ヒト・アンギオポエチン２に対する抗体
本発明は、ヒト・アンギオポエチン2に対する抗体（抗ANG-2抗体）と、その製造方法と、その抗体を含む医薬組成物と、その利用法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・アンギオポエチン2に対する抗体（抗AHG-2抗体）と、その製造方法と、その抗体を含む医薬組成物と、その利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血管新生は、固形腫瘍、眼内新生血管形成症候群（例えば増殖性網膜症、加齢性黄斑変性（AMD））、関節リウマチ、乾癬といったさまざまな疾患の病因に関与している（Folkman, J.他、J. Biol. Chem. 第267巻 (1992年) 10931〜10934頁；Klagsbrun, M.他、Annu. Rev. Physiol. 第53巻 (1991年) 217〜239頁；『眼科疾患の病理学、ダイナミックなアプローチ』（Garner, A.、Klintworth, G. K. (編)、第2版、マルセル・デッカー社、ニューヨーク (1994年)）の中のGarner, A.、「血管性疾患」、1625〜1710頁）。固形腫瘍の場合には、腫瘍細胞は、新生血管形成によって正常な細胞と比べて増殖上の利点と増殖の自律性を獲得することができる。そのため乳がんと他のいくつかの腫瘍において、腫瘍セグメント内の微小血管の密度と患者の生存の間に相関が観察されている（Weidner, N.他、N. Engl. J. Med. 第324巻 (1991年) 1〜8頁；Horak, E.R.他、Lancet 340巻 (1992年) 1120〜1124頁；Macchiarini, P.他、Lancet 第340巻 (1992年) 145〜146頁）。
【０００３】
ANG-2と抗AHG-2抗体
【０００４】
ヒト・アンギオポエチン2（ANG-2）（あるいはANGPT2、ANG2と略される）（配列番号107）は、Maisonpierre, P.C.他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁と、Cheung, A.H.他、Genomics 第48巻 (1998年) 389〜391頁に記載されている。アンギオポエチン-1とアンギオポエチン-2（ANG-I（配列番号108）とANG-2 （配列番号107））は、血管内皮細胞の中で選択的に発現するTiesというチロシンキナーゼ・ファミリーの1つのリガンドとして発見された。Yancopoulos, G. D.他、Nature 第407巻 (2000年) 242〜248頁。現在ではアンギオポエチン・ファミリーの4つの明確なメンバーが存在している。アンギオポエチン-3とアンギオポエチン-4（Ang-3とAng-4）は、マウスとヒトの同じ遺伝子座の大きく異なる片割れを表わしている可能性がある。Kim, I.他、FEBS Let、第443巻 (1999年) 353〜356頁；Kim, I.他、J. Biol. Chem. 第274巻 (1999年) 26523〜26528頁。ANG-1とANG-2は、元々は組織培養実験においてそれぞれアゴニストとアンタゴニストとして同定された（ANG-1に関しては、Davies, S.他、Cell、第87巻 (1996年) 1161〜1169頁を参照のこと；ANG-2に関しては、Maisonpierre, P.C.他、Science 277巻 (1997年) 55〜60頁を参照のこと）。既知のすべてのアンギオポエチンは主にTie2に結合し、Ang-1とAng-2の両方とも、2nM（Kd）というアフィニティでTie2に結合する。Maisonpierre, P. C他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁。ANG-1はECの生存をサポートし、内皮細胞が完全な状態であることを促進することがわかっている。Davis, S.他、Cell、第87巻 (1996年) 1161〜1169頁；Kwak, H.J.他、FEBS Lett 第448巻 (1999年) 249〜253頁；Suri, C他、Science 第282巻 (1998年) 468〜471頁；Thurston, G.他、Science 第286巻 (1999年) 2511〜2514頁；Thurston, G.他、Nat. Med. 第6巻 (2000年) 460〜463頁。それに対してANG-2は逆の効果を持ち、生存因子VEGFまたは塩基性線維芽細胞増殖因子の不在下では血管の不安定化と退縮を促進した。Maisonpierre, P. C他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁。しかしANG-2の機能に関する多くの研究は、より複雑な状況を示唆している。ANG-2は、血管リモデリングの複雑な調節因子であり、血管の新芽形成と退縮の両方においてある役割を果たしていると考えられる。ANG-2のこのような役割を支持するように、発現分析により、成人の血管新芽形成の状況ではANG-2がVEGFとともに急速に誘導される一方で、血管退縮の状況ではVEGFの不在下でANG-2が誘導されることが明らかにされた。Holash, J.他、Science 第284巻 (1999年) 1994〜1998頁；Holash, J.他、Oncogene 第18巻 (1999年) 5356〜5362頁。文脈に依存した役割に合致するように、ANG-2は、同じ内皮細胞特異的受容体Tie-2と特異的に結合する。Tie-2はANG-1によって活性化されるが、その活性化に対しては文脈に依存した効果を有する。Maisonpierre, P. C他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁。
【０００５】
角膜血管新生アッセイにより、ANG-1とANG-2の両方が似た効果を持っていて、VEGFと相乗的に作用して新しい血管の生長を促進することがわかった。Asahara, T.他、Circ. Res.、第83巻、(1998年) 233〜240頁。試験管内では高濃度だとANG-2が血管新生も促進できるという観察結果から、投与量に依存した内皮細胞の応答が存在する可能性が提起された。Kim, I.他、Oncogene 第19巻 (2000年) 4549〜4552頁。ANG-2は、高濃度だと、血清欠乏アポトーシスの間、内皮細胞にとって、PI-3キナーゼとAktの経路によるTie2の活性化を通じたアポトーシス生存因子として作用する。Kim, I.他、Oncogene 第19巻 (2000年) 4549〜4552頁。
【０００６】
他の試験管内実験から、持続曝露の間、ANG-2の効果はTie2のアンタゴニストとしての効果からアゴニストとしての効果へと徐々にシフトする可能性があり、その後は血管の形成と新規血管の安定化に直接寄与する可能性があることが示唆された。Teichert-Kuliszewska, K.他、Cardiovasc. Res. 第49巻 (2001年) 659〜670頁。さらに、ECをフィブリン・ゲルの上で培養すると、ANG-2によるTie2の活性化も観察された。これはおそらく、ANG-2の作用がECの分化状態に依存する可能性のあることを示唆している。Teichert-Kuliszewska; K.他、Cardiovasc. Res. 第49巻 (2001年) 659〜670頁。三次元コラーゲン・ゲルの中で培養した微小血管ECでは、ANG-2はTie2の活性化を誘導し、毛細血管様構造の形成も促進することができる。Mochizuki, Y.他、J. Cell. Sci. 第115巻 (2002年) 175〜183頁。血管成熟の試験管内モデルとして3D球状共存培養を利用すると、ECと間充織細胞の直接的な接触がVEGFへの応答を阻止するのに対し、VEGFとANG-2の存在は新芽形成を誘導することがわかった。Korff, T.他、Faseb J. 第15巻 (2001年) 447〜457頁。Etoh, T.らは、Tie2を構成的に発現するECと、MMP-1、MMP-9、u-PAの発現が、VEGFの存在下でANG-2によって強く上方調節されることを明らかにした。Etoh, T.他、Cancer Res. 第61巻 (2001年) 2145〜2153頁。Lobov, I.B.らは、生体内瞳孔膜モデルを用い、内在性VEGFの存在下でANG-2が毛細血管の直径の急速な増大と、基底層のリモデリングと、内皮細胞の増殖および移動を促進し、新しい血管の新芽形成を促すことを示した。Lobov, I.B.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第99巻 (2002年) 11205〜11210頁。それとは対照的に、ANG-2は、VEGFなしでは内皮細胞の死と血管の退縮を促進する。Lobov, I.B.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第99巻 (2002年) 11205〜11210頁。同様に、Vajkoczy, P.らは、生体内腫瘍モデルを用い、多細胞凝集体が、宿主と腫瘍内皮によるVEGFR-2とANG-2の同時発現を通じた血管の新芽形成によって血管の成長を開始させることを証明した。Vajkoczy, P.他、J. Clin. Invest. 第09巻 (2002年) 777〜785頁。このモデルは、増殖する腫瘍で確立される微小血管系が、VEGFとANG-2の発現によって媒介されると考えられる連続的リモデリングを特徴とすることを示した。Vajkoczy, M.A.他、J Clin. Invest. 第09巻 (2002年) 777〜785頁。
【０００７】
Tie-2とアンギオポエチン-1をノック-アウトしたマウスの研究は同様の表現型を示しているため、アンギオポエチン-1によって刺激されたTie-2のリン酸化が発達中の血管のリモデリングと安定化を媒介し、血管新生中の血管の成熟と内皮細胞-支持細胞の接着維持を促進することが示唆されている（Dumont, D.J.他、Genes & Development、第8巻 (1994年) 1897〜1909頁；Sato, T.N.、Nature、376巻 (1995年) 70〜74頁；Thurston, G.他、Nature Medicine 第6巻 (2000年) 460〜463頁）。アンギオポエチン-1の役割は、アンギオポエチン-1が広く構成的に発現している成人では保存されていると考えられている（Hanahan, D.、Science、第277巻 (1997年) 48〜50頁；Zagzag, D.他、Exp. Neurology、159巻 (1999年) 391〜400頁）。それとは逆に、アンギオポエチン-2の発現は主に血管のリモデリングが起こっている部位に限られており、そこではアンギオポエチン-1の構成的安定化機能または成熟機能が阻止されるため、血管が、新芽形成信号により多く応答する可能性のある可塑的な状態に戻ってその状態に留まることが可能になると考えられている（Hanahan, D.、1997年；Holash, J.他、Orzcogerze 第18巻 (1999年) 5356〜5362頁；Maisonpierre, P.C.、1997年）。異常な血管新生でのアンギオポエチン-2の発現の研究により、多くのタイプの腫瘍が血管でアンギオポエチン-2を発現することが見いだされた（Maisonpierre, P. C他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁）。機能の研究から、マウス異種移植モデルではアンギオポエチン-2が腫瘍の血管新生に関与していることと、アンギオポエチン-2の過剰発現と腫瘍増殖の増加が関連していることが示唆されている（Ahmad, S.A.他、Cancer Res.、第61巻 (2001年)1255〜1259頁）。他の研究は、アンギオポエチン-2の過剰発現と腫瘍の過剰な血管形成を関連付けている（Etoh, T.他、Cancer Res. 第61巻 (2001年) 2145〜2153頁；Tanaka, F.他、Cancer Res. 62巻 (2002年) 7124〜7129頁）。
【０００８】
近年、アンギオポエチン-1、および／またはアンギオポエチン2、および／またはTie-2は抗がん療法の標的となる可能性のあることが提案されている。例えばアメリカ合衆国特許第6,166,185号、アメリカ合衆国特許第5,650,490号、アメリカ合衆国特許第5,814,464号のそれぞれには、抗Tie-2リガンドと抗Tie-2受容体の抗体が開示されている。可溶性Tie-2を用いた研究において、囓歯類で腫瘍の数とサイズの低下が報告された（Lin, P、1997; Lin, P.、1998）。Siemester, G.ら (1999年)は、Tie-2の細胞外ドメインを発現するヒト黒色腫細胞系を作り出してそれをヌード・マウスの中に注入し、可溶性Tie-2が腫瘍の増殖と血管新生を有意に抑制することを報告した。アンギオポエチン-1とアンギオポエチン2の両方ともTie-2に結合するため、アンギオポエチン-1、アンギオポエチン2、Tie-2のいずれかが抗がん療法の魅力的な標的となるかどうかをこれらの研究から明確にすることはできない。しかし効果的な抗アンギオポエチン2療法は、疾患の進行が異常な血管新生に依存するがんなどの疾患の治療に利点をもたらすと考えられており、がんでそのプロセスを阻止すると、疾患の進行を止められる可能性がある（Folkman, J.、Nature Medicine. 第1巻、(1995年) 27〜31頁）。
【０００９】
それに加え、いくつかのグループがアンギオポエチン2に結合する抗体とペプチドの利用を報告している。例えばアメリカ合衆国特許第6,166,185号、アメリカ合衆国特許出願公開第2003/10124129号. WO 03/030833、WO 2006/068953、WO 03/057134、アメリカ合衆国特許出願公開第2006/0122370号を参照のこと。
【００１０】
病巣でのアンギオポエチン2発現の効果に関する研究から、アンギオポエチン-1／Tie-2シグナルの拮抗によって緊密な血管構造が緩み、そのことによってECが血管新生誘導因子（例えばVEGF）からの活性化シグナルに曝されることがわかった（Hanahan、1997）。アンギオポエチン-1の抑制から生じるこの血管新生促進効果は、抗アンギオポエチン-1療法が有効な抗がん療法にはならないであろうことを示している。
【００１１】
ANG-2は、成長中に血管のリモデリングが起こっている部位で発現する。Maisonpierre, P.C.他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁。成人では、ANG-2の発現は、血管リモデリングの部位と、高度に血管が発達した腫瘍に限られる。腫瘍の中には、グリオーム（Osada, H.他、Int. J. Oncol. 第18巻 (2001年) 305〜309頁；Koga, K.他、Cancer Res. 第61巻 (2001年) 6248〜6254頁）、肝細胞がん（Tanaka, S.他、J. Clin. Invest. 第103巻 (1999年) 341〜345頁）、胃がん（Etoh, T.他、Cancer Res. 第61巻 (2001年) 2145〜2153頁；Lee, J.H.他、Int. J. Oncol. 第18巻 (2001年) 355〜361頁）、甲状腺腫瘍（Bunone, G.他、Am. J. Pathol 第155巻 (1999年) 1967〜1976頁）、非小細胞肺がん（Wong, M. P.他、Lung Cancer 第29巻 (2000年) 11〜22頁）、大腸がん（Ahmad, S.A.他、Cancer 第92巻 (2001年) 1138〜1143頁）前立腺がん（Wurmbach, J.H.他、Anticancer Res. 第20巻 (2000年) 5217〜5220頁）が含まれる。ANG-2を発現する腫瘍細胞がいくつか見いだされている。例えばTanaka, S.ら（J. Clin. Invest. 第103巻 (1999年) 341〜345頁）は、ヒト肝細胞がん（HCC）のサンプル12個のうちの10個でANG-2 mRNAを検出した。Ellisのグループは、ANG-2 が上皮腫瘍にあまねく発現していることを報告した。Ahmad, S. A.他、Cancer 第92巻 (2001年) 1138〜1143頁。他の研究者たちも同様の発見を報告した。Chen, L.他、J. Tongji Med. Univ. 第21巻 (2001年) 228〜230頁、235頁 (2001年)。アーカイブ化されているヒト乳がんサンプルにおけるANG-2 mRNAのレベルを検出することにより、Sfilogoi, C.ら（Int. J. Cancer 第103巻 (2003年) 466〜474頁）は、ANG-2 mRNAが、二次リンパ節侵入、無疾患時間の短さ、全体的な生存率の低さと有意に関係していることを報告した。Tanaka, F.ら（Cancer Res. 第62巻 (2002年) 7124〜7129頁）は、ステージ-I〜ステージ-IIIAの非小細胞肺がん（NSCLC）の患者合計236人についてまとめている。彼らは免疫組織化学を利用し、NSCLC患者の13.9％でANG-2が陽性であることを見いだした。ANG-2陽性腫瘍の微小血管の密度は、ANG-2陰性腫瘍よりも有意に大きい。ANG-2のこのような血管新生効果は、VEGFの発現が大きいときにだけ見られる。さらに、ANG-2の陽性発現は、手術後の生存率が低いことを予測するための1つの重要な因子であった。Tanaka, F.他、Cancer Res. 第62巻 (2002年) 7124〜7129頁。しかし彼らは、ANG-2の発現と微小血管の密度の間に有意な相関を見いだしていない。Tanaka, F.他、Cancer Res. 第62巻 (2002年) 7124〜7129頁。これらの結果は、AHG-2が、いくつかのタイプのがんで患者の悪い予後の1つの指標であることを示唆している。
【００１２】
最近、Yancopoulosのグループは、ANG-2ノックアウト・マウス・モデルを用い、AHG-2が誕生後の血管新生に必要であることを報告した。Gale, N. W.他、Dev. Cell 第3巻 (2002年) 411〜423頁。彼らは、目で発生学的にプログラムされている硝子様血管系の退縮がANG-2ノックアウト・マウスで起こらず、そのマウスの網膜の血管は中心網膜動脈からは出現しないことを示した。Gale, N. W.他、Dev. Cell 第3巻 (2002年) 411〜423頁。彼らは、ANG-2の欠失によってリンパ血管系のパターニングと機能に大きな欠陥が生じることも見いだした。Gale, N. W.他、Dev. Cell 第3巻 (2002年) 411〜423頁。ANG-1を用いた遺伝子レスキューによってリンパ血管系は補正されるが、血管新生の欠陥は補正されない。Gale, N. W.他、Dev. Cell 第3巻 (2002年) 411〜423頁。
【００１３】
Petersとその同僚は、可溶性Tie2を組み換えタンパク質として供給するか、ウイルス発現ベクターに入れて供給すると、マウス・モデルにおいてマウスの乳がんと黒色腫の生体内増殖を抑制することを報告した。Lin, P.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第95巻 (1998年) 8829〜8834頁；Lin, P.他、J. Clin. Invest. 第100巻 (1997年) 2072〜2078頁。このような処理をした腫瘍組織における血管の密度は、大いに低下した。それに加え、可溶性Tie2は、腫瘍細胞で条件づけた培地を用いて刺激したラットの角膜において血管新生を阻止した。Lin, P.他、J. Clin. Invest. 第100巻 (1997年) 2072〜2078頁。さらに、Isnerと彼のチームは、VEGFにANG-2を添加すると、VEGF単独の場合よりも周囲の新生血管形成が有意に長く、かつ多くなるのを促進することを証明した。Asahara, T.他、Circ. Res.、第83巻 (1998年) 233〜240頁。過剰な可溶性Tie2受容体は、ANG-2によるVEGF誘導新生血管形成の変化を阻止した。Asahara, T.他、Circ. Res.、第83巻 (1998年) 233〜240頁。Siemeister, G.ら（Cancer Res. 第59巻 (1999年) 3185〜3191頁）は、ヌード・マウス異種移植片を用い、その異種移植片の中でFlt-1またはTie2の細胞外リガンド結合領域が過剰発現することで経路の有意な抑制が起こるが、それを他方が補償することはできないことを示した。これは、VEGF受容体経路とTie2経路を、生体内血管新生プロセスにとって不可欠な2つの独立なメディエータと見なすべきであることを示唆している。Siemeister, G.他、Cancer Res. 第59巻 (1999年) 3185〜3191頁。これは、White, R.R.ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第100巻 (2003年) 5028〜5033頁）のより最近の論文で証明されている。彼らの研究では、ANG-2に特異的に結合してANG-2を抑制するヌクレアーゼ抵抗性RNAアプタマーが、ラット角膜マイクロポケット血管新生モデルにおいて、bFGFによって誘導される新生血管形成を有意に抑制することが証明された。
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要
本発明は、ヒト・アンギオポエチン-2に特異的に結合する抗体であって、重鎖可変領域CDR3領域として、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、配列番号49いずれかのCDR3領域を含むことを特徴とする抗体を含んでいる。
【００１５】
この抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、配列番号49いずれかのCDR3領域と、配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34、配列番号42、配列番号50いずれかのCDR2領域と、配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35、配列番号43、配列番号51いずれかのCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36、配列番号44、配列番号52いずれかのCDR3領域と、配列番号5、配列番号13、配列番号21、配列番号29、配列番号37、配列番号45、配列番号53いずれかのCDR2領域と、配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38、配列番号46、配列番号54いずれかのCDR1領域を含むことを特徴とすることが好ましい。
【００１６】
抗体は、
a）配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号55いずれかの重鎖可変領域と、
b）配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40、配列番号48、配列番号56いずれかの軽鎖可変領域を含むことを特徴とすることが好ましい。
【００１７】
好ましくは、抗体は、アンギオポエチン-1（ANG-1）に特異的に結合しないことを特徴とする。
【００１８】
本発明の更なる実施態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物である。
【００１９】
本発明の更なる実施態様は、本発明の抗体を利用した医薬組成物の製造である。
【００２０】
本発明の更なる実施態様は、転移の抑制ための本発明の抗体の使用である。
【００２１】
本発明の更なる実施態様は、がんの治療のための本発明の抗体の使用である。
【００２２】
本発明の更なる実施態様は、血管性疾患の治療のための本発明の抗体の使用である。
【００２３】
本発明の更なる実施態様は、網膜症の治療のための本発明の抗体の使用である。
【００２４】
本発明の更なる実施態様は、本発明による抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸である。
【００２５】
本発明は、さらに、本発明の核酸を含み、その核酸を原核宿主細胞または真核宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターと、そのような抗体を組み換え産生させるためのそのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞を含んでいる。
【００２７】
本発明はさらに、本発明の組み換えヒト抗体または組み換えヒト化抗体を製造する方法であって、本発明の核酸を原核宿主細胞または真核宿主細胞で発現させ、その細胞または細胞培養物の上清からその抗体を回収することを特徴とする方法を含む。本発明はさらに、このような組み換え法によって得ることのできる抗体を含む。
【００２８】
本発明による抗体は、続発腫瘍／転移の抑制、または血管性疾患、例えば網膜症の治療に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】一過性発現用IgGの発現ベクターへのクローニング：A）Ang2i-LC06（図1A）。
【図１Ｂ】一過性発現用IgGの発現ベクターへのクローニング：B）Ang2k-LC08（図1B）。
【図２】精製した抗ANG-2抗体であるAng2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08のSDS-PAGEゲル。
【図３】アンギオポエチン-Tie2相互作用ELISA。
【図４】Ang2i-LC06とAng2k-LC08によるTie2へのANG-2の結合の抑制。
【図５】Ang2i-LC06とAng2k-LC08によるTie2へのANG-1の結合の抑制。
【図６】生体内における抗ANG-2抗体の効果を調べるためのClo205異種移植片モデル。
【図７】生体内における抗ANG-2抗体の効果を調べるためのKPL-4異種移植片モデル。
【図８】Biacoreを通じたANG-1の結合のセンソグラム。
【図９Ａ】原発大腸腫瘍異種移植片（9A）における本発明の抗体による肺転移／続発腫瘍の抑制。
【図９Ｂ】原発乳房腫瘍異種移植片（9B）における本発明の抗体による肺転移／続発腫瘍の抑制。
【図１０Ａ】本発明の抗体による網膜症の抑制。
【図１０Ｂ】本発明の抗体による網膜症の抑制。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合する抗体であって、重鎖可変領域として、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、配列番号49いずれかのCDR3領域を含むことを特徴とする抗体を含んでいる。
【００３１】
本発明の一実施態様では、抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、配列番号49いずれかのCDR3領域と、配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34、配列番号42、配列番号50いずれかのCDR2領域と、配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35、配列番号43、配列番号51いずれかのCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36、配列番号44、配列番号52いずれかのCDR3領域と、配列番号5、配列番号13、配列番号21、配列番号29、配列番号37、配列番号45、配列番号53いずれかのCDR2領域と、配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38、配列番号46、配列番号54いずれかのCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００３２】
抗体は、
a）配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号55いずれかの重鎖可変領域と、
b）配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40、配列番号48、配列番号56いずれかの軽鎖可変領域を含むことを特徴とすることが好ましい。
【００３３】
本発明の別の一実施態様は、ヒトANG-2に特異的に結合するが、ヒト・アンギオポエチン-1（ANG-1）には特異的に結合しないことを特徴とする抗体である。ヒトANG-2に特異的に結合するがヒトANG-1には特異的に結合しない典型的な抗体は、例えば、Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i_LC07のほか、Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i_LC07、Ang2i_LC10と同じエピトープに結合する抗体（Ang2i_LC06と同じエピトープに結合する抗体が好ましい）である。したがって本発明の一実施態様では、ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合するがヒトANG-1には特異的に結合しない抗体は、Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i_LC07、Ang2i_LC10と同じエピトープに結合する（Ang2i_LC06と同じエピトープに結合することが好ましい）。ANG-2に特異的に結合するがANG-1には特異的に結合しないこのような抗体は、ANG-2特異的抗体およびANG-1特異的抗体と比べて改善された特性（例えば効果、より少ない毒性、薬理動態特性）を持つことができる。
【００３４】
したがって本発明の一実施態様では、ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合するがヒトANG-1には特異的に結合しない抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1、配列番号9、配列番号25、配列番号33、配列番号49いずれかのCDR3領域と、配列番号2、配列番号10、配列番号26、配列番号34、配列番号50いずれかのCDR2領域と、配列番号3、配列番号11、配列番号27、配列番号35、配列番号51いずれかのCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号12、配列番号28、配列番号36、配列番号52いずれかのCDR3領域と、配列番号5、配列番号13、配列番号29、配列番号37、配列番号53いずれかのCDR2領域と、配列番号6、配列番号14、配列番号30、配列番号38、配列番号54いずれかのCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００３５】
ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合するがヒトANG-1には特異的に結合しないこのような抗体は、
a）配列番号7、配列番号15、配列番号31、配列番号39、配列番号55の重鎖可変領域と、
b）配列番号8、配列番号16、配列番号32、配列番号40、配列番号56の軽鎖可変領域を含むことを特徴とすることが好ましい。
【００３６】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1または配列番号9のCDR3領域と、配列番号2または配列番号10のCDR2領域と、配列番号3または配列番号11のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4または配列番号12のCDR3領域と、配列番号5または配列番号13のCDR2領域と、配列番号6、配列番号14のCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００３７】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）配列番号7または配列番号15の重鎖可変領域と、
b）配列番号8または配列番号16の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。
【００３８】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1のCDR3領域と、配列番号2のCDR2領域と、配列番号3のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4のCDR3領域と、配列番号5のCDR2領域と、配列番号6のCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００３９】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）配列番号7の重鎖可変領域と、
b）配列番号8の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。
【００４０】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号17のCDR3領域と、配列番号18のCDR2領域と、配列番号19のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号20のCDR3領域と、配列番号21のCDR2領域と、配列番号22のCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００４１】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）配列番号23の重鎖可変領域と、
b）配列番号24の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。
【００４２】
本発明による抗体は、ヒトIgG1サブクラスの抗体、またはヒトIgG4サブクラスの抗体であることを特徴とすることが好ましい。
【００４３】
“抗体”という用語には、抗体全体や抗体フラグメントに限らず、さまざまな形態の抗体構造が含まれる。本発明による抗体はヒト化抗体やキメラ抗体であることが好ましく、本発明の特性が維持される限りはさらに遺伝子操作された抗体であることも好ましい。
【００４４】
“抗体フラグメント”には、完全長の抗体の一部（その可変領域であることが好ましい）、またはその抗体の少なくとも抗原結合部位が含まれる。抗体フラグメントの例として、抗体フラグメントから形成される二重特異性抗体、一本鎖抗体分子（scFvまたはscFab）、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）がある。scFv抗体は、例えばHouston, J. S.、Methods in Enzymol. 第203巻 (1991年) 46〜88頁に記載されている。それに加え、抗体フラグメントは、VH領域の特性（すなわちVL領域と組み合わさることができる）またはANG-2に結合するVL領域の特性（すなわちVH領域と組み合わさって機能的抗原部位となり、そのことによってその特性を提供する）を持つ一本鎖ポリペプチドを含んでいる。SvFvsは、例えばa）ジスルフィド安定化（例えばWO 94/029350、Rajagopal, V.他、Prot. Engin.、第10巻 (1997年) 1453〜1459頁；Kobayashi, H.他、Nuclear Medicine & Biology、第25巻、(1998年) 387〜393頁；Schmidt, M.他、Oncogene (1999年) 第18巻 1711〜1721頁を参照）、またはb）安定化されたフレームワーク（例えばWO 2007/109254の特異的突然変異による；特異的な安定化されたフレームワークに関しては、例えばアメリカ合衆国特許第7,258,985号、Furrer, F.他、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 第50巻 (2009年)、 771〜778頁、Ottiger, M.他、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 第50巻 (2009年)、779〜786頁を参照）を利用して安定化させることができる。
【００４５】
本明細書では、“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”という用語は、単一アミノ酸組成物の抗体分子の調製物を表わす。
【００４６】
