バイオフィルム処理のための方法およびコーティング
細菌によるバイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害する方法であって、対象物品を有効量のＤ−アミノ酸を含む組成物と接触させるステップであって、前記組成物が、基本的に、対応するＬ−アミノ酸を含まず、それにより、バイオフィルムの形成を処理、低減、または阻害するステップを含んでいる。ここで、Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、同時係属中の２０１０年１月８日出願米国仮出願第６１／２９３、４１４号、および２０１０年４月３０日出願米国特許仮出願第６１／３２９、９３０号の優先権を主張する。
【０００２】
この出願は、本出願と同日付出願の「バイオフィルム処理のための方法と組成物」の名称の同時係属中国際特許出願と関連している。
【０００３】
これらの出願の内容は、参照によって組み込まれる。
【０００４】
米国政府の権利に関する記述
本発明は、国立衛生研究所認可ＣＡ２４４８７、ＧＭ０５８２１３、ＧＭ０８２１３７、ＧＭ０８６２５８、およびＧＭ１８５６８に基づいて米国政府の支援により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
バイオフィルムは、表面で定着および増殖し、細胞外ポリマーマトリックスにより覆われている細胞の共同体である。これらは、増殖が遅く、多くは増殖の定常期にある。これらは、全部ではないにしても、多くは病原体により形成されうる。ＣＤＣによれば、米国の全感染症中の６５％が、共通の病原体により形成されるバイオフィルムが原因である。また、バイオフィルムは、飲料水送水系等の工業環境中にも認められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】（なし）
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明の態様は、細菌によるバイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害する方法を特徴とする。一部の実施形態では、この方法は、有効量のＤ−アミノ酸を含む組成物と表面を接触させ、それによりバイオフィルム形成を処理、低減、または阻害することを含む。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性細菌である。特定の実施形態では、細菌は、桿菌、ブドウ球菌、大腸菌、またはシュードモナス細菌である。
他の１つまたは複数の実施形態では、表面は、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙を含む。
【０００８】
他の態様では、本発明は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含む工業用、処理用または、医薬組成物等の組成物を特徴とする。特定の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、組成物は、２つ以上のＤ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリン、またはＤ−トリプトファンを含み、またさらなる実施形態では、後者の組成物が、基本的にデタージェントおよび／またはＬアミノ酸を含まない。他の実施形態では、組成物は、本明細書記載の、例えば、水処理または配管系等の工業バイオフィルムの処理に使用される。
【０００９】
本開示の一態様は、バイオフィルム形成細菌によるバイオフィルム形成を処理、低減、または阻害する方法に関し、この方法は、対象物品を有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物と接触させ、それによりバイオフィルム形成を処理、低減、または阻害することを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００１０】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００１１】
一部の実施形態では、対象物品は、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙からなる群より選択される１つまたは複数の物品を含む。さらなる実施形態では、対象物品は、水凝集物の収集、水再循環、下水輸送、製紙パルプ化および製造、ならびに水処理および輸送に関与する１つまたは複数の構成部材である。さらなる他の実施形態では、対象物品は、排水管、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業用の食品または飲料生産設備、フロア、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、送水管、冷却系、または発電所である。
【００１２】
一部の実施形態では、対象物品は、金属、金属合金、合成高分子、天然ポリマー、セラミック、木材、ガラス、革、紙、織物、非金属無機物、複合材料およびこられの組み合わせからなる群より選択される材料から作られる。
【００１３】
他の実施形態では、接触させる工程は、対象物品にコーティングを適用することを含み、前記コーティングは、有効量のＤ−アミノ酸を含む。さらなる実施形態では、コーティングは、さらに結合剤を含む。一部の実施形態では、コーティングは、コーティング組成物の表面への毛管作用、吹付け、ディッピング、スピンコーティング、積層、塗布、スクリーン印刷、押し出しまたはドローダウンにより達成される。他の実施形態では、接触させる工程は、前駆物質中にＤ−アミノ酸を導入し、前駆物質を処理して対象物品中にＤ−アミノ酸を含浸させることを含む。さらなる実施形態では、接触させる工程は、液体組成物中にＤ−アミノ酸を導入することを含む。
【００１４】
前述の方法の一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシンを含む。別の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む。さらに他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。またさらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００１５】
いずれかの前述の方法の一部の実施形態では、方法は、表面を殺生物剤に接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む。
【００１６】
いずれかの前述の方法の別の実施形態では、組成物は、１％未満のＬ−アミノ酸を含む。
【００１７】
いずれかの前述の方法のさらなる実施形態では、組成物は、基本的にデタージェントを含まない。
【００１８】
さらなる別の本開示の態様は、バイオフィルム形成に耐性を有するコートされた対象物品に関し、少なくとも１つの露出表面にコーティングを含む対象物品を含み、そのコーティングが、有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルム形成を処理、低減、阻害する。ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００１９】
一部の実施形態では、コーティングは、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００２０】
一部の実施形態では、対象物品は、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙からなる群より選択される１つまたは複数の物品を含む。他の実施形態では、対象物品は、水凝集物の収集、水再循環、下水輸送、製紙パルプ化および製造、ならびに水処理および輸送に関与する１つまたは複数の構成部材である。さらなる実施形態では、対象物品は、排水管、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業食品もしくは飲料生産設備、フロア、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、送水管、冷却系、または発電所である。
【００２１】
一部の実施形態では、対象物品は、金属、金属合金、合成高分子、天然ポリマー、セラミック、木材、ガラス、革、紙、織物、非金属無機物、複合材料およびこれらの組み合わせからなる群より選択される材料から作られる。さらなる実施形態では、コーティングは、さらに結合剤を含む。他の実施形態では、コーティングは、ポリマーをさらに含み、Ｄ−アミノ酸は、ポリマー中に分散されている。
【００２２】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸コーティングは、徐放製剤として配合される。
【００２３】
一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシンを含む。さらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む。またさらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。さらに他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００２４】
一部の実施形態では、組成物は、殺生物剤をさらに含む。さらなる実施形態では、殺生物剤は、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、いずれかの前述のコートされた対象物品または組成物は、１％未満のＬ−アミノ酸を含む。他の実施形態では、コートされた対象物品または組成物は、基本的にデタージェントを含まない。
【００２６】
本開示の別の態様は、バイオフィルム形成に耐性を示す組成物に関し、液体基剤、および基剤中に分散した有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それによりバイオフィルム形成の処理、低減または阻害を行い、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、およびＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００２７】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００２８】
一部の実施形態では、液体基剤は、液体、ゲル、ペーストから選択される。
【００２９】
一部の実施形態では、組成物は、水、洗浄用配合物、消毒用配合物、塗布およびコーティング用配合物からなる群より選択される。
【００３０】
さらに別の本開示の態様は、２つ以上のＤ−アミノ酸を含むコーティング組成物に関し、この組成物は、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、およびＤ−トリプトファンからなる群より選択され、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される異なるＤ−アミノ酸であり、さらに高分子結合剤が含まれる。
【００３１】
一部の実施形態では、組成物は、基本的にＤ−アミノ酸に関連する対応するＬ−アミノ酸を含まない。
【００３２】
以下の図は、説明の目的のみで提示されるもであり、制限を加える意図はない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、枯草菌株ＮＣＩＢ３６１０の細胞を示す。この細胞は、１２ウエルプレートを使って液体バイオフィルム誘導培地中、２２℃で３日間（Ａ）または８日間（Ｂ）成長させた。図１Ｃ及び１Ｄは、６〜８日間培養液（Ｃ）または３日間培養液（Ｄ）の馴化培地をＣ１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカラムに適用後、乾燥・再懸濁したメタノール溶出液（１：１００ｖ／ｖ）を添加した培地中で３日間成長させた細胞を示す。ウエルに添加された最終濃度の濃縮因子は、元の馴化培地の容量ベースで１：４希釈であった。図１Ｅは、その因子がメタノールを使ったステップワイズ溶出によりＣ−１８カラムでさらに精製されたことを除いて、図１Ｃと同じである。３μｌの４０％メタノール溶出液を添加した結果を示す。図１Ｆは、新しい培地への添加の前に、４０％メタノール溶出液をプロテイナーゼＫビーズと共に２時間インキュベートし、続いて、遠心分離によりビーズを除去したことを除いて、図１Ｃと同じである。
【図２】図２Ａは、３日間のインキュベーション後に、バイオフィルム誘導培地中で新しく播種した培養液にＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）、Ｌ−チロシン（７ｍＭ）、またはＬ−ロイシン（８．５ｍＭ）を添加した場合のペリクル形成に対する効果を示す。図２Ｂは、ペリクル形成の完全な阻害に必要なＤ−アミノ酸の最小バイオフィルム阻害濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＭＢＩＣ）を示す。図２Ｃは、アミノ酸無添加（未処理）、Ｄ−チロシン（３μＭ）の添加またはＤ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニンおよびＤ−ロイシン（各２．５ｎＭ）の混合物添加に続いて、さらに８時間インキュベーションした３日間培養液を示す。図２Ｄは、野性型またはｙｌｍＥおよびｒａｃＸに対し二重変異体株（ＩＫＧ５５）の８日間培養液由来の馴化培地から得た濃縮Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラム溶出液の効果を示す。図２Ｅは、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、３７℃のグルコース（０．５％）およびＮａＣｌ（３％）を含むＴＳＢ培地中で、２４時間成長させた黄色ブドウ球菌（株ＳＣＯ１）を示す。さらに、ウエルへのアミノ酸無添加（未処理）、Ｄ−チロシン（５０μＭ）添加またはＤ−アミノ酸混合物（各１５ｎＭ）添加の条件を付加した。未結合細胞を洗い流した後、ポリスチレンに結合した細胞をクリスタルバイオレットで染色して可視化した。
【図３】図３Ａは、細胞壁への放射性のＤ−チロシンの組み込みを示す。細胞をバイオフィルム誘導培地中で成長させ、１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。結果を、細胞（Ｌ−プロリンに対しては３６０、０００ｃｐｍ／ｍｌ、Ｄ−チロシンに対しては４６、０００ｃｐｍ／ｍｌ）への全体組み込みのパーセントとして示す。図３Ｂは、機能性ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳融合体含有細胞（ＤＲ−３０（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１０、近刊））からの全蛍光を示す。Ｄ−チロシン（６μＭ）が存在または非存在の場合について、バイオフィルム誘導培地中で定常期になるまで振盪を加えながら細胞を成長させた。図３Ｃは、蛍光顕微鏡によるＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの細胞会合を示す。表示されているように、Ｄ−チロシン（６μＭ）が存在または非存在（未処理）の場合について、野性型細胞およびｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合体含有ｙｑｘＭ６（ＩＫＧ５１）変異体細胞をバイオフィルム誘導培地中で定常期（ＯＤ＝１．５）になるまで振盪を加えながら細胞を成長させ、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。図３Ｄは、電子顕微鏡によるＴａｓＡ線維の細胞会合を示す。Ｄ−チロシンのない場合（画像１と２）またはＤ−チロシン（０．１ｍＭ）添加の場合（画像３〜６）について、２４時間培養液に対し、１２時間追加してインキュベートした。実施例に記載のように、ＴａｓＡ繊維を抗ＴａｓＡ抗体を使って免疫金標識により染色し、透過型電子顕微鏡により可視化した。菌体外多糖の非存在によりＴａｓＡ繊維の画像化が著しく改善されたので、細胞はｅｐｓオペロン（Δｅｐｓ）に対し変異体であった。中実矢印は、繊維バンドルを示し；中空矢印は、個別の繊維を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。拡大画像２、４および６のスケールバーは１００ｎｍである。画像１と２は、細胞に付着した繊維バンドル、画像３、４と６は、個別の繊維および細胞から離脱したバンドルを示し、画像３〜５は、ほとんどまたは全く繊維状物質のない細胞を示す。
【図４】図４Ａは、Ｄ−チロシン含有または非含有の固体（上段画像）または液体（下段画像）バイオフィルム誘導培地で３日間成長させた細胞を示す。図４Ｂは、ＹｑｘＭの簡略アミノ酸配列を示す。下線は、表示した配列変化中でｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６フレームシフト変異が生じたコドンにより特定される残基である。
【図５】図５は、Ｄ−トリプトファン（０．５ｍＭ）、Ｄ−メチオニン（２ｍＭ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）またはＬ−メチオニン（５ｍＭ）を補充した後、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、３日間インキュベートしたＭＳｇｇ培地含有ウエルを示す。
【図６】図６は、Ｄ−チロシン（３μＭ）またはＤ−ロイシン（８．５ｍＭ）を補充後、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、４日間インキュベートした固体ＭＳｇｇ培地を含むプレートを示す。
【図７】図７は、１２ウエルプレート中で成長させ、５日間インキュベートしたＮＣＩＢ３６１０（野性型）およびｙｌｍＥおよびｒａｃＸ（ＩＫＧ１５５）の二重欠失変異体を示す。
【図８】図８は、Ｄ−アミノ酸の細胞成長に与える効果を示す。細胞をＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）を含むＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた。
【図９】図９Ａは、株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺを保持）によるＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺの発現を示し、図９Ｂは、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）を含むＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺを保持）によるＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺの発現を示す。
【図１０】図１０は、緑膿菌バイオフィルム形成のＤ−アミノ酸による阻害を示す。緑膿菌株Ｐ０１４を１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グリセリン（０．２％）およびカザアミノ酸（２０μｇ／ｍｌ）含有Ｍ６３培地中３０℃で４８時間成長させた。アミノ酸無添加（未処理）、Ｄ−チロシン添加またはＤ−アミノ酸混合物の条件をウエルに付加した。ポリスチレンに結合した細胞を、未結合細胞を洗い流した後、クリスタルバイオレットで染色して可視化した。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗い流し、完全に乾燥した。
【図１１】図１１は、個別Ｄ−アミノ酸または４つの混合物と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１２】図１２は、個別Ｄ−アミノ酸または４つの混合物と共にＭ６３培地中で４８時間成長させた緑膿菌のクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１３】図１３は、個別Ｄ−アミノ酸または混合物と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１４】図１４は、Ｌ−アミノ酸と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１５】図１５は、浮遊細菌を除去後Ｄ−アミノ酸を適用したＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルムの代表的画像である。
【図１６】図１６は、浮遊細菌を除去後Ｌ−アミノ酸を適用したＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルムの代表的画像である。
【図１７】図１７は、浮遊細菌を除去後ＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルム内の細胞の定量化である。細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。
【図１８】図１８は、表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に与えるＤ−ａａ混合物（１ｍＭ）の効果を示す。エポキシ表面をＤ／Ｌ−ａａ混合物中に浸漬した後、細菌と２４時間インキュベートした。
【図１９】図１９は、表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に与えるＤ−ａａ混合物（１ｍＭ）の効果を示す。エポキシ表面をＤ／Ｌ−ａａ混合物中に浸漬した後、細菌と２４時間インキュベートした。
【図２０】図２０は、Ｍ６３固体培地上の緑膿菌中のバイオフィルム形成に与えるＤ−ａａの効果を示す。コロニーは、室温で４日間成長させた。
【図２１】図２１は、バイオフィルム誘導条件下における、緑膿菌の６ウエルプレートのボタン中の単一付着細胞のＳｙｔｏｘ染色を示す。
【図２２】図２２は、培地中でＤ−アミノ酸（１００μＭ）またはＬ−アミノ酸（１００μＭ）混合物と共に４８時間成長させたプロテウス・ミラビリスのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図２３】図２３は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸（１ｍＭ）を含む、ショ糖（０．５％）培地を添加したＢＨＩ培地で７２時間成長させたストレプトコッカス・ミュータンスのクリスタルバイオレット染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
特に別義の定義がなければ、本明細書で使われる全ての技術科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験に使用可能であるが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で挙げた全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、説明のみの目的であり、制限する意図はない。
【００３５】
用語の「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本明細書では、本明細書記載の組成物（例えば、予防もしくは処理組成物）の投与、もしくは処理薬の組み合わせ（例えば、予防もしくは処理組成物の組み合わせ）の投与の結果としての、表面上のバイオフィルムの発生または発症の阻害またはバイオフィルムの１つまたは複数の徴候もしくは症状の再発、発症、もしくは発生の防止を指す。
【００３６】
本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細説明および請求項から明らかであろう。当業者には明らかなように、本明細書記載の具体的特徴および実施形態は、他のいずれかの特徴または実施形態と組み合わせることができる。
【００３７】
本発明は、少なくとも一部は、成熟バイオフィルム由来の馴化培地中に存在するＤ−アミノ酸がバイオフィルム形成を防ぎ、既存のバイオフィルム分解の引き金となるという発見に基づいている。標準的アミノ酸は、相互に鏡像関係にあるＬ−またはＤ−アミノ酸と呼ばれる２つの光学的異性体のどちらかの形で存在しうる。Ｌ−アミノ酸は、タンパク質中に見出される大部分のアミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸は細菌のペプチドグリカン細胞壁の成分である。本明細書記載のＤ−アミノ酸は、生存および非生存表面上のバイオフィルムに浸透でき、細菌の表面への付着およびバイオフィルムのさらなる発達を阻害でき、このようなバイオフィルムを剥離させることができおよび／または生物学的マトリックス中のバイオフィルム形成微生物のさらなる増殖を阻害することができ、またはこのような微生物を消滅させることができる。
【００３８】
Ｄ−アミノ酸は、当技術分野で既知であり、既知の技術を使って調製可能である。代表的方法には、例えば、米国特許公開第２００９０２０３０９１号に記載のものが含まれる。Ｄ−アミノ酸は、また、市販品として入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から）。
【００３９】
本明細書記載の方法には、いずれのＤ−アミノ酸も使用可能であり、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、またはＤ−チロシンが、非制限的に含まれる。Ｄ−アミノ酸は、単独でまたは他のＤ−アミノ酸と組み合わせて使用可能である。代表的方法では、２、３、４、５、６、または７以上のＤ−アミノ酸が組み合わせて使用される。好ましくは、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、またはＤ−トリプトファンが、単独または組み合わせて、本明細書記載の方法で使用される。他の好ましい実施形態では、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンが、単独または組み合わせて、本明細書記載の方法で使用される。
【００４０】
Ｄ−アミノ酸は、約０．１ｎＭ〜約１００μＭ、例えば、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約５ｎＭ〜約５μＭ、または約１０ｎＭ〜約１μＭの濃度、例えば、０．１ｎＭ〜１００μＭ、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度で使用可能である。
【００４１】
バイオフィルム形成の阻害または処理に特に有効であると解った代表的Ｄ−アミノ酸組成物、コーティング、または溶液には、Ｄ−チロシンが含まれる。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンは、単独で使用され、例えば、１ｍＭ未満、または１００μＭ未満、または１０μＭ未満の濃度として、または０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度で使用できる。
【００４２】
他の実施形態では、Ｄ−チロシンが１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンと組み合わせて使用される。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンは、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンと組み合わせて使用される。Ｄ−チロシンの１つまたは複数のＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンとの組み合わせは、相乗的となり得、１０μＭ以下、例えば、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約５ｎＭ〜約５μＭ、または約１０ｎＭ〜約１μＭの全体Ｄ−アミノ酸濃度、または０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度でバイオフィルム形成を阻害または処理するのに有効である可能性がある。
【００４３】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、等モルである。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、等モルではない。
【００４４】
一部の実施形態では、組成物、基本的に、Ｌ−アミノ酸を含まない。例えば、組成物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０２５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満、約０．００２５％未満、約０．００１％、またはそれ未満のＬ−アミノ酸を含む。他の実施形態では、組成物は、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００２５％未満、０．００１％未満のＬ−アミノ酸を含む。好ましい実施形態では、Ｌ−アミノ酸のパーセンテージは、対応するＤ−アミノ酸に対する割合である。例えば、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸のラセミ混合物は、５０％Ｌ−アミノ酸を含む。
【００４５】
一部の実施形態では、組成物、基本的に、デタージェントを含まない。例えば、組成物は、約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満、約１重量％未満、約０．５重量％未満、約０．２５重量％未満、約０．１重量％未満、約０．０５重量％未満、約０．０２５重量％未満、約０．０１重量％未満、約０．００５重量％未満、約０．００２５重量％未満、約０．００１重量％未満、またはそれ未満のデタージェントを含む。他の実施形態では、組成物は、全体組成物に対して、約３０重量％未満、２０重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．２５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０２５重量％未満、０．０１重量％未満、０．００５重量％未満、０．００２５重量％未満、０．００１重量％未満のデタージェントを含む。デタージェント、例えば、界面活性剤含有製剤に置いて、界面活性剤が活性試薬、例えば、Ｄ−アミノ酸と相互作用し、往々にして、試薬の有効性に大きな影響を与える可能性がある。一部の実施形態では、特定の界面活性剤型の存在が有効性を変えるかどうかを判定するための選別として、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤および双性イオン界面活性剤に対して試薬の有効性を選別する必要が生じうる。デタージェントの低減または除去が組成物の有効性を増加させおよび／または製剤の合併症を低減する。
【００４６】
バイオフィルム
ほとんどの細菌は、バイオフィルムとして知られる複合体のマトリックス含有多細胞の共同体を形成できる（Ｏ’Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：４９（２０００）；Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３３：１５２（２００９）；Ｋａｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：３１０（２００９））。バイオフィルム関連細菌は、外界からの刺激、例えば、抗生物質から保護されている（Ｂｒｙｅｒｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１００：１（２００８））。しかし、バイオフィルムが熟成するにつれ、栄養素が限定的となり老廃物が蓄積して、バイオフィルム関連細菌は、浮遊実体に戻る方が都合がよくなる（Ｋａｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：３１０（２００９））。従って、バイオフィルムは、有限の寿命を有し、最終的な分解を特徴とする。
【００４７】
ごく一般的には、バイオフィルムは、生存および非生存表面に付着した、生きているまたは死んでいる微生物、特に細菌と、細胞外の高分子物質（ＥＰＳマトリックス）、例えば、多糖類の形のそれらの代謝物とが一緒になった、集合体であると理解されている。浮遊細胞に対しては、通常、優れた増殖阻害または致死の作用を示す抗バイオフィルム物質の活性が、例えば、生物学的マトリックス中への活性物質の不十分な浸透のために、バイオフィルム中で組織化されている微生物に対して大きく低減される可能性がある。
【００４８】
他の単細胞の生物に加えて、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌は、バイオフィルムを産生できる。細菌性バイオフィルムは、コロニーを形成している細胞により産生される細胞外の多糖マトリックス内に包まれた細胞表面付着共同体である。バイオフィルム成長は、一連のプログラムされたステップにより発生し、このステップは、最初の表面への付着、３次元マイクロコロニー形成、およびその後の成熟バイオフィルムの成長を含む。バイオフィルム内の細胞の場所が深くなればなるほど（例えば、細胞がバイオフィルムが付着している固体表面に近いほど、大部分のバイオフィルムマトリックスにより遮蔽され、保護される）、細胞はさらに代謝不活性になる。この生理学的変化と勾配の結果、効率的システムが樹立され、それにより微生物が多様な機能的体質を有する細菌性共同体集団が作られる。また、バイオフィルムは、種々の、多様な非細胞性成分で作られ、これらに限定されないが、炭水化物（単体および複合体）、脂質、タンパク質（ポリペプチドを含む）、および糖類およびタンパク質の脂質複合体類（リポ多糖類およびリポタンパク質）を含んでもよい。
【００４９】
バイオフィルムは、適した成長条件が発生し、微生物に対し生存を保証する選択優位性を提供できるまで、一定時間の間休眠状態での存在を可能とする。しかし、この選択は、バイオフィルムがヒト細菌感染の約６５％に関与すると認められている点で、ヒトの健康に重大な脅威を提起する可能性がある（Ｓｍｉｔｈ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５７：１５３９−１５５０（２００５）；Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：９５−１０８（２００４））。
【００５０】
本明細書記載のように、バイオフィルムは、多種多様の生物学的、医学的、商業的、工業的、およびプロセシング作用に影響を与える可能性がある。工業環境では、バイオフィルムは、表面、例えば、パイプおよびフィルターに付着することができる。バイオフィルムは、熱交換器、油送管、水系、フィルター、等の工業システムにおける生物腐食および生物付着の原因となるために、工業環境では、問題を生ずる（Ｃｏｅｔｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ．３１：２１２−３２）。従って、バイオフィルムは、パイプ中の液体の通過を阻害し、水および他の液体系を詰まらせ、さらに病原菌、原虫類、および真菌のリザーバーの役割をする可能性がある。このように、工業バイオフィルムは、工業処理システムにおける経済的非効率の重要な原因である。さらに、異なる種のバイオフィルム産生細菌がこのようなシステム内で共存する可能性がある。従って、このような系では、複数の種に起因するバイオフィルム形成の可能性がある。
