ヒトＴＮＦ−αに対する抗体酵素およびその利用
【課題】リウマチや慢性閉塞性肺炎疾患のようなサイトカインの産生異常により発症する疾患を予防または治療する目的で用いることが可能な抗体酵素を提供することにある。
【解決手段】ヒトＴＮＦ−αを抗原として作製された抗体またはその断片は、ＴＮＦ−αを認識するとともに、当該ＴＮＦ−αを切断および／または分解することができる抗体酵素である。
【解決手段】ヒトＴＮＦ−αを抗原として作製された抗体またはその断片は、ＴＮＦ−αを認識するとともに、当該ＴＮＦ−αを切断および／または分解することができる抗体酵素である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体酵素およびその利用に関するものであって、特に、リウマチや慢性閉塞性肺炎疾患のようなサイトカインの産生異常により発症する疾患を予防または治療する目的で用いることが可能な抗体酵素に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、自己成分が異物として認識されることにより、自己抗体が産生されたり、自己反応性リンパ球が出現したりする状態（自己免疫と呼ばれる）によって引き起こされる病態である。具体的には、通常、免疫系は体の中に侵入した細菌やウイルスを排除して体を防御するように働くが、自己に対して過剰な免疫応答を起こさない。つまり、自己成分は免疫寛容を獲得しているのである。しかし、自己免疫疾患では、免疫寛容に何らかの異常が生じているため、上記のような病態が引き起こされる。
【０００３】
自己免疫疾患の代表的な疾患としては、例えば、慢性関節リウマチ、橋本病、全身性エリマトーデスなどを挙げることができる。
【０００４】
上記自己免疫疾患のうち、慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis；以下、「ＲＡ」ともいう）は、多発性関節炎を主徴とする原因不明の慢性炎症性疾患である。日本全国でＲＡ患者は７０万人とも１００万人ともいわれ、その数は高齢化に伴い年々増加する傾向がある。また、女性の患者が圧倒的に多く、ＲＡ患者の８割が女性といわれているが、その原因は分かっていない。
【０００５】
ＲＡの病因には、遺伝、免疫異常、内分泌、環境要因などが複雑に関与していると推測されている。しかし、はっきりとした病因は判明していない。病変の主座は関節滑膜であるが、進行すれば軟骨・骨を侵し、関節組織の破壊や変形へと至る。多くの関節が腫れ、そして痛みを伴い、歩くことをはじめ、日常生活動作が徐々に障害される難病である。関節以外に皮膚、肺、腎などの全身症状も伴うことも少なくない。病理組織学的には、リンパ球やマクロファージの炎症性細胞の浸潤、滑膜細胞の増殖などが起こるといわれている。
【０００６】
ＲＡの関節液あるいは滑膜細胞を用いた研究において、ＲＡの病態には炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインのアンバランスが原因であることが明らかにされている。さらに、その中心的役割をしているサイトカインは、腫瘍壊死因子（tumour necrosis factor;以下、「ＴＮＦ」ともいう）のＴＮＦ−αであるといわれている。具体的には、ＲＡ患者の関節液では、ＴＮＦ−αの濃度上昇が見られる。濃度が上昇したＴＮＦ−αは、（ａ）血管内皮細胞の接着分子の発現を誘導することにより、リンパ球などの白血球が炎症部位に浸潤するのを促進し、（ｂ）滑膜細胞に作用して、様々な炎症性サイトカインを産生させ、（ｃ）破骨細胞の分化・活性化を促進させることにより、関節破壊を誘発し、（ｄ）線維芽細胞を活性化し、線維芽細胞を増殖させるといった作用を示すことにより、関節破壊、炎症の持続・慢性化を起こすと考えられている。
【０００７】
ＲＡの治療は、通常、ＲＡ病態の病状の進行度によって選択すべき治療手段が異なる。一般的に確定診断を下すことが困難なＲＡ初期では、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他の自己免疫疾患との鑑別を同時に行う。ＲＡがさらに進行し、ＲＡとの確定診断が下されると、ＮＳＡＩＤに加えて疾患修飾性リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を投与する。さらに、疼痛のための薬物療法と共に関節機能の維持・回復に対して理学療法・装具療法を行う。また、関節破壊により日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
【特許文献１】特表２００３−５３５５９１号公報（平成１５（２００３）年１２月２日公表）
【特許文献２】特表２００５−５２２４５７号公報（平成１７（２００５）年７月２８日公表）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特定疾患に指定されている疾患が多く存在することからも分かるように、自己免疫疾患は、一般的に根治することが困難な疾患である。そのため、自己免疫疾患の診断や治療および予防に関する研究はされているが、未だ十分とはいえないのが現状である。
【０００９】
ところで、近年、上述したように自己免疫疾患ではＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージなどから様々なサイトカインが産生されていることが分かってきた。そのため、サイトカインを標的に自己免疫疾患の治療を行うことに注目が集まっており、抗サイトカイン療法の臨床応用が既に始まっている。例えば、サイトカインと特異的に結合し、その機能を阻害するモノクローナル抗体や、サイトカインの働きを阻害する可溶性受容体や拮抗物（アンタゴニスト）の利用が検討されている。より具体的には、特許文献１には、ヒトＴＮＦ−αに対して特異性を有する抗体分子を、ＴＮＦ−αによって媒介される慢性関節リウマチまたは骨関節炎を治療するための医薬の製造に用いることが開示されている。
【００１０】
また、サイトカインの産生異常との関連が知られている疾患は、自己免疫疾患だけではなく、例えば、慢性閉塞性肺炎疾患（以下、「ＣＯＰＤ」ともいう）についても、サイトカインの産生異常と疾患との関連性が知られている。より具体的には、特許文献２には、プロ炎症性サイトカインまたは炎症性サイトカインカスケードにより引き起こされる炎症を低減する方法として、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化させることを含む、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される慢性閉塞性肺疾患の危険性にあるか、または該疾患を有する脊椎動物においてＴＮＦの放出を阻害する方法が開示されている。
【００１１】
このように、サイトカインは、様々な疾患の病態に関与しており、現在、サイトカインを標的分子とした疾患の治療や予防に関する技術の開発が求められている。
【００１２】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、リウマチやＣＯＰＤのようなサイトカインの産生異常により発症する疾患を予防または治療する目的で用いることが可能な抗体酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＲＡやＣＯＰＤの病態との関連性が知られているＴＮＦ−αに対する抗体酵素を製造可能であることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。
【００１４】
（１）ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であり、かつ、上記ＴＮＦ−αを分解することを特徴とする抗体酵素。
【００１５】
（２）上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする（１）に記載の抗体酵素。
【００１６】
（３）上記抗体酵素は、上記ＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでなることを特徴とする（１）または（２）に記載の抗体酵素。
【００１７】
（４）上記軽鎖可変領域は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドからなり、上記重鎖可変領域は、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドからなることを特徴とする（３）に記載の抗体酵素。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
【００１８】
（５）上記軽鎖可変領域は、配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなり、上記重鎖可変領域は、配列番号４に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなることを特徴とする（３）に記載の抗体酵素。
【００１９】
（６）以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
【００２０】
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体酵素を含み、生体内におけるＴＮＦ−α量の増加を抑制することを特徴とする薬学的組成物。
【００２１】
（８）（６）に記載のポリヌクレオチドを導入してなることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【００２２】
本発明にかかる抗体酵素は、以上のように、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であり、かつ、当該ＴＮＦ−αを分解するという構成を備えている。それゆえ、生体に投与した際、生体内のＴＮＦ−αを効率よく分解することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明について以下により具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００２４】
＜１．ＴＮＦ−α＞
本発明にかかる抗体酵素は、後述するようにヒトＴＮＦ−αを抗原として得られる抗体である。そこで、まず、本発明の抗体酵素の抗原であるＴＮＦ−αについて以下詳細に述べることとする。
【００２５】
ＴＮＦ−αは１９世紀末にWilliam Coleyによって発見されたサイトカインである。Coleyは細菌感染後に何人かの癌患者の腫瘍が退縮または消失していることを発見した。そこで細菌を投与し、癌の治療を試みたが一貫した結果が得られず、医学的治療とはなり得なかった。腫瘍を消失させる活性成分は、その後、ＬＰＳ(エンドトキシン)と呼ばれる複雑な生体分子であることが示された。ＬＰＳ自身には抗腫瘍活性を持っていない。ＬＰＳを投与された動物の血清には癌細胞に対して毒性を示す因子が含まれることが明らかにされた。ＬＰＳに対する反応の結果、特異的な細胞から産生されるこの因子がＴＮＦ(腫瘍壊死因子)である。
【００２６】
腫瘍壊死因子はインターフェロン、インターロイキンとは異なるサイトカイン・ファミリーの調節タンパクである。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βとの２種類のＴＮＦが知られている。両方とも同じ受容体に結合し同様の広い生物的反応を誘導するが、両者の相同性は、３０％以下と低い。特に腫瘍壊死因子としてのＴＮＦは、より正確にはＴＮＦ−αを指す。ＴＮＦ−αはカケクチン(cachectin)としても知られている。
【００２７】
ＴＮＦ−αの主な生物学的活性としては、食細胞の活性化、直接的または関節的な炎症の促進、形質転換細胞に対する細胞障害、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、コロニー刺激因子などのサイトカイン合成および産生の誘導が挙げられる。また、全身的に高濃度なＴＮＦ−αは、敗血症ショックや、自己免疫疾患を誘導する。
【００２８】
また、生物学的に活性なヒトＴＮＦ−αは、３つの同じポリペプチド・サブユニットが３回転軸対称で強く結合したホモトリマー(ホモ３量体)である。モノマーは生物学的に不活性であり、１７．３ｋＤａの分子量をもつ。なお、ＴＮＦ−αの特性については、下記の表１にまとめている。
【００２９】
【表１】
【００３０】
上記ヒトＴＮＦ−αとしては、具体的には、ＮＣＢＩアクセション番号ＣＡＡ２６６６９や、ＮＰ＿０００５８５に登録されているアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモ３量体を挙げることができる。
【００３１】
本発明において用いるヒトＴＮＦ−αを取得する方法は特に限定されるものではないが、例えば、市販品を購入することにより取得することができる。また、従来公知の遺伝子組み換え技術等を用いて製造して用いてもよい。例えば、上記例示したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子をベクター等に組み込んだ後、発現可能に適当な宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたポリペプチドを精製する等の方法により製造することができる。さらに、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成したり、無細胞系のタンパク質合成液を利用して合成したりすることもできる。
【００３２】
さらに、本発明においては、上記例示したＴＮＦ−αのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上述したようなヒトＴＮＦ−αの生理活性を有するポリペプチド、換言すれば、変異ヒトＴＮＦ−αをヒトＴＮＦ−αとして用いることもできる。
【００３３】
このような変異ヒトＴＮＦ−αの取得方法も特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて製造することにより、取得することができる。
【００３４】
また、本発明においては、上述したヒトＴＮＦ−αや変異ヒトＴＮＦ−αに加えて、それらのペプチド断片を抗原として用いてもよい。このようなペプチド断片を得る方法も特に限定されるものではない。例えば、上述しような方法で取得したヒトＴＮＦ−αや変異ヒトＴＮＦ−αを適当なプロテアーゼを用いて目的とするペプチド断片が得られるように切断すればよい。また、予め設計したペプチド断片をコードする遺伝子を上述したように従来公知の方法で発現させることにより製造してもよい。また、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成したり、無細胞系のタンパク質合成液を利用して合成したりすることもできる。
【００３５】
以上のようなヒトＴＮＦ−αやそのペプチド断片を抗原として用いることにより、後述する本発明にかかる抗体酵素を製造することができる。
【００３６】
＜２．本発明にかかる抗体酵素＞
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であって、かつ、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有する抗体酵素であればよい。
【００３７】
本明細書において、「抗体酵素」とは、抗体でありながら酵素作用を有するものであり、その中でも特に、その抗原タンパク質を標的として高い分解活性を示すものは「スーパー抗体酵素」と呼ばれる。上記「スーパー抗体酵素」は、標的としたタンパク質を完全分解することができ、しかも天然型酵素に近い活性を有する（Super Catalytic Antibody ［I］ : Decomposition of targeted protein by its antibody light chain. Hifumi, E., Okamoto, Y., Uda, T., J. Biosci. Bioeng., 88（3）, 323-327 （1999）を参照）。つまり、本発明にかかる抗体酵素は、ＴＮＦ−αを抗原とする抗体であり、当該ＴＮＦ−αを完全分解するため、「スーパー抗体酵素」に含まれるものである。また、本明細書における「抗体酵素」には、抗体の断片であって、当該抗体の抗原を認識し、当該抗原を分解する活性を有するものも含まれる。
【００３８】
また、本明細書において、「抗体の断片」とは、抗体を構成する各ペプチド鎖、例えば、軽鎖（以下、「Ｌ鎖」ともいう）や重鎖（以下、「Ｈ鎖」ともいう）を意味する。さらに、「抗体の断片」には、上記各ペプチド鎖内の一部の領域のペプチド断片、例えば、軽鎖可変領域や重鎖可変領域、およびそれら可変領域を含むペプチド断片も含まれる。
【００３９】
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＴＮＦ−αに対するポリクロナール抗体であってもよいが、ヒトＴＮＦ−αに対するに対するモノクローナル抗体であることがより好ましい。これにより、当該ＴＮＦ−αに対する特異性の高い抗体酵素を得ることができる。
【００４０】
また、本発明にかかる抗体酵素が認識するＴＮＦ−αは、ヒトＴＮＦ−αに限定されるものではなく、ヒトＴＮＦ−αに加えて、その他のあらゆる生物由来のＴＮＦ−αを認識してもよい。
【００４１】
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であると同時に、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有する。すなわち、本発明にかかる抗体酵素はＴＮＦ−αを特異的に認識する抗体としての性質と、認識したＴＮＦ−αを切断および／または分解する酵素としての性質を併せ持つ。それゆえ、ＴＮＦ−αの分解活性を有さない抗体では、抗体１分子に対して、１分子または２分子のＴＮＦ−αが結合するだけであるが、本発明の抗体酵素では、抗体酵素１分子に対して、ＴＮＦ−αが次から次に結合しては分解されるという反応を繰り返す。したがって、本発明にかかる抗体酵素のＴＮＦ−αを分解する能力は、ＴＮＦ−αの分解活性を有さない抗体のそれの数百倍あるいは数千倍に達する。
【００４２】
このように、ＴＮＦ−αに対する高い分解活性を有する本発明の抗体酵素を生体に投与することにより、ＴＮＦ−αが過剰に産生された場合であっても、ＴＮＦ−αの過剰な蓄積を抑制することができ、ＲＡやＣＯＰＤのようなＴＮＦ−αの過剰産生が発症の原因となる疾患の予防や治療に寄与することが期待できる。すなわち、本発明には、本発明にかかる抗体酵素を含み、生体内におけるＴＮＦ−α量の増加を抑制することができる薬学的組成物も含まれる。
【００４３】
また、本発明にかかる抗体酵素は、抗体であると同時に酵素であるため、酵素センサの構築が可能である。このように、本発明にかかる抗体酵素は、抗原の分解活性を有さない通常の抗体よりも応用範囲が広い。なお、本発明にかかる抗体酵素の酵素活性は、ヒトＴＮＦ−α以外に、他の生物由来のＴＮＦ−αをも切断および／または分解するものであってもよい。
【００４４】
本発明にかかる抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。なお、「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことをいう。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。したがって、本発明にかかる抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であるということもできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。発明者らは、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有するマウス由来抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した結果、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とが立体構造上近接して存在することを明らかにした（例えば特開２００４−９７２１１号公報（平成１６年４月２日公開）参照）。ここで、「立体構造上近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とのCα間の距離が、少なくとも３〜２０Åの範囲内、好ましくは、３〜１０Åの範囲内にあることを意味する。
【００４５】
本発明にかかる抗体酵素が、上記「触媒三つ組残基構造」を有するか否かを調べる方法は、特に限定されるものではない。例えば、Ｘ線回折による立体構造決定法のように、実際に当該抗体酵素の立体構造を決定する方法を用いて、「触媒三つ組残基構造」の有無を調べることができる。また、当該抗体酵素の一次構造、すなわち当該抗体酵素のアミノ酸配列をもとに、タンパク質の立体構造予測ソフトウェアを用いて、当該抗体酵素の立体構造を予測することによって、「触媒三つ組残基構造」の有無を調べることもできる。
【００４６】
上記抗体酵素は、上記ＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでなることが好ましい。この「可変領域」とは、抗体を構成するＨ鎖およびＬ鎖のうち、Ｎ末端から約１１０残基のアミノ酸からなる部分のことである。この可変領域は、抗体の種類によって一次構造に多様性が見られ、抗体が酵素としての活性を有する場合にその活性中心が含まれている可能性が高い。それゆえ、本発明にかかる抗体酵素が抗体の可変領域を含めば、酵素として高い活性を有していると予測できる。
【００４７】
本発明において、上記軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖および重鎖の可変領域であればよく、特に限定されるものではない。上記軽鎖可変領域を構成するポリペプチドとしては、例えば、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００４８】
また、上記重鎖可変領域を構成するポリペプチドとしては、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００４９】
なお、本明細書において、「１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）および（ｄ）のポリペプチドは、それぞれ、上記（ａ）および（ｃ）のポリペプチドの変異体であるといえる。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、自然発生的に生じた変異であってもよい。
【００５０】
上述したように、本発明にかかる抗体酵素は、その一実施形態として、上記ＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでなるものである。したがって、本発明にかかる抗体酵素の具体例としては、上記例示したポリペプチドを挙げることができる。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列は、後述する実施例において製造した抗体酵素であるＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号２に示すアミノ酸配列は、当該抗体酵素であるＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。図１３にＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、図１１にＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図１３に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域は、下線を付して示す３つの相補性決定領域（complementarity determing region、以下「ＣＤＲ」ともいう）、具体的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有している。すなわち、ＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４番目から３８番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４番目から６０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１に示されるアミノ酸配列の９３番目から１０１番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。
【００５１】
また、図１１に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域もまた、下線を付して示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有している。すなわち、ＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３１番目から３５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列の５０番目から６６番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号２に示されるアミノ酸配列の９９番目から１０８番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。
【００５２】
また、本発明にかかる抗体酵素には、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体の断片であって、上記抗体の可変領域を含み、かつ、ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有する抗体の断片が含まれる。上記可変領域は、重鎖可変領域であっても、軽鎖可変領域であってもよい。また、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、かかる可変領域をヒトその他の動物の抗体に移植してキメラ抗体を作製するために好適に用いることができる。
