ニコチアナミンから誘導されたメタロフォア及びそれを製造する方法
本発明はニコチアナミン誘導体、及びそれを化学合成又は酵素合成する方法に関する。該ニコチアナミン誘導体は以下の式（Ｉ）を有する。本発明は特に薬学の分野において使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はニコチアナミン誘導体、及びそれを化学合成又は酵素合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチアナミン（ＮＡ）は全ての高等植物に存在する、タンパク質を構成しない（non-proteinogenic）アミノ酸である。ＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで多くの金属イオン（Ｆｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ）をキレート化することができ、ｉｎ ｖｉｖｏでは植物におけるこれらの金属の恒常性に重要な役割を果たしている。
【０００３】
加えて、ニコチアナミンはアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）を阻害することにより抗高血圧性を有することが示されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００４】
高等植物では、ニコチアナミン生合成はニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ；ＥＣ ２．５．１．４３）によって触媒され、３つのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）分子の三量体形成によって起こる。配列データベース検索によって、高等植物以外の生物、特に真菌及び古細菌におけるＮＡＳの推定ホモログを発見することが可能となった（非特許文献４、非特許文献５）。糸状菌アカパンカビ（Neurospora crassa）においても機能的ＮＡＳの存在が実証されている（非特許文献６）。近年、本発明者らのチーム（非特許文献７）は大腸菌において、真核生物のＮＡＳのホモログである古細菌メタノサーモバクター・サーモオートトロフィカス（Methanothermobacter thermoautotrophicus）の酵素（ＭＴＨ６７５；ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿２７５８１７）を発現させた。この酵素を以下でＭｔＮＡＳと称する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kinoshita et al., Biosci Biotechnol Biochem, 57, 1107-10, 1993
【非特許文献２】Shimizu et al., J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 45, 375-83, 1999
【非特許文献３】Wada et al., Biosci Biotechnol Biochem, 70, 1408-15, 2006
【非特許文献４】Trampczynska et al., FEBS Lett, 580, 3173-8, 2006
【非特許文献５】Herbik et al., Eur J Biochem, 265, 231-9, 1999
【非特許文献６】Trampczynska et al., FEBS Lett, 580, 3173-8, 2006
【非特許文献７】Dreyfus et al., Acta Cryst., F64, 933-5, 2008
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、このメタノサーモバクター・サーモオートトロフィカスの酵素の特性化についての研究を続ける中で、この酵素によって合成される新規の分子を発見した。
【０００７】
この分子（以下、サーモニコチアナミン（ｔｈＮＡ）と称する）は、ニコチアナミンに比べ、さらなるカルボン酸基を含む。
【０００８】
このニコチアナミン誘導体は以下の式を有する：
【０００９】
【化１】
【００１０】
この誘導体は、
ａ）Ｌ−アスパラギン酸のα−ｔｅｒｔ−ブチルエステルのアミン官能基を保護する工程、
ｂ）工程ａ）で得られる化合物のカルボン酸官能基を還元する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られる化合物のアルコール官能基を、好ましくはヨウ素でハロゲン化する工程、
ｄ）Ｌ−グルタミン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルのアミン官能基を保護活性化する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られる化合物を、工程ｃ）で得られる化合物でアルキル化する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られる化合物のアミン官能基を脱保護した後、保護活性化する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られる化合物を、工程ｃ）で得られる化合物でアルキル化する工程、及び
ｈ）工程ｇ）で得られる化合物を完全に脱保護する工程
を含む化学的方法によって有利に合成することも可能である。
【００１１】
サーモニコチアナミンはまた、基質であるＳＡＭ及びグルタミン酸（ＧＬＵ）を、非特許文献７に記載のように精製されるメタノサーモバクター属のＭｔＮＡＳ酵素、又は別の古細菌におけるそのオーソログの１つの存在下でインキュベートすることによって酵素的に合成することができる。
【００１２】
サーモニコチアナミンを、メタノサーモバクター・サーモオートトロフィカス若しくはＭｔＮＡＳのオーソログを発現する別の古細菌の培養物を用いて、又はＭｔＮＡＳ若しくはそのオーソログの１つをコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞（例えば大腸菌）を用いて、上記酵素を発現させることによって合成することも可能である。
【００１３】
本発明によるニコチアナミン誘導体は、ニコチアナミン自体に代えて、又はニコチアナミン自体に加えて、ニコチアナミンの全ての用途に有利に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のニコチアナミン誘導体を合成する化学的方法は、以下の反応スキームに従って行われる：
【００１５】
【化２】
【００１６】
より具体的には、本発明によるニコチアナミン誘導体は、一方では市販品であるＬ−アスパラギン酸のα−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、他方では同じく市販品であるＬ−グルタミン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルから出発して生成される。
【００１７】
出発化合物はしたがって、以下の式を有する化合物（１と称する）である、Ｌ−アスパラギン酸のα−ｔｅｒｔ−ブチルエステルである：
【００１８】
【化３】
【００１９】
次いで、この化合物のアミンの保護を以下のようにして行う：
重炭酸ナトリウム（１３ｇ、１５９ｍｍｏｌ）及びジオキサン（７０ｍＬ）中のクロロギ酸ベンジル（１１．８ｍＬ、６９ｍｍｏｌ）の溶液を、水／ジオキサン混合物（２／１）（１７０ｍＬ）中のアスパラギン酸α−ｔｅｒｔ−ブチル（１０ｇ、５３ｍｍｏｌ）の溶液に２時間かけて添加する。周囲温度で一晩撹拌を行う。反応媒体を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で洗浄した後、０℃でｐＨ＝２となるまで６Ｎ塩酸溶液で酸性にする。水相を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を塩水（２００ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、濃縮すると、化合物２が無色の油の形態で得られる（１６．７ｇ、９７％）。
【００２０】
以下の式を有する化合物２が得られる：
【００２１】
【化４】
【００２２】
Ｒｆ値：（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ３７％）＝０．６８
ＨＰＬＣ：１．５６分
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋、３２４．１；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、２６８．１
