ヒト成長ホルモンの効率化された製造方法
【課題】形質転換大腸菌によるヒト成長ホルモンの産生効率を増大するための手段，及び産生された封入体からの活性タンパク質の回収率を増大するための手段を提供すること。
【解決手段】配列番号３に示す塩基配列又は配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列を含んでなるＤＮＡを組み込んだ，ＰＬ及びＰＲプロモータ及び温度感受性リプレッサー遺伝子を含んだヒト成長ホルモン発現ベクター，該発現ベクターで形質転換した大腸菌にヒト成長ホルモンを産生させる方法，並びに封入体の形で産生されたヒト成長ホルモンから活性なヒト成長ホルモンを製造する方法。
【解決手段】配列番号３に示す塩基配列又は配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列を含んでなるＤＮＡを組み込んだ，ＰＬ及びＰＲプロモータ及び温度感受性リプレッサー遺伝子を含んだヒト成長ホルモン発現ベクター，該発現ベクターで形質転換した大腸菌にヒト成長ホルモンを産生させる方法，並びに封入体の形で産生されたヒト成長ホルモンから活性なヒト成長ホルモンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，原核細胞，特に大腸菌に真核性ポリペプチドを生産させる効率的方法及び産生されたポリペプチドの効率的精製方法に関し，特に，大腸菌を宿主としてヒト成長ホルモンを生産させる効率的方法及び産生されたポリペプチドの効率的精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Escherichia coli）を用いて成長ホルモンを製造する方法は，遺伝子工学の先駆けを成す技術であり1980年前後に確立された。特に，非耐熱性（温度感受性）リプレッサーＣIを含有する適切な宿主大腸菌を，λバクテリオファージ由来のプロモーター・オペレターＰLＯLを含む発現ベクターで形質転換することより，真核性ポリペプチドを高い効率で産生できることが広く知られている（特許文献１）。例えば，この種の発現ベクター（温度感受性リプレッサーとしてλcI857を利用）を用いることにより，ウシ成長ホルモンの場合には，形質転換した大腸菌の高密度培養法により，３〜６ｇ／Ｌの産生効率が達成できることが報告されている（特許文献２）。
【０００３】
しかしながら，同様の発現ベクターを用いて大腸菌にヒト成長ホルモンを産生させる方法では，今日まで，上記ウシの場合のような高い産生効率を達成できておらず，ヒト成長ホルモンの産生効率は１ｇ／Ｌ程度に止まっている。従って，下垂体小人症等の治療に医薬品として使用されているヒト成長ホルモンにおいても，ウシのそれに匹敵するほどの高い産生効率を実現にして，医薬品としての製造効率の向上とコストの低減を可能にする方法に対する，潜在的な需要がある。
【０００４】
一般に，大腸菌を宿主としこれに異種生物のタンパク質をコードする外因性ＤＮＡを導入して当該タンパク質を産生させるに際し，当該ＤＮＡのコード領域が宿主大腸菌にとって稀なコドンを含む場合には，それらが宿主中における遺伝子発現の妨げになることが知られている。この他にも，ＧＣ含量や内部ＳＤ様配列，ＲＮＡ２次構造など大腸菌での発現に負に働くことが分かっている要因を除去した方が，発現効率が高まる。しかしながら他にも様々な負の因子が考えられ，それらを統合して遺伝子配列を設計することは容易でない。
【０００５】
また，ヒト成長ホルモンの製造には，大腸菌における産生効率が高くないことに加えて，産生されたタンパク質からの活性なヒト成長ホルモンの回収率が低いという別の問題もある。すなわち，大腸菌中で産生されたヒト成長ホルモンその他の外因性の組換えタンパク質は，一般に，菌体内に不溶化された状態で封入体として集積される。その場合，目的とする活性なタンパク質の回収は，菌体を破壊し，封入体（遠心により沈殿する）を単離して，これを可溶化するプロセスを経て行われる。封入体の可溶化には高濃度の尿素，イソチオシアン酸グアニジン，又はグアニジン塩酸塩を用いる方法，或いは，それらの可溶化剤の代わりにカチオン性界面活性剤のみを用いて可溶化させる方法，又は封入体を水酸化ナトリウムでｐＨ１１．８のアルカリ条件で処理することにより可溶化させる方法等が知られている（特許文献１，特許文献２，特許文献４，特許文献５，特許文献６，特許文献７）。
【０００６】
しなしながら，封入体を形成しているタンパク質は，通常，その固有の生理活性を失っている。従って，封入体から回収された組換えタンパク質を活性型とすることが極めて重要である。多くの場合，タンパク質がその生理活性を備えるためには，そのタンパク質が特有の３次元構造を形成するよう，そのポリペプチド鎖が正しく折りたたまれること（フォールディング）が必要である。従って，活性なタンパク質を回収するためには，不溶化されている封入体タンパク質を単に可溶化するだけでは足りず，その生理活性の発現に必要な正しい３次元構造を形成するよう再度折りたたみが起こる（リフォールディング）ように促す必要がある。可溶化した封入体タンパク質をリフォールディングさせる方法に関しても検討が進められており，最近では，封入体から回収された組換えタンパク質その他の変性タンパク質を，アルギニン，還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に滴下することによってリフォールディングさせ再活性化することも試みられている（特許文献８）。また，還元剤の存在下に，９．０以上のｐＨでタンパク質を可溶化する方法で０．４Ｍの尿素，０．４〜４Ｍの塩酸グアニジン，又は０．４〜４ＭのＬ−アルギニンを用いるものが知られている（特許文献９）。しかしながら，この公報には，成長ホルモンの記載はない。これら種々の知見にも関わらず，現在，形質転換大腸菌から単離された封入体からの活性なヒト成長ホルモンの回収率は，３０〜４０％程度に止まり，残り７０〜６０％の活性は失われたままである。従ってまた，封入体タンパク質からよりこれより高い回収率で活性なヒト成長ホルモンを回収することを可能にする方法に対する，潜在的な需要も存在する。
【０００７】
【特許文献１】特開昭６０−９１９８６号公報
【特許文献２】特開昭６２−６５６９８号公報
【特許文献３】特開昭６１−９３１２８号公報
【特許文献４】特開昭６２−２２３１９２号公報
【特許文献５】特表２００２−５１２８０８（ＷＯ ９９／５５８９９）
【特許文献６】特表２００５−５３５２８６号公報（ＷＯ ２００３／０６６６７６）
【特許文献７】特開平７−９９９９０号公報
【特許文献８】ＷＯ ２００５／０３３３０７
【特許文献９】特許第３９２９７７７号公報（ＷＯ ２００１／０５５１７４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の背景の下で，本発明の一目的は，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの製造において，大腸菌に，改善された高い効率で当該タンパク質を産生させることのできる方法を提供することにより，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの製造効率を改善することである。
本発明の別の一目的は，大腸菌の菌体内に蓄積された封入体より，改善された高い効率で活性なヒト成長ホルモンを回収する方法を提供することにより，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの製造効率を改善することである。
本発明の更なる別の一目的は，上記２つの方法を併用することにより，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの産生効率と，大腸菌の菌体からの活性なヒト成長ホルモンの回収率との双方を改善することにより，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの製造効率を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的に向けた研究において，本発明者は，λバクテリオファージ由来のオペレータープロモーター系を利用した周知のヒト成長ホルモン発現ベクターをベースとして用いた。本発明者は，当該発現ベクター中のヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列を，それがコードするアミノ酸配列に変更が生じないよう各アミノ酸のコードの縮重の範囲内で修正を加えて，大腸菌の菌体内におけるヒト成長ホルモンの発現に最適化させるよう試み，その結果得られた塩基配列を，その上流に付加したＳＤ（Shine-Dalgarno）配列と共に，市販のpCE30ベクター（ATCC37830）に組み込んで発現ベクターを構築した。この発現ベクターを導入して大腸菌を形質転換したところ，従来の３〜４倍の極めて高い効率でヒト成長ホルモンを産生できることを見出した。
【００１０】
更に本発明者は，大腸菌の菌体内から回収された封入体ヒト成長ホルモンを，強アルカリ条件下において還元剤の不存在下にグアニジン塩酸塩と接触させて可溶化することを試みた。その結果，予想外にも，この方法によれば封入体ヒト成長ホルモンを可溶化させ且つ９５％以上という非常に高い回収率を以って活性ヒト成長ホルモンが得られることを見出し，これに基づき，大腸菌の封入体からの活性体としてヒト成長ホルモンの回収方法を確立した。
本発明は，これらの発見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
すなわち本発明は以下を提供する。
１．配列番号３に示す塩基配列，及び配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列を含んでなるＤＮＡ。
２．上記１のＤＮＡをコード領域として有するヒト成長ホルモン発現ベクター。
３．該コード領域の塩基配列の上流にＳＤ配列，その上流にλファージのＰＬプロモーター，更にその直ぐ上流にＰＲプロモーターを含んでいるものである，上記２のヒト成長ホルモン発現ベクター。
４．温度感受性リプレッサー遺伝子を更に含むものである，上記２又は３のヒト成長ホルモン発現ベクター。
５．該温度感受性リプレッサーが４２℃において不活性化されるリプレッサーである，上記４のヒト成長ホルモン発現ベクター。
６．該温度感受性リプレッサーがλcI857である，上記４のヒト成長ホルモン発現ベクター。
７．上記２ないし６のヒト成長ホルモン発現ベクターで形質転換された大腸菌。
８．大腸菌にヒト成長ホルモン発現ベクターを導入し，該大腸菌を培養することを含んでなる成長ホルモンの産生方法であって，該発現ベクターにおけるヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列が，配列番号３に示す塩基配列，及び配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列であることを特徴とする，方法。
９．該発現ベクターが，該ヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列の上流にＳＤ配列，その上流にλファージのＰＬプロモーター，更にその直ぐ上流にＰＲプロモーターを含んでいるものである，上記８の方法。
１０．該発現ベクターが，温度感受性リプレッサー遺伝子を更に含むものである，上記８又は９の方法。
１１．該温度感受性リプレッサーが４２℃において不活性化されるものである，上記８ないし１０の何れかの方法。
１２．該温度感受性リプレッサーがλcI857である，上記８ないし１０の何れかの方法。