【００５３】
本発明において用いることが可能な抗体の断片としては、例えば、上述の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドや、これらのポリペプチドのアミノ酸配列を含む抗体の断片を挙げることができる。
【００５４】
また、本発明には、上記抗体酵素をコードする遺伝子も含まれる。本発明にかかる遺伝子としては、具体的には、例えば、配列番号３または４に示される塩基配列からなる遺伝子、またはこれらを含む遺伝子を挙げることができる。配列番号３に示される塩基配列は、後述する実施例において製造した抗体酵素であるＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子であり、配列番号４に示される塩基配列は、上記ＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子である。
【００５５】
本発明にかかる遺伝子を適当な宿主に発現可能に導入することにより、本発明の抗体酵素を宿主内で発現させることができる。また、本発明の抗体酵素の可変領域、またはそのＣＤＲを組み込んだ可変領域は、そのまま発現させてもよいが、定常領域をコードする遺伝子と連結してキメラ抗体酵素として発現させることもできる。
【００５６】
なお、本明細書において「遺伝子」との用語は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む。）等の配列を含むものであってもよい。
【００５７】
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、真核生物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、原核生物由来のイントロンなどの非コード配列を含まない「ゲノム」形ＤＮＡであってもよい。また、逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。また、細胞がゲノムＤＮＡとは別に保持しうる低分子量の環状ＤＮＡである「プラスミド」形ＤＮＡであってもよい。
【００５８】
また、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡを含む全ＲＮＡ等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
【００５９】
「塩基配列」との用語は、「核酸配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（それぞれＡ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの「塩基配列」は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドに対してのデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドに対してのリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）を意図する。
【００６０】
また、本発明にかかる遺伝子は、配列番号３または４に示される塩基配列と必ずしも同一である必要はなく、配列番号３または４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有する抗体酵素をコードする遺伝子であってもよい。
【００６１】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（すなわち、ハイブリダイズし難くなる）。
【００６２】
＜３．本発明にかかる抗体酵素の製造方法＞
本発明にかかる抗体酵素は、例えば、ＴＮＦ−αを抗原ペプチドとして、免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を産生することにより製造することができる。重鎖、軽鎖を得る場合には、得られたモノクローナル抗体を重鎖と軽鎖とに分離すればよい。また、本発明の抗体の断片を得る場合には、まず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体の断片が得られるように切断すればよい。また、ファージディスプレイ法で得られる抗体であってよい。
【００６３】
モノクローナル抗体の取得は通常のハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc.,77-96(1985)）等により行なわれる。
【００６４】
また、上記抗原ペプチドには、上述したＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αのペプチド断片を用いればよい。
【００６５】
さらに、アミノ酸配列が明らかになっている抗体酵素については、従来公知の遺伝子組み換え技術等を用いて本発明の抗体酵素を製造することができる。この場合、上記抗体酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子をベクター等に組み込んだ後、発現可能に適当な宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたペプチドを精製する等の方法を用いることができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく製造することができる。
【００６６】
また、上述の（ｂ）または（ｄ）のポリペプチドのように、変異型のポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、上記（ｂ）や（ｄ）のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異型のポリペプチドの作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００６７】
さらに、本発明にかかる抗体酵素の取得方法は、上述に限定されるものではなく、例えば、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成されたものであってもよい。また別の方法としては、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明にかかる遺伝子から本発明にかかるポリペプチドを合成してもよい。
【００６８】
＜４．本発明にかかる形質転換体＞
本発明にかかる形質転換体は、本発明にかかる遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【００６９】
本発明に係る形質転換体の作製方法（生産方法）は、本発明にかかる遺伝子を含む組換え発現ベクターを形質転換する方法を挙げることができる。
【００７０】
上記組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
【００７１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主（ホスト）細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかる遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター、及びウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルス）、並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド）を利用可能である。
【００７２】
より具体的には、細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、及びｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratageneから入手可能）；並びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Phrmaciaから入手可能）が含まれる。
【００７３】
また、好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、及びｐＳＧ（Stratageneから入手可能）；並びにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Phrmaciaから入手可能）が含まれる。
【００７４】
植物における使用に好ましいベクターの中には、例えば、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」（いずれもClontech社製）、「ｐＴＡ７００１」、「ｐＴＡ７００２」(Aoyama ら(1997) Plant J. 11:605) 、「ｐＰＺＰ２１１」(Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25:989(1994)などが含まれる。
【００７５】
また、形質転換の対象となる生物（宿主生物）も特に限定されるものではなく、従来公知の各種生物およびそれら由来の細胞を好適に用いることができる。適切な宿主の代表的な例としては、菌体（例えば、E. coli細胞、Streptomyces細胞、及びSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila Ｓ２細胞及びSpodoptera Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；並びに植物細胞（例えばシロイヌナズナ、タバコなどの双子葉植物、イネ、オオムギなどの単子葉植物）が挙げられる。
【００７６】
本発明にかかる好ましい形質転換体としては、本発明にかかる遺伝子を、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、宿主細胞に発現可能に導入した形質転換体が挙げられる。
【００７７】
さらに、形質転換する方法についても特に限定されるものではなく、宿主生物の種類に応じた従来公知の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション法、感染法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポソーム法、適切なベクター系を用いた導入法等を例に挙げることができる。
【００７８】
このようにして得られる形質転換体は、本発明にかかるポリペプチドを産生することができる。これらポリペプチドは、従来公知の方法により、当該形質転換体生物から抽出、精製することができる。
【００７９】
当該ポリペプチドを抽出、製造する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。
【００８０】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８１】
本発明について、実施例および図１〜２１に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、実施例における抗体の力価、抗体産生細胞（ハイブリドーマ）のクローニングは以下の方法に従って行った。
【００８２】
〔ＥＬＩＳＡによる力価測定〕
抗原（ＴＮＦ-α）をＰＢＳに溶解し、４μg/ｍｌの抗原溶液を調整した。９６穴イムノプレートに上記抗原溶液を５０μｌずつオクタピペットを用いて入れた。その後、４℃で一晩反応させた（コーティング）。
【００８３】
翌日、プレートを室温に戻し、イムノウォッシャーを用いて０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ−Ｔ」ともいう）でプレートを２回洗浄した。洗浄したプレートをキムタオルの上に逆さに置き、軽く叩いてウェルの中の水分を除去した。全てのウェルに２％ゼラチン／ＰＢＳを１３０μｌずつ入れ、３０〜６０分間、室温でインキュベーションした（ブロッキング）。
【００８４】
ブロッキングの間に、一次反応の準備を行った。免疫マウスから採血を行った抗血清をまず１／５０に希釈し、そこから３倍連続希釈を７点行い、１サンプルにつき８種類の希釈液を作製した。また、未処理マウスの血清も同様に希釈を行い、コントロールとして使用した。
【００８５】
ブロッキング後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを２回洗浄し、水分を除去した。その後、ブロッキング中に作製したそれぞれの血清希釈液を５０μｌずつウェルに入れ、６０分間インキュベーションした（一次反応）。
【００８６】
一次反応後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを２回洗浄し、水分を除去した。次に、ＰＢＳ−Ｔで希釈調製したアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウス抗体を５０μｌずつウェルに入れ、６０分間室温でインキュベーションした（二次反応）。
【００８７】
二次反応後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを２回洗浄し、水分を除去した。次に、ＡＬＰ基質タブレットをＡＬＰ基質緩衝液で溶かし、各ウェルに１００μｌずつ入れ、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、λ1＝４０５ｎｍ、λ2 ＝６２０ｎｍに設定したイムノリーダーで吸光度を測定した。Ｘ軸に抗体の希釈割合（Dilution）、Ｙ軸に吸光度をとったグラフを作成し、力価を測定した。
【００８８】
〔限界希釈法によるクローニング〕
まず、６ｍｌ滅菌チューブおよび１４ｍｌ滅菌チューブを各２本ずつ用意した。６ｍｌ滅菌チューブの一方をＡ、もう一方をＢとした。１４ｍｌ滅菌チューブの一方にはＨＣＦ添加ＨＡＴ培地を３．９ｍｌ分注し、もう一方にはＨＣＦ添加ＨＡＴ培地を２．４ｍｌ分注した。ＨＣＦ添加ＨＡＴ培地を３．９ｍｌ分注したチューブをＣ、２．４ｍｌ分注したチューブをＤとした。
【００８９】
クローニングしたいウェルの細胞をマイクロピペットでピペッティングし、その懸濁液から５０μｌをＡに入れた。
【００９０】
これとは別に、上記懸濁液から５０μｌを採取し、トリパンブルー５０μｌと混合した後、血球計算盤で細胞数をカウントした。その計測した結果を用いて、最終的な細胞濃度が２×１０３個/ｍｌになるように、必要量のＨＡＴ培地をＢに入れた。
【００９１】
次に、上記Ａに１ｍｌのＨＡＴ培地を加え、そこから１００μｌを上記Ｂに移し、よくピペッティングを行った。その後Ｂから１００μｌを採取し、それをＣに移し、ピペッティングを行った。その後、Ｃから６００μｌを採取し、それをＤに移し混合した。このようにして得られたＣおよびＤに入った細胞懸濁液をそれぞれ１００μｌずつ９６穴プレートに分注し、インキュベーターで培養を開始した。７日後に培地の添加を行い、その後は、３日ごとに培地の交換を行った。
【００９２】
７日目を過ぎたあたりからコロニーのチェックを行い、コロニーが形成されたウェルのスクリーニングを行った。スクリーニングの結果、同じプレート内でＴＮＦ−αに対して最も反応が高いシングルコロニーをクローニングした。コロニーが形成されたウェルが全て陽性になるまで、上記の方法でスクリーニングとクローニングとを繰り返し行った。
【００９３】
〔実施例１：抗ＴＮＦ−α抗体の製造〕
（１．マウスの免疫）
免疫に用いた抗原タンパクとして、Recombinant Human TNF-α（Strathmann Biotec AG社製,hTNFa-1000,Lot.090590）を用いた。また、免疫する動物として、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌６週齢）を２匹用いた。
【００９４】
まず、クリーンベンチ内にＦＣＡ（Freund’s complete adjuvant）、抗原（Recombinant Human TNF-α）、ルアーロック式シリンジを２本、注射針（１９Ｇ）を２本、および三方活栓を用意した。上記シリンジに注射針をセットし、ＦＣＡを必要量より少し多めにとり、三方活栓に取り付けた。０．５ｍｇ／ｍｌに調製した抗原をＦＣＡと同様にシリンジにとり、三方活栓に取り付けた。三方活栓で繋いだシリンジをクリーンベンチから取り出し、抗原側、ＦＣＡ側それぞれのシリンジ先端に残った空気を抜いた後に、water in oilの要領でＦＣＡと抗原とを混合した。２本のシリンジをそれぞれ交互に押し、ＦＣＡと抗原とをよく混合した。その後、４℃で静置した。白い乳液状になるまでこの操作を繰り返し、ＦＣＡと抗原とを混合した。
【００９５】
次に、片方のシリンジに混合した溶液を集め、シリンジを三方活栓から外し２５Ｇの注射針を取り付けた。マウスの腹部をアルコール綿で拭いて消毒し、腹部皮下の２箇所に１００μｌずつ投与した。なお、注射針はマウスごとに交換しなかった。また、マウス１匹あたりの抗原投与量は５０μｇであった。
【００９６】
免疫注射から１０日後にマウスの採血を行い、上述の手順で、ＥＬＩＳＡ法により力価測定を行った。
【００９７】
初回免疫から約２週間後に追加免疫を行った。２回目からは不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を用いた。免疫方法は初回免疫と同様とし、マウス１匹あたりの抗原投与量は５０μｇとした。追加免疫から１０日後、眼窩静脈叢より採血を行い、ＥＬＩＳＡ法により力価測定を行った。
【００９８】
同様の方法で、マウスＩには、さらにもう１回追加免疫（合計３回目免疫）を行い、力価測定を行った。また、マウスＩＩについては、さらに２回追加免疫（合計４回目免疫）を行った。
【００９９】
追加免疫後、力価が十分上がったマウス（３回目免疫後のマウスＩ、４回目免疫後のマウスＩＩ）に最終免疫を行った。最終免疫は滅菌ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに調製した抗原をマウス尾静脈または腹腔内に投与した。なお、本実施例の免疫スケジュールを表２に示す。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
上記のように免疫したマウスから採取した血清の力価測定結果を図１〜図５に示す。図１〜図５に示すように、マウスＩ、ＩＩともに順調に力価が上がり、３回目免疫後には細胞融合が可能な力価まで上がった（図３を参照）。マウスＩＩについては、最終免疫後の力価は、４回目免疫後力価よりも落ちていたが、細胞融合するのに十分な力価を保っていた（図４および図５を参照）。
【０１０２】
こうして得られた免疫マウスを用いて、最終免疫の３〜４日後に後述の細胞融合を行った。
【０１０３】
（２．細胞融合）
上記免疫マウスの首を切断することにより全採血を行った。採取した血液は４℃に一晩静置後、翌日、３０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間遠心分離を行うことにより、血清を回収し、力価測定を行った。その結果を表３に示す。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
次に、上記マウスを消毒して解剖後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓を洗浄用ＭＥＭ培地が５ｍｌ入ったシャーレに移した。脾臓に付着している脂肪などの余分な組織を取り除き、洗浄した。洗浄した脾臓を新しいＭＥＭ培地が５ｍｌ入ったシャーレに移し、擦りガラス板で脾臓をまず３等分した。擦りガラスを２枚合わせて、３等分にした脾臓を１つずつ擦りながら脾細胞を取り出し、シャーレに入れた。
【０１０６】
次に、上記脾細胞を、５０ｍｌ遠心チューブの上にのせたろ過フィルターに注いだ。さらに上記脾細胞が入っていたシャーレを５ｍｌのＭＥＭ培地で共洗いし、上記脾細胞がシャーレに残らないよう遠心チューブに移した。その後、上記脾細胞を１４００ｒｐｍで６分間遠心分離した（１回目の洗浄）。脾細胞の遠心分離を行っている間に、予め培養していたミエローマ細胞（ＮＳ−１）を回収し、５０ｍｌの遠心チューブに移した。上記脾細胞の遠心分離が終了後、上記ミエローマ細胞を１４００ｒｐｍで６分間遠心分離した（培地の除去）。
【０１０７】
１回目の洗浄を終えた脾細胞の上清をアスピレーターで吸引除去し、３０ｍｌのＭＥＭ培地をピペッティングしながら加え、ペレットをほぐした。上記ミエローマ細胞についても同様に上清を吸引除去し、３０ｍｌのＭＥＭ培地で懸濁した。
【０１０８】
上記のように懸濁した脾細胞およびミエローマ細胞を１４００ｒｐｍで６分間遠心分離した（脾細胞は２回目の洗浄、ミエローマ細胞は１回目の洗浄)。遠心分離終了後、脾細胞およびミエローマ細胞の上清を吸引除去し、３０ｍｌのＭＥＭ培地で懸濁後、１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行った（脾細胞は３回目の洗浄、ミエローマ細胞は２回目の洗浄）。遠心分離後、上清を吸引除去し、１０ｍｌのＭＥＭ培地に細胞を懸濁した。
【０１０９】
次に、脾細胞およびミエローマ細胞のそれぞれの懸濁液について、血球計算盤を用いて細胞数をカウントした。その後、表４に示すように、細胞数の比が脾細胞:ミエローマ細胞＝５：１になるように、必要なミエローマ細胞数を脾細胞が入った遠心チューブに移した。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
脾細胞およびミエローマ細胞の混合懸濁液を十分に撹拌後、１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行い、上清を除去した。上清除去後、遠心チューブを軽く叩きつけて、ペレットをほぐした。その後、ペレットの入った遠心チューブを激しく振り続けながら、１ｍｌのＰＥＧを１分間かけて１滴ずつゆっくりと加えた。ＰＥＧを添加後、さらに１分間遠心チューブを振り続けた。その後、遠心チューブを振り続けながら、１ｍｌのＭＥＭ培地を１分間かけて加えた。再度、同様に１ｍｌのＭＥＭ培地を１分間かけて加えた。次に、遠心チューブを振り続けながら、７ｍｌのＭＥＭ培地を３〜４分間かけてゆっくり加えた。その後、８００ｒｐｍで６分間遠心分離を行い、上清を吸引除去した。上清除去後、遠心チューブを叩きつけてペレットをほぐした。その後、まず、５ｍｌのＨＡＴ培地をペレットに勢いよく吹き付け、ペレットを崩した。次に、マウスＩでは３３ｍｌ、マウスＩＩでは５７ｍｌのＨＡＴ培地をピペッティングせずに加えた。この細胞懸濁液を滅菌処理済の９６穴プレートに１００μｌずつ播き、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養開始した。３〜４日後にＨＡＴ培地を５ｍｌのピペットを用いて２滴ずつ添加した。そして、７日後には培地の交換を行った。
【０１１２】
細胞融合後の７日目頃からコロニー確認を行ったところ、最終的にマウスＩおよびマウスＩＩともに全てのウェルでコロニー形成が確認された。すなわち、細胞融合効率は１００％であった（表４を参照）。
（３．スクリーニングおよびクローニング）
そこで、それら全てのウェルの上清を用いて、スクリーニングを行った。スクリーニングは、上述したＥＬＩＳＡ法による力価測定の方法の一部条件を変更した方法を用いて行った。変更点は、具体的には、（１）コーティングに使用する抗原をＴＮＦ−αの他に、ＨＳＡおよびＩｇＧ（濃度はどちらも４μｇ／ｍｌとした）を用いた、（２）コーティング後の洗浄は行わず、アスピレートのみを行った、（３）コロニーが確認できたウェルの上清を９６穴Ｕ底プレートに入れ、ＰＢＳ−Ｔで１／２に希釈したものを一次反応に用いた、（４）一次反応の陽性コントロールとして細胞融合時の抗血清を、陰性コントロールとして、ＰＢＳ−Ｔで１／２に希釈したＨＡＴ培地を用いた点である。一次スクリーニングの結果、マウスＩでは陽性ウェル数が２７ウェル、マウスＩＩでは陽性ウェル数は９ウェルであった（表５を参照）。そのうち、マウスＩの１４ウェル、マウスＩＩの９ウェルについて、上述の限界希釈法によるクローニングを行った。なお、ＴＮＦ−αに対して吸光度が０．１以上のものを陽性とした。また、限界希釈法によるクローニングの結果、陽性ウェル１００％が２回連続した株を、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体産生株（以下、「抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマ」ともいう）とした。
【０１１３】
その結果、最終的に確立した抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマはマウスＩで１３株、マウスＩＩで４株の計１７株となった（表５を参照）。これらのハイブリドーマをＥＴＮＦ−１〜１７とし、各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をＥＴＮＦ−１〜１７抗体とした。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
次に、上記抗体ＥＴＮＦ−１〜１７抗体について、Iso StripTM マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いてアイソタイプ決定を行った。結果を表６に示す。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
（４．タンパク質との交差反応試験）
上記抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いて、ＥＴＮＦ−１〜１７抗体の各種タンパクに対する反応性をＥＬＩＳＡ法によって調べた。タンパク質には、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ヒトＩｇＡ（図６および図７ではＨ−ＩｇＡと表記する）、ヒトＩｇＭ（図６および図７ではＨ−ＩｇＭと表記する）、ヒトＩｇＥ（図６および図７ではＨ−ＩｇＥと表記する）、ヒト血清アルブミン（図８および図９ではＨＳＡと表記する）、ヒトヘモグロビン（図８および図９ではＨ−ｈｅｍｏと表記する）、ウシ血清アルブミン（図８および図９ではＢＳＡと表記する）、Keyhole Lympet Hemocyanine（図８および図９ではＫＬＨと表記する）を用いた。図６〜図９に示すように、ＥＴＮＦ−１、３〜７、９〜１４抗体は高い反応特異性を示した。ＥＴＮＦ−２および１６抗体はヒトＩｇＡおよびＩｇＥに対して交差反応した。また、ＥＴＮＦ−８、１５、および１７抗体には非特異的な反応が認められた。
