フィブリン層を備えた要素、それらの作製および使用
【課題】フィブリンをベースにした層を備えた要素に関し、支持体細孔の均質性または均一性が欠けているとある場合には、細胞の付着に影響を与える欠点の解決。
【解決手段】フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層を備えた要素であって、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）疎水性または実質的に疎水性の支持体であって、厚さ０．１〜５ｍｍの多孔性部分を有し、該細孔は、その厚さを横切って伸長していて、５〜１００μｍの結節間隔を有し、該多孔性部分の１面は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質をベースにした化合物で処理されている；（ｂ）該支持体の該処理面を覆っているフィブリンベース層であって、該処理面上において実質的に均一かつ均質であり、該フィブリン層と、該支持体のうち少なくとも該フィブリン層と接触している面とは、実質的にフィブリンノーゲンを含まない要素。
【解決手段】フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層を備えた要素であって、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）疎水性または実質的に疎水性の支持体であって、厚さ０．１〜５ｍｍの多孔性部分を有し、該細孔は、その厚さを横切って伸長していて、５〜１００μｍの結節間隔を有し、該多孔性部分の１面は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質をベースにした化合物で処理されている；（ｂ）該支持体の該処理面を覆っているフィブリンベース層であって、該処理面上において実質的に均一かつ均質であり、該フィブリン層と、該支持体のうち少なくとも該フィブリン層と接触している面とは、実質的にフィブリンノーゲンを含まない要素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリンをベースにした層を備えた要素に関し、該要素は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）疎水性または実質的に疎水性の支持体であって、該支持体は、厚さ０．１〜５ｍｍの多孔性部分を有し、該細孔は、その厚さを横切って伸長していて、５〜１００μｍの結節間隔を有し、該多孔性部分の１面は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンをベースにした化合物で処理されている；および（ｂ）該支持体の該処理面を覆っているフィブリンをベースにした層。
【背景技術】
【０００２】
このような要素は、特許文献１および特許文献２から公知である。 これらの公知要素は、単に、フィブリノーゲンおよびトロンビンを含有する溶液に支持体を浸けることにより、またはこのような溶液を多孔性支持体に通して押すことにより、作製される。これらの公知要素は、簡単な浸漬により作製するとき、実質的に小型のフィブリン層を有し、その支持体細孔内には殆どまたは全くフィブリンを有しないか、またはフィブリンが直径の大きい細孔を簡単に通るので、直径の大きい細孔内にはフィブリンを有し直径の小さい細孔内にはフィブリンを有しない。このように、フィブリンが直径の大きい細孔を簡単に通ることから、均質性および／または均一性が欠けることになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９６／０７４４４号
【特許文献２】米国特許第５２９８２５５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの支持体細孔において、フィブリンの存在に関して、このように均質性または均一性が欠けていると、ある場合には、細胞の付着に影響を与えることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、これらの欠点をなくすことを目的としており、本明細書の第一段落で記述したような要素に関し、該要素は、該フィブリンベース層が該処理面において実質的に均一かつ均質であることにより、特徴付けられる。本発明によるフィブリン層は、フィブリノーゲンがなく、このフィブリン層と結合していないことにより、特徴付けられる。このフィブリン層上にフィブリノーゲンがないことは、その電気泳動図でγバンドがないことにより、検出され得る。このフィブリン層でのフィブリノーゲンの欠如は、フィブリン層を形成するように反応していないいずれのフィブリノーゲンも、この多孔性支持体を通って吸引されるという事実により、起こる。それゆえ、本発明による要素は、このフィブリン層と支持体との接触面において、実質的に、好ましくは、反応していないフィブリノーゲンが存在していないということにより、特徴付けられる。例えば、本発明による要素のフィブリン層は、フィブリンネットワークを形成するように反応していないフィブリノーゲンを、２重量％未満、好ましくは、１重量％未満、特に、０．５重量％未満、さらに特定すると、０．１重量％未満で含有する。
【０００６】
有利には、このフィブリン層、および少なくとも、１０μｍの厚さを横切って伸長している支持体層は、このフィブリン層の重量に対して、１重量％未満、有利には、０．５重量％未満、好ましくは、０．１重量％未満の未反応フィブリノーゲンを含有する。好ましくは、フィブリンは、この支持体の処理多孔性部分の厚さを横切って、該処理面から少なくとも２μｍの深さまで伸長しており、両方とも、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔および２０μｍより大きい平均直径を有する細孔を通る。
【０００７】
特定の実施形態に従って、この支持体の多孔性部分は、この処理面の全面にわたって、実質的に均質かつ均一な多孔度を有し、一部のフィブリンは、この支持体の多孔性部分の厚さを横切って、少なくとも１０μｍの深さまで、均質かつ均一に伸長している。可能な実施形態によれば、この多孔性支持体は、このフィブリン層と接触している面から１０μｍより離れた層で、特に、２０μｍの深さまで、フィブリノーゲンを含有する。
【０００８】
このフィブリンネットワークが既に形成されたとき、乾燥したフィブリン層を再浸漬する際に、このネットワークで新たなフィブリン結合（このような結合は、このネットワークの胞（ａｌｖｅｏｌｉ）または一部の胞のサイズを小さくする）が形成されるのを防止するために、好ましくは、（未だに反応していない）遊離のフィブリノーゲンが存在しないようにしなければならない。
【０００９】
本発明の１実施形態によれば、このネットワークに付着したフィブリンの一部は、この支持体の処理多孔性部分の厚さを横切って、該処理面から少なくとも２μｍの深さまで伸長しており、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔および２０μｍより大きい平均直径を有する細孔を通る。この支持体は、任意の疎水性または実質的に疎水性の物質から製造され得るものの、それは、特に、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレートまたはポリテトラフルオロエチレンから製造され、該物質は、有利には、特に二軸方向に延伸されている。
【００１０】
疎水性または実質的に疎水性の物質との用語は、本明細書中にて、３０〜５０°のバイアスを有する物質を同定するのに使用され、このバイアスは、ＡＳＴＭ
Ｄ ２５７８−８４法で測定される。
【００１１】
有利には、この支持体の多孔性部分は、この処理面の全面にわたって、実質的に均質かつ均一な多孔度を有し、すなわち、表面単位による細孔の分布または数は、この多孔性部分に対して、実質的に均一である。例えば、ある多孔性部分では、この多孔性部分１ｃｍ2の面積における１０μｍよりも大きい直径を有する細孔は、多孔性部分の各ｃｍ2に対して、１０μｍよりも大きい直径を有する細孔の平均体積の０．８〜１．２倍、好ましくは、０．９〜１．１倍で変わる。
【００１２】
１実施形態によれば、このフィブリン層のうち、少なくとも、この多孔性支持体と接触している面とは反対の面は、安定化されている。特に、該フィブリンベース層は、少なくとも部分的に架橋されて、その間で開口部を有する隣接胞のネットワークを形成する。この層は、有利には、水溶性でない程度に充分に架橋されている。有利な１実施形態の詳細によれば、該層は、細胞および／またはタンパク質、特に、細胞−フィブリン結合を媒介するタンパク質（フィブロネクチンなど）を備えている。
【００１３】
このフィブリン層の厚さは、水和または再水和したとき、好ましい１実施形態の特徴によれば、１００μｍより大きく、１５０μｍより大きくさえあり得るが、この支持体の多孔性部分を覆う架橋フィブリンベース層（水和した状態または水和後の状態）は、０．５〜１００μｍ厚、有利には、２．５〜５０μｍ厚、好ましくは、５〜２０μｍ厚であり、架橋したフィブリンベース分子または結合間には、胞が形成されており、該胞は、５〜２５μｍ3の体積を有し、該房（ｃｈａｍｂｅｒ）の平均厚さまたは高さは、１〜５μｍ、特に、１〜３μｍである。
【００１４】