【００５１】
本明細書記載の方法および材料は、多種多様の商業的、工業的、および処理操作、例えば、水処理／加工業において認められる操作に関連したバイオフィルム形成を防ぐまたは減らすことができる。一部の例では、Ｄ−アミノ酸は、このような表面に認められるバイオフィルムに適用できる。他の例では、Ｄ−アミノ酸は、バイオフィルム形成細菌が表面に付着するのを防ぐために使用できる。例えば、表面は、産業機器の表面（例えば、優良製造規範（ＧＭＰ）施設、または食物処理プラント、写真処理現場、等にある設備）、給排水設備の表面、または水域の表面（湖、スイミングプール、海洋、等）でありうる。
【００５２】
表面は、細菌性バイオフィルムの形成を防ぐために使用する前に、Ｄ−アミノ酸でコート、吹き付け、または含浸することができる。このような表面の具体的な非制限的例では、配管、パイプ、および水凝集物収集、下水排水、製紙パルプ化作業、再循環水系（エアコンシステム、クーリングタワー、等）、および、帯水、水取扱、水処理、および水収集系に付随する支持部材が含まれる。Ｄ−アミノ酸の付与により、水の表面またはパイプまたは水処理系の配管表面または水に接触する収集および／または操作系が関与する他の表面のバイオフィルム形成を処理する、防ぐまたは減らすことができる。
【００５３】
バイオフィルム形成細菌
本明細書記載の方法は、バイオフィルムの形成および／または脅威を防ぐ、または遅らせるために使用できる。代表的方法では、バイオフィルムは、バイオフィルム成形細菌により形成される。細菌は、グラム陰性菌種またはグラム陽性細菌性種であってもよい。このような細菌の非制限的例には、以下の属のメンバーが含まれる：アクチノバチルス属のメンバー（例えば、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス）、アシネトバクター属のメンバー（例えば、アシネトバクター・バウマンニ）、エロモナス属のメンバー、ボルデテラ属のメンバー（例えば、百日咳菌、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、またはパラ百日咳菌）、ブレビバシラス属のメンバー、ブルセラ属のメンバー、バクテロイデス属のメンバー（例えば、バクテロイデス・フラジリス）、バークホルデリア属のメンバー（例えば、セパシア菌または類鼻疽菌）、ボレリア属のメンバー（例えば、ライム病ボレリア）、桿菌属のメンバー（例えば、炭疽菌または枯草菌）、カンピロバクター属のメンバー（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ）、キャプノサイトファーガ属のメンバー、カルジオバクテリウム属のメンバー（例えば、カーディオバクテリウム・ホミニス）、シトロバクター属のメンバー、クロストリジウム属のメンバー（例えば、破傷風菌またはクロストリジウム・ディフィシル）、クラミジア属のメンバー（例えば、トラコーマクラミジア、肺炎クラミジア、またはオウム病クラミジア）、エイケネラ属のメンバー（例えば、エイケネラ・コローデンス）、エンテロバクター属のメンバー、エシェリキア属のメンバー（例えば、大腸菌）、フランシセラ属のメンバー（例えば、野兎病菌）、フソバクテリウム属のメンバー、フラボバクテリウム属のメンバー、ヘモフィルス属のメンバー（例えば、軟性下疳菌またはインフルエンザ菌）、ヘリコバクター属のメンバー（例えば、ピロリ菌）、キンゲラ属のメンバー（例えば、キンゲラ・キンゲ）、クレブシエラ属のメンバー（例えば、肺炎桿菌）、レジオネラ属のメンバー（例えば、在郷軍人病菌）、リステリア属のメンバー（例えば、リステリア菌）、レプトスピラ属のメンバー、モラクセラ属のメンバー（例えば、カタル球菌）、モルガネラ属のメンバー、マイコプラズマ属のメンバー（例えば、マイコプラズマ・ホミニスまたは肺炎マイコプラズマ）、マイコバクテリウム属のメンバー（例えば、マイコバクテリウム結核またはらい菌）、ナイセリア属のメンバー（例えば、淋菌または髄膜炎菌）、パスツレラ属のメンバー（例えば、パスツレラ・マルトシダ）、プロテウス属のメンバー（例えば、プロテウス・ブルガリスまたはプロテウス・ミラビリス）、プレボテラ属のメンバー、プレジオモナス属のメンバー（例えば、プレジオモナス・シゲロイデス）、シュードモナス属のメンバー（例えば、緑膿菌）、プロビデンシア属のメンバー、リケッチア属のメンバー（例えば、リケッチア・リケッチイまたは発疹熱リケッチア）、ステノトロフォモナス属のメンバー（例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア）、ブドウ球菌属のメンバー（例えば、ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌）、連鎖球菌属のメンバー（例えば、緑色連鎖球菌、化膿性連鎖球菌（グループＡ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（グループＢ）、ストレプトコッカス・ボビス、または肺炎球菌）、ストレプトマイセス属のメンバー（例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス）、サルモネラ属のメンバー（例えば、腸炎菌、チフス菌、またはネズミチフス菌）、セラチア属のメンバー（例えば、霊菌）、赤痢菌属のメンバー、スピリルム属のメンバー（例えば、鼡咬症スピリルム）、トレポネーマ属のメンバー（例えば、梅毒トレポネーマ）、ベイヨネラ属のメンバー、ビブリオ属のメンバー（例えば、コレラ菌、腸炎ビブリオ、またはビブリオ・バルニフィカス）、エルシニア属のメンバー（例えば、エンテロコリチカ菌、ペスト菌、または仮性結核菌）、およびザントモナス属のメンバー（例えば、ザントモナス・マルトフィリア）。
【００５４】
枯草菌は、特異的に半固体表面上に複合共同体を構築し、静置培養液の空気／液体界面に厚いペリクルを形成する（Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３３：１５２（２００９）；Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：６３８（２００７）；Ｖｌａｍａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２２：９４５（２００８）；Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１））。枯草菌バイオフィルムは、菌体外多糖およびタンパク質ＴａｓＡから成るアミロイド線維で構成される細胞外のマトリックスにより一緒に保持された長鎖細胞から成る（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１）；Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２２９（２００６）；Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１０、近刊））。菌体外多糖は、ｅｐｓＡ−Ｏオペロンによりコードされた酵素により産生され（「ｅｐｓオペロン」）、ＴａｓＡタンパク質は、ｙｑｘＭ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡオペロン（「ｙｑｘＭオペロン」）のプロモーター遠位遺伝子によりコードされる（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６））。
【００５５】
バイオフィルム産生細菌、例えば、本明細書記載の種は、本明細書記載のように、インビトロで、または表面上で、生存患者中に見出すことができる。
【００５６】
用途／配合
Ｄ−アミノ酸組成物は、非生物学的半固形または固体表面上のバイオフィルム形成を減らすまたは防ぐために使用できる。このような表面は、バイオフィルム形成および細菌付着が起こりやすいどのような表面であってもよい。表面の非制限的例には、１つまたは複数の以下の材料から作られる硬質表面が含まれる（これらは任意選択で、例えば、ペンキまたはエナメルでコートされる）：金属、プラスチック、ゴム、板、ガラス、木材、紙、コンクリート、岩石、大理石、石膏およびセラミック材料、例えば、磁器。
【００５７】
特定の実施形態では、表面は、水または、特に、貯留水と接触する表面である。例えば、表面は、給排水設備、産業機器、水凝集物収集装置、下水輸送用設備、水再循環設備、製紙パルプ化設備、ならびに水処理および水輸送設備の表面であってもよい。排水施設の表面の非制限的例には、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業食品および飲料生産設備、およびフロアリングが含まれる。他の表面には、海洋構造物、例えば、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、およびのぞき窓が含まれる。
【００５８】
Ｄ−アミノ酸は、有効量のＤ−アミノ酸の表面への充填またはロードに関連する被覆、コーティング、接触、等のどの既知の手段によっても表面に適用可能である。Ｄ−アミノ酸は、例えば、蒸発により除去してＤ−アミノ酸コーティングを残す適切なキャリア、例えば、液体キャリア、と共に表面に適用可能である。具体的な例では、Ｄ−アミノ酸は、例えば、ポリマー／Ｄ−アミノ酸フィルムを表面に吹付け付けることにより、例えば、ポリマー／Ｄ−アミノ酸溶液中にディッピングまたはこれを表面にスピンコーティングすることにより、または他の共有結合もしくは非共有結合の手段により表面に直接付着される。他の例では、表面は、Ｄ−アミノ酸を吸収する吸収性物質（例えば、ヒドロゲル）でコートされる。
【００５９】
Ｄ−アミノ酸は、病院または医学環境での表面の処理に適している。本明細書記載のＤ−アミノ酸および組成物をコーティング、潤滑剤、洗浄または清浄溶液、等として適用した場合、バイオフィルム形成を阻害またはバイオフィルム形成を低減することができる。
【００６０】
本明細書記載のＤ−アミノ酸は、また、特に、織物繊維材料を保持する場合、の処理に適する。このような材料は、例えば、絹、ウール、ポリアミドまたはポリウレタン、および特に各種セルロース繊維材料の染色されていないおよび染色されたまたは印刷された繊維材料である。このような繊維材料は、例えば、天然セルロース繊維、例えば、綿、リネン、ジュートおよび麻、ならびにセルロースおよび再生セルロースである。紙、例えば、衛生目的で使われる紙にも、１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸を使った抗バイオフィルム特性を付与することもできる。また、不織布、例えば、おむつ／おしめ、生理用ナプキン、パンティーライナー、および衛生用布巾および家庭用品に、抗バイオフィルム特性を付与することもできる。
【００６１】
また、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、特に、工業配合物、例えば、コーティング、潤滑剤等に抗バイオフィルム特性を付与する、または維持する処理をするのにも適している。
【００６２】
また、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、洗浄および清浄配合物、例えば、液体または粉末洗浄剤または柔軟剤にも使用可能である。本明細書記載のＤ−アミノ酸は、また、硬質表面の洗浄と消毒のための家庭用および汎用洗浄剤としても使用可能である。代表的洗浄配合物は、例えば、次の組成を有する：０．０１〜５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、３．０重量％のオクチルアルコール４ＥＯ、１．３重量％の脂肪アルコールＣ８〜Ｃ１０ポリグルコシド、３．０重量％のイソプロパノール、および水添加１００％。
【００６３】
また、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、木材の抗バイオフィルム処理および革の抗バイオフィルム処理、抗バイオフィルム特性を付与した革の保護および革の貯蔵にも使用可能である。本明細書記載のＤ−アミノ酸は、また、化粧品および家庭用品を微生物の被害から保護するためにも使用可能である。
【００６４】
本明細書記載のＤ−アミノ酸は、問題になっている対象物品または対象物品の表面に１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸を組み込むことにより、またはコーティングまたはフィルムの一部としてこれらの表面に抗バイオフィルムを適用することにより、生物付着を防ぐ、または表面の微生物蓄積を除去または管理するのに有用である。このような表面は、海洋環境（淡水、半塩水および塩水環境を含む）と接触する表面、例えば、船体、ドックの表面または循環または通過水システム中のパイプの内面を含む。同様な生物付着を受けやすい他の表面としては、例えば、雨水露出壁、シャワー室の壁、屋根、排水路、プール域、サウナ、例えば、地階またはガレージなどの湿気環境露出フロアおよび壁、、および工具箱およびアウトドア家具さえも挙げられる。米国特許第７、６１８、６９７号（参照により全体が組み込まれる）は、生物付着から表面を保護するコーティングまたはフィルムとして有用な化合物を開示している。
【００６５】
フィルムまたはコーティングの一部として適用する場合は、本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸は、結合剤を含む組成物の一部としてもよい。結合剤は、本抗バイオフィルムと適合する任意のポリマーまたはオリゴマーであってよい。結合剤は、抗付着組成物調製の前のポリマーまたはオリゴマーの形であってもよく、または、基質への適用後を含む調製の間または後の重合により形成されてもよい。特定の適用、例えば、特定のコーティング適用では、適用後の抗付着組成物オリゴマーまたはポリマーを架橋させることが望ましいであろう。本明細書で使われる用語の「結合剤」には、材料、例えば、木材、プラスチック、ガラスおよび他の表面の保護の目的で商業的に使用されているグリコール、オイル、ワックスおよび界面活性剤もまた含まれる。例には、木材用防水剤、ビニル保護剤、保護ワックス、等が挙げられる。
【００６６】
組成物は、コーティングまたはフィルムであってもよい。組成物が、例えば、カレンダー仕上げまたは共押し出しを含む接着剤の使用または溶融塗布により表面に適用される熱可塑性フィルムの場合は、結合剤は、フィルム調製に使用される熱可塑性ポリマーマトリックスである。組成物がコーティングの場合には、組成物は、液体溶液または懸濁液、ペースト、ゲル、オイルとして適用でき、またはコーティング組成物は、固体、例えば、粉末コーティングでもよく、これは、その後、熱、ＵＶ光他の方法により硬化される。
【００６７】
本発明の組成物は、コーティングまたはフィルムでもよいので、結合剤は、コーティング調製またはフィルム調製に使用される任意のポリマーを含むことができる。例えば、結合剤は、熱硬化、熱可塑、エラストマー、元々架橋しているまたは架橋させたポリマーである。熱硬化、熱可塑、エラストマー、元々架橋しているまたは架橋させたポリマーには、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリビニルアセタート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ハロゲン化ビニルポリマー例えば、ＰＶＣ、天然および合成ゴム、アルキド樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル、不飽和ポリアミド、ポリイミド、シリコン含有およびカルバマートポリマー、フッ素化ポリマー、置換アクリルエステル由来、例えば、エポキシアクリラート、ウレタンアクリラートまたはポリエステルアクリラート由来架橋性アクリル樹脂が含まれる。また、ポリマーは、前出材料の混合物でも、共重合体でもよい。
【００６８】
生体適合性コーティングポリマー、例えば、ポリ［−アルコキシアルカノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシアルケノアート］（ＰＨＡＥ）ポリエステル（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５２、６５−７０（２００４））もまた、本発明の結合剤として使用可能である。アルキド樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹脂、シリコーン含有ポリマー、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、フッ素化ポリマーおよびビニルアセタートポリマー、ビニルアルコールおよびビニルアミンは、本発明に有用な通常のコーティング結合剤の非制限的例である。他の既知のコーティング結合剤は、本開示の一部である。
【００６９】
コーティングは、例えば、メラミン樹脂、尿素樹脂、イソシアナート、イソシアヌラート、ポリイソシアナート、エポキシ樹脂、無水物、ポリ酸およびアミンで架橋可能であり、アクセラレータを加えても加えなくてもよい。本明細書記載の組成物は、生物蓄積に好適な条件に暴露される表面に適用される、例えば、コーティングであってもよい。前記コーティング中の本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸の存在が、表面への生物の付着を防ぐ。
【００７０】
本明細書記載のＤ−アミノ酸は、完全なコーティングまたはペンキ配合物、例えば、海洋ゲルコート、セラック、ワニス、ラッカーもしくはペンキの一部であってもよく、または抗付着組成物は、本発明のポリマーと結合剤のみ、または本発明のポリマー、結合剤およびキャリア物質のみを含んでもよい。このようなコーティング配合物または適用において、当技術分野で既知の他の添加物もまた、適する。
【００７１】
コーティングは溶媒ベースでも水性でもよい。水性コーティングは、通常、より環境に優しいと考えられる。一部の例では、コーティングは、本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および結合剤または水ベースコーティングもしくはペンキの水性分散液であってもよい。例えば、コーティングは、１つまたは複数のＤ−アミノ酸およびアクリル、メタクリル酸またはアクリルアミドポリマーもしくはコポリマーまたはポリ［−アルコキシアルカノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシアルケノアート］ポリエステルの水性分散液を含んでもよい。
【００７２】
コーティングは、前にコートされた対象物品上に適用された保護剤コーティング、仕上げ塗装または保護ワックス、等の既にコーティングがなされている表面にも適用可能である。コーティングシステムには、海洋コーティング、木材コーティング、他の金属用コーティングおよびプラスチックおよびセラミック上のコーティングが含まれる。代表的海洋コーティングは、不飽和ポリエステル、スチレンおよび触媒を含むゲルコートである。一部の例では、コーティングは、ハウスペイント、または他の修飾的または保護ペンキである。また、ペンキまたはセメント、コンクリートまたは他の石造物品に適用される他のコーティングであってもよい。コーティングは、地階または基礎用等の防水剤であってもよい。
【００７３】
一部の例では、コーティング組成物は、スピンコーティング、ディップコーティング、スプレーコーティング、へら引き、または刷毛、ローラーまたは他の塗布器を含む任意の従来の手段により表面に塗装できる。乾燥または硬化時間を考慮して適用してもよい。
【００７４】
コーティングまたはフィルムの厚さは、用途に応じて変わるが、当業者ならわずかな試験の後に容易に決定できる。
【００７５】
一部の例では、本明細書記載の組成物は、保護用のラミネートフィルムの形であってもよい。このようなフィルムは、熱硬化、熱可塑、エラストマー、または架橋ポリマーを含んでもよい。これらに限定されないが、このようなポリマーの例には、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリビニルアセタート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ハロゲン化ビニルポリマー、例えば、ＰＶＣ、天然および合成ゴム、アルキド樹脂、エポキシ樹脂、不飽和のポリエステル、不飽和のポリアミド、ポリイミド、フッ素化ポリマー、シリコン含有およびカルバマートポリマーが含まれる。ポリマーは、また、前述の材料の混合物および共重合体であってもよい。
【００７６】
本明細書記載の組成物がプリフォームフィルムである場合は、例えば、接着剤の使用、または表面上への共押し出しにより表面に適用可能である。また、本発明のエステルを採用するのが好都合でもあるシーラントまたはコーキングの使用が必要と思われる締め具を介して機械的に貼り付けることもできる。プラスチックフィルムは、また、カレンダー仕上げ、溶融塗布およびシュリンクラップを含む熱を使った適用が可能である。
【００７７】
他の例では、本明細書記載の組成物は、研磨剤、例えば、家具研磨剤、または分散剤もしくは界面活性剤配合物、例えば、グリコールもしくはミネラルオイル分散剤または例えば、木材保護に使われるような他の配合物の一部であってもよい。有用な界面活性剤の例には、これらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレアート（ＰＳＴ）、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレアート（ＰＳＨ）、ポリオキシエチレン６トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１２トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１８トリデシルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤、トリトン（登録商標）界面活性剤、およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）およびポロキサマー（登録商標）製品シリーズ（ＢＡＳＦ）を含む、ポリオキシエチレンベース界面活性剤が含まれる。他のマトリックス形成成分には、デキストラン、直鎖ＰＥＧ分子（ＭＷ５００〜５、０００、０００）、星形ＰＥＧ分子、コーム型およびデンドリマー状、多分岐ＰＥＧ分子、ならびに類似の直鎖、星形、およびデンドリマーポリアミンポリマー、および種々の炭酸塩化、全フッ素置換（例えば、ＤＵＰＯＮＴ ＺＯＮＹＬ（登録商標）フッ素系界面活性剤）およびシコーン化（例えば、ジメチルシロキサン−エチレンオキシドブロック共重合体）界面活性剤が含まれる。
【００７８】
本明細書記載のＤ−アミノ酸の広範囲の適用を考えると、Ｄ−アミノ酸含有組成物は、他の添加物、例えば、抗酸化剤、ＵＶ吸収剤、ヒンダードアミン、ホスフィットまたはホスホニット、ベンゾフラン−２−オン、チオ相乗剤、ポリアミド安定剤、金属ステアラート、各形成剤、充填剤、強化剤、潤滑剤、乳化剤、染料、顔料、分散剤、他の光学的光沢剤、難燃剤、帯電防止剤、発泡剤、等、例えば、下記に列挙した材料、またはこれらの混合物を含んでもよい。
【００７９】
処置される基質は、無機または有機基質、例えば、金属または金属合金；上述のように元来架橋しているまたは架橋させた熱可塑性、エラストマーポリマー；天然ポリマー、例えば、木材またはゴム；セラミック材料；ガラス；革または他の織物であってもよい。基質は、例えば、非金属無機表面、例えば、シリカ、二酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化鉄、炭素、シリコン、種々のケイ酸塩およびゾルゲル、石造物、および複合材料、例えば、グラスファイバーおよびプラスチック木材（ポリマーと木材削りくず、木粉または他の木材粒子の混合物）であってもよい。
【００８０】
基質は、同じまたは異なる部材の各層からなる多層対象物品であってもよい。コートまたは積層される表面は、既にコーティングまたは積層を適用した露出表面であってもよい。
【００８１】
コートまたは積層される無機または有機基質は、どのような固形形態であってもよい。
【００８２】
例えば、ポリマー基質は、フィルムの形状のプラスチック、射出成形対象物品、押し出し製品、繊維、フェルトまたは織物であってもよい。例えば、耐久財、例えば、壁板、鼻隠し板および郵便受け、の構築組み立てまたは製造に使用される成形または押し出し高分子対象物品は、すべて本Ｄ−アミノ酸の組込みの利益を得ることができる。特定の状況下では、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を、例えば、成形プロセス等の形成の間に高分子対象物品中に組み込むことができる。
【００８３】
本方法から利益が得られるプラスチックには、これらに限定されないが、耐久財または機械部品の構築または製造に使われる下記を含むプラスチックが含まれる。アウトドア家具、ボート、壁板、屋根ふき材、つや出し材料、保護フィルム、ステッカー、シーラント、プラスチック木材および繊維強化複合材料等の複合材料、ディスプレイに使われるフィルムを含む機能性フィルムならびに合成繊維から構築される対象物品、例えばオーニング、例えば、キャンバスまたは帆に使われる繊維およびゴム対象物品、例えば、アウトドアマット、フロアカバー、プラスチックコーティング、プラスチック容器およびパッケージング材料；キッチンおよび浴室用具（例えば、ブラシ、シャワーカーテン、スポンジ、バスマット）、ラテックス、フィルター材料（空気および水フィルター）、医学の分野で使われるプラスチック対象物品、例えば、包帯材、注射器、カテーテル等、いわゆる「医療機器」、手袋およびマットレス。代表的なこのようなプラスチックスは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ＰＶＣ、ＰＯＭ、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリル酸およびメタクリル酸、ポリブタジエン、熱可塑性ポリオレフィン、イオノマー、不飽和のポリエステルおよびＡＢＳ、ＳＡＮおよびＰＣ／ＡＢＳを含むポリマー樹脂の混合物である。
【００８４】
１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸の再循環冷却水中への組込み等の特定の状況では、パイプおよび他の機械的な装置の壁のバイオフィルム蓄積を防ぐために、数ｐｐｍのＤ−アミノ酸の使用で有効である。しかし、浸出に起因する幾分かのロス、アミノ酸に関連する反応による幾分かのロスおよび分解反応等による幾分かのロス等とは、実施に当たり、適用が想定される期間にわたり、Ｄ−アミノ酸が暴露される環境的ストレスを考慮に入れて、有効であると思われる濃度を有する配合物を調製する必要があることを意味する。
【００８５】
例えば、工業用水への適用では、処理される水に対して、約０．００１重量％〜約１０重量％または、例えば、０．００１重量％〜１０重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能であり、しばしば約１０％未満の上限値が使用可能であり、例えば、約５％、約３％、約２％または約１％以下でさえも、多くの環境中で有効である可能性があり、例えば、約０．０１％〜約５％、または約０．０１％〜約２％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸の添加レベルが使用可能である。他の実施形態では、１０％、５％、３％、２％、１％、未満の上限値が使用可能であり、例えば、０．０１重量％〜５重量％、または約．０１重量％〜２重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能である。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すれば、非常に少ない量で、環境中で有効であり、約０．０００００１％〜約０．５％の濃度、例えば、約０．０００００１％〜約０．１％または、約０．０００００１％〜約０．０１％の濃度が、工業用水適用で使用可能である。他の実施形態では、０．０００００１％〜０．５％の濃度、例えば、０．０００００１％〜０．１％または０．０００００１％〜０．０１％濃度が、工業用水適用で使用可能である。
【００８６】
Ｄ−アミノ酸、特に低濃度のものは、摂取の可能性のある用途、例えば、バイオフィルム発生の可能性のある再利用可能水ボトルまたは飲用容器であっても安全に使用可能である。このような水輸送機器の表面は、１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸を含む製剤で洗浄可能であり、または低レベルの１つまたは複数のＤ−アミノ酸を、導管を通過する水の中に導入可能である。例えば、約０．０００１重量％未満または約１重量％までの、典型的には、約０．１重量％未満の１つまたは複数のＤ−アミノ酸をこのような水中に導入できる。他の例では、０．０００１重量％以下または１重量％まで、典型的には、０．１重量％未満の１つまたは複数のＤ−アミノ酸を、このような水の中に導入可能である。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、約０．０００００１％〜約０．１％、例えば、約０．０００００１％〜約０．０１％、または約０．０００００１％〜約０．００１％がこのような用途に使用可能である。別の例では、０．０００００１％〜０．１％、０．０００００１％〜０．０１％、または０．０００００１％〜０．００１％の濃度が、使用可能である。
【００８７】
一部の例では、液体製剤は、約０．０００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜約５０μＭ Ｄ−アミノ酸、例えば、約０．００１μＭ Ｄ−アミノ酸〜約２５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００２μＭ Ｄ−アミノ酸〜約１０μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００３μＭ Ｄ−アミノ酸〜約５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００４μＭ Ｄ−アミノ酸〜約１μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．０１μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．１μＭ Ｄ−アミノ酸、または約０．０２μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．１μＭ Ｄ−アミノ酸の濃度で調製される。他の実施形態では、液体製剤は、０．０００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜５０μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００１μＭ Ｄ−アミノ酸〜２５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００２μＭ Ｄ−アミノ酸〜１０μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００３μＭ Ｄ−アミノ酸〜５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００４μＭ Ｄ−アミノ酸〜１μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．０１μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．１μＭ Ｄ−アミノ酸、または０．０２μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．１μＭ Ｄ−アミノ酸の濃度で調製される。好ましくは、Ｄ−アミノ酸組成物は、ナノモル濃度、例えば、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約５０ｎＭ、またはそれ以上の濃度である。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸組成物は、約５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、または５０ｎＭの濃度である。
【００８８】
コーティングまたはフィルムとして使用される場合は、短期の使用には、少量の１つまたは複数のＤ−アミノ酸の存在でよく、例えば、季節限定または廃棄用途等に使用可能である。一般的に、約０．００１％以下から約５％まで、例えば、約３％まで、または約２％までを、このようなコーティングまたはフィルムに使用可能である。他の実施形態では、０．００重量１％から５重量％まで、または重量３％まで、または２重量％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸を使用可能である。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すれば、多くの環境中で非常に少量で有効であり、約０．０００１％〜約１％、例えば、約０．０００１％〜約０．５％、または約０．０００１％〜約０．０１％の濃度をコーティング適用に対し使用可能である。他の実施形態では、０．０００１重量％〜１重量％、０．０００１重量％〜０．５重量％、または０．０００１重量％〜０．０１重量％の濃度の１つまたは複数のＤ−アミノ酸をコーティング適用に対し使用可能である。
【００８９】
より堅牢な用途、例えば、海洋、プール、シャワーまたは建設用材料へのコーティングに対しては、より高レベルの１つまたは複数のＤ−アミノ酸を使用可能である。例えば、コーティングまたはフィルム配合物ベースで約０．０１％〜約３０％を採用可能である；多くの用途では、約０．０１％〜約１５％、または約０．０１％〜約１０％で有効であり、約０．０１％〜約５％、または約０．０１％〜約１％、または約０．１％以下のＤ−アミノ酸でさえ、使用可能であることが多い。他の実施形態では、０．０１％〜１５％、または０．０１％〜１０％で有効であり、０．０１％〜５％、または０．０１％〜１％、またはただの０．１％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能であることが多い。
【００９０】
成形プラスチック製品への組込みに対しては、約０．００００１％〜約１０％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能で、例えば、重量ベースで、約０．０００１％〜約３％、例えば、約０．００１％から約１％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能でありうる。一部の実施形態では、０．００００１％〜１０％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能であり、または０．０００１％〜３％、または０．００１％から１％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能である。すでに成形済みの製品または線維の表面中にＤ−アミノ酸が含浸された状況では、表面に存在するＤ−アミノ酸の実際の量は、基質材料、含浸組成物の配合、および含浸ステップの間に使われた時間と温度に依存すると思われる。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、重量ベースで、約０．０００１％〜約１％、例えば、約０．０００１％〜約０．１％、もしくは約０．０００１％〜約０．０１％の濃度がプラスチックスに使用可能である。他の実施形態では、０．０００１重量％〜１重量％、もしくは０．０００１重量％〜０．１重量％、もしくは、０．０００１重量％〜０．０１重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸をプラスチックに使用可能である。