【０１１８】
〔実施例２：ＥＴＮＦ−６抗体の可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列の決定〕
以下に示す方法で、実施例１の抗ＴＮＦ−α抗体（ＥＴＮＦ−６抗体）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を決定した。さらに、上記塩基配列から、当該抗ＴＮＦ−α抗体の可変領域の推定アミノ酸配列を決定した。
【０１１９】
（１．抗体産生細胞の培養）
抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマは、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５．５％で２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で１×１０７〜５×１０７細胞が得られるまで培養した。培養後の細胞培養液を５０ｍｌ遠心チューブに移し、１４００ｒｐｍで６分間遠心分離することにより、細胞を回収した。培地をアスピレーターにて除去後、１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、１つのチューブにまとめて再度１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行った。上清を吸引除去後、再度１０ｍｌのＰＢＳに懸濁して血球計算盤を使用し細胞数をカウントした。
【０１２０】
カウント後、１×１０７〜５×１０７細胞分の細胞懸濁液を採取し、再度１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行った。上清を除去後、ペーパータオル上で逆さにし完全に液を切った。アスピレートが不十分であれば、再度遠心し、マイクロピペットで残ったＰＢＳを除去した。
【０１２１】
（２．ｍＲＮＡの抽出と精製）
ｍＲＮＡの抽出はQuickPrepTMmRNA purirfcation Kit (amershampharmacia biotect)を用いて、推奨プロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。
【０１２２】
まず、Extraction bufferを３７℃のインキュベーターに約３０分間静置し、結晶を完全に溶解させた。こうして得られたExtraction buffer １．５ｍｌを上記（１．抗体産生細胞の培養）で回収した細胞のペレットに添加した。そして、２１Ｇの針に数回通すことで細胞を破砕した。その後、その破砕溶液に３ｍｌのElution bufferを加え、さらに細胞を破砕した。こうして得られた破砕溶液をRNase freeの １．５ｍｌマイクロチューブ４本に分注した。その後、室温（２５℃）、１８０００×ｇで、２０分間遠心分離を行い、その上清を後述のoligo(dT)-cellulose spin columnに添加するサンプルとした。
【０１２３】
ｍＲＮＡの単離は、まず、oligo(dT)-cellulose spin columnの樹脂を懸濁し、上下のキャップを外して１５ｍｌ遠心チューブにセットし、１３００ｒｐｍで１分４５秒間遠心分離を行って保存液を除去した。そして、下キャップを装着し、タンパク質およびＤＮＡが除去された上記サンプル（上清）を４ｍｌ添加した。その後、上キャップをしっかりと取り付け、oligo(dT)-cellulose spin columnの樹脂を懸濁した後、１０〜１５分間、転倒混和し、樹脂にｍＲＮＡを吸着させた。そして、上下のキャップを装着し、１４００ｒｐｍで、１〜２分間遠心分離を行った。その後、上のキャップを取り、RNase freeのマイクロピペットを使用し、上清を除去した。そこに、３ｍｌのHigh-salt bufferを添加し、緩やかに２分間ほど混和した。その後、上キャップを装着し、１４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上清を除去した。さらにこの操作を２回繰り返した。
【０１２４】
次に、３ｍｌのLow---salt bufferを添加して緩やかに１〜２分間程度懸濁した後、キャップを装着し、１５ｍｌチューブに入れ、１４００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行った。そして、生じた上清を除去した。その後、下のキャップを外し、スピンカラムの表面が平らになるように、３ｍｌのLow-salt bufferを壁に添わせながら回し入れた。その後、１５ｍｌチューブに設置し、１３００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行った。
【０１２５】
次に、新しい１５ｍｌ遠心チューブを用意し、ｍＲＮＡ回収用の１．５ｍｌマイクロチューブ２個の蓋をハサミで切断後、遠心チューブに重ねて入れ、溶出用チューブとした。溶出用チューブにカラムを入れ、そこに６５℃に加熱していた０．２５ｍｌのElution bufferを回し入れるように添加した。その後、１３００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行った。この操作を２回繰り返した。溶出液は、ｍＲＮＡ画分として１．５ｍｌマイクロチューブ２本に回収し、氷上に静置した。別に定量用のマイクロチューブを準備し、１０μｌのｍＲＮＡ画分を取り、７０μｌのElution bufferを加え、希釈した(１／８希釈)。その希釈した溶液を用いて、吸光度ブランクをElution Bufferとして、Ａ２６０およびＡ２８０を測定した。なお、セルは測定前に予め、塩酸：メタノール＝１：１の溶液に１時間ほど浸し、RNase freeにし、ＤＥＰＣ処理水で洗浄しておいた。また、ＲＮＡの濃度は下記式を用いて算出した。
【０１２６】
ＲＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）＝Ａ２６０×希釈率×４０
次に、２等分され、氷上に静置しておいたｍＲＮＡ画分（ｍＲＮＡ抽出溶液）に、１／１０量の３Ｍ酢酸カリウム、１／５０量のグリコーゲン、２．５倍量の９５％エタノールを加えて攪拌した。その後、−３０℃に約４０分間置き、その後、４℃、１５０００ｒｐｍで、５分間遠心分離した後、−８０℃で保存した。
【０１２７】
なお、実験に用いたガラスおよび金属類（実験器具）には、２４０℃で２時間乾熱滅菌したものを用い、プラスチック類の実験器具にはRNase freeおよびDNase freeのものを用いた。
【０１２８】
（３．ｍＲＮＡからのＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成）
−８０℃でエタノール沈澱の状態で保存していたｍＲＮＡを取り出し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を除去した。
【０１２９】
その後、１ｍｌの氷冷した７５％エタノール（予めＤＥＰＣ処理水で調製し、−３０℃に用意しておいた。）をペレットのない側からそっと加えてリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、その後、マイクロピペットで上清を除去した。そして、１５分間真空乾燥を行い、０．２μｇ／μｌとなるようにＤＥＰＣ処理水を添加し１時間静置し溶解した。溶解後、確認のために、ｍＲＮＡ溶液をＤＥＰＣ処理水でＡ２６０＝１前後になるように希釈し吸光度を測定した。ｃＤＮＡの合成はAMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）のプロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。
【０１３０】
RNase freeの０．２ｍｌマイクロチューブにｍＲＮＡ ２μｇ分のｍＲＮＡ溶液を添加した。そのチューブにpd(T)12-18primer（０．５μｇ／ｍｌ）を２μｌ、ＤＥＰＣ処理水をｍＲＮＡ溶液と合わせて１７μｌとなるように添加し、混合後、７０℃で１０分間アニーリング処理を行った。その後、氷上に置き、０．２５Ｍ ＤＴＴを１μｌ、RNase inhibitorを１μｌ、５×Reaction bufferを５μｌ添加し、よく混合した。更にＡＭＶ−ＲＴを１μｌ添加し緩やかに攪拌し、４１℃で６０分間伸長反応を行った。処理時間終了後氷上に置き、反応を止め、−３０℃に保存した。
【０１３１】
（４．ＰＣＲによる抗体可変領域遺伝子の増幅）
Mouse Ig primer Kit（Novagen）、NovaTaqTM Hot Start DNA Polymerase Kit（Novagen）を使用し、上記（３．ｍＲＮＡからのＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成）で得られたｃＤＮＡから、抗体遺伝子可変領域の増幅を行った。
【０１３２】
まず、抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の増幅には、Positive Control、Negative Control、primerの本数分準備したＰＣＲチューブのそれぞれに、３７．２５μｌの滅菌超純水、０．５μｌの３’−Primer（最終濃度５ｐｍｏｌ）、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2（最終濃度１．５ｍＭ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（最終濃度０．２ｍＭ）、５μｌの１０×NovaTaq Hot Start Buffer（最終濃度１×）、０．２５μｌのNovaTaq Hot Start DNA Polymerase（最終濃度１．２５Ｕ）をサンプルの本数＋０．５のスケールで混合した。）を加えて、そこに、１μｌの５’−Primer（最終濃度５ｐｍｏｌ）、２μｌのｃＤＮＡ溶液を添加した。なお、Positive Controlは Mouse Ig primer Kitに付属のものを使用し、Negative Controlには滅菌超純水を使用した。
【０１３３】
以上の組成物をよく混合し、Biometra社T-GRADIENT、TaKaRa社PCR Thermal cycler PERSONALを使用しＰＣＲを行った。反応条件として、Ｌ鎖は９５℃で７分間のプレヒート後、熱変性を９８℃で１５秒間、伸長反応を７４℃で１５秒間に固定し、アニーリング温度を７０℃、６６℃、６２℃、５８℃、５４℃、および５０℃と６段階に４℃ずつ下げるStep Down法を行った。なお、アニーリング時間は、１５秒間に固定した。上記の３ステップを５段階まで３サイクルずつ行い、６段階目を１０サイクル行った。Ｈ鎖は９５℃で１０分間のプレヒート後、熱変性を９４℃で１分間、アニーリング温度５０℃で２分間、伸長反応を７２℃で２分間の３ステップを４０サイクル行った後、７２℃の伸長反応を１０分間行った。ＰＣＲ終了後、アガロース電気泳動により、抗体可変領域遺伝子の増幅を確認した。
【０１３４】
（５．抗体可変領域遺伝子のクローニング）
クローニングは、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen）を用いて、以下のようにして行った。
【０１３５】
アガロースゲル電気泳動で抗体可変領域と予測されるＤＮＡの増幅を確認したＰＣＲ産物を２μｌ、salt Solutionを１μｌ、および滅菌水を２μｌ、氷上にてＰＣＲチューブに分注し攪拌した。さらに、１μｌのTOPO vectorを添加し緩やかに攪拌後、３０分間、室温でライゲーション反応させた。３０分間の反応後直ちに、上記ＰＣＲチューブを氷上に置き、反応を止めた。このようにして調製された反応液を以下「ライゲーション反応液」と称する。
【０１３６】
使用直前に−８０℃のフリーザーからOne Shot TOP10 Chemically Competent E. coli（Invitrogen）を取り出し氷上で溶解した。そこに、氷上に置いていた上記ライゲーション反応液を２μｌ加え、氷上で３０分間インキュベーションし、コンピテントセル間にＤＮＡを拡散させた。反応終了後、４２℃で４５秒間、熱ショックを与えてＤＮＡを取り込ませ、氷上に戻し、２分間静置した。そこに、予め、室温に戻しておいた２５０μｌのＳＯＣ培地をクリーンベンチ内で加え、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間培養した。
【０１３７】
１時間の培養中に、予め準備しておいたアンピシリンを含むＬＢプレート培地１枚に対し、１００μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧストックと、２０μｌの５０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを塗り広げ、１５〜３０分間乾燥させた。
【０１３８】
培養終了後、アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ／ＬＢプレート培地に、培養後の大腸菌液を５０μｌ、および１００μｌの２種類の濃度で塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
【０１３９】
翌日、形質転換後の青／白判定によりＤＮＡ断片がインサートされていると考えられる白コロニーを１２コロニー選択し、偽陽性を除くため、さらに画線培養を行った。画線培養では、形質転換後の大腸菌を培養したのと同様にアンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ／ＬＢプレート培地を使用し、白金耳で単一コロニーが得られるように画線し、３７℃で一晩培養した。
【０１４０】
（６．プラスミドＤＮＡの調製）
上記（５．抗体可変領域遺伝子のクローニング）で得られた大腸菌をアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。大腸菌培養液から０．７５ｍｌを取り、０．２ｍｌの８０％グリセロールと混合し、大腸菌のグリセロールストックとして−８０℃で保存した。プラスミドＤＮＡは残りの培養液を用いてアルカリＳＤＳ法により調製した。
【０１４１】
残りの約５．２５ｍｌの培養液を１．５ｍｌマイクロチューブ６本に移し、１２０００ｒｐｍで１分間、遠心分離して集菌し、上清を丁寧に吸引除去した。そこに、Solution I（５０ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１００μｌ加えてボルテックスにかけよく懸濁した。
【０１４２】
そこに、Solution II（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を２００μｌ加えて転倒混和後、氷中に５分間置き、Solution III（３Ｍ酢酸カリウム、２Ｍ酢酸）を１５０μｌ加え、緩やかに撹拌した後、氷上に５分間置いた。
【０１４３】
そして、４℃、１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離を行った後、沈殿が入らない様に注意しながら上清を採り、新しい１．５ｍｌマイクロチューブに移した。このとき得られ上清と等量のフェノール・クロロホルムを加えて攪拌した後、４℃、１５０００ｒｐｍで、２分間遠心分離した。さらに同じ作業を繰り返し、２回のフェノール・クロロホルム処理を行った後、上層（水層）を別のマイクロチューブに移した。そこに、２．５倍等量の氷冷エタノールを加えて上下に振って攪拌し、−７０℃で５分間静置した。そして、４℃、１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離を行った後、上清を除去した。そして、氷冷７０％エタノールを１ｍｌ加え、ペレットをリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を除去し、１５分間真空乾燥した。
【０１４４】
乾燥終了後、４５μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に、ペレットを溶解し、RNase A溶液（５ｍｇ／ｍｌ RNase A、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を５μｌ加えた(終濃度：５０μｇ／ｍｌ)。その後、２本のチューブの溶液を１本のチューブにまとめ、３７℃で１時間反応させた。
【０１４５】
反応終了後、２／３等量のＰＥＧ（１３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．８Ｍ ＮａＣｌ）を入れ、氷上に１時間以上置いた。その後、４℃、１５０００ｒｐｍで、１５分間遠心分離を行い、上清を除去した。そこに、７０％エタノールを１ｍｌ加えてリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離を行った。
【０１４６】
上清を除去後、真空乾燥し、１サンプルにつき５０μｌの滅菌水に溶解し、１本のチューブにまとめプラスミド溶液とした。そして、アガロース電気泳動によるバンド比較にてサンプルのＤＮＡ濃度を推測した。
【０１４７】
（７．塩基配列の決定）
Thermo SequenaseTMCyTM5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia)を用いて、塩基配列の決定を行った。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの４種類の塩基用に、ＰＣＲチューブを用意し、d(N)TP/Cy5.5-dd(N)TPを各サンプル分、１μｌずつ分注した。
【０１４８】
次に、ＤＮＡ／プライマーミックスの調製を行った。（６．プラスミドＤＮＡの調製）で調製された１．５μｇのＤＮＡ、３．５μｌのReaction Buffer、１μｌのTOPO13 Reverse（４ｐｍｏｌ／μｌ）（Invitrogen）、および２μｌのThermo Sequenase（１０Ｕ／μｌ）を混合し、さらに滅菌超純水を添加して全量が３１．５μｌとなるようにした。これを上記のＰＣＲチューブに７μｌずつ分注し、すみやかにBiometoraサーマルサイクラーにセットし、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１２０秒間の反応サイクルを３０サイクル行い、４℃で冷却し反応を停止させた。
【０１４９】
反応終了後、サンプルをＰＣＲチューブから１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを１μｌ、７．５Ｍ酢酸アンモニウムを２μｌ、および９８％エタノールを３０μｌ添加し、よく混合した。１０分間氷上で静置した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その後、キムワイプ上でデカンテーションにより上清を除去し、７０％エタノールを２００μｌ添加し、ペレットおよびチューブ内壁をリンスした。そして１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、その後、マイクロピペットを使用し、上清を丁寧に除去した。そして、遮光してペレットを乾燥させ、６μｌのLoading Dyeに溶解し、７２℃で、３分間熱処理を行い、LONG-READ TOWERTM System (Amersham Pharmacia Biotech.)に各２μｌずつローディングし、解析を行った。得られた塩基配列は、
ＤＮＡＳＩＳソフトウェアを使用して解析され、アミノ酸配列に翻訳された。
【０１５０】
その結果、抗ＴＮＦ−α抗体であるＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡは、それぞれ、配列番号３および配列番号４に示される塩基配列からなることが分かった。また、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域の推定アミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２に示されるアミノ酸配列であった。
【０１５１】
〔実施例３：ＥＴＮＦ−６抗体の可変領域の立体構造予測〕
実施例２で決定した塩基配列から推定したＥＴＮＦ−６抗体の可変領域のアミノ酸配列（配列番号１および配列番号２を参照）をもとに、ＡｂＭ（Oxford Molecular、 Oxford、UK）により目的抗体ＣＤＲ領域のループ構造とＦＲ領域の立体構造を予測した。ＡｂＭで予測された立体構造をもとに、InsightII/Discover3（Molecular Simulatoin、USA）により分子間力計算を行い、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
【０１５２】
さらに、PPC Protein AdviSer（FQS、Japan）を用いて、立体構造中のセリンプロテアーゼの触媒三つ組み残基を構成するＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐの残基群を探索した。その結果を図１０〜図１３に示す。
【０１５３】
図１０および図１２は、それぞれＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の予測立体構造を模式的に示す図である。また、図１０および図１２には、触媒三つ組残基を構成すると思われるアミノ酸残基（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ）が記載されている。また、図１０および図１２では、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖のそれぞれのＣＤＲ１〜３をリボンで表現している。
【０１５４】
図１１および図１３は、それぞれ、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列を示すものであり、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖それぞれのＣＤＲ１〜３には、下線が付されている。
【０１５５】
図１０および図１１に示すように、Ｈ鎖については、Ｈｉｓ３５−Ｓｅｒ９９のＣα間は７．１２Å、Ｈｉｓ３５−Ａｓｐ１０１のＣα間は９．８７Åと空間的に近い位置で３残基がＣＤＲ部分に存在すると予測された。その結果、これら３つのアミノ酸残基は、触媒三つ組残基様構造を構成すると考えられる。
【０１５６】
また、図１２および図１３に示すように、Ｌ鎖については、触媒三つ組残基を構成すると思われるアミノ酸残基（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ）は、ＣＤＲ部分に存在していないと予測された。しかし、Ｈｉｓ８０−Ｓｅｒ６７のＣα間は７．９８Å、Ｈｉｓ８０−Ａｓｐ８５のＣα間は１２．６３Å、Ｈｉｓ８０−Ａｓｐ８６は１０．３６Åと３残基が空間的に近い位置に存在すると予測された。
【０１５７】
また、現在見出されている天然型抗体酵素のトリプシンや当研究室で見出された抗体酵素の触媒三つ組残基（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ）の距離と比較したところ、これらと同じようにＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖では、ＨｉｓとＳｅｒとの距離は１０Å以内、ＨｉｓとＡｓｐとの距離は１５Å以内であった（表７を参照）。
【０１５８】
【表７】
【０１５９】
これらの結果をこれまでの本発明者らによる多くの研究成果（例えば、Appl. Biochem. Biotech., 83, 209-220(2000); J. Immunol. Methods, 269, 283-298(2002); Immunol. Lett. 86, 249-257(2003); Biotechnol. Bioeng., 84(7), 485-493(2003); 化学工業、54, 368-372(2003); Biotechnol. Bioeng. 86(2), 217-225(2004); 科学、75(11), 1254-1259(2005)を参照）に照らして考察したところ、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖は、抗体酵素であることが示唆された。
【０１６０】
〔実施例４：ＥＴＮＦ−６モノクローナル抗体の大量取得と精製〕
予めプリスタンを投与したＢａｌｂ／ｃマウスに実施例１の抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマを１×１０６個投与後、腹水を採取することにより、ＥＴＮＦ−６モノクローナル抗体を大量に取得することができた。また、モノクローナル抗体の精製は、以下の方法に従って行った。
【０１６１】
（１．塩析）
腹水約８ｍｌを同量のＰＢＳで希釈後、濾紙を使用して濾過してフィブリンを除去した。これを２本の高速冷却遠心チューブに分け、各々、同量の飽和硫酸アンモニウムをドロップワイズで加えた。これを氷中で３０分間静置し、その後、４℃、１００００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した。デカンテーションにより上清を除去し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。再度、等量の飽和硫酸アンモニウムを添加して、塩析し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。これを、１本のチューブに合わせ、ＰＢＳに対して２回透析した。
【０１６２】
（２．カラム精製）