“キメラ抗体”という用語は、1つの供給源または種からの可変領域（すなわち結合領域）と、異なる供給源または種からの定常領域の少なくとも一部とを含んでいて、通常は組み換えDNA技術によって調製される抗体を意味する。マウス可変領域とヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に含まれる“キメラ抗体”の他の好ましい形態は、本発明の特性を生み出すよう、特にC1qへの結合および／またはFc受容体（FcR）への結合に関して定常領域が元の抗体から改変されるか変えられたものである。このようなキメラ抗体は、“クラス・スイッチ”抗体とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリンの可変領域をコードするDNAセグメントと、免疫グロブリンの定常領域をコードするDNAセグメントとを含む発現した免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体の製造法には従来の組み換えDNA技術が含まれ、遺伝子トランスフェクション技術が従来からよく知られている。例えばMorrison, S.L.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第81巻 (1984年) 6851〜6855頁；アメリカ合衆国特許第5,202,238号、アメリカ合衆国特許第5,204,244号を参照のこと。
【００４７】
“ヒト化抗体”という用語は、フレームワークまたは“相補性決定領域”（CDR）が改変されて、親となる免疫グロブリンとは特異性が異なる免疫グロブリンのCDRを含むようにされた抗体を表わす。好ましい一実施態様では、マウスCDRがヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされて“ヒト化抗体”が調製される。例えばRiechmann, L.他、Nature 第332巻 (1988年) 323〜327頁；Neuberger, M.S.他、Nature 第314巻 (1985年) 268〜270頁を参照のこと。特に好ましいCDRは、上記の抗原を認識する配列を表わすキメラ抗体用CDRに対応する。本発明に含まれる他の形態の“ヒト化抗体”は、本発明の特性を生み出すよう、特にC1qへの結合および／またはFc受容体（FcR）への結合に関して定常領域が元の抗体の定常領域からさらに改変されるか変えられたものである。
【００４８】
本明細書では、“ヒト抗体”という用語に、ヒト遺伝子系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有する抗体が含まれるものとする。ヒト抗体は従来からよく知られている（van Dijk, M.A.とvan de Winkel, J.G.、Curr. Opin. Chem. Biol. 第5巻 (2001年) 368〜374頁）。ヒト抗体は、免疫化したときに内在性免疫グロブリンの産生がない状態でヒト抗体の完全なレパートリーまたは一連のヒト抗体の産生が可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）の中で産生させることもできる。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列突然変異マウスに移すと、抗原を用いたチャレンジによりヒト抗体が産生されるであろう（例えばJakobovits, A.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第90巻 (1993年) 2551〜2555頁；Jakobovits, A.他、Nature 362巻 (1993年) 255〜258頁；Brueggemann, M.他、Year Immunol. 第7巻 (1993年) 33〜40頁を参照）。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリの中で産生させることもできる（Hoogenboom, H. R.とWinter, G.、J. Mol. Biol. 第227巻 (1992年) 381〜388頁；Marks, J.D.他、J. Mol. Biol. 第222巻 (1991年) 581〜597頁）。Cole, S.P.C.らとBoerner, P.らの技術もヒト・モノクローナル抗体の調製に利用できる（Cole, S.P.C.他、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Liss, A.R.、(1985年) 77〜96頁；Boerner, P.他、J. Immunol. 第147巻 (1991年) 86〜95頁）。本発明によるキメラ抗体とヒト化抗体に関してすでに述べたように、本明細書では、“ヒト抗体”という用語に、本発明の特性を生み出すよう、特にC1qへの結合および／またはFc受容体（FcR）への結合に関して定常領域が例えばFc部の“クラス・スイッチ”、すなわち変化または突然変異（例えばIgG1からIgG4へ、および／またはIgG1/IgG4突然変異）によって改変された抗体も含まれる。
【００４９】
本明細書では、“組み換えヒト抗体”という用語は、組み換え手段によって調製、発現、創出、単離されたあらゆるヒト抗体を含むものとし、例えばNS0細胞やCHO細胞といった宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリンにとってのトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離された抗体や、宿主細胞にトランスフェクトした組み換え発現ベクターを用いて発現させた抗体が挙げられる。このような組み換えヒト抗体は、再構成された形態の可変領域と定常領域を有する。本発明の組み換えヒト抗体は、生体内で体細胞高頻度突然変異を受けている。したがって組み換え抗体のVH領域とVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列とVL配列に由来していてこれら配列と関係しているとはいえ、生体内のヒト抗体生殖系列レパートリーの中に天然には存在していない可能性のある配列である。
【００５０】
本明細書では、“可変領域”（軽鎖（VL）の可変領域、重鎖（VH）の可変領域）という用語は、抗原に対する抗体の結合に直接関与する軽鎖領域と重鎖領域のペアのそれぞれを表わす。軽鎖領域と重鎖領域は一般的な構造が同じであり、各領域は、配列が広く保存されていて3つの“超可変領域”（または相補性決定領域、CDR）によって接続された4つのフレームワーク（FR）領域を含んでいる。フレームワーク領域はβ-シートのコンホメーションを採用しているため、CDRはそのβ-シート構造を接続するループを形成できる。各鎖のCDRはフレームワーク領域によって三次元構造に維持され、他の鎖からのCDRと合わさって抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖と軽鎖のCDR3領域は、本発明による抗体の結合特異性／アフィニティにおいて特に重要な役割を果たすため、本発明のさらに別の目的を提供する。
【００５１】
本明細書では、“抗体の抗原結合部”という用語は、抗体のうちで抗原の結合にとって重要なアミノ酸残基を表わす。抗体の抗原結合部は、“相補性決定領域”すなわち“CDR”からのアミノ酸残基を含んでいる。“フレームワーク”または“FR”領域は、本明細書に規定した超可変領域の残基とは異なる可変領域である。したがって抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、N末端からC末端に向けて、領域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4を含んでいる。特に重鎖のCDR3は抗原の結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を規定する。CDR領域とFR領域は、Kabat, E.A.らの『免疫学的に興味のあるタンパク質の配列』（第5版、公衆衛生サービス、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、1991年）の標準的な定義、および／または“超可変ループ”からの残基に従って決定される。
【００５２】
本明細書では、“核酸”または“核酸分子”という用語にDNA分子とRNA分子が含まれるものとする。核酸分子は一重鎖または二重鎖が可能だが、二重鎖DNAが好ましい。
【００５３】
本明細書では、“アミノ酸”という用語は天然のカルボキシα-アミノ酸のグループを表わし、その中には、アラニン（三文字コード：ala、一文字コード：A）、アルギニン（arg、R）、アスパラギン（asn、N）、アスパラギン酸（asp、D）、システイン（cys、C）、グルタミン（gln、Q）、グルタミン酸（glu、E）、グリシン（gly、G）、ヒスチジン（his、H）、イソロイシン（ile、I）、ロイシン（leu、L）、リシン（lys、K）、メチオニン（met、M）、フェニルアラニン（phe、F）、プロリン（pro、P）、セリン（ser、S）、トレオニン（thr、T）、トリプトファン（trp、W）、チロシン（tyr、Y）、バリン（val、V）が含まれる。
【００５４】
核酸は、別の核酸と機能関係にされるとき“機能可能にリンクされている”。例えばプレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、そのポリペプチドのためのDNAに機能可能にリンクされている。プロモータまたはエンハンサは、コード配列の転写に影響を与える場合に、そのコード配列に機能可能にリンクされている。リボソーム結合部位は、翻訳を容易にする位置にある場合に、機能可能にリンクされている。一般に、“機能可能にリンクされている”は、リンクされるDNA配列が同一直線上にあり、分泌リーダーの場合には連続していて読み取り枠の中にあることを意味する。しかしエンハンサは連続している必要はない。リンクは、都合のよい制限部位での連結によって実現する。そのような部位が存在しない場合には、従来からの方式に従って合成オリゴヌクレオチドからなるアドプターまたはリンカーを利用する。
【００５５】
本明細書では、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”という用語は同じ意味で用いられ、そのどれにも子孫が含まれる。したがって“形質転換体”と“形質転換された細胞”という用語には、対象となる主要な細胞と、転移回数に関係なくその細胞に由来する培養物が含まれる。また、意図的な突然変異または予期しない突然変異のため、すべての子孫のDNAの内容が正確に同じではない可能性があると理解する。元になる形質転換された細胞におけるのと機能または生物学的活性が同じものがスクリーニングされた子孫変異体が含まれる。
【００５６】
本明細書では、“結合”または“特異的な結合”という表現は、インビトロ・アッセイにおいて抗原（ANG-2）のエピトープに抗体が結合することを表わす。アッセイは、野生型ANG-2抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore、GE-ヘルスケア社、ウプサラ、スウェーデン国）（実施例3）が好ましい。結合のアフィニティは、ka（抗体／抗原複合体からの抗体の会合速度定数）、kD（解離定数）、KD（kD/ka）によって定義される。結合または特異的な結合は、10-8モル／リットル以下の結合アフィニティ（KD）を意味し、この値は10-9M〜10-13モル／リットルであることが好ましい。
【００５７】
FcγRIIIへの抗体の結合は、BIAcoreアッセイ（GE-ヘルスケア社、ウプサラ、スウェーデン国）によって調べることができる。結合のアフィニティは、ka（抗体／抗原複合体からの抗体の会合速度定数）、kD（解離定数）、KD（kD/ka）によって定義される。
【００５８】
本明細書では、“ANG-1に結合しない”または“ANG-1に特異的には結合しない”という表現は、（実施例2によれば）インビトロANG-1結合ELISAアッセイにおいて抗体のEC50値が8000ng/mlよりも大きいことを表わす。
【００５９】
“エピトープ”という用語には、抗体に特異的に結合できるあらゆるポリペプチド決定基が含まれる。いくつかの実施態様では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面基（例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、スルホニル）を含んでおり、いくつかの実施態様では、特異的な三次元構造特性および／または特異的電荷特性を持つことができる。エピトープは、抗原のうちで抗体が結合する領域である。
【００６０】
抗体の“Fc部”は、抗原に対する抗体の結合には直接関与しないが、さまざまなエフェクタ機能を示す。“抗体のFc部”は当業者によく知られた用語であり、パパインによる抗体の開裂に基づいて定義される。抗体または免疫グロブリンは、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列によってIgA、IgD、IgE、IgG、IgMというクラスに分けられ、そのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分けることができる（例えばIgGlとIgG2とIgG3とIgG4や、IgAlとIgA2）。免疫グロブリンの異なるクラスは、重鎖定常領域に応じてそれぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる。抗体のFc部は、補体の活性化、C1qへの結合、Fc受容体への結合に基づいてADCC（抗体依存性細胞傷害）とCDC（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（CDC）は、補体因子C1qがIgG抗体のほとんどのサブクラスに結合することによって開始される。補体系への抗体の影響はいくつかの条件に依存するが、C1qへの結合は、Fc部の決められた結合部位によって起こる。そのような結合部位は従来から知られており、例えばBoakle, R. J.他、Nature 第282巻 (1975年) 742〜743頁；Lukas, T.J.他、J. Immunol. 第127巻 (1981年) 2555〜2560頁；Brunhouse, R.とCebra, J.J.、Mol. Immunol. 第16巻 (1979年) 907〜917頁；Burton, D.R.他、Nature 第288巻 (1980年) 338〜344頁；Thommesen, J.E.他、Mol. Immunol. 第37巻 (2000年) 995〜1004頁；Idusogie, E.E.他、J. Immunol.、第164巻 (2000年) 4178〜4184頁；Hezareh, M.他、J. Virology 第75巻 (2001年) 12161〜12168頁；Morgan, A.他、Immunology 第86巻 (1995年) 319〜324頁；ヨーロッパ特許第0307434号に記載されている。このような結合部位は、例えばL234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、P329である（KabatのEUインデックスに従う番号、下記参照）。サブクラスIgGl、IgG2、IgG3の抗体は、通常、補体活性化と、C1qおよびC3への結合を示すのに対し、IgG4の抗体は補体系を活性化せず、C1qとC3に結合しない。
【００６１】
本発明による抗体は、ヒト起源のFc部を含むことが好ましい。これは、サブクラスIgG1のヒト抗体のFc部である。
【００６２】
本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴としている。そのような定常鎖は従来からよく知られており、例えばKabat, E.A.が記載している（例えばJohnson, G.とWu, T. T.、Nucleic Acids Res. 第28巻 (2000年) 214〜218頁を参照のこと）。有用なヒト重鎖定常領域は、例えば配列番号57または配列番号58のアミノ酸配列を含んでいる。有用なヒト軽鎖定常領域は、例えば、配列番号59のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列、または配列番号60のλ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含んでいる。
【００６３】
本明細書では、“定常領域”という用語は、抗体のうちで可変領域以外の領域の合計を表わす。定常領域は抗原の結合に直接は関与しないが、さまざまなエフェクタ機能を示す。抗体は、その重鎖定常領域のアミノ酸配列によって IgA、IgD、IgE、IgG、IgMというクラスに分けられ、そのうちのいくつかはさらに、IgGlとIgG2とIgG3とIgG4や、IgAlとIgA2というサブクラスに分けられる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる。5つのクラスの抗体すべてに見られる軽鎖定常領域は、κ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる。
【００６４】
本明細書では、“ヒト起源の定常領域”という表現は、サブクラスIgGl、IgG2、IgG3、IgG4いずれかのヒト抗体の重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域κを表わす。このような定常領域は従来からよく知られており、例えばKabat, E.A.が記載している（Johnson, G.とWu, T.T.、Nucleic Acids Res. 第28巻 (2000年) 214〜218頁；Kabat, E.A.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第72巻 (1975年) 2785〜2788頁）。
【００６５】
IgG4サブクラスの抗体はFc受容体（FcγRIIIa）への結合が低下しているが、他のIgGサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかしPro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc炭化水素の喪失）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、His435は、変化した場合にやはりFc受容体への結合が低下する残基である（Shields, R.L.他、J. Biol. Chem. 第276巻 (2001年) 6591〜6604頁；Lund, J.他、FASEB J. 第9巻 (1995年) 115〜119頁；Morgan, A.他、Immunology 第86巻 (1995年) 319〜324頁；ヨーロッパ特許第0 307 434号）。
【００６６】
一実施態様では、本発明の抗体はIgG1抗体と比べてFcRへの結合が低下しており、単一特異性二価親抗体は、IgG4サブクラスのFcRへの結合、またはIgG1、IgG2サブクラスのFcRへの結合に関してS228、および／またはL234、および／またはL235に突然変異を有する、および／またはPVA236突然変異を含んでいる。一実施態様では、単一特異性二価親抗体における突然変異は、S228P、および／またはL234A、および／またはL235A、および／またはL235E、および／またはPVA236である。別の一実施態様では、単一特異性二価親抗体の突然変異は、IgG4ではS228P、IgG1ではL234AとL235Aである。重鎖定常領域を配列番号57と配列番号58に示してある。一実施態様では、単一特異性二価親抗体の重鎖定常領域は、突然変異L234AとL235Aを有する配列番号57である。一実施態様では、単一特異性二価親抗体の重鎖定常領域は、突然変異S228Pを有する配列番号58である。別の一実施態様では、単一特異性二価親抗体の軽鎖定常領域は、配列番号59のカッパ軽鎖領域、または配列番号60のラムダ軽鎖定常領域である。本発明の一実施態様では、単一特異性二価親抗体の重鎖定常領域は、突然変異S228Pを有する配列番号57または配列番号58である。
【００６７】
抗体の定常領域は、ADCC（抗体依存性細胞傷害）とCDC（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（CDC）は、補体因子C1qがたいていのIgG抗体サブクラスの定常領域に結合することによって開始される。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位における特定のタンパク質-タンパク質相互作用によって起こる。このような定常領域結合部位は従来から知られており、例えばLukas, T.J.他、J. Immunol. 第127巻 (1981年) 2555〜2560頁；Brunhouse, R.と Cebra, JJ.、Mol. Immunol. 第16巻 (1979年) 907〜917頁；Burton, D.R.他、Nature 第288巻 (1980年) 338〜344頁；Thommesen, J.E.他、Mol. Immunol. 第37巻 (2000年) 995〜1004頁；Idusogie, E.E.他、J. Immunol. 第164巻 (2000年) 4178〜4184頁；Hezareh, M.他、J. Virol. 第75巻 (2001年) 12161〜12168頁；Morgan, A.他、Immunology 第86巻 (1995年) 319〜324頁；ヨーロッパ特許第0 307 434号に記載されている。このような定常領域結合部位は、例えばアミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、P329を特徴とする（KabatのEUインデックスに従う番号）。
【００６８】
“抗体依存性細胞傷害（ADCC）”という用語は、エフェクタ細胞の存在下での本発明の抗体によるヒト標的細胞の溶解を表わす。ADCCは、エフェクタ細胞（例えば単離したばかりのPBMCや、軟層から精製したエフェクタ細胞（例えば単球、ナチュラル・キラー（NK）細胞、永続的に増殖しているNK細胞系など））の存在下で、CCR5を発現する細胞の調製物を本発明の抗体で処理することによって測定されることが好ましい。
【００６９】
“補体依存性細胞傷害（CDC）”という用語は、たいていのIgG抗体サブクラスのFc部への補体因子C1qの結合によって開始されるプロセスを表わす。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位における特定のタンパク質-タンパク質相互作用によって起こる。このようなFc部結合部位は従来から知られている（上記参照）。このようなFc部結合部位は、例えばアミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、P329を特徴とする（KabatのEUインデックスに従う番号）。サブクラスIgGl、IgG2、IgG3の抗体は、通常、C1qおよびC3への結合が含まれていて補体活性化を示すのに対し、IgG4は補体系を活性化せず、C1qおよび／またはC3に結合しない。
【００７０】
本発明による抗体は、組み換え手段によって産生される。したがって本発明の1つの特徴は、本発明の抗体をコードしている核酸であり、別の特徴は、本発明の抗体をコードしているその核酸を含む細胞である。組み換え産生のための方法は従来から広く知られており、原核細胞と真核細胞の中でタンパク質を発現させた後、抗体を単離し、通常は精製して薬理学的に許容可能な純度にする操作を含んでいる。上記の抗体を宿主細胞の中で発現させるため、改変された軽鎖と重鎖をそれぞれコードする核酸を標準的な方法で発現ベクターの中に挿入する。発現は、適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞（例えばCFO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、大腸菌細胞）の中で行なわせ、抗体をその細胞（上清、または溶解後の細胞）から回収する。抗体を組み換え産生させるための一般的な方法は従来からよく知られており、例えばMakrides, S.C.、Protein Expr. Purif. 第17巻 (1999年) 183〜202頁；Geisse, S.他、Protein Expr. Purif. 第8巻 (1996年) 271〜282頁；Kaufman, R.J.、Mol. Biotechnol. 第16巻 (2000年) 151〜161頁；Werner, R.G.、J. Drug Res. 第48巻 (1998年) 870〜880頁の概説論文に記載されている。
【００７１】
本発明の抗体は、通常の免疫グロブリン精製手続き（例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、アフィニティ・クロマトグラフィ）によって培地からうまく分離される。モノクローナル抗体をコードしているDNAとRNAは容易に単離され、一般的な手続きを利用してシークエンシングする。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAとRNAの供給源として役立つ可能性がある。DNAは、単離されると、発現ベクターに挿入することができる。次にその発現ベクターを宿主細胞（例えば別の場合に免疫グロブリン・タンパク質を産生しないHEK293細胞、CHO細胞、ミエローマ細胞）にトランスフェクトしてその宿主細胞の中で組み換えモノクローナル抗体を合成させる。
【００７２】
本発明による抗体のアミノ酸配列の変異体（または突然変異体）は、適切なヌクレオチドの変更を抗体のDNAに導入することによって、またはヌクレオチドの合成によって調製される。しかしこのような改変は、例えば上に説明したように非常に限られた範囲でしか実行できない。例えば改変によって抗体の上記の特性（例えばIgGのアイソタイプ、抗原の結合）は変化しないが、組み換え産生の収率、タンパク質の安定性、精製の容易さが改善される可能性がある。
【００７３】
本明細書で用いる“宿主細胞”という用語は、本発明の抗体を産生するように操作できるあらゆる種類の細胞系を表わす。一実施態様では、HEK293細胞とCHO細胞を宿主細胞として用いる。本明細書では、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”という表現は同じ意味で用いられ、そのどれにも子孫が含まれる。したがって“形質転換体”と“形質転換された細胞”という用語には、対象となる主要な細胞と、転移回数に関係なくその細胞に由来する培養物が含まれる。また、意図的な突然変異または予期しない突然変異のため、すべての子孫のDNAの内容が正確に同じではない可能性があると理解する。元になる形質転換された細胞におけるのと機能または生物学的活性が同じものがスクリーニングされた子孫変異体が含まれる。
【００７４】
NS0細胞における発現は、例えばBarnes, L.M.他、Cytotechnology 第32巻 (2000年) 109〜123頁；Barnes, L.M.他、Biotech. Bioeng. 第73巻 (2001年) 261〜270頁に記載されている。一過的発現は、例えばDurocher, Y.他、Nucl. Acids. Res. 第30巻 (2002年) E9頁に記載されている。可変領域のクローニングは、Orlandi, R.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第86巻 (1989年) 3833〜3837頁；Carter, P.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第89巻 (1992年) 4285〜4289頁；Norderhaug, L.他、J. Immunol. Methods 第204巻 (1997年) 77〜87頁に記載されている。好ましい一過的発現系（HEK 293）は、Schlaeger, E.-J.とChristensen, K.、Cytotechnology 第30巻 (1999年) 71〜83頁；Schlaeger, E.-J.、J. Immunol. Methods 第194巻 (1996年) 191〜199頁に記載されている。
【００７５】
例えば原核細胞に適した対照配列は、プロモータと、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位とを含んでいる。真核細胞は、プロモータと、エンハンサと、ポリアデニル化シグナルとを利用することが知られている。
【００７６】
核酸は、他の核酸配列と機能関係にされるときに“機能可能にリンクされている”。例えばプレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、そのポリペプチドのためのDNAに機能可能にリンクされている。プロモータまたはエンハンサは、コード配列の転写に影響を与える場合に、そのコード配列に機能可能にリンクされている。リボソーム結合部位は、翻訳を容易にする位置にある場合に、機能可能にリンクされている。一般に、“機能可能にリンクされている”は、リンクされるDNA配列が連続であり、分泌リーダーの場合には連続で読み取り枠の中にあることを意味する。しかしエンハンサは連続である必要はない。リンクは、都合のよい制限部位での連結によって実現する。そのような部位が存在しない場合には、従来からの方式に従って合成オリゴヌクレオチドからなるアドプターまたはリンカーを利用する。
【００７７】
抗体の精製は、細胞成分または他の汚染物質（例えば他の細胞の核酸やタンパク質）を除去するために標準的な技術（例えば、アルカリ／SDS処理、CsClバンディング、カラム・クロマトグラフィ、アガロース・ゲル電気泳動、従来からよく知られている他の技術）によって実施する。Ausbel, F.他編、『分子生物学の最新プロトコル』（グリーン・パブリッシング・アンド・ワイリー・インターサイエンス社、ニューヨーク、1987年）を参照のこと。タンパク質の精製に関してさまざまな方法がしっかりと確立されて広く使用されている。例えば、微生物のタンパク質を用いたアフィニティ・クロマトグラフィ（プロテインAアフィニティ・クロマトグラフィ、またはプロテインGアフィニティ・クロマトグラフィ）、イオン交換クロマトグラフィ（例えばカチオン交換クロマトグラフィ（カルボキシルメチル樹脂））、アニオン交換クロマトグラフィ（アミノエチル樹脂）、混合モード交換クロマトグラフィ）、イオウ親和性吸着（例えばβ-メルカプトエタノールや他のSHリガンド）、疎水性相互作用クロマトグラフィまたは芳香族吸着クロマトグラフィ（例えばフェニル-セファロース、アザ-アレノ親和性樹脂、m-アミノフェニルボロン酸を使用）、金属キレート・アフィニティ・クロマトグラフィ（例えばNi(II)-アフィニティ材料、Cu(II)-アフィニティ材料を使用）、サイズ排除クロマトグラフィ、電気泳動的方法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）などがある（Vijayalakshmi, M.A.、Appl. Biochem. Biotech. 第75巻 (1998年) 93〜102頁）。
【００７８】
本発明には、治療を必要とする患者の治療法として、その患者に本発明の抗体を治療に有効な量投与することを特徴とする方法が含まれる。
【００７９】
本発明には、本発明の抗体を利用した治療が含まれる。
【００８０】
本発明には、本発明の抗体を利用した転移抑制薬の調製が含まれる。
【００８１】
本発明には、本発明の抗体を利用したがん治療薬の調製が含まれる。
【００８２】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の特徴は、本発明の抗体を利用した医薬組成物の製造である。本発明のさらに別の特徴は、本発明の抗体を含む医薬組成物の製造法である。別の特徴では、本発明により、本発明の抗体を含んでいて医薬用基剤とともに製剤にされた組成物（例えば医薬組成物）が提供される。
【００８３】
本発明の別の1つの特徴は、転移を抑制するための蒸気医薬組成物である。
【００８４】
本発明の別の1つの特徴は、転移を抑制するための本発明による抗体である。
【００８５】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を利用した転移抑制用の薬の製造である。
【００８６】
本発明の別の1つの特徴は、原発がんに苦しむ患者の転移を抑制するため、そのような予防的治療を必要とする患者に本発明の抗体を投与することによる方法である。
【００８７】
われわれは、（腫瘍細胞を腹腔内に注入する実験モデルとは異なり）同所性がんモデルと皮下がんモデルにおいて、生体内の自発的転移／続発腫瘍が非常に効果的に抑制されることを示すことができた（実施例9参照）。これは、細胞が原発腫瘍から拡散して肺や肝臓といった二次臓器（そこに続発腫瘍がある）に転移する臨床状況に近い。
【００８８】
本発明による“転移”という用語は、患者の体内でがん性細胞が原発腫瘍から他の1つ以上の部位に移動し、そこで続発腫瘍が増殖することを表わす。がんが転移したかどうかを明らかにするMetastasMeansが従来から知られており、その中には、骨スキャン、胸部X線、CATスキャン、MRIスキャン、腫瘍マーカー試験が含まれる。
【００８９】
本明細書では、“転移の抑制”または“続発腫瘍の抑制”という用語は同じ意味であり、再発したHER2陽性がんに苦しむ患者における転移に対する予防剤を表わす。このようにして、患者の体内でがん性細胞が原発腫瘍から他の1つ以上の部位にさらに移動するのを抑制するか少なくする。これは、原発腫瘍または原発がんの転移が抑制され、または遅延し、または減少し、したがって続発腫瘍の増殖が抑制され、または遅延し、または減少することを意味する。転移、すなわち肺の続発腫瘍が抑制されるか減少することが好ましい。これは、原発腫瘍から肺へのがん性細胞の転移が抑制されるか減少することを意味する。
【００９０】
本発明の別の1つの特徴は、がんを治療するための上記医薬組成物である。
【００９１】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を利用したがんの治療である。
【００９２】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を利用したがん治療薬の製造である。
【００９３】
本発明の別の1つの特徴は、がんに苦しむ患者を治療するため、そのような治療を必要とする患者に本発明の抗体を投与することによる方法である。
【００９４】
本明細書では、“医薬用基剤”に、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが含まれる。基剤は、（例えば注射や輸液による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、上皮投与に適していることが好ましい。
【００９５】
本発明の組成物は、従来から知られている多彩な方法で投与することができる。当業者であればわかるように、投与経路および／または投与法は、望む結果が何であるかに応じて異なる。本発明の化合物をある投与経路で投与するには、その化合物の不活化を阻止する材料でその化合物を被覆するか、その化合物をその材料とともに投与する必要があろう。例えば本発明の化合物は、適切な基剤（例えばリポソーム）または希釈剤の中に入れて患者に投与するとよい。薬理学的に許容可能な希釈剤として、生理食塩水、水性緩衝溶液などがある。医薬用基剤として、減菌水溶液、減菌分散液や、減菌水溶液または減菌分散液を必要に応じて調製するための殺菌粉末などがある。このような媒体を薬理学的に活性な物質で利用することは従来から知られている。
【００９６】
本明細書では、“非経口投与”と“非経口で投与される”という表現は、腸投与と局所投与以外の投与法を意味し、通常は注射による。例えば、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、硬膜下腔内投与、包内投与、眼窩内投与、心臓内投与、皮内投与、腹腔内投与、経気管投与、皮下投与、表皮下投与、関節内投与、被膜下投与、クモ膜下投与、脊椎内投与、硬膜外投与、胸骨内注射、輸液などがあるが、これだけに限られるわけではない。
【００９７】
本明細書では、がんという用語は増殖性疾患を表わし、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（NSCL）がん、気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または首部のがん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、大腸がん、乳がん、ファロピウス管のがん、子宮内膜のがん、子宮頸部のがん、膣のがん、陰門のがん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎腺がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（CNS）の新生物、脊柱腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平細胞がん、下垂体腺腫、ユーイング肉腫があり、その中には、これらのがんの難治性のものや、これらのがんの2つ以上の組み合わせが含まれる。
【００９８】
本発明の別の1つの特徴は、抗血管新生剤としての上記組成物である。このような抗血管新生剤は、がん（特に固形腫瘍）や他の血管性疾患の治療に用いることができる。
【００９９】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を利用した血管性疾患の治療薬の製造である。
【０１００】
本発明の別の1つの特徴は、血管性疾患を治療するための本発明の抗体である。
【０１０１】
好ましい一実施態様は、網膜症を治療するための本発明の抗体である。
【０１０２】
好ましい一実施態様は、本発明の抗体を利用した網膜症の治療薬の製造である。
【０１０３】
