ヒトの癌における予後マーカーとしてのＨＰ１アルファ
本発明は、その高い過剰発現が予後不良と関連する、ヒトの癌における予後マーカーであるＨＰ１αを提供する。本発明はさらに、腫瘍細胞においてＨＰ１αが特異的に過剰発現している、対象における癌の診断方法を提供する。本発明はまた、アジュバント療法のために癌に罹患した対象を選択する方法、及び癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングする方法をも提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野、具体的には腫瘍学に関する。ヒトの癌における新しい予後及び／又は診断マーカーを提供する。
【０００２】
発明の背景
癌は、細胞分裂が制御できない状態になった場合、及び、ＤＮＡ修復経路の損傷、正常な遺伝子の腫瘍遺伝子への形質転換、又は腫瘍抑制遺伝子の機能不全の結果により生じる。多数の異なる形態の癌が存在する。これらの癌の頻度は多様であるが、癌は大部分の先進国において、心疾患に次ぐ、死亡原因の二番目に高い原因となっている。異なる形態の癌は異なる特性を有するが、多くの癌に共通する１つの因子は転移する能力である。全ての悪性腫瘍の遠隔転移は、この疾患を有する患者の死亡の主因である。
【０００３】
癌を有する患者への治療的処置は第一に、手術、放射線治療及び化学療法に基づき、施術者がその患者に最も適応した治療法を選択しなくてはならない。大部分の症例では、治療プロトコールの選択は病理解剖学及び臨床データに基づいている。現在、予後の決定及び患者へのアジュバント療法の選択方法は主に、病理学及び臨床病期による。しかしながら、どの限局性腫瘍が遠隔転移を生ずるかを予測することは非常に難しい。
【０００４】
そのため、転移の高い可能性、初期疾患進行、疾患再発の増加又は患者の生存率の低下を含む予後不良と関連がある腫瘍を、他の腫瘍から正確に区別することができる予後マーカーの同定が強く必要とされている。そのようなマーカーを用いることで、施術者は患者の予後を予測することができ、そしてアジュバント療法が最も効きそうな個体を効果的に標的とすることができる。
【０００５】
発明の概要
発明者らは、非腫瘍細胞と比較して、癌細胞ではＨＰ１αが過剰発現していること、及び、この癌細胞におけるＨＰ１αの高い発現レベルが、初期疾患進行、転移形成の増加、疾患再発の増加及び／又は患者の生存率の低下を含む予後不良と相関していることを示した。
【０００６】
従って、第一の態様において、本発明は、癌に罹患した対象の臨床転帰を予測する又はモニタリングする方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは予後不良の指標となる）を決定する工程を含む。好ましくは、予後不良は、患者の生存率の低下及び／又は初期疾患進行及び／又は疾患再発の増加及び／又は転移形成の増加である。
【０００７】
第二の態様において、本発明は、対象における癌の診断方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは前記対象が癌に罹患していることを示す）を決定する工程を含む。
【０００８】
第三の態様において、本発明は、アジュバント化学療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象の選択方法、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかの決定方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルはアジュバント化学療法及び／又は放射線治療が必要であることを示す）を決定する工程を含む。
【０００９】
最後の態様において、本発明は、癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングする方法に関し、ここでこの方法は、治療の投与前の前記対象からの癌試料及び治療の投与後の前記対象からの癌試料における、ＨＰ１αの発現レベル（治療の投与後に得た試料におけるＨＰ１αの発現レベルの低下は、対象が治療に反応することの指標となる）を決定する工程を含む。
【００１０】
一実施形態において、ＨＰ１αの発現レベルは、ＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。
【００１１】
さらなる実施形態において、ＨＰ１αタンパク質の量は、免疫組織化学、半定量的ウエスタンブロット、又はタンパク質若しくは抗体アレイにより測定される。
【００１２】
別のさらなる実施形態において、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量は、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、又はリアルタイム定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、又はトランスクリプトーム解析により測定される。
【００１３】
別の実施形態において、本発明の方法は、ＨＰ１αの発現レベルを基準発現レベルと比較する工程を含む。加えて、本発明の方法は、ＨＰ１αの発現レベルが前記基準発現レベルよりも高いかどうかを決定する工程をさらに含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、基準発現レベルは正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベルである。
【００１５】
あるいは、基準発現レベルは、ＲＰＬＰＯ遺伝子のような、様々な癌試料において安定した発現を有する遺伝子の発現レベルである。
【００１６】
その上さらに別の実施形態において、本発明による方法は、腫瘍悪性度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現のような少なくとも１つの別の癌又は予後マーカーを評価することをさらに含む。
【００１７】
その上さらに別の実施形態において、癌は固形癌又は造血癌であり、好ましくは固形癌であり、そしてより好ましくは局所的又は全身性の浸潤のない、早期固形癌である。
【００１８】
好ましくは、癌は、乳癌、膵臓癌、子宮及び子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌並びに白血病からなる群より選択される。より好ましくは、癌は乳癌である。さらにより好ましくは、癌は、局所的又は全身性の浸潤のない早期乳癌である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αの発現は静止期にはダウンレギュレートされる。非同調的増殖期（Ａｓ．）及び静止期（Ｇ０）のＷＩ３８肺線維芽細胞、ＭＣＦ７乳癌細胞及びＢＪ初期包皮線維芽細胞におけるＨＰ１α、β及びγの全タンパク質レベルをウエスタンブロットにより検出した。線維芽細胞を血清飢餓により、及びＭＣＦ７細胞を抗エストロゲン処理により、静止期において停止させた。濃縮した（ｘ）全細胞抽出物をローディングし、ローディングコントロールとしてはβ−アクチンを用いた。細胞増殖のマーカーとしては、ＣＡＦ−１ ｐ６０（Polo et al, 2004）及びサイクリンＡを用いた。
【図１Ｂ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αの発現は静止期にはダウンレギュレートされる。Ａに示した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析
【図１Ｃ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αの発現は静止期にはダウンレギュレートされる。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、増殖期（Ａｓ．）及び静止期（Ｇ０）のＢＪ包皮繊維芽細胞におけるＨＰ１αのｍＲＮＡレベル。レベルは基準遺伝子であるリボソームタンパク質Ｐ０様タンパク質（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化し、増殖期細胞のレベルを１００％と設定した。ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のレベルを比較のために示す。エラーバーは３回の独立した実験からのデータを示す。
【図２Ａ】静止期を解除すると、ＨＰ１αレベルは徐々に増加した。血清飢餓によりＢＪ初代線維芽細胞を静止期（Ｇ０）において停止させ、そして示した時間血清を再添加することにより解除した。全タンパク質レベルをウエスタンブロットにより解析した。ＣＡＦ−１ ｐ６０（Polo et al, 2004）及びサイクリンＡを細胞増殖のマーカーとして用いた。β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図２Ｂ】静止期を解除すると、ＨＰ１αレベルは徐々に増加した。図２Ａに示した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析。
【図３Ａ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。ＨｅＬａ子宮頸癌細胞は、二重チミジン遮断の解除（Ｇ１、Ｇｌ／Ｓ、Ｓ、Ｇ２）及びノコダゾール（Ｍ）により、細胞周期において同調する。ウエスタンブロットを用い、ＨＰ１αの発現レベルについて全タンパク質抽出物を解析した。β−アクチンをローディングコントロールとして用い、サイクリンＡをＧ２／Ｓ期のマーカーとして用いた。ＣＡＦ−１ ｐ６０を比較のために示す。
【図３Ｂ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。図３Ａに示した同調した細胞のフローサイトメトリー細胞周期解析。
【図３Ｃ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。ＢＪ包皮初代線維芽細胞は、二重チミジン遮断の解除（Ｇ１、Ｇｌ／Ｓ、Ｓ、Ｇ２）及びノコダゾール（Ｍ）により、細胞周期において同調する。ウエスタンブロットを用い、全細胞抽出物におけるＨＰ１αタンパク質レベル解析した。β−アクチンをローディングコントロールとして用い、サイクリンＡをＧ２／Ｓ期のマーカーとして用いた。ＣＡＦ−１ ｐ６０を比較のために示す。
【図３Ｄ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。図３Ｃで示した同調した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析。
【図３Ｅ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、同調したＢＪ細胞におけるＨＰ１αのｍＲＮＡレベル。レベルは基準遺伝子であるリボソームタンパク質ＰＯ様タンパク質（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化し、非同調的増殖期細胞のレベルを１００％と設定した。ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のレベルを比較のために示す（Polo et al, 2004)。エラーバーは、２回の独立した実験からのデータを示す。
【図４Ａ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。図４Ｂにおいて使用した、全、可溶性、及び、クロマチン結合細胞抽出物を得るために用いた実験手順の模式図。
【図４Ｂ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。同じ患者由来の乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び非腫瘍乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）（Hackett et al, 1977）の、可溶性及びクロマチン結合核抽出物中におけるＨＰ１α、β及びγのタンパク質レベルをウエスタンブロットにより解析した。サイクリンＡ及びＣＡＦ−１ ｐ６０を比較のために示す。濃縮した（ｘ）全細胞抽出物をローディングし、β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図４Ｃ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。ＣＡＦ−１ ｐ６０（Polo et al, 2004）の量と比較した場合の、腫瘍乳房細胞（Ｔ）及び非腫瘍乳房細胞（Ｂｓｔ）における全ＨＰ１αタンパク質レベルの相対量。濃縮した（ｘ）全細胞抽出物をローディングし、β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図４Ｄ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。倍数性を評価するための、腫瘍乳房細胞（Ｔ）及び非腫瘍乳房細胞（Ｂｓｔ）のフローサイトメトリー解析。腫瘍（Ｔ）及び非腫瘍（Ｂｓｔ）細胞はそれぞれ、２５％及び１３％のＳ期にある細胞を含む。
【図４Ｅ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、腫瘍（Ｔ）及び非腫瘍（Ｂｓｔ）乳房細胞におけるＨＰ１αの相対的なｍＲＮＡレベル。レベルは基準遺伝子であるリボソームタンパク質ＰＯ様タンパク質（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化し、非腫瘍細胞を１００％と設定した。ＣＡＦ−１ ｐ１５０を比較のために示す。エラーバーは２回の独立した実験からのデータを示す。
【図５Ａ】可溶性及びクロマチン結合核画分のＨＰ１タンパク質のレベル。同じ患者由来の乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び健康な乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）（Hackett et al, 1977）の、可溶性及びクロマチン結合核画分を得るための抽出手順を図示する模式図。
【図５Ｂ】可溶性及びクロマチン結合核画分のＨＰ１タンパク質のレベル。癌細胞Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び健康な細胞Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）からの可溶性及びクロマチン結合核抽出物におけるＨＰ１α、β及びγのタンパク質レベルをウエスタンブロットにより解析した。ローディングは、同一の量の細胞を用いたものとして修正した（それぞれの抽出物につき、２×１０５及び４×１０５個の細胞）。複数の古典的なローディングコントロールを示した。α−チューブリン画分及びβ−アクチンの存在が腫瘍細胞と健康な細胞との間で僅かに異なっているが、これらの実験条件下では、ＧＡＰＤＨが最も同一のローディングを反映する。サイクリンＡ及びＣＡＦ−１ ｐ６０を比較のために示した。
【図６Ａ】健康な乳房細胞と比較して乳癌細胞においては、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ではなく、ＨＰ１αの核分布が変化する。乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び非腫瘍乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）におけるＨＰ１αの免疫蛍光染色。ＣＲＥＳＴ患者の血清を用いたセントロメアの対比染色は、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞における、不完全ではあるが部分的なＨＰ１αのスポットとの共局在を明らかにした。ＤＮＡはＤＡＰＩを用いて染色した。顕微鏡像の下に示した数値は、乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び健康な乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）において、明確に区別できるＨＰ１αのスポットを示した細胞のパーセンテージの平均を示す。２回の独立した実験に基づく標準誤差を示す。
【図６Ｂ】健康な乳房細胞と比較して乳癌細胞においては、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ではなく、ＨＰ１αの核分布が変化する。腫瘍（Ｔ）及び非腫瘍（Ｂｓｔ）乳房細胞における、ＨＰ１αと比較した場合のＨ３Ｋ９ｍｅ３ヒストン修飾の核分布。ＤＮＡはＤＡＰＩを用いて示した。
【図６Ｃ】健康な乳房細胞と比較して乳癌細胞においては、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ではなく、ＨＰ１αの核分布が変化する。Ｃｄｔｌ（Ｇ１期の指標）、サイクリンＡ（Ｓ及びＧ２期の指標）、又はＳ１０がリン酸化されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０Ｐ、Ｇ２及びＭ期の指標）を用いたＨＰ１αの対比染色は、細胞周期の状態とスポットされたＨＰ１αのパターンとの間の相関を示さなかった。スケールバー：１０μm。
【図７Ａ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＨＰ１α（ｓｉＨＰ１α．３と命名）、ＨＰ１β、ＨＰ１γ又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした７２時間後の、ＨｅＬａ細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット解析。濃縮した（ｘ）全細胞抽出物をローディングし、β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図７Ｂ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。Ａに示した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析。
【図７Ｃ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＨＰ１α、ＨＰ１β、ＨＰ１γ又は模擬ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした後の、典型的な有糸分裂の図。
【図７Ｄ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＨＰ１α、ＨＰ１β、ＨＰ１γ又は模擬ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした７２時間後の、非同調的なＨｅＬａ細胞における異常な有糸分裂（遅滞染色体、不均衡、染色体橋）の図のパーセンテージ。エラーバーは３回の独立した、盲検的に計測した実験からのデータを示す。
【図７Ｅ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＤＡＰＩ染色は、ＨＰ１αを標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした７２時間後の小核の形成を表す。
【図７Ｆ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＨＰ１α、ＨＰ１β、ＨＰ１γ又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした７２時間後の、小核が形成された細胞のパーセンテージの定量。エラーバーは３回の独立した実験からのデータを示し、このうち２回は盲検的に計測した。
【図８Ａ】初代細胞におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは（前）中期に影響を及ぼす。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）又はＨＰ１α（α．１又はα．３）を標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ配列を用い、ヌクレオフェクションにより、ＢＪ初代線維芽細胞をトランスフェクションした。全タンパク質レベルをウエスタンブロットにより解析した。ＨＰ１β及びＨＰ１γは、ｓｉＲＮＡがＨＰ１αイソ型への特異性を示すことを明らかにした。
【図８Ｂ】初代細胞におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは（前）中期に影響を及ぼす。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）又はＨＰ１αを標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＨＰ１α．１／３）を用いてトランスフェクションした７２時間後の、図８Ａに示した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析。
【図８Ｃ】初代細胞におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは（前）中期に影響を及ぼす。有糸分裂細胞のプロファイルを、トランスフェクションした７２時間後に免疫蛍光法により解析した。１２時間のチミジン遮断を６時間解除することにより、有糸分裂細胞を増やした。典型的な有糸分裂プロファイル（上段）及び有糸分裂細胞の総数における各有糸分裂期の割合をパーセンテージとして図示した（グラフ）。エラーバーは３回の独立した実験（各回につきｎ＞１００）に基づく標準誤差を示し、このうち２回は盲検的に計測した。
【図８Ｄ】初代細胞におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは（前）中期に影響を及ぼす。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）又はＨＰ１α ｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＰ１α．３）を用いた２回の連続したトランスフェクションの後の有糸分裂時間のライブセルイメージングによる決定。ＤＮＡをＨ２Ｂ−Ｃｈｅｒｒｙ（赤色）の発現により可視化した。２回目のトランスフェクションの４８時間後から２４時間、２０分毎に画像を取得した。有糸分裂の時間は（上のグラフ）、ＤＮＡの凝縮から２つの別個の細胞の確立までの時間と定義した。実験開始前に染色体の分離が見られた場合には、（前）中期にある有糸分裂細胞を図示している画像の平均数もまた決定した（下のグラフ）。ｓｉＧＦＰ及びｓｉＨＰ１αそれぞれで、有糸分裂細胞の総数が１３０、及び８７であることを示している、３回の独立した実験の平均を図示した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｗｉｌｃｏｘｏｎの検定を用いてＰ値を決定した。ｓｉＧＦＰ及びｓｉＨＰ１αそれぞれの平均Ｈ２Ｂ−ｃｈｅｒｒｙトランスフェクション効率は３７％及び３９％であった。
【図９Ａ】ＨＰ１αのｍＲＮＡは複数の型の癌において過剰発現し、臨床的及び分子データと関連する。正常な組織と比較した場合の、異なる型の癌におけるＨＰ１αのマイクロアレイ発現プロファイルの箱形図。箱は２５番目〜７５番目のパーセンタイル、括弧は範囲、黒線は中間値、黒点はアウトライアー、ｎはサンプル数を示す。ｐ値はスチューデントのＴ検定に基づく。結果をＯＮＣＯＭＩＮＥを用いて解析してプロットし（Rhodes et al, 2004）、異なる腫瘍型におけるトランスクリプトーム研究からのデータを活用した（Andersson e tal, 2007;Pyeon et al, 2007;Quade et al, 2004;Ramaswamy et al, 2003;Richardson et al, 2006;Yu et al, 2004）。
【図９Ｂ】ＨＰ１αのｍＲＮＡは複数の型の癌において過剰発現し、臨床的及び分子データと関連する。左側のパネル：小児急性リンパ性白血病におけるＨＰ１αの発現レベルと再発までの期間との相関（Kirschner-Schwabe et al, 2006）。非常に早い期間での再発（最初の診断から１８ヶ月以内）、早い（最初の診断から１８ヶ月より後であるが、直近の治療の休止より６ヶ月未満）又は遅い（直近の治療を休止して６ヶ月より後）。箱形図の表現は図９Ａと同様である。右側のパネル：小児急性リンパ性白血病におけるＨＰ１αの発現レベルとＣＡＦ−１ ｐ１５０及び増殖マーカーＫｉ６７発現レベルとの正の相関を示す散布図（Kirschner-Schwabe et al, 2006)。灰色線：最良のあてはめ線、Ｒ：ピアソン相関係数。結果をＯＮＣＯＭＩＮＥを用いて解析し、プロットした（Rhodes et al, 2004)。
【図１０Ａ】ＨＰ１αタンパク質は複数型のヒトの癌において過剰発現する。腫瘍及び正常な組織由来の切片を含む、凍結したヒト組織のアレイにおけるＨＰ１αを免疫組織化学により染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【図１０Ｂ】ＨＰ１αタンパク質は複数型のヒトの癌において過剰発現する。凍結した子宮組織切片におけるＨＰ１α、β及びγを免疫組織化学により染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。３種類の抗体について、組織アレイを同様に処理した。
【図１０Ｃ】ＨＰ１αタンパク質は複数型のヒトの癌において過剰発現する。凍結した髄様乳癌からの２枚の隣接した切片のＨＰ１α及び上皮パン−サイトケラチンのマーカーであるＫＬ−１を、免疫蛍光法（ＩＦ）により染色した。ＤＮＡはＤＡＰＩを用いて示した。ＨＰ１αが過剰発現している部分は、上皮腫瘍細胞の領域と関連している。スケールバー：１００μm。
【図１１Ａ】ポリクローナル抗体を用いて検出したヒト腫瘍試料におけるＨＰ１αの過剰発現は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色の変化とは一致しなかった。ポリクローナルＨＰ１α抗体を用いた、腫瘍及び正常な組織からの凍結ヒト組織切片を含む組織アレイの免疫組織化学的染色。組織をヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【図１１Ｂ】ポリクローナル抗体を用いて検出したヒト腫瘍試料におけるＨＰ１αの過剰発現は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色の変化とは一致しなかった。凍結したヒト組織アレイ（図１１Ａのものと同じバッチ）におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３を免疫組織化学染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。
【図１２Ａ】ＨＰ１αの発現レベルは乳癌患者における予後値を有する。１０年を越えて追跡調査した患者の８６の乳癌試料における、示した臨床病理学的な因子による対数的なＨＰ１αのｍＲＮＡ発現レベルを示す箱形図。箱は２５番目〜７５番目のパーセンタイル、括弧は範囲、黒線は中間値、黒点はアウトライアーを示す。