透析終了後、抗体の精製を行った。操作はMAPS-IIキット（BIO-RAD社製/ProteinAを使った精製キット）の説明に従い、４℃で行った。使用する試薬として、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、Elution buffer、および２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を以下のようにして調製した。０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳは、０．１ｇのＮａＮ３を２００ｍｌのＰＢＳに溶解した。Binding bufferは、４７．１ｇのBinding buffer粉末を蒸留水に溶解し、１５０ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが９±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。Elution bufferは２．３ｇのElution buffer粉末を蒸留水に溶解し、１００ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが３±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、１２．１１ｇのＴｒｉｓを蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを８．０に調整した後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした。
【０１６３】
透析終了後、上記の塩析済みの腹水を、腹水: Binding buffer＝１:１．２になるように希釈した。不溶物が認められる時には、濾紙で濾過して取り除いた。また、精製操作前に、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、およびElution buffer、並びにサンプル（上記腹水の濾液）を脱気した。
【０１６４】
アフィゲルプロテインＡを充填し、カラムを上記Binding bufferで洗浄した。ＵＶ ２８０ｎｍの吸光度をモニターし、ベースラインが落ち着くまで上記Binding bufferでゲルを洗浄した。流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎに調節し、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、上記サンプルをカラムに供した。
【０１６５】
次に、５０ｍｌ以上のBinding bufferを供し、抗体以外の夾雑物質を除去した。ここで検出したピーク部分は、素通り画分として採取した。素通り画分を分取後、ベースラインが落ち着いたら、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、４５ｍｌのElution bufferを添加し、アフィゲルプロテインＡに結合した抗体を溶出させ、ピーク部分を抗体画分として分取した。回収した各画分について、ｐＨ試験紙でｐＨを測定し、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。上記抗体画分（抗体液）は、ＰＢＳに対して２回透析した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認した。純度の高い画分のみを回収し、ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD）でタンパク濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で（１ｍｇ／ｍｌ未満の場合は濃縮して）凍結保存した。
【０１６６】
〔実施例５：ＥＴＮＦ−６抗体の重鎖(Ｈ鎖)および軽鎖（Ｌ鎖）の分離・精製〕
実施例４で精製したＥＴＮＦ−６抗体を用いて、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の分離精製を以下に示す方法に従い、行った。
【０１６７】
（１．限外濾過）
実施例４で精製した抗体溶液５ｍｇ分を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２回透析した。透析の終了後の抗体溶液を、セントリプレップ−１０を用いて、４℃、２８００ｒｐｍで遠心分離し、約１ｍｌになるまで限外濾過により濃縮した。さらに、５ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、約１ｍｌになるまで再び遠心分離した。この操作を再度行い、限外濾過による濃縮後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で抗体溶液を２．７ｍｌに調整し、褐色瓶に入れ以下の実験に使用するまで低温で保存した。
【０１６８】
（２．ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の分離）
まず、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液、および上記抗体溶液２．７ｍｌをそれぞれ脱気した。２Ｍ ２−メルカプトエタノール（以下、「２−ＭＥ」ともいう）と、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）とを抗体溶液に加え、ピペッティングで軽く撹拌したのち、１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液でｐＨ８．０に調整し、窒素封入を行った。その後、インキュベーター内で、１５℃、３時間スターラーで撹拌しながら還元反応を行った。還元反応後、上記抗体溶液に脱気した０．６Ｍヨードアセトアミド溶液を６００μｌ加え混合した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液でｐＨ８．０に調整した。そして、１５℃で、１５分間撹拌しながらアルキル化反応を行った。次に、ディスクフィルター（０．２μｍ）を使用し、上記抗体溶液から粒子の除去を行った。セントリプレップ−１０を用いて、液量が約０．５ｍｌになるまで濃縮した。
【０１６９】
（３．サイズ排除ＨＰＬＣによるＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の精製）
ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の精製は、上記のようにして得られた還元アルキル化処理後の抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより行った。
【０１７０】
サイズ排除クロマトグラフィーシステムとして、ＰＵ−２０８０ Ｐｌｕｓ（ＪＡＳＣＯ社製）を用いた。また、カラムには、Protein-PakTM300SW（φ７．５ｍｍ×３００ｍｍ；Waters製）を用いた。上記カラムの平衡化は、移動相に用いる６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ６．５）を、０．１５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、約２時間流すことにより行った。サンプル（上記還元アルキル化処理後の抗体溶液）は、２〜３回に分けて供した。Ｈ鎖およびＬ鎖に相当する画分を分取した。分取後の各画分はＰＢＳに対して透析を行い、Ｈ鎖およびＬ鎖をRefoldingした。バッファーを１５ｍＭ ＰＢに交換した後、クリーンベンチ内でサンプルを回収した。ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD）でＨ鎖およびＬ鎖の濃度を測定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認して４℃で保存した。このようにして調製したＨ鎖およびＬ鎖の液量と濃度とを表８に示す。
【０１７１】
【表８】
【０１７２】
〔実施例６：ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖におけるペプチダーゼ活性〕
天然型抗体酵素は、タンパク質を基質として用いる場合には標的タンパク質を特異的に分解するという特徴を持つ。しかし、ペプチド基質においては、非特異的に分解することが分かっている。そこで、これまでの抗体酵素のペプチダーゼ活性試験で基質として用いてきたTP41-1 peptide(H2N-TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD-COOH : ２１ｍｅｒ、配列番号５)を使用してＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖が上記ペプチドに対する分解能を有するか検討した。
【０１７３】
実験操作は全てクリーンベンチ内で行い、使用する試験管、緩衝液などは、すべて滅菌処理を行った後、使用した。
【０１７４】
粉末のTP41-1 peptideを必要量はかり、１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）に溶解した後に、ウルトラフリーＭＣ（φ０．２２μｍ、MILLIPORE製)を使って、濾過滅菌した。また、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖についても、１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）を用いて濃度を調整した。最終的に、TP41-1 peptideの濃度が１２０μＭ、Ｌ鎖の濃度が０．８μＭ、Ｈ鎖の濃度が０．４μＭになるように試験管内で混合し、２５℃で反応させた。
【０１７５】
反応の経時時間ごとに、反応液の一部をクリーンベンチ内で採取し、ウルトラフリーＣ３(φ０．５μｍ、MILLIPORE製)で除粒子した。これを逆相ＨＰＬＣで分析することにより、ペプチド基質の濃度変化を経時的に追跡した。逆相ＨＰＬＣの分析条件には、puresil C18カラム（Waters製）を使用した。移動相には０．０８％ＴＦＡを含む１３％アセトニトリルを用い、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、モニター波長２１４ｎｍ、分析温度を４０℃とした。その結果を、図１４〜図１７に示す。図１４および図１５はＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖の結果を、図１６および図１７は、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖の結果を示す。また、図１５および図１７は、各経時時間で採取したサンプルのＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを示し、図１４および図１６は、それらのＨＰＬＣのクロマトグラムから算出した各経時時間におけるTP41-1 peptide量をグラフに示したものである。なお、図１５の（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、０時間後、２７．７時間後、５０．４時間後、７３．２時間後の結果を示す。また、図１７の（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、０．３時間後、２７．７時間後、５０．７時間後、５８．７時間後の結果を示す。
【０１７６】
図１４〜図１７に示すように、反応時間が経過するにつれ、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖またはＬ鎖を含む反応液では、ペプチド基質の濃度の減少が見られた。具体的には、ペプチド基質の濃度は、反応開始後２７時間ごろから減少していき、Ｌ鎖を含む反応液では７３時間で（図１４および図１５を参照）、Ｈ鎖を含む反応液では５９時間で完全にペプチドが消失した（図１６および図１７を参照）。また、ペプチド基質の濃度の減少に伴い、当該ペプチドの分解断片と思われるピークも出現した。
【０１７７】
また、このＨ鎖およびＬ鎖はどちらも、分解速度の遅い「誘導期」と高活性を示す「活性期」とからなる２相性の分解曲線を描いていた。本発明者らは、これまでの研究において、通常の酵素の特性とは異なる天然型抗体酵素の特性として、２相性の分解曲線があることを見出している。これは、上記誘導期において抗体の立体構造に変化が起こり、抗体の酵素活性が高い構造に変化することにより、活性期が現れると推測されている。
【０１７８】
このように、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖が天然型抗体酵素と同様の特性を示したことは、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖が抗体酵素であることを示唆するものである。
【０１７９】
〔実施例７：ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖における抗原分解能〕
実施例６に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖はペプチダーゼ活性を有することが明らかとなった。そこで、次にＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖が、抗原タンパクであるＴＮＦ−αを分解する能力を有するか否かの検討を行った。
【０１８０】
抗原タンパクには、実施例１で用いたＴＮＦ−αを用いた。まず、バッファーを１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）に交換した。続いて、濃度を６００μｇ／ｍｌに調整した後、濾過滅菌して用いた。
【０１８１】
また、コントロールタンパクとしてウマ心臓由来のミオグロビン（SIGMA M1882-250MG）、およびＢＳＡ（BIO-RAD Protein Assay Standard II）についても、同様に分解試験を行った。ミオグロビンおよびＢＳＡは、粉末を必要量測り取り、１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）に溶解後、ウルトラフリーＭＣ（φ０．２２μｍ、MILLIPORE製）により濾過滅菌した。分解実験における終濃度は、それぞれミオグロビンが０．９μＭ（１５μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡが０．３μＭ（２０μｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−αが１．１μＭ（２０μｇ／ｍｌ）、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖が０．４μＭ（１０μｇ／ｍｌ）、およびＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖が０．２μＭ（１０μｇ／ｍｌ）とした。
【０１８２】
反応時間４、８、１２、２４時間、４８時間、および７４時間において、各タンパク質の反応液の一部をクリーンベンチ内で分取し、各タンパク質の経時変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥで追跡した。その結果を、図１８〜図２１に示す。図１８および図１９は、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖とＴＮＦ−αとの反応結果を示すものである。
【０１８３】
まず、図１８（ｂ）に示すように、ネガティブコントロールであるＴＮＦ−αのみの反応液では、１７．０ｋＤａに太いバンドが検出され、このバンドは７４時間経過しても変化はみられなかった。
【０１８４】
一方、図１８（ａ）に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖とＴＮＦ−αとの反応液では、反応開始直後からＴＮＦ−αの太いバンドの上部が薄くなり、下部の１６．８ｋＤａのバンドが鮮明になってきた。また、反応時間４時間では、１５．０ｋＤａおよび１３．３ｋＤａ付近にＴＮＦ−αの分解断片と思われるバンドが出現した。反応時間が８時間、１６時間と経過するにつれて、１６．８ｋＤａのバンドは強くなり、かつ、１３．３ｋＤａのバンドおよびその下に、このフラグメントがさらに断片化されたと思われる複数のバンドが出現してきた。反応時間４８時間では、もとの１７．０ｋＤａの太いバンドは細くなり、１６．８ｋＤａのバンドのみが明らかに強く検出された。
【０１８５】
Ｎ末端アミノ酸配列の結果、この細いバンドはＴＮＦ−αのＮ末端から５番目のセリンと６番目のアルギニンとの間のペプチド結合が切断されたものであることが判明した。また、１５．０ｋＤａに現れるバンドは、Ｎ末端から２０番目のプロリンと２１番目のグルタミンとの間のペプチド結合が切断されて生じる断片であった。さらに、１３．３ｋＤａに現れるバンドは、Ｎ末端から３６番目のロイシンと３７番目のロイシンとの間のペプチド結合が切断されて生じる断片であった。つまり、ＴＮＦ−αは反応時間４時間あたりから、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖による分解がはじまり、２０〜３０時間でほとんど分解されたものと考えられる。以上の結果から、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖は抗体酵素であることが実証された。
【０１８６】
図１９に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖についても同様の分解傾向が見られ、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖においても抗原分解活性が見られた。
【０１８７】
なお、本実施例において、Ｈ鎖単独あるいはＬ鎖単独では時間と共に自己消化を起こし、いくつかの抗体酵素は、自己消化により生じる断片と結びついて多量体を形成していた（図１８（ｃ）および図１９（ｃ）を参照）。
【０１８８】
次に、コントロールタンパクのミオグロビンのみの反応液では、図２０（ｂ）に示すように、１８．０ｋＤａにバンドが認められ、このバンドは７４時間経過しても変化は見られなかった。Ｌ鎖とミオグロビンとの反応液では、図２０（ａ）に示すように、高分子側と低分子側に若干バンドが見られたが、ミオグロビンには変化が見られなかった。また、Ｌ鎖のみの反応液でも、図１９（ｃ）に示すように、同様のバンドが見られた。このため、これらのバンドは、ミオグロビンの分解断片ではなく、Ｌ鎖由来の断片であると考えられる。
【０１８９】
また、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖とＢＳＡと反応の結果でも、図２０（ｃ）に示すように、８時間ごろから若干ＢＳＡより低分子側のバンドが濃くなっていた。しかし、ＢＳＡと思われるバンドには変化は見られなかったことから、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖は、ＢＳＡの分解活性を有さないと考えられる。
【０１９０】
また、Ｈ鎖についてもＬ鎖と同様に、図２１（ａ）および（ｂ）に示すように、にミオグロビンには変化が見られなかった。さらに、ＢＳＡとＨ鎖との反応液では、図２１（ｃ）に示すように、Ｌ鎖と同様に８時間ごろから若干ＢＳＡより低分子側のバンドが濃くなっていた。しかし、これらのバンドもまた、Ｈ鎖由来の分解断片であると考えられる（図１８（ｃ）および図２１（ｃ）を参照）。以上の結果より、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖は、ＴＮＦ−αを特異的に分解する活性を有する抗体酵素であることが明らかとなった。
【０１９１】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
以上のように、本発明にかかる抗体酵素は、ＴＮＦ−αに対する抗体として機能し、かつ、ＴＮＦ−αを切断および／または分解することができる抗体酵素であるため、当該抗体酵素を用いることにより、効率よくＴＮＦ−αを分解することができる。それゆえ、本発明は、関節リウマチやＣＯＰＤのようにＴＮＦ−αの過剰産生により引き起こされる疾患の予防や治療に利用することができる。さらに、本発明は、ＴＮＦ−αを利用する医療業、製薬産業、試薬産業、医療機器産業、食品産業等に幅広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（初回）した後の力価測定（初回免疫より９日後）の結果を示すグラフである。
【図２】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（２回目）した後の力価測定（初回免疫より２３日後）の結果を示すグラフである。
【図３】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（３回目）した後の力価測定（初回免疫より３７日後）の結果を示すグラフである。
【図４】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（４回目）した後の力価測定（初回免疫より５２日後）の結果を示すグラフである。
【図５】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（最終）した後の力価測定（マウスＩについては、初回免疫より４３日後；マウスＩＩについては初回免疫より１０８日後）の結果を示すグラフである。
【図６】本実施例において、ＥＴＮＦ−１〜８抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図７】本実施例において、ＥＴＮＦ−９〜１７抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図８】本実施例において、ＥＴＮＦ−１〜８抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図９】本実施例において、ＥＴＮＦ−９〜１７抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖可変領域の立体構造を予測した結果を示す図である。
【図１１】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖可変領域の立体構造を予測した結果を示す図である。
【図１３】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖によるペプチド基質の分解をモニターした結果を示すグラフである。
【図１５】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖によるペプチド基質の分解産物をＨＰＬＣにより経時的に分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１６】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖によるペプチド基質の分解をモニターした結果を示すグラフである。
【図１７】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖によるペプチド基質の分解産物をＨＰＬＣにより経時的に分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１８】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖によるＴＮＦ−αの分解を電気泳動によりモニターした結果を示す図である。
【図１９】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖によるＴＮＦ−αの分解を電気泳動によりモニターした結果を示す図である。
【図２０】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖によるコントロールタンパク質（ミオグロビンおよびＢＳＡ）の分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりモニターした結果を示す図である。
【図２１】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖によるコントロールタンパク質（ミオグロビンおよびＢＳＡ）の分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりモニターした結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体酵素およびその利用に関するものであって、特に、リウマチや慢性閉塞性肺炎疾患のようなサイトカインの産生異常により発症する疾患を予防または治療する目的で用いることが可能な抗体酵素に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、自己成分が異物として認識されることにより、自己抗体が産生されたり、自己反応性リンパ球が出現したりする状態（自己免疫と呼ばれる）によって引き起こされる病態である。具体的には、通常、免疫系は体の中に侵入した細菌やウイルスを排除して体を防御するように働くが、自己に対して過剰な免疫応答を起こさない。つまり、自己成分は免疫寛容を獲得しているのである。しかし、自己免疫疾患では、免疫寛容に何らかの異常が生じているため、上記のような病態が引き起こされる。
【０００３】
自己免疫疾患の代表的な疾患としては、例えば、慢性関節リウマチ、橋本病、全身性エリマトーデスなどを挙げることができる。
【０００４】
上記自己免疫疾患のうち、慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis；以下、「ＲＡ」ともいう）は、多発性関節炎を主徴とする原因不明の慢性炎症性疾患である。日本全国でＲＡ患者は７０万人とも１００万人ともいわれ、その数は高齢化に伴い年々増加する傾向がある。また、女性の患者が圧倒的に多く、ＲＡ患者の８割が女性といわれているが、その原因は分かっていない。
