ビタミンＢ６の分別定量方法およびビタミンＢ６の分別定量用キット
【課題】食品、尿、母乳などの夾雑物を多く含む試料が対象であっても、試料中に含まれる個々のビタミンＢ6をより正確かつ効率的に分別定量できる方法と、当該方法に使用できるビタミンＢ6分別定量用キットを提供。
【解決手段】ビタミンＢ6の分別定量方法は、ピリドキサール−４−デヒドロゲナーゼ等、特定の酵素を組合わせて試料を処理することにより生じる４−ピリドキソラクトンを定量し、各反応で得られた定量値から個々のビタミンＢ6を分別定量するものである。
【解決手段】ビタミンＢ6の分別定量方法は、ピリドキサール−４−デヒドロゲナーゼ等、特定の酵素を組合わせて試料を処理することにより生じる４−ピリドキソラクトンを定量し、各反応で得られた定量値から個々のビタミンＢ6を分別定量するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＢ6を個別に定量するための方法、およびビタミンＢ6を個別に定量するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康への関心が高まっており、食品中の機能性成分に注目が集まっている。また、ビタミン類の一つであるビタミンＢ6が欠乏すると、特に新生児や妊婦において皮膚炎や痙攣などが引き起こされることがある。よって、食品に加え、血液や尿に含まれるビタミンＢ6や、その代謝物である４−ピリドキシン酸を定量することが行われている。
【０００３】
ビタミンＢ6の一般的な定量方法としては、塩酸や硫酸を用いて試料中のリン酸型ビタミンＢ6を加水分解した上で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＴＣＣ９０８０の増殖を特定波長の吸光度に基づいて測定し、検量線からビタミンＢ6の総量を定量する方法が知られている。
【０００４】
しかし当該方法では微生物を用いるため、その精度と信頼性は決して高いものではない。また、ビタミンＢ6としては、ピリドキサミン、ピリドキサール、ピリドキシン、およびそれらのリン酸エステルであるピリドキサミン ５’−リン酸、ピリドキサール ５’−リン酸、ピリドキシン ５’−リン酸があり、これらのうちピリドキサミン ５’−リン酸は加水分解され難いので、これを多く含む食品などの測定値は不正確となりやすい。さらに当該方法では、ビタミンＢ6と構造が類似するもののビタミンＢ6には分類されないピリドキシン−β−グルコシドの量も測定値に含まれてしまうという問題がある。
【０００５】
また、個々のビタミンＢ6は、それぞれに特有の作用効果や物性を有する。例えば、ピリドキサール ５’−リン酸はトランスアミナーゼやデカルボキシラーゼなどの補酵素として働く。かかるデカルボキシラーゼとしては脳に存在するグルタミン酸デカルボキシラーゼが挙げられ、ピリドキサール ５’−リン酸が欠乏すると当該デカルボキシラーゼの活性低下につながり、神経症状の原因になると考えられている。また、ピリドキサール ５’−リン酸は、種々の酵素のリシン残基に結合してその活性を阻害する。このようにピリドキサール ５’−リン酸は、生体内の代謝に深く関わっている。その他、最近、ピリドキサミンは糖尿病合併症の予防作用や治療作用を有することが見出されている。また、ピリドキサール ５’−リン酸とピリドキサミンは糖尿病腎症の予防作用等を有することが明らかにされている。一方、ピリドキサールは肝臓のアルデヒドオキダーゼにより直接４−ピリドキシン酸に酸化されて尿中に排泄されてしまうので、ヒトにビタミンＢ6を投与する場合には、ピリドキサールよりピリドキシンでの投与が有効であるといわれている。よって、上記方法のようにビタミンＢ6の総量を測定するよりも、個々のビタミンＢ6をそれぞれ定量することが望まれる。
【０００６】
そこで、高速液体クロマトグラフィを用いて各ビタミンＢ6を分別定量する方法が開発されている。しかし当該方法には、比較的含量の多いピリドキサール ５’−リン酸とピリドキサール以外のビタミンＢ6の定量が難しいという問題がある。カラムを工夫することによりピリドキサミン ５’−リン酸も定量できるようにはなるものの、全てのビタミンＢ6を定量し難いことには変わりはない。また、食品、尿、母乳、各種臓器など蛍光性夾雑物を特に多く含む試料では、含量の低いビタミンＢ6の定量は非常に困難である。
【０００７】
ところで本発明者は、特許文献１のとおり、ピリドキサールを４−ピリドキソラクトンへ効率的に変換する酵素を見出している。
【０００８】
また、本発明者の研究グループは、非特許文献１のとおり、塩酸による加水分解反応と酵素反応を組合わせてビタミンＢ6を分別定量する方法を開発している。詳しくは、試料中のピリドキサミン ５’−リン酸などのリン酸型ビタミンＢ6を、０．０５５〜０．８８Ｍの塩酸中、１２１℃で５時間加水分解した後、反応液を中和してから酵素反応に付すことにより蛍光発色性が極めて高い４−ピリドキソラクトンに導く。また、ピリドキサールなどリン酸化されていないビタミンＢ6は、タンパク質などの高分子や脂質といった夾雑物を除去するために塩酸中低温で処理した上で酵素処理することにより、同じく４−ピリドキソラクトンに導く。これら酵素反応において使用する酵素の組合わせを工夫し、生じた４−ピリドキソラクトンを定量することによって、個々のビタミンＢ6を分別定量することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２３８８０８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Saki NISHIMURAら，Journal of Nutritional Science and Vitaminology（ジャーナル・オブ・ニュトリショナル・サイエンス・アンド・ヴィタミノロジー），第５４巻，第１８〜２４頁（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、本発明者の研究グループは、塩酸による加水分解反応と酵素反応を組合わせてビタミンＢ6を分別定量する方法を開発している。
【００１２】
しかし、リン酸体を加水分解するため長時間にわたり加熱酸処理すると、定量対象であるビタミンＢ6が夾雑物と反応して変質してしまい、正確な定量ができなくなるおそれがある。一方、ＡＯＡＣ（The Association of Official Analytical Chemists）で定められているリン酸型ビタミンＢ6の公的加水分解条件のとおり反応時間を２〜３時間にとどめると、特にピリドキサミン ５’−リン酸とピリドキシン ５’−リン酸が十分に加水分解されない。さらに当該方法では、ピリドキシン ５’−リン酸と、ビタミンＢ6ではないピリドキシン−β−グルコシドを区別できず、これらの合計量しか測定できないという問題もある。
【００１３】
そこで本発明は、たとえ食品、尿、母乳など夾雑物を多く含む試料が対象であっても、試料中に含まれる個々のビタミンＢ6をより正確かつ効率的に分別定量できる方法と、当該方法に使用できるビタミンＢ6分別定量用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、リン酸型ビタミンＢ6の加水分解には酸性ホスファターゼは使えない一方で、アルカリホスファターゼを用いれば極めて効率的に各ビタミンＢ6を分別定量できる上に、ピリドキシン−β−グルコシドの存在の有無にかかわらずピリドキシン ５’−リン酸を分別定量できることを見出して、本発明を完成した。
【００１５】
本発明に係るビタミンＢ6の分別定量方法は、試料にピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量することにより、ピリドキサールを定量する工程１；試料にピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程２；試料にピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程３；試料にアルカリホスファターゼ、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程４；試料にアルカリホスファターゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程５；試料にアルカリホスファターゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程６；工程２の定量値から工程１の定量値を引き、ピリドキサミンを定量する工程；工程３の定量値から工程１の定量値を引き、ピリドキシンを定量する工程；工程４の定量値から工程２の定量値を引き、ピリドキサミン ５’−リン酸を定量する工程；工程５の定量値から工程１の定量値を引き、ピリドキサール ５’−リン酸を定量する工程；工程６の定量値から工程３の定量値を引き、ピリドキシン ５’−リン酸を定量する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明方法においては、酵素反応前に試料をトリクロロ酢酸で処理することが好ましい。当該処理により脂質やタンパク質などの夾雑物を試料から良好に除去できる一方で、後続する酵素反応をワンポットで問題なく実施できる。さらに、試料中でタンパク質に結合しているピリドキサール ５’−リン酸を遊離させることができ、より正確な定量が可能になる。
【００１７】
また、本発明では、さらに、試料にβ−グルコシダーゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程７；並びに、工程７の定量値から工程１および工程３の定量値を減じ、ピリドキシン−β−グルコシドを定量する工程を実施することが好ましい。これら工程により、ビタミンＢ6には分類されないものの、構造的には類似でありビタミンＢ6と同様の働きをする可能性もあるピリドキシン−β−グルコシドも定量することが可能になる。
【００１８】
本発明に係るビタミンＢ6分別定量用キットは、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含むことを特徴とする。当該キットを用いれば、本発明方法を実施することができる。
【００１９】
また、上記本発明方法と同様に、本発明に係るビタミンＢ6分別定量用キットとしては、さらにトリクロロ酢酸を含むものや、β−グルコシダーゼを含むものが好適である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明方法によれば、たとえ食品、尿、母乳など夾雑物を多く含む試料が対象であっても、試料中における個々のビタミンＢ6をより正確かつ効率的に分別定量することができる。また、本発明に係るビタミンＢ6分別定量用キットは、本発明方法を実施するために用いることができる。よって本発明は、近年の健康志向に応じて、生体内での代謝などに深く関与するビタミンＢ6の含有量を、食品や母乳など夾雑物を多く含む試料においても正確に分別定量できることから非常に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、まず本発明方法を実施の順番に従って説明する。
【００２２】
（１） 試料の前処理工程
本発明で各ビタミンＢ6の含有量を測定すべき試料は特に制限されず、ビタミンＢ6の含有量を知ることが望ましい何らかの理由があるものであればよい。例えば、食品原料や加工食品などの食品；脳や肝臓などの臓器試料；血液、血清、血漿、尿、母乳などの液状生体試料；微生物や土壌などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
測定対象試料には、蛍光性物質、タンパク質などの高分子や脂質、セルロースなどの水不溶性物質などが含まれている場合が多い。これらは正確な測定を阻害するおそれがあり得るため、特に食品、尿、母乳など、夾雑物が多く含まれる試料を測定対象とする場合には、夾雑物の量を減らすための前処理を行うことが好ましい。また、ピリドキサール ５’−リン酸は、タンパク質と結合している場合がある。かかるピリドキサール ５’−リン酸を遊離させるためにも、前処理することが好ましい。
【００２４】
かかる前処理としては、酸処理が好ましい。ビタミンＢ6は水溶性で且つ、酸性水溶液中で析出せず分解されにくいことから、アルカリ水溶液よりも酸性水溶液で処理する。使用する酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸；トリクロロ酢酸、ピクリン酸などの有機酸を挙げることができる。但し、過塩素酸など酵素反応を阻害するものは使用すべきでない。
【００２５】
酸性水溶液の濃度や量、処理の温度や時間などは、夾雑物を不溶化することができ、且つリン酸型ビタミンＢ6が加水分解されず、他のビタミンＢ6が変質しない範囲で適宜調整すればよい。例えば、トリクロロ酢酸を用いる場合、その濃度を３０ｗ／ｖ％以上、６０ｗ／ｖ％以下程度とし、尿などの液体試料に対しては試料１ｍＬに対して０．０１ｍＬ以上、０．０５ｍＬ以下程度、食品などの固体試料に対しては試料１ｇに対して０．０５ｍＬ以上、０．５ｍＬ以下程度用いることができ、また、反応温度は８０℃以上、１２０℃以下程度、反応時間は１分間以上、２０分間以下程度とすることができる。塩酸を用いる場合には、その濃度を０．０５Ｎ以上、０．２Ｎ以下程度とし、固体試料に対しては試料１ｇに対して１ｍＬ以上、１０ｍＬ以下程度用いることができ、反応温度は８０℃以上、１２０℃以下程度、反応時間は１０分間以上、１時間以下程度とすることができる。
【００２６】