【図１２Ｂ】ＨＰ１αの発現レベルは乳癌患者における予後値を有する。高い（＞１０）又は低い（＜１０）レベルのＨＰ１αを発現する患者における、生存率、転移の発生率、及び疾患のない間隔（限局的な再発の発生、所属リンパ節再発、対側性乳癌又は転移の前の間隔）の単変量Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。各時点でリスクを有する患者の数をグラフの下に示した。
【図１３Ａ】乳癌のサブタイプにおける発現レベル。試験した乳癌試料の分子的な特徴。ＥＲ：エストロゲン受容体、ＰＲ：プロゲステロン受容体。
【図１３Ｂ】乳癌のサブタイプにおける発現レベル。マイクロアレイでのトランスクリプトームデータにおけるｍＲＮＡレベルとして決定した（図１３Ｂ）、又は逆相タンパク質アレイを用いてタンパク質レベルとして決定した（図１３Ｃ）ＨＰ１αの発現レベルを示す箱形図。箱は２５〜７５番目のパーセンタイル、括弧は範囲、黒線は中間値、黒点はアウトライアーを示す。１群当たりの試料数をグラフの下に示した（ｎ）。アスタリスクは群の間での有意差を示す（Ｔ−検定）。
【図１３Ｃ】乳癌のサブタイプにおける発現レベル。マイクロアレイでのトランスクリプトームデータにおけるｍＲＮＡレベルとして決定した（図１３Ｂ）、又は逆相タンパク質アレイを用いてタンパク質レベルとして決定した（図１３Ｃ）ＨＰ１αの発現レベルを示す箱形図。箱は２５〜７５番目のパーセンタイル、括弧は範囲、黒線は中間値、黒点はアウトライアーを示す。１群当たりの試料数をグラフの下に示した（ｎ）。アスタリスクは群の間での有意差を示す（Ｔ−検定）。
【００２０】
本発明の詳細な説明
哺乳類の細胞は３種類の密接に関係したヘテロクロマチンタンパク質１のイソ型である、ＨＰ１α、β及びγを含み、これらは酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）におけるそれらの唯一の対応物との類似性により、遺伝子サイレンシング、ゲノム安定性及び染色体の分離に関与してきた。
【００２１】
ＨＰ１タンパク質と腫瘍形成との間の第一に可能性のある関連は、ＨＰ１が腫瘍抑制網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）と相互作用するという観察（Nielsen et al, 2001b; Williams&Grafi, 2000）及び、ＨＰ１がサイクリンＥのような細胞周期遺伝子のＲｂ依存性サイレンシングに関与するという観察（Nielsen et al, 2001b）から提唱された。同様に、ＨＰ１は、Ｅ２Ｆ１（Wang et al, 2007）及びｐ５３（Wang et al, 2005）タンパク質の制御に関与する、転写のコリプレッサーであるＫＡＰ−１と相互作用する（Ryan et al, 1999）。さらに、ＨＰ１α及びγはクロマチン会合因子１（ＣＡＦ−１）との複合体中に見いだされ（Murzina et al, 1999; Quivy et al, 2004）、この内の中間体サブユニットｐ６０は乳癌における有効な増殖マーカーである（Polo et al, 2004)。しかしながら、細胞増殖、静止期及び癌に関連する、３つのＨＰ１イソ型に特異的な及び／又は共通の制御パターンは明かになっていない。
【００２２】
発明者らは、ＨＰ１αが増殖依存的な発現パターンを表すという特異な特性を示すこと、及び、同じ患者由来の癌細胞において、非腫瘍細胞と比較した場合に、ＨＰ１β又はγではなくＨＰ１αの有意な過剰発現が認められたことを示した。このＨＰ１αの過剰発現は、膵臓、子宮、卵巣、前立腺及び乳癌において認められた。これらの結果は、ＨＰ１αが複数の型の癌の診断のためのマーカーを構成することを示す。本明細書において発明者らは、癌におけるＨＰ１αの発現レベルが臨床データ及び疾患の転帰と関連することもまた示す。それらは、癌におけるＨＰ１αの高い発現レベルが、時間経過に伴う患者の生存率の低下、初期疾患進行、疾患再発の増加及び／又は転移の発生の増加、すなわち予後不良と関連することを示す。
【００２３】
定義
本明細書で使用する場合、「ＨＰ１α」という語は、高度に保存された非ヒストンタンパク質である、ヘテロクロマチンタンパク質１−アルファを指す。Ｇｅｎｂａｎｋには、ＮＰ＿００１１２０７９３、ＮＰ＿００１１２０７９４、ＮＰ＿０３６２４９の、ヒトＨＰ１αに対応する３つのアクセッション番号がある。このタンパク質は、遺伝子ＣＢＸ５（ＧｅｎｅＩＤ：２３４６８）によりコードされる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「癌」又は「腫瘍」という語は、制御されない増殖、不死性、転移可能性、早い増殖及び増殖率のような癌を誘発する細胞の典型的な特徴、及び特定の特徴的な形態学的特徴を有する細胞の存在を指す。この語は、任意の型の悪性度（初期又は転移）を指す。典型的な癌は、乳、胃、食道、肉腫、卵巣、子宮内膜、膀胱、子宮頸、直腸、結腸、肺又はＯＲＬ癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、多形膠芽細胞腫）、リンパ腫、白血病、骨髄腫、精上皮腫、ホジキン及び悪性血液疾患のような固形癌又は造血癌である。好ましくは、癌は、乳癌、膵臓癌、子宮及び子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌並びに白血病からなる群より選択される。好ましくは、癌は固形癌であり、より好ましくは、局所的又は全身性の浸潤のない早期固形癌である。好ましくは、固形癌は乳癌であり、より好ましくは局所的又は全身性の浸潤のない早期乳癌である。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」又は「治療している」という語は、疾患の治療、予防、防御及び遅延のような、患者の健康状態を回復することを意図する、任意の行為を指す。特定の実施形態においては、そのような語は、疾患又は疾患に関連がある症状の回復又は根絶を指す。その他の実施形態においては、この語は、そのような疾患を有する対象に１つ以上の治療薬を投与することにより、疾患の拡大又は悪化を最小限にすることを指す。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「化学療法治療」又は「化学療法」という語は、化学的な又は生化学的な物質、具体的には１つ又は複数の抗腫瘍薬を用いた癌の治療的処置を指す。
【００２７】
「放射線治療処置」又は「放射線治療」という語は、内部の及び外部の放射線治療又は放射免疫治療、及びＸ線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、放射性同位元素、及びその他の型の電離放射線を含む様々な型の放射線の使用を含む、複数の型の放射線治療を指す、当該分野において一般的に用いられる語である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「アジュバント療法」という語は、一般に、転移及び／又は再発する恐れがあるリスクを有する癌に罹患した患者の初期腫瘍を外科的に切除した後に、追加の治療として与えられる化学療法又は放射線治療を指す。そのようなアジュバント治療の目的は、予後を改善することである。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「予後不良」という語は、患者の生存率の低下及び／又は初期疾患進行及び／又は疾患再発の増加及び／又は転移形成の増加を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「対象」又は「患者」という語は、動物、好ましくは哺乳類、さらにより好ましくは成人、子供及び出生前段階のヒトを含むヒトを指す。しかしながら、「対象」という語は、中でも治療を必要とする非ヒト動物、具体的にはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及び非ヒト霊長類のような哺乳類を指す。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「試料」という語は、対象由来の細胞を含む任意の試料、好ましくは核酸を含む試料を意味する。そのような試料の例としては、血液、血漿、唾液、尿及び精液試料のような液体、並びに生検、器官、組織又は細胞試料が挙げられる。試料をその使用の前に処理してもよい。「癌試料」という語は、患者由来の腫瘍細胞を含む任意の試料、好ましくは核酸を含む試料を指す。好ましくは、この試料は腫瘍細胞のみを含む。「正常な試料」という語は、いずれの腫瘍細胞も含まない任意の試料を指す。
【００３２】
以下に開示する本発明の方法は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロの方法であってよく、好ましくはインビトロの方法である。
【００３３】
これまでの研究では、ＨＰ１αの発現の増加は、複数の乳癌細胞株における浸潤の可能性の低下と関連していた（Kirschmann et al., 2000; Norwood et al., 2006)。驚くことに、本明細書において発明者らは、ＨＰ１αの高い発現レベルがそれどころか予後不良と関連があり、従って死亡リスクの増加と関連することを示した。
【００３４】
従って、本発明は、癌に罹患した対象の臨床転帰を予測又はモニタリングする方法に関し、ここでこの方法は、前記対象由来の癌試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは予後不良の指標となる）を決定する工程を含む。
【００３５】
ある実施形態において、この方法は、対象から癌試料を準備する工程をさらに含む。
【００３６】
ＨＰ１αの発現レベルは、癌試料から、様々な技術によって決定することができる。ある実施形態においては、ＨＰ１αの発現レベルは、ＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。
【００３７】
特定の実施形態においては、ＨＰ１αの発現レベルは、ＨＰ１αタンパク質の量を測定することにより決定される。ＨＰ１αタンパク質の量は、当業者に既知の任意の方法によって決定され得る。一般に、これらの方法は、試料と、試料中に存在するＨＰ１αタンパク質と選択的に相互作用することが可能な結合パートナーとを接触させることを含む。結合パートナーは通常、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。抗ＨＰ１αのポリクローナル及びモノクローナル抗体は市販されている。これら市販の抗体の例としては、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘのマウスモノクローナル抗ＨＰ１α ２ＨＰ−１Ｈ５（アミノ酸６７〜１１９に対する）、Ｓｉｇｍａのウサギポリクローナル抗ＨＰ１α Ｈ２１６４（アミノ酸１７７〜１９１に対する）及びＥｕｒｏｍｅｄｅｘのマウスモノクローナル抗ＨＰ１α ２ＨＰ−２Ｇ９が挙げられる。ＨＰ１αタンパク質を定量するために、異なる方法において用いられるその他の抗体は当業者において既知であり、市販されている。ＨＰ１αタンパク質の量を、半定量的ウエスタンブロット、酵素で標識した及び酵素介在性免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ビオチン／アビジン型アッセイ、放射性免疫アッセイ、免疫電気泳動若しくは免疫沈降など）又はタンパク質若しくは抗体アレイにより測定してもよい。タンパク質の発現レベルを、癌試料（例えば凍結又はホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した材料）の組織切片上での免疫組織化学により評価してもよい。反応は通常、蛍光、化学発光、放射性活性、酵素標識又は色素分子のような標識体を表す工程、又は、抗原と抗体若しくはそれと反応する抗体との複合体の形成を検出するその他の方法を含む。好ましくは、ＨＰ１αタンパク質の量は免疫組織化学又は半定量的ウェスタンブロットにより測定される。免疫組織化学によるＨＰ１αの検出は、慣習的に用いられるＫｉ−６７マーカーとは異なって、抗原の脱マスキング工程を必要としないため、染色工程の時間を短縮する。
【００３８】
別の実施形態において、ＨＰ１αの発現レベルは、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。ｍＲＮＡの量を決定する方法は当該分野において周知である。例えば、試料（例えば、患者から調製した細胞又は組織）に含まれる核酸を最初に標準的な方法、例えば溶解酵素若しくは化学溶液を用いて抽出するか、又は製造業者の説明に従って核酸結合樹脂により抽出する。次に、抽出したｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット解析）及び／又は増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により検出する。好ましくは定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲは特に有利である。推定されるゲノムの混入からｃＤＮＡの増幅を区別できるように、イントロンを含むようにプライマー対を設計することが好ましい。この方法において用いることができるプライマー対の例は実施例部分に示されおり、かつ、配列番号８及び配列番号９のプライマーから構成されている。当業者はその他のプライマーを容易に設計することができる。増幅のその他の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、ＳＤＡ法（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。好ましくは、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量は、定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、又はリアルタイム定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、又はトランスクリプトーム解析により測定される。
【００３９】
ある実施形態においては、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルと基準の発現レベルを比較する工程をさらに含む。
【００４０】
特定の実施形態においては、基準となる発現レベルは、正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベルである。正常な試料とは非腫瘍試料であり、好ましくは癌試料と同じ組織由来のものである。正常な試料を、癌に罹患した対象から得てもよく、又はその他の対象、好ましくは正常又は健康な対象、すなわち癌に罹患していない対象から得てもよい。好ましくは、正常な試料は癌試料と同じ対象から得られる。癌及び正常な試料から得られた発現レベルを、ＲＰＬＰＯ（酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ）、ＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ）又はβ−アクチンのような、安定した発現を有することが知られているタンパク質の発現レベルを用いて正規化してもよい。
【００４１】
別の実施形態においては、基準となる発現レベルは、異なる癌試料において安定して発現する遺伝子の発現レベルである。そのような遺伝子には、例えば、ＲＰＬＰＯ、ＴＢＰ、ＧＡＰＤＨ又はβ−アクチンが含まれる。好ましくは、基準発現レベルは、ＲＰＬＰＯ遺伝子の発現レベルである。基準としてのヒト酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）遺伝子の使用については、de Cremouxら（de Cremoux et al., 2004）の文献に記載されている。好ましい実施形態においては、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量は、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量に従って正規化される。ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量は、基準の量（すなわち１００％）として用いられる。ＨＰ１α ｍＲＮＡの量は、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量に関する相対量として表される。
【００４２】
さらなる実施形態においては、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルが基準発現レベルと比較して高いかどうかを決定する工程をさらに含む。
【００４３】
基準発現レベルが正常な試料のＨＰ１αの発現レベルであるとき、正規化した後で、癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルが正常な試料における発現レベルよりも少なくとも１．５倍高い場合に高いと考えられる。好ましくは、癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルが正常な試料における発現レベルよりも少なくとも２倍、又は、３、４、５又は６倍高い場合に、高いと考えられる。
【００４４】
基準発現レベルが異なる癌試料において安定した発現を有する遺伝子、具体的にはＲＰＬＰＯ遺伝子、の発現レベルであるとき、ＨＰ１α ｍＲＮＡのレベル又は量が、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡレベル又は量の少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％である場合に、ＨＰ１αの発現レベルが高いと考えられる。好ましい実施形態においては、ＨＰ１α ｍＲＮＡのレベル又は量が、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡレベル又は量の少なくとも１０％である場合に、ＨＰ１αの発現レベルが高いと考えられる。その他の基準遺伝子を用いることで、当業者により、このカットオフ値は容易に調整され得る。このカットオフ値は、具体的には乳癌に適用可能である。この値は、癌の型により多様になり得、そして当業者により容易に適用されるだろう。
【００４５】
ある実施形態においては、本方法は、腫瘍悪性度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現、好ましくはＣＡＦ−１増殖マーカーの発現のような、少なくとも１つの別の癌又は予後マーカーを評価することをさらに含む。これらのマーカーは一般的に使用されており、そしてこれらのマーカーにより得られる結果を、予後を確認するために本方法によって得られる結果と組み合わせても良い。これらのマーカーの使用は、当業者に周知である。例としては、腫瘍悪性度をＥｌｓｔｏｎ＆Ｅｌｌｉｓの方法（Elston & Ellis, 2002）により決定することができ、ホルモン受容体の状態（エストロゲン及びプロゲステロン）をタンパク質又はｍＲＮＡレベルで決定することができ、代表的な組織切片中の１０個の顕微鏡視野における有糸分裂細胞を計測することにより分裂指数を決定することができ、そして腫瘍サイズを画像技術（例えば乳房撮影）により、触診により、若しくは手術後の切除組織を用いて検出することができる。Ｋｉ６７及びＣＡＦ−１の発現を、タンパク質レベル又はｍＲＮＡレベルで評価することができる。高い悪性度、高い分裂指数、大きなサイズ及び／又は高いＫｉ６７若しくはＣＡＦ−１の発現は、悪い予後の指標となる。ＨＪＵＲＰ発現レベルを、Hu et al., 2010に記載されたように評価してもよい。高いＨＪＵＲＰ発現は臨床転帰の不良と関連がある。
【００４６】
多変量の統計解析を用い、以下の実施例部分において発明者らは、ＨＰ１αの発現レベルが、これらの標準的な予後マーカーよりもよく疾患転帰を予測することを示した。
【００４７】
これまでに、異なる癌細胞株におけるＨＰ１の発現レベルが比較されてきたが、腫瘍及び非腫瘍細胞におけるＨＰ１の発現レベルを比較する研究は行われていない。本明細書において、発明者らは初めて、同じ患者由来の非腫瘍細胞におけるＨＰ１αの発現と比較して、ＨＰ１αが腫瘍細胞において特異的に過剰発現していることを示す。そのような過剰発現は、従って、複数の型の癌、具体的には乳癌、の診断マーカーとなる。
【００４８】
従って、本発明は、対象における癌の診断方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは前記対象が癌に罹患していることを示す）を決定する工程を含む。
【００４９】
ある実施形態においては、この方法は、対象から試料を準備する工程をさらに含む。好ましくは、この試料は腫瘍細胞を含む考えられる。
【００５０】
この試料におけるＨＰ１αの発現レベルは上述したように、好ましくはＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより、決定される。
【００５１】
ある実施形態においては、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルを、基準発現レベル、好ましくは正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベル、と比較する工程をさらに含む。上述したように、正常な試料とは非腫瘍試料、好ましくは試験する試料と同じ組織由来の試料である。正常な試料を、診断する対象又はその他の対象、好ましくは健康な対象から得てもよい。正常な試料及び試験する試料から得た発現レベルを、本明細書上部で記載したような、安定した発現を有することが知られているタンパク質の発現レベルを用いて正規化してもよい。
【００５２】
さらなる実施形態において、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルが前記基準発現レベルよりも高いかどうかを決定する工程をさらに含む。試験する試料におけるＨＰ１αの発現レベルが、正常な試料における発現レベルよりも少なくとも１０、２５、５０又は７５％高い場合に、対象は癌に罹患していると診断される。好ましくは、試験する試料におけるＨＰ１αの発現レベルが、正常な試料よりも少なくとも２５％高い場合に対象が癌に罹患していると診断される。
【００５３】
別の実施形態において、本方法は、腫瘍悪性度、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現、好ましくはＣＡＦ−１増殖マーカーの発現、のような癌の診断に用いられる少なくとも１つの別のマーカーを評価することをさらに含む。これらのマーカーは診断の目的において一般的に使用されており、そしてこれらのマーカーにより得られる結果を、予後を確認するために本方法によって得られる結果と組み合わせても良い。
【００５４】
本発明はまた、対象における癌の診断に有用な情報の提供方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは前記対象が癌に罹患していることの指標となる）を決定する工程を含む。ある実施形態において、この方法は、対象から癌試料を準備する工程をさらに含む。
【００５５】
さらなる態様において、本発明は、アジュバント化学療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択する方法、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定する方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルはアジュバント化学療法及び／又は放射線治療が必要であることを示す）を決定する工程を含む。
【００５６】
ある実施形態において、この方法は、対象から癌試料を準備する工程をさらに含む。
【００５７】
上述したように、この癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルは、好ましくはＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより、決定される。
【００５８】
ある実施形態において、この方法は、臨床転帰の予測方法に関して、上述したようにＨＰ１αの発現レベルを基準発現レベルと比較する工程を含む。基準となる発現レベルは正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベル、又はＲＰＬＰＯ遺伝子のような様々な癌試料において安定した発現を有する遺伝子の発現レベルであってもよい。
【００５９】
さらなる実施形態において、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルが前記基準発現レベルよりも高いかどうかを決定する工程をさらに含む。特定の実施形態においては、正規化した後で、癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルが正常な試料における発現レベルよりも少なくとも１．５、２、３、４、５又は６倍高い場合に、高いと考えられる。好ましくは癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルが正常な試料における発現レベルよりも少なくとも１．５倍高い場合に、高いと考えられる。別の特定の実施形態においては、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量が、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡ量の少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％である場合にＨＰ１αの発現レベルが高いと考えられる。好ましくは、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量が、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量の少なくとも１０％である場合に、ＨＰ１αの発現レベルが高いと考えられる。
【００６０】
上記で説明したように、これらのカットオフ値は特に乳癌に適用され、また、癌の型によって多様になり得る。しかしながら、当業者はこのカットオフ値を容易に適用することができる。
【００６１】
ＨＰ１αの高い発現レベルは、患者の生存率の低下及び／又は初期疾患進行及び／又は疾患再発の増加及び／又は転移形成の増加を示す。従って、予後不良と関連があるこの型の癌は、患者の生存の機会を改善する目的において、アジュバント化学療法及び／又は放射線治療で治療する必要がある。アジュバント療法の型は施術者により選択される。
【００６２】
ある実施形態において、本方法は、腫瘍悪性度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現、好ましくはＣＡＦ−１増殖マーカーの発現、のような少なくとも１つの別の癌及び予後マーカーを評価することをさらに含む。これらのマーカーにより得られる結果を、本発明の方法によって得られる結果を確認するために、及び／又はアジュバント療法の選択のために用いてもよい。
【００６３】