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．４５（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．５及び１４Ｈｚ，ＣＨ２b）；４．５５（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，ＣＨa）；５．１０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ）；５．８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＮＨ）；７．３５（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）；１０．７（ｂｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：２７．７９；３６．７３；５０．７５；６７．１２；８２．８３；１２８．１１；１２８．２０；１２８．５３；１３６．１２；１５６．０６；１６９．４６；１７６．２５。
【００２３】
次いで、化合物２のカルボン酸官能基の還元を以下のようにして行う：
ジイソプロピルエチルアミン（１０．５ｍＬ、６０．４ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ中の化合物２（１５ｇ、４６．４ｍｍｏｌ）及びＢＯＰ（２７ｇ、６０．４ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加する。反応媒体を色が黄色に変わるまで１０分間激しく撹拌し続けた後、１５分間かけて０℃まで冷却する。次に、反応媒体にＮａＢＨ４（２．３ｇ、６０．４ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。反応混合物を一晩激しく撹拌し続ける。溶媒を蒸発させて、残渣を酢酸エチル（２５０ｍＬ）中に取り込む。溶液を１０％クエン酸溶液（３×１００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３×１００ｍＬ）、次に蒸留水（２×１００ｍＬ）で続けて洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮すると、無色の油が得られる。この化合物３をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル：３／７）によって精製すると、無色の油が得られる（１３．９５ｇ、９６％）。
【００２４】
以下の式を有する化合物３が得られる：
【００２５】
【化５】
【００２６】
Ｒｆ値：（石油エーテル／エーテル：３／７）＝０．４２
ＨＰＬＣ：１．４５分
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋、３１０．２；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、２５４．１
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．４３（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；２．０９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．６及び１５．２Ｈｚ，ＣＨ２b）；３．４８（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；３．８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；４．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；５．１０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ）；５．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＮＨ）；７．３５（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：２７．９；３５．４５；５１．９５；５８．４；６７．０１；８２．４４；１２８．０７；１２８．１３；１２８．１３；１２８．３１；１２９．０１；１３６．１；１５６．７９；１６９．４６；１７１．６８。
【００２７】
次いで、化合物３のアルコールのハロゲン化を以下のようにして行う：
ヨウ素（１４．３ｇ、５６．４ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１４．８ｇ、５６．４ｍｍｏｌ）、さらに１０分後、イミダゾール（９．６ｇ、１４１ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（２６０ｍＬ）中の化合物３（５．８ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で添加する。反応媒体を還流させ、３時間激しく撹拌し続ける。反応混合物が周囲温度に戻った時点で、硫酸水素カリウムのモル溶液（３×１５０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（３×１５０ｍＬ）、及びチオ硫酸ナトリウムの５％溶液（３×１５０ｍＬ）、及び塩水（１５０ｍＬ）で続けて洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮すると、黄色のペーストが得られる。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル：１０／０→８／２）の後、生成物４が黄色の油の形態で得られる（６．２ｇ、７８％）。
【００２８】
以下の式を有する化合物４が得られる：
【００２９】
【化６】
【００３０】
Ｒｆ値：（石油エーテル／酢酸エチル：８／２）＝０．６５
ＨＰＬＣ：
ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋、４４２．０；［Ｍ＋Ｈ］＋、４２０．１；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、３６４．２
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．４５（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；２．１５〜２．４５（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ２b）；３．１５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；４．３５（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；５．１０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ）；５．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＮＨ）；７．３５（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１６．１；２８．４２；３８．４５；５４．２４；５６．１５；６７．８９；８３．５９；１２８．９５；１２９．０３；１２９．２２；１２９．３４；１２９．３８；１３６．９３；１５６．６９；１７１．０３。
【００３１】
これとは別に、Ｌ−グルタミン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物５）を得て、以下の式を有するこの化合物５のアミンの保護活性化を行う：
【００３２】
【化７】
【００３３】
トリエチルアミン（０．２９ｍＬ、２．１０ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のグルタミン酸ｔｅｒｔ−ブチル塩酸塩（０．６２ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。溶液を濾過した後、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）中に溶解したトリエチルアミン（０．６０ｍＬ、４．４１ｍｍｏｌ）及び２，２，５，６，７−ペンタメチルクロマンスルホニルクロリド（０．７ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを用いて２時間かけてそれに添加する。反応媒体を一晩激しく撹拌し続ける。反応媒体を真空下で濃縮した後、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に取り込む。有機相をクエン酸の１０％溶液（３×２０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（３×２０ｍＬ）及び蒸留水（３×２０ｍＬ）で続けて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル：８／２）の後、スルホンアミド６が無色の油の形態で得られる（１ｇ、９１％）。
