンビン阻害剤がアルガトロバンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒルジンの、組換え又は合成の、誘導体又はアナログが、ビバリルジン、レピルジン、及びデシルジンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
キシメラガトランの代謝産物がメラガトランである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
トロンビン阻害剤が間接トロンビン阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
間接トロンビン阻害剤がヘパリン、クマリン、デルマタン、又はトロンボモジュリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
トロンビン変異体が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
トロンビン変異体が配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
トロンビン変異体が患者に非経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
トロンビン変異体が患者に腹腔内、静脈内、皮下、又は筋肉内投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
トロンビン変異体が患者に静脈内投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トロンビン変異体が、体重１ｋｇ当たり約０．１ｎｇ〜約５００ｍｇの投与量で患者に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
トロンビン変異体が、少なくとも３μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分な投与量で患者に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
トロンビン変異体が、３．７５μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分な投与量で患者に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
患者に止血剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
止血剤が活性化第VII因子又は活性化プロトロンビン複合体濃縮製剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
トロンビン変異体及び止血剤が同時投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
トロンビン変異体及び止血剤が順次投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
以下のステップを含む、患者の血漿又は全血中の直接トロンビン阻害剤の濃度を定量する方法。
ａ）前記患者から血漿又は全血試料を得るステップ；
ｂ）前記血漿又は全血試料にトロンボモジュリンを添加するステップ；
ｃ）一連の試験チャンバーに、様々な濃度に上昇させたトロンビン変異体をロードするステップ；
ｄ）前記血漿又は全血試料を前記試験チャンバーの各々に等量添加するステップ；
ｅ）前記試験チャンバーの各々における前記血漿又は全血試料の凝血開始までの時間を測定するステップ；
ｆ）凝血開始までの時間が最も短い試験チャンバーを選択するステップ；及び
ｇ）前記血漿又は全血試料中の前記直接トロンビン阻害剤の濃度が、選択しなかった試験チャンバーにおける前記トロンビン変異体の濃度と比較して、選択した試験チャンバーにおける前記トロンビン変異体の濃度に相当する濃度に最も近い濃度であると評価するステップ。
【請求項２２】
トロンビン変異体が、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
ａ）配列番号１に示されるトロンビン変異体Ｗ２１５Ａ／Ｅ２１７Ａのアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号１の２６３位及び２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１の２６３位及び２６５位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；
ｄ）配列番号２に示されるトロンビン変異体Ｗ２１５Ａのアミノ酸配列；
ｅ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号２の２６３位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列；及び
ｆ）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２の２６３位に相当する位置にアラニン残基を有するアミノ酸配列であって、前記トロンビン阻害剤に結合するトロンビン変異体をコードするアミノ酸配列。
【請求項２３】
トロンビン変異体が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
トロンビン変異体が配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
直接トロンビン阻害が、アルガトロバン又はその誘導体若しくはアナログ、ヒルジン又はその組換え若しくは合成の誘導体若しくはアナログ、トリペプチドＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの誘導体、クロロメチルケトン誘導体、キシメラガトラン又はその誘導体、代謝産物、若しくはアナログ、アニオン結合エキソサイト阻害剤、及びＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
直接トロンビン阻害剤がアルガトロバンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒルジンの組換え又は合成の誘導体又はアナログが、ビバリルジン、レピルジン、及びデシルジンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
キシメラガトランの代謝産物がメラガトランである、請求項２５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５３０３１２（Ｐ２００９−５３０３１２Ａ）
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５００６０９（Ｐ２００９−５００６０９）
【出願日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４０８１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０６８９３
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０７１８７２４８）エモリー ユニヴァーシティ (5)
【出願人】（５０８２７８３３２）ザ ワシントンユニヴァーシティー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【出願人】（５０８２７８３４３）オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニヴァーシティー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＯＲＥＧＯＮ ＨＥＡＬＴＨ ＆ ＳＣＩＥＮＣＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６４０８１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０６８９３
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５０７１８７２４８）エモリー ユニヴァーシティ (5)
【出願人】（５０８２７８３３２）ザ ワシントンユニヴァーシティー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【出願人】（５０８２７８３４３）オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニヴァーシティー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＯＲＥＧＯＮ ＨＥＡＬＴＨ ＆ ＳＣＩＥＮＣＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]