最後の態様において、本発明は、癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングする方法にさらに関し、ここでこの方法は、治療の投与前の前記対象からの癌試料及び治療の投与後の前記対象からの癌試料における、ＨＰ１αの発現レベル（治療の投与後に得た試料におけるＨＰ１αの発現レベルの低下は、対象が治療に反応することの指標となる）を決定する工程を含む。
【００６４】
ある実施形態において、この方法は、対象から癌試料を準備する工程をさらに含む。
【００６５】
治療は、任意の化学療法又は放射線治療であってよい。最初の癌試料は、治療の投与前に対象から得られる。二番目の試料は、治療の投与後に同じ対象から得られる。好ましくは、二番目の試料は、選択した治療による、細胞増殖への有意な効果が期待される場合に採取される。ある実施形態においては、二番目の試料は治療投与の少なくとも２日後、好ましくは前記投与の１週間後に採取される。
【００６６】
患者の治療への反応性は、治療の前及び後の腫瘍細胞におけるＨＰ１αの発現レベルを決定することにより評価される。癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルは上述したように、好ましくはＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。治療前に採取した試料に含まれる腫瘍細胞におけるＨＰ１αの発現レベルと比較して、治療後に採取した試料に含まれる腫瘍細胞におけるＨＰ１αのより低い発現レベルが、対象が治療に反応することを示す。
【００６７】
ある実施形態において、この方法は、腫瘍悪性度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現、好ましくはＣＡＦ−１増殖マーカーの発現、のような、少なくとも１つの別の癌マーカーを評価することをさらに含む。
【００６８】
この方法は、必要とされる治療の期間及び／又は程度の指標をもまた提供するだろう。この例においては、各治療サイクルの後の経過観察は、治療前よりもＨＰ１αの発現レベルが低いかどうかを決定し、従って、それに応じて治療の期間及び／又は程度を調整することを可能にする。
【００６９】
本発明はさらに、癌における、好ましくはヒトの癌における、そしてより好ましくはヒトの乳癌における、予後マーカーとしてのＨＰ１αの使用に関する。好ましい実施形態において、ＨＰ１αは、局所的又は全身性の浸潤のない、早期乳癌における予後マーカーとして用いられる。本明細書で使用する場合、「予後マーカー」という語は、癌に罹患した対象の臨床転帰を予測する又はモニタリングするために用いられる化合物、すなわちＨＰ１αを指す。
【００７０】
本発明はまた、癌の、好ましくはヒトの癌の、そしてより好ましくはヒトの乳癌の診断マーカーとしてのＨＰ１αの使用に関する。本明細書で使用する場合、「診断マーカー」という語は、対象における癌の診断のために用いられる化合物、すなわちＨＰ１αを指す。
【００７１】
本発明はまた、アジュバント療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択するための、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するためのマーカーとしてのＨＰ１αの使用に関する。好ましくは、この癌はヒトの癌であり、より好ましくはヒトの乳癌である。
【００７２】
本発明はさらに、癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングするためのマーカーとしてのＨＰ１αの使用に関する。好ましくは、この癌はヒトの癌であり、より好ましくはヒトの乳癌である。
【００７３】
ＨＰ１αを、上述した本発明の方法のうちのいずれか１つにおいて、マーカーとして使用することができる。
【００７４】
別の態様において、本発明はさらに、
（ａ）癌に罹患した対象の臨床転帰を予測又はモニタリングするための；及び／又は
（ｂ）対象における癌を診断するための；及び／又は
（ｃ）アジュバント療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択するための、若しくは癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するための；及び／又は
（ｄ）癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングするための、
キットに関し、ここでこのキットは、
（ｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１αに特異的な抗体、及び任意に、ＨＰ１αと前記少なくとも１つの抗体との複合体の形成を検出する手段；及び／又は
（ｉｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的なプローブ、及び任意に、前記少なくとも１つのプローブと、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する手段；及び／又は
（ｉｉｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的な核酸プライマー対、及び任意に、前記ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを増幅及び／又は検出する手段；及び、
（ｉｖ）任意に、そのようなキットの使用についての指針を提供する印刷物、
を含む。
【００７５】
本発明のさらなる態様及び利点を以下の実施例に記載するが、この実施例は説明するのためのものであり、限定するものではないと見なされるべきである。
【００７６】
実施例
実施例１
材料及び方法
細胞培養及び同調化
Ｗｉ３８初代肺線維芽細胞（ＡＴＣＣ）及びＢＪ初代包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ）をＭＥＭα培地（ＧＩＢＣＯ）中で、ＭＣＦ７乳癌細胞及びＨｅＬａ子宮頸癌細胞をＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞を１０mMのインスリン（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）中で、及びＨｓ５７８Ｂｓｔ健康乳房細胞（ＡＴＣＣ）を３０ng／mlの上皮成長因子（ＴＥＢＵ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。培地には１０％ウシ胎仔血清（Ｅｕｒｏｂｉｏ）並びに１０mg／mlのペニシリン及びストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を添加した。
【００７７】
静止期での同調化のために、初代細胞を、血清を含まない培地中で少なくとも７２時間、ＭＣＦ７細胞については１０nMの抗エストロゲンＩＣＩ１８２７８０（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Carroll et al, 2000）を含む培地中で４８時間、生育させた。
【００７８】
同調化を（Polo et al, 2004）に従ってフローサイトメトリーにより確認し、データをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて解析した。
【００７９】
ＨｅＬａ細胞を、（Polo et al, 2004）に記載されているように、細胞周期の異なる段階において同調化した。ＢＪ細胞を、１４時間遮断、１０時間解除、１４時間の再遮断、及び、Ｓ、Ｇ２及びＧ１期のそれぞれについて３、６、又は１２時間の解除、を行った以外は、同様に同調化した。有糸分裂をしているＢＪ細胞については、チミジンからの２回目の解除の４時間後に１０ng／mlのノコダゾールを添加し、１０時間後に細胞を回収した。同調化を（Polo et al, 2004）に記載されているようにフローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリーデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いて行った。
【００８０】
トランスフェクション及びｓｉＲＮＡ
抗生物質を含まない培地にプレーティングしたＨｅＬａ細胞を、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＯｐｔｉｍｅｍ １培地（Ｇｉｂｃｏ）を用い、３０nMのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。
【化１】
【００８１】
ＢＪ初代細胞を、２７回目の継代（ＡＴＣＣからの受領後、８回目の継代）の時に、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ）を用いて製造業者の説明に従って、トランスフェクションした。簡単に述べると、４×１０５個の細胞を、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ Ｘ−００１を用い、１００μlのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒ（Ａｍａｘａ）に溶解した０．８nmolのｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）又は１μgのプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。その後細胞を、４日以内にコンフルエンスに達しないように増殖させるため、７０００細胞／cm2の密度でプレーティングした。
【００８２】
ライブセルイメージング
ライブセルイメージング用に、ＢＪ細胞を７２時間の間隔でｓｉＲＮＡで２回トランスフェクションした。２回目のトランスフェクションではＨ２Ｂ−ｃｈｅｒｒｙをコードしているプラスミドを導入し、そしてガラスボトムディッシュ（Ｍａｔｔｅｋ）にプレーティングした。Ｂｉｏ Ｓｔａｔｉｏｎシステム（Ｎｉｋｏｎ）を用いて動画を作成した。２回目のトランスフェクションから４８時間後に開始して２４時間の間、画像を２０分毎に取得した。動画をＩｍａｇｅＪを用いて解析した。
【００８３】
細胞抽出物
全細胞抽出物については、ＰＢＳ中で洗った後、細胞をプレートから１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（６０mM Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ６．８；１０％グリセロール；２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；１％２−メルカプトエタノール及び０．００２％ブロモフェノールブルー）中にかき取り、そしてこれらの抽出物を１０分間煮沸し、その後−２０℃で保存した。
【００８４】
クロマチン結合細胞抽出物は、（Martini et al, 1998）に従って準備した。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ溶液を用いて決定した。
【００８５】
抗体
一次抗体：Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘのマウスモノクローナル抗ＨＰ１α ２ＨＰ−１Ｈ５及びＳｉｇｍａのウサギポリクローナル抗ＨＰ１α Ｈ２１６４（それぞれ、アミノ酸６７〜１１９及び１７７〜１９１、に対する）（免疫蛍光法及び免疫組織化学用）、ウエスタンブロット用マウスモノクローナル抗ＨＰ１α ２ＨＰ−２Ｇ９（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、マウスモノクローナル抗ＨＰ１β １ＭＯＤ１Ａ９（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、マウスモノクローナル抗ＨＰｌγ ２ＭＯＤ−１Ｇ６−ＡＳ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、抗ＣＲＥＳＴヒト血清、ウサギポリクローナル抗ＣＡＦ−１ ｐ６０、マウスモノクローナル抗β−アクチン ＡＣ−１５（Ｓｉｇｍａ）、マウスモノクローナル抗ＫＬ１抗体（Ｄａｋｏ）、ウサギポリクローナル抗サイクリンＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、マウスモノクローナル抗Ｈ３Ｓ１０Ｐ（Ａｂｃａｍ ａｂ１４９５５）及びウサギポリクローナル抗Ｃｄｔｌ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ２８２６２）。
【００８６】
二次抗体：Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテキサスレッド結合抗体（免疫蛍光法）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（ウェスタンブロット）。
【００８７】
ウェスタンブロット
２５Ｕのｂｅｎｚｏｎａｓｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で３０分間処理した後、細胞抽出物をｌ×ＭＥＳ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４〜１２％の勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、その後（Martini et al, 1998）に記載の通りにウェスタンブロットを行った。
【００８８】
免疫蛍光法
２％のパラホルムアルデヒド中で固定した後、ＰＢＳに溶解した０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で細胞を透過処理した。免疫蛍光検出は（Martini et al, 1998）の通りに行った。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中にカバーグラスを封入した。
【００８９】
組織試料上での免疫蛍光法用に、凍結した乳房組織（Ｃｕｒｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から８μmの凍結切片を作成し、スライドグラス上、３％ パラホルムアルデヒド中で固定し、その後免疫染色を上述したように行った。
【００９０】
免疫組織化学
凍結した乳房組織（Ｃｕｒｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）からの８μm凍結切片又は凍結組織アレイ（ＦＭＣ４０１、Ｂｉｏｍａｘ）を用いた。スライドグラス上、３％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして０．５％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ中で４分間透過処理した切片を、ペルオキシダーゼを阻害するために３％Ｈ２Ｏ２（Ｐｒｏｌａｂｏ）中で５分間インキュベートし、その後１％ＢＳＡと５％脱脂粉乳を含むＰＢＳ中でブロッキングした。ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）及びジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて検出し、その後ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ）を用いて対比染色した。高濃度のエタノールとトルエンでスライドを脱水し、その後Ｅｎｔｅｌｌａｎ封入剤（Ｍｅｒｃｋ）を用いて封入した。
【００９１】
ＲＮＡの抽出、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びプライマー
細胞株又は凍結した患者試料からのトータルＲＮＡの抽出にはｍＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、そして１反応当たりｌμgのＲＮＡと３μgのランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、Ｓｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲには、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ２．０システム（Ｒｏｃｈｅ）及びＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。患者試料については、９６−ウェルプレートのＳｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。２連の反応を測定し、そしてプライマー効率を評価するために、３つの連続希釈したｃＤＮＡを用いた。推定されるゲノムの混入からｃＤＮＡの増幅を区別できるように、プライマー対をイントロンを含むように設計した。
【化２】
ＨＰ１α ｍＲＮＡの量を、ｘ＝Ｅ（Ｃｐ ＲＰＬＰＯ−Ｃｐ ＨＰ１α）の式（式中、Ｅはプライマー対の効率の平均、及びｘは示された試料におけるＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量に対するＨＰ１α ｍＲＮＡの相対量）を適用することにより、ヒト酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化した。
【００９２】
乳癌患者試料及び統計値
本研究は、最初の保存的な腫瘍摘出術のために、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃｕｒｉｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒから選択した９２の乳癌試料（腫瘍の中間サイズ：１８mm［６〜５０mm］）を含んだ。患者は１９９５年に診断され、そしてリンパ節陰性（ＮＯ）、かつ、転移が無い（ＭＯ）であると認められた。患者には調査目的が告知され、患者は反対意見を表明しなかった。患者及び腫瘍の特徴を表１に示す。冷凍保存した組織からＲＮＡを抽出し、そして上述したように解析した。８６の試料からのＲＮＡはさらなる解析に十分な質であった。
【００９３】
群間の差を、カテゴリー変数についてはχ２又はフィッシャーの直接確率検定によって、及び連続変数についてはクラスカル・ワリスによって解析した。再発がなく、生存している患者については、最後に会ったことが分かっている日時で調査を打ち切った。生存データは乳癌と診断された日から疾患進行の発生までの期間として定義し、疾患進行の発生は治療した乳房における局所再発、リンパ節領域における局所再発、対側乳癌又は遠隔再発として定義した。無病期間（ＤＦＩ）についての予後カットオフ値の決定はコックスの比例ハザードモデル（Ｃｏｘ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋｓ ｍｏｄｅｌ）を用いてコンピューターにより行った。各イベントにおけるこの変数の予後値の評価には、ワルド検定を用いた。全生存（ＯＳ）、無転移期間及びＤＦＩ率をカプラン・マイヤー法により予測し、そしてログランク検定を用いて群間の比較を行った。コックスの前向き解析（Ｃｏｘ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）（Ｃｏｘ１９７２）を用いて、ＯＳ及びＤＦＩにおける予後因子の相対的な影響を評価するために多変量解析を行った。有意なレベルは０．０５であった。解析はＲソフトウェア２．５．０バージョンを用いて行った。
【００９４】
結果
ＨＰ１αの発現は細胞増殖に依存する
近年の研究には、ＨＰ１タンパク質が、未分化の血液細胞と比較して、分化した血液細胞でダウンレギュレートされていることが記載されてきた（Baxter et al, 2004; Gilbert et al, 2003; Istomina et al, 2003; Ritou et al, 2007）。このダウンレギュレーションは、細胞周期からの離脱に共通の反応、又は（血液）細胞の分化に特異的な結果だと考えられる。この問題を扱うために、発明者らは分化過程を伴わない、一過性の細胞周期からの離脱が同様にＨＰ１のダウンレギュレーションを生じるかどうかについて試験した。血清飢餓によって静止期を誘導した２種類の異なるヒト初代線維芽細胞（ＷＩ３８及びＢＪ）を用い、発明者らは、ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのタンパク質レベルが、増殖期細胞と比較して静止期細胞ではより低いことを観察した（図１Ａ）。抗エストロゲン処理により静止期で停止させたＭＣＦ７乳癌細胞（Carroll et al, 2000）も同様に、ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションを示す。従って、静止期を誘導するための２つの異なる手段を用いて、発明者らは、その量が細胞が静止期にあった時間に関係する、ＨＰ１αイソ型の特異的なダウンレギュレーションを見いだした。対照として、全ての静止期細胞におけるＣＡＦ−１ ｐ６０のダウンレギュレーション（Polo et al, 2004）を確認し（図１Ａ）、フローサイトメトリーにより同調効率を評価した（図１Ｂ）。非同調的増殖期の細胞と比較した場合、静止期ＢＪ細胞もまた低いＨＰ１α ｍＲＮＡレベルを示すことから（定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、図１Ｃ）、ＣＡＦ−１ ｐ１５０及びｐ６０と同様に、一過性の静止期におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは部分的には転写制御に関係する。静止状態からの離脱に際しては、ＨＰ１αのタンパク質レベルは、細胞周期への進入の時間（フローサイトメトリーにより決定した、図２Ｂ）と対応する、解除から１６〜２４時間の間に徐々に増加する（図２Ａ）。ＨＰ１αの蓄積はＣＡＦ−１ ｐ６０のうちの１つより早く起こり（図２Ａ）、大部分はＤＮＡ複製の開始において観察された。
【００９５】
静止期において観察されるＨＰ１αのダウンレギュレーションは、静止状態に特異的か、又は細胞周期の特定の状態に限定される発現を反映するものだと考えられた。そこで発明者らは、同調させたＨｅＬａ細胞の細胞周期経過におけるＨＰ１αのレベルを解析した。細胞周期マーカーであるサイクリンＡとは対照的に、同調した細胞集団におけるＨＰ１αレベルの有意な変動は観察されなかった（図３Ａ、Ｂ）。同様に、正常な細胞周期の制御を示すヒト初代線維芽細胞は、同調した細胞集団におけるＨＰ１αタンパク質（図３Ｃ）及びｍＲＮＡと本質的に類似したレベルを示す（図３Ｄ、Ｅ）。この点においてＨＰ１αは、細胞周期経過において普遍的に発現するが静止期においてダウンレギュレートされる、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びｐ１５０と同様にふるまう（図１及び３；（(Polo et al, 2004））。結論として、ＨＰ１αの発現レベルは増殖可能な細胞において細胞周期の全ての状態において高く、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは静止状態に特異的である。
【００９６】
ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現する
ＨＰ１αの増殖依存的な発現は、ＣＡＦ−１ ｐ６０（Polo et al, 2004）を含む増殖マーカーに見られるような、腫瘍及び非腫瘍細胞間での差次的発現の可能性を示唆するものである。この問題を試験するために、発明者らは比較のため、同じ患者由来の腫瘍（Ｈｓ５７８Ｔ）又は非腫瘍（Ｈｓ５７８Ｂｓｔ）（Hackett et al, 1977）いずれかの乳房細胞を用いた。全細胞抽出物に加え、可溶性画分及びクロマチン結合画分の両方におけるＨＰ１タンパク質のレベルも解析した（図４Ａ）。実際には、ＨＰ１タンパク質は、高濃度塩を用いた又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤を用いた抽出に抵抗性があることで区別される、様々な核画分に分布する。ＨＰ１の塩又は界面活性剤抵抗性プールは、活性な、ＨＰ１のクロマチン結合プールであり、そしてウエスタンブロット定量（Taddei et al, 2001）又はＦＲＡＰ（Cheutin et al, 2003; Dialynas et al, 2007; Festenstein et al, 2003）によって決定されたように、ヒト及び齧歯類細胞の全ＨＰ１の１０％未満を示すと考えられる。
【００９７】
クロマチン結合及び可溶性核画分の両方において、発明者らは、非腫瘍Ｈｓ５７８ＢｓＴ細胞と比較して腫瘍Ｈｓ５７８Ｔ細胞においてより高いレベルのＨＰ１αを観察したが、ＨＰ１β又はγの発見はローディングコントロールであるβ−アクチンと比較してほとんど差を示さない（図４Ｂ）。同一量の細胞をロードした場合も、特異的な、ＨＰ１αの腫瘍での過剰発現を示す（図５）。全細胞抽出物を用いた半定量的ウエスタンブロットは、ローディングコントロールと比較して、腫瘍Ｈｓ５７８Ｔ細胞は非腫瘍Ｈｓ５７８ＢｓＴ細胞よりもおよそ８倍多いＨＰ１αタンパク質を含むことを示す（図４Ｃ）。フローサイトメトリーにおいて腫瘍Ｈｓ５７８Ｔ細胞が非常に中程度な異数性を示すことから（図４Ｄ）、発明者らは、ＨＰ１αの発現レベルが細胞のＤＮＡ含量を反映している可能性を排除することができた。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出したＨＰ１α ｍＲＮＡの過剰発現（図４Ｅ）はさらに、少なくとも部分的には転写を含む制御を示す。
【００９８】
クロマチン結合及び可溶性画分に関する本解析は、腫瘍細胞におけるＨＰ１αの過剰発現は部分的にはクロマチン結合であり、そのためクロマチン構成に重要である可能性を示唆するものである。これは、非腫瘍乳房細胞では粒状で分散しているが、乳癌細胞の大部分においては別々のスポットとしてはっきりと局在する（図６Ａ）、その核局在と一致するようである。ＣＲＥＳＴ自己免疫血清により検出したように、これらのスポットの大部分はセントロメア領域に局在する（図６Ａ）。さらに、ＨＰ１αの差次的な局在は、変化したＨ３Ｋ９ｍｅ３の核分布を伴わず（図６Ｂ）、そして細胞周期マーカーの染色により検出されるように（図６Ｃ）、ＨＰ１α染色の異なるパターンは細胞周期の特定の状態とは相関しないようであった。結論として、本細胞株モデルは、ＨＰ１β又はγではなくＨＰ１αの、非腫瘍乳房細胞と比較して腫瘍乳房細胞での過剰発現を示した。乳癌細胞におけるＨＰ１αの大部分の画分はクロマチン結合であり、そしてセントロメア領域に局在する。
【００９９】
ＨＰ１αのダウンレギュレーションは有糸分裂の欠損を生じる
