ヒト体脂肪量と関連する遺伝子多型に基づく肥満発症リスクの判定方法
【課題】肥満を早期に予期しうる遺伝的マーカーを開発し、メタボリックシンドロームをはじめとする肥満関連疾患の予防に寄与する。
【解決手段】ヒト被験者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子に存在する特定の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれらと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出することを含み、当該遺伝子多型又はその組み合わせは、前記被験者の成人後における体脂肪量が増加しやすいか否かを示唆する。
【解決手段】ヒト被験者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子に存在する特定の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれらと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出することを含み、当該遺伝子多型又はその組み合わせは、前記被験者の成人後における体脂肪量が増加しやすいか否かを示唆する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満の遺伝的素因を解明する医学分野の発明であり、より詳細には肥満発症リスクの判定方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、メタボリックシンドロームをはじめとする様々な疾患の原因となり、ヒトのＡＤＬ（日常生活動作）並びにＱＯＬ（クオリティー・オブ・ライフ）を大きく損なう。肥満は、体脂肪が過度に増加している状態である。近年、食生活の欧米化により我が国の肥満人口は増加の一途をたどり、それに伴う合併症に対する医療費も増加している。このことは、肥満を早期に予知するマーカーが存在し、さらに早期に治療を行うことが重要であることを示唆するが、肥満を早期かつ適格に予知しうるマーカーは未だ存在しない。
【０００３】
多数の日本人について、肥満指数（ＢＭＩ）に基づいて肥満者と正常者とを分類し、予め選択された１２４個の遺伝子に関する一塩基多型を検出し、統計解析を行なった結果が報告されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、これらの候補遺伝子は、血圧及び内分泌機能の制御、血管に関する生物学、及び脂質や糖の代謝に関連する遺伝子を予め選択してきたものであり、ヒトの全遺伝子を対象とするものではない。
【０００４】
また、抗肥満薬の標的分子としては、これまでレプチン、ＰＰＡＲγ、ニューロペプチドＹ等が知られているが、さらに近年、ミトコンドリア内膜に存在するトランスポーターの一種であるＳｌｃ２５ａ１０の機能を阻害することによってエネルギー消費を亢進せしめ、肥満の治療や予防に有効な化合物のスクリーニングになりうることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、肥満の原因は非常に多様であるため、より効果的な創薬標的分子の探索も必要である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２２８９１７号公報
【非特許文献１】国際公開２００５／０１２５７０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒトの全遺伝子を対象として、肥満、すなわち体脂肪が増加する遺伝的素因を解明することにより、肥満を早期に予期しうる遺伝的マーカーを開発し、メタボリックシンドロームをはじめとする肥満関連疾患の予防に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒト遺伝子上に存在する約５万個のＳＮＰからスクリーニングしたＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子に存在する遺伝子多型が体脂肪量と相関することを見出し、これに基づいて以下の本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の被験者における肥満の素因の有無を判定する方法は、ヒト被験者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、下記（ａ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれか１又は複数の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれらと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出することを含み、当該遺伝子多型又はその組み合わせは、前記被験者の成人後における体脂肪量が増加しやすいか否かを示唆することを特徴とする。
（ａ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｂ）ＯＤＺ３遺伝子のイントロン２１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５２０５４１の一塩基多型Ｃ／Ｇ、
（ｃ）ＫＩＡＡ１７９７遺伝子のイントロン１３に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５１１６８４の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｄ）ＤＬＤ遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２２３７６８２の一塩基多型Ｃ／Ｇ、
（ｅ）ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のイントロン９に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型Ｔ／Ｃ、
（ｆ）ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９４０７７０の一塩基多型Ｇ／Ｃ、
（ｇ）ＮＰＡＳ３遺伝子のイントロン６に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８の一塩基多型Ｔ／Ｇ、
（ｈ）ＡＣＣＮ１遺伝子のイントロン７に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２０７４２１５の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｉ）ＴＧＭ２遺伝子の５’上流領域に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ７６１００２の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｊ）ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２５８８６２の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｋ）ＥＳＲＲＧ遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０の一塩基多型Ｇ／Ａ、
（ｌ）ＬＲＰ１Ｂ遺伝子のイントロン５１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７の一塩基多型Ｔ／Ｇ、
（ｍ）ＦＧＦ１０遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５１２８４４の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｎ）ＫＩＡＡ１６００遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ７８９７９３７の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｏ）ＡＦＴＰＨ遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ９３０９３６１の一塩基多型Ｃ／Ｔ、及び