前処理で使用する酸は一種のみ用いてもよいし、二種以上を組合わせて使用してもよい。例えば、試料を均質化するために０．１Ｎ程度の塩酸を加えて約１００℃で３０分間程度加熱した後、５０ｗ／ｖ％程度のトリクロロ酢酸を加えて約１００℃で５分間程度加熱してもよい。
【００２７】
固体試料を測定する場合、上記酸処理する前に、水または上記酸性水溶液中で、ホモジェナイザーなどを用いて固体試料を十分に粉砕することが好ましい。
【００２８】
上記酸処理の後は、水酸化ナトリウムなどのアルカリや緩衝液を加え、後続の酵素反応などのために必要であれば、ｐＨを調整してもよい。
【００２９】
次いで、遠心分離や濾過などにより、不溶性の夾雑物を除去する。この際、水溶性であるビタミンＢ6は、上澄や濾液に溶解している。より一層正確な定量のために、残渣を水洗し、洗浄液を上澄などに混合してもよい。
【００３０】
さらに、本発明方法では各ビタミンＢ6を４−ピリドキソラクトンに変換して定量するが、４−ピリドキソラクトンの蛍光発色性は極めて高くｐｍｏｌレベルでも検出可能であるので、必要に応じて反応液を希釈してもよい。希釈率は、予備実験などで適宜決定すればよい。
【００３１】
得られた試料溶液は、後続する酵素反応のために、同様のものを最低７つ調製する。
【００３２】
（２） 工程１：ＰＬの定量工程
本工程では、下記式のとおり、試料にピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりピリドキサール（ＰＬ）を４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量することにより、ビタミンＢ6の一つであるＰＬを間接的に定量する。
【００３３】
【化１】
【００３４】
ＰＬＤＨはピリドキシンを唯一の炭素源として生育する微生物に存在し、ＰＬを不可逆的に酸化して４−ＰＡＬに変換する酵素である。ＰＬＤＨは、Ｐｓｃｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＡ−１株から単離したり、また、特許文献１のとおり、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉから対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。例えば、本発明者の研究グループによる、Arch Biochem Biophys, 452(1), pp.1-8（2006）に記載の方法により得ることができる。また、市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００３５】
ＰＬＤＨの反応至適ｐＨは８．７〜９．７程度であることから、緩衝液などを適量添加して反応溶液のｐＨを当該範囲に調整することが好ましい。
【００３６】
使用するＰＬＤＨの適量は、反応溶液中におけるＰＬの量に依存するので、予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＮＡＤ+を添加する。
【００３７】
ＰＬＤＨの至適反応温度は３０〜５５℃程度であることから、酵素反応時の反応溶液温度は当該範囲に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００３８】
十分に酵素反応を行った後、塩酸などを添加することにより酵素反応を停止させた上で、不溶成分などを遠心分離や濾過などにより除去する。次に、４−ＰＡＬを定量することによりＰＬを間接的に定量する。
【００３９】
４−ＰＡＬは３５５〜３６５ｎｍの波長で励起すると４２５〜４３５ｎｍ程度の波長の蛍光を強く発し、ｐｍｏｌレベルの量でも十分に検出可能である。よって、当該波長範囲の検出波長で反応溶液を高速液体クロマトグラフィなどで蛍光強度を測定する場合、蛍光性夾雑物などの悪影響は少ないといえる。
【００４０】
得られた蛍光強度から、検量線などにより４−ＰＡＬを定量し、ひいてはＰＬを定量する。因みに、本発明者による実験的知見によれば、４−ＰＡＬの蛍光強度と濃度は明確な比例関係にあるので、蛍光強度から４−ＰＡＬの濃度を正確に求めることが可能である。
【００４１】
（３） 工程２：ＰＭとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ）を作用させることによりピリドキサミン（ＰＭ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００４２】
【化２】
【００４３】
ＰＰＡＴは、ピリドキサミンまたはピリドキシンを単一炭素源として生育した微生物のみから見出されている酵素であり、ＰＭとＰＬの相互変換を触媒する。ＰＰＡＴは、Ｐｓｃｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＡ−１株から単離することができる。また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉから対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。例えば、本発明者の研究グループによる、Biochem J, 396(3), pp.499-507（2006）に記載の方法により得ることができる。市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００４４】
また、ＰＰＡＴとＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００４５】
ＰＰＡＴの至適反応ｐＨは９．５程度であることから、ＰＬＤＨの至適反応ｐＨも考慮し、緩衝液を適量添加することにより反応溶液のｐＨを９．０以上、１０．０以下程度に調整することが好ましい。
【００４６】
使用するＰＰＡＴの適量は反応溶液中におけるＰＭの量に依存し、ＰＬＤＨの適量はＰＭとＰＬの合計量に依存するので、両酵素の使用量は工程１の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のピルビン酸とＮＡＤ+を添加する。
【００４７】
ＰＰＡＴの至適反応温度は７０℃程度であることから、ＰＬＤＨの至適反応温度も考慮し、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＭとＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＰＰＡＴとＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００４８】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＭとＰＬの合計量を定量することができる。
【００４９】
（４） 工程３：ＰＮとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にピリドキシン ４−オキシダーゼ（ＰＮＯＸ）を作用させることによりピリドキシン（ＰＮ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００５０】
【化３】
【００５１】
ＰＮＯＸは、Ｐｓｃｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＡ−１株から単離したり、また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉから対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。例えば、本発明者の研究グループによる、FEMS Microbiol Lett, 234(2), pp.225-230（2004）に記載の方法により得ることができる。市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００５２】
ＰＮＯＸとＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００５３】
ＰＮＯＸの至適反応ｐＨは７．５〜８．０程度であることから、ＰＬＤＨの至適反応ｐＨも考慮し、緩衝液を適量添加することにより反応溶液のｐＨを８．０以上、９．５以下程度に調整することが好ましい。
【００５４】
使用するＰＮＯＸの適量は反応溶液中におけるＰＮの量に依存し、ＰＬＤＨの適量はＰＮとＰＬの合計量に依存するので、両酵素の使用量は工程１の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＦＡＤとＮＡＤ+を添加する。
【００５５】
ＰＮＯＸの至適反応温度は４０℃程度であることから、ＰＬＤＨの至適反応温度も考慮し、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＮとＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＰＮＯＸとＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００５６】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＮとＰＬの合計量を定量することができる。
【００５７】
（５） 工程４：ＰＭＰとＰＭとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を作用させることによりピリドキサミン ５’−リン酸（ＰＭＰ）をピリドキサミン（ＰＭ）に変換し、さらにピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ）を作用させることによりピリドキサミン（ＰＭ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００５８】
【化４】
【００５９】
ＡＬＰは、至適反応ｐＨがアルカリ側にあり、多くのリン酸モノエステル結合を加水分解できる特異性の広い酵素である。ＡＬＰは微生物から高等動物まで広く存在しているので、常法により単離精製することができるし、これら生物から対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。また、市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００６０】
また、ＡＬＰ、ＰＰＡＴおよびＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００６１】
ＡＬＰの至適反応ｐＨは９．０〜１０．５程度であることから、ＰＰＡＴおよびＰＬＤＨの至適反応ｐＨも考慮し、緩衝液を適量添加することにより反応溶液のｐＨを８．０以上、９．５以下程度に調整することが好ましい。また、ＡＬＰの活性維持のためにＭｇ2+を塩化マグネシウムなどの塩として添加することが好ましい。
【００６２】
使用するＡＬＰの適量は反応溶液中におけるＰＭＰ、ピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）およびピリドキシン ５’−リン酸（ＰＬＰ）の合計量とその他のリン酸エステル化合物の総量に依存し、ＰＰＡＴの適量はＰＭＰとＰＭの合計量に依存し、ＰＬＤＨの適量はこれらとＰＬの合計量に依存するので、これら酵素の使用量は工程１等の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＮＡＤ+を添加する。
【００６３】
ＡＬＰの至適反応温度は７０〜８０℃程度であることから、ＰＰＡＴおよびＰＬＤＨの至適反応温度も考慮し、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＭＰ、ＰＭおよびＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＡＬＰ、ＰＰＡＴおよびＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００６４】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＭＰ、ＰＭおよびＰＬの合計量を定量することができる。
【００６５】
（６） 工程５：ＰＬＰとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を作用させることによりピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００６６】
【化５】
【００６７】
ＡＬＰとＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００６８】
上記工程４と同様に、反応溶液のｐＨを８．０以上、９．５以下程度に調整することが好ましい。また、ＡＬＰの活性維持のためにＭｇ2+を塩化マグネシウムなどの塩として添加することが好ましい。
【００６９】
使用するＡＬＰの適量は反応溶液中におけるリン酸型ビタミンＢ6とその他のリン酸エステル型化合物の量に依存し、ＰＬＤＨの適量はＰＬＰとＰＬの合計量に依存するので、これら酵素の使用量は工程１の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＮＡＤ+を添加する。
【００７０】
上記工程４と同様に、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＬＰとＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＡＬＰとＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００７１】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＬＰとＰＬの合計量を定量することができる。