ＨＰ１β又γには見られない、ＨＰ１αの増殖依存的発現は、このイソ型に特異な機能を指摘し、そしてこのタンパク質の量が多いことが細胞成長に有利になり得ることを示唆するものである。興味深いことに、ＣＡＦ−１ ｐ１５０のダウンレギュレーションは、そのＨＰ１タンパク質との相互作用による、Ｓ期での著明な停止を生じる（Quivy et al, 2008; Quivy et al, 2004）。そのため、発見者らは、ヒト癌細胞の増殖においてＨＰ１α、β又はγの高い発現レベルが必要なのかどうかについて試験した。ＨＰ１α、β又はγを標的とするｓｉＲＮＡを用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクションすることにより、ＨＰ１の各イソ型の特異的なダウンレギュレーションを得た（図７Ａ）。その結合パートナーであるＣＡＦ−１ ｐ１５０（Quivy et al, 2008）のダウンレギュレーションと比較して、ＨＰ１イソ型のダウンレギュレーションは、フローサイトメトリーによって評価したように（図７Ｂ）、細胞増殖において明らかに影響を及ぼさなかった。発明者らは、乳癌細胞株Ｈｓ５７８ＴにおけるＨＰ１αのダウンレギュレーションについても同様の結果を得た。しかしながら、これまでの報告と同様に（Auth et al, 2006; Obuse et al, 2004）、発明者らは、ＨＰ１αのダウンレギュレーションの後に遅滞染色体、不均衡及び染色体橋を示す（図７Ｃ）有糸分裂プロファイルの画分の増加を認めた。これらを異常な有糸分裂画分として定量した（図７Ｄ）。興味深いことに、本実施例の条件下においては、ＨＰ１β又γのダウンレギュレーションは有糸分裂欠損の増加をもたらさず、このことはＨＰ１αイソ型のみが正常な有糸分裂に重要であることを示唆している。さらに、ＨＰ１β又γではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションの後に小核の形成が３倍増加したことが観察されたことからも、有糸分裂の欠損が支持された（図７Ｅ、Ｆ）。
【０１００】
ＨｅＬａ細胞がこれまでに、多くの画分での有糸分裂の欠損（〜２０％）及び多くの画分での小核の形成（〜１０％）を示したことから、さらなる解析のために、発明者らは、細胞周期の制御及びチェックポイントの活性に有用な、初代線維芽細胞を用いた。ＨＰ１αに対する２つの異なるｓｉＲＮＡを用いた一過性のトランスフェクションは、このイソ型の特異的なダウンレギュレーションを生じた（図８Ａ）。ここでも、発明者らはフローサイトメトリーによる全体的な細胞周期分布における有意な効果を検出しなかったが（図８Ｂ）、顕微鏡観察により、少なくはあるが再現可能な前中期のパーセンテージの増加、及び中期のパーセンテージの低下を認めた（図８Ｃ）。興味深いことに、この効果は、ＨＰ１αのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホモログの突然変異（Kellum & Alberts, 1995）、又はニワトリ細胞におけるセントロメアヒストンＨ３変異体ＣＥＮＰＡの不活性化（Regnier et al, 2005）において見られる効果と類似するものである。ライブセルイメージングを用い、ＨＰ１αのダウンレギュレーション後の有糸分裂期間における、対照と比較して、少なくはあるが統計学的に有意な（ｐ＝４．９ｅ−７）増加を測定した（図８Ｄ、上段のグラフ）。興味深いことに、ここでもまた、遅延は主に実際の染色体分離に先立つ工程に影響した（図８Ｄ、下段のグラフ）。結論として、腫瘍及び初代細胞両方を用いた本観察は、おそらく位置の調整、又は染色体の中期における安定した結合に寄与することによる、ＨＰ１αの初期有系分裂における役割を示唆するものである。
【０１０１】
ヒト癌試料におけるＨＰ１αの過剰発現
乳癌細胞株におけるＨＰ１αの増殖依存的発現及びその過剰発現は、発明者らを、ヒトの癌の生理学的な状況におけるＨＰ１αの発現について研究するよう促した。最初に、異なる組織型において行われ、報告されたトランスクリプトーム研究からのデータをＯｎｃｏｍｉｎｅデータベース（Rhodes et al, 2004）を用いて解析した。これらのデータは、ＨＰ１αが複数の型の固形腫瘍並びに白血病において有意に及び一貫して過剰発現すること（図９Ａ）、及びその発現が結合パートナーであるＣＡＦ−１ ｐ１５０及び増殖マーカーＫｉ６７の発現と相関すること（図９Ｂ）を示した。
【０１０２】
培養細胞における本結果は、ＨＰ１αタンパク質レベルの差が、対応するｍＲＮＡレベルよりも顕著であり（図１及び４）、おそらく転写後の制御を反映しているのだろうということを系統的に示した。これに刺激され、発明者らは免疫組織化学により、凍結した腫瘍及び非腫瘍ヒト組織切片におけるＨＰ１αタンパク質レベルを解析した。膵臓、子宮、卵巣、前立腺及び乳房での悪性腫瘍の腫瘍細胞の核において、ＨＰ１αの強い染色が系統的に観察された（図１０Ａ）。対応する非腫瘍組織においては、ＨＰ１αレベルは主に、検出限界よりも低かった。ＨＰ１β及びγは腫瘍及び非腫瘍組織の両方での核染色を示す中で、この差次的発現はＨＰ１αに特異的であった（図１０Ｂ）。癌細胞に対応するＨＰ１αの強い免疫染色を示す核は、上皮サイトケラチンマーカーＫＬ−１についてもまた陽性であった（図１０Ｃ）。加えて、図１０で用いられたモノクローナル抗体よりも強い染色を呈するＨＰ１αに対するポリクローナル抗体もまた、癌細胞における明かな過剰発現と、非腫瘍組織におけるいくらかの染色を示した（図１１Ａ）。しかしながら、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３についての染色は、非腫瘍及び腫瘍組織間での明かな差は示さず（図１１Ｂ）、このことはＨＰ１αの検出がより感受性であるか、又は過剰発現がＨ３Ｋ９ｍｅ３とは独立して生じるかのいずれかを示唆するものである。
【０１０３】
腫瘍成長及び疾患転帰におけるＨＰ１αの過剰発現の重要性を決定するために、１９９５年に採取され、凍結保存した乳癌標本を選択した。発明者らは、それらのサイズ（中間値１８mm；範囲６〜５０mm）が最初の保存的腫瘍摘出に適した、リンパ節転移陰性及び転移のない浸潤癌に焦点を当てた。これらの症例ではアジュバント化学療法の指標である新しい予後マーカーから恩恵を受けると考えられる。患者及び腫瘍の特徴は以下のとおり、表１に示した。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
経過観察の中間値は１４６ヶ月である（範囲３０〜１６１）。１０年目での全生存、遠隔再発及び疾患進行率はそれぞれ、９０％［８３〜９７％］、８７％［８０〜９５％］及び７０％［６１〜８１％］であった。８６の試料におけるＨＰ１α ｍＲＮＡ発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、発現レベルを基準遺伝子であるリボソームタンパク質ＰＯ様タンパク質（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化した。発明者らはＨＰ１αの高いレベルが患者の年齢上昇と関連し（ｐ＝０．００１４）、より大きく、高度に分裂した、グレードＩＩＩの腫瘍と関連する（有意差なし）傾向にあることを見いだした（図１２Ａ）。単変量解析においては、ＨＰ１αの継続的な発現は、疾患進行のリスク増加と有意に関連した：ｌｏｇ２（ＨＰ１α）の１単位の増加は、疾患進行のリスクを３％増加させた（ＲＲ＝１．０３［１．００−１．０５］、ｐ＝０．０４１）。発明者らは、患者を２群に分け（７４．４％がＨＰ１αレベル≦１０及び２５．６％がＨＰ１αレベル＞１０）、疾患進行と有意に関連がある（ｐ＝０．０１１３；相対リスク＝２．４７［１．２０−５．０９］）カットオフ値が１０であることを決定した。１０年目においては、ＨＰ１αレベルが低い患者の７５％［６４−８７］対ＨＰ１αレベルが高い患者の５７％［３９−８３］が疾患の進行を示さなかった。さらに、このカットオフ値は全生存（ｐ＝０．０１３４；相対リスク＝３．７６［１．０３−１３．７］）及び遠隔再発の発症（ｐ＝０．０１１；相対リスク＝３．７４［１．２６−１１．２］）とも有意に関連する（図１２Ｂ）。
【０１０６】
既知の予後因子（すなわち患者の年齢、分裂指数、腫瘍悪性度、腫瘍サイズ、ホルモン受容体の状態及びＫｉ６７レベル）で調整される多変量解析では、ＨＰ１αの発現のみが全生存における独立した予後因子である（ｐ＝０．０４３１）：高い（＞１０）ＨＰ１αレベルが死亡リスクの上昇と関連する（相対リスク＝３．７６［１．０３−１３．７］）。同様に、同じパラメーターで調整すると、高いＨＰ１αの発現（ｐ＝０．００７７；相対リスク＝３．０２［１．３８−６．６３］）及び高い腫瘍悪性度（ｐ＝０．０１７０；グレードＩＩＩについての相対リスク＝４．５３［１．５１−１３．６］）のみが疾患進行を悪化させる。
【０１０７】
結論として、免疫組織化学による本結果は、ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αが複数の型のヒト癌細胞において過剰発現することを示すものである。さらに、ＨＰ１αについて行った定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、臨床病理学的データ及び疾患転帰との有意な相関関係を示した。本区分の８６の小さい乳房腫瘍においては、ＨＰ１αの高い発現は、分裂指数、腫瘍悪性度、腫瘍サイズ、ホルモン受容体の状態又はＫｉ６７のような古典的な予後マーカーを用いた調整の後においても、依然として全生存における独立した予後因子である。まとめると、これらのデータは、ＨＰ１αが、乳癌及びその他の型の癌の予後のための、臨床的関連における細胞増殖及び腫瘍形成の新しいクロマチン関連マーカーを構成することを示す。
【０１０８】
考察
ＨＰ１αイソ型の特異な制御
ＨＰ１ファミリーのタンパク質は、２０年以上前に同定されたが（James & Elgin, 1986）、３つのイソ型に共通の又は異なる機能の大部分は明らかになっていない。本結果は、ヒトの細胞においては、ＨＰ１αイソ型が、ＨＰ１β及びγとは共通しない、特異な特性を有することを示す。タンパク質は増殖依存的に発現し、一過性の細胞周期からの離脱の間、ダウンレギュレートされる。これらの発見と一致して、培養癌細胞は、非腫瘍細胞と比較してＨＰ１αを過剰発現する。重要なことは、このことが患者試料において確認されたことである。従って、これらのデータは、ＨＰ１β又はγとは異なる、ＨＰ１αの特異な制御を示すものである。
【０１０９】
癌におけるＨＰ１αの重要性
ＨＰ１α発現の臨床上における重要性を評価するために、ヒト癌におけるＨＰ１αタンパク質及びｍＲＮＡレベルを免疫組織化学及び定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。凍結保存したヒト組織試料の染色は、腫瘍細胞においてＨＰ１β又γではなく、ＨＰ１αの有意な過剰発現を示した。従って、ＨＰ１αは、複数の型の癌を診断するためのマーカーを構成する。Ｋｉ６７のようなその他の増殖マーカーとは対照的に、ＨＰ１αは全ての腫瘍細胞を染色するため、腫瘍の正確な位置及び度合いに決定するのに非常に適している。
【０１１０】
ＨＰ１αの発現を定量し、そして予後値を決定するために、１０年より長く経過を管理をした８６の小さい乳房腫瘍におけるＨＰ１αのｍＲＮＡレベルを測定した。本データは、ＨＰ１αの高い発現が、経過期間における生存の低下及び転移発生の増加と相関することを明らかにした。さらに、多変量解析は、標準的な予後マーカーよりも、ＨＰ１αのレベルが疾患転帰をより正確に予測することを示した。従って、ＨＰ１αは、乳癌及びその他の型の癌における予後値のマーカーを構成する。
【０１１１】
実施例２
材料及び方法
ＤＮＡ及びＲＮＡマイクロアレイ解析
Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＣｕｒｉｅのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｃｅｎｔｅｒから選択された、１５８のよく注釈付けられた凍結腫瘍試料及び１９の健康な乳房組織から、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）及びＲＮＡ ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。各ＲＮＡ試料の質をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーを用いて決定した。ＲＮＡの量は、分光光度計を用いて２６０nmで測定した。ＲＮＡをＵ１３３ ｐｌｕｓ ２．０ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ上にハイブリダイズさせた。トランスクリプトームのデータをＧＣ−ＲＭＡ（Ｉｒｉｚａｒｒｙ、Hobbs et al.2003）を用いて正規化した。生データ及び正規化したトランスクリプトームのデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（アクセッション番号：［ＧＳＥ１３７８７］）で公開されている。
【０１１２】
逆相タンパク質アレイ解析
タンパク質アレイ用に、トランスクリプトーム解析に用いた試料の内の１６８の凍結ヒト腫瘍を、５０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、５％ グリセロール、２mM ＤＴＴ、２．５mM ＥＤＴＡ、２．５mM ＥＧＴＡ、２mM オルトバナジウム酸ナトリウム、１０mM フッ化ナトリウム、並びにプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｆｒａｎｃｅ）及びフォスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｐｅｒｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）インヒビターのカクテルを含む緩衝液中で溶解した。Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、５mmのステンレス製ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）と共に３０Hzで２分間ホモジナイズした。溶解物を１００℃で１０分間煮沸し、そして−８０℃で保存した。タンパク質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｐｅｒｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）により決定した。全ての溶解物について、５種類の２倍連続希釈液を、ニトロセルロースでコーティングしたスライドグラス（ＦＡＳＴ ｓｌｉｄｅｓ、Ｗｈａｔｍａｎ）上に、ＳＭＰ３ＸＢピン（チップの直径＝７５μm、１スポット当たりの容積＝１．２nl；Ｔｅｌｅｃｈｅｍ、Ｐｒｏｔｅｉｇｅｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を備えたＭｉｃｒｏ Ｇｒｉｄ Ｃｏｍｐａｃｔアレイヤー（Ｂｉｏ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）装置を用いて３連でスポットした。次に、スライドをアビジン、ビオチン、及びペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｄａｋｏ、Ｆｒａｎｃｅ）と共にインキュベートし、その後０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び５％ ＢＳＡ（ＴＢＳＴ−ＢＳＡ）を含むＴＢＳで飽和させ、そしてＴＢＳＴ−ＢＳＡで希釈した一次抗体（ウサギポリクローナル抗ＨＰ１α、Ｈ２１６４、Ｓｉｇｍａ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ中で洗った後、アレイをＴＢＳＴ−ＢＳＡで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、室温で１時間プローブ化した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて室温で１０分間反応させて、シグナルを増幅させた。次にスライドを１０％ ＤＭＳＯを含むＴＢＳＴで２分間すすぎ、ＴＢＳＴ−ＢＳＡで希釈したＣｙ５−ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて室温で１時間プローブ化した。蛍光シグナルをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂマイクロアレイスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてスキャンした。スポットの検出及びシグナルの定量はＭｉｃｒｏ Ｖｉｇｅｎｅソフトウェア（Ｖｉｇｅｎｅ ＴｅｃｈＩｎｃ、ＭＡ）を用いて決定した。シグナル強度を、ネガティブコントロール（一次抗体なし）及び全タンパク質染色の両方に対して正規化した。このために、１枚のスライドを７％酢酸と１０％メタノールの溶液で１５分間固定し、その後Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙタンパク質染色溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｓ１１７９１）で染色した。
【０１１３】
統計分析
統計分析には、Ｒソフトウェアｖ２．４．０を用いた。分布を正規化するために、データをＬｏｇ（２）により変換した。差次的発現をＴ検定により評価した。５％未満のｐ値を有意だと見なした。
【０１１４】
結果
この１０年で、マイクロアレイでのｍＲＮＡ発現プロファイルに基づき、複数の研究が、乳癌が４つの主要な群、（ｉ）ルミナール乳癌、主にＥＲ陽性であり、さらにルミナールＡ（グレードが低い）及びルミナールＢ（グレードが高い）に分類される；（ｉｉ）基底細胞様乳癌、主にＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２陰性；及び（ｉｉｉ）ＨＥＲ２過剰発現癌（Sotiriou and Piccart 2007）、に分類できることを示した。ＨＰ１αの発現をこれらの異なる分類の乳房腫瘍において解析した。
【０１１５】
１５８のよく注釈付けられた乳癌試料、及び１９の健康な乳房細胞試料からのトランスクリプトームデータを解析した。試料の分子的な特徴を図１３Ａに要約した。得られた発現プロファイルは、全ての高いグレードの腫瘍サブタイプ（ルミナールＢ、ＨＥＲ２＋及び基底細胞様）が、健康な組織と比較して、有意なＨＰ１α ｍＲＮＡの過剰発現を示すことを示すものである（図１３Ｂ）。興味深いことに、ＨＰ１αの過剰発現は、基底細胞様乳癌において特に重要である（図１３Ｂ）。ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の過剰発現が陰性なこれらの乳房腫瘍は、効果的な治療に対して臨床的に悪性の癌であり、現在のところ予後マーカーがない（Rakha and Ellis 2009にまとめられている）。
【０１１６】
ＨＰ１αが、高いグレードの腫瘍サブタイプ（ルミナールＢ、ＨＥＲ２＋及び基底細胞様）における標的となるであろうことを確認するために、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）技術を用い、タンパク質レベルでその発現レベルを解析した。このマイクロドットブロット技術は、ニトロセルロースで覆ったスライドグラス上に、非常に少量（１ng）のタンパク質溶解物を乗せる工程を含む。その後、目的のタンパク質を特異的抗体を用いて明らかにした。この方法においては、全１６８の乳房腫瘍試料からのタンパク質溶解物を、それらのＨＰ１αのタンパク質レベルについて同時に解析した。異なる腫瘍型から得られたプロファイルは、トランスクリプトームプロファイルと近似し（図１３Ｃ）、グレードの高いルミナールＢ腫瘍及び基底細胞様乳癌における発現レベルが特に高かった。
【０１１７】
従って、これらの結果から、ＨＰ１αが予後及び診断マーカーとして使用可能であることを確認した。ＨＰ１αの発現レベルが特に、最も悪性の臨床的挙動を有する乳癌サブタイプである、基底細胞様、ルミナールＢ、及びＨＥＲ２過剰発現乳癌においてその発現が高いことから、乳癌における予後マーカーに適している。
【０１１８】
さらに、これらの結果から、ＨＰ１α発現レベルを、ｍＲＮＡレベルにおいてだけでなく、タンパク質レベルにおいても定量的な方法で評価することができることを確認した。
【０１１９】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野、具体的には腫瘍学に関する。ヒトの癌における新しい予後及び／又は診断マーカーを提供する。
【０００２】
発明の背景
癌は、細胞分裂が制御できない状態になった場合、及び、ＤＮＡ修復経路の損傷、正常な遺伝子の腫瘍遺伝子への形質転換、又は腫瘍抑制遺伝子の機能不全の結果により生じる。多数の異なる形態の癌が存在する。これらの癌の頻度は多様であるが、癌は大部分の先進国において、心疾患に次ぐ、死亡原因の二番目に高い原因となっている。異なる形態の癌は異なる特性を有するが、多くの癌に共通する１つの因子は転移する能力である。全ての悪性腫瘍の遠隔転移は、この疾患を有する患者の死亡の主因である。
【０００３】
癌を有する患者への治療的処置は第一に、手術、放射線治療及び化学療法に基づき、施術者がその患者に最も適応した治療法を選択しなくてはならない。大部分の症例では、治療プロトコールの選択は病理解剖学及び臨床データに基づいている。現在、予後の決定及び患者へのアジュバント療法の選択方法は主に、病理学及び臨床病期による。しかしながら、どの限局性腫瘍が遠隔転移を生ずるかを予測することは非常に難しい。
【０００４】
そのため、転移の高い可能性、初期疾患進行、疾患再発の増加又は患者の生存率の低下を含む予後不良と関連がある腫瘍を、他の腫瘍から正確に区別することができる予後マーカーの同定が強く必要とされている。そのようなマーカーを用いることで、施術者は患者の予後を予測することができ、そしてアジュバント療法が最も効きそうな個体を効果的に標的とすることができる。
【０００５】
発明の概要
発明者らは、非腫瘍細胞と比較して、癌細胞ではＨＰ１αが過剰発現していること、及び、この癌細胞におけるＨＰ１αの高い発現レベルが、初期疾患進行、転移形成の増加、疾患再発の増加及び／又は患者の生存率の低下を含む予後不良と相関していることを示した。
【０００６】
従って、第一の態様において、本発明は、癌に罹患した対象の臨床転帰を予測する又はモニタリングする方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは予後不良の指標となる）を決定する工程を含む。好ましくは、予後不良は、患者の生存率の低下及び／又は初期疾患進行及び／又は疾患再発の増加及び／又は転移形成の増加である。
【０００７】
第二の態様において、本発明は、対象における癌の診断方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは前記対象が癌に罹患していることを示す）を決定する工程を含む。
【０００８】
第三の態様において、本発明は、アジュバント化学療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象の選択方法、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかの決定方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルはアジュバント化学療法及び／又は放射線治療が必要であることを示す）を決定する工程を含む。
【０００９】
最後の態様において、本発明は、癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングする方法に関し、ここでこの方法は、治療の投与前の前記対象からの癌試料及び治療の投与後の前記対象からの癌試料における、ＨＰ１αの発現レベル（治療の投与後に得た試料におけるＨＰ１αの発現レベルの低下は、対象が治療に反応することの指標となる）を決定する工程を含む。
【００１０】
一実施形態において、ＨＰ１αの発現レベルは、ＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。
【００１１】
さらなる実施形態において、ＨＰ１αタンパク質の量は、免疫組織化学、半定量的ウエスタンブロット、又はタンパク質若しくは抗体アレイにより測定される。
【００１２】
別のさらなる実施形態において、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量は、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、又はリアルタイム定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、又はトランスクリプトーム解析により測定される。
【００１３】
別の実施形態において、本発明の方法は、ＨＰ１αの発現レベルを基準発現レベルと比較する工程を含む。加えて、本発明の方法は、ＨＰ１αの発現レベルが前記基準発現レベルよりも高いかどうかを決定する工程をさらに含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、基準発現レベルは正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベルである。
【００１５】
あるいは、基準発現レベルは、ＲＰＬＰＯ遺伝子のような、様々な癌試料において安定した発現を有する遺伝子の発現レベルである。
【００１６】
その上さらに別の実施形態において、本発明による方法は、腫瘍悪性度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現のような少なくとも１つの別の癌又は予後マーカーを評価することをさらに含む。
【００１７】
その上さらに別の実施形態において、癌は固形癌又は造血癌であり、好ましくは固形癌であり、そしてより好ましくは局所的又は全身性の浸潤のない、早期固形癌である。
【００１８】
好ましくは、癌は、乳癌、膵臓癌、子宮及び子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌並びに白血病からなる群より選択される。より好ましくは、癌は乳癌である。さらにより好ましくは、癌は、局所的又は全身性の浸潤のない早期乳癌である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αの発現は静止期にはダウンレギュレートされる。非同調的増殖期（Ａｓ．）及び静止期（Ｇ０）のＷＩ３８肺線維芽細胞、ＭＣＦ７乳癌細胞及びＢＪ初期包皮線維芽細胞におけるＨＰ１α、β及びγの全タンパク質レベルをウエスタンブロットにより検出した。線維芽細胞を血清飢餓により、及びＭＣＦ７細胞を抗エストロゲン処理により、静止期において停止させた。濃縮した（ｘ）全細胞抽出物をローディングし、ローディングコントロールとしてはβ−アクチンを用いた。細胞増殖のマーカーとしては、ＣＡＦ−１ ｐ６０（Polo et al, 2004）及びサイクリンＡを用いた。
【図１Ｂ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αの発現は静止期にはダウンレギュレートされる。Ａに示した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析
【図１Ｃ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αの発現は静止期にはダウンレギュレートされる。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、増殖期（Ａｓ．）及び静止期（Ｇ０）のＢＪ包皮繊維芽細胞におけるＨＰ１αのｍＲＮＡレベル。レベルは基準遺伝子であるリボソームタンパク質Ｐ０様タンパク質（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化し、増殖期細胞のレベルを１００％と設定した。ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のレベルを比較のために示す。エラーバーは３回の独立した実験からのデータを示す。