【００９１】
Ｄ−アミノ酸を使った処理によるバイオフィルムの阻害または減少は、当技術分野で充分に確立された技術を使って測定できる。これらの技術は、吸着生物の発色を測定し、顕微鏡法を使ってインビボで微生物を観察することにより細菌の付着を評価すること、または毒性試薬に応答したバイオフィルム中の細胞死をモニターすることを可能にする。処理後、バイオフィルムは、バイオフィルムに覆われている表面積、厚さ、および一貫性（例えば、バイオフィルムの健全性）を減らすことができる。バイオフィルムアッセイの非制限的例には、マイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイ、蛍光ベースバイオフィルムアッセイ、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：３６９３-３７０１（２００５）による静的バイオフィルムアッセイ、空気液体界面アッセイ、コロニーバイオフィルムアッセイ、およびＫａｄｏｕｒｉ Ｄｒｉｐ−Ｆｅｄバイオフィルムアッセイ（Ｍｅｒｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．、（２００５）微生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１．Ｂ．１．１−１．Ｂ．１．１７）が含まれる。このようなアッセイは、バイオフィルム形成の破壊または阻害に対するＤ−アミノ酸の活性の測定に使用できる（Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７（６）：６６３−７２；Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００６）Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ５（１）：３２−６）。
【００９２】
一部の例では、Ｄ−アミノ酸は、第２の試薬、例えば、殺生物剤、抗生物質と組み合わせて使用し、バイオフィルムを処理するまたはバイオフィルムの形成を防ぐことができる。抗生物質は、順次または同時にＤ−アミノ酸と組み合わせることができる。例えば、本明細書記載の組成物のいずれかを１つまたは複数のＤ−アミノ酸と、１つまたは複数の第２の試薬とを含むように処方することができる。
【００９３】
抗生物質は、細菌の増殖を阻害する、または細菌を死滅させる当業者に既知の任意の化合物でよい。有用な抗生物質の非制限的例には、リンコサミド（クリンダマイシン）；クロラムフェニコール；テトラサイクリン（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン）；アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン）；ベータ−ラクタム（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アズトレオナム）；糖ペプチド抗生物質（例えば、バンコマイシン）；ポリペプチド抗生物質（例えば、バシトラシン）；マクロライド（エリスロマイシン）、アンフォテリシン；スルホンアミド（例えば、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファシチン、スルファドキシン、マフェナイド、ｐ‐アミノ安息香酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾール）；メテナミン；ニトロフラントイン；フェナゾピリジン；トリメトプリム；リファンピシン；メトロニダゾール；セファゾリン；リンコマイシン；スペクチノマイシン；ムピロシン；キノロン（例えば、ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、ペルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、レボフロキサシン）；ノボビオシン；ポリミキシン；グラミシジン；および抗シュードモナス（例えば、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリンカルベニシリン）またはそれらのいずれかの塩もしくは変異体が含まれる。このような抗生物質は、市販品として、例えば、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ、Ｉｎｃ．（Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ、ＮＪ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）、およびＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）から入手可能である。使用される抗生物質は、細菌感染のタイプに依存する。
【００９４】
追加の既知の殺生物剤には、トリクロサン、二酸化塩素、ビグアナイド、クロルヘキシジン、キシリトール、等が含まれる。
【００９５】
抗菌剤の有用な例には、これらに限定されないが、次のものが含まれる：ピリチオン、特に、亜鉛錯体（ＺＰＴ）；Ｏｃｔｏｐｉｒｏｘ（登録商標）；ジメチルジメチロールヒダントイン（Ｇｌｙｄａｎｔ（登録商標））；メチルクロロイソチアゾリノン／メチルイソチアゾリノン（Ｋａｔｈｏｎ ＣＧ（登録商標））；ナトリウムスルフィット；ナトリウムビスルフィット；イミダゾリジニル尿素（Ｇｅｒｍａｌｌ １１５（登録商標））、ジアゾリジニル尿素（Ｇｅｒｍａｉｌｌ ＩＩ（登録商標））；ベンジルアルコール；２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１、３−ジオール（Ｂｒｏｎｏｐｏｌ（登録商標））；ホルマリン（ホルムアルデヒド）；ヨードプロピニルブチルカルバマート（Ｐｏｌｙｐｈａｓｅ Ｐ１００（登録商標））；クロルアセトアミド；メタンアミン；メチルジブロモニトリルグルタロニトリル（１、２−ジブロモ−２、４−ジシアノブタンまたはＴｅｋｔａｍｅｒ（登録商標））；グルタルアルデヒド；５−ブロモ−５−ニトロ−１、３−ジオキサン（Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標））；フェネチルアルコール；ｏ−フェニルフェノール／ナトリウムｏ−フェニルフェノール；ナトリウムヒドロキシメチルグリシナート（Ｓｕｔｔｏｃｉｄｅ Ａ（登録商標））；ポリメトキシ二環式オキサゾリジン（ＮｕｏｓｅｐｔＣ（登録商標））；ジメトキサン；チメロサール；ジクロロベンジルアルコール；カプタン；クロルフェネシン；ジクロロフェン；クロロブタノール；グリセリルラウラート；ハロゲン化ジフェニルエーテル；２、４、４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシ−ジフェニルエーテル（トリクロサン（登録商標）またはＴＣＳ）；２、２’−ジヒドロキシ−５、５’−ジブロモ−ジフェニルエーテル；フェノール性化合物；フェノール；２−メチルフェノール；３−メチルフェノール；４−メチルフェノール；４−エチルフェノール；２、４−ジメチルフェノール；２、５−ジメチルフェノール；３、４−ジメチルフェノール；２、６−ジメチルフェノール；４−ｎ−プロピルフェノール；４−ｎ−ブチルフェノール；４−ｎ−アミルフェノール；４−ｔｅｒｔ−アミルフェノール；４−ｎ−ヘキシルフェノール；４−ｎ−ヘプチルフェノール；モノおよびポリアルキルおよび芳香族ハロフェノール；ｐ−クロロフェノール；メチルｐ−クロロフェノール；エチルｐ−クロロフェノール；ｎ−プロピルｐ−クロロフェノール；ｎ−ブチルｐ−クロロフェノール；ｎ−アミルｐ−クロロフェノール；ｓｅｃ−アミルｐ−クロロフェノール；シクロヘキシルｐ−クロロフェノール；ｎ−ヘプチルｐ−クロロフェノール；ｎ−オクチルｐ−クロロフェノール；ｏ−クロロフェノール；メチルｏ−クロロフェノール；エチルｏ−クロロフェノール；ｎ−プロピルｏ−クロロフェノール；ｎ−ブチルｏ−クロロフェノール；ｎ−アミルｏ−クロロフェノール；ｔｅｒｔ−アミルｏ−クロロフェノール；ｎ−ヘキシルｏ−クロロフェノール；ｎ−ヘプチルｏ−クロロフェノール；ｏ−ベンジルｐ−クロロフェノール；ｏ−ベンジル−ｍ−メチルｐ−クロロフェノール；ｏ−ベンジル−ｍ；ｍ−ジメチルｐ−クロロフェノール；ｏ−フェニルエチルｐ−クロロフェノール；ｏ−フェニルエチル−ｍ−メチルｐ−クロロフェノール；３−メチルｐ−クロロフェノール；３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−エチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−ｎ−プロピル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−イソ−プロピル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−エチル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ｓｅｃ−ブチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−イソ−プロピル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ジエチルメチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−イソ−プロピル−２−エチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−ｓｅｃ−アミル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；２−ジエチルメチル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ｓｅｃ−オクチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール：ｐ−ブロモフェノール；メチルｐ−ブロモフェノール；エチルｐ−ブロモフェノール；ｎ−プロピルｐ−ブロモフェノール；ｎ−ブチルｐ−ブロモフェノール；ｎ−アミルｐ−ブロモフェノール；ｓｅｃ−アミルｐ−ブロモフェノール；ｎ−ヘキシルｐ−ブロモフェノール；シクロヘキシルｐ−ブロモフェノール；ｏ−ブロモフェノール；ｔｅｒｔ−アミルｏ−ブロモフェノール；ｎ−ヘキシルｏ−ブロモフェノール；ｎ−プロピル−ｍ、ｍ−ジメチルｏ−ブロモフェノール；２−フェニルフェノール；４−クロロ−２−メチルフェノール；４−クロロ−３−メチルフェノール；４−クロロ−３、５−ジメチルフェノール；２、４−ジクロロ−３、５−ジメチルフェノール；３、４、５、６−テラブロモ−２−メチルフェノール；５−メチル−２−ペンチルフェノール；４−イソプロピル−３−メチルフェノール；パラ−クロロ−メタ−キシレノール（ＰＣＭＸ）；クロロチモール；フェノキシエタノール；フェノキシイソプロパノール；５−クロロ−２−ヒドロキシジフェニルメタン；レゾルシノールおよびその誘導体；レゾルシノール；メチルレゾルシノール；エチルレゾルシノール；ｎ−プロピルレゾルシノール；ｎ−ブチルレゾルシノール；ｎ−アミルレゾルシノール；ｎ−ヘキシルレゾルシノール；ｎ−ヘプチルレゾルシノール；ｎ−オクチルレゾルシノール；ｎ−ノニルレゾルシノール；フェニルレゾルシノール；ベンジルレゾルシノール；フェニルエチルレゾルシノール；フェニルプロピルレゾルシノール；ｐ−クロロベンジルレゾルシノール；５−クロロ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；４’−クロロ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；５−ブロモ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；４’−ブロモ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；ビスフェノール酸化合物；２、２’−メチレンビス−（４−クロロフェノール）；２、２’−メチレンビス−（３、４、６−トリクロロフェノール）；２、２’−メチレンビス（４−クロロ−６−ブロモフェノール）；ビス（２−ヒドロキシ−３、５−ジクロロフェニル）スルフィド；ビス（２−ヒドロキシ−５−クロロベンジル）スルフィド；安息香酸エステル（パラベン）；メチルパラベン；プロピルパラベン；ブチルパラベン；エチルパラベン；イソプロピルパラベン；イソブチルパラベン；ベンジルパラベン；ナトリウムメチルパラベン；ナトリウムプロピルパラベン；ハロゲン化カルバニリド；３、４、４’−トリクロロカルバニリド（トリクロカーバン（登録商標）またはＴＣＣ）；３−トリフルオロメチル−４、４’−ジクロロカルバニリド；３、３’、４−トリクロロカルバニリド；クロルヘキシジンおよびそのジグルコナート；ジアセタートおよびジヒドロクロリド；ウンデセン酸；チアベンダゾール、ヘキセチジン；ポリ（ヘキサメチルエネビグアニド）塩酸塩（Ｃｏｓｍｏｃｉｌ（登録商標））；銀化合物、例えば、有機銀塩またはＪＭ Ａｃｔｉｃａｒｅ（登録商標）および微粒子化した銀粒子等のそれらの製剤を含む無機銀塩、銀塩化物。
【００９６】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これは、請求項に記載の本発明の範囲を制限するものではない。室温は、２０〜２５℃の範囲の温度を示す。
【実施例】
【００９７】
材料と方法
株と培地。 Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃またはＭＳｇｇ培地（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１６２１（２００１））中、２３℃で枯草菌ＮＣＩＢ ３６１０およびその誘導体を成長させた。固形培地には、１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒを添加した。必要な場合は、枯草菌の増殖用に抗生物質を次の濃度で添加した：テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、およびエリスロマイシン５μｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍｌ。
【００９８】
本実験で使った株：
全枯草菌株は、強固なバイオフィルムを形成する野生株のＮＣＩＢ３６１０の誘導体である（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１）） ；
株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺ ｃａｔ）（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６）） ；
株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺ ｓｐｅｃ）（Ｃｈｕｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６）） ；
株ＩＫＧ５５（ΔｒａｃＸ：：ｓｐｅｃ ΔｙｌｍＥ：：ｔｅｔＲ） ；
株ＤＲ−３０（ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｃａｔ）；
株ＩＫＧ４０（ｙｑｘＭ２）；
株ＩＫＧ４４（ｙｑｘＭ６）；
株ＩＫＧ５０（ｙｑｘＭ２ ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）；
株ＩＫＧ５１（ｙｑｘＭ６ ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）；
ブドウ球菌ＳＣ０１（Ｋｏｌｔｅｒ ｌａｂコレクション由来）。
【００９９】
株構築。標準的手法を使って株を構築した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ、２００１）。ロングフランキングＰＣＲ変異誘発を使ってΔｒａｃＸ：：ｓｐｅｃおよびΔｙｌｍＥ：：ｔｅｔＲを生成した（Ｗａｃｈ、Ｙｅａｓｔ １２：２５９（１９９６））。ＤＮＡを、コンピテント細胞のＤＮＡ媒介形質転換により、株ＰＹ７９誘導体中に導入した（Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：３１８（１９７８））。ＳＰＰ１ファージ媒介形質導入を使って、抗生物質耐性結合変異をＰＹ７９誘導体からＮＣＩＢ ３６１０中に導入した（Ｙａｓｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４：１３４３（１９７４））。
【０１００】
試薬。 アミノ酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。１４Ｃ−Ｄ−チロシンおよび１４Ｃ−Ｌ−プロリンをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０１０１】
コロニーおよびペリクル形成。固形培地上へのコロニー形成形成のために、細胞を最初にＬＢ培地中で指数増殖期迄増殖し、３μｌの培養液を１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ含有固形ＭＳｇｇ培地上に配置した。プレートを２３℃でインキュベートした。液体培地中のペリクル形成のために、細胞を指数増殖期迄成長させ、１２ウエルプレート（ＶＷＲ）中で、６μｌの培養液を６ｍｌの培地と混合した。プレートを２３℃でインキュベートした。コロニーとペリクルの画像をＳＰＯＴカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）で撮影した。
【０１０２】
馴化培地の調製。ＬＢ培地中で細胞を指数増殖期まで成長させた。０．１ｍｌの培養液を１００ｍｌのＭＳｇｇ培地に添加し、５００ｍｌビーカー中、２３℃で振盪を加えずに成長させた。次に、遠心分離を使って８、０００ｒｐｍ、１５分間ペリクルおよび馴化培地を集めた。馴化培地（上清液）を取りだし、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾液を４℃で貯蔵した。さらなる精製のために、Ｃ−１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカートリッジを使って、５％毎のステップの０％〜１００％メタノールによる段階的溶出により、バイオフィルム阻害活性を分別した。
【０１０３】
馴化培地中のＤ−アミノ酸の特定および定量化。（Ａ）アミノ酸の定量化。Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＴｒｐの標準溶液を種々の濃度（０．００１〜０．２ｍＭ）で調製した。これらの溶液を０％〜６０％から１００％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸含有）のステップ勾配溶媒系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ ４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）の（０−１２−２０分）の条件でＬＣ／ＭＳで分析し、イオンカウント積分により各アミノ酸濃度の検量線を得た。馴化培地試料を、全４つのキラルアミノ酸の全体濃度測定と同じ方法でＬＣ／ＭＳを使って分析した。（Ｂ）Ｄ−アミノ酸の特定。試料をＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥し、１００μＬの１Ｎ ＮａＨＣＯ３に溶解した。１０ｍｇ／ｍＬのＬ−ＦＤＡＡ（Ｎ−（２、４−ジニトロ−５−フルオロ−フェニル）−Ｌ−アラニンアミド）溶液をアセトン中で調製し、５０μＬのアセトン溶液を１Ｎ ＮａＨＣＯ３中の試料に添加した。反応混合物を８０℃で５分間インキュベートし、５０μＬの２Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた。誘導体を、１０％〜１００％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸含有）の勾配溶媒系を使って３０分間にわたりＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣ／６１３０シリーズＭＳ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）を使って分析した。Ｌ−ＦＤＡＡ−アミノ酸の保持時間をＬ−ＦＤＡＡ真性標準アミノ酸比較した。
【０１０４】
クリスタルバイオレット染色。細胞を６ウエルプレートで成長させたこと以外は、以前記載したのと同様にクリスタルバイオレット染色を行った（Ｏ’Ｔｏｏｌｅｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２９５（１９９８））。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗浄し、完全に乾燥した。
【０１０５】
蛍光顕微鏡観察。蛍光顕微鏡分析用として、１ｍｌの培養液を採取した。細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、５０μｌのＰＢＳ緩衝液中に懸濁した。カバースライドをポリＬ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で前処理した。試料をＯｌｙｍｐｕｓワークステーションＢＸ６１顕微鏡を使って調査した。自動化ソフトウェアプログラムＳｉｍｐｌｅＰＣＩを使って画像を取り込み、ＭｅｔａＭｏｒｐｈプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使って解析した。
【０１０６】
透過型電子顕微鏡観察および免疫標識。試料を蒸留水で希釈し、炭素またはホルムバール／炭素被覆グリッド上に吸着させた。真空エバポレーター中でグロー放電で使用する前にグリッド表面を親水性にした。試料がフィルム表面上に吸着されるとすぐに、過剰試料を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）で拭き取り、グリッドを５μｌの染色溶液（１〜２％水性ウラニルアセタート）上に数分間浮かべた後、拭き取った。試料を乾燥し、Ｔｅｃｎａｉ（登録商標）Ｇ2ＳｐｉｒｉｔＢｉｏＴＷＩＮ顕微鏡を使い、加速電圧８０ＫＶで調査した。ＡＭＴ ２ｋ ＣＣＤカメラで画像を撮影した。
【０１０７】
ＴａｓＡの免疫局在性のために、ニッケルグリッド上の希釈試料を０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ中の１％脱脂粉ミルクから成るブロッキング緩衝液上に３０分間浮かべ、ブロッキング緩衝液で１：１５０に希釈した抗ＴａｓＡ一次抗体と共に２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ抗ウサギ２０ｎｍ金二次抗体（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）に１時間暴露し洗浄した。全てのグリッドをウラニルアセタートおよび鉛シトラートで染色した後、上述のように観察した。
【０１０８】
β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイ。細胞をＭＳｇｇ培地中、３７℃でウォーターバスを使って浸透を加えながら培養した。１ｍｌの培養液を各時点で採取した。β−ガラクトシダーゼ活性を以前に記載の方法と同様に測定した（Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：２５４（２００８））。
【０１０９】
アミノ酸の細胞壁への組込み。増殖の指数増殖期の中間点で５０ｍｌの培養液中の細胞を遠心分離により採取し、０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、５ｍｌの同じ緩衝液中に再懸濁した。細胞を、１０μＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリンで処理し、３７℃で２時間、さらにインキュベートした。全細胞および細胞壁画分の放射能をモニターし、間隔を置いて試料を取り出した。全細胞中への取り込みの測定用として、０．１ｍｌの試料を採取した。細胞壁への取り込みの測定用として、０．５ｍｌの試料を採取した。細胞を遠心分離により採取し、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム含有ＳＭ緩衝液［０．５Ｍショ糖、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭカリウムホスファート、ｐＨ（６．８）］中に再懸濁した。次に、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、得られたプロトプラストを５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離より取り出し、細胞壁物質を上清液中に残した。細胞壁画分はタンパク質を含まないことが、抗シグマＡ抗体を使った免疫ブロット法分析により確認された。最後に、１０ｍｌの５％トリクロロ酢酸を全細胞試料および細胞壁物質に添加し、氷上で少なくとも３０分間維持した。ＴＣＡ不溶性物質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（０．２２μｍ孔径、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に採取し、５％ＴＣＡで洗浄した。フィルターを風乾し、シンチレーションバイアル中に置き、シンチレーションカウンターを使って、ＴＣＡ不溶性物のカウント／分を測定した。
【０１１０】
実施例１．枯草菌により形成されたバイオフィルム中のＤ−アミノ酸の選別
枯草菌は、バイオフィルムを誘導培地中での３日間のインキュベーション後の静置培養空気／液体界面に分厚いペリクルを形成する（図１Ａ）。しかし、追加の３から５日のインキュベーションにより、ペリクルは、その構造的健全性を失う（図１−Ｂ）。成熟バイオフィルムが、バイオフィルム分解の引き金を引く因子を産生するのかどうかを調べるために、馴化培地の濃縮および部分精製抽出物の新しい培地を添加した場合のペリクル形成に与える効果をアッセイした。この目的のために、８日間培養液由来の馴化培地をＣ１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカラムに負荷した。次に、そのカラムからの濃縮した溶出液を、新しく播種した培養液に添加した。等容量の馴化培地由来の物質の２５％に相等する濃縮溶出液の量が、ペリクル形成を防ぐのに充分であった（図１Ｃ）。対照としての、３日間培養液由来の馴化培地を使って調製した追加の濃縮溶出液は、ペリクル形成に対しほとんどまたは全く効果を示さないことが観察された（図１Ｄ）。さらなる因子の精製は、メタノールの濃度増加と共にカートリッジを段階的に溶出することにより達成される。４０％メタノールでの溶出により、ペリクル形成の阻害に対し高度に活性な画分が得られた（図１Ｅ）。しかも、この物質は、細胞成長にはほとんどまたは全く影響を与えなかった。バイオフィルム阻害活性は、１００℃で２時間の加熱およびプロテイナーゼＫ処理に耐性を示した（図１Ｆ）。
【０１１１】
Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンが、液体および固形培地の両方で、枯草菌によるバイオフィルム形成を阻害するものとして選別された（図２Ａ、５、６）。図２Ａは、バイオフィルムを誘導する培地中の新しく播種した培養液中へのＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）、Ｌ−チロシン（７ｍＭ）、またはＬ−ロイシン（８．５ｍＭ）の添加の、３日間のインキュベーション後のペリクル形成に対する効果を示す。Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンの両方が、対応するＬ−アミノ酸に比較して、バイオフィルム成長に対する有意な阻害を示した。同様に、図５は、Ｄ−トリプトファン（０．５ｍＭ）、Ｄ−メチオニン（２ｍＭ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）またはＬ−メチオニン（５ｍＭ）を補充したＭＳｇｇ培地を含み、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、３日間インキュベートしたウエルを示す。Ｄ−アミノ酸のみが、バイオフィルム形成の阻害に対し活性であった。
【０１１２】
図６は、Ｄ−チロシン（３μＭ）またはＤ−ロイシン（８．５ｍＭ）を補充した固形ＭＳｇｇ培地を含み、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、４日間インキュベートしたプレートを示す。Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシン補両方がバイオフィルム形成を阻害した。
【０１１３】
Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンは、対応するＬ−アミノ酸に比較して、バイオフィルム成長に対する有意な阻害を示した。対照的に対応するＬ−異性体および他のアミノ酸のＤ−異性体、例えば、Ｄ−アラニンおよびＤ−フェニルアラニンは、枯草菌に対するバイオフィルム阻害アッセイで有効ではなかった。
【０１１４】
次に、バイオフィルム形成を防ぐのに必要な最小濃度（ＭＩＣ：最小阻害濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））を測定した。図２Ｂに示すように、それぞれのＤ−アミノ酸は、活性が変わり、Ｄ−チロシンが最も有効であった。Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−ロイシンは、約１ｍＭのＭＩＣであり、一包、Ｄ−チロシンは、約１００ｎＭのＭＩＣである。著しいのは、全ての４つのＤ−アミノ酸の混合物（等モル量の）は、特に強力で、１０ｎＭ未満のＭＢＩＣであった。従って、Ｄ−アミノ酸は、相乗的に作用する。Ｄ−アミノ酸は、バイオフィルム形成を阻害するのみでなく、破壊された既存バイオフィルムを破壊した。図２Ｃは、３日間培養液を示し、これに対し、どのアミノ酸も添加されない（未処理）、またはＤ−チロシン（３μＭ）が添加された、またはＤ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニンおよびＤ−ロイシン（各２．５ｎＭ）の混合物が添加されたものに対し、続いて、さらに８時間インキュベーションを行った。Ｄ−チロシンまたは４つのＤ−アミノ酸の混合物の追加により、８時間の間に、ペリクルの顕著な崩壊が起こった。
【０１１５】
Ｄ−アミノ酸は、これらのアミノ酸のα−炭素立体中心をＬ−型からＤ−型へ変換する酵素であるアミノ酸ラセマーゼにより生成される（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：１０３（２００３））。バイオフィルム阻害因子はＤ−アミノ酸であるという考えと一致する遺伝的証拠は、ｙｌｍＥおよびｒａｃＸ、遺伝子の変異体を使って得られ、その予測された産物は、既知のラセマーゼに類似の配列を示した。ｙｌｍＥまたはｒａｃＸ単独に対する株変異体は、ペリクル分解の中程度の遅延を示した（デーは示さず）。図７は、１２ウエルプレート中で成長させ、５日間インキュベートした、ＮＣＩＢ３６１０（ＷＴ）ならびにｙｌｍＥおよびｒａｃＸ（ＩＫＧ１５５）に対し２重に欠失した株変異体を示す。想定上のラセマーゼである二重変異体細胞により形成されたペリクルの分解が有意に遅延し、ラセマーゼ活性が特異的に低減した株もまた、低減した抗バイオフィルム阻害を示すことを示唆している。また、二重変異体由来馴化培地は、野性型由来の馴化培地とは対照的に、バイオフィルム形成阻害に関し無力であった。図２Ｄは、野性型または二重変異体が有意なバイオフィルム成長を示すｙｌｍＥおよびｒａｃＸの二重株変異体（ＩＫＧ５５）の８日間培養液由来の馴化培地の濃縮Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラム溶出液の効果を示す。
【０１１６】
次いで、Ｄ−アミノ酸がバイオフィルム成熟の間に産生されるのかどうか、また、成熟バイオフィルムの分解を説明するのに充分な存在量で産生されるのかどうかを測定した。従って、ＬＣ／ＭＳを行い、続いて、ペリクル形成の初期および後期に採取した馴化培地に対し、Ｎα−（２、４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド（Ｌ−ＦＤＡＡ）による誘導体化を使ってＤ−アミノ酸を特定した。Ｄ−チロシン（６μＭ）、Ｄ−ロイシン（２３μＭ）、およびＤ−メチオニン（５μＭ）は、６日目までにバイオフィルム形成を阻害するのに必要な、またはそれ超の濃度で存在したが、３日目には、１０ｎＭ未満の濃度で、例えば、バイオフィルム形成を阻害するのに十分ではないレベルで存在したという結果であった。
【０１１７】
馴化培地と同様に、Ｄ−アミノ酸は、細胞成長を阻害せず、マトリックスオペロンｅｐｓおよびｙｑｘＭの発現も阻害しなかった（図８〜９）。図８は、Ｄ−アミノ酸の細胞成長に与える影響を示す。細胞を、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）含有ＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた。Ｄ−アミノ酸処理培養液中の細胞成長は、実質的に未処理試料と同じであった。図９Ａは、株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺ保有）によるＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺの発現を示し、図９Ｂは、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）含有ＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺ保有）によるＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺの発現を示す。この場合も、Ｄ−アミノ酸処理試料にたいするｙｑｘＭおよびｅｐｓ発現は、実質的に未処理試料と同じであった。
【０１１８】
Ｄ−アミノ酸は、細胞壁のペプチドグリカン成分のペプチド架橋中に組み込まれることを以前報告した。確認のため、細胞をバイオフィルム誘導培地中で成長させ、１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。図３Ａは、放射性Ｄ−チロシンの細胞壁への組込みを示す。１４Ｃ−Ｄ−チロシンを使って、Ｄ−チロシン（１４Ｃ−Ｌ−プロリンではそうではないが）は、細胞壁に組み込まれたことが示された。結果を細胞中への合計組込み（Ｌ−プロリンに対しては３６０、０００ｃｐｍ／ｍｌ、Ｄ−チロシンに対しては４６、０００ｃｐｍ／ｍｌ）のパーセントで表す。
【０１１９】
