ヒトＢＲＣＡ２遺伝子の表現型の決定方法
【課題】ＢＲＣＡ２遺伝子の多型を提供する。
【解決手段】ＢＲＣＡ２遺伝子について、決定された５種のＤＮＡおよびタンパク質を提供する。ＢＲＣＡ２遺伝子の正常な対立遺伝子における１０種の多形性とその発生頻度を示す。配列ＢＲＣＡ２(omi1-5)および１０の多形性部位は、遺伝子試験について正確さと信頼性を提供する。当業者は、遺伝子および／またはタンパク質の配列における変化の誤解釈を回避し、ＢＲＣＡ２の正常な配列および変異の存在を決定できる。本発明はまた、ＢＲＣＡ２(omi1-5)コード配列またはそのフラグメントでもって遺伝子療法を行う方法に関する。本発明はさらに、ＢＲＣＡ２(omi1-5)タンパク質またはその機能的等価物でのタンパク質療法にも関する。
【解決手段】ＢＲＣＡ２遺伝子について、決定された５種のＤＮＡおよびタンパク質を提供する。ＢＲＣＡ２遺伝子の正常な対立遺伝子における１０種の多形性とその発生頻度を示す。配列ＢＲＣＡ２(omi1-5)および１０の多形性部位は、遺伝子試験について正確さと信頼性を提供する。当業者は、遺伝子および／またはタンパク質の配列における変化の誤解釈を回避し、ＢＲＣＡ２の正常な配列および変異の存在を決定できる。本発明はまた、ＢＲＣＡ２(omi1-5)コード配列またはそのフラグメントでもって遺伝子療法を行う方法に関する。本発明はさらに、ＢＲＣＡ２(omi1-5)タンパク質またはその機能的等価物でのタンパク質療法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、米国仮出願６０／０５５，７８４（１９９７年８月１５日出願）、６０／０６４，９２６（１９９７年１１月７日出願）および６０／０６５，３６７（１９９７年１１月１２日出願）に基づく。
【０００２】
発明の領域
本発明は、遺伝子に変異がみられる乳癌に関連する遺伝子に関する。より具体的には、本発明は、ヒトから同定されたＢＲＣＡ２の５種の非反復コード配列、ＢＲＣＡ２(omi1)、ＢＲＣＡ２(omi2)、ＢＲＣＡ２(omi3)、ＢＲＣＡ２(omi4)およびＢＲＣＡ(omi5)に関し、これらは５種の新しい半数型（haplotype）である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
乳癌の５−１０％が遺伝性のものであると考えられている。Ｒowell,S., et al., American Journal of Human Genetics 55:861-865(1994)。乳房および卵巣の癌に関連する最初の遺伝子は、染色体１７からミキらにより１９９４年に単離された（Miki et al., Science 266:66-71(1994)）。第２の乳癌の高い危険性を与える遺伝子は、１９９４年に染色体１３上に位置付けされ（Wooster, R., et al., Science 265: 2088-2090）、ついで１９９５年に単離された（Wooster, R., et al., Nature 378: 789-792）。この“腫瘍抑圧”遺伝子の変異は、遺伝性乳癌の約３５％、および男性乳癌含有家系の８０−９０％の原因となっていると考えられている。
【０００４】
染色体１３のＢＲＣＡ２領域における１以上の変異を突き止めることは、高い危険性のある女性および男性を早期に検出することによって、乳癌の高い発生率および死亡率を低下し得る有望な手段を提供する。このよう者は、一度認定されると、さらに高度な予防方法の対象とすることができる。スクリーニングは、核型認定、プローブ結合、ＤＮＡ配列決定を含む種々の方法によって実施される。
【０００５】
ＤＮＡ配列決定技術において、ゲノムＤＮＡは全血から抽出され、そしてＢＲＣＡ２遺伝子のコード配列が増幅される。各コード配列は完全に配列決定されて、その結果が遺伝子の正常ＤＮＡ配列と比較される。別法として、サンプル遺伝子のコード配列は、遺伝子を完全に配列決定して、それを遺伝子の正常配列と比較する前に、既知の変異などの選別方法のパネルと比較することができる。
【０００６】
ＢＲＣＡ２遺伝子は２７の別個のエキソンに分類される。エキソン１は非暗号であって、最終機能的ＢＲＣＡ２タンパク質産物の部分ではない。ＢＲＣＡ２コード配列は７０ｋｂ以上の大略１０４３３塩基対（ｂｐ）に及ぶ。各エキソンは１００−６００ｂｐからなるが、エキソン１０、１１および２７が例外である。完全長のｍＲＮＡは１１−１２ｋｂである。ＢＲＣＡ２遺伝子のコード配列を決定するために、各エキソンは別個に増幅されて、得たＰＣＲ産物が正および逆方向に配列される。エキソン１０、１１および２７がこのように大きいので、我々は、これらを各々約２５０−６２５ｂｐの３個、２１個および２個の重複するＰＣＲフラグメントに分断した（エキソン１０のセグメントＡからＣ、エキソン１１のセグメントＡからＵ、およびエキソン２７のセグメントＡからＢ）。
【０００７】
多くの変異および正常多型がＢＲＣＡ２遺伝子について既に報告されている。乳癌感受性遺伝子における変化の検出および特性化を容易にするために、世界的な情報網がつくられている。このようなＢＲＣＡ２の変異は、http://www.nchgr.nih.gov/dir/lab transfer/bic.の乳癌情報機関を通じて情報を得ることができる。この情報機関は１９９５年１１月１日に一般に利用可能となった。Friend, S. et al., Nature Genetics 11:238,(1995)。ＢＲＣＡ２の情報は１９９６年２月に加えられた。
【０００８】
乳癌症候の遺伝は、低い浸透度の常染色体優性である。この意味を簡単に言うと、この症候は家系を通じて生じ、（１）男女共に保持し（ほとんどの女性は発病し、男性は発病しないか、時に乳癌となる）、（２）すべての世代が乳癌になりやすく、（３）時には、この遺伝子のある女性が発病する時間を得ないままに若くして死亡するか（子孫は遺伝子を持って）、あるいは乳房または卵巣の癌になることなしに老齢で死亡する（後者の人々を、癌が発病することがないので、“低い浸透度”を有すると言う）。いかなる研究よりも前に血統的解析および遺伝学的検討が、適当な家系対策に絶対的に必須である。
【０００９】
現在のところ、ＢＲＣＡ２のゲノム配列情報の唯一の供給源は、ジーンバンク（アクセス番号Ｕ４３７４６）か、乳房情報コア共同体（ＢＩＣ）の会員であることを要するインターネットのＢＩＣデーターベースを通じてである。しかし、本特許出願の開示に基づくと、ジーンバンクもＢＩＣも配列の同定が完全には正しくない。これらの誤りを是正する必要があり、さもないと患者からの配列データを異常と誤って解釈することにつながり、またその逆も起こり得る。
【００１０】
さらに、この分野で必要があるのは、正常な母集団の大部分で最も普通に見られるＢＲＣＡ２配列を提示する機能性対立遺伝子のプロファイルを利用可能にすることである。この機能性対立遺伝子プロファイルは頻繁に起こる多形性（polymorphism）および正しい骨格配列に基づいている。いくつかの普通の半数型についての知識が真の変異を多形性と容易に同定または識別するのを可能にする。ＢＲＣＡ２遺伝子およびタンパク質の変異を同定することは、現在可能であること以上に広範な遺伝性乳房癌の診断選別ができるようになる。
【００１１】
これらの普通の正常半数型の使用は、前に公表されているＢＲＣＡ２配列に加えて、病的な“変異”（すなわち、個体に疾患を起こす、または個体に疾患が生じる高い危険性をもたらす）を有する正常集団にみられる“配列変化”の読み誤りやすさを減少せしめる。乳癌の素質試験において、読み誤りは特に問題である。すでに乳癌になっている者は、“私の病気は遺伝性の変異によるものですか”との医学的質問をする。乳癌の患者の家族は、“私は家族が有する変異の素質があるのですか、私の危険性が増加しているなら、私ももっと高度の検査プログラムを受けねばならないのでしょうか”と尋ねる。
【非特許文献１】Ｒowell,S., et al., American Journal of Human Genetics 55:861-865(1994)
【非特許文献２】Miki et al., Science 266:66-71(1994)
【非特許文献３】Wooster, R., et al., Science 265: 2088-2090
【非特許文献４】Wooster, R., et al., Nature 378: 789-792
【非特許文献５】Friend, S. et al., Nature Genetics 11:238,(1995)
【発明の概要】
【００１２】
本発明の要約
本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子の正常人に見いだされる正しいゲノムＢＲＣＡ２、および５種の新規配列半数型の発見に基づいている。
本発明の目的は、ＢＲＣＡ２遺伝子の正しいイントロン／エキソン配列を提供することである。
本発明の別の目的は、癌感受性の増加に対応しない正常な個体のＢＲＣＡ２遺伝子の５種の非反復半数型を提供することである。
本発明の別の目的は、ＢＲＣＡ２遺伝子またはその部分の配列決定を行い、
それを５種の半数型配列と比較して、配列変化が多形性または潜在的に危険な変異を提示するかどうかを決定することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、ＢＲＣＡ２遺伝子上の１０多形性ポイントの各々で生じる対のリストを提供することである。
本発明の他の目的は、ＢＲＣＡ２遺伝子のコドン２８９、３７２，４５５，７４３，８９４，９９１、１１３２、１２６９、２４１４および２９５１での多形性の発生比率を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ＢＲＣＡ２またはその部分のエキソンが１以上のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅される方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ＢＲＣＡ２コード配列の変異がなく、従って、乳房または卵巣の癌に対する遺伝子感受性が増加していない者を同定する方法を提供することである。異常なＢＲＣＡ２遺伝子の保持がないとの知見に基づき同定される。
【００１５】
本発明の他の目的は、乳房または卵巣の癌に対する遺伝子感受性または素質を増大せしめるＢＲＣＡ２の変異を同定する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、５種のＢＲＣＡ２半数型配列から誘導された５種の新規ＢＲＣＡ２タンパク質配列を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、５種の新規ＢＲＣＡ２タンパク質配列、それらのＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはそれらの機能的等価物の全体またはフラグメントをコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターを含有する原核または真核の宿主を包含することである。
本発明の他の目的は、５種の新規ＢＲＣＡ２タンパク質配列、それらのＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはそれらの機能的等価物の全体またはフラグメントを免疫原として用いるアンチＢＲＣＡ２タンパク質抗体を包含することである。
【００１７】
癌感受性の増加の危険性のない正常人からの、ＢＲＣＡ２遺伝子のｃＤＮＡ配列およびＢＲＣＡ２のタンパク質配列について技術上の必要性がある。ＢＲＣＡ２変異を含有するかもしれない患者のサンプルが実際に変異を有しているかどうかを調べるために、患者のＢＲＣＡ２ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列をすべて既知の正常ＢＲＣＡ２配列と比較する必要がある。得たサンプルをすべての天然型の正常配列と比較できないと、臨床的に意味のない多形性のときでもサンプルが潜在的に危険な変異を含有するものとして報告することになってしまう。
【００１８】
遺伝子感受性試験における当業者は、本発明が下記の事項に有用であることが分かるであろう。
ａ）コード配列変異のない正常なＢＲＣＡ２遺伝子を有する個体、従ってＢＲＣＡ２遺伝子からの乳房または卵巣の癌の増大した遺伝子感受性を有するとは言えない個体を同定すること。
ｂ）ＢＲＣＡ２遺伝子にみられる正常な多形性の読み誤りを回避すること。
ｃ）ＢＲＣＡ２遺伝子に今まで知られていない変異の存在を認定すること。
ｄ）乳癌より卵巣癌（すなわち、推測“卵巣癌クラスター”領域に存在）に対して素質または高い感受性を示すＢＲＣＡ２のエキソン１１での変異を同定すること。
ｅ）ＢＲＣＡ２遺伝子のヒトサンプルを対立遺伝子でプローブし、多形性対立遺伝子または変異の存在または不存在を決定すること。
ｆ）正しいＢＲＣＡ２遺伝子で遺伝子療法を行うこと。
ｇ）正しいＢＲＣＡ２タンパク質配列またはその機能的等価物でタンパク質置換療法を行うこと。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１は、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【００２０】
図２は、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【００２１】
図３は、ＢＲＣＡ２などの遺伝子内の一単位すなわち“半数型”として提示され得る染色体の多形性部位における代わりの対立遺伝子を示す。ジーンバンク（ＧＢ）の半数型を淡いシャドーで示す。５種の追加の半数型を図３に示す（ヌクレオチド部位１０９３、１３４２、１５９３、２４５７、２９０８、３１９９、３６２４、４０３５、７４７０、９０７９の代わりの対立遺伝子を含む）。ＢＲＣＡ２(omi1)、ＢＲＣＡ２(omi2)、ＢＲＣＡ２(omi3)、ＢＲＣＡ２(omi4)およびＢＲＣＡ２(omi5)は濃淡混合のシャドーで示す（左から右へ２、４、６、８、１０）。全体として、ＢＲＣＡ２遺伝子の１０半数型中５は非反復である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図３】図３は、ＢＲＣＡ２などの遺伝子内の一単位すなわち“半数型”として提示され得る染色体の多形性部位における代わりの対立遺伝子を示す。ジーンバンク（ＧＢ）の半数型を淡いシャドーで示す。５種の追加の半数型を図３に示す（ヌクレオチド部位１０９３、１３４２、１５９３、２４５７、２９０８、３１９９、３６２４、４０３５、７４７０、９０７９の代わりの対立遺伝子を含む）。ＢＲＣＡ２(omi1)、ＢＲＣＡ２(omi2)、ＢＲＣＡ２(omi3)、ＢＲＣＡ２(omi4)およびＢＲＣＡ２(omi5)は濃淡混合のシャドーで示す（左から右へ２、４、６、８、１０）。全体として、ＢＲＣＡ２遺伝子の１０半数型中５は非反復である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
下記の定義は本発明を理解する目的で提供される。
“乳房および卵巣の癌”は、当業者の理解によると、女性における乳房および卵巣および膵臓の癌、および男性における乳房、前立腺および膵臓の癌を含む。ＢＲＣＡ２は、遺伝性の乳房、卵巣および膵臓の癌に対する遺伝子感受性に関連している。従って、本明細書の請求項で乳房および／または卵巣の癌と記載されたものは、男性および女性における乳房、卵巣、前立腺および膵臓の癌を意味する。
【００２４】
“コード配列”は、一緒になってペプチド（タンパク質）をコードする、または核酸自体が機能する遺伝子の部分を意味する。
“タンパク質”または“ペプチド”は、機能する配列アミノ酸を意味する。
【００２５】
“ＢＲＣＡ２(omi)”は、ジーンバンク（アクセス番号Ｕ４３７４６）に開示されたＢＲＣＡ２配列を意味し、うち、
（１）１０ｂｐ伸張（５’−ＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧ−３’）はエキソン５の５末端よりもむしろイントロン４の３’末端でイントロン性であり、
（２）１６ｂｐ伸張（５’−ＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＣＡＧ−３’）はエキソンの５’末端よりもむしろエキソン１５の３’末端でエキソン性である。
【００２６】
“ＢＲＣＡ２(omi1-5)”は、ＢＲＣＡ２遺伝子およびそのイントロン（特にエキソンに隣接の切片部位）の５種の非反復ＤＮＡ配列を意味する。これらの配列は、母集団から無作為に抽出された５人のＢＲＣＡ２遺伝子を端から端へ配列決定することでみつけられた。この５人は乳房または卵巣の癌について家族歴のない者である。配列決定されたエキソンは、いかなる末端切除変異も含有していないことが分かった。すべての場合、多形性部位での核酸の変化は、ジーンバンクで前に公表されている標準物からのコドン変化およびアミノ酸変化を招く（参照、表III）。ある場合には、核酸の変化が起きる頻度は、公表の頻度と異なることがわったか、または初めて決定した。これらの配列変動は、半数型が癌の危険性増大を示さない対立遺伝子であると思われる。
【００２７】
“正常ＤＮＡ配列”または“正常遺伝子配列”は、正常機能のタンパク質をコードする遺伝子またはそれ自体が正常な機能を有する遺伝子を保持する者の集団において、核酸が高頻度でそれぞれの位置で生じることの知られている核酸の配列を意味する。
【００２８】
“正常タンパク質配列”は、正常機能のタンパク質をコードする遺伝子を保持する者の集団において、タンパク質配列のアミノ酸が高頻度で生じることの知られているタンパク質の配列を意味する。
【００２９】
“正常配列”とは、正常機能のタンパク質をコードする遺伝子またはそれ自体が正常な機能を有する遺伝子を保持する者の集団において、核酸またはアミノ酸が、高頻度でそれぞれの位置で生じることの知られている核酸またはタンパク質の配列を意味する。
【００３０】
“半数型”は、染色体上の遺伝子内の特異的対立遺伝子の１系統を意味する。
“機能的対立遺伝子”は、完全な機能を有する正常人の母集団における対立遺伝子のリストを意味する。
【００３１】
“変異”は、ＤＮＡ配列における塩基の変化、または塩基対の獲得または喪失を意味し、非機能性のタンパク質または実質的に低下あるいは変化した機能のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらすものである。
“多形性”は、既知の病理と関連しないＤＮＡ配列における塩基変化を意味する。
【００３２】
“プライマー”は、ＢＲＣＡ２遺伝子に相補的な配列を有する約１５以上のヌクレオチドを含有する配列を意味する。当業者はプライマーハイブリダイゼーションに使用できる他のプライマーを知っているか、容易に確認できる。
【００３３】
“実質的に相補的”は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが相補的であるＢＲＣＡ２配列とハイブリダイズするように、ストリンジェントな条件で提供される配列および／またはＢＲＣＡ２配列との充分な相同性を有する配列とハイブリダイズするプライマー配列を意味する。
【００３４】
“単離された核酸”は、他の核酸、タンパク質、炭水化物および結合し得る他の物質を実質的に含まない核酸を意味する。かかる結合は、細胞性材料および合成培地のいずれでも典型的である。
【００３５】
“生物サンプル”または“生物体サンプル”は、生物源から得たＤＮＡ含有のサンプルを意味する。サンプルは種々の組織または細胞の生きている、死んだ、さらには考古学的な源に由来する。サンプルには、体液（例えば、血液（白血球）、尿（上皮細胞）、唾液、乳、月経、子宮・膣分泌物）、皮膚，毛根／毛嚢、粘膜（例えば、口腔または舌細胞の擦過）膣頚部細胞（ＰＡＰスメアなどから由来）、リンパ組織、内部組織（正常または腫瘍）が含まれる。
【００３６】
“ベクター”は、自己複製可能なポリヌクレオチドまたは自己複製ポリヌクレオチドへの組込みを起こすポリヌクレオチドを意味する。例えば、複製起点または組込み部位を含有するポリヌクレオチドがある。ベクターは宿主細胞の染色体に組込まれるか、自動的複製部位を形成し得る。
【００３７】
“腫瘍成長阻害剤”は、ＢＲＣＡ２タンパク質、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはこれらの機能的等価物の全体またはフラグメントなどの分子を意味する。この分子は、乳房または卵巣の癌の形質転換または悪性の表現型の形成を予防、減少または消失するのに効果的である。
【００３８】
“ＢＲＣＡ２ポリペプチド”は、ＢＲＣＡ２タンパク質から直接的に誘導されるか、またはＢＲＣＡ２タンパク質に相同性であるＢＲＣＡ２ポリペプチド、またはＢＲＣＡ２タンパク質およびポリペプチドの全体またはフラグメントからなる融合タンパク質を意味する。
【００３９】
“機能的等価物”は、非天然のＢＲＣＡ２ポリペプチド、元のＢＲＣＡ２タンパク質として実質的な生物活性を保持する薬剤または天然産物を意味する。ＢＲＣＡ２タンパク質の活性および機能に、活性導入、グラニン(granin)、ＤＮＡ修復などが含まれる。
【００４０】
“標的ポリヌクレオチド”は、所望の核酸配列、例えばＢＲＣＡ２コードポリヌクレオチドを意味する。当業者は、プライマーハイブリダイゼーションに使用できる他のプライマーを知るか、容易に確認し得る。
【００４１】
本発明はいくつかの実施態様においてつぎのものを含む。配列番号４、６、８、１０および１２のＢＲＣＡ２コード配列の単離されたＤＮＡ配列、配列番号５，７、９、１１、１３のＢＲＣＡ２タンパク質の配列、乳房および卵巣の癌の危険性を増大させない正常ＢＲＣＡ２遺伝子を有する者を同定する方法、ＢＲＣＡ２コード配列での変異の存在に由来する遺伝子感受性の増大を検出する方法、腫瘍を防止または治療する遺伝子療法を行う方法、腫瘍を防止または治療するタンパク質置換療法を行う方法、開示されたＢＲＣＡ２ｃＤＮＡおよびタンパク質配列の全体またはフラグメントを含有する診断薬。
【００４２】
配列決定
すべての核酸標本は、精製形態であろうと非精製形態であろうと、多形性または変異対立遺伝子を含む特殊な核酸配列を含有するか、または含有するかも知れない限り、出発の核酸として用いることができる。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡは増幅し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは一重鎖あるいは二重鎖であり得る。ＲＮＡが鋳型として用いられる場合は、鋳型をＤＮＡへ逆転写するための酵素および／または適当な条件が用いられるであろう。更に、各一重鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドが用いられる。核酸の混合物も用いられ、あるいは同一または異なるプライマーを用いてあらかじめ増幅反応で産生された核酸が用いられる。増幅された特殊な核酸配列、すなわち多形性および／または変異対立遺伝子は、より大きい分子の断片であり得たり、または個々の分子として最初は存在し得て、特殊な配列が完全な核酸を構成する。多様な増幅法が用いられる。例えば、ＤＮＡサンプルまたはそのフラグメントの複製可能ベクターへの連結、あるいは複製システムへの組込みによってＢＲＣＡ２遺伝子の少なくとも部分を含有すると思われるＤＮＡ複写数を増加する。増幅法にいわゆる“ショットガン・クローニング”も含まれる。増幅される配列が最初から純粋な形で存在することは必要でない。全ヒトＤＮＡ中に含まれるような複合混合物の小さい断片であり得る。
【００４３】
注意すべきことは、変異が存在するかどうかを調べるために全コード領域または全ＤＮＡフラグメントすらも配列決定する必要がないことである。例えば、ある変異が一家族員でわかっていると、他の家族員を試験したとき、配列決定によって、またはＡＳＯなどの他の変異検出システムによって、変異部位のみでの配列を調べることで十分である。
【００４４】
ここで用いられるＤＮＡは、血液、組織材料などの生物体サンプルから（Ｍaniatis，et.al．in Ｍolecular Ｃloning：Ａ Laboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，ＮＹ，p.280-281，1982）に記載のような様々な方法により抽出され得る。抽出されたサンプルが純粋でなければ、増幅の前に効果的な試薬量で処置して、細胞を開き、核酸の鎖を爆露および／または単離することができる。この鎖を爆露または単離する溶菌および核酸変性工程は、増幅がより迅速に起きるのを可能にする。
【００４５】
クローニングによる増幅のために、単離ＤＮＡをフラグメントに、制限エンドヌクレオターゼにより、またはＤＮＡ含有混合物をシリンジからの２５ゲージ針を通すせん断により分解して、１〜１．５ｋｂのフラグメントを調製する。次いでフラグメントを切断ベクター（ウイルス、プラスミド、トランスポソン、コスミドなど）に連結し、形成した形質転換ベクターをそのベクターに典型的な方法で複製する。
【００４６】