本発明の別の1つの特徴は、血管性疾患に苦しむ患者を治療するため、そのような治療を必要とする患者に本発明の抗体を投与することによる方法である。
【０１０４】
“血管性疾患”という用語に含まれるのは、がん、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、外傷、敗血症、COPD、喘息、糖尿病、AMD、網膜症、脳卒中、脂肪症、急性肺損傷、出血、血管漏れ（例えばサイトカインによって誘導されるもの）、アレルギー、グレーヴズ病、橋本自己免疫甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞性動脈炎、関節リウマチ、全身性ループス・エリテマトーデス（SLE）、ループス腎炎、クローン病、多形性硬化症、潰瘍性大腸炎、固形腫瘍、眼内新生血管症候群（例えば増殖性網膜症、加齢性黄斑変性（AMD））、リウマチ性関節炎、乾癬などである（Folkman, J.他、J. Biol. Chem. 第267巻 (1992年) 10931〜10934頁；Klagsbrun, M.他、Annu. Rev. Physiol. 第53巻 (1991年) 217〜239頁；『眼科疾患の病理生物学、ダイナミックなアプローチ』（Garner, A.、Klintworth, G. K. (編)、第2版、マルセル・デッカー社、ニューヨーク、1994年）の中のGarner, A.、「血管性疾患」、1625〜1710頁）。
【０１０５】
これら組成物は、アジュバント（例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤）も含んでいてよい。微生物の存在抑制は、殺菌手続きと、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）の含有の両方（特に前者）によって保証できる。等張剤（例えば糖、塩化ナトリウムなど）を組成物に含めることも望ましかろう。それに加え、注射可能な医薬剤形を長期間にわたって吸収させることは、吸収を遅らせる物質（例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチン）を含めることによって可能になろう。
【０１０６】
本発明の化合物（適切な水和物の形態で使用できる）および／または本発明の医薬組成物は、選択する投与経路に関係なく、当業者に知られている従来法で薬理学的に許容可能な剤形にされる。
【０１０７】
医薬組成物に含まれる活性成分の実際の投与レベルは、個々の患者、個々の組成物、個々の投与法にとって毒性なしに望ましい治療反応を実現するのに有効な活性成分の量が得られるように変えることができる。選択した投与量のレベルは、さまざまな薬理動態因子に依存するであろう。そのような因子として、使用する本発明の個々の組成物の活性、投与経路、投与時刻、使用する個々の化合物の排泄速度、治療期間、使用する個々の組成物と組み合わせて用いる他の薬および／または化合物および／または材料、治療している患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態、既往歴や、医療でよく知られている同様の因子などがある。
【０１０８】
この組成物は、注射器で供給される限りは、殺菌されていて流体でなければならない。基剤は、水に加え、等張緩衝化生理食塩溶液が好ましい。
【０１０９】
例えばコーティング（レシチンなど）を用いることによって、必要な粒径を維持することによって（分散液の場合）、界面活性剤の利用によって、適度な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物に等張剤として例えば糖、ポリアルコール（マンニトールやソルビトールなど）、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。
【０１１０】
本明細書では、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”という表現は同じ意味で用いられ、そのどれにも子孫が含まれる。したがって“形質転換体”と“形質転換された細胞”という用語には、対象となる主要な細胞と、転移回数に関係なくその細胞に由来する培養物が含まれる。また、意図的な突然変異または予期しない突然変異のため、すべての子孫のDNAの内容が正確に同じではない可能性があると理解する。元になる形質転換された細胞におけるのと機能または生物学的活性が同じものがスクリーニングされた子孫変異体が含まれる。別のことを意味する場合には、文脈から明らかであろう。
【０１１１】
本明細書では、“形質転換”という用語は、ベクター／核酸を宿主細胞に移すプロセスを表わす。強力な細胞壁のない細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばGraham, F. L.とvan der Eb、Virology 第52巻 (1973年) 456〜467頁に記載されているリン酸カルシウム沈降法によってトランスフェクションを行なう。しかしDNAを細胞内に導入する他の方法（例えば核注入やプロトプラスト融合による方法）も利用できる。原核細胞、または実質的に細胞壁を有する細胞を用いる場合には、例えばトランスフェクションを行なう1つの方法は、Cohen, F. N.ら（PNAS. 69巻 (1972年) 7110頁以降）が記載しているように、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
【０１１２】
本明細書では、“発現”は、核酸をmRNAに転写するプロセスおよび／または転写されたmRNA（転写産物とも呼ばれる）をその後翻訳してペプチド、ポリペプチド、タンパク質にするプロセスを表わす。転写産物とコードされたポリペプチドは、まとめて遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合には、真核細胞における発現にmRNAのスプライシングが含まれる可能性がある。
【０１１３】
“ベクター”は、挿入された核酸分子を宿主細胞の中および／または宿主細胞の間に移す、特に自己複製性の核酸分子である。この用語には、主としてDNAまたはRNAを細胞の中に挿入する（例えば染色体と一体化させる）機能を持つベクターと、主にDNAまたはRNAの複製のための複製ベクターと、DNAまたはRNAの転写および／または翻訳の機能を持つ発現ベクターが含まれる。また、ここに記載した2つ以上の機能を持つベクターも含まれる。
【０１１４】
“発現ベクター”は、適切な宿主細胞の中に導入されたときに転写され翻訳されてポリペプチドになることのできるポリヌクレオチドである。“発現系”は、通常は、望む発現産物を生み出すことのできる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を表わす。
【０１１５】
以下の実施例、配列リスト、図面は、本発明の理解を助けるために提示したのであり、本発明の真の範囲は添付の請求項に開示されている。本発明の精神から逸脱することなく、開示した手続きを変更できるものと理解する。
【０１１６】
実験手続き1
材料と一般的な方法
ヒト免疫グロブリンの軽鎖と重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A.らの『免疫学的に興味あるタンパク質の配列』（第5版、公衆衛生サービス、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、1991年）に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、EU番号に従って番号を付けられており、それを参照する（Edelman, G. M.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第63巻 (1969年) 78〜85頁；Kabat, E.A.他、『免疫学的に興味あるタンパク質の配列』（第5版、公衆衛生サービス、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、1991年））。
【０１１７】
組み換えDNA技術
Sambrook, J.他、『分子クローニング；実験室マニュアル』（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年）に記載されているように、標準的な方法を利用してDNAを操作した。分子生物学用の試薬を製造者の指示に従って使用した。
【０１１８】
遺伝子合成
化学合成によって作ったオリゴヌクレオチドから望む遺伝子セグメントを調製した。その遺伝子セグメントは、個々の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接している。PCR増幅を含むアニーリングとオリゴヌクレオチドの連結によってそれらの遺伝子セグメントを組み立てた後、pPCRScript（ストラタジーン社）をベースにしたpGA4クローニング・ベクターに指定の制限部位（例えばKpnI/SacIまたはAscI/PacI）を通じてクローニングした。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列をDNAシークエンシングによって確認した。合成した遺伝子フラグメントは、ジーンアート社（レーゲンスブルク、ドイツ国）で所定の仕様に従って順番に並べた。
【０１１９】
DNA配列の決定
メディゲノミクス社（マルチンスリート、ドイツ国）またはセキサーヴ社（ファーターシュテッテン、ドイツ国）で二本鎖シークエンシングによってDNA配列を決定した。
【０１２０】
DNA配列とタンパク質配列の分析と配列データの管理
GCG（ジェネティクス・コンピュータ・グループ、マディソン、ウィスコンシン州）のソフトウエア・パッケージ（バージョン10.2）とインフォマックス社のVector NT1 Advance suite（バージョン8.0）を用いて配列を作り出し、マッピングし、分析し、注釈を付け、図示した。
【０１２１】
発現ベクター
上記の抗体を発現させるため、CMV-イントロンAを有するcDNA組織またはCMVプロモータを有するゲノム組織に基づく（例えばHEK293 EBNA細胞またはHEK293-F細胞の中での）一過性発現用または（例えばCHO細胞の中での）安定な発現用のさまざまな発現プラスミド（例えば図1）を適用した。
【０１２２】
ベクターは、抗体発現カセット以外に以下のものを含んでいた：
- このプラスミドを大腸菌の中で複製できるようにする複製起点、
- 大腸菌の中でアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０１２３】
抗体遺伝子の転写ユニットは、以下の要素で構成されている：
- 5'末端にある特有の制限部位、
- ヒト・サイトメガロウイルスからの極初期エンハンサと極初期プロモータ、
- cDNA組織の場合には、それに続くイントロンA配列、
- ヒト抗体遺伝子の5'非翻訳領域、
- 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- cDNAとしての、または免疫グロブリンのエキソン-イントロン組織を有するゲノム組織としてのヒト抗体鎖（重鎖、改変された重鎖、軽鎖のいずれか）、
- ポリアデニル化シグナル配列を有する3'非翻訳領域、
- 3'末端にある特有の制限部位。
【０１２４】
以下に記載する選択した抗体の重鎖配列を含む融合タンパク質をPCRおよび／または遺伝子合成によって生成させ、既知の組み換え法と組み換え技術を利用して対応する核酸セグメントを接続することによって組み立てた（例えばゲノム重鎖ベクター内の唯一のNsiI部位とEcoRI部位を用いる）。サブクローニングした核酸配列をDNAシークエンシングによって確認した。一過性トランスフェクションと安定なトランスフェクションのため、形質転換した大腸菌培養物（Nucleobond AX、マシェレー-ネイゲル社）からプラスミドを調製することによってより大量のプラスミドを調製した。
【０１２５】
細胞培養技術
『細胞生物学の最新プロトコル』（2000年、Bonifacino, J.S.、Dasso, M.、Harford, J.B.、Lippincott-Schwartz, J. 、Yamada, K.M. (編)、ジョン・ワイリー＆サンズ社）に記載されている標準的な培養技術を利用した。
【０１２６】
HEK293-F系での一過性トランスフェクション
HEK293-F系（インヴィトロジェン社）を製造者の指示に従って用い、重鎖または改変した重鎖のそれぞれと、対応する軽鎖とをコードしている2種類のプラスミドの一過性トランスフェクションによって抗体を生成させた。簡単に述べると、振盪フラスコまたは撹拌式発酵器の中で無血清FreeStyle 293発現培地に懸濁させた増殖中のHEK293-F細胞（インヴィトロジェン社）を、2種類の発現プラスミドのそれぞれと293フェクチンまたはフェクチン（インヴィトロジェン社）の混合物をトランスフェクトした。例えば2リットルの振盪フラスコ（コーニング社）に関しては、600mlの中に細胞を1.0×106個/mlの密度で入れ、120rpm、8%％CO2にてインキュベートした。翌日、A）重鎖または改変した重鎖のそれぞれと、対応する軽鎖とをコードしているプラスミドDNA（1μg/ml）を同じモル比にしたもの合計600μgを含む20mlのOpti-MEM（インヴィトロジェン社）と、B）20mlのOpti-MEM＋1.2mlの293フェクチンまたはフェクチン（2μl/ml）との混合物約42mlとともに、細胞を約1.5×106個/mlの密度でトランスフェクトした。発酵期間中、グルコースの消費に合わせてグルコース溶液を添加した。分泌された抗体を含む上清を5〜10日後に回収し、その上清から抗体を直接精製するか、その上清を凍結させて保管した。
【０１２７】
タンパク質の測定
精製した抗体と誘導体のタンパク質濃度を、280nmで光学密度（OD）を測定することによって明らかにした。そのとき、Pace, C.N.,他、Protein Science、第4巻 (1995年) 2411〜2423頁に従ってアミノ酸配列に基づいて計算したモル消滅係数を利用した。
【０１２８】
上清の中の抗体濃度測定
細胞培養物の上清に含まれる抗体と誘導体の濃度を、プロテインAアガロース-ビーズ（ロシュ社）を用いた免疫沈降によって見積もった。60μlのプロテインAアガロース-ビーズをTBS-NP40（50mMのトリス、pH7.5、150mMのNaCl、1％のNonidet-P40）の中で3回洗浄した。その後、細胞培養物の上清1〜15mlを、TBS-NP40の中であらかじめ平衡させたプロテインAアガロース-ビーズに注ぐ。室温にて1時間にわたってインキュベートした後、Ultrafree-MC-フィルタ・カラム（アミコン社）上で、ビーズを0.5mlのTBS-NP40を用いて1回洗浄し、0.5mlの2×リン酸緩衝化生理食塩水（2×PBS、ロシュ社）を用いて2回洗浄し、0.5mlの100mM クエン酸Na（pH5.0）を用いて軽く4回洗浄する。35μlのNuPAGE（登録商標）LDSサンプル緩衝液（インヴィトロジェン社）を添加することにより、結合した抗体を溶離させる。サンプルの半分を、それぞれNuPAGE（登録商標）サンプル還元剤と組み合わせるか、還元せずに放置した後、10分間にわたって70℃に加熱する。その後、20μlを4〜12％のNuPAGE（登録商標）ビス-トリスSDS-PAGE（インヴィトロジェン社）（非還元SDS-PAGEに関してはMOPS緩衝液、還元SDS-PAGEに関しては、NuPAGE（登録商標）抗酸化ランニング緩衝液添加剤（インヴィトロジェン社）を含むMES緩衝液）に注ぎ、クーマシー・ブルーで染色する。
【０１２９】
細胞培養物の上清に含まれる抗体と誘導体の濃度をプロテインA-HPLCクロマトグラフィによって測定した。簡単に述べると、プロテインAに結合する抗体と誘導体を含む細胞培養物の上清を、50mMのK2HPO4＋300mMのNaCl（pH7.3）の中にあるHiTrapプロテインAカラム（GEヘルスケア社）に注ぎ、Dionex HPLCシステム上で50mMの酢酸（pH2.5）を用いてマトリックスから溶離させた。溶離したタンパク質をUV吸光度とピーク面積の積分によって定量した。精製した基準IgG1抗体を基準として用いた。
【０１３０】
あるいは細胞培養物の上清に含まれる抗体と誘導体の濃度は、サンドイッチ-IgG-ELISAによって測定した。簡単に述べると、StreptaWell高結合ストレプトアビジンA-96ウエル微量滴定プレート（ロシュ社）を、0.1μg/mlのビオチニル化した抗ヒトIgG捕獲分子F(ab')2<h-Fcγ>BI（ダイアノヴァ社）をウエル1つにつき100μl用いて室温にて1時間にわたって覆うか、4℃にて一晩にわたって覆った後、200μl/ウエルのPBS＋0.05％のトゥイーン（PBST、シグマ社）で3回洗浄した。細胞培養物の上清を含むPBS（シグマ社）に各抗体を希釈した一連の希釈液をウエル1つにつき100μl添加し、微量滴定プレート振盪機の上で室温にて1〜2時間にわたってインキュベートした。200μl/ウエルのPBSTでウエルを3回洗浄した後、結合した抗体を、0.1μg/mlのF(ab')2<h-Fcγ>POD（ダイアノヴァ社）100μlを検出抗体として用い、微量滴定プレート振盪機の上で室温にて1〜2時間かけて検出した。結合しなかった検出抗体は200μl/ウエルのPBSTで3回洗浄して除去し、結合した検出抗体は、100μlのABTS/ウエルを添加することによって検出した。吸光度の測定は、Tecan蛍光分光器を用いて測定波長405nmにて実施した（参照波長492nm）。
【０１３１】
タンパク質の精製
標準的なプロトコルを参照し、濾過した細胞培養物の上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインAセファロース・カラム（GEヘルスケア社）に注ぎ、PBSで洗浄した。酸性pHで抗体を溶離させた後すぐにサンプルを中和した。20mMのヒスチジン＋140mMのNaCl（pH6.0）の中でサイズ排除クロマトグラフィ（Superdex 200、GEヘルスケア社）を実施することにより、凝集したタンパク質をモノマー抗体から分離した。モノマー抗体画分をプールし、必要に応じて例えばミリポア社のAmicon Ultra（30 MWCO）遠心分離濃縮機を用いて濃縮し、-80℃で保管した。サンプルの一部を使用し、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィ、質量分析、内毒素測定によってあとでタンパク質の分析と特徴分析を行なった（図2参照）。
【０１３２】
SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）プレ-キャスト・ゲル・システム（インヴィトロジェン社）を製造者の指示に従って使用した。特に、4〜20％のNuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）トリス-グリシン・プレ-キャスト・ゲルとNovex（登録商標）トリス-グリシンSDSランニング緩衝液を用いた。（例えば図2参照）。NuPAGE（登録商標）サンプル還元剤を添加してサンプルを還元した後、ゲルを走らせた。
【０１３３】
分析的サイズ排除クロマトグラフィ
抗体の凝集とオリゴマーの状態を明らかにするため、HPLCクロマトグラフィによってサイズ排除クロマトグラフィを実施した。簡単に述べると、プロテインAで精製した抗体を、Dionex HPLCシステムにおいて300mMのNaCl＋50mMのKH2PO4/K2HPO4（pH7.5）の中でTosoh TSKgel G3000SWカラムに注ぐか、Dionex HPLCシステムにおいて2×PBSの中でSuperdex 200カラム（GEヘルスケア社）に注いだ。溶離したタンパク質をUV吸光度とピーク面積の積分によって定量した。BioRadゲル濾過基準151-1901を基準として用いた。
【０１３４】
質量分析
エレクトロスプレー・イオン化質量分析（ESI-MS）により、脱グリコシル化された抗体の全質量を測定して確認した。簡単に述べると、精製した抗体100μgを、100mMのKH2PO4/K2HPO4（pH7）の中で20mUのN-グリコシダーゼF（PNGアーゼF、ProZyme）を用い、2mg/mlまでのタンパク質濃度で37℃にて12〜24時間にわたって脱グリコシル化した後、セファデクスG25カラム（GEヘルスケア社）を用いたHPLCによって脱塩した。脱グリコシル化と還元の後、重鎖と軽鎖それぞれの質量をESI-MSによって測定した。簡単に述べると、115μlの中の抗体50μgを、60μlの1M TCEPおよび50μlの8Mグアニジニウム-ヒドロクロリドとともにインキュベートした後、脱塩した。全質量と、還元された重鎖および軽鎖の質量を、NanoMate源を備えるQ-StarエリートMSシステムを用いたESI-MSによって測定した。
【０１３５】
ANG-1とANG-2の結合ELISA
ANGPT（アンギオポエチン1またはアンギオポエチン2）に向かう抗体の結合特性を、完全長のアンギオポエチン-2-Hisタンパク質（R&Dシステムズ社、#623-AN/CF、または自家製材料）またはアンギオポエチン-1-Hisタンパク質（R&Dシステムズ社、#923-AN）を用いたELISAアッセイで評価した。そのために1mg/μlの組み換えヒト・アンギオポエチン-1またはアンギオポエチン-2（基剤なし）を100μl含むPBS（シグマ社）で96ウエルのプレート（Falconポリスチレン透明増強微量滴定プレート、またはNunc Maxisorb）を室温にて2時間にわたって、または4℃にて一晩にわたって被覆した。ウエルを300μlのPBST（0.2％トゥイーン20）で3回洗浄した後、200μlの2％BSA＋0.1％トゥイーン20で室温にて30分間にわたってブロックし、その後300μlのPBSTで3回洗浄した。<ANG-2>に対する精製試験抗体を希釈した一連の希釈液（40pM〜0.01pM）と、参照基準としてのMab536（Oliner, J.他、Cancer Cell、2004年11月6日号、507〜516頁、アメリカ合衆国特許出願公開第2006/0122370号）を含むPBSを100μl/ウエルの割合でウエルに添加し、微量滴定プレート振盪機の上で室温にて1時間にわたってインキュベートした。ウエルを300μlのPBST（0.2％トゥイーン20）で3回洗浄した後、結合した抗体を、0.1μg/mlのF(ab')<hk>POD（バイオゾル社カタログ番号206005）を含む2％BSA＋0.1％トゥイーン20を検出抗体として0.1μg/ウエルの割合で用い、微量滴定プレート振盪機の上で室温にて1時間かけて検出した。結合しなかった検出抗体は300μl/ウエルのPBSTで3回洗浄して除去し、結合した検出抗体は、100μlのABTS/ウエルを添加することによって検出した。吸光度の測定は、Tecan蛍光分光器を用いて測定波長405nmにて実施した（参照波長492nm）。
【０１３６】
ANG-2結合BIACORE
BIACORE T100装置（GEヘルスケア・バイオサイエンシーズ社、ウプサラ、スウェーデン国）を用い、抗原（例えばヒトANG-2）への抗体の結合を表面プラズモン共鳴によって調べた。簡単に述べると、アフィニティを測定するため、ヤギ<hIgG-Fcγ>ポリクローナル抗体を、ヒトANG-2に対してその抗体を提示することを目的として、アミン・カップリングを通じてCM4チップの表面に固定化した。結合は、HBS緩衝液（HBS-P（10mMのヘペス、150mMのNaCl、0.05％のトゥイーン20、pH7.4））の中で25℃にて測定した。精製したANG-2-His（R&Dシステムズ社、または自家精製）を添加し、0.41nM〜200nMの間のさまざまな濃度の溶液にした。ANG-2を3分間注入することによって会合を測定した。解離は、チップの表面をHBS緩衝液で5分間にわたって洗浄することによって測定し、1：1ラングミュア結合モデルを利用してKD値を推定した。ANG-2調製物の不均一性のため、1：1の結合は観察できなかった。したがってKD値は相対的な評価にすぎない。システムに固有のベースラインのドリフト補正とノイズ信号低減のため、負の対照のデータ（例えば緩衝液の曲線）をサンプルの曲線から差し引いた。Biacore T100評価ソフトウエア1.1.1を用いてセンソグラムの分析とアフィニティ・データの計算を行なった。あるいはANG-2は、CM5チップの表面にアミン・カップリング（無BSA）を通じて固定化したPentaHisAntibody（PentaHis-Ab無BSA、キアジェン社、第34660番）を通じ、2000〜1700RUの捕獲レベルで捕獲できた（下記参照）。
【０１３７】
Tie-2に対するヒトANG-2の結合の抑制（ELISA）
384ウエル微量滴定プレート（マイクロコート社、ドイツ国、カタログ番号464718）上で室温にて相互作用ELISAを実施した。各インキュベーション・ステップの後、プレートをPBSTで3回洗浄した。ELISAプレートを0.5μg/mlのTie-2タンパク質（R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号313-TI）で少なくとも2時間にわたって覆った。その後、0.2％のトゥイーン20と2％BSA（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国）を補足したPBSでウエルを1時間にわたってブロックした。精製抗体をPBSに希釈した希釈液を0.2μg/mlのヒト・アンギオポエチン-2（R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号623-AN）とともに室温にて1時間にわたってインキュベートした。洗浄後、0.5μg/mlのビオチニル化した抗アンギオポエチン-2クローンBAM0981（R&Dシステムズ社、イギリス国）と1：3000に希釈したストレプトアビジンHRP（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、カタログ番号11089153001）の混合物を1時間かけて添加した。その後、プレートをPBSTで6回洗浄した。調製したばかりのABTS試薬（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、緩衝液#204 530 001、錠剤#11 112 422 001）を用いて室温にて30分間にわたってプレートを現像した。吸光度を405nmで測定した。
【０１３８】
Tie-2に対するヒトANG-1の結合の抑制（ELISA）
384ウエル微量滴定プレート（MaxiSorb Nunc#442768）上で室温にて相互作用ELISAを実施した。各インキュベーション・ステップの後、プレートをPBSTで3回洗浄した。ELISAプレートを0.5μg/mlのTie-2タンパク質（R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号313-TI、または自家製材料）で少なくとも2時間にわたって覆った。その後、0.2％のトゥイーン20と2％BSA（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国）を補足したPBSでウエルを1時間にわたってブロックした。精製抗体をPBSに希釈した希釈液を0.2μg/mlのヒト・アンギオポエチン-1（R&Dシステムズ社、#923-AN/CF、または自家製材料）とともに室温にて1時間にわたってインキュベートした。洗浄後、0.5μg/mlのビオチニル化した抗アンギオポエチン-1クローン（R&Dシステムズ社、#BAF923）と1：3000に希釈したストレプトアビジンHRP（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、カタログ番号11089153001）の混合物を1時間かけて添加した。その後、プレートをPBSTで6回洗浄した。調製したばかりのABTS試薬（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、緩衝液#204 530 001、錠剤#11 112 422 001）を用いて室温にて30分間にわたってプレートを現像した。吸光度を405nmで測定した。
【０１３９】
HEK293-Tie2細胞系の生成
ANGPT2で刺激するTie2リン酸化へのアンギオポエチン-2抗体の干渉と、細胞表面のTie2へのANGPT2の結合を調べるため、組み換えHEK293-Tie細胞系を生成させた。簡単に述べると、pcDNA3をベースとしていて完全長ヒトTie2（配列番号61）をコードしているプラスミド（RB22-pcDNA3 Topo hTie2）を、CMVプロモータとネオマイシン耐性マーカーの制御下で、Fugene（ロシュ・アプライド・サイエンス社）をトランスフェクト試薬として用いてHEK293細胞（ATCC）にトランスフェクトし、DMEM＋10％FCS＋500μg/ml G418の中で耐性細胞を選択した。個々のクローンをクローニング・シリンダを通じて単離した後、FACSによってTie2の発現を分析した。クローン22は、G418の不在下でも強くて安定なTie2を発現するクローンとして同定された（HEK293-Tieクローン22）。その後、HEK293-Tieクローン22を細胞アッセイで使用した。そのアッセイとは、ANGPT2誘導Tie2リン酸化アッセイと、ANGPT2細胞リガンド結合アッセイである。
【０１４０】
ANGPT2誘導Tie2リン酸化アッセイ
ANGPT2で誘導するTie2リン酸化のANGPT2抗体による抑制を、以下のアッセイ原理に従って測定した。ANGPT2抗体の不在下または存在下にて、HEK293-Tie2クローン22をANGPT2で5分間にわたって刺激した後、P-Tie2をサンドイッチELISAによって定量した。簡単に述べると、ポリ-D-リシンで被覆した96ウエルの微量滴定プレート上にて、ウエル1つにつき2×105個のHEK293-Tie2クローン22細胞を、100μlのDMEM＋10％FCS＋500μg/ml のジェネティシンの中で一晩にわたって増殖させた。翌日、ANGPT2抗体の滴定を行なう1つの行を微量滴定プレート上に用意し（4倍に濃縮、最終体積75μl/ウエル、デュープリケート）、75μlのANGPT2（R&Dシステムズ社、#623-AN）希釈液（4倍濃縮溶液として3.2μg/ml）と混合した。抗体とANGPT2は室温で15分間にわたってあらかじめインキュベートしておいた。この混合物100μlを（1mMのNaV3O4（シグマ社、#S6508）とともに5分間にわたってあらかじめインキュベートした）HEK293-Tieクローン22細胞に添加し、37℃で5分間にわたってインキュベートした。その後、細胞を、ウエル1つにつき200μlの氷冷PBS＋1mMのNaV3O4で洗浄し、氷の上でウエル1つにつき120μlの溶解緩衝液（20mMのトリス、pH8.0、137mMのNaCl、1％のNP-40、10％のグリセロール、2mMのEDTA、1mMのNaV3O4、1mMのPMSF、10μg/mlのアプロチニン）を添加して溶解させた。微量滴定プレート振盪機の上で細胞を4℃にて30分間にわたって溶解させた後、あらかじめ遠心分離することなく、全タンパク質を測定することもなく、100μlのライセートをp-Tie2 ELISA微量滴定プレート（R&Dシステムズ社、R&D #DY990）に直接移した。p-Tie2の量を製造者の指示に従って定量し、エクセルのためのXLfit4分析プラグ-イン（投与量-応答ワン・サイト、モデル205）を用いて抑制のIC50値を決定した。IC50値は1つの実験内では比較できるが、実験ごとに変化する可能性がある。
【０１４１】
ANGPT1誘導Tie2リン酸化アッセイ
ANGPT1で誘導するTie2リン酸化のANGPT1抗体による抑制を、以下のアッセイ原理に従って測定した。ANGPT1抗体の不在下または存在下にて、HEK293-Tie2クローン22をANGPT1で5分間にわたって刺激し、P-Tie2をサンドイッチELISAによって定量した。簡単に述べると、ポリ-D-リシンで被覆した96ウエルの微量滴定プレート上にて、ウエル1つにつき2×105個のHEK293-Tie2クローン22細胞を100μlのDMEM＋10％FCS＋500μg/ml のジェネティシンの中で一晩にわたって増殖させた。翌日、ANGPT2抗体の滴定を行なう1つの行を微量滴定プレート上に用意し（4倍に濃縮、最終体積75μl/ウエル、デュープリケート）、75μlのANGPT1（R&Dシステムズ社、#923-AN）希釈液（4倍濃縮溶液として3.2μg/ml）と混合した。抗体とANGPT1は室温で15分間にわたってあらかじめインキュベートしておいた。この混合物100μlを（1mMのNaV3O4（シグマ社、#S6508）とともに5分間にわたってあらかじめインキュベートした）HEK293-Tieクローン22細胞に添加し、37℃で5分間にわたってインキュベートした。その後、細胞を、ウエル1つにつき200μlの氷冷PBS＋1mMのNaV3O4で洗浄し、氷の上でウエル1つにつき120μlの溶解緩衝液（20mMのトリス、pH8.0、137mMのNaCl、1％のNP-40、10％のグリセロール、2mMのEDTA、1mMのNaV3O4、1mMのPMSF、10μg/mlのアプロチニン）を添加して溶解させた。微量滴定プレート振盪機の上で細胞を4℃にて30分間にわたって溶解させた後、あらかじめ遠心分離することなく、全タンパク質を測定することもなく、100μlのライセートをp-Tie2 ELISA微量滴定プレート（R&Dシステムズ社、R&D #DY990）に直接移した。p-Tie2の量を製造者の指示に従って定量し、エクセルのためのXLfit4分析プラグ-イン（投与量-応答ワン・サイト、モデル205）を用いて抑制のIC50値を決定した。IC50値は1つの実験内では比較できるが、実験ごとに変化する可能性がある。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：
モノクローナル<ANG-2>抗体Ang2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08の発現と精製
対応する抗体Ang2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08の軽鎖と重鎖を上記のようにして発現ベクターの中に構成した。重鎖とκ軽鎖はゲノム発現カセットの中でクローニングしたのに対し、λ軽鎖はイントロンAを有するcDNAとしてクローニングした（図1B）。プラスミドを大腸菌の中で増幅し、精製した後、トランスフェクトしてHEK293-F細胞の中で組み換えタンパク質として一過性発現させた（インヴィトロジェン社のFreeStyle 293系を使用）。7日後、HEK293-F細胞の上清を回収し、濾過し、抗体をプロテインAとサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。全抗体の一様性を、非還元条件下と還元条件下のSDS-PAGEと、分析的サイズ排除クロマトグラフィによって確認した。還元条件下では（図2）、<ANG-2>抗体のポリペプチド重鎖は、SDS-PAGEにおいて見かけの分子量が分子量の計算値に近い約50kDaであり、ポリペプチド軽鎖は、見かけの分子量が予測通りの25kDaであった。質量分析により、精製した抗体が何であるかを確認した。全コンストラクトの発現レベルをプロテインA HPLCによって分析した。
【０１４３】
精製物のサイズ排除クロマトグラフィ分析。すべての抗体を調製し、説明した手続きと同様にして特徴を分析した。対応する抗体のSECデータを以下の表にまとめてある。
【０１４４】
【表１】
【０１４５】
実施例２：
ELISAによるヒトANG-1とヒトANG-2への結合アッセイ
上記のようにして、ヒトANG-1とヒトANG-2への<ANG-2>抗体Ang2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08の結合をANG-1結合ELISAまたはANG-2結合ELISAで調べた。簡単に述べると、ELISAタイプのアッセイは、微量滴定プレートの中にヒト野生型のアンギオポエチン-1またはアンギオポエチン-2を固定化することに基づいている。固定化されたANG-1またはANG-2に対する抗体の結合を、POD共役体を用いて<ヒトFc>（抗IgG）抗体を通じて測定する。一連の<ANG-2>抗体希釈液により、EC50濃度を決定することができる。参照基準として、ヒト抗ANG-2抗体<ANG-2>Mab536（Oliner, J.他、Cancer Cell、2004年11月6日号、507〜516頁、アメリカ合衆国特許出願公開第2006/0122370号）を使用した。決定したEC50濃度を以下の表にまとめてある。
【０１４６】
【表２】
【０１４７】
すべての抗体がANG-2に特異的に結合する。Mab536とAng2k-LC08はANG-1にも特異的に結合するのに対し、Ang2i-LC06とAng2i-LC07はEC50値が8000ng/ml（検出限界）を超えるためANG-1に特異的に結合しない。
【０１４８】
実施例３：
Biacoreを通じたANG-2への結合
上記のようにして、ヒトANGPT2への結合に関するアフィニティをBiacoreアッセイで調べた。簡単に述べると、このアッセイでは、捕獲抗体（抗Fc）をBiacoreチップの表面に固定化し、この捕獲抗体が対応する抗体（例えばAng2i-LC06）を捕獲して提示する。リガンド（ここではANGPT2）は溶液から捕獲される。この相互作用のアフィニティは、1：1相互作用を仮定して決定される。この実験の詳細は、一般的な方法の項に見いだすことができる。ANGPT2結合（KD）に関して決定されたアフィニティを以下の表にまとめてある。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08は大きなアフィニティでANGPT2に結合する。