【０００５】
ＲＡの病因には、遺伝、免疫異常、内分泌、環境要因などが複雑に関与していると推測されている。しかし、はっきりとした病因は判明していない。病変の主座は関節滑膜であるが、進行すれば軟骨・骨を侵し、関節組織の破壊や変形へと至る。多くの関節が腫れ、そして痛みを伴い、歩くことをはじめ、日常生活動作が徐々に障害される難病である。関節以外に皮膚、肺、腎などの全身症状も伴うことも少なくない。病理組織学的には、リンパ球やマクロファージの炎症性細胞の浸潤、滑膜細胞の増殖などが起こるといわれている。
【０００６】
ＲＡの関節液あるいは滑膜細胞を用いた研究において、ＲＡの病態には炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインのアンバランスが原因であることが明らかにされている。さらに、その中心的役割をしているサイトカインは、腫瘍壊死因子（tumour necrosis factor;以下、「ＴＮＦ」ともいう）のＴＮＦ−αであるといわれている。具体的には、ＲＡ患者の関節液では、ＴＮＦ−αの濃度上昇が見られる。濃度が上昇したＴＮＦ−αは、（ａ）血管内皮細胞の接着分子の発現を誘導することにより、リンパ球などの白血球が炎症部位に浸潤するのを促進し、（ｂ）滑膜細胞に作用して、様々な炎症性サイトカインを産生させ、（ｃ）破骨細胞の分化・活性化を促進させることにより、関節破壊を誘発し、（ｄ）線維芽細胞を活性化し、線維芽細胞を増殖させるといった作用を示すことにより、関節破壊、炎症の持続・慢性化を起こすと考えられている。
【０００７】
ＲＡの治療は、通常、ＲＡ病態の病状の進行度によって選択すべき治療手段が異なる。一般的に確定診断を下すことが困難なＲＡ初期では、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他の自己免疫疾患との鑑別を同時に行う。ＲＡがさらに進行し、ＲＡとの確定診断が下されると、ＮＳＡＩＤに加えて疾患修飾性リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を投与する。さらに、疼痛のための薬物療法と共に関節機能の維持・回復に対して理学療法・装具療法を行う。また、関節破壊により日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
【特許文献１】特表２００３−５３５５９１号公報（平成１５（２００３）年１２月２日公表）
【特許文献２】特表２００５−５２２４５７号公報（平成１７（２００５）年７月２８日公表）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特定疾患に指定されている疾患が多く存在することからも分かるように、自己免疫疾患は、一般的に根治することが困難な疾患である。そのため、自己免疫疾患の診断や治療および予防に関する研究はされているが、未だ十分とはいえないのが現状である。
【０００９】
ところで、近年、上述したように自己免疫疾患ではＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージなどから様々なサイトカインが産生されていることが分かってきた。そのため、サイトカインを標的に自己免疫疾患の治療を行うことに注目が集まっており、抗サイトカイン療法の臨床応用が既に始まっている。例えば、サイトカインと特異的に結合し、その機能を阻害するモノクローナル抗体や、サイトカインの働きを阻害する可溶性受容体や拮抗物（アンタゴニスト）の利用が検討されている。より具体的には、特許文献１には、ヒトＴＮＦ−αに対して特異性を有する抗体分子を、ＴＮＦ−αによって媒介される慢性関節リウマチまたは骨関節炎を治療するための医薬の製造に用いることが開示されている。
【００１０】
また、サイトカインの産生異常との関連が知られている疾患は、自己免疫疾患だけではなく、例えば、慢性閉塞性肺炎疾患（以下、「ＣＯＰＤ」ともいう）についても、サイトカインの産生異常と疾患との関連性が知られている。より具体的には、特許文献２には、プロ炎症性サイトカインまたは炎症性サイトカインカスケードにより引き起こされる炎症を低減する方法として、脊椎動物の脳ムスカリン性レセプターを活性化させることを含む、炎症性サイトカインカスケードにより媒介される慢性閉塞性肺疾患の危険性にあるか、または該疾患を有する脊椎動物においてＴＮＦの放出を阻害する方法が開示されている。
【００１１】
このように、サイトカインは、様々な疾患の病態に関与しており、現在、サイトカインを標的分子とした疾患の治療や予防に関する技術の開発が求められている。
【００１２】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、リウマチやＣＯＰＤのようなサイトカインの産生異常により発症する疾患を予防または治療する目的で用いることが可能な抗体酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＲＡやＣＯＰＤの病態との関連性が知られているＴＮＦ−αに対する抗体酵素を製造可能であることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。
【００１４】
（１）ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であり、かつ、上記ＴＮＦ−αを分解することを特徴とする抗体酵素。
【００１５】
（２）上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする（１）に記載の抗体酵素。
【００１６】
（３）上記抗体酵素は、上記ＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでなることを特徴とする（１）または（２）に記載の抗体酵素。
【００１７】
（４）上記軽鎖可変領域は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドからなり、上記重鎖可変領域は、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドからなることを特徴とする（３）に記載の抗体酵素。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
【００１８】
（５）上記軽鎖可変領域は、配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなり、上記重鎖可変領域は、配列番号４に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなることを特徴とする（３）に記載の抗体酵素。
【００１９】
（６）以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
【００２０】
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体酵素を含み、生体内におけるＴＮＦ−α量の増加を抑制することを特徴とする薬学的組成物。
【００２１】
（８）（６）に記載のポリヌクレオチドを導入してなることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【００２２】
本発明にかかる抗体酵素は、以上のように、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であり、かつ、当該ＴＮＦ−αを分解するという構成を備えている。それゆえ、生体に投与した際、生体内のＴＮＦ−αを効率よく分解することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明について以下により具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００２４】
＜１．ＴＮＦ−α＞
本発明にかかる抗体酵素は、後述するようにヒトＴＮＦ−αを抗原として得られる抗体である。そこで、まず、本発明の抗体酵素の抗原であるＴＮＦ−αについて以下詳細に述べることとする。
【００２５】
ＴＮＦ−αは１９世紀末にWilliam Coleyによって発見されたサイトカインである。Coleyは細菌感染後に何人かの癌患者の腫瘍が退縮または消失していることを発見した。そこで細菌を投与し、癌の治療を試みたが一貫した結果が得られず、医学的治療とはなり得なかった。腫瘍を消失させる活性成分は、その後、ＬＰＳ(エンドトキシン)と呼ばれる複雑な生体分子であることが示された。ＬＰＳ自身には抗腫瘍活性を持っていない。ＬＰＳを投与された動物の血清には癌細胞に対して毒性を示す因子が含まれることが明らかにされた。ＬＰＳに対する反応の結果、特異的な細胞から産生されるこの因子がＴＮＦ(腫瘍壊死因子)である。
【００２６】
腫瘍壊死因子はインターフェロン、インターロイキンとは異なるサイトカイン・ファミリーの調節タンパクである。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βとの２種類のＴＮＦが知られている。両方とも同じ受容体に結合し同様の広い生物的反応を誘導するが、両者の相同性は、３０％以下と低い。特に腫瘍壊死因子としてのＴＮＦは、より正確にはＴＮＦ−αを指す。ＴＮＦ−αはカケクチン(cachectin)としても知られている。
【００２７】
ＴＮＦ−αの主な生物学的活性としては、食細胞の活性化、直接的または関節的な炎症の促進、形質転換細胞に対する細胞障害、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、コロニー刺激因子などのサイトカイン合成および産生の誘導が挙げられる。また、全身的に高濃度なＴＮＦ−αは、敗血症ショックや、自己免疫疾患を誘導する。
【００２８】
また、生物学的に活性なヒトＴＮＦ−αは、３つの同じポリペプチド・サブユニットが３回転軸対称で強く結合したホモトリマー(ホモ３量体)である。モノマーは生物学的に不活性であり、１７．３ｋＤａの分子量をもつ。なお、ＴＮＦ−αの特性については、下記の表１にまとめている。
【００２９】
【表１】
【００３０】
上記ヒトＴＮＦ−αとしては、具体的には、ＮＣＢＩアクセション番号ＣＡＡ２６６６９や、ＮＰ＿０００５８５に登録されているアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモ３量体を挙げることができる。
【００３１】
本発明において用いるヒトＴＮＦ−αを取得する方法は特に限定されるものではないが、例えば、市販品を購入することにより取得することができる。また、従来公知の遺伝子組み換え技術等を用いて製造して用いてもよい。例えば、上記例示したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子をベクター等に組み込んだ後、発現可能に適当な宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたポリペプチドを精製する等の方法により製造することができる。さらに、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成したり、無細胞系のタンパク質合成液を利用して合成したりすることもできる。
【００３２】
さらに、本発明においては、上記例示したＴＮＦ−αのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上述したようなヒトＴＮＦ−αの生理活性を有するポリペプチド、換言すれば、変異ヒトＴＮＦ−αをヒトＴＮＦ−αとして用いることもできる。
【００３３】
このような変異ヒトＴＮＦ−αの取得方法も特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて製造することにより、取得することができる。
【００３４】
また、本発明においては、上述したヒトＴＮＦ−αや変異ヒトＴＮＦ−αに加えて、それらのペプチド断片を抗原として用いてもよい。このようなペプチド断片を得る方法も特に限定されるものではない。例えば、上述しような方法で取得したヒトＴＮＦ−αや変異ヒトＴＮＦ−αを適当なプロテアーゼを用いて目的とするペプチド断片が得られるように切断すればよい。また、予め設計したペプチド断片をコードする遺伝子を上述したように従来公知の方法で発現させることにより製造してもよい。また、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成したり、無細胞系のタンパク質合成液を利用して合成したりすることもできる。
【００３５】
以上のようなヒトＴＮＦ−αやそのペプチド断片を抗原として用いることにより、後述する本発明にかかる抗体酵素を製造することができる。
【００３６】
＜２．本発明にかかる抗体酵素＞
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であって、かつ、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有する抗体酵素であればよい。
【００３７】
本明細書において、「抗体酵素」とは、抗体でありながら酵素作用を有するものであり、その中でも特に、その抗原タンパク質を標的として高い分解活性を示すものは「スーパー抗体酵素」と呼ばれる。上記「スーパー抗体酵素」は、標的としたタンパク質を完全分解することができ、しかも天然型酵素に近い活性を有する（Super Catalytic Antibody ［I］ : Decomposition of targeted protein by its antibody light chain. Hifumi, E., Okamoto, Y., Uda, T., J. Biosci. Bioeng., 88（3）, 323-327 （1999）を参照）。つまり、本発明にかかる抗体酵素は、ＴＮＦ−αを抗原とする抗体であり、当該ＴＮＦ−αを完全分解するため、「スーパー抗体酵素」に含まれるものである。また、本明細書における「抗体酵素」には、抗体の断片であって、当該抗体の抗原を認識し、当該抗原を分解する活性を有するものも含まれる。
【００３８】
また、本明細書において、「抗体の断片」とは、抗体を構成する各ペプチド鎖、例えば、軽鎖（以下、「Ｌ鎖」ともいう）や重鎖（以下、「Ｈ鎖」ともいう）を意味する。さらに、「抗体の断片」には、上記各ペプチド鎖内の一部の領域のペプチド断片、例えば、軽鎖可変領域や重鎖可変領域、およびそれら可変領域を含むペプチド断片も含まれる。
【００３９】
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＴＮＦ−αに対するポリクロナール抗体であってもよいが、ヒトＴＮＦ−αに対するに対するモノクローナル抗体であることがより好ましい。これにより、当該ＴＮＦ−αに対する特異性の高い抗体酵素を得ることができる。
【００４０】
また、本発明にかかる抗体酵素が認識するＴＮＦ−αは、ヒトＴＮＦ−αに限定されるものではなく、ヒトＴＮＦ−αに加えて、その他のあらゆる生物由来のＴＮＦ−αを認識してもよい。
【００４１】
本発明にかかる抗体酵素は、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であると同時に、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有する。すなわち、本発明にかかる抗体酵素はＴＮＦ−αを特異的に認識する抗体としての性質と、認識したＴＮＦ−αを切断および／または分解する酵素としての性質を併せ持つ。それゆえ、ＴＮＦ−αの分解活性を有さない抗体では、抗体１分子に対して、１分子または２分子のＴＮＦ−αが結合するだけであるが、本発明の抗体酵素では、抗体酵素１分子に対して、ＴＮＦ−αが次から次に結合しては分解されるという反応を繰り返す。したがって、本発明にかかる抗体酵素のＴＮＦ−αを分解する能力は、ＴＮＦ−αの分解活性を有さない抗体のそれの数百倍あるいは数千倍に達する。
【００４２】
このように、ＴＮＦ−αに対する高い分解活性を有する本発明の抗体酵素を生体に投与することにより、ＴＮＦ−αが過剰に産生された場合であっても、ＴＮＦ−αの過剰な蓄積を抑制することができ、ＲＡやＣＯＰＤのようなＴＮＦ−αの過剰産生が発症の原因となる疾患の予防や治療に寄与することが期待できる。すなわち、本発明には、本発明にかかる抗体酵素を含み、生体内におけるＴＮＦ−α量の増加を抑制することができる薬学的組成物も含まれる。
【００４３】
また、本発明にかかる抗体酵素は、抗体であると同時に酵素であるため、酵素センサの構築が可能である。このように、本発明にかかる抗体酵素は、抗原の分解活性を有さない通常の抗体よりも応用範囲が広い。なお、本発明にかかる抗体酵素の酵素活性は、ヒトＴＮＦ−α以外に、他の生物由来のＴＮＦ−αをも切断および／または分解するものであってもよい。
【００４４】
本発明にかかる抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。なお、「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことをいう。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。したがって、本発明にかかる抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であるということもできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。発明者らは、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有するマウス由来抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した結果、ペプチドや抗原タンパク質を切断および／または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とが立体構造上近接して存在することを明らかにした（例えば特開２００４−９７２１１号公報（平成１６年４月２日公開）参照）。ここで、「立体構造上近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基またはグルタミン酸残基とのCα間の距離が、少なくとも３〜２０Åの範囲内、好ましくは、３〜１０Åの範囲内にあることを意味する。
【００４５】
本発明にかかる抗体酵素が、上記「触媒三つ組残基構造」を有するか否かを調べる方法は、特に限定されるものではない。例えば、Ｘ線回折による立体構造決定法のように、実際に当該抗体酵素の立体構造を決定する方法を用いて、「触媒三つ組残基構造」の有無を調べることができる。また、当該抗体酵素の一次構造、すなわち当該抗体酵素のアミノ酸配列をもとに、タンパク質の立体構造予測ソフトウェアを用いて、当該抗体酵素の立体構造を予測することによって、「触媒三つ組残基構造」の有無を調べることもできる。
【００４６】
上記抗体酵素は、上記ＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでなることが好ましい。この「可変領域」とは、抗体を構成するＨ鎖およびＬ鎖のうち、Ｎ末端から約１１０残基のアミノ酸からなる部分のことである。この可変領域は、抗体の種類によって一次構造に多様性が見られ、抗体が酵素としての活性を有する場合にその活性中心が含まれている可能性が高い。それゆえ、本発明にかかる抗体酵素が抗体の可変領域を含めば、酵素として高い活性を有していると予測できる。
【００４７】
本発明において、上記軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖および重鎖の可変領域であればよく、特に限定されるものではない。上記軽鎖可変領域を構成するポリペプチドとしては、例えば、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００４８】
また、上記重鎖可変領域を構成するポリペプチドとしては、（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００４９】
なお、本明細書において、「１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）および（ｄ）のポリペプチドは、それぞれ、上記（ａ）および（ｃ）のポリペプチドの変異体であるといえる。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、自然発生的に生じた変異であってもよい。
【００５０】
上述したように、本発明にかかる抗体酵素は、その一実施形態として、上記ＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでなるものである。したがって、本発明にかかる抗体酵素の具体例としては、上記例示したポリペプチドを挙げることができる。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列は、後述する実施例において製造した抗体酵素であるＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列であり、配列番号２に示すアミノ酸配列は、当該抗体酵素であるＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。図１３にＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、図１１にＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図１３に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域は、下線を付して示す３つの相補性決定領域（complementarity determing region、以下「ＣＤＲ」ともいう）、具体的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有している。すなわち、ＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４番目から３８番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５４番目から６０番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号１に示されるアミノ酸配列の９３番目から１０１番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。
【００５１】
また、図１１に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域もまた、下線を付して示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有している。すなわち、ＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３１番目から３５番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列の５０番目から６６番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、配列番号２に示されるアミノ酸配列の９９番目から１０８番目のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。
【００５２】
また、本発明にかかる抗体酵素には、ヒトＴＮＦ−αに対する抗体の断片であって、上記抗体の可変領域を含み、かつ、ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有する抗体の断片が含まれる。上記可変領域は、重鎖可変領域であっても、軽鎖可変領域であってもよい。また、上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、かかる可変領域をヒトその他の動物の抗体に移植してキメラ抗体を作製するために好適に用いることができる。
【００５３】
本発明において用いることが可能な抗体の断片としては、例えば、上述の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリペプチドや、これらのポリペプチドのアミノ酸配列を含む抗体の断片を挙げることができる。
【００５４】
また、本発明には、上記抗体酵素をコードする遺伝子も含まれる。本発明にかかる遺伝子としては、具体的には、例えば、配列番号３または４に示される塩基配列からなる遺伝子、またはこれらを含む遺伝子を挙げることができる。配列番号３に示される塩基配列は、後述する実施例において製造した抗体酵素であるＥＴＮＦ−６抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子であり、配列番号４に示される塩基配列は、上記ＥＴＮＦ−６抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子である。
【００５５】
本発明にかかる遺伝子を適当な宿主に発現可能に導入することにより、本発明の抗体酵素を宿主内で発現させることができる。また、本発明の抗体酵素の可変領域、またはそのＣＤＲを組み込んだ可変領域は、そのまま発現させてもよいが、定常領域をコードする遺伝子と連結してキメラ抗体酵素として発現させることもできる。
【００５６】
なお、本明細書において「遺伝子」との用語は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む。）等の配列を含むものであってもよい。
【００５７】
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、真核生物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、原核生物由来のイントロンなどの非コード配列を含まない「ゲノム」形ＤＮＡであってもよい。また、逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。また、細胞がゲノムＤＮＡとは別に保持しうる低分子量の環状ＤＮＡである「プラスミド」形ＤＮＡであってもよい。