細胞壁中に組み込まれたＤ−アミノ酸が、ＴａｓＡ繊維を細胞への固定から離脱させることが可能かどうかを調べるために、ＴａｓＡと蛍光のレポーターｍＣｈｅｒｒｙの機能性融合体の局在化を調べた。図３Ｂは、機能性ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳融合体を含む細胞由来の合計蛍光を示す。細胞を、Ｄ−チロシン（６μＭ）の存在または非存在下のバイオフィルム誘導培地中で振盪を加えながら定常期まで成長させた。図３Ｂに示すように、Ｄ−チロシンによる処理は、ＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの合計蓄積に対しほとんどまたは全く効果がなかった。対照的に、細胞を遠心分離で洗浄し、再懸濁した後、蛍光顕微鏡で調べた場合は、未処理細胞（凝集していることが多い）は、ＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙで強力に装飾されていることが認められた。対照的に、Ｄ−チロシン処理細胞（ほとんど非凝集）は、低レベルの蛍光を示すに過ぎなかった。Ｄ−ロイシンおよび４つのＤ−アミノ酸等モル混合物でも、同様の結果が得られた。非修飾ＴａｓＡタンパク質の局在化もまた、金標識抗ＴａｓＡ抗体を使って透過電子顕微鏡で解析された。図３Ｄは、電子顕微鏡によるＴａｓＡ繊維の細胞会合を示す。２４時間培養液を、Ｄ−チロシン無し（画像１と２）またはＤ−チロシン（０．１ｍＭ）添加あり（画像３〜６）の場合で、追加の１２時間のインキュベートを行った。ＴａｓＡ繊維を、抗ＴａｓＡ抗体を使って免疫金標識により染色し、実施例に記載のように透過電子顕微鏡により可視化した。外多糖の非存在によりＴａｓＡ繊維の画像処理が著しく改善されたので、細胞は、菌体ｅｐｓオペロン（Δｅｐｓ）の変異であった。中実矢印は、繊維バンドルを示し、中空矢印はそれぞれの繊維を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。拡大画像２、４および６のスケールバーは、１００ｎｍである。画像１と２は、細胞に付着した繊維バンドルを示し、画像３、４および６は、細胞から離脱した個別繊維およびバンドルを示し、画像３〜５は、繊維物質がほとんど無いか全く無い細胞を示す。ＴａｓＡ繊維は、未処理ペリクルの細胞に固定されているように見えた（図３Ｄ、画像１と２）。対照的に、Ｄ−チロシンで１２時間処理した細胞は、ＴａｓＡ繊維ではほとんど装飾されていない細胞の混合物および細胞に固定されていない遊離ＴａｓＡ繊維または繊維凝集体で構成されていた（図３Ｄ、画像３〜６）。理論に拘泥する意図はないが、Ｄ−チロシンがバイオフィルムを処理する１つの機序は、細胞による繊維の脱落の導入である可能性がある。
【０１２０】
Ｄ−アミノ酸が、ＴａｓＡ繊維の細胞への固定を破壊することにより作用することの遺伝的証拠をＤ−チロシン耐性変異体の単離から入手した。図４Ａは、Ｄ−チロシン非含有または含有固形（上段画像）または液体（下段画像）バイオフィルム誘導培地で３日間成長させた細胞を示す。Ｄ−チロシン（図４Ａ）またはＤ−ロイシン（データを示さず）含有固形培地上で成長の間に形成された平坦コロニー上に、しわの寄った乳頭状突起が自然に現れた。重要なことは、全ての４つの活性Ｄ−アミノ酸を含むプレート上には、このような乳頭状突起は出現しなかったことである。精製される場合、これらの自然の変異体は、Ｄ−チロシンまたはＤ−ロイシンの存在下、しわの寄ったコロニーやペリクルを生じた。いくつかのこのような変異体が単離されたが、大抵は、ｙｑｘＭオペロンまたはその近くに変異を含んでいた。２つの変異が詳細に調査され、７５９塩基対長ｙｑｘＭ遺伝子の３’末端近傍のフレームシフト変異であることがわかった。ｙｑｘＭ２は、ｙｑｘＭ読み取り枠中の塩基対７２８の位置のＧ：Ｃの挿入であり、ｙｑｘＭ６は、塩基対５６８の位置のＡ：Ｔの欠失であった（図４Ｂ）。図４Ｂは、ＹｑｘＭの簡略アミノ酸配列を示す。下線は、ｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６フレームシフト変異により図に示された配列変化を生じ、コドンから特定された残基である。
【０１２１】
図３Ｃは、蛍光顕微鏡によるＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞会合を示す。ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合体含有の野性型細胞およびｙｑｘＭ６（ＩＫＧ５１）変異体細胞を、バイオフィルム誘導培地中で、図中で示したようにＤ−チロシン（６μＭ）の存在またはＤ−チロシン非存在（未処理）下で振盪を加えながら定常期（ＯＤ＝１．５）まで成長させ、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。蛍光顕微鏡結果は、ｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６の存在が、凝集およびＤ−チロシン処理細胞に対するＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙによる細胞装飾を復活させたことを示す（図３Ｃ）。以前に行った仕事では、ＴａｓＡと細胞の結合のためにＹｑｘＭが必要であることが示された（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２２９（２００６））。理論に拘泥する意図はないが、Ｄ−アミノ酸のバイオフィルム阻害効果が、ＹｑｘＭ変異体によって打ち負かされるというこの発見は、Ｄ−アミノ酸の細胞壁への組込みの効果が、ＴａｓＡ繊維の細胞への固定を傷害することであるという考えを補強するものである。ＹｑｘＭのＣ末端近傍ドメインは、細胞壁中のＤ−チロシンまたはＤ−ロイシンの存在に呼応してＴａｓＡ放出の引き金になる可能性がある。
【０１２２】
実施例２．黄色ブドウ球菌および緑膿菌によるバイオフィルム形成におけるアミノ酸の選別
他の細菌に関し、バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果について調査した。病原菌ブドウ球菌は、プラスチック表面上にバイオフィルムを形成する（Ｏｔｔｏ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２２：２０７（２００８））。これは、非結合細胞を洗い流し、結合細胞をクリスタルバイオレットで染色することによって検出できる。図２Ｅは、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グルコース（０．５％）とＮａＣｌ（３％）含有ＴＳＢ培地中で３７℃、２４時間成長させた黄色ブドウ球菌（株ＳＣＯ１）を示す。さらに、アミノ酸添加無し（未処理）、Ｄ−チロシン（５０μＭ）またはＤ−アミノ酸混合物（各１５ｎＭ）添加の条件をウエルに付加した。非結合細胞を洗い流し、クリスタルバイオレットで染色することによりポリスチレン結合細胞を可視化した。図２Ｅは、５０μＭ濃度のＤ−チロシンおよび５０ｎＭ濃度のＤ−アミノ酸混合物（Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニン；各５０ｎＭ）が病原菌によるバイオフィルム形成の阻害に対し極めて効果的であることを示す。
【０１２３】
さらに、図１０は、１０μＭのＤ−チロシンが緑膿菌によるバイオフィルム形成の阻害に対し効果的であったことを示し、また、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンの１μＭの等モル混合物が有効であったことを示す。図１０は、Ｄ−アミノ酸による緑膿菌バイオフィルム形成の阻害を示す。緑膿菌株Ｐ０１４を、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グリセリン（０．２％）およびカザアミノ酸（２０μｇ／ｍｌ）含有Ｍ６３培地中で、３０℃、４８時間成長させた。さらに、アミノ酸添加無し（未処理）、Ｄ−チロシンまたはＤ−アミノ酸等モル混合物添加の条件をウエルに付加した。非結合細胞を洗い流し、クリスタルバイオレットで染色することによりポリスチレン結合細胞を可視化した。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗浄後、完全に乾燥した。
【０１２４】
実施例３．ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルム阻害に対し活性なＤ−アミノ酸混合物
２つの異なる混合物は、ブドウ球菌バイオフィルムの形成の阻害に対し極めて活性である。１つは、Ｄ−チロシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−ロイシンおよびＤ−トリプトファンの等モル混合物である。枯草菌、ブドウ球菌（図１１）、および緑膿菌（図１２）の全試験細菌株で、Ｄ−ｔｒｐ、Ｄ−ｍｅｔ、Ｄ−ｔｙｒおよびＤ−ｌｅｕのＤ−ａａ混合物は、個別のアミノ酸よりも極めて低い濃度で活性であった。表１の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。表２の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＰＡ１４、培地はＭ６３、細胞播種は１．５ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムをクリスタルバイオレット法を使って可視化した。データを下表１と２に示す：
【表１】
【表２】
【０１２５】
Ｄ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリンの等モル混合物は、上記混合物よりもさらに効果的である。また、その混合物は、個々のアミノ酸それぞれよりも混合物として活性が大きい（図１３と１４）。表３と４の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムをクリスタルバイオレット法を使って可視化した。データを表３と４に示す：
【表３】
【表４】
【０１２６】
実施例４．黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の代替定量方法
浮遊細胞をＧｉｌｓｏｎピペットで完全に除去し、次いで、ペーパータオル越しに液体を排出した。次に、バイオフィルムプレートの画像を黒を背景に注意深く撮影した（図１５と１６）。表５と６の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを黒を背景として視覚に訴える方法で可視化した。データを表５と６に示す：
【表５】
【表６】
【０１２７】
バイオフィルム細胞をＰＢＳ中に再懸濁することにより上記表５と６のプレートから除去し、これらのＯＤ６００を分光光度計を使って測定した（図１７）。表７の実験では、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを吸収された細菌のＯＤ６００を測定することにより可視化した。データを表７示す：
【表７】
【０１２８】
実施例５．エポキシ表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果
異なる表面からのＤ−アミノ酸の徐放方法開発の可能性を試験する目的で、エポキシ表面をＤ−アミノ酸混合物中で２４時間インキュベートした。これを完全に乾燥し、黄色ブドウ球菌を播種した新しいＴＳＢ培地中でインキュベートした。表８と９の実験では、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを黒を背景として視覚に訴える方法で可視化した。図１８と１９に示すように、Ｄ−ａａ混合物（上述のような）は、浸漬状態の基質上のブドウ球菌バイオフィルム形成を劇的に低減させた。データを表８と９に示す：
【表８】
【表９】
【０１２９】
さらに、Ｎｏｒｌａｎｄ光学接着剤６１表面をＤ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニンと共に２４時間インキュベートした。これを完全に乾燥し、黄色ブドウ球菌を播種した新しいＴＳＢ培地中でインキュベートした。Ｄ−ａａ混合物（Ｌ−混合物ではそうではないが）は、ブドウ球菌バイオフィルム形成を劇的に低減した。
【０１３０】
この実施例では、ポリマー基質は、ＵＶＯ−１１４（Ｅｐｏｘｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＮｏｒｌａｎｄ光学接着剤６１（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ＵＶ−硬化型ポリマーを使って、ポリジメチルシロキサン（ＳＹＬＧＡＲＤ１８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で成形した。
【０１３１】
実施例６．緑膿菌バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果を観察する別の方法
枯草菌と同様に、緑膿菌は、複合体構造を特定の培地に形成する。これらの複合体構造には、細胞外マトリックスの適切な形成と構築が必要である。Ｄ−チロシン（５００μＭ）またはＤ−トリプトファン（５００μＭ）の追加により、特定培地の緑膿菌バイオフィルム形成が阻害され（図２０）、一方、Ｌ−チロシン（５００μＭ）およびＬ−トリプトファンの追加では、そうならなかった。同様の結果が枯草菌でも得られた。これらの実験では、生物体／株はＰ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＰＡ１４、培地はＭ６３、細胞播種は１．５ｘ１０９ｃｆｕとした。
【０１３２】
Ｄ−アミノ酸のある場合と無い場合について、Ｓｙｔｏ−９染色を使って６ウエルプレート上でバイオフィルム形成を観察する別の方法は、以下の通りである：緑膿菌バイオフィルムをＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中の５％グルタルアルデヒドで少なくとも１時固定した。次に、固定バイオフィルムを、ＰＢＳで再度１回洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ｖ／ｖトリトンＸ−１００（ＰＢＳＴ）中に１５分間浸漬した。溶液を冷ＰＢＳＴ中の０．１ｎＭ ＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と入れ替え、暗所で少なくとも１５分間緩やかに揺らした。バイオフィルムの蛍光像をＸｅランプおよびＫ３ライカフィルターキューブを使ってライカＤＭＲＸ複式顕微鏡で取り込んだ。図２１に示すように、Ｄ−チロシンの存在下で、バイオフィルムプレートの底に付着した細胞の数が激減した。単一細胞付着量をｉｍａｇｅＪを使って定量化した。Ｄ−ａａに浸漬したエポキシ表面に付着した細胞の量の減少は、Ｌ−ａａ対照に比較して相当多かった。
【表１０】
【０１３３】
実施例７．グラム陰性病原菌に与えるＤ−アミノ酸の効果の評価
広範囲の抗バイオフィルム活性の可能性を評価するために、効果のあるＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−プロリンの等モルカルテットをグラム陰性病原菌プロテウス・ミラビリスに対して試験した。図２２に示すように、Ｄ−ａａ混合物はプロテウス・ミラビリスに対して活性であった。表１１のバイオフィルムは、クリスタルバイオレット法により可視化した。データを表１１に示す：
【表１１】
【０１３４】
実施例８：グラム陽性の病原菌に対するＤ−アミノ酸の効果の評価
広範囲の抗バイオフィルム活性の可能性を評価するために、効果のあるＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−プロリンの等モルカルテットをグラム陽性の病原菌ストレプトコッカス・ミュータンスに対して試験した。図２３に示すように、Ｄ−ａａ混合物は、ストレプトコッカス・ミュータンスに対し活性であった。表１２のバイオフィルムをクリスタルバイオレット法により可視化した。データを表１２に示す：
【表１２】
【０１３５】
実施例９：Ｄ−チロシン含有コーティング
樹脂固形分の重量ベースで、０．５％のＤ−チロシンを市販ポリエステルポリオールおよび市販イソシアヌラートベースの２成分ポリエステルウレタンコーティング中に組み込む。コーティング系は、全体樹脂固形分ベースで０．０１５％のジブチルスズジラウラートにより触媒された。
【０１３６】
コーティング製剤をへら引きにより透明ガラススライド約４”ｘ６”上に塗布して約２ミル（０．００２”）のフィルム厚さにする。
【０１３７】
これらのフィルムを１２０°Ｆ（４９℃）のオーブン中で硬化する。
【０１３８】
実施例１０：Ｄ−アミノ酸混合物含有ポリマー
液体シリコーンゴムシートを米国特許第５、９７３、０３０号に記載のようにして調製する。製剤中に、Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物をさらに０．０１〜１重量パーセント添加する。
【０１３９】
実施例１１：Ｄ−アミノ酸混合物含有水ベース工業用コーティング
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物を１重量パーセント含む水ベース透明アクリル産業コーティング製剤を２ミル厚さでガラススライドにコートする。
【０１４０】
実施例１２：Ｄ−アミノ酸混合物含有溶媒ベース工業用コーティング
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物を１重量パーセント含む溶媒べースポリウレタンコーティングを調製する。このコーティングを２ミル厚さでガラススライドに塗布する。
【０１４１】
実施例１３：Ｄ−アミノ酸混合物含有ＵＶ硬化型水ベース工業用コーティング
透明ＵＶ硬化型水性産業コーティングを高速スターラーで各成分（下表参照）の混合により配合した。
【表１３】
【０１４２】
調合製剤に、Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物を添加し、高せん断速度（２０００ｒｐｍ）下、室温で３０分間攪拌する。比較の目的のため、Ｄ−アミノ酸不含の対照製剤を同じ方法で調製する。
【０１４３】
コーティングを５０μｍスリットコーターで白塗装アルミニウムパネルに塗布し、６０℃で１０分間乾燥した後、２つの中圧水銀ランプ（２ｘ８０Ｗ／ｃｍ）を用いて５ｍ／ｍｉｎで硬化する。
【０１４４】
実施例１４：Ｄ−アミノ酸混合物含有溶媒ベース工業用コーティング
２液型溶媒使用ポリウレタンコーティングを下記の手順で調製する：
【０１４５】
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物を、ミルベース配合として結合剤および溶媒に添加し、高せん断速度で１０分間、５μｍ未満の粒径になるまで攪拌する。
【０１４６】
ミルベース配合
【表１４】
【０１４７】
コーティング製剤は、成分Ａの材料を混合し、最終段階で塗布の前に成分Ｂを添加して調製する（下表参照）。全体製剤中のＤ−アミノ酸混合物の含量は、０．１重量．％である。
【表１５】
【０１４８】
それぞれのコーティング製剤を白塗装アルミニウムパネル上にスプレーし（乾燥被覆厚さ：４０μｍ）、８０℃で３０分乾燥する。
【０１４９】
実施例１５：油中水型（Ｗ／Ｏ）代表的配合
以下のＤ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物０．１ｗｔ／ｗｔ％含有Ｗ／Ｏ乳剤を調製する。
Ｗ／Ｏ乳剤：
部分Ａ
流動パラフィン ７．５部
イソヘキサデカン ６．０
ＰＥＧ−７水素化ヒマシ油 ４．１
イソプロピルパルミタート ２．０
Cera microcristallina ０．５
ラノリンアルコール ０．６
部分Ｂ
水 全体配合で１００部に希釈
硫酸マグネシウム １．０
グリシン ３．２０
部分Ｃ
Ｄ−アミノ酸混合物 ０．５％ｗｔ／ｗｔ水溶液の２０部
【０１５０】
実施例１６：水中油型（Ｏ／Ｗ）代表的配合
以下のＤ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物０．１ｗｔ／ｗｔ％含有Ｏ／Ｗ乳剤を調製する。
部分Ａ
ステアレス−２ ２．２部
ステアレス−２１ １．０
ＰＥＧ−１５ ステアリルエーテル ６．０
ジカプリリルエーテル ６．０
部分Ｂ
水 全体配合で１００部に希釈
ナトリウムポリアクリラート ０．２
部分Ｃ
Ｄ−アミノ酸混合物 ０．５％ｗｔ／ｗｔ水溶液の２０部
【０１５１】
実施例１７：黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成のインビボ阻害
Ａｎｇｕｉｔａ−Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５１：２５９４（２００７）に記載のように、Ｄ−アミノ酸または２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせのインビボ試験を行う。
【０１５２】
実施例１８：黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の別のインビボ阻害
Ｂｅｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８６：４６６５（２００４）に記載のように、Ｄ−アミノ酸または２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせのインビボ試験を行う。
【０１５３】
実施例１９：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ＴｙｐおよびＤ−Ｍｅｔの安定水性混合物の調製
アミノ酸Ｄ−ＭｅｔおよびＤ−Ｌｅｕを、室温で５ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に別々に溶解する。通常、各アミノ酸に対し、１０ｍＬの溶液が調製される。Ｄ−トリプトファンは、脱イオン水に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解するが、４０〜５０℃、５〜１０分の少しの加熱が必要である。Ｄ−チロシンは、５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０５Ｍ ＨＣｌに溶解するが、４０〜５０℃、５〜１０分の加熱が必要である。加熱超音波処理浴を使って、アミノ酸の溶解を促進することができる。全ての溶液は組み合わされ、室温で細菌濾過を行って約４０ｍＬの保存液が得られる。
【０１５４】
実施例２０：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｒｏ、およびＤ−Ｐｈｅの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５５】
実施例２１：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｓｐ、およびＤ−Ｇｌｕの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５６】
実施例２２：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、およびＤ−Ｌｙｓの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５７】
実施例２３：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｖａｌ、およびＤ−Ａｓｎの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５８】
実施例２４：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、およびＤ−Ｇｌｎの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５９】
等価物
本発明をその詳細説明と関連付けて説明してきたが、前述の記載は説明の目的のためのものであって本発明の範囲を制限する意図はなく、これは添付の請求項の範囲によって定められることは理解されるべきである。他の態様、優位性、および変更は以下の特許請求の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、同時係属中の２０１０年１月８日出願米国仮出願第６１／２９３、４１４号、および２０１０年４月３０日出願米国特許仮出願第６１／３２９、９３０号の優先権を主張する。
【０００２】
この出願は、本出願と同日付出願の「バイオフィルム処理のための方法と組成物」の名称の同時係属中国際特許出願と関連している。
【０００３】
これらの出願の内容は、参照によって組み込まれる。
【０００４】
米国政府の権利に関する記述
本発明は、国立衛生研究所認可ＣＡ２４４８７、ＧＭ０５８２１３、ＧＭ０８２１３７、ＧＭ０８６２５８、およびＧＭ１８５６８に基づいて米国政府の支援により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
バイオフィルムは、表面で定着および増殖し、細胞外ポリマーマトリックスにより覆われている細胞の共同体である。これらは、増殖が遅く、多くは増殖の定常期にある。これらは、全部ではないにしても、多くは病原体により形成されうる。ＣＤＣによれば、米国の全感染症中の６５％が、共通の病原体により形成されるバイオフィルムが原因である。また、バイオフィルムは、飲料水送水系等の工業環境中にも認められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】（なし）
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明の態様は、細菌によるバイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害する方法を特徴とする。一部の実施形態では、この方法は、有効量のＤ−アミノ酸を含む組成物と表面を接触させ、それによりバイオフィルム形成を処理、低減、または阻害することを含む。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性またはグラム陽性細菌である。特定の実施形態では、細菌は、桿菌、ブドウ球菌、大腸菌、またはシュードモナス細菌である。
他の１つまたは複数の実施形態では、表面は、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙を含む。
【０００８】
他の態様では、本発明は、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含む工業用、処理用または、医薬組成物等の組成物を特徴とする。特定の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、組成物は、２つ以上のＤ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−プロリン、またはＤ−トリプトファンを含み、またさらなる実施形態では、後者の組成物が、基本的にデタージェントおよび／またはＬアミノ酸を含まない。他の実施形態では、組成物は、本明細書記載の、例えば、水処理または配管系等の工業バイオフィルムの処理に使用される。
【０００９】
本開示の一態様は、バイオフィルム形成細菌によるバイオフィルム形成を処理、低減、または阻害する方法に関し、この方法は、対象物品を有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物と接触させ、それによりバイオフィルム形成を処理、低減、または阻害することを含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００１０】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００１１】
一部の実施形態では、対象物品は、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙からなる群より選択される１つまたは複数の物品を含む。さらなる実施形態では、対象物品は、水凝集物の収集、水再循環、下水輸送、製紙パルプ化および製造、ならびに水処理および輸送に関与する１つまたは複数の構成部材である。さらなる他の実施形態では、対象物品は、排水管、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業用の食品または飲料生産設備、フロア、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、送水管、冷却系、または発電所である。
【００１２】
一部の実施形態では、対象物品は、金属、金属合金、合成高分子、天然ポリマー、セラミック、木材、ガラス、革、紙、織物、非金属無機物、複合材料およびこられの組み合わせからなる群より選択される材料から作られる。
【００１３】
他の実施形態では、接触させる工程は、対象物品にコーティングを適用することを含み、前記コーティングは、有効量のＤ−アミノ酸を含む。さらなる実施形態では、コーティングは、さらに結合剤を含む。一部の実施形態では、コーティングは、コーティング組成物の表面への毛管作用、吹付け、ディッピング、スピンコーティング、積層、塗布、スクリーン印刷、押し出しまたはドローダウンにより達成される。他の実施形態では、接触させる工程は、前駆物質中にＤ−アミノ酸を導入し、前駆物質を処理して対象物品中にＤ−アミノ酸を含浸させることを含む。さらなる実施形態では、接触させる工程は、液体組成物中にＤ−アミノ酸を導入することを含む。
【００１４】
前述の方法の一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシンを含む。別の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む。さらに他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。またさらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００１５】
いずれかの前述の方法の一部の実施形態では、方法は、表面を殺生物剤に接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む。
【００１６】
いずれかの前述の方法の別の実施形態では、組成物は、１％未満のＬ−アミノ酸を含む。
【００１７】
いずれかの前述の方法のさらなる実施形態では、組成物は、基本的にデタージェントを含まない。
【００１８】
さらなる別の本開示の態様は、バイオフィルム形成に耐性を有するコートされた対象物品に関し、少なくとも１つの露出表面にコーティングを含む対象物品を含み、そのコーティングが、有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルム形成を処理、低減、阻害する。ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、またはＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００１９】
一部の実施形態では、コーティングは、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００２０】
一部の実施形態では、対象物品は、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙からなる群より選択される１つまたは複数の物品を含む。他の実施形態では、対象物品は、水凝集物の収集、水再循環、下水輸送、製紙パルプ化および製造、ならびに水処理および輸送に関与する１つまたは複数の構成部材である。さらなる実施形態では、対象物品は、排水管、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業食品もしくは飲料生産設備、フロア、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、送水管、冷却系、または発電所である。
【００２１】
一部の実施形態では、対象物品は、金属、金属合金、合成高分子、天然ポリマー、セラミック、木材、ガラス、革、紙、織物、非金属無機物、複合材料およびこれらの組み合わせからなる群より選択される材料から作られる。さらなる実施形態では、コーティングは、さらに結合剤を含む。他の実施形態では、コーティングは、ポリマーをさらに含み、Ｄ−アミノ酸は、ポリマー中に分散されている。
【００２２】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸コーティングは、徐放製剤として配合される。
【００２３】
一部の実施形態では、組成物は、Ｄ−チロシンを含む。さらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む。またさらなる実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む。さらに他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む。
【００２４】
一部の実施形態では、組成物は、殺生物剤をさらに含む。さらなる実施形態では、殺生物剤は、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、いずれかの前述のコートされた対象物品または組成物は、１％未満のＬ−アミノ酸を含む。他の実施形態では、コートされた対象物品または組成物は、基本的にデタージェントを含まない。
【００２６】
本開示の別の態様は、バイオフィルム形成に耐性を示す組成物に関し、液体基剤、および基剤中に分散した有効量のＤ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それによりバイオフィルム形成の処理、低減または阻害を行い、ここで、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるか、およびＤ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の相乗的組み合わせである。
【００２７】
一部の実施形態では、組成物は、基本的に、対応するＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸の組み合わせに関連するＬ−アミノ酸を含まない。
【００２８】
一部の実施形態では、液体基剤は、液体、ゲル、ペーストから選択される。
【００２９】
一部の実施形態では、組成物は、水、洗浄用配合物、消毒用配合物、塗布およびコーティング用配合物からなる群より選択される。
【００３０】
さらに別の本開示の態様は、２つ以上のＤ−アミノ酸を含むコーティング組成物に関し、この組成物は、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、およびＤ−トリプトファンからなる群より選択され、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される異なるＤ−アミノ酸であり、さらに高分子結合剤が含まれる。
【００３１】
一部の実施形態では、組成物は、基本的にＤ−アミノ酸に関連する対応するＬ−アミノ酸を含まない。
【００３２】
以下の図は、説明の目的のみで提示されるもであり、制限を加える意図はない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、枯草菌株ＮＣＩＢ３６１０の細胞を示す。この細胞は、１２ウエルプレートを使って液体バイオフィルム誘導培地中、２２℃で３日間（Ａ）または８日間（Ｂ）成長させた。図１Ｃ及び１Ｄは、６〜８日間培養液（Ｃ）または３日間培養液（Ｄ）の馴化培地をＣ１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカラムに適用後、乾燥・再懸濁したメタノール溶出液（１：１００ｖ／ｖ）を添加した培地中で３日間成長させた細胞を示す。ウエルに添加された最終濃度の濃縮因子は、元の馴化培地の容量ベースで１：４希釈であった。図１Ｅは、その因子がメタノールを使ったステップワイズ溶出によりＣ−１８カラムでさらに精製されたことを除いて、図１Ｃと同じである。３μｌの４０％メタノール溶出液を添加した結果を示す。図１Ｆは、新しい培地への添加の前に、４０％メタノール溶出液をプロテイナーゼＫビーズと共に２時間インキュベートし、続いて、遠心分離によりビーズを除去したことを除いて、図１Ｃと同じである。