【０１５１】
実施例４：
ANGPT1/2-Tie2相互作用の中和（ヒト）
ヒトANGPT1/2／ヒトTie2相互作用のブロッキングを受容体相互作用ELISAによって示した。384ウエルのMaxisorpプレート（ナンク社）を0.5μg/mlのヒトTie2（R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号313-TI、または自家製材料）で室温にて2時間にわたって被覆し、0.2％のトゥイーン-20と2％BSAを補足したPBS（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国）で室温にて1時間にわたって振盪下でブロックした。その間に、精製した抗体をPBSに希釈したものを0.2μg/mlのヒト・アンギオポエチン-1/2（R&Dシステムズ#923-AN/CF、R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号623-AN、または自家製材料）とともに室温にて1時間にわたってインキュベートした。0.5μg/mlのビオチニル化された抗アンギオポエチン-1/2クローン（R&Dシステムズ#BAF923、BAM0981、R&Dシステムズ社、イギリス国）と1：3000に希釈したストレプトアビジンHRP（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、カタログ番号11089153001）の混合物を1時間かけて添加した。その後、プレートをPBSTで6回洗浄した。調製したばかりのABTS試薬（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、緩衝液#204 530 001、錠剤#11 112 422 001）を用いて室温にて30分間にわたってプレートを現像した。吸光度を405nmで測定した。
【０１５２】
得られた抑制濃度を以下の表にまとめてある。
【０１５３】
【表４】
【０１５４】
上の表から、2つの抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08で選択性プロファイルが異なることがわかる。Ang2i-LC06はANGPT2選択性であるのに対し、Ang2k-LC08は、ANGPT1/2 Tie2相互作用の抑制においてANGPT1/2交差反応性である。
【０１５５】
実施例５：
Tie2リン酸化
同定されたANGPT2抗体がANGPT2とANGPT1を媒介としてTie2のリン酸化に干渉する能力を、上に説明したANGPT2とANGPT1で誘導するTie2リン酸化アッセイで調べた。アッセイの設定の模式図を図3に示す。
【０１５６】
図4に示してあるように、抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08は両方とも、ANGPT2で刺激したTie2リン酸化に投与量に依存して干渉し、IC50値は同程度であった。Ang2i-LC06は、ANGPT2で刺激したTie2リン酸化に約508ng/mlというIC50値で干渉し、Ang2k-LC08は、ANGPT2で刺激したTie2リン酸化に約499ng/mlというIC50値で干渉した。それとは対照的に、Ang2k-LC08だけが、ANGPT1で刺激したTie2リン酸化に約391ng/mlというIC50値で干渉したのに対し、Ang2i-LC06は、試験した同じ濃度範囲では、ANGPT1で刺激したTie2リン酸化に干渉しなかった（図5）。
【０１５７】
実施例６：生体内効果
Colo205異種移植片の増殖に対するANGPT抗体の効果
病期判定皮下Colo205異種移植片モデルにおいて<ANGPT2>Mab536と比較した<ANGPT2>抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08の生体内効果
【０１５８】
メスScidベージュ・マウスでの病期判定皮下Colo205異種移植片モデル（Ang2_PZ_Colo205_006）において、精製した抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08を抗体Mab536と比較した。
【０１５９】
抗体：Mab536は凍結貯蔵溶液（c=4.5mg/ml）として提供され、Ang2i-LC06とAng2k-LC08は、20mMのヒスチジン＋140mMのNaCl（pH6.0）の中の凍結貯蔵溶液（c=1mg/ml）として提供された。抗体を貯蔵溶液からPBSの中に適度に希釈した後、必要な場所に注入し、PBSを賦形剤として用いた。薬局から購入したヒト化IgG1抗IgE抗体Xolair（オマリズマブ）を正の対照とした。
【０１６０】
細胞系と培養条件：Colo205ヒト結腸直腸がん細胞をATCCから最初に取得し、増殖後にロシュ・ペンツベルク内部細胞バンクに寄託した。腫瘍細胞系を、10％ウシ胎仔血清（PAラボラトリーズ、オーストリア国）と2mMのL-グルタミンを補足したRPMI 1640培地（PAラボラトリーズ、オーストリア国）の中で37℃、飽和水蒸気、5％CO2にて定法通りに培養した。継代3を移植に用いた。
【０１６１】
動物：委員会にかけられたガイドライン（GV-Solas；Felasa；TierschG）に従い、（Charles River（ドイツ国）から購入した）メスSCIDベージュ・マウスを、特定の病原体がない条件下にて、1日を12時間明／12時間暗のサイクルにして飼育した。実験研究のプロトコルは地方当局によって検討され、承認された。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために動物施設の検疫部に1週間保管した。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。餌（Provimi Kliba 3337）と水（pH2.5〜3に酸性化）を自由に摂取させた。マウスの年齢は研究開始時に12〜14週間であった。
【０１６２】
モニタリング：動物の臨床症状を毎日調べ、悪い効果を検出した。実験期間を通じてモニタリングするため、動物の体重を記録し、病期を判定した後に腫瘍の体積をノギスで測定した。
【０１６３】
腫瘍細胞の注入：注入日にColo205細胞を遠心分離し、1回洗浄し、PBSに再度懸濁させた。PBSでさらに洗浄した後、細胞カウンタと分析システム（Vi-CELL、ベックマン・コールター社）を用いて細胞の濃度とサイズを測定した。Colo205細胞を注入するため、最終力価を5.0×107細胞/ml、生存率約90％に調節した。その後、動物1匹あたり細胞が2.5×106個に対応するこの懸濁液100μlをマウスの右脇腹に皮下注射した。
【０１６４】
動物の治療：細胞移植（研究Ang2_PZ_Colo205_006）の16日後で腫瘍の体積の平均値が178mm3のときにランダム化を行ない、その日に動物の治療を開始した。
【０１６５】
研究Ang2_PZ_Colo205_006の投薬スケジュール
【０１６６】
【表５】
【０１６７】
50日目までの腫瘍の増殖抑制を図6に示してある。このデータから、ANGPT2選択性抗体Ang2i-LC06が最も活性のある抗体だったことがわかる（腫瘍制御比（TCR）値が0.39）。Ang2i-LC06は、抗体Mab536（TCR値が0.47）およびANGPT2選択性ANGPT1交差反応性抗体Ang2k-LC08（TCR値が0.46）よりも腫瘍増殖の抑制に関して効果が大きかった。
【０１６８】
KPL-4異種移植片の増殖に対する抗ANGPT抗体の効果
【０１６９】
病期判定同所KPL-4異種移植片モデルにおいて<ANGPT2>Mab536と比較した<ANGPT2>抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08の生体内効果
【０１７０】
メスScidベージュ・マウスでの病期判定同所KPL-4異種移植片モデル（Ang2_PZ_KPL-4_002）において、精製した抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08を抗体Mab536と比較した。
【０１７１】
抗体：Mab536は凍結貯蔵溶液（c=4.5mg/ml）として提供され、Ang2i-LC06とAng2k-LC08は、20mMのヒスチジン＋140mMのNaCl（pH6.0）の中の凍結貯蔵溶液（c=1mg/ml）として提供された。抗体を貯蔵溶液からPBSの中に適度に希釈した後、必要な場所に注入し、PBSを賦形剤として用いた。
【０１７２】
細胞系と培養条件：そもそもKPL-4ヒト乳がん細胞は、炎症性皮膚転移がある乳がん患者の悪性胸水から確立された。KPL-4細胞は、親切にも紅林淳一（川崎医科大学、倉敷、日本国）から提供された。腫瘍細胞を、10％ウシ胎仔血清（PANバイオテック社、ドイツ国）と2mMのL-グルタミン（PANバイオテック社、ドイツ国）を補足したDMEM培地（（PANバイオテック社、ドイツ国））の中で37℃、飽和水蒸気、5％CO2にて定法通りに培養した。トリプシン／EDTA 1×(PAN)分割3回／週で継代培養を実施した。
【０１７３】
動物：委員会にかけられたガイドライン（GV-Solas；Felasa；TierschG）に従い、（Charles River（ドイツ国）から購入した）メスSCIDベージュ・マウスを、特定の病原体がない条件下にて、1日を12時間明／12時間暗のサイクルにして飼育した。実験研究のプロトコルは地方当局によって検討され、承認された。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために動物施設の検疫部に1週間保管した。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。餌（Provimi Kliba 3337）と水（pH2.5〜3に酸性化）を自由に摂取させた。マウスの年齢は研究開始時に約12週間であった。
【０１７４】
モニタリング：動物の臨床症状を毎日調べ、悪い効果を検出した。実験期間を通じてモニタリングするため、動物の体重を記録し、病期を判定した後に腫瘍の体積をノギスで測定した。
【０１７５】
腫瘍細胞の注入：注入日に腫瘍細胞を培養フラスコ（グライナー社、TriFlask）から回収し（トリプシン-EDTA）、50mlの培地に移し、1回洗浄し、PBSの中に再び懸濁させた。PBSを用いた洗浄ステップをさらに1回実施した後に濾過し（細胞濾過器；Falcon（登録商標）；100μm）、細胞の最終力価を1.5×108/mlに調節した。細胞が凝集しないようホールピペットを用いて腫瘍細胞懸濁液を注意深く混合した。予備インキュベーション・チェンバー（プレクシグラス）と、個別のマウス鼻マスク（シリコン）と、不燃性または非爆発性の麻酔化合物イソフラン（ファルマシア-アップジョン社、ドイツ国）を閉鎖循環系の中で使用し、小動物のためのステフェンズの吸入ユニットを用いて麻酔を行なった。注入する2日前に動物の体毛を剃った。乳房内脂肪パッドに注入するため、麻酔した各マウスの最後から2番目の右鼠径部乳房脂肪パッドに20μlの体積（3×106個/動物）で細胞を同所注入した。同所移植のため、ハミルトン・マイクロリットル注射器と30G×1/2"針を用いて細胞懸濁液を乳首の下の皮膚を通じて注入した。
【０１７６】
細胞移植（研究Ang2_PZ_KPL-4_002）の3.35日後で腫瘍が60〜180mm、腫瘍の体積の平均値が90mm3のときにランダム化を行ない、その日に動物の治療を開始した。
【０１７７】
研究Ang2_PZ_KPL-4_002の投薬スケジュール
【０１７８】
【表６】
【０１７９】
64日目までの腫瘍の増殖抑制を図7に示してある。このデータから、KPL-4ではANGPT2選択性抗体Ang2i-LC06が最も活性のある抗体だったことがわかる（TCR値が0.55）。Ang2i-LC06は、抗体Mab536（TCR値が0.57）およびANGPT2選択性ANGPT1交差反応性抗体Ang2k-LC08（TCR値が0.57）よりも腫瘍増殖の抑制に関して効果が大きかった。
【０１８０】
実施例７：
Biacoreを通じたANG-1への結合
BiacoreアッセイでヒトANG-1に対する結合のアフィニティを調べた。アミン・カップリングを利用してヒトANG-1をCM5バイオセンサーチップに固定化した。タンパク質を5μl/分の流速で20分間かけて10μg/mlの酢酸ナトリウム（pH4.5）に注入した。その結果、表面密度が約20000RUになった。参照用のフロー・セルには同じ条件でBSAを固定化した。抗体をHBS-Pに希釈して100nMにした後、3分間かけて注入した（会合相）。ランニング緩衝液で3分間洗浄した（解離相）後、10mMの水酸化ナトリウムを5μl/分で1分間注入することにより表面を再生させた。結果を図8に示す。Ang2k_LC08は、複合体の解離半減期が約50秒であり、Ang2i_LC06は約5秒であり、Ang2i_LC10はANG-1に結合しなかった。
【０１８１】
実施例８：原発腫瘍のある生体内での転移／続発腫瘍の抑制
a）原発Colo205腫瘍を異種移植したマウスにおける転移／続発腫瘍の抑制
細胞系と培養条件：
Colo205ヒト結腸直腸がん細胞をATCCから最初に取得し、増殖後にロシュ・ペンツベルク内部細胞バンクに寄託した。腫瘍細胞系を、10％ウシ胎仔血清（PAラボラトリーズ、オーストリア国）と2mMのL-グルタミンを補足したRPMI 1640培地（PAラボラトリーズ、オーストリア国）の中で37℃、飽和水蒸気、5％CO2にて定法通りに培養した。継代3を移植に用いた。
【０１８２】
動物：
委員会にかけられたガイドライン（GV-Solas；Felasa；TierschG）に従い、（Charles River（ドイツ国）から購入した）メスSCIDベージュ・マウス（到着時に年齢4〜5週間）を、特定の病原体がない条件下にて、1日を12時間明／12時間暗のサイクルにして飼育した。実験研究のプロトコルは地方当局によって検討され、承認された。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために動物施設の検疫部に1週間保管した。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。餌（Provimi Kliba 3337）と水（pH2.5〜3に酸性化）を自由に摂取させた。マウスの年齢は研究開始時に約10週間であった。
【０１８３】
腫瘍細胞の注入：
注入日にColo205腫瘍細胞を培養フラスコ（グライナー社）から回収し（トリプシン-EDTA）、50mlの培地に移し、1回洗浄し、PBSの中に再び懸濁させた。PBSを用いた洗浄ステップをさらに1回実施した後、濾過し（細胞濾過器；Falcon φ 100μm）、細胞の最終力価を2.5×107/mlに調節した。細胞が凝集しないようホールピペットを用いて腫瘍細胞懸濁液を注意深く混合した。この操作の後、広い針（1.10×40mm）を用いて細胞懸濁液を1.0mlのツベルクリン注射器（ブラウン・メルスンゲン社）に満たした。注射のために針のサイズを変え（0.45×25mm）、1回の注射ごとに新しい針を使用した。予備インキュベーション・チェンバー（プレクシグラス）と、個別のマウス鼻マスク（シリコン）と、不燃性または非爆発性の麻酔化合物イソフラン（ファルマシア-アップジョン社、ドイツ国）を閉鎖循環系の中で使用し、小動物のためのステフェンズの吸入ユニットを用いて麻酔を行なった。注入する2日前に動物の皮膚を剃り、細胞を注入するため麻酔した動物の皮膚を解剖用鉗子で注意深く持ち上げ、100μlの細胞懸濁液（=2.5×106細胞）を動物の右脇腹に皮下注射した。原発腫瘍の増殖をモニターした（データは示さず）。
【０１８４】
例えば肺におけるヒトAlu配列の定量による続発腫瘍のモニタリング
実験が終了したとき（103日目）、全群の動物から肺を回収した。簡単に述べると、サンプルを液体窒素の中に直ちに移す。次のステップにおいて、MagNA Pure LC装置を製造者の指示に従って用いて全DNAをサンプルから単離した。Alu配列を定量PCR（LightCycler装置）によって選択的に増幅するため、ヒトAlu特異的プライマーを選択した。（T. Schneider他、Clin. Exp. Metas.、2002年、第19巻、571〜582頁）。
【０１８５】
動物の治療：
細胞を移植した14日後、腫瘍の平均体積が340mm3であるときに、アバスタチン（10mg/kg腹腔、週に1回）を用いた動物の治療を開始した（研究Ang2_PZ_Colo205_008）。7週間後にマウスをランダム化し、51日目に以下の表に示す化合物を用いた二次治療を開始した。研究Ang2_PZ_Colo205_008の51日目に開始した二次治療。
【０１８６】
【表７】
【０１８７】
（肺の）転移／続発腫瘍の抑制結果を以下の表と図9Aに示してある。
【０１８８】
【表８】
【０１８９】
結果は、ANG2i-LC06により、アバスタチンと比べて続発腫瘍／転移の抑制効果が明らかに改善されていることを示している。
【０１９０】
b）原発KPL-4腫瘍を異種移植したマウスにおける転移／続発腫瘍の抑制
腫瘍細胞系
親切にも紅林淳一（川崎医科大学、倉敷、日本国）から提供されたKPL-4ヒト乳がん細胞は、そもそもは炎症性皮膚転移がある乳がん患者の悪性胸水から確立された。腫瘍細胞を、10％ウシ胎仔血清（PANバイオテック社、ドイツ国）と2mMのL-グルタミン（PANバイオテック社、ドイツ国）を補足したDMEM培地（（PANバイオテック社、ドイツ国））の中で37℃、飽和水蒸気、5％CO2にて定法通りに培養した。トリプシン／EDTA 1×(PAN)分割3回／週で継代培養を実施した。
【０１９１】
マウス
到着後、新環境への馴致と観察のため、メスSCIDベージュ・マウス（到着時に年齢10〜12週間；体重18〜20g；Charles River、スルツフェルト、ドイツ国）を動物施設の検疫部に1週間保管した。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。マウスは、国際的なガイドライン（GV-Solas；Felasa；TierschG）に従い、無病原体条件下にて、1日を12時間明／12時間暗のサイクルにして飼育した。餌（Provimi Kliba 3337）と水（pH2.5〜3に酸性化）を自由に摂取させた。実験研究のプロトコルは地方当局によって検討され、承認された（オーバーバイエルン行政管区；登録番号第211.2531.2-22/2003号）。
【０１９２】
腫瘍細胞の注入
注入日に腫瘍細胞を培養フラスコ（グライナー社、TriFlask）から回収し（トリプシン-EDTA）、50mlの培地に移し、1回洗浄し、PBSの中に再び懸濁させた。PBSを用いた洗浄ステップをさらに1回実施して濾過した（細胞濾過器；Falcon φ 100μm）後、細胞の最終力価を1.5×108/mlに調節した。細胞が凝集しないようホールピペットを用いて腫瘍細胞懸濁液を注意深く混合した。予備インキュベーション・チェンバー（プレクシグラス）と、個別のマウス鼻マスク（シリコン）と、不燃性または非爆発性の麻酔化合物イソフラン（ファルマシア-アップジョン社、ドイツ国）を閉鎖循環系の中で使用し、小動物のためのステフェンズの吸入ユニットを用いて麻酔を行なった。注入する2日前に動物の体毛を剃った。乳房内脂肪パッドに注入するため、麻酔した各マウスの最後から2番目の右鼠径部乳房脂肪パッドに20μlの体積で細胞を同所注入した。同所移植のため、ハミルトン・マイクロリットル注射器と30G×1/2"針を用いて細胞懸濁液を乳首の下の皮膚を通じて注入した。原発腫瘍の増殖をモニターした（データは示さず）。
【０１９３】
例えば肺におけるヒトAlu配列の定量による続発腫瘍のモニタリング
【０１９４】
実験が終了したとき（103日目）、全群の動物から肺を回収した。簡単に述べると、サンプルを液体窒素の中に直ちに移す。次のステップにおいて、MagNA Pure LC装置を製造者の指示に従って用いて全DNAをサンプルから単離した。Alu配列を定量的PCR（LightCycler装置）によって選択的に増幅するため、ヒトAlu特異的プライマーを選択した。（T. Schneider他、Clin. Exp. Metas.、2002年、第19巻、571〜582頁）。
【０１９５】
動物の治療
細胞を移植した35日後、腫瘍の平均体積が60〜160mm3であるときに動物の治療を開始した。化合物と投薬スケジュールを以下の表に示す。
【０１９６】
【表９】
【０１９７】
（肺の）転移／続発腫瘍の抑制結果を以下の表と図9Bに示してある。
【０１９８】
【表１０】
【０１９９】
結果は、Ang2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08によって続発腫瘍／転移が非常に効果的に抑制されることを示している。
【０２００】
実施例９：網膜症の治療における効果
方法
里親となる授乳メス親マウスCD1に子マウスC57/B16を育てさせ、P7からP12までを75％の酸素に曝露した（PRO-OX 110チェンバー酸素制御装置、バイオスフェリクス社、レッドフィールド、ニューヨーク州）。すると網膜の中心で血管の閉塞と毛細血管の停止が誘導される。子マウスと授乳メス親マウスを通常の大気中に置いて相対的な低酸素症へと導き、新生血管形成を誘導する。P13でイソフルオラン（5％で誘導、1.5％の酸素を組み合わせて3％で維持）を用いて子マウスを麻酔し、目を露出させ、35ゲージの針（WPI、サラソタ、フロリダ州）を取り付けたNanofil注射器を用いて左目に1μlの眼内注入を行なった。P17で両目を切除し、4％パラホルムアルデヒドの中に4℃で4時間にわたって固定し、網膜を切除した。0.5％トリトンX-100と1％ウシ血清アルブミンを含むPBSの中で網膜を浸透性にし、1％トリトンX-100と、0.1mMのCaCl2と、0.1mMのMgCl2を含むPBS（pH6.8）の中の20μg/mlのビオチニル化されたイソレクチンB4（シグマ・オールドリッチ社、ギリンガム、イギリス国）で染色した後、20μg/mlのALEXA488-ストレプトアビジン（モレキュラー・プローブズ社、ユージン、オレゴン州）で処理し、Vectashield（ヴェクター・ラボラトリーズ社、バーリンゲイム、カリフォルニア州）の中に平らに取り付けた。ニコン落射蛍光顕微鏡を4倍の倍率で用いて網膜の画像を取得した。フォトショップCS3とイメージJ（NIH）を用いて盲検式で新生血管と虚血の面積を測定し、網膜の全面積（=正常＋虚血＋新生血管）に対する割合として表示した。
【０２０１】
結果
図10Aは、イソレクチン染色によって可視化した網膜血管構造を持つ平らに取り付けた代表的な網膜を示している。中心の虚血領域は、血管誘導因子の上方調節によって網膜血管の新生血管形成と再成長を誘導する。新生血管の前線は過剰増殖性であり、不規則な血管パターンを持つ曲がりくねった血管になる。最も外側の領域は、影響されない正常な血管を含んでいる。平らに取り付けた網膜の定量結果から、アバスチンを用いたVEGFの抑制によって予想通り網膜の血管新生形成が抑制されたことがわかる（図10B参照、注入なしの場合の36.7±1.8％に対し、注入した場合の22.4±3.0％）。抗体LC06またはLC08を用いたAhg2の抑制も新生血管形成の低下につながった（31.5±1.1％対18.8±1.3％と、34.0±3.1％対25.4±3.4％）。対照であるヒトIgGの注入には新生血管形成に対する効果がなかった（図10B参照、38.3±1.1％対38.3±0.8％）。
【配列表フリーテキスト】
【０２０２】
アミノ酸配列の説明
配列番号1 重鎖CDR3、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号2 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2i_LC06
配列番号3 重鎖CDR1、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号4 軽鎖CDR3、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号5 軽鎖CDR2、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号6 軽鎖CDR1、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号7 重鎖可変領域、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号8 軽鎖可変領域、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号9 重鎖CDR3、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号10 重鎖CDR2、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号11 重鎖CDR1、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号12 軽鎖CDR3、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号13 軽鎖CDR2、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号14 軽鎖CDR1、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号15 重鎖可変領域、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号16 軽鎖可変領域、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号17 重鎖CDR3、< ANG-2>Ang2k_LC08
配列番号18 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号19 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号20 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号21 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号22 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号23 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号24 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号25 重鎖CDR3、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号26 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号27 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号28 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号29 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号30 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号31 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号32 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号33 重鎖CDR3、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号34 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号35 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号36 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号37 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号38 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号39 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号40 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号41 重鎖CDR3、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号42 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号43 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号44 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号45 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号46 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2k_LCl1
配列番号47 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号48 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号49 重鎖CDR3、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号50 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号51 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号52 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号53 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号54 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号55 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号56 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号57 IgG1に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号58 IgG4に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号59 κ軽鎖定常領域
配列番号60 λ軽鎖定常領域
配列番号61 ヒトTie-2受容体
配列番号62 リーダーとHisタグを有するヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）
配列番号63 リーダーとHisタグを有するヒト・アンギオポエチン-1（ANG-1）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・アンギオポエチン2に対する抗体（抗AHG-2抗体）と、その製造方法と、その抗体を含む医薬組成物と、その利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血管新生は、固形腫瘍、眼内新生血管形成症候群（例えば増殖性網膜症、加齢性黄斑変性（AMD））、関節リウマチ、乾癬といったさまざまな疾患の病因に関与している（Folkman, J.他、J. Biol. Chem. 第267巻 (1992年) 10931〜10934頁；Klagsbrun, M.他、Annu. Rev. Physiol. 第53巻 (1991年) 217〜239頁；『眼科疾患の病理学、ダイナミックなアプローチ』（Garner, A.、Klintworth, G. K. (編)、第2版、マルセル・デッカー社、ニューヨーク (1994年)）の中のGarner, A.、「血管性疾患」、1625〜1710頁）。固形腫瘍の場合には、腫瘍細胞は、新生血管形成によって正常な細胞と比べて増殖上の利点と増殖の自律性を獲得することができる。そのため乳がんと他のいくつかの腫瘍において、腫瘍セグメント内の微小血管の密度と患者の生存の間に相関が観察されている（Weidner, N.他、N. Engl. J. Med. 第324巻 (1991年) 1〜8頁；Horak, E.R.他、Lancet 340巻 (1992年) 1120〜1124頁；Macchiarini, P.他、Lancet 第340巻 (1992年) 145〜146頁）。
【０００３】
ANG-2と抗AHG-2抗体
【０００４】
ヒト・アンギオポエチン2（ANG-2）（あるいはANGPT2、ANG2と略される）（配列番号107）は、Maisonpierre, P.C.他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁と、Cheung, A.H.他、Genomics 第48巻 (1998年) 389〜391頁に記載されている。アンギオポエチン-1とアンギオポエチン-2（ANG-I（配列番号108）とANG-2 （配列番号107））は、血管内皮細胞の中で選択的に発現するTiesというチロシンキナーゼ・ファミリーの1つのリガンドとして発見された。Yancopoulos, G. D.他、Nature 第407巻 (2000年) 242〜248頁。現在ではアンギオポエチン・ファミリーの4つの明確なメンバーが存在している。アンギオポエチン-3とアンギオポエチン-4（Ang-3とAng-4）は、マウスとヒトの同じ遺伝子座の大きく異なる片割れを表わしている可能性がある。Kim, I.他、FEBS Let、第443巻 (1999年) 353〜356頁；Kim, I.他、J. Biol. Chem. 第274巻 (1999年) 26523〜26528頁。ANG-1とANG-2は、元々は組織培養実験においてそれぞれアゴニストとアンタゴニストとして同定された（ANG-1に関しては、Davies, S.他、Cell、第87巻 (1996年) 1161〜1169頁を参照のこと；ANG-2に関しては、Maisonpierre, P.C.他、Science 277巻 (1997年) 55〜60頁を参照のこと）。既知のすべてのアンギオポエチンは主にTie2に結合し、Ang-1とAng-2の両方とも、2nM（Kd）というアフィニティでTie2に結合する。Maisonpierre, P. C他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁。ANG-1はECの生存をサポートし、内皮細胞が完全な状態であることを促進することがわかっている。Davis, S.他、Cell、第87巻 (1996年) 1161〜1169頁；Kwak, H.J.他、FEBS Lett 第448巻 (1999年) 249〜253頁；Suri, C他、Science 第282巻 (1998年) 468〜471頁；Thurston, G.他、Science 第286巻 (1999年) 2511〜2514頁；Thurston, G.他、Nat. Med. 第6巻 (2000年) 460〜463頁。それに対してANG-2は逆の効果を持ち、生存因子VEGFまたは塩基性線維芽細胞増殖因子の不在下では血管の不安定化と退縮を促進した。Maisonpierre, P. C他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁。しかしANG-2の機能に関する多くの研究は、より複雑な状況を示唆している。ANG-2は、血管リモデリングの複雑な調節因子であり、血管の新芽形成と退縮の両方においてある役割を果たしていると考えられる。ANG-2のこのような役割を支持するように、発現分析により、成人の血管新芽形成の状況ではANG-2がVEGFとともに急速に誘導される一方で、血管退縮の状況ではVEGFの不在下でANG-2が誘導されることが明らかにされた。Holash, J.他、Science 第284巻 (1999年) 1994〜1998頁；Holash, J.他、Oncogene 第18巻 (1999年) 5356〜5362頁。文脈に依存した役割に合致するように、ANG-2は、同じ内皮細胞特異的受容体Tie-2と特異的に結合する。Tie-2はANG-1によって活性化されるが、その活性化に対しては文脈に依存した効果を有する。Maisonpierre, P. C他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁。
【０００５】