特定の１実施形態の詳細によれば、該フィブリン層で覆われた支持体部分の細孔は、水溶性または実質的に水溶性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われた内面を有する。例えば、該フィブリン層で覆われた支持体部分の細孔は、フィブリノーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、バイブロネクチン（ｖｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）またはそれらの混合物により、覆われている。特に、この処理面とは反対の支持体面は、水溶性または実質的に水溶性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われている。このような被覆は、この支持体のうち処理面と反対の面と接触している組織の癒着を向上させるのに、有利である。
【００１５】
有利な特徴によれば、少なくとも、この支持体の多孔性部分は、少なくとも部分的に、水溶性または水混和性の極性添加剤で覆われている。このような添加剤は、好ましくは、タンパク質に対して非変性で生体適合性の構造である。このような添加剤には、グリセロール、糖（スクロース、マンニトール、ソルビトールなど）が挙げられ得る。このような添加剤は、特に、水に溶解性であるかまたは少なくとも混和性であり、特に、大気圧での水の凍結温度と比較して、凍結温度を下げることができる水溶性または水混和性添加剤から選択される。
【００１６】
好ましい実施形態によれば、この要素は、乾燥しており、例えば、０．５重量％未満、または、さらに０．１重量％未満の水分を有する。
【００１７】
有利な実施形態によれば、このフィブリン層は、フィブロネクチンの存在下にて、架橋される。このフィブリン層中の架橋フィブロネクチン含量は、有利には、この架橋層中のフィブリンおよびフィブロネクチンの重量の０．５〜１５％、好ましくは、１〜１０％である。この含量は、この層中のフィブリンおよびフィブロネクチン結合の重量と比較した、この層中のフィブロネクチン結合の重量に対応している。
【００１８】
有利な実施形態の詳細によれば、このフィブリン層は、カルシウム、特に、カルシウムおよび塩素、さらに正確には、塩化カルシウムを含有する。このフィブリン層のカルシウム含量は、フィブリン層の体積単位（ｃｍ3）あたりのカルシウムのμｇで表わされるが、有利には、１〜１００μｇ／ｃｍ3、好ましくは、５〜９０μｇ／ｃｍ3、特に、１０〜５０μｇ／ｃｍ3である。このフィブリン層中の塩素含量は、有利には、１．５〜２００μｇ／ｃｍ3、好ましくは、８〜１７０μｇ／ｃｍ3、特に、１６〜１００μｇ／ｃｍ3である。カルシウムが塩化カルシウムの形態のとき、このフィブリン層中の塩化カルシウムの含量（これは、フィブリン層の体積単位（ｃｍ3）あたりの塩化カルシウムのμｇで表わされる）は、有利には、２．５〜３００μｇ／ｃｍ3、好ましくは、１３〜２６０μｇ／ｃｍ3、特に、２６〜１５０μｇ／ｃｍ3である。
【００１９】
有利には、このフィブリン層は、実質的に、塩化カルシウム以外のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を含有しない。
【００２０】
好ましくは、塩化カルシウムとは異なるアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の含量は、このフィブリン層中の塩化カルシウムの含量の少なくとも１０分の１、好ましくは、２０分の１、特に、５０分の１である。
【００２１】
この支持体は、それが何であれ、多孔性支持体であり得るものの、この要素支持体は、好ましくは、生体適合性および／または生体分解性支持体である。
【００２２】
本発明に従った要素の１実施形態の特定の詳細によれば、この要素は、２層以上の重なり合ったフィブリン層を有する。有利には、これらの層は、異なる平均体積を備えた胞を有する。特に、この多孔性支持体と接触してこのフィブリン層を覆っているフィブリン層は、多孔性支持体と接触したフィブリン層の胞の平均体積と比較して、小さい平均体積を備えた胞を有する。例えば、この支持体と接触してフィブリン層を覆っているフィブリン層中の胞の平均体積は、この支持体と接触したフィブリン層中の胞の平均体積の０．５倍未満である。１実施形態によれば、この支持体と接触してこのフィブリン層を覆っているフィブリン層は、部分的に、この支持体と接触して該フィブリン層を貫通する。大きい胞を備えたフィブリン層での小さい胞を備えたフィブリン層の貫通は、有利には、小さい胞を備えたフィブリン層が、大きい胞を備えたフィブリン層の厚さの少なくとも５０％で貫通するように、しかし、好ましくは、その全厚未満で貫通するようにされる。
【００２３】
本発明の要素の層のフィブリンは、その多孔性基板中に存在するフィブリンと同様に、実質的に変性しておらず、好ましくは、全く変性していない。
【００２４】
本発明はまた、本発明に従って要素を作製する方法に関する。
【００２５】
この方法は、以下を提供する：
多孔性支持体の第一面の少なくとも多孔質部分は、フィブリンまたはフィブリノーゲンを含有する水溶液か、またはフィブリノーゲン含有化合物の１種以上のフィブリンベースと接触され、
この支持体の多孔性部分のうち該第一面と反対の面は、均質かつ均一に、該多孔性部分を少なくとも部分的に通って溶液を吸引する吸引力を受け、それにより、この多孔性部分に対して均質かつ均一に、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層を確実に堆積し、そして多孔性支持体の多孔性部分を通って、少なくとも、この溶液の水を確実に拡散するだけでなく、多孔性支持体を通って、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を確実に貫通させる。このような吸引により、特に、もし、このフィブリン層を水または水溶液で洗浄したなら、実質的にフィブリノーゲンを含まないフィブリン層が得られる。有利には、この多孔性物質を通るこの溶液の吸引は、少なくとも、フィブリンの架橋中において、好ましくは、少なくとも、このフィブリノーゲン含有物質の反応中およびフィブリンの架橋中において、行われる。この多孔性物質中に存在しているフィブリンは、従って、有利には、この多孔性物質の該第一面を覆っているフィブリン層と架橋される。
【００２６】
本発明による方法は、先に記述したように、それと適合する要素を提供する。
【００２７】
吸引によって、そのネットワークに付着されたフィブリンは、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔および２０μｍより大きい平均直径を有する細孔の両方において、少なくとも２μｍの深さまで、この多孔性支持体を貫通するように、配列されている。
【００２８】
有利には、この支持体のうち該第一面と反対の面は、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、その多孔性部分の２面間において、少なくとも０．３×１０5Ｐａの圧力差が生じる。好ましくは、この支持体のうち該第一面と反対の面は、０．５×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、その多孔性部分の２面間において、０．４×１０5Ｐａ以下の圧力差が生じる。好ましい実施形態によれば、この支持体の多孔性部分の厚さを横切ってフィブリンまたはフィブリノーゲンを効率的に通過させつつ、第一面と反対の支持体面は、断続的に、０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第一圧力を受け、第一圧力は、第二圧力よりも少なくとも５％高い。該第一面と反対の面において正圧または負圧を変える代わりに、該第一面に加える圧力を僅かに変えることも可能である。
【００２９】
有利には、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、そして０〜１００℃の温度、好ましくは、１５〜６０℃の温度、特に、２５〜４０℃の温度に晒される。
【００３０】
本発明による方法の変形に従って、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、逆浸透を生じるように選択された溶液を受け、これによって少なくともこの溶液の水は、この支持体の多孔性部分を通って、この第一面と接触して、拡散される。このような拡散は、それにより、この多孔性支持体の厚さを少なくとも部分的に通るフィブリンまたはフィブリノーゲンの実質的に均一かつ規則的な通過を保証する。
【００３１】
本発明の方法を実施するために、５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液、特に、５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質および１ｍｌあたり０．０１〜１０単位のトロンビンを含有する溶液、好ましくは、５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、ＸＩＩＩ因子、および１ｍｌあたり０．０１〜２単位、好ましくは０．０５〜１単位のトロンビンを含有する溶液が使用される。有利な実施形態によれば、この溶液は、１ｍｌあたり０．５単位未満のトロンビンを含有する。
【００３２】
１ｍｌあたり０．１〜１０単位のＸＩＩＩ因子を含有する溶液を使っても、有利であることが認められている。フィブリン溶解を少なくするかまたは遅らすために、１〜４０ミリモルのＣａＣｌ2／ｍｌ、特に１〜２０ミリモルのＣａＣｌ2／ｍｌを含有する溶液からも、有利な結果が得られている。それゆえ、例えば、２０ミリモルのＣａＣｌ2／ｍｌを使って調製したフィブリン層に対しては、このフィブリン層を調製した１週間後、フィブリノーゲンは、視覚的に検出されなかった。
【００３３】