【００７２】
（７） 工程６：ＰＮＰとＰＮとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を作用させることによりピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）をピリドキシン（ＰＮ）に変換し、さらにピリドキシン ４−オキシダーゼ（ＰＮＯＸ）を作用させることによりピリドキシン（ＰＮ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００７３】
【化６】
【００７４】
ＡＬＰ、ＰＮＯＸおよびＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００７５】
上記工程４と同様に、反応溶液のｐＨを８．０以上、９．５以下程度に調整することが好ましい。また、ＡＬＰの活性維持のためにＭｇ2+を塩化マグネシウムなどの塩として添加することが好ましい。
【００７６】
使用するＡＬＰの適量は反応溶液中におけるリン酸型ビタミンＢ6とその他のリン酸エステル型化合物の量に依存し、ＰＮＯＸの適量はＰＮＰとＰＮの合計量に依存し、ＰＬＤＨの適量はこれらとＰＬの合計量に依存するので、これら酵素の使用量は工程１等の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＦＡＤとＮＡＤ+を添加する。
【００７７】
上記工程４と同様に、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＮＰ、ＰＮおよびＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＡＬＰ、ＰＮＯＸおよびＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００７８】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＮＰ、ＰＮおよびＰＬの合計量を定量することができる。
【００７９】
（８） 各ビタミンＢ6の量の算出工程
上記工程１により、試料中におけるピリドキサール（ＰＬ）の量を求めることができる。また、上記工程２によりピリドキサミン（ＰＭ）とＰＬとの合計量が、上記工程３によりピリドキシン（ＰＮ）とＰＬとの合計量が、上記工程４によりピリドキサミン ５’−リン酸（ＰＭＰ）とＰＭとＰＬとの合計量が、上記工程５によりピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）とＰＬとの合計量が、上記工程６によりピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）とＰＮとＰＬとの合計量が求められる。
【００８０】
従って、上記工程２の定量値から上記工程１の定量値を減ずることにより、ピリドキサミン（ＰＭ）の定量値を求めることができ；
上記工程３の定量値から上記工程１の定量値を減ずることにより、ピリドキシン（ＰＮ）の定量値を求めることができ；
上記工程４の定量値から上記工程２の定量値を減ずることにより、ピリドキサミン ５’−リン酸（ＰＭＰ）の定量値を求めることができ；
上記工程５の定量値から上記工程１の定量値を減ずることにより、ピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）の定量値を求めることができ；
上記工程６の定量値から上記工程３の定量値を減ずることにより、ピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）の定量値を求めることができる。
【００８１】
（９） ＰＮＧの定量工程
ピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）はピリドキシンにグルコースがβ結合した構造を有し、ビタミンＢ6と構造的に類似するものの、ヒト体内でビタミンＢ6と栄養学的に同じように働くか否か不明な点があり、ビタミンＢ6には分類されていない。しかしＰＮＧは植物細胞中に含まれており、ヒト体内でそのまま吸収されてから代謝されてビタミンＢ6と同様の作用を示したり、或いはピリドキシンに変換されて吸収されるという報告もあるので、ＰＮＧも定量することが好ましい。
【００８２】
ＰＮＧを定量するには、先ず下記式のとおり、試料にβ−グルコシダーゼを作用させることによりピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）をピリドキシン（ＰＮ）に変換し、さらにピリドキシン ４−オキシダーゼ（ＰＮＯＸ）を作用させることによりピリドキシン（ＰＮ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００８３】
【化７】
【００８４】
β−グルコシダーゼは、その至適ｐＨが酸性側にあり、多くのβ−１，４−グリコシド結合を加水分解できる特異性の広い酵素である。β−グルコシダーゼは微生物から高等生物まで広く存在しているので、常法により単離精製することができるし、これら生物から対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。また、市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００８５】
β−グルコシダーゼの反応は酸性条件下で行い、反応後、反応溶液のｐＨをアルカリ性にしてからＰＮＯＸとＰＬＤＨを添加し、ＰＮをＰＬへ連続的に変換する。
【００８６】
β−グルコシダーゼの至適反応ｐＨは５．０程度であることから、β−グルコシダーゼによる反応段階では、緩衝液を適量添加することにより反応溶液のｐＨを４．０以上、５．５以下程度に調整することが好ましい。また、ＰＮＯＸとＰＬＤＨによる反応段階では、上記工程３と同様にｐＨを８．０以上、９．５以下程度にすることが好ましい。
【００８７】
使用するβ−グルコシダーゼの適量は反応溶液中におけるＰＮＧとその他のβ−グリコシド化合物の量に依存し、ＰＮＯＸの適量はＰＮＧおよびピリドキシンの合計量に依存し、ＰＬＤＨの適量はこれらとＰＬの合計量に依存するので、これら酵素の使用量は工程１等の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＮＡＤ+とＦＡＤを添加する。
【００８８】
β−グルコシダーゼの至適反応温度は３０〜４０℃程度であることから、ＰＮＯＸおよびＰＬＤＨの至適反応温度も考慮し、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＮＧ、ＰＮおよびＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のβ−グルコシダーゼ、ＰＮＯＸおよびＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００８９】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＮＧ、ＰＮおよびＰＬの合計量を定量することができる。
【００９０】
よって、当該工程の定量値から、上記工程３の定量値を減ずることにより、ピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）の定量値を求めることができる。
【００９１】
上記工程１〜７の番号は便宜上付したものであり、上記工程１〜７を実施する順番は任意である。また、各ビタミンＢ6およびピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）の定量値を算出する各工程の実施順序も任意である。
【００９２】
以上のとおり試料を処理することにより、試料中に含まれる各ビタミンＢ6、および任意にピリドキシン−β−グルコシドを、簡便かつ正確に分別定量することが可能である。
【００９３】
また、上記の説明に従えば、本発明方法は、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ）、ピリドキシン ４−オキシダーゼ（ＰＮＯＸ）、およびアルカリホスファターゼを含む、本発明に係るビタミンＢ6分別定量用キットにより実施することが可能である。
【００９４】
より詳しくは、本発明のビタミンＢ6分別定量用キットは、本発明方法の各反応を実施するために、下記の組合わせがセットになっているものが好ましい。
・ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＰＰＡＴ、ピルビン酸、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＰＮＯＸ、ＦＡＤ、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＡＬＰ、マグネシウム塩、ＰＰＡＴ、ピルビン酸、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＡＬＰ、マグネシウム塩、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＡＬＰ、マグネシウム塩、ＰＮＯＸ、ＦＡＤ、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
【００９５】
さらに、各酵素反応のための緩衝液、反応を停止し且つ試料から夾雑物を除去するための塩酸、試料から夾雑物を除去するためのトリクロロ酢酸や、β−グルコシダーゼを含むビタミンＢ6分別定量用キットももちろん好適である。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００９７】
実施例１ ヒト尿における各ビタミンＢ6の分別定量
（１） ヒト尿の前処理
２１〜２２歳の成人男性５名から採取した尿（５ｍＬ）に、５０ｗ／ｖ％のトリクロロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、１００℃で５分間加熱処理した。次いで、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【００９８】
（２） ピリドキサール（ＰＬ）の定量
Arch Biochem Biophys, 452(1), pp.1-8（2006）に記載の遺伝子組み換え方法により、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを得た。次いで、上記実施例１（１）で得られた上澄液（５μＬ）に、当該ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（１ｍＵ）、２５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ９．０，０．０４ｍＬ）、１００ｍＭ ＮＡＤ+水溶液（２μＬ）および精製水（０．３３２ｍＬ）を加え、３０℃で１時間反応させた。
【００９９】
反応液に０．５５Ｎ塩酸（２０μＬ）を加えて反応を停止した後に、濾過した。濾液（１００μＬ）を下記条件の高速液体クロマトグラフィで分析し、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
カラム： ナラカイテスク社製，Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
溶離液： リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／メタノール＝９０／１０（ｖ／ｖ）の混合液
流速： ０．５ｍＬ／分
検出波長： 励起波長−３６０ｎｍ，測定波長４３０ｎｍ
【０１００】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）、ひいてはピリドキサール（ＰＬ）の尿中濃度を算出した。
【０１０１】
（３） ピリドキサミン（ＰＭ）の定量
Biochem J, 396(3), pp.499-507（2006）に記載の遺伝子組み換え方法により、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼを得た。次いで、上記実施例１（２）において、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼに加えて当該ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（１ｍＵ）と１００ｍＭピルビン酸水溶液（８μＬ）を用いた以外は同様にして酵素反応を行い、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１０２】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線によりＰＬとピリドキサミン（ＰＭ）の合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（２）の結果と合わせてＰＭの尿中濃度を求めた。
【０１０３】
（４） ピリドキシン（ＰＮ）の定量
FEMS Microbiol Lett, 234(2), pp.225-230（2004）に記載の遺伝子組み換え方法により、ピリドキシン ４−オキシダーゼを得た。次いで、上記実施例１（２）において、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼに加えて当該ピリドキシン ４−オキシダーゼ（１ｍＵ）と１ｍＭ ＦＡＤ水溶液（１μＬ）を用いた以外は同様にして酵素反応を行い、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１０４】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により、ＰＬとピリドキシン（ＰＮ）の合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（２）の結果と合わせてＰＮの尿中濃度を求めた。