（ｐ）ＤＡＰＫ１遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１４７５５２４の一塩基多型Ｔ／Ｃ。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、前記被験者の遺伝子多型について、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＧ、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のイントロン９に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＴ、ＮＰＡＳ３遺伝子のイントロン６に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８の一塩基多型の遺伝子型がＴＴ、ＥＳＲＲＧ遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０の一塩基多型の遺伝子型がＧＧ、及び／又はＬＲＰ１Ｂ遺伝子のイントロン５１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７の一塩基多型の遺伝子型がＧＧ、であるとき当該被験者が肥満の素因を有すると判定されることを特徴とする。
【００１０】
別の観点において、本発明は肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法を提供する。当該方法は、候補化合物を哺乳動物に投与するか、又は候補化合物の存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、前記哺乳動物又は哺乳動物細胞内で、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子からなる群より選択されるいずれか１又は複数の遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、ヒトの体脂肪量又は体脂肪率を規定する遺伝子マーカーを提供するものであり、これを用いて肥満発症リスクの高いハイリスク群を同定することが可能となり、肥満の早期診断及びこれらの遺伝子マーカーに関連する遺伝子を分子標的として新規肥満治療薬を開発することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる一塩基多型(single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）、及び連続した複数ヌクレオチドにわたる多型の両方を含むものとする。すなわち、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１又は複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異が当該１又は複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、又は当該個体内突然変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」という。
【００１３】
「対立遺伝子（allele）」とは、相同な遺伝子座を占める遺伝子に複数の種類がある場合の、個々の遺伝子のことをいい、特定の遺伝子座を占める２種類の対立遺伝子の組を「遺伝子型」と称する。「連鎖不平衡」とは、２つの対立遺伝子がそれぞれ独立に遺伝する場合よりも大きな頻度で互いに連鎖して遺伝することをいう。
【００１４】
本書において、「関連がある」との用語が、「肥満と関連がある」などの文脈で使用される場合には、統計学的な関連を有することを指し、好ましくは統計学的な解析によりｐ値が０．０５以下程度の有意な関連を有することを指す。本発明における「肥満」とは、体脂肪量又は体脂肪率が顕著に増加した状態と定義される一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、いわゆる「肥満症」も含む。また、肥満の「素因」とは、現在肥満であることのみならず、将来、例えば成人後に肥満になることも含む。
【００１５】
本明細書中において引用するＳＮＰ識別番号は、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）が提供するＳＮＰデータベース（ｄｂＳＮＰ）から入手することができる。例えば、ＳＮＰ識別番号（ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ）：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型は、ヒトゲノム１ｐ１３．３に存在するＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在する。対立遺伝子としてはＡ／Ｇ（遺伝子の相補鎖ではＴ／Ｃ）であり、Ａが祖先型と推定されている。一般的に、母集団が異なると頻度も異なるが、日本人集団においてはＡが多数（約６０％）でありＧが少数である。なお、本書において、塩基配列の記号について、アデニンは「Ａ」、グアニンは「Ｇ」、シトシンは「Ｃ」、チミンは「Ｔ」、ウラシルは「Ｕ」、プリン（アデニン又はグアニン）は「Ｒ」、ピリミジン（チミン／ウラシル又はシトシン）は「Ｙ」と略記する。
【００１６】
本発明の方法で用いられる「ヒトのゲノムＤＮＡを含む試料」は、好ましくは日本人の被験者、さらに好ましくは日本人女性の被験者から単離されるあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器等を材料として調製される。該材料としては、末梢血から分離した白血球又は単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法にしたがって単離される。
【００１７】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行なうことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮａｓｅにより除去することができる。ただし、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行ってもよい。
【００１８】
次に、得られたヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、肥満症と関連がある遺伝子多型（本発明の場合は、全て一塩基多型）を検出する。使用可能な検出法として、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラー・ビーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、及びＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法などが挙げられる。以下、代表的な遺伝子多型検出方法について説明する。
【００１９】
ＤＮＡチップ法
多型部位を含む種々のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップ（遺伝子チップ）を用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ｃＤＮＡやｃＲＮＡとハイブリダイゼーションを行なう。オリゴヌクレオチドを光リソグラフィー技術により、アレイ上で合成し、１チップ上に数千から数十万個のプローブを配置させたもの（アフィメトリクス社製、ＧｅｎＣｈｉｐ（登録商標）等）や、予め調製したｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドをピン又はインクジェット方式によりガラス上に固定化する方法等が知られている。
【００２０】
ダイレクトシークエンス法
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を直接ジデオキシ法により解析する方法である（Biotechniques, 11, 246-249 (1991)）。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５'末端側の位置に相当する１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００２１】
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である（Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)）。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１３〜２０塩基程度のオリゴヌクレオチドであり、５'末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、３'末端はクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型のヌクレオチド変化の検出が可能である。