このフィブリンネットワークの形成で使用される少量のトロンビンは、この多孔性支持体を貫通できる多量のフィブリノーゲンに対応していることが認められる。これにもかかわらず、本発明による方法は、特に、この支持体のうちこのフィブリン層と接触している面において、実質的にフィブリノーゲンを含まないフィブリン層を提供する。
【００３４】
本発明による方法の特徴に従って、第一工程中において、多孔性支持体の第一面の少なくとも一部は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液と接触して配置され、この間、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、均質かつ均一に吸引力を受けて、それにより、この多孔性支持体の厚さを横切って、少なくともこの溶液の水を確実に拡散し、そして第一面の該多孔性部分に対して均質かつ均一に、少なくとも２μｍの深さまで、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を確実に貫通させ、そして第二工程中において、このフィブリンおよび／またはフィブリノーゲン層が安定化される、
可能な実施形態に従って、この第一面の該部分と、移動している水溶液との間で、接触が生じる。
【００３５】
有利には、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液はまた、極性有機添加剤を含有する。このような極性有機添加剤を使用すると、フィブリンネットワーク中の繊維厚さを制御できることが判明した。さらに、このような有機添加剤が存在することにより、また、この乾燥工程中でのフィブリンベース層の保護において有利であり、これは、おそらく、洗浄後に生じ得る。この乾燥操作は、有利には、−３０℃〜−１００℃の温度、好ましくは、−４０℃〜−７０℃の温度で、少なくとも部分的に、凍結乾燥により行われる。例えば、この乾燥操作は、幾つかの工程、すなわち、（例えば、３０〜７０℃の温度で）温度を上げるかまたはこの支持体の多孔性部分と接触したフィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質溶液の除去後に真空を形成するための第一乾燥工程、および凍結乾燥のための第二乾燥工程で、実行される。
【００３６】
乾燥操作は、有利には、水、水溶液（例えば、グリセリンのような極性有機添加剤を（例えば、約１〜２０重量％、特に、約５〜１０重量％で）含有する水溶液）によって、１つ以上の洗浄工程後、実行される。特定の洗浄操作は、このフィブリン層を、水溶液（特に、グリセロールを（例えば、１〜２０重量％、特に、５〜１０重量％）で含有する水溶液）と接触して、この多孔性支持体と一体化すること、その後、この支持体の他の面を吸引力に晒して、この多孔性支持体を通って、この溶液を吸引することからなる。このような洗浄操作により、フィブリノーゲンを含まない多孔性支持体が得られる。この操作は、本発明とは対応していないフィブリン層を備えた支持体上で実行され得、それにより、この多孔性支持体をこのフィブリノーゲン含有溶液と単に接触させることにより得た生成物は、本発明による要素に変えることが可能となる。
【００３７】
本発明によりフィブリン層を形成する方法で使用されるフィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質の溶液は、好ましくは、０〜２０％、特に、３〜１５％、さらに特定すると、５〜１０％の該極性有機添加剤を含有する。この添加剤は、有利には、グリセロール、糖（マンニトール、ソルビトール、スクロース、グルコースなど）であり得る。本発明による方法において、約５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、約０．０１〜１０単位／ｍｌのトロンビンおよび５〜１０％のグリセロールを含有する溶液を使用するとき、フィブリン繊維のネットワークが得られ、ここで、その胞のサイズは、本発明による方法において、約５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、約０．０１〜１０単位／ｍｌのトロンビン（グリセロールなし）を含有する溶液を使って得られたネットワークのものと類似している。それにもかかわらず、グリセロールを使用して得られたネットワーク中の繊維サイズは、より小さく、それにより、グリセロールを用いると、この溶液中でフィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をうまく使用できた。
【００３８】
フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質の溶液のｐＨは、有利には、５〜８．５、好ましくは、５．５〜８、特に、６〜７．５である。この溶液のｐＨは、鉱物起源または有機起源の強酸（ＨＣｌ）または弱酸（クエン酸など）を添加することにより、緩衝溶液（例えば、トリス緩衝液）によって制御され得る。
【００３９】
この溶液はまた、有利には、少なくとも、水溶性タンパク質、特に、アルブミンを含有する。
【００４０】
特定の１実施形態によれば、少なくとも、このフィブリンまたはフィブリノーゲン化合物ベース層の堆積の一部に対して、第一面と接触した溶液中のフィブリンまたはフィブリノーゲン化合物の濃度は、この支持体を通って実質的に一定の水拡散を保証するために、制御される。
【００４１】
本発明による方法では、生体適合性または生体分解性多孔性支持体が使用される。
【００４２】
特定の実施形態によれば、それから得られる利点は、その開始から、この多孔性支持体の厚さを通る実質的に均一な水拡散を保証するように得られ、この多孔性部分は、このフィブリンまたはフィブリノーゲン含有溶液が該多孔性部分と接触する前に、湿潤剤および／または水溶性タンパク質および／または極性有機添加剤を有利に含有する水溶液で処理される。
【００４３】
本発明によれば、この多孔性支持体はまた、引き続いて、数層のフィブリン層を堆積するために、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液で処理され得る。本発明によれば、この多孔性支持体は、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有するがトロンビンを含有しない溶液で処理され得、次いで、前処理された支持体は、トロンビンを含有する溶液で処理され得る。
【００４４】
本発明はまた、本発明による要素からなる濾過膜を含有するフィルター、本発明による要素からなる膜を含有するバイオリアクター、本発明による要素からなる移植片、および本発明による要素から製造した人工皮膚に関する。
【００４５】
フィブリン（薄い繊維）をうまく使用するため、およびフィブリンネットワークに付着した細胞の良好な生存度を保証するために、グリセロールは、胞のサイズを制御するのに有用であることが分かったので、本発明の他の目的は、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした化合物であり、該化合物は、乾燥発泡体または乾燥発泡体粒子の形状を有し、０．０５〜１０重量％の水溶性または水混和性の極性有機添加剤を含有し、該発泡体は、房の少なくとも５０容量％からなる多孔度または５〜２５μｍ2の体積空洞（ｖｏｌｕｍｅ ｃａｖｉｔｉｅｓ）を有する。有利には、フィブリンの少なくとも９０重量％は、架橋形状である。おそらく、この化合物はまた、１種以上のタンパク質および／または１種以上の活性物質を含有する。極性添加剤のうちで、グリセリンが好ましいが、他の添加剤（例えば、糖、スクロース、グルコース、マンニトールなど）もまた使用され得る。その水含量は、有利には、０．５重量％より低い。実際、この発泡体または架橋フィブリンネットワークは、少なくとも部分的に、水溶性または水混和性の極性有機添加剤で覆われている。
【００４６】
この化合物の調製は、ある方法で行われ得、ここで、おそらく前乾燥工程後、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンの水溶液（これはまた、水溶性または水混和性の極性有機添加剤を含有する）は、凍結乾燥により乾燥され、該溶液の有機溶媒含量は、それを０．５重量％未満で含有する化合物を得るために、０．０５〜１０重量％である。有利には、凍結乾燥による乾燥操作は、−４０〜−１００℃、好ましくは、−５０℃〜−７５℃の温度で、行われる。特に、凍結乾燥は、３段階で実行され、各段階は、この化合物または溶液を−４０〜−１００℃まで温度低下させることに続いて、０．４ｂａｒ（０．４×１０5Ｐａ）未満まで圧力低下させることを包含する。例えば、第一段階では、圧力は、０．２〜０．４×１０5Ｐａまで低下され、最終段階では、圧力は、０．２×１０5Ｐａ未満まで低下される。
【００４７】
本発明はまた、フィブリノーゲンを含まないフィブリン層（特に、共にフィブリノーゲンを含まない多孔性支持体およびフィブリン層）を得るような様式で、このフィブリン層から未結合フィブリノーゲン（特に、この多孔性支持体で見られるフィブリノーゲン）を抽出させる方法に関する。この方法は、以下を提供する：
この多孔性支持体の第一面上で付着されたフィブリン層の少なくとも一部は、極性有機添加剤を有利に含有する水溶液と接触され、そして
この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、均質かつ均一に、該多孔性部分を少なくとも部分的に通ってこの溶液を吸引する吸引力を受けて、それにより、該多孔性支持体に対して均質かつ均一に、この支持体の該第一面付近のフィブリノーゲンを確実に除去する。この吸引によって、少なくとも、この溶液の水は、この多孔性支持体の多孔性部分の厚さを通って拡散される。この方法が充分な時間にわたって適用されるなら、この多孔性部分の厚さを通って拡散される水の量は、多孔性部分の細孔中のフィブリノーゲンを除去または抽出するのに充分であり得る。従って、この吸引により、実質的にフィブリノーゲンを含まないフィブリン層が得られるか、またはフィブリノーゲンを含まない多孔性支持体およびフィブリン層さえ得られる。