ＰＣＲ増幅のために、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートdＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰおよびdＴＴＰを、個々にまたはプライマーと共に、適当な量で、合成混合物に加え、得た溶液を約１−１０分間、好ましくは１−４分間、約９０−１００℃で加熱する。この加熱期間後、溶液を冷却する。これはプライマーハイブリデイションに好ましい。冷却した混合物にプライマー伸長反応を生じるのに適した薬剤（ここでは、“ポリメリゼイション剤”と呼ぶ）を加え、反応を当業者に知られた条件で生起せしめる。ポリメリゼイション剤も熱安定性であると、他の反応剤と共に加えることができる。この合成（増幅）反応は、室温またはポリメリゼイション剤がもはや機能しない上記温度で生じ得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼが反応剤として用いられたときは、温度は一般的に４０℃より大きくはない。最も好都合には、反応は室温で生じる。Ｔａｑなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたときは、高熱を使用できる。
【００４７】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、対象者が乳房または卵巣の癌になる危険性を有するかを調べるとき、および腫瘍の特性を調べるときに有用である。プライマーは配列決定前に標的ポリヌクレオチドの増幅を指示する。表IIに示すエキソン２−２７についてのこれら非反復ＢＲＣＡ２オリゴヌクレオチドを設計し、特異的につくって、配列決定すべきＢＲＣＡ２の部分の増幅を最適にした。
【００４８】
本発明の実施に用いられるプライマーは、ポリメリゼイションを開始するのに充分な長さと適当な配列のオリゴヌクレオチドを含む。合成を促進する環境条件は、ヌクレオチドトリホスフェート、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメリゼイション剤および適当な温度とpＨである。プライマーは、増幅に最も効率的には単鎖であるが、二重鎖でもよい。二重鎖のときは、伸長生産物を製造するのに用いる前に、プライマーはその鎖を分離するためにまず処置される。プライマーは、ポリメリゼイションの促進剤の存在下に伸長生産物の合成を始めるのに充分長くなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、緩衝剤およびヌクレオチドの組成を含む多くの要因に依存する。オリゴヌクレオチドは、典型的には１８−２８を含み、および便宜的にいくつかの場合にはＭ１３テイルをさらに含む。
【００４９】
本発明の実施に用いられるプライマーは、増幅されるべきゲノム座の各鎖に実質的に相補的であるように設計される。このことは、ポリメリゼイション剤が働く条件下で、各々の鎖にハイブリダイズするのに充分に相補的でなければならなことを意味する。換言すると、プライマーは変異を挟む５'および３'配列に充分に相補的であるべきで、それとハイブリダイズし、ゲノム座の増幅をもたらす。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、関与する反応段階数に比較して急増した量の多形性座を生産する酵素鎖反応である増幅過程において用いられる。典型的には、一つのプライマーが多形性座の負（−）鎖に相補的であり、他の一つが正（＋）鎖に相補的である。ＤＮＡポリメラーゼの大きいフラグメント（Ｋlenow）などの酵素で伸長による変性核酸およびヌクレオチドプライマーをアニーリングすることは、標的多形性座配列を含む新規合成の＋および−鎖をもたらす。これらの新規合成配列は鋳型でもあるので、変性のくりかえしサイクル、プライマーアニーリングおよび伸長は、プライマーで定義される領域（すなわち標的多形性座配列）の急増的な産生をもたらす。鎖反応の産物は、用いられる特殊なプライマーの末端に対応する終末を有する目立たない核酸２量体である。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、通常のホスホトリエステルおよびホスホジエステル方法またはその自動実施などの適当な方法を用いて調製される。一つのかかる自動実施において、ジエチルホスホルアミジットが出発物質として用いられ、Ｂeaucage，et al.，Ｔetrahedron Letters，２２：1859-1862，1981に記載のように合成される。修正された固体支持体でのオリゴヌクレオチドの合成の一つの方法が米国特許第４,４５８,０６６に記載されている。
【００５２】
ポリメリゼイション剤は、酵素を含み、プライマー伸長産物の合成を遂行する機能を有するいかなる化合物およびシステムでもあり得る。この目的のための適当な酵素としては、例えばＥ.coli ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのＫlenowフラグメント、ポリメラーゼミュテイン、逆トランスクリプターゼおよびＴaqポリメラーゼなどの熱安定性の酵素（すなわち、変性を起こすのに充分高い温度にかけた後にプライマー伸長をおこす酵素）を含む他の酵素がある。適当な酵素は、各多形性座核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物を形成するのに適した状態で、ヌクレオチドの結合を容易にする。一般に、合成は各プライマーの３'末に始まり、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５'末の方向に進み、相違する長さの分子を産生する。
【００５３】
新規合成の鎖およびその相補的核酸鎖は、上記したハイブリダイズ条件で二重鎖分子を形成し、このハイブリドは続く工程に用いられる。次の工程において、新規合成二重鎖分子は、一重鎖分子を提供するために、上記手法のいずれかを用いて、変性条件の対象とされる。
【００５４】
変性、アニーリングおよび伸長産物合成の工程は、標的多形性座核酸配列を検出に必要な程度にまで増幅するために、何度もくりかえされる。製造された特殊な核酸配列の量は急増して蓄積される。増幅については、ＰＣＲ.Ａ.Ｐractical Ａpproach，ＩＬＲ Ｐress，Ｅds.Ｍ.Ｊ.ＭcＰherson，Ｐ.Ｑurke，and Ｇ.Ｒ.Ｔaylor，1992．に記載されている。
【００５５】
増幅産物は、サザンブロット法により放射活性プローブを用いずに、検出される。この方法において、例えば、多形性座の核酸配列の非常に低レベルを含有するＤＮＡの小サンプルは、増幅され、サザンブロット法あるいは類似的にドットブロット法を用いて、解析される。非放射活性プローブまたはラベルの使用は、増幅シグナルの高レベルによって容易となる。別法として、増幅産物を検出するのに用いられるプローブは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素によって、直接的または間接的に検出可能なようにラベルされる。当業者は、プローブを結合する他の適当なラベルを知り、または通常実験で適当なラベルを確定することができるであろう。
【００５６】
本発明方法により増幅された配列は、ＰＣＲなどの特殊なＤＮＡ配列の検出に通常用いられる方法で、オリゴーマ制限（Ｓaiki，et.al.，Ｂio／Ｔechnology，3：1008-10102，1985)、対立遺伝子特異オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ解析法(Ｃonner，et.al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．U.S.A.，80：278，1983)、オリゴヌクレオチド連結反応検定（Ｌandgren，et.al.，Ｓcience，241：1007，1988）などによって、溶液において、または固体支持体に結合された後に、さらに検討され、検定され、クローン化され、配列決定される。ＤＮＡ解析の分子的手法は総説されている（Landgren，et.al.，Ｓcience，242：229-237，1988)。
【００５７】
好ましくは、増幅方法は、本明細書記載のように、かつ当業者に普通使用されているように、ＰＣＲによるものである。増幅の他の方法は、記述されており、本発明のプライマーＰＣＲにより増幅されたＢＲＣＡ２座が同様に他の手段で増幅される限り、使用することができる。かかる他の増幅系には、制限するわけでないが、望むＲＮＡの短い配列およびＴ７プロモーターで始まる自己保持配列複製がある。逆トランスクリプターゼは、ＲＮＡをcＤＮＡに複写し、ＲＮＡを変性し、次いでＤＮＡの第２鎖をポリメリゼーションする。
【００５８】
他の核酸増幅技術は、逆転写およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用い、２プライマーをそのサイクル標的とするように合体する核酸配列を基とする増幅（ＮＡＳＢＡ）である。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで始まり、いずれかで終わり、６０−９０分以内に１０8コピーに増幅する。他の方法として、核酸は連結反応活性転写（ＬＡＴ）により増幅することができる。ＬＡＴは、単鎖鋳型から、部分的に単鎖であり部分的に二重鎖である単一のプライマーに働く。増幅は、cＤＮＡをプロモーターオリゴヌクレオチドに連結することにより始まり、数時間で１０8−１０9となる。本発明方法で有用な他の増幅はＱβレプリカーゼ系である。Ｑβレプリカーゼ系は、ＭＤＶ−１と呼ばれるＲＮＡ配列を望むＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡに結合することにより、用いることができる。サンプルと混合するに際して、ハイブリドＲＮＡは、標本のmＲＮＡ中にその補体を見出し、望む指標アロング配列を複写するレプリカーゼを活性化して、結合する。他の核酸増幅技法であるリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）は、新しい標的を形成し、サンプル中の隣接配列の存在下にリガーゼにより共有結合された望む配列の２つの別個にラベルされた半分を用いる。修復鎖反応（ＲＣＲ）核酸増幅技術は、標的配列を幾何的に増幅するために、２つの相補的かつ標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ対、熱安定性ポリメラーゼおよびリガーゼ、およびＤＮＡヌクレオチドを用いる。Ａ２−塩基間隙は、オリゴヌクレオチドプローブ対を単離し、ＲＣＲは、ＤＮＡ修復を模倣して間隙を満たし結合せしめる。鎖置換活性化（ＳＤＡ）による核酸増幅は、標的ＤＮＡに結合する５'末上に短い張り出しを有するＨinkIIの認識部位を含む短いプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼは、硫黄含有アデニン類似体での張り出しの反対側のプライマーの部分を満たす。ＨinkIIは、加えられるが、非修飾のＤＮＡ鎖を切断するのみである。５'エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼは、ニックの部位に入り、そしてポリメリゼーションを開始し、最初のプライマー鎖を下流方向に置換し、よりプライマーとして働く新しいものを形成する。ＳＤＡは３７℃で２時間で１０7の以上の増幅を行う。ＲＣＲおよびＬＣＲと異なり、ＳＤＡは器具設置の温度サイクルを要しない。
【００５９】
他の方法は、精製されて、または核酸の混合物中に存在しているＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型から核酸配列を増幅する方法である。得た核酸配列は鋳型の正確なコピーであり、また修飾し得る。この方法は、特殊な核酸配列を複写する信頼性を増大し、単一検定で特定の点変異を効率的に検出するのを可能にすることにおいてＰＣＲより優れている。標的核酸は、鎖置換を回避しながら酵素的に増幅される。３プライマーが用いられる。第１のプライマーは標的の第１末端に相補的である。第２プライマーは標的の第２末端に相補的である。第３プライマーは、標的の第１末端に類似し、かつ第１プライマーの少なくとも一部に実質的に相補的であり、第３プライマーが第１プライマーとハイブリダイズしたときに、第１プライマーの５'末端の塩基に相補的な第３プライマーの位置が実質的に鎖置換を回避する修飾を含む。この方法は、Ｂhatnager et. al.,1997の米国特許第５,５９３,８４０（出典明示により本明細書の一部とする）に詳記されている。
【００６０】
最後に、ＤＮＡチップスまたはミクロ配置法の最新の応用によって、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを小さい固体支持物に固定して、サンプルＢＲＣＡ２遺伝子を迅速に配列決定でき、その発現を分析できる。典型的には、ＤＮＡフラグメントの高密度配置をガラスまたはナイロンの基質上に、インシトウ光指向組み合せ合成によりつくるか、または通常の合成によりつくり固定化する（Fodor et al., 米国特許第５，４４５，９３４）。サンプルＤＮＡまたはＲＮＡをＰＣＲで増幅し、蛍光標識でラベルして、ミクロ配置にハイブリドできる。この技術の例は、米国特許第５，５１０，２７０および５，５４７，８３９（出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。
【００６１】
ＢＲＣＡ２遺伝子のすべてのエキソンまたは隣接イントロンの配列は、上記の方法で５人の正常者について端から端へ配列決定して取得し、得たデータを解析した。得たデータにより、ＢＲＣＡ２遺伝子の正しいイントロン／エキソン構造を確立した。さらに、前に公表された６種の正常な多形性（１３４２，２４５７，３１９９，３６２４，４０３５、７４７０）を集団における正確さと頻度について評価し、まえに特性化されていない追加の多形性（１０９３，１５９３，２９０８，９０７９）を同定した。
【００６２】
遺伝子治療
ＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン、全コード配列またはフラグメントのセンスまたはアンチセンス転写からのポリヌクレオチドは、遺伝子治療に使用できる。様々な方法が遺伝子転移について知られているが、そのいずれも利用できるであろう。
【００６３】
インビボでの組換えＤＮＡの直接注入：
１．“裸の”ＤＮＡをシリンジおよび針で特異的な組織に直接注入し、血管床を通して浸透し、またはカテーテルを通して内皮細胞に移行さす。
２．人工的脂質小胞または他の包含運搬体に含まれるＤＮＡを直接注入する。
３．ジフテリア抗原や抗体などの標的受容体組織を複合したＤＮＡを直接注入する。
４．ＤＮＡを金粒子上にコートし、細胞中に射入するものであり、粒子を爆撃的に直接注入する。
【００６４】
ヒト人工染色体
この新しい遺伝子運搬方法は、複製に基本的な要素および転移の望む遺伝子のみを含有するように、はがされたヒト染色体の使用を含む。
【００６５】
レセプター仲介遺伝子転移
ＤＮＡが特異的な細胞表面レセプターに結合する標的分子にリンクされ、ＤＮＡの哺乳動物細胞へのエンドサイト−シスおよび転移を誘発する。この技術の一つでは、アシアログリコタンパク質をＤＮＡにリンクするために、ポリ−Ｌ−リジンを用いる。アデノウイルスも複合体に加えられて、リソソームをこわし、ＤＮＡの変性を回避し、その核への移動を可能にする。これらの粒子の静脈内注入は肝細胞への遺伝子転移をもたらす。
【００６６】
組替えウイルスベクター
いくつかのベクターが遺伝子治療で用いられている。それらには、モノロニイ・ネズミ白血病ウイルス（ＭoＭＬＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ポックスウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクターがある。
【００６７】
遺伝子の置換および修復
遺伝性疾患の処置についての理想的な遺伝子操作法は、欠陥遺伝子をその遺伝子の正常なコピーで置きかえることである。相同組換えは、ＤＮＡのセクションを切りかえ、新しいもので置換することを意味する用語である。この技術により、欠陥遺伝子を機能的ＢＲＣＡ２腫瘍生長阻害タンパク質発現の正常な遺伝子で置換することができる。
【００６８】
遺伝子治療についての詳細な記載は、Ｇene Ｔherapy Ａ Ｐrimer Ｆor Ｐhysicians 2d Ｅd. by Ｋenneth Ｗ.Ｃulver，Ｍ.Ｄ. Ｐubl．Ｍary Ａnn Ｌiebert Ｉnc.(1996)にも記載されている。ＢＲＣＡ２について２種の遺伝子治療プロトコールがＪeffrey Ｔ.Ｈolt et al.組換えＤＮＡ諮問委員会で認められている。このプロトコールは、9602−148および9603−149としてリストされ、ＮＩＨから入手できる。単離されたＢＲＣＡ２は増幅産物から合成または組み立てられて、ＬＸＳＮベクターなどのベクターに挿入される。
【００６９】
ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはその機能的等価物
乳房および卵巣の癌の生長は、機能的ＢＲＣＡ２活性が機能的に不適当であることが、この癌の原因となっているＢＲＣＡ２タンパク質レベルを直接増加することにより、停止または防止できる。５種の新規ＢＲＣＡ２半数型のｃＤＮＡおよびアミノ酸の配列を開示する（配列番号４−１３）。ＢＲＣＡ２の全体およびフラグメントは乳房および卵巣の癌についての治療的または予防的処置に用いられる。かかるフラグメントは、ＢＲＣＡ２遺伝子の天然ＢＲＣＡ２タンパク質に類似の生物機能を有し，または下記に特定するような望ましい生物機能を有し得る。ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたは相同あるいは修飾のポリペプチド配列を含むその機能的等価物も本発明の範囲内にある。元の配列の変化は、乳房および卵巣の癌の治療的または予防的処置に適したＢＲＣＡ２誘導ポリペプチドまたは機能的等価物を生産または使用するのに、好都合である。例えば、この変化が望ましいのは、インビボタンパク質分解性開裂に対する抵抗性をつくるために、治療薬を容易に移行または運送するために、腫瘍抑制剤を局在せしめ集中するために、または標的種を発現，単離、精製するためにである。
【００７０】
活性ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたは機能的等価物を腫瘍生長阻害剤として生産する方法は、多様である。例えば、１以上のアミノ酸を、よく知られた方法（Maniatis et al.,1982）で置換、欠失または挿入する。アミノ酸の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性を考慮することが、意図する処置に適した相同ポリペプチド変化を設計するのに重要である。特に、関連の側鎖構造および電荷のアミノ酸を使用する同類アミノ酸置換で、化学的および生物的性質を保持することができる。相同ポリペプチドは元の配列に少なくとも７０％の相同性を典型的には含有する。ポリペプチドの非天然型も、修飾が実質的な生物活性を保持している限り、組込むことができる。このような非天然ポリペプチドは、構造類似の化学的薬剤を典型的に含み、元のＢＲＣＡ２タンパク質の活性領域として類似の三次元構造を有する。例えば、これらの修飾には、末端Ｄ−アミノ酸、環状ペプチド、非天然アミノ酸側鎖、プソイドペプチド結合、Ｎ末アセチル化、グリコシル化およびビオチン化などがある。これらのペプチドの非天然型は望ましい生物機能を有する。例えば、細胞性または血清性のプロテアーゼおよびエキソペプチダーゼの存在で特に強い。効果的なＢＲＣＡ２ポリペプチドまたは機能的等価物は、元のＢＲＣＡ２タンパク質の還元によっても得られる。ＢＲＣＡ２タンパク質の領域を系統的に欠失し、どの領域が腫瘍生長阻害活性に欠かせないかを同定する。次いで、ＢＲＣＡ２タンパク質のこのような小さいフラグメントを構造的または機能的に修飾し、治療的または予防的に効果的なものを誘導する。最後に、薬剤、天然産物または小分子を選別または合成して、ＢＲＣＡ２タンパク質の機能を模倣する。典型的には、活性種は三次元形態と化学的活性を保持し、それでもって天然ＢＲＣＡ２タンパク質の生物活性の望ましい相を保持する。ＢＲＣＡ２の活性および機能には、活性移行、グラニン、ＤＮＡ修復などがある。ＢＲＣＡ２の機能について、Bertwistle and Ashworth, Curr. Opin. Genet. Dev. 8(1): 14-20 (1998)およびZhang et al., Cell 92: 433-436 (1998)にも総説されている。当業者に明らかなように、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたは機能的等価物の選択は、かかるポリペプチドまたは機能的等価物が天然ＢＲＣＡ２タンパク質と類似の生物活性を有することでなされる。
【００７１】
宿主細胞におけるＢＲＣＡ２タンパク質およびポリペプチドの発現
ＢＲＣＡ２タンパク質およびポリペプチドの全体またはフラグメントの生産は、外来遺伝子の複製および発現を指示し得る宿主細胞でなされ得る。適当な宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞または高等な真核細胞があり、意図するＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを生産するための１以上の調節配列に操作的に連結したＢＲＣＡ２ｃＤＮＡ配列の全体またはフラグメント（配列番号４，６、８、１０、１２）を含む発現ベクターを含有する。原核細胞には、グラム陽性またはグラム陰性菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉやＢａｃｉｌｌｕｓ株がある。例えば、ＣＯＳ、ＭＣＦ７、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＨＢＬ１００、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６細胞などのＳｆ９昆虫細胞およびヒト細胞系がある。
【００７２】
広範な適当な発現ベクターが当技術で用いられる。発現ベクターは、複製起点、プロモーター、表現型選択遺伝子（抗生物質抵抗性や栄養要求性）およびＢＲＣＡ２タンパク質の全体またはフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含有する。発現ベクターはまた、当技術で知られた他の操作的に結合する調節ＤＮＡ配列を含み得る。例えば、安定リーダー配列、分泌リーダー配列、制限酵素開裂配列、ポリアデニル化配列、終了配列などである。発現ベクターの必須および調節因子は、意図する宿主に適合しなければならない。望ましいコードおよび調節領域を含有する適当な発現ベクターは、当技術で知られる標準的組換えＤＮＡ法を用いて構築される。このような技法の多くは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)に記載されている。例えば、適当な複製起点には、ＣｏｌＥ１、ウイルス性ＳＶ４０およびＭ１３複製起点がある。適当なプロモーターは、構成的あるいは誘導的であって、例えば、ｔａｃプロモーター。ｌａｃＺプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＴＶプロモーターおよびＬＸＳＮプロモーターである。選択マーカーの例としては、ネオマイシン、アンピシリン、ヒグロマイシンの抵抗性などがある。多くの適当な原核細胞性、ウイルス性および哺乳動物の発現ベクターは、市販されており、例えばInvitrogen Corp., San Diego, CA またはClontech, Palo Alto, CA から入手できる。望ましくは、ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドは融合タンパク質として生産され、選択した宿主細胞での発現を高め、トランスフェクトされた細胞での発現を検出し、精製方法を簡素化する。ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドの適当な融合相手は、当技術でよく知られており、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびポリヒスチジンｔａｇなどである。
【００７３】
発現ベクターは種々の既知技術で宿主細胞に導入される。形質転換方法は、形質転換すべき宿主によって異なる。ベクターの宿主細胞への導入方法には、リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション、デキストラン調節トランスフェクション、リポソーム封入、核微注入、ウイルスまたはファージ感染などがある。
【００７４】