【００２２】
サーマルサイクラーを用いたＤＮＡの増幅を伴わない種々の方法が開発されている。例えば、インベーダー（登録商標）法は、２種類のオリゴヌクレオチドを用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する特殊な酵素反応に基づく（例えば、米国特許５８４６７１７号等参照）。この他に、ＵＣＡＮ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法及びＳＭＡＰ法等があるがこれらに限定されず、他の公知の遺伝子多型検出法を本発明の判定方法のために利用することができる。また、本発明の方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
また、本発明は、肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法をも包含し、これは候補化合物を哺乳動物に投与するか、又は候補化合物の存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、前記哺乳動物又は哺乳動物細胞内で、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子からなる群より選択されるいずれか１又は複数の遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、を含む。
【００２４】
上記遺伝子の発現レベルを測定するために、それらの遺伝子の転写産物の量や翻訳産物の活性を測定することができる。転写産物の量の測定は、試料中における、又は当該試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡから、前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせによる定量的ＰＣＲ分析を行うことができる。前記遺伝子に特異的なプローブによるノーザンブロットも適用されうる。ＤＮＡチップを用いることによって転写産物を測定することが好ましい場合もある。
【００２５】
上記遺伝子の翻訳産物の量及び／又は活性は、免疫アッセイ、酵素活性の測定及び／又は結合アッセイを用いて検出されうる。これらのアッセイは、抗ポリペプチド抗体又は抗ポリペプチド抗体に結合する二次抗体の何れかに結合する、酵素的、蛍光的、放射性、磁性、又は発光標識の使用により、前記翻訳産物と抗ポリペプチド抗体との間の結合量を測定することができる。
【００２６】
肥満の治療や予防のための該候補化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、発酵生産物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、あるいは公知の化合物であってもよい。
【００２７】
以下に、「実験例」により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。但し、ここでは、「実験例」とは、本発明の元となる原理・現象を証拠付けるデータを得るための実験の例を指し、本発明そのものを実際に実施した例ではない。但し、当業者であれば、これらの実験例に記載された情報、及び、前述した実施形態に関する記載を基に、容易に本発明を実施可能であることは明らかである。
【実施例１】
【００２８】
１ 方法
５５〜８３歳の閉経後の女性２５３名の血液よりＤＮＡを抽出し、遺伝子多型を決定した。対象とした遺伝子は、アフィメトリクス社のＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍａｐｐｉｎｇ １００Ｋ Ｓｅｔに含まれる、５万ＳＮＰについて、同社ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ法を用いて決定した。全身体脂肪量はＤＥＸＡ法（二重エネルギーＸ線吸収測定法）により測定した。年齢補正を行った全身体脂肪量との相関解析を行い、体脂肪量と関連するＳＮＰｓを選択した。本解析によって選択されたＳＮＰｓについて対象者数を増やし、再解析を行った。
【００２９】
なお、本実施例における相関解析は以下のとおりである。すなわち、年齢が高くなると体脂肪は小さくなる傾向があることが知られている。そのため、体脂肪率（％ＦＡＴ）をあるＳＮＰによる遺伝的効果を直接的に表したものとして解析するために統計学的に補正した値を算出し、この補正体脂肪率を％ＦＡＴＺとする。
本実施例では、次の式：
を用いて修正した体脂肪を年齢補正した体脂肪率として扱う。
この体脂肪率は、観測で得られた体脂肪率と、体脂肪率の年齢による線形モデルを考え、最小二乗法によって得られた予測値
との差である。つまり、％ＦＡＴＺは、％ＦＡＴから年齢に依存する部分を取り除いたものであり、年齢に依存しない量として扱うことができる。
【００３０】
次に、％ＦＡＴの閾値を設定し、質的形質へ変換した。もし医学的または統計的見知から量的形質に対して適切な閾値を設定することで、肥満群と非肥満群とに分割が可能であるならば、関連研究の解釈を容易にする。本解析では、最尤法を用いて肥満群と非肥満群の２分類を決めるための閾値を推定する。今ｎ個体の観測があるとする。xiとgi、i=1,...,nをそれぞれ個体iの％ＦＡＴ値、遺伝子型とする。閾値をtとし、t以上の％ＦＡＴに対応する個体と、そうでない個体に分割する。関連解析においてＦｉｓｈｅｒの正確法を適用するため、対数オッズ比の絶対値が最大となるようなtを推定する。以上の方法によりＦｉｓｈｅｒの関連解析を行いＰ＜０．０５を有意とした。
【００３１】
２ 結果
本解析により、日本人閉経後女性２５３名の遺伝子上にランダムに存在する約５万個のＳＮＰｓにおける遺伝子型(genotype)を決定した。その結果、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ（ＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５）をはじめ、いくつかの候補ＳＮＰｓが体脂肪量と有意に相関した。さらに、本解析により有意差が見出されたＳＮＰｓに関して、対象者数を７５２名まで増やし相関解析を行った。その結果を表１に示す。また、夫々のＳＮＰが存在する遺伝子の名称又は機能の概要を表２に示す。なお、表１において、左から順に、遺伝子記号、ＳＮＰデータベース識別番号（ｄｂＳＮＰ）、多型（ＳＮＰ）、肥満リスクＳＮＰ、オッズ比、信頼区間、及びＰ値(P value)を示した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
表１には、Ｐ値の小さいＳＮＰから順に並んでいる。表１において、オッズ比とは、要因（ＳＮＰ）と結果（肥満）との関連の強さを示す指標であり、０〜無限大に分布し、１は無相関、１より小さければその要因（ＳＮＰ）を有する者の肥満のリスクが低いことを、１より大きければリスクが高いことを意味する。信頼区間とは、９５％の確立で真の値が存在する範囲である。信頼区間の下限値が１を超えていたり、上限が１を下回っておれば５％水準で有意であるといえる。一方、Ｐ値は差がないという仮説、つまり帰無仮説 (Null hypothesis)を偶然起きたこととして受け入れる確率を表している。別の言い方をすると、実際に差がないのにサンプル抽出の際に偶然偏りが起きてしまって、差があるという結果が得られる確率を示している。そういう確率が低ければ低いほど、すなわちＰ値が小さければ小さい程、二つの群が同じ母集団に属する可能性は低くなり、二つの群は異なる母集団に属している可能性が高くなる。
【００３５】
表２には、各遺伝子の名称及びその翻訳産物の機能を示す。これらのうち、ミトコンドリアに存在する膜タンパク質や代謝酵素は、エネルギー産生や蓄積に関与している可能性が高い。また、脳や神経組織又は種々の組織で発現する受容体は、様々なシグナル伝達の制御機構を介して肥満と関連するかもしれない。あるいは、ＦＧＦ１０のように脂肪生成に重要な役割を果たしている遺伝子も存在する。従って、本発明に係るＳＮＰの存在又は不存在は、これらの遺伝子の発現を亢進させたり抑制することによって肥満を引き起こしている蓋然性が高いと考えられる。
【００３６】
さらに、表１に示したいくつかのＳＮＰについて、異なる手法にて統計的解析を行なった結果を図１〜図５に示した。図１から、被験者のＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＧであるとき、すなわち、遺伝子型がＧＧ又はＡＧである被験者は、ＡＡの遺伝子型を有する被験者に比べて有意に体脂肪率が上昇していることが分かる。図５に示したＬＯＣ４４１２８２遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型についても同様に、少なくとも１つの対立遺伝子がＴの場合に被験者の体脂肪率が増加する。