【００５８】
また、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡを含む全ＲＮＡ等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
【００５９】
「塩基配列」との用語は、「核酸配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（それぞれＡ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの「塩基配列」は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドに対してのデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドに対してのリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）を意図する。
【００６０】
また、本発明にかかる遺伝子は、配列番号３または４に示される塩基配列と必ずしも同一である必要はなく、配列番号３または４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有する抗体酵素をコードする遺伝子であってもよい。
【００６１】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（すなわち、ハイブリダイズし難くなる）。
【００６２】
＜３．本発明にかかる抗体酵素の製造方法＞
本発明にかかる抗体酵素は、例えば、ＴＮＦ−αを抗原ペプチドとして、免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を産生することにより製造することができる。重鎖、軽鎖を得る場合には、得られたモノクローナル抗体を重鎖と軽鎖とに分離すればよい。また、本発明の抗体の断片を得る場合には、まず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体の断片が得られるように切断すればよい。また、ファージディスプレイ法で得られる抗体であってよい。
【００６３】
モノクローナル抗体の取得は通常のハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc.,77-96(1985)）等により行なわれる。
【００６４】
また、上記抗原ペプチドには、上述したＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αのペプチド断片を用いればよい。
【００６５】
さらに、アミノ酸配列が明らかになっている抗体酵素については、従来公知の遺伝子組み換え技術等を用いて本発明の抗体酵素を製造することができる。この場合、上記抗体酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子をベクター等に組み込んだ後、発現可能に適当な宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたペプチドを精製する等の方法を用いることができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく製造することができる。
【００６６】
また、上述の（ｂ）または（ｄ）のポリペプチドのように、変異型のポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、上記（ｂ）や（ｄ）のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異型のポリペプチドの作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００６７】
さらに、本発明にかかる抗体酵素の取得方法は、上述に限定されるものではなく、例えば、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成されたものであってもよい。また別の方法としては、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明にかかる遺伝子から本発明にかかるポリペプチドを合成してもよい。
【００６８】
＜４．本発明にかかる形質転換体＞
本発明にかかる形質転換体は、本発明にかかる遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【００６９】
本発明に係る形質転換体の作製方法（生産方法）は、本発明にかかる遺伝子を含む組換え発現ベクターを形質転換する方法を挙げることができる。
【００７０】
上記組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
【００７１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主（ホスト）細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかる遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター、及びウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルス）、並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド）を利用可能である。
【００７２】
より具体的には、細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、及びｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratageneから入手可能）；並びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Phrmaciaから入手可能）が含まれる。
【００７３】
また、好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、及びｐＳＧ（Stratageneから入手可能）；並びにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Phrmaciaから入手可能）が含まれる。
【００７４】
植物における使用に好ましいベクターの中には、例えば、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」（いずれもClontech社製）、「ｐＴＡ７００１」、「ｐＴＡ７００２」(Aoyama ら(1997) Plant J. 11:605) 、「ｐＰＺＰ２１１」(Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25:989(1994)などが含まれる。
【００７５】
また、形質転換の対象となる生物（宿主生物）も特に限定されるものではなく、従来公知の各種生物およびそれら由来の細胞を好適に用いることができる。適切な宿主の代表的な例としては、菌体（例えば、E. coli細胞、Streptomyces細胞、及びSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila Ｓ２細胞及びSpodoptera Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；並びに植物細胞（例えばシロイヌナズナ、タバコなどの双子葉植物、イネ、オオムギなどの単子葉植物）が挙げられる。
【００７６】
本発明にかかる好ましい形質転換体としては、本発明にかかる遺伝子を、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、宿主細胞に発現可能に導入した形質転換体が挙げられる。
【００７７】
さらに、形質転換する方法についても特に限定されるものではなく、宿主生物の種類に応じた従来公知の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション法、感染法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポソーム法、適切なベクター系を用いた導入法等を例に挙げることができる。
【００７８】
このようにして得られる形質転換体は、本発明にかかるポリペプチドを産生することができる。これらポリペプチドは、従来公知の方法により、当該形質転換体生物から抽出、精製することができる。
【００７９】
当該ポリペプチドを抽出、製造する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。
【００８０】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８１】
本発明について、実施例および図１〜２１に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、実施例における抗体の力価、抗体産生細胞（ハイブリドーマ）のクローニングは以下の方法に従って行った。
【００８２】
〔ＥＬＩＳＡによる力価測定〕
抗原（ＴＮＦ-α）をＰＢＳに溶解し、４μg/ｍｌの抗原溶液を調整した。９６穴イムノプレートに上記抗原溶液を５０μｌずつオクタピペットを用いて入れた。その後、４℃で一晩反応させた（コーティング）。
【００８３】
翌日、プレートを室温に戻し、イムノウォッシャーを用いて０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ−Ｔ」ともいう）でプレートを２回洗浄した。洗浄したプレートをキムタオルの上に逆さに置き、軽く叩いてウェルの中の水分を除去した。全てのウェルに２％ゼラチン／ＰＢＳを１３０μｌずつ入れ、３０〜６０分間、室温でインキュベーションした（ブロッキング）。
【００８４】
ブロッキングの間に、一次反応の準備を行った。免疫マウスから採血を行った抗血清をまず１／５０に希釈し、そこから３倍連続希釈を７点行い、１サンプルにつき８種類の希釈液を作製した。また、未処理マウスの血清も同様に希釈を行い、コントロールとして使用した。
【００８５】
ブロッキング後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを２回洗浄し、水分を除去した。その後、ブロッキング中に作製したそれぞれの血清希釈液を５０μｌずつウェルに入れ、６０分間インキュベーションした（一次反応）。
【００８６】
一次反応後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを２回洗浄し、水分を除去した。次に、ＰＢＳ−Ｔで希釈調製したアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウス抗体を５０μｌずつウェルに入れ、６０分間室温でインキュベーションした（二次反応）。
【００８７】
二次反応後、ＰＢＳ−Ｔでプレートを２回洗浄し、水分を除去した。次に、ＡＬＰ基質タブレットをＡＬＰ基質緩衝液で溶かし、各ウェルに１００μｌずつ入れ、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、λ1＝４０５ｎｍ、λ2 ＝６２０ｎｍに設定したイムノリーダーで吸光度を測定した。Ｘ軸に抗体の希釈割合（Dilution）、Ｙ軸に吸光度をとったグラフを作成し、力価を測定した。
【００８８】
〔限界希釈法によるクローニング〕
まず、６ｍｌ滅菌チューブおよび１４ｍｌ滅菌チューブを各２本ずつ用意した。６ｍｌ滅菌チューブの一方をＡ、もう一方をＢとした。１４ｍｌ滅菌チューブの一方にはＨＣＦ添加ＨＡＴ培地を３．９ｍｌ分注し、もう一方にはＨＣＦ添加ＨＡＴ培地を２．４ｍｌ分注した。ＨＣＦ添加ＨＡＴ培地を３．９ｍｌ分注したチューブをＣ、２．４ｍｌ分注したチューブをＤとした。
【００８９】
クローニングしたいウェルの細胞をマイクロピペットでピペッティングし、その懸濁液から５０μｌをＡに入れた。
【００９０】
これとは別に、上記懸濁液から５０μｌを採取し、トリパンブルー５０μｌと混合した後、血球計算盤で細胞数をカウントした。その計測した結果を用いて、最終的な細胞濃度が２×１０３個/ｍｌになるように、必要量のＨＡＴ培地をＢに入れた。
【００９１】
次に、上記Ａに１ｍｌのＨＡＴ培地を加え、そこから１００μｌを上記Ｂに移し、よくピペッティングを行った。その後Ｂから１００μｌを採取し、それをＣに移し、ピペッティングを行った。その後、Ｃから６００μｌを採取し、それをＤに移し混合した。このようにして得られたＣおよびＤに入った細胞懸濁液をそれぞれ１００μｌずつ９６穴プレートに分注し、インキュベーターで培養を開始した。７日後に培地の添加を行い、その後は、３日ごとに培地の交換を行った。
【００９２】
７日目を過ぎたあたりからコロニーのチェックを行い、コロニーが形成されたウェルのスクリーニングを行った。スクリーニングの結果、同じプレート内でＴＮＦ−αに対して最も反応が高いシングルコロニーをクローニングした。コロニーが形成されたウェルが全て陽性になるまで、上記の方法でスクリーニングとクローニングとを繰り返し行った。
【００９３】
〔実施例１：抗ＴＮＦ−α抗体の製造〕
（１．マウスの免疫）
免疫に用いた抗原タンパクとして、Recombinant Human TNF-α（Strathmann Biotec AG社製,hTNFa-1000,Lot.090590）を用いた。また、免疫する動物として、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌６週齢）を２匹用いた。
【００９４】
まず、クリーンベンチ内にＦＣＡ（Freund’s complete adjuvant）、抗原（Recombinant Human TNF-α）、ルアーロック式シリンジを２本、注射針（１９Ｇ）を２本、および三方活栓を用意した。上記シリンジに注射針をセットし、ＦＣＡを必要量より少し多めにとり、三方活栓に取り付けた。０．５ｍｇ／ｍｌに調製した抗原をＦＣＡと同様にシリンジにとり、三方活栓に取り付けた。三方活栓で繋いだシリンジをクリーンベンチから取り出し、抗原側、ＦＣＡ側それぞれのシリンジ先端に残った空気を抜いた後に、water in oilの要領でＦＣＡと抗原とを混合した。２本のシリンジをそれぞれ交互に押し、ＦＣＡと抗原とをよく混合した。その後、４℃で静置した。白い乳液状になるまでこの操作を繰り返し、ＦＣＡと抗原とを混合した。
【００９５】
次に、片方のシリンジに混合した溶液を集め、シリンジを三方活栓から外し２５Ｇの注射針を取り付けた。マウスの腹部をアルコール綿で拭いて消毒し、腹部皮下の２箇所に１００μｌずつ投与した。なお、注射針はマウスごとに交換しなかった。また、マウス１匹あたりの抗原投与量は５０μｇであった。
【００９６】
免疫注射から１０日後にマウスの採血を行い、上述の手順で、ＥＬＩＳＡ法により力価測定を行った。
【００９７】
初回免疫から約２週間後に追加免疫を行った。２回目からは不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を用いた。免疫方法は初回免疫と同様とし、マウス１匹あたりの抗原投与量は５０μｇとした。追加免疫から１０日後、眼窩静脈叢より採血を行い、ＥＬＩＳＡ法により力価測定を行った。
【００９８】
同様の方法で、マウスＩには、さらにもう１回追加免疫（合計３回目免疫）を行い、力価測定を行った。また、マウスＩＩについては、さらに２回追加免疫（合計４回目免疫）を行った。
【００９９】
追加免疫後、力価が十分上がったマウス（３回目免疫後のマウスＩ、４回目免疫後のマウスＩＩ）に最終免疫を行った。最終免疫は滅菌ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに調製した抗原をマウス尾静脈または腹腔内に投与した。なお、本実施例の免疫スケジュールを表２に示す。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
上記のように免疫したマウスから採取した血清の力価測定結果を図１〜図５に示す。図１〜図５に示すように、マウスＩ、ＩＩともに順調に力価が上がり、３回目免疫後には細胞融合が可能な力価まで上がった（図３を参照）。マウスＩＩについては、最終免疫後の力価は、４回目免疫後力価よりも落ちていたが、細胞融合するのに十分な力価を保っていた（図４および図５を参照）。
【０１０２】
こうして得られた免疫マウスを用いて、最終免疫の３〜４日後に後述の細胞融合を行った。
【０１０３】
（２．細胞融合）
上記免疫マウスの首を切断することにより全採血を行った。採取した血液は４℃に一晩静置後、翌日、３０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間遠心分離を行うことにより、血清を回収し、力価測定を行った。その結果を表３に示す。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
次に、上記マウスを消毒して解剖後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓を洗浄用ＭＥＭ培地が５ｍｌ入ったシャーレに移した。脾臓に付着している脂肪などの余分な組織を取り除き、洗浄した。洗浄した脾臓を新しいＭＥＭ培地が５ｍｌ入ったシャーレに移し、擦りガラス板で脾臓をまず３等分した。擦りガラスを２枚合わせて、３等分にした脾臓を１つずつ擦りながら脾細胞を取り出し、シャーレに入れた。
【０１０６】
次に、上記脾細胞を、５０ｍｌ遠心チューブの上にのせたろ過フィルターに注いだ。さらに上記脾細胞が入っていたシャーレを５ｍｌのＭＥＭ培地で共洗いし、上記脾細胞がシャーレに残らないよう遠心チューブに移した。その後、上記脾細胞を１４００ｒｐｍで６分間遠心分離した（１回目の洗浄）。脾細胞の遠心分離を行っている間に、予め培養していたミエローマ細胞（ＮＳ−１）を回収し、５０ｍｌの遠心チューブに移した。上記脾細胞の遠心分離が終了後、上記ミエローマ細胞を１４００ｒｐｍで６分間遠心分離した（培地の除去）。
【０１０７】
１回目の洗浄を終えた脾細胞の上清をアスピレーターで吸引除去し、３０ｍｌのＭＥＭ培地をピペッティングしながら加え、ペレットをほぐした。上記ミエローマ細胞についても同様に上清を吸引除去し、３０ｍｌのＭＥＭ培地で懸濁した。
【０１０８】
上記のように懸濁した脾細胞およびミエローマ細胞を１４００ｒｐｍで６分間遠心分離した（脾細胞は２回目の洗浄、ミエローマ細胞は１回目の洗浄)。遠心分離終了後、脾細胞およびミエローマ細胞の上清を吸引除去し、３０ｍｌのＭＥＭ培地で懸濁後、１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行った（脾細胞は３回目の洗浄、ミエローマ細胞は２回目の洗浄）。遠心分離後、上清を吸引除去し、１０ｍｌのＭＥＭ培地に細胞を懸濁した。
【０１０９】
次に、脾細胞およびミエローマ細胞のそれぞれの懸濁液について、血球計算盤を用いて細胞数をカウントした。その後、表４に示すように、細胞数の比が脾細胞:ミエローマ細胞＝５：１になるように、必要なミエローマ細胞数を脾細胞が入った遠心チューブに移した。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
脾細胞およびミエローマ細胞の混合懸濁液を十分に撹拌後、１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行い、上清を除去した。上清除去後、遠心チューブを軽く叩きつけて、ペレットをほぐした。その後、ペレットの入った遠心チューブを激しく振り続けながら、１ｍｌのＰＥＧを１分間かけて１滴ずつゆっくりと加えた。ＰＥＧを添加後、さらに１分間遠心チューブを振り続けた。その後、遠心チューブを振り続けながら、１ｍｌのＭＥＭ培地を１分間かけて加えた。再度、同様に１ｍｌのＭＥＭ培地を１分間かけて加えた。次に、遠心チューブを振り続けながら、７ｍｌのＭＥＭ培地を３〜４分間かけてゆっくり加えた。その後、８００ｒｐｍで６分間遠心分離を行い、上清を吸引除去した。上清除去後、遠心チューブを叩きつけてペレットをほぐした。その後、まず、５ｍｌのＨＡＴ培地をペレットに勢いよく吹き付け、ペレットを崩した。次に、マウスＩでは３３ｍｌ、マウスＩＩでは５７ｍｌのＨＡＴ培地をピペッティングせずに加えた。この細胞懸濁液を滅菌処理済の９６穴プレートに１００μｌずつ播き、３７℃のＣＯ２インキュベーターで培養開始した。３〜４日後にＨＡＴ培地を５ｍｌのピペットを用いて２滴ずつ添加した。そして、７日後には培地の交換を行った。
【０１１２】
細胞融合後の７日目頃からコロニー確認を行ったところ、最終的にマウスＩおよびマウスＩＩともに全てのウェルでコロニー形成が確認された。すなわち、細胞融合効率は１００％であった（表４を参照）。
（３．スクリーニングおよびクローニング）
そこで、それら全てのウェルの上清を用いて、スクリーニングを行った。スクリーニングは、上述したＥＬＩＳＡ法による力価測定の方法の一部条件を変更した方法を用いて行った。変更点は、具体的には、（１）コーティングに使用する抗原をＴＮＦ−αの他に、ＨＳＡおよびＩｇＧ（濃度はどちらも４μｇ／ｍｌとした）を用いた、（２）コーティング後の洗浄は行わず、アスピレートのみを行った、（３）コロニーが確認できたウェルの上清を９６穴Ｕ底プレートに入れ、ＰＢＳ−Ｔで１／２に希釈したものを一次反応に用いた、（４）一次反応の陽性コントロールとして細胞融合時の抗血清を、陰性コントロールとして、ＰＢＳ−Ｔで１／２に希釈したＨＡＴ培地を用いた点である。一次スクリーニングの結果、マウスＩでは陽性ウェル数が２７ウェル、マウスＩＩでは陽性ウェル数は９ウェルであった（表５を参照）。そのうち、マウスＩの１４ウェル、マウスＩＩの９ウェルについて、上述の限界希釈法によるクローニングを行った。なお、ＴＮＦ−αに対して吸光度が０．１以上のものを陽性とした。また、限界希釈法によるクローニングの結果、陽性ウェル１００％が２回連続した株を、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体産生株（以下、「抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマ」ともいう）とした。
【０１１３】
その結果、最終的に確立した抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマはマウスＩで１３株、マウスＩＩで４株の計１７株となった（表５を参照）。これらのハイブリドーマをＥＴＮＦ−１〜１７とし、各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をＥＴＮＦ−１〜１７抗体とした。
【０１１４】
【表５】
【０１１５】
次に、上記抗体ＥＴＮＦ−１〜１７抗体について、Iso StripTM マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いてアイソタイプ決定を行った。結果を表６に示す。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
（４．タンパク質との交差反応試験）
上記抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いて、ＥＴＮＦ−１〜１７抗体の各種タンパクに対する反応性をＥＬＩＳＡ法によって調べた。タンパク質には、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ヒトＩｇＡ（図６および図７ではＨ−ＩｇＡと表記する）、ヒトＩｇＭ（図６および図７ではＨ−ＩｇＭと表記する）、ヒトＩｇＥ（図６および図７ではＨ−ＩｇＥと表記する）、ヒト血清アルブミン（図８および図９ではＨＳＡと表記する）、ヒトヘモグロビン（図８および図９ではＨ−ｈｅｍｏと表記する）、ウシ血清アルブミン（図８および図９ではＢＳＡと表記する）、Keyhole Lympet Hemocyanine（図８および図９ではＫＬＨと表記する）を用いた。図６〜図９に示すように、ＥＴＮＦ−１、３〜７、９〜１４抗体は高い反応特異性を示した。ＥＴＮＦ−２および１６抗体はヒトＩｇＡおよびＩｇＥに対して交差反応した。また、ＥＴＮＦ−８、１５、および１７抗体には非特異的な反応が認められた。
【０１１８】
〔実施例２：ＥＴＮＦ−６抗体の可変領域の塩基配列およびアミノ酸配列の決定〕
以下に示す方法で、実施例１の抗ＴＮＦ−α抗体（ＥＴＮＦ−６抗体）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を決定した。さらに、上記塩基配列から、当該抗ＴＮＦ−α抗体の可変領域の推定アミノ酸配列を決定した。
【０１１９】
（１．抗体産生細胞の培養）
抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマは、培養温度３７℃、ＣＯ２濃度５．５％で２０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地で１×１０７〜５×１０７細胞が得られるまで培養した。培養後の細胞培養液を５０ｍｌ遠心チューブに移し、１４００ｒｐｍで６分間遠心分離することにより、細胞を回収した。培地をアスピレーターにて除去後、１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、１つのチューブにまとめて再度１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行った。上清を吸引除去後、再度１０ｍｌのＰＢＳに懸濁して血球計算盤を使用し細胞数をカウントした。
【０１２０】
カウント後、１×１０７〜５×１０７細胞分の細胞懸濁液を採取し、再度１４００ｒｐｍで６分間遠心分離を行った。上清を除去後、ペーパータオル上で逆さにし完全に液を切った。アスピレートが不十分であれば、再度遠心し、マイクロピペットで残ったＰＢＳを除去した。
【０１２１】
（２．ｍＲＮＡの抽出と精製）
ｍＲＮＡの抽出はQuickPrepTMmRNA purirfcation Kit (amershampharmacia biotect)を用いて、推奨プロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。