発現ベクターが適当な宿主細胞に導入されると、多量のＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを発現し得る条件で宿主細胞を培養できる。発現産物の同定は既知の多くの方法でなすことができる。例えば、ＰＣＲによる増幅後の配列決定、望むＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーション、酵素活性や抗生物質抵抗などのマーカーー遺伝子機能の有無、意図した配列をコードするｍＲＮＡ生産のレベル、ウエスタンブロティングやＥＬＩＳＡなどのモノクローナルポリクローナル抗体を用いた遺伝子産物検出法がある。このようにして生産されたＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを細胞溶解後に単離し、既知の種々のタンパク質精製法で精製する。精製法には、例えばイオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過クロマトグラフィ−およびイムノアフィニティイクロマトグラフィ−がある。
【００７５】
一般的に好ましいのは、いつもできるだけ、長いフラグメントのＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを用いることで、特にＢＲＣＡ２の所望の機能的ドメインを用いる。ＤＮＡの短いフラグメントの発現は、アンチＢＲＣＡ２抗体の生産のためのＢＲＣＡ２誘導免疫原をつくるのに有用である。当然のことであるが、すべての発現ベクター、ＤＮＡ調節配列または宿主細胞が、本発明のＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを発現するのに等しくよく機能するわけでない。しかし、当業者は、余分な実験なしに既知の技術を用いて発現を最大化するために、発現ベクター、ＤＮＡ調節配列、宿主細胞およびコドン使用を選択できるであろう。ＢＲＣＡ２タンパク質機能の研究およびＢＲＣＡ２タンパク質の遺伝操作の例については、つぎの２論文に総説されている。Berwistle and Asworth, Curr. Opin. Genet. Dev. 8(1): 14-20 (1998)およびZhang et al., Cell 92: 433-436 (1998)。
【００７６】
インビトロ合成および化学合成
ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドのフラグメントが原核または真核の宿主細胞によって得られることは好ましいが、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはその機能的等価物は当業者に既知の方法によるインビトロ翻訳または合成手段でも得ることができる。例えば、インビトロ翻訳では、ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドのフラグメントをコードするＤＮＡ配列によりコードされたｍＲＮＡを用いる。固相合成などの化学合成法を用いて、ＢＲＣＡ２ポリペプチド構造模擬体およびその化学的修飾類似体を合成する。このようにつくられたポリペプチドまたはその修飾模擬体を単離し、種々の精製法で精製する。精製法には、例えばイオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過クロマトグラフィ−およびイムノアフィニティイクロマトグラフィ−がある。
【００７７】
タンパク質置換療法
ＢＲＣＡ２の腫瘍抑制機能からして、種々のＢＲＣＡ２タンパク質標的療法が乳房および卵巣の癌における腫瘍を治療または予防するのに用いられ得る。したがって、本発明は、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチドまたはその機能的等価物を含有する医薬組成物を用いて乳房または卵巣の癌を治療的または予防的に処置することを含む。例えば、タンパク質置換療法には、薬学的に効果的な担体中のＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチドまたはその機能的等価物を直接的に投与することが含まれる。あるいは、タンパク質置換療法では、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチドまたはその機能的等価物のフラグメントに融合した腫瘍抗原特異的抗体を用い、抗癌剤を腫瘍細胞に特異的に運ぶ。
【００７８】
本発明の医薬組成物をつくるには、活性のＢＲＣＡ２タンパク質、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を、通常の製薬技術により選択し製造した担体と組み合す。適当な量の組成物を腫瘍部位に局所的に、または全身的に投与して、腫瘍細胞の増殖を止める。投与方法には、当技術での確立したプロトコールに従って非経口、経口または静脈内などがある。
【００７９】
組成物を高めたり安定化したり、また組成物の製造を容易にする薬学的に許容される固体または液体の担体または成分として、限定ではないが、シロップ、水、等張液、５％グルコース水溶液、酢酸ナトリウムまたはアンモニウムの緩衝液、油、グリセリン、アルコール類、香料、保存剤、着色剤、デンプン、砂糖、希釈剤、果粒化剤、滑沢剤、結合剤および徐放化剤がある。医薬組成物の投与量は、広い範囲で変動するが、癌の進行段階、患者の年齢や状態などに依存し、個々に調整される。
【００８０】
診断薬
ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物、抗体およびポリヌクレオチドは、遺伝子治療やタンパク質置換療法以外に広範な用途がある。診断薬として用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでＢＲＣＡ２の正常または異常な活性を測定できる。従って、本発明は、配列番号４−１３のＢＲＣＡ２ｃＤＮＡおよびタンパク質配列から誘導される診断薬を含む。この診断薬は、疾患の進行の監視、患者が遺伝子またはタンパク質置換療法に適しているかの決定、療法後の腫瘍増殖阻害剤の存在検定または定量などの方法に用いられる。かかる方法には通常の組織化学的技術が含まれ、患者からの腫瘍組織の取得、腫瘍の増殖または代謝からの抽出物の作成およびその試験などがある。例えば、腫瘍増殖試験には通常の診断アッセイを用いた異常ＢＲＣＡ２活性の測定が含まれる。このアッセイは、サザン、ノーザンおよびウエスタン・ブロティング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫沈降法などである。腫瘍組織の生検において、腫瘍組織におけるＢＲＣＡ２発現の喪失をＲＮＡレベルでＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロッチングで確認できる。サザンブロット、ゲノムＰＣＲまたはインシツ・ハイブリダイゼーションの蛍光（ＦＩＳＨ）によっても、ＤＮＡレベルでＢＲＣＡ２の変異を調べられる。ウエステンブロッティング、タンパク質切断アッセイあるいは免疫沈降法を用いて、タンパク質レベルでの効果を検査できる。
【００８１】
これらの診断薬は、検出される標識に共有的または非共有的に結合している。このような標識には、放射活性標識、比色酵素標識、蛍光標識またはエピトープ標識がある。しばしば、調節配列の下流レポーター遺伝子は、ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドと融合して、標的種の検出または精製を容易にする。ＢＲＣＡ２融合タンパク質において普通に用いられるレポーターに、β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ遺伝子がある。
【００８２】
ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物、抗体およびポリヌクレオチドは、ＢＲＣＡ２タンパク質の特性の試験にも有用である。癌の原因におけるＢＲＣＡ２の組織および機能、または正常または癌性の細胞におけるＢＲＣＡ２タンパク質の局在の試験に有用である。例えば、酵母の２種のハイブリド系がＢＲＣＡ２の細胞機能の研究に用いられて、ＢＲＣＡ２腫瘍抑制機能の調節体または作用体が同定されている（Sharan et al., Nature 386: 804-810b (1997) and Katagiri et al., Genes, Chromosomes & Cancer 21: 217-222(1988)）。さらに、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物、抗体およびポリヌクレオチドは、インビボ細胞に基づくアッセイおよびインビトロ細胞なしのアッセイで用いられて、ＢＲＣＡ２タンパク質機能を模倣、調節または促進する天然産物または合成化合物を選別する。
【００８３】
アンチセンス阻害
内在性ＢＲＣＡ２発現のアンチセンス抑制でもって、既知の技術（Crooke, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 329-376(1992)およびRobinson-Benion and Holt, Methods Enzymol. 254: 363-375 (1995)）を用いて細胞成長阻害に対するＢＲＣＡ２の作用が調べられる。配列番号４，６、８、１０、１２のｃＤＮＡから、野生型ＢＲＣＡ２タンパク質または成熟型ＢＲＣＡ２タンパク質の
生産に関与するＤＮＡまたはＲＮＡの配列のアンチセンス鎖を当業者は容易に得ることができる。あるいは、ＢＲＣＡ２の制御配列を標的とするようにアンチセンス・オリゴヌクレオチドを設計して、外因性ＢＲＣＡ２遺伝子の発現を低下または防止できる。
【００８４】
抗体
ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物を免疫原として用い、既知の方法で（Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988）ＢＲＣＡ２誘導抗原に結合し得るポリクロナールまたはモノクロナール抗体をつくることができる。この抗体は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイおよび免疫細胞化学法などのイムノアッセイで、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物を検出するのに用いられる。典型的には、アンチＢＲＣＡ２抗体は、溶液の形であるか、プレート、粒子、ビードまたはチューブなどの固体表面に接着している。抗体はＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを含有するかもしれないサンプルまたはブロットに接触すると、最初の免疫複合体を形成する。十分にインキュベーションした後、最初の免疫複合体を水洗し、非特異的結合種を除去する。特異的に結合したＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドの定量は、放射活性、蛍光または酵素標識などの結合標識またはマーカーの検出を用いる。あるいは、ＢＲＣＡ２誘導抗原の検出は、このような標識またはマーカーに結合している第２抗体を用いて、第２免疫複合体を形成して行える。抗体は、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物を単離または精製するためのアフィニティイクロマトグラフィ−で使用できる。
【実施例】
【００８５】
実施例１
正常人のＢＲＣＡ２遺伝子のコード配列半数型の決定
肉親 (すなわち、一等および二等の親族）が癌の経歴をもたない個体を同定するために約１５０人の志願者を審査した。各人に下記の表Ｉに示される『遺伝性癌を事前選別試験するためのアンケート』に答えてもらった。ＢＲＣＡ２遺伝子の全配列を決定するために、これらの中の５人を任意に選んだ。一等の親族は両親、兄弟または子である。二等の親族は、おば、おじ、祖父母、孫、めい、甥または半兄弟である。
【００８６】
上記の質問に対する返答を解析して選んだ５人の正常人の白血球細胞から、ゲノムＤＮＡを単離した。ジデオキシ配列解析をポリメラーゼ連鎖反応増幅後に行った。
ＢＲＣＡ２遺伝子の全てのエキソンは、このＤＮＡサンプルから増幅した一本鎖産物を生ぜしめるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて不斉増幅することによる、直接ジデオキシ配列解析の対象とした。Shuldiner、et al.、Handbook of Techniques in Endocrine Research、p.457-486、DePablo、F.、Scanes、C.、監修、Academic Press、Inc.、1993。Taq Dye TerminatorKit（Perkin-Elmer（登録商標） 商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素を結合させた。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）自動シークエンサー（モデル３７７）の正および逆の両方向で行った。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター”であった。
【００８７】
１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）を５正常個体の白血球細胞から抽出した。５個のサンプルの各々を端から端まで配列決定した。各サンプルを、１μｌ（１００ｎｇ）ゲノムＤＮＡ、２.５μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８.３、５００ｍＭＫＣｌ、１.２ｍＭＭｇＣｌ2）、２.５μｌ １０×ｄＮＴＰ混合（２ｍＭ各ヌクレオチド）、２.５μｌ正のプライマー、２.５μｌ負のプライマー、および１μｌＴａｑポリメラーゼ（５単位）、および１３μｌ水を含む最終容量２５μｌで増幅した。
【００８８】
下の表IIのプライマーを使用して、様々な分画のＢＲＣＡ２遺伝子のサンプルを増幅した。プライマーは、ＤＮＡ／ＲＮＡモデル３９４（登録商標）シンセサイザーで合成した。
【００８９】
３５サイクルを行い、各々は、変性（９５℃；３０秒）、アニーリング（５５℃；１分）、および伸長（７２℃；９０秒）から構成され、ただし、始めのサイクルでは変性時間を５分に増やし、最後のサイクルでは伸長時間を５分に増やした。
【００９０】
ＰＣＲ産物は、Qia-quick（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Qiagen 商品番号28104；Chatsworth、CA）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の収率および純度は、ベックマンＤＵ６５０分光光度計においてＯＤ260で分光光度的に測定する。
【００９１】
２．ジデオキシ配列解析
Taq Dye Terminator Kit（Perkin-Elmer（登録商標） 商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素をＰＣＲ産物に結合させた。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）Foster City、CA.、自動モデル３７７（登録商標）シークエンサーを用いて正および逆の両方向で行った。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター（登録商標）”であった。
【００９２】
３．結果
５人の正常人の配列に基づいて、ジーンバンクとBICの両方の標準配列が正しくないことを決定した。ジーンバンクでは、１０塩基伸長（5'-TTTATTTTAG-3'）をエキソン５の５’末端で、誤ってエキソンとして挙げているが、これはｃＤＮＡおよび得られたタンパク質中に含まれないのでイントロンとすべきである。加えて、乳癌の不正確な診断を招きかねない問題の大きい誤りが、ジーンバンクとBICとの両方に存在する：（5'-GTGTTCTCATAAACAG-3'）の１６塩基対配列はエキソン１５の終了部であると考えられるが、しかるに、データベース中ではエキソン１６の開始部として挙げている。ジーンバンクの開示および表を図１に示す。ＢＲＣＡ２の正しいイントロン／エキソン配列を図２に示す。この中で、
（１）１０塩基伸長（5'-TTTATTTTAG-3'）は、エキソン５の５’末端というよりはむしろイントロン４の３’末端におけるイントロンである（訂正したエキソン５を配列番号：１に示す）、および
（２）１６塩基伸長（5'-GTGTTCTCATAAACAG-3'）は、エキソン１６の５’末端というよりはむしろエキソン１５の３’末端におけるイントロンである（訂正したエキソン１５および１６を、それぞれ配列番号：２および３に示す）。
【００９３】
BIC ＢＲＣＡ２配列もまた、CGTTTGTGT（アミノ酸：Arg-Leu-Cys）で示される５５５４−５４６０位置における９つのヌクレオチドの伸長で、配列の誤りがある。これらの位置の正しい配列はGTTTGTGTT（アミノ酸：Val-Cys-Val）である。加えて、BIC ＢＲＣＡ２ヌクレオチドの２０２４位置（コドン５９９）、４５５３（コドン１４４２）、４８１５（コドン１５２９）、５８４１（コドン１８７１）、および５９７２（コドン１９１５）は、T、T、A、C、およびTであるが、これらの位置の正しいヌクレオチドはそれぞれC、C、G、TおよびCである。この中で、コドン５９９、１４４２、１９１５のヌクレオチドの誤りは、アミノ酸の変化をもたらす。
【００９４】
５人の正常人の核酸における更なる違いが１０の多形性座中で判明した。この変化および位置を表IIIに示す。ＢＲＣＡ２の各染色体の個別の半数型を図３に示す。各例について、ジーンバンクで報告された最初の半数型（アクセス番号 U43746）を参考にして、新たな半数型ＯＭＩ １−５を決定した。その結果、ジーンバンクの配列は、次の５種の半数型の５０％のみを示すにすぎない；５つの新たなＢＲＣＡ２(OMI 1-5)ＤＮＡ配列を各配列番号：４、６、８、１０、および１２に示し（図３参照）、関連するポリペプチドを各配列番号：５、７、９、１１、および１３に示す。組み合わせて、これらの７つの半数型はＢＲＣＡ２遺伝子の対立遺伝子像表わす。
【００９５】
このデータによると、各サンプルにおいて、１０の多形性領域を除いてＢＲＣＡ２のエキソン全部が同一である。これらの多形性のうち６種は以前に同定されている（Tartigan et al., Nature Genetics 12: 333-337 (1996) ; Phelan et al., Nature Genetics 13: 120-122 (1996); Couch et al., Nature Genetics 13: 123-125 (1996); Teng, et al., Nature Genetics 13: 241-244 (1996); Schubert et al 60: 1031-1040 (1997)）。しかし、４種は本発明独特である。各多形性を同定することができるが、これらの完全な半数型は何れも過去に決定されていない。
【００９６】
【表１】
【００９７】
表１の続き
【表２】
【００９８】
表１の続き
【表３】
【００９９】
表１の続き
【表４】
【０１００】
表１の続き
【表５】
【０１０１】
表１の続き
【表６】
【０１０２】
表１の続き
【表７】
【０１０３】
表２
【表８】
【０１０４】
表２の続き
【表９】
【０１０５】
表２の続き
【表１０】
【０１０６】
表２の続き
【表１１】
【０１０７】
表２の続き
【表１２】
【０１０８】
表３
【表１３】
【０１０９】
表３の続き
【表１４】
【０１１０】
実施例２
ＢＲＣＡ２(omi 1-5)および参考としての１０の多形性を用いた正常個体の決定
遺伝子感受性試験の当業者は、本発明が以下事項に有用であることがわかるであろう：
ａ）正常のＢＲＣＡ２遺伝子を有する個体の同定；
ｂ）正常人群にみられる正常の多形性を読み誤ることの回避；
【０１１１】
配列決定は、問題となっている患者の血液を用いて実施例１のように行う。しかしながら、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列を参考のために使用し、患者にみられる多形性部位を、各多形性部位の正常コドンについて上記した核酸配列と比較する。正常サンプルは、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列に匹敵するものであり、ただ小多形性部位でおこる小さい変化の１つを含む。各多形性部位であらわれる対立変化は、参考のために対にする。
・１０９３位のＡＡＴ(Ａｓｎ)およびＣＡＴ(Ｈｉｓ)、(コドン ２８９)
・１３４２位のＣＡＴ(Ｈｉｓ)およびＡＡＴ(Ａｓｎ)、(コドン ３７２)
・１５９３位のＴＣＡ(Ｓｅｒ)およびＴＣＧ(Ｓｅｒ)、(コドン ４５５)
・２４５７位のＣＡＴ(Ｈｉｓ)およびＣＡＣ(Ｈｉｓ)、(コドン ７４３)
・２９０８位のＧＴＡ(Ｖａｌ)およびＡＴＡ(ｌｌｅ)、(コドン ８９４)
・３１９９位のＡＡＣ(Ａｓｎ)およびＧＡＣ(Ａｓｐ)、(コドン ９９１)
・３６２４位のＡＡＡ(Ｌｙｓ)およびＡＡＧ(Ｌｙｓ)、(コドン １１３２)
・４０３５位のＧＴＴ(Ｖａｌ)およびＧＴＣ(Ｖａｌ)、(コドン １２６９)
・７４７０位のＴＣＡ(Ｓｅｒ)およびＴＣＧ(Ｓｅｒ)、(コドン ２４１４)
・９０７９位のＧＣＣ(Ａｌａ)およびＡＣＣ(Ｔｈｒ)、(コドン ２９５１)
【０１１２】
これらの多形性対を使用すると、当業者が、正常の変異を多形性変異と間違えることなく正しく多形性変異を解釈できることが一層確かになる。
ＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン全ては、このＤＮＡサンプルから増幅した一本鎖産物を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて不斉増幅し、直接ジデオキシ配列解析に供する。Shuldiner、et al.、Handbook of Techniques in Endocrine Research、p.457-486、DePablo、F.、Scanes、C.、監修、Academic Press、Inc.、1993。Taq Dye Terminator Kit（Perkin-Elmer（登録商標） 商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素を結合させた。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）自動シークエンサー（モデル３７７）の正および逆の両方向で行った。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター”である。
【０１１３】
１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
患者のサンプルであるＢＲＣＡ２遺伝子を増幅するために使用するＰＣＲプライマーを表IIに示す。プライマーをＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーモデル３９４（登録商標）で合成した。３５サイクルで増幅し、各々は、変性（９５℃；３０秒）、アニーリング（５５℃；１分）、および伸長（７２℃；９０秒）から構成され、ただし、始めのサイクルでは変性時間を５分に増やし、最後のサイクルで伸長時間を５分に増やす。
【０１１４】
ＰＣＲ産物をQia-quick（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Qiagen（登録商標）、商品番号28104；Chatsworth、CA）を用いて精製する。ＰＣＲ産物の収率および純度は、ベックマンＤＵ６５０分光光度計においてＯＤ260で分光光度的に測定した。
【０１１５】
２．ジデオキシ配列解析
Taq Dye Terminator Kit（Perkin-ELmer（登録商標）、商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素をＰＣＲ産物に結合させる。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）Foster City、CA.、自動モデル３７７（登録商標）シークエンサーの正および逆の両方向で行う。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター（登録商標）”である。ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列を比較の標準物としてシークエンスナビゲーターソフトウェアに、連続的に入れる。シークエンスナビゲーターソフトウェアは、１塩基ごとに患者のサンプル配列を各ＢＲＣＡ２(omi 1-5)標準物と比較する。シークエンスナビゲーターは、標準物と患者のサンプルの配列との間の全ての相違を明らかにする。
【０１１６】