角膜血管新生アッセイにより、ANG-1とANG-2の両方が似た効果を持っていて、VEGFと相乗的に作用して新しい血管の生長を促進することがわかった。Asahara, T.他、Circ. Res.、第83巻、(1998年) 233〜240頁。試験管内では高濃度だとANG-2が血管新生も促進できるという観察結果から、投与量に依存した内皮細胞の応答が存在する可能性が提起された。Kim, I.他、Oncogene 第19巻 (2000年) 4549〜4552頁。ANG-2は、高濃度だと、血清欠乏アポトーシスの間、内皮細胞にとって、PI-3キナーゼとAktの経路によるTie2の活性化を通じたアポトーシス生存因子として作用する。Kim, I.他、Oncogene 第19巻 (2000年) 4549〜4552頁。
【０００６】
他の試験管内実験から、持続曝露の間、ANG-2の効果はTie2のアンタゴニストとしての効果からアゴニストとしての効果へと徐々にシフトする可能性があり、その後は血管の形成と新規血管の安定化に直接寄与する可能性があることが示唆された。Teichert-Kuliszewska, K.他、Cardiovasc. Res. 第49巻 (2001年) 659〜670頁。さらに、ECをフィブリン・ゲルの上で培養すると、ANG-2によるTie2の活性化も観察された。これはおそらく、ANG-2の作用がECの分化状態に依存する可能性のあることを示唆している。Teichert-Kuliszewska; K.他、Cardiovasc. Res. 第49巻 (2001年) 659〜670頁。三次元コラーゲン・ゲルの中で培養した微小血管ECでは、ANG-2はTie2の活性化を誘導し、毛細血管様構造の形成も促進することができる。Mochizuki, Y.他、J. Cell. Sci. 第115巻 (2002年) 175〜183頁。血管成熟の試験管内モデルとして3D球状共存培養を利用すると、ECと間充織細胞の直接的な接触がVEGFへの応答を阻止するのに対し、VEGFとANG-2の存在は新芽形成を誘導することがわかった。Korff, T.他、Faseb J. 第15巻 (2001年) 447〜457頁。Etoh, T.らは、Tie2を構成的に発現するECと、MMP-1、MMP-9、u-PAの発現が、VEGFの存在下でANG-2によって強く上方調節されることを明らかにした。Etoh, T.他、Cancer Res. 第61巻 (2001年) 2145〜2153頁。Lobov, I.B.らは、生体内瞳孔膜モデルを用い、内在性VEGFの存在下でANG-2が毛細血管の直径の急速な増大と、基底層のリモデリングと、内皮細胞の増殖および移動を促進し、新しい血管の新芽形成を促すことを示した。Lobov, I.B.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第99巻 (2002年) 11205〜11210頁。それとは対照的に、ANG-2は、VEGFなしでは内皮細胞の死と血管の退縮を促進する。Lobov, I.B.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第99巻 (2002年) 11205〜11210頁。同様に、Vajkoczy, P.らは、生体内腫瘍モデルを用い、多細胞凝集体が、宿主と腫瘍内皮によるVEGFR-2とANG-2の同時発現を通じた血管の新芽形成によって血管の成長を開始させることを証明した。Vajkoczy, P.他、J. Clin. Invest. 第09巻 (2002年) 777〜785頁。このモデルは、増殖する腫瘍で確立される微小血管系が、VEGFとANG-2の発現によって媒介されると考えられる連続的リモデリングを特徴とすることを示した。Vajkoczy, M.A.他、J Clin. Invest. 第09巻 (2002年) 777〜785頁。
【０００７】
Tie-2とアンギオポエチン-1をノック-アウトしたマウスの研究は同様の表現型を示しているため、アンギオポエチン-1によって刺激されたTie-2のリン酸化が発達中の血管のリモデリングと安定化を媒介し、血管新生中の血管の成熟と内皮細胞-支持細胞の接着維持を促進することが示唆されている（Dumont, D.J.他、Genes & Development、第8巻 (1994年) 1897〜1909頁；Sato, T.N.、Nature、376巻 (1995年) 70〜74頁；Thurston, G.他、Nature Medicine 第6巻 (2000年) 460〜463頁）。アンギオポエチン-1の役割は、アンギオポエチン-1が広く構成的に発現している成人では保存されていると考えられている（Hanahan, D.、Science、第277巻 (1997年) 48〜50頁；Zagzag, D.他、Exp. Neurology、159巻 (1999年) 391〜400頁）。それとは逆に、アンギオポエチン-2の発現は主に血管のリモデリングが起こっている部位に限られており、そこではアンギオポエチン-1の構成的安定化機能または成熟機能が阻止されるため、血管が、新芽形成信号により多く応答する可能性のある可塑的な状態に戻ってその状態に留まることが可能になると考えられている（Hanahan, D.、1997年；Holash, J.他、Orzcogerze 第18巻 (1999年) 5356〜5362頁；Maisonpierre, P.C.、1997年）。異常な血管新生でのアンギオポエチン-2の発現の研究により、多くのタイプの腫瘍が血管でアンギオポエチン-2を発現することが見いだされた（Maisonpierre, P. C他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁）。機能の研究から、マウス異種移植モデルではアンギオポエチン-2が腫瘍の血管新生に関与していることと、アンギオポエチン-2の過剰発現と腫瘍増殖の増加が関連していることが示唆されている（Ahmad, S.A.他、Cancer Res.、第61巻 (2001年)1255〜1259頁）。他の研究は、アンギオポエチン-2の過剰発現と腫瘍の過剰な血管形成を関連付けている（Etoh, T.他、Cancer Res. 第61巻 (2001年) 2145〜2153頁；Tanaka, F.他、Cancer Res. 62巻 (2002年) 7124〜7129頁）。
【０００８】
近年、アンギオポエチン-1、および／またはアンギオポエチン2、および／またはTie-2は抗がん療法の標的となる可能性のあることが提案されている。例えばアメリカ合衆国特許第6,166,185号、アメリカ合衆国特許第5,650,490号、アメリカ合衆国特許第5,814,464号のそれぞれには、抗Tie-2リガンドと抗Tie-2受容体の抗体が開示されている。可溶性Tie-2を用いた研究において、囓歯類で腫瘍の数とサイズの低下が報告された（Lin, P、1997; Lin, P.、1998）。Siemester, G.ら (1999年)は、Tie-2の細胞外ドメインを発現するヒト黒色腫細胞系を作り出してそれをヌード・マウスの中に注入し、可溶性Tie-2が腫瘍の増殖と血管新生を有意に抑制することを報告した。アンギオポエチン-1とアンギオポエチン2の両方ともTie-2に結合するため、アンギオポエチン-1、アンギオポエチン2、Tie-2のいずれかが抗がん療法の魅力的な標的となるかどうかをこれらの研究から明確にすることはできない。しかし効果的な抗アンギオポエチン2療法は、疾患の進行が異常な血管新生に依存するがんなどの疾患の治療に利点をもたらすと考えられており、がんでそのプロセスを阻止すると、疾患の進行を止められる可能性がある（Folkman, J.、Nature Medicine. 第1巻、(1995年) 27〜31頁）。
【０００９】
それに加え、いくつかのグループがアンギオポエチン2に結合する抗体とペプチドの利用を報告している。例えばアメリカ合衆国特許第6,166,185号、アメリカ合衆国特許出願公開第2003/10124129号. WO 03/030833、WO 2006/068953、WO 03/057134、アメリカ合衆国特許出願公開第2006/0122370号を参照のこと。
【００１０】
病巣でのアンギオポエチン2発現の効果に関する研究から、アンギオポエチン-1／Tie-2シグナルの拮抗によって緊密な血管構造が緩み、そのことによってECが血管新生誘導因子（例えばVEGF）からの活性化シグナルに曝されることがわかった（Hanahan、1997）。アンギオポエチン-1の抑制から生じるこの血管新生促進効果は、抗アンギオポエチン-1療法が有効な抗がん療法にはならないであろうことを示している。
【００１１】
ANG-2は、成長中に血管のリモデリングが起こっている部位で発現する。Maisonpierre, P.C.他、Science 第277巻 (1997年) 55〜60頁。成人では、ANG-2の発現は、血管リモデリングの部位と、高度に血管が発達した腫瘍に限られる。腫瘍の中には、グリオーム（Osada, H.他、Int. J. Oncol. 第18巻 (2001年) 305〜309頁；Koga, K.他、Cancer Res. 第61巻 (2001年) 6248〜6254頁）、肝細胞がん（Tanaka, S.他、J. Clin. Invest. 第103巻 (1999年) 341〜345頁）、胃がん（Etoh, T.他、Cancer Res. 第61巻 (2001年) 2145〜2153頁；Lee, J.H.他、Int. J. Oncol. 第18巻 (2001年) 355〜361頁）、甲状腺腫瘍（Bunone, G.他、Am. J. Pathol 第155巻 (1999年) 1967〜1976頁）、非小細胞肺がん（Wong, M. P.他、Lung Cancer 第29巻 (2000年) 11〜22頁）、大腸がん（Ahmad, S.A.他、Cancer 第92巻 (2001年) 1138〜1143頁）前立腺がん（Wurmbach, J.H.他、Anticancer Res. 第20巻 (2000年) 5217〜5220頁）が含まれる。ANG-2を発現する腫瘍細胞がいくつか見いだされている。例えばTanaka, S.ら（J. Clin. Invest. 第103巻 (1999年) 341〜345頁）は、ヒト肝細胞がん（HCC）のサンプル12個のうちの10個でANG-2 mRNAを検出した。Ellisのグループは、ANG-2 が上皮腫瘍にあまねく発現していることを報告した。Ahmad, S. A.他、Cancer 第92巻 (2001年) 1138〜1143頁。他の研究者たちも同様の発見を報告した。Chen, L.他、J. Tongji Med. Univ. 第21巻 (2001年) 228〜230頁、235頁 (2001年)。アーカイブ化されているヒト乳がんサンプルにおけるANG-2 mRNAのレベルを検出することにより、Sfilogoi, C.ら（Int. J. Cancer 第103巻 (2003年) 466〜474頁）は、ANG-2 mRNAが、二次リンパ節侵入、無疾患時間の短さ、全体的な生存率の低さと有意に関係していることを報告した。Tanaka, F.ら（Cancer Res. 第62巻 (2002年) 7124〜7129頁）は、ステージ-I〜ステージ-IIIAの非小細胞肺がん（NSCLC）の患者合計236人についてまとめている。彼らは免疫組織化学を利用し、NSCLC患者の13.9％でANG-2が陽性であることを見いだした。ANG-2陽性腫瘍の微小血管の密度は、ANG-2陰性腫瘍よりも有意に大きい。ANG-2のこのような血管新生効果は、VEGFの発現が大きいときにだけ見られる。さらに、ANG-2の陽性発現は、手術後の生存率が低いことを予測するための1つの重要な因子であった。Tanaka, F.他、Cancer Res. 第62巻 (2002年) 7124〜7129頁。しかし彼らは、ANG-2の発現と微小血管の密度の間に有意な相関を見いだしていない。Tanaka, F.他、Cancer Res. 第62巻 (2002年) 7124〜7129頁。これらの結果は、AHG-2が、いくつかのタイプのがんで患者の悪い予後の1つの指標であることを示唆している。
【００１２】
最近、Yancopoulosのグループは、ANG-2ノックアウト・マウス・モデルを用い、AHG-2が誕生後の血管新生に必要であることを報告した。Gale, N. W.他、Dev. Cell 第3巻 (2002年) 411〜423頁。彼らは、目で発生学的にプログラムされている硝子様血管系の退縮がANG-2ノックアウト・マウスで起こらず、そのマウスの網膜の血管は中心網膜動脈からは出現しないことを示した。Gale, N. W.他、Dev. Cell 第3巻 (2002年) 411〜423頁。彼らは、ANG-2の欠失によってリンパ血管系のパターニングと機能に大きな欠陥が生じることも見いだした。Gale, N. W.他、Dev. Cell 第3巻 (2002年) 411〜423頁。ANG-1を用いた遺伝子レスキューによってリンパ血管系は補正されるが、血管新生の欠陥は補正されない。Gale, N. W.他、Dev. Cell 第3巻 (2002年) 411〜423頁。
【００１３】
Petersとその同僚は、可溶性Tie2を組み換えタンパク質として供給するか、ウイルス発現ベクターに入れて供給すると、マウス・モデルにおいてマウスの乳がんと黒色腫の生体内増殖を抑制することを報告した。Lin, P.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第95巻 (1998年) 8829〜8834頁；Lin, P.他、J. Clin. Invest. 第100巻 (1997年) 2072〜2078頁。このような処理をした腫瘍組織における血管の密度は、大いに低下した。それに加え、可溶性Tie2は、腫瘍細胞で条件づけた培地を用いて刺激したラットの角膜において血管新生を阻止した。Lin, P.他、J. Clin. Invest. 第100巻 (1997年) 2072〜2078頁。さらに、Isnerと彼のチームは、VEGFにANG-2を添加すると、VEGF単独の場合よりも周囲の新生血管形成が有意に長く、かつ多くなるのを促進することを証明した。Asahara, T.他、Circ. Res.、第83巻 (1998年) 233〜240頁。過剰な可溶性Tie2受容体は、ANG-2によるVEGF誘導新生血管形成の変化を阻止した。Asahara, T.他、Circ. Res.、第83巻 (1998年) 233〜240頁。Siemeister, G.ら（Cancer Res. 第59巻 (1999年) 3185〜3191頁）は、ヌード・マウス異種移植片を用い、その異種移植片の中でFlt-1またはTie2の細胞外リガンド結合領域が過剰発現することで経路の有意な抑制が起こるが、それを他方が補償することはできないことを示した。これは、VEGF受容体経路とTie2経路を、生体内血管新生プロセスにとって不可欠な2つの独立なメディエータと見なすべきであることを示唆している。Siemeister, G.他、Cancer Res. 第59巻 (1999年) 3185〜3191頁。これは、White, R.R.ら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第100巻 (2003年) 5028〜5033頁）のより最近の論文で証明されている。彼らの研究では、ANG-2に特異的に結合してANG-2を抑制するヌクレアーゼ抵抗性RNAアプタマーが、ラット角膜マイクロポケット血管新生モデルにおいて、bFGFによって誘導される新生血管形成を有意に抑制することが証明された。
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要
本発明は、ヒト・アンギオポエチン-2に特異的に結合する抗体であって、重鎖可変領域CDR3領域として、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、配列番号49いずれかのCDR3領域を含むことを特徴とする抗体を含んでいる。
【００１５】
この抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、配列番号49いずれかのCDR3領域と、配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34、配列番号42、配列番号50いずれかのCDR2領域と、配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35、配列番号43、配列番号51いずれかのCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36、配列番号44、配列番号52いずれかのCDR3領域と、配列番号5、配列番号13、配列番号21、配列番号29、配列番号37、配列番号45、配列番号53いずれかのCDR2領域と、配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38、配列番号46、配列番号54いずれかのCDR1領域を含むことを特徴とすることが好ましい。
【００１６】
抗体は、
a）配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号55いずれかの重鎖可変領域と、
b）配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40、配列番号48、配列番号56いずれかの軽鎖可変領域を含むことを特徴とすることが好ましい。
【００１７】
好ましくは、抗体は、アンギオポエチン-1（ANG-1）に特異的に結合しないことを特徴とする。
【００１８】
本発明の更なる実施態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物である。
【００１９】
本発明の更なる実施態様は、本発明の抗体を利用した医薬組成物の製造である。
【００２０】
本発明の更なる実施態様は、転移の抑制ための本発明の抗体の使用である。
【００２１】
本発明の更なる実施態様は、がんの治療のための本発明の抗体の使用である。
【００２２】
本発明の更なる実施態様は、血管性疾患の治療のための本発明の抗体の使用である。
【００２３】
本発明の更なる実施態様は、網膜症の治療のための本発明の抗体の使用である。
【００２４】
本発明の更なる実施態様は、本発明による抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸である。
【００２５】
本発明は、さらに、本発明の核酸を含み、その核酸を原核宿主細胞または真核宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターと、そのような抗体を組み換え産生させるためのそのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞を含んでいる。
【００２７】
本発明はさらに、本発明の組み換えヒト抗体または組み換えヒト化抗体を製造する方法であって、本発明の核酸を原核宿主細胞または真核宿主細胞で発現させ、その細胞または細胞培養物の上清からその抗体を回収することを特徴とする方法を含む。本発明はさらに、このような組み換え法によって得ることのできる抗体を含む。
【００２８】
本発明による抗体は、続発腫瘍／転移の抑制、または血管性疾患、例えば網膜症の治療に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】一過性発現用IgGの発現ベクターへのクローニング：A）Ang2i-LC06（図1A）。
【図１Ｂ】一過性発現用IgGの発現ベクターへのクローニング：B）Ang2k-LC08（図1B）。
【図２】精製した抗ANG-2抗体であるAng2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08のSDS-PAGEゲル。
【図３】アンギオポエチン-Tie2相互作用ELISA。
【図４】Ang2i-LC06とAng2k-LC08によるTie2へのANG-2の結合の抑制。
【図５】Ang2i-LC06とAng2k-LC08によるTie2へのANG-1の結合の抑制。
【図６】生体内における抗ANG-2抗体の効果を調べるためのClo205異種移植片モデル。
【図７】生体内における抗ANG-2抗体の効果を調べるためのKPL-4異種移植片モデル。
【図８】Biacoreを通じたANG-1の結合のセンソグラム。
【図９Ａ】原発大腸腫瘍異種移植片（9A）における本発明の抗体による肺転移／続発腫瘍の抑制。
【図９Ｂ】原発乳房腫瘍異種移植片（9B）における本発明の抗体による肺転移／続発腫瘍の抑制。
【図１０Ａ】本発明の抗体による網膜症の抑制。
【図１０Ｂ】本発明の抗体による網膜症の抑制。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合する抗体であって、重鎖可変領域として、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、配列番号49いずれかのCDR3領域を含むことを特徴とする抗体を含んでいる。
【００３１】
本発明の一実施態様では、抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、配列番号49いずれかのCDR3領域と、配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34、配列番号42、配列番号50いずれかのCDR2領域と、配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35、配列番号43、配列番号51いずれかのCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36、配列番号44、配列番号52いずれかのCDR3領域と、配列番号5、配列番号13、配列番号21、配列番号29、配列番号37、配列番号45、配列番号53いずれかのCDR2領域と、配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38、配列番号46、配列番号54いずれかのCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００３２】
抗体は、
a）配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39、配列番号47、配列番号55いずれかの重鎖可変領域と、
b）配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40、配列番号48、配列番号56いずれかの軽鎖可変領域を含むことを特徴とすることが好ましい。
【００３３】
本発明の別の一実施態様は、ヒトANG-2に特異的に結合するが、ヒト・アンギオポエチン-1（ANG-1）には特異的に結合しないことを特徴とする抗体である。ヒトANG-2に特異的に結合するがヒトANG-1には特異的に結合しない典型的な抗体は、例えば、Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i_LC07のほか、Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i_LC07、Ang2i_LC10と同じエピトープに結合する抗体（Ang2i_LC06と同じエピトープに結合する抗体が好ましい）である。したがって本発明の一実施態様では、ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合するがヒトANG-1には特異的に結合しない抗体は、Ang2s_R3_LC03、Ang2s_LC09、Ang2i_LC06、Ang2i_LC07、Ang2i_LC10と同じエピトープに結合する（Ang2i_LC06と同じエピトープに結合することが好ましい）。ANG-2に特異的に結合するがANG-1には特異的に結合しないこのような抗体は、ANG-2特異的抗体およびANG-1特異的抗体と比べて改善された特性（例えば効果、より少ない毒性、薬理動態特性）を持つことができる。
【００３４】
したがって本発明の一実施態様では、ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合するがヒトANG-1には特異的に結合しない抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1、配列番号9、配列番号25、配列番号33、配列番号49いずれかのCDR3領域と、配列番号2、配列番号10、配列番号26、配列番号34、配列番号50いずれかのCDR2領域と、配列番号3、配列番号11、配列番号27、配列番号35、配列番号51いずれかのCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号12、配列番号28、配列番号36、配列番号52いずれかのCDR3領域と、配列番号5、配列番号13、配列番号29、配列番号37、配列番号53いずれかのCDR2領域と、配列番号6、配列番号14、配列番号30、配列番号38、配列番号54いずれかのCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００３５】
ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合するがヒトANG-1には特異的に結合しないこのような抗体は、
a）配列番号7、配列番号15、配列番号31、配列番号39、配列番号55の重鎖可変領域と、
b）配列番号8、配列番号16、配列番号32、配列番号40、配列番号56の軽鎖可変領域を含むことを特徴とすることが好ましい。
【００３６】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1または配列番号9のCDR3領域と、配列番号2または配列番号10のCDR2領域と、配列番号3または配列番号11のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4または配列番号12のCDR3領域と、配列番号5または配列番号13のCDR2領域と、配列番号6、配列番号14のCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００３７】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）配列番号7または配列番号15の重鎖可変領域と、
b）配列番号8または配列番号16の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。
【００３８】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号1のCDR3領域と、配列番号2のCDR2領域と、配列番号3のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4のCDR3領域と、配列番号5のCDR2領域と、配列番号6のCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００３９】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）配列番号7の重鎖可変領域と、
b）配列番号8の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。
【００４０】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）重鎖可変領域が、配列番号17のCDR3領域と、配列番号18のCDR2領域と、配列番号19のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号20のCDR3領域と、配列番号21のCDR2領域と、配列番号22のCDR1領域を含むことを特徴とする。
【００４１】
一実施態様では、本発明によるこの抗体は、
a）配列番号23の重鎖可変領域と、
b）配列番号24の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。
【００４２】
本発明による抗体は、ヒトIgG1サブクラスの抗体、またはヒトIgG4サブクラスの抗体であることを特徴とすることが好ましい。
【００４３】
“抗体”という用語には、抗体全体や抗体フラグメントに限らず、さまざまな形態の抗体構造が含まれる。本発明による抗体はヒト化抗体やキメラ抗体であることが好ましく、本発明の特性が維持される限りはさらに遺伝子操作された抗体であることも好ましい。
【００４４】
“抗体フラグメント”には、完全長の抗体の一部（その可変領域であることが好ましい）、またはその抗体の少なくとも抗原結合部位が含まれる。抗体フラグメントの例として、抗体フラグメントから形成される二重特異性抗体、一本鎖抗体分子（scFvまたはscFab）、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）がある。scFv抗体は、例えばHouston, J. S.、Methods in Enzymol. 第203巻 (1991年) 46〜88頁に記載されている。それに加え、抗体フラグメントは、VH領域の特性（すなわちVL領域と組み合わさることができる）またはANG-2に結合するVL領域の特性（すなわちVH領域と組み合わさって機能的抗原部位となり、そのことによってその特性を提供する）を持つ一本鎖ポリペプチドを含んでいる。SvFvsは、例えばa）ジスルフィド安定化（例えばWO 94/029350、Rajagopal, V.他、Prot. Engin.、第10巻 (1997年) 1453〜1459頁；Kobayashi, H.他、Nuclear Medicine & Biology、第25巻、(1998年) 387〜393頁；Schmidt, M.他、Oncogene (1999年) 第18巻 1711〜1721頁を参照）、またはb）安定化されたフレームワーク（例えばWO 2007/109254の特異的突然変異による；特異的な安定化されたフレームワークに関しては、例えばアメリカ合衆国特許第7,258,985号、Furrer, F.他、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 第50巻 (2009年)、 771〜778頁、Ottiger, M.他、Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 第50巻 (2009年)、779〜786頁を参照）を利用して安定化させることができる。
【００４５】
本明細書では、“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”という用語は、単一アミノ酸組成物の抗体分子の調製物を表わす。
【００４６】
“キメラ抗体”という用語は、1つの供給源または種からの可変領域（すなわち結合領域）と、異なる供給源または種からの定常領域の少なくとも一部とを含んでいて、通常は組み換えDNA技術によって調製される抗体を意味する。マウス可変領域とヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に含まれる“キメラ抗体”の他の好ましい形態は、本発明の特性を生み出すよう、特にC1qへの結合および／またはFc受容体（FcR）への結合に関して定常領域が元の抗体から改変されるか変えられたものである。このようなキメラ抗体は、“クラス・スイッチ”抗体とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリンの可変領域をコードするDNAセグメントと、免疫グロブリンの定常領域をコードするDNAセグメントとを含む発現した免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体の製造法には従来の組み換えDNA技術が含まれ、遺伝子トランスフェクション技術が従来からよく知られている。例えばMorrison, S.L.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第81巻 (1984年) 6851〜6855頁；アメリカ合衆国特許第5,202,238号、アメリカ合衆国特許第5,204,244号を参照のこと。
【００４７】
“ヒト化抗体”という用語は、フレームワークまたは“相補性決定領域”（CDR）が改変されて、親となる免疫グロブリンとは特異性が異なる免疫グロブリンのCDRを含むようにされた抗体を表わす。好ましい一実施態様では、マウスCDRがヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされて“ヒト化抗体”が調製される。例えばRiechmann, L.他、Nature 第332巻 (1988年) 323〜327頁；Neuberger, M.S.他、Nature 第314巻 (1985年) 268〜270頁を参照のこと。特に好ましいCDRは、上記の抗原を認識する配列を表わすキメラ抗体用CDRに対応する。本発明に含まれる他の形態の“ヒト化抗体”は、本発明の特性を生み出すよう、特にC1qへの結合および／またはFc受容体（FcR）への結合に関して定常領域が元の抗体の定常領域からさらに改変されるか変えられたものである。
【００４８】
本明細書では、“ヒト抗体”という用語に、ヒト遺伝子系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有する抗体が含まれるものとする。ヒト抗体は従来からよく知られている（van Dijk, M.A.とvan de Winkel, J.G.、Curr. Opin. Chem. Biol. 第5巻 (2001年) 368〜374頁）。ヒト抗体は、免疫化したときに内在性免疫グロブリンの産生がない状態でヒト抗体の完全なレパートリーまたは一連のヒト抗体の産生が可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）の中で産生させることもできる。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列突然変異マウスに移すと、抗原を用いたチャレンジによりヒト抗体が産生されるであろう（例えばJakobovits, A.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第90巻 (1993年) 2551〜2555頁；Jakobovits, A.他、Nature 362巻 (1993年) 255〜258頁；Brueggemann, M.他、Year Immunol. 第7巻 (1993年) 33〜40頁を参照）。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリの中で産生させることもできる（Hoogenboom, H. R.とWinter, G.、J. Mol. Biol. 第227巻 (1992年) 381〜388頁；Marks, J.D.他、J. Mol. Biol. 第222巻 (1991年) 581〜597頁）。Cole, S.P.C.らとBoerner, P.らの技術もヒト・モノクローナル抗体の調製に利用できる（Cole, S.P.C.他、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Liss, A.R.、(1985年) 77〜96頁；Boerner, P.他、J. Immunol. 第147巻 (1991年) 86〜95頁）。本発明によるキメラ抗体とヒト化抗体に関してすでに述べたように、本明細書では、“ヒト抗体”という用語に、本発明の特性を生み出すよう、特にC1qへの結合および／またはFc受容体（FcR）への結合に関して定常領域が例えばFc部の“クラス・スイッチ”、すなわち変化または突然変異（例えばIgG1からIgG4へ、および／またはIgG1/IgG4突然変異）によって改変された抗体も含まれる。
【００４９】
本明細書では、“組み換えヒト抗体”という用語は、組み換え手段によって調製、発現、創出、単離されたあらゆるヒト抗体を含むものとし、例えばNS0細胞やCHO細胞といった宿主細胞から、またはヒト免疫グロブリンにとってのトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離された抗体や、宿主細胞にトランスフェクトした組み換え発現ベクターを用いて発現させた抗体が挙げられる。このような組み換えヒト抗体は、再構成された形態の可変領域と定常領域を有する。本発明の組み換えヒト抗体は、生体内で体細胞高頻度突然変異を受けている。したがって組み換え抗体のVH領域とVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列とVL配列に由来していてこれら配列と関係しているとはいえ、生体内のヒト抗体生殖系列レパートリーの中に天然には存在していない可能性のある配列である。
【００５０】
本明細書では、“可変領域”（軽鎖（VL）の可変領域、重鎖（VH）の可変領域）という用語は、抗原に対する抗体の結合に直接関与する軽鎖領域と重鎖領域のペアのそれぞれを表わす。軽鎖領域と重鎖領域は一般的な構造が同じであり、各領域は、配列が広く保存されていて3つの“超可変領域”（または相補性決定領域、CDR）によって接続された4つのフレームワーク（FR）領域を含んでいる。フレームワーク領域はβ-シートのコンホメーションを採用しているため、CDRはそのβ-シート構造を接続するループを形成できる。各鎖のCDRはフレームワーク領域によって三次元構造に維持され、他の鎖からのCDRと合わさって抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖と軽鎖のCDR3領域は、本発明による抗体の結合特異性／アフィニティにおいて特に重要な役割を果たすため、本発明のさらに別の目的を提供する。