【０１０５】
（５） ピリドキサミン ５’−リン酸（ＰＭＰ）の定量
上記実施例１（１）で得られた上澄液（５μＬ）に、２５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ９．０，０．０４ｍＬ）、アルカリホスファターゼ（１０ｍＵ，シグマ社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（４０μＬ）および精製水（０．３３２ｍＬ）を加え、３０℃で２時間反応させた。次いで、反応溶液にピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（１ｍＵ）、１００ｍＭ ＮＡＤ+水溶液（２μＬ）、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（１ｍＵ）および１００ｍＭピルビン酸水溶液（８μＬ）を加え、３０℃で１時間反応させた。
【０１０６】
反応液に０．５５Ｎ塩酸（２０μＬ）を加えて反応を停止した後に、濾過した。濾液（１００μＬ）を上記実施例１（２）の条件の高速液体クロマトグラフィで分析し、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１０７】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により、ＰＭＰとＰＭとＰＬの合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（３）の結果と合わせてＰＭＰの尿中濃度を求めた。
【０１０８】
（６） ピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）の定量
上記実施例１（２）において、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼに加えてアルカリホスファターゼ（１０ｍＵ，シグマ社製）と５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（４０μＬ）を用いた以外は同様にして酵素反応を行い、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１０９】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により、ＰＬとピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）の合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（２）の結果と合わせてＰＬＰの尿中濃度を求めた。
【０１１０】
（７） ピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）の定量
上記実施例１（５）において、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（１ｍＵ）および１００ｍＭピルビン酸水溶液（８μＬ）の代わりにピリドキシン ４−オキシダーゼ（１ｍＵ）および１ｍＭ ＦＡＤ水溶液（１μＬ）を用いた以外は同様にして酵素反応を行い、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１１１】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により、ＰＮＰとＰＭとＰＬの合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（３）の結果と合わせてＰＮＰの尿中濃度を求めた。
【０１１２】
（８） ４−ピリドキシン酸（４−ＰＡ）の定量
ビタミンＢ6の代謝物である４−ピリドキシン酸の尿中濃度を下記のとおり求めた。即ち、尿（１０μＬ）に精製水（９０μＬ）と５Ｎ塩酸（０．２ｍＬ）を添加し、２０分間煮沸した。冷却後、反応混合液を４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上澄（１０μＬ）に、上記実施例１（２）の溶離液（９０μＬ）を添加した後、上記実施例１（２）に示す条件の高速液体クロマトグラフィで分析し、４−ピリドキシン酸の尿中濃度を求めた。
【０１１３】
以上の結果を表１に示す。なお、表１中の数値の単位はｎｍｏｌ／ｍＬである。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】
また、尿の濃度を補正するため、尿中クレアチニン含有量（ｇ）当たりのピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）および４−ピリドキシン酸（４−ＰＡ）の含有量（μｍｏｌ）を表２に示す。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
上記結果のとおり、ヒト尿中には一定量のピリドキサール（ＰＬ）とピリドキサミン（ＰＭ）が含まれていることが明らかとなった。また、ピリドキサールの含有量は各人であまり大きく変動しないが、ピリドキサミンの含有量には個人間で大きな差が認められた。このように本発明方法によれば、ｎｍｏｌ／ｍＬという極めて低濃度のレベルでのビタミンＢ6含有量の定量が可能であることが実証された。
【０１１８】
（９） 測定感度
測定試料に含まれる各ビタミンＢ6等が精度良く検出できているか、内部標準法により確認した。具体的には、上記（１）で得られた上澄液（５μＬ）に内部標準として各ビタミンＢ6等（２ｐｍｏｌ）を加え、上記（２）〜（８）と同様にして各ビタミンＢ6等を定量した。内部標準を加えた場合と加えない場合の値から、下記式により測定感度を求めた。
測定感度（％）＝（［｛内部標準を加えた場合の定量値（ｎｍｏｌ／ｍＬ）｝−｛内部標準を加えない場合の定量値（ｎｍｏｌ／ｍＬ）｝］／［内部標準の量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）］）×１００
【０１１９】
その結果、本発明方法による測定感度は７６〜１３４％であった。このように本発明方法は、試料に微量含まれる各ビタミンＢ6を約±３０％の誤差で検出可能であり、従来方法よりも正確であることが明らかとなった。
【０１２０】
実施例２ トリささ身における各ビタミンＢ6の分別定量
（１） 各ビタミンＢ6の定量
生のトリささ身（１．０ｇ）に０．１Ｎ塩酸（５．０ｍＬ）を加え、ホモジェナイザー（セントラル科学貿易製、製品名:ポリトロン）で５分間ホモジェナイズした後、１００℃で３０分間加熱処理した。当該混合液を氷中で冷却した後、５０ｗ／ｖ％のトリクロロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、さらに１００℃で５分間加熱処理した。当該混合液を氷中で冷却した後、０．５Ｍトリス酢酸（ｐＨ７．５，０．５ｍＬ）を加えてよく混合し、さらに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５７０μＬ）を添加してｐＨを７．５とし、また、総液量を５ｍＬとした。当該混合液を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上澄を精製水で１０倍に希釈し、当該希釈液を試料として、上記実施例１（２）〜（７）と同様に各ビタミンＢ6を分別定量した。
【０１２１】
（２） ピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）の定量
ピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）の定量のため、上記希釈液（５０μＬ）に、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０，４０μＬ）、β−グルコシダーゼ（５０ｍＵ，シグマ社製）、１００ｍＭリン酸第二水素ナトリウム水溶液（２０μＬ）および精製水（０．０７ｍＬ）を加え、３０℃で２時間反応させた。次いで、反応溶液を中和するため、１００ｍＭ水酸化ナトリウム（８０μＬ）と５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０，８μＬ）を添加した後、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（１ｍＵ）、１００ｍＭ ＮＡＤ+水溶液（２μＬ）、ピリドキシン ４−オキシダーゼ（１ｍＵ，第一ファインケミカル社製），１ｍＭ ＦＡＤ（１μＬ）および精製水（８３μＬ）を加え、３０℃で１時間反応させた。
【０１２２】
反応液に０．５５Ｎ塩酸（２０μＬ）を加えて反応を停止した後に、濾過した。濾液（１００μＬ）を上記実施例１（２）に示す条件の高速液体クロマトグラフィで分析し、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定し、トリささ身に含まれるＰＮＧの含有量を求めた。
【０１２３】
以上の結果を表３に示す。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
上記結果のとおり、トリささ身中にはピリドキサール（ＰＬ）が最も多く含まれ、次いでピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）が多く含まれている一方で、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）およびピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）はほとんど含まれていなかった。また、測定されたビタミンＢ6総量は、従来方法である微生物定量法が用いられている食品成分表の値（６００μｇ／１００ｇ）よりもかなり多い。その理由としては、微生物定量法ではリン酸型ビタミンＢ6を塩酸により加水分解するので、その際に含有ビタミンＢ6の一部が分解されているのに対して、本発明方法によれば含有ビタミンＢ6が分解されることなく定量可能であることが考えられる。
【０１２６】
このように本発明方法によれば、ｎｍｏｌ／ｇという極めて低濃度のレベルでのビタミンＢ6含有量の定量が可能であることが証明された。また、上記結果によっても、本発明方法は試料に含まれる各ビタミンＢ6を約±３０％の誤差で検出可能であり、従来方法よりも正確であることが実証された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＢ6を個別に定量するための方法、およびビタミンＢ6を個別に定量するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康への関心が高まっており、食品中の機能性成分に注目が集まっている。また、ビタミン類の一つであるビタミンＢ6が欠乏すると、特に新生児や妊婦において皮膚炎や痙攣などが引き起こされることがある。よって、食品に加え、血液や尿に含まれるビタミンＢ6や、その代謝物である４−ピリドキシン酸を定量することが行われている。
【０００３】
ビタミンＢ6の一般的な定量方法としては、塩酸や硫酸を用いて試料中のリン酸型ビタミンＢ6を加水分解した上で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＴＣＣ９０８０の増殖を特定波長の吸光度に基づいて測定し、検量線からビタミンＢ6の総量を定量する方法が知られている。
【０００４】
しかし当該方法では微生物を用いるため、その精度と信頼性は決して高いものではない。また、ビタミンＢ6としては、ピリドキサミン、ピリドキサール、ピリドキシン、およびそれらのリン酸エステルであるピリドキサミン ５’−リン酸、ピリドキサール ５’−リン酸、ピリドキシン ５’−リン酸があり、これらのうちピリドキサミン ５’−リン酸は加水分解され難いので、これを多く含む食品などの測定値は不正確となりやすい。さらに当該方法では、ビタミンＢ6と構造が類似するもののビタミンＢ6には分類されないピリドキシン−β−グルコシドの量も測定値に含まれてしまうという問題がある。
【０００５】
また、個々のビタミンＢ6は、それぞれに特有の作用効果や物性を有する。例えば、ピリドキサール ５’−リン酸はトランスアミナーゼやデカルボキシラーゼなどの補酵素として働く。かかるデカルボキシラーゼとしては脳に存在するグルタミン酸デカルボキシラーゼが挙げられ、ピリドキサール ５’−リン酸が欠乏すると当該デカルボキシラーゼの活性低下につながり、神経症状の原因になると考えられている。また、ピリドキサール ５’−リン酸は、種々の酵素のリシン残基に結合してその活性を阻害する。このようにピリドキサール ５’−リン酸は、生体内の代謝に深く関わっている。その他、最近、ピリドキサミンは糖尿病合併症の予防作用や治療作用を有することが見出されている。また、ピリドキサール ５’−リン酸とピリドキサミンは糖尿病腎症の予防作用等を有することが明らかにされている。一方、ピリドキサールは肝臓のアルデヒドオキダーゼにより直接４−ピリドキシン酸に酸化されて尿中に排泄されてしまうので、ヒトにビタミンＢ6を投与する場合には、ピリドキサールよりピリドキシンでの投与が有効であるといわれている。よって、上記方法のようにビタミンＢ6の総量を測定するよりも、個々のビタミンＢ6をそれぞれ定量することが望まれる。