【０１２２】
まず、Extraction bufferを３７℃のインキュベーターに約３０分間静置し、結晶を完全に溶解させた。こうして得られたExtraction buffer １．５ｍｌを上記（１．抗体産生細胞の培養）で回収した細胞のペレットに添加した。そして、２１Ｇの針に数回通すことで細胞を破砕した。その後、その破砕溶液に３ｍｌのElution bufferを加え、さらに細胞を破砕した。こうして得られた破砕溶液をRNase freeの １．５ｍｌマイクロチューブ４本に分注した。その後、室温（２５℃）、１８０００×ｇで、２０分間遠心分離を行い、その上清を後述のoligo(dT)-cellulose spin columnに添加するサンプルとした。
【０１２３】
ｍＲＮＡの単離は、まず、oligo(dT)-cellulose spin columnの樹脂を懸濁し、上下のキャップを外して１５ｍｌ遠心チューブにセットし、１３００ｒｐｍで１分４５秒間遠心分離を行って保存液を除去した。そして、下キャップを装着し、タンパク質およびＤＮＡが除去された上記サンプル（上清）を４ｍｌ添加した。その後、上キャップをしっかりと取り付け、oligo(dT)-cellulose spin columnの樹脂を懸濁した後、１０〜１５分間、転倒混和し、樹脂にｍＲＮＡを吸着させた。そして、上下のキャップを装着し、１４００ｒｐｍで、１〜２分間遠心分離を行った。その後、上のキャップを取り、RNase freeのマイクロピペットを使用し、上清を除去した。そこに、３ｍｌのHigh-salt bufferを添加し、緩やかに２分間ほど混和した。その後、上キャップを装着し、１４００ｒｐｍで２分間遠心分離を行い、上清を除去した。さらにこの操作を２回繰り返した。
【０１２４】
次に、３ｍｌのLow---salt bufferを添加して緩やかに１〜２分間程度懸濁した後、キャップを装着し、１５ｍｌチューブに入れ、１４００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行った。そして、生じた上清を除去した。その後、下のキャップを外し、スピンカラムの表面が平らになるように、３ｍｌのLow-salt bufferを壁に添わせながら回し入れた。その後、１５ｍｌチューブに設置し、１３００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行った。
【０１２５】
次に、新しい１５ｍｌ遠心チューブを用意し、ｍＲＮＡ回収用の１．５ｍｌマイクロチューブ２個の蓋をハサミで切断後、遠心チューブに重ねて入れ、溶出用チューブとした。溶出用チューブにカラムを入れ、そこに６５℃に加熱していた０．２５ｍｌのElution bufferを回し入れるように添加した。その後、１３００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行った。この操作を２回繰り返した。溶出液は、ｍＲＮＡ画分として１．５ｍｌマイクロチューブ２本に回収し、氷上に静置した。別に定量用のマイクロチューブを準備し、１０μｌのｍＲＮＡ画分を取り、７０μｌのElution bufferを加え、希釈した(１／８希釈)。その希釈した溶液を用いて、吸光度ブランクをElution Bufferとして、Ａ２６０およびＡ２８０を測定した。なお、セルは測定前に予め、塩酸：メタノール＝１：１の溶液に１時間ほど浸し、RNase freeにし、ＤＥＰＣ処理水で洗浄しておいた。また、ＲＮＡの濃度は下記式を用いて算出した。
【０１２６】
ＲＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）＝Ａ２６０×希釈率×４０
次に、２等分され、氷上に静置しておいたｍＲＮＡ画分（ｍＲＮＡ抽出溶液）に、１／１０量の３Ｍ酢酸カリウム、１／５０量のグリコーゲン、２．５倍量の９５％エタノールを加えて攪拌した。その後、−３０℃に約４０分間置き、その後、４℃、１５０００ｒｐｍで、５分間遠心分離した後、−８０℃で保存した。
【０１２７】
なお、実験に用いたガラスおよび金属類（実験器具）には、２４０℃で２時間乾熱滅菌したものを用い、プラスチック類の実験器具にはRNase freeおよびDNase freeのものを用いた。
【０１２８】
（３．ｍＲＮＡからのＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成）
−８０℃でエタノール沈澱の状態で保存していたｍＲＮＡを取り出し、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、マイクロピペットで上清を除去した。
【０１２９】
その後、１ｍｌの氷冷した７５％エタノール（予めＤＥＰＣ処理水で調製し、−３０℃に用意しておいた。）をペレットのない側からそっと加えてリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、その後、マイクロピペットで上清を除去した。そして、１５分間真空乾燥を行い、０．２μｇ／μｌとなるようにＤＥＰＣ処理水を添加し１時間静置し溶解した。溶解後、確認のために、ｍＲＮＡ溶液をＤＥＰＣ処理水でＡ２６０＝１前後になるように希釈し吸光度を測定した。ｃＤＮＡの合成はAMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）のプロトコールに準じて行った。以下にその方法を示す。
【０１３０】
RNase freeの０．２ｍｌマイクロチューブにｍＲＮＡ ２μｇ分のｍＲＮＡ溶液を添加した。そのチューブにpd(T)12-18primer（０．５μｇ／ｍｌ）を２μｌ、ＤＥＰＣ処理水をｍＲＮＡ溶液と合わせて１７μｌとなるように添加し、混合後、７０℃で１０分間アニーリング処理を行った。その後、氷上に置き、０．２５Ｍ ＤＴＴを１μｌ、RNase inhibitorを１μｌ、５×Reaction bufferを５μｌ添加し、よく混合した。更にＡＭＶ−ＲＴを１μｌ添加し緩やかに攪拌し、４１℃で６０分間伸長反応を行った。処理時間終了後氷上に置き、反応を止め、−３０℃に保存した。
【０１３１】
（４．ＰＣＲによる抗体可変領域遺伝子の増幅）
Mouse Ig primer Kit（Novagen）、NovaTaqTM Hot Start DNA Polymerase Kit（Novagen）を使用し、上記（３．ｍＲＮＡからのＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡの合成）で得られたｃＤＮＡから、抗体遺伝子可変領域の増幅を行った。
【０１３２】
まず、抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子の増幅には、Positive Control、Negative Control、primerの本数分準備したＰＣＲチューブのそれぞれに、３７．２５μｌの滅菌超純水、０．５μｌの３’−Primer（最終濃度５ｐｍｏｌ）、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ2（最終濃度１．５ｍＭ）、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（最終濃度０．２ｍＭ）、５μｌの１０×NovaTaq Hot Start Buffer（最終濃度１×）、０．２５μｌのNovaTaq Hot Start DNA Polymerase（最終濃度１．２５Ｕ）をサンプルの本数＋０．５のスケールで混合した。）を加えて、そこに、１μｌの５’−Primer（最終濃度５ｐｍｏｌ）、２μｌのｃＤＮＡ溶液を添加した。なお、Positive Controlは Mouse Ig primer Kitに付属のものを使用し、Negative Controlには滅菌超純水を使用した。
【０１３３】
以上の組成物をよく混合し、Biometra社T-GRADIENT、TaKaRa社PCR Thermal cycler PERSONALを使用しＰＣＲを行った。反応条件として、Ｌ鎖は９５℃で７分間のプレヒート後、熱変性を９８℃で１５秒間、伸長反応を７４℃で１５秒間に固定し、アニーリング温度を７０℃、６６℃、６２℃、５８℃、５４℃、および５０℃と６段階に４℃ずつ下げるStep Down法を行った。なお、アニーリング時間は、１５秒間に固定した。上記の３ステップを５段階まで３サイクルずつ行い、６段階目を１０サイクル行った。Ｈ鎖は９５℃で１０分間のプレヒート後、熱変性を９４℃で１分間、アニーリング温度５０℃で２分間、伸長反応を７２℃で２分間の３ステップを４０サイクル行った後、７２℃の伸長反応を１０分間行った。ＰＣＲ終了後、アガロース電気泳動により、抗体可変領域遺伝子の増幅を確認した。
【０１３４】
（５．抗体可変領域遺伝子のクローニング）
クローニングは、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen）を用いて、以下のようにして行った。
【０１３５】
アガロースゲル電気泳動で抗体可変領域と予測されるＤＮＡの増幅を確認したＰＣＲ産物を２μｌ、salt Solutionを１μｌ、および滅菌水を２μｌ、氷上にてＰＣＲチューブに分注し攪拌した。さらに、１μｌのTOPO vectorを添加し緩やかに攪拌後、３０分間、室温でライゲーション反応させた。３０分間の反応後直ちに、上記ＰＣＲチューブを氷上に置き、反応を止めた。このようにして調製された反応液を以下「ライゲーション反応液」と称する。
【０１３６】
使用直前に−８０℃のフリーザーからOne Shot TOP10 Chemically Competent E. coli（Invitrogen）を取り出し氷上で溶解した。そこに、氷上に置いていた上記ライゲーション反応液を２μｌ加え、氷上で３０分間インキュベーションし、コンピテントセル間にＤＮＡを拡散させた。反応終了後、４２℃で４５秒間、熱ショックを与えてＤＮＡを取り込ませ、氷上に戻し、２分間静置した。そこに、予め、室温に戻しておいた２５０μｌのＳＯＣ培地をクリーンベンチ内で加え、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間培養した。
【０１３７】
１時間の培養中に、予め準備しておいたアンピシリンを含むＬＢプレート培地１枚に対し、１００μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧストックと、２０μｌの５０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを塗り広げ、１５〜３０分間乾燥させた。
【０１３８】
培養終了後、アンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ／ＬＢプレート培地に、培養後の大腸菌液を５０μｌ、および１００μｌの２種類の濃度で塗り広げ、３７℃で一晩培養した。
【０１３９】
翌日、形質転換後の青／白判定によりＤＮＡ断片がインサートされていると考えられる白コロニーを１２コロニー選択し、偽陽性を除くため、さらに画線培養を行った。画線培養では、形質転換後の大腸菌を培養したのと同様にアンピシリン／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ／ＬＢプレート培地を使用し、白金耳で単一コロニーが得られるように画線し、３７℃で一晩培養した。
【０１４０】
（６．プラスミドＤＮＡの調製）
上記（５．抗体可変領域遺伝子のクローニング）で得られた大腸菌をアンピシリンを含むＬＢ液体培地で培養した。大腸菌培養液から０．７５ｍｌを取り、０．２ｍｌの８０％グリセロールと混合し、大腸菌のグリセロールストックとして−８０℃で保存した。プラスミドＤＮＡは残りの培養液を用いてアルカリＳＤＳ法により調製した。
【０１４１】
残りの約５．２５ｍｌの培養液を１．５ｍｌマイクロチューブ６本に移し、１２０００ｒｐｍで１分間、遠心分離して集菌し、上清を丁寧に吸引除去した。そこに、Solution I（５０ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１００μｌ加えてボルテックスにかけよく懸濁した。
【０１４２】
そこに、Solution II（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を２００μｌ加えて転倒混和後、氷中に５分間置き、Solution III（３Ｍ酢酸カリウム、２Ｍ酢酸）を１５０μｌ加え、緩やかに撹拌した後、氷上に５分間置いた。
【０１４３】
そして、４℃、１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離を行った後、沈殿が入らない様に注意しながら上清を採り、新しい１．５ｍｌマイクロチューブに移した。このとき得られ上清と等量のフェノール・クロロホルムを加えて攪拌した後、４℃、１５０００ｒｐｍで、２分間遠心分離した。さらに同じ作業を繰り返し、２回のフェノール・クロロホルム処理を行った後、上層（水層）を別のマイクロチューブに移した。そこに、２．５倍等量の氷冷エタノールを加えて上下に振って攪拌し、−７０℃で５分間静置した。そして、４℃、１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離を行った後、上清を除去した。そして、氷冷７０％エタノールを１ｍｌ加え、ペレットをリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を除去し、１５分間真空乾燥した。
【０１４４】
乾燥終了後、４５μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に、ペレットを溶解し、RNase A溶液（５ｍｇ／ｍｌ RNase A、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を５μｌ加えた(終濃度：５０μｇ／ｍｌ)。その後、２本のチューブの溶液を１本のチューブにまとめ、３７℃で１時間反応させた。
【０１４５】
反応終了後、２／３等量のＰＥＧ（１３％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、０．８Ｍ ＮａＣｌ）を入れ、氷上に１時間以上置いた。その後、４℃、１５０００ｒｐｍで、１５分間遠心分離を行い、上清を除去した。そこに、７０％エタノールを１ｍｌ加えてリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離を行った。
【０１４６】
上清を除去後、真空乾燥し、１サンプルにつき５０μｌの滅菌水に溶解し、１本のチューブにまとめプラスミド溶液とした。そして、アガロース電気泳動によるバンド比較にてサンプルのＤＮＡ濃度を推測した。
【０１４７】
（７．塩基配列の決定）
Thermo SequenaseTMCyTM5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia)を用いて、塩基配列の決定を行った。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの４種類の塩基用に、ＰＣＲチューブを用意し、d(N)TP/Cy5.5-dd(N)TPを各サンプル分、１μｌずつ分注した。
【０１４８】
次に、ＤＮＡ／プライマーミックスの調製を行った。（６．プラスミドＤＮＡの調製）で調製された１．５μｇのＤＮＡ、３．５μｌのReaction Buffer、１μｌのTOPO13 Reverse（４ｐｍｏｌ／μｌ）（Invitrogen）、および２μｌのThermo Sequenase（１０Ｕ／μｌ）を混合し、さらに滅菌超純水を添加して全量が３１．５μｌとなるようにした。これを上記のＰＣＲチューブに７μｌずつ分注し、すみやかにBiometoraサーマルサイクラーにセットし、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で１２０秒間の反応サイクルを３０サイクル行い、４℃で冷却し反応を停止させた。
【０１４９】
反応終了後、サンプルをＰＣＲチューブから１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを１μｌ、７．５Ｍ酢酸アンモニウムを２μｌ、および９８％エタノールを３０μｌ添加し、よく混合した。１０分間氷上で静置した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その後、キムワイプ上でデカンテーションにより上清を除去し、７０％エタノールを２００μｌ添加し、ペレットおよびチューブ内壁をリンスした。そして１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、その後、マイクロピペットを使用し、上清を丁寧に除去した。そして、遮光してペレットを乾燥させ、６μｌのLoading Dyeに溶解し、７２℃で、３分間熱処理を行い、LONG-READ TOWERTM System (Amersham Pharmacia Biotech.)に各２μｌずつローディングし、解析を行った。得られた塩基配列は、
ＤＮＡＳＩＳソフトウェアを使用して解析され、アミノ酸配列に翻訳された。
【０１５０】
その結果、抗ＴＮＦ−α抗体であるＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡは、それぞれ、配列番号３および配列番号４に示される塩基配列からなることが分かった。また、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域の推定アミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２に示されるアミノ酸配列であった。
【０１５１】
〔実施例３：ＥＴＮＦ−６抗体の可変領域の立体構造予測〕
実施例２で決定した塩基配列から推定したＥＴＮＦ−６抗体の可変領域のアミノ酸配列（配列番号１および配列番号２を参照）をもとに、ＡｂＭ（Oxford Molecular、 Oxford、UK）により目的抗体ＣＤＲ領域のループ構造とＦＲ領域の立体構造を予測した。ＡｂＭで予測された立体構造をもとに、InsightII/Discover3（Molecular Simulatoin、USA）により分子間力計算を行い、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
【０１５２】
さらに、PPC Protein AdviSer（FQS、Japan）を用いて、立体構造中のセリンプロテアーゼの触媒三つ組み残基を構成するＳｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｐの残基群を探索した。その結果を図１０〜図１３に示す。
【０１５３】
図１０および図１２は、それぞれＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の予測立体構造を模式的に示す図である。また、図１０および図１２には、触媒三つ組残基を構成すると思われるアミノ酸残基（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ）が記載されている。また、図１０および図１２では、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖のそれぞれのＣＤＲ１〜３をリボンで表現している。
【０１５４】
図１１および図１３は、それぞれ、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列を示すものであり、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖それぞれのＣＤＲ１〜３には、下線が付されている。
【０１５５】
図１０および図１１に示すように、Ｈ鎖については、Ｈｉｓ３５−Ｓｅｒ９９のＣα間は７．１２Å、Ｈｉｓ３５−Ａｓｐ１０１のＣα間は９．８７Åと空間的に近い位置で３残基がＣＤＲ部分に存在すると予測された。その結果、これら３つのアミノ酸残基は、触媒三つ組残基様構造を構成すると考えられる。
【０１５６】
また、図１２および図１３に示すように、Ｌ鎖については、触媒三つ組残基を構成すると思われるアミノ酸残基（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ）は、ＣＤＲ部分に存在していないと予測された。しかし、Ｈｉｓ８０−Ｓｅｒ６７のＣα間は７．９８Å、Ｈｉｓ８０−Ａｓｐ８５のＣα間は１２．６３Å、Ｈｉｓ８０−Ａｓｐ８６は１０．３６Åと３残基が空間的に近い位置に存在すると予測された。
【０１５７】
また、現在見出されている天然型抗体酵素のトリプシンや当研究室で見出された抗体酵素の触媒三つ組残基（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ）の距離と比較したところ、これらと同じようにＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖では、ＨｉｓとＳｅｒとの距離は１０Å以内、ＨｉｓとＡｓｐとの距離は１５Å以内であった（表７を参照）。
【０１５８】
【表７】
【０１５９】
これらの結果をこれまでの本発明者らによる多くの研究成果（例えば、Appl. Biochem. Biotech., 83, 209-220(2000); J. Immunol. Methods, 269, 283-298(2002); Immunol. Lett. 86, 249-257(2003); Biotechnol. Bioeng., 84(7), 485-493(2003); 化学工業、54, 368-372(2003); Biotechnol. Bioeng. 86(2), 217-225(2004); 科学、75(11), 1254-1259(2005)を参照）に照らして考察したところ、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖は、抗体酵素であることが示唆された。
【０１６０】
〔実施例４：ＥＴＮＦ−６モノクローナル抗体の大量取得と精製〕
予めプリスタンを投与したＢａｌｂ／ｃマウスに実施例１の抗ＴＮＦ−α抗体産生ハイブリドーマを１×１０６個投与後、腹水を採取することにより、ＥＴＮＦ−６モノクローナル抗体を大量に取得することができた。また、モノクローナル抗体の精製は、以下の方法に従って行った。
【０１６１】
（１．塩析）
腹水約８ｍｌを同量のＰＢＳで希釈後、濾紙を使用して濾過してフィブリンを除去した。これを２本の高速冷却遠心チューブに分け、各々、同量の飽和硫酸アンモニウムをドロップワイズで加えた。これを氷中で３０分間静置し、その後、４℃、１００００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した。デカンテーションにより上清を除去し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。再度、等量の飽和硫酸アンモニウムを添加して、塩析し、ペレットを６ｍｌのＰＢＳに溶解した。これを、１本のチューブに合わせ、ＰＢＳに対して２回透析した。
【０１６２】
（２．カラム精製）
透析終了後、抗体の精製を行った。操作はMAPS-IIキット（BIO-RAD社製/ProteinAを使った精製キット）の説明に従い、４℃で行った。使用する試薬として、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、Elution buffer、および２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を以下のようにして調製した。０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳは、０．１ｇのＮａＮ３を２００ｍｌのＰＢＳに溶解した。Binding bufferは、４７．１ｇのBinding buffer粉末を蒸留水に溶解し、１５０ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが９±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。Elution bufferは２．３ｇのElution buffer粉末を蒸留水に溶解し、１００ｍｌにメスアップして調製した。この時、ｐＨメーターを用い、ｐＨが３±０．２であることを確認し、範囲外である時はＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを調整した。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、１２．１１ｇのＴｒｉｓを蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを８．０に調整した後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした。
【０１６３】
透析終了後、上記の塩析済みの腹水を、腹水: Binding buffer＝１:１．２になるように希釈した。不溶物が認められる時には、濾紙で濾過して取り除いた。また、精製操作前に、０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ、Binding buffer、およびElution buffer、並びにサンプル（上記腹水の濾液）を脱気した。
【０１６４】
アフィゲルプロテインＡを充填し、カラムを上記Binding bufferで洗浄した。ＵＶ ２８０ｎｍの吸光度をモニターし、ベースラインが落ち着くまで上記Binding bufferでゲルを洗浄した。流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎに調節し、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、上記サンプルをカラムに供した。
【０１６５】