【００４８】
１種以上の添加剤（例えば、１種以上の水溶性タンパク質、１種以上の薬剤など）を含有する水溶液を使用するとき、この洗浄工程により、この多孔性支持体に一定量の該添加剤を導入できるようになり、またはこの支持体のうちフィブリン層と接触していない面を該添加剤で被覆できるようになる。
【００４９】
溶液の吸引によって、水は、この多孔性支持体を貫通できるようになり、その結果、例えば、第一面（このフィブリン層を備えた面）から少なくとも２μｍ、有利には、少なくとも１０μｍ、好ましくは、少なくとも２０μｍの深さで、少なくとも、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔は、フィブリノーゲンを含まなくなる。
【００５０】
有利には、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、０．８×１０5 Ｐａ未満の圧力を受け、その多孔性部分の２面間において、少なくとも０．３×１０5Ｐａの圧力差が生じる。好ましくは、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、０．５×１０5Ｐａ未満、さらに好ましくは、０．４×１０5Ｐａ以下の圧力を受ける。好ましい実施形態によれば、この支持体の多孔性部分の厚さを横切って水を効率的に通過させつつ、第一面と反対の多孔性支持体面は、断続的に、０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第一圧力を受け、そして０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第二圧力を受け、第一圧力は、第二圧力よりも少なくとも５％高い。該第一面と反対の面において正圧または負圧を変える代わりに、該第一面に加える圧力を僅かに変えることも可能である。
【００５１】
有利には、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、そして０〜１００℃の温度、好ましくは、１５〜６０℃の温度、特に、２５〜４０℃の温度に晒される。
【００５２】
本発明による方法の変形に従って、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、逆浸透を生じるように選択された溶液を受け、少なくともこの溶液の水は、この支持体の多孔性部分を通って、この第一面と接触して、拡散を引き起こす。このような拡散は、それにより、この多孔性支持体の厚さを少なくとも部分的に通る水の実質的に均一かつ規則的な通過を保証する。
【００５３】
本発明のさらに他の目的は、生体吸収性物質または吸収性重合体（特に、ポリ乳酸重合体および／またはポリグリコール重合体および／または生体高分子）だけでなく構造タンパク質および多糖類から製造された層で覆われた多孔性支持体を作製する方法であり、該構造タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンおよびフィブリン、およびヒトまたは動物の組織を形成する他のタンパク質だけでなく、組換えタンパク質を含む群から選択される。 この方法により、水溶液または水性懸濁液が調製され、これは、１種以上の重合体および／または生体高分子および／または該重合体および／または生体高分子をその場で形成する物質を含有する。この溶液または懸濁液は、この多孔性支持体の少なくとも１つの異なる面（有利には、第一面と反対の面）から該溶液または懸濁液の水の少なくとも一部を吸引しつつ、多孔性支持体の第一面と接触される。この吸引力により、水および有利に吸収可能な生体高分子または重合体は、この多孔性支持体で拡散される。このような拡散を保証するために、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面（この溶液または懸濁液と接触している面）は、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、この間、この多孔性支持体の２つの面間において、少なくとも０．３×１０5Ｐａの圧力差が生じる。好ましくは、該第一面と反対の支持体面は、０．５×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の圧力を受ける。好ましい実施形態によれば、この支持体の多孔性部分の厚さを通って水を効率的に通過させつつ、この支持体のうち第一面と反対の面は、断続的に、０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第一圧力を受け、そして０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第二圧力を受け、第一圧力は、第二圧力よりも少なくとも５％高い。該第一面と反対の面において正圧または負圧を変える代わりに、該第一面に加える圧力を僅かに変えることも可能である。この重合体溶液または懸濁液と接触する面とは反対の該面はまた、逆浸透を生じるように選択された溶液の影響を受け得、少なくとも、この支持体の多孔性部分を通って第一面と接触するこの溶液の水の拡散を引き起こす。このような拡散は、それにより、この多孔性支持体の厚さを少なくとも部分的に通る水の実質的に均一かつ規則的な通過を保証する。この多孔性支持体を通って拡散している溶液は、有利には、２０〜７０℃、特に、３０〜５０℃の温度である。一旦、吸収性重合体または生体高分子が形成されると、この層は、有利には、凍結乾燥で乾燥される。凍結乾燥は、有利には、このフィブリン層に関して記述したように、行われる。もし、乾燥工程を凍結乾燥で実行するなら、この層を形成するのに使用する溶液は、有利には、例えば、約１〜１５％、特に、５〜１０％で、極性添加剤（特に、グリセロール）を含有する。
【００５４】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層を備えた要素であって、該要素は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）疎水性または実質的に疎水性の支持体であって、該支持体は、厚さ０．１〜５ｍｍの多孔性部分を有し、該細孔は、その厚さを横切って伸長していて、５〜１００μｍの結節間隔を有し、該多孔性部分の１面は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質をベースにした化合物で処理されている；および（ｂ）該支持体の該処理面を覆っているフィブリンベース層：ここで、該フィブリンベース層は、該処理面上において、実質的に均一かつ均質であり、該フィブリン層と、該支持体のうち少なくとも該フィブリン層と接触している面とは、実質的にフィブリンノーゲンを含まない、
要素。
（項目２） 前記フィブリン層と、少なくとも、１０μｍの厚さを横切って伸長している支持体とが、該フィブリン層の重量に対して、１重量％未満、有利には、０．５重量％未満、好ましくは、０．１重量％未満の未反応フィブリノーゲンを含有する、項目１に記載の要素。
（項目３） フィブリンが、前記支持体の前記処理多孔性部分の厚さを横切って、前記処理面から少なくとも２μｍの深さまで伸長しており、両方とも、１０〜２０μｍの平均直径を有する前記細孔および２０μｍより大きい平均直径を有する前記細孔を通る、項目１または２に記載の要素。
（項目４） 前記支持体の前記多孔性部分が、前記処理面の全面にわたって、実質的に均質かつ均一な多孔度を有し、一部のフィブリンが、該支持体の該多孔性部分の厚さを横切って、少なくとも１０μｍの深さまで、均質かつ均一に伸長している、項目１〜３のいずれかの項目に記載の要素。
（項目５） 前記多孔性支持体が、前記フィブリン層と接触している前記面から１０μｍより離れた層に、フィブリノーゲンを含有する、項目２に記載の要素。
（項目６） フィブリノーゲンが、前記支持体の厚さを横切って、少なくとも２０μｍの深さまで伸長している、項目５に記載の要素。
（項目７） 前記フィブリン層のうち、少なくとも、前記多孔性支持体と接触している面とは反対の面が安定化されている、項目１〜６のいずれかの項目に記載の要素。
（項目８） 前記フィブリンベース層が、少なくとも部分的に架橋されて、隣接胞のネットワークを形成する、項目７に記載の要素。
（項目９） 前記層が、細胞および／またはタンパク質、特に、細胞−フィブリン結合を媒介するタンパク質を備えている、項目１〜８のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１０） 前記支持体の前記多孔性部分を覆っている前記架橋フィブリンベース層が、乾燥状態で測定したとき、０．５〜１００μｍの厚さ、好ましくは、２．５〜５０μｍの厚さであり、該架橋フィブリンベース分子または結合間、または繊維間で、胞が形成され、該胞が、５〜２５μｍ3の体積を有し、該胞の平均厚さまたは高さが、１〜５μｍ、特に、１〜３μｍである、項目１〜９のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１１） 前記フィブリン層で覆われた前記支持体部分の前記細孔が、水溶性または実質的に水溶性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われた内面を有する、項目１〜１０のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１２） 前記処理面とは反対の前記支持体面が、水溶性または実質的に水溶性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われている、項目１１に記載の要素。