【０００６】
そこで、高速液体クロマトグラフィを用いて各ビタミンＢ6を分別定量する方法が開発されている。しかし当該方法には、比較的含量の多いピリドキサール ５’−リン酸とピリドキサール以外のビタミンＢ6の定量が難しいという問題がある。カラムを工夫することによりピリドキサミン ５’−リン酸も定量できるようにはなるものの、全てのビタミンＢ6を定量し難いことには変わりはない。また、食品、尿、母乳、各種臓器など蛍光性夾雑物を特に多く含む試料では、含量の低いビタミンＢ6の定量は非常に困難である。
【０００７】
ところで本発明者は、特許文献１のとおり、ピリドキサールを４−ピリドキソラクトンへ効率的に変換する酵素を見出している。
【０００８】
また、本発明者の研究グループは、非特許文献１のとおり、塩酸による加水分解反応と酵素反応を組合わせてビタミンＢ6を分別定量する方法を開発している。詳しくは、試料中のピリドキサミン ５’−リン酸などのリン酸型ビタミンＢ6を、０．０５５〜０．８８Ｍの塩酸中、１２１℃で５時間加水分解した後、反応液を中和してから酵素反応に付すことにより蛍光発色性が極めて高い４−ピリドキソラクトンに導く。また、ピリドキサールなどリン酸化されていないビタミンＢ6は、タンパク質などの高分子や脂質といった夾雑物を除去するために塩酸中低温で処理した上で酵素処理することにより、同じく４−ピリドキソラクトンに導く。これら酵素反応において使用する酵素の組合わせを工夫し、生じた４−ピリドキソラクトンを定量することによって、個々のビタミンＢ6を分別定量することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２３８８０８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Saki NISHIMURAら，Journal of Nutritional Science and Vitaminology（ジャーナル・オブ・ニュトリショナル・サイエンス・アンド・ヴィタミノロジー），第５４巻，第１８〜２４頁（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、本発明者の研究グループは、塩酸による加水分解反応と酵素反応を組合わせてビタミンＢ6を分別定量する方法を開発している。
【００１２】
しかし、リン酸体を加水分解するため長時間にわたり加熱酸処理すると、定量対象であるビタミンＢ6が夾雑物と反応して変質してしまい、正確な定量ができなくなるおそれがある。一方、ＡＯＡＣ（The Association of Official Analytical Chemists）で定められているリン酸型ビタミンＢ6の公的加水分解条件のとおり反応時間を２〜３時間にとどめると、特にピリドキサミン ５’−リン酸とピリドキシン ５’−リン酸が十分に加水分解されない。さらに当該方法では、ピリドキシン ５’−リン酸と、ビタミンＢ6ではないピリドキシン−β−グルコシドを区別できず、これらの合計量しか測定できないという問題もある。
【００１３】
そこで本発明は、たとえ食品、尿、母乳など夾雑物を多く含む試料が対象であっても、試料中に含まれる個々のビタミンＢ6をより正確かつ効率的に分別定量できる方法と、当該方法に使用できるビタミンＢ6分別定量用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、リン酸型ビタミンＢ6の加水分解には酸性ホスファターゼは使えない一方で、アルカリホスファターゼを用いれば極めて効率的に各ビタミンＢ6を分別定量できる上に、ピリドキシン−β−グルコシドの存在の有無にかかわらずピリドキシン ５’−リン酸を分別定量できることを見出して、本発明を完成した。
【００１５】
本発明に係るビタミンＢ6の分別定量方法は、試料にピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量することにより、ピリドキサールを定量する工程１；試料にピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程２；試料にピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程３；試料にアルカリホスファターゼ、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程４；試料にアルカリホスファターゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程５；試料にアルカリホスファターゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程６；工程２の定量値から工程１の定量値を引き、ピリドキサミンを定量する工程；工程３の定量値から工程１の定量値を引き、ピリドキシンを定量する工程；工程４の定量値から工程２の定量値を引き、ピリドキサミン ５’−リン酸を定量する工程；工程５の定量値から工程１の定量値を引き、ピリドキサール ５’−リン酸を定量する工程；工程６の定量値から工程３の定量値を引き、ピリドキシン ５’−リン酸を定量する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明方法においては、酵素反応前に試料をトリクロロ酢酸で処理することが好ましい。当該処理により脂質やタンパク質などの夾雑物を試料から良好に除去できる一方で、後続する酵素反応をワンポットで問題なく実施できる。さらに、試料中でタンパク質に結合しているピリドキサール ５’−リン酸を遊離させることができ、より正確な定量が可能になる。
【００１７】
また、本発明では、さらに、試料にβ−グルコシダーゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程７；並びに、工程７の定量値から工程１および工程３の定量値を減じ、ピリドキシン−β−グルコシドを定量する工程を実施することが好ましい。これら工程により、ビタミンＢ6には分類されないものの、構造的には類似でありビタミンＢ6と同様の働きをする可能性もあるピリドキシン−β−グルコシドも定量することが可能になる。
【００１８】
本発明に係るビタミンＢ6分別定量用キットは、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含むことを特徴とする。当該キットを用いれば、本発明方法を実施することができる。
【００１９】
また、上記本発明方法と同様に、本発明に係るビタミンＢ6分別定量用キットとしては、さらにトリクロロ酢酸を含むものや、β−グルコシダーゼを含むものが好適である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明方法によれば、たとえ食品、尿、母乳など夾雑物を多く含む試料が対象であっても、試料中における個々のビタミンＢ6をより正確かつ効率的に分別定量することができる。また、本発明に係るビタミンＢ6分別定量用キットは、本発明方法を実施するために用いることができる。よって本発明は、近年の健康志向に応じて、生体内での代謝などに深く関与するビタミンＢ6の含有量を、食品や母乳など夾雑物を多く含む試料においても正確に分別定量できることから非常に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、まず本発明方法を実施の順番に従って説明する。
【００２２】
（１） 試料の前処理工程
本発明で各ビタミンＢ6の含有量を測定すべき試料は特に制限されず、ビタミンＢ6の含有量を知ることが望ましい何らかの理由があるものであればよい。例えば、食品原料や加工食品などの食品；脳や肝臓などの臓器試料；血液、血清、血漿、尿、母乳などの液状生体試料；微生物や土壌などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
測定対象試料には、蛍光性物質、タンパク質などの高分子や脂質、セルロースなどの水不溶性物質などが含まれている場合が多い。これらは正確な測定を阻害するおそれがあり得るため、特に食品、尿、母乳など、夾雑物が多く含まれる試料を測定対象とする場合には、夾雑物の量を減らすための前処理を行うことが好ましい。また、ピリドキサール ５’−リン酸は、タンパク質と結合している場合がある。かかるピリドキサール ５’−リン酸を遊離させるためにも、前処理することが好ましい。
【００２４】
かかる前処理としては、酸処理が好ましい。ビタミンＢ6は水溶性で且つ、酸性水溶液中で析出せず分解されにくいことから、アルカリ水溶液よりも酸性水溶液で処理する。使用する酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸；トリクロロ酢酸、ピクリン酸などの有機酸を挙げることができる。但し、過塩素酸など酵素反応を阻害するものは使用すべきでない。
【００２５】
酸性水溶液の濃度や量、処理の温度や時間などは、夾雑物を不溶化することができ、且つリン酸型ビタミンＢ6が加水分解されず、他のビタミンＢ6が変質しない範囲で適宜調整すればよい。例えば、トリクロロ酢酸を用いる場合、その濃度を３０ｗ／ｖ％以上、６０ｗ／ｖ％以下程度とし、尿などの液体試料に対しては試料１ｍＬに対して０．０１ｍＬ以上、０．０５ｍＬ以下程度、食品などの固体試料に対しては試料１ｇに対して０．０５ｍＬ以上、０．５ｍＬ以下程度用いることができ、また、反応温度は８０℃以上、１２０℃以下程度、反応時間は１分間以上、２０分間以下程度とすることができる。塩酸を用いる場合には、その濃度を０．０５Ｎ以上、０．２Ｎ以下程度とし、固体試料に対しては試料１ｇに対して１ｍＬ以上、１０ｍＬ以下程度用いることができ、反応温度は８０℃以上、１２０℃以下程度、反応時間は１０分間以上、１時間以下程度とすることができる。
【００２６】
前処理で使用する酸は一種のみ用いてもよいし、二種以上を組合わせて使用してもよい。例えば、試料を均質化するために０．１Ｎ程度の塩酸を加えて約１００℃で３０分間程度加熱した後、５０ｗ／ｖ％程度のトリクロロ酢酸を加えて約１００℃で５分間程度加熱してもよい。
【００２７】
固体試料を測定する場合、上記酸処理する前に、水または上記酸性水溶液中で、ホモジェナイザーなどを用いて固体試料を十分に粉砕することが好ましい。
【００２８】
上記酸処理の後は、水酸化ナトリウムなどのアルカリや緩衝液を加え、後続の酵素反応などのために必要であれば、ｐＨを調整してもよい。
【００２９】
次いで、遠心分離や濾過などにより、不溶性の夾雑物を除去する。この際、水溶性であるビタミンＢ6は、上澄や濾液に溶解している。より一層正確な定量のために、残渣を水洗し、洗浄液を上澄などに混合してもよい。
【００３０】
さらに、本発明方法では各ビタミンＢ6を４−ピリドキソラクトンに変換して定量するが、４−ピリドキソラクトンの蛍光発色性は極めて高くｐｍｏｌレベルでも検出可能であるので、必要に応じて反応液を希釈してもよい。希釈率は、予備実験などで適宜決定すればよい。
【００３１】
得られた試料溶液は、後続する酵素反応のために、同様のものを最低７つ調製する。
【００３２】
（２） 工程１：ＰＬの定量工程
本工程では、下記式のとおり、試料にピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりピリドキサール（ＰＬ）を４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量することにより、ビタミンＢ6の一つであるＰＬを間接的に定量する。
【００３３】
【化１】
【００３４】
ＰＬＤＨはピリドキシンを唯一の炭素源として生育する微生物に存在し、ＰＬを不可逆的に酸化して４−ＰＡＬに変換する酵素である。ＰＬＤＨは、Ｐｓｃｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＡ−１株から単離したり、また、特許文献１のとおり、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉから対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。例えば、本発明者の研究グループによる、Arch Biochem Biophys, 452(1), pp.1-8（2006）に記載の方法により得ることができる。また、市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００３５】
ＰＬＤＨの反応至適ｐＨは８．７〜９．７程度であることから、緩衝液などを適量添加して反応溶液のｐＨを当該範囲に調整することが好ましい。
【００３６】
使用するＰＬＤＨの適量は、反応溶液中におけるＰＬの量に依存するので、予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＮＡＤ+を添加する。
【００３７】
ＰＬＤＨの至適反応温度は３０〜５５℃程度であることから、酵素反応時の反応溶液温度は当該範囲に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００３８】
十分に酵素反応を行った後、塩酸などを添加することにより酵素反応を停止させた上で、不溶成分などを遠心分離や濾過などにより除去する。次に、４−ＰＡＬを定量することによりＰＬを間接的に定量する。
【００３９】
４−ＰＡＬは３５５〜３６５ｎｍの波長で励起すると４２５〜４３５ｎｍ程度の波長の蛍光を強く発し、ｐｍｏｌレベルの量でも十分に検出可能である。よって、当該波長範囲の検出波長で反応溶液を高速液体クロマトグラフィなどで蛍光強度を測定する場合、蛍光性夾雑物などの悪影響は少ないといえる。