【００３４】
以下の化合物６が得られる：
【００３５】
【化８】
【００３６】
Ｒｆ値：（石油エーテル／エーテル：６／４）＝０．３
ＨＰＬＣ：２．４１分
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋、５２６．３；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、４７０．２；［Ｍ＋Ｈ−２ｔＢｕ］＋、４１４．２
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．１４〜１．２４（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；１．２２〜１．２４（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３）；１．３６（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；１．７０〜１．９９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２メタ位，ＣＨ２b）；２．０３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；２．２７〜２．３３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；２．４７〜２．４９（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．５４〜２．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８及び６．８Ｈｚ，ＣＨ２）；３．６６〜３．６７（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；５．２０〜５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＮＨ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１１．４２；１２．１７；１４．１１；１７．３０；１８．２５；１９．４２；２０．４２；２１．５０；２２．６０；２６．５２；２６．８１；２７．６０；２８．０５；２８．６０；２９．０４；２９．６８；３０．９７；３２．６７；５５．０９；７３．９１；７６．６１；８０．５３；８２．２９；１１８．３２；１２４．６０；１２８．４３；１３６．４２；１３６．６０；１５４．６５；１７１．０７；１７１．９７。
【００３７】
次いで、化合物４による化合物６のアルキル化を以下のようにして行う：
炭酸セシウム（０．７５ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（２０ｍＬ）中のスルホンアミド６（０．８１ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応媒体を３０分間激しく撹拌した後、５５℃に加熱する。次に、無水アセトニトリル（５ｍＬ）中のヨード化合物４（０．６４ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジポンプを用いて極めてゆっくりと添加する。反応媒体を５５℃で一晩激しく撹拌し続ける。反応媒体を真空蒸発させた後、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に取り込む。有機相を塩水（３×２０ｍＬ）及び蒸留水（３×２０ｍＬ）で続けて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル：７／３、次にジクロロメタン／エーテル：９９／１→９８／２）の後、スルホンアミド７が無色の油の形態で得られる（１ｇ、８０％）。
【００３８】
以下の式を有する化合物７が得られる：
【００３９】
【化９】
【００４０】
Ｒｆ値：（石油エーテル／エーテル：６／４）＝０．５７
ＨＰＬＣ：２．７２分
ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋、８３９．６；［Ｍ＋Ｈ］＋、８１７．６；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、７６１．５；［Ｍ＋Ｈ−２ｔＢｕ］＋、７０５．５；［Ｍ＋Ｈ−３ｔＢｕ］＋、６４９．５
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．１７〜１．３６（５ｓ，３３Ｈ，３ｔＢｕ，２ＣＨ３）；１．７０〜２．００（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２，ＣＨ２b，ＣＨ２b’）；２．０３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３メタ位）；２．１７〜２．２０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；２．４１〜２．４２（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．５２〜２．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８及び６．３Ｈｚ，ＣＨ２）；３．２７〜３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g’）；４．０１〜４．０６（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；４．１０〜４．１３（ｔ，１Ｈ，ＣＨa’）；５．０２〜５．０３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ）；５．１９〜５．２５（１Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＮＨ）；７．２４〜７．２９（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１１．０６；１６．０４；１７．０２；１８．２１；２０．３１；２１．３９；２４．４１；２５．４０；２５．５４；２６．５５；２６．６３；２６．８０；２７．８２；２８．４６；３０．６２；３１．３４；３１．４２；３９．４２；５１．６３；５６．９７；６５．６０；７２．７８；７５．４０；７９．３１；８０．７３；８１．００；１１７．２４；１２３．４８；１２６．４２；１２６．８２；１２７．２３；１３５．１６；１３６．４７；１３６．６６；１５３．７９；１５４．７８；１６９．０６；１６９．６０；１７０．２４。
【００４１】
次いで、化合物７の脱保護、続くこの脱保護した化合物のアミン官能基の保護活性化を以下のようにして行う：
パラジウム炭素（１５０ｍｇ、３０重量％）を、無水ＴＨＦ（７ｍＬ）中に溶解した化合物７（０．４８ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）に添加する。装置内の空気を除去し、３回のアルゴン−真空サイクルによってアルゴンに置き換えた後、３回の水素−真空サイクルによって水素に置き換える。反応媒体を６時間激しく撹拌し続けた後、セライトを通して濾過し、濃縮する。反応混合物を無水ジクロロメタン（５ｍＬ）中に溶解した後、トリエチルアミン（０．２０ｍＬ、１．１８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて無水ジクロロメタン（４ｍＬ）中に溶解した２，２，５，６，７−ペンタメチルクロマンスルホニルクロリド（２３１ｍｇ、０．７６８ｍｍｏｌ）を２時間かけて滴下する。反応媒体を一晩激しく撹拌し続ける。反応媒体を真空下で濃縮した後、エーテル（１０ｍＬ）中に取り込む。有機相をクエン酸の１０％溶液（３×１０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（３×１０ｍＬ）及び蒸留水（３×１０ｍＬ）で続けて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル：６／４）の後、ジスルホンアミド８が無色の油の形態で得られる（４８０ｍｇ、８６％）。
【００４２】
以下の化合物８が得られる：
【００４３】
【化１０】
【００４４】
Ｒｆ値：（石油エーテル／エーテル：６／４）＝０．２７
ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋、９７１．６；［Ｍ＋Ｈ］＋、９４６．６；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］−、８９３．５；［Ｍ＋Ｈ−２ｔＢｕ］＋、８３７．４；［Ｍ＋Ｈ−３ｔＢｕ］＋、７８１．３