一番目の技術者が、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)標準物を患者のサンプルと視覚的に比較することによりコンピューター化された結果を調べ、再び標準物とサンプルの間のあらゆる差異を明白にする。次いで、一番目の技術者が、配列に沿って各位置における配列の変化を読む。各配列変異のクロマトグラムは、シークエンスナビゲーターにより作成され、カラープリンターに印刷される。ピークは、一番目の技術者および二番目の技術者がよむ。次いで、二番目の技術者はクロマトグラムを再試験する。最後に、結果を遺伝学者がよむ。各々の場合において、変異は、位置および塩基変化が既知の正常多形性と比較される。
【０１１７】
３．結果
患者のＢＲＣＡ２配列は７つのヌクレオチド位：１０９３(Ａ/Ｃ)、１３４２(Ａ/Ｃ)、１５９３(Ａ/Ｇ)、２４５７(Ｃ/Ｔ)、２９０８(Ａ/Ｇ)、３１９９(Ａ/Ｇ)および９０７９(Ａ/Ｇ)で異種接合体であることが判明した。加えて、これはポリペプチド産物で５つのアミノ酸を変化させる：コドン２８９のＡｓｎをＨｉｓへ、コドン３７２のＡｓｎをＨｉｓへ、コドン８９４のＶａｌをＩｌｅへ、コドン９９１のＡｓｎをＡｓｐへ、およびコドン２９５１のＡｌａをＴｈｒへ変化させる。これらの変化の何れかまたは全てが患者にとって意味があるのであろうかという疑問が生じる。
患者の結果とＢＲＣＡ２(omi 1-5)半数型とを比較すると、ＢＲＣＡ２omi標準物（＃５）の一つと合わさることがはっきりとする。従って患者のサンプルは、乳癌の危険性を増大することのない正常な遺伝子配列を保持していると、解釈される。
【０１１８】
実施例３
ＢＲＣＡ２(omi 1-5)を用いたＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン１１における変異の存在の決定
遺伝子感受性試験の当業者はわかるように、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子において既知または未知の変異の存在を決定するのに有用である。ＢＲＣＡ２の変異の一覧表は乳癌情報機関のhttp://www.nchgr.nih.gov/dir/lab_transfer/bic.で公共的に入手できる。この情報機関は１９９５年１１月１日に公共的に使用できるようになった。Friend、S.et al.Nature Genetics 11:238、(1995)。
【０１１９】
本実施例で、エキソン１１の変異は、変異領域を増幅するプライマーを設置すると変異領域を増幅するという特徴がある。問題の患者の血液サンプルを使用して、実施例１と同様に配列決定を行なった。特にＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン１１は、このＤＮＡサンプルから増幅した一本鎖産物を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて不斉増幅し、直接ジデオキシ配列決定する。Shuldiner、et al.、Handbook of Techniques in Endocrine Research、p.457-486、DePablo、F.、Scanes、C.、監修、Academic Press、Inc.、1993。Taq Dye TerminatorKit（Perkin-Elmer（登録商標）、商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素を結合させた。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）自動シークエンサー（モデル３７７）の正および逆の両方向で行った。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター”である。
【０１２０】
１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
該体の白血球から抽出したゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）は、１μｌ（１００ｎｇ）ゲノムＤＮＡ、２.５μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８.３、５００ｍＭＫＣｌ、１.２ｍＭＭｇＣｌ2）、２.５μｌ １０×ｄＮＴＰ混合（２ｍＭ各ヌクレオチド）、２.５μｌ正のプライマー（ＢＲＣＡ２−１１Ｑ−Ｆ、１０μＭ溶液）、２.５μｌ負のプライマー（ＢＲＣＡ２−１１Ｑ−Ｒ、１０μＭ溶液）、および１μｌＴａｑポリメラーゼ（５単位）、および１３μｌ水を含む最終容量２５μｌにおいて増幅する。
【０１２１】
エキソン１１のセグメントＱ（６１７４del T1変異がある）を増幅するのに使用するＰＣＲプライマーを以下示す。
ＢＲＣＡ２-１１Ｑ-Ｆ：5'-ACG'AAA'ATT'ATG'GCA'GGT'TGT-3'
ＢＲＣＡ２-１１Ｑ-Ｒ：5'-CTT'GTC'TTG'CGT'TTT'GTA'ATG-3'
【０１２２】
プライマーをＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーモデル３９４（登録商標）で合成する。３５サイクルで行ない、各々は変性（９５℃；３０秒）、アニーリング（５５℃；１分）、および伸長（７２℃；９０秒）から構成され、ただし、始めのサイクルでは変性時間を５分に増やし、最後のサイクルで伸長時間を５分に増やす。
ＰＣＲ産物をQia-quick（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Qiagen（登録商標）、商品番号28104；Chatsworth、CA）を用いて精製する。ＰＣＲ産物の収率および純度は、ベックマンＤＵ６５０分光光度計においてＯＤ260で分光光度的に測定する。
【０１２３】
２．ジデオキシ配列解析
Taq Dye Terminator Kit（Perkin-ELmer（登録商標）、商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素をＰＣＲ産物に結合させる。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）Foster City、CA.、自動シークエンサー（モデル３７７）の正および逆の両方向で行う。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター（登録商標）”である。ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列を比較の標準物としてシークエンスナビゲーターソフトウェアに入れる。シークエンスナビゲーターソフトウェアは、１塩基ごとにサンプル配列をＢＲＣＡ２(omi)標準物と比較する。シークエンスナビゲーターソフトウェアは、ＢＲＣＡ２(omi)正常ＤＮＡ配列と患者のサンプルの配列との間の全ての相違を明らかにする。
【０１２４】
一番目の技術者が、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)標準物を患者のサンプルと視覚的に比較することによりコンピューター化された結果を調べ、再び標準物とサンプルの間のあらゆる差異を明白にする。次いで、一番目の技術者が、配列に沿って各位置における配列の変化を読む。各配列変異のクロマトグラムは、シークエンスナビゲーターにより作成され、カラープリンターに印刷される。ピークは、一番目の技術者および二番目の技術者もよむ。次いで、二番目の技術者はクロマトグラムを再試験する。最後に、結果を遺伝学者がよむ。各々の場合において、配列変異は、位置および塩基変化が既知の正常な多形性と比較される。ＢＲＣＡ２で起こる１０のフラグメントの多形性は：
・１０９３位のＡＡＴ(Ａｓｎ)およびＣＡＴ(Ｈｉｓ)、(コドン ２８９)
・１３４２位のＣＡＴ(Ｈｉｓ)およびＡＡＴ(Ａｓｎ)、(コドン ３７２)
・１５９３位のＴＣＡ(Ｓｅｒ)およびＴＣＧ(Ｓｅｒ)、(コドン ４５５)
・２４５７位のＣＡＴ(Ｈｉｓ)およびＣＡＣ(Ｈｉｓ)、(コドン ７４３)
・２９０８位のＧＴＡ(Ｖａｌ)およびＡＴＡ(ｌｌｅ)、(コドン ８９４)
・３１９９位のＡＡＣ(Ａｓｎ)およびＧＡＣ(Ａｓｐ)、(コドン ９９１)
・３６２４位のＡＡＡ(Ｌｙｓ)およびＡＡＧ(Ｌｙｓ)、(コドン １１３２)
・４０３５位のＧＴＴ(Ｖａｌ)およびＧＴＣ(Ｖａｌ)、(コドン １２６９)
・７４７０位のＴＣＡ(Ｓｅｒ)およびＴＣＧ(Ｓｅｒ)、(コドン ２４１４)
・９０７９位のＧＣＣ(Ａｌａ)およびＡＣＣ(Ｔｈｒ)、(コドン ２９５１)
【０１２５】
３．結果
上記のＰＣＲ増幅および標準蛍光配列決定法を用いて、６１７４ｄｅｌＴ変異を発見し得る。変異は非対の配列変化の鎖長で示される。このような長い誤対合の形態は欠失および挿入で生じる。この変異は、変異の命名に提案されている命名法、Baudet、A et al.、Ｈuman Mutation 2:245-248、(1993)に従って命名される。ＢＲＣＡ２遺伝子のコドン１９８２の６１７４ｄｅｌＴ変異は、エキソン１１のセグメント“Ｑ”でおこる。このＤＮＡ配列決定の結果により、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列の６１７４ヌクレオチドでＴの１つの塩基対が欠失していることが実証される。この変異はＢＲＣＡ２転写産物の正常なリーディングフレームを阻害し、その結果コドン２００３位でインフレームターミネーター（ＴＡＧ）が現れる。それ故、この変異は、切断されて、おそらく機能しないであろうタンパク質をもたらすと予測される。
【０１２６】
実施例４
免疫原としてＧＳＴ-ＢＲＣＡ２融合タンパク質を使用したモノクローナルおよびポリクローナル抗体の産出
ＤＮＡプライマーを使用し、ＰＣＲ法を用いてＢＲＣＡ２フラグメントを増幅する。生成物を適切な酵素で消化した後、ＧＳＴ発現ベクターｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc.）を使用するEscherichia coliで、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする遺伝子とフレーム中で融合する。融合タンパク質の発現をイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドの添加で誘発する。次いで細菌を分解し、過剰発現した融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズで精製する。この融合タンパク質をＳＤＳ/ＰＡＧＥゲルで確かめ、Ｎ-末端タンパク質配列決定する。精製したタンパク質をHarlow & Lane (1988)による標準的な方法でウサギを免疫化するのに使用する。数週間後ポリクローナル抗体を血清から集め、当業者に既知の方法で精製する。ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチドまたは機能的同等物の全体またはフラグメントに対するモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法を用いて得ることができる。Harlow & Lane (1988)参照。このＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドは、グルタルアルデヒドの存在下でキーホールリンペットヘモシアニン担体と結合する。結合した免疫原を補助剤と混ぜ、ウサギへ注射する。抗体を含有するウサギから脾臓を取り出す。脾臓から単離したＢ細胞を骨髄腫細胞と融合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して融合を促進する。骨髄腫とＢ細胞間のハイブリッドを選択し、免疫原ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドに対する抗体の産物をスクリーンする。陽性細胞を再びクローンして、モノクローナル抗体を産出する。
【０１２７】
実施例５
ヒト組織および細胞株でのＢＲＣＡ２発現の検出
ヒト組織でのＢＲＣＡ２発現を、ノーザンブロット分析を使用して決定する。膵臓、精巣、前立腺、卵巣、胸部、小腸および結腸などのヒト組織を、Clontech Laboratories, Inc., Paloから入手する。異なるヒト組織のポリ(Ａ)+ｍＲＮＡノーザンブロットをＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡプローブと交雑し、プロトコルを製造する。さらに、プライマーとしてオリゴ-d(Ｔ)などの適切なプライマーを使用するＲＴ-ＰＣＲで発現レベルを整える。
【０１２８】
癌細胞系のノーザンブロット法のために、ヒト卵巣癌細胞系ＳＫＯＶ−３およびヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７を米国基準菌株保存機構ＡＴＣＣから得る。全ＲＮＡをグアニジンイソシアネートの存在で細胞を溶解して調製する。ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡの単離に、Ｐｒｏｍｅｇａ（Madison,WI）のＰｏｌｙＡＴｒａｃｔｍＲＮＡ単離システムを用いる。単離ＲＮＡを変性条件で電気泳動し、ナイロン膜に移行せしめる。ノーザンブロットに用いるプローブはＰＣＲ増幅で得たＢＲＣＡ２配列のフラグメントである。[α−32Ｐ]ｄＣＴＰでのプローブの標識にはランダムプライム標識キット（American Life Science, Arlington Heights, Il）を使用する。
【０１２９】
実施例６
ＢＲＣＡ２タンパク質の発現
ＢＲＣＡ２トランスフェクト細胞のの全細胞抽出物を免疫沈降法および免疫ブロット法にかけ、ＢＲＣＡ２タンパク質レベルを測定する。ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドの免疫沈降には、実施例４で調製したアンチＢＲＣＡ２抗体を使用する。サンプルをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースに移行する。ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドについてウエスタンブロットを表示の抗体で行う。抗体反応の提示には化学発光試薬（DuPont New England Nuclear, Boston, MA）を用いる。
【０１３０】
実施例７
ＢＲＣＡ２(omi 1-5)遺伝子治療の使用
ＢＲＣＡ２遺伝子の発現を増加することにより、卵巣癌、乳癌または前立腺癌の成長を抑制し得る。この遺伝子の不十分な発現は遺伝性の卵巣癌、乳癌および前立腺癌をもたらす。腫瘍サイズを減少させるために患者に遺伝子治療を行う。ＬＸＳＮベクターを配列番号４、６、８、１０、１２のＢＲＣＡ２(omi1-5)コード配列で形質転換し得る。
【０１３１】
ベクター
ＬＸＳＮベクターを配列番号４、６、８、１０、１２の野生型ＢＲＣＡ２(omi1-5)コード配列で形質転換する。ＬＸＳＮ−ＢＲＣＡ２(omi1-5)レトロウイルス発現ベクターは、ＳａｌＩ連結ＢＲＣＡ２(omi1-5)ｃＤＮＡまたはそのフラグメントをベクターＬＸＳＮのＸｈｏＩ部位にクローン化することにより構築される。構築物をＤＮＡ配列決定により確認する。参照、Holt et al.Nature Genetics 12:298-302(1996)。レトロウイルスベクターは、血清およびフェノールレッドが含まれていない条件を用いて、ウイルス産生細胞から調製し、標準的解析法により、不稔性、特定の病原体の非存在、および複製能を有するレトロウイルスの存在について試験する。レトロウイルスは試験を行う分割単位で凍結させて保存する。
【０１３２】
患者は、全体的健康を調べるために、完全な物理的検査、血液検査および尿検査を受ける。彼らはまた、腫瘍段階を評定するために、胸部Ｘ線、心電図、および適当な放射線測定を受ける。
【０１３３】
転移性卵巣癌の患者は、薬剤単位形あたり１０9および１０10の間のウイルス粒子で、腫瘍を含む腹膜部位に組換えＬＸＳＮ−ＢＲＣＡ２(omi1-5)レトロウイルスベクターを注入することによるレトロウイルス遺伝子治療を用いて処置する。血液サンプルを毎日採取し、感度の良いポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）を基礎とした解析により、レトロウイルスベクターの存在を試験する。取得した液体を解析して以下を決定する：
【０１３４】
１．組換えＬＸＳＮ−ＢＲＣＡ２(omi1-5)レトロウイルスベクターの組み合わせを取り込んだ癌細胞のパーセンテージ。ＢＲＣＡ２遺伝子が癌細胞にうまく取り込まれたことは、ＲＴ−ＰＣＲ解析およびインシツハイブリダイゼーションにより示される。ＲＴ−ＰＣＲは、配列番号４、６、８、１０、１２のまたはそのフラグメントのＢＲＣＡ２(omi1-5)由来のプライマーを用いて、Thompson et al.Nature Genetics 9:444-450(1995)の方法により行われる。Jensen et al., Nature Genetics 12:303-308(1996)およびJensen et al.Biochemistry 31:10887-10892(1992)の方法により、細胞溶解物を調製し、イムノブロットを行う。
【０１３５】
２．ApoTAG（登録商標）インシツアポトーシス検知キット（Oncor、Inc.、Gaithersburg、メリーランド）およびＤＮＡ解析を用いたプログラム細胞死の存在。
【０１３６】
３．スライド免疫蛍光法またはウエスタンブロットによるＢＲＣＡ２遺伝子発現の測定。
【０１３７】
測定可能な疾病の患者をまた、ＬＸＳＮ−ＢＲＣＡ２（omi1-5）に対する臨床応答について検査し、特にレトロウイルスベクター治療後すぐに通常の処置はしないで患者を検査する。流動細胞診、腹部の周囲、腹部のＣＴスキャンおよび局所徴候を検査する。
【０１３８】
その他の部位の疾病については、以下のような慣用的な評価基準を使用する:
１．完全反応（ＣＲ）、少なくとも４週間、疾患の全ての測定可能な病巣および全ての徴候および症状の完全な消失。
２．部分反応（ＰＲ）、４週間以内に２人の観察者により決定された全ての測定可能な病巣の最も大きい２つの垂線の直径の産物の合計が少なくとも５０％減少。ＰＲを続けると、この間に全く新しい病巣は現れず、またどの病巣もサイズが増大しない。
３．安定な疾病、前回の測定から腫瘍容積が２５％以下の変化。
４．進行性疾病、前回の測定から腫瘍測定が２５％以上の増加。
【０１３９】
実施例８
タンパク質置換療法
機能的ＢＲＣＡ２タンパク質レベルの治療上の増大は、内因性ＢＲＣＡ２腫瘍抑制活性の不存在または低下を改善する。乳房または卵巣の癌に対する処置には、薬学的に許容される担体中のＢＲＣＡ２、ポリペプチドまたはその機能的等価物の治療的有効量を投与する。臨床的に効果的な運送方法は、既知のプロトコールでもって、腫瘍の部位に局所的に行うか、または他の転移箇所に到達するように全身的に行う。そのようなプロトコールでは腫瘍に直接注入する方法または時間放出カプセルを用いる拡散法がある。治療的に効果的な量は当業者により決定される。
【０１４０】
乳房または卵巣の癌の予防には、薬学的に許容される担体中のＢＲＣＡ２、ポリペプチドまたはその機能的等価物の予防上の有効量を投与する。乳房または卵巣の癌の危険性がわかっている者にタンパク質置換療法を行い、腫瘍原性を予防し、癌のおそれを低下せしめる。乳房および卵巣の癌の危険性の増大には、１以上のＢＲＣＡ２およびＢＲＣＡ１変異の保持、後期出産の子供、月経の早い開始、閉経の遅い開始、ある種の高危険性の食事習慣などの因子がある。臨床上効果的な運送方法は、既知のプロトコールで用いられるものであり、例えば腹膜腔内投与または植込み時間放出カプセルである。予防的に効果的な量は当業者により決定される。
【０１４１】
文献目録
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本発明は、好ましい実施態様に関連して記述されているが、本発明の精神からそれることなく様々な修飾を行なうことができることを理解すべきである。それに応じて、本発明は次の請求の範囲のみによって限定される。
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、米国仮出願６０／０５５，７８４（１９９７年８月１５日出願）、６０／０６４，９２６（１９９７年１１月７日出願）および６０／０６５，３６７（１９９７年１１月１２日出願）に基づく。
【０００２】
発明の領域
本発明は、遺伝子に変異がみられる乳癌に関連する遺伝子に関する。より具体的には、本発明は、ヒトから同定されたＢＲＣＡ２の５種の非反復コード配列、ＢＲＣＡ２(omi1)、ＢＲＣＡ２(omi2)、ＢＲＣＡ２(omi3)、ＢＲＣＡ２(omi4)およびＢＲＣＡ(omi5)に関し、これらは５種の新しい半数型（haplotype）である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
乳癌の５−１０％が遺伝性のものであると考えられている。Ｒowell,S., et al., American Journal of Human Genetics 55:861-865(1994)。乳房および卵巣の癌に関連する最初の遺伝子は、染色体１７からミキらにより１９９４年に単離された（Miki et al., Science 266:66-71(1994)）。第２の乳癌の高い危険性を与える遺伝子は、１９９４年に染色体１３上に位置付けされ（Wooster, R., et al., Science 265: 2088-2090）、ついで１９９５年に単離された（Wooster, R., et al., Nature 378: 789-792）。この“腫瘍抑圧”遺伝子の変異は、遺伝性乳癌の約３５％、および男性乳癌含有家系の８０−９０％の原因となっていると考えられている。
【０００４】
染色体１３のＢＲＣＡ２領域における１以上の変異を突き止めることは、高い危険性のある女性および男性を早期に検出することによって、乳癌の高い発生率および死亡率を低下し得る有望な手段を提供する。このよう者は、一度認定されると、さらに高度な予防方法の対象とすることができる。スクリーニングは、核型認定、プローブ結合、ＤＮＡ配列決定を含む種々の方法によって実施される。
【０００５】
ＤＮＡ配列決定技術において、ゲノムＤＮＡは全血から抽出され、そしてＢＲＣＡ２遺伝子のコード配列が増幅される。各コード配列は完全に配列決定されて、その結果が遺伝子の正常ＤＮＡ配列と比較される。別法として、サンプル遺伝子のコード配列は、遺伝子を完全に配列決定して、それを遺伝子の正常配列と比較する前に、既知の変異などの選別方法のパネルと比較することができる。
【０００６】
ＢＲＣＡ２遺伝子は２７の別個のエキソンに分類される。エキソン１は非暗号であって、最終機能的ＢＲＣＡ２タンパク質産物の部分ではない。ＢＲＣＡ２コード配列は７０ｋｂ以上の大略１０４３３塩基対（ｂｐ）に及ぶ。各エキソンは１００−６００ｂｐからなるが、エキソン１０、１１および２７が例外である。完全長のｍＲＮＡは１１−１２ｋｂである。ＢＲＣＡ２遺伝子のコード配列を決定するために、各エキソンは別個に増幅されて、得たＰＣＲ産物が正および逆方向に配列される。エキソン１０、１１および２７がこのように大きいので、我々は、これらを各々約２５０−６２５ｂｐの３個、２１個および２個の重複するＰＣＲフラグメントに分断した（エキソン１０のセグメントＡからＣ、エキソン１１のセグメントＡからＵ、およびエキソン２７のセグメントＡからＢ）。
【０００７】
多くの変異および正常多型がＢＲＣＡ２遺伝子について既に報告されている。乳癌感受性遺伝子における変化の検出および特性化を容易にするために、世界的な情報網がつくられている。このようなＢＲＣＡ２の変異は、http://www.nchgr.nih.gov/dir/lab transfer/bic.の乳癌情報機関を通じて情報を得ることができる。この情報機関は１９９５年１１月１日に一般に利用可能となった。Friend, S. et al., Nature Genetics 11:238,(1995)。ＢＲＣＡ２の情報は１９９６年２月に加えられた。
【０００８】
乳癌症候の遺伝は、低い浸透度の常染色体優性である。この意味を簡単に言うと、この症候は家系を通じて生じ、（１）男女共に保持し（ほとんどの女性は発病し、男性は発病しないか、時に乳癌となる）、（２）すべての世代が乳癌になりやすく、（３）時には、この遺伝子のある女性が発病する時間を得ないままに若くして死亡するか（子孫は遺伝子を持って）、あるいは乳房または卵巣の癌になることなしに老齢で死亡する（後者の人々を、癌が発病することがないので、“低い浸透度”を有すると言う）。いかなる研究よりも前に血統的解析および遺伝学的検討が、適当な家系対策に絶対的に必須である。
【０００９】