【００３７】
一方、図２〜４に示したように、例えば、ＮＡＰＳ３遺伝子のｒｓ１８８７０６８、ＥＳＲＲＧ遺伝子のｒｓ８６７４１０及びＬＲＰ１Ｂ遺伝子のｒｓ２１７１１０７の一塩基多型は、それぞれの遺伝子型がＴＴ、ＧＧ及びＧＧである場合に被験者の体脂肪率が増加している。
【００３８】
また、本解析により見出された上記ＳＮＰは、夫々の遺伝子近傍において連鎖不平衡にあるいくつかのＳＮＰｓが知られている。これらのＳＮＰｓは、すでにＨａｐＭａｐデータベースに登録されており、例えば、以下のような例を挙げることができる。
【００３９】
【表３】
【００４０】
従って、本発明において、上記表１に示したＳＮＰを検出する代わりに、或いはそれと共に、これらと連鎖不平衡にある何れか１又は複数のＳＮＰを検出しても良い。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の方法により肥満のハイリスク群を同定することができ、これらの被験者に肥満の早期治療を行なうことによって肥満患者の減少ひいては医療費の削減が達成され、国民経済上も多くの利益が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【図２】ＮＰＡＳ３遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【図３】ＥＳＲＲＧ遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【図４】ＬＲＰ１Ｂ遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【図５】ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満の遺伝的素因を解明する医学分野の発明であり、より詳細には肥満発症リスクの判定方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、メタボリックシンドロームをはじめとする様々な疾患の原因となり、ヒトのＡＤＬ（日常生活動作）並びにＱＯＬ（クオリティー・オブ・ライフ）を大きく損なう。肥満は、体脂肪が過度に増加している状態である。近年、食生活の欧米化により我が国の肥満人口は増加の一途をたどり、それに伴う合併症に対する医療費も増加している。このことは、肥満を早期に予知するマーカーが存在し、さらに早期に治療を行うことが重要であることを示唆するが、肥満を早期かつ適格に予知しうるマーカーは未だ存在しない。
【０００３】
多数の日本人について、肥満指数（ＢＭＩ）に基づいて肥満者と正常者とを分類し、予め選択された１２４個の遺伝子に関する一塩基多型を検出し、統計解析を行なった結果が報告されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、これらの候補遺伝子は、血圧及び内分泌機能の制御、血管に関する生物学、及び脂質や糖の代謝に関連する遺伝子を予め選択してきたものであり、ヒトの全遺伝子を対象とするものではない。
【０００４】
また、抗肥満薬の標的分子としては、これまでレプチン、ＰＰＡＲγ、ニューロペプチドＹ等が知られているが、さらに近年、ミトコンドリア内膜に存在するトランスポーターの一種であるＳｌｃ２５ａ１０の機能を阻害することによってエネルギー消費を亢進せしめ、肥満の治療や予防に有効な化合物のスクリーニングになりうることが報告されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、肥満の原因は非常に多様であるため、より効果的な創薬標的分子の探索も必要である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２２８９１７号公報
【非特許文献１】国際公開２００５／０１２５７０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒトの全遺伝子を対象として、肥満、すなわち体脂肪が増加する遺伝的素因を解明することにより、肥満を早期に予期しうる遺伝的マーカーを開発し、メタボリックシンドロームをはじめとする肥満関連疾患の予防に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒト遺伝子上に存在する約５万個のＳＮＰからスクリーニングしたＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子に存在する遺伝子多型が体脂肪量と相関することを見出し、これに基づいて以下の本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の被験者における肥満の素因の有無を判定する方法は、ヒト被験者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、下記（ａ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれか１又は複数の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれらと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出することを含み、当該遺伝子多型又はその組み合わせは、前記被験者の成人後における体脂肪量が増加しやすいか否かを示唆することを特徴とする。
（ａ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｂ）ＯＤＺ３遺伝子のイントロン２１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５２０５４１の一塩基多型Ｃ／Ｇ、
（ｃ）ＫＩＡＡ１７９７遺伝子のイントロン１３に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５１１６８４の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｄ）ＤＬＤ遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２２３７６８２の一塩基多型Ｃ／Ｇ、
（ｅ）ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のイントロン９に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型Ｔ／Ｃ、
（ｆ）ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９４０７７０の一塩基多型Ｇ／Ｃ、
（ｇ）ＮＰＡＳ３遺伝子のイントロン６に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８の一塩基多型Ｔ／Ｇ、
（ｈ）ＡＣＣＮ１遺伝子のイントロン７に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２０７４２１５の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｉ）ＴＧＭ２遺伝子の５’上流領域に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ７６１００２の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｊ）ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２５８８６２の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｋ）ＥＳＲＲＧ遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０の一塩基多型Ｇ／Ａ、
（ｌ）ＬＲＰ１Ｂ遺伝子のイントロン５１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７の一塩基多型Ｔ／Ｇ、
（ｍ）ＦＧＦ１０遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５１２８４４の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｎ）ＫＩＡＡ１６００遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ７８９７９３７の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｏ）ＡＦＴＰＨ遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ９３０９３６１の一塩基多型Ｃ／Ｔ、及び