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．１３〜１．３３（５ｓ，３９Ｈ，３ｔＢｕ，６ＣＨ３）；１．７１〜１．８２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２）；１．９４〜２．０３（ｍ，１０Ｈ，２ＣＨ３メタ位，ＣＨ２b，ＣＨ２b’）；２．１４〜２．１７（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２g）；２．４１〜２．４２（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．４６〜２．４８（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．５５〜２．５９（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．６及び６．５Ｈｚ，ＣＨ２）；３．４０〜３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．９及び８．７Ｈｚ，ＣＨ２g’）；３．５２〜３．６１（ｍ，１Ｈ，ＣＨa’）；３．９９〜４．０６（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；５．１９〜５．２２（１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ＮＨ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１２．３０；１３．０５；１３．１５；１５．１９；１８．１９；１９．１２；１９．１５；１９．６３；２０．３０；２２．３５；２２．４４；２３．４８；２６．３７；２７．４９；２７．５１；２７．６５；２８．４２；２８．８８；２９．９１；３０．５６；３２．５５；３３．５４；３４．０８；４１．４０；５５．１１；５９．０８；７４．８４；８１．３２；８２．６７；８３．３８；１０３．６８；１１９．２０；１１９．３８；１２５．４６；１２５．５１；１２８．４７；１２９．２４；１３７．３６；１３７．５６；１３８．６８；１３８．７６；１５５．５３；１５５．８４；１７１．１３；１７１．４０；１７２．３１。
【００４５】
化合物４による化合物８の新たなアルキル化を以下のようにして行う：
炭酸セシウム（７５ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（６００μｌ）中のスルホンアミド８（１２１ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）の溶液に不活性雰囲気下で添加する。反応媒体を３０分間激しく撹拌した後、５５℃に加熱する。次に、無水アセトニトリル（６００μｌ）中のヨード化合物４（１０７ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジポンプを用いて極めてゆっくりと添加する。反応媒体を５５℃で一晩激しく撹拌し続ける。反応媒体を真空下で濃縮した後、シクロヘキサン（５ｍＬ）中に取り込む。有機相を蒸留水（３×５ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／エーテル：９７／３）の後、ジスルホンアミド９が無色の油の形態で得られる（９９ｍｇ、６０％）。
【００４６】
以下の化合物９が得られる：
【００４７】
【化１１】
【００４８】
Ｒｆ値：（ジクロロメタン／エーテル：９６／４）＝０．２６
ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋、１２６２．５；［Ｍ＋Ｈ］＋、１２４０．５；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、１１８４．４；［Ｍ＋Ｈ−２ｔＢｕ］＋、１１２８．４；［Ｍ＋Ｈ−３ｔＢｕ］＋、１０７２．４；［Ｍ＋Ｈ−４ｔＢｕ］＋、１０１６．３
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．２２〜１．３７（５ｓ，４８Ｈ，３ｔＢｕ，６ＣＨ３）；１．７０〜１．７５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４及び６．７Ｈｚ，ＣＨ２）；１．７８〜２．０４（ｍ，１２Ｈ，２ＣＨ３メタ位，ＣＨ２b，ＣＨ２b’，ＣＨ２b’’）；２．１７〜２．２０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；２．４０〜２．４４（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．４６〜２．４８（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．５５〜２．５８（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５及び６．６Ｈｚ，ＣＨ２）；３．３３〜３．４４（ｍ，４Ｈ，Ｊ＝ＣＨ２g’，ＣＨ２g’’）；３．９５〜４．０３（２ｍ，３Ｈ，ＣＨa，ＣＨa’，ＣＨa’’；５．００〜５．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ２Ｐｈ）；７．２２〜７．２６（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１２．３０；１３．０５；１３．１５；１５．１９；１８．１９；１９．１２；１９．１５；１９．６３；２０．３０；２２．３５；２２．４４；２３．４８；２６．３７；２７．４９；２７．５１；２７．６５；２８．４２；２８．８８；２９．９１；３０．５６；３２．５５；３３．５４；３４．０８；４１．４０；５５．１１；５９．０８；７４．８４；８１．３２；８２．６７；８３．３８；１０３．６８；１１９．２０；１１９．３８；１２５．４６；１２５．５１；１２８．４７；１２９．２４；１３７．３６；１３７．５６；１３８．６８；１３８．７６；１５５．５３；１５５．８４；１７１．１３；１７１．４０；１７２．３１。
【００４９】
最後に、化合物９の脱保護を以下のようにして行う：
化合物９（７９ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を含有するテフロン（登録商標）反応器に、アニソール（２００μｌ、１０％（ｖ／ｖ））、続いてフッ化水素（２ｍＬ、過剰量）をテフロン（登録商標）ベンチ（Teflon bench）を用いて添加する。反応媒体を０℃で９時間激しく撹拌し続ける。過剰のフッ化水素を水酸化カリウムで中和する。残渣をエーテル（３×３ｍＬ）から粉砕した後、０．１Ｍ塩酸溶液中に取り込む。水を凍結乾燥によって除去すると、純粋な化合物１０が白色の固体の形態で得られる。
【００５０】
以下の式を有する、本発明によるニコチアナミン誘導体である化合物１０が得られる：
【００５１】
【化１２】
【００５２】
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋、３５０．１；［Ｍ−Ｈ−１８］＋、３３２．１
【技術分野】
【０００１】
本発明はニコチアナミン誘導体、及びそれを化学合成又は酵素合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチアナミン（ＮＡ）は全ての高等植物に存在する、タンパク質を構成しない（non-proteinogenic）アミノ酸である。ＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで多くの金属イオン（Ｆｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ）をキレート化することができ、ｉｎ ｖｉｖｏでは植物におけるこれらの金属の恒常性に重要な役割を果たしている。
【０００３】
加えて、ニコチアナミンはアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）を阻害することにより抗高血圧性を有することが示されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００４】
高等植物では、ニコチアナミン生合成はニコチアナミン合成酵素（ＮＡＳ；ＥＣ ２．５．１．４３）によって触媒され、３つのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）分子の三量体形成によって起こる。配列データベース検索によって、高等植物以外の生物、特に真菌及び古細菌におけるＮＡＳの推定ホモログを発見することが可能となった（非特許文献４、非特許文献５）。糸状菌アカパンカビ（Neurospora crassa）においても機能的ＮＡＳの存在が実証されている（非特許文献６）。近年、本発明者らのチーム（非特許文献７）は大腸菌において、真核生物のＮＡＳのホモログである古細菌メタノサーモバクター・サーモオートトロフィカス（Methanothermobacter thermoautotrophicus）の酵素（ＭＴＨ６７５；ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿２７５８１７）を発現させた。この酵素を以下でＭｔＮＡＳと称する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kinoshita et al., Biosci Biotechnol Biochem, 57, 1107-10, 1993