【００５１】
本明細書では、“抗体の抗原結合部”という用語は、抗体のうちで抗原の結合にとって重要なアミノ酸残基を表わす。抗体の抗原結合部は、“相補性決定領域”すなわち“CDR”からのアミノ酸残基を含んでいる。“フレームワーク”または“FR”領域は、本明細書に規定した超可変領域の残基とは異なる可変領域である。したがって抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、N末端からC末端に向けて、領域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4を含んでいる。特に重鎖のCDR3は抗原の結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を規定する。CDR領域とFR領域は、Kabat, E.A.らの『免疫学的に興味のあるタンパク質の配列』（第5版、公衆衛生サービス、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、1991年）の標準的な定義、および／または“超可変ループ”からの残基に従って決定される。
【００５２】
本明細書では、“核酸”または“核酸分子”という用語にDNA分子とRNA分子が含まれるものとする。核酸分子は一重鎖または二重鎖が可能だが、二重鎖DNAが好ましい。
【００５３】
本明細書では、“アミノ酸”という用語は天然のカルボキシα-アミノ酸のグループを表わし、その中には、アラニン（三文字コード：ala、一文字コード：A）、アルギニン（arg、R）、アスパラギン（asn、N）、アスパラギン酸（asp、D）、システイン（cys、C）、グルタミン（gln、Q）、グルタミン酸（glu、E）、グリシン（gly、G）、ヒスチジン（his、H）、イソロイシン（ile、I）、ロイシン（leu、L）、リシン（lys、K）、メチオニン（met、M）、フェニルアラニン（phe、F）、プロリン（pro、P）、セリン（ser、S）、トレオニン（thr、T）、トリプトファン（trp、W）、チロシン（tyr、Y）、バリン（val、V）が含まれる。
【００５４】
核酸は、別の核酸と機能関係にされるとき“機能可能にリンクされている”。例えばプレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、そのポリペプチドのためのDNAに機能可能にリンクされている。プロモータまたはエンハンサは、コード配列の転写に影響を与える場合に、そのコード配列に機能可能にリンクされている。リボソーム結合部位は、翻訳を容易にする位置にある場合に、機能可能にリンクされている。一般に、“機能可能にリンクされている”は、リンクされるDNA配列が同一直線上にあり、分泌リーダーの場合には連続していて読み取り枠の中にあることを意味する。しかしエンハンサは連続している必要はない。リンクは、都合のよい制限部位での連結によって実現する。そのような部位が存在しない場合には、従来からの方式に従って合成オリゴヌクレオチドからなるアドプターまたはリンカーを利用する。
【００５５】
本明細書では、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”という用語は同じ意味で用いられ、そのどれにも子孫が含まれる。したがって“形質転換体”と“形質転換された細胞”という用語には、対象となる主要な細胞と、転移回数に関係なくその細胞に由来する培養物が含まれる。また、意図的な突然変異または予期しない突然変異のため、すべての子孫のDNAの内容が正確に同じではない可能性があると理解する。元になる形質転換された細胞におけるのと機能または生物学的活性が同じものがスクリーニングされた子孫変異体が含まれる。
【００５６】
本明細書では、“結合”または“特異的な結合”という表現は、インビトロ・アッセイにおいて抗原（ANG-2）のエピトープに抗体が結合することを表わす。アッセイは、野生型ANG-2抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore、GE-ヘルスケア社、ウプサラ、スウェーデン国）（実施例3）が好ましい。結合のアフィニティは、ka（抗体／抗原複合体からの抗体の会合速度定数）、kD（解離定数）、KD（kD/ka）によって定義される。結合または特異的な結合は、10-8モル／リットル以下の結合アフィニティ（KD）を意味し、この値は10-9M〜10-13モル／リットルであることが好ましい。
【００５７】
FcγRIIIへの抗体の結合は、BIAcoreアッセイ（GE-ヘルスケア社、ウプサラ、スウェーデン国）によって調べることができる。結合のアフィニティは、ka（抗体／抗原複合体からの抗体の会合速度定数）、kD（解離定数）、KD（kD/ka）によって定義される。
【００５８】
本明細書では、“ANG-1に結合しない”または“ANG-1に特異的には結合しない”という表現は、（実施例2によれば）インビトロANG-1結合ELISAアッセイにおいて抗体のEC50値が8000ng/mlよりも大きいことを表わす。
【００５９】
“エピトープ”という用語には、抗体に特異的に結合できるあらゆるポリペプチド決定基が含まれる。いくつかの実施態様では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面基（例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、スルホニル）を含んでおり、いくつかの実施態様では、特異的な三次元構造特性および／または特異的電荷特性を持つことができる。エピトープは、抗原のうちで抗体が結合する領域である。
【００６０】
抗体の“Fc部”は、抗原に対する抗体の結合には直接関与しないが、さまざまなエフェクタ機能を示す。“抗体のFc部”は当業者によく知られた用語であり、パパインによる抗体の開裂に基づいて定義される。抗体または免疫グロブリンは、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列によってIgA、IgD、IgE、IgG、IgMというクラスに分けられ、そのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分けることができる（例えばIgGlとIgG2とIgG3とIgG4や、IgAlとIgA2）。免疫グロブリンの異なるクラスは、重鎖定常領域に応じてそれぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる。抗体のFc部は、補体の活性化、C1qへの結合、Fc受容体への結合に基づいてADCC（抗体依存性細胞傷害）とCDC（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（CDC）は、補体因子C1qがIgG抗体のほとんどのサブクラスに結合することによって開始される。補体系への抗体の影響はいくつかの条件に依存するが、C1qへの結合は、Fc部の決められた結合部位によって起こる。そのような結合部位は従来から知られており、例えばBoakle, R. J.他、Nature 第282巻 (1975年) 742〜743頁；Lukas, T.J.他、J. Immunol. 第127巻 (1981年) 2555〜2560頁；Brunhouse, R.とCebra, J.J.、Mol. Immunol. 第16巻 (1979年) 907〜917頁；Burton, D.R.他、Nature 第288巻 (1980年) 338〜344頁；Thommesen, J.E.他、Mol. Immunol. 第37巻 (2000年) 995〜1004頁；Idusogie, E.E.他、J. Immunol.、第164巻 (2000年) 4178〜4184頁；Hezareh, M.他、J. Virology 第75巻 (2001年) 12161〜12168頁；Morgan, A.他、Immunology 第86巻 (1995年) 319〜324頁；ヨーロッパ特許第0307434号に記載されている。このような結合部位は、例えばL234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、P329である（KabatのEUインデックスに従う番号、下記参照）。サブクラスIgGl、IgG2、IgG3の抗体は、通常、補体活性化と、C1qおよびC3への結合を示すのに対し、IgG4の抗体は補体系を活性化せず、C1qとC3に結合しない。
【００６１】
本発明による抗体は、ヒト起源のFc部を含むことが好ましい。これは、サブクラスIgG1のヒト抗体のFc部である。
【００６２】
本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源であることを特徴としている。そのような定常鎖は従来からよく知られており、例えばKabat, E.A.が記載している（例えばJohnson, G.とWu, T. T.、Nucleic Acids Res. 第28巻 (2000年) 214〜218頁を参照のこと）。有用なヒト重鎖定常領域は、例えば配列番号57または配列番号58のアミノ酸配列を含んでいる。有用なヒト軽鎖定常領域は、例えば、配列番号59のκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列、または配列番号60のλ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含んでいる。
【００６３】
本明細書では、“定常領域”という用語は、抗体のうちで可変領域以外の領域の合計を表わす。定常領域は抗原の結合に直接は関与しないが、さまざまなエフェクタ機能を示す。抗体は、その重鎖定常領域のアミノ酸配列によって IgA、IgD、IgE、IgG、IgMというクラスに分けられ、そのうちのいくつかはさらに、IgGlとIgG2とIgG3とIgG4や、IgAlとIgA2というサブクラスに分けられる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる。5つのクラスの抗体すべてに見られる軽鎖定常領域は、κ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる。
【００６４】
本明細書では、“ヒト起源の定常領域”という表現は、サブクラスIgGl、IgG2、IgG3、IgG4いずれかのヒト抗体の重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域κを表わす。このような定常領域は従来からよく知られており、例えばKabat, E.A.が記載している（Johnson, G.とWu, T.T.、Nucleic Acids Res. 第28巻 (2000年) 214〜218頁；Kabat, E.A.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第72巻 (1975年) 2785〜2788頁）。
【００６５】
IgG4サブクラスの抗体はFc受容体（FcγRIIIa）への結合が低下しているが、他のIgGサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかしPro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc炭化水素の喪失）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、His435は、変化した場合にやはりFc受容体への結合が低下する残基である（Shields, R.L.他、J. Biol. Chem. 第276巻 (2001年) 6591〜6604頁；Lund, J.他、FASEB J. 第9巻 (1995年) 115〜119頁；Morgan, A.他、Immunology 第86巻 (1995年) 319〜324頁；ヨーロッパ特許第0 307 434号）。
【００６６】
一実施態様では、本発明の抗体はIgG1抗体と比べてFcRへの結合が低下しており、単一特異性二価親抗体は、IgG4サブクラスのFcRへの結合、またはIgG1、IgG2サブクラスのFcRへの結合に関してS228、および／またはL234、および／またはL235に突然変異を有する、および／またはPVA236突然変異を含んでいる。一実施態様では、単一特異性二価親抗体における突然変異は、S228P、および／またはL234A、および／またはL235A、および／またはL235E、および／またはPVA236である。別の一実施態様では、単一特異性二価親抗体の突然変異は、IgG4ではS228P、IgG1ではL234AとL235Aである。重鎖定常領域を配列番号57と配列番号58に示してある。一実施態様では、単一特異性二価親抗体の重鎖定常領域は、突然変異L234AとL235Aを有する配列番号57である。一実施態様では、単一特異性二価親抗体の重鎖定常領域は、突然変異S228Pを有する配列番号58である。別の一実施態様では、単一特異性二価親抗体の軽鎖定常領域は、配列番号59のカッパ軽鎖領域、または配列番号60のラムダ軽鎖定常領域である。本発明の一実施態様では、単一特異性二価親抗体の重鎖定常領域は、突然変異S228Pを有する配列番号57または配列番号58である。
【００６７】
抗体の定常領域は、ADCC（抗体依存性細胞傷害）とCDC（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（CDC）は、補体因子C1qがたいていのIgG抗体サブクラスの定常領域に結合することによって開始される。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位における特定のタンパク質-タンパク質相互作用によって起こる。このような定常領域結合部位は従来から知られており、例えばLukas, T.J.他、J. Immunol. 第127巻 (1981年) 2555〜2560頁；Brunhouse, R.と Cebra, JJ.、Mol. Immunol. 第16巻 (1979年) 907〜917頁；Burton, D.R.他、Nature 第288巻 (1980年) 338〜344頁；Thommesen, J.E.他、Mol. Immunol. 第37巻 (2000年) 995〜1004頁；Idusogie, E.E.他、J. Immunol. 第164巻 (2000年) 4178〜4184頁；Hezareh, M.他、J. Virol. 第75巻 (2001年) 12161〜12168頁；Morgan, A.他、Immunology 第86巻 (1995年) 319〜324頁；ヨーロッパ特許第0 307 434号に記載されている。このような定常領域結合部位は、例えばアミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、P329を特徴とする（KabatのEUインデックスに従う番号）。
【００６８】
“抗体依存性細胞傷害（ADCC）”という用語は、エフェクタ細胞の存在下での本発明の抗体によるヒト標的細胞の溶解を表わす。ADCCは、エフェクタ細胞（例えば単離したばかりのPBMCや、軟層から精製したエフェクタ細胞（例えば単球、ナチュラル・キラー（NK）細胞、永続的に増殖しているNK細胞系など））の存在下で、CCR5を発現する細胞の調製物を本発明の抗体で処理することによって測定されることが好ましい。
【００６９】
“補体依存性細胞傷害（CDC）”という用語は、たいていのIgG抗体サブクラスのFc部への補体因子C1qの結合によって開始されるプロセスを表わす。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位における特定のタンパク質-タンパク質相互作用によって起こる。このようなFc部結合部位は従来から知られている（上記参照）。このようなFc部結合部位は、例えばアミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、P329を特徴とする（KabatのEUインデックスに従う番号）。サブクラスIgGl、IgG2、IgG3の抗体は、通常、C1qおよびC3への結合が含まれていて補体活性化を示すのに対し、IgG4は補体系を活性化せず、C1qおよび／またはC3に結合しない。
【００７０】
本発明による抗体は、組み換え手段によって産生される。したがって本発明の1つの特徴は、本発明の抗体をコードしている核酸であり、別の特徴は、本発明の抗体をコードしているその核酸を含む細胞である。組み換え産生のための方法は従来から広く知られており、原核細胞と真核細胞の中でタンパク質を発現させた後、抗体を単離し、通常は精製して薬理学的に許容可能な純度にする操作を含んでいる。上記の抗体を宿主細胞の中で発現させるため、改変された軽鎖と重鎖をそれぞれコードする核酸を標準的な方法で発現ベクターの中に挿入する。発現は、適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞（例えばCFO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、大腸菌細胞）の中で行なわせ、抗体をその細胞（上清、または溶解後の細胞）から回収する。抗体を組み換え産生させるための一般的な方法は従来からよく知られており、例えばMakrides, S.C.、Protein Expr. Purif. 第17巻 (1999年) 183〜202頁；Geisse, S.他、Protein Expr. Purif. 第8巻 (1996年) 271〜282頁；Kaufman, R.J.、Mol. Biotechnol. 第16巻 (2000年) 151〜161頁；Werner, R.G.、J. Drug Res. 第48巻 (1998年) 870〜880頁の概説論文に記載されている。
【００７１】
本発明の抗体は、通常の免疫グロブリン精製手続き（例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、アフィニティ・クロマトグラフィ）によって培地からうまく分離される。モノクローナル抗体をコードしているDNAとRNAは容易に単離され、一般的な手続きを利用してシークエンシングする。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAとRNAの供給源として役立つ可能性がある。DNAは、単離されると、発現ベクターに挿入することができる。次にその発現ベクターを宿主細胞（例えば別の場合に免疫グロブリン・タンパク質を産生しないHEK293細胞、CHO細胞、ミエローマ細胞）にトランスフェクトしてその宿主細胞の中で組み換えモノクローナル抗体を合成させる。
【００７２】
本発明による抗体のアミノ酸配列の変異体（または突然変異体）は、適切なヌクレオチドの変更を抗体のDNAに導入することによって、またはヌクレオチドの合成によって調製される。しかしこのような改変は、例えば上に説明したように非常に限られた範囲でしか実行できない。例えば改変によって抗体の上記の特性（例えばIgGのアイソタイプ、抗原の結合）は変化しないが、組み換え産生の収率、タンパク質の安定性、精製の容易さが改善される可能性がある。
【００７３】
本明細書で用いる“宿主細胞”という用語は、本発明の抗体を産生するように操作できるあらゆる種類の細胞系を表わす。一実施態様では、HEK293細胞とCHO細胞を宿主細胞として用いる。本明細書では、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”という表現は同じ意味で用いられ、そのどれにも子孫が含まれる。したがって“形質転換体”と“形質転換された細胞”という用語には、対象となる主要な細胞と、転移回数に関係なくその細胞に由来する培養物が含まれる。また、意図的な突然変異または予期しない突然変異のため、すべての子孫のDNAの内容が正確に同じではない可能性があると理解する。元になる形質転換された細胞におけるのと機能または生物学的活性が同じものがスクリーニングされた子孫変異体が含まれる。
【００７４】
NS0細胞における発現は、例えばBarnes, L.M.他、Cytotechnology 第32巻 (2000年) 109〜123頁；Barnes, L.M.他、Biotech. Bioeng. 第73巻 (2001年) 261〜270頁に記載されている。一過的発現は、例えばDurocher, Y.他、Nucl. Acids. Res. 第30巻 (2002年) E9頁に記載されている。可変領域のクローニングは、Orlandi, R.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第86巻 (1989年) 3833〜3837頁；Carter, P.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第89巻 (1992年) 4285〜4289頁；Norderhaug, L.他、J. Immunol. Methods 第204巻 (1997年) 77〜87頁に記載されている。好ましい一過的発現系（HEK 293）は、Schlaeger, E.-J.とChristensen, K.、Cytotechnology 第30巻 (1999年) 71〜83頁；Schlaeger, E.-J.、J. Immunol. Methods 第194巻 (1996年) 191〜199頁に記載されている。
【００７５】
例えば原核細胞に適した対照配列は、プロモータと、場合によってはオペレータ配列と、リボソーム結合部位とを含んでいる。真核細胞は、プロモータと、エンハンサと、ポリアデニル化シグナルとを利用することが知られている。
【００７６】
核酸は、他の核酸配列と機能関係にされるときに“機能可能にリンクされている”。例えばプレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合に、そのポリペプチドのためのDNAに機能可能にリンクされている。プロモータまたはエンハンサは、コード配列の転写に影響を与える場合に、そのコード配列に機能可能にリンクされている。リボソーム結合部位は、翻訳を容易にする位置にある場合に、機能可能にリンクされている。一般に、“機能可能にリンクされている”は、リンクされるDNA配列が連続であり、分泌リーダーの場合には連続で読み取り枠の中にあることを意味する。しかしエンハンサは連続である必要はない。リンクは、都合のよい制限部位での連結によって実現する。そのような部位が存在しない場合には、従来からの方式に従って合成オリゴヌクレオチドからなるアドプターまたはリンカーを利用する。
【００７７】
抗体の精製は、細胞成分または他の汚染物質（例えば他の細胞の核酸やタンパク質）を除去するために標準的な技術（例えば、アルカリ／SDS処理、CsClバンディング、カラム・クロマトグラフィ、アガロース・ゲル電気泳動、従来からよく知られている他の技術）によって実施する。Ausbel, F.他編、『分子生物学の最新プロトコル』（グリーン・パブリッシング・アンド・ワイリー・インターサイエンス社、ニューヨーク、1987年）を参照のこと。タンパク質の精製に関してさまざまな方法がしっかりと確立されて広く使用されている。例えば、微生物のタンパク質を用いたアフィニティ・クロマトグラフィ（プロテインAアフィニティ・クロマトグラフィ、またはプロテインGアフィニティ・クロマトグラフィ）、イオン交換クロマトグラフィ（例えばカチオン交換クロマトグラフィ（カルボキシルメチル樹脂））、アニオン交換クロマトグラフィ（アミノエチル樹脂）、混合モード交換クロマトグラフィ）、イオウ親和性吸着（例えばβ-メルカプトエタノールや他のSHリガンド）、疎水性相互作用クロマトグラフィまたは芳香族吸着クロマトグラフィ（例えばフェニル-セファロース、アザ-アレノ親和性樹脂、m-アミノフェニルボロン酸を使用）、金属キレート・アフィニティ・クロマトグラフィ（例えばNi(II)-アフィニティ材料、Cu(II)-アフィニティ材料を使用）、サイズ排除クロマトグラフィ、電気泳動的方法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）などがある（Vijayalakshmi, M.A.、Appl. Biochem. Biotech. 第75巻 (1998年) 93〜102頁）。
【００７８】
本発明には、治療を必要とする患者の治療法として、その患者に本発明の抗体を治療に有効な量投与することを特徴とする方法が含まれる。
【００７９】
本発明には、本発明の抗体を利用した治療が含まれる。
【００８０】
本発明には、本発明の抗体を利用した転移抑制薬の調製が含まれる。
【００８１】
本発明には、本発明の抗体を利用したがん治療薬の調製が含まれる。
【００８２】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の特徴は、本発明の抗体を利用した医薬組成物の製造である。本発明のさらに別の特徴は、本発明の抗体を含む医薬組成物の製造法である。別の特徴では、本発明により、本発明の抗体を含んでいて医薬用基剤とともに製剤にされた組成物（例えば医薬組成物）が提供される。
【００８３】
本発明の別の1つの特徴は、転移を抑制するための蒸気医薬組成物である。
【００８４】
本発明の別の1つの特徴は、転移を抑制するための本発明による抗体である。
【００８５】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を利用した転移抑制用の薬の製造である。
【００８６】
本発明の別の1つの特徴は、原発がんに苦しむ患者の転移を抑制するため、そのような予防的治療を必要とする患者に本発明の抗体を投与することによる方法である。
【００８７】
われわれは、（腫瘍細胞を腹腔内に注入する実験モデルとは異なり）同所性がんモデルと皮下がんモデルにおいて、生体内の自発的転移／続発腫瘍が非常に効果的に抑制されることを示すことができた（実施例9参照）。これは、細胞が原発腫瘍から拡散して肺や肝臓といった二次臓器（そこに続発腫瘍がある）に転移する臨床状況に近い。
【００８８】
本発明による“転移”という用語は、患者の体内でがん性細胞が原発腫瘍から他の1つ以上の部位に移動し、そこで続発腫瘍が増殖することを表わす。がんが転移したかどうかを明らかにするMetastasMeansが従来から知られており、その中には、骨スキャン、胸部X線、CATスキャン、MRIスキャン、腫瘍マーカー試験が含まれる。
【００８９】
本明細書では、“転移の抑制”または“続発腫瘍の抑制”という用語は同じ意味であり、再発したHER2陽性がんに苦しむ患者における転移に対する予防剤を表わす。このようにして、患者の体内でがん性細胞が原発腫瘍から他の1つ以上の部位にさらに移動するのを抑制するか少なくする。これは、原発腫瘍または原発がんの転移が抑制され、または遅延し、または減少し、したがって続発腫瘍の増殖が抑制され、または遅延し、または減少することを意味する。転移、すなわち肺の続発腫瘍が抑制されるか減少することが好ましい。これは、原発腫瘍から肺へのがん性細胞の転移が抑制されるか減少することを意味する。
【００９０】
本発明の別の1つの特徴は、がんを治療するための上記医薬組成物である。
【００９１】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を利用したがんの治療である。
【００９２】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を利用したがん治療薬の製造である。
【００９３】
本発明の別の1つの特徴は、がんに苦しむ患者を治療するため、そのような治療を必要とする患者に本発明の抗体を投与することによる方法である。
【００９４】
本明細書では、“医薬用基剤”に、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが含まれる。基剤は、（例えば注射や輸液による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、上皮投与に適していることが好ましい。
【００９５】
本発明の組成物は、従来から知られている多彩な方法で投与することができる。当業者であればわかるように、投与経路および／または投与法は、望む結果が何であるかに応じて異なる。本発明の化合物をある投与経路で投与するには、その化合物の不活化を阻止する材料でその化合物を被覆するか、その化合物をその材料とともに投与する必要があろう。例えば本発明の化合物は、適切な基剤（例えばリポソーム）または希釈剤の中に入れて患者に投与するとよい。薬理学的に許容可能な希釈剤として、生理食塩水、水性緩衝溶液などがある。医薬用基剤として、減菌水溶液、減菌分散液や、減菌水溶液または減菌分散液を必要に応じて調製するための殺菌粉末などがある。このような媒体を薬理学的に活性な物質で利用することは従来から知られている。
【００９６】
本明細書では、“非経口投与”と“非経口で投与される”という表現は、腸投与と局所投与以外の投与法を意味し、通常は注射による。例えば、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、硬膜下腔内投与、包内投与、眼窩内投与、心臓内投与、皮内投与、腹腔内投与、経気管投与、皮下投与、表皮下投与、関節内投与、被膜下投与、クモ膜下投与、脊椎内投与、硬膜外投与、胸骨内注射、輸液などがあるが、これだけに限られるわけではない。
【００９７】
本明細書では、がんという用語は増殖性疾患を表わし、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（NSCL）がん、気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または首部のがん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、大腸がん、乳がん、ファロピウス管のがん、子宮内膜のがん、子宮頸部のがん、膣のがん、陰門のがん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎腺がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（CNS）の新生物、脊柱腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性神経膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平細胞がん、下垂体腺腫、ユーイング肉腫があり、その中には、これらのがんの難治性のものや、これらのがんの2つ以上の組み合わせが含まれる。
【００９８】
本発明の別の1つの特徴は、抗血管新生剤としての上記組成物である。このような抗血管新生剤は、がん（特に固形腫瘍）や他の血管性疾患の治療に用いることができる。
【００９９】
本発明の別の1つの特徴は、本発明の抗体を利用した血管性疾患の治療薬の製造である。
【０１００】
本発明の別の1つの特徴は、血管性疾患を治療するための本発明の抗体である。
【０１０１】
好ましい一実施態様は、網膜症を治療するための本発明の抗体である。
【０１０２】
好ましい一実施態様は、本発明の抗体を利用した網膜症の治療薬の製造である。
【０１０３】
本発明の別の1つの特徴は、血管性疾患に苦しむ患者を治療するため、そのような治療を必要とする患者に本発明の抗体を投与することによる方法である。
【０１０４】
“血管性疾患”という用語に含まれるのは、がん、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、外傷、敗血症、COPD、喘息、糖尿病、AMD、網膜症、脳卒中、脂肪症、急性肺損傷、出血、血管漏れ（例えばサイトカインによって誘導されるもの）、アレルギー、グレーヴズ病、橋本自己免疫甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞性動脈炎、関節リウマチ、全身性ループス・エリテマトーデス（SLE）、ループス腎炎、クローン病、多形性硬化症、潰瘍性大腸炎、固形腫瘍、眼内新生血管症候群（例えば増殖性網膜症、加齢性黄斑変性（AMD））、リウマチ性関節炎、乾癬などである（Folkman, J.他、J. Biol. Chem. 第267巻 (1992年) 10931〜10934頁；Klagsbrun, M.他、Annu. Rev. Physiol. 第53巻 (1991年) 217〜239頁；『眼科疾患の病理生物学、ダイナミックなアプローチ』（Garner, A.、Klintworth, G. K. (編)、第2版、マルセル・デッカー社、ニューヨーク、1994年）の中のGarner, A.、「血管性疾患」、1625〜1710頁）。
【０１０５】
これら組成物は、アジュバント（例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤）も含んでいてよい。微生物の存在抑制は、殺菌手続きと、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）の含有の両方（特に前者）によって保証できる。等張剤（例えば糖、塩化ナトリウムなど）を組成物に含めることも望ましかろう。それに加え、注射可能な医薬剤形を長期間にわたって吸収させることは、吸収を遅らせる物質（例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチン）を含めることによって可能になろう。
【０１０６】
本発明の化合物（適切な水和物の形態で使用できる）および／または本発明の医薬組成物は、選択する投与経路に関係なく、当業者に知られている従来法で薬理学的に許容可能な剤形にされる。
【０１０７】
医薬組成物に含まれる活性成分の実際の投与レベルは、個々の患者、個々の組成物、個々の投与法にとって毒性なしに望ましい治療反応を実現するのに有効な活性成分の量が得られるように変えることができる。選択した投与量のレベルは、さまざまな薬理動態因子に依存するであろう。そのような因子として、使用する本発明の個々の組成物の活性、投与経路、投与時刻、使用する個々の化合物の排泄速度、治療期間、使用する個々の組成物と組み合わせて用いる他の薬および／または化合物および／または材料、治療している患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態、既往歴や、医療でよく知られている同様の因子などがある。
【０１０８】
この組成物は、注射器で供給される限りは、殺菌されていて流体でなければならない。基剤は、水に加え、等張緩衝化生理食塩溶液が好ましい。
【０１０９】
例えばコーティング（レシチンなど）を用いることによって、必要な粒径を維持することによって（分散液の場合）、界面活性剤の利用によって、適度な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物に等張剤として例えば糖、ポリアルコール（マンニトールやソルビトールなど）、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。
【０１１０】
本明細書では、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”という表現は同じ意味で用いられ、そのどれにも子孫が含まれる。したがって“形質転換体”と“形質転換された細胞”という用語には、対象となる主要な細胞と、転移回数に関係なくその細胞に由来する培養物が含まれる。また、意図的な突然変異または予期しない突然変異のため、すべての子孫のDNAの内容が正確に同じではない可能性があると理解する。元になる形質転換された細胞におけるのと機能または生物学的活性が同じものがスクリーニングされた子孫変異体が含まれる。別のことを意味する場合には、文脈から明らかであろう。
【０１１１】
本明細書では、“形質転換”という用語は、ベクター／核酸を宿主細胞に移すプロセスを表わす。強力な細胞壁のない細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばGraham, F. L.とvan der Eb、Virology 第52巻 (1973年) 456〜467頁に記載されているリン酸カルシウム沈降法によってトランスフェクションを行なう。しかしDNAを細胞内に導入する他の方法（例えば核注入やプロトプラスト融合による方法）も利用できる。原核細胞、または実質的に細胞壁を有する細胞を用いる場合には、例えばトランスフェクションを行なう1つの方法は、Cohen, F. N.ら（PNAS. 69巻 (1972年) 7110頁以降）が記載しているように、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
【０１１２】
本明細書では、“発現”は、核酸をmRNAに転写するプロセスおよび／または転写されたmRNA（転写産物とも呼ばれる）をその後翻訳してペプチド、ポリペプチド、タンパク質にするプロセスを表わす。転写産物とコードされたポリペプチドは、まとめて遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合には、真核細胞における発現にmRNAのスプライシングが含まれる可能性がある。
【０１１３】
“ベクター”は、挿入された核酸分子を宿主細胞の中および／または宿主細胞の間に移す、特に自己複製性の核酸分子である。この用語には、主としてDNAまたはRNAを細胞の中に挿入する（例えば染色体と一体化させる）機能を持つベクターと、主にDNAまたはRNAの複製のための複製ベクターと、DNAまたはRNAの転写および／または翻訳の機能を持つ発現ベクターが含まれる。また、ここに記載した2つ以上の機能を持つベクターも含まれる。