（ｐ）ＤＡＰＫ１遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１４７５５２４の一塩基多型Ｔ／Ｃ。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態において、前記被験者の遺伝子多型について、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＧ、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のイントロン９に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＴ、ＮＰＡＳ３遺伝子のイントロン６に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８の一塩基多型の遺伝子型がＴＴ、ＥＳＲＲＧ遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０の一塩基多型の遺伝子型がＧＧ、及び／又はＬＲＰ１Ｂ遺伝子のイントロン５１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７の一塩基多型の遺伝子型がＧＧ、であるとき当該被験者が肥満の素因を有すると判定されることを特徴とする。
【００１０】
別の観点において、本発明は肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法を提供する。当該方法は、候補化合物を哺乳動物に投与するか、又は候補化合物の存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、前記哺乳動物又は哺乳動物細胞内で、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子からなる群より選択されるいずれか１又は複数の遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、ヒトの体脂肪量又は体脂肪率を規定する遺伝子マーカーを提供するものであり、これを用いて肥満発症リスクの高いハイリスク群を同定することが可能となり、肥満の早期診断及びこれらの遺伝子マーカーに関連する遺伝子を分子標的として新規肥満治療薬を開発することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書中において、「遺伝子多型」には、いわゆる一塩基多型(single nucleotide polymorphism：ＳＮＰ）、及び連続した複数ヌクレオチドにわたる多型の両方を含むものとする。すなわち、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１又は複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転位、逆位等の変異が存在するとき、その変異が当該１又は複数の個体に生じた突然変異でないことが統計的に確実か、又は当該個体内突然変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」という。
【００１３】
「対立遺伝子（allele）」とは、相同な遺伝子座を占める遺伝子に複数の種類がある場合の、個々の遺伝子のことをいい、特定の遺伝子座を占める２種類の対立遺伝子の組を「遺伝子型」と称する。「連鎖不平衡」とは、２つの対立遺伝子がそれぞれ独立に遺伝する場合よりも大きな頻度で互いに連鎖して遺伝することをいう。
【００１４】
本書において、「関連がある」との用語が、「肥満と関連がある」などの文脈で使用される場合には、統計学的な関連を有することを指し、好ましくは統計学的な解析によりｐ値が０．０５以下程度の有意な関連を有することを指す。本発明における「肥満」とは、体脂肪量又は体脂肪率が顕著に増加した状態と定義される一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、いわゆる「肥満症」も含む。また、肥満の「素因」とは、現在肥満であることのみならず、将来、例えば成人後に肥満になることも含む。
【００１５】
本明細書中において引用するＳＮＰ識別番号は、ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）が提供するＳＮＰデータベース（ｄｂＳＮＰ）から入手することができる。例えば、ＳＮＰ識別番号（ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ）：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型は、ヒトゲノム１ｐ１３．３に存在するＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在する。対立遺伝子としてはＡ／Ｇ（遺伝子の相補鎖ではＴ／Ｃ）であり、Ａが祖先型と推定されている。一般的に、母集団が異なると頻度も異なるが、日本人集団においてはＡが多数（約６０％）でありＧが少数である。なお、本書において、塩基配列の記号について、アデニンは「Ａ」、グアニンは「Ｇ」、シトシンは「Ｃ」、チミンは「Ｔ」、ウラシルは「Ｕ」、プリン（アデニン又はグアニン）は「Ｒ」、ピリミジン（チミン／ウラシル又はシトシン）は「Ｙ」と略記する。
【００１６】
本発明の方法で用いられる「ヒトのゲノムＤＮＡを含む試料」は、好ましくは日本人の被験者、さらに好ましくは日本人女性の被験者から単離されるあらゆる細胞（生殖細胞を除く）、組織、臓器等を材料として調製される。該材料としては、末梢血から分離した白血球又は単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法にしたがって単離される。
【００１７】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロテイナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行なうことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮａｓｅにより除去することができる。ただし、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行ってもよい。
【００１８】
次に、得られたヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、肥満症と関連がある遺伝子多型（本発明の場合は、全て一塩基多型）を検出する。使用可能な検出法として、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラー・ビーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、及びＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法などが挙げられる。以下、代表的な遺伝子多型検出方法について説明する。
【００１９】
ＤＮＡチップ法
多型部位を含む種々のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップ（遺伝子チップ）を用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ｃＤＮＡやｃＲＮＡとハイブリダイゼーションを行なう。オリゴヌクレオチドを光リソグラフィー技術により、アレイ上で合成し、１チップ上に数千から数十万個のプローブを配置させたもの（アフィメトリクス社製、ＧｅｎＣｈｉｐ（登録商標）等）や、予め調製したｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドをピン又はインクジェット方式によりガラス上に固定化する方法等が知られている。
【００２０】
ダイレクトシークエンス法
ダイレクトシークエンス法は、遺伝子多型部位を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した後、増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を直接ジデオキシ法により解析する方法である（Biotechniques, 11, 246-249 (1991)）。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、好ましくは、多型部位を含む約０．０５〜４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、シークエンスプライマーとしては、好ましくは、多型部位から５０〜３００ヌクレオチド程度５'末端側の位置に相当する１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いる。