【図２Ａ】静止期を解除すると、ＨＰ１αレベルは徐々に増加した。血清飢餓によりＢＪ初代線維芽細胞を静止期（Ｇ０）において停止させ、そして示した時間血清を再添加することにより解除した。全タンパク質レベルをウエスタンブロットにより解析した。ＣＡＦ−１ ｐ６０（Polo et al, 2004）及びサイクリンＡを細胞増殖のマーカーとして用いた。β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図２Ｂ】静止期を解除すると、ＨＰ１αレベルは徐々に増加した。図２Ａに示した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析。
【図３Ａ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。ＨｅＬａ子宮頸癌細胞は、二重チミジン遮断の解除（Ｇ１、Ｇｌ／Ｓ、Ｓ、Ｇ２）及びノコダゾール（Ｍ）により、細胞周期において同調する。ウエスタンブロットを用い、ＨＰ１αの発現レベルについて全タンパク質抽出物を解析した。β−アクチンをローディングコントロールとして用い、サイクリンＡをＧ２／Ｓ期のマーカーとして用いた。ＣＡＦ−１ ｐ６０を比較のために示す。
【図３Ｂ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。図３Ａに示した同調した細胞のフローサイトメトリー細胞周期解析。
【図３Ｃ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。ＢＪ包皮初代線維芽細胞は、二重チミジン遮断の解除（Ｇ１、Ｇｌ／Ｓ、Ｓ、Ｇ２）及びノコダゾール（Ｍ）により、細胞周期において同調する。ウエスタンブロットを用い、全細胞抽出物におけるＨＰ１αタンパク質レベル解析した。β−アクチンをローディングコントロールとして用い、サイクリンＡをＧ２／Ｓ期のマーカーとして用いた。ＣＡＦ−１ ｐ６０を比較のために示す。
【図３Ｄ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。図３Ｃで示した同調した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析。
【図３Ｅ】ＨＰ１αの発現は、細胞周期の間には目に見えるほど変動しない。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、同調したＢＪ細胞におけるＨＰ１αのｍＲＮＡレベル。レベルは基準遺伝子であるリボソームタンパク質ＰＯ様タンパク質（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化し、非同調的増殖期細胞のレベルを１００％と設定した。ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のレベルを比較のために示す（Polo et al, 2004)。エラーバーは、２回の独立した実験からのデータを示す。
【図４Ａ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。図４Ｂにおいて使用した、全、可溶性、及び、クロマチン結合細胞抽出物を得るために用いた実験手順の模式図。
【図４Ｂ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。同じ患者由来の乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び非腫瘍乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）（Hackett et al, 1977）の、可溶性及びクロマチン結合核抽出物中におけるＨＰ１α、β及びγのタンパク質レベルをウエスタンブロットにより解析した。サイクリンＡ及びＣＡＦ−１ ｐ６０を比較のために示す。濃縮した（ｘ）全細胞抽出物をローディングし、β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図４Ｃ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。ＣＡＦ−１ ｐ６０（Polo et al, 2004）の量と比較した場合の、腫瘍乳房細胞（Ｔ）及び非腫瘍乳房細胞（Ｂｓｔ）における全ＨＰ１αタンパク質レベルの相対量。濃縮した（ｘ）全細胞抽出物をローディングし、β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図４Ｄ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。倍数性を評価するための、腫瘍乳房細胞（Ｔ）及び非腫瘍乳房細胞（Ｂｓｔ）のフローサイトメトリー解析。腫瘍（Ｔ）及び非腫瘍（Ｂｓｔ）細胞はそれぞれ、２５％及び１３％のＳ期にある細胞を含む。
【図４Ｅ】ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現し、クロマチンと関連する。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、腫瘍（Ｔ）及び非腫瘍（Ｂｓｔ）乳房細胞におけるＨＰ１αの相対的なｍＲＮＡレベル。レベルは基準遺伝子であるリボソームタンパク質ＰＯ様タンパク質（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化し、非腫瘍細胞を１００％と設定した。ＣＡＦ−１ ｐ１５０を比較のために示す。エラーバーは２回の独立した実験からのデータを示す。
【図５Ａ】可溶性及びクロマチン結合核画分のＨＰ１タンパク質のレベル。同じ患者由来の乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び健康な乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）（Hackett et al, 1977）の、可溶性及びクロマチン結合核画分を得るための抽出手順を図示する模式図。
【図５Ｂ】可溶性及びクロマチン結合核画分のＨＰ１タンパク質のレベル。癌細胞Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び健康な細胞Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）からの可溶性及びクロマチン結合核抽出物におけるＨＰ１α、β及びγのタンパク質レベルをウエスタンブロットにより解析した。ローディングは、同一の量の細胞を用いたものとして修正した（それぞれの抽出物につき、２×１０５及び４×１０５個の細胞）。複数の古典的なローディングコントロールを示した。α−チューブリン画分及びβ−アクチンの存在が腫瘍細胞と健康な細胞との間で僅かに異なっているが、これらの実験条件下では、ＧＡＰＤＨが最も同一のローディングを反映する。サイクリンＡ及びＣＡＦ−１ ｐ６０を比較のために示した。
【図６Ａ】健康な乳房細胞と比較して乳癌細胞においては、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ではなく、ＨＰ１αの核分布が変化する。乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び非腫瘍乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）におけるＨＰ１αの免疫蛍光染色。ＣＲＥＳＴ患者の血清を用いたセントロメアの対比染色は、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞における、不完全ではあるが部分的なＨＰ１αのスポットとの共局在を明らかにした。ＤＮＡはＤＡＰＩを用いて染色した。顕微鏡像の下に示した数値は、乳癌細胞株Ｈｓ５７８Ｔ（Ｔ）及び健康な乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（Ｂｓｔ）において、明確に区別できるＨＰ１αのスポットを示した細胞のパーセンテージの平均を示す。２回の独立した実験に基づく標準誤差を示す。
【図６Ｂ】健康な乳房細胞と比較して乳癌細胞においては、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ではなく、ＨＰ１αの核分布が変化する。腫瘍（Ｔ）及び非腫瘍（Ｂｓｔ）乳房細胞における、ＨＰ１αと比較した場合のＨ３Ｋ９ｍｅ３ヒストン修飾の核分布。ＤＮＡはＤＡＰＩを用いて示した。
【図６Ｃ】健康な乳房細胞と比較して乳癌細胞においては、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ではなく、ＨＰ１αの核分布が変化する。Ｃｄｔｌ（Ｇ１期の指標）、サイクリンＡ（Ｓ及びＧ２期の指標）、又はＳ１０がリン酸化されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０Ｐ、Ｇ２及びＭ期の指標）を用いたＨＰ１αの対比染色は、細胞周期の状態とスポットされたＨＰ１αのパターンとの間の相関を示さなかった。スケールバー：１０μm。
【図７Ａ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＨＰ１α（ｓｉＨＰ１α．３と命名）、ＨＰ１β、ＨＰ１γ又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした７２時間後の、ＨｅＬａ細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット解析。濃縮した（ｘ）全細胞抽出物をローディングし、β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。
【図７Ｂ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。Ａに示した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析。
【図７Ｃ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＨＰ１α、ＨＰ１β、ＨＰ１γ又は模擬ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした後の、典型的な有糸分裂の図。
【図７Ｄ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＨＰ１α、ＨＰ１β、ＨＰ１γ又は模擬ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした７２時間後の、非同調的なＨｅＬａ細胞における異常な有糸分裂（遅滞染色体、不均衡、染色体橋）の図のパーセンテージ。エラーバーは３回の独立した、盲検的に計測した実験からのデータを示す。
【図７Ｅ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＤＡＰＩ染色は、ＨＰ１αを標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした７２時間後の小核の形成を表す。
【図７Ｆ】ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは、ＨｅＬａ細胞における有糸分裂欠損を誘導する。ＨＰ１α、ＨＰ１β、ＨＰ１γ又は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡ配列を用いてトランスフェクションした７２時間後の、小核が形成された細胞のパーセンテージの定量。エラーバーは３回の独立した実験からのデータを示し、このうち２回は盲検的に計測した。
【図８Ａ】初代細胞におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは（前）中期に影響を及ぼす。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）又はＨＰ１α（α．１又はα．３）を標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ配列を用い、ヌクレオフェクションにより、ＢＪ初代線維芽細胞をトランスフェクションした。全タンパク質レベルをウエスタンブロットにより解析した。ＨＰ１β及びＨＰ１γは、ｓｉＲＮＡがＨＰ１αイソ型への特異性を示すことを明らかにした。
【図８Ｂ】初代細胞におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは（前）中期に影響を及ぼす。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）又はＨＰ１αを標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＨＰ１α．１／３）を用いてトランスフェクションした７２時間後の、図８Ａに示した細胞の細胞周期分布のフローサイトメトリー解析。
【図８Ｃ】初代細胞におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは（前）中期に影響を及ぼす。有糸分裂細胞のプロファイルを、トランスフェクションした７２時間後に免疫蛍光法により解析した。１２時間のチミジン遮断を６時間解除することにより、有糸分裂細胞を増やした。典型的な有糸分裂プロファイル（上段）及び有糸分裂細胞の総数における各有糸分裂期の割合をパーセンテージとして図示した（グラフ）。エラーバーは３回の独立した実験（各回につきｎ＞１００）に基づく標準誤差を示し、このうち２回は盲検的に計測した。
【図８Ｄ】初代細胞におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは（前）中期に影響を及ぼす。対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）又はＨＰ１α ｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＰ１α．３）を用いた２回の連続したトランスフェクションの後の有糸分裂時間のライブセルイメージングによる決定。ＤＮＡをＨ２Ｂ−Ｃｈｅｒｒｙ（赤色）の発現により可視化した。２回目のトランスフェクションの４８時間後から２４時間、２０分毎に画像を取得した。有糸分裂の時間は（上のグラフ）、ＤＮＡの凝縮から２つの別個の細胞の確立までの時間と定義した。実験開始前に染色体の分離が見られた場合には、（前）中期にある有糸分裂細胞を図示している画像の平均数もまた決定した（下のグラフ）。ｓｉＧＦＰ及びｓｉＨＰ１αそれぞれで、有糸分裂細胞の総数が１３０、及び８７であることを示している、３回の独立した実験の平均を図示した。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｗｉｌｃｏｘｏｎの検定を用いてＰ値を決定した。ｓｉＧＦＰ及びｓｉＨＰ１αそれぞれの平均Ｈ２Ｂ−ｃｈｅｒｒｙトランスフェクション効率は３７％及び３９％であった。
【図９Ａ】ＨＰ１αのｍＲＮＡは複数の型の癌において過剰発現し、臨床的及び分子データと関連する。正常な組織と比較した場合の、異なる型の癌におけるＨＰ１αのマイクロアレイ発現プロファイルの箱形図。箱は２５番目〜７５番目のパーセンタイル、括弧は範囲、黒線は中間値、黒点はアウトライアー、ｎはサンプル数を示す。ｐ値はスチューデントのＴ検定に基づく。結果をＯＮＣＯＭＩＮＥを用いて解析してプロットし（Rhodes et al, 2004）、異なる腫瘍型におけるトランスクリプトーム研究からのデータを活用した（Andersson e tal, 2007;Pyeon et al, 2007;Quade et al, 2004;Ramaswamy et al, 2003;Richardson et al, 2006;Yu et al, 2004）。
【図９Ｂ】ＨＰ１αのｍＲＮＡは複数の型の癌において過剰発現し、臨床的及び分子データと関連する。左側のパネル：小児急性リンパ性白血病におけるＨＰ１αの発現レベルと再発までの期間との相関（Kirschner-Schwabe et al, 2006）。非常に早い期間での再発（最初の診断から１８ヶ月以内）、早い（最初の診断から１８ヶ月より後であるが、直近の治療の休止より６ヶ月未満）又は遅い（直近の治療を休止して６ヶ月より後）。箱形図の表現は図９Ａと同様である。右側のパネル：小児急性リンパ性白血病におけるＨＰ１αの発現レベルとＣＡＦ−１ ｐ１５０及び増殖マーカーＫｉ６７発現レベルとの正の相関を示す散布図（Kirschner-Schwabe et al, 2006)。灰色線：最良のあてはめ線、Ｒ：ピアソン相関係数。結果をＯＮＣＯＭＩＮＥを用いて解析し、プロットした（Rhodes et al, 2004)。
【図１０Ａ】ＨＰ１αタンパク質は複数型のヒトの癌において過剰発現する。腫瘍及び正常な組織由来の切片を含む、凍結したヒト組織のアレイにおけるＨＰ１αを免疫組織化学により染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【図１０Ｂ】ＨＰ１αタンパク質は複数型のヒトの癌において過剰発現する。凍結した子宮組織切片におけるＨＰ１α、β及びγを免疫組織化学により染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。３種類の抗体について、組織アレイを同様に処理した。
【図１０Ｃ】ＨＰ１αタンパク質は複数型のヒトの癌において過剰発現する。凍結した髄様乳癌からの２枚の隣接した切片のＨＰ１α及び上皮パン−サイトケラチンのマーカーであるＫＬ−１を、免疫蛍光法（ＩＦ）により染色した。ＤＮＡはＤＡＰＩを用いて示した。ＨＰ１αが過剰発現している部分は、上皮腫瘍細胞の領域と関連している。スケールバー：１００μm。
【図１１Ａ】ポリクローナル抗体を用いて検出したヒト腫瘍試料におけるＨＰ１αの過剰発現は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色の変化とは一致しなかった。ポリクローナルＨＰ１α抗体を用いた、腫瘍及び正常な組織からの凍結ヒト組織切片を含む組織アレイの免疫組織化学的染色。組織をヘマトキシリンを用いて対比染色した。
【図１１Ｂ】ポリクローナル抗体を用いて検出したヒト腫瘍試料におけるＨＰ１αの過剰発現は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色の変化とは一致しなかった。凍結したヒト組織アレイ（図１１Ａのものと同じバッチ）におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３を免疫組織化学染色し、そしてヘマトキシリンを用いて対比染色した。スケールバー：５０μm。
【図１２Ａ】ＨＰ１αの発現レベルは乳癌患者における予後値を有する。１０年を越えて追跡調査した患者の８６の乳癌試料における、示した臨床病理学的な因子による対数的なＨＰ１αのｍＲＮＡ発現レベルを示す箱形図。箱は２５番目〜７５番目のパーセンタイル、括弧は範囲、黒線は中間値、黒点はアウトライアーを示す。
【図１２Ｂ】ＨＰ１αの発現レベルは乳癌患者における予後値を有する。高い（＞１０）又は低い（＜１０）レベルのＨＰ１αを発現する患者における、生存率、転移の発生率、及び疾患のない間隔（限局的な再発の発生、所属リンパ節再発、対側性乳癌又は転移の前の間隔）の単変量Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。各時点でリスクを有する患者の数をグラフの下に示した。
【図１３Ａ】乳癌のサブタイプにおける発現レベル。試験した乳癌試料の分子的な特徴。ＥＲ：エストロゲン受容体、ＰＲ：プロゲステロン受容体。
【図１３Ｂ】乳癌のサブタイプにおける発現レベル。マイクロアレイでのトランスクリプトームデータにおけるｍＲＮＡレベルとして決定した（図１３Ｂ）、又は逆相タンパク質アレイを用いてタンパク質レベルとして決定した（図１３Ｃ）ＨＰ１αの発現レベルを示す箱形図。箱は２５〜７５番目のパーセンタイル、括弧は範囲、黒線は中間値、黒点はアウトライアーを示す。１群当たりの試料数をグラフの下に示した（ｎ）。アスタリスクは群の間での有意差を示す（Ｔ−検定）。
【図１３Ｃ】乳癌のサブタイプにおける発現レベル。マイクロアレイでのトランスクリプトームデータにおけるｍＲＮＡレベルとして決定した（図１３Ｂ）、又は逆相タンパク質アレイを用いてタンパク質レベルとして決定した（図１３Ｃ）ＨＰ１αの発現レベルを示す箱形図。箱は２５〜７５番目のパーセンタイル、括弧は範囲、黒線は中間値、黒点はアウトライアーを示す。１群当たりの試料数をグラフの下に示した（ｎ）。アスタリスクは群の間での有意差を示す（Ｔ−検定）。
【００２０】
本発明の詳細な説明
哺乳類の細胞は３種類の密接に関係したヘテロクロマチンタンパク質１のイソ型である、ＨＰ１α、β及びγを含み、これらは酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）におけるそれらの唯一の対応物との類似性により、遺伝子サイレンシング、ゲノム安定性及び染色体の分離に関与してきた。
【００２１】
ＨＰ１タンパク質と腫瘍形成との間の第一に可能性のある関連は、ＨＰ１が腫瘍抑制網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）と相互作用するという観察（Nielsen et al, 2001b; Williams&Grafi, 2000）及び、ＨＰ１がサイクリンＥのような細胞周期遺伝子のＲｂ依存性サイレンシングに関与するという観察（Nielsen et al, 2001b）から提唱された。同様に、ＨＰ１は、Ｅ２Ｆ１（Wang et al, 2007）及びｐ５３（Wang et al, 2005）タンパク質の制御に関与する、転写のコリプレッサーであるＫＡＰ−１と相互作用する（Ryan et al, 1999）。さらに、ＨＰ１α及びγはクロマチン会合因子１（ＣＡＦ−１）との複合体中に見いだされ（Murzina et al, 1999; Quivy et al, 2004）、この内の中間体サブユニットｐ６０は乳癌における有効な増殖マーカーである（Polo et al, 2004)。しかしながら、細胞増殖、静止期及び癌に関連する、３つのＨＰ１イソ型に特異的な及び／又は共通の制御パターンは明かになっていない。
【００２２】
発明者らは、ＨＰ１αが増殖依存的な発現パターンを表すという特異な特性を示すこと、及び、同じ患者由来の癌細胞において、非腫瘍細胞と比較した場合に、ＨＰ１β又はγではなくＨＰ１αの有意な過剰発現が認められたことを示した。このＨＰ１αの過剰発現は、膵臓、子宮、卵巣、前立腺及び乳癌において認められた。これらの結果は、ＨＰ１αが複数の型の癌の診断のためのマーカーを構成することを示す。本明細書において発明者らは、癌におけるＨＰ１αの発現レベルが臨床データ及び疾患の転帰と関連することもまた示す。それらは、癌におけるＨＰ１αの高い発現レベルが、時間経過に伴う患者の生存率の低下、初期疾患進行、疾患再発の増加及び／又は転移の発生の増加、すなわち予後不良と関連することを示す。
【００２３】
定義
本明細書で使用する場合、「ＨＰ１α」という語は、高度に保存された非ヒストンタンパク質である、ヘテロクロマチンタンパク質１−アルファを指す。Ｇｅｎｂａｎｋには、ＮＰ＿００１１２０７９３、ＮＰ＿００１１２０７９４、ＮＰ＿０３６２４９の、ヒトＨＰ１αに対応する３つのアクセッション番号がある。このタンパク質は、遺伝子ＣＢＸ５（ＧｅｎｅＩＤ：２３４６８）によりコードされる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「癌」又は「腫瘍」という語は、制御されない増殖、不死性、転移可能性、早い増殖及び増殖率のような癌を誘発する細胞の典型的な特徴、及び特定の特徴的な形態学的特徴を有する細胞の存在を指す。この語は、任意の型の悪性度（初期又は転移）を指す。典型的な癌は、乳、胃、食道、肉腫、卵巣、子宮内膜、膀胱、子宮頸、直腸、結腸、肺又はＯＲＬ癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、多形膠芽細胞腫）、リンパ腫、白血病、骨髄腫、精上皮腫、ホジキン及び悪性血液疾患のような固形癌又は造血癌である。好ましくは、癌は、乳癌、膵臓癌、子宮及び子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌並びに白血病からなる群より選択される。好ましくは、癌は固形癌であり、より好ましくは、局所的又は全身性の浸潤のない早期固形癌である。好ましくは、固形癌は乳癌であり、より好ましくは局所的又は全身性の浸潤のない早期乳癌である。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」又は「治療している」という語は、疾患の治療、予防、防御及び遅延のような、患者の健康状態を回復することを意図する、任意の行為を指す。特定の実施形態においては、そのような語は、疾患又は疾患に関連がある症状の回復又は根絶を指す。その他の実施形態においては、この語は、そのような疾患を有する対象に１つ以上の治療薬を投与することにより、疾患の拡大又は悪化を最小限にすることを指す。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「化学療法治療」又は「化学療法」という語は、化学的な又は生化学的な物質、具体的には１つ又は複数の抗腫瘍薬を用いた癌の治療的処置を指す。
【００２７】
「放射線治療処置」又は「放射線治療」という語は、内部の及び外部の放射線治療又は放射免疫治療、及びＸ線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、放射性同位元素、及びその他の型の電離放射線を含む様々な型の放射線の使用を含む、複数の型の放射線治療を指す、当該分野において一般的に用いられる語である。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「アジュバント療法」という語は、一般に、転移及び／又は再発する恐れがあるリスクを有する癌に罹患した患者の初期腫瘍を外科的に切除した後に、追加の治療として与えられる化学療法又は放射線治療を指す。そのようなアジュバント治療の目的は、予後を改善することである。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「予後不良」という語は、患者の生存率の低下及び／又は初期疾患進行及び／又は疾患再発の増加及び／又は転移形成の増加を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「対象」又は「患者」という語は、動物、好ましくは哺乳類、さらにより好ましくは成人、子供及び出生前段階のヒトを含むヒトを指す。しかしながら、「対象」という語は、中でも治療を必要とする非ヒト動物、具体的にはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及び非ヒト霊長類のような哺乳類を指す。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「試料」という語は、対象由来の細胞を含む任意の試料、好ましくは核酸を含む試料を意味する。そのような試料の例としては、血液、血漿、唾液、尿及び精液試料のような液体、並びに生検、器官、組織又は細胞試料が挙げられる。試料をその使用の前に処理してもよい。「癌試料」という語は、患者由来の腫瘍細胞を含む任意の試料、好ましくは核酸を含む試料を指す。好ましくは、この試料は腫瘍細胞のみを含む。「正常な試料」という語は、いずれの腫瘍細胞も含まない任意の試料を指す。