【０１１４】
“発現ベクター”は、適切な宿主細胞の中に導入されたときに転写され翻訳されてポリペプチドになることのできるポリヌクレオチドである。“発現系”は、通常は、望む発現産物を生み出すことのできる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を表わす。
【０１１５】
以下の実施例、配列リスト、図面は、本発明の理解を助けるために提示したのであり、本発明の真の範囲は添付の請求項に開示されている。本発明の精神から逸脱することなく、開示した手続きを変更できるものと理解する。
【０１１６】
実験手続き1
材料と一般的な方法
ヒト免疫グロブリンの軽鎖と重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A.らの『免疫学的に興味あるタンパク質の配列』（第5版、公衆衛生サービス、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、1991年）に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、EU番号に従って番号を付けられており、それを参照する（Edelman, G. M.他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第63巻 (1969年) 78〜85頁；Kabat, E.A.他、『免疫学的に興味あるタンパク質の配列』（第5版、公衆衛生サービス、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、1991年））。
【０１１７】
組み換えDNA技術
Sambrook, J.他、『分子クローニング；実験室マニュアル』（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、1989年）に記載されているように、標準的な方法を利用してDNAを操作した。分子生物学用の試薬を製造者の指示に従って使用した。
【０１１８】
遺伝子合成
化学合成によって作ったオリゴヌクレオチドから望む遺伝子セグメントを調製した。その遺伝子セグメントは、個々の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接している。PCR増幅を含むアニーリングとオリゴヌクレオチドの連結によってそれらの遺伝子セグメントを組み立てた後、pPCRScript（ストラタジーン社）をベースにしたpGA4クローニング・ベクターに指定の制限部位（例えばKpnI/SacIまたはAscI/PacI）を通じてクローニングした。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列をDNAシークエンシングによって確認した。合成した遺伝子フラグメントは、ジーンアート社（レーゲンスブルク、ドイツ国）で所定の仕様に従って順番に並べた。
【０１１９】
DNA配列の決定
メディゲノミクス社（マルチンスリート、ドイツ国）またはセキサーヴ社（ファーターシュテッテン、ドイツ国）で二本鎖シークエンシングによってDNA配列を決定した。
【０１２０】
DNA配列とタンパク質配列の分析と配列データの管理
GCG（ジェネティクス・コンピュータ・グループ、マディソン、ウィスコンシン州）のソフトウエア・パッケージ（バージョン10.2）とインフォマックス社のVector NT1 Advance suite（バージョン8.0）を用いて配列を作り出し、マッピングし、分析し、注釈を付け、図示した。
【０１２１】
発現ベクター
上記の抗体を発現させるため、CMV-イントロンAを有するcDNA組織またはCMVプロモータを有するゲノム組織に基づく（例えばHEK293 EBNA細胞またはHEK293-F細胞の中での）一過性発現用または（例えばCHO細胞の中での）安定な発現用のさまざまな発現プラスミド（例えば図1）を適用した。
【０１２２】
ベクターは、抗体発現カセット以外に以下のものを含んでいた：
- このプラスミドを大腸菌の中で複製できるようにする複製起点、
- 大腸菌の中でアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
【０１２３】
抗体遺伝子の転写ユニットは、以下の要素で構成されている：
- 5'末端にある特有の制限部位、
- ヒト・サイトメガロウイルスからの極初期エンハンサと極初期プロモータ、
- cDNA組織の場合には、それに続くイントロンA配列、
- ヒト抗体遺伝子の5'非翻訳領域、
- 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
- cDNAとしての、または免疫グロブリンのエキソン-イントロン組織を有するゲノム組織としてのヒト抗体鎖（重鎖、改変された重鎖、軽鎖のいずれか）、
- ポリアデニル化シグナル配列を有する3'非翻訳領域、
- 3'末端にある特有の制限部位。
【０１２４】
以下に記載する選択した抗体の重鎖配列を含む融合タンパク質をPCRおよび／または遺伝子合成によって生成させ、既知の組み換え法と組み換え技術を利用して対応する核酸セグメントを接続することによって組み立てた（例えばゲノム重鎖ベクター内の唯一のNsiI部位とEcoRI部位を用いる）。サブクローニングした核酸配列をDNAシークエンシングによって確認した。一過性トランスフェクションと安定なトランスフェクションのため、形質転換した大腸菌培養物（Nucleobond AX、マシェレー-ネイゲル社）からプラスミドを調製することによってより大量のプラスミドを調製した。
【０１２５】
細胞培養技術
『細胞生物学の最新プロトコル』（2000年、Bonifacino, J.S.、Dasso, M.、Harford, J.B.、Lippincott-Schwartz, J. 、Yamada, K.M. (編)、ジョン・ワイリー＆サンズ社）に記載されている標準的な培養技術を利用した。
【０１２６】
HEK293-F系での一過性トランスフェクション
HEK293-F系（インヴィトロジェン社）を製造者の指示に従って用い、重鎖または改変した重鎖のそれぞれと、対応する軽鎖とをコードしている2種類のプラスミドの一過性トランスフェクションによって抗体を生成させた。簡単に述べると、振盪フラスコまたは撹拌式発酵器の中で無血清FreeStyle 293発現培地に懸濁させた増殖中のHEK293-F細胞（インヴィトロジェン社）を、2種類の発現プラスミドのそれぞれと293フェクチンまたはフェクチン（インヴィトロジェン社）の混合物をトランスフェクトした。例えば2リットルの振盪フラスコ（コーニング社）に関しては、600mlの中に細胞を1.0×106個/mlの密度で入れ、120rpm、8%％CO2にてインキュベートした。翌日、A）重鎖または改変した重鎖のそれぞれと、対応する軽鎖とをコードしているプラスミドDNA（1μg/ml）を同じモル比にしたもの合計600μgを含む20mlのOpti-MEM（インヴィトロジェン社）と、B）20mlのOpti-MEM＋1.2mlの293フェクチンまたはフェクチン（2μl/ml）との混合物約42mlとともに、細胞を約1.5×106個/mlの密度でトランスフェクトした。発酵期間中、グルコースの消費に合わせてグルコース溶液を添加した。分泌された抗体を含む上清を5〜10日後に回収し、その上清から抗体を直接精製するか、その上清を凍結させて保管した。
【０１２７】
タンパク質の測定
精製した抗体と誘導体のタンパク質濃度を、280nmで光学密度（OD）を測定することによって明らかにした。そのとき、Pace, C.N.,他、Protein Science、第4巻 (1995年) 2411〜2423頁に従ってアミノ酸配列に基づいて計算したモル消滅係数を利用した。
【０１２８】
上清の中の抗体濃度測定
細胞培養物の上清に含まれる抗体と誘導体の濃度を、プロテインAアガロース-ビーズ（ロシュ社）を用いた免疫沈降によって見積もった。60μlのプロテインAアガロース-ビーズをTBS-NP40（50mMのトリス、pH7.5、150mMのNaCl、1％のNonidet-P40）の中で3回洗浄した。その後、細胞培養物の上清1〜15mlを、TBS-NP40の中であらかじめ平衡させたプロテインAアガロース-ビーズに注ぐ。室温にて1時間にわたってインキュベートした後、Ultrafree-MC-フィルタ・カラム（アミコン社）上で、ビーズを0.5mlのTBS-NP40を用いて1回洗浄し、0.5mlの2×リン酸緩衝化生理食塩水（2×PBS、ロシュ社）を用いて2回洗浄し、0.5mlの100mM クエン酸Na（pH5.0）を用いて軽く4回洗浄する。35μlのNuPAGE（登録商標）LDSサンプル緩衝液（インヴィトロジェン社）を添加することにより、結合した抗体を溶離させる。サンプルの半分を、それぞれNuPAGE（登録商標）サンプル還元剤と組み合わせるか、還元せずに放置した後、10分間にわたって70℃に加熱する。その後、20μlを4〜12％のNuPAGE（登録商標）ビス-トリスSDS-PAGE（インヴィトロジェン社）（非還元SDS-PAGEに関してはMOPS緩衝液、還元SDS-PAGEに関しては、NuPAGE（登録商標）抗酸化ランニング緩衝液添加剤（インヴィトロジェン社）を含むMES緩衝液）に注ぎ、クーマシー・ブルーで染色する。
【０１２９】
細胞培養物の上清に含まれる抗体と誘導体の濃度をプロテインA-HPLCクロマトグラフィによって測定した。簡単に述べると、プロテインAに結合する抗体と誘導体を含む細胞培養物の上清を、50mMのK2HPO4＋300mMのNaCl（pH7.3）の中にあるHiTrapプロテインAカラム（GEヘルスケア社）に注ぎ、Dionex HPLCシステム上で50mMの酢酸（pH2.5）を用いてマトリックスから溶離させた。溶離したタンパク質をUV吸光度とピーク面積の積分によって定量した。精製した基準IgG1抗体を基準として用いた。
【０１３０】
あるいは細胞培養物の上清に含まれる抗体と誘導体の濃度は、サンドイッチ-IgG-ELISAによって測定した。簡単に述べると、StreptaWell高結合ストレプトアビジンA-96ウエル微量滴定プレート（ロシュ社）を、0.1μg/mlのビオチニル化した抗ヒトIgG捕獲分子F(ab')2<h-Fcγ>BI（ダイアノヴァ社）をウエル1つにつき100μl用いて室温にて1時間にわたって覆うか、4℃にて一晩にわたって覆った後、200μl/ウエルのPBS＋0.05％のトゥイーン（PBST、シグマ社）で3回洗浄した。細胞培養物の上清を含むPBS（シグマ社）に各抗体を希釈した一連の希釈液をウエル1つにつき100μl添加し、微量滴定プレート振盪機の上で室温にて1〜2時間にわたってインキュベートした。200μl/ウエルのPBSTでウエルを3回洗浄した後、結合した抗体を、0.1μg/mlのF(ab')2<h-Fcγ>POD（ダイアノヴァ社）100μlを検出抗体として用い、微量滴定プレート振盪機の上で室温にて1〜2時間かけて検出した。結合しなかった検出抗体は200μl/ウエルのPBSTで3回洗浄して除去し、結合した検出抗体は、100μlのABTS/ウエルを添加することによって検出した。吸光度の測定は、Tecan蛍光分光器を用いて測定波長405nmにて実施した（参照波長492nm）。
【０１３１】
タンパク質の精製
標準的なプロトコルを参照し、濾過した細胞培養物の上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインAセファロース・カラム（GEヘルスケア社）に注ぎ、PBSで洗浄した。酸性pHで抗体を溶離させた後すぐにサンプルを中和した。20mMのヒスチジン＋140mMのNaCl（pH6.0）の中でサイズ排除クロマトグラフィ（Superdex 200、GEヘルスケア社）を実施することにより、凝集したタンパク質をモノマー抗体から分離した。モノマー抗体画分をプールし、必要に応じて例えばミリポア社のAmicon Ultra（30 MWCO）遠心分離濃縮機を用いて濃縮し、-80℃で保管した。サンプルの一部を使用し、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィ、質量分析、内毒素測定によってあとでタンパク質の分析と特徴分析を行なった（図2参照）。
【０１３２】
SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）プレ-キャスト・ゲル・システム（インヴィトロジェン社）を製造者の指示に従って使用した。特に、4〜20％のNuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）トリス-グリシン・プレ-キャスト・ゲルとNovex（登録商標）トリス-グリシンSDSランニング緩衝液を用いた。（例えば図2参照）。NuPAGE（登録商標）サンプル還元剤を添加してサンプルを還元した後、ゲルを走らせた。
【０１３３】
分析的サイズ排除クロマトグラフィ
抗体の凝集とオリゴマーの状態を明らかにするため、HPLCクロマトグラフィによってサイズ排除クロマトグラフィを実施した。簡単に述べると、プロテインAで精製した抗体を、Dionex HPLCシステムにおいて300mMのNaCl＋50mMのKH2PO4/K2HPO4（pH7.5）の中でTosoh TSKgel G3000SWカラムに注ぐか、Dionex HPLCシステムにおいて2×PBSの中でSuperdex 200カラム（GEヘルスケア社）に注いだ。溶離したタンパク質をUV吸光度とピーク面積の積分によって定量した。BioRadゲル濾過基準151-1901を基準として用いた。
【０１３４】
質量分析
エレクトロスプレー・イオン化質量分析（ESI-MS）により、脱グリコシル化された抗体の全質量を測定して確認した。簡単に述べると、精製した抗体100μgを、100mMのKH2PO4/K2HPO4（pH7）の中で20mUのN-グリコシダーゼF（PNGアーゼF、ProZyme）を用い、2mg/mlまでのタンパク質濃度で37℃にて12〜24時間にわたって脱グリコシル化した後、セファデクスG25カラム（GEヘルスケア社）を用いたHPLCによって脱塩した。脱グリコシル化と還元の後、重鎖と軽鎖それぞれの質量をESI-MSによって測定した。簡単に述べると、115μlの中の抗体50μgを、60μlの1M TCEPおよび50μlの8Mグアニジニウム-ヒドロクロリドとともにインキュベートした後、脱塩した。全質量と、還元された重鎖および軽鎖の質量を、NanoMate源を備えるQ-StarエリートMSシステムを用いたESI-MSによって測定した。
【０１３５】
ANG-1とANG-2の結合ELISA
ANGPT（アンギオポエチン1またはアンギオポエチン2）に向かう抗体の結合特性を、完全長のアンギオポエチン-2-Hisタンパク質（R&Dシステムズ社、#623-AN/CF、または自家製材料）またはアンギオポエチン-1-Hisタンパク質（R&Dシステムズ社、#923-AN）を用いたELISAアッセイで評価した。そのために1mg/μlの組み換えヒト・アンギオポエチン-1またはアンギオポエチン-2（基剤なし）を100μl含むPBS（シグマ社）で96ウエルのプレート（Falconポリスチレン透明増強微量滴定プレート、またはNunc Maxisorb）を室温にて2時間にわたって、または4℃にて一晩にわたって被覆した。ウエルを300μlのPBST（0.2％トゥイーン20）で3回洗浄した後、200μlの2％BSA＋0.1％トゥイーン20で室温にて30分間にわたってブロックし、その後300μlのPBSTで3回洗浄した。<ANG-2>に対する精製試験抗体を希釈した一連の希釈液（40pM〜0.01pM）と、参照基準としてのMab536（Oliner, J.他、Cancer Cell、2004年11月6日号、507〜516頁、アメリカ合衆国特許出願公開第2006/0122370号）を含むPBSを100μl/ウエルの割合でウエルに添加し、微量滴定プレート振盪機の上で室温にて1時間にわたってインキュベートした。ウエルを300μlのPBST（0.2％トゥイーン20）で3回洗浄した後、結合した抗体を、0.1μg/mlのF(ab')<hk>POD（バイオゾル社カタログ番号206005）を含む2％BSA＋0.1％トゥイーン20を検出抗体として0.1μg/ウエルの割合で用い、微量滴定プレート振盪機の上で室温にて1時間かけて検出した。結合しなかった検出抗体は300μl/ウエルのPBSTで3回洗浄して除去し、結合した検出抗体は、100μlのABTS/ウエルを添加することによって検出した。吸光度の測定は、Tecan蛍光分光器を用いて測定波長405nmにて実施した（参照波長492nm）。
【０１３６】
ANG-2結合BIACORE
BIACORE T100装置（GEヘルスケア・バイオサイエンシーズ社、ウプサラ、スウェーデン国）を用い、抗原（例えばヒトANG-2）への抗体の結合を表面プラズモン共鳴によって調べた。簡単に述べると、アフィニティを測定するため、ヤギ<hIgG-Fcγ>ポリクローナル抗体を、ヒトANG-2に対してその抗体を提示することを目的として、アミン・カップリングを通じてCM4チップの表面に固定化した。結合は、HBS緩衝液（HBS-P（10mMのヘペス、150mMのNaCl、0.05％のトゥイーン20、pH7.4））の中で25℃にて測定した。精製したANG-2-His（R&Dシステムズ社、または自家精製）を添加し、0.41nM〜200nMの間のさまざまな濃度の溶液にした。ANG-2を3分間注入することによって会合を測定した。解離は、チップの表面をHBS緩衝液で5分間にわたって洗浄することによって測定し、1：1ラングミュア結合モデルを利用してKD値を推定した。ANG-2調製物の不均一性のため、1：1の結合は観察できなかった。したがってKD値は相対的な評価にすぎない。システムに固有のベースラインのドリフト補正とノイズ信号低減のため、負の対照のデータ（例えば緩衝液の曲線）をサンプルの曲線から差し引いた。Biacore T100評価ソフトウエア1.1.1を用いてセンソグラムの分析とアフィニティ・データの計算を行なった。あるいはANG-2は、CM5チップの表面にアミン・カップリング（無BSA）を通じて固定化したPentaHisAntibody（PentaHis-Ab無BSA、キアジェン社、第34660番）を通じ、2000〜1700RUの捕獲レベルで捕獲できた（下記参照）。
【０１３７】
Tie-2に対するヒトANG-2の結合の抑制（ELISA）
384ウエル微量滴定プレート（マイクロコート社、ドイツ国、カタログ番号464718）上で室温にて相互作用ELISAを実施した。各インキュベーション・ステップの後、プレートをPBSTで3回洗浄した。ELISAプレートを0.5μg/mlのTie-2タンパク質（R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号313-TI）で少なくとも2時間にわたって覆った。その後、0.2％のトゥイーン20と2％BSA（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国）を補足したPBSでウエルを1時間にわたってブロックした。精製抗体をPBSに希釈した希釈液を0.2μg/mlのヒト・アンギオポエチン-2（R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号623-AN）とともに室温にて1時間にわたってインキュベートした。洗浄後、0.5μg/mlのビオチニル化した抗アンギオポエチン-2クローンBAM0981（R&Dシステムズ社、イギリス国）と1：3000に希釈したストレプトアビジンHRP（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、カタログ番号11089153001）の混合物を1時間かけて添加した。その後、プレートをPBSTで6回洗浄した。調製したばかりのABTS試薬（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、緩衝液#204 530 001、錠剤#11 112 422 001）を用いて室温にて30分間にわたってプレートを現像した。吸光度を405nmで測定した。
【０１３８】
Tie-2に対するヒトANG-1の結合の抑制（ELISA）
384ウエル微量滴定プレート（MaxiSorb Nunc#442768）上で室温にて相互作用ELISAを実施した。各インキュベーション・ステップの後、プレートをPBSTで3回洗浄した。ELISAプレートを0.5μg/mlのTie-2タンパク質（R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号313-TI、または自家製材料）で少なくとも2時間にわたって覆った。その後、0.2％のトゥイーン20と2％BSA（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国）を補足したPBSでウエルを1時間にわたってブロックした。精製抗体をPBSに希釈した希釈液を0.2μg/mlのヒト・アンギオポエチン-1（R&Dシステムズ社、#923-AN/CF、または自家製材料）とともに室温にて1時間にわたってインキュベートした。洗浄後、0.5μg/mlのビオチニル化した抗アンギオポエチン-1クローン（R&Dシステムズ社、#BAF923）と1：3000に希釈したストレプトアビジンHRP（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、カタログ番号11089153001）の混合物を1時間かけて添加した。その後、プレートをPBSTで6回洗浄した。調製したばかりのABTS試薬（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、緩衝液#204 530 001、錠剤#11 112 422 001）を用いて室温にて30分間にわたってプレートを現像した。吸光度を405nmで測定した。
【０１３９】
HEK293-Tie2細胞系の生成
ANGPT2で刺激するTie2リン酸化へのアンギオポエチン-2抗体の干渉と、細胞表面のTie2へのANGPT2の結合を調べるため、組み換えHEK293-Tie細胞系を生成させた。簡単に述べると、pcDNA3をベースとしていて完全長ヒトTie2（配列番号61）をコードしているプラスミド（RB22-pcDNA3 Topo hTie2）を、CMVプロモータとネオマイシン耐性マーカーの制御下で、Fugene（ロシュ・アプライド・サイエンス社）をトランスフェクト試薬として用いてHEK293細胞（ATCC）にトランスフェクトし、DMEM＋10％FCS＋500μg/ml G418の中で耐性細胞を選択した。個々のクローンをクローニング・シリンダを通じて単離した後、FACSによってTie2の発現を分析した。クローン22は、G418の不在下でも強くて安定なTie2を発現するクローンとして同定された（HEK293-Tieクローン22）。その後、HEK293-Tieクローン22を細胞アッセイで使用した。そのアッセイとは、ANGPT2誘導Tie2リン酸化アッセイと、ANGPT2細胞リガンド結合アッセイである。
【０１４０】
ANGPT2誘導Tie2リン酸化アッセイ
ANGPT2で誘導するTie2リン酸化のANGPT2抗体による抑制を、以下のアッセイ原理に従って測定した。ANGPT2抗体の不在下または存在下にて、HEK293-Tie2クローン22をANGPT2で5分間にわたって刺激した後、P-Tie2をサンドイッチELISAによって定量した。簡単に述べると、ポリ-D-リシンで被覆した96ウエルの微量滴定プレート上にて、ウエル1つにつき2×105個のHEK293-Tie2クローン22細胞を、100μlのDMEM＋10％FCS＋500μg/ml のジェネティシンの中で一晩にわたって増殖させた。翌日、ANGPT2抗体の滴定を行なう1つの行を微量滴定プレート上に用意し（4倍に濃縮、最終体積75μl/ウエル、デュープリケート）、75μlのANGPT2（R&Dシステムズ社、#623-AN）希釈液（4倍濃縮溶液として3.2μg/ml）と混合した。抗体とANGPT2は室温で15分間にわたってあらかじめインキュベートしておいた。この混合物100μlを（1mMのNaV3O4（シグマ社、#S6508）とともに5分間にわたってあらかじめインキュベートした）HEK293-Tieクローン22細胞に添加し、37℃で5分間にわたってインキュベートした。その後、細胞を、ウエル1つにつき200μlの氷冷PBS＋1mMのNaV3O4で洗浄し、氷の上でウエル1つにつき120μlの溶解緩衝液（20mMのトリス、pH8.0、137mMのNaCl、1％のNP-40、10％のグリセロール、2mMのEDTA、1mMのNaV3O4、1mMのPMSF、10μg/mlのアプロチニン）を添加して溶解させた。微量滴定プレート振盪機の上で細胞を4℃にて30分間にわたって溶解させた後、あらかじめ遠心分離することなく、全タンパク質を測定することもなく、100μlのライセートをp-Tie2 ELISA微量滴定プレート（R&Dシステムズ社、R&D #DY990）に直接移した。p-Tie2の量を製造者の指示に従って定量し、エクセルのためのXLfit4分析プラグ-イン（投与量-応答ワン・サイト、モデル205）を用いて抑制のIC50値を決定した。IC50値は1つの実験内では比較できるが、実験ごとに変化する可能性がある。
【０１４１】
ANGPT1誘導Tie2リン酸化アッセイ
ANGPT1で誘導するTie2リン酸化のANGPT1抗体による抑制を、以下のアッセイ原理に従って測定した。ANGPT1抗体の不在下または存在下にて、HEK293-Tie2クローン22をANGPT1で5分間にわたって刺激し、P-Tie2をサンドイッチELISAによって定量した。簡単に述べると、ポリ-D-リシンで被覆した96ウエルの微量滴定プレート上にて、ウエル1つにつき2×105個のHEK293-Tie2クローン22細胞を100μlのDMEM＋10％FCS＋500μg/ml のジェネティシンの中で一晩にわたって増殖させた。翌日、ANGPT2抗体の滴定を行なう1つの行を微量滴定プレート上に用意し（4倍に濃縮、最終体積75μl/ウエル、デュープリケート）、75μlのANGPT1（R&Dシステムズ社、#923-AN）希釈液（4倍濃縮溶液として3.2μg/ml）と混合した。抗体とANGPT1は室温で15分間にわたってあらかじめインキュベートしておいた。この混合物100μlを（1mMのNaV3O4（シグマ社、#S6508）とともに5分間にわたってあらかじめインキュベートした）HEK293-Tieクローン22細胞に添加し、37℃で5分間にわたってインキュベートした。その後、細胞を、ウエル1つにつき200μlの氷冷PBS＋1mMのNaV3O4で洗浄し、氷の上でウエル1つにつき120μlの溶解緩衝液（20mMのトリス、pH8.0、137mMのNaCl、1％のNP-40、10％のグリセロール、2mMのEDTA、1mMのNaV3O4、1mMのPMSF、10μg/mlのアプロチニン）を添加して溶解させた。微量滴定プレート振盪機の上で細胞を4℃にて30分間にわたって溶解させた後、あらかじめ遠心分離することなく、全タンパク質を測定することもなく、100μlのライセートをp-Tie2 ELISA微量滴定プレート（R&Dシステムズ社、R&D #DY990）に直接移した。p-Tie2の量を製造者の指示に従って定量し、エクセルのためのXLfit4分析プラグ-イン（投与量-応答ワン・サイト、モデル205）を用いて抑制のIC50値を決定した。IC50値は1つの実験内では比較できるが、実験ごとに変化する可能性がある。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：
モノクローナル<ANG-2>抗体Ang2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08の発現と精製
対応する抗体Ang2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08の軽鎖と重鎖を上記のようにして発現ベクターの中に構成した。重鎖とκ軽鎖はゲノム発現カセットの中でクローニングしたのに対し、λ軽鎖はイントロンAを有するcDNAとしてクローニングした（図1B）。プラスミドを大腸菌の中で増幅し、精製した後、トランスフェクトしてHEK293-F細胞の中で組み換えタンパク質として一過性発現させた（インヴィトロジェン社のFreeStyle 293系を使用）。7日後、HEK293-F細胞の上清を回収し、濾過し、抗体をプロテインAとサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。全抗体の一様性を、非還元条件下と還元条件下のSDS-PAGEと、分析的サイズ排除クロマトグラフィによって確認した。還元条件下では（図2）、<ANG-2>抗体のポリペプチド重鎖は、SDS-PAGEにおいて見かけの分子量が分子量の計算値に近い約50kDaであり、ポリペプチド軽鎖は、見かけの分子量が予測通りの25kDaであった。質量分析により、精製した抗体が何であるかを確認した。全コンストラクトの発現レベルをプロテインA HPLCによって分析した。
【０１４３】
精製物のサイズ排除クロマトグラフィ分析。すべての抗体を調製し、説明した手続きと同様にして特徴を分析した。対応する抗体のSECデータを以下の表にまとめてある。
【０１４４】
【表１】
【０１４５】
実施例２：
ELISAによるヒトANG-1とヒトANG-2への結合アッセイ
上記のようにして、ヒトANG-1とヒトANG-2への<ANG-2>抗体Ang2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08の結合をANG-1結合ELISAまたはANG-2結合ELISAで調べた。簡単に述べると、ELISAタイプのアッセイは、微量滴定プレートの中にヒト野生型のアンギオポエチン-1またはアンギオポエチン-2を固定化することに基づいている。固定化されたANG-1またはANG-2に対する抗体の結合を、POD共役体を用いて<ヒトFc>（抗IgG）抗体を通じて測定する。一連の<ANG-2>抗体希釈液により、EC50濃度を決定することができる。参照基準として、ヒト抗ANG-2抗体<ANG-2>Mab536（Oliner, J.他、Cancer Cell、2004年11月6日号、507〜516頁、アメリカ合衆国特許出願公開第2006/0122370号）を使用した。決定したEC50濃度を以下の表にまとめてある。
【０１４６】
【表２】
【０１４７】
すべての抗体がANG-2に特異的に結合する。Mab536とAng2k-LC08はANG-1にも特異的に結合するのに対し、Ang2i-LC06とAng2i-LC07はEC50値が8000ng/ml（検出限界）を超えるためANG-1に特異的に結合しない。
【０１４８】
実施例３：
Biacoreを通じたANG-2への結合
上記のようにして、ヒトANGPT2への結合に関するアフィニティをBiacoreアッセイで調べた。簡単に述べると、このアッセイでは、捕獲抗体（抗Fc）をBiacoreチップの表面に固定化し、この捕獲抗体が対応する抗体（例えばAng2i-LC06）を捕獲して提示する。リガンド（ここではANGPT2）は溶液から捕獲される。この相互作用のアフィニティは、1：1相互作用を仮定して決定される。この実験の詳細は、一般的な方法の項に見いだすことができる。ANGPT2結合（KD）に関して決定されたアフィニティを以下の表にまとめてある。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08は大きなアフィニティでANGPT2に結合する。
【０１５１】
実施例４：
ANGPT1/2-Tie2相互作用の中和（ヒト）
ヒトANGPT1/2／ヒトTie2相互作用のブロッキングを受容体相互作用ELISAによって示した。384ウエルのMaxisorpプレート（ナンク社）を0.5μg/mlのヒトTie2（R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号313-TI、または自家製材料）で室温にて2時間にわたって被覆し、0.2％のトゥイーン-20と2％BSAを補足したPBS（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国）で室温にて1時間にわたって振盪下でブロックした。その間に、精製した抗体をPBSに希釈したものを0.2μg/mlのヒト・アンギオポエチン-1/2（R&Dシステムズ#923-AN/CF、R&Dシステムズ社、イギリス国、カタログ番号623-AN、または自家製材料）とともに室温にて1時間にわたってインキュベートした。0.5μg/mlのビオチニル化された抗アンギオポエチン-1/2クローン（R&Dシステムズ#BAF923、BAM0981、R&Dシステムズ社、イギリス国）と1：3000に希釈したストレプトアビジンHRP（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、カタログ番号11089153001）の混合物を1時間かけて添加した。その後、プレートをPBSTで6回洗浄した。調製したばかりのABTS試薬（ロシュ・ディアグノスティクス社、ドイツ国、緩衝液#204 530 001、錠剤#11 112 422 001）を用いて室温にて30分間にわたってプレートを現像した。吸光度を405nmで測定した。
【０１５２】
得られた抑制濃度を以下の表にまとめてある。
【０１５３】
【表４】
【０１５４】
上の表から、2つの抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08で選択性プロファイルが異なることがわかる。Ang2i-LC06はANGPT2選択性であるのに対し、Ang2k-LC08は、ANGPT1/2 Tie2相互作用の抑制においてANGPT1/2交差反応性である。
【０１５５】
実施例５：
Tie2リン酸化
同定されたANGPT2抗体がANGPT2とANGPT1を媒介としてTie2のリン酸化に干渉する能力を、上に説明したANGPT2とANGPT1で誘導するTie2リン酸化アッセイで調べた。アッセイの設定の模式図を図3に示す。
【０１５６】
図4に示してあるように、抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08は両方とも、ANGPT2で刺激したTie2リン酸化に投与量に依存して干渉し、IC50値は同程度であった。Ang2i-LC06は、ANGPT2で刺激したTie2リン酸化に約508ng/mlというIC50値で干渉し、Ang2k-LC08は、ANGPT2で刺激したTie2リン酸化に約499ng/mlというIC50値で干渉した。それとは対照的に、Ang2k-LC08だけが、ANGPT1で刺激したTie2リン酸化に約391ng/mlというIC50値で干渉したのに対し、Ang2i-LC06は、試験した同じ濃度範囲では、ANGPT1で刺激したTie2リン酸化に干渉しなかった（図5）。
【０１５７】
実施例６：生体内効果
Colo205異種移植片の増殖に対するANGPT抗体の効果
病期判定皮下Colo205異種移植片モデルにおいて<ANGPT2>Mab536と比較した<ANGPT2>抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08の生体内効果
【０１５８】
メスScidベージュ・マウスでの病期判定皮下Colo205異種移植片モデル（Ang2_PZ_Colo205_006）において、精製した抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08を抗体Mab536と比較した。
【０１５９】
抗体：Mab536は凍結貯蔵溶液（c=4.5mg/ml）として提供され、Ang2i-LC06とAng2k-LC08は、20mMのヒスチジン＋140mMのNaCl（pH6.0）の中の凍結貯蔵溶液（c=1mg/ml）として提供された。抗体を貯蔵溶液からPBSの中に適度に希釈した後、必要な場所に注入し、PBSを賦形剤として用いた。薬局から購入したヒト化IgG1抗IgE抗体Xolair（オマリズマブ）を正の対照とした。
【０１６０】
細胞系と培養条件：Colo205ヒト結腸直腸がん細胞をATCCから最初に取得し、増殖後にロシュ・ペンツベルク内部細胞バンクに寄託した。腫瘍細胞系を、10％ウシ胎仔血清（PAラボラトリーズ、オーストリア国）と2mMのL-グルタミンを補足したRPMI 1640培地（PAラボラトリーズ、オーストリア国）の中で37℃、飽和水蒸気、5％CO2にて定法通りに培養した。継代3を移植に用いた。
【０１６１】
動物：委員会にかけられたガイドライン（GV-Solas；Felasa；TierschG）に従い、（Charles River（ドイツ国）から購入した）メスSCIDベージュ・マウスを、特定の病原体がない条件下にて、1日を12時間明／12時間暗のサイクルにして飼育した。実験研究のプロトコルは地方当局によって検討され、承認された。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために動物施設の検疫部に1週間保管した。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。餌（Provimi Kliba 3337）と水（pH2.5〜3に酸性化）を自由に摂取させた。マウスの年齢は研究開始時に12〜14週間であった。
【０１６２】
モニタリング：動物の臨床症状を毎日調べ、悪い効果を検出した。実験期間を通じてモニタリングするため、動物の体重を記録し、病期を判定した後に腫瘍の体積をノギスで測定した。
【０１６３】