【００２１】
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である（Genet. Anal., 14, 143-149 (1999), J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)）。この方法で用いられるＰＣＲプライマーは、通常多型部位を含む約０．０５〜２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するための、１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである。また、ＴａｑＭａｎプローブは、多型部位を含む１３〜２０塩基程度のオリゴヌクレオチドであり、５'末端は蛍光レポーター色素によって標識されており、３'末端はクエンチャー（消光物質）によって標識されている。このプローブを用いることにより、野生型と変異型のヌクレオチド変化の検出が可能である。
【００２２】
サーマルサイクラーを用いたＤＮＡの増幅を伴わない種々の方法が開発されている。例えば、インベーダー（登録商標）法は、２種類のオリゴヌクレオチドを用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する特殊な酵素反応に基づく（例えば、米国特許５８４６７１７号等参照）。この他に、ＵＣＡＮ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法及びＳＭＡＰ法等があるがこれらに限定されず、他の公知の遺伝子多型検出法を本発明の判定方法のために利用することができる。また、本発明の方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
また、本発明は、肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法をも包含し、これは候補化合物を哺乳動物に投与するか、又は候補化合物の存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、前記哺乳動物又は哺乳動物細胞内で、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子からなる群より選択されるいずれか１又は複数の遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、を含む。
【００２４】
上記遺伝子の発現レベルを測定するために、それらの遺伝子の転写産物の量や翻訳産物の活性を測定することができる。転写産物の量の測定は、試料中における、又は当該試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡから、前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせによる定量的ＰＣＲ分析を行うことができる。前記遺伝子に特異的なプローブによるノーザンブロットも適用されうる。ＤＮＡチップを用いることによって転写産物を測定することが好ましい場合もある。
【００２５】
上記遺伝子の翻訳産物の量及び／又は活性は、免疫アッセイ、酵素活性の測定及び／又は結合アッセイを用いて検出されうる。これらのアッセイは、抗ポリペプチド抗体又は抗ポリペプチド抗体に結合する二次抗体の何れかに結合する、酵素的、蛍光的、放射性、磁性、又は発光標識の使用により、前記翻訳産物と抗ポリペプチド抗体との間の結合量を測定することができる。
【００２６】
肥満の治療や予防のための該候補化合物としては、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、人工的に合成された化合物、発酵生産物、組織や細胞の抽出液、血清などが挙げられるが、これらに制限されない。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、あるいは公知の化合物であってもよい。
【００２７】
以下に、「実験例」により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。但し、ここでは、「実験例」とは、本発明の元となる原理・現象を証拠付けるデータを得るための実験の例を指し、本発明そのものを実際に実施した例ではない。但し、当業者であれば、これらの実験例に記載された情報、及び、前述した実施形態に関する記載を基に、容易に本発明を実施可能であることは明らかである。
【実施例１】
【００２８】
１ 方法
５５〜８３歳の閉経後の女性２５３名の血液よりＤＮＡを抽出し、遺伝子多型を決定した。対象とした遺伝子は、アフィメトリクス社のＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍａｐｐｉｎｇ １００Ｋ Ｓｅｔに含まれる、５万ＳＮＰについて、同社ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ法を用いて決定した。全身体脂肪量はＤＥＸＡ法（二重エネルギーＸ線吸収測定法）により測定した。年齢補正を行った全身体脂肪量との相関解析を行い、体脂肪量と関連するＳＮＰｓを選択した。本解析によって選択されたＳＮＰｓについて対象者数を増やし、再解析を行った。
【００２９】
なお、本実施例における相関解析は以下のとおりである。すなわち、年齢が高くなると体脂肪は小さくなる傾向があることが知られている。そのため、体脂肪率（％ＦＡＴ）をあるＳＮＰによる遺伝的効果を直接的に表したものとして解析するために統計学的に補正した値を算出し、この補正体脂肪率を％ＦＡＴＺとする。
本実施例では、次の式：
を用いて修正した体脂肪を年齢補正した体脂肪率として扱う。
この体脂肪率は、観測で得られた体脂肪率と、体脂肪率の年齢による線形モデルを考え、最小二乗法によって得られた予測値
との差である。つまり、％ＦＡＴＺは、％ＦＡＴから年齢に依存する部分を取り除いたものであり、年齢に依存しない量として扱うことができる。
【００３０】
次に、％ＦＡＴの閾値を設定し、質的形質へ変換した。もし医学的または統計的見知から量的形質に対して適切な閾値を設定することで、肥満群と非肥満群とに分割が可能であるならば、関連研究の解釈を容易にする。本解析では、最尤法を用いて肥満群と非肥満群の２分類を決めるための閾値を推定する。今ｎ個体の観測があるとする。xiとgi、i=1,...,nをそれぞれ個体iの％ＦＡＴ値、遺伝子型とする。閾値をtとし、t以上の％ＦＡＴに対応する個体と、そうでない個体に分割する。関連解析においてＦｉｓｈｅｒの正確法を適用するため、対数オッズ比の絶対値が最大となるようなtを推定する。以上の方法によりＦｉｓｈｅｒの関連解析を行いＰ＜０．０５を有意とした。
【００３１】
２ 結果
本解析により、日本人閉経後女性２５３名の遺伝子上にランダムに存在する約５万個のＳＮＰｓにおける遺伝子型(genotype)を決定した。その結果、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ（ＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５）をはじめ、いくつかの候補ＳＮＰｓが体脂肪量と有意に相関した。さらに、本解析により有意差が見出されたＳＮＰｓに関して、対象者数を７５２名まで増やし相関解析を行った。その結果を表１に示す。また、夫々のＳＮＰが存在する遺伝子の名称又は機能の概要を表２に示す。なお、表１において、左から順に、遺伝子記号、ＳＮＰデータベース識別番号（ｄｂＳＮＰ）、多型（ＳＮＰ）、肥満リスクＳＮＰ、オッズ比、信頼区間、及びＰ値(P value)を示した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
表１には、Ｐ値の小さいＳＮＰから順に並んでいる。表１において、オッズ比とは、要因（ＳＮＰ）と結果（肥満）との関連の強さを示す指標であり、０〜無限大に分布し、１は無相関、１より小さければその要因（ＳＮＰ）を有する者の肥満のリスクが低いことを、１より大きければリスクが高いことを意味する。信頼区間とは、９５％の確立で真の値が存在する範囲である。信頼区間の下限値が１を超えていたり、上限が１を下回っておれば５％水準で有意であるといえる。一方、Ｐ値は差がないという仮説、つまり帰無仮説 (Null hypothesis)を偶然起きたこととして受け入れる確率を表している。別の言い方をすると、実際に差がないのにサンプル抽出の際に偶然偏りが起きてしまって、差があるという結果が得られる確率を示している。そういう確率が低ければ低いほど、すなわちＰ値が小さければ小さい程、二つの群が同じ母集団に属する可能性は低くなり、二つの群は異なる母集団に属している可能性が高くなる。