（項目１３） 前記支持体の前記多孔性部分の少なくとも前記細孔が、水溶性または水混和性の極性有機添加剤で覆われている、項目１〜１２のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１４） 前記架橋フィブリン繊維のネットワークが、水溶性または水混和性極性添加剤、好ましくは、グリセロール、糖およびそれらの混合物を含む群から選択される添加剤で少なくとも部分的に覆われている、そして／または該添加剤を含む、項目１３に記載の要素。
（項目１５） ０．５重量％未満、好ましくは、０．１重量％未満の水分含量を有する、項目１〜１４のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１６） フィブロネクチンが、前記フィブリン層に付着されており、該フィブロネクチン含量が、該層中のフィブリンおよびフィブロネクチンの重量と比較して、０．５〜１５％である、項目１〜１５のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１７） 前記フィブリン層が、該フィブリン層の体積１ｃｍ3あたり、１〜１００μｇ、好ましくは、１〜５０μｇのオーダーのカルシウムを含有する、項目１〜１６のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１８） カルシウムが、塩化カルシウムの形態をとっている、項目１４に記載の要素。
（項目１９） 前記支持体が、２層の重なり合ったフィブリン層を有し、該支持体と接触している層が、該支持体と接触している該フィブリン層を覆う層の胞と比較して、大きい体積の胞を有する、項目１〜１８のいずれかの項目に記載の要素。
（項目２０） 前記支持体が、生体適合性および／または生体分解性である、項目１〜１９のいずれかの項目に記載の要素。
（項目２１） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素を作製する方法であって、ここで、多孔性支持体の第一面の少なくとも１つの多孔質部分は、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有する水溶液と接触して配置されており、ここで、該支持体の該多孔性部分のうち該第一面と反対の面は、均質かつ均一に、該多孔性部分を少なくとも部分的に通って該溶液を吸引する吸引力を受け、それにより、該多孔性部分に対して均質かつ均一に、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層を確実に堆積し、そして該多孔性支持体の該多孔性部分を通って、少なくとも、該溶液の水を確実に拡散するだけでなく、該多孔性支持体を通って、フィブリンまたはフィブリノーゲンを確実に貫通させる、
方法。
（項目２２） 前記支持体のうち前記第一面と反対の面が、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、ここで、前記多孔性部分の２面間において、少なくとも０．３×１０5Ｐａの圧力差が生じる、項目２１に記載の方法。
（項目２３） 前記第一面と反対の前記支持体面が、０．５×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ以下の圧力を受ける、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記第一面と反対の前記支持体面が、断続的に、０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第一圧力を受け、そして０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第二圧力を受け、該第一圧力が、該第二圧力よりも少なくとも５％高い、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５） 前記多孔性支持体のうち前記第一面と反対の面が、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、そして０〜１００℃の温度、好ましくは、１５〜６０℃の温度に晒される、項目２２〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６） 前記多孔性支持体のうち前記第一面と反対の面が、逆浸透を生じるように選択された溶液を受け、少なくとも該溶液の水が、該第一面と接触して該支持体の前記多孔性部分を通って、拡散を引き起こす、項目２１に記載の方法。
（項目２７） ５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液が使用される、項目２１〜２６のいずれかに記載の方法。
（項目２８） ５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質および１ｍｌあたり０．０１〜１０単位のトロンビンを含有する溶液が使用される、項目２７に記載の方法。
（項目２９） ５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、第ＸＩＩＩ因子、および１ｍｌあたり０．０１〜２単位のトロンビンを含有する溶液が使用される、項目２８に記載の方法。
（項目３０） １ｍｌあたり０．１〜１０単位のＸＩＩＩ因子を含有する溶液が使用される、項目２９に記載の方法。
（項目３１） 前記溶液が、１ｍｌあたり、１〜４０ミリモルの塩化カルシウムを含有する、項目２７〜３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２） 前記溶液が、０〜２０重量％、有利には、３〜１５重量％、好ましくは、５〜１０重量％の水溶性または水混和性の極性有機添加剤を含有する、項目２７〜３１のいずれかに記載の方法。
（項目３３） 前記添加剤が、グリセロールである、項目３２に記載の方法。
（項目３４） 第一工程中において、多孔性支持体の第一面の少なくとも一部が、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液と接触して配置され、ここで、該多孔性支持体のうち該第一面と反対の面が、吸引力を受けて、それにより、該多孔性支持体の厚さを横切って、少なくとも該溶液の水を確実に拡散し、そして該第一面の該多孔性部分に対して均質かつ均一に、該多孔性支持体の厚さを横切って、フィブリンまたはフィブリノーゲンを確実に貫通させ、そして第二工程中において、前記フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン層が安定化される、項目２１〜３３のいずれかに記載の方法。
（項目３５） 前記第一面の前記部分と、移動している水溶液との間で、接触が生じる、項目２１〜３４のいずれかに記載の方法。
（項目３６） 湿潤剤を含有する水溶液が使用されて、前記支持体を前記フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有する前記溶液と接触して配置する前に、前記多孔性支持体の前記細孔を満たす、項目２１〜３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７） 前記フィブリン層が、おそらく洗浄工程の後に、乾燥工程を受ける、項目２１〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８） 前記乾燥操作が、有利には、−３０℃〜−１００℃の温度、好ましくは、−４０℃〜−７０℃の温度で、少なくとも部分的に、凍結乾燥により行われる、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 少なくとも、前記フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層の堆積物の一部に対して、前記第一面と接触する前記溶液中のフィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質の濃度が、前記支持体を通る実質的に一定の水拡散を保証するために、制御されている、項目２８〜３８のいずれかに記載の方法。
（項目４０） 生体適合性および／または生体分解性の多孔性支持体が使用される、項目２１〜３９のいずれかに記載の方法。
（項目４１） 前記多孔性部分が、有利には湿潤剤、タンパク質または極性有機添加剤またはそれらの混合物を含有する水溶液で処理され、その後、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質を含有する前記溶液が該多孔性部分と接触される、項目２１〜４０のいずれかに記載の方法。
（項目４２） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素からなる膜を含む、フィルター。
（項目４３） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素からなる膜を含む、バイオリアクター。
（項目４４） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素からなる、移植片。
（項目４５） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素から製造される、人工皮膚。
【００５５】