現在のところ、ＢＲＣＡ２のゲノム配列情報の唯一の供給源は、ジーンバンク（アクセス番号Ｕ４３７４６）か、乳房情報コア共同体（ＢＩＣ）の会員であることを要するインターネットのＢＩＣデーターベースを通じてである。しかし、本特許出願の開示に基づくと、ジーンバンクもＢＩＣも配列の同定が完全には正しくない。これらの誤りを是正する必要があり、さもないと患者からの配列データを異常と誤って解釈することにつながり、またその逆も起こり得る。
【００１０】
さらに、この分野で必要があるのは、正常な母集団の大部分で最も普通に見られるＢＲＣＡ２配列を提示する機能性対立遺伝子のプロファイルを利用可能にすることである。この機能性対立遺伝子プロファイルは頻繁に起こる多形性（polymorphism）および正しい骨格配列に基づいている。いくつかの普通の半数型についての知識が真の変異を多形性と容易に同定または識別するのを可能にする。ＢＲＣＡ２遺伝子およびタンパク質の変異を同定することは、現在可能であること以上に広範な遺伝性乳房癌の診断選別ができるようになる。
【００１１】
これらの普通の正常半数型の使用は、前に公表されているＢＲＣＡ２配列に加えて、病的な“変異”（すなわち、個体に疾患を起こす、または個体に疾患が生じる高い危険性をもたらす）を有する正常集団にみられる“配列変化”の読み誤りやすさを減少せしめる。乳癌の素質試験において、読み誤りは特に問題である。すでに乳癌になっている者は、“私の病気は遺伝性の変異によるものですか”との医学的質問をする。乳癌の患者の家族は、“私は家族が有する変異の素質があるのですか、私の危険性が増加しているなら、私ももっと高度の検査プログラムを受けねばならないのでしょうか”と尋ねる。
【非特許文献１】Ｒowell,S., et al., American Journal of Human Genetics 55:861-865(1994)
【非特許文献２】Miki et al., Science 266:66-71(1994)
【非特許文献３】Wooster, R., et al., Science 265: 2088-2090
【非特許文献４】Wooster, R., et al., Nature 378: 789-792
【非特許文献５】Friend, S. et al., Nature Genetics 11:238,(1995)
【発明の概要】
【００１２】
本発明の要約
本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子の正常人に見いだされる正しいゲノムＢＲＣＡ２、および５種の新規配列半数型の発見に基づいている。
本発明の目的は、ＢＲＣＡ２遺伝子の正しいイントロン／エキソン配列を提供することである。
本発明の別の目的は、癌感受性の増加に対応しない正常な個体のＢＲＣＡ２遺伝子の５種の非反復半数型を提供することである。
本発明の別の目的は、ＢＲＣＡ２遺伝子またはその部分の配列決定を行い、
それを５種の半数型配列と比較して、配列変化が多形性または潜在的に危険な変異を提示するかどうかを決定することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、ＢＲＣＡ２遺伝子上の１０多形性ポイントの各々で生じる対のリストを提供することである。
本発明の他の目的は、ＢＲＣＡ２遺伝子のコドン２８９、３７２，４５５，７４３，８９４，９９１、１１３２、１２６９、２４１４および２９５１での多形性の発生比率を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ＢＲＣＡ２またはその部分のエキソンが１以上のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅される方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ＢＲＣＡ２コード配列の変異がなく、従って、乳房または卵巣の癌に対する遺伝子感受性が増加していない者を同定する方法を提供することである。異常なＢＲＣＡ２遺伝子の保持がないとの知見に基づき同定される。
【００１５】
本発明の他の目的は、乳房または卵巣の癌に対する遺伝子感受性または素質を増大せしめるＢＲＣＡ２の変異を同定する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、５種のＢＲＣＡ２半数型配列から誘導された５種の新規ＢＲＣＡ２タンパク質配列を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、５種の新規ＢＲＣＡ２タンパク質配列、それらのＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはそれらの機能的等価物の全体またはフラグメントをコードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターを含有する原核または真核の宿主を包含することである。
本発明の他の目的は、５種の新規ＢＲＣＡ２タンパク質配列、それらのＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはそれらの機能的等価物の全体またはフラグメントを免疫原として用いるアンチＢＲＣＡ２タンパク質抗体を包含することである。
【００１７】
癌感受性の増加の危険性のない正常人からの、ＢＲＣＡ２遺伝子のｃＤＮＡ配列およびＢＲＣＡ２のタンパク質配列について技術上の必要性がある。ＢＲＣＡ２変異を含有するかもしれない患者のサンプルが実際に変異を有しているかどうかを調べるために、患者のＢＲＣＡ２ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列をすべて既知の正常ＢＲＣＡ２配列と比較する必要がある。得たサンプルをすべての天然型の正常配列と比較できないと、臨床的に意味のない多形性のときでもサンプルが潜在的に危険な変異を含有するものとして報告することになってしまう。
【００１８】
遺伝子感受性試験における当業者は、本発明が下記の事項に有用であることが分かるであろう。
ａ）コード配列変異のない正常なＢＲＣＡ２遺伝子を有する個体、従ってＢＲＣＡ２遺伝子からの乳房または卵巣の癌の増大した遺伝子感受性を有するとは言えない個体を同定すること。
ｂ）ＢＲＣＡ２遺伝子にみられる正常な多形性の読み誤りを回避すること。
ｃ）ＢＲＣＡ２遺伝子に今まで知られていない変異の存在を認定すること。
ｄ）乳癌より卵巣癌（すなわち、推測“卵巣癌クラスター”領域に存在）に対して素質または高い感受性を示すＢＲＣＡ２のエキソン１１での変異を同定すること。
ｅ）ＢＲＣＡ２遺伝子のヒトサンプルを対立遺伝子でプローブし、多形性対立遺伝子または変異の存在または不存在を決定すること。
ｆ）正しいＢＲＣＡ２遺伝子で遺伝子療法を行うこと。
ｇ）正しいＢＲＣＡ２タンパク質配列またはその機能的等価物でタンパク質置換療法を行うこと。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１は、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【００２０】
図２は、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【００２１】
図３は、ＢＲＣＡ２などの遺伝子内の一単位すなわち“半数型”として提示され得る染色体の多形性部位における代わりの対立遺伝子を示す。ジーンバンク（ＧＢ）の半数型を淡いシャドーで示す。５種の追加の半数型を図３に示す（ヌクレオチド部位１０９３、１３４２、１５９３、２４５７、２９０８、３１９９、３６２４、４０３５、７４７０、９０７９の代わりの対立遺伝子を含む）。ＢＲＣＡ２(omi1)、ＢＲＣＡ２(omi2)、ＢＲＣＡ２(omi3)、ＢＲＣＡ２(omi4)およびＢＲＣＡ２(omi5)は濃淡混合のシャドーで示す（左から右へ２、４、６、８、１０）。全体として、ＢＲＣＡ２遺伝子の１０半数型中５は非反復である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＢＲＣＡ２のジーンバンクゲノム配列（アクセス番号Ｕ４３７４６）を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５および１６の誤りのエキソンを太文字で示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＢＲＣＡ２の正しいゲノム配列を示す。小文字はイントロン配列を、大文字はエキソン配列を意味する。エキソン５、１１および１５の訂正したイントロンおよびエキソンを太文字で示す。
【図３】図３は、ＢＲＣＡ２などの遺伝子内の一単位すなわち“半数型”として提示され得る染色体の多形性部位における代わりの対立遺伝子を示す。ジーンバンク（ＧＢ）の半数型を淡いシャドーで示す。５種の追加の半数型を図３に示す（ヌクレオチド部位１０９３、１３４２、１５９３、２４５７、２９０８、３１９９、３６２４、４０３５、７４７０、９０７９の代わりの対立遺伝子を含む）。ＢＲＣＡ２(omi1)、ＢＲＣＡ２(omi2)、ＢＲＣＡ２(omi3)、ＢＲＣＡ２(omi4)およびＢＲＣＡ２(omi5)は濃淡混合のシャドーで示す（左から右へ２、４、６、８、１０）。全体として、ＢＲＣＡ２遺伝子の１０半数型中５は非反復である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
下記の定義は本発明を理解する目的で提供される。
“乳房および卵巣の癌”は、当業者の理解によると、女性における乳房および卵巣および膵臓の癌、および男性における乳房、前立腺および膵臓の癌を含む。ＢＲＣＡ２は、遺伝性の乳房、卵巣および膵臓の癌に対する遺伝子感受性に関連している。従って、本明細書の請求項で乳房および／または卵巣の癌と記載されたものは、男性および女性における乳房、卵巣、前立腺および膵臓の癌を意味する。
【００２４】
“コード配列”は、一緒になってペプチド（タンパク質）をコードする、または核酸自体が機能する遺伝子の部分を意味する。
“タンパク質”または“ペプチド”は、機能する配列アミノ酸を意味する。
【００２５】
“ＢＲＣＡ２(omi)”は、ジーンバンク（アクセス番号Ｕ４３７４６）に開示されたＢＲＣＡ２配列を意味し、うち、
（１）１０ｂｐ伸張（５’−ＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧ−３’）はエキソン５の５末端よりもむしろイントロン４の３’末端でイントロン性であり、
（２）１６ｂｐ伸張（５’−ＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＣＡＧ−３’）はエキソンの５’末端よりもむしろエキソン１５の３’末端でエキソン性である。
【００２６】
“ＢＲＣＡ２(omi1-5)”は、ＢＲＣＡ２遺伝子およびそのイントロン（特にエキソンに隣接の切片部位）の５種の非反復ＤＮＡ配列を意味する。これらの配列は、母集団から無作為に抽出された５人のＢＲＣＡ２遺伝子を端から端へ配列決定することでみつけられた。この５人は乳房または卵巣の癌について家族歴のない者である。配列決定されたエキソンは、いかなる末端切除変異も含有していないことが分かった。すべての場合、多形性部位での核酸の変化は、ジーンバンクで前に公表されている標準物からのコドン変化およびアミノ酸変化を招く（参照、表III）。ある場合には、核酸の変化が起きる頻度は、公表の頻度と異なることがわったか、または初めて決定した。これらの配列変動は、半数型が癌の危険性増大を示さない対立遺伝子であると思われる。
【００２７】
“正常ＤＮＡ配列”または“正常遺伝子配列”は、正常機能のタンパク質をコードする遺伝子またはそれ自体が正常な機能を有する遺伝子を保持する者の集団において、核酸が高頻度でそれぞれの位置で生じることの知られている核酸の配列を意味する。
【００２８】
“正常タンパク質配列”は、正常機能のタンパク質をコードする遺伝子を保持する者の集団において、タンパク質配列のアミノ酸が高頻度で生じることの知られているタンパク質の配列を意味する。
【００２９】
“正常配列”とは、正常機能のタンパク質をコードする遺伝子またはそれ自体が正常な機能を有する遺伝子を保持する者の集団において、核酸またはアミノ酸が、高頻度でそれぞれの位置で生じることの知られている核酸またはタンパク質の配列を意味する。
【００３０】
“半数型”は、染色体上の遺伝子内の特異的対立遺伝子の１系統を意味する。
“機能的対立遺伝子”は、完全な機能を有する正常人の母集団における対立遺伝子のリストを意味する。
【００３１】
“変異”は、ＤＮＡ配列における塩基の変化、または塩基対の獲得または喪失を意味し、非機能性のタンパク質または実質的に低下あるいは変化した機能のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらすものである。
“多形性”は、既知の病理と関連しないＤＮＡ配列における塩基変化を意味する。
【００３２】
“プライマー”は、ＢＲＣＡ２遺伝子に相補的な配列を有する約１５以上のヌクレオチドを含有する配列を意味する。当業者はプライマーハイブリダイゼーションに使用できる他のプライマーを知っているか、容易に確認できる。
【００３３】
“実質的に相補的”は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが相補的であるＢＲＣＡ２配列とハイブリダイズするように、ストリンジェントな条件で提供される配列および／またはＢＲＣＡ２配列との充分な相同性を有する配列とハイブリダイズするプライマー配列を意味する。
【００３４】
“単離された核酸”は、他の核酸、タンパク質、炭水化物および結合し得る他の物質を実質的に含まない核酸を意味する。かかる結合は、細胞性材料および合成培地のいずれでも典型的である。
【００３５】
“生物サンプル”または“生物体サンプル”は、生物源から得たＤＮＡ含有のサンプルを意味する。サンプルは種々の組織または細胞の生きている、死んだ、さらには考古学的な源に由来する。サンプルには、体液（例えば、血液（白血球）、尿（上皮細胞）、唾液、乳、月経、子宮・膣分泌物）、皮膚，毛根／毛嚢、粘膜（例えば、口腔または舌細胞の擦過）膣頚部細胞（ＰＡＰスメアなどから由来）、リンパ組織、内部組織（正常または腫瘍）が含まれる。
【００３６】
“ベクター”は、自己複製可能なポリヌクレオチドまたは自己複製ポリヌクレオチドへの組込みを起こすポリヌクレオチドを意味する。例えば、複製起点または組込み部位を含有するポリヌクレオチドがある。ベクターは宿主細胞の染色体に組込まれるか、自動的複製部位を形成し得る。
【００３７】
“腫瘍成長阻害剤”は、ＢＲＣＡ２タンパク質、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはこれらの機能的等価物の全体またはフラグメントなどの分子を意味する。この分子は、乳房または卵巣の癌の形質転換または悪性の表現型の形成を予防、減少または消失するのに効果的である。
【００３８】
“ＢＲＣＡ２ポリペプチド”は、ＢＲＣＡ２タンパク質から直接的に誘導されるか、またはＢＲＣＡ２タンパク質に相同性であるＢＲＣＡ２ポリペプチド、またはＢＲＣＡ２タンパク質およびポリペプチドの全体またはフラグメントからなる融合タンパク質を意味する。
【００３９】
“機能的等価物”は、非天然のＢＲＣＡ２ポリペプチド、元のＢＲＣＡ２タンパク質として実質的な生物活性を保持する薬剤または天然産物を意味する。ＢＲＣＡ２タンパク質の活性および機能に、活性導入、グラニン(granin)、ＤＮＡ修復などが含まれる。
【００４０】
“標的ポリヌクレオチド”は、所望の核酸配列、例えばＢＲＣＡ２コードポリヌクレオチドを意味する。当業者は、プライマーハイブリダイゼーションに使用できる他のプライマーを知るか、容易に確認し得る。
【００４１】
本発明はいくつかの実施態様においてつぎのものを含む。配列番号４、６、８、１０および１２のＢＲＣＡ２コード配列の単離されたＤＮＡ配列、配列番号５，７、９、１１、１３のＢＲＣＡ２タンパク質の配列、乳房および卵巣の癌の危険性を増大させない正常ＢＲＣＡ２遺伝子を有する者を同定する方法、ＢＲＣＡ２コード配列での変異の存在に由来する遺伝子感受性の増大を検出する方法、腫瘍を防止または治療する遺伝子療法を行う方法、腫瘍を防止または治療するタンパク質置換療法を行う方法、開示されたＢＲＣＡ２ｃＤＮＡおよびタンパク質配列の全体またはフラグメントを含有する診断薬。
【００４２】
配列決定
すべての核酸標本は、精製形態であろうと非精製形態であろうと、多形性または変異対立遺伝子を含む特殊な核酸配列を含有するか、または含有するかも知れない限り、出発の核酸として用いることができる。ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡは増幅し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは一重鎖あるいは二重鎖であり得る。ＲＮＡが鋳型として用いられる場合は、鋳型をＤＮＡへ逆転写するための酵素および／または適当な条件が用いられるであろう。更に、各一重鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリドが用いられる。核酸の混合物も用いられ、あるいは同一または異なるプライマーを用いてあらかじめ増幅反応で産生された核酸が用いられる。増幅された特殊な核酸配列、すなわち多形性および／または変異対立遺伝子は、より大きい分子の断片であり得たり、または個々の分子として最初は存在し得て、特殊な配列が完全な核酸を構成する。多様な増幅法が用いられる。例えば、ＤＮＡサンプルまたはそのフラグメントの複製可能ベクターへの連結、あるいは複製システムへの組込みによってＢＲＣＡ２遺伝子の少なくとも部分を含有すると思われるＤＮＡ複写数を増加する。増幅法にいわゆる“ショットガン・クローニング”も含まれる。増幅される配列が最初から純粋な形で存在することは必要でない。全ヒトＤＮＡ中に含まれるような複合混合物の小さい断片であり得る。
【００４３】
注意すべきことは、変異が存在するかどうかを調べるために全コード領域または全ＤＮＡフラグメントすらも配列決定する必要がないことである。例えば、ある変異が一家族員でわかっていると、他の家族員を試験したとき、配列決定によって、またはＡＳＯなどの他の変異検出システムによって、変異部位のみでの配列を調べることで十分である。
【００４４】
ここで用いられるＤＮＡは、血液、組織材料などの生物体サンプルから（Ｍaniatis，et.al．in Ｍolecular Ｃloning：Ａ Laboratory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，ＮＹ，p.280-281，1982）に記載のような様々な方法により抽出され得る。抽出されたサンプルが純粋でなければ、増幅の前に効果的な試薬量で処置して、細胞を開き、核酸の鎖を爆露および／または単離することができる。この鎖を爆露または単離する溶菌および核酸変性工程は、増幅がより迅速に起きるのを可能にする。
【００４５】
クローニングによる増幅のために、単離ＤＮＡをフラグメントに、制限エンドヌクレオターゼにより、またはＤＮＡ含有混合物をシリンジからの２５ゲージ針を通すせん断により分解して、１〜１．５ｋｂのフラグメントを調製する。次いでフラグメントを切断ベクター（ウイルス、プラスミド、トランスポソン、コスミドなど）に連結し、形成した形質転換ベクターをそのベクターに典型的な方法で複製する。
【００４６】
ＰＣＲ増幅のために、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートdＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰおよびdＴＴＰを、個々にまたはプライマーと共に、適当な量で、合成混合物に加え、得た溶液を約１−１０分間、好ましくは１−４分間、約９０−１００℃で加熱する。この加熱期間後、溶液を冷却する。これはプライマーハイブリデイションに好ましい。冷却した混合物にプライマー伸長反応を生じるのに適した薬剤（ここでは、“ポリメリゼイション剤”と呼ぶ）を加え、反応を当業者に知られた条件で生起せしめる。ポリメリゼイション剤も熱安定性であると、他の反応剤と共に加えることができる。この合成（増幅）反応は、室温またはポリメリゼイション剤がもはや機能しない上記温度で生じ得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼが反応剤として用いられたときは、温度は一般的に４０℃より大きくはない。最も好都合には、反応は室温で生じる。Ｔａｑなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたときは、高熱を使用できる。
【００４７】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、対象者が乳房または卵巣の癌になる危険性を有するかを調べるとき、および腫瘍の特性を調べるときに有用である。プライマーは配列決定前に標的ポリヌクレオチドの増幅を指示する。表IIに示すエキソン２−２７についてのこれら非反復ＢＲＣＡ２オリゴヌクレオチドを設計し、特異的につくって、配列決定すべきＢＲＣＡ２の部分の増幅を最適にした。
【００４８】
本発明の実施に用いられるプライマーは、ポリメリゼイションを開始するのに充分な長さと適当な配列のオリゴヌクレオチドを含む。合成を促進する環境条件は、ヌクレオチドトリホスフェート、ＤＮＡポリメラーゼなどのポリメリゼイション剤および適当な温度とpＨである。プライマーは、増幅に最も効率的には単鎖であるが、二重鎖でもよい。二重鎖のときは、伸長生産物を製造するのに用いる前に、プライマーはその鎖を分離するためにまず処置される。プライマーは、ポリメリゼイションの促進剤の存在下に伸長生産物の合成を始めるのに充分長くなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、緩衝剤およびヌクレオチドの組成を含む多くの要因に依存する。オリゴヌクレオチドは、典型的には１８−２８を含み、および便宜的にいくつかの場合にはＭ１３テイルをさらに含む。
【００４９】
本発明の実施に用いられるプライマーは、増幅されるべきゲノム座の各鎖に実質的に相補的であるように設計される。このことは、ポリメリゼイション剤が働く条件下で、各々の鎖にハイブリダイズするのに充分に相補的でなければならなことを意味する。換言すると、プライマーは変異を挟む５'および３'配列に充分に相補的であるべきで、それとハイブリダイズし、ゲノム座の増幅をもたらす。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、関与する反応段階数に比較して急増した量の多形性座を生産する酵素鎖反応である増幅過程において用いられる。典型的には、一つのプライマーが多形性座の負（−）鎖に相補的であり、他の一つが正（＋）鎖に相補的である。ＤＮＡポリメラーゼの大きいフラグメント（Ｋlenow）などの酵素で伸長による変性核酸およびヌクレオチドプライマーをアニーリングすることは、標的多形性座配列を含む新規合成の＋および−鎖をもたらす。これらの新規合成配列は鋳型でもあるので、変性のくりかえしサイクル、プライマーアニーリングおよび伸長は、プライマーで定義される領域（すなわち標的多形性座配列）の急増的な産生をもたらす。鎖反応の産物は、用いられる特殊なプライマーの末端に対応する終末を有する目立たない核酸２量体である。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、通常のホスホトリエステルおよびホスホジエステル方法またはその自動実施などの適当な方法を用いて調製される。一つのかかる自動実施において、ジエチルホスホルアミジットが出発物質として用いられ、Ｂeaucage，et al.，Ｔetrahedron Letters，２２：1859-1862，1981に記載のように合成される。修正された固体支持体でのオリゴヌクレオチドの合成の一つの方法が米国特許第４,４５８,０６６に記載されている。
【００５２】
ポリメリゼイション剤は、酵素を含み、プライマー伸長産物の合成を遂行する機能を有するいかなる化合物およびシステムでもあり得る。この目的のための適当な酵素としては、例えばＥ.coli ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのＫlenowフラグメント、ポリメラーゼミュテイン、逆トランスクリプターゼおよびＴaqポリメラーゼなどの熱安定性の酵素（すなわち、変性を起こすのに充分高い温度にかけた後にプライマー伸長をおこす酵素）を含む他の酵素がある。適当な酵素は、各多形性座核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物を形成するのに適した状態で、ヌクレオチドの結合を容易にする。一般に、合成は各プライマーの３'末に始まり、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５'末の方向に進み、相違する長さの分子を産生する。
【００５３】
新規合成の鎖およびその相補的核酸鎖は、上記したハイブリダイズ条件で二重鎖分子を形成し、このハイブリドは続く工程に用いられる。次の工程において、新規合成二重鎖分子は、一重鎖分子を提供するために、上記手法のいずれかを用いて、変性条件の対象とされる。