次に、５０ｍｌ以上のBinding bufferを供し、抗体以外の夾雑物質を除去した。ここで検出したピーク部分は、素通り画分として採取した。素通り画分を分取後、ベースラインが落ち着いたら、ゲル表面とBinding bufferの液面とがほぼ一致したところで、４５ｍｌのElution bufferを添加し、アフィゲルプロテインＡに結合した抗体を溶出させ、ピーク部分を抗体画分として分取した。回収した各画分について、ｐＨ試験紙でｐＨを測定し、２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。上記抗体画分（抗体液）は、ＰＢＳに対して２回透析した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認した。純度の高い画分のみを回収し、ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD）でタンパク濃度を測定し、１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で（１ｍｇ／ｍｌ未満の場合は濃縮して）凍結保存した。
【０１６６】
〔実施例５：ＥＴＮＦ−６抗体の重鎖(Ｈ鎖)および軽鎖（Ｌ鎖）の分離・精製〕
実施例４で精製したＥＴＮＦ−６抗体を用いて、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の分離精製を以下に示す方法に従い、行った。
【０１６７】
（１．限外濾過）
実施例４で精製した抗体溶液５ｍｇ分を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２回透析した。透析の終了後の抗体溶液を、セントリプレップ−１０を用いて、４℃、２８００ｒｐｍで遠心分離し、約１ｍｌになるまで限外濾過により濃縮した。さらに、５ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、約１ｍｌになるまで再び遠心分離した。この操作を再度行い、限外濾過による濃縮後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で抗体溶液を２．７ｍｌに調整し、褐色瓶に入れ以下の実験に使用するまで低温で保存した。
【０１６８】
（２．ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の分離）
まず、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液、および上記抗体溶液２．７ｍｌをそれぞれ脱気した。２Ｍ ２−メルカプトエタノール（以下、「２−ＭＥ」ともいう）と、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）とを抗体溶液に加え、ピペッティングで軽く撹拌したのち、１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液でｐＨ８．０に調整し、窒素封入を行った。その後、インキュベーター内で、１５℃、３時間スターラーで撹拌しながら還元反応を行った。還元反応後、上記抗体溶液に脱気した０．６Ｍヨードアセトアミド溶液を６００μｌ加え混合した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液でｐＨ８．０に調整した。そして、１５℃で、１５分間撹拌しながらアルキル化反応を行った。次に、ディスクフィルター（０．２μｍ）を使用し、上記抗体溶液から粒子の除去を行った。セントリプレップ−１０を用いて、液量が約０．５ｍｌになるまで濃縮した。
【０１６９】
（３．サイズ排除ＨＰＬＣによるＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の精製）
ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖の精製は、上記のようにして得られた還元アルキル化処理後の抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーに供することにより行った。
【０１７０】
サイズ排除クロマトグラフィーシステムとして、ＰＵ−２０８０ Ｐｌｕｓ（ＪＡＳＣＯ社製）を用いた。また、カラムには、Protein-PakTM300SW（φ７．５ｍｍ×３００ｍｍ；Waters製）を用いた。上記カラムの平衡化は、移動相に用いる６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ６．５）を、０．１５ｍｌ／ｍｉｎの流速で、約２時間流すことにより行った。サンプル（上記還元アルキル化処理後の抗体溶液）は、２〜３回に分けて供した。Ｈ鎖およびＬ鎖に相当する画分を分取した。分取後の各画分はＰＢＳに対して透析を行い、Ｈ鎖およびＬ鎖をRefoldingした。バッファーを１５ｍＭ ＰＢに交換した後、クリーンベンチ内でサンプルを回収した。ＤＣプロテインスタンダードアッセイ（BIO-RAD）でＨ鎖およびＬ鎖の濃度を測定した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を確認して４℃で保存した。このようにして調製したＨ鎖およびＬ鎖の液量と濃度とを表８に示す。
【０１７１】
【表８】
【０１７２】
〔実施例６：ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖におけるペプチダーゼ活性〕
天然型抗体酵素は、タンパク質を基質として用いる場合には標的タンパク質を特異的に分解するという特徴を持つ。しかし、ペプチド基質においては、非特異的に分解することが分かっている。そこで、これまでの抗体酵素のペプチダーゼ活性試験で基質として用いてきたTP41-1 peptide(H2N-TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD-COOH : ２１ｍｅｒ、配列番号５)を使用してＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖が上記ペプチドに対する分解能を有するか検討した。
【０１７３】
実験操作は全てクリーンベンチ内で行い、使用する試験管、緩衝液などは、すべて滅菌処理を行った後、使用した。
【０１７４】
粉末のTP41-1 peptideを必要量はかり、１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）に溶解した後に、ウルトラフリーＭＣ（φ０．２２μｍ、MILLIPORE製)を使って、濾過滅菌した。また、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖についても、１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）を用いて濃度を調整した。最終的に、TP41-1 peptideの濃度が１２０μＭ、Ｌ鎖の濃度が０．８μＭ、Ｈ鎖の濃度が０．４μＭになるように試験管内で混合し、２５℃で反応させた。
【０１７５】
反応の経時時間ごとに、反応液の一部をクリーンベンチ内で採取し、ウルトラフリーＣ３(φ０．５μｍ、MILLIPORE製)で除粒子した。これを逆相ＨＰＬＣで分析することにより、ペプチド基質の濃度変化を経時的に追跡した。逆相ＨＰＬＣの分析条件には、puresil C18カラム（Waters製）を使用した。移動相には０．０８％ＴＦＡを含む１３％アセトニトリルを用い、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、モニター波長２１４ｎｍ、分析温度を４０℃とした。その結果を、図１４〜図１７に示す。図１４および図１５はＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖の結果を、図１６および図１７は、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖の結果を示す。また、図１５および図１７は、各経時時間で採取したサンプルのＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムを示し、図１４および図１６は、それらのＨＰＬＣのクロマトグラムから算出した各経時時間におけるTP41-1 peptide量をグラフに示したものである。なお、図１５の（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、０時間後、２７．７時間後、５０．４時間後、７３．２時間後の結果を示す。また、図１７の（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、０．３時間後、２７．７時間後、５０．７時間後、５８．７時間後の結果を示す。
【０１７６】
図１４〜図１７に示すように、反応時間が経過するにつれ、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖またはＬ鎖を含む反応液では、ペプチド基質の濃度の減少が見られた。具体的には、ペプチド基質の濃度は、反応開始後２７時間ごろから減少していき、Ｌ鎖を含む反応液では７３時間で（図１４および図１５を参照）、Ｈ鎖を含む反応液では５９時間で完全にペプチドが消失した（図１６および図１７を参照）。また、ペプチド基質の濃度の減少に伴い、当該ペプチドの分解断片と思われるピークも出現した。
【０１７７】
また、このＨ鎖およびＬ鎖はどちらも、分解速度の遅い「誘導期」と高活性を示す「活性期」とからなる２相性の分解曲線を描いていた。本発明者らは、これまでの研究において、通常の酵素の特性とは異なる天然型抗体酵素の特性として、２相性の分解曲線があることを見出している。これは、上記誘導期において抗体の立体構造に変化が起こり、抗体の酵素活性が高い構造に変化することにより、活性期が現れると推測されている。
【０１７８】
このように、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖が天然型抗体酵素と同様の特性を示したことは、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖が抗体酵素であることを示唆するものである。
【０１７９】
〔実施例７：ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖における抗原分解能〕
実施例６に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖はペプチダーゼ活性を有することが明らかとなった。そこで、次にＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖が、抗原タンパクであるＴＮＦ−αを分解する能力を有するか否かの検討を行った。
【０１８０】
抗原タンパクには、実施例１で用いたＴＮＦ−αを用いた。まず、バッファーを１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）に交換した。続いて、濃度を６００μｇ／ｍｌに調整した後、濾過滅菌して用いた。
【０１８１】
また、コントロールタンパクとしてウマ心臓由来のミオグロビン（SIGMA M1882-250MG）、およびＢＳＡ（BIO-RAD Protein Assay Standard II）についても、同様に分解試験を行った。ミオグロビンおよびＢＳＡは、粉末を必要量測り取り、１５ｍＭ ＰＢ（ｐＨ６．５）に溶解後、ウルトラフリーＭＣ（φ０．２２μｍ、MILLIPORE製）により濾過滅菌した。分解実験における終濃度は、それぞれミオグロビンが０．９μＭ（１５μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡが０．３μＭ（２０μｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−αが１．１μＭ（２０μｇ／ｍｌ）、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖が０．４μＭ（１０μｇ／ｍｌ）、およびＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖が０．２μＭ（１０μｇ／ｍｌ）とした。
【０１８２】
反応時間４、８、１２、２４時間、４８時間、および７４時間において、各タンパク質の反応液の一部をクリーンベンチ内で分取し、各タンパク質の経時変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥで追跡した。その結果を、図１８〜図２１に示す。図１８および図１９は、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖とＴＮＦ−αとの反応結果を示すものである。
【０１８３】
まず、図１８（ｂ）に示すように、ネガティブコントロールであるＴＮＦ−αのみの反応液では、１７．０ｋＤａに太いバンドが検出され、このバンドは７４時間経過しても変化はみられなかった。
【０１８４】
一方、図１８（ａ）に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖とＴＮＦ−αとの反応液では、反応開始直後からＴＮＦ−αの太いバンドの上部が薄くなり、下部の１６．８ｋＤａのバンドが鮮明になってきた。また、反応時間４時間では、１５．０ｋＤａおよび１３．３ｋＤａ付近にＴＮＦ−αの分解断片と思われるバンドが出現した。反応時間が８時間、１６時間と経過するにつれて、１６．８ｋＤａのバンドは強くなり、かつ、１３．３ｋＤａのバンドおよびその下に、このフラグメントがさらに断片化されたと思われる複数のバンドが出現してきた。反応時間４８時間では、もとの１７．０ｋＤａの太いバンドは細くなり、１６．８ｋＤａのバンドのみが明らかに強く検出された。
【０１８５】
Ｎ末端アミノ酸配列の結果、この細いバンドはＴＮＦ−αのＮ末端から５番目のセリンと６番目のアルギニンとの間のペプチド結合が切断されたものであることが判明した。また、１５．０ｋＤａに現れるバンドは、Ｎ末端から２０番目のプロリンと２１番目のグルタミンとの間のペプチド結合が切断されて生じる断片であった。さらに、１３．３ｋＤａに現れるバンドは、Ｎ末端から３６番目のロイシンと３７番目のロイシンとの間のペプチド結合が切断されて生じる断片であった。つまり、ＴＮＦ−αは反応時間４時間あたりから、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖による分解がはじまり、２０〜３０時間でほとんど分解されたものと考えられる。以上の結果から、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖は抗体酵素であることが実証された。
【０１８６】
図１９に示すように、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖についても同様の分解傾向が見られ、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖においても抗原分解活性が見られた。
【０１８７】
なお、本実施例において、Ｈ鎖単独あるいはＬ鎖単独では時間と共に自己消化を起こし、いくつかの抗体酵素は、自己消化により生じる断片と結びついて多量体を形成していた（図１８（ｃ）および図１９（ｃ）を参照）。
【０１８８】
次に、コントロールタンパクのミオグロビンのみの反応液では、図２０（ｂ）に示すように、１８．０ｋＤａにバンドが認められ、このバンドは７４時間経過しても変化は見られなかった。Ｌ鎖とミオグロビンとの反応液では、図２０（ａ）に示すように、高分子側と低分子側に若干バンドが見られたが、ミオグロビンには変化が見られなかった。また、Ｌ鎖のみの反応液でも、図１９（ｃ）に示すように、同様のバンドが見られた。このため、これらのバンドは、ミオグロビンの分解断片ではなく、Ｌ鎖由来の断片であると考えられる。
【０１８９】
また、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖とＢＳＡと反応の結果でも、図２０（ｃ）に示すように、８時間ごろから若干ＢＳＡより低分子側のバンドが濃くなっていた。しかし、ＢＳＡと思われるバンドには変化は見られなかったことから、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖は、ＢＳＡの分解活性を有さないと考えられる。
【０１９０】
また、Ｈ鎖についてもＬ鎖と同様に、図２１（ａ）および（ｂ）に示すように、にミオグロビンには変化が見られなかった。さらに、ＢＳＡとＨ鎖との反応液では、図２１（ｃ）に示すように、Ｌ鎖と同様に８時間ごろから若干ＢＳＡより低分子側のバンドが濃くなっていた。しかし、これらのバンドもまた、Ｈ鎖由来の分解断片であると考えられる（図１８（ｃ）および図２１（ｃ）を参照）。以上の結果より、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖およびＬ鎖は、ＴＮＦ−αを特異的に分解する活性を有する抗体酵素であることが明らかとなった。
【０１９１】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
以上のように、本発明にかかる抗体酵素は、ＴＮＦ−αに対する抗体として機能し、かつ、ＴＮＦ−αを切断および／または分解することができる抗体酵素であるため、当該抗体酵素を用いることにより、効率よくＴＮＦ−αを分解することができる。それゆえ、本発明は、関節リウマチやＣＯＰＤのようにＴＮＦ−αの過剰産生により引き起こされる疾患の予防や治療に利用することができる。さらに、本発明は、ＴＮＦ−αを利用する医療業、製薬産業、試薬産業、医療機器産業、食品産業等に幅広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（初回）した後の力価測定（初回免疫より９日後）の結果を示すグラフである。
【図２】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（２回目）した後の力価測定（初回免疫より２３日後）の結果を示すグラフである。
【図３】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（３回目）した後の力価測定（初回免疫より３７日後）の結果を示すグラフである。
【図４】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（４回目）した後の力価測定（初回免疫より５２日後）の結果を示すグラフである。
【図５】本実施例において、マウスをＴＮＦ−αで免疫（最終）した後の力価測定（マウスＩについては、初回免疫より４３日後；マウスＩＩについては初回免疫より１０８日後）の結果を示すグラフである。
【図６】本実施例において、ＥＴＮＦ−１〜８抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図７】本実施例において、ＥＴＮＦ−９〜１７抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図８】本実施例において、ＥＴＮＦ−１〜８抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図９】本実施例において、ＥＴＮＦ−９〜１７抗体の様々なタンパク質との交差反応性を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖可変領域の立体構造を予測した結果を示す図である。
【図１１】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖可変領域の立体構造を予測した結果を示す図である。
【図１３】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図１４】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖によるペプチド基質の分解をモニターした結果を示すグラフである。
【図１５】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖によるペプチド基質の分解産物をＨＰＬＣにより経時的に分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１６】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖によるペプチド基質の分解をモニターした結果を示すグラフである。
【図１７】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖によるペプチド基質の分解産物をＨＰＬＣにより経時的に分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図１８】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖によるＴＮＦ−αの分解を電気泳動によりモニターした結果を示す図である。
【図１９】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖によるＴＮＦ−αの分解を電気泳動によりモニターした結果を示す図である。
【図２０】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＬ鎖によるコントロールタンパク質（ミオグロビンおよびＢＳＡ）の分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりモニターした結果を示す図である。
【図２１】本実施例において、ＥＴＮＦ−６抗体のＨ鎖によるコントロールタンパク質（ミオグロビンおよびＢＳＡ）の分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりモニターした結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であり、かつ、上記ＴＮＦ−αを分解することを特徴とする抗体酵素。
【請求項２】
上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体酵素。
【請求項３】
上記抗体酵素は、上記ＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでなることを特徴とする請求項１または２に記載の抗体酵素。
【請求項４】
上記軽鎖可変領域は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドからなり、
上記重鎖可変領域は、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドからなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
上記軽鎖可変領域は、配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなり、
上記重鎖可変領域は、配列番号４に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
【請求項６】
以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体酵素を含み、生体内におけるＴＮＦ−α量の増加を抑制することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項８】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを導入してなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１】
ヒトＴＮＦ−αに対する抗体または当該抗体の断片であり、かつ、上記ＴＮＦ−αを分解することを特徴とする抗体酵素。
【請求項２】
上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体酵素。
【請求項３】
上記抗体酵素は、上記ＴＮＦ−αに対する抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでなることを特徴とする請求項１または２に記載の抗体酵素。
【請求項４】
上記軽鎖可変領域は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドからなり、
上記重鎖可変領域は、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドからなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
上記軽鎖可変領域は、配列番号３に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなり、
上記重鎖可変領域は、配列番号４に示される塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるポリペプチドからなることを特徴とする請求項３に記載の抗体酵素。
【請求項６】
以下の（ｅ）または（ｆ）に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＴＮＦ−αを認識し、当該ＴＮＦ−αを分解する活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体酵素を含み、生体内におけるＴＮＦ−α量の増加を抑制することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項８】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを導入してなることを特徴とする形質転換体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２００７−２０２４４４（Ｐ２００７−２０２４４４Ａ）
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３６６５（Ｐ２００６−２３６６５）
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月３１日（２００６．１．３１）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]