それ以上の特徴および詳細は、添付の図面を参照して、特定の実施形態の上記詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、本発明による要素の概略図である。
【図２】図２は、本発明による要素を作製するための設備の概略図である。
【図３】図３は、凍結乾燥前、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図４】図４は、凍結乾燥前、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図５】図５は、凍結乾燥前、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図６】図６は、凍結乾燥後、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図７】図７は、凍結乾燥後、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図８】図８は、凍結乾燥後、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図９】図９は、断面で見たとき、１ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液によって得られたネットワークの断面図である。
【図１０】図１０は、断面で見たとき、１０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液によって得られたネットワークの断面図である。
【図１１】図１１は、断面で見たとき、２０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液によって得られたネットワークの断面図である。
【図１２】図１２は、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）を使って撮影したときの、ＣａＣｌ2を含有しない溶液によって得たネットワークの断面図である。
【図１３】図１３は、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）を使って撮影したときの、２．７ｍＭのＣａＣｌ2／ｍｌを含有する溶液によって得たネットワークの断面図である。
【図１４】図１４は、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）を使って撮影したときの、２７ｍＭのＣａＣｌ2／ｍｌを含有する溶液によって得たネットワークの断面図である。
【図１５】図１５は、５００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の細胞を有するフィブリンネットワークの上面図である。
【図１６】図１６は、５００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の細胞を有するフィブリンネットワークの上面図である。
【図１７】図１７は、５００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の細胞を有するフィブリンネットワークの上面図である。
【図１８】図１８は、５００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の細胞を有するフィブリンネットワークの上面図である。
【図１９】図１９は、１００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときの、細胞「Ｃ」を備えたフィブリン層４を有する多孔性支持体２の断面図である。
【図２０】図２０は、１００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときの、細胞「Ｃ」を備えたフィブリン層４を有する多孔性支持体２の断面図である。
【図２１】図２１は、１０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときの、細胞「Ｃ」を備えたフィブリン層４を有する多孔性支持体２の断面図である。
【図２２】図２２は、低分子量のマーカー（１、６）、コントロールフィブリノーゲン（５）、コントロールフィブリン（４）、インキュベーション後に浸出液に由来の重合体層（その多孔性膜を通っている部分）およびインキュベーション後の浸出液の浮いている部分の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
図１は、本発明による要素の一部の拡大断面図を概略的に示す。
【００５８】
要素１は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）疎水性または実質的に疎水性の支持体２、例えば、ＰＴＦＥ（これは、両方の軸方向に拡大され延伸されている）であって、これは、０．１〜５ｍｍ、例えば、３００〜５００μｍの厚さＥを備えた多孔性部分を有し、その細孔Ｐは、その厚さに沿って伸長しているが、５〜１００μｍ、例えば、約３０〜４０μｍの平均直径「ｄ」（細孔体積／細孔の表面）を有し、該支持体２の該多孔性部分の一面３は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンベース化合物で処理されている；および（ｂ）フィブリンベース層４であって、これは、支持体２の処理面３を覆っている。
【００５９】
該フィブリンベース層４は、該処理面３において、実質的に均一かつ均質である。例えば、層４中のフィブリノーゲン（このフィブリン層に結合していないフィブリン）の含量は、このフィブリン層の０．５重量％より低く、好ましくは、０．１重量％より低い。
【００６０】
一部のフィブリノーゲンＦは、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔（その体積（μｍ3で表わす）を細孔壁の表面積（μｍ2で表わす）で割った値が１０〜２０μｍである細孔）および２０μｍより大きい平均直径を有する細孔の両方において、この支持体の処理した多孔性部分の厚さＥを横切って、該処理面から少なくとも１０μｍの深さ「ｅ」まで伸長し得る。特に、この多孔性部分の処理面の２５μｍより大きい全細孔では、一部のフィブリノーゲンは、この支持体の厚さＥを横切って、少なくとも３０μｍの深さ「ｅ」まで伸長している。それにもかかわらず、面３では、この支持体は、このネットワークに結合していないフィブリノーゲンを実質的に含まない。このフィブリンネットワークに結合していないフィブリノーゲンがないことは、この多孔性支持体を通る水の通過のせいである。特定の１実施形態では、この多孔性支持体は、このフィブリン層を支える面から、少なくとも１０μｍの深さまで、フィブリノーゲンを含まない。特に有利な実施形態によれば、この支持体は、その厚さ全体にわたって、フィブリノーゲンを含まない。
【００６１】
フィブリン層４は、図１で示すように、ＸＩＩＩ因子の存在により、架橋によって安定化されている。それゆえ、該層４は、隣接胞４０のネットワークを形成する。
【００６２】
面３から決定されるフィブリン層の厚さ「ｈ」（その脱水形態）は、例えば、約１０μｍであるのに対して、房またはセルの平均体積は、約１０μｍ3である。その胞は、開いており、その間に開口部を有する。胞との用語は、５μｍ3より大きい体積を有する無フィブリン領域を規定しており、これは、フィブリン結合で取り囲まれている。層４における胞の分布は、実質的に規則的であり、すなわち、層４で覆われた面３の１ｃｍ2の領域における胞の体積は、その領域の単位表面積（ｃｍ2）あたりの房の平均体積の０．８〜１．２倍（好ましくは、０．９〜１．１倍）である。これらの房の平均高さは、面３に垂直に測定したとき、例えば、２〜３μｍである。
【００６３】
図１で示した要素は、有利には、乾燥状態である。その水分含量は、例えば、０．０１重量％未満であり、これにより、この要素の優れた保存および安定性が保証される。この要素を再水和したとき、このフィブリン層は、例えば、１．５倍より大きい倍率、特に、１．６〜２．５倍で膨張する（再水和後のフィブリン層の厚さは、乾燥フィブリン層の厚さの１．６〜２．５倍に相当している）。
【００６４】
特定の実施形態によれば、細孔Ｐは、水溶性または実質的に水混和性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われた内面を有し、および／またはこの支持体のうち処理面とは反対の面６は、水溶性または実質的に水混和性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われている。このような被覆は、例えば、細胞固定化、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質で処理された面とは反対の面を取り囲む組織の癒着を助けるのに有利である。
【００６５】
１実施形態の有利な特徴によれば、この支持体の多孔性部分の細孔Ｐ（内壁）は、水溶性または水混和性の極性有機添加剤またはこのような添加剤の痕跡により、少なくとも部分的に覆われている。この極性有機添加剤はまた、有利には、層４のフィブリン層およびこの支持体の面３および６上で、少なくとも一部で存在している。この添加剤は、例えば、グリセロール、糖など、またはこれらの添加剤の混合物であり得る。該添加剤は、水に特に溶解性であるかまたは少なくとも混和性であり、特に、大気圧で水の凍結温度に対して、凍結温度を下げることができる水溶性添加剤のうちから選択される。このフィブリン、フィブリノーゲンおよび／またはトロンビン溶液中または湿潤架橋フィブリン層（これは、乾燥しておらず、その細孔中の水含量は、約５０％である）中の溶解性または混和性添加剤の量は、好ましくは、大気圧での凍結温度を−５℃未満、好ましくは、−１０℃未満で下げるのに充分である。