【００３５】
表２には、各遺伝子の名称及びその翻訳産物の機能を示す。これらのうち、ミトコンドリアに存在する膜タンパク質や代謝酵素は、エネルギー産生や蓄積に関与している可能性が高い。また、脳や神経組織又は種々の組織で発現する受容体は、様々なシグナル伝達の制御機構を介して肥満と関連するかもしれない。あるいは、ＦＧＦ１０のように脂肪生成に重要な役割を果たしている遺伝子も存在する。従って、本発明に係るＳＮＰの存在又は不存在は、これらの遺伝子の発現を亢進させたり抑制することによって肥満を引き起こしている蓋然性が高いと考えられる。
【００３６】
さらに、表１に示したいくつかのＳＮＰについて、異なる手法にて統計的解析を行なった結果を図１〜図５に示した。図１から、被験者のＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＧであるとき、すなわち、遺伝子型がＧＧ又はＡＧである被験者は、ＡＡの遺伝子型を有する被験者に比べて有意に体脂肪率が上昇していることが分かる。図５に示したＬＯＣ４４１２８２遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型についても同様に、少なくとも１つの対立遺伝子がＴの場合に被験者の体脂肪率が増加する。
【００３７】
一方、図２〜４に示したように、例えば、ＮＡＰＳ３遺伝子のｒｓ１８８７０６８、ＥＳＲＲＧ遺伝子のｒｓ８６７４１０及びＬＲＰ１Ｂ遺伝子のｒｓ２１７１１０７の一塩基多型は、それぞれの遺伝子型がＴＴ、ＧＧ及びＧＧである場合に被験者の体脂肪率が増加している。
【００３８】
また、本解析により見出された上記ＳＮＰは、夫々の遺伝子近傍において連鎖不平衡にあるいくつかのＳＮＰｓが知られている。これらのＳＮＰｓは、すでにＨａｐＭａｐデータベースに登録されており、例えば、以下のような例を挙げることができる。
【００３９】
【表３】
【００４０】
従って、本発明において、上記表１に示したＳＮＰを検出する代わりに、或いはそれと共に、これらと連鎖不平衡にある何れか１又は複数のＳＮＰを検出しても良い。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の方法により肥満のハイリスク群を同定することができ、これらの被験者に肥満の早期治療を行なうことによって肥満患者の減少ひいては医療費の削減が達成され、国民経済上も多くの利益が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【図２】ＮＰＡＳ３遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【図３】ＥＳＲＲＧ遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【図４】ＬＲＰ１Ｂ遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【図５】ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７に関する被験者の遺伝子型と体脂肪率との相関を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、下記（ａ）〜（ｐ）からなる群より選択される何れか１又は複数の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれらと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出することを含み、当該遺伝子多型又はその組み合わせは、前記被験者の成人後における体脂肪量が増加しやすいか否かを示唆することを特徴とする、当該被験者における肥満の素因の有無を判定する方法：
（ａ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｂ）ＯＤＺ３遺伝子のイントロン２１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５２０５４１の一塩基多型Ｃ／Ｇ、
（ｃ）ＫＩＡＡ１７９７遺伝子のイントロン１３に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５１１６８４の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｄ）ＤＬＤ遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２２３７６８２の一塩基多型Ｃ／Ｇ、
（ｅ）ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のイントロン９に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型Ｔ／Ｃ、
（ｆ）ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９４０７７０の一塩基多型Ｇ／Ｃ、
（ｇ）ＮＰＡＳ３遺伝子のイントロン６に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８の一塩基多型Ｔ／Ｇ、
（ｈ）ＡＣＣＮ１遺伝子のイントロン７に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２０７４２１５の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｉ）ＴＧＭ２遺伝子の５’上流領域に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ７６１００２の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｊ）ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２５８８６２の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｋ）ＥＳＲＲＧ遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０の一塩基多型Ｇ／Ａ、
（ｌ）ＬＲＰ１Ｂ遺伝子のイントロン５１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７の一塩基多型Ｔ／Ｇ、
（ｍ）ＦＧＦ１０遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５１２８４４の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｎ）ＫＩＡＡ１６００遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ７８９７９３７の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｏ）ＡＦＴＰＨ遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ９３０９３６１の一塩基多型Ｃ／Ｔ、及び
（ｐ）ＤＡＰＫ１遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１４７５５２４の一塩基多型Ｔ／Ｃ。
【請求項２】
前記被験者の遺伝子多型について、
ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＧ、
ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のイントロン９に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＴ、
ＮＰＡＳ３遺伝子のイントロン６に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８の一塩基多型の遺伝子型がＴＴ、
ＥＳＲＲＧ遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０の一塩基多型の遺伝子型がＧＧ、及び／又は
ＬＲＰ１Ｂ遺伝子のイントロン５１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７の一塩基多型の遺伝子型がＧＧ、
