本発明は、混合物中の個々のポリマーがナノポア中の別の化合物、例えば酵素により作用されることを検出及び制御できるデバイス及び方法を提供する。本デバイス及び方法は、フィードバック制御下で、またはポリヌクレオチド及びナノポア間の相互作用により生成された信号を使用して、ポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列を迅速に（約＞５０Ｈｚ）決定するためにも使用される。本発明は、分子生物学、構造生物学、細胞生物学、分子スイッチ、分子回路、及び分子計算デバイス、並びにそれらの製造の分野に特に有用である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する酵素の結合を制御するための方法であって：２つの別々の隣接した媒質の貯留、一方の貯留から他方の貯留に一度に１つのポリヌクレオチドのみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する前記２つの貯留間の界面を準備すること；部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する結合活性を有する酵素を準備すること；第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド複合体であり、前記ポリヌクレオチド複合体の一部は二本鎖であり、前記第１のポリヌクレオチドは、前記第２のポリヌクレオチドと適合しない部分を更に含むポリヌクレオチド複合体を準備すること；前記２つの貯留の１つに前記ポリヌクレオチド複合体を導入すること；前記貯留の１つに前記酵素を導入すること；前記２つの貯留間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成させること；最初に前記電位差を反転させて、それにより第２の極性を生成させること；２度目に前記電位差を反転させて前記第１の極性を生成し、それにより前記部分的に二本鎖のポリヌクレオチド複合体に対する前記酵素の結合を制御することを含む方法。
【請求項２】
前記２つの貯留間の電流を測定するステップ；前記第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、前記第１の極性が２度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２つの貯留間の電流を測定するステップ；前記第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後に取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記部分が、ペプチド核酸、２’−Ｏ−メチル基、蛍光化合物、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、及びリボゾームからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；前記ポリヌクレオチド複合体を含む前記貯留に前記試薬を導入するステップと；適温で前記貯留をインキュベートするステップとを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試薬が、デオキシリボヌクレオチド及び補助因子からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記デオキシリボヌクレオチドが、前記補助因子を導入する前に前記貯留に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記補助因子が、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、及びＳ−アデノシルメチオニンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記媒質が導電性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記媒質が水溶液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも２つの化合物の結合を検出するためのデバイスであって、混合信号半導体ウェーハ、少なくとも１つの電気化学的層であり、前記電気化学的層が半導体材料を含み、前記半導体材料が表面改質剤を更に含み、前記電気化学的層が複数のオリフィスを定義し、前記オリフィスがチャンバー及び頚部を含み、前記オリフィスの前記チャンバーが前記混合信号半導体ウェーハの金属被覆組成物と共局在し、前記オリフィスの一部が金属で塞がれており、前記金属が前記金属被覆組成物と電気的に連通しており、前記オリフィスが薄膜を更に含み、前記薄膜が前記オリフィスの前記頚部で溶媒不透過性の密閉を形成し、前記薄膜が細孔を更を含み、前記細孔が細孔開口部を更に含む電気化学的層を含むデバイス。
【請求項１３】
前記化合物が生体化合物である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記生体化合物が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、リン脂質、ポリサッカライド、ポリケチド、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、リガーゼ、及びリアーゼからなる群から選択される、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記半導体材料が二酸化ケイ素である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記表面改質剤が炭化水素である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記金属被膜組成物が、ニッケル、金、銅、及びアルミニウムからなる群から選択される、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記金属が銀である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記薄膜がリン脂質二重層である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記オリフィスの大きさが約０．５から３μｍである、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記オリフィスの大きさが約１から２μｍである、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記オリフィスの大きさが約１．２５から１．５μｍである、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記細孔が生体分子である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記生体分子が、イオンチャネル、ヌクレオシドチャネル、ペプチドチャネル、糖輸送体、シナプスチャネル、膜貫通受容体、及び核膜孔からなる群から選択される、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記生体分子がα溶血素である、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記細孔開口部の大きさが約０．５から８ｎｍである、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記細孔開口部の大きさが約０．５から４ｎｍである、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記細孔開口部の大きさが約１から２ｎｍである、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
電圧フィードバック制御を使用してポリヌクレオチドに対する酵素の結合を制御するための方法であって：前記ポリヌクレオチドによる前記酵素の捕捉及び解離の繰り返しに帰着する方法であり、媒質を含む２つの別々の隣接したチャンバー、前記チャネルのシス側から前記チャネルのトランス側に一度に１つのポリヌクレオチド鎖のみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法のチャネルを有する前記２つのチャンバー間の界面を準備するステップ；ポリヌクレオチドに対する結合活性を有する酵素を準備するステップ；保護デオキシリボヌクレオチドを準備するステップ；ポリヌクレオチド結合性化合物を準備するステップ；ポリヌクレオチド複合体の一部が二本鎖であり一部が一本鎖である前記ポリヌクレオチド複合体を準備するステップ；前記ポリヌクレオチド複合体を前記２つのチャンバーの１つに導入するステップ；前記２つのチャンバー間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成し、前記第１の極性が前記ポリヌクレオチドの前記一本鎖部分を、前記チャネルを通して前記トランス側に移動させるステップ；前記保護デオキシリボヌクレオチドを同じチャンバーに導入するステップ；前記酵素を同じチャンバーに導入するステップ；前記酵素が前記ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；前記保護デオキシリボヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；前記チャネルを通る電流を測定し、それにより前記ポリヌクレオチドに対する前記酵素及び前記保護デオキシリボヌクレオチドの結合を検出するステップ；前記ポリヌクレオチド結合性化合物を前記２つのチャンバーの他方に導入するステップ；最初に前記電位差を減少させ、それにより第２の極性を生成させるステップ；前記ポリヌクレオチド結合性化合物が前記一本鎖ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；前記電位差を反転させ、それにより第３の極性を生成させるステップ；二度目に前記電位差を反転させるステップ；前記チャネルを通る電流を測定し、それによりポリヌクレオチド単独、又は前記酵素及び前記保護デオキシリボヌクレオチドに結合したポリヌクレオチドを検出するステップ；前記ステップのいずれか１つを繰り返し、それにより前記ポリヌクレオチドに対する前記酵素の結合を制御するステップを含む方法。