【図２】図２Ａは、３日間のインキュベーション後に、バイオフィルム誘導培地中で新しく播種した培養液にＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）、Ｌ−チロシン（７ｍＭ）、またはＬ−ロイシン（８．５ｍＭ）を添加した場合のペリクル形成に対する効果を示す。図２Ｂは、ペリクル形成の完全な阻害に必要なＤ−アミノ酸の最小バイオフィルム阻害濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＭＢＩＣ）を示す。図２Ｃは、アミノ酸無添加（未処理）、Ｄ−チロシン（３μＭ）の添加またはＤ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニンおよびＤ−ロイシン（各２．５ｎＭ）の混合物添加に続いて、さらに８時間インキュベーションした３日間培養液を示す。図２Ｄは、野性型またはｙｌｍＥおよびｒａｃＸに対し二重変異体株（ＩＫＧ５５）の８日間培養液由来の馴化培地から得た濃縮Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラム溶出液の効果を示す。図２Ｅは、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、３７℃のグルコース（０．５％）およびＮａＣｌ（３％）を含むＴＳＢ培地中で、２４時間成長させた黄色ブドウ球菌（株ＳＣＯ１）を示す。さらに、ウエルへのアミノ酸無添加（未処理）、Ｄ−チロシン（５０μＭ）添加またはＤ−アミノ酸混合物（各１５ｎＭ）添加の条件を付加した。未結合細胞を洗い流した後、ポリスチレンに結合した細胞をクリスタルバイオレットで染色して可視化した。
【図３】図３Ａは、細胞壁への放射性のＤ−チロシンの組み込みを示す。細胞をバイオフィルム誘導培地中で成長させ、１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。結果を、細胞（Ｌ−プロリンに対しては３６０、０００ｃｐｍ／ｍｌ、Ｄ−チロシンに対しては４６、０００ｃｐｍ／ｍｌ）への全体組み込みのパーセントとして示す。図３Ｂは、機能性ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳融合体含有細胞（ＤＲ−３０（Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１０、近刊））からの全蛍光を示す。Ｄ−チロシン（６μＭ）が存在または非存在の場合について、バイオフィルム誘導培地中で定常期になるまで振盪を加えながら細胞を成長させた。図３Ｃは、蛍光顕微鏡によるＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの細胞会合を示す。表示されているように、Ｄ−チロシン（６μＭ）が存在または非存在（未処理）の場合について、野性型細胞およびｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合体含有ｙｑｘＭ６（ＩＫＧ５１）変異体細胞をバイオフィルム誘導培地中で定常期（ＯＤ＝１．５）になるまで振盪を加えながら細胞を成長させ、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。図３Ｄは、電子顕微鏡によるＴａｓＡ線維の細胞会合を示す。Ｄ−チロシンのない場合（画像１と２）またはＤ−チロシン（０．１ｍＭ）添加の場合（画像３〜６）について、２４時間培養液に対し、１２時間追加してインキュベートした。実施例に記載のように、ＴａｓＡ繊維を抗ＴａｓＡ抗体を使って免疫金標識により染色し、透過型電子顕微鏡により可視化した。菌体外多糖の非存在によりＴａｓＡ繊維の画像化が著しく改善されたので、細胞はｅｐｓオペロン（Δｅｐｓ）に対し変異体であった。中実矢印は、繊維バンドルを示し；中空矢印は、個別の繊維を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。拡大画像２、４および６のスケールバーは１００ｎｍである。画像１と２は、細胞に付着した繊維バンドル、画像３、４と６は、個別の繊維および細胞から離脱したバンドルを示し、画像３〜５は、ほとんどまたは全く繊維状物質のない細胞を示す。
【図４】図４Ａは、Ｄ−チロシン含有または非含有の固体（上段画像）または液体（下段画像）バイオフィルム誘導培地で３日間成長させた細胞を示す。図４Ｂは、ＹｑｘＭの簡略アミノ酸配列を示す。下線は、表示した配列変化中でｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６フレームシフト変異が生じたコドンにより特定される残基である。
【図５】図５は、Ｄ−トリプトファン（０．５ｍＭ）、Ｄ−メチオニン（２ｍＭ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）またはＬ−メチオニン（５ｍＭ）を補充した後、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、３日間インキュベートしたＭＳｇｇ培地含有ウエルを示す。
【図６】図６は、Ｄ−チロシン（３μＭ）またはＤ−ロイシン（８．５ｍＭ）を補充後、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、４日間インキュベートした固体ＭＳｇｇ培地を含むプレートを示す。
【図７】図７は、１２ウエルプレート中で成長させ、５日間インキュベートしたＮＣＩＢ３６１０（野性型）およびｙｌｍＥおよびｒａｃＸ（ＩＫＧ１５５）の二重欠失変異体を示す。
【図８】図８は、Ｄ−アミノ酸の細胞成長に与える効果を示す。細胞をＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）を含むＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた。
【図９】図９Ａは、株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺを保持）によるＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺの発現を示し、図９Ｂは、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）を含むＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺを保持）によるＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺの発現を示す。
【図１０】図１０は、緑膿菌バイオフィルム形成のＤ−アミノ酸による阻害を示す。緑膿菌株Ｐ０１４を１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グリセリン（０．２％）およびカザアミノ酸（２０μｇ／ｍｌ）含有Ｍ６３培地中３０℃で４８時間成長させた。アミノ酸無添加（未処理）、Ｄ−チロシン添加またはＤ−アミノ酸混合物の条件をウエルに付加した。ポリスチレンに結合した細胞を、未結合細胞を洗い流した後、クリスタルバイオレットで染色して可視化した。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗い流し、完全に乾燥した。
【図１１】図１１は、個別Ｄ−アミノ酸または４つの混合物と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１２】図１２は、個別Ｄ−アミノ酸または４つの混合物と共にＭ６３培地中で４８時間成長させた緑膿菌のクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１３】図１３は、個別Ｄ−アミノ酸または混合物と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１４】図１４は、Ｌ−アミノ酸と共にＴＳＢ培地中で２４時間成長させたブドウ球菌バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図１５】図１５は、浮遊細菌を除去後Ｄ−アミノ酸を適用したＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルムの代表的画像である。
【図１６】図１６は、浮遊細菌を除去後Ｌ−アミノ酸を適用したＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルムの代表的画像である。
【図１７】図１７は、浮遊細菌を除去後ＴＳＢ培地中で形成されたブドウ球菌バイオフィルム内の細胞の定量化である。細胞をＰＢＳ中に再懸濁した。
【図１８】図１８は、表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に与えるＤ−ａａ混合物（１ｍＭ）の効果を示す。エポキシ表面をＤ／Ｌ−ａａ混合物中に浸漬した後、細菌と２４時間インキュベートした。
【図１９】図１９は、表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に与えるＤ−ａａ混合物（１ｍＭ）の効果を示す。エポキシ表面をＤ／Ｌ−ａａ混合物中に浸漬した後、細菌と２４時間インキュベートした。
【図２０】図２０は、Ｍ６３固体培地上の緑膿菌中のバイオフィルム形成に与えるＤ−ａａの効果を示す。コロニーは、室温で４日間成長させた。
【図２１】図２１は、バイオフィルム誘導条件下における、緑膿菌の６ウエルプレートのボタン中の単一付着細胞のＳｙｔｏｘ染色を示す。
【図２２】図２２は、培地中でＤ−アミノ酸（１００μＭ）またはＬ−アミノ酸（１００μＭ）混合物と共に４８時間成長させたプロテウス・ミラビリスのクリスタルバイオレット染色を示す。
【図２３】図２３は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸（１ｍＭ）を含む、ショ糖（０．５％）培地を添加したＢＨＩ培地で７２時間成長させたストレプトコッカス・ミュータンスのクリスタルバイオレット染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
特に別義の定義がなければ、本明細書で使われる全ての技術科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験に使用可能であるが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で挙げた全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、説明のみの目的であり、制限する意図はない。
【００３５】
用語の「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本明細書では、本明細書記載の組成物（例えば、予防もしくは処理組成物）の投与、もしくは処理薬の組み合わせ（例えば、予防もしくは処理組成物の組み合わせ）の投与の結果としての、表面上のバイオフィルムの発生または発症の阻害またはバイオフィルムの１つまたは複数の徴候もしくは症状の再発、発症、もしくは発生の防止を指す。
【００３６】
本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細説明および請求項から明らかであろう。当業者には明らかなように、本明細書記載の具体的特徴および実施形態は、他のいずれかの特徴または実施形態と組み合わせることができる。
【００３７】
本発明は、少なくとも一部は、成熟バイオフィルム由来の馴化培地中に存在するＤ−アミノ酸がバイオフィルム形成を防ぎ、既存のバイオフィルム分解の引き金となるという発見に基づいている。標準的アミノ酸は、相互に鏡像関係にあるＬ−またはＤ−アミノ酸と呼ばれる２つの光学的異性体のどちらかの形で存在しうる。Ｌ−アミノ酸は、タンパク質中に見出される大部分のアミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸は細菌のペプチドグリカン細胞壁の成分である。本明細書記載のＤ−アミノ酸は、生存および非生存表面上のバイオフィルムに浸透でき、細菌の表面への付着およびバイオフィルムのさらなる発達を阻害でき、このようなバイオフィルムを剥離させることができおよび／または生物学的マトリックス中のバイオフィルム形成微生物のさらなる増殖を阻害することができ、またはこのような微生物を消滅させることができる。
【００３８】
Ｄ−アミノ酸は、当技術分野で既知であり、既知の技術を使って調製可能である。代表的方法には、例えば、米国特許公開第２００９０２０３０９１号に記載のものが含まれる。Ｄ−アミノ酸は、また、市販品として入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から）。
【００３９】
本明細書記載の方法には、いずれのＤ−アミノ酸も使用可能であり、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、またはＤ−チロシンが、非制限的に含まれる。Ｄ−アミノ酸は、単独でまたは他のＤ−アミノ酸と組み合わせて使用可能である。代表的方法では、２、３、４、５、６、または７以上のＤ−アミノ酸が組み合わせて使用される。好ましくは、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、またはＤ−トリプトファンが、単独または組み合わせて、本明細書記載の方法で使用される。他の好ましい実施形態では、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンが、単独または組み合わせて、本明細書記載の方法で使用される。
【００４０】
Ｄ−アミノ酸は、約０．１ｎＭ〜約１００μＭ、例えば、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約５ｎＭ〜約５μＭ、または約１０ｎＭ〜約１μＭの濃度、例えば、０．１ｎＭ〜１００μＭ、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度で使用可能である。
【００４１】
バイオフィルム形成の阻害または処理に特に有効であると解った代表的Ｄ−アミノ酸組成物、コーティング、または溶液には、Ｄ−チロシンが含まれる。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンは、単独で使用され、例えば、１ｍＭ未満、または１００μＭ未満、または１０μＭ未満の濃度として、または０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度で使用できる。
【００４２】
他の実施形態では、Ｄ−チロシンが１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンと組み合わせて使用される。一部の実施形態では、Ｄ−チロシンは、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンと組み合わせて使用される。Ｄ−チロシンの１つまたは複数のＤ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンとの組み合わせは、相乗的となり得、１０μＭ以下、例えば、約１ｎＭ〜約１０μＭ、約５ｎＭ〜約５μＭ、または約１０ｎＭ〜約１μＭの全体Ｄ−アミノ酸濃度、または０．１ｎＭ〜１００μＭ、例えば、１ｎＭ〜１０μＭ、５ｎＭ〜５μＭ、または１０ｎＭ〜１μＭの濃度でバイオフィルム形成を阻害または処理するのに有効である可能性がある。
【００４３】
一部の実施形態では、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、等モルである。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、等モルではない。
【００４４】
一部の実施形態では、組成物、基本的に、Ｌ−アミノ酸を含まない。例えば、組成物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、約０．０２５％未満、約０．０１％未満、約０．００５％未満、約０．００２５％未満、約０．００１％、またはそれ未満のＬ−アミノ酸を含む。他の実施形態では、組成物は、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００２５％未満、０．００１％未満のＬ−アミノ酸を含む。好ましい実施形態では、Ｌ−アミノ酸のパーセンテージは、対応するＤ−アミノ酸に対する割合である。例えば、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸のラセミ混合物は、５０％Ｌ−アミノ酸を含む。
【００４５】
一部の実施形態では、組成物、基本的に、デタージェントを含まない。例えば、組成物は、約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満、約５重量％未満、約１重量％未満、約０．５重量％未満、約０．２５重量％未満、約０．１重量％未満、約０．０５重量％未満、約０．０２５重量％未満、約０．０１重量％未満、約０．００５重量％未満、約０．００２５重量％未満、約０．００１重量％未満、またはそれ未満のデタージェントを含む。他の実施形態では、組成物は、全体組成物に対して、約３０重量％未満、２０重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．２５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０２５重量％未満、０．０１重量％未満、０．００５重量％未満、０．００２５重量％未満、０．００１重量％未満のデタージェントを含む。デタージェント、例えば、界面活性剤含有製剤に置いて、界面活性剤が活性試薬、例えば、Ｄ−アミノ酸と相互作用し、往々にして、試薬の有効性に大きな影響を与える可能性がある。一部の実施形態では、特定の界面活性剤型の存在が有効性を変えるかどうかを判定するための選別として、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤および双性イオン界面活性剤に対して試薬の有効性を選別する必要が生じうる。デタージェントの低減または除去が組成物の有効性を増加させおよび／または製剤の合併症を低減する。
【００４６】
バイオフィルム
ほとんどの細菌は、バイオフィルムとして知られる複合体のマトリックス含有多細胞の共同体を形成できる（Ｏ’Ｔｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：４９（２０００）；Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３３：１５２（２００９）；Ｋａｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：３１０（２００９））。バイオフィルム関連細菌は、外界からの刺激、例えば、抗生物質から保護されている（Ｂｒｙｅｒｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１００：１（２００８））。しかし、バイオフィルムが熟成するにつれ、栄養素が限定的となり老廃物が蓄積して、バイオフィルム関連細菌は、浮遊実体に戻る方が都合がよくなる（Ｋａｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７３：３１０（２００９））。従って、バイオフィルムは、有限の寿命を有し、最終的な分解を特徴とする。
【００４７】
ごく一般的には、バイオフィルムは、生存および非生存表面に付着した、生きているまたは死んでいる微生物、特に細菌と、細胞外の高分子物質（ＥＰＳマトリックス）、例えば、多糖類の形のそれらの代謝物とが一緒になった、集合体であると理解されている。浮遊細胞に対しては、通常、優れた増殖阻害または致死の作用を示す抗バイオフィルム物質の活性が、例えば、生物学的マトリックス中への活性物質の不十分な浸透のために、バイオフィルム中で組織化されている微生物に対して大きく低減される可能性がある。
【００４８】
他の単細胞の生物に加えて、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌は、バイオフィルムを産生できる。細菌性バイオフィルムは、コロニーを形成している細胞により産生される細胞外の多糖マトリックス内に包まれた細胞表面付着共同体である。バイオフィルム成長は、一連のプログラムされたステップにより発生し、このステップは、最初の表面への付着、３次元マイクロコロニー形成、およびその後の成熟バイオフィルムの成長を含む。バイオフィルム内の細胞の場所が深くなればなるほど（例えば、細胞がバイオフィルムが付着している固体表面に近いほど、大部分のバイオフィルムマトリックスにより遮蔽され、保護される）、細胞はさらに代謝不活性になる。この生理学的変化と勾配の結果、効率的システムが樹立され、それにより微生物が多様な機能的体質を有する細菌性共同体集団が作られる。また、バイオフィルムは、種々の、多様な非細胞性成分で作られ、これらに限定されないが、炭水化物（単体および複合体）、脂質、タンパク質（ポリペプチドを含む）、および糖類およびタンパク質の脂質複合体類（リポ多糖類およびリポタンパク質）を含んでもよい。
【００４９】
バイオフィルムは、適した成長条件が発生し、微生物に対し生存を保証する選択優位性を提供できるまで、一定時間の間休眠状態での存在を可能とする。しかし、この選択は、バイオフィルムがヒト細菌感染の約６５％に関与すると認められている点で、ヒトの健康に重大な脅威を提起する可能性がある（Ｓｍｉｔｈ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５７：１５３９−１５５０（２００５）；Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：９５−１０８（２００４））。
【００５０】
本明細書記載のように、バイオフィルムは、多種多様の生物学的、医学的、商業的、工業的、およびプロセシング作用に影響を与える可能性がある。工業環境では、バイオフィルムは、表面、例えば、パイプおよびフィルターに付着することができる。バイオフィルムは、熱交換器、油送管、水系、フィルター、等の工業システムにおける生物腐食および生物付着の原因となるために、工業環境では、問題を生ずる（Ｃｏｅｔｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００５）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ．３１：２１２−３２）。従って、バイオフィルムは、パイプ中の液体の通過を阻害し、水および他の液体系を詰まらせ、さらに病原菌、原虫類、および真菌のリザーバーの役割をする可能性がある。このように、工業バイオフィルムは、工業処理システムにおける経済的非効率の重要な原因である。さらに、異なる種のバイオフィルム産生細菌がこのようなシステム内で共存する可能性がある。従って、このような系では、複数の種に起因するバイオフィルム形成の可能性がある。
【００５１】
本明細書記載の方法および材料は、多種多様の商業的、工業的、および処理操作、例えば、水処理／加工業において認められる操作に関連したバイオフィルム形成を防ぐまたは減らすことができる。一部の例では、Ｄ−アミノ酸は、このような表面に認められるバイオフィルムに適用できる。他の例では、Ｄ−アミノ酸は、バイオフィルム形成細菌が表面に付着するのを防ぐために使用できる。例えば、表面は、産業機器の表面（例えば、優良製造規範（ＧＭＰ）施設、または食物処理プラント、写真処理現場、等にある設備）、給排水設備の表面、または水域の表面（湖、スイミングプール、海洋、等）でありうる。
【００５２】
表面は、細菌性バイオフィルムの形成を防ぐために使用する前に、Ｄ−アミノ酸でコート、吹き付け、または含浸することができる。このような表面の具体的な非制限的例では、配管、パイプ、および水凝集物収集、下水排水、製紙パルプ化作業、再循環水系（エアコンシステム、クーリングタワー、等）、および、帯水、水取扱、水処理、および水収集系に付随する支持部材が含まれる。Ｄ−アミノ酸の付与により、水の表面またはパイプまたは水処理系の配管表面または水に接触する収集および／または操作系が関与する他の表面のバイオフィルム形成を処理する、防ぐまたは減らすことができる。
【００５３】
バイオフィルム形成細菌
本明細書記載の方法は、バイオフィルムの形成および／または脅威を防ぐ、または遅らせるために使用できる。代表的方法では、バイオフィルムは、バイオフィルム成形細菌により形成される。細菌は、グラム陰性菌種またはグラム陽性細菌性種であってもよい。このような細菌の非制限的例には、以下の属のメンバーが含まれる：アクチノバチルス属のメンバー（例えば、アクチノバチルス・アクチノミセタムコミタンス）、アシネトバクター属のメンバー（例えば、アシネトバクター・バウマンニ）、エロモナス属のメンバー、ボルデテラ属のメンバー（例えば、百日咳菌、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、またはパラ百日咳菌）、ブレビバシラス属のメンバー、ブルセラ属のメンバー、バクテロイデス属のメンバー（例えば、バクテロイデス・フラジリス）、バークホルデリア属のメンバー（例えば、セパシア菌または類鼻疽菌）、ボレリア属のメンバー（例えば、ライム病ボレリア）、桿菌属のメンバー（例えば、炭疽菌または枯草菌）、カンピロバクター属のメンバー（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ）、キャプノサイトファーガ属のメンバー、カルジオバクテリウム属のメンバー（例えば、カーディオバクテリウム・ホミニス）、シトロバクター属のメンバー、クロストリジウム属のメンバー（例えば、破傷風菌またはクロストリジウム・ディフィシル）、クラミジア属のメンバー（例えば、トラコーマクラミジア、肺炎クラミジア、またはオウム病クラミジア）、エイケネラ属のメンバー（例えば、エイケネラ・コローデンス）、エンテロバクター属のメンバー、エシェリキア属のメンバー（例えば、大腸菌）、フランシセラ属のメンバー（例えば、野兎病菌）、フソバクテリウム属のメンバー、フラボバクテリウム属のメンバー、ヘモフィルス属のメンバー（例えば、軟性下疳菌またはインフルエンザ菌）、ヘリコバクター属のメンバー（例えば、ピロリ菌）、キンゲラ属のメンバー（例えば、キンゲラ・キンゲ）、クレブシエラ属のメンバー（例えば、肺炎桿菌）、レジオネラ属のメンバー（例えば、在郷軍人病菌）、リステリア属のメンバー（例えば、リステリア菌）、レプトスピラ属のメンバー、モラクセラ属のメンバー（例えば、カタル球菌）、モルガネラ属のメンバー、マイコプラズマ属のメンバー（例えば、マイコプラズマ・ホミニスまたは肺炎マイコプラズマ）、マイコバクテリウム属のメンバー（例えば、マイコバクテリウム結核またはらい菌）、ナイセリア属のメンバー（例えば、淋菌または髄膜炎菌）、パスツレラ属のメンバー（例えば、パスツレラ・マルトシダ）、プロテウス属のメンバー（例えば、プロテウス・ブルガリスまたはプロテウス・ミラビリス）、プレボテラ属のメンバー、プレジオモナス属のメンバー（例えば、プレジオモナス・シゲロイデス）、シュードモナス属のメンバー（例えば、緑膿菌）、プロビデンシア属のメンバー、リケッチア属のメンバー（例えば、リケッチア・リケッチイまたは発疹熱リケッチア）、ステノトロフォモナス属のメンバー（例えば、ステノトロホモナス・マルトフィリア）、ブドウ球菌属のメンバー（例えば、ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌）、連鎖球菌属のメンバー（例えば、緑色連鎖球菌、化膿性連鎖球菌（グループＡ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（グループＢ）、ストレプトコッカス・ボビス、または肺炎球菌）、ストレプトマイセス属のメンバー（例えば、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス）、サルモネラ属のメンバー（例えば、腸炎菌、チフス菌、またはネズミチフス菌）、セラチア属のメンバー（例えば、霊菌）、赤痢菌属のメンバー、スピリルム属のメンバー（例えば、鼡咬症スピリルム）、トレポネーマ属のメンバー（例えば、梅毒トレポネーマ）、ベイヨネラ属のメンバー、ビブリオ属のメンバー（例えば、コレラ菌、腸炎ビブリオ、またはビブリオ・バルニフィカス）、エルシニア属のメンバー（例えば、エンテロコリチカ菌、ペスト菌、または仮性結核菌）、およびザントモナス属のメンバー（例えば、ザントモナス・マルトフィリア）。
【００５４】
枯草菌は、特異的に半固体表面上に複合共同体を構築し、静置培養液の空気／液体界面に厚いペリクルを形成する（Ｌoｐｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３３：１５２（２００９）；Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：６３８（２００７）；Ｖｌａｍａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２２：９４５（２００８）；Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１））。枯草菌バイオフィルムは、菌体外多糖およびタンパク質ＴａｓＡから成るアミロイド線維で構成される細胞外のマトリックスにより一緒に保持された長鎖細胞から成る（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１）；Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２２９（２００６）；Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１０、近刊））。菌体外多糖は、ｅｐｓＡ−Ｏオペロンによりコードされた酵素により産生され（「ｅｐｓオペロン」）、ＴａｓＡタンパク質は、ｙｑｘＭ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡオペロン（「ｙｑｘＭオペロン」）のプロモーター遠位遺伝子によりコードされる（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６））。
【００５５】
バイオフィルム産生細菌、例えば、本明細書記載の種は、本明細書記載のように、インビトロで、または表面上で、生存患者中に見出すことができる。
【００５６】
用途／配合
Ｄ−アミノ酸組成物は、非生物学的半固形または固体表面上のバイオフィルム形成を減らすまたは防ぐために使用できる。このような表面は、バイオフィルム形成および細菌付着が起こりやすいどのような表面であってもよい。表面の非制限的例には、１つまたは複数の以下の材料から作られる硬質表面が含まれる（これらは任意選択で、例えば、ペンキまたはエナメルでコートされる）：金属、プラスチック、ゴム、板、ガラス、木材、紙、コンクリート、岩石、大理石、石膏およびセラミック材料、例えば、磁器。
【００５７】
特定の実施形態では、表面は、水または、特に、貯留水と接触する表面である。例えば、表面は、給排水設備、産業機器、水凝集物収集装置、下水輸送用設備、水再循環設備、製紙パルプ化設備、ならびに水処理および水輸送設備の表面であってもよい。排水施設の表面の非制限的例には、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業食品および飲料生産設備、およびフロアリングが含まれる。他の表面には、海洋構造物、例えば、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、およびのぞき窓が含まれる。
【００５８】
Ｄ−アミノ酸は、有効量のＤ−アミノ酸の表面への充填またはロードに関連する被覆、コーティング、接触、等のどの既知の手段によっても表面に適用可能である。Ｄ−アミノ酸は、例えば、蒸発により除去してＤ−アミノ酸コーティングを残す適切なキャリア、例えば、液体キャリア、と共に表面に適用可能である。具体的な例では、Ｄ−アミノ酸は、例えば、ポリマー／Ｄ−アミノ酸フィルムを表面に吹付け付けることにより、例えば、ポリマー／Ｄ−アミノ酸溶液中にディッピングまたはこれを表面にスピンコーティングすることにより、または他の共有結合もしくは非共有結合の手段により表面に直接付着される。他の例では、表面は、Ｄ−アミノ酸を吸収する吸収性物質（例えば、ヒドロゲル）でコートされる。
【００５９】
Ｄ−アミノ酸は、病院または医学環境での表面の処理に適している。本明細書記載のＤ−アミノ酸および組成物をコーティング、潤滑剤、洗浄または清浄溶液、等として適用した場合、バイオフィルム形成を阻害またはバイオフィルム形成を低減することができる。
【００６０】
本明細書記載のＤ−アミノ酸は、また、特に、織物繊維材料を保持する場合、の処理に適する。このような材料は、例えば、絹、ウール、ポリアミドまたはポリウレタン、および特に各種セルロース繊維材料の染色されていないおよび染色されたまたは印刷された繊維材料である。このような繊維材料は、例えば、天然セルロース繊維、例えば、綿、リネン、ジュートおよび麻、ならびにセルロースおよび再生セルロースである。紙、例えば、衛生目的で使われる紙にも、１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸を使った抗バイオフィルム特性を付与することもできる。また、不織布、例えば、おむつ／おしめ、生理用ナプキン、パンティーライナー、および衛生用布巾および家庭用品に、抗バイオフィルム特性を付与することもできる。
【００６１】
また、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、特に、工業配合物、例えば、コーティング、潤滑剤等に抗バイオフィルム特性を付与する、または維持する処理をするのにも適している。
【００６２】
また、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、洗浄および清浄配合物、例えば、液体または粉末洗浄剤または柔軟剤にも使用可能である。本明細書記載のＤ−アミノ酸は、また、硬質表面の洗浄と消毒のための家庭用および汎用洗浄剤としても使用可能である。代表的洗浄配合物は、例えば、次の組成を有する：０．０１〜５重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、３．０重量％のオクチルアルコール４ＥＯ、１．３重量％の脂肪アルコールＣ８〜Ｃ１０ポリグルコシド、３．０重量％のイソプロパノール、および水添加１００％。
【００６３】
また、本明細書記載のＤ−アミノ酸は、木材の抗バイオフィルム処理および革の抗バイオフィルム処理、抗バイオフィルム特性を付与した革の保護および革の貯蔵にも使用可能である。本明細書記載のＤ−アミノ酸は、また、化粧品および家庭用品を微生物の被害から保護するためにも使用可能である。
【００６４】
本明細書記載のＤ−アミノ酸は、問題になっている対象物品または対象物品の表面に１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸を組み込むことにより、またはコーティングまたはフィルムの一部としてこれらの表面に抗バイオフィルムを適用することにより、生物付着を防ぐ、または表面の微生物蓄積を除去または管理するのに有用である。このような表面は、海洋環境（淡水、半塩水および塩水環境を含む）と接触する表面、例えば、船体、ドックの表面または循環または通過水システム中のパイプの内面を含む。同様な生物付着を受けやすい他の表面としては、例えば、雨水露出壁、シャワー室の壁、屋根、排水路、プール域、サウナ、例えば、地階またはガレージなどの湿気環境露出フロアおよび壁、、および工具箱およびアウトドア家具さえも挙げられる。米国特許第７、６１８、６９７号（参照により全体が組み込まれる）は、生物付着から表面を保護するコーティングまたはフィルムとして有用な化合物を開示している。