【００３２】
以下に開示する本発明の方法は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロの方法であってよく、好ましくはインビトロの方法である。
【００３３】
これまでの研究では、ＨＰ１αの発現の増加は、複数の乳癌細胞株における浸潤の可能性の低下と関連していた（Kirschmann et al., 2000; Norwood et al., 2006)。驚くことに、本明細書において発明者らは、ＨＰ１αの高い発現レベルがそれどころか予後不良と関連があり、従って死亡リスクの増加と関連することを示した。
【００３４】
従って、本発明は、癌に罹患した対象の臨床転帰を予測又はモニタリングする方法に関し、ここでこの方法は、前記対象由来の癌試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは予後不良の指標となる）を決定する工程を含む。
【００３５】
ある実施形態において、この方法は、対象から癌試料を準備する工程をさらに含む。
【００３６】
ＨＰ１αの発現レベルは、癌試料から、様々な技術によって決定することができる。ある実施形態においては、ＨＰ１αの発現レベルは、ＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。
【００３７】
特定の実施形態においては、ＨＰ１αの発現レベルは、ＨＰ１αタンパク質の量を測定することにより決定される。ＨＰ１αタンパク質の量は、当業者に既知の任意の方法によって決定され得る。一般に、これらの方法は、試料と、試料中に存在するＨＰ１αタンパク質と選択的に相互作用することが可能な結合パートナーとを接触させることを含む。結合パートナーは通常、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。抗ＨＰ１αのポリクローナル及びモノクローナル抗体は市販されている。これら市販の抗体の例としては、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘのマウスモノクローナル抗ＨＰ１α ２ＨＰ−１Ｈ５（アミノ酸６７〜１１９に対する）、Ｓｉｇｍａのウサギポリクローナル抗ＨＰ１α Ｈ２１６４（アミノ酸１７７〜１９１に対する）及びＥｕｒｏｍｅｄｅｘのマウスモノクローナル抗ＨＰ１α ２ＨＰ−２Ｇ９が挙げられる。ＨＰ１αタンパク質を定量するために、異なる方法において用いられるその他の抗体は当業者において既知であり、市販されている。ＨＰ１αタンパク質の量を、半定量的ウエスタンブロット、酵素で標識した及び酵素介在性免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ、ビオチン／アビジン型アッセイ、放射性免疫アッセイ、免疫電気泳動若しくは免疫沈降など）又はタンパク質若しくは抗体アレイにより測定してもよい。タンパク質の発現レベルを、癌試料（例えば凍結又はホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した材料）の組織切片上での免疫組織化学により評価してもよい。反応は通常、蛍光、化学発光、放射性活性、酵素標識又は色素分子のような標識体を表す工程、又は、抗原と抗体若しくはそれと反応する抗体との複合体の形成を検出するその他の方法を含む。好ましくは、ＨＰ１αタンパク質の量は免疫組織化学又は半定量的ウェスタンブロットにより測定される。免疫組織化学によるＨＰ１αの検出は、慣習的に用いられるＫｉ−６７マーカーとは異なって、抗原の脱マスキング工程を必要としないため、染色工程の時間を短縮する。
【００３８】
別の実施形態において、ＨＰ１αの発現レベルは、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。ｍＲＮＡの量を決定する方法は当該分野において周知である。例えば、試料（例えば、患者から調製した細胞又は組織）に含まれる核酸を最初に標準的な方法、例えば溶解酵素若しくは化学溶液を用いて抽出するか、又は製造業者の説明に従って核酸結合樹脂により抽出する。次に、抽出したｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット解析）及び／又は増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により検出する。好ましくは定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲは特に有利である。推定されるゲノムの混入からｃＤＮＡの増幅を区別できるように、イントロンを含むようにプライマー対を設計することが好ましい。この方法において用いることができるプライマー対の例は実施例部分に示されおり、かつ、配列番号８及び配列番号９のプライマーから構成されている。当業者はその他のプライマーを容易に設計することができる。増幅のその他の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、ＳＤＡ法（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。好ましくは、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量は、定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、又はリアルタイム定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、又はトランスクリプトーム解析により測定される。
【００３９】
ある実施形態においては、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルと基準の発現レベルを比較する工程をさらに含む。
【００４０】
特定の実施形態においては、基準となる発現レベルは、正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベルである。正常な試料とは非腫瘍試料であり、好ましくは癌試料と同じ組織由来のものである。正常な試料を、癌に罹患した対象から得てもよく、又はその他の対象、好ましくは正常又は健康な対象、すなわち癌に罹患していない対象から得てもよい。好ましくは、正常な試料は癌試料と同じ対象から得られる。癌及び正常な試料から得られた発現レベルを、ＲＰＬＰＯ（酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ）、ＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ）又はβ−アクチンのような、安定した発現を有することが知られているタンパク質の発現レベルを用いて正規化してもよい。
【００４１】
別の実施形態においては、基準となる発現レベルは、異なる癌試料において安定して発現する遺伝子の発現レベルである。そのような遺伝子には、例えば、ＲＰＬＰＯ、ＴＢＰ、ＧＡＰＤＨ又はβ−アクチンが含まれる。好ましくは、基準発現レベルは、ＲＰＬＰＯ遺伝子の発現レベルである。基準としてのヒト酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）遺伝子の使用については、de Cremouxら（de Cremoux et al., 2004）の文献に記載されている。好ましい実施形態においては、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量は、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量に従って正規化される。ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量は、基準の量（すなわち１００％）として用いられる。ＨＰ１α ｍＲＮＡの量は、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量に関する相対量として表される。
【００４２】
さらなる実施形態においては、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルが基準発現レベルと比較して高いかどうかを決定する工程をさらに含む。
【００４３】
基準発現レベルが正常な試料のＨＰ１αの発現レベルであるとき、正規化した後で、癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルが正常な試料における発現レベルよりも少なくとも１．５倍高い場合に高いと考えられる。好ましくは、癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルが正常な試料における発現レベルよりも少なくとも２倍、又は、３、４、５又は６倍高い場合に、高いと考えられる。
【００４４】
基準発現レベルが異なる癌試料において安定した発現を有する遺伝子、具体的にはＲＰＬＰＯ遺伝子、の発現レベルであるとき、ＨＰ１α ｍＲＮＡのレベル又は量が、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡレベル又は量の少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％である場合に、ＨＰ１αの発現レベルが高いと考えられる。好ましい実施形態においては、ＨＰ１α ｍＲＮＡのレベル又は量が、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡレベル又は量の少なくとも１０％である場合に、ＨＰ１αの発現レベルが高いと考えられる。その他の基準遺伝子を用いることで、当業者により、このカットオフ値は容易に調整され得る。このカットオフ値は、具体的には乳癌に適用可能である。この値は、癌の型により多様になり得、そして当業者により容易に適用されるだろう。
【００４５】
ある実施形態においては、本方法は、腫瘍悪性度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現、好ましくはＣＡＦ−１増殖マーカーの発現のような、少なくとも１つの別の癌又は予後マーカーを評価することをさらに含む。これらのマーカーは一般的に使用されており、そしてこれらのマーカーにより得られる結果を、予後を確認するために本方法によって得られる結果と組み合わせても良い。これらのマーカーの使用は、当業者に周知である。例としては、腫瘍悪性度をＥｌｓｔｏｎ＆Ｅｌｌｉｓの方法（Elston & Ellis, 2002）により決定することができ、ホルモン受容体の状態（エストロゲン及びプロゲステロン）をタンパク質又はｍＲＮＡレベルで決定することができ、代表的な組織切片中の１０個の顕微鏡視野における有糸分裂細胞を計測することにより分裂指数を決定することができ、そして腫瘍サイズを画像技術（例えば乳房撮影）により、触診により、若しくは手術後の切除組織を用いて検出することができる。Ｋｉ６７及びＣＡＦ−１の発現を、タンパク質レベル又はｍＲＮＡレベルで評価することができる。高い悪性度、高い分裂指数、大きなサイズ及び／又は高いＫｉ６７若しくはＣＡＦ−１の発現は、悪い予後の指標となる。ＨＪＵＲＰ発現レベルを、Hu et al., 2010に記載されたように評価してもよい。高いＨＪＵＲＰ発現は臨床転帰の不良と関連がある。
【００４６】
多変量の統計解析を用い、以下の実施例部分において発明者らは、ＨＰ１αの発現レベルが、これらの標準的な予後マーカーよりもよく疾患転帰を予測することを示した。
【００４７】
これまでに、異なる癌細胞株におけるＨＰ１の発現レベルが比較されてきたが、腫瘍及び非腫瘍細胞におけるＨＰ１の発現レベルを比較する研究は行われていない。本明細書において、発明者らは初めて、同じ患者由来の非腫瘍細胞におけるＨＰ１αの発現と比較して、ＨＰ１αが腫瘍細胞において特異的に過剰発現していることを示す。そのような過剰発現は、従って、複数の型の癌、具体的には乳癌、の診断マーカーとなる。
【００４８】
従って、本発明は、対象における癌の診断方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは前記対象が癌に罹患していることを示す）を決定する工程を含む。
【００４９】
ある実施形態においては、この方法は、対象から試料を準備する工程をさらに含む。好ましくは、この試料は腫瘍細胞を含む考えられる。
【００５０】
この試料におけるＨＰ１αの発現レベルは上述したように、好ましくはＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより、決定される。
【００５１】
ある実施形態においては、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルを、基準発現レベル、好ましくは正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベル、と比較する工程をさらに含む。上述したように、正常な試料とは非腫瘍試料、好ましくは試験する試料と同じ組織由来の試料である。正常な試料を、診断する対象又はその他の対象、好ましくは健康な対象から得てもよい。正常な試料及び試験する試料から得た発現レベルを、本明細書上部で記載したような、安定した発現を有することが知られているタンパク質の発現レベルを用いて正規化してもよい。
【００５２】
さらなる実施形態において、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルが前記基準発現レベルよりも高いかどうかを決定する工程をさらに含む。試験する試料におけるＨＰ１αの発現レベルが、正常な試料における発現レベルよりも少なくとも１０、２５、５０又は７５％高い場合に、対象は癌に罹患していると診断される。好ましくは、試験する試料におけるＨＰ１αの発現レベルが、正常な試料よりも少なくとも２５％高い場合に対象が癌に罹患していると診断される。
【００５３】
別の実施形態において、本方法は、腫瘍悪性度、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現、好ましくはＣＡＦ−１増殖マーカーの発現、のような癌の診断に用いられる少なくとも１つの別のマーカーを評価することをさらに含む。これらのマーカーは診断の目的において一般的に使用されており、そしてこれらのマーカーにより得られる結果を、予後を確認するために本方法によって得られる結果と組み合わせても良い。
【００５４】
本発明はまた、対象における癌の診断に有用な情報の提供方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルは前記対象が癌に罹患していることの指標となる）を決定する工程を含む。ある実施形態において、この方法は、対象から癌試料を準備する工程をさらに含む。
【００５５】
さらなる態様において、本発明は、アジュバント化学療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択する方法、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定する方法に関し、ここでこの方法は、前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベル（ＨＰ１αの高い発現レベルはアジュバント化学療法及び／又は放射線治療が必要であることを示す）を決定する工程を含む。
【００５６】
ある実施形態において、この方法は、対象から癌試料を準備する工程をさらに含む。
【００５７】
上述したように、この癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルは、好ましくはＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより、決定される。
【００５８】
ある実施形態において、この方法は、臨床転帰の予測方法に関して、上述したようにＨＰ１αの発現レベルを基準発現レベルと比較する工程を含む。基準となる発現レベルは正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベル、又はＲＰＬＰＯ遺伝子のような様々な癌試料において安定した発現を有する遺伝子の発現レベルであってもよい。
【００５９】
さらなる実施形態において、この方法は、ＨＰ１αの発現レベルが前記基準発現レベルよりも高いかどうかを決定する工程をさらに含む。特定の実施形態においては、正規化した後で、癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルが正常な試料における発現レベルよりも少なくとも１．５、２、３、４、５又は６倍高い場合に、高いと考えられる。好ましくは癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルが正常な試料における発現レベルよりも少なくとも１．５倍高い場合に、高いと考えられる。別の特定の実施形態においては、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量が、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡ量の少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％である場合にＨＰ１αの発現レベルが高いと考えられる。好ましくは、ＨＰ１α ｍＲＮＡの量が、ＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量の少なくとも１０％である場合に、ＨＰ１αの発現レベルが高いと考えられる。
【００６０】
上記で説明したように、これらのカットオフ値は特に乳癌に適用され、また、癌の型によって多様になり得る。しかしながら、当業者はこのカットオフ値を容易に適用することができる。
【００６１】
ＨＰ１αの高い発現レベルは、患者の生存率の低下及び／又は初期疾患進行及び／又は疾患再発の増加及び／又は転移形成の増加を示す。従って、予後不良と関連があるこの型の癌は、患者の生存の機会を改善する目的において、アジュバント化学療法及び／又は放射線治療で治療する必要がある。アジュバント療法の型は施術者により選択される。
【００６２】
ある実施形態において、本方法は、腫瘍悪性度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現、好ましくはＣＡＦ−１増殖マーカーの発現、のような少なくとも１つの別の癌及び予後マーカーを評価することをさらに含む。これらのマーカーにより得られる結果を、本発明の方法によって得られる結果を確認するために、及び／又はアジュバント療法の選択のために用いてもよい。
【００６３】
最後の態様において、本発明は、癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングする方法にさらに関し、ここでこの方法は、治療の投与前の前記対象からの癌試料及び治療の投与後の前記対象からの癌試料における、ＨＰ１αの発現レベル（治療の投与後に得た試料におけるＨＰ１αの発現レベルの低下は、対象が治療に反応することの指標となる）を決定する工程を含む。
【００６４】
ある実施形態において、この方法は、対象から癌試料を準備する工程をさらに含む。
【００６５】
治療は、任意の化学療法又は放射線治療であってよい。最初の癌試料は、治療の投与前に対象から得られる。二番目の試料は、治療の投与後に同じ対象から得られる。好ましくは、二番目の試料は、選択した治療による、細胞増殖への有意な効果が期待される場合に採取される。ある実施形態においては、二番目の試料は治療投与の少なくとも２日後、好ましくは前記投与の１週間後に採取される。
【００６６】
患者の治療への反応性は、治療の前及び後の腫瘍細胞におけるＨＰ１αの発現レベルを決定することにより評価される。癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルは上述したように、好ましくはＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。治療前に採取した試料に含まれる腫瘍細胞におけるＨＰ１αの発現レベルと比較して、治療後に採取した試料に含まれる腫瘍細胞におけるＨＰ１αのより低い発現レベルが、対象が治療に反応することを示す。
【００６７】
ある実施形態において、この方法は、腫瘍悪性度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又はＫｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現、好ましくはＣＡＦ−１増殖マーカーの発現、のような、少なくとも１つの別の癌マーカーを評価することをさらに含む。
【００６８】
この方法は、必要とされる治療の期間及び／又は程度の指標をもまた提供するだろう。この例においては、各治療サイクルの後の経過観察は、治療前よりもＨＰ１αの発現レベルが低いかどうかを決定し、従って、それに応じて治療の期間及び／又は程度を調整することを可能にする。
【００６９】
本発明はさらに、癌における、好ましくはヒトの癌における、そしてより好ましくはヒトの乳癌における、予後マーカーとしてのＨＰ１αの使用に関する。好ましい実施形態において、ＨＰ１αは、局所的又は全身性の浸潤のない、早期乳癌における予後マーカーとして用いられる。本明細書で使用する場合、「予後マーカー」という語は、癌に罹患した対象の臨床転帰を予測する又はモニタリングするために用いられる化合物、すなわちＨＰ１αを指す。
【００７０】
本発明はまた、癌の、好ましくはヒトの癌の、そしてより好ましくはヒトの乳癌の診断マーカーとしてのＨＰ１αの使用に関する。本明細書で使用する場合、「診断マーカー」という語は、対象における癌の診断のために用いられる化合物、すなわちＨＰ１αを指す。
【００７１】
本発明はまた、アジュバント療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択するための、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するためのマーカーとしてのＨＰ１αの使用に関する。好ましくは、この癌はヒトの癌であり、より好ましくはヒトの乳癌である。
【００７２】
本発明はさらに、癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングするためのマーカーとしてのＨＰ１αの使用に関する。好ましくは、この癌はヒトの癌であり、より好ましくはヒトの乳癌である。
【００７３】
ＨＰ１αを、上述した本発明の方法のうちのいずれか１つにおいて、マーカーとして使用することができる。
【００７４】
別の態様において、本発明はさらに、
（ａ）癌に罹患した対象の臨床転帰を予測又はモニタリングするための；及び／又は
（ｂ）対象における癌を診断するための；及び／又は
（ｃ）アジュバント療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択するための、若しくは癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するための；及び／又は
（ｄ）癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングするための、
キットに関し、ここでこのキットは、
（ｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１αに特異的な抗体、及び任意に、ＨＰ１αと前記少なくとも１つの抗体との複合体の形成を検出する手段；及び／又は
（ｉｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的なプローブ、及び任意に、前記少なくとも１つのプローブと、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する手段；及び／又は
（ｉｉｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的な核酸プライマー対、及び任意に、前記ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを増幅及び／又は検出する手段；及び、
（ｉｖ）任意に、そのようなキットの使用についての指針を提供する印刷物、
を含む。
【００７５】
本発明のさらなる態様及び利点を以下の実施例に記載するが、この実施例は説明するのためのものであり、限定するものではないと見なされるべきである。
【００７６】
実施例
実施例１
材料及び方法
細胞培養及び同調化
Ｗｉ３８初代肺線維芽細胞（ＡＴＣＣ）及びＢＪ初代包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ）をＭＥＭα培地（ＧＩＢＣＯ）中で、ＭＣＦ７乳癌細胞及びＨｅＬａ子宮頸癌細胞をＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で、Ｈｓ５７８Ｔ乳癌細胞を１０mMのインスリン（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）中で、及びＨｓ５７８Ｂｓｔ健康乳房細胞（ＡＴＣＣ）を３０ng／mlの上皮成長因子（ＴＥＢＵ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。培地には１０％ウシ胎仔血清（Ｅｕｒｏｂｉｏ）並びに１０mg／mlのペニシリン及びストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を添加した。
【００７７】
静止期での同調化のために、初代細胞を、血清を含まない培地中で少なくとも７２時間、ＭＣＦ７細胞については１０nMの抗エストロゲンＩＣＩ１８２７８０（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Carroll et al, 2000）を含む培地中で４８時間、生育させた。
【００７８】
同調化を（Polo et al, 2004）に従ってフローサイトメトリーにより確認し、データをＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて解析した。
【００７９】
ＨｅＬａ細胞を、（Polo et al, 2004）に記載されているように、細胞周期の異なる段階において同調化した。ＢＪ細胞を、１４時間遮断、１０時間解除、１４時間の再遮断、及び、Ｓ、Ｇ２及びＧ１期のそれぞれについて３、６、又は１２時間の解除、を行った以外は、同様に同調化した。有糸分裂をしているＢＪ細胞については、チミジンからの２回目の解除の４時間後に１０ng／mlのノコダゾールを添加し、１０時間後に細胞を回収した。同調化を（Polo et al, 2004）に記載されているようにフローサイトメトリーにより解析した。フローサイトメトリーデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いて行った。
【００８０】
トランスフェクション及びｓｉＲＮＡ