であるとき当該被験者が肥満の素因を有すると判定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子多型の検出が、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラー・ビーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、及びＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法から成る群より選択される何れかの方法を用いて行われることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト被験者が日本人であることを特徴とする請求項１〜３の何れか記載の方法。
【請求項５】
前記日本人が女性であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
候補化合物を哺乳動物に投与するか、又は候補化合物の存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、
前記哺乳動物又は哺乳動物細胞内で、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子からなる群より選択されるいずれか１又は複数の遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【請求項１】
ヒト被験者のゲノムＤＮＡを含む試料を用いて、下記（ａ）〜（ｐ）からなる群より選択される何れか１又は複数の一塩基多型（ＳＮＰ）、又はそれらと連鎖不平衡にある遺伝子多型を検出することを含み、当該遺伝子多型又はその組み合わせは、前記被験者の成人後における体脂肪量が増加しやすいか否かを示唆することを特徴とする、当該被験者における肥満の素因の有無を判定する方法：
（ａ）ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｂ）ＯＤＺ３遺伝子のイントロン２１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５２０５４１の一塩基多型Ｃ／Ｇ、
（ｃ）ＫＩＡＡ１７９７遺伝子のイントロン１３に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５１１６８４の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｄ）ＤＬＤ遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２２３７６８２の一塩基多型Ｃ／Ｇ、
（ｅ）ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のイントロン９に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型Ｔ／Ｃ、
（ｆ）ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９４０７７０の一塩基多型Ｇ／Ｃ、
（ｇ）ＮＰＡＳ３遺伝子のイントロン６に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８の一塩基多型Ｔ／Ｇ、
（ｈ）ＡＣＣＮ１遺伝子のイントロン７に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２０７４２１５の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｉ）ＴＧＭ２遺伝子の５’上流領域に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ７６１００２の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｊ）ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２５８８６２の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｋ）ＥＳＲＲＧ遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０の一塩基多型Ｇ／Ａ、
（ｌ）ＬＲＰ１Ｂ遺伝子のイントロン５１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７の一塩基多型Ｔ／Ｇ、
（ｍ）ＦＧＦ１０遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１０５１２８４４の一塩基多型Ｃ／Ｔ、
（ｎ）ＫＩＡＡ１６００遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ７８９７９３７の一塩基多型Ａ／Ｇ、
（ｏ）ＡＦＴＰＨ遺伝子のイントロンに存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ９３０９３６１の一塩基多型Ｃ／Ｔ、及び
（ｐ）ＤＡＰＫ１遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１４７５５２４の一塩基多型Ｔ／Ｃ。
【請求項２】
前記被験者の遺伝子多型について、
ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子のイントロン２に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ４９１７８５の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＧ、
ＬＯＣ４４１２８２遺伝子のイントロン９に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ６９５５８８７の一塩基多型の少なくとも１つの対立遺伝子がＴ、
ＮＰＡＳ３遺伝子のイントロン６に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ１８８７０６８の一塩基多型の遺伝子型がＴＴ、
ＥＳＲＲＧ遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ８６７４１０の一塩基多型の遺伝子型がＧＧ、及び／又は
ＬＲＰ１Ｂ遺伝子のイントロン５１に存在するＳＮＰ識別番号：ｒｓ２１７１１０７の一塩基多型の遺伝子型がＧＧ、
であるとき当該被験者が肥満の素因を有すると判定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子多型の検出が、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラー・ビーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、及びＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法から成る群より選択される何れかの方法を用いて行われることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト被験者が日本人であることを特徴とする請求項１〜３の何れか記載の方法。
【請求項５】
前記日本人が女性であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
候補化合物を哺乳動物に投与するか、又は候補化合物の存在下において哺乳動物細胞を培養する工程と、
前記哺乳動物又は哺乳動物細胞内で、ＳＬＣ２５Ａ２４遺伝子、ＯＤＺ３遺伝子、ＫＩＡＡ１７９７遺伝子、ＤＬＤ遺伝子、ＬＯＣ４４１２８２遺伝子、ＯＮＥＣＵＴ２遺伝子、ＮＰＡＳ３遺伝子、ＡＣＣＮ１遺伝子、ＴＧＭ２遺伝子、ＦＡＭ４４Ｂ遺伝子、ＥＳＲＲＧ遺伝子、ＬＲＰ１Ｂ遺伝子、ＦＧＦ１０遺伝子、ＫＩＡＡ１６００遺伝子、ＡＦＴＰＨ遺伝子、及びＤＡＰＫ１遺伝子からなる群より選択されるいずれか１又は複数の遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−１１８８０３（Ｐ２００９−１１８８０３Ａ）
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２９８０４５（Ｐ２００７−２９８０４５）
【出願日】平成１９年１１月１６日（２００７．１１．１６）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１６日（２００７．１１．１６）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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