【非特許文献２】Shimizu et al., J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 45, 375-83, 1999
【非特許文献３】Wada et al., Biosci Biotechnol Biochem, 70, 1408-15, 2006
【非特許文献４】Trampczynska et al., FEBS Lett, 580, 3173-8, 2006
【非特許文献５】Herbik et al., Eur J Biochem, 265, 231-9, 1999
【非特許文献６】Trampczynska et al., FEBS Lett, 580, 3173-8, 2006
【非特許文献７】Dreyfus et al., Acta Cryst., F64, 933-5, 2008
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、このメタノサーモバクター・サーモオートトロフィカスの酵素の特性化についての研究を続ける中で、この酵素によって合成される新規の分子を発見した。
【０００７】
この分子（以下、サーモニコチアナミン（ｔｈＮＡ）と称する）は、ニコチアナミンに比べ、さらなるカルボン酸基を含む。
【０００８】
このニコチアナミン誘導体は以下の式を有する：
【０００９】
【化１】
【００１０】
この誘導体は、
ａ）Ｌ−アスパラギン酸のα−ｔｅｒｔ−ブチルエステルのアミン官能基を保護する工程、
ｂ）工程ａ）で得られる化合物のカルボン酸官能基を還元する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られる化合物のアルコール官能基を、好ましくはヨウ素でハロゲン化する工程、
ｄ）Ｌ−グルタミン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルのアミン官能基を保護活性化する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られる化合物を、工程ｃ）で得られる化合物でアルキル化する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られる化合物のアミン官能基を脱保護した後、保護活性化する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られる化合物を、工程ｃ）で得られる化合物でアルキル化する工程、及び
ｈ）工程ｇ）で得られる化合物を完全に脱保護する工程
を含む化学的方法によって有利に合成することも可能である。
【００１１】
サーモニコチアナミンはまた、基質であるＳＡＭ及びグルタミン酸（ＧＬＵ）を、非特許文献７に記載のように精製されるメタノサーモバクター属のＭｔＮＡＳ酵素、又は別の古細菌におけるそのオーソログの１つの存在下でインキュベートすることによって酵素的に合成することができる。
【００１２】
サーモニコチアナミンを、メタノサーモバクター・サーモオートトロフィカス若しくはＭｔＮＡＳのオーソログを発現する別の古細菌の培養物を用いて、又はＭｔＮＡＳ若しくはそのオーソログの１つをコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞（例えば大腸菌）を用いて、上記酵素を発現させることによって合成することも可能である。
【００１３】
本発明によるニコチアナミン誘導体は、ニコチアナミン自体に代えて、又はニコチアナミン自体に加えて、ニコチアナミンの全ての用途に有利に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のニコチアナミン誘導体を合成する化学的方法は、以下の反応スキームに従って行われる：
【００１５】
【化２】
【００１６】
より具体的には、本発明によるニコチアナミン誘導体は、一方では市販品であるＬ−アスパラギン酸のα−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、他方では同じく市販品であるＬ−グルタミン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルから出発して生成される。
【００１７】
出発化合物はしたがって、以下の式を有する化合物（１と称する）である、Ｌ−アスパラギン酸のα−ｔｅｒｔ−ブチルエステルである：
【００１８】
【化３】
【００１９】
次いで、この化合物のアミンの保護を以下のようにして行う：
重炭酸ナトリウム（１３ｇ、１５９ｍｍｏｌ）及びジオキサン（７０ｍＬ）中のクロロギ酸ベンジル（１１．８ｍＬ、６９ｍｍｏｌ）の溶液を、水／ジオキサン混合物（２／１）（１７０ｍＬ）中のアスパラギン酸α−ｔｅｒｔ−ブチル（１０ｇ、５３ｍｍｏｌ）の溶液に２時間かけて添加する。周囲温度で一晩撹拌を行う。反応媒体を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で洗浄した後、０℃でｐＨ＝２となるまで６Ｎ塩酸溶液で酸性にする。水相を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機相を塩水（２００ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、濃縮すると、化合物２が無色の油の形態で得られる（１６．７ｇ、９７％）。
【００２０】
以下の式を有する化合物２が得られる：
【００２１】
【化４】
【００２２】
Ｒｆ値：（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ３７％）＝０．６８
ＨＰＬＣ：１．５６分
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋、３２４．１；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、２６８．１
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．４５（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；２．９５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．５及び１４Ｈｚ，ＣＨ２b）；４．５５（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，ＣＨa）；５．１０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ）；５．８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＮＨ）；７．３５（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）；１０．７（ｂｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：２７．７９；３６．７３；５０．７５；６７．１２；８２．８３；１２８．１１；１２８．２０；１２８．５３；１３６．１２；１５６．０６；１６９．４６；１７６．２５。
【００２３】
次いで、化合物２のカルボン酸官能基の還元を以下のようにして行う：
ジイソプロピルエチルアミン（１０．５ｍＬ、６０．４ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ中の化合物２（１５ｇ、４６．４ｍｍｏｌ）及びＢＯＰ（２７ｇ、６０．４ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加する。反応媒体を色が黄色に変わるまで１０分間激しく撹拌し続けた後、１５分間かけて０℃まで冷却する。次に、反応媒体にＮａＢＨ４（２．３ｇ、６０．４ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。反応混合物を一晩激しく撹拌し続ける。溶媒を蒸発させて、残渣を酢酸エチル（２５０ｍＬ）中に取り込む。溶液を１０％クエン酸溶液（３×１００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３×１００ｍＬ）、次に蒸留水（２×１００ｍＬ）で続けて洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮すると、無色の油が得られる。この化合物３をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル：３／７）によって精製すると、無色の油が得られる（１３．９５ｇ、９６％）。