【００６５】
フィルムまたはコーティングの一部として適用する場合は、本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸は、結合剤を含む組成物の一部としてもよい。結合剤は、本抗バイオフィルムと適合する任意のポリマーまたはオリゴマーであってよい。結合剤は、抗付着組成物調製の前のポリマーまたはオリゴマーの形であってもよく、または、基質への適用後を含む調製の間または後の重合により形成されてもよい。特定の適用、例えば、特定のコーティング適用では、適用後の抗付着組成物オリゴマーまたはポリマーを架橋させることが望ましいであろう。本明細書で使われる用語の「結合剤」には、材料、例えば、木材、プラスチック、ガラスおよび他の表面の保護の目的で商業的に使用されているグリコール、オイル、ワックスおよび界面活性剤もまた含まれる。例には、木材用防水剤、ビニル保護剤、保護ワックス、等が挙げられる。
【００６６】
組成物は、コーティングまたはフィルムであってもよい。組成物が、例えば、カレンダー仕上げまたは共押し出しを含む接着剤の使用または溶融塗布により表面に適用される熱可塑性フィルムの場合は、結合剤は、フィルム調製に使用される熱可塑性ポリマーマトリックスである。組成物がコーティングの場合には、組成物は、液体溶液または懸濁液、ペースト、ゲル、オイルとして適用でき、またはコーティング組成物は、固体、例えば、粉末コーティングでもよく、これは、その後、熱、ＵＶ光他の方法により硬化される。
【００６７】
本発明の組成物は、コーティングまたはフィルムでもよいので、結合剤は、コーティング調製またはフィルム調製に使用される任意のポリマーを含むことができる。例えば、結合剤は、熱硬化、熱可塑、エラストマー、元々架橋しているまたは架橋させたポリマーである。熱硬化、熱可塑、エラストマー、元々架橋しているまたは架橋させたポリマーには、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリビニルアセタート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ハロゲン化ビニルポリマー例えば、ＰＶＣ、天然および合成ゴム、アルキド樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル、不飽和ポリアミド、ポリイミド、シリコン含有およびカルバマートポリマー、フッ素化ポリマー、置換アクリルエステル由来、例えば、エポキシアクリラート、ウレタンアクリラートまたはポリエステルアクリラート由来架橋性アクリル樹脂が含まれる。また、ポリマーは、前出材料の混合物でも、共重合体でもよい。
【００６８】
生体適合性コーティングポリマー、例えば、ポリ［−アルコキシアルカノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシアルケノアート］（ＰＨＡＥ）ポリエステル（Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ．ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５２、６５−７０（２００４））もまた、本発明の結合剤として使用可能である。アルキド樹脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ樹脂、シリコーン含有ポリマー、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、フッ素化ポリマーおよびビニルアセタートポリマー、ビニルアルコールおよびビニルアミンは、本発明に有用な通常のコーティング結合剤の非制限的例である。他の既知のコーティング結合剤は、本開示の一部である。
【００６９】
コーティングは、例えば、メラミン樹脂、尿素樹脂、イソシアナート、イソシアヌラート、ポリイソシアナート、エポキシ樹脂、無水物、ポリ酸およびアミンで架橋可能であり、アクセラレータを加えても加えなくてもよい。本明細書記載の組成物は、生物蓄積に好適な条件に暴露される表面に適用される、例えば、コーティングであってもよい。前記コーティング中の本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸の存在が、表面への生物の付着を防ぐ。
【００７０】
本明細書記載のＤ−アミノ酸は、完全なコーティングまたはペンキ配合物、例えば、海洋ゲルコート、セラック、ワニス、ラッカーもしくはペンキの一部であってもよく、または抗付着組成物は、本発明のポリマーと結合剤のみ、または本発明のポリマー、結合剤およびキャリア物質のみを含んでもよい。このようなコーティング配合物または適用において、当技術分野で既知の他の添加物もまた、適する。
【００７１】
コーティングは溶媒ベースでも水性でもよい。水性コーティングは、通常、より環境に優しいと考えられる。一部の例では、コーティングは、本明細書記載の１つまたは複数のＤ−アミノ酸、および結合剤または水ベースコーティングもしくはペンキの水性分散液であってもよい。例えば、コーティングは、１つまたは複数のＤ−アミノ酸およびアクリル、メタクリル酸またはアクリルアミドポリマーもしくはコポリマーまたはポリ［−アルコキシアルカノアート−ｃｏ−３−ヒドロキシアルケノアート］ポリエステルの水性分散液を含んでもよい。
【００７２】
コーティングは、前にコートされた対象物品上に適用された保護剤コーティング、仕上げ塗装または保護ワックス、等の既にコーティングがなされている表面にも適用可能である。コーティングシステムには、海洋コーティング、木材コーティング、他の金属用コーティングおよびプラスチックおよびセラミック上のコーティングが含まれる。代表的海洋コーティングは、不飽和ポリエステル、スチレンおよび触媒を含むゲルコートである。一部の例では、コーティングは、ハウスペイント、または他の修飾的または保護ペンキである。また、ペンキまたはセメント、コンクリートまたは他の石造物品に適用される他のコーティングであってもよい。コーティングは、地階または基礎用等の防水剤であってもよい。
【００７３】
一部の例では、コーティング組成物は、スピンコーティング、ディップコーティング、スプレーコーティング、へら引き、または刷毛、ローラーまたは他の塗布器を含む任意の従来の手段により表面に塗装できる。乾燥または硬化時間を考慮して適用してもよい。
【００７４】
コーティングまたはフィルムの厚さは、用途に応じて変わるが、当業者ならわずかな試験の後に容易に決定できる。
【００７５】
一部の例では、本明細書記載の組成物は、保護用のラミネートフィルムの形であってもよい。このようなフィルムは、熱硬化、熱可塑、エラストマー、または架橋ポリマーを含んでもよい。これらに限定されないが、このようなポリマーの例には、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリビニルアセタート、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ハロゲン化ビニルポリマー、例えば、ＰＶＣ、天然および合成ゴム、アルキド樹脂、エポキシ樹脂、不飽和のポリエステル、不飽和のポリアミド、ポリイミド、フッ素化ポリマー、シリコン含有およびカルバマートポリマーが含まれる。ポリマーは、また、前述の材料の混合物および共重合体であってもよい。
【００７６】
本明細書記載の組成物がプリフォームフィルムである場合は、例えば、接着剤の使用、または表面上への共押し出しにより表面に適用可能である。また、本発明のエステルを採用するのが好都合でもあるシーラントまたはコーキングの使用が必要と思われる締め具を介して機械的に貼り付けることもできる。プラスチックフィルムは、また、カレンダー仕上げ、溶融塗布およびシュリンクラップを含む熱を使った適用が可能である。
【００７７】
他の例では、本明細書記載の組成物は、研磨剤、例えば、家具研磨剤、または分散剤もしくは界面活性剤配合物、例えば、グリコールもしくはミネラルオイル分散剤または例えば、木材保護に使われるような他の配合物の一部であってもよい。有用な界面活性剤の例には、これらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンテトラオレアート（ＰＳＴ）、ポリオキシエチレンソルビトールヘキサオレアート（ＰＳＨ）、ポリオキシエチレン６トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１２トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１８トリデシルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤、トリトン（登録商標）界面活性剤、およびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）およびポロキサマー（登録商標）製品シリーズ（ＢＡＳＦ）を含む、ポリオキシエチレンベース界面活性剤が含まれる。他のマトリックス形成成分には、デキストラン、直鎖ＰＥＧ分子（ＭＷ５００〜５、０００、０００）、星形ＰＥＧ分子、コーム型およびデンドリマー状、多分岐ＰＥＧ分子、ならびに類似の直鎖、星形、およびデンドリマーポリアミンポリマー、および種々の炭酸塩化、全フッ素置換（例えば、ＤＵＰＯＮＴ ＺＯＮＹＬ（登録商標）フッ素系界面活性剤）およびシコーン化（例えば、ジメチルシロキサン−エチレンオキシドブロック共重合体）界面活性剤が含まれる。
【００７８】
本明細書記載のＤ−アミノ酸の広範囲の適用を考えると、Ｄ−アミノ酸含有組成物は、他の添加物、例えば、抗酸化剤、ＵＶ吸収剤、ヒンダードアミン、ホスフィットまたはホスホニット、ベンゾフラン−２−オン、チオ相乗剤、ポリアミド安定剤、金属ステアラート、各形成剤、充填剤、強化剤、潤滑剤、乳化剤、染料、顔料、分散剤、他の光学的光沢剤、難燃剤、帯電防止剤、発泡剤、等、例えば、下記に列挙した材料、またはこれらの混合物を含んでもよい。
【００７９】
処置される基質は、無機または有機基質、例えば、金属または金属合金；上述のように元来架橋しているまたは架橋させた熱可塑性、エラストマーポリマー；天然ポリマー、例えば、木材またはゴム；セラミック材料；ガラス；革または他の織物であってもよい。基質は、例えば、非金属無機表面、例えば、シリカ、二酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化鉄、炭素、シリコン、種々のケイ酸塩およびゾルゲル、石造物、および複合材料、例えば、グラスファイバーおよびプラスチック木材（ポリマーと木材削りくず、木粉または他の木材粒子の混合物）であってもよい。
【００８０】
基質は、同じまたは異なる部材の各層からなる多層対象物品であってもよい。コートまたは積層される表面は、既にコーティングまたは積層を適用した露出表面であってもよい。
【００８１】
コートまたは積層される無機または有機基質は、どのような固形形態であってもよい。
【００８２】
例えば、ポリマー基質は、フィルムの形状のプラスチック、射出成形対象物品、押し出し製品、繊維、フェルトまたは織物であってもよい。例えば、耐久財、例えば、壁板、鼻隠し板および郵便受け、の構築組み立てまたは製造に使用される成形または押し出し高分子対象物品は、すべて本Ｄ−アミノ酸の組込みの利益を得ることができる。特定の状況下では、１つまたは複数のＤ−アミノ酸を、例えば、成形プロセス等の形成の間に高分子対象物品中に組み込むことができる。
【００８３】
本方法から利益が得られるプラスチックには、これらに限定されないが、耐久財または機械部品の構築または製造に使われる下記を含むプラスチックが含まれる。アウトドア家具、ボート、壁板、屋根ふき材、つや出し材料、保護フィルム、ステッカー、シーラント、プラスチック木材および繊維強化複合材料等の複合材料、ディスプレイに使われるフィルムを含む機能性フィルムならびに合成繊維から構築される対象物品、例えばオーニング、例えば、キャンバスまたは帆に使われる繊維およびゴム対象物品、例えば、アウトドアマット、フロアカバー、プラスチックコーティング、プラスチック容器およびパッケージング材料；キッチンおよび浴室用具（例えば、ブラシ、シャワーカーテン、スポンジ、バスマット）、ラテックス、フィルター材料（空気および水フィルター）、医学の分野で使われるプラスチック対象物品、例えば、包帯材、注射器、カテーテル等、いわゆる「医療機器」、手袋およびマットレス。代表的なこのようなプラスチックスは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ＰＶＣ、ＰＯＭ、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリル酸およびメタクリル酸、ポリブタジエン、熱可塑性ポリオレフィン、イオノマー、不飽和のポリエステルおよびＡＢＳ、ＳＡＮおよびＰＣ／ＡＢＳを含むポリマー樹脂の混合物である。
【００８４】
１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸の再循環冷却水中への組込み等の特定の状況では、パイプおよび他の機械的な装置の壁のバイオフィルム蓄積を防ぐために、数ｐｐｍのＤ−アミノ酸の使用で有効である。しかし、浸出に起因する幾分かのロス、アミノ酸に関連する反応による幾分かのロスおよび分解反応等による幾分かのロス等とは、実施に当たり、適用が想定される期間にわたり、Ｄ−アミノ酸が暴露される環境的ストレスを考慮に入れて、有効であると思われる濃度を有する配合物を調製する必要があることを意味する。
【００８５】
例えば、工業用水への適用では、処理される水に対して、約０．００１重量％〜約１０重量％または、例えば、０．００１重量％〜１０重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能であり、しばしば約１０％未満の上限値が使用可能であり、例えば、約５％、約３％、約２％または約１％以下でさえも、多くの環境中で有効である可能性があり、例えば、約０．０１％〜約５％、または約０．０１％〜約２％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸の添加レベルが使用可能である。他の実施形態では、１０％、５％、３％、２％、１％、未満の上限値が使用可能であり、例えば、０．０１重量％〜５重量％、または約．０１重量％〜２重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能である。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すれば、非常に少ない量で、環境中で有効であり、約０．０００００１％〜約０．５％の濃度、例えば、約０．０００００１％〜約０．１％または、約０．０００００１％〜約０．０１％の濃度が、工業用水適用で使用可能である。他の実施形態では、０．０００００１％〜０．５％の濃度、例えば、０．０００００１％〜０．１％または０．０００００１％〜０．０１％濃度が、工業用水適用で使用可能である。
【００８６】
Ｄ−アミノ酸、特に低濃度のものは、摂取の可能性のある用途、例えば、バイオフィルム発生の可能性のある再利用可能水ボトルまたは飲用容器であっても安全に使用可能である。このような水輸送機器の表面は、１つまたは複数の本明細書記載のＤ−アミノ酸を含む製剤で洗浄可能であり、または低レベルの１つまたは複数のＤ−アミノ酸を、導管を通過する水の中に導入可能である。例えば、約０．０００１重量％未満または約１重量％までの、典型的には、約０．１重量％未満の１つまたは複数のＤ−アミノ酸をこのような水中に導入できる。他の例では、０．０００１重量％以下または１重量％まで、典型的には、０．１重量％未満の１つまたは複数のＤ−アミノ酸を、このような水の中に導入可能である。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、約０．０００００１％〜約０．１％、例えば、約０．０００００１％〜約０．０１％、または約０．０００００１％〜約０．００１％がこのような用途に使用可能である。別の例では、０．０００００１％〜０．１％、０．０００００１％〜０．０１％、または０．０００００１％〜０．００１％の濃度が、使用可能である。
【００８７】
一部の例では、液体製剤は、約０．０００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜約５０μＭ Ｄ−アミノ酸、例えば、約０．００１μＭ Ｄ−アミノ酸〜約２５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００２μＭ Ｄ−アミノ酸〜約１０μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００３μＭ Ｄ−アミノ酸〜約５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００４μＭ Ｄ−アミノ酸〜約１μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．５μＭ Ｄ−アミノ酸、約０．０１μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．１μＭ Ｄ−アミノ酸、または約０．０２μＭ Ｄ−アミノ酸〜約０．１μＭ Ｄ−アミノ酸の濃度で調製される。他の実施形態では、液体製剤は、０．０００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜５０μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００１μＭ Ｄ−アミノ酸〜２５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００２μＭ Ｄ−アミノ酸〜１０μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００３μＭ Ｄ−アミノ酸〜５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００４μＭ Ｄ−アミノ酸〜１μＭ Ｄ−アミノ酸、０．００５μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．５μＭ Ｄ−アミノ酸、０．０１μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．１μＭ Ｄ−アミノ酸、または０．０２μＭ Ｄ−アミノ酸〜０．１μＭ Ｄ−アミノ酸の濃度で調製される。好ましくは、Ｄ−アミノ酸組成物は、ナノモル濃度、例えば、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約５０ｎＭ、またはそれ以上の濃度である。他の実施形態では、Ｄ−アミノ酸組成物は、約５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、または５０ｎＭの濃度である。
【００８８】
コーティングまたはフィルムとして使用される場合は、短期の使用には、少量の１つまたは複数のＤ−アミノ酸の存在でよく、例えば、季節限定または廃棄用途等に使用可能である。一般的に、約０．００１％以下から約５％まで、例えば、約３％まで、または約２％までを、このようなコーティングまたはフィルムに使用可能である。他の実施形態では、０．００重量１％から５重量％まで、または重量３％まで、または２重量％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸を使用可能である。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すれば、多くの環境中で非常に少量で有効であり、約０．０００１％〜約１％、例えば、約０．０００１％〜約０．５％、または約０．０００１％〜約０．０１％の濃度をコーティング適用に対し使用可能である。他の実施形態では、０．０００１重量％〜１重量％、０．０００１重量％〜０．５重量％、または０．０００１重量％〜０．０１重量％の濃度の１つまたは複数のＤ−アミノ酸をコーティング適用に対し使用可能である。
【００８９】
より堅牢な用途、例えば、海洋、プール、シャワーまたは建設用材料へのコーティングに対しては、より高レベルの１つまたは複数のＤ−アミノ酸を使用可能である。例えば、コーティングまたはフィルム配合物ベースで約０．０１％〜約３０％を採用可能である；多くの用途では、約０．０１％〜約１５％、または約０．０１％〜約１０％で有効であり、約０．０１％〜約５％、または約０．０１％〜約１％、または約０．１％以下のＤ−アミノ酸でさえ、使用可能であることが多い。他の実施形態では、０．０１％〜１５％、または０．０１％〜１０％で有効であり、０．０１％〜５％、または０．０１％〜１％、またはただの０．１％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能であることが多い。
【００９０】
成形プラスチック製品への組込みに対しては、約０．００００１％〜約１０％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能で、例えば、重量ベースで、約０．０００１％〜約３％、例えば、約０．００１％から約１％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能でありうる。一部の実施形態では、０．００００１％〜１０％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能であり、または０．０００１％〜３％、または０．００１％から１％までの１つまたは複数のＤ−アミノ酸が使用可能である。すでに成形済みの製品または線維の表面中にＤ−アミノ酸が含浸された状況では、表面に存在するＤ−アミノ酸の実際の量は、基質材料、含浸組成物の配合、および含浸ステップの間に使われた時間と温度に依存すると思われる。本Ｄ−アミノ酸の高活性を考慮すると、非常に少ない量で多くの環境中で有効であり、重量ベースで、約０．０００１％〜約１％、例えば、約０．０００１％〜約０．１％、もしくは約０．０００１％〜約０．０１％の濃度がプラスチックスに使用可能である。他の実施形態では、０．０００１重量％〜１重量％、もしくは０．０００１重量％〜０．１重量％、もしくは、０．０００１重量％〜０．０１重量％の１つまたは複数のＤ−アミノ酸をプラスチックに使用可能である。
【００９１】
Ｄ−アミノ酸を使った処理によるバイオフィルムの阻害または減少は、当技術分野で充分に確立された技術を使って測定できる。これらの技術は、吸着生物の発色を測定し、顕微鏡法を使ってインビボで微生物を観察することにより細菌の付着を評価すること、または毒性試薬に応答したバイオフィルム中の細胞死をモニターすることを可能にする。処理後、バイオフィルムは、バイオフィルムに覆われている表面積、厚さ、および一貫性（例えば、バイオフィルムの健全性）を減らすことができる。バイオフィルムアッセイの非制限的例には、マイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイ、蛍光ベースバイオフィルムアッセイ、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：３６９３-３７０１（２００５）による静的バイオフィルムアッセイ、空気液体界面アッセイ、コロニーバイオフィルムアッセイ、およびＫａｄｏｕｒｉ Ｄｒｉｐ−Ｆｅｄバイオフィルムアッセイ（Ｍｅｒｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．、（２００５）微生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１．Ｂ．１．１−１．Ｂ．１．１７）が含まれる。このようなアッセイは、バイオフィルム形成の破壊または阻害に対するＤ−アミノ酸の活性の測定に使用できる（Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７（６）：６６３−７２；Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００６）Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ５（１）：３２−６）。
【００９２】
一部の例では、Ｄ−アミノ酸は、第２の試薬、例えば、殺生物剤、抗生物質と組み合わせて使用し、バイオフィルムを処理するまたはバイオフィルムの形成を防ぐことができる。抗生物質は、順次または同時にＤ−アミノ酸と組み合わせることができる。例えば、本明細書記載の組成物のいずれかを１つまたは複数のＤ−アミノ酸と、１つまたは複数の第２の試薬とを含むように処方することができる。
【００９３】
抗生物質は、細菌の増殖を阻害する、または細菌を死滅させる当業者に既知の任意の化合物でよい。有用な抗生物質の非制限的例には、リンコサミド（クリンダマイシン）；クロラムフェニコール；テトラサイクリン（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン）；アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン）；ベータ−ラクタム（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アズトレオナム）；糖ペプチド抗生物質（例えば、バンコマイシン）；ポリペプチド抗生物質（例えば、バシトラシン）；マクロライド（エリスロマイシン）、アンフォテリシン；スルホンアミド（例えば、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファシチン、スルファドキシン、マフェナイド、ｐ‐アミノ安息香酸、トリメトプリム−スルファメトキサゾール）；メテナミン；ニトロフラントイン；フェナゾピリジン；トリメトプリム；リファンピシン；メトロニダゾール；セファゾリン；リンコマイシン；スペクチノマイシン；ムピロシン；キノロン（例えば、ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、ペルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、レボフロキサシン）；ノボビオシン；ポリミキシン；グラミシジン；および抗シュードモナス（例えば、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリンカルベニシリン）またはそれらのいずれかの塩もしくは変異体が含まれる。このような抗生物質は、市販品として、例えば、Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ、Ｉｎｃ．（Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ、ＮＪ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）、およびＳａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）から入手可能である。使用される抗生物質は、細菌感染のタイプに依存する。
【００９４】
追加の既知の殺生物剤には、トリクロサン、二酸化塩素、ビグアナイド、クロルヘキシジン、キシリトール、等が含まれる。
【００９５】
抗菌剤の有用な例には、これらに限定されないが、次のものが含まれる：ピリチオン、特に、亜鉛錯体（ＺＰＴ）；Ｏｃｔｏｐｉｒｏｘ（登録商標）；ジメチルジメチロールヒダントイン（Ｇｌｙｄａｎｔ（登録商標））；メチルクロロイソチアゾリノン／メチルイソチアゾリノン（Ｋａｔｈｏｎ ＣＧ（登録商標））；ナトリウムスルフィット；ナトリウムビスルフィット；イミダゾリジニル尿素（Ｇｅｒｍａｌｌ １１５（登録商標））、ジアゾリジニル尿素（Ｇｅｒｍａｉｌｌ ＩＩ（登録商標））；ベンジルアルコール；２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１、３−ジオール（Ｂｒｏｎｏｐｏｌ（登録商標））；ホルマリン（ホルムアルデヒド）；ヨードプロピニルブチルカルバマート（Ｐｏｌｙｐｈａｓｅ Ｐ１００（登録商標））；クロルアセトアミド；メタンアミン；メチルジブロモニトリルグルタロニトリル（１、２−ジブロモ−２、４−ジシアノブタンまたはＴｅｋｔａｍｅｒ（登録商標））；グルタルアルデヒド；５−ブロモ−５−ニトロ−１、３−ジオキサン（Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標））；フェネチルアルコール；ｏ−フェニルフェノール／ナトリウムｏ−フェニルフェノール；ナトリウムヒドロキシメチルグリシナート（Ｓｕｔｔｏｃｉｄｅ Ａ（登録商標））；ポリメトキシ二環式オキサゾリジン（ＮｕｏｓｅｐｔＣ（登録商標））；ジメトキサン；チメロサール；ジクロロベンジルアルコール；カプタン；クロルフェネシン；ジクロロフェン；クロロブタノール；グリセリルラウラート；ハロゲン化ジフェニルエーテル；２、４、４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシ−ジフェニルエーテル（トリクロサン（登録商標）またはＴＣＳ）；２、２’−ジヒドロキシ−５、５’−ジブロモ−ジフェニルエーテル；フェノール性化合物；フェノール；２−メチルフェノール；３−メチルフェノール；４−メチルフェノール；４−エチルフェノール；２、４−ジメチルフェノール；２、５−ジメチルフェノール；３、４−ジメチルフェノール；２、６−ジメチルフェノール；４−ｎ−プロピルフェノール；４−ｎ−ブチルフェノール；４−ｎ−アミルフェノール；４−ｔｅｒｔ−アミルフェノール；４−ｎ−ヘキシルフェノール；４−ｎ−ヘプチルフェノール；モノおよびポリアルキルおよび芳香族ハロフェノール；ｐ−クロロフェノール；メチルｐ−クロロフェノール；エチルｐ−クロロフェノール；ｎ−プロピルｐ−クロロフェノール；ｎ−ブチルｐ−クロロフェノール；ｎ−アミルｐ−クロロフェノール；ｓｅｃ−アミルｐ−クロロフェノール；シクロヘキシルｐ−クロロフェノール；ｎ−ヘプチルｐ−クロロフェノール；ｎ−オクチルｐ−クロロフェノール；ｏ−クロロフェノール；メチルｏ−クロロフェノール；エチルｏ−クロロフェノール；ｎ−プロピルｏ−クロロフェノール；ｎ−ブチルｏ−クロロフェノール；ｎ−アミルｏ−クロロフェノール；ｔｅｒｔ−アミルｏ−クロロフェノール；ｎ−ヘキシルｏ−クロロフェノール；ｎ−ヘプチルｏ−クロロフェノール；ｏ−ベンジルｐ−クロロフェノール；ｏ−ベンジル−ｍ−メチルｐ−クロロフェノール；ｏ−ベンジル−ｍ；ｍ−ジメチルｐ−クロロフェノール；ｏ−フェニルエチルｐ−クロロフェノール；ｏ−フェニルエチル−ｍ−メチルｐ−クロロフェノール；３−メチルｐ−クロロフェノール；３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−エチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−ｎ−プロピル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−イソ−プロピル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−エチル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ｓｅｃ−ブチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−イソ−プロピル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ジエチルメチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；６−イソ−プロピル−２−エチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；２−ｓｅｃ−アミル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；２−ジエチルメチル−３、５−ジメチルｐ−クロロフェノール；６−ｓｅｃ−オクチル−３−メチルｐ−クロロフェノール；ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール：ｐ−ブロモフェノール；メチルｐ−ブロモフェノール；エチルｐ−ブロモフェノール；ｎ−プロピルｐ−ブロモフェノール；ｎ−ブチルｐ−ブロモフェノール；ｎ−アミルｐ−ブロモフェノール；ｓｅｃ−アミルｐ−ブロモフェノール；ｎ−ヘキシルｐ−ブロモフェノール；シクロヘキシルｐ−ブロモフェノール；ｏ−ブロモフェノール；ｔｅｒｔ−アミルｏ−ブロモフェノール；ｎ−ヘキシルｏ−ブロモフェノール；ｎ−プロピル−ｍ、ｍ−ジメチルｏ−ブロモフェノール；２−フェニルフェノール；４−クロロ−２−メチルフェノール；４−クロロ−３−メチルフェノール；４−クロロ−３、５−ジメチルフェノール；２、４−ジクロロ−３、５−ジメチルフェノール；３、４、５、６−テラブロモ−２−メチルフェノール；５−メチル−２−ペンチルフェノール；４−イソプロピル−３−メチルフェノール；パラ−クロロ−メタ−キシレノール（ＰＣＭＸ）；クロロチモール；フェノキシエタノール；フェノキシイソプロパノール；５−クロロ−２−ヒドロキシジフェニルメタン；レゾルシノールおよびその誘導体；レゾルシノール；メチルレゾルシノール；エチルレゾルシノール；ｎ−プロピルレゾルシノール；ｎ−ブチルレゾルシノール；ｎ−アミルレゾルシノール；ｎ−ヘキシルレゾルシノール；ｎ−ヘプチルレゾルシノール；ｎ−オクチルレゾルシノール；ｎ−ノニルレゾルシノール；フェニルレゾルシノール；ベンジルレゾルシノール；フェニルエチルレゾルシノール；フェニルプロピルレゾルシノール；ｐ−クロロベンジルレゾルシノール；５−クロロ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；４’−クロロ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；５−ブロモ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；４’−ブロモ２、４−ジヒドロキシジフェニルメタン；ビスフェノール酸化合物；２、２’−メチレンビス−（４−クロロフェノール）；２、２’−メチレンビス−（３、４、６−トリクロロフェノール）；２、２’−メチレンビス（４−クロロ−６−ブロモフェノール）；ビス（２−ヒドロキシ−３、５−ジクロロフェニル）スルフィド；ビス（２−ヒドロキシ−５−クロロベンジル）スルフィド；安息香酸エステル（パラベン）；メチルパラベン；プロピルパラベン；ブチルパラベン；エチルパラベン；イソプロピルパラベン；イソブチルパラベン；ベンジルパラベン；ナトリウムメチルパラベン；ナトリウムプロピルパラベン；ハロゲン化カルバニリド；３、４、４’−トリクロロカルバニリド（トリクロカーバン（登録商標）またはＴＣＣ）；３−トリフルオロメチル−４、４’−ジクロロカルバニリド；３、３’、４−トリクロロカルバニリド；クロルヘキシジンおよびそのジグルコナート；ジアセタートおよびジヒドロクロリド；ウンデセン酸；チアベンダゾール、ヘキセチジン；ポリ（ヘキサメチルエネビグアニド）塩酸塩（Ｃｏｓｍｏｃｉｌ（登録商標））；銀化合物、例えば、有機銀塩またはＪＭ Ａｃｔｉｃａｒｅ（登録商標）および微粒子化した銀粒子等のそれらの製剤を含む無機銀塩、銀塩化物。
【００９６】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これは、請求項に記載の本発明の範囲を制限するものではない。室温は、２０〜２５℃の範囲の温度を示す。
【実施例】
【００９７】