【００４０】
得られた蛍光強度から、検量線などにより４−ＰＡＬを定量し、ひいてはＰＬを定量する。因みに、本発明者による実験的知見によれば、４−ＰＡＬの蛍光強度と濃度は明確な比例関係にあるので、蛍光強度から４−ＰＡＬの濃度を正確に求めることが可能である。
【００４１】
（３） 工程２：ＰＭとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ）を作用させることによりピリドキサミン（ＰＭ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００４２】
【化２】
【００４３】
ＰＰＡＴは、ピリドキサミンまたはピリドキシンを単一炭素源として生育した微生物のみから見出されている酵素であり、ＰＭとＰＬの相互変換を触媒する。ＰＰＡＴは、Ｐｓｃｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＡ−１株から単離することができる。また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉから対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。例えば、本発明者の研究グループによる、Biochem J, 396(3), pp.499-507（2006）に記載の方法により得ることができる。市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００４４】
また、ＰＰＡＴとＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００４５】
ＰＰＡＴの至適反応ｐＨは９．５程度であることから、ＰＬＤＨの至適反応ｐＨも考慮し、緩衝液を適量添加することにより反応溶液のｐＨを９．０以上、１０．０以下程度に調整することが好ましい。
【００４６】
使用するＰＰＡＴの適量は反応溶液中におけるＰＭの量に依存し、ＰＬＤＨの適量はＰＭとＰＬの合計量に依存するので、両酵素の使用量は工程１の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のピルビン酸とＮＡＤ+を添加する。
【００４７】
ＰＰＡＴの至適反応温度は７０℃程度であることから、ＰＬＤＨの至適反応温度も考慮し、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＭとＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＰＰＡＴとＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００４８】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＭとＰＬの合計量を定量することができる。
【００４９】
（４） 工程３：ＰＮとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にピリドキシン ４−オキシダーゼ（ＰＮＯＸ）を作用させることによりピリドキシン（ＰＮ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００５０】
【化３】
【００５１】
ＰＮＯＸは、Ｐｓｃｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＡ−１株から単離したり、また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉから対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。例えば、本発明者の研究グループによる、FEMS Microbiol Lett, 234(2), pp.225-230（2004）に記載の方法により得ることができる。市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００５２】
ＰＮＯＸとＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００５３】
ＰＮＯＸの至適反応ｐＨは７．５〜８．０程度であることから、ＰＬＤＨの至適反応ｐＨも考慮し、緩衝液を適量添加することにより反応溶液のｐＨを８．０以上、９．５以下程度に調整することが好ましい。
【００５４】
使用するＰＮＯＸの適量は反応溶液中におけるＰＮの量に依存し、ＰＬＤＨの適量はＰＮとＰＬの合計量に依存するので、両酵素の使用量は工程１の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＦＡＤとＮＡＤ+を添加する。
【００５５】
ＰＮＯＸの至適反応温度は４０℃程度であることから、ＰＬＤＨの至適反応温度も考慮し、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＮとＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＰＮＯＸとＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００５６】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＮとＰＬの合計量を定量することができる。
【００５７】
（５） 工程４：ＰＭＰとＰＭとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を作用させることによりピリドキサミン ５’−リン酸（ＰＭＰ）をピリドキサミン（ＰＭ）に変換し、さらにピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ）を作用させることによりピリドキサミン（ＰＭ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００５８】
【化４】
【００５９】
ＡＬＰは、至適反応ｐＨがアルカリ側にあり、多くのリン酸モノエステル結合を加水分解できる特異性の広い酵素である。ＡＬＰは微生物から高等動物まで広く存在しているので、常法により単離精製することができるし、これら生物から対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。また、市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００６０】
また、ＡＬＰ、ＰＰＡＴおよびＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００６１】
ＡＬＰの至適反応ｐＨは９．０〜１０．５程度であることから、ＰＰＡＴおよびＰＬＤＨの至適反応ｐＨも考慮し、緩衝液を適量添加することにより反応溶液のｐＨを８．０以上、９．５以下程度に調整することが好ましい。また、ＡＬＰの活性維持のためにＭｇ2+を塩化マグネシウムなどの塩として添加することが好ましい。
【００６２】
使用するＡＬＰの適量は反応溶液中におけるＰＭＰ、ピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）およびピリドキシン ５’−リン酸（ＰＬＰ）の合計量とその他のリン酸エステル化合物の総量に依存し、ＰＰＡＴの適量はＰＭＰとＰＭの合計量に依存し、ＰＬＤＨの適量はこれらとＰＬの合計量に依存するので、これら酵素の使用量は工程１等の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＮＡＤ+を添加する。
【００６３】
ＡＬＰの至適反応温度は７０〜８０℃程度であることから、ＰＰＡＴおよびＰＬＤＨの至適反応温度も考慮し、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＭＰ、ＰＭおよびＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＡＬＰ、ＰＰＡＴおよびＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００６４】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＭＰ、ＰＭおよびＰＬの合計量を定量することができる。
【００６５】
（６） 工程５：ＰＬＰとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を作用させることによりピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００６６】
【化５】
【００６７】
ＡＬＰとＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００６８】
上記工程４と同様に、反応溶液のｐＨを８．０以上、９．５以下程度に調整することが好ましい。また、ＡＬＰの活性維持のためにＭｇ2+を塩化マグネシウムなどの塩として添加することが好ましい。
【００６９】
使用するＡＬＰの適量は反応溶液中におけるリン酸型ビタミンＢ6とその他のリン酸エステル型化合物の量に依存し、ＰＬＤＨの適量はＰＬＰとＰＬの合計量に依存するので、これら酵素の使用量は工程１の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＮＡＤ+を添加する。
【００７０】
上記工程４と同様に、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＬＰとＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＡＬＰとＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００７１】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＬＰとＰＬの合計量を定量することができる。
【００７２】
（７） 工程６：ＰＮＰとＰＮとＰＬとの合計量の測定工程
本工程では、下記式のとおり、試料にアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を作用させることによりピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）をピリドキシン（ＰＮ）に変換し、さらにピリドキシン ４−オキシダーゼ（ＰＮＯＸ）を作用させることによりピリドキシン（ＰＮ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００７３】
【化６】
【００７４】
ＡＬＰ、ＰＮＯＸおよびＰＬＤＨによる各反応は逐次的に行うこともできるが、反応溶液に両酵素を存在せしめて連続的に行うこともできる。効率を考慮すれば、各反応を連続的に行うことが好ましい。
【００７５】
上記工程４と同様に、反応溶液のｐＨを８．０以上、９．５以下程度に調整することが好ましい。また、ＡＬＰの活性維持のためにＭｇ2+を塩化マグネシウムなどの塩として添加することが好ましい。
【００７６】
使用するＡＬＰの適量は反応溶液中におけるリン酸型ビタミンＢ6とその他のリン酸エステル型化合物の量に依存し、ＰＮＯＸの適量はＰＮＰとＰＮの合計量に依存し、ＰＬＤＨの適量はこれらとＰＬの合計量に依存するので、これら酵素の使用量は工程１等の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＦＡＤとＮＡＤ+を添加する。
【００７７】
上記工程４と同様に、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＮＰ、ＰＮおよびＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のＡＬＰ、ＰＮＯＸおよびＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００７８】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＮＰ、ＰＮおよびＰＬの合計量を定量することができる。
【００７９】
（８） 各ビタミンＢ6の量の算出工程
上記工程１により、試料中におけるピリドキサール（ＰＬ）の量を求めることができる。また、上記工程２によりピリドキサミン（ＰＭ）とＰＬとの合計量が、上記工程３によりピリドキシン（ＰＮ）とＰＬとの合計量が、上記工程４によりピリドキサミン ５’−リン酸（ＰＭＰ）とＰＭとＰＬとの合計量が、上記工程５によりピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）とＰＬとの合計量が、上記工程６によりピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）とＰＮとＰＬとの合計量が求められる。
【００８０】
従って、上記工程２の定量値から上記工程１の定量値を減ずることにより、ピリドキサミン（ＰＭ）の定量値を求めることができ；
上記工程３の定量値から上記工程１の定量値を減ずることにより、ピリドキシン（ＰＮ）の定量値を求めることができ；
上記工程４の定量値から上記工程２の定量値を減ずることにより、ピリドキサミン ５’−リン酸（ＰＭＰ）の定量値を求めることができ；
上記工程５の定量値から上記工程１の定量値を減ずることにより、ピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）の定量値を求めることができ；