【００２４】
以下の式を有する化合物３が得られる：
【００２５】
【化５】
【００２６】
Ｒｆ値：（石油エーテル／エーテル：３／７）＝０．４２
ＨＰＬＣ：１．４５分
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋、３１０．２；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、２５４．１
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．４３（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；２．０９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．６及び１５．２Ｈｚ，ＣＨ２b）；３．４８（ｓ，１Ｈ，ＯＨ）；３．８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；４．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；５．１０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ）；５．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＮＨ）；７．３５（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：２７．９；３５．４５；５１．９５；５８．４；６７．０１；８２．４４；１２８．０７；１２８．１３；１２８．１３；１２８．３１；１２９．０１；１３６．１；１５６．７９；１６９．４６；１７１．６８。
【００２７】
次いで、化合物３のアルコールのハロゲン化を以下のようにして行う：
ヨウ素（１４．３ｇ、５６．４ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１４．８ｇ、５６．４ｍｍｏｌ）、さらに１０分後、イミダゾール（９．６ｇ、１４１ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（２６０ｍＬ）中の化合物３（５．８ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で添加する。反応媒体を還流させ、３時間激しく撹拌し続ける。反応混合物が周囲温度に戻った時点で、硫酸水素カリウムのモル溶液（３×１５０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（３×１５０ｍＬ）、及びチオ硫酸ナトリウムの５％溶液（３×１５０ｍＬ）、及び塩水（１５０ｍＬ）で続けて洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濃縮すると、黄色のペーストが得られる。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル：１０／０→８／２）の後、生成物４が黄色の油の形態で得られる（６．２ｇ、７８％）。
【００２８】
以下の式を有する化合物４が得られる：
【００２９】
【化６】
【００３０】
Ｒｆ値：（石油エーテル／酢酸エチル：８／２）＝０．６５
ＨＰＬＣ：
ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋、４４２．０；［Ｍ＋Ｈ］＋、４２０．１；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、３６４．２
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．４５（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；２．１５〜２．４５（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ２b）；３．１５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；４．３５（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；５．１０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ）；５．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＮＨ）；７．３５（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１６．１；２８．４２；３８．４５；５４．２４；５６．１５；６７．８９；８３．５９；１２８．９５；１２９．０３；１２９．２２；１２９．３４；１２９．３８；１３６．９３；１５６．６９；１７１．０３。
【００３１】
これとは別に、Ｌ−グルタミン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物５）を得て、以下の式を有するこの化合物５のアミンの保護活性化を行う：
【００３２】
【化７】
【００３３】
トリエチルアミン（０．２９ｍＬ、２．１０ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のグルタミン酸ｔｅｒｔ−ブチル塩酸塩（０．６２ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。溶液を濾過した後、無水ジクロロメタン（４ｍＬ）中に溶解したトリエチルアミン（０．６０ｍＬ、４．４１ｍｍｏｌ）及び２，２，５，６，７−ペンタメチルクロマンスルホニルクロリド（０．７ｇ、３．３０ｍｍｏｌ）を、シリンジポンプを用いて２時間かけてそれに添加する。反応媒体を一晩激しく撹拌し続ける。反応媒体を真空下で濃縮した後、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に取り込む。有機相をクエン酸の１０％溶液（３×２０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（３×２０ｍＬ）及び蒸留水（３×２０ｍＬ）で続けて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル：８／２）の後、スルホンアミド６が無色の油の形態で得られる（１ｇ、９１％）。
【００３４】
以下の化合物６が得られる：
【００３５】
【化８】
【００３６】
Ｒｆ値：（石油エーテル／エーテル：６／４）＝０．３
ＨＰＬＣ：２．４１分
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋、５２６．３；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、４７０．２；［Ｍ＋Ｈ−２ｔＢｕ］＋、４１４．２
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．１４〜１．２４（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；１．２２〜１．２４（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３）；１．３６（ｓ，９Ｈ，１ｔＢｕ）；１．７０〜１．９９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２メタ位，ＣＨ２b）；２．０３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；２．２７〜２．３３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；２．４７〜２．４９（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．５４〜２．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８及び６．８Ｈｚ，ＣＨ２）；３．６６〜３．６７（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；５．２０〜５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＮＨ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１１．４２；１２．１７；１４．１１；１７．３０；１８．２５；１９．４２；２０．４２；２１．５０；２２．６０；２６．５２；２６．８１；２７．６０；２８．０５；２８．６０；２９．０４；２９．６８；３０．９７；３２．６７；５５．０９；７３．９１；７６．６１；８０．５３；８２．２９；１１８．３２；１２４．６０；１２８．４３；１３６．４２；１３６．６０；１５４．６５；１７１．０７；１７１．９７。