【００６６】
図示した実施形態の支持体は、ＰＴＦＥの生体適合性の多孔性支持体であるものの、他の生体適合性支持体、特に、生体分解性支持体または生体適合性で生体分解性の支持体は、使用できる。
【００６７】
本発明による要素を作製する方法の少数の例を以下で記述する。
【００６８】
本発明による１個以上の要素の作製には、その房内で大気圧に対して真空または負圧を生じるために、真空ポンプ１１に接続された真空チャンバ１０が使用される。このチャンバは、図２で概略的に示されている。
【００６９】
このチャンバは、これらの溶液をチューブの内部空間または中空部（これは、１〜１００ｍｍ、さらに特定すると、２〜１０ｍｍの内径を有する）に入れるための吸気口を有する。チューブ１３は、非多孔性リング１３Ｂで分離された多孔性円筒形部分１３Ａ（２０〜３０μｍの細孔の平均直径）を有する。そのチューブ厚は、この多孔性部分に対して、約２００〜３００μｍであった。吸気口１２は、液密様式でそこにこのチューブの末端１３Ｃを留める手段を含む。吸気口１２は、ダクト１５によって、フィブリノーゲン含有物質（１０〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度）の水溶液（これは、１ミリリットルあたり０．２〜２０単位のＸＩＩＩ因子（ＩＵ／ｍｌ）および１００〜１０００μｇ／ｍｌのフィブロネクチン）を含有するタンク１４に接続されており、ダクト１６によって、トロンビン（０．０５〜２ＩＵ／ｍｌの濃度）の水溶液を含有するタンク１７に接続されており、そしてダクト１８によって、水およびおそらく１種以上の添加剤を含有するタンク１９に接続されている。ダクト１５、１６および１８には、流体の通過を許容または防止するバルブＶが取り付けられている。該ダクトは、大気圧に依存して、１種以上の流体をこの吸気口に向ける。制御システム２０は、所望の容量およびこのチャンバ内で測定された容量に依存して、この真空ポンプの操作を制御する。
【００７０】
この吸気口に留めたものと反対のチューブ末端は、プラグ２１で閉じられるが、これは、有利には、バルブ２３付きのダクト２２により伸長され、チューブ内に含まれる流体または溶液の排出を可能にする。
【００７１】
このチャンバはまた、そのチャンバ温度を＋６０℃〜−１００℃の範囲に調節する手段２４を備えている。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
本実施例では、溶液Ａ（これは、２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、１ｍｌあたり１０００μｇのフィブロネクチンおよび２ＩＵ／ｍｌのＸＩＩＩ因子を含有する）、および溶液Ｂ（これは、１ｍｌあたり０．２ＩＵのトロンビン、および４０ｍＭ（ミリモル）の塩化カルシウムを含有する）を使用した。
【００７３】
溶液Ａおよび溶液Ｂを、同じ流速で、この吸気口に供給して、溶液Ａおよび溶液Ｂの両方の１：１混合物を得た。そのように得た混合物は、１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン、５００μｇ／ｍｌのフィブロネクチン、１ＩＵ／ｍｌのＸＩＩＩ因子、０．１ＩＵ／ｍｌのトロンビンおよび２０ ｍＭ／ｍｌのＣａＣｌ2を含有していた。
【００７４】
このチューブの中空部および内部空間を、溶液ＡおよびＢの混合物で満たし、そのチャンバ圧を０．４×１０5Ｐａ（すなわち、大気圧に対して、約６００ミリバールの負圧）まで低下させた。この真空の形成により、水は、このチューブの多孔性部分の厚さを通って吸引される。この真空は、このチューブの外面で生じるので、後者は、僅かに伸展されるかまたは締められ、これは、このチューブの細孔を通る液体の拡散を助ける。
【００７５】
真空を作って維持している間、このチューブの外壁は、濡れていることが分かった。
【００７６】
約１〜３０分間にわたって真空を維持した後、このチャンバの圧力は、漸次、大気圧に戻した。一旦、このチューブを空にして水洗すると、チューブの内面は、約５μｍ厚の架橋フィブリン層で覆われていることが分かり、１５〜２０μｍ3の房または開放セルは、チューブの多孔性部分上にあった（この層を支える支持体の面に平行に測定したように、２〜３μｍのセル高さ、５〜７μｍ2の面積）。このフィブリン層だけでなく、フィブリン層との支持体界面上には、フィブリン層に結合していないフィブリノーゲンは存在しなかった。フィブリノーゲンは、この支持体の細孔において、１０μｍより大きい平均直径を有する全細孔に対して、少なくとも約２０μｍの深さ（このチューブの内面から）まで、存在していた。
【００７７】
この多孔性支持体を通るフィブリノーゲンの通過は、図２２の電気泳動図で確認される。実際、このフィブリノーゲン溶液と接触している面とは反対の面からの一部の液体を収集した。この液体をインキュベートした後、形成された重合体層（２）および上澄み液（３）の両方について、電気泳動ピークを決定した。この結果、インキュベーション後、この電気泳動（２）により、フィブリンに典型的なピークが明らかとなり、このことから、そのフィブリノーゲンは、この多孔性支持体を通ったことが判明した。
【００７８】
このチューブは、引き続いて、５０℃に加熱した気体で乾燥した。
【００７９】
（実施例２）
そのチャンバ内の圧力を約０．４×１０5Ｐａで維持して洗浄水がこの多孔性支持体を通って確実に拡散するようにしつつ、このチューブの内側に脱塩水流れを入れてフィブリノーゲン溶液を排出することにより、その洗浄工程を行ったこと以外は、実施例１を繰り返した。この拡散により、フィブリノーゲンは、この多孔性支持体から除去できる。
【００８０】
（実施例３）
そのチューブの温度を−６０℃まで下げて水を氷にし、それをこの温度で凍結乾燥することにより、このチューブを乾燥したこと以外は、実施例１を繰り返した。
【００８１】
（実施例４）
５０％の溶液Ａおよび５０％の溶液Ｂからなる混合物の約５重量％でグリセロールを添加したこと以外は、実施例３を繰り返した。この多孔性支持体およびフィブリン層の両方でグリセロールが存在していることにより、この要素にある程度の融通性が得られることに注目した。さらに、その凍結乾燥工程は、簡単であった。
【００８２】
その架橋フィブリンの形成時にグリセロールが存在していることは、このフィブリン層に規則的で均一な構造を与えるのに有利であることが判明した。さらに、グリセロールが存在していることにより、フィブリンおよびフィブリノーゲンがこのチューブの多孔性部分の細孔を通過し易くなった。
【００８３】
（実施例５）
５０％の溶液Ａおよび５０％の溶液Ｂからなる混合物の約１０重量％でグリセロールを添加したこと以外は、実施例４を繰り返した。この多孔性支持体およびフィブリン層の両方でグリセロールが存在していることにより、この要素にある程度の融通性が得られることに注目した。さらに、その凍結乾燥工程は、簡単であった。
【００８４】
実施例２および４に由来のフィブリンネットワークの一部を、凍結乾燥前および後に、その中に２〜２．５％のグルタルアルデヒドの溶液を含有する皿に一晩置いた。その後、グルタルアルデヒドで固定したネットワークの薄片を、加熱した小刀によって横に切断し、その薄片を、４０％、５０％、７０％、８０％、９０％および１００％のエタノール溶液で脱水した。
【００８５】
図３、４および５は、凍結乾燥前、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、それぞれ、実施例２、３および４に由来のフィブリンネットワークの薄片の断面図であるのに対して、図６、７および８は、凍結乾燥後、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときの、それぞれ、実施例２、３および４に由来のフィブリンネットワークの薄片の断面図である。これらの図を比較すると、その結果、凍結乾燥前の実施例２、３および４に由来のフィブリンネットワークの胞は、類似しており、凍結乾燥後の実施例２、３および４に由来のフィブリンネットワークの胞は、類似しており、グルセロールを使用することによって、このネットワークの繊維のサイズが小さくなっている。それゆえ、グリセロールは、この凍結乾燥工程中に繊維を保護するのに有用である以外に、このフィブリンネットワークの繊維のサイズまたは直径を制御できる試薬である。
【００８６】
（実施例６）
グリセロールを、まず、グルコースで置き換え、次いで、マンニトールで置き換えたこと以外は、実施例４を繰り返した。
【００８７】
（実施例７）
約１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンおよびそれぞれ１ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌおよび２０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液を使用したこと以外は、実施例１を繰り返した。
【００８８】
それにより得られたネットワークを、２〜２．５％のグルタルアルデヒドを含有する溶液および実施例４で記述したエタノール含有溶液で処理した。そのように得たネットワークの一部の薄片を、電子顕微鏡（走査型電子顕微鏡、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）で検査した。図９、１０および１１は、それぞれ、３，５００倍の倍率で、１ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌおよび２０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液を使って得られたネットワークの断面図である。