上記工程６の定量値から上記工程３の定量値を減ずることにより、ピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）の定量値を求めることができる。
【００８１】
（９） ＰＮＧの定量工程
ピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）はピリドキシンにグルコースがβ結合した構造を有し、ビタミンＢ6と構造的に類似するものの、ヒト体内でビタミンＢ6と栄養学的に同じように働くか否か不明な点があり、ビタミンＢ6には分類されていない。しかしＰＮＧは植物細胞中に含まれており、ヒト体内でそのまま吸収されてから代謝されてビタミンＢ6と同様の作用を示したり、或いはピリドキシンに変換されて吸収されるという報告もあるので、ＰＮＧも定量することが好ましい。
【００８２】
ＰＮＧを定量するには、先ず下記式のとおり、試料にβ−グルコシダーゼを作用させることによりピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）をピリドキシン（ＰＮ）に変換し、さらにピリドキシン ４−オキシダーゼ（ＰＮＯＸ）を作用させることによりピリドキシン（ＰＮ）をピリドキサール（ＰＬ）に変換し、さらにピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）を作用させることによりＰＬを４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）に変換し、生じた４−ＰＡＬを定量する。
【００８３】
【化７】
【００８４】
β−グルコシダーゼは、その至適ｐＨが酸性側にあり、多くのβ−１，４−グリコシド結合を加水分解できる特異性の広い酵素である。β−グルコシダーゼは微生物から高等生物まで広く存在しているので、常法により単離精製することができるし、これら生物から対応遺伝子を取得し、遺伝子組み換え法により得てもよい。また、市販のものがあれば、市販品を使用してもよい。
【００８５】
β−グルコシダーゼの反応は酸性条件下で行い、反応後、反応溶液のｐＨをアルカリ性にしてからＰＮＯＸとＰＬＤＨを添加し、ＰＮをＰＬへ連続的に変換する。
【００８６】
β−グルコシダーゼの至適反応ｐＨは５．０程度であることから、β−グルコシダーゼによる反応段階では、緩衝液を適量添加することにより反応溶液のｐＨを４．０以上、５．５以下程度に調整することが好ましい。また、ＰＮＯＸとＰＬＤＨによる反応段階では、上記工程３と同様にｐＨを８．０以上、９．５以下程度にすることが好ましい。
【００８７】
使用するβ−グルコシダーゼの適量は反応溶液中におけるＰＮＧとその他のβ−グリコシド化合物の量に依存し、ＰＮＯＸの適量はＰＮＧおよびピリドキシンの合計量に依存し、ＰＬＤＨの適量はこれらとＰＬの合計量に依存するので、これら酵素の使用量は工程１等の結果や予備実験などにより決定すればよい。また、反応溶液中には、十分量のＮＡＤ+とＦＡＤを添加する。
【００８８】
β−グルコシダーゼの至適反応温度は３０〜４０℃程度であることから、ＰＮＯＸおよびＰＬＤＨの至適反応温度も考慮し、反応溶液の温度を３０℃以上、５５℃以下程度に調整することが好ましい。また、反応時間は、反応溶液に含まれるＰＮＧ、ＰＮおよびＰＬが十分に４−ＰＡＬへ変換されるように適宜調整すればよいが、本発明者による実験的知見によれば、適量のβ−グルコシダーゼ、ＰＮＯＸおよびＰＬＤＨを用いる限り４５分間以上、２時間程度反応させれば十分である。
【００８９】
反応終了後は、上記工程１と同様にして４−ＰＡＬを定量することにより、間接的にＰＮＧ、ＰＮおよびＰＬの合計量を定量することができる。
【００９０】
よって、当該工程の定量値から、上記工程３の定量値を減ずることにより、ピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）の定量値を求めることができる。
【００９１】
上記工程１〜７の番号は便宜上付したものであり、上記工程１〜７を実施する順番は任意である。また、各ビタミンＢ6およびピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）の定量値を算出する各工程の実施順序も任意である。
【００９２】
以上のとおり試料を処理することにより、試料中に含まれる各ビタミンＢ6、および任意にピリドキシン−β−グルコシドを、簡便かつ正確に分別定量することが可能である。
【００９３】
また、上記の説明に従えば、本発明方法は、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ）、ピリドキシン ４−オキシダーゼ（ＰＮＯＸ）、およびアルカリホスファターゼを含む、本発明に係るビタミンＢ6分別定量用キットにより実施することが可能である。
【００９４】
より詳しくは、本発明のビタミンＢ6分別定量用キットは、本発明方法の各反応を実施するために、下記の組合わせがセットになっているものが好ましい。
・ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＰＰＡＴ、ピルビン酸、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＰＮＯＸ、ＦＡＤ、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＡＬＰ、マグネシウム塩、ＰＰＡＴ、ピルビン酸、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＡＬＰ、マグネシウム塩、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
・ＡＬＰ、マグネシウム塩、ＰＮＯＸ、ＦＡＤ、ＰＬＤＨ、ＮＡＤ+
【００９５】
さらに、各酵素反応のための緩衝液、反応を停止し且つ試料から夾雑物を除去するための塩酸、試料から夾雑物を除去するためのトリクロロ酢酸や、β−グルコシダーゼを含むビタミンＢ6分別定量用キットももちろん好適である。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００９７】
実施例１ ヒト尿における各ビタミンＢ6の分別定量
（１） ヒト尿の前処理
２１〜２２歳の成人男性５名から採取した尿（５ｍＬ）に、５０ｗ／ｖ％のトリクロロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、１００℃で５分間加熱処理した。次いで、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【００９８】
（２） ピリドキサール（ＰＬ）の定量
Arch Biochem Biophys, 452(1), pp.1-8（2006）に記載の遺伝子組み換え方法により、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを得た。次いで、上記実施例１（１）で得られた上澄液（５μＬ）に、当該ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（１ｍＵ）、２５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ９．０，０．０４ｍＬ）、１００ｍＭ ＮＡＤ+水溶液（２μＬ）および精製水（０．３３２ｍＬ）を加え、３０℃で１時間反応させた。
【００９９】
反応液に０．５５Ｎ塩酸（２０μＬ）を加えて反応を停止した後に、濾過した。濾液（１００μＬ）を下記条件の高速液体クロマトグラフィで分析し、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
カラム： ナラカイテスク社製，Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ，４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
溶離液： リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／メタノール＝９０／１０（ｖ／ｖ）の混合液
流速： ０．５ｍＬ／分
検出波長： 励起波長−３６０ｎｍ，測定波長４３０ｎｍ
【０１００】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により４−ピリドキソラクトン（４−ＰＡＬ）、ひいてはピリドキサール（ＰＬ）の尿中濃度を算出した。
【０１０１】
（３） ピリドキサミン（ＰＭ）の定量
Biochem J, 396(3), pp.499-507（2006）に記載の遺伝子組み換え方法により、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼを得た。次いで、上記実施例１（２）において、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼに加えて当該ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（１ｍＵ）と１００ｍＭピルビン酸水溶液（８μＬ）を用いた以外は同様にして酵素反応を行い、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１０２】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線によりＰＬとピリドキサミン（ＰＭ）の合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（２）の結果と合わせてＰＭの尿中濃度を求めた。
【０１０３】
（４） ピリドキシン（ＰＮ）の定量
FEMS Microbiol Lett, 234(2), pp.225-230（2004）に記載の遺伝子組み換え方法により、ピリドキシン ４−オキシダーゼを得た。次いで、上記実施例１（２）において、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼに加えて当該ピリドキシン ４−オキシダーゼ（１ｍＵ）と１ｍＭ ＦＡＤ水溶液（１μＬ）を用いた以外は同様にして酵素反応を行い、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１０４】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により、ＰＬとピリドキシン（ＰＮ）の合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（２）の結果と合わせてＰＮの尿中濃度を求めた。
【０１０５】
（５） ピリドキサミン ５’−リン酸（ＰＭＰ）の定量
上記実施例１（１）で得られた上澄液（５μＬ）に、２５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ９．０，０．０４ｍＬ）、アルカリホスファターゼ（１０ｍＵ，シグマ社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（４０μＬ）および精製水（０．３３２ｍＬ）を加え、３０℃で２時間反応させた。次いで、反応溶液にピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（１ｍＵ）、１００ｍＭ ＮＡＤ+水溶液（２μＬ）、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（１ｍＵ）および１００ｍＭピルビン酸水溶液（８μＬ）を加え、３０℃で１時間反応させた。
【０１０６】
反応液に０．５５Ｎ塩酸（２０μＬ）を加えて反応を停止した後に、濾過した。濾液（１００μＬ）を上記実施例１（２）の条件の高速液体クロマトグラフィで分析し、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１０７】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により、ＰＭＰとＰＭとＰＬの合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（３）の結果と合わせてＰＭＰの尿中濃度を求めた。
【０１０８】
（６） ピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）の定量
上記実施例１（２）において、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼに加えてアルカリホスファターゼ（１０ｍＵ，シグマ社製）と５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（４０μＬ）を用いた以外は同様にして酵素反応を行い、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１０９】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により、ＰＬとピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）の合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（２）の結果と合わせてＰＬＰの尿中濃度を求めた。
【０１１０】
（７） ピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）の定量