抗生物質を含まない培地にプレーティングしたＨｅＬａ細胞を、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＯｐｔｉｍｅｍ １培地（Ｇｉｂｃｏ）を用い、３０nMのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。
【化１】
【００８１】
ＢＪ初代細胞を、２７回目の継代（ＡＴＣＣからの受領後、８回目の継代）の時に、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ）を用いて製造業者の説明に従って、トランスフェクションした。簡単に述べると、４×１０５個の細胞を、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ Ｘ−００１を用い、１００μlのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒ（Ａｍａｘａ）に溶解した０．８nmolのｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）又は１μgのプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。その後細胞を、４日以内にコンフルエンスに達しないように増殖させるため、７０００細胞／cm2の密度でプレーティングした。
【００８２】
ライブセルイメージング
ライブセルイメージング用に、ＢＪ細胞を７２時間の間隔でｓｉＲＮＡで２回トランスフェクションした。２回目のトランスフェクションではＨ２Ｂ−ｃｈｅｒｒｙをコードしているプラスミドを導入し、そしてガラスボトムディッシュ（Ｍａｔｔｅｋ）にプレーティングした。Ｂｉｏ Ｓｔａｔｉｏｎシステム（Ｎｉｋｏｎ）を用いて動画を作成した。２回目のトランスフェクションから４８時間後に開始して２４時間の間、画像を２０分毎に取得した。動画をＩｍａｇｅＪを用いて解析した。
【００８３】
細胞抽出物
全細胞抽出物については、ＰＢＳ中で洗った後、細胞をプレートから１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（６０mM Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ６．８；１０％グリセロール；２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；１％２−メルカプトエタノール及び０．００２％ブロモフェノールブルー）中にかき取り、そしてこれらの抽出物を１０分間煮沸し、その後−２０℃で保存した。
【００８４】
クロマチン結合細胞抽出物は、（Martini et al, 1998）に従って準備した。タンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ溶液を用いて決定した。
【００８５】
抗体
一次抗体：Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘのマウスモノクローナル抗ＨＰ１α ２ＨＰ−１Ｈ５及びＳｉｇｍａのウサギポリクローナル抗ＨＰ１α Ｈ２１６４（それぞれ、アミノ酸６７〜１１９及び１７７〜１９１、に対する）（免疫蛍光法及び免疫組織化学用）、ウエスタンブロット用マウスモノクローナル抗ＨＰ１α ２ＨＰ−２Ｇ９（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、マウスモノクローナル抗ＨＰ１β １ＭＯＤ１Ａ９（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、マウスモノクローナル抗ＨＰｌγ ２ＭＯＤ−１Ｇ６−ＡＳ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）、抗ＣＲＥＳＴヒト血清、ウサギポリクローナル抗ＣＡＦ−１ ｐ６０、マウスモノクローナル抗β−アクチン ＡＣ−１５（Ｓｉｇｍａ）、マウスモノクローナル抗ＫＬ１抗体（Ｄａｋｏ）、ウサギポリクローナル抗サイクリンＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、マウスモノクローナル抗Ｈ３Ｓ１０Ｐ（Ａｂｃａｍ ａｂ１４９５５）及びウサギポリクローナル抗Ｃｄｔｌ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ２８２６２）。
【００８６】
二次抗体：Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテキサスレッド結合抗体（免疫蛍光法）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（ウェスタンブロット）。
【００８７】
ウェスタンブロット
２５Ｕのｂｅｎｚｏｎａｓｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で３０分間処理した後、細胞抽出物をｌ×ＭＥＳ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４〜１２％の勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、その後（Martini et al, 1998）に記載の通りにウェスタンブロットを行った。
【００８８】
免疫蛍光法
２％のパラホルムアルデヒド中で固定した後、ＰＢＳに溶解した０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で細胞を透過処理した。免疫蛍光検出は（Martini et al, 1998）の通りに行った。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中にカバーグラスを封入した。
【００８９】
組織試料上での免疫蛍光法用に、凍結した乳房組織（Ｃｕｒｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から８μmの凍結切片を作成し、スライドグラス上、３％ パラホルムアルデヒド中で固定し、その後免疫染色を上述したように行った。
【００９０】
免疫組織化学
凍結した乳房組織（Ｃｕｒｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）からの８μm凍結切片又は凍結組織アレイ（ＦＭＣ４０１、Ｂｉｏｍａｘ）を用いた。スライドグラス上、３％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして０．５％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳ中で４分間透過処理した切片を、ペルオキシダーゼを阻害するために３％Ｈ２Ｏ２（Ｐｒｏｌａｂｏ）中で５分間インキュベートし、その後１％ＢＳＡと５％脱脂粉乳を含むＰＢＳ中でブロッキングした。ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）及びジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて検出し、その後ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ）を用いて対比染色した。高濃度のエタノールとトルエンでスライドを脱水し、その後Ｅｎｔｅｌｌａｎ封入剤（Ｍｅｒｃｋ）を用いて封入した。
【００９１】
ＲＮＡの抽出、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びプライマー
細胞株又は凍結した患者試料からのトータルＲＮＡの抽出にはｍＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、そして１反応当たりｌμgのＲＮＡと３μgのランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、Ｓｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲには、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ２．０システム（Ｒｏｃｈｅ）及びＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。患者試料については、９６−ウェルプレートのＳｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。２連の反応を測定し、そしてプライマー効率を評価するために、３つの連続希釈したｃＤＮＡを用いた。推定されるゲノムの混入からｃＤＮＡの増幅を区別できるように、プライマー対をイントロンを含むように設計した。
【化２】
ＨＰ１α ｍＲＮＡの量を、ｘ＝Ｅ（Ｃｐ ＲＰＬＰＯ−Ｃｐ ＨＰ１α）の式（式中、Ｅはプライマー対の効率の平均、及びｘは示された試料におけるＲＰＬＰＯ ｍＲＮＡの量に対するＨＰ１α ｍＲＮＡの相対量）を適用することにより、ヒト酸性リボソームリンタンパク質ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化した。
【００９２】
乳癌患者試料及び統計値
本研究は、最初の保存的な腫瘍摘出術のために、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃｕｒｉｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒから選択した９２の乳癌試料（腫瘍の中間サイズ：１８mm［６〜５０mm］）を含んだ。患者は１９９５年に診断され、そしてリンパ節陰性（ＮＯ）、かつ、転移が無い（ＭＯ）であると認められた。患者には調査目的が告知され、患者は反対意見を表明しなかった。患者及び腫瘍の特徴を表１に示す。冷凍保存した組織からＲＮＡを抽出し、そして上述したように解析した。８６の試料からのＲＮＡはさらなる解析に十分な質であった。
【００９３】
群間の差を、カテゴリー変数についてはχ２又はフィッシャーの直接確率検定によって、及び連続変数についてはクラスカル・ワリスによって解析した。再発がなく、生存している患者については、最後に会ったことが分かっている日時で調査を打ち切った。生存データは乳癌と診断された日から疾患進行の発生までの期間として定義し、疾患進行の発生は治療した乳房における局所再発、リンパ節領域における局所再発、対側乳癌又は遠隔再発として定義した。無病期間（ＤＦＩ）についての予後カットオフ値の決定はコックスの比例ハザードモデル（Ｃｏｘ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋｓ ｍｏｄｅｌ）を用いてコンピューターにより行った。各イベントにおけるこの変数の予後値の評価には、ワルド検定を用いた。全生存（ＯＳ）、無転移期間及びＤＦＩ率をカプラン・マイヤー法により予測し、そしてログランク検定を用いて群間の比較を行った。コックスの前向き解析（Ｃｏｘ ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）（Ｃｏｘ１９７２）を用いて、ＯＳ及びＤＦＩにおける予後因子の相対的な影響を評価するために多変量解析を行った。有意なレベルは０．０５であった。解析はＲソフトウェア２．５．０バージョンを用いて行った。
【００９４】
結果
ＨＰ１αの発現は細胞増殖に依存する
近年の研究には、ＨＰ１タンパク質が、未分化の血液細胞と比較して、分化した血液細胞でダウンレギュレートされていることが記載されてきた（Baxter et al, 2004; Gilbert et al, 2003; Istomina et al, 2003; Ritou et al, 2007）。このダウンレギュレーションは、細胞周期からの離脱に共通の反応、又は（血液）細胞の分化に特異的な結果だと考えられる。この問題を扱うために、発明者らは分化過程を伴わない、一過性の細胞周期からの離脱が同様にＨＰ１のダウンレギュレーションを生じるかどうかについて試験した。血清飢餓によって静止期を誘導した２種類の異なるヒト初代線維芽細胞（ＷＩ３８及びＢＪ）を用い、発明者らは、ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのタンパク質レベルが、増殖期細胞と比較して静止期細胞ではより低いことを観察した（図１Ａ）。抗エストロゲン処理により静止期で停止させたＭＣＦ７乳癌細胞（Carroll et al, 2000）も同様に、ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションを示す。従って、静止期を誘導するための２つの異なる手段を用いて、発明者らは、その量が細胞が静止期にあった時間に関係する、ＨＰ１αイソ型の特異的なダウンレギュレーションを見いだした。対照として、全ての静止期細胞におけるＣＡＦ−１ ｐ６０のダウンレギュレーション（Polo et al, 2004）を確認し（図１Ａ）、フローサイトメトリーにより同調効率を評価した（図１Ｂ）。非同調的増殖期の細胞と比較した場合、静止期ＢＪ細胞もまた低いＨＰ１α ｍＲＮＡレベルを示すことから（定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した、図１Ｃ）、ＣＡＦ−１ ｐ１５０及びｐ６０と同様に、一過性の静止期におけるＨＰ１αのダウンレギュレーションは部分的には転写制御に関係する。静止状態からの離脱に際しては、ＨＰ１αのタンパク質レベルは、細胞周期への進入の時間（フローサイトメトリーにより決定した、図２Ｂ）と対応する、解除から１６〜２４時間の間に徐々に増加する（図２Ａ）。ＨＰ１αの蓄積はＣＡＦ−１ ｐ６０のうちの１つより早く起こり（図２Ａ）、大部分はＤＮＡ複製の開始において観察された。
【００９５】
静止期において観察されるＨＰ１αのダウンレギュレーションは、静止状態に特異的か、又は細胞周期の特定の状態に限定される発現を反映するものだと考えられた。そこで発明者らは、同調させたＨｅＬａ細胞の細胞周期経過におけるＨＰ１αのレベルを解析した。細胞周期マーカーであるサイクリンＡとは対照的に、同調した細胞集団におけるＨＰ１αレベルの有意な変動は観察されなかった（図３Ａ、Ｂ）。同様に、正常な細胞周期の制御を示すヒト初代線維芽細胞は、同調した細胞集団におけるＨＰ１αタンパク質（図３Ｃ）及びｍＲＮＡと本質的に類似したレベルを示す（図３Ｄ、Ｅ）。この点においてＨＰ１αは、細胞周期経過において普遍的に発現するが静止期においてダウンレギュレートされる、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びｐ１５０と同様にふるまう（図１及び３；（(Polo et al, 2004））。結論として、ＨＰ１αの発現レベルは増殖可能な細胞において細胞周期の全ての状態において高く、ＨＰ１αのダウンレギュレーションは静止状態に特異的である。
【００９６】
ＨＰ１αは乳癌細胞において過剰発現する
ＨＰ１αの増殖依存的な発現は、ＣＡＦ−１ ｐ６０（Polo et al, 2004）を含む増殖マーカーに見られるような、腫瘍及び非腫瘍細胞間での差次的発現の可能性を示唆するものである。この問題を試験するために、発明者らは比較のため、同じ患者由来の腫瘍（Ｈｓ５７８Ｔ）又は非腫瘍（Ｈｓ５７８Ｂｓｔ）（Hackett et al, 1977）いずれかの乳房細胞を用いた。全細胞抽出物に加え、可溶性画分及びクロマチン結合画分の両方におけるＨＰ１タンパク質のレベルも解析した（図４Ａ）。実際には、ＨＰ１タンパク質は、高濃度塩を用いた又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤を用いた抽出に抵抗性があることで区別される、様々な核画分に分布する。ＨＰ１の塩又は界面活性剤抵抗性プールは、活性な、ＨＰ１のクロマチン結合プールであり、そしてウエスタンブロット定量（Taddei et al, 2001）又はＦＲＡＰ（Cheutin et al, 2003; Dialynas et al, 2007; Festenstein et al, 2003）によって決定されたように、ヒト及び齧歯類細胞の全ＨＰ１の１０％未満を示すと考えられる。
【００９７】
クロマチン結合及び可溶性核画分の両方において、発明者らは、非腫瘍Ｈｓ５７８ＢｓＴ細胞と比較して腫瘍Ｈｓ５７８Ｔ細胞においてより高いレベルのＨＰ１αを観察したが、ＨＰ１β又はγの発見はローディングコントロールであるβ−アクチンと比較してほとんど差を示さない（図４Ｂ）。同一量の細胞をロードした場合も、特異的な、ＨＰ１αの腫瘍での過剰発現を示す（図５）。全細胞抽出物を用いた半定量的ウエスタンブロットは、ローディングコントロールと比較して、腫瘍Ｈｓ５７８Ｔ細胞は非腫瘍Ｈｓ５７８ＢｓＴ細胞よりもおよそ８倍多いＨＰ１αタンパク質を含むことを示す（図４Ｃ）。フローサイトメトリーにおいて腫瘍Ｈｓ５７８Ｔ細胞が非常に中程度な異数性を示すことから（図４Ｄ）、発明者らは、ＨＰ１αの発現レベルが細胞のＤＮＡ含量を反映している可能性を排除することができた。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出したＨＰ１α ｍＲＮＡの過剰発現（図４Ｅ）はさらに、少なくとも部分的には転写を含む制御を示す。
【００９８】
クロマチン結合及び可溶性画分に関する本解析は、腫瘍細胞におけるＨＰ１αの過剰発現は部分的にはクロマチン結合であり、そのためクロマチン構成に重要である可能性を示唆するものである。これは、非腫瘍乳房細胞では粒状で分散しているが、乳癌細胞の大部分においては別々のスポットとしてはっきりと局在する（図６Ａ）、その核局在と一致するようである。ＣＲＥＳＴ自己免疫血清により検出したように、これらのスポットの大部分はセントロメア領域に局在する（図６Ａ）。さらに、ＨＰ１αの差次的な局在は、変化したＨ３Ｋ９ｍｅ３の核分布を伴わず（図６Ｂ）、そして細胞周期マーカーの染色により検出されるように（図６Ｃ）、ＨＰ１α染色の異なるパターンは細胞周期の特定の状態とは相関しないようであった。結論として、本細胞株モデルは、ＨＰ１β又はγではなくＨＰ１αの、非腫瘍乳房細胞と比較して腫瘍乳房細胞での過剰発現を示した。乳癌細胞におけるＨＰ１αの大部分の画分はクロマチン結合であり、そしてセントロメア領域に局在する。
【００９９】
ＨＰ１αのダウンレギュレーションは有糸分裂の欠損を生じる
ＨＰ１β又γには見られない、ＨＰ１αの増殖依存的発現は、このイソ型に特異な機能を指摘し、そしてこのタンパク質の量が多いことが細胞成長に有利になり得ることを示唆するものである。興味深いことに、ＣＡＦ−１ ｐ１５０のダウンレギュレーションは、そのＨＰ１タンパク質との相互作用による、Ｓ期での著明な停止を生じる（Quivy et al, 2008; Quivy et al, 2004）。そのため、発見者らは、ヒト癌細胞の増殖においてＨＰ１α、β又はγの高い発現レベルが必要なのかどうかについて試験した。ＨＰ１α、β又はγを標的とするｓｉＲＮＡを用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクションすることにより、ＨＰ１の各イソ型の特異的なダウンレギュレーションを得た（図７Ａ）。その結合パートナーであるＣＡＦ−１ ｐ１５０（Quivy et al, 2008）のダウンレギュレーションと比較して、ＨＰ１イソ型のダウンレギュレーションは、フローサイトメトリーによって評価したように（図７Ｂ）、細胞増殖において明らかに影響を及ぼさなかった。発明者らは、乳癌細胞株Ｈｓ５７８ＴにおけるＨＰ１αのダウンレギュレーションについても同様の結果を得た。しかしながら、これまでの報告と同様に（Auth et al, 2006; Obuse et al, 2004）、発明者らは、ＨＰ１αのダウンレギュレーションの後に遅滞染色体、不均衡及び染色体橋を示す（図７Ｃ）有糸分裂プロファイルの画分の増加を認めた。これらを異常な有糸分裂画分として定量した（図７Ｄ）。興味深いことに、本実施例の条件下においては、ＨＰ１β又γのダウンレギュレーションは有糸分裂欠損の増加をもたらさず、このことはＨＰ１αイソ型のみが正常な有糸分裂に重要であることを示唆している。さらに、ＨＰ１β又γではなく、ＨＰ１αのダウンレギュレーションの後に小核の形成が３倍増加したことが観察されたことからも、有糸分裂の欠損が支持された（図７Ｅ、Ｆ）。
【０１００】
ＨｅＬａ細胞がこれまでに、多くの画分での有糸分裂の欠損（〜２０％）及び多くの画分での小核の形成（〜１０％）を示したことから、さらなる解析のために、発明者らは、細胞周期の制御及びチェックポイントの活性に有用な、初代線維芽細胞を用いた。ＨＰ１αに対する２つの異なるｓｉＲＮＡを用いた一過性のトランスフェクションは、このイソ型の特異的なダウンレギュレーションを生じた（図８Ａ）。ここでも、発明者らはフローサイトメトリーによる全体的な細胞周期分布における有意な効果を検出しなかったが（図８Ｂ）、顕微鏡観察により、少なくはあるが再現可能な前中期のパーセンテージの増加、及び中期のパーセンテージの低下を認めた（図８Ｃ）。興味深いことに、この効果は、ＨＰ１αのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホモログの突然変異（Kellum & Alberts, 1995）、又はニワトリ細胞におけるセントロメアヒストンＨ３変異体ＣＥＮＰＡの不活性化（Regnier et al, 2005）において見られる効果と類似するものである。ライブセルイメージングを用い、ＨＰ１αのダウンレギュレーション後の有糸分裂期間における、対照と比較して、少なくはあるが統計学的に有意な（ｐ＝４．９ｅ−７）増加を測定した（図８Ｄ、上段のグラフ）。興味深いことに、ここでもまた、遅延は主に実際の染色体分離に先立つ工程に影響した（図８Ｄ、下段のグラフ）。結論として、腫瘍及び初代細胞両方を用いた本観察は、おそらく位置の調整、又は染色体の中期における安定した結合に寄与することによる、ＨＰ１αの初期有系分裂における役割を示唆するものである。
【０１０１】
ヒト癌試料におけるＨＰ１αの過剰発現
乳癌細胞株におけるＨＰ１αの増殖依存的発現及びその過剰発現は、発明者らを、ヒトの癌の生理学的な状況におけるＨＰ１αの発現について研究するよう促した。最初に、異なる組織型において行われ、報告されたトランスクリプトーム研究からのデータをＯｎｃｏｍｉｎｅデータベース（Rhodes et al, 2004）を用いて解析した。これらのデータは、ＨＰ１αが複数の型の固形腫瘍並びに白血病において有意に及び一貫して過剰発現すること（図９Ａ）、及びその発現が結合パートナーであるＣＡＦ−１ ｐ１５０及び増殖マーカーＫｉ６７の発現と相関すること（図９Ｂ）を示した。
【０１０２】
培養細胞における本結果は、ＨＰ１αタンパク質レベルの差が、対応するｍＲＮＡレベルよりも顕著であり（図１及び４）、おそらく転写後の制御を反映しているのだろうということを系統的に示した。これに刺激され、発明者らは免疫組織化学により、凍結した腫瘍及び非腫瘍ヒト組織切片におけるＨＰ１αタンパク質レベルを解析した。膵臓、子宮、卵巣、前立腺及び乳房での悪性腫瘍の腫瘍細胞の核において、ＨＰ１αの強い染色が系統的に観察された（図１０Ａ）。対応する非腫瘍組織においては、ＨＰ１αレベルは主に、検出限界よりも低かった。ＨＰ１β及びγは腫瘍及び非腫瘍組織の両方での核染色を示す中で、この差次的発現はＨＰ１αに特異的であった（図１０Ｂ）。癌細胞に対応するＨＰ１αの強い免疫染色を示す核は、上皮サイトケラチンマーカーＫＬ−１についてもまた陽性であった（図１０Ｃ）。加えて、図１０で用いられたモノクローナル抗体よりも強い染色を呈するＨＰ１αに対するポリクローナル抗体もまた、癌細胞における明かな過剰発現と、非腫瘍組織におけるいくらかの染色を示した（図１１Ａ）。しかしながら、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３についての染色は、非腫瘍及び腫瘍組織間での明かな差は示さず（図１１Ｂ）、このことはＨＰ１αの検出がより感受性であるか、又は過剰発現がＨ３Ｋ９ｍｅ３とは独立して生じるかのいずれかを示唆するものである。
【０１０３】
腫瘍成長及び疾患転帰におけるＨＰ１αの過剰発現の重要性を決定するために、１９９５年に採取され、凍結保存した乳癌標本を選択した。発明者らは、それらのサイズ（中間値１８mm；範囲６〜５０mm）が最初の保存的腫瘍摘出に適した、リンパ節転移陰性及び転移のない浸潤癌に焦点を当てた。これらの症例ではアジュバント化学療法の指標である新しい予後マーカーから恩恵を受けると考えられる。患者及び腫瘍の特徴は以下のとおり、表１に示した。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
経過観察の中間値は１４６ヶ月である（範囲３０〜１６１）。１０年目での全生存、遠隔再発及び疾患進行率はそれぞれ、９０％［８３〜９７％］、８７％［８０〜９５％］及び７０％［６１〜８１％］であった。８６の試料におけるＨＰ１α ｍＲＮＡ発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、発現レベルを基準遺伝子であるリボソームタンパク質ＰＯ様タンパク質（ＲＰＬＰＯ）（de Cremoux et al, 2004）に対して正規化した。発明者らはＨＰ１αの高いレベルが患者の年齢上昇と関連し（ｐ＝０．００１４）、より大きく、高度に分裂した、グレードＩＩＩの腫瘍と関連する（有意差なし）傾向にあることを見いだした（図１２Ａ）。単変量解析においては、ＨＰ１αの継続的な発現は、疾患進行のリスク増加と有意に関連した：ｌｏｇ２（ＨＰ１α）の１単位の増加は、疾患進行のリスクを３％増加させた（ＲＲ＝１．０３［１．００−１．０５］、ｐ＝０．０４１）。発明者らは、患者を２群に分け（７４．４％がＨＰ１αレベル≦１０及び２５．６％がＨＰ１αレベル＞１０）、疾患進行と有意に関連がある（ｐ＝０．０１１３；相対リスク＝２．４７［１．２０−５．０９］）カットオフ値が１０であることを決定した。１０年目においては、ＨＰ１αレベルが低い患者の７５％［６４−８７］対ＨＰ１αレベルが高い患者の５７％［３９−８３］が疾患の進行を示さなかった。さらに、このカットオフ値は全生存（ｐ＝０．０１３４；相対リスク＝３．７６［１．０３−１３．７］）及び遠隔再発の発症（ｐ＝０．０１１；相対リスク＝３．７４［１．２６−１１．２］）とも有意に関連する（図１２Ｂ）。
【０１０６】
既知の予後因子（すなわち患者の年齢、分裂指数、腫瘍悪性度、腫瘍サイズ、ホルモン受容体の状態及びＫｉ６７レベル）で調整される多変量解析では、ＨＰ１αの発現のみが全生存における独立した予後因子である（ｐ＝０．０４３１）：高い（＞１０）ＨＰ１αレベルが死亡リスクの上昇と関連する（相対リスク＝３．７６［１．０３−１３．７］）。同様に、同じパラメーターで調整すると、高いＨＰ１αの発現（ｐ＝０．００７７；相対リスク＝３．０２［１．３８−６．６３］）及び高い腫瘍悪性度（ｐ＝０．０１７０；グレードＩＩＩについての相対リスク＝４．５３［１．５１−１３．６］）のみが疾患進行を悪化させる。
【０１０７】
結論として、免疫組織化学による本結果は、ＨＰ１β又はγではなく、ＨＰ１αが複数の型のヒト癌細胞において過剰発現することを示すものである。さらに、ＨＰ１αについて行った定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、臨床病理学的データ及び疾患転帰との有意な相関関係を示した。本区分の８６の小さい乳房腫瘍においては、ＨＰ１αの高い発現は、分裂指数、腫瘍悪性度、腫瘍サイズ、ホルモン受容体の状態又はＫｉ６７のような古典的な予後マーカーを用いた調整の後においても、依然として全生存における独立した予後因子である。まとめると、これらのデータは、ＨＰ１αが、乳癌及びその他の型の癌の予後のための、臨床的関連における細胞増殖及び腫瘍形成の新しいクロマチン関連マーカーを構成することを示す。