【００５４】
変性、アニーリングおよび伸長産物合成の工程は、標的多形性座核酸配列を検出に必要な程度にまで増幅するために、何度もくりかえされる。製造された特殊な核酸配列の量は急増して蓄積される。増幅については、ＰＣＲ.Ａ.Ｐractical Ａpproach，ＩＬＲ Ｐress，Ｅds.Ｍ.Ｊ.ＭcＰherson，Ｐ.Ｑurke，and Ｇ.Ｒ.Ｔaylor，1992．に記載されている。
【００５５】
増幅産物は、サザンブロット法により放射活性プローブを用いずに、検出される。この方法において、例えば、多形性座の核酸配列の非常に低レベルを含有するＤＮＡの小サンプルは、増幅され、サザンブロット法あるいは類似的にドットブロット法を用いて、解析される。非放射活性プローブまたはラベルの使用は、増幅シグナルの高レベルによって容易となる。別法として、増幅産物を検出するのに用いられるプローブは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素によって、直接的または間接的に検出可能なようにラベルされる。当業者は、プローブを結合する他の適当なラベルを知り、または通常実験で適当なラベルを確定することができるであろう。
【００５６】
本発明方法により増幅された配列は、ＰＣＲなどの特殊なＤＮＡ配列の検出に通常用いられる方法で、オリゴーマ制限（Ｓaiki，et.al.，Ｂio／Ｔechnology，3：1008-10102，1985)、対立遺伝子特異オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ解析法(Ｃonner，et.al.，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．U.S.A.，80：278，1983)、オリゴヌクレオチド連結反応検定（Ｌandgren，et.al.，Ｓcience，241：1007，1988）などによって、溶液において、または固体支持体に結合された後に、さらに検討され、検定され、クローン化され、配列決定される。ＤＮＡ解析の分子的手法は総説されている（Landgren，et.al.，Ｓcience，242：229-237，1988)。
【００５７】
好ましくは、増幅方法は、本明細書記載のように、かつ当業者に普通使用されているように、ＰＣＲによるものである。増幅の他の方法は、記述されており、本発明のプライマーＰＣＲにより増幅されたＢＲＣＡ２座が同様に他の手段で増幅される限り、使用することができる。かかる他の増幅系には、制限するわけでないが、望むＲＮＡの短い配列およびＴ７プロモーターで始まる自己保持配列複製がある。逆トランスクリプターゼは、ＲＮＡをcＤＮＡに複写し、ＲＮＡを変性し、次いでＤＮＡの第２鎖をポリメリゼーションする。
【００５８】
他の核酸増幅技術は、逆転写およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用い、２プライマーをそのサイクル標的とするように合体する核酸配列を基とする増幅（ＮＡＳＢＡ）である。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで始まり、いずれかで終わり、６０−９０分以内に１０8コピーに増幅する。他の方法として、核酸は連結反応活性転写（ＬＡＴ）により増幅することができる。ＬＡＴは、単鎖鋳型から、部分的に単鎖であり部分的に二重鎖である単一のプライマーに働く。増幅は、cＤＮＡをプロモーターオリゴヌクレオチドに連結することにより始まり、数時間で１０8−１０9となる。本発明方法で有用な他の増幅はＱβレプリカーゼ系である。Ｑβレプリカーゼ系は、ＭＤＶ−１と呼ばれるＲＮＡ配列を望むＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡに結合することにより、用いることができる。サンプルと混合するに際して、ハイブリドＲＮＡは、標本のmＲＮＡ中にその補体を見出し、望む指標アロング配列を複写するレプリカーゼを活性化して、結合する。他の核酸増幅技法であるリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）は、新しい標的を形成し、サンプル中の隣接配列の存在下にリガーゼにより共有結合された望む配列の２つの別個にラベルされた半分を用いる。修復鎖反応（ＲＣＲ）核酸増幅技術は、標的配列を幾何的に増幅するために、２つの相補的かつ標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ対、熱安定性ポリメラーゼおよびリガーゼ、およびＤＮＡヌクレオチドを用いる。Ａ２−塩基間隙は、オリゴヌクレオチドプローブ対を単離し、ＲＣＲは、ＤＮＡ修復を模倣して間隙を満たし結合せしめる。鎖置換活性化（ＳＤＡ）による核酸増幅は、標的ＤＮＡに結合する５'末上に短い張り出しを有するＨinkIIの認識部位を含む短いプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼは、硫黄含有アデニン類似体での張り出しの反対側のプライマーの部分を満たす。ＨinkIIは、加えられるが、非修飾のＤＮＡ鎖を切断するのみである。５'エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼは、ニックの部位に入り、そしてポリメリゼーションを開始し、最初のプライマー鎖を下流方向に置換し、よりプライマーとして働く新しいものを形成する。ＳＤＡは３７℃で２時間で１０7の以上の増幅を行う。ＲＣＲおよびＬＣＲと異なり、ＳＤＡは器具設置の温度サイクルを要しない。
【００５９】
他の方法は、精製されて、または核酸の混合物中に存在しているＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型から核酸配列を増幅する方法である。得た核酸配列は鋳型の正確なコピーであり、また修飾し得る。この方法は、特殊な核酸配列を複写する信頼性を増大し、単一検定で特定の点変異を効率的に検出するのを可能にすることにおいてＰＣＲより優れている。標的核酸は、鎖置換を回避しながら酵素的に増幅される。３プライマーが用いられる。第１のプライマーは標的の第１末端に相補的である。第２プライマーは標的の第２末端に相補的である。第３プライマーは、標的の第１末端に類似し、かつ第１プライマーの少なくとも一部に実質的に相補的であり、第３プライマーが第１プライマーとハイブリダイズしたときに、第１プライマーの５'末端の塩基に相補的な第３プライマーの位置が実質的に鎖置換を回避する修飾を含む。この方法は、Ｂhatnager et. al.,1997の米国特許第５,５９３,８４０（出典明示により本明細書の一部とする）に詳記されている。
【００６０】
最後に、ＤＮＡチップスまたはミクロ配置法の最新の応用によって、ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを小さい固体支持物に固定して、サンプルＢＲＣＡ２遺伝子を迅速に配列決定でき、その発現を分析できる。典型的には、ＤＮＡフラグメントの高密度配置をガラスまたはナイロンの基質上に、インシトウ光指向組み合せ合成によりつくるか、または通常の合成によりつくり固定化する（Fodor et al., 米国特許第５，４４５，９３４）。サンプルＤＮＡまたはＲＮＡをＰＣＲで増幅し、蛍光標識でラベルして、ミクロ配置にハイブリドできる。この技術の例は、米国特許第５，５１０，２７０および５，５４７，８３９（出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。
【００６１】
ＢＲＣＡ２遺伝子のすべてのエキソンまたは隣接イントロンの配列は、上記の方法で５人の正常者について端から端へ配列決定して取得し、得たデータを解析した。得たデータにより、ＢＲＣＡ２遺伝子の正しいイントロン／エキソン構造を確立した。さらに、前に公表された６種の正常な多形性（１３４２，２４５７，３１９９，３６２４，４０３５、７４７０）を集団における正確さと頻度について評価し、まえに特性化されていない追加の多形性（１０９３，１５９３，２９０８，９０７９）を同定した。
【００６２】
遺伝子治療
ＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン、全コード配列またはフラグメントのセンスまたはアンチセンス転写からのポリヌクレオチドは、遺伝子治療に使用できる。様々な方法が遺伝子転移について知られているが、そのいずれも利用できるであろう。
【００６３】
インビボでの組換えＤＮＡの直接注入：
１．“裸の”ＤＮＡをシリンジおよび針で特異的な組織に直接注入し、血管床を通して浸透し、またはカテーテルを通して内皮細胞に移行さす。
２．人工的脂質小胞または他の包含運搬体に含まれるＤＮＡを直接注入する。
３．ジフテリア抗原や抗体などの標的受容体組織を複合したＤＮＡを直接注入する。
４．ＤＮＡを金粒子上にコートし、細胞中に射入するものであり、粒子を爆撃的に直接注入する。
【００６４】
ヒト人工染色体
この新しい遺伝子運搬方法は、複製に基本的な要素および転移の望む遺伝子のみを含有するように、はがされたヒト染色体の使用を含む。
【００６５】
レセプター仲介遺伝子転移
ＤＮＡが特異的な細胞表面レセプターに結合する標的分子にリンクされ、ＤＮＡの哺乳動物細胞へのエンドサイト−シスおよび転移を誘発する。この技術の一つでは、アシアログリコタンパク質をＤＮＡにリンクするために、ポリ−Ｌ−リジンを用いる。アデノウイルスも複合体に加えられて、リソソームをこわし、ＤＮＡの変性を回避し、その核への移動を可能にする。これらの粒子の静脈内注入は肝細胞への遺伝子転移をもたらす。
【００６６】
組替えウイルスベクター
いくつかのベクターが遺伝子治療で用いられている。それらには、モノロニイ・ネズミ白血病ウイルス（ＭoＭＬＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ポックスウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクターがある。
【００６７】
遺伝子の置換および修復
遺伝性疾患の処置についての理想的な遺伝子操作法は、欠陥遺伝子をその遺伝子の正常なコピーで置きかえることである。相同組換えは、ＤＮＡのセクションを切りかえ、新しいもので置換することを意味する用語である。この技術により、欠陥遺伝子を機能的ＢＲＣＡ２腫瘍生長阻害タンパク質発現の正常な遺伝子で置換することができる。
【００６８】
遺伝子治療についての詳細な記載は、Ｇene Ｔherapy Ａ Ｐrimer Ｆor Ｐhysicians 2d Ｅd. by Ｋenneth Ｗ.Ｃulver，Ｍ.Ｄ. Ｐubl．Ｍary Ａnn Ｌiebert Ｉnc.(1996)にも記載されている。ＢＲＣＡ２について２種の遺伝子治療プロトコールがＪeffrey Ｔ.Ｈolt et al.組換えＤＮＡ諮問委員会で認められている。このプロトコールは、9602−148および9603−149としてリストされ、ＮＩＨから入手できる。単離されたＢＲＣＡ２は増幅産物から合成または組み立てられて、ＬＸＳＮベクターなどのベクターに挿入される。
【００６９】
ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはその機能的等価物
乳房および卵巣の癌の生長は、機能的ＢＲＣＡ２活性が機能的に不適当であることが、この癌の原因となっているＢＲＣＡ２タンパク質レベルを直接増加することにより、停止または防止できる。５種の新規ＢＲＣＡ２半数型のｃＤＮＡおよびアミノ酸の配列を開示する（配列番号４−１３）。ＢＲＣＡ２の全体およびフラグメントは乳房および卵巣の癌についての治療的または予防的処置に用いられる。かかるフラグメントは、ＢＲＣＡ２遺伝子の天然ＢＲＣＡ２タンパク質に類似の生物機能を有し，または下記に特定するような望ましい生物機能を有し得る。ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたは相同あるいは修飾のポリペプチド配列を含むその機能的等価物も本発明の範囲内にある。元の配列の変化は、乳房および卵巣の癌の治療的または予防的処置に適したＢＲＣＡ２誘導ポリペプチドまたは機能的等価物を生産または使用するのに、好都合である。例えば、この変化が望ましいのは、インビボタンパク質分解性開裂に対する抵抗性をつくるために、治療薬を容易に移行または運送するために、腫瘍抑制剤を局在せしめ集中するために、または標的種を発現，単離、精製するためにである。
【００７０】
活性ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたは機能的等価物を腫瘍生長阻害剤として生産する方法は、多様である。例えば、１以上のアミノ酸を、よく知られた方法（Maniatis et al.,1982）で置換、欠失または挿入する。アミノ酸の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性を考慮することが、意図する処置に適した相同ポリペプチド変化を設計するのに重要である。特に、関連の側鎖構造および電荷のアミノ酸を使用する同類アミノ酸置換で、化学的および生物的性質を保持することができる。相同ポリペプチドは元の配列に少なくとも７０％の相同性を典型的には含有する。ポリペプチドの非天然型も、修飾が実質的な生物活性を保持している限り、組込むことができる。このような非天然ポリペプチドは、構造類似の化学的薬剤を典型的に含み、元のＢＲＣＡ２タンパク質の活性領域として類似の三次元構造を有する。例えば、これらの修飾には、末端Ｄ−アミノ酸、環状ペプチド、非天然アミノ酸側鎖、プソイドペプチド結合、Ｎ末アセチル化、グリコシル化およびビオチン化などがある。これらのペプチドの非天然型は望ましい生物機能を有する。例えば、細胞性または血清性のプロテアーゼおよびエキソペプチダーゼの存在で特に強い。効果的なＢＲＣＡ２ポリペプチドまたは機能的等価物は、元のＢＲＣＡ２タンパク質の還元によっても得られる。ＢＲＣＡ２タンパク質の領域を系統的に欠失し、どの領域が腫瘍生長阻害活性に欠かせないかを同定する。次いで、ＢＲＣＡ２タンパク質のこのような小さいフラグメントを構造的または機能的に修飾し、治療的または予防的に効果的なものを誘導する。最後に、薬剤、天然産物または小分子を選別または合成して、ＢＲＣＡ２タンパク質の機能を模倣する。典型的には、活性種は三次元形態と化学的活性を保持し、それでもって天然ＢＲＣＡ２タンパク質の生物活性の望ましい相を保持する。ＢＲＣＡ２の活性および機能には、活性移行、グラニン、ＤＮＡ修復などがある。ＢＲＣＡ２の機能について、Bertwistle and Ashworth, Curr. Opin. Genet. Dev. 8(1): 14-20 (1998)およびZhang et al., Cell 92: 433-436 (1998)にも総説されている。当業者に明らかなように、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたは機能的等価物の選択は、かかるポリペプチドまたは機能的等価物が天然ＢＲＣＡ２タンパク質と類似の生物活性を有することでなされる。
【００７１】
宿主細胞におけるＢＲＣＡ２タンパク質およびポリペプチドの発現
ＢＲＣＡ２タンパク質およびポリペプチドの全体またはフラグメントの生産は、外来遺伝子の複製および発現を指示し得る宿主細胞でなされ得る。適当な宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞または高等な真核細胞があり、意図するＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを生産するための１以上の調節配列に操作的に連結したＢＲＣＡ２ｃＤＮＡ配列の全体またはフラグメント（配列番号４，６、８、１０、１２）を含む発現ベクターを含有する。原核細胞には、グラム陽性またはグラム陰性菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉやＢａｃｉｌｌｕｓ株がある。例えば、ＣＯＳ、ＭＣＦ７、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＨＢＬ１００、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６細胞などのＳｆ９昆虫細胞およびヒト細胞系がある。
【００７２】
広範な適当な発現ベクターが当技術で用いられる。発現ベクターは、複製起点、プロモーター、表現型選択遺伝子（抗生物質抵抗性や栄養要求性）およびＢＲＣＡ２タンパク質の全体またはフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含有する。発現ベクターはまた、当技術で知られた他の操作的に結合する調節ＤＮＡ配列を含み得る。例えば、安定リーダー配列、分泌リーダー配列、制限酵素開裂配列、ポリアデニル化配列、終了配列などである。発現ベクターの必須および調節因子は、意図する宿主に適合しなければならない。望ましいコードおよび調節領域を含有する適当な発現ベクターは、当技術で知られる標準的組換えＤＮＡ法を用いて構築される。このような技法の多くは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)に記載されている。例えば、適当な複製起点には、ＣｏｌＥ１、ウイルス性ＳＶ４０およびＭ１３複製起点がある。適当なプロモーターは、構成的あるいは誘導的であって、例えば、ｔａｃプロモーター。ｌａｃＺプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＴＶプロモーターおよびＬＸＳＮプロモーターである。選択マーカーの例としては、ネオマイシン、アンピシリン、ヒグロマイシンの抵抗性などがある。多くの適当な原核細胞性、ウイルス性および哺乳動物の発現ベクターは、市販されており、例えばInvitrogen Corp., San Diego, CA またはClontech, Palo Alto, CA から入手できる。望ましくは、ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドは融合タンパク質として生産され、選択した宿主細胞での発現を高め、トランスフェクトされた細胞での発現を検出し、精製方法を簡素化する。ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドの適当な融合相手は、当技術でよく知られており、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびポリヒスチジンｔａｇなどである。
【００７３】
発現ベクターは種々の既知技術で宿主細胞に導入される。形質転換方法は、形質転換すべき宿主によって異なる。ベクターの宿主細胞への導入方法には、リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション、デキストラン調節トランスフェクション、リポソーム封入、核微注入、ウイルスまたはファージ感染などがある。
【００７４】
発現ベクターが適当な宿主細胞に導入されると、多量のＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを発現し得る条件で宿主細胞を培養できる。発現産物の同定は既知の多くの方法でなすことができる。例えば、ＰＣＲによる増幅後の配列決定、望むＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーション、酵素活性や抗生物質抵抗などのマーカーー遺伝子機能の有無、意図した配列をコードするｍＲＮＡ生産のレベル、ウエスタンブロティングやＥＬＩＳＡなどのモノクローナルポリクローナル抗体を用いた遺伝子産物検出法がある。このようにして生産されたＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを細胞溶解後に単離し、既知の種々のタンパク質精製法で精製する。精製法には、例えばイオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過クロマトグラフィ−およびイムノアフィニティイクロマトグラフィ−がある。
【００７５】
一般的に好ましいのは、いつもできるだけ、長いフラグメントのＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを用いることで、特にＢＲＣＡ２の所望の機能的ドメインを用いる。ＤＮＡの短いフラグメントの発現は、アンチＢＲＣＡ２抗体の生産のためのＢＲＣＡ２誘導免疫原をつくるのに有用である。当然のことであるが、すべての発現ベクター、ＤＮＡ調節配列または宿主細胞が、本発明のＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを発現するのに等しくよく機能するわけでない。しかし、当業者は、余分な実験なしに既知の技術を用いて発現を最大化するために、発現ベクター、ＤＮＡ調節配列、宿主細胞およびコドン使用を選択できるであろう。ＢＲＣＡ２タンパク質機能の研究およびＢＲＣＡ２タンパク質の遺伝操作の例については、つぎの２論文に総説されている。Berwistle and Asworth, Curr. Opin. Genet. Dev. 8(1): 14-20 (1998)およびZhang et al., Cell 92: 433-436 (1998)。
【００７６】
インビトロ合成および化学合成
ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドのフラグメントが原核または真核の宿主細胞によって得られることは好ましいが、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはその機能的等価物は当業者に既知の方法によるインビトロ翻訳または合成手段でも得ることができる。例えば、インビトロ翻訳では、ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドのフラグメントをコードするＤＮＡ配列によりコードされたｍＲＮＡを用いる。固相合成などの化学合成法を用いて、ＢＲＣＡ２ポリペプチド構造模擬体およびその化学的修飾類似体を合成する。このようにつくられたポリペプチドまたはその修飾模擬体を単離し、種々の精製法で精製する。精製法には、例えばイオン交換クロマトグラフィ−、ゲル濾過クロマトグラフィ−およびイムノアフィニティイクロマトグラフィ−がある。
【００７７】
タンパク質置換療法
ＢＲＣＡ２の腫瘍抑制機能からして、種々のＢＲＣＡ２タンパク質標的療法が乳房および卵巣の癌における腫瘍を治療または予防するのに用いられ得る。したがって、本発明は、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチドまたはその機能的等価物を含有する医薬組成物を用いて乳房または卵巣の癌を治療的または予防的に処置することを含む。例えば、タンパク質置換療法には、薬学的に効果的な担体中のＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチドまたはその機能的等価物を直接的に投与することが含まれる。あるいは、タンパク質置換療法では、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチドまたはその機能的等価物のフラグメントに融合した腫瘍抗原特異的抗体を用い、抗癌剤を腫瘍細胞に特異的に運ぶ。
【００７８】
本発明の医薬組成物をつくるには、活性のＢＲＣＡ２タンパク質、ＢＲＣＡ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を、通常の製薬技術により選択し製造した担体と組み合す。適当な量の組成物を腫瘍部位に局所的に、または全身的に投与して、腫瘍細胞の増殖を止める。投与方法には、当技術での確立したプロトコールに従って非経口、経口または静脈内などがある。
【００７９】
組成物を高めたり安定化したり、また組成物の製造を容易にする薬学的に許容される固体または液体の担体または成分として、限定ではないが、シロップ、水、等張液、５％グルコース水溶液、酢酸ナトリウムまたはアンモニウムの緩衝液、油、グリセリン、アルコール類、香料、保存剤、着色剤、デンプン、砂糖、希釈剤、果粒化剤、滑沢剤、結合剤および徐放化剤がある。医薬組成物の投与量は、広い範囲で変動するが、癌の進行段階、患者の年齢や状態などに依存し、個々に調整される。
【００８０】
診断薬
ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物、抗体およびポリヌクレオチドは、遺伝子治療やタンパク質置換療法以外に広範な用途がある。診断薬として用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでＢＲＣＡ２の正常または異常な活性を測定できる。従って、本発明は、配列番号４−１３のＢＲＣＡ２ｃＤＮＡおよびタンパク質配列から誘導される診断薬を含む。この診断薬は、疾患の進行の監視、患者が遺伝子またはタンパク質置換療法に適しているかの決定、療法後の腫瘍増殖阻害剤の存在検定または定量などの方法に用いられる。かかる方法には通常の組織化学的技術が含まれ、患者からの腫瘍組織の取得、腫瘍の増殖または代謝からの抽出物の作成およびその試験などがある。例えば、腫瘍増殖試験には通常の診断アッセイを用いた異常ＢＲＣＡ２活性の測定が含まれる。このアッセイは、サザン、ノーザンおよびウエスタン・ブロティング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫沈降法などである。腫瘍組織の生検において、腫瘍組織におけるＢＲＣＡ２発現の喪失をＲＮＡレベルでＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロッチングで確認できる。サザンブロット、ゲノムＰＣＲまたはインシツ・ハイブリダイゼーションの蛍光（ＦＩＳＨ）によっても、ＤＮＡレベルでＢＲＣＡ２の変異を調べられる。ウエステンブロッティング、タンパク質切断アッセイあるいは免疫沈降法を用いて、タンパク質レベルでの効果を検査できる。
【００８１】
これらの診断薬は、検出される標識に共有的または非共有的に結合している。このような標識には、放射活性標識、比色酵素標識、蛍光標識またはエピトープ標識がある。しばしば、調節配列の下流レポーター遺伝子は、ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドと融合して、標的種の検出または精製を容易にする。ＢＲＣＡ２融合タンパク質において普通に用いられるレポーターに、β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ遺伝子がある。
【００８２】
ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物、抗体およびポリヌクレオチドは、ＢＲＣＡ２タンパク質の特性の試験にも有用である。癌の原因におけるＢＲＣＡ２の組織および機能、または正常または癌性の細胞におけるＢＲＣＡ２タンパク質の局在の試験に有用である。例えば、酵母の２種のハイブリド系がＢＲＣＡ２の細胞機能の研究に用いられて、ＢＲＣＡ２腫瘍抑制機能の調節体または作用体が同定されている（Sharan et al., Nature 386: 804-810b (1997) and Katagiri et al., Genes, Chromosomes & Cancer 21: 217-222(1988)）。さらに、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物、抗体およびポリヌクレオチドは、インビボ細胞に基づくアッセイおよびインビトロ細胞なしのアッセイで用いられて、ＢＲＣＡ２タンパク質機能を模倣、調節または促進する天然産物または合成化合物を選別する。
【００８３】
アンチセンス阻害
内在性ＢＲＣＡ２発現のアンチセンス抑制でもって、既知の技術（Crooke, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 329-376(1992)およびRobinson-Benion and Holt, Methods Enzymol. 254: 363-375 (1995)）を用いて細胞成長阻害に対するＢＲＣＡ２の作用が調べられる。配列番号４，６、８、１０、１２のｃＤＮＡから、野生型ＢＲＣＡ２タンパク質または成熟型ＢＲＣＡ２タンパク質の
生産に関与するＤＮＡまたはＲＮＡの配列のアンチセンス鎖を当業者は容易に得ることができる。あるいは、ＢＲＣＡ２の制御配列を標的とするようにアンチセンス・オリゴヌクレオチドを設計して、外因性ＢＲＣＡ２遺伝子の発現を低下または防止できる。
【００８４】
抗体
ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物を免疫原として用い、既知の方法で（Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988）ＢＲＣＡ２誘導抗原に結合し得るポリクロナールまたはモノクロナール抗体をつくることができる。この抗体は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイおよび免疫細胞化学法などのイムノアッセイで、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物を検出するのに用いられる。典型的には、アンチＢＲＣＡ２抗体は、溶液の形であるか、プレート、粒子、ビードまたはチューブなどの固体表面に接着している。抗体はＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドを含有するかもしれないサンプルまたはブロットに接触すると、最初の免疫複合体を形成する。十分にインキュベーションした後、最初の免疫複合体を水洗し、非特異的結合種を除去する。特異的に結合したＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドの定量は、放射活性、蛍光または酵素標識などの結合標識またはマーカーの検出を用いる。あるいは、ＢＲＣＡ２誘導抗原の検出は、このような標識またはマーカーに結合している第２抗体を用いて、第２免疫複合体を形成して行える。抗体は、ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチド、これらの機能的等価物を単離または精製するためのアフィニティイクロマトグラフィ−で使用できる。
【実施例】
【００８５】
実施例１
正常人のＢＲＣＡ２遺伝子のコード配列半数型の決定
肉親 (すなわち、一等および二等の親族）が癌の経歴をもたない個体を同定するために約１５０人の志願者を審査した。各人に下記の表Ｉに示される『遺伝性癌を事前選別試験するためのアンケート』に答えてもらった。ＢＲＣＡ２遺伝子の全配列を決定するために、これらの中の５人を任意に選んだ。一等の親族は両親、兄弟または子である。二等の親族は、おば、おじ、祖父母、孫、めい、甥または半兄弟である。
【００８６】
上記の質問に対する返答を解析して選んだ５人の正常人の白血球細胞から、ゲノムＤＮＡを単離した。ジデオキシ配列解析をポリメラーゼ連鎖反応増幅後に行った。
ＢＲＣＡ２遺伝子の全てのエキソンは、このＤＮＡサンプルから増幅した一本鎖産物を生ぜしめるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて不斉増幅することによる、直接ジデオキシ配列解析の対象とした。Shuldiner、et al.、Handbook of Techniques in Endocrine Research、p.457-486、DePablo、F.、Scanes、C.、監修、Academic Press、Inc.、1993。Taq Dye TerminatorKit（Perkin-Elmer（登録商標） 商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素を結合させた。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）自動シークエンサー（モデル３７７）の正および逆の両方向で行った。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター”であった。
【００８７】
１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）を５正常個体の白血球細胞から抽出した。５個のサンプルの各々を端から端まで配列決定した。各サンプルを、１μｌ（１００ｎｇ）ゲノムＤＮＡ、２.５μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８.３、５００ｍＭＫＣｌ、１.２ｍＭＭｇＣｌ2）、２.５μｌ １０×ｄＮＴＰ混合（２ｍＭ各ヌクレオチド）、２.５μｌ正のプライマー、２.５μｌ負のプライマー、および１μｌＴａｑポリメラーゼ（５単位）、および１３μｌ水を含む最終容量２５μｌで増幅した。
【００８８】
下の表IIのプライマーを使用して、様々な分画のＢＲＣＡ２遺伝子のサンプルを増幅した。プライマーは、ＤＮＡ／ＲＮＡモデル３９４（登録商標）シンセサイザーで合成した。
【００８９】
３５サイクルを行い、各々は、変性（９５℃；３０秒）、アニーリング（５５℃；１分）、および伸長（７２℃；９０秒）から構成され、ただし、始めのサイクルでは変性時間を５分に増やし、最後のサイクルでは伸長時間を５分に増やした。
【００９０】
ＰＣＲ産物は、Qia-quick（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Qiagen 商品番号28104；Chatsworth、CA）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の収率および純度は、ベックマンＤＵ６５０分光光度計においてＯＤ260で分光光度的に測定する。
【００９１】
２．ジデオキシ配列解析
Taq Dye Terminator Kit（Perkin-Elmer（登録商標） 商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素をＰＣＲ産物に結合させた。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）Foster City、CA.、自動モデル３７７（登録商標）シークエンサーを用いて正および逆の両方向で行った。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター（登録商標）”であった。
【００９２】
３．結果
５人の正常人の配列に基づいて、ジーンバンクとBICの両方の標準配列が正しくないことを決定した。ジーンバンクでは、１０塩基伸長（5'-TTTATTTTAG-3'）をエキソン５の５’末端で、誤ってエキソンとして挙げているが、これはｃＤＮＡおよび得られたタンパク質中に含まれないのでイントロンとすべきである。加えて、乳癌の不正確な診断を招きかねない問題の大きい誤りが、ジーンバンクとBICとの両方に存在する：（5'-GTGTTCTCATAAACAG-3'）の１６塩基対配列はエキソン１５の終了部であると考えられるが、しかるに、データベース中ではエキソン１６の開始部として挙げている。ジーンバンクの開示および表を図１に示す。ＢＲＣＡ２の正しいイントロン／エキソン配列を図２に示す。この中で、
（１）１０塩基伸長（5'-TTTATTTTAG-3'）は、エキソン５の５’末端というよりはむしろイントロン４の３’末端におけるイントロンである（訂正したエキソン５を配列番号：１に示す）、および
（２）１６塩基伸長（5'-GTGTTCTCATAAACAG-3'）は、エキソン１６の５’末端というよりはむしろエキソン１５の３’末端におけるイントロンである（訂正したエキソン１５および１６を、それぞれ配列番号：２および３に示す）。
【００９３】
BIC ＢＲＣＡ２配列もまた、CGTTTGTGT（アミノ酸：Arg-Leu-Cys）で示される５５５４−５４６０位置における９つのヌクレオチドの伸長で、配列の誤りがある。これらの位置の正しい配列はGTTTGTGTT（アミノ酸：Val-Cys-Val）である。加えて、BIC ＢＲＣＡ２ヌクレオチドの２０２４位置（コドン５９９）、４５５３（コドン１４４２）、４８１５（コドン１５２９）、５８４１（コドン１８７１）、および５９７２（コドン１９１５）は、T、T、A、C、およびTであるが、これらの位置の正しいヌクレオチドはそれぞれC、C、G、TおよびCである。この中で、コドン５９９、１４４２、１９１５のヌクレオチドの誤りは、アミノ酸の変化をもたらす。
【００９４】
５人の正常人の核酸における更なる違いが１０の多形性座中で判明した。この変化および位置を表IIIに示す。ＢＲＣＡ２の各染色体の個別の半数型を図３に示す。各例について、ジーンバンクで報告された最初の半数型（アクセス番号 U43746）を参考にして、新たな半数型ＯＭＩ １−５を決定した。その結果、ジーンバンクの配列は、次の５種の半数型の５０％のみを示すにすぎない；５つの新たなＢＲＣＡ２(OMI 1-5)ＤＮＡ配列を各配列番号：４、６、８、１０、および１２に示し（図３参照）、関連するポリペプチドを各配列番号：５、７、９、１１、および１３に示す。組み合わせて、これらの７つの半数型はＢＲＣＡ２遺伝子の対立遺伝子像表わす。
【００９５】
このデータによると、各サンプルにおいて、１０の多形性領域を除いてＢＲＣＡ２のエキソン全部が同一である。これらの多形性のうち６種は以前に同定されている（Tartigan et al., Nature Genetics 12: 333-337 (1996) ; Phelan et al., Nature Genetics 13: 120-122 (1996); Couch et al., Nature Genetics 13: 123-125 (1996); Teng, et al., Nature Genetics 13: 241-244 (1996); Schubert et al 60: 1031-1040 (1997)）。しかし、４種は本発明独特である。各多形性を同定することができるが、これらの完全な半数型は何れも過去に決定されていない。
【００９６】
【表１】
【００９７】
表１の続き
【表２】
【００９８】
表１の続き
【表３】
【００９９】
表１の続き
【表４】
【０１００】
表１の続き
【表５】
【０１０１】
表１の続き
【表６】
【０１０２】
表１の続き
【表７】
【０１０３】
表２
【表８】
【０１０４】
表２の続き
【表９】
【０１０５】
表２の続き
【表１０】
【０１０６】
表２の続き
【表１１】
【０１０７】
表２の続き
【表１２】
【０１０８】
表３
【表１３】
【０１０９】
表３の続き
【表１４】
【０１１０】
実施例２
ＢＲＣＡ２(omi 1-5)および参考としての１０の多形性を用いた正常個体の決定
遺伝子感受性試験の当業者は、本発明が以下事項に有用であることがわかるであろう：
ａ）正常のＢＲＣＡ２遺伝子を有する個体の同定；
ｂ）正常人群にみられる正常の多形性を読み誤ることの回避；
【０１１１】
配列決定は、問題となっている患者の血液を用いて実施例１のように行う。しかしながら、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列を参考のために使用し、患者にみられる多形性部位を、各多形性部位の正常コドンについて上記した核酸配列と比較する。正常サンプルは、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列に匹敵するものであり、ただ小多形性部位でおこる小さい変化の１つを含む。各多形性部位であらわれる対立変化は、参考のために対にする。
・１０９３位のＡＡＴ(Ａｓｎ)およびＣＡＴ(Ｈｉｓ)、(コドン ２８９)
・１３４２位のＣＡＴ(Ｈｉｓ)およびＡＡＴ(Ａｓｎ)、(コドン ３７２)
・１５９３位のＴＣＡ(Ｓｅｒ)およびＴＣＧ(Ｓｅｒ)、(コドン ４５５)
・２４５７位のＣＡＴ(Ｈｉｓ)およびＣＡＣ(Ｈｉｓ)、(コドン ７４３)
・２９０８位のＧＴＡ(Ｖａｌ)およびＡＴＡ(ｌｌｅ)、(コドン ８９４)
・３１９９位のＡＡＣ(Ａｓｎ)およびＧＡＣ(Ａｓｐ)、(コドン ９９１)
・３６２４位のＡＡＡ(Ｌｙｓ)およびＡＡＧ(Ｌｙｓ)、(コドン １１３２)
・４０３５位のＧＴＴ(Ｖａｌ)およびＧＴＣ(Ｖａｌ)、(コドン １２６９)
・７４７０位のＴＣＡ(Ｓｅｒ)およびＴＣＧ(Ｓｅｒ)、(コドン ２４１４)
・９０７９位のＧＣＣ(Ａｌａ)およびＡＣＣ(Ｔｈｒ)、(コドン ２９５１)
【０１１２】
これらの多形性対を使用すると、当業者が、正常の変異を多形性変異と間違えることなく正しく多形性変異を解釈できることが一層確かになる。
ＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン全ては、このＤＮＡサンプルから増幅した一本鎖産物を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて不斉増幅し、直接ジデオキシ配列解析に供する。Shuldiner、et al.、Handbook of Techniques in Endocrine Research、p.457-486、DePablo、F.、Scanes、C.、監修、Academic Press、Inc.、1993。Taq Dye Terminator Kit（Perkin-Elmer（登録商標） 商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素を結合させた。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）自動シークエンサー（モデル３７７）の正および逆の両方向で行った。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター”である。
【０１１３】
１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
患者のサンプルであるＢＲＣＡ２遺伝子を増幅するために使用するＰＣＲプライマーを表IIに示す。プライマーをＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーモデル３９４（登録商標）で合成した。３５サイクルで増幅し、各々は、変性（９５℃；３０秒）、アニーリング（５５℃；１分）、および伸長（７２℃；９０秒）から構成され、ただし、始めのサイクルでは変性時間を５分に増やし、最後のサイクルで伸長時間を５分に増やす。
【０１１４】
ＰＣＲ産物をQia-quick（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Qiagen（登録商標）、商品番号28104；Chatsworth、CA）を用いて精製する。ＰＣＲ産物の収率および純度は、ベックマンＤＵ６５０分光光度計においてＯＤ260で分光光度的に測定した。
【０１１５】
２．ジデオキシ配列解析
Taq Dye Terminator Kit（Perkin-ELmer（登録商標）、商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素をＰＣＲ産物に結合させる。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）Foster City、CA.、自動モデル３７７（登録商標）シークエンサーの正および逆の両方向で行う。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター（登録商標）”である。ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列を比較の標準物としてシークエンスナビゲーターソフトウェアに、連続的に入れる。シークエンスナビゲーターソフトウェアは、１塩基ごとに患者のサンプル配列を各ＢＲＣＡ２(omi 1-5)標準物と比較する。シークエンスナビゲーターは、標準物と患者のサンプルの配列との間の全ての相違を明らかにする。
【０１１６】
一番目の技術者が、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)標準物を患者のサンプルと視覚的に比較することによりコンピューター化された結果を調べ、再び標準物とサンプルの間のあらゆる差異を明白にする。次いで、一番目の技術者が、配列に沿って各位置における配列の変化を読む。各配列変異のクロマトグラムは、シークエンスナビゲーターにより作成され、カラープリンターに印刷される。ピークは、一番目の技術者および二番目の技術者がよむ。次いで、二番目の技術者はクロマトグラムを再試験する。最後に、結果を遺伝学者がよむ。各々の場合において、変異は、位置および塩基変化が既知の正常多形性と比較される。
【０１１７】
３．結果
患者のＢＲＣＡ２配列は７つのヌクレオチド位：１０９３(Ａ/Ｃ)、１３４２(Ａ/Ｃ)、１５９３(Ａ/Ｇ)、２４５７(Ｃ/Ｔ)、２９０８(Ａ/Ｇ)、３１９９(Ａ/Ｇ)および９０７９(Ａ/Ｇ)で異種接合体であることが判明した。加えて、これはポリペプチド産物で５つのアミノ酸を変化させる：コドン２８９のＡｓｎをＨｉｓへ、コドン３７２のＡｓｎをＨｉｓへ、コドン８９４のＶａｌをＩｌｅへ、コドン９９１のＡｓｎをＡｓｐへ、およびコドン２９５１のＡｌａをＴｈｒへ変化させる。これらの変化の何れかまたは全てが患者にとって意味があるのであろうかという疑問が生じる。
患者の結果とＢＲＣＡ２(omi 1-5)半数型とを比較すると、ＢＲＣＡ２omi標準物（＃５）の一つと合わさることがはっきりとする。従って患者のサンプルは、乳癌の危険性を増大することのない正常な遺伝子配列を保持していると、解釈される。
【０１１８】
実施例３
ＢＲＣＡ２(omi 1-5)を用いたＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン１１における変異の存在の決定
遺伝子感受性試験の当業者はわかるように、本発明は、ＢＲＣＡ２遺伝子において既知または未知の変異の存在を決定するのに有用である。ＢＲＣＡ２の変異の一覧表は乳癌情報機関のhttp://www.nchgr.nih.gov/dir/lab_transfer/bic.で公共的に入手できる。この情報機関は１９９５年１１月１日に公共的に使用できるようになった。Friend、S.et al.Nature Genetics 11:238、(1995)。
【０１１９】
本実施例で、エキソン１１の変異は、変異領域を増幅するプライマーを設置すると変異領域を増幅するという特徴がある。問題の患者の血液サンプルを使用して、実施例１と同様に配列決定を行なった。特にＢＲＣＡ２遺伝子のエキソン１１は、このＤＮＡサンプルから増幅した一本鎖産物を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて不斉増幅し、直接ジデオキシ配列決定する。Shuldiner、et al.、Handbook of Techniques in Endocrine Research、p.457-486、DePablo、F.、Scanes、C.、監修、Academic Press、Inc.、1993。Taq Dye TerminatorKit（Perkin-Elmer（登録商標）、商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素を結合させた。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）自動シークエンサー（モデル３７７）の正および逆の両方向で行った。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター”である。
【０１２０】
１．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅
該体の白血球から抽出したゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）は、１μｌ（１００ｎｇ）ゲノムＤＮＡ、２.５μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８.３、５００ｍＭＫＣｌ、１.２ｍＭＭｇＣｌ2）、２.５μｌ １０×ｄＮＴＰ混合（２ｍＭ各ヌクレオチド）、２.５μｌ正のプライマー（ＢＲＣＡ２−１１Ｑ−Ｆ、１０μＭ溶液）、２.５μｌ負のプライマー（ＢＲＣＡ２−１１Ｑ−Ｒ、１０μＭ溶液）、および１μｌＴａｑポリメラーゼ（５単位）、および１３μｌ水を含む最終容量２５μｌにおいて増幅する。
【０１２１】
エキソン１１のセグメントＱ（６１７４del T1変異がある）を増幅するのに使用するＰＣＲプライマーを以下示す。
ＢＲＣＡ２-１１Ｑ-Ｆ：5'-ACG'AAA'ATT'ATG'GCA'GGT'TGT-3'
ＢＲＣＡ２-１１Ｑ-Ｒ：5'-CTT'GTC'TTG'CGT'TTT'GTA'ATG-3'
【０１２２】
プライマーをＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーモデル３９４（登録商標）で合成する。３５サイクルで行ない、各々は変性（９５℃；３０秒）、アニーリング（５５℃；１分）、および伸長（７２℃；９０秒）から構成され、ただし、始めのサイクルでは変性時間を５分に増やし、最後のサイクルで伸長時間を５分に増やす。
ＰＣＲ産物をQia-quick（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Qiagen（登録商標）、商品番号28104；Chatsworth、CA）を用いて精製する。ＰＣＲ産物の収率および純度は、ベックマンＤＵ６５０分光光度計においてＯＤ260で分光光度的に測定する。
【０１２３】
２．ジデオキシ配列解析