【００３７】
次いで、化合物４による化合物６のアルキル化を以下のようにして行う：
炭酸セシウム（０．７５ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（２０ｍＬ）中のスルホンアミド６（０．８１ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応媒体を３０分間激しく撹拌した後、５５℃に加熱する。次に、無水アセトニトリル（５ｍＬ）中のヨード化合物４（０．６４ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジポンプを用いて極めてゆっくりと添加する。反応媒体を５５℃で一晩激しく撹拌し続ける。反応媒体を真空蒸発させた後、酢酸エチル（２０ｍＬ）中に取り込む。有機相を塩水（３×２０ｍＬ）及び蒸留水（３×２０ｍＬ）で続けて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル：７／３、次にジクロロメタン／エーテル：９９／１→９８／２）の後、スルホンアミド７が無色の油の形態で得られる（１ｇ、８０％）。
【００３８】
以下の式を有する化合物７が得られる：
【００３９】
【化９】
【００４０】
Ｒｆ値：（石油エーテル／エーテル：６／４）＝０．５７
ＨＰＬＣ：２．７２分
ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋、８３９．６；［Ｍ＋Ｈ］＋、８１７．６；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、７６１．５；［Ｍ＋Ｈ−２ｔＢｕ］＋、７０５．５；［Ｍ＋Ｈ−３ｔＢｕ］＋、６４９．５
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．１７〜１．３６（５ｓ，３３Ｈ，３ｔＢｕ，２ＣＨ３）；１．７０〜２．００（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２，ＣＨ２b，ＣＨ２b’）；２．０３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３メタ位）；２．１７〜２．２０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；２．４１〜２．４２（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．５２〜２．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８及び６．３Ｈｚ，ＣＨ２）；３．２７〜３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g’）；４．０１〜４．０６（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；４．１０〜４．１３（ｔ，１Ｈ，ＣＨa’）；５．０２〜５．０３（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｐｈ）；５．１９〜５．２５（１Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＮＨ）；７．２４〜７．２９（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１１．０６；１６．０４；１７．０２；１８．２１；２０．３１；２１．３９；２４．４１；２５．４０；２５．５４；２６．５５；２６．６３；２６．８０；２７．８２；２８．４６；３０．６２；３１．３４；３１．４２；３９．４２；５１．６３；５６．９７；６５．６０；７２．７８；７５．４０；７９．３１；８０．７３；８１．００；１１７．２４；１２３．４８；１２６．４２；１２６．８２；１２７．２３；１３５．１６；１３６．４７；１３６．６６；１５３．７９；１５４．７８；１６９．０６；１６９．６０；１７０．２４。
【００４１】
次いで、化合物７の脱保護、続くこの脱保護した化合物のアミン官能基の保護活性化を以下のようにして行う：
パラジウム炭素（１５０ｍｇ、３０重量％）を、無水ＴＨＦ（７ｍＬ）中に溶解した化合物７（０．４８ｇ、０．５９ｍｍｏｌ）に添加する。装置内の空気を除去し、３回のアルゴン−真空サイクルによってアルゴンに置き換えた後、３回の水素−真空サイクルによって水素に置き換える。反応媒体を６時間激しく撹拌し続けた後、セライトを通して濾過し、濃縮する。反応混合物を無水ジクロロメタン（５ｍＬ）中に溶解した後、トリエチルアミン（０．２０ｍＬ、１．１８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて無水ジクロロメタン（４ｍＬ）中に溶解した２，２，５，６，７−ペンタメチルクロマンスルホニルクロリド（２３１ｍｇ、０．７６８ｍｍｏｌ）を２時間かけて滴下する。反応媒体を一晩激しく撹拌し続ける。反応媒体を真空下で濃縮した後、エーテル（１０ｍＬ）中に取り込む。有機相をクエン酸の１０％溶液（３×１０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（３×１０ｍＬ）及び蒸留水（３×１０ｍＬ）で続けて洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル：６／４）の後、ジスルホンアミド８が無色の油の形態で得られる（４８０ｍｇ、８６％）。
【００４２】
以下の化合物８が得られる：
【００４３】
【化１０】
【００４４】
Ｒｆ値：（石油エーテル／エーテル：６／４）＝０．２７
ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋、９７１．６；［Ｍ＋Ｈ］＋、９４６．６；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］−、８９３．５；［Ｍ＋Ｈ−２ｔＢｕ］＋、８３７．４；［Ｍ＋Ｈ−３ｔＢｕ］＋、７８１．３
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．１３〜１．３３（５ｓ，３９Ｈ，３ｔＢｕ，６ＣＨ３）；１．７１〜１．８２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２）；１．９４〜２．０３（ｍ，１０Ｈ，２ＣＨ３メタ位，ＣＨ２b，ＣＨ２b’）；２．１４〜２．１７（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２g）；２．４１〜２．４２（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．４６〜２．４８（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．５５〜２．５９（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．６及び６．５Ｈｚ，ＣＨ２）；３．４０〜３．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．９及び８．７Ｈｚ，ＣＨ２g’）；３．５２〜３．６１（ｍ，１Ｈ，ＣＨa’）；３．９９〜４．０６（ｍ，１Ｈ，ＣＨa）；５．１９〜５．２２（１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ＮＨ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１２．３０；１３．０５；１３．１５；１５．１９；１８．１９；１９．１２；１９．１５；１９．６３；２０．３０；２２．３５；２２．４４；２３．４８；２６．３７；２７．４９；２７．５１；２７．６５；２８．４２；２８．８８；２９．９１；３０．５６；３２．５５；３３．５４；３４．０８；４１．４０；５５．１１；５９．０８；７４．８４；８１．３２；８２．６７；８３．３８；１０３．６８；１１９．２０；１１９．３８；１２５．４６；１２５．５１；１２８．４７；１２９．２４；１３７．３６；１３７．５６；１３８．６８；１３８．７６；１５５．５３；１５５．８４；１７１．１３；１７１．４０；１７２．３１。
【００４５】
化合物４による化合物８の新たなアルキル化を以下のようにして行う：
炭酸セシウム（７５ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（６００μｌ）中のスルホンアミド８（１２１ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ）の溶液に不活性雰囲気下で添加する。反応媒体を３０分間激しく撹拌した後、５５℃に加熱する。次に、無水アセトニトリル（６００μｌ）中のヨード化合物４（１０７ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジポンプを用いて極めてゆっくりと添加する。反応媒体を５５℃で一晩激しく撹拌し続ける。反応媒体を真空下で濃縮した後、シクロヘキサン（５ｍＬ）中に取り込む。有機相を蒸留水（３×５ｍＬ）で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、真空下で濃縮する。シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／エーテル：９７／３）の後、ジスルホンアミド９が無色の油の形態で得られる（９９ｍｇ、６０％）。