【請求項３０】
前記２つのチャンバー間の電流を測定するステップ；前記第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、前記第１の極性が２度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記２つのチャンバー間の電流を測定するステップ；前記第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチド結合性化合物が、前記ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、及びリボゾームからなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；前記ポリヌクレオチド複合体を含む前記チャンバーに前記試薬を導入するステップと；酵素活性を維持するのに十分な温度で前記チャンバーをインキュベートするステップとを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記試薬が補助因子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記補助因子が、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、及びＳ−アデノシルメチオニンからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記媒質が導電性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記媒質が水媒質である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記保護デオキシリボヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ＵＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記試薬が、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＵＴＰからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
電圧フィードバック制御を使用してポリヌクレオチドに対する酵素の結合を制御するための方法であって：ポリヌクレオチド配列の同定に帰着する方法であり、媒質を含む２つの別々の隣接したチャンバー、前記チャネルの前記シス側から前記チャネルの前記トランス側に一度に１つのポリヌクレオチド鎖のみをモノマー毎に順次通過させることを可能にするような寸法の前記チャネルを有する前記２つのチャンバー間の界面を準備するステップ；ポリヌクレオチドに対する結合活性を有する酵素を準備するステップ；保護デオキシリボヌクレオチドを準備するステップ；ポリヌクレオチド結合性化合物を準備するステップ；ポリヌクレオチド複合体の一部が二本鎖であり一部が一本鎖である前記ポリヌクレオチド複合体を準備するステップ；前記ポリヌクレオチド複合体を前記２つのチャンバーの１つに導入するステップ；前記２つのチャンバー間に電位差を印加し、それにより第１の極性を生成し、前記第１の極性が前記ポリヌクレオチドの前記一本鎖部分を、前記チャネルを通して前記トランス側に移動させるステップ；前記保護デオキシリボヌクレオチドを同じチャンバーに導入するステップ；前記酵素を同じチャンバーに導入するステップ；前記酵素が前記ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；前記保護デオキシリボヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；前記チャネルを通る電流を測定し、それにより前記ポリヌクレオチドに対する前記酵素及び前記保護デオキシリボヌクレオチドの結合を検出するステップ；前記ポリヌクレオチド結合性化合物を前記２つのチャンバーの他方に導入するステップ；最初に前記電位差を減少させ、それにより第２の極性を生成させるステップ；前記ポリヌクレオチド結合性化合物が前記一本鎖ポリヌクレオチドに結合することを可能にするステップ；前記電位差を反転させ、それにより第３の極性を生成させるステップ；二度目に前記電位差を反転させるステップ；前記チャネルを通る電流を測定し、それによりポリヌクレオチド単独、又は前記酵素及び前記保護デオキシリボヌクレオチドに結合したポリヌクレオチドを検出するステップ；上記ステップのいずれか１つを繰り返し、それにより前記ポリヌクレオチドに対する前記酵素の結合を制御するステップを含む方法。
【請求項４２】
前記２つのチャンバー間の電流を測定するステップ；前記第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、前記第１の極性が２度目に誘導された際に取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記２つのチャンバー間の電流を測定するステップ；前記第１の極性が最初に誘導された際に取得された電流値を、後で取得された電流値と比較するステップを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリヌクレオチド結合性化合物が、前記ポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、誘導体化ヌクレオチド、及びヌクレオチド異性体からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮａｓｅ、ウラシルＤＮＡグリコシダーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、及びリボゾームからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
酵素活性を開始させる少なくとも１つの試薬を準備するステップと；前記ポリヌクレオチド複合体を含む前記チャンバーに前記試薬を導入するステップと；酵素活性を維持するのに十分な温度で前記チャンバーをインキュベートするステップとを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記試薬が補助因子である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記補助因子が、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋、ＡＴＰ、ＮＡＤ^＋、ＮＡＤＰ^＋、及びＳ−アデノシルメチオニンからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記媒質が導電性である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記媒質が水媒質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記保護デオキシリボヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ＵＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択されるデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記試薬が、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＵＴＰからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
電気的連通手段により接続されているシス及びトランスチャンバーであり、前記シス及びトランスチャンバーが、少なくとも１つの細孔又はチャネルを含む薄膜により隔てられており、前記細孔又はチャネルが、ポリマーを通過させるのに好適な寸法を有する形状及び大きさに作られているシス及びトランスチャンバーと、前記シス及びトランスチャンバー間に電場を印加するための手段と、前記シス及びトランスチャンバー間の電流を検出するための手段とを含む有限状態機械。
【請求項５４】
前記薄膜が、疎水性領域及び親水性領域を有する化合物を含む、請求項５３に記載の有限状態機械。
【請求項５５】
前記薄膜がリン脂質を含む、請求項５３に記載の有限状態機械。
【請求項５６】
前記細孔又はチャネルが、前記ポリマーの相当な部分を収納する、請求項５３に記載の有限状態機械。
【請求項５７】
前記細孔又はチャネルが生物活性を有する、請求項５３に記載の有限状態機械。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【公表番号】特表２０１０−５２４４３６（Ｐ２０１０−５２４４３６Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０２１５３（Ｐ２０１０−５０２１５３）
【出願日】平成２０年４月４日（２００８．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４４６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２４１０７
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（５０８２２８０６１）ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　カリフォルニア (10)
【Ｆターム（参考）】