【００８９】
これらの図９〜１１は、この溶液中のトロンビンが高濃度で存在していると、繊維の数が多くなるが、そのサイズは小さくなることを示している。
【００９０】
（実施例８）
０ｍＭ／ｍｌ、２．７ｍＭ／ｍｌおよび２７ｍＭ／ｍｌの濃度のＣａＣｌ2を有するトロンビンおよびフィブリノーゲン溶液を調製したこと以外は、実施例１を繰り返した。実施例４で記述したネットワークを処理し洗浄した後、０ｍＭ／ｍｌ（図１２）、２．７ｍＭ／ｍｌ（図１３）および２７ｍＭ／ｍｌ（図１４）を含有する溶液で得たネットワークの断面を、電子顕微鏡（走査型電子顕微鏡、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）で５，０００倍の倍率で検査した。これらの図は、高いカルシウム含量が、多い繊維、その大きいサイズ、およびその胞の小さい体積に対応していることを示している。
【００９１】
（実施例９）
５％のグリセロール、２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン、１ｍｌあたり５００μｇのフィブロネクチン、１０ＩＵ／ｍｌのＸＩＩＩ因子、１ｍｌあたり１ＩＵのトロンビンおよび１ｍｌあたり４０ｍＭ（ミリモル）のカルシウムを含有する溶液を使用すること以外は、実施例４を繰り返した。
【００９２】
（実施例１０）
そのチャンバの真空を制御して、大気圧に対する６００ｍｂａｒ（約０．４×１０5Ｐａの圧力）から大気圧に対する６３０ｍｂａｒ（約０．３８×１０5Ｐａの圧力）まで断続的に変えたこと以外は、実施例４を繰り返した。この真空の変化は、この支持体の孔内でフィブリンおよびフィブリノーゲンが拡散するのに有利であることが分かった。水で洗浄し、このフィブリン層を水流と接触させ、そしてこのチャンバ内にて、大気圧に対する６００ｍｂａｒ（約０．４×１０5Ｐａの圧力）から大気圧に対する６３０ｍｂａｒ（約０．３８×１０5Ｐａの圧力）までの真空を作った後、この支持体およびフィブリン層は、それ以上の遊離のフィブリノーゲンを含有していなかった。
【００９３】
このチューブは、必要なら、凍結乾燥前または後に、１２１℃の温度で６０分間、例えば、オートクレーブで簡単に滅菌し得る。他の任意の滅菌法は、この架橋フィブリン層の胞構造も支持体構造も破壊しないという条件で、使用され得る。
【００９４】
（実施例１１）
そのチューブ内で実質的に一定のフィブリノーゲン濃度を保証するために、この拡散工程中にて、このチューブで、フィブリノーゲンの濃度を制御したこと以外は、実施例３を繰り返した。こうするために、バルブ２３を断続的に開いて、このチューブから一定量の溶液を排出し、このチューブに、フィブリノーゲンを殆どまたは全く含有しない溶液を供給した。これにより、このフィブリン層は、実質的に規則的かつ均質な厚さであることが保証される。
【００９５】
（実施例１２）
そのフィブリノーゲン濃度を実質的に連続的に制御して、このチューブの内壁にフィブリンが堆積するにつれて、この濃度を低下させたこと以外は、実施例１１を繰り返した。
【００９６】
（実施例１３）
そのチューブをフィブリノーゲン溶液で処理する前に、脱塩水、１ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含有する水溶液、１０ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含有する水溶液、３０ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含有する水溶液を、それぞれ、このチューブに供給して、その細孔を該溶液で満たしたこと以外は、実施例３を繰り返した。
【００９７】
（実施例１４）
その溶液に含有されたタンパク質が、３０ｍｇ／ｍｌのアルブミンおよび１０ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンであること以外は、実施例３を繰り返した。ビブロネクチンなどのような他のタンパク質は、アルブミンおよび／またはフィブロネクチンに代えて、個々にまたは混合物中で使用できた。
【００９８】
ＷＯ９６／０７４４４で示すように、このフィブリン層は、それを変性するかまたはそれに特定の特性を与えるか、いずれかのために処理できる。
【００９９】
このフィブリン層は、水、１種以上の塩（おそらく、溶液中）、フィブリン層を備えた支持体の生体適合性を改良するのに使用される添加剤で処理され得る。これらの添加剤は、例えば、タンパク質、抗凝固剤、抗炎症化合物、移植片の拒絶を少なくする化合物、生細胞、細胞成長阻害剤、内皮細胞を刺激する試薬、抗生物質、抗新生物剤、遺伝子物質、架橋フィブリン層上の内皮細胞の成長および／または付着を促進および／または刺激するタンパク質、成長因子、ヘパリン結合のための成長因子、コレステロールに抗する物質（ＺＯＣＯＲ（登録商標））などから選択され得る。添加剤の一部の特定の例は、米国特許第５，６６０，８７３号で示されており、その内容は、参考として、含まれている。
【０１００】
このフィブリン層は、もし必要なら、例えば、プラスチンによって、加水分解され得る。
【０１０１】
（実施例１５）
第一工程中にて、このチューブに溶液Ａを供給して、このチャンバ内で真空を作ることにより、非架橋フィブリンまたはフィブリノーゲン層を得ること、および第二工程中にて、このチューブに溶液Ｂ（トロンビン）を供給して、フィブリンモノマーを形成し、架橋構造を得たこと以外は、実施例１を繰り返した。
【０１０２】
（実施例１６）
凍結乾燥を、数段階、すなわち、温度を−５８℃まで下げること、この−５８℃という温度を維持すること、１〜５時間にわたって真空を作ること（その凍結乾燥装置は、７Ｐａの圧力設定値で調節し、その結果、真空ポンプは連続的に作動し得た）、この真空を維持しつつ、温度を−５８℃から−２０℃〜−３０℃まで上げること、この真空を維持しつつ、−２０℃〜−３０℃の温度を少なくとも１０時間（１０〜１００時間）維持すること、この真空を維持しつつ、この温度を２０℃より高く上げることによって行ったこと以外は、実施例４を繰り返した。
【０１０３】
（実施例１７）
その多孔性チューブを、引き続いて、溶液Ａおよび溶液Ｂで処理したこと以外は、実施例１を繰り返した。
【０１０４】
本実施例の処理工程は、以下である：
ａ）このチューブに溶液Ａ（フィブリノーゲン）を供給すること；
ｂ）このチューブの外側の空間に真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ａを吸引すること；
ｃ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ａを除去すること；
ｄ）室温で１５分間にわたって堆積したフィブリノーゲン層をインキュベートすること（工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、工程ｅ）の前に、１回または数回、例えば、２回または３回繰り返され得る）；
ｅ）このチューブに溶液Ｂ（トロンビン）を供給すること；
ｆ）このチューブの外側の空間で真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ｂを吸引すること；
ｇ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ｂを除去すること；
ｈ）この層を３７℃で３０分間インキュベートすること；
ｉ）このチューブに溶液Ａ（フィブリノーゲン）を供給すること；
ｊ）このチューブの外側の空間に真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ａを吸引すること；
ｋ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ａを除去すること；
ｌ）この層を、室温で１５分間にわたってインキュベートすること（工程ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、１回または数回繰り返し得る）；
ｍ）この層を、３７℃で９０分間インキュベートすること。
【０１０５】
（実施例１８）
中間インキュベーション工程ｄ、ｈおよびｌを省いたこと以外は、実施例１６を繰り返した。
【０１０６】
（実施例１９）
その多孔性チューブを、引き続いて、溶液Ａおよび溶液Ｂで処理したこと以外は、実施例１を繰り返した。
【０１０７】
本実施例の処理工程は、以下である：
ａ）このチューブに溶液Ａ（フィブリノーゲン）を供給すること；
ｂ）このチューブの外側の空間に真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ａを吸引すること；
ｃ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ａを除去すること；
ｄ）室温で１５分間にわたって堆積したフィブリノーゲン層をインキュベートすること；
ｅ）このチューブに溶液Ｂ（トロンビン）を供給すること；
ｆ）このチューブの外側の空間で真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ｂを吸引すること；
ｇ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ｂを除去すること；
ｈ）この層を３７℃で３０分間インキュベートすること；
ｉ）このチューブを水で洗浄すること（好ましくは、連続的な洗浄操作）；
ｊ）工程ａ〜ｉを１回