腫瘍細胞の注入：注入日にColo205細胞を遠心分離し、1回洗浄し、PBSに再度懸濁させた。PBSでさらに洗浄した後、細胞カウンタと分析システム（Vi-CELL、ベックマン・コールター社）を用いて細胞の濃度とサイズを測定した。Colo205細胞を注入するため、最終力価を5.0×107細胞/ml、生存率約90％に調節した。その後、動物1匹あたり細胞が2.5×106個に対応するこの懸濁液100μlをマウスの右脇腹に皮下注射した。
【０１６４】
動物の治療：細胞移植（研究Ang2_PZ_Colo205_006）の16日後で腫瘍の体積の平均値が178mm3のときにランダム化を行ない、その日に動物の治療を開始した。
【０１６５】
研究Ang2_PZ_Colo205_006の投薬スケジュール
【０１６６】
【表５】
【０１６７】
50日目までの腫瘍の増殖抑制を図6に示してある。このデータから、ANGPT2選択性抗体Ang2i-LC06が最も活性のある抗体だったことがわかる（腫瘍制御比（TCR）値が0.39）。Ang2i-LC06は、抗体Mab536（TCR値が0.47）およびANGPT2選択性ANGPT1交差反応性抗体Ang2k-LC08（TCR値が0.46）よりも腫瘍増殖の抑制に関して効果が大きかった。
【０１６８】
KPL-4異種移植片の増殖に対する抗ANGPT抗体の効果
【０１６９】
病期判定同所KPL-4異種移植片モデルにおいて<ANGPT2>Mab536と比較した<ANGPT2>抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08の生体内効果
【０１７０】
メスScidベージュ・マウスでの病期判定同所KPL-4異種移植片モデル（Ang2_PZ_KPL-4_002）において、精製した抗体Ang2i-LC06とAng2k-LC08を抗体Mab536と比較した。
【０１７１】
抗体：Mab536は凍結貯蔵溶液（c=4.5mg/ml）として提供され、Ang2i-LC06とAng2k-LC08は、20mMのヒスチジン＋140mMのNaCl（pH6.0）の中の凍結貯蔵溶液（c=1mg/ml）として提供された。抗体を貯蔵溶液からPBSの中に適度に希釈した後、必要な場所に注入し、PBSを賦形剤として用いた。
【０１７２】
細胞系と培養条件：そもそもKPL-4ヒト乳がん細胞は、炎症性皮膚転移がある乳がん患者の悪性胸水から確立された。KPL-4細胞は、親切にも紅林淳一（川崎医科大学、倉敷、日本国）から提供された。腫瘍細胞を、10％ウシ胎仔血清（PANバイオテック社、ドイツ国）と2mMのL-グルタミン（PANバイオテック社、ドイツ国）を補足したDMEM培地（（PANバイオテック社、ドイツ国））の中で37℃、飽和水蒸気、5％CO2にて定法通りに培養した。トリプシン／EDTA 1×(PAN)分割3回／週で継代培養を実施した。
【０１７３】
動物：委員会にかけられたガイドライン（GV-Solas；Felasa；TierschG）に従い、（Charles River（ドイツ国）から購入した）メスSCIDベージュ・マウスを、特定の病原体がない条件下にて、1日を12時間明／12時間暗のサイクルにして飼育した。実験研究のプロトコルは地方当局によって検討され、承認された。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために動物施設の検疫部に1週間保管した。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。餌（Provimi Kliba 3337）と水（pH2.5〜3に酸性化）を自由に摂取させた。マウスの年齢は研究開始時に約12週間であった。
【０１７４】
モニタリング：動物の臨床症状を毎日調べ、悪い効果を検出した。実験期間を通じてモニタリングするため、動物の体重を記録し、病期を判定した後に腫瘍の体積をノギスで測定した。
【０１７５】
腫瘍細胞の注入：注入日に腫瘍細胞を培養フラスコ（グライナー社、TriFlask）から回収し（トリプシン-EDTA）、50mlの培地に移し、1回洗浄し、PBSの中に再び懸濁させた。PBSを用いた洗浄ステップをさらに1回実施した後に濾過し（細胞濾過器；Falcon（登録商標）；100μm）、細胞の最終力価を1.5×108/mlに調節した。細胞が凝集しないようホールピペットを用いて腫瘍細胞懸濁液を注意深く混合した。予備インキュベーション・チェンバー（プレクシグラス）と、個別のマウス鼻マスク（シリコン）と、不燃性または非爆発性の麻酔化合物イソフラン（ファルマシア-アップジョン社、ドイツ国）を閉鎖循環系の中で使用し、小動物のためのステフェンズの吸入ユニットを用いて麻酔を行なった。注入する2日前に動物の体毛を剃った。乳房内脂肪パッドに注入するため、麻酔した各マウスの最後から2番目の右鼠径部乳房脂肪パッドに20μlの体積（3×106個/動物）で細胞を同所注入した。同所移植のため、ハミルトン・マイクロリットル注射器と30G×1/2"針を用いて細胞懸濁液を乳首の下の皮膚を通じて注入した。
【０１７６】
細胞移植（研究Ang2_PZ_KPL-4_002）の3.35日後で腫瘍が60〜180mm、腫瘍の体積の平均値が90mm3のときにランダム化を行ない、その日に動物の治療を開始した。
【０１７７】
研究Ang2_PZ_KPL-4_002の投薬スケジュール
【０１７８】
【表６】
【０１７９】
64日目までの腫瘍の増殖抑制を図7に示してある。このデータから、KPL-4ではANGPT2選択性抗体Ang2i-LC06が最も活性のある抗体だったことがわかる（TCR値が0.55）。Ang2i-LC06は、抗体Mab536（TCR値が0.57）およびANGPT2選択性ANGPT1交差反応性抗体Ang2k-LC08（TCR値が0.57）よりも腫瘍増殖の抑制に関して効果が大きかった。
【０１８０】
実施例７：
Biacoreを通じたANG-1への結合
BiacoreアッセイでヒトANG-1に対する結合のアフィニティを調べた。アミン・カップリングを利用してヒトANG-1をCM5バイオセンサーチップに固定化した。タンパク質を5μl/分の流速で20分間かけて10μg/mlの酢酸ナトリウム（pH4.5）に注入した。その結果、表面密度が約20000RUになった。参照用のフロー・セルには同じ条件でBSAを固定化した。抗体をHBS-Pに希釈して100nMにした後、3分間かけて注入した（会合相）。ランニング緩衝液で3分間洗浄した（解離相）後、10mMの水酸化ナトリウムを5μl/分で1分間注入することにより表面を再生させた。結果を図8に示す。Ang2k_LC08は、複合体の解離半減期が約50秒であり、Ang2i_LC06は約5秒であり、Ang2i_LC10はANG-1に結合しなかった。
【０１８１】
実施例８：原発腫瘍のある生体内での転移／続発腫瘍の抑制
a）原発Colo205腫瘍を異種移植したマウスにおける転移／続発腫瘍の抑制
細胞系と培養条件：
Colo205ヒト結腸直腸がん細胞をATCCから最初に取得し、増殖後にロシュ・ペンツベルク内部細胞バンクに寄託した。腫瘍細胞系を、10％ウシ胎仔血清（PAラボラトリーズ、オーストリア国）と2mMのL-グルタミンを補足したRPMI 1640培地（PAラボラトリーズ、オーストリア国）の中で37℃、飽和水蒸気、5％CO2にて定法通りに培養した。継代3を移植に用いた。
【０１８２】
動物：
委員会にかけられたガイドライン（GV-Solas；Felasa；TierschG）に従い、（Charles River（ドイツ国）から購入した）メスSCIDベージュ・マウス（到着時に年齢4〜5週間）を、特定の病原体がない条件下にて、1日を12時間明／12時間暗のサイクルにして飼育した。実験研究のプロトコルは地方当局によって検討され、承認された。動物は、到着後、新環境への馴致と観察のために動物施設の検疫部に1週間保管した。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。餌（Provimi Kliba 3337）と水（pH2.5〜3に酸性化）を自由に摂取させた。マウスの年齢は研究開始時に約10週間であった。
【０１８３】
腫瘍細胞の注入：
注入日にColo205腫瘍細胞を培養フラスコ（グライナー社）から回収し（トリプシン-EDTA）、50mlの培地に移し、1回洗浄し、PBSの中に再び懸濁させた。PBSを用いた洗浄ステップをさらに1回実施した後、濾過し（細胞濾過器；Falcon φ 100μm）、細胞の最終力価を2.5×107/mlに調節した。細胞が凝集しないようホールピペットを用いて腫瘍細胞懸濁液を注意深く混合した。この操作の後、広い針（1.10×40mm）を用いて細胞懸濁液を1.0mlのツベルクリン注射器（ブラウン・メルスンゲン社）に満たした。注射のために針のサイズを変え（0.45×25mm）、1回の注射ごとに新しい針を使用した。予備インキュベーション・チェンバー（プレクシグラス）と、個別のマウス鼻マスク（シリコン）と、不燃性または非爆発性の麻酔化合物イソフラン（ファルマシア-アップジョン社、ドイツ国）を閉鎖循環系の中で使用し、小動物のためのステフェンズの吸入ユニットを用いて麻酔を行なった。注入する2日前に動物の皮膚を剃り、細胞を注入するため麻酔した動物の皮膚を解剖用鉗子で注意深く持ち上げ、100μlの細胞懸濁液（=2.5×106細胞）を動物の右脇腹に皮下注射した。原発腫瘍の増殖をモニターした（データは示さず）。
【０１８４】
例えば肺におけるヒトAlu配列の定量による続発腫瘍のモニタリング
実験が終了したとき（103日目）、全群の動物から肺を回収した。簡単に述べると、サンプルを液体窒素の中に直ちに移す。次のステップにおいて、MagNA Pure LC装置を製造者の指示に従って用いて全DNAをサンプルから単離した。Alu配列を定量PCR（LightCycler装置）によって選択的に増幅するため、ヒトAlu特異的プライマーを選択した。（T. Schneider他、Clin. Exp. Metas.、2002年、第19巻、571〜582頁）。
【０１８５】
動物の治療：
細胞を移植した14日後、腫瘍の平均体積が340mm3であるときに、アバスタチン（10mg/kg腹腔、週に1回）を用いた動物の治療を開始した（研究Ang2_PZ_Colo205_008）。7週間後にマウスをランダム化し、51日目に以下の表に示す化合物を用いた二次治療を開始した。研究Ang2_PZ_Colo205_008の51日目に開始した二次治療。
【０１８６】
【表７】
【０１８７】
（肺の）転移／続発腫瘍の抑制結果を以下の表と図9Aに示してある。
【０１８８】
【表８】
【０１８９】
結果は、ANG2i-LC06により、アバスタチンと比べて続発腫瘍／転移の抑制効果が明らかに改善されていることを示している。
【０１９０】
b）原発KPL-4腫瘍を異種移植したマウスにおける転移／続発腫瘍の抑制
腫瘍細胞系
親切にも紅林淳一（川崎医科大学、倉敷、日本国）から提供されたKPL-4ヒト乳がん細胞は、そもそもは炎症性皮膚転移がある乳がん患者の悪性胸水から確立された。腫瘍細胞を、10％ウシ胎仔血清（PANバイオテック社、ドイツ国）と2mMのL-グルタミン（PANバイオテック社、ドイツ国）を補足したDMEM培地（（PANバイオテック社、ドイツ国））の中で37℃、飽和水蒸気、5％CO2にて定法通りに培養した。トリプシン／EDTA 1×(PAN)分割3回／週で継代培養を実施した。
【０１９１】
マウス
到着後、新環境への馴致と観察のため、メスSCIDベージュ・マウス（到着時に年齢10〜12週間；体重18〜20g；Charles River、スルツフェルト、ドイツ国）を動物施設の検疫部に1週間保管した。連続的な健康のモニタリングを定期的に実施した。マウスは、国際的なガイドライン（GV-Solas；Felasa；TierschG）に従い、無病原体条件下にて、1日を12時間明／12時間暗のサイクルにして飼育した。餌（Provimi Kliba 3337）と水（pH2.5〜3に酸性化）を自由に摂取させた。実験研究のプロトコルは地方当局によって検討され、承認された（オーバーバイエルン行政管区；登録番号第211.2531.2-22/2003号）。
【０１９２】
腫瘍細胞の注入
注入日に腫瘍細胞を培養フラスコ（グライナー社、TriFlask）から回収し（トリプシン-EDTA）、50mlの培地に移し、1回洗浄し、PBSの中に再び懸濁させた。PBSを用いた洗浄ステップをさらに1回実施して濾過した（細胞濾過器；Falcon φ 100μm）後、細胞の最終力価を1.5×108/mlに調節した。細胞が凝集しないようホールピペットを用いて腫瘍細胞懸濁液を注意深く混合した。予備インキュベーション・チェンバー（プレクシグラス）と、個別のマウス鼻マスク（シリコン）と、不燃性または非爆発性の麻酔化合物イソフラン（ファルマシア-アップジョン社、ドイツ国）を閉鎖循環系の中で使用し、小動物のためのステフェンズの吸入ユニットを用いて麻酔を行なった。注入する2日前に動物の体毛を剃った。乳房内脂肪パッドに注入するため、麻酔した各マウスの最後から2番目の右鼠径部乳房脂肪パッドに20μlの体積で細胞を同所注入した。同所移植のため、ハミルトン・マイクロリットル注射器と30G×1/2"針を用いて細胞懸濁液を乳首の下の皮膚を通じて注入した。原発腫瘍の増殖をモニターした（データは示さず）。
【０１９３】
例えば肺におけるヒトAlu配列の定量による続発腫瘍のモニタリング
【０１９４】
実験が終了したとき（103日目）、全群の動物から肺を回収した。簡単に述べると、サンプルを液体窒素の中に直ちに移す。次のステップにおいて、MagNA Pure LC装置を製造者の指示に従って用いて全DNAをサンプルから単離した。Alu配列を定量的PCR（LightCycler装置）によって選択的に増幅するため、ヒトAlu特異的プライマーを選択した。（T. Schneider他、Clin. Exp. Metas.、2002年、第19巻、571〜582頁）。
【０１９５】
動物の治療
細胞を移植した35日後、腫瘍の平均体積が60〜160mm3であるときに動物の治療を開始した。化合物と投薬スケジュールを以下の表に示す。
【０１９６】
【表９】
【０１９７】
（肺の）転移／続発腫瘍の抑制結果を以下の表と図9Bに示してある。
【０１９８】
【表１０】
【０１９９】
結果は、Ang2i-LC06、Ang2i-LC07、Ang2k-LC08によって続発腫瘍／転移が非常に効果的に抑制されることを示している。
【０２００】
実施例９：網膜症の治療における効果
方法
里親となる授乳メス親マウスCD1に子マウスC57/B16を育てさせ、P7からP12までを75％の酸素に曝露した（PRO-OX 110チェンバー酸素制御装置、バイオスフェリクス社、レッドフィールド、ニューヨーク州）。すると網膜の中心で血管の閉塞と毛細血管の停止が誘導される。子マウスと授乳メス親マウスを通常の大気中に置いて相対的な低酸素症へと導き、新生血管形成を誘導する。P13でイソフルオラン（5％で誘導、1.5％の酸素を組み合わせて3％で維持）を用いて子マウスを麻酔し、目を露出させ、35ゲージの針（WPI、サラソタ、フロリダ州）を取り付けたNanofil注射器を用いて左目に1μlの眼内注入を行なった。P17で両目を切除し、4％パラホルムアルデヒドの中に4℃で4時間にわたって固定し、網膜を切除した。0.5％トリトンX-100と1％ウシ血清アルブミンを含むPBSの中で網膜を浸透性にし、1％トリトンX-100と、0.1mMのCaCl2と、0.1mMのMgCl2を含むPBS（pH6.8）の中の20μg/mlのビオチニル化されたイソレクチンB4（シグマ・オールドリッチ社、ギリンガム、イギリス国）で染色した後、20μg/mlのALEXA488-ストレプトアビジン（モレキュラー・プローブズ社、ユージン、オレゴン州）で処理し、Vectashield（ヴェクター・ラボラトリーズ社、バーリンゲイム、カリフォルニア州）の中に平らに取り付けた。ニコン落射蛍光顕微鏡を4倍の倍率で用いて網膜の画像を取得した。フォトショップCS3とイメージJ（NIH）を用いて盲検式で新生血管と虚血の面積を測定し、網膜の全面積（=正常＋虚血＋新生血管）に対する割合として表示した。
【０２０１】
結果
図10Aは、イソレクチン染色によって可視化した網膜血管構造を持つ平らに取り付けた代表的な網膜を示している。中心の虚血領域は、血管誘導因子の上方調節によって網膜血管の新生血管形成と再成長を誘導する。新生血管の前線は過剰増殖性であり、不規則な血管パターンを持つ曲がりくねった血管になる。最も外側の領域は、影響されない正常な血管を含んでいる。平らに取り付けた網膜の定量結果から、アバスチンを用いたVEGFの抑制によって予想通り網膜の血管新生形成が抑制されたことがわかる（図10B参照、注入なしの場合の36.7±1.8％に対し、注入した場合の22.4±3.0％）。抗体LC06またはLC08を用いたAhg2の抑制も新生血管形成の低下につながった（31.5±1.1％対18.8±1.3％と、34.0±3.1％対25.4±3.4％）。対照であるヒトIgGの注入には新生血管形成に対する効果がなかった（図10B参照、38.3±1.1％対38.3±0.8％）。
【配列表フリーテキスト】
【０２０２】
アミノ酸配列の説明
配列番号1 重鎖CDR3、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号2 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2i_LC06
配列番号3 重鎖CDR1、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号4 軽鎖CDR3、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号5 軽鎖CDR2、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号6 軽鎖CDR1、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号7 重鎖可変領域、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号8 軽鎖可変領域、<ANG-2>Ang2i_LC06
配列番号9 重鎖CDR3、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号10 重鎖CDR2、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号11 重鎖CDR1、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号12 軽鎖CDR3、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号13 軽鎖CDR2、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号14 軽鎖CDR1、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号15 重鎖可変領域、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号16 軽鎖可変領域、<ANG-2>Ang2i_LC07
配列番号17 重鎖CDR3、< ANG-2>Ang2k_LC08
配列番号18 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号19 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号20 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号21 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号22 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号23 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号24 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2k_LC08
配列番号25 重鎖CDR3、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号26 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号27 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号28 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号29 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号30 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号31 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号32 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2s_LC09
配列番号33 重鎖CDR3、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号34 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号35 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号36 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号37 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号38 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号39 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号40 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2i_LC10
配列番号41 重鎖CDR3、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号42 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号43 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号44 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号45 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号46 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2k_LCl1
配列番号47 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号48 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2k_LC11
配列番号49 重鎖CDR3、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号50 重鎖CDR2、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号51 重鎖CDR1、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号52 軽鎖CDR3、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号53 軽鎖CDR2、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号54 軽鎖CDR1、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号55 重鎖可変領域、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号56 軽鎖可変領域、<ANG-2> Ang2s_R3_LC03
配列番号57 IgG1に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号58 IgG4に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号59 κ軽鎖定常領域
配列番号60 λ軽鎖定常領域
配列番号61 ヒトTie-2受容体
配列番号62 リーダーとHisタグを有するヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）
配列番号63 リーダーとHisタグを有するヒト・アンギオポエチン-1（ANG-1）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域CDR3領域として、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、または配列番号49のCDR3領域を含むことを特徴とする、ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
a）重鎖可変領域が、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、または配列番号49のCDR3領域と、配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34、配列番号42、または配列番号50のCDR2領域と、配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35、配列番号43、または配列番号51のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36、配列番号44、または配列番号52のCDR3領域と、配列番号5、配列番号13、配列番号21、配列番号29、配列番号37、配列番号45、または配列番号53のCDR2領域と、配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38、配列番号46、または配列番号54のCDR1領域を含む、ことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
a）配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39、配列番号47、または配列番号55の重鎖可変領域と、
b）配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40、配列番号48、または配列番号56の軽鎖可変領域
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項４】
a）重鎖可変領域が、配列番号1のCDR3領域と、配列番号2のCDR2領域と、配列番号3のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4のCDR3領域と、配列番号5のCDR2領域と、配列番号6のCDR1領域を含む
ことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項５】
a）配列番号7の重鎖可変領域と、
b）配列番号8の軽鎖可変領域
を含むことを特徴とする、請求項4に記載の抗体。
【請求項６】
a）重鎖可変領域が、配列番号17のCDR3領域と、配列番号18のCDR2領域と、配列番号19のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号20のCDR3領域と、配列番号21のCDR2領域と、配列番号22のCDR1領域を含む
ことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項７】
a）配列番号23の重鎖可変領域と、
b）配列番号24の軽鎖可変領域
を含むことを特徴とする、請求項6に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト・アンギオポエチン1（ANG-1）に結合しないことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項９】
ヒトIgG4サブクラスまたはヒトIgG1サブクラスであることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
転移を抑制するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１２】
転移を抑制するための医薬の製造のための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
癌を治療するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１４】
癌を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１５】
血管性疾患を治療するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１６】
血管性疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１７】
血管性疾患を治療するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１８】
網膜症を治療するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１９】
網膜症を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）と特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸であって、該抗体が請求項1に記載の可変領域を含むことを特徴とする、核酸。
【請求項２１】
ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）と特異的に結合する抗体を原核宿主細胞または真核宿主細胞の中で発現させるため請求項20に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２２】
請求項21に記載のベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞。
【請求項１】
重鎖可変領域CDR3領域として、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、または配列番号49のCDR3領域を含むことを特徴とする、ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
a）重鎖可変領域が、配列番号1、配列番号9、配列番号17、配列番号25、配列番号33、配列番号41、または配列番号49のCDR3領域と、配列番号2、配列番号10、配列番号18、配列番号26、配列番号34、配列番号42、または配列番号50のCDR2領域と、配列番号3、配列番号11、配列番号19、配列番号27、配列番号35、配列番号43、または配列番号51のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4、配列番号12、配列番号20、配列番号28、配列番号36、配列番号44、または配列番号52のCDR3領域と、配列番号5、配列番号13、配列番号21、配列番号29、配列番号37、配列番号45、または配列番号53のCDR2領域と、配列番号6、配列番号14、配列番号22、配列番号30、配列番号38、配列番号46、または配列番号54のCDR1領域を含む、ことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
a）配列番号7、配列番号15、配列番号23、配列番号31、配列番号39、配列番号47、または配列番号55の重鎖可変領域と、
b）配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、配列番号40、配列番号48、または配列番号56の軽鎖可変領域
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項４】
a）重鎖可変領域が、配列番号1のCDR3領域と、配列番号2のCDR2領域と、配列番号3のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号4のCDR3領域と、配列番号5のCDR2領域と、配列番号6のCDR1領域を含む
ことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項５】
a）配列番号7の重鎖可変領域と、
b）配列番号8の軽鎖可変領域
を含むことを特徴とする、請求項4に記載の抗体。
【請求項６】
a）重鎖可変領域が、配列番号17のCDR3領域と、配列番号18のCDR2領域と、配列番号19のCDR1領域を含み、
b）軽鎖可変領域が、配列番号20のCDR3領域と、配列番号21のCDR2領域と、配列番号22のCDR1領域を含む
ことを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項７】
a）配列番号23の重鎖可変領域と、
b）配列番号24の軽鎖可変領域
を含むことを特徴とする、請求項6に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト・アンギオポエチン1（ANG-1）に結合しないことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項９】
ヒトIgG4サブクラスまたはヒトIgG1サブクラスであることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体またはその断片を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
転移を抑制するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１２】
転移を抑制するための医薬の製造のための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
癌を治療するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１４】
癌を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１５】
血管性疾患を治療するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１６】
血管性疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１７】
血管性疾患を治療するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１８】
網膜症を治療するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体。
【請求項１９】
網膜症を治療するための医薬を製造するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）と特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸であって、該抗体が請求項1に記載の可変領域を含むことを特徴とする、核酸。
【請求項２１】
ヒト・アンギオポエチン-2（ANG-2）と特異的に結合する抗体を原核宿主細胞または真核宿主細胞の中で発現させるため請求項20に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２２】
請求項21に記載のベクターを含む原核宿主細胞または真核宿主細胞。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５１１８９７（Ｐ２０１２−５１１８９７Ａ）
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３９９６０（Ｐ２０１１−５３９９６０）
【出願日】平成２１年１２月１４日（２００９．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００８９３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６９５３２
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１４日（２００９．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００８９３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６９５３２
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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