材料と方法
株と培地。 Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃またはＭＳｇｇ培地（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１６２１（２００１））中、２３℃で枯草菌ＮＣＩＢ ３６１０およびその誘導体を成長させた。固形培地には、１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒを添加した。必要な場合は、枯草菌の増殖用に抗生物質を次の濃度で添加した：テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ、およびエリスロマイシン５μｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍｌ。
【００９８】
本実験で使った株：
全枯草菌株は、強固なバイオフィルムを形成する野生株のＮＣＩＢ３６１０の誘導体である（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１６２１（２００１）） ；
株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺ ｃａｔ）（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６）） ；
株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺ ｓｐｅｃ）（Ｃｈｕｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２１６（２００６）） ；
株ＩＫＧ５５（ΔｒａｃＸ：：ｓｐｅｃ ΔｙｌｍＥ：：ｔｅｔＲ） ；
株ＤＲ−３０（ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ ｃａｔ）；
株ＩＫＧ４０（ｙｑｘＭ２）；
株ＩＫＧ４４（ｙｑｘＭ６）；
株ＩＫＧ５０（ｙｑｘＭ２ ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）；
株ＩＫＧ５１（ｙｑｘＭ６ ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ）；
ブドウ球菌ＳＣ０１（Ｋｏｌｔｅｒ ｌａｂコレクション由来）。
【００９９】
株構築。標準的手法を使って株を構築した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ、２００１）。ロングフランキングＰＣＲ変異誘発を使ってΔｒａｃＸ：：ｓｐｅｃおよびΔｙｌｍＥ：：ｔｅｔＲを生成した（Ｗａｃｈ、Ｙｅａｓｔ １２：２５９（１９９６））。ＤＮＡを、コンピテント細胞のＤＮＡ媒介形質転換により、株ＰＹ７９誘導体中に導入した（Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：３１８（１９７８））。ＳＰＰ１ファージ媒介形質導入を使って、抗生物質耐性結合変異をＰＹ７９誘導体からＮＣＩＢ ３６１０中に導入した（Ｙａｓｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４：１３４３（１９７４））。
【０１００】
試薬。 アミノ酸をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。１４Ｃ−Ｄ−チロシンおよび１４Ｃ−Ｌ−プロリンをＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０１０１】
コロニーおよびペリクル形成。固形培地上へのコロニー形成形成のために、細胞を最初にＬＢ培地中で指数増殖期迄増殖し、３μｌの培養液を１．５％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ含有固形ＭＳｇｇ培地上に配置した。プレートを２３℃でインキュベートした。液体培地中のペリクル形成のために、細胞を指数増殖期迄成長させ、１２ウエルプレート（ＶＷＲ）中で、６μｌの培養液を６ｍｌの培地と混合した。プレートを２３℃でインキュベートした。コロニーとペリクルの画像をＳＰＯＴカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）で撮影した。
【０１０２】
馴化培地の調製。ＬＢ培地中で細胞を指数増殖期まで成長させた。０．１ｍｌの培養液を１００ｍｌのＭＳｇｇ培地に添加し、５００ｍｌビーカー中、２３℃で振盪を加えずに成長させた。次に、遠心分離を使って８、０００ｒｐｍ、１５分間ペリクルおよび馴化培地を集めた。馴化培地（上清液）を取りだし、０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾液を４℃で貯蔵した。さらなる精製のために、Ｃ−１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカートリッジを使って、５％毎のステップの０％〜１００％メタノールによる段階的溶出により、バイオフィルム阻害活性を分別した。
【０１０３】
馴化培地中のＤ−アミノ酸の特定および定量化。（Ａ）アミノ酸の定量化。Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、およびＴｒｐの標準溶液を種々の濃度（０．００１〜０．２ｍＭ）で調製した。これらの溶液を０％〜６０％から１００％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸含有）のステップ勾配溶媒系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ ４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）の（０−１２−２０分）の条件でＬＣ／ＭＳで分析し、イオンカウント積分により各アミノ酸濃度の検量線を得た。馴化培地試料を、全４つのキラルアミノ酸の全体濃度測定と同じ方法でＬＣ／ＭＳを使って分析した。（Ｂ）Ｄ−アミノ酸の特定。試料をＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥し、１００μＬの１Ｎ ＮａＨＣＯ３に溶解した。１０ｍｇ／ｍＬのＬ−ＦＤＡＡ（Ｎ−（２、４−ジニトロ−５−フルオロ−フェニル）−Ｌ−アラニンアミド）溶液をアセトン中で調製し、５０μＬのアセトン溶液を１Ｎ ＮａＨＣＯ３中の試料に添加した。反応混合物を８０℃で５分間インキュベートし、５０μＬの２Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた。誘導体を、１０％〜１００％ＣＨ３ＣＮ（０．１％ギ酸含有）の勾配溶媒系を使って３０分間にわたりＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣ／６１３０シリーズＭＳ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）を使って分析した。Ｌ−ＦＤＡＡ−アミノ酸の保持時間をＬ−ＦＤＡＡ真性標準アミノ酸比較した。
【０１０４】
クリスタルバイオレット染色。細胞を６ウエルプレートで成長させたこと以外は、以前記載したのと同様にクリスタルバイオレット染色を行った（Ｏ’Ｔｏｏｌｅｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２９５（１９９８））。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗浄し、完全に乾燥した。
【０１０５】
蛍光顕微鏡観察。蛍光顕微鏡分析用として、１ｍｌの培養液を採取した。細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、５０μｌのＰＢＳ緩衝液中に懸濁した。カバースライドをポリＬ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で前処理した。試料をＯｌｙｍｐｕｓワークステーションＢＸ６１顕微鏡を使って調査した。自動化ソフトウェアプログラムＳｉｍｐｌｅＰＣＩを使って画像を取り込み、ＭｅｔａＭｏｒｐｈプログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使って解析した。
【０１０６】
透過型電子顕微鏡観察および免疫標識。試料を蒸留水で希釈し、炭素またはホルムバール／炭素被覆グリッド上に吸着させた。真空エバポレーター中でグロー放電で使用する前にグリッド表面を親水性にした。試料がフィルム表面上に吸着されるとすぐに、過剰試料を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）で拭き取り、グリッドを５μｌの染色溶液（１〜２％水性ウラニルアセタート）上に数分間浮かべた後、拭き取った。試料を乾燥し、Ｔｅｃｎａｉ（登録商標）Ｇ2ＳｐｉｒｉｔＢｉｏＴＷＩＮ顕微鏡を使い、加速電圧８０ＫＶで調査した。ＡＭＴ ２ｋ ＣＣＤカメラで画像を撮影した。
【０１０７】
ＴａｓＡの免疫局在性のために、ニッケルグリッド上の希釈試料を０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ中の１％脱脂粉ミルクから成るブロッキング緩衝液上に３０分間浮かべ、ブロッキング緩衝液で１：１５０に希釈した抗ＴａｓＡ一次抗体と共に２時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ抗ウサギ２０ｎｍ金二次抗体（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）に１時間暴露し洗浄した。全てのグリッドをウラニルアセタートおよび鉛シトラートで染色した後、上述のように観察した。
【０１０８】
β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイ。細胞をＭＳｇｇ培地中、３７℃でウォーターバスを使って浸透を加えながら培養した。１ｍｌの培養液を各時点で採取した。β−ガラクトシダーゼ活性を以前に記載の方法と同様に測定した（Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：２５４（２００８））。
【０１０９】
アミノ酸の細胞壁への組込み。増殖の指数増殖期の中間点で５０ｍｌの培養液中の細胞を遠心分離により採取し、０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、５ｍｌの同じ緩衝液中に再懸濁した。細胞を、１０μＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリンで処理し、３７℃で２時間、さらにインキュベートした。全細胞および細胞壁画分の放射能をモニターし、間隔を置いて試料を取り出した。全細胞中への取り込みの測定用として、０．１ｍｌの試料を採取した。細胞壁への取り込みの測定用として、０．５ｍｌの試料を採取した。細胞を遠心分離により採取し、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム含有ＳＭ緩衝液［０．５Ｍショ糖、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭカリウムホスファート、ｐＨ（６．８）］中に再懸濁した。次に、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、得られたプロトプラストを５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離より取り出し、細胞壁物質を上清液中に残した。細胞壁画分はタンパク質を含まないことが、抗シグマＡ抗体を使った免疫ブロット法分析により確認された。最後に、１０ｍｌの５％トリクロロ酢酸を全細胞試料および細胞壁物質に添加し、氷上で少なくとも３０分間維持した。ＴＣＡ不溶性物質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（０．２２μｍ孔径、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に採取し、５％ＴＣＡで洗浄した。フィルターを風乾し、シンチレーションバイアル中に置き、シンチレーションカウンターを使って、ＴＣＡ不溶性物のカウント／分を測定した。
【０１１０】
実施例１．枯草菌により形成されたバイオフィルム中のＤ−アミノ酸の選別
枯草菌は、バイオフィルムを誘導培地中での３日間のインキュベーション後の静置培養空気／液体界面に分厚いペリクルを形成する（図１Ａ）。しかし、追加の３から５日のインキュベーションにより、ペリクルは、その構造的健全性を失う（図１−Ｂ）。成熟バイオフィルムが、バイオフィルム分解の引き金を引く因子を産生するのかどうかを調べるために、馴化培地の濃縮および部分精製抽出物の新しい培地を添加した場合のペリクル形成に与える効果をアッセイした。この目的のために、８日間培養液由来の馴化培地をＣ１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカラムに負荷した。次に、そのカラムからの濃縮した溶出液を、新しく播種した培養液に添加した。等容量の馴化培地由来の物質の２５％に相等する濃縮溶出液の量が、ペリクル形成を防ぐのに充分であった（図１Ｃ）。対照としての、３日間培養液由来の馴化培地を使って調製した追加の濃縮溶出液は、ペリクル形成に対しほとんどまたは全く効果を示さないことが観察された（図１Ｄ）。さらなる因子の精製は、メタノールの濃度増加と共にカートリッジを段階的に溶出することにより達成される。４０％メタノールでの溶出により、ペリクル形成の阻害に対し高度に活性な画分が得られた（図１Ｅ）。しかも、この物質は、細胞成長にはほとんどまたは全く影響を与えなかった。バイオフィルム阻害活性は、１００℃で２時間の加熱およびプロテイナーゼＫ処理に耐性を示した（図１Ｆ）。
【０１１１】
Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンが、液体および固形培地の両方で、枯草菌によるバイオフィルム形成を阻害するものとして選別された（図２Ａ、５、６）。図２Ａは、バイオフィルムを誘導する培地中の新しく播種した培養液中へのＤ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）、Ｌ−チロシン（７ｍＭ）、またはＬ−ロイシン（８．５ｍＭ）の添加の、３日間のインキュベーション後のペリクル形成に対する効果を示す。Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンの両方が、対応するＬ−アミノ酸に比較して、バイオフィルム成長に対する有意な阻害を示した。同様に、図５は、Ｄ−トリプトファン（０．５ｍＭ）、Ｄ−メチオニン（２ｍＭ）、Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）またはＬ−メチオニン（５ｍＭ）を補充したＭＳｇｇ培地を含み、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、３日間インキュベートしたウエルを示す。Ｄ−アミノ酸のみが、バイオフィルム形成の阻害に対し活性であった。
【０１１２】
図６は、Ｄ−チロシン（３μＭ）またはＤ−ロイシン（８．５ｍＭ）を補充した固形ＭＳｇｇ培地を含み、株ＮＣＩＢ３６１０を播種し、４日間インキュベートしたプレートを示す。Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシン補両方がバイオフィルム形成を阻害した。
【０１１３】
Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシンおよびＤ−ロイシンは、対応するＬ−アミノ酸に比較して、バイオフィルム成長に対する有意な阻害を示した。対照的に対応するＬ−異性体および他のアミノ酸のＤ−異性体、例えば、Ｄ−アラニンおよびＤ−フェニルアラニンは、枯草菌に対するバイオフィルム阻害アッセイで有効ではなかった。
【０１１４】
次に、バイオフィルム形成を防ぐのに必要な最小濃度（ＭＩＣ：最小阻害濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））を測定した。図２Ｂに示すように、それぞれのＤ−アミノ酸は、活性が変わり、Ｄ−チロシンが最も有効であった。Ｄ−メチオニン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−ロイシンは、約１ｍＭのＭＩＣであり、一包、Ｄ−チロシンは、約１００ｎＭのＭＩＣである。著しいのは、全ての４つのＤ−アミノ酸の混合物（等モル量の）は、特に強力で、１０ｎＭ未満のＭＢＩＣであった。従って、Ｄ−アミノ酸は、相乗的に作用する。Ｄ−アミノ酸は、バイオフィルム形成を阻害するのみでなく、破壊された既存バイオフィルムを破壊した。図２Ｃは、３日間培養液を示し、これに対し、どのアミノ酸も添加されない（未処理）、またはＤ−チロシン（３μＭ）が添加された、またはＤ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−メチオニンおよびＤ−ロイシン（各２．５ｎＭ）の混合物が添加されたものに対し、続いて、さらに８時間インキュベーションを行った。Ｄ−チロシンまたは４つのＤ−アミノ酸の混合物の追加により、８時間の間に、ペリクルの顕著な崩壊が起こった。
【０１１５】
Ｄ−アミノ酸は、これらのアミノ酸のα−炭素立体中心をＬ−型からＤ−型へ変換する酵素であるアミノ酸ラセマーゼにより生成される（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９６：１０３（２００３））。バイオフィルム阻害因子はＤ−アミノ酸であるという考えと一致する遺伝的証拠は、ｙｌｍＥおよびｒａｃＸ、遺伝子の変異体を使って得られ、その予測された産物は、既知のラセマーゼに類似の配列を示した。ｙｌｍＥまたはｒａｃＸ単独に対する株変異体は、ペリクル分解の中程度の遅延を示した（デーは示さず）。図７は、１２ウエルプレート中で成長させ、５日間インキュベートした、ＮＣＩＢ３６１０（ＷＴ）ならびにｙｌｍＥおよびｒａｃＸ（ＩＫＧ１５５）に対し２重に欠失した株変異体を示す。想定上のラセマーゼである二重変異体細胞により形成されたペリクルの分解が有意に遅延し、ラセマーゼ活性が特異的に低減した株もまた、低減した抗バイオフィルム阻害を示すことを示唆している。また、二重変異体由来馴化培地は、野性型由来の馴化培地とは対照的に、バイオフィルム形成阻害に関し無力であった。図２Ｄは、野性型または二重変異体が有意なバイオフィルム成長を示すｙｌｍＥおよびｒａｃＸの二重株変異体（ＩＫＧ５５）の８日間培養液由来の馴化培地の濃縮Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｃ−１８カラム溶出液の効果を示す。
【０１１６】
次いで、Ｄ−アミノ酸がバイオフィルム成熟の間に産生されるのかどうか、また、成熟バイオフィルムの分解を説明するのに充分な存在量で産生されるのかどうかを測定した。従って、ＬＣ／ＭＳを行い、続いて、ペリクル形成の初期および後期に採取した馴化培地に対し、Ｎα−（２、４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド（Ｌ−ＦＤＡＡ）による誘導体化を使ってＤ−アミノ酸を特定した。Ｄ−チロシン（６μＭ）、Ｄ−ロイシン（２３μＭ）、およびＤ−メチオニン（５μＭ）は、６日目までにバイオフィルム形成を阻害するのに必要な、またはそれ超の濃度で存在したが、３日目には、１０ｎＭ未満の濃度で、例えば、バイオフィルム形成を阻害するのに十分ではないレベルで存在したという結果であった。
【０１１７】
馴化培地と同様に、Ｄ−アミノ酸は、細胞成長を阻害せず、マトリックスオペロンｅｐｓおよびｙｑｘＭの発現も阻害しなかった（図８〜９）。図８は、Ｄ−アミノ酸の細胞成長に与える影響を示す。細胞を、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）含有ＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた。Ｄ−アミノ酸処理培養液中の細胞成長は、実質的に未処理試料と同じであった。図９Ａは、株ＦＣ１２２（ＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺ保有）によるＰｙｑｘＭ−ｌａｃＺの発現を示し、図９Ｂは、Ｄ−チロシン（３μＭ）、Ｄ−ロイシン（８．５ｍＭ）または４つのＤ−アミノ酸混合物（各２．５ｎＭ）含有ＭＳｇｇ培地中で振盪を加えながら成長させた株ＦＣ５（ＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺ保有）によるＰｅｐｓＡ−ｌａｃＺの発現を示す。この場合も、Ｄ−アミノ酸処理試料にたいするｙｑｘＭおよびｅｐｓ発現は、実質的に未処理試料と同じであった。
【０１１８】
Ｄ−アミノ酸は、細胞壁のペプチドグリカン成分のペプチド架橋中に組み込まれることを以前報告した。確認のため、細胞をバイオフィルム誘導培地中で成長させ、１４Ｃ−Ｄ−チロシンまたは１４Ｃ−Ｌ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。図３Ａは、放射性Ｄ−チロシンの細胞壁への組込みを示す。１４Ｃ−Ｄ−チロシンを使って、Ｄ−チロシン（１４Ｃ−Ｌ−プロリンではそうではないが）は、細胞壁に組み込まれたことが示された。結果を細胞中への合計組込み（Ｌ−プロリンに対しては３６０、０００ｃｐｍ／ｍｌ、Ｄ−チロシンに対しては４６、０００ｃｐｍ／ｍｌ）のパーセントで表す。
【０１１９】
細胞壁中に組み込まれたＤ−アミノ酸が、ＴａｓＡ繊維を細胞への固定から離脱させることが可能かどうかを調べるために、ＴａｓＡと蛍光のレポーターｍＣｈｅｒｒｙの機能性融合体の局在化を調べた。図３Ｂは、機能性ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ翻訳融合体を含む細胞由来の合計蛍光を示す。細胞を、Ｄ−チロシン（６μＭ）の存在または非存在下のバイオフィルム誘導培地中で振盪を加えながら定常期まで成長させた。図３Ｂに示すように、Ｄ−チロシンによる処理は、ＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙの合計蓄積に対しほとんどまたは全く効果がなかった。対照的に、細胞を遠心分離で洗浄し、再懸濁した後、蛍光顕微鏡で調べた場合は、未処理細胞（凝集していることが多い）は、ＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙで強力に装飾されていることが認められた。対照的に、Ｄ−チロシン処理細胞（ほとんど非凝集）は、低レベルの蛍光を示すに過ぎなかった。Ｄ−ロイシンおよび４つのＤ−アミノ酸等モル混合物でも、同様の結果が得られた。非修飾ＴａｓＡタンパク質の局在化もまた、金標識抗ＴａｓＡ抗体を使って透過電子顕微鏡で解析された。図３Ｄは、電子顕微鏡によるＴａｓＡ繊維の細胞会合を示す。２４時間培養液を、Ｄ−チロシン無し（画像１と２）またはＤ−チロシン（０．１ｍＭ）添加あり（画像３〜６）の場合で、追加の１２時間のインキュベートを行った。ＴａｓＡ繊維を、抗ＴａｓＡ抗体を使って免疫金標識により染色し、実施例に記載のように透過電子顕微鏡により可視化した。外多糖の非存在によりＴａｓＡ繊維の画像処理が著しく改善されたので、細胞は、菌体ｅｐｓオペロン（Δｅｐｓ）の変異であった。中実矢印は、繊維バンドルを示し、中空矢印はそれぞれの繊維を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。拡大画像２、４および６のスケールバーは、１００ｎｍである。画像１と２は、細胞に付着した繊維バンドルを示し、画像３、４および６は、細胞から離脱した個別繊維およびバンドルを示し、画像３〜５は、繊維物質がほとんど無いか全く無い細胞を示す。ＴａｓＡ繊維は、未処理ペリクルの細胞に固定されているように見えた（図３Ｄ、画像１と２）。対照的に、Ｄ−チロシンで１２時間処理した細胞は、ＴａｓＡ繊維ではほとんど装飾されていない細胞の混合物および細胞に固定されていない遊離ＴａｓＡ繊維または繊維凝集体で構成されていた（図３Ｄ、画像３〜６）。理論に拘泥する意図はないが、Ｄ−チロシンがバイオフィルムを処理する１つの機序は、細胞による繊維の脱落の導入である可能性がある。
【０１２０】
Ｄ−アミノ酸が、ＴａｓＡ繊維の細胞への固定を破壊することにより作用することの遺伝的証拠をＤ−チロシン耐性変異体の単離から入手した。図４Ａは、Ｄ−チロシン非含有または含有固形（上段画像）または液体（下段画像）バイオフィルム誘導培地で３日間成長させた細胞を示す。Ｄ−チロシン（図４Ａ）またはＤ−ロイシン（データを示さず）含有固形培地上で成長の間に形成された平坦コロニー上に、しわの寄った乳頭状突起が自然に現れた。重要なことは、全ての４つの活性Ｄ−アミノ酸を含むプレート上には、このような乳頭状突起は出現しなかったことである。精製される場合、これらの自然の変異体は、Ｄ−チロシンまたはＤ−ロイシンの存在下、しわの寄ったコロニーやペリクルを生じた。いくつかのこのような変異体が単離されたが、大抵は、ｙｑｘＭオペロンまたはその近くに変異を含んでいた。２つの変異が詳細に調査され、７５９塩基対長ｙｑｘＭ遺伝子の３’末端近傍のフレームシフト変異であることがわかった。ｙｑｘＭ２は、ｙｑｘＭ読み取り枠中の塩基対７２８の位置のＧ：Ｃの挿入であり、ｙｑｘＭ６は、塩基対５６８の位置のＡ：Ｔの欠失であった（図４Ｂ）。図４Ｂは、ＹｑｘＭの簡略アミノ酸配列を示す。下線は、ｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６フレームシフト変異により図に示された配列変化を生じ、コドンから特定された残基である。
【０１２１】
図３Ｃは、蛍光顕微鏡によるＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞会合を示す。ｔａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合体含有の野性型細胞およびｙｑｘＭ６（ＩＫＧ５１）変異体細胞を、バイオフィルム誘導培地中で、図中で示したようにＤ−チロシン（６μＭ）の存在またはＤ−チロシン非存在（未処理）下で振盪を加えながら定常期（ＯＤ＝１．５）まで成長させ、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。蛍光顕微鏡結果は、ｙｑｘＭ２およびｙｑｘＭ６の存在が、凝集およびＤ−チロシン処理細胞に対するＴａｓＡ−ｍＣｈｅｒｒｙによる細胞装飾を復活させたことを示す（図３Ｃ）。以前に行った仕事では、ＴａｓＡと細胞の結合のためにＹｑｘＭが必要であることが示された（Ｂｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１２２９（２００６））。理論に拘泥する意図はないが、Ｄ−アミノ酸のバイオフィルム阻害効果が、ＹｑｘＭ変異体によって打ち負かされるというこの発見は、Ｄ−アミノ酸の細胞壁への組込みの効果が、ＴａｓＡ繊維の細胞への固定を傷害することであるという考えを補強するものである。ＹｑｘＭのＣ末端近傍ドメインは、細胞壁中のＤ−チロシンまたはＤ−ロイシンの存在に呼応してＴａｓＡ放出の引き金になる可能性がある。
【０１２２】
実施例２．黄色ブドウ球菌および緑膿菌によるバイオフィルム形成におけるアミノ酸の選別
他の細菌に関し、バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果について調査した。病原菌ブドウ球菌は、プラスチック表面上にバイオフィルムを形成する（Ｏｔｔｏ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２２：２０７（２００８））。これは、非結合細胞を洗い流し、結合細胞をクリスタルバイオレットで染色することによって検出できる。図２Ｅは、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グルコース（０．５％）とＮａＣｌ（３％）含有ＴＳＢ培地中で３７℃、２４時間成長させた黄色ブドウ球菌（株ＳＣＯ１）を示す。さらに、アミノ酸添加無し（未処理）、Ｄ−チロシン（５０μＭ）またはＤ−アミノ酸混合物（各１５ｎＭ）添加の条件をウエルに付加した。非結合細胞を洗い流し、クリスタルバイオレットで染色することによりポリスチレン結合細胞を可視化した。図２Ｅは、５０μＭ濃度のＤ−チロシンおよび５０ｎＭ濃度のＤ−アミノ酸混合物（Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニン；各５０ｎＭ）が病原菌によるバイオフィルム形成の阻害に対し極めて効果的であることを示す。
【０１２３】
さらに、図１０は、１０μＭのＤ−チロシンが緑膿菌によるバイオフィルム形成の阻害に対し効果的であったことを示し、また、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンの１μＭの等モル混合物が有効であったことを示す。図１０は、Ｄ−アミノ酸による緑膿菌バイオフィルム形成の阻害を示す。緑膿菌株Ｐ０１４を、１２ウエルポリスチレンプレートを用い、グリセリン（０．２％）およびカザアミノ酸（２０μｇ／ｍｌ）含有Ｍ６３培地中で、３０℃、４８時間成長させた。さらに、アミノ酸添加無し（未処理）、Ｄ−チロシンまたはＤ−アミノ酸等モル混合物添加の条件をウエルに付加した。非結合細胞を洗い流し、クリスタルバイオレットで染色することによりポリスチレン結合細胞を可視化した。ウエルを５００μｌの１．０％クリスタルバイオレット染料で染色し、２ｍｌの再蒸留水で２回洗浄後、完全に乾燥した。
【０１２４】
実施例３．ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルム阻害に対し活性なＤ−アミノ酸混合物
２つの異なる混合物は、ブドウ球菌バイオフィルムの形成の阻害に対し極めて活性である。１つは、Ｄ−チロシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−ロイシンおよびＤ−トリプトファンの等モル混合物である。枯草菌、ブドウ球菌（図１１）、および緑膿菌（図１２）の全試験細菌株で、Ｄ−ｔｒｐ、Ｄ−ｍｅｔ、Ｄ−ｔｙｒおよびＤ−ｌｅｕのＤ−ａａ混合物は、個別のアミノ酸よりも極めて低い濃度で活性であった。表１の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。表２の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＰＡ１４、培地はＭ６３、細胞播種は１．５ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムをクリスタルバイオレット法を使って可視化した。データを下表１と２に示す：
【表１】
【表２】
【０１２５】
Ｄ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリンの等モル混合物は、上記混合物よりもさらに効果的である。また、その混合物は、個々のアミノ酸それぞれよりも混合物として活性が大きい（図１３と１４）。表３と４の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムをクリスタルバイオレット法を使って可視化した。データを表３と４に示す：
【表３】
【表４】
【０１２６】
実施例４．黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の代替定量方法
浮遊細胞をＧｉｌｓｏｎピペットで完全に除去し、次いで、ペーパータオル越しに液体を排出した。次に、バイオフィルムプレートの画像を黒を背景に注意深く撮影した（図１５と１６）。表５と６の実験に対しては、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを黒を背景として視覚に訴える方法で可視化した。データを表５と６に示す：
【表５】
【表６】
【０１２７】
バイオフィルム細胞をＰＢＳ中に再懸濁することにより上記表５と６のプレートから除去し、これらのＯＤ６００を分光光度計を使って測定した（図１７）。表７の実験では、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを吸収された細菌のＯＤ６００を測定することにより可視化した。データを表７示す：
【表７】
【０１２８】
実施例５．エポキシ表面上のブドウ球菌バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果
異なる表面からのＤ−アミノ酸の徐放方法開発の可能性を試験する目的で、エポキシ表面をＤ−アミノ酸混合物中で２４時間インキュベートした。これを完全に乾燥し、黄色ブドウ球菌を播種した新しいＴＳＢ培地中でインキュベートした。表８と９の実験では、生物体／株はＳ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＳＣＯ１、培地はＴＳＢ、細胞播種は２ｘ１０９ｃｆｕとした。バイオフィルムを黒を背景として視覚に訴える方法で可視化した。図１８と１９に示すように、Ｄ−ａａ混合物（上述のような）は、浸漬状態の基質上のブドウ球菌バイオフィルム形成を劇的に低減させた。データを表８と９に示す：
【表８】
【表９】
【０１２９】
さらに、Ｎｏｒｌａｎｄ光学接着剤６１表面をＤ−チロシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニンと共に２４時間インキュベートした。これを完全に乾燥し、黄色ブドウ球菌を播種した新しいＴＳＢ培地中でインキュベートした。Ｄ−ａａ混合物（Ｌ−混合物ではそうではないが）は、ブドウ球菌バイオフィルム形成を劇的に低減した。
【０１３０】
この実施例では、ポリマー基質は、ＵＶＯ−１１４（Ｅｐｏｘｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＮｏｒｌａｎｄ光学接着剤６１（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ＵＶ−硬化型ポリマーを使って、ポリジメチルシロキサン（ＳＹＬＧＡＲＤ１８４、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で成形した。
【０１３１】
実施例６．緑膿菌バイオフィルム形成に対するＤ−アミノ酸の効果を観察する別の方法
枯草菌と同様に、緑膿菌は、複合体構造を特定の培地に形成する。これらの複合体構造には、細胞外マトリックスの適切な形成と構築が必要である。Ｄ−チロシン（５００μＭ）またはＤ−トリプトファン（５００μＭ）の追加により、特定培地の緑膿菌バイオフィルム形成が阻害され（図２０）、一方、Ｌ−チロシン（５００μＭ）およびＬ−トリプトファンの追加では、そうならなかった。同様の結果が枯草菌でも得られた。これらの実験では、生物体／株はＰ．ａ．Ｈａｒｖａｒｄ ＰＡ１４、培地はＭ６３、細胞播種は１．５ｘ１０９ｃｆｕとした。
【０１３２】
Ｄ−アミノ酸のある場合と無い場合について、Ｓｙｔｏ−９染色を使って６ウエルプレート上でバイオフィルム形成を観察する別の方法は、以下の通りである：緑膿菌バイオフィルムをＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中の５％グルタルアルデヒドで少なくとも１時固定した。次に、固定バイオフィルムを、ＰＢＳで再度１回洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ｖ／ｖトリトンＸ−１００（ＰＢＳＴ）中に１５分間浸漬した。溶液を冷ＰＢＳＴ中の０．１ｎＭ ＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と入れ替え、暗所で少なくとも１５分間緩やかに揺らした。バイオフィルムの蛍光像をＸｅランプおよびＫ３ライカフィルターキューブを使ってライカＤＭＲＸ複式顕微鏡で取り込んだ。図２１に示すように、Ｄ−チロシンの存在下で、バイオフィルムプレートの底に付着した細胞の数が激減した。単一細胞付着量をｉｍａｇｅＪを使って定量化した。Ｄ−ａａに浸漬したエポキシ表面に付着した細胞の量の減少は、Ｌ−ａａ対照に比較して相当多かった。