【０１０８】
考察
ＨＰ１αイソ型の特異な制御
ＨＰ１ファミリーのタンパク質は、２０年以上前に同定されたが（James & Elgin, 1986）、３つのイソ型に共通の又は異なる機能の大部分は明らかになっていない。本結果は、ヒトの細胞においては、ＨＰ１αイソ型が、ＨＰ１β及びγとは共通しない、特異な特性を有することを示す。タンパク質は増殖依存的に発現し、一過性の細胞周期からの離脱の間、ダウンレギュレートされる。これらの発見と一致して、培養癌細胞は、非腫瘍細胞と比較してＨＰ１αを過剰発現する。重要なことは、このことが患者試料において確認されたことである。従って、これらのデータは、ＨＰ１β又はγとは異なる、ＨＰ１αの特異な制御を示すものである。
【０１０９】
癌におけるＨＰ１αの重要性
ＨＰ１α発現の臨床上における重要性を評価するために、ヒト癌におけるＨＰ１αタンパク質及びｍＲＮＡレベルを免疫組織化学及び定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した。凍結保存したヒト組織試料の染色は、腫瘍細胞においてＨＰ１β又γではなく、ＨＰ１αの有意な過剰発現を示した。従って、ＨＰ１αは、複数の型の癌を診断するためのマーカーを構成する。Ｋｉ６７のようなその他の増殖マーカーとは対照的に、ＨＰ１αは全ての腫瘍細胞を染色するため、腫瘍の正確な位置及び度合いに決定するのに非常に適している。
【０１１０】
ＨＰ１αの発現を定量し、そして予後値を決定するために、１０年より長く経過を管理をした８６の小さい乳房腫瘍におけるＨＰ１αのｍＲＮＡレベルを測定した。本データは、ＨＰ１αの高い発現が、経過期間における生存の低下及び転移発生の増加と相関することを明らかにした。さらに、多変量解析は、標準的な予後マーカーよりも、ＨＰ１αのレベルが疾患転帰をより正確に予測することを示した。従って、ＨＰ１αは、乳癌及びその他の型の癌における予後値のマーカーを構成する。
【０１１１】
実施例２
材料及び方法
ＤＮＡ及びＲＮＡマイクロアレイ解析
Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＣｕｒｉｅのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｃｅｎｔｅｒから選択された、１５８のよく注釈付けられた凍結腫瘍試料及び１９の健康な乳房組織から、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）及びＲＮＡ ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。各ＲＮＡ試料の質をＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーを用いて決定した。ＲＮＡの量は、分光光度計を用いて２６０nmで測定した。ＲＮＡをＵ１３３ ｐｌｕｓ ２．０ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ上にハイブリダイズさせた。トランスクリプトームのデータをＧＣ−ＲＭＡ（Ｉｒｉｚａｒｒｙ、Hobbs et al.2003）を用いて正規化した。生データ及び正規化したトランスクリプトームのデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（アクセッション番号：［ＧＳＥ１３７８７］）で公開されている。
【０１１２】
逆相タンパク質アレイ解析
タンパク質アレイ用に、トランスクリプトーム解析に用いた試料の内の１６８の凍結ヒト腫瘍を、５０mM Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、５％ グリセロール、２mM ＤＴＴ、２．５mM ＥＤＴＡ、２．５mM ＥＧＴＡ、２mM オルトバナジウム酸ナトリウム、１０mM フッ化ナトリウム、並びにプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｆｒａｎｃｅ）及びフォスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｐｅｒｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）インヒビターのカクテルを含む緩衝液中で溶解した。Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、５mmのステンレス製ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）と共に３０Hzで２分間ホモジナイズした。溶解物を１００℃で１０分間煮沸し、そして−８０℃で保存した。タンパク質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｐｅｒｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）により決定した。全ての溶解物について、５種類の２倍連続希釈液を、ニトロセルロースでコーティングしたスライドグラス（ＦＡＳＴ ｓｌｉｄｅｓ、Ｗｈａｔｍａｎ）上に、ＳＭＰ３ＸＢピン（チップの直径＝７５μm、１スポット当たりの容積＝１．２nl；Ｔｅｌｅｃｈｅｍ、Ｐｒｏｔｅｉｇｅｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を備えたＭｉｃｒｏ Ｇｒｉｄ Ｃｏｍｐａｃｔアレイヤー（Ｂｉｏ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）装置を用いて３連でスポットした。次に、スライドをアビジン、ビオチン、及びペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｄａｋｏ、Ｆｒａｎｃｅ）と共にインキュベートし、その後０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び５％ ＢＳＡ（ＴＢＳＴ−ＢＳＡ）を含むＴＢＳで飽和させ、そしてＴＢＳＴ−ＢＳＡで希釈した一次抗体（ウサギポリクローナル抗ＨＰ１α、Ｈ２１６４、Ｓｉｇｍａ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ中で洗った後、アレイをＴＢＳＴ−ＢＳＡで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、室温で１時間プローブ化した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて室温で１０分間反応させて、シグナルを増幅させた。次にスライドを１０％ ＤＭＳＯを含むＴＢＳＴで２分間すすぎ、ＴＢＳＴ−ＢＳＡで希釈したＣｙ５−ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて室温で１時間プローブ化した。蛍光シグナルをＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂマイクロアレイスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてスキャンした。スポットの検出及びシグナルの定量はＭｉｃｒｏ Ｖｉｇｅｎｅソフトウェア（Ｖｉｇｅｎｅ ＴｅｃｈＩｎｃ、ＭＡ）を用いて決定した。シグナル強度を、ネガティブコントロール（一次抗体なし）及び全タンパク質染色の両方に対して正規化した。このために、１枚のスライドを７％酢酸と１０％メタノールの溶液で１５分間固定し、その後Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙタンパク質染色溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｓ１１７９１）で染色した。
【０１１３】
統計分析
統計分析には、Ｒソフトウェアｖ２．４．０を用いた。分布を正規化するために、データをＬｏｇ（２）により変換した。差次的発現をＴ検定により評価した。５％未満のｐ値を有意だと見なした。
【０１１４】
結果
この１０年で、マイクロアレイでのｍＲＮＡ発現プロファイルに基づき、複数の研究が、乳癌が４つの主要な群、（ｉ）ルミナール乳癌、主にＥＲ陽性であり、さらにルミナールＡ（グレードが低い）及びルミナールＢ（グレードが高い）に分類される；（ｉｉ）基底細胞様乳癌、主にＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２陰性；及び（ｉｉｉ）ＨＥＲ２過剰発現癌（Sotiriou and Piccart 2007）、に分類できることを示した。ＨＰ１αの発現をこれらの異なる分類の乳房腫瘍において解析した。
【０１１５】
１５８のよく注釈付けられた乳癌試料、及び１９の健康な乳房細胞試料からのトランスクリプトームデータを解析した。試料の分子的な特徴を図１３Ａに要約した。得られた発現プロファイルは、全ての高いグレードの腫瘍サブタイプ（ルミナールＢ、ＨＥＲ２＋及び基底細胞様）が、健康な組織と比較して、有意なＨＰ１α ｍＲＮＡの過剰発現を示すことを示すものである（図１３Ｂ）。興味深いことに、ＨＰ１αの過剰発現は、基底細胞様乳癌において特に重要である（図１３Ｂ）。ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２の過剰発現が陰性なこれらの乳房腫瘍は、効果的な治療に対して臨床的に悪性の癌であり、現在のところ予後マーカーがない（Rakha and Ellis 2009にまとめられている）。
【０１１６】
ＨＰ１αが、高いグレードの腫瘍サブタイプ（ルミナールＢ、ＨＥＲ２＋及び基底細胞様）における標的となるであろうことを確認するために、逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）技術を用い、タンパク質レベルでその発現レベルを解析した。このマイクロドットブロット技術は、ニトロセルロースで覆ったスライドグラス上に、非常に少量（１ng）のタンパク質溶解物を乗せる工程を含む。その後、目的のタンパク質を特異的抗体を用いて明らかにした。この方法においては、全１６８の乳房腫瘍試料からのタンパク質溶解物を、それらのＨＰ１αのタンパク質レベルについて同時に解析した。異なる腫瘍型から得られたプロファイルは、トランスクリプトームプロファイルと近似し（図１３Ｃ）、グレードの高いルミナールＢ腫瘍及び基底細胞様乳癌における発現レベルが特に高かった。
【０１１７】
従って、これらの結果から、ＨＰ１αが予後及び診断マーカーとして使用可能であることを確認した。ＨＰ１αの発現レベルが特に、最も悪性の臨床的挙動を有する乳癌サブタイプである、基底細胞様、ルミナールＢ、及びＨＥＲ２過剰発現乳癌においてその発現が高いことから、乳癌における予後マーカーに適している。
【０１１８】
さらに、これらの結果から、ＨＰ１α発現レベルを、ｍＲＮＡレベルにおいてだけでなく、タンパク質レベルにおいても定量的な方法で評価することができることを確認した。
【０１１９】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患した対象の臨床転帰を予測又はモニタリングするインビトロでの方法であって、該方法が前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルを決定する工程、ここでＨＰ１αの高い発現レベルは予後不良の指標となる、を含む方法。
【請求項２】
対象における癌を診断するインビトロでの方法であって、該方法が前記対象からの試料におけるＨＰ１αの発現レベルを決定する工程、ここでＨＰ１αの高い発現レベルは前記対象が癌に罹患していることの指標となる、を含む方法。
【請求項３】
アジュバント化学療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択する、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するインビトロでの方法であって、該方法が前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルを決定する工程、ここでＨＰ１αの高い発現レベルは、アジュバント化学療法及び／又は放射線治療が必要であることの指標となる、を含む方法。
【請求項４】
癌に罹患した対象の、治療への反応をモニタリングするインビトロでの方法であって、該方法が、治療の投与前の前記対象からの癌試料及び治療の投与後の前記対象からの癌試料における、ＨＰ１αの発現レベルを決定する工程、ここで治療の投与後に得た試料におけるＨＰ１αの発現レベルの低下は、該対象が治療に反応することの指標となる、を含む方法。
【請求項５】
ＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することによりＨＰ１αの発現レベルを決定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＨＰ１αタンパク質の量を、免疫組織化学、半定量的ウエスタンブロット、又はタンパク質若しくは抗体アレイによって測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＨＰ１α ｍＲＮＡの量を、定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、又はリアルタイム定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、又はトランスクリプトーム解析によって測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＨＰ１αの発現レベルを基準発現レベルと比較する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
基準発現レベルが、正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＰ１αの発現レベルを基準発現レベルと比較する工程をさらに含む方法であって、ここで該基準発現レベルが、ＲＰＬＰＯ遺伝子のような様々な癌において安定した発現を有する遺伝子の発現レベルである、請求項１及び請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基準発現レベルと比較して、ＨＰ１αの発現レベルが高いかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載に記載の方法。
【請求項１２】
予後不良が、患者の生存率の低下及び／又は初期疾患進行及び／又は疾患再発の増加及び／又は転移形成の増加である、請求項１及び請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又は、Ｋｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現のような、少なくとも１つの別の癌又は予後マーカーを評価することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
癌における予後マーカーとしてのＨＰ１αの使用。
【請求項１５】
癌における診断マーカーとしてのＨＰ１αの使用。
【請求項１６】
アジュバント療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択するための、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するためのマーカーとしてのＨＰ１αの使用。
【請求項１７】
癌に罹患した対象の、治療への反応をモニタリングするためのマーカーとしてのＨＰ１αの使用。
【請求項１８】
癌が、固形癌又は造血癌であり、好ましくは固形癌であり、より好ましくは局所的又は全身性の浸潤のない早期固形癌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法又は請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
癌が、乳癌、膵臓癌、子宮及び子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌及び白血病からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法又は使用。
【請求項２０】
癌が乳癌であり、好ましくは局所的又は全身性の浸潤のない早期乳癌である、請求項１９に記載の方法又は使用。
【請求項２１】
（ａ）癌に罹患した対象の臨床転帰を予測又はモニタリングするための；及び／又は
（ｂ）対象における癌を診断するための；及び／又は
（ｃ）アジュバント療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択するための、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するための；及び／又は
（ｄ）癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングするための、
キットであり、ここで該キットが
（ｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１αに特異的な抗体、及び／又は
（ｉｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的なプローブ、及び／又は
（ｉｉｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的な核酸プライマー対、及び場合により、そのようなキットの使用についての指針を提供する印刷物、
を含むキット。
【請求項２２】
ＨＰ１αと前記少なくとも１つのＨＰ１αに特異的な抗体との複合体の形成を検出する手段；及び／又は、前記少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡに特異的なプローブとＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する手段；及び／又は、前記ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを増幅及び／又は検出する手段；をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項１】
癌に罹患した対象の臨床転帰を予測又はモニタリングするインビトロでの方法であって、該方法が前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルを決定する工程、ここでＨＰ１αの高い発現レベルは予後不良の指標となる、を含む方法。
【請求項２】
対象における癌を診断するインビトロでの方法であって、該方法が前記対象からの試料におけるＨＰ１αの発現レベルを決定する工程、ここでＨＰ１αの高い発現レベルは前記対象が癌に罹患していることの指標となる、を含む方法。
【請求項３】
アジュバント化学療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択する、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するインビトロでの方法であって、該方法が前記対象からの癌試料におけるＨＰ１αの発現レベルを決定する工程、ここでＨＰ１αの高い発現レベルは、アジュバント化学療法及び／又は放射線治療が必要であることの指標となる、を含む方法。
【請求項４】
癌に罹患した対象の、治療への反応をモニタリングするインビトロでの方法であって、該方法が、治療の投与前の前記対象からの癌試料及び治療の投与後の前記対象からの癌試料における、ＨＰ１αの発現レベルを決定する工程、ここで治療の投与後に得た試料におけるＨＰ１αの発現レベルの低下は、該対象が治療に反応することの指標となる、を含む方法。
【請求項５】
ＨＰ１αタンパク質又はＨＰ１α ｍＲＮＡの量を測定することによりＨＰ１αの発現レベルを決定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＨＰ１αタンパク質の量を、免疫組織化学、半定量的ウエスタンブロット、又はタンパク質若しくは抗体アレイによって測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＨＰ１α ｍＲＮＡの量を、定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、又はリアルタイム定量的若しくは半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、又はトランスクリプトーム解析によって測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＨＰ１αの発現レベルを基準発現レベルと比較する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
基準発現レベルが、正常な試料におけるＨＰ１αの発現レベルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＰ１αの発現レベルを基準発現レベルと比較する工程をさらに含む方法であって、ここで該基準発現レベルが、ＲＰＬＰＯ遺伝子のような様々な癌において安定した発現を有する遺伝子の発現レベルである、請求項１及び請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基準発現レベルと比較して、ＨＰ１αの発現レベルが高いかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載に記載の方法。
【請求項１２】
予後不良が、患者の生存率の低下及び／又は初期疾患進行及び／又は疾患再発の増加及び／又は転移形成の増加である、請求項１及び請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍度、ホルモン受容体の状態、分裂指数、腫瘍サイズ、ＨＪＵＲＰ発現レベル、又は、Ｋｉ６７、ＭＣＭ２、ＣＡＦ−１ ｐ６０及びＣＡＦ−１ ｐ１５０のような増殖マーカーの発現のような、少なくとも１つの別の癌又は予後マーカーを評価することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
癌における予後マーカーとしてのＨＰ１αの使用。
【請求項１５】
癌における診断マーカーとしてのＨＰ１αの使用。
【請求項１６】
アジュバント療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択するための、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するためのマーカーとしてのＨＰ１αの使用。
【請求項１７】
癌に罹患した対象の、治療への反応をモニタリングするためのマーカーとしてのＨＰ１αの使用。
【請求項１８】
癌が、固形癌又は造血癌であり、好ましくは固形癌であり、より好ましくは局所的又は全身性の浸潤のない早期固形癌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法又は請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
癌が、乳癌、膵臓癌、子宮及び子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌及び白血病からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法又は使用。
【請求項２０】
癌が乳癌であり、好ましくは局所的又は全身性の浸潤のない早期乳癌である、請求項１９に記載の方法又は使用。
【請求項２１】
（ａ）癌に罹患した対象の臨床転帰を予測又はモニタリングするための；及び／又は
（ｂ）対象における癌を診断するための；及び／又は
（ｃ）アジュバント療法及び／又は放射線治療のために癌に罹患した対象を選択するための、又は癌に罹患した対象がアジュバント化学療法及び／又は放射線治療からの利益を受けやすいかどうかを決定するための；及び／又は
（ｄ）癌に罹患した対象の治療への反応をモニタリングするための、
キットであり、ここで該キットが
（ｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１αに特異的な抗体、及び／又は
（ｉｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的なプローブ、及び／又は
（ｉｉｉ）少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的な核酸プライマー対、及び場合により、そのようなキットの使用についての指針を提供する印刷物、
を含むキット。
【請求項２２】
ＨＰ１αと前記少なくとも１つのＨＰ１αに特異的な抗体との複合体の形成を検出する手段；及び／又は、前記少なくとも１つの、ＨＰ１α ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡに特異的なプローブとＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する手段；及び／又は、前記ＨＰ１α ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを増幅及び／又は検出する手段；をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【公表番号】特表２０１２−５２４８９２（Ｐ２０１２−５２４８９２Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０６５１２（Ｐ２０１２−５０６５１２）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５４２３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２２１３７
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５０００２６５３３）アンスティテュ・キュリ (20)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＣＵＲＩＥ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５５４２３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２２１３７
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５０００２６５３３）アンスティテュ・キュリ (20)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＣＵＲＩＥ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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