上記実施例１（５）において、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ（１ｍＵ）および１００ｍＭピルビン酸水溶液（８μＬ）の代わりにピリドキシン ４−オキシダーゼ（１ｍＵ）および１ｍＭ ＦＡＤ水溶液（１μＬ）を用いた以外は同様にして酵素反応を行い、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定した。
【０１１１】
得られた蛍光強度の測定値と、標準試料から事前に作成した検量線により、ＰＮＰとＰＭとＰＬの合計の尿中濃度を算出し、上記実施例１（３）の結果と合わせてＰＮＰの尿中濃度を求めた。
【０１１２】
（８） ４−ピリドキシン酸（４−ＰＡ）の定量
ビタミンＢ6の代謝物である４−ピリドキシン酸の尿中濃度を下記のとおり求めた。即ち、尿（１０μＬ）に精製水（９０μＬ）と５Ｎ塩酸（０．２ｍＬ）を添加し、２０分間煮沸した。冷却後、反応混合液を４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上澄（１０μＬ）に、上記実施例１（２）の溶離液（９０μＬ）を添加した後、上記実施例１（２）に示す条件の高速液体クロマトグラフィで分析し、４−ピリドキシン酸の尿中濃度を求めた。
【０１１３】
以上の結果を表１に示す。なお、表１中の数値の単位はｎｍｏｌ／ｍＬである。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】
また、尿の濃度を補正するため、尿中クレアチニン含有量（ｇ）当たりのピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）および４−ピリドキシン酸（４−ＰＡ）の含有量（μｍｏｌ）を表２に示す。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
上記結果のとおり、ヒト尿中には一定量のピリドキサール（ＰＬ）とピリドキサミン（ＰＭ）が含まれていることが明らかとなった。また、ピリドキサールの含有量は各人であまり大きく変動しないが、ピリドキサミンの含有量には個人間で大きな差が認められた。このように本発明方法によれば、ｎｍｏｌ／ｍＬという極めて低濃度のレベルでのビタミンＢ6含有量の定量が可能であることが実証された。
【０１１８】
（９） 測定感度
測定試料に含まれる各ビタミンＢ6等が精度良く検出できているか、内部標準法により確認した。具体的には、上記（１）で得られた上澄液（５μＬ）に内部標準として各ビタミンＢ6等（２ｐｍｏｌ）を加え、上記（２）〜（８）と同様にして各ビタミンＢ6等を定量した。内部標準を加えた場合と加えない場合の値から、下記式により測定感度を求めた。
測定感度（％）＝（［｛内部標準を加えた場合の定量値（ｎｍｏｌ／ｍＬ）｝−｛内部標準を加えない場合の定量値（ｎｍｏｌ／ｍＬ）｝］／［内部標準の量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）］）×１００
【０１１９】
その結果、本発明方法による測定感度は７６〜１３４％であった。このように本発明方法は、試料に微量含まれる各ビタミンＢ6を約±３０％の誤差で検出可能であり、従来方法よりも正確であることが明らかとなった。
【０１２０】
実施例２ トリささ身における各ビタミンＢ6の分別定量
（１） 各ビタミンＢ6の定量
生のトリささ身（１．０ｇ）に０．１Ｎ塩酸（５．０ｍＬ）を加え、ホモジェナイザー（セントラル科学貿易製、製品名:ポリトロン）で５分間ホモジェナイズした後、１００℃で３０分間加熱処理した。当該混合液を氷中で冷却した後、５０ｗ／ｖ％のトリクロロ酢酸（０．１ｍＬ）を加え、さらに１００℃で５分間加熱処理した。当該混合液を氷中で冷却した後、０．５Ｍトリス酢酸（ｐＨ７．５，０．５ｍＬ）を加えてよく混合し、さらに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５７０μＬ）を添加してｐＨを７．５とし、また、総液量を５ｍＬとした。当該混合液を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上澄を精製水で１０倍に希釈し、当該希釈液を試料として、上記実施例１（２）〜（７）と同様に各ビタミンＢ6を分別定量した。
【０１２１】
（２） ピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）の定量
ピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）の定量のため、上記希釈液（５０μＬ）に、５００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０，４０μＬ）、β−グルコシダーゼ（５０ｍＵ，シグマ社製）、１００ｍＭリン酸第二水素ナトリウム水溶液（２０μＬ）および精製水（０．０７ｍＬ）を加え、３０℃で２時間反応させた。次いで、反応溶液を中和するため、１００ｍＭ水酸化ナトリウム（８０μＬ）と５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０，８μＬ）を添加した後、ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ（１ｍＵ）、１００ｍＭ ＮＡＤ+水溶液（２μＬ）、ピリドキシン ４−オキシダーゼ（１ｍＵ，第一ファインケミカル社製），１ｍＭ ＦＡＤ（１μＬ）および精製水（８３μＬ）を加え、３０℃で１時間反応させた。
【０１２２】
反応液に０．５５Ｎ塩酸（２０μＬ）を加えて反応を停止した後に、濾過した。濾液（１００μＬ）を上記実施例１（２）に示す条件の高速液体クロマトグラフィで分析し、４−ピリドキソラクトンの蛍光強度を測定し、トリささ身に含まれるＰＮＧの含有量を求めた。
【０１２３】
以上の結果を表３に示す。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
上記結果のとおり、トリささ身中にはピリドキサール（ＰＬ）が最も多く含まれ、次いでピリドキサール ５’−リン酸（ＰＬＰ）が多く含まれている一方で、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキシン ５’−リン酸（ＰＮＰ）およびピリドキシン−β−グルコシド（ＰＮＧ）はほとんど含まれていなかった。また、測定されたビタミンＢ6総量は、従来方法である微生物定量法が用いられている食品成分表の値（６００μｇ／１００ｇ）よりもかなり多い。その理由としては、微生物定量法ではリン酸型ビタミンＢ6を塩酸により加水分解するので、その際に含有ビタミンＢ6の一部が分解されているのに対して、本発明方法によれば含有ビタミンＢ6が分解されることなく定量可能であることが考えられる。
【０１２６】
このように本発明方法によれば、ｎｍｏｌ／ｇという極めて低濃度のレベルでのビタミンＢ6含有量の定量が可能であることが証明された。また、上記結果によっても、本発明方法は試料に含まれる各ビタミンＢ6を約±３０％の誤差で検出可能であり、従来方法よりも正確であることが実証された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＢ6を個別に定量するための方法であって、
試料にピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量することにより、ピリドキサールを定量する工程１；
試料にピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程２；
試料にピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程３；
試料にアルカリホスファターゼ、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程４；
試料にアルカリホスファターゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程５；
試料にアルカリホスファターゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程６；
工程２の定量値から工程１の定量値を減じ、ピリドキサミンを定量する工程；
工程３の定量値から工程１の定量値を減じ、ピリドキシンを定量する工程；
工程４の定量値から工程２の定量値を減じ、ピリドキサミン ５’−リン酸を定量する工程；
工程５の定量値から工程１の定量値を減じ、ピリドキサール ５’−リン酸を定量する工程；
工程６の定量値から工程３の定量値を減じ、ピリドキシン ５’−リン酸を定量する工程；
を含むことを特徴とするビタミンＢ6の分別定量方法。
【請求項２】
酵素反応前に試料をトリクロロ酢酸で処理する請求項１に記載のビタミンＢ6の分別定量方法。
【請求項３】
さらに、試料にβ−グルコシダーゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程７；並びに
工程７の定量値から工程１および工程３の定量値を減じ、ピリドキシン−β−グルコシドを定量する工程；
を含む請求項１または２に記載のビタミンＢ6の分別定量方法。
【請求項４】
ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含むことを特徴とするビタミンＢ6分別定量用キット。
【請求項５】
さらにトリクロロ酢酸を含む請求項４に記載のビタミンＢ6分別定量用キット。
【請求項６】
さらにβ−グルコシダーゼを含む請求項４または５に記載のビタミンＢ6分別定量用キット。
【請求項１】
ビタミンＢ6を個別に定量するための方法であって、
試料にピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量することにより、ピリドキサールを定量する工程１；
試料にピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程２；
試料にピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程３；
試料にアルカリホスファターゼ、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程４；
試料にアルカリホスファターゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程５；
試料にアルカリホスファターゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程６；
工程２の定量値から工程１の定量値を減じ、ピリドキサミンを定量する工程；
工程３の定量値から工程１の定量値を減じ、ピリドキシンを定量する工程；
工程４の定量値から工程２の定量値を減じ、ピリドキサミン ５’−リン酸を定量する工程；
工程５の定量値から工程１の定量値を減じ、ピリドキサール ５’−リン酸を定量する工程；
工程６の定量値から工程３の定量値を減じ、ピリドキシン ５’−リン酸を定量する工程；
を含むことを特徴とするビタミンＢ6の分別定量方法。
【請求項２】
酵素反応前に試料をトリクロロ酢酸で処理する請求項１に記載のビタミンＢ6の分別定量方法。
【請求項３】
さらに、試料にβ−グルコシダーゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼを作用させ、生じた４−ピリドキソラクトンを定量する工程７；並びに
工程７の定量値から工程１および工程３の定量値を減じ、ピリドキシン−β−グルコシドを定量する工程；
を含む請求項１または２に記載のビタミンＢ6の分別定量方法。
【請求項４】
ピリドキサール ４−デヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン−ピルビン酸 アミノトランスフェラーゼ、ピリドキシン ４−オキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含むことを特徴とするビタミンＢ6分別定量用キット。
【請求項５】
さらにトリクロロ酢酸を含む請求項４に記載のビタミンＢ6分別定量用キット。
【請求項６】
さらにβ−グルコシダーゼを含む請求項４または５に記載のビタミンＢ6分別定量用キット。
【公開番号】特開２０１１−７８３５７（Ｐ２０１１−７８３５７Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３３６３１（Ｐ２００９−２３３６３１）
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００９年４月２５日に日本ビタミン学会発行の「ビタミン 第８３巻 第４号（日本ビタミン学会第６１回大会 プログラム・講演要旨）」において発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度及び平成２０年度、独立行政法人科学技術振興機構、地域イノベーション創出総合支援事業シーズ発掘試験、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００９年４月２５日に日本ビタミン学会発行の「ビタミン 第８３巻 第４号（日本ビタミン学会第６１回大会 プログラム・講演要旨）」において発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度及び平成２０年度、独立行政法人科学技術振興機構、地域イノベーション創出総合支援事業シーズ発掘試験、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]