１３．上記８ないし１２の何れかの方法によって菌体内に産生され，菌体から単離されたヒト成長ホルモン封入体の可溶化方法であって，該単離されたヒト成長ホルモン封入体を，還元剤の不存在下，ｐＨ１１〜１３アルカリ性条件下に水性媒質中で２Ｍ以上の濃度のグアニジン塩と混合するステップと，該混合物中の封入体が溶解するまで混合物を撹拌するステップとを含んでなるものである，方法。
１４．グアニジン塩の濃度が２〜６Ｍである，上記１３の方法。
１５．該グアニジン塩がグアニジン塩酸塩である，上記１３又は１４の方法。
１６．上記１３ないし１５の何れかの方法によって得られたヒト成長ホルモン含有溶液からの，活性なヒト成長ホルモンの製造方法であって，該溶液の塩酸グアニジンを除去し且つ溶液のｐＨを中性方向へと低下させることにより，ヒト成長ホルモンのリフォールディングを起こさせるステップを含んでなるものである，方法。
１７．大腸菌の菌体内に産生され菌体から単離されたヒト成長ホルモン封入体の可溶化方法であって，該単離されたヒト成長ホルモン封入体を，還元剤の不存在下，ｐＨ１１〜１３のアルカリ性条件下に水性媒質中で２Ｍ以上の濃度のグアニジン塩と混合するステップと，該混合物中の封入体が溶解するまで混合物を撹拌するステップとを含んでなるものである，方法。
１８．グアニジン塩の濃度が２〜６Ｍである，上記１７の方法。
１９．該グアニジン塩がグアニジン塩酸塩である，上記１７又は１８の方法。
２０．上記１７ないし１９の何れかの方法によって得られたヒト成長ホルモン含有溶液からの，活性なヒト成長ホルモンの製造方法であって，該溶液の塩酸グアニジンを除去し且つ溶液のｐＨを中性方向へと低下させることにより，ヒト成長ホルモンのリフォールディングを起こさせるステップを含んでなるものである，方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は，大腸菌の菌体内におけるヒト成長ホルモンの産生率を従来に比して格段に高めることにより，及び／又は大腸菌の菌体内に封入体として産生されたヒト成長ホルモンからの，活性なホルモンの回収率を格段に高めることにより，従来に比して極めて高い製造効率で，大腸菌を用いてヒト成長ホルモンの製造することを可能にする。なお，本発明により得られるヒト成長ホルモンは，形質転換大腸菌を用いて従来製造されているヒト成長ホルモンと同様，Ｎ末端にメチオニンが結合したものである。大腸菌より抽出後，従来と同様にアミノペプチダーゼ（例えば，Vibrio proteolyticusのアミノペプチダーゼ）で末端メチオニンを除去することにより，天然型のヒト成長ホルモンを与える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において，ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡの取り分け好ましい最適化した塩基配列は，従来に比して３〜４倍という，高いヒト成長ホルモン産生効率を達成できる配列番号３の塩基配列である。しかしながら，当該配列に近い塩基配列を有し且つ当該配列と同一のアミノ酸配列をコードするものであるＤＮＡもまた，本発明において好ましく用いることができる。本来のヒト成長ホルモン遺伝子（野生型）のコード領域の塩基配列（配列番号１）は，塩基総数が579個，塩基Gが138個，塩基Cが179個であり，塩基GとCの合計が317個，GC％が54.7％〔317/579×100〕である。これに対し，配列番号３の最適化した塩基配列は，塩基総数は同一であるが，塩基Gが146個，塩基Cが143個，塩基G及びCの合計が289個，GC％が49.9％〔289/579×100〕であるという特徴を有する。改変により生じたこの低いGC％は，宿主大腸菌にヒト成長ホルモンを高い効率で産生させる上での重要な要因である。このことから，野生型のヒト成長ホルモン遺伝子のGC％よりも，配列番号３の塩基配列のGC％の方に近いGC％に収まる範囲内で（例えば，48〜52％のGC％で），且つコードされるアミノ酸を変更しない範囲で（すなわち，各アミノ酸について縮重したコドンの範囲内で），配列番号３のＤＮＡの塩基を置換することにより，天然型のヒト成長ホルモン遺伝子を用いて大腸菌にヒト成長ホルモンを産生させる従来の方法に比して優れた産生効率を達成する改変型ヒト成長ホルモン遺伝子を得ることができる。より具体的には，塩基G及びCの個数の合計が278〜301個の範囲に収まるように，配列番号３の塩基配列において，縮重したコドンの範囲内で，塩基を置換すればよい。本発明は，こうして得られる改変型のヒト成長ホルモン遺伝子であるＤＮＡをも包含する。
【００１４】
本発明において，ヒト成長ホルモンの最適化したコード領域のＤＮＡ（配列番号３）は，好ましくはその上流に付加したＳＤ（Shine-Dalgarno）配列と共に，大腸菌内での外因性タンパク質の発現に適したベクターに組み込んで，発現ベクターを構築するのに用いることができる。発現ベクターは，温度感受性リプレッサー遺伝子を有することが好ましく，例えば温度４２℃で不活性化されるリプレッサーの遺伝子を有することが好ましい。特に好ましいベクターとしては，市販のpCE30（ATCC37830）を挙げることができ，これはクローニング部位の上流に，順次，λファージのＰＬプロモーター，これとタンデムに並んだＰＲプロモーター，更にはその上流の温度感受性リプレッサー遺伝子λcI857の塩基配列を有する。
【００１５】
上記のヒト成長ホルモン発現ベクターで形質転換した大腸菌は，従来周知の方法に準じ，酸素濃度を高めた培地中で，溶存酸素濃度が平均で例えば２０〜６０％飽和となるようにしつつ培養し，培地温度を４２℃まで高めることにより，温度感受性リプレッサーを不活性化させてヒト成長ホルモンを産生させることができる。その間培地は，十分に撹拌しつつｐＨを約７（例えば，７．０±０．０５）に維持するのが好ましい。ｐＨを常時モニターしつつ，ｐＨの調節には，アルカリとしてアンモニア水を，酸として塩酸を用いることが好ましい。培養は，培養液の吸光度（ＯＤ600）がほぼプラトーに達してから２時間程度は続けるのが好ましい。
【００１６】
培養後は，遠心して菌体を回収し，菌体の細胞壁の破壊と封入体の分離及び精製を行う。細胞壁の破壊は，超音波処理等の機械的破砕によってもよく，界面活性剤を主体とした細胞壁を破壊してタンパク質を抽出するための市販の試薬（例えば，BugBusterTMProtein Extraction Reagent，タカラバイオ（株））を用いて行ってもよい。核酸の分解には，細胞壁の破壊又はその後のタンパク質抽出に際して，細胞を含んだ溶液にエンドヌクレアーゼを加えておけばよい。細胞壁の破壊と核酸の分解の後は，遠心にして封入体を沈殿として回収し，例えば，水洗及び遠心による回収のプロセスを複数回行って夾雑タンパク質を除去ずることにより，封入体を精製することができる。
【００１７】
精製した封入体の可溶化は，還元剤を含まないｐＨ１１〜１３のグアニジン塩溶液中に封入体を分散させて（例えば，３ｍｇ／ｍＬ），低温（例えば４℃）で撹拌することにより行うことができる。他の可溶化剤，例えば尿素等を加える必要はない。グアニジン塩としては，例えばグアニジン塩酸塩を用いることができる。グアニジン塩（例えばグアニジン塩酸塩）の濃度は，２Ｍ以上であることが好ましい。グアニジン塩酸塩の濃度に明確な上限はないが，４Ｍ又は６Ｍで封入体が完全に可溶化する上，余分に加えても除去に手間を要するのみであることを考慮すれば，６Ｍまでとするのが便利である。従って，グアニジン塩の濃度は，２〜６Ｍの範囲とすればよい。グアニジン塩溶液には，必須ではないが緩衝剤を含有させておくことができる。緩衝剤としては特に限定はないが，可溶化後ｐＨを下げてヒト成長ホルモンのリフォールデングを起こさせる際に，溶液のｐＨを８付近で比較的安定させるのに役立つものが挙げられる。一例は，Ｔｒｉｓ〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕である。封入体の可溶化は，約１〜１８時間にわたって封入体の懸濁液を撹拌することにより完了する。
【００１８】
上記可溶化処理により得られたヒト成長ホルモン溶液（強アルカリ性）は，次いでグアニジン塩を除去すると共に溶液のｐＨを中性方向へと低下させることによりリフォールディングさせることができる。ここに，「中性方向への」とは，ｐＨ７付近へ向けて低下させることをいうが，必ずしもｐＨ７にまで低下させることを要しない。活性測定もアルカリ側で行うことができ（例えば，ｐＨ７．３５〜７．６５。実施例の部を参照），これよりアルカリ側のｐＨ，例えばｐＨ９やｐＨ８でもリフォールディングは起こるからである。従って，例えば，ｐＨ９又はｐＨ８付近へとｐＨを低下させればで十分である。
【００１９】
またここに，「グアニジン塩の除去」というときは，必ずしも完全に除去すること意味せず，グアニジン塩の濃度を５００ｍＭ程度又はそれ以下にすることを含む。その程度の除去でリフォールディングが起こるからである。従って，「グアニジン塩の除去」は，例えばグアニジン塩の濃度を，５００ｍＭ，４００ｍＭ，３００ｍＭ，２００ｍＭ，１００ｍＭ又は０ｍＭにすることを含む。
【００２０】
グアニジン塩を除去し且つｐＨを中性方向へと低下させるには，可溶化処理完了直後のヒト成長ホルモン溶液を，例えば，中性付近（例えばｐＨ８）の緩衝液で単に希釈するか，又は同様の緩衝液を添加して限外濾過を行うか，同様の緩衝液に対して透析を行う等，適宜な手段を用いることができる。こうしてグアニジン塩を除去しｐＨを中性方向へと低下させることにより，正しくリフォールディングしたヒト成長ホルモンが溶液中に得られる。このプロセス中に沈殿が生じた場合，沈殿中には，ヒト成長ホルモンは殆ど含まれないため，遠心等により除去すればよい。
【００２１】
その後，こうしてリフォールディングされたヒト成長ホルモンを更に精製するには，例えば，イオン交換クロマトグラフィーその他，タンパク質の精製の分野で当業者に周知の手段を適宜選んで用いればよい。なお，上記でリフォールディングして得られたヒト成長ホルモンは，従来方法で大腸菌に産生させ抽出して得られているヒト成長ホルモンと同様，Ｎ末端にメチオニンが付加したものであり，この形でもヒト成長ホルモンとしての活性を十分に有する。天然型のヒト成長ホルモンを得るには，これまで大腸菌を用いたヒト成長ホルモン製剤の製造で行われてきた周知方法と同様にして，Ｎ末端のメチオニンをアミノペプチダーゼで除去すればよい。
【実施例１】
【００２２】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００２３】
１．ＧＨ発現ベクターの作製
ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡのコード領域の塩基配列を，大腸菌発現系に好適となるよう修正し最適化した合成ＤＮＡを用いて，ヒト成長ホルモンの発現ベクターを構築した。ヒト成長ホルモン遺伝子のコード領域の本来の（すなわち野生型の）塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２に，大腸菌内での発現用に最適化したコード領域の塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を配列番号３及び４に，それぞれ示す。配列番号２及び配列番号４により表された配列は，同一である。配列番号３の塩基配列中，配列番号１との相違箇所の塩基に下線を付して，図１に示す。配列番号１のＤＮＡのGC％〔（塩基Ｇの数＋塩基Ｃの数）／全塩基数×１００〕が，54.7％〔(138+179)/579×100〕であるのに対して，配列番号１の最適化ＤＮＡのGC％は，49.9％〔(146+143)/579×100〕である。また配列番号３の全塩基579個中，139個が，それぞれ，コードされるアミノ酸を変更しない範囲で（すなわち，各アミノ酸に対して縮重したコドンの範囲内で）他の塩基に置換されている。
【００２４】
発現ベクターの構築手順は次の通りである。すなわち，配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを挿入して構築したプラスミドＤＮＡ(#055563)を鋳型に，KOD-plusを用いＰＣＲ反応を行った。反応系を半量に変更した以外は製品に添付のマニュアルに従ってＰＣＲ増幅を行った。順方向プライマーとしてOpt_hGH_FW 〔5’-CGGGATCCTAAGGAGGTTATCATATGTTTCCGACCATTCCGC-3’（配列番号５），塩基３〜８のGGATCCはBamHI部位，塩基９〜１７のTAAGGAGGTはＳＤ配列，塩基２４以降がヒト成長ホルモンの最適化したコード領域である。〕を，逆方向プライマーとしてOpt_hGH_RV〔5’-CGGAATTC GCGGCCGCTTAAAAGCCGC-3’（配列番号６），塩基３〜８のGAATTCはEcoRI部位，塩基９〜１６のGCGGCCGCはNotI部位である。〕を用いた。反応条件は「９４℃／２分，（９４℃／２０秒，５３℃／３０秒，６８℃／４５秒）×３０サイクル，４℃／∞」とした。アガロースゲル電気泳動で増幅を確認後，残りをQIAquick ＰＣＲ精製キットで精製した。この精製したＰＣＲ産物及びpCE30（ATCC37830。ATCCより購入）を，それぞれBamHIとEcoRIで消化し，アガロースゲル電気泳動後に切り出してQIAquickゲル抽出キット若しくはMinEluteゲル抽出キットで精製した。両断片をLigation-Convenience キットを用いて連結し，Competent high HB101に導入して当該大腸菌を形質転換した。翌日，任意の１０クローンＬＢ＋Ａｍｐ培地で一晩培養し，さらにその翌日，QIAprep Spin Miniprep Kitでプラスミドを精製した。制限酵素処理解析でインサートが確認されたクローンのヒト成長ホルモン遺伝子配列をBigDye Terminator v1.1 Cycle sequencing Kit及びABI PRISM 3100-Avant genetic Analyzerを用いて解析し，配列（配列番号３）に誤りがないことを確認した。構築したヒト成長ホルモン発現ベクターを「pRL-hGH」と命名した。図２にそのベクターマップを示す。この発現ベクターは，pCE30が有するλファージのＰＲプロモーター及びＰＬプロモーターが，最適化ヒト成長ホルモン遺伝子の直ぐ上流にタンデムに並んでおり，これを強力に転写する。また同一ベクター内にpCE30が有するcI857遺伝子があり，どのような大腸菌でもこの発現ベクターで形質転換するだけで，温度を上昇させる（４２℃）ことによる厳密な発現誘導が可能である。
【００２５】
２．コンピテントセル（ＢＬ２１）の作製
一般的な塩化カルシウム法を用いて行った。１ｍＬのＬＢ培地にＡＴＣＣより購入したＢＬ２１を植菌し，３７℃で一晩培養した。この培養液０．２５ｍＬに１２．５ｍＬのＬＢ培地を加えて更に３７℃で２時間培養した。氷上で２０分置いた後，３０００ｒｐｍ／４℃で１０分遠心後に上清を除去して氷冷した０．１Ｍ塩化カルシウムを５ｍＬ加えた。更に氷上で２０分置いた後，３０００ｒｐｍ／４℃で１０分遠心後に上清を除去して氷冷した０．１Ｍ塩化カルシウムを０．２５ｍＬ加えた。これを更に氷上で３時間置いたものをコンピテントセルとして形質転換に用いた。
【００２６】
３．ヒト成長ホルモン生産株の構築
上記１で構築した「pRL-hGH」１μLを，上記２で作製したコンピテントＢＬ２１の２０μＬに加え，氷上で３０分置いた。３７℃の浴槽で１分温めた後，200μＬのＳＯＣ培地を加え，LB+Ampプレートに播種し３７℃で培養した。翌日１０個のクローンをＬＢ培地に植菌し，下記４及び５の方法で発現を確認した。発現の確認できた１０個のクローンのうちの１つでグリセロールストック（−８０℃）を作成し，ヒト成長ホルモン生産株とした。このクローンを，以後のジャーファーメンター実験に用いた。
【００２７】
４．小スケール（試験管）での発現誘導
目的のクローンを１ｍＬのLB+Amp培地に植菌して３０℃で一晩培養した。５０μLの培養液に９５０μＬ の２×ＹＴ培地を加えて更に３〜５時間，３２℃で培養した。培養温度を４２℃へ上げて発現を誘導し，更に３時間培養した。
５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現確認
菌体を含む培養液を７０００ｒｐｍで１分遠心して菌体ペレットを分離し，５％の２−メルカプトエタノールを含むLaemmli Sample Bufferで菌体を懸濁した後，９５℃で５分加熱してSDS-PAGEに供した。この際，ヒト成長ホルモン標準品（Ｎ末端のメチオニン残基が除去されている）も同時にSDS-PAGEに供した。ヒト成長ホルモン標準品と同サイズのバンドの有無で発現確認を行った。それによると，この形質転換大腸菌は，３０℃では全くヒト成長ホルモンの発現を示さなかったが（図３レーン２），４２℃では，３時間の誘導で約１０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ600のヒト成長ホルモンを産生した。この形質転換大腸菌の全タンパク質中，ヒト成長ホルモンにおいて最も濃いバンドが見られた（図３レーン３）。
【００２８】
６．ヒト成長ホルモンの定量
ヒト成長ホルモンの定量は，SDS-PAGE，CBB染色，スキャナによる取り込み及びImage J による画像解析の手順により行った。ヒト成長ホルモン標準品の段階希釈液を３点作成し，それで検量線を作成してサンプル中のヒト成長ホルモンを測定した。
【００２９】
７．ジャーファーメンター用培地とFeed液の作製
ジャーファーメンター用の培地及びFeed液の組成は次の通りとした。
＜ジャーファーメンター用培地（TK25）（１Ｌ量）＞
（ＮＨ4）6ＨＰＯ4・・・・・・・・・・２５ｇ
Ｋ2ＳＯ4・・・・・・・・・・・・・・・５ｇ
ＮａＣｌ・・・・・・・・・・・・・・・・０．７５ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・５ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・７５０ｍｇ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・１７０ｍｇ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・７５ｍｇ
ＭｎＳＯ4・４〜５Ｈ2Ｏ・・・・・・・・３８ｍｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・１５０ｍｇ
Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ・・・・・・・１７ｍｇ
（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・・・・・・・・・７．５ｍｇ
グルコース・・・・・・・・・・・・・・・２０ｇ
酵母エキス・・・・・・・・・・・・・・・５ｇ
＜Feed液（P10E10G35）（300ｍＬ分）＞
７０％グルコース水溶液
上記の培地，Feed液共に，含水結晶ぶどう糖と他成分とを分けてオートクレーブ滅菌し，その後混合した。
【００３０】
８．全容３Ｌジャーファーメンター培養
ヒト成長ホルモン産生株のグリセロールストックの一部を１００ｍＬのTK25培地に植菌し，３２℃で一晩培養した。この培養液をジャーファーメンターと共にオートクレーブ滅菌した１ＬのTK25培地へ加えて，３２℃で培養を開始した。その他のパラメーターは自動制御でｐＨ７．０±０．０５，エアー流量２Ｌ／分，ＤＯ（溶存酸素濃度）＞５０％飽和（回転数と酸素供給による２段階制御）に設定した。菌増殖は濁度計で常時モニターした。ｐＨ調製用として，アルカリとして２８％アンモニア水を，酸方向への調整用には塩酸を用いた。回転数も自動制御で初期は６００ｒｐｍに設定し，ＤＯの低下に従って６００から１０００ｒｐｍに上がるようにした。１０００ｒｐｍでもＤＯの低下が見られたら，回転数を１０００ｒｐｍに固定し，酸素を自動制御でＤＯ＞５０％となるようにエアーに混合して供給した。Feed液は培養開始５時間後に添加開始し，段階的にFeed液量を増加させた（培養開始から５〜８時間後: 約２５ｍＬ／ｈ，８〜１０時間：約３５ｍＬ／ｈ，１０〜１４時間後：約４０ｍＬ／ｈ）。培養開始８〜９時間後に培養温度を４２℃に上げて，発現を誘導した。培養開始約１４時間後に培養を止めて培養液を回収し，１００００ｇ／４℃で１５分遠心して菌体ペレットを得た。培養途中もサンプリングを行い，氷上もしくは４℃で保存し，培養終了後に全サンプル同時に吸光度（ＯＤ600）を測定した。
【００３１】
上記全１４時間の培養で，菌の増殖を示す吸光度（ＯＤ600）は約１００に達し（図４Ａ），その時のヒト成長ホルモン発現量は３〜４ｇ／Ｌに達した。これはヒト成長ホルモン遺伝子の塩基配列をそのまま用いた従来の方法でのヒト成長ホルモン発現量の３〜４倍である。図４Ｂに示すように，ＤＯは培養開始後から減少し始め，それに伴って回転数が上昇し，培養３時間後には最大回転数の１０００ｒｐｍに達した。これ以降は酸素供給を行ってＤＯの維持に努めた。酸素消費速度はグルコース消費と相関しており，酸素消費速度を観察することでグルコースの枯渇をある程度察知できるため，それに応じて，培養開始から約５時間後にFeed液の供給を開始した。
【００３２】
９．封入体の精製
７．８ｇの菌体ペレット（湿重量）に，４０ｍＬのBugBuster（タンパク質抽出試薬，タカラバイオ（株））及び２０μＬ Benzonase（エンドヌクレアーゼ，Merck KGaA）を加えて混合した。ローテーター（タイテック（株））で混合物を回転撹拌しながら室温で２０分間置いた後，１６０００ｇ／４℃で２０分間遠心した。上清を除去し，ヒト成長ホルモン封入体を沈殿として得た。沈殿に洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＥＤＴＡ及び２％デオキシコール酸塩を含有，ｐＨ８．０）５０ｍＬを加えて混合し，懸濁液とした。この懸濁液を１６０００ｇ／４℃で１５分間遠心後，上清を除去し，沈殿に再度上記の洗浄液５０ｍＬを加えて混合して懸濁液とし，１６０００ｇ／４℃で１５分遠心した。上清を除去し，沈殿を５０ｍＬの超純水（MilliQ水）に懸濁させ，１６０００ｇ／４℃で１５分間遠心した。この操作を２回行い，沈殿を回収した。これにより，ヒト成長ホルモンを殆どロスすることなしに，多くの夾雑タンパク質が除去された（図５）。得られた沈殿を次の「封入体の可溶化」プロセスに供した。
【００３３】
１０．封入体の可溶化の検討
予備的実験においてヒト成長ホルモン封入体は，ｐＨ８の水溶液中においては全く可溶化せず，強アルカリ性（ｐＨ１２．５）でも３０〜４０％しか可溶化されないことが判明した（図６Ａ）。このため，上記で精製した封入体の溶解のための改良方法を求めて検討した。上記で精製した封入体のサンプルをとり，(a)１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び２〜８Ｍ尿素を含有する水溶液，又は(b)１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び０．５〜６Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｎＨＣｌ）を含有する水溶液（共に，水酸化ナトリウムによりｐＨ１２．５に調整）に，ヒト成長ホルモンとして３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように加え，ローテーターで混合物を回転攪拌しながら，４℃で１時間以上（１〜１８時間）処理した。各混合物を１５０００ｒｐｍ／４℃で１５分間遠心し，上清中に可溶化されたヒト成長ホルモンを得た。図６Ｂに示すように，ｐＨ１２．５における尿素の使用は，濃度４Ｍまでは可溶化効果がなく，８Ｍにおいても，封入体の約７０％が可溶化されるに止まった。これに対し，ｐＨ１２．５におけるグアニジン塩酸塩の使用では，２Ｍで封入体の９５％以上が，４Ｍ以上で１００％が可溶化された（図７）。高濃度の尿素ではタンパク質がカルバミル化される可能性も報告されていることや，可溶化率が極めて優れることから，強アルカリ性におけるグアニジン塩酸塩の使用が極めて好ましい可溶化方法であることが判明した。従ってこの方法で封入体を可溶化し，次の「リフォールディング」のプロセスに供した。
【００３４】
１１．リフォールディング及び陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ ＦＦ）による簡易精製
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び２Ｍ グアニジン塩酸塩（ｐＨ１２．５）含有の水溶液で可溶化することにより得られたヒト成長ホルモン溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を，これに当量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．０）を加え混合することによって，１／２希釈した。同様の１／２希釈操作を更に４回反復することにより，溶液中のグアニジン塩酸塩の濃度を最終的に６２．５ｍＭまで低下させた（ｐＨ８〜９）。得られた溶液を１２０００ｒｐｍ／４℃で１時間遠心し，沈殿を除去した。ヒト成長ホルモンは沈殿中には殆ど含まれず，可溶画分に存在していた（図８）。得られた上清を，次の「陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ ＦＦ）による簡易精製」のプロセスに供した。
【００３５】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．０）で平衡化済みのＤＥＡＥ ＦＦカラムに，超純水で１０倍希釈し，０．８μｍフィルターを通した上記のヒト成長ホルモン希釈溶液を負荷した。これを，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄後，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２５／５０／１００／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０で溶出させた。１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した画分をAmicon Ultra-4 10,000 MWCO膜で約３０倍濃縮し，緩衝液をＰＢＳ（−）（塩化ナトリウム０．８％，塩化カリウム０．０２％，リン酸一水素ナトリウム（無水）０．１１５％，リン酸ニ水素カリウム（無水）０．０２％，ｐＨ７．３５〜７．６５，タカラバイオ（株））に置換した。溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し，分子吸光係数をＥ1%1cm＝８．３５としてヒト成長ホルモン濃度を算出した。図９に精製の結果を示す〔レーン１；負荷液（リフォーディングした本発明によるヒト成長ホルモン），レーン２；Pass画分，レーン３：PW画分，レーン４〜７；溶出画分（それぞれ，25，50，100，150ｍＭ塩化ナトリウム），レーン８；Strip画分（１Ｍ塩化ナトリウム），レーン９：ヒト成長ホルモン標準品〕。このうちレーン６のサンプルを次の「in vitroバイオアッセイ」に供した。
【００３６】
１３．in vitro バイオアッセイ
成長ホルモン依存性細胞株を用いた。まず，ＧＨ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋０．４ｍｇ／ｍＬ，Ｇ４１８＋１００ｎｇ／ｍＬ）に，成長ホルモン依存性細胞を１×１０5個／ｍＬで播種し，３７℃／５％ＣＯ2にて３日間培養した。４倍量の同培地を加えて，更に一晩３７℃／５％ＣＯ2で培養した。翌日，ＰＢＳ（−）で細胞を３回洗浄した後，培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％，ウマ血清０．１ｍｇ／ｍＬ，Ｇ４１８）に懸濁し，３７℃／５％ＣＯ2で１６時間培養した。細胞数を測定し，３×１０5個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウマ血清にて調整し，９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。上記簡易精製プロセスにより調製されたヒト成長ホルモンと，ヒト成長ホルモン標準品とを，ＰＢＳ（−）＋０．５％ＢＳＡで，６０ｎｇ／ｍＬの濃度から始めて各３倍希釈して９希釈系列を作成し（６０〜０．００９ｎｇ／ｍＬ），各ウェルに加えた（ｎ＝３）。ヒト成長ホルモンを加えないウェルをブランクとした。これらのプレートを３７℃／５％ＣＯ2にて２２時間培養後に，CellTiter96 Aqueous細胞増殖試験キット（Promega製）を用いて，増殖した細胞数を比色定量した。その結果，上記で得られたヒト成長ホルモンに生物活性があることが確認された（図１０Ａ及びＢ）。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は，大腸菌の菌体内におけるヒト成長ホルモンの産生率を格段に高め，及び／又は大腸菌の菌体内に封入体として産生されたヒト成長ホルモンからの，活性なホルモンの回収率を格段に高めるため，高い製造効率でのヒト成長ホルモンの製造に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】最適化したヒト成長ホルモンコード領域の塩基配列。塩基の下線は，本来のコード配列の塩基からの変更箇所を示す。
【図２】pRL-hGHのベクターマップ。
【図３】SDS-PAGEの結果を示す図面代用写真。レーン１；ヒト成長ホルモン標準品，レーン２；誘導前（３０℃），レーン３；誘導３時間後。
【図４Ａ】１４時間培養時のＯＤ600の推移，及びヒト成長ホルモン発現誘導開始から４，５，６時間後におけるヒト成長ホルモンの発現量を示すグラフ。
【図４Ｂ】ジャーファーメンターでの１４時間培養における制御パラメーターの推移を示すグラフ。
【図５】精製された封入体の精製度合いを示す図面代用写真
【図６Ａ】弱アルカリ条件下及び強アルカリ条件下（４時間）での，封入体可溶化の程度を示すグラフ。
【図６Ｂ】強アルカリ条件下での８Ｍまでの尿素による封入体可溶化の程度を示すグラフ。
【図７】強アルカリ条件下での６Ｍまでのグアニジン塩酸塩による封入体の可溶化を示すグラフ。
【図８】強アルカリ条件下でのグアニジン塩酸塩による封入体可溶化後のヒト成長ホルモンのリフォールディング効率を示すグラフ。
【図９】DEAE FFによる簡易精製の結果を示す図面代用写真。レーン１；負荷液（リフォーディングしたヒト成長ホルモン），レーン２；Pass画分，レーン３：PW画分，レーン４〜７；溶出画分（それぞれ，25，50，100，150ｍＭ塩化ナトリウム），レーン８；Strip画分（１Ｍ塩化ナトリウム），レーン９：ヒト成長ホルモン標準品。
【図１０】（Ａ）ヒト成長ホルモン標準品のホルモン活性を示す標準曲線。（Ｂ）本発明により得られたヒト成長ホルモン（Ｎ末端メチオニン未除去）のホルモン活性を示す標準曲線。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，原核細胞，特に大腸菌に真核性ポリペプチドを生産させる効率的方法及び産生されたポリペプチドの効率的精製方法に関し，特に，大腸菌を宿主としてヒト成長ホルモンを生産させる効率的方法及び産生されたポリペプチドの効率的精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Escherichia coli）を用いて成長ホルモンを製造する方法は，遺伝子工学の先駆けを成す技術であり1980年前後に確立された。特に，非耐熱性（温度感受性）リプレッサーＣIを含有する適切な宿主大腸菌を，λバクテリオファージ由来のプロモーター・オペレターＰLＯLを含む発現ベクターで形質転換することより，真核性ポリペプチドを高い効率で産生できることが広く知られている（特許文献１）。例えば，この種の発現ベクター（温度感受性リプレッサーとしてλcI857を利用）を用いることにより，ウシ成長ホルモンの場合には，形質転換した大腸菌の高密度培養法により，３〜６ｇ／Ｌの産生効率が達成できることが報告されている（特許文献２）。
【０００３】
しかしながら，同様の発現ベクターを用いて大腸菌にヒト成長ホルモンを産生させる方法では，今日まで，上記ウシの場合のような高い産生効率を達成できておらず，ヒト成長ホルモンの産生効率は１ｇ／Ｌ程度に止まっている。従って，下垂体小人症等の治療に医薬品として使用されているヒト成長ホルモンにおいても，ウシのそれに匹敵するほどの高い産生効率を実現にして，医薬品としての製造効率の向上とコストの低減を可能にする方法に対する，潜在的な需要がある。
【０００４】
一般に，大腸菌を宿主としこれに異種生物のタンパク質をコードする外因性ＤＮＡを導入して当該タンパク質を産生させるに際し，当該ＤＮＡのコード領域が宿主大腸菌にとって稀なコドンを含む場合には，それらが宿主中における遺伝子発現の妨げになることが知られている。この他にも，ＧＣ含量や内部ＳＤ様配列，ＲＮＡ２次構造など大腸菌での発現に負に働くことが分かっている要因を除去した方が，発現効率が高まる。しかしながら他にも様々な負の因子が考えられ，それらを統合して遺伝子配列を設計することは容易でない。
【０００５】
また，ヒト成長ホルモンの製造には，大腸菌における産生効率が高くないことに加えて，産生されたタンパク質からの活性なヒト成長ホルモンの回収率が低いという別の問題もある。すなわち，大腸菌中で産生されたヒト成長ホルモンその他の外因性の組換えタンパク質は，一般に，菌体内に不溶化された状態で封入体として集積される。その場合，目的とする活性なタンパク質の回収は，菌体を破壊し，封入体（遠心により沈殿する）を単離して，これを可溶化するプロセスを経て行われる。封入体の可溶化には高濃度の尿素，イソチオシアン酸グアニジン，又はグアニジン塩酸塩を用いる方法，或いは，それらの可溶化剤の代わりにカチオン性界面活性剤のみを用いて可溶化させる方法，又は封入体を水酸化ナトリウムでｐＨ１１．８のアルカリ条件で処理することにより可溶化させる方法等が知られている（特許文献１，特許文献２，特許文献４，特許文献５，特許文献６，特許文献７）。
【０００６】
しなしながら，封入体を形成しているタンパク質は，通常，その固有の生理活性を失っている。従って，封入体から回収された組換えタンパク質を活性型とすることが極めて重要である。多くの場合，タンパク質がその生理活性を備えるためには，そのタンパク質が特有の３次元構造を形成するよう，そのポリペプチド鎖が正しく折りたたまれること（フォールディング）が必要である。従って，活性なタンパク質を回収するためには，不溶化されている封入体タンパク質を単に可溶化するだけでは足りず，その生理活性の発現に必要な正しい３次元構造を形成するよう再度折りたたみが起こる（リフォールディング）ように促す必要がある。可溶化した封入体タンパク質をリフォールディングさせる方法に関しても検討が進められており，最近では，封入体から回収された組換えタンパク質その他の変性タンパク質を，アルギニン，還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に滴下することによってリフォールディングさせ再活性化することも試みられている（特許文献８）。また，還元剤の存在下に，９．０以上のｐＨでタンパク質を可溶化する方法で０．４Ｍの尿素，０．４〜４Ｍの塩酸グアニジン，又は０．４〜４ＭのＬ−アルギニンを用いるものが知られている（特許文献９）。しかしながら，この公報には，成長ホルモンの記載はない。これら種々の知見にも関わらず，現在，形質転換大腸菌から単離された封入体からの活性なヒト成長ホルモンの回収率は，３０〜４０％程度に止まり，残り７０〜６０％の活性は失われたままである。従ってまた，封入体タンパク質からよりこれより高い回収率で活性なヒト成長ホルモンを回収することを可能にする方法に対する，潜在的な需要も存在する。
【０００７】
【特許文献１】特開昭６０−９１９８６号公報
【特許文献２】特開昭６２−６５６９８号公報
【特許文献３】特開昭６１−９３１２８号公報
【特許文献４】特開昭６２−２２３１９２号公報
【特許文献５】特表２００２−５１２８０８（ＷＯ ９９／５５８９９）
【特許文献６】特表２００５−５３５２８６号公報（ＷＯ ２００３／０６６６７６）
【特許文献７】特開平７−９９９９０号公報
【特許文献８】ＷＯ ２００５／０３３３０７
【特許文献９】特許第３９２９７７７号公報（ＷＯ ２００１／０５５１７４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の背景の下で，本発明の一目的は，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの製造において，大腸菌に，改善された高い効率で当該タンパク質を産生させることのできる方法を提供することにより，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの製造効率を改善することである。
本発明の別の一目的は，大腸菌の菌体内に蓄積された封入体より，改善された高い効率で活性なヒト成長ホルモンを回収する方法を提供することにより，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの製造効率を改善することである。
本発明の更なる別の一目的は，上記２つの方法を併用することにより，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの産生効率と，大腸菌の菌体からの活性なヒト成長ホルモンの回収率との双方を改善することにより，大腸菌を用いた組換えヒト成長ホルモンの製造効率を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的に向けた研究において，本発明者は，λバクテリオファージ由来のオペレータープロモーター系を利用した周知のヒト成長ホルモン発現ベクターをベースとして用いた。本発明者は，当該発現ベクター中のヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列を，それがコードするアミノ酸配列に変更が生じないよう各アミノ酸のコードの縮重の範囲内で修正を加えて，大腸菌の菌体内におけるヒト成長ホルモンの発現に最適化させるよう試み，その結果得られた塩基配列を，その上流に付加したＳＤ（Shine-Dalgarno）配列と共に，市販のpCE30ベクター（ATCC37830）に組み込んで発現ベクターを構築した。この発現ベクターを導入して大腸菌を形質転換したところ，従来の３〜４倍の極めて高い効率でヒト成長ホルモンを産生できることを見出した。
【００１０】
更に本発明者は，大腸菌の菌体内から回収された封入体ヒト成長ホルモンを，強アルカリ条件下において還元剤の不存在下にグアニジン塩酸塩と接触させて可溶化することを試みた。その結果，予想外にも，この方法によれば封入体ヒト成長ホルモンを可溶化させ且つ９５％以上という非常に高い回収率を以って活性ヒト成長ホルモンが得られることを見出し，これに基づき，大腸菌の封入体からの活性体としてヒト成長ホルモンの回収方法を確立した。
本発明は，これらの発見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
すなわち本発明は以下を提供する。
１．配列番号３に示す塩基配列，及び配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列を含んでなるＤＮＡ。
２．上記１のＤＮＡをコード領域として有するヒト成長ホルモン発現ベクター。
３．該コード領域の塩基配列の上流にＳＤ配列，その上流にλファージのＰＬプロモーター，更にその直ぐ上流にＰＲプロモーターを含んでいるものである，上記２のヒト成長ホルモン発現ベクター。
４．温度感受性リプレッサー遺伝子を更に含むものである，上記２又は３のヒト成長ホルモン発現ベクター。
５．該温度感受性リプレッサーが４２℃において不活性化されるリプレッサーである，上記４のヒト成長ホルモン発現ベクター。
６．該温度感受性リプレッサーがλcI857である，上記４のヒト成長ホルモン発現ベクター。
７．上記２ないし６のヒト成長ホルモン発現ベクターで形質転換された大腸菌。
８．大腸菌にヒト成長ホルモン発現ベクターを導入し，該大腸菌を培養することを含んでなる成長ホルモンの産生方法であって，該発現ベクターにおけるヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列が，配列番号３に示す塩基配列，及び配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列であることを特徴とする，方法。
９．該発現ベクターが，該ヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列の上流にＳＤ配列，その上流にλファージのＰＬプロモーター，更にその直ぐ上流にＰＲプロモーターを含んでいるものである，上記８の方法。
１０．該発現ベクターが，温度感受性リプレッサー遺伝子を更に含むものである，上記８又は９の方法。
１１．該温度感受性リプレッサーが４２℃において不活性化されるものである，上記８ないし１０の何れかの方法。
１２．該温度感受性リプレッサーがλcI857である，上記８ないし１０の何れかの方法。
１３．上記８ないし１２の何れかの方法によって菌体内に産生され，菌体から単離されたヒト成長ホルモン封入体の可溶化方法であって，該単離されたヒト成長ホルモン封入体を，還元剤の不存在下，ｐＨ１１〜１３アルカリ性条件下に水性媒質中で２Ｍ以上の濃度のグアニジン塩と混合するステップと，該混合物中の封入体が溶解するまで混合物を撹拌するステップとを含んでなるものである，方法。
１４．グアニジン塩の濃度が２〜６Ｍである，上記１３の方法。
１５．該グアニジン塩がグアニジン塩酸塩である，上記１３又は１４の方法。
１６．上記１３ないし１５の何れかの方法によって得られたヒト成長ホルモン含有溶液からの，活性なヒト成長ホルモンの製造方法であって，該溶液の塩酸グアニジンを除去し且つ溶液のｐＨを中性方向へと低下させることにより，ヒト成長ホルモンのリフォールディングを起こさせるステップを含んでなるものである，方法。
１７．大腸菌の菌体内に産生され菌体から単離されたヒト成長ホルモン封入体の可溶化方法であって，該単離されたヒト成長ホルモン封入体を，還元剤の不存在下，ｐＨ１１〜１３のアルカリ性条件下に水性媒質中で２Ｍ以上の濃度のグアニジン塩と混合するステップと，該混合物中の封入体が溶解するまで混合物を撹拌するステップとを含んでなるものである，方法。
１８．グアニジン塩の濃度が２〜６Ｍである，上記１７の方法。
１９．該グアニジン塩がグアニジン塩酸塩である，上記１７又は１８の方法。
２０．上記１７ないし１９の何れかの方法によって得られたヒト成長ホルモン含有溶液からの，活性なヒト成長ホルモンの製造方法であって，該溶液の塩酸グアニジンを除去し且つ溶液のｐＨを中性方向へと低下させることにより，ヒト成長ホルモンのリフォールディングを起こさせるステップを含んでなるものである，方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は，大腸菌の菌体内におけるヒト成長ホルモンの産生率を従来に比して格段に高めることにより，及び／又は大腸菌の菌体内に封入体として産生されたヒト成長ホルモンからの，活性なホルモンの回収率を格段に高めることにより，従来に比して極めて高い製造効率で，大腸菌を用いてヒト成長ホルモンの製造することを可能にする。なお，本発明により得られるヒト成長ホルモンは，形質転換大腸菌を用いて従来製造されているヒト成長ホルモンと同様，Ｎ末端にメチオニンが結合したものである。大腸菌より抽出後，従来と同様にアミノペプチダーゼ（例えば，Vibrio proteolyticusのアミノペプチダーゼ）で末端メチオニンを除去することにより，天然型のヒト成長ホルモンを与える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において，ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡの取り分け好ましい最適化した塩基配列は，従来に比して３〜４倍という，高いヒト成長ホルモン産生効率を達成できる配列番号３の塩基配列である。しかしながら，当該配列に近い塩基配列を有し且つ当該配列と同一のアミノ酸配列をコードするものであるＤＮＡもまた，本発明において好ましく用いることができる。本来のヒト成長ホルモン遺伝子（野生型）のコード領域の塩基配列（配列番号１）は，塩基総数が579個，塩基Gが138個，塩基Cが179個であり，塩基GとCの合計が317個，GC％が54.7％〔317/579×100〕である。これに対し，配列番号３の最適化した塩基配列は，塩基総数は同一であるが，塩基Gが146個，塩基Cが143個，塩基G及びCの合計が289個，GC％が49.9％〔289/579×100〕であるという特徴を有する。改変により生じたこの低いGC％は，宿主大腸菌にヒト成長ホルモンを高い効率で産生させる上での重要な要因である。このことから，野生型のヒト成長ホルモン遺伝子のGC％よりも，配列番号３の塩基配列のGC％の方に近いGC％に収まる範囲内で（例えば，48〜52％のGC％で），且つコードされるアミノ酸を変更しない範囲で（すなわち，各アミノ酸について縮重したコドンの範囲内で），配列番号３のＤＮＡの塩基を置換することにより，天然型のヒト成長ホルモン遺伝子を用いて大腸菌にヒト成長ホルモンを産生させる従来の方法に比して優れた産生効率を達成する改変型ヒト成長ホルモン遺伝子を得ることができる。より具体的には，塩基G及びCの個数の合計が278〜301個の範囲に収まるように，配列番号３の塩基配列において，縮重したコドンの範囲内で，塩基を置換すればよい。本発明は，こうして得られる改変型のヒト成長ホルモン遺伝子であるＤＮＡをも包含する。
【００１４】
本発明において，ヒト成長ホルモンの最適化したコード領域のＤＮＡ（配列番号３）は，好ましくはその上流に付加したＳＤ（Shine-Dalgarno）配列と共に，大腸菌内での外因性タンパク質の発現に適したベクターに組み込んで，発現ベクターを構築するのに用いることができる。発現ベクターは，温度感受性リプレッサー遺伝子を有することが好ましく，例えば温度４２℃で不活性化されるリプレッサーの遺伝子を有することが好ましい。特に好ましいベクターとしては，市販のpCE30（ATCC37830）を挙げることができ，これはクローニング部位の上流に，順次，λファージのＰＬプロモーター，これとタンデムに並んだＰＲプロモーター，更にはその上流の温度感受性リプレッサー遺伝子λcI857の塩基配列を有する。
【００１５】
上記のヒト成長ホルモン発現ベクターで形質転換した大腸菌は，従来周知の方法に準じ，酸素濃度を高めた培地中で，溶存酸素濃度が平均で例えば２０〜６０％飽和となるようにしつつ培養し，培地温度を４２℃まで高めることにより，温度感受性リプレッサーを不活性化させてヒト成長ホルモンを産生させることができる。その間培地は，十分に撹拌しつつｐＨを約７（例えば，７．０±０．０５）に維持するのが好ましい。ｐＨを常時モニターしつつ，ｐＨの調節には，アルカリとしてアンモニア水を，酸として塩酸を用いることが好ましい。培養は，培養液の吸光度（ＯＤ600）がほぼプラトーに達してから２時間程度は続けるのが好ましい。
【００１６】
培養後は，遠心して菌体を回収し，菌体の細胞壁の破壊と封入体の分離及び精製を行う。細胞壁の破壊は，超音波処理等の機械的破砕によってもよく，界面活性剤を主体とした細胞壁を破壊してタンパク質を抽出するための市販の試薬（例えば，BugBusterTMProtein Extraction Reagent，タカラバイオ（株））を用いて行ってもよい。核酸の分解には，細胞壁の破壊又はその後のタンパク質抽出に際して，細胞を含んだ溶液にエンドヌクレアーゼを加えておけばよい。細胞壁の破壊と核酸の分解の後は，遠心にして封入体を沈殿として回収し，例えば，水洗及び遠心による回収のプロセスを複数回行って夾雑タンパク質を除去ずることにより，封入体を精製することができる。
【００１７】
精製した封入体の可溶化は，還元剤を含まないｐＨ１１〜１３のグアニジン塩溶液中に封入体を分散させて（例えば，３ｍｇ／ｍＬ），低温（例えば４℃）で撹拌することにより行うことができる。他の可溶化剤，例えば尿素等を加える必要はない。グアニジン塩としては，例えばグアニジン塩酸塩を用いることができる。グアニジン塩（例えばグアニジン塩酸塩）の濃度は，２Ｍ以上であることが好ましい。グアニジン塩酸塩の濃度に明確な上限はないが，４Ｍ又は６Ｍで封入体が完全に可溶化する上，余分に加えても除去に手間を要するのみであることを考慮すれば，６Ｍまでとするのが便利である。従って，グアニジン塩の濃度は，２〜６Ｍの範囲とすればよい。グアニジン塩溶液には，必須ではないが緩衝剤を含有させておくことができる。緩衝剤としては特に限定はないが，可溶化後ｐＨを下げてヒト成長ホルモンのリフォールデングを起こさせる際に，溶液のｐＨを８付近で比較的安定させるのに役立つものが挙げられる。一例は，Ｔｒｉｓ〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕である。封入体の可溶化は，約１〜１８時間にわたって封入体の懸濁液を撹拌することにより完了する。
【００１８】
上記可溶化処理により得られたヒト成長ホルモン溶液（強アルカリ性）は，次いでグアニジン塩を除去すると共に溶液のｐＨを中性方向へと低下させることによりリフォールディングさせることができる。ここに，「中性方向への」とは，ｐＨ７付近へ向けて低下させることをいうが，必ずしもｐＨ７にまで低下させることを要しない。活性測定もアルカリ側で行うことができ（例えば，ｐＨ７．３５〜７．６５。実施例の部を参照），これよりアルカリ側のｐＨ，例えばｐＨ９やｐＨ８でもリフォールディングは起こるからである。従って，例えば，ｐＨ９又はｐＨ８付近へとｐＨを低下させればで十分である。
【００１９】
またここに，「グアニジン塩の除去」というときは，必ずしも完全に除去すること意味せず，グアニジン塩の濃度を５００ｍＭ程度又はそれ以下にすることを含む。その程度の除去でリフォールディングが起こるからである。従って，「グアニジン塩の除去」は，例えばグアニジン塩の濃度を，５００ｍＭ，４００ｍＭ，３００ｍＭ，２００ｍＭ，１００ｍＭ又は０ｍＭにすることを含む。
【００２０】
グアニジン塩を除去し且つｐＨを中性方向へと低下させるには，可溶化処理完了直後のヒト成長ホルモン溶液を，例えば，中性付近（例えばｐＨ８）の緩衝液で単に希釈するか，又は同様の緩衝液を添加して限外濾過を行うか，同様の緩衝液に対して透析を行う等，適宜な手段を用いることができる。こうしてグアニジン塩を除去しｐＨを中性方向へと低下させることにより，正しくリフォールディングしたヒト成長ホルモンが溶液中に得られる。このプロセス中に沈殿が生じた場合，沈殿中には，ヒト成長ホルモンは殆ど含まれないため，遠心等により除去すればよい。
【００２１】
その後，こうしてリフォールディングされたヒト成長ホルモンを更に精製するには，例えば，イオン交換クロマトグラフィーその他，タンパク質の精製の分野で当業者に周知の手段を適宜選んで用いればよい。なお，上記でリフォールディングして得られたヒト成長ホルモンは，従来方法で大腸菌に産生させ抽出して得られているヒト成長ホルモンと同様，Ｎ末端にメチオニンが付加したものであり，この形でもヒト成長ホルモンとしての活性を十分に有する。天然型のヒト成長ホルモンを得るには，これまで大腸菌を用いたヒト成長ホルモン製剤の製造で行われてきた周知方法と同様にして，Ｎ末端のメチオニンをアミノペプチダーゼで除去すればよい。
【実施例１】
【００２２】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
【００２３】
１．ＧＨ発現ベクターの作製
ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡのコード領域の塩基配列を，大腸菌発現系に好適となるよう修正し最適化した合成ＤＮＡを用いて，ヒト成長ホルモンの発現ベクターを構築した。ヒト成長ホルモン遺伝子のコード領域の本来の（すなわち野生型の）塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２に，大腸菌内での発現用に最適化したコード領域の塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列を配列番号３及び４に，それぞれ示す。配列番号２及び配列番号４により表された配列は，同一である。配列番号３の塩基配列中，配列番号１との相違箇所の塩基に下線を付して，図１に示す。配列番号１のＤＮＡのGC％〔（塩基Ｇの数＋塩基Ｃの数）／全塩基数×１００〕が，54.7％〔(138+179)/579×100〕であるのに対して，配列番号１の最適化ＤＮＡのGC％は，49.9％〔(146+143)/579×100〕である。また配列番号３の全塩基579個中，139個が，それぞれ，コードされるアミノ酸を変更しない範囲で（すなわち，各アミノ酸に対して縮重したコドンの範囲内で）他の塩基に置換されている。
【００２４】
発現ベクターの構築手順は次の通りである。すなわち，配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを挿入して構築したプラスミドＤＮＡ(#055563)を鋳型に，KOD-plusを用いＰＣＲ反応を行った。反応系を半量に変更した以外は製品に添付のマニュアルに従ってＰＣＲ増幅を行った。順方向プライマーとしてOpt_hGH_FW 〔5’-CGGGATCCTAAGGAGGTTATCATATGTTTCCGACCATTCCGC-3’（配列番号５），塩基３〜８のGGATCCはBamHI部位，塩基９〜１７のTAAGGAGGTはＳＤ配列，塩基２４以降がヒト成長ホルモンの最適化したコード領域である。〕を，逆方向プライマーとしてOpt_hGH_RV〔5’-CGGAATTC GCGGCCGCTTAAAAGCCGC-3’（配列番号６），塩基３〜８のGAATTCはEcoRI部位，塩基９〜１６のGCGGCCGCはNotI部位である。〕を用いた。反応条件は「９４℃／２分，（９４℃／２０秒，５３℃／３０秒，６８℃／４５秒）×３０サイクル，４℃／∞」とした。アガロースゲル電気泳動で増幅を確認後，残りをQIAquick ＰＣＲ精製キットで精製した。この精製したＰＣＲ産物及びpCE30（ATCC37830。ATCCより購入）を，それぞれBamHIとEcoRIで消化し，アガロースゲル電気泳動後に切り出してQIAquickゲル抽出キット若しくはMinEluteゲル抽出キットで精製した。両断片をLigation-Convenience キットを用いて連結し，Competent high HB101に導入して当該大腸菌を形質転換した。翌日，任意の１０クローンＬＢ＋Ａｍｐ培地で一晩培養し，さらにその翌日，QIAprep Spin Miniprep Kitでプラスミドを精製した。制限酵素処理解析でインサートが確認されたクローンのヒト成長ホルモン遺伝子配列をBigDye Terminator v1.1 Cycle sequencing Kit及びABI PRISM 3100-Avant genetic Analyzerを用いて解析し，配列（配列番号３）に誤りがないことを確認した。構築したヒト成長ホルモン発現ベクターを「pRL-hGH」と命名した。図２にそのベクターマップを示す。この発現ベクターは，pCE30が有するλファージのＰＲプロモーター及びＰＬプロモーターが，最適化ヒト成長ホルモン遺伝子の直ぐ上流にタンデムに並んでおり，これを強力に転写する。また同一ベクター内にpCE30が有するcI857遺伝子があり，どのような大腸菌でもこの発現ベクターで形質転換するだけで，温度を上昇させる（４２℃）ことによる厳密な発現誘導が可能である。
【００２５】
２．コンピテントセル（ＢＬ２１）の作製
一般的な塩化カルシウム法を用いて行った。１ｍＬのＬＢ培地にＡＴＣＣより購入したＢＬ２１を植菌し，３７℃で一晩培養した。この培養液０．２５ｍＬに１２．５ｍＬのＬＢ培地を加えて更に３７℃で２時間培養した。氷上で２０分置いた後，３０００ｒｐｍ／４℃で１０分遠心後に上清を除去して氷冷した０．１Ｍ塩化カルシウムを５ｍＬ加えた。更に氷上で２０分置いた後，３０００ｒｐｍ／４℃で１０分遠心後に上清を除去して氷冷した０．１Ｍ塩化カルシウムを０．２５ｍＬ加えた。これを更に氷上で３時間置いたものをコンピテントセルとして形質転換に用いた。
【００２６】
３．ヒト成長ホルモン生産株の構築
上記１で構築した「pRL-hGH」１μLを，上記２で作製したコンピテントＢＬ２１の２０μＬに加え，氷上で３０分置いた。３７℃の浴槽で１分温めた後，200μＬのＳＯＣ培地を加え，LB+Ampプレートに播種し３７℃で培養した。翌日１０個のクローンをＬＢ培地に植菌し，下記４及び５の方法で発現を確認した。発現の確認できた１０個のクローンのうちの１つでグリセロールストック（−８０℃）を作成し，ヒト成長ホルモン生産株とした。このクローンを，以後のジャーファーメンター実験に用いた。
【００２７】
４．小スケール（試験管）での発現誘導
目的のクローンを１ｍＬのLB+Amp培地に植菌して３０℃で一晩培養した。５０μLの培養液に９５０μＬ の２×ＹＴ培地を加えて更に３〜５時間，３２℃で培養した。培養温度を４２℃へ上げて発現を誘導し，更に３時間培養した。
５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現確認
菌体を含む培養液を７０００ｒｐｍで１分遠心して菌体ペレットを分離し，５％の２−メルカプトエタノールを含むLaemmli Sample Bufferで菌体を懸濁した後，９５℃で５分加熱してSDS-PAGEに供した。この際，ヒト成長ホルモン標準品（Ｎ末端のメチオニン残基が除去されている）も同時にSDS-PAGEに供した。ヒト成長ホルモン標準品と同サイズのバンドの有無で発現確認を行った。それによると，この形質転換大腸菌は，３０℃では全くヒト成長ホルモンの発現を示さなかったが（図３レーン２），４２℃では，３時間の誘導で約１０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ600のヒト成長ホルモンを産生した。この形質転換大腸菌の全タンパク質中，ヒト成長ホルモンにおいて最も濃いバンドが見られた（図３レーン３）。
【００２８】
６．ヒト成長ホルモンの定量
ヒト成長ホルモンの定量は，SDS-PAGE，CBB染色，スキャナによる取り込み及びImage J による画像解析の手順により行った。ヒト成長ホルモン標準品の段階希釈液を３点作成し，それで検量線を作成してサンプル中のヒト成長ホルモンを測定した。
【００２９】
７．ジャーファーメンター用培地とFeed液の作製
ジャーファーメンター用の培地及びFeed液の組成は次の通りとした。
＜ジャーファーメンター用培地（TK25）（１Ｌ量）＞
（ＮＨ4）6ＨＰＯ4・・・・・・・・・・２５ｇ
Ｋ2ＳＯ4・・・・・・・・・・・・・・・５ｇ
ＮａＣｌ・・・・・・・・・・・・・・・・０．７５ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・５ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・７５０ｍｇ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・１７０ｍｇ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・７５ｍｇ
ＭｎＳＯ4・４〜５Ｈ2Ｏ・・・・・・・・３８ｍｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ・・・・・・・・・・１５０ｍｇ
Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ・・・・・・・１７ｍｇ
（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・・・・・・・・・７．５ｍｇ
グルコース・・・・・・・・・・・・・・・２０ｇ
酵母エキス・・・・・・・・・・・・・・・５ｇ
＜Feed液（P10E10G35）（300ｍＬ分）＞
７０％グルコース水溶液
上記の培地，Feed液共に，含水結晶ぶどう糖と他成分とを分けてオートクレーブ滅菌し，その後混合した。
【００３０】
８．全容３Ｌジャーファーメンター培養
ヒト成長ホルモン産生株のグリセロールストックの一部を１００ｍＬのTK25培地に植菌し，３２℃で一晩培養した。この培養液をジャーファーメンターと共にオートクレーブ滅菌した１ＬのTK25培地へ加えて，３２℃で培養を開始した。その他のパラメーターは自動制御でｐＨ７．０±０．０５，エアー流量２Ｌ／分，ＤＯ（溶存酸素濃度）＞５０％飽和（回転数と酸素供給による２段階制御）に設定した。菌増殖は濁度計で常時モニターした。ｐＨ調製用として，アルカリとして２８％アンモニア水を，酸方向への調整用には塩酸を用いた。回転数も自動制御で初期は６００ｒｐｍに設定し，ＤＯの低下に従って６００から１０００ｒｐｍに上がるようにした。１０００ｒｐｍでもＤＯの低下が見られたら，回転数を１０００ｒｐｍに固定し，酸素を自動制御でＤＯ＞５０％となるようにエアーに混合して供給した。Feed液は培養開始５時間後に添加開始し，段階的にFeed液量を増加させた（培養開始から５〜８時間後: 約２５ｍＬ／ｈ，８〜１０時間：約３５ｍＬ／ｈ，１０〜１４時間後：約４０ｍＬ／ｈ）。培養開始８〜９時間後に培養温度を４２℃に上げて，発現を誘導した。培養開始約１４時間後に培養を止めて培養液を回収し，１００００ｇ／４℃で１５分遠心して菌体ペレットを得た。培養途中もサンプリングを行い，氷上もしくは４℃で保存し，培養終了後に全サンプル同時に吸光度（ＯＤ600）を測定した。
【００３１】
上記全１４時間の培養で，菌の増殖を示す吸光度（ＯＤ600）は約１００に達し（図４Ａ），その時のヒト成長ホルモン発現量は３〜４ｇ／Ｌに達した。これはヒト成長ホルモン遺伝子の塩基配列をそのまま用いた従来の方法でのヒト成長ホルモン発現量の３〜４倍である。図４Ｂに示すように，ＤＯは培養開始後から減少し始め，それに伴って回転数が上昇し，培養３時間後には最大回転数の１０００ｒｐｍに達した。これ以降は酸素供給を行ってＤＯの維持に努めた。酸素消費速度はグルコース消費と相関しており，酸素消費速度を観察することでグルコースの枯渇をある程度察知できるため，それに応じて，培養開始から約５時間後にFeed液の供給を開始した。
【００３２】
９．封入体の精製
７．８ｇの菌体ペレット（湿重量）に，４０ｍＬのBugBuster（タンパク質抽出試薬，タカラバイオ（株））及び２０μＬ Benzonase（エンドヌクレアーゼ，Merck KGaA）を加えて混合した。ローテーター（タイテック（株））で混合物を回転撹拌しながら室温で２０分間置いた後，１６０００ｇ／４℃で２０分間遠心した。上清を除去し，ヒト成長ホルモン封入体を沈殿として得た。沈殿に洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５ｍＭ ＥＤＴＡ及び２％デオキシコール酸塩を含有，ｐＨ８．０）５０ｍＬを加えて混合し，懸濁液とした。この懸濁液を１６０００ｇ／４℃で１５分間遠心後，上清を除去し，沈殿に再度上記の洗浄液５０ｍＬを加えて混合して懸濁液とし，１６０００ｇ／４℃で１５分遠心した。上清を除去し，沈殿を５０ｍＬの超純水（MilliQ水）に懸濁させ，１６０００ｇ／４℃で１５分間遠心した。この操作を２回行い，沈殿を回収した。これにより，ヒト成長ホルモンを殆どロスすることなしに，多くの夾雑タンパク質が除去された（図５）。得られた沈殿を次の「封入体の可溶化」プロセスに供した。
【００３３】
１０．封入体の可溶化の検討
予備的実験においてヒト成長ホルモン封入体は，ｐＨ８の水溶液中においては全く可溶化せず，強アルカリ性（ｐＨ１２．５）でも３０〜４０％しか可溶化されないことが判明した（図６Ａ）。このため，上記で精製した封入体の溶解のための改良方法を求めて検討した。上記で精製した封入体のサンプルをとり，(a)１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び２〜８Ｍ尿素を含有する水溶液，又は(b)１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び０．５〜６Ｍグアニジン塩酸塩（ＧｎＨＣｌ）を含有する水溶液（共に，水酸化ナトリウムによりｐＨ１２．５に調整）に，ヒト成長ホルモンとして３ｍｇ／ｍＬの濃度となるように加え，ローテーターで混合物を回転攪拌しながら，４℃で１時間以上（１〜１８時間）処理した。各混合物を１５０００ｒｐｍ／４℃で１５分間遠心し，上清中に可溶化されたヒト成長ホルモンを得た。図６Ｂに示すように，ｐＨ１２．５における尿素の使用は，濃度４Ｍまでは可溶化効果がなく，８Ｍにおいても，封入体の約７０％が可溶化されるに止まった。これに対し，ｐＨ１２．５におけるグアニジン塩酸塩の使用では，２Ｍで封入体の９５％以上が，４Ｍ以上で１００％が可溶化された（図７）。高濃度の尿素ではタンパク質がカルバミル化される可能性も報告されていることや，可溶化率が極めて優れることから，強アルカリ性におけるグアニジン塩酸塩の使用が極めて好ましい可溶化方法であることが判明した。従ってこの方法で封入体を可溶化し，次の「リフォールディング」のプロセスに供した。
【００３４】
１１．リフォールディング及び陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ ＦＦ）による簡易精製
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ及び２Ｍ グアニジン塩酸塩（ｐＨ１２．５）含有の水溶液で可溶化することにより得られたヒト成長ホルモン溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を，これに当量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．０）を加え混合することによって，１／２希釈した。同様の１／２希釈操作を更に４回反復することにより，溶液中のグアニジン塩酸塩の濃度を最終的に６２．５ｍＭまで低下させた（ｐＨ８〜９）。得られた溶液を１２０００ｒｐｍ／４℃で１時間遠心し，沈殿を除去した。ヒト成長ホルモンは沈殿中には殆ど含まれず，可溶画分に存在していた（図８）。得られた上清を，次の「陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ ＦＦ）による簡易精製」のプロセスに供した。
【００３５】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．０）で平衡化済みのＤＥＡＥ ＦＦカラムに，超純水で１０倍希釈し，０．８μｍフィルターを通した上記のヒト成長ホルモン希釈溶液を負荷した。これを，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄後，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２５／５０／１００／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０で溶出させた。１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した画分をAmicon Ultra-4 10,000 MWCO膜で約３０倍濃縮し，緩衝液をＰＢＳ（−）（塩化ナトリウム０．８％，塩化カリウム０．０２％，リン酸一水素ナトリウム（無水）０．１１５％，リン酸ニ水素カリウム（無水）０．０２％，ｐＨ７．３５〜７．６５，タカラバイオ（株））に置換した。溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し，分子吸光係数をＥ1%1cm＝８．３５としてヒト成長ホルモン濃度を算出した。図９に精製の結果を示す〔レーン１；負荷液（リフォーディングした本発明によるヒト成長ホルモン），レーン２；Pass画分，レーン３：PW画分，レーン４〜７；溶出画分（それぞれ，25，50，100，150ｍＭ塩化ナトリウム），レーン８；Strip画分（１Ｍ塩化ナトリウム），レーン９：ヒト成長ホルモン標準品〕。このうちレーン６のサンプルを次の「in vitroバイオアッセイ」に供した。
【００３６】
１３．in vitro バイオアッセイ
成長ホルモン依存性細胞株を用いた。まず，ＧＨ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋０．４ｍｇ／ｍＬ，Ｇ４１８＋１００ｎｇ／ｍＬ）に，成長ホルモン依存性細胞を１×１０5個／ｍＬで播種し，３７℃／５％ＣＯ2にて３日間培養した。４倍量の同培地を加えて，更に一晩３７℃／５％ＣＯ2で培養した。翌日，ＰＢＳ（−）で細胞を３回洗浄した後，培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％，ウマ血清０．１ｍｇ／ｍＬ，Ｇ４１８）に懸濁し，３７℃／５％ＣＯ2で１６時間培養した。細胞数を測定し，３×１０5個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウマ血清にて調整し，９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。上記簡易精製プロセスにより調製されたヒト成長ホルモンと，ヒト成長ホルモン標準品とを，ＰＢＳ（−）＋０．５％ＢＳＡで，６０ｎｇ／ｍＬの濃度から始めて各３倍希釈して９希釈系列を作成し（６０〜０．００９ｎｇ／ｍＬ），各ウェルに加えた（ｎ＝３）。ヒト成長ホルモンを加えないウェルをブランクとした。これらのプレートを３７℃／５％ＣＯ2にて２２時間培養後に，CellTiter96 Aqueous細胞増殖試験キット（Promega製）を用いて，増殖した細胞数を比色定量した。その結果，上記で得られたヒト成長ホルモンに生物活性があることが確認された（図１０Ａ及びＢ）。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は，大腸菌の菌体内におけるヒト成長ホルモンの産生率を格段に高め，及び／又は大腸菌の菌体内に封入体として産生されたヒト成長ホルモンからの，活性なホルモンの回収率を格段に高めるため，高い製造効率でのヒト成長ホルモンの製造に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】最適化したヒト成長ホルモンコード領域の塩基配列。塩基の下線は，本来のコード配列の塩基からの変更箇所を示す。
【図２】pRL-hGHのベクターマップ。
【図３】SDS-PAGEの結果を示す図面代用写真。レーン１；ヒト成長ホルモン標準品，レーン２；誘導前（３０℃），レーン３；誘導３時間後。
【図４Ａ】１４時間培養時のＯＤ600の推移，及びヒト成長ホルモン発現誘導開始から４，５，６時間後におけるヒト成長ホルモンの発現量を示すグラフ。
【図４Ｂ】ジャーファーメンターでの１４時間培養における制御パラメーターの推移を示すグラフ。
【図５】精製された封入体の精製度合いを示す図面代用写真
【図６Ａ】弱アルカリ条件下及び強アルカリ条件下（４時間）での，封入体可溶化の程度を示すグラフ。
【図６Ｂ】強アルカリ条件下での８Ｍまでの尿素による封入体可溶化の程度を示すグラフ。
【図７】強アルカリ条件下での６Ｍまでのグアニジン塩酸塩による封入体の可溶化を示すグラフ。
【図８】強アルカリ条件下でのグアニジン塩酸塩による封入体可溶化後のヒト成長ホルモンのリフォールディング効率を示すグラフ。
【図９】DEAE FFによる簡易精製の結果を示す図面代用写真。レーン１；負荷液（リフォーディングしたヒト成長ホルモン），レーン２；Pass画分，レーン３：PW画分，レーン４〜７；溶出画分（それぞれ，25，50，100，150ｍＭ塩化ナトリウム），レーン８；Strip画分（１Ｍ塩化ナトリウム），レーン９：ヒト成長ホルモン標準品。
【図１０】（Ａ）ヒト成長ホルモン標準品のホルモン活性を示す標準曲線。（Ｂ）本発明により得られたヒト成長ホルモン（Ｎ末端メチオニン未除去）のホルモン活性を示す標準曲線。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示す塩基配列，及び配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列を含んでなるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１のＤＮＡをコード領域として有するヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項３】
該コード領域の塩基配列の上流にＳＤ配列，その上流にλファージのＰＬプロモーター，更にその直ぐ上流にＰＲプロモーターを含んでいるものである，請求項２のヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項４】
温度感受性リプレッサー遺伝子を更に含むものである，請求項２又は３のヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項５】
該温度感受性リプレッサーが４２℃において不活性化されるリプレッサーである，請求項４のヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項６】
該温度感受性リプレッサーがλcI857である，請求項４のヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項７】
請求項２ないし６のヒト成長ホルモン発現ベクターで形質転換された大腸菌。
【請求項８】
大腸菌にヒト成長ホルモン発現ベクターを導入し，該大腸菌を培養することを含んでなる成長ホルモンの産生方法であって，該発現ベクターにおけるヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列が，配列番号３に示す塩基配列，及び配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列であることを特徴とする，方法。
【請求項９】
該発現ベクターが，該ヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列の上流にＳＤ配列，その上流にλファージのＰＬプロモーター，更にその直ぐ上流にＰＲプロモーターを含んでいるものである，請求項８の方法。
【請求項１０】
該発現ベクターが，温度感受性リプレッサー遺伝子を更に含むものである，請求項８又は９の方法。
【請求項１１】
該温度感受性リプレッサーが４２℃において不活性化されるものである，請求項８ないし１０の何れかの方法。
【請求項１２】
該温度感受性リプレッサーがλcI857である，請求項８ないし１０の何れかの方法。
【請求項１３】
請求項８ないし１２の何れかの方法によって菌体内に産生され，菌体から単離されたヒト成長ホルモン封入体の可溶化方法であって，該単離されたヒト成長ホルモン封入体を，還元剤の不存在下，ｐＨ１１〜１３アルカリ性条件下に水性媒質中で２Ｍ以上の濃度のグアニジン塩と混合するステップと，該混合物中の封入体が溶解するまで混合物を撹拌するステップとを含んでなるものである，方法。
【請求項１４】
グアニジン塩の濃度が２〜６Ｍである，請求項１３の方法。
【請求項１５】
該グアニジン塩がグアニジン塩酸塩である，請求項１３又は１４の方法。
【請求項１６】
請求項１３ないし１５の何れかの方法によって得られたヒト成長ホルモン含有溶液からの，活性なヒト成長ホルモンの製造方法であって，該溶液の塩酸グアニジンを除去し且つ溶液のｐＨを中性方向へと低下させることにより，ヒト成長ホルモンのリフォールディングを起こさせるステップを含んでなるものである，方法。
【請求項１７】
大腸菌の菌体内に産生され菌体から単離されたヒト成長ホルモン封入体の可溶化方法であって，該単離されたヒト成長ホルモン封入体を，還元剤の不存在下，ｐＨ１１〜１３のアルカリ性条件下に水性媒質中で２Ｍ以上の濃度のグアニジン塩と混合するステップと，該混合物中の封入体が溶解するまで混合物を撹拌するステップとを含んでなるものである，方法。
【請求項１８】
グアニジン塩の濃度が２〜６Ｍである，請求項１７の方法。
【請求項１９】
該グアニジン塩がグアニジン塩酸塩である，請求項１７又は１８の方法。
【請求項２０】
上記１７ないし１９の何れかの方法によって得られたヒト成長ホルモン含有溶液からの，活性なヒト成長ホルモンの製造方法であって，該溶液の塩酸グアニジンを除去し且つ溶液のｐＨを中性方向へと低下させることにより，ヒト成長ホルモンのリフォールディングを起こさせるステップを含んでなるものである，方法。
【請求項１】
配列番号３に示す塩基配列，及び配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列を含んでなるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１のＤＮＡをコード領域として有するヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項３】
該コード領域の塩基配列の上流にＳＤ配列，その上流にλファージのＰＬプロモーター，更にその直ぐ上流にＰＲプロモーターを含んでいるものである，請求項２のヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項４】
温度感受性リプレッサー遺伝子を更に含むものである，請求項２又は３のヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項５】
該温度感受性リプレッサーが４２℃において不活性化されるリプレッサーである，請求項４のヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項６】
該温度感受性リプレッサーがλcI857である，請求項４のヒト成長ホルモン発現ベクター。
【請求項７】
請求項２ないし６のヒト成長ホルモン発現ベクターで形質転換された大腸菌。
【請求項８】
大腸菌にヒト成長ホルモン発現ベクターを導入し，該大腸菌を培養することを含んでなる成長ホルモンの産生方法であって，該発現ベクターにおけるヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列が，配列番号３に示す塩基配列，及び配列番号３に示す塩基配列においてＧＣ％が４８〜５２％となる範囲において，コードするアミノ酸に変更を生じさせることのないように塩基を置換してなる塩基配列よりなる群より選ばれる何れかの塩基配列であることを特徴とする，方法。
【請求項９】
該発現ベクターが，該ヒト成長ホルモンのコード領域の塩基配列の上流にＳＤ配列，その上流にλファージのＰＬプロモーター，更にその直ぐ上流にＰＲプロモーターを含んでいるものである，請求項８の方法。
【請求項１０】
該発現ベクターが，温度感受性リプレッサー遺伝子を更に含むものである，請求項８又は９の方法。
【請求項１１】
該温度感受性リプレッサーが４２℃において不活性化されるものである，請求項８ないし１０の何れかの方法。
【請求項１２】
該温度感受性リプレッサーがλcI857である，請求項８ないし１０の何れかの方法。
【請求項１３】
請求項８ないし１２の何れかの方法によって菌体内に産生され，菌体から単離されたヒト成長ホルモン封入体の可溶化方法であって，該単離されたヒト成長ホルモン封入体を，還元剤の不存在下，ｐＨ１１〜１３アルカリ性条件下に水性媒質中で２Ｍ以上の濃度のグアニジン塩と混合するステップと，該混合物中の封入体が溶解するまで混合物を撹拌するステップとを含んでなるものである，方法。
【請求項１４】
グアニジン塩の濃度が２〜６Ｍである，請求項１３の方法。
【請求項１５】
該グアニジン塩がグアニジン塩酸塩である，請求項１３又は１４の方法。
【請求項１６】
請求項１３ないし１５の何れかの方法によって得られたヒト成長ホルモン含有溶液からの，活性なヒト成長ホルモンの製造方法であって，該溶液の塩酸グアニジンを除去し且つ溶液のｐＨを中性方向へと低下させることにより，ヒト成長ホルモンのリフォールディングを起こさせるステップを含んでなるものである，方法。
【請求項１７】
大腸菌の菌体内に産生され菌体から単離されたヒト成長ホルモン封入体の可溶化方法であって，該単離されたヒト成長ホルモン封入体を，還元剤の不存在下，ｐＨ１１〜１３のアルカリ性条件下に水性媒質中で２Ｍ以上の濃度のグアニジン塩と混合するステップと，該混合物中の封入体が溶解するまで混合物を撹拌するステップとを含んでなるものである，方法。
【請求項１８】
グアニジン塩の濃度が２〜６Ｍである，請求項１７の方法。
【請求項１９】
該グアニジン塩がグアニジン塩酸塩である，請求項１７又は１８の方法。
【請求項２０】
上記１７ないし１９の何れかの方法によって得られたヒト成長ホルモン含有溶液からの，活性なヒト成長ホルモンの製造方法であって，該溶液の塩酸グアニジンを除去し且つ溶液のｐＨを中性方向へと低下させることにより，ヒト成長ホルモンのリフォールディングを起こさせるステップを含んでなるものである，方法。
【図１】
【図４Ａ】
【図２】
【図３】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図４Ａ】
【図２】
【図３】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１０６１８０（Ｐ２００９−１０６１８０Ａ）
【公開日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８０９１２（Ｐ２００７−２８０９１２）
【出願日】平成１９年１０月２９日（２００７．１０．２９）
【出願人】（０００２２８５４５）日本ケミカルリサーチ株式会社 (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２９日（２００７．１０．２９）
【出願人】（０００２２８５４５）日本ケミカルリサーチ株式会社 (27)
【Ｆターム（参考）】
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