【表１０】
【０１３３】
実施例７．グラム陰性病原菌に与えるＤ−アミノ酸の効果の評価
広範囲の抗バイオフィルム活性の可能性を評価するために、効果のあるＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−プロリンの等モルカルテットをグラム陰性病原菌プロテウス・ミラビリスに対して試験した。図２２に示すように、Ｄ−ａａ混合物はプロテウス・ミラビリスに対して活性であった。表１１のバイオフィルムは、クリスタルバイオレット法により可視化した。データを表１１に示す：
【表１１】
【０１３４】
実施例８：グラム陽性の病原菌に対するＤ−アミノ酸の効果の評価
広範囲の抗バイオフィルム活性の可能性を評価するために、効果のあるＤ−チロシン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−プロリンの等モルカルテットをグラム陽性の病原菌ストレプトコッカス・ミュータンスに対して試験した。図２３に示すように、Ｄ−ａａ混合物は、ストレプトコッカス・ミュータンスに対し活性であった。表１２のバイオフィルムをクリスタルバイオレット法により可視化した。データを表１２に示す：
【表１２】
【０１３５】
実施例９：Ｄ−チロシン含有コーティング
樹脂固形分の重量ベースで、０．５％のＤ−チロシンを市販ポリエステルポリオールおよび市販イソシアヌラートベースの２成分ポリエステルウレタンコーティング中に組み込む。コーティング系は、全体樹脂固形分ベースで０．０１５％のジブチルスズジラウラートにより触媒された。
【０１３６】
コーティング製剤をへら引きにより透明ガラススライド約４”ｘ６”上に塗布して約２ミル（０．００２”）のフィルム厚さにする。
【０１３７】
これらのフィルムを１２０°Ｆ（４９℃）のオーブン中で硬化する。
【０１３８】
実施例１０：Ｄ−アミノ酸混合物含有ポリマー
液体シリコーンゴムシートを米国特許第５、９７３、０３０号に記載のようにして調製する。製剤中に、Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物をさらに０．０１〜１重量パーセント添加する。
【０１３９】
実施例１１：Ｄ−アミノ酸混合物含有水ベース工業用コーティング
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物を１重量パーセント含む水ベース透明アクリル産業コーティング製剤を２ミル厚さでガラススライドにコートする。
【０１４０】
実施例１２：Ｄ−アミノ酸混合物含有溶媒ベース工業用コーティング
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤアミノ酸混合物を１重量パーセント含む溶媒べースポリウレタンコーティングを調製する。このコーティングを２ミル厚さでガラススライドに塗布する。
【０１４１】
実施例１３：Ｄ−アミノ酸混合物含有ＵＶ硬化型水ベース工業用コーティング
透明ＵＶ硬化型水性産業コーティングを高速スターラーで各成分（下表参照）の混合により配合した。
【表１３】
【０１４２】
調合製剤に、Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物を添加し、高せん断速度（２０００ｒｐｍ）下、室温で３０分間攪拌する。比較の目的のため、Ｄ−アミノ酸不含の対照製剤を同じ方法で調製する。
【０１４３】
コーティングを５０μｍスリットコーターで白塗装アルミニウムパネルに塗布し、６０℃で１０分間乾燥した後、２つの中圧水銀ランプ（２ｘ８０Ｗ／ｃｍ）を用いて５ｍ／ｍｉｎで硬化する。
【０１４４】
実施例１４：Ｄ−アミノ酸混合物含有溶媒ベース工業用コーティング
２液型溶媒使用ポリウレタンコーティングを下記の手順で調製する：
【０１４５】
Ｄ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物を、ミルベース配合として結合剤および溶媒に添加し、高せん断速度で１０分間、５μｍ未満の粒径になるまで攪拌する。
【０１４６】
ミルベース配合
【表１４】
【０１４７】
コーティング製剤は、成分Ａの材料を混合し、最終段階で塗布の前に成分Ｂを添加して調製する（下表参照）。全体製剤中のＤ−アミノ酸混合物の含量は、０．１重量．％である。
【表１５】
【０１４８】
それぞれのコーティング製剤を白塗装アルミニウムパネル上にスプレーし（乾燥被覆厚さ：４０μｍ）、８０℃で３０分乾燥する。
【０１４９】
実施例１５：油中水型（Ｗ／Ｏ）代表的配合
以下のＤ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物０．１ｗｔ／ｗｔ％含有Ｗ／Ｏ乳剤を調製する。
Ｗ／Ｏ乳剤：
部分Ａ
流動パラフィン ７．５部
イソヘキサデカン ６．０
ＰＥＧ−７水素化ヒマシ油 ４．１
イソプロピルパルミタート ２．０
Cera microcristallina ０．５
ラノリンアルコール ０．６
部分Ｂ
水 全体配合で１００部に希釈
硫酸マグネシウム １．０
グリシン ３．２０
部分Ｃ
Ｄ−アミノ酸混合物 ０．５％ｗｔ／ｗｔ水溶液の２０部
【０１５０】
実施例１６：水中油型（Ｏ／Ｗ）代表的配合
以下のＤ−チロシン：Ｄ−ロイシン：Ｄ−メチオニン：Ｄ−トリプトファンの１：１：１：１の比率のＤ−アミノ酸混合物０．１ｗｔ／ｗｔ％含有Ｏ／Ｗ乳剤を調製する。
部分Ａ
ステアレス−２ ２．２部
ステアレス−２１ １．０
ＰＥＧ−１５ ステアリルエーテル ６．０
ジカプリリルエーテル ６．０
部分Ｂ
水 全体配合で１００部に希釈
ナトリウムポリアクリラート ０．２
部分Ｃ
Ｄ−アミノ酸混合物 ０．５％ｗｔ／ｗｔ水溶液の２０部
【０１５１】
実施例１７：黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成のインビボ阻害
Ａｎｇｕｉｔａ−Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５１：２５９４（２００７）に記載のように、Ｄ−アミノ酸または２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせのインビボ試験を行う。
【０１５２】
実施例１８：黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の別のインビボ阻害
Ｂｅｅｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１８６：４６６５（２００４）に記載のように、Ｄ−アミノ酸または２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせのインビボ試験を行う。
【０１５３】
実施例１９：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−ＴｙｐおよびＤ−Ｍｅｔの安定水性混合物の調製
アミノ酸Ｄ−ＭｅｔおよびＤ−Ｌｅｕを、室温で５ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に別々に溶解する。通常、各アミノ酸に対し、１０ｍＬの溶液が調製される。Ｄ−トリプトファンは、脱イオン水に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解するが、４０〜５０℃、５〜１０分の少しの加熱が必要である。Ｄ−チロシンは、５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０５Ｍ ＨＣｌに溶解するが、４０〜５０℃、５〜１０分の加熱が必要である。加熱超音波処理浴を使って、アミノ酸の溶解を促進することができる。全ての溶液は組み合わされ、室温で細菌濾過を行って約４０ｍＬの保存液が得られる。
【０１５４】
実施例２０：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｐｒｏ、およびＤ−Ｐｈｅの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５５】
実施例２１：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｓｐ、およびＤ−Ｇｌｕの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５６】
実施例２２：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｈｉｓ、およびＤ−Ｌｙｓの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５７】
実施例２３：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｖａｌ、およびＤ−Ａｓｎの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５８】
実施例２４：Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、およびＤ−Ｇｌｎの安定な水性混合物の調製
実施例１９に記載されたように水溶液を調製する。
【０１５９】
等価物
本発明をその詳細説明と関連付けて説明してきたが、前述の記載は説明の目的のためのものであって本発明の範囲を制限する意図はなく、これは添付の請求項の範囲によって定められることは理解されるべきである。他の態様、優位性、および変更は以下の特許請求の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌によるバイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害する方法であって、
対象物品を有効量のＤ−アミノ酸を含む組成物と接触させるステップであって、前記組成物が、基本的に、対応するＬ−アミノ酸を含まないステップと、それにより、バイオフィルムの形成を処理、低減、または阻害するステップを含み、
ここで、Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項２】
細菌によるバイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害する方法であって、
対象物品を有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物と接触させるステップと、それにより、バイオフィルムの形成を処理、低減、または阻害するステップを含む方法。
【請求項３】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象物品が、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙からなる群より選択される１つまたは複数の物品である請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
対象物品が、関与する水凝集物の収集、水再循環、下水輸送、製紙パルプ化および製造、ならびに水処理および輸送に関与する１つまたは複数の構成部材である請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
対象物品が、排水管、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業用の食品もしくは飲料生産設備、フロア、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、送水管、冷却系、または発電所である請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
対象物品が、金属、合金、合成高分子、天然ポリマー、セラミック、木材、ガラス、革、紙、織物、非金属無機物、複合材料およびこれらの組み合わせからなる群より選択される材料から作られる請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
接触させるステップが、対象物品にコーティングを適用することを含み、前記コーティングが有効量のＤ−アミノ酸を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
コーティングが、結合剤をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
コーティングが、コーティング組成物の表面への毛管作用、吹付け、ディッピング、スピンコーティング、積層、塗布、スクリーン印刷、押し出しまたはドローダウンにより達成される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
接触させるステップが、Ｄ−アミノ酸を前駆物質中に導入し、前駆物質を対象物品に対し処理してＤ−アミノ酸を含浸させることを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
接触させるステップが、Ｄ−アミノ酸を液体組成物中に導入することを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、Ｄ−チロシンを含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン．ｕｔａｍｉｃ酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンおよびＤ−メチオニン含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
表面を殺生物剤と接触させることをさらに含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
組成物が１％未満のＬ−アミノ酸を含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が、基本的にデタージェント(detergent)を含まない請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
組成物が、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
バイオフィルム形成に耐性を示すコートされた対象物品であって、
少なくとも１つの露出表面上にコーティングを含む対象物品を含み、コーティングが、有効量のＤ−アミノ酸を含み、基本的に、対応するＬ−アミノ酸を含まず、それにより、バイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害し、
Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される対象物品。
【請求項２４】
バイオフィルム形成に耐性を示すコートされた対象物品であって、
少なくとも１つの露出表面上にコーティングを含む対象物品を含み、コーティングが、有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルム形成を処理、低減、または阻害する対象物品。
【請求項２５】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項２４に記載のコートされた対象物品。
【請求項２６】
対象物品が、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙からなる群より選択される１つまたは複数の物品である請求項２３、２４または２５のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項２７】
対象物品が、水凝集物の収集、水再循環、下水輸送、製紙パルプ化および製造、ならびに水処理および輸送に関与する１つまたは複数の構成部材である請求項２３、２４または２５のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項２８】
対象物品が、排水管、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業用の食品または飲料生産設備、フロア、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、送水管、冷却系、または発電所である請求項２３、２４または２５のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項２９】
対象物品が、金属、金属合金、合成高分子、天然ポリマー、セラミック、木材、ガラス、革、紙、織物、非金属無機物、複合材料およびこれらの組み合わせからなる群より選択される材料から作られる請求項２３、２４または２５のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項３０】
コーティングが結合剤をさらに含む請求項２３〜２９のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項３１】
コーティングが、ポリマーをさらに含み、Ｄ−アミノ酸が、ポリマー中に分散されている請求項２３〜３０のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項３２】
Ｄ−アミノ酸コーティングが、徐放製剤として配合されている請求項２３〜３１のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項３３】
組成物がＤ−チロシンを含む請求項２３〜３２のいずれか１項に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３４】
組成物が、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３５】
組成物が、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３６】
組成物が、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３７】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンを含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３８】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンおよびＤ−メチオニンを含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３９】
さらに殺生物剤を含む請求項２３〜３８のいずれかに１項に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項４０】
殺生物剤が、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む請求項３９に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項４１】
組成物が、基本的に、デタージェントを含まない請求項２３〜４０のいずれか１項に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項４２】
バイオフィルム形成に耐性を示す組成物であって、
液体基剤；および
基剤中に分散された有効量のＤ−アミノ酸を含み、それにより、バイオフィルム形成を処理、低減、または阻害し、
組成物が、基本的に、対応するＬ−アミノ酸を含まず、さらに
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される組成物。
【請求項４３】
バイオフィルム形成に耐性を示す組成物であって、
液体基剤；および
基剤中に分散された有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルム形成を処理、低減、または阻害し、
Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである組成物。
【請求項４４】
液体基剤が、液体、ゲル、ペーストから選択される請求項４２または４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
組成物が、水、洗浄用配合物、消毒用配合物、塗布およびコーティング用配合物からなる群より選択される請求項４２または４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、およびＤ−トリプトファンからなる群より選択され、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される異なるＤ−アミノ酸である２つ以上のＤ−アミノ酸；ならびに
高分子結合剤を含む、コーティング組成物。
【請求項４７】
有効量のＤ−アミノ酸を含む少なくとも１つの成分であって、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、およびＤ−トリプトファンからなる群より選択される成分、および、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される異なるＤ−アミノ酸を含み、この場合の組成物が、基本的に対応するＬ−アミノ酸と前記成分中に組み込まれた前記Ｄ−アミノ酸を含まない、対象物品。
【請求項１】
細菌によるバイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害する方法であって、
対象物品を有効量のＤ−アミノ酸を含む組成物と接触させるステップであって、前記組成物が、基本的に、対応するＬ−アミノ酸を含まないステップと、それにより、バイオフィルムの形成を処理、低減、または阻害するステップを含み、
ここで、Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項２】
細菌によるバイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害する方法であって、
対象物品を有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含む組成物と接触させるステップと、それにより、バイオフィルムの形成を処理、低減、または阻害するステップを含む方法。
【請求項３】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
対象物品が、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙からなる群より選択される１つまたは複数の物品である請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
対象物品が、関与する水凝集物の収集、水再循環、下水輸送、製紙パルプ化および製造、ならびに水処理および輸送に関与する１つまたは複数の構成部材である請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
対象物品が、排水管、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業用の食品もしくは飲料生産設備、フロア、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、送水管、冷却系、または発電所である請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
対象物品が、金属、合金、合成高分子、天然ポリマー、セラミック、木材、ガラス、革、紙、織物、非金属無機物、複合材料およびこれらの組み合わせからなる群より選択される材料から作られる請求項１、２、または３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
接触させるステップが、対象物品にコーティングを適用することを含み、前記コーティングが有効量のＤ−アミノ酸を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
コーティングが、結合剤をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
コーティングが、コーティング組成物の表面への毛管作用、吹付け、ディッピング、スピンコーティング、積層、塗布、スクリーン印刷、押し出しまたはドローダウンにより達成される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
接触させるステップが、Ｄ−アミノ酸を前駆物質中に導入し、前駆物質を対象物品に対し処理してＤ−アミノ酸を含浸させることを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
接触させるステップが、Ｄ−アミノ酸を液体組成物中に導入することを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
組成物が、Ｄ−チロシンを含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
組成物が、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン．ｕｔａｍｉｃ酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンおよびＤ−メチオニン含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
表面を殺生物剤と接触させることをさらに含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
組成物が１％未満のＬ−アミノ酸を含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が、基本的にデタージェント(detergent)を含まない請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
組成物が、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
バイオフィルム形成に耐性を示すコートされた対象物品であって、
少なくとも１つの露出表面上にコーティングを含む対象物品を含み、コーティングが、有効量のＤ−アミノ酸を含み、基本的に、対応するＬ−アミノ酸を含まず、それにより、バイオフィルム形成を処理（又は処置）、低減、または阻害し、
Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される対象物品。
【請求項２４】
バイオフィルム形成に耐性を示すコートされた対象物品であって、
少なくとも１つの露出表面上にコーティングを含む対象物品を含み、コーティングが、有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルム形成を処理、低減、または阻害する対象物品。
【請求項２５】
Ｄ−アミノ酸の組み合わせが、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである請求項２４に記載のコートされた対象物品。
【請求項２６】
対象物品が、産業機器、給排水設備、水域、家庭にある表面、織物および紙からなる群より選択される１つまたは複数の物品である請求項２３、２４または２５のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項２７】
対象物品が、水凝集物の収集、水再循環、下水輸送、製紙パルプ化および製造、ならびに水処理および輸送に関与する１つまたは複数の構成部材である請求項２３、２４または２５のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項２８】
対象物品が、排水管、浴槽、台所用電気器具、調理台、シャワーカーテン、グラウト、洗面所、工業用の食品または飲料生産設備、フロア、ボート、埠頭、石油掘削用プラットホーム、取水口、濾過装置、送水管、冷却系、または発電所である請求項２３、２４または２５のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項２９】
対象物品が、金属、金属合金、合成高分子、天然ポリマー、セラミック、木材、ガラス、革、紙、織物、非金属無機物、複合材料およびこれらの組み合わせからなる群より選択される材料から作られる請求項２３、２４または２５のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項３０】
コーティングが結合剤をさらに含む請求項２３〜２９のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項３１】
コーティングが、ポリマーをさらに含み、Ｄ−アミノ酸が、ポリマー中に分散されている請求項２３〜３０のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項３２】
Ｄ−アミノ酸コーティングが、徐放製剤として配合されている請求項２３〜３１のいずれか１項に記載のコートされた対象物品。
【請求項３３】
組成物がＤ−チロシンを含む請求項２３〜３２のいずれか１項に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３４】
組成物が、１つまたは複数のＤ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンをさらに含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３５】
組成物が、１つまたは複数のＤ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−メチオニンをさらに含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３６】
組成物が、１つまたは複数のＤ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ．ｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、およびＤ−トリプトファンをさらに含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３７】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−フェニルアラニンを含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３８】
組成物が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファンおよびＤ−メチオニンを含む請求項３４に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項３９】
さらに殺生物剤を含む請求項２３〜３８のいずれかに１項に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項４０】
殺生物剤が、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン、キシリトール、トリクロサン、または二酸化塩素を含む請求項３９に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項４１】
組成物が、基本的に、デタージェントを含まない請求項２３〜４０のいずれか１項に記載のコートされた対象物品または組成物。
【請求項４２】
バイオフィルム形成に耐性を示す組成物であって、
液体基剤；および
基剤中に分散された有効量のＤ−アミノ酸を含み、それにより、バイオフィルム形成を処理、低減、または阻害し、
組成物が、基本的に、対応するＬ−アミノ酸を含まず、さらに
Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される組成物。
【請求項４３】
バイオフィルム形成に耐性を示す組成物であって、
液体基剤；および
基剤中に分散された有効量のＤ−アミノ酸の組み合わせを含み、それにより、バイオフィルム形成を処理、低減、または阻害し、
Ｄ−アミノ酸の組み合わせは、Ｄ−アラニン、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される２つ以上のＤ−アミノ酸の組み合わせである組成物。
【請求項４４】
液体基剤が、液体、ゲル、ペーストから選択される請求項４２または４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
組成物が、水、洗浄用配合物、消毒用配合物、塗布およびコーティング用配合物からなる群より選択される請求項４２または４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、およびＤ−トリプトファンからなる群より選択され、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される異なるＤ−アミノ酸である２つ以上のＤ−アミノ酸；ならびに
高分子結合剤を含む、コーティング組成物。
【請求項４７】
有効量のＤ−アミノ酸を含む少なくとも１つの成分であって、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、およびＤ−トリプトファンからなる群より選択される成分、および、少なくとも１つのＤ−アミノ酸が、Ｄ−システイン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−リシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−プロリン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トレオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−トリプトファン、およびＤ−チロシンからなる群より選択される異なるＤ−アミノ酸を含み、この場合の組成物が、基本的に対応するＬ−アミノ酸と前記成分中に組み込まれた前記Ｄ−アミノ酸を含まない、対象物品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２０１３−５１６２９７（Ｐ２０１３−５１６２９７Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８２１４（Ｐ２０１２−５４８２１４）
【出願日】平成２３年１月１０日（２０１１．１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２０７０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０９１１９
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１０日（２０１１．１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２０７０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０９１１９
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
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