【００４６】
以下の化合物９が得られる：
【００４７】
【化１１】
【００４８】
Ｒｆ値：（ジクロロメタン／エーテル：９６／４）＝０．２６
ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］＋、１２６２．５；［Ｍ＋Ｈ］＋、１２４０．５；［Ｍ＋Ｈ−ｔＢｕ］＋、１１８４．４；［Ｍ＋Ｈ−２ｔＢｕ］＋、１１２８．４；［Ｍ＋Ｈ−３ｔＢｕ］＋、１０７２．４；［Ｍ＋Ｈ−４ｔＢｕ］＋、１０１６．３
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：１．２２〜１．３７（５ｓ，４８Ｈ，３ｔＢｕ，６ＣＨ３）；１．７０〜１．７５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４及び６．７Ｈｚ，ＣＨ２）；１．７８〜２．０４（ｍ，１２Ｈ，２ＣＨ３メタ位，ＣＨ２b，ＣＨ２b’，ＣＨ２b’’）；２．１７〜２．２０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２g）；２．４０〜２．４４（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．４６〜２．４８（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３オルト位）；２．５５〜２．５８（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５及び６．６Ｈｚ，ＣＨ２）；３．３３〜３．４４（ｍ，４Ｈ，Ｊ＝ＣＨ２g’，ＣＨ２g’’）；３．９５〜４．０３（２ｍ，３Ｈ，ＣＨa，ＣＨa’，ＣＨa’’；５．００〜５．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ２Ｐｈ）；７．２２〜７．２６（ｍ，５Ｈ，ａｒｏｍ）
１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：１２．３０；１３．０５；１３．１５；１５．１９；１８．１９；１９．１２；１９．１５；１９．６３；２０．３０；２２．３５；２２．４４；２３．４８；２６．３７；２７．４９；２７．５１；２７．６５；２８．４２；２８．８８；２９．９１；３０．５６；３２．５５；３３．５４；３４．０８；４１．４０；５５．１１；５９．０８；７４．８４；８１．３２；８２．６７；８３．３８；１０３．６８；１１９．２０；１１９．３８；１２５．４６；１２５．５１；１２８．４７；１２９．２４；１３７．３６；１３７．５６；１３８．６８；１３８．７６；１５５．５３；１５５．８４；１７１．１３；１７１．４０；１７２．３１。
【００４９】
最後に、化合物９の脱保護を以下のようにして行う：
化合物９（７９ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を含有するテフロン（登録商標）反応器に、アニソール（２００μｌ、１０％（ｖ／ｖ））、続いてフッ化水素（２ｍＬ、過剰量）をテフロン（登録商標）ベンチ（Teflon bench）を用いて添加する。反応媒体を０℃で９時間激しく撹拌し続ける。過剰のフッ化水素を水酸化カリウムで中和する。残渣をエーテル（３×３ｍＬ）から粉砕した後、０．１Ｍ塩酸溶液中に取り込む。水を凍結乾燥によって除去すると、純粋な化合物１０が白色の固体の形態で得られる。
【００５０】
以下の式を有する、本発明によるニコチアナミン誘導体である化合物１０が得られる：
【００５１】
【化１２】
【００５２】
ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋、３５０．１；［Ｍ−Ｈ−１８］＋、３３２．１
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有することを特徴とするニコチアナミン誘導体：
【化１】
【請求項２】
請求項１に記載のニコチアナミン誘導体を化学合成する方法であって、
ａ）Ｌ−アスパラギン酸のα−ｔｅｒｔ−ブチルエステルのアミン官能基を保護する工程、
ｂ）工程ａ）で得られる化合物のカルボン酸官能基を還元する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られる化合物のアルコール官能基を、好ましくはヨウ素でハロゲン化する工程、
ｄ）Ｌ−グルタミン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルのアミン官能基を保護活性化する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られる化合物を、工程ｃ）で得られる化合物でアルキル化する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られる化合物のアミン官能基を脱保護した後、保護活性化する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られる化合物を、工程ｃ）で得られる化合物でアルキル化する工程、及び
ｈ）工程ｇ）で得られる化合物を完全に脱保護する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１に記載のニコチアナミン誘導体を、基質であるＳ−アデノシルメチオニン及びグルタミン酸をメタノサーモバクター属のＭｔＮＡＳ酵素、又は別の古細菌におけるそのオーソログの１つの存在下でインキュベートすることにより酵素合成する方法。
【請求項１】
以下の式を有することを特徴とするニコチアナミン誘導体：
【化１】
【請求項２】
請求項１に記載のニコチアナミン誘導体を化学合成する方法であって、
ａ）Ｌ−アスパラギン酸のα−ｔｅｒｔ−ブチルエステルのアミン官能基を保護する工程、
ｂ）工程ａ）で得られる化合物のカルボン酸官能基を還元する工程、
ｃ）工程ｂ）で得られる化合物のアルコール官能基を、好ましくはヨウ素でハロゲン化する工程、
ｄ）Ｌ−グルタミン酸のジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルのアミン官能基を保護活性化する工程、
ｅ）工程ｄ）で得られる化合物を、工程ｃ）で得られる化合物でアルキル化する工程、
ｆ）工程ｅ）で得られる化合物のアミン官能基を脱保護した後、保護活性化する工程、
ｇ）工程ｆ）で得られる化合物を、工程ｃ）で得られる化合物でアルキル化する工程、及び
ｈ）工程ｇ）で得られる化合物を完全に脱保護する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１に記載のニコチアナミン誘導体を、基質であるＳ−アデノシルメチオニン及びグルタミン酸をメタノサーモバクター属のＭｔＮＡＳ酵素、又は別の古細菌におけるそのオーソログの１つの存在下でインキュベートすることにより酵素合成する方法。
【公表番号】特表２０１２−５２２０３４（Ｐ２０１２−５２２０３４Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２７２８（Ｐ２０１２−５０２７２８）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０００２６１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１２６９７
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５０６４２３２９１）コミサリア ア レネルジィ アトミーク エ オ ゼネ ルジイ アルテアナティーフ (85)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２０１０／０００２６１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１２６９７
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５０６４２３２９１）コミサリア ア レネルジィ アトミーク エ オ ゼネ ルジイ アルテアナティーフ (85)
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ
【出願人】（５０２２０５８４６）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク (154)
【Ｆターム（参考）】
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