Taq Dye Terminator Kit（Perkin-ELmer（登録商標）、商品番号 401628）を用いて、自動配列決定するために蛍光色素をＰＣＲ産物に結合させる。ＤＮＡ配列決定は、Applied Biosystems、Inc.（ABI）Foster City、CA.、自動シークエンサー（モデル３７７）の正および逆の両方向で行う。得られたデータの解析に使用したソフトウェアは、ＡＢＩから購入した“シークエンスナビゲーター（登録商標）”である。ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列を比較の標準物としてシークエンスナビゲーターソフトウェアに入れる。シークエンスナビゲーターソフトウェアは、１塩基ごとにサンプル配列をＢＲＣＡ２(omi)標準物と比較する。シークエンスナビゲーターソフトウェアは、ＢＲＣＡ２(omi)正常ＤＮＡ配列と患者のサンプルの配列との間の全ての相違を明らかにする。
【０１２４】
一番目の技術者が、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)標準物を患者のサンプルと視覚的に比較することによりコンピューター化された結果を調べ、再び標準物とサンプルの間のあらゆる差異を明白にする。次いで、一番目の技術者が、配列に沿って各位置における配列の変化を読む。各配列変異のクロマトグラムは、シークエンスナビゲーターにより作成され、カラープリンターに印刷される。ピークは、一番目の技術者および二番目の技術者もよむ。次いで、二番目の技術者はクロマトグラムを再試験する。最後に、結果を遺伝学者がよむ。各々の場合において、配列変異は、位置および塩基変化が既知の正常な多形性と比較される。ＢＲＣＡ２で起こる１０のフラグメントの多形性は：
・１０９３位のＡＡＴ(Ａｓｎ)およびＣＡＴ(Ｈｉｓ)、(コドン ２８９)
・１３４２位のＣＡＴ(Ｈｉｓ)およびＡＡＴ(Ａｓｎ)、(コドン ３７２)
・１５９３位のＴＣＡ(Ｓｅｒ)およびＴＣＧ(Ｓｅｒ)、(コドン ４５５)
・２４５７位のＣＡＴ(Ｈｉｓ)およびＣＡＣ(Ｈｉｓ)、(コドン ７４３)
・２９０８位のＧＴＡ(Ｖａｌ)およびＡＴＡ(ｌｌｅ)、(コドン ８９４)
・３１９９位のＡＡＣ(Ａｓｎ)およびＧＡＣ(Ａｓｐ)、(コドン ９９１)
・３６２４位のＡＡＡ(Ｌｙｓ)およびＡＡＧ(Ｌｙｓ)、(コドン １１３２)
・４０３５位のＧＴＴ(Ｖａｌ)およびＧＴＣ(Ｖａｌ)、(コドン １２６９)
・７４７０位のＴＣＡ(Ｓｅｒ)およびＴＣＧ(Ｓｅｒ)、(コドン ２４１４)
・９０７９位のＧＣＣ(Ａｌａ)およびＡＣＣ(Ｔｈｒ)、(コドン ２９５１)
【０１２５】
３．結果
上記のＰＣＲ増幅および標準蛍光配列決定法を用いて、６１７４ｄｅｌＴ変異を発見し得る。変異は非対の配列変化の鎖長で示される。このような長い誤対合の形態は欠失および挿入で生じる。この変異は、変異の命名に提案されている命名法、Baudet、A et al.、Ｈuman Mutation 2:245-248、(1993)に従って命名される。ＢＲＣＡ２遺伝子のコドン１９８２の６１７４ｄｅｌＴ変異は、エキソン１１のセグメント“Ｑ”でおこる。このＤＮＡ配列決定の結果により、ＢＲＣＡ２(omi 1-5)配列の６１７４ヌクレオチドでＴの１つの塩基対が欠失していることが実証される。この変異はＢＲＣＡ２転写産物の正常なリーディングフレームを阻害し、その結果コドン２００３位でインフレームターミネーター（ＴＡＧ）が現れる。それ故、この変異は、切断されて、おそらく機能しないであろうタンパク質をもたらすと予測される。
【０１２６】
実施例４
免疫原としてＧＳＴ-ＢＲＣＡ２融合タンパク質を使用したモノクローナルおよびポリクローナル抗体の産出
ＤＮＡプライマーを使用し、ＰＣＲ法を用いてＢＲＣＡ２フラグメントを増幅する。生成物を適切な酵素で消化した後、ＧＳＴ発現ベクターｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc.）を使用するEscherichia coliで、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする遺伝子とフレーム中で融合する。融合タンパク質の発現をイソプロピル-β-チオガラクトピラノシドの添加で誘発する。次いで細菌を分解し、過剰発現した融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズで精製する。この融合タンパク質をＳＤＳ/ＰＡＧＥゲルで確かめ、Ｎ-末端タンパク質配列決定する。精製したタンパク質をHarlow & Lane (1988)による標準的な方法でウサギを免疫化するのに使用する。数週間後ポリクローナル抗体を血清から集め、当業者に既知の方法で精製する。ＢＲＣＡ２タンパク質、ポリペプチドまたは機能的同等物の全体またはフラグメントに対するモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法を用いて得ることができる。Harlow & Lane (1988)参照。このＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドは、グルタルアルデヒドの存在下でキーホールリンペットヘモシアニン担体と結合する。結合した免疫原を補助剤と混ぜ、ウサギへ注射する。抗体を含有するウサギから脾臓を取り出す。脾臓から単離したＢ細胞を骨髄腫細胞と融合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して融合を促進する。骨髄腫とＢ細胞間のハイブリッドを選択し、免疫原ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドに対する抗体の産物をスクリーンする。陽性細胞を再びクローンして、モノクローナル抗体を産出する。
【０１２７】
実施例５
ヒト組織および細胞株でのＢＲＣＡ２発現の検出
ヒト組織でのＢＲＣＡ２発現を、ノーザンブロット分析を使用して決定する。膵臓、精巣、前立腺、卵巣、胸部、小腸および結腸などのヒト組織を、Clontech Laboratories, Inc., Paloから入手する。異なるヒト組織のポリ(Ａ)+ｍＲＮＡノーザンブロットをＢＲＣＡ２ ｃＤＮＡプローブと交雑し、プロトコルを製造する。さらに、プライマーとしてオリゴ-d(Ｔ)などの適切なプライマーを使用するＲＴ-ＰＣＲで発現レベルを整える。
【０１２８】
癌細胞系のノーザンブロット法のために、ヒト卵巣癌細胞系ＳＫＯＶ−３およびヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７を米国基準菌株保存機構ＡＴＣＣから得る。全ＲＮＡをグアニジンイソシアネートの存在で細胞を溶解して調製する。ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡの単離に、Ｐｒｏｍｅｇａ（Madison,WI）のＰｏｌｙＡＴｒａｃｔｍＲＮＡ単離システムを用いる。単離ＲＮＡを変性条件で電気泳動し、ナイロン膜に移行せしめる。ノーザンブロットに用いるプローブはＰＣＲ増幅で得たＢＲＣＡ２配列のフラグメントである。[α−32Ｐ]ｄＣＴＰでのプローブの標識にはランダムプライム標識キット（American Life Science, Arlington Heights, Il）を使用する。
【０１２９】
実施例６
ＢＲＣＡ２タンパク質の発現
ＢＲＣＡ２トランスフェクト細胞のの全細胞抽出物を免疫沈降法および免疫ブロット法にかけ、ＢＲＣＡ２タンパク質レベルを測定する。ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドの免疫沈降には、実施例４で調製したアンチＢＲＣＡ２抗体を使用する。サンプルをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースに移行する。ＢＲＣＡ２タンパク質またはポリペプチドについてウエスタンブロットを表示の抗体で行う。抗体反応の提示には化学発光試薬（DuPont New England Nuclear, Boston, MA）を用いる。
【０１３０】
実施例７
ＢＲＣＡ２(omi 1-5)遺伝子治療の使用
ＢＲＣＡ２遺伝子の発現を増加することにより、卵巣癌、乳癌または前立腺癌の成長を抑制し得る。この遺伝子の不十分な発現は遺伝性の卵巣癌、乳癌および前立腺癌をもたらす。腫瘍サイズを減少させるために患者に遺伝子治療を行う。ＬＸＳＮベクターを配列番号４、６、８、１０、１２のＢＲＣＡ２(omi1-5)コード配列で形質転換し得る。
【０１３１】
ベクター
ＬＸＳＮベクターを配列番号４、６、８、１０、１２の野生型ＢＲＣＡ２(omi1-5)コード配列で形質転換する。ＬＸＳＮ−ＢＲＣＡ２(omi1-5)レトロウイルス発現ベクターは、ＳａｌＩ連結ＢＲＣＡ２(omi1-5)ｃＤＮＡまたはそのフラグメントをベクターＬＸＳＮのＸｈｏＩ部位にクローン化することにより構築される。構築物をＤＮＡ配列決定により確認する。参照、Holt et al.Nature Genetics 12:298-302(1996)。レトロウイルスベクターは、血清およびフェノールレッドが含まれていない条件を用いて、ウイルス産生細胞から調製し、標準的解析法により、不稔性、特定の病原体の非存在、および複製能を有するレトロウイルスの存在について試験する。レトロウイルスは試験を行う分割単位で凍結させて保存する。
【０１３２】
患者は、全体的健康を調べるために、完全な物理的検査、血液検査および尿検査を受ける。彼らはまた、腫瘍段階を評定するために、胸部Ｘ線、心電図、および適当な放射線測定を受ける。
【０１３３】
転移性卵巣癌の患者は、薬剤単位形あたり１０9および１０10の間のウイルス粒子で、腫瘍を含む腹膜部位に組換えＬＸＳＮ−ＢＲＣＡ２(omi1-5)レトロウイルスベクターを注入することによるレトロウイルス遺伝子治療を用いて処置する。血液サンプルを毎日採取し、感度の良いポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）を基礎とした解析により、レトロウイルスベクターの存在を試験する。取得した液体を解析して以下を決定する：
【０１３４】
１．組換えＬＸＳＮ−ＢＲＣＡ２(omi1-5)レトロウイルスベクターの組み合わせを取り込んだ癌細胞のパーセンテージ。ＢＲＣＡ２遺伝子が癌細胞にうまく取り込まれたことは、ＲＴ−ＰＣＲ解析およびインシツハイブリダイゼーションにより示される。ＲＴ−ＰＣＲは、配列番号４、６、８、１０、１２のまたはそのフラグメントのＢＲＣＡ２(omi1-5)由来のプライマーを用いて、Thompson et al.Nature Genetics 9:444-450(1995)の方法により行われる。Jensen et al., Nature Genetics 12:303-308(1996)およびJensen et al.Biochemistry 31:10887-10892(1992)の方法により、細胞溶解物を調製し、イムノブロットを行う。
【０１３５】
２．ApoTAG（登録商標）インシツアポトーシス検知キット（Oncor、Inc.、Gaithersburg、メリーランド）およびＤＮＡ解析を用いたプログラム細胞死の存在。
【０１３６】
３．スライド免疫蛍光法またはウエスタンブロットによるＢＲＣＡ２遺伝子発現の測定。
【０１３７】
測定可能な疾病の患者をまた、ＬＸＳＮ−ＢＲＣＡ２（omi1-5）に対する臨床応答について検査し、特にレトロウイルスベクター治療後すぐに通常の処置はしないで患者を検査する。流動細胞診、腹部の周囲、腹部のＣＴスキャンおよび局所徴候を検査する。
【０１３８】
その他の部位の疾病については、以下のような慣用的な評価基準を使用する:
１．完全反応（ＣＲ）、少なくとも４週間、疾患の全ての測定可能な病巣および全ての徴候および症状の完全な消失。
２．部分反応（ＰＲ）、４週間以内に２人の観察者により決定された全ての測定可能な病巣の最も大きい２つの垂線の直径の産物の合計が少なくとも５０％減少。ＰＲを続けると、この間に全く新しい病巣は現れず、またどの病巣もサイズが増大しない。
３．安定な疾病、前回の測定から腫瘍容積が２５％以下の変化。
４．進行性疾病、前回の測定から腫瘍測定が２５％以上の増加。
【０１３９】
実施例８
タンパク質置換療法
機能的ＢＲＣＡ２タンパク質レベルの治療上の増大は、内因性ＢＲＣＡ２腫瘍抑制活性の不存在または低下を改善する。乳房または卵巣の癌に対する処置には、薬学的に許容される担体中のＢＲＣＡ２、ポリペプチドまたはその機能的等価物の治療的有効量を投与する。臨床的に効果的な運送方法は、既知のプロトコールでもって、腫瘍の部位に局所的に行うか、または他の転移箇所に到達するように全身的に行う。そのようなプロトコールでは腫瘍に直接注入する方法または時間放出カプセルを用いる拡散法がある。治療的に効果的な量は当業者により決定される。
【０１４０】
乳房または卵巣の癌の予防には、薬学的に許容される担体中のＢＲＣＡ２、ポリペプチドまたはその機能的等価物の予防上の有効量を投与する。乳房または卵巣の癌の危険性がわかっている者にタンパク質置換療法を行い、腫瘍原性を予防し、癌のおそれを低下せしめる。乳房および卵巣の癌の危険性の増大には、１以上のＢＲＣＡ２およびＢＲＣＡ１変異の保持、後期出産の子供、月経の早い開始、閉経の遅い開始、ある種の高危険性の食事習慣などの因子がある。臨床上効果的な運送方法は、既知のプロトコールで用いられるものであり、例えば腹膜腔内投与または植込み時間放出カプセルである。予防的に効果的な量は当業者により決定される。
【０１４１】
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本発明は、好ましい実施態様に関連して記述されているが、本発明の精神からそれることなく様々な修飾を行なうことができることを理解すべきである。それに応じて、本発明は次の請求の範囲のみによって限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＲＣＡ２遺伝子を含有するゲノムＤＮＡであって、
そのうち、エキソン５から始まる最初の１２のヌクレオチドが配列番号１の５’−ＴＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴ−３’であり、
そのうち、ヌクレオチド番号５７８２−５７９０が配列番号４のＧＴＴＴＧＴＧＴＴであり、
そのうち、エキソン１５で終わる最後の２０のヌクレオチドが配列番号２の５’−ＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＣＡＧ−３’であり、
そのうち、エキソン１６で始まる最初の２０のヌクレオチドが配列番号３の５’−ＣＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＴＴＴＣ−３’である、
ゲノムＤＮＡ。
【請求項２】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ａ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項３】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項４】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｃ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項５】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ｃ、１３４２Ａ、１５９３Ａ、２４５７Ｃ、２９０８Ｇ、３１９９Ｇ、３６２４Ｇ、４０３５Ｔ、７４７０Ｇ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項６】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ｇ、４０３５Ｔ、７４７０Ｇ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項７】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ｃ、１３４２Ｃ、１５９３Ｇ、２４５７Ｃ、２９０８Ａ、３１９９Ｇ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ａである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項８】
コード配列ヌクレオチドが次の２０２４Ｃ、４５５３Ｃ、４８１５Ｇ、５８４１Ｔ、５９７２Ｃである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項９】
ＢＲＣＡ２コード配列を含有するＤＮＡであり、
そのうち、ヌクレオチド番号６４３−６６６がＣＴＴＡＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡであり、
そのうち、ヌクレオチド番号５７８２−５７９０がＧＴＴＴＧＴＧＴＴである、
ＤＮＡ。
【請求項１０】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ａ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１１】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号４の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１２】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号６の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｃ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１３】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号８の１０９３Ｃ、１３４２Ａ、１５９３Ａ、２４５７Ｃ、２９０８Ｇ、３１９９Ｇ、３６２４Ｇ、４０３５Ｔ、７４７０Ｇ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１４】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号１０の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ｇ、４０３５Ｔ、７４７０Ｇ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１５】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号１２の１０９３Ｃ、１３４２Ｃ、１５９３Ｇ、２４５７Ｃ、２９０８Ａ、３１９９Ｇ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ａである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１】
ＢＲＣＡ２遺伝子を含有するゲノムＤＮＡであって、
そのうち、エキソン５から始まる最初の１２のヌクレオチドが配列番号１の５’−ＴＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴ−３’であり、
そのうち、ヌクレオチド番号５７８２−５７９０が配列番号４のＧＴＴＴＧＴＧＴＴであり、
そのうち、エキソン１５で終わる最後の２０のヌクレオチドが配列番号２の５’−ＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＣＡＧ−３’であり、
そのうち、エキソン１６で始まる最初の２０のヌクレオチドが配列番号３の５’−ＣＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＴＧＧＣＧＴＴＴＣ−３’である、
ゲノムＤＮＡ。
【請求項２】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ａ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項３】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項４】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｃ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項５】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ｃ、１３４２Ａ、１５９３Ａ、２４５７Ｃ、２９０８Ｇ、３１９９Ｇ、３６２４Ｇ、４０３５Ｔ、７４７０Ｇ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項６】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ｇ、４０３５Ｔ、７４７０Ｇ、９０７９Ｇである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項７】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ｃ、１３４２Ｃ、１５９３Ｇ、２４５７Ｃ、２９０８Ａ、３１９９Ｇ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ａである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項８】
コード配列ヌクレオチドが次の２０２４Ｃ、４５５３Ｃ、４８１５Ｇ、５８４１Ｔ、５９７２Ｃである、請求項１のゲノムＤＮＡ。
【請求項９】
ＢＲＣＡ２コード配列を含有するＤＮＡであり、
そのうち、ヌクレオチド番号６４３−６６６がＣＴＴＡＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡであり、
そのうち、ヌクレオチド番号５７８２−５７９０がＧＴＴＴＧＴＧＴＴである、
ＤＮＡ。
【請求項１０】
コード配列ヌクレオチドが次の１０９３Ａ、１３４２Ａ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１１】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号４の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１２】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号６の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ａ、４０３５Ｃ、７４７０Ａ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１３】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号８の１０９３Ｃ、１３４２Ａ、１５９３Ａ、２４５７Ｃ、２９０８Ｇ、３１９９Ｇ、３６２４Ｇ、４０３５Ｔ、７４７０Ｇ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１４】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号１０の１０９３Ａ、１３４２Ｃ、１５９３Ａ、２４５７Ｔ、２９０８Ｇ、３１９９Ａ、３６２４Ｇ、４０３５Ｔ、７４７０Ｇ、９０７９Ｇである、請求項９のＤＮＡ。
【請求項１５】
コード配列ヌクレオチドが次の配列番号１２の１０９３Ｃ、１３４２Ｃ、１５９３Ｇ、２４５７Ｃ、２９０８Ａ、３１９９Ｇ、３６２４Ａ、４０３５Ｔ、７４７０Ａ、９０７９Ａである、請求項９のＤＮＡ。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１１８８６３（Ｐ２００９−１１８８６３Ａ）
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５８７８８（Ｐ２００９−５８７８８）
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【分割の表示】特願２０００−５０９８２８（Ｐ２０００−５０９８２８）の分割
【原出願日】平成１０年８月１４日（１９９８．８．１４）
【出願人】（５００２５４４４６）オア・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【分割の表示】特願２０００−５０９８２８（Ｐ２０００−５０９８２８）の分割
【原出願日】平成１０年８月１４日（１９９８．８．１４）
【出願人】（５００２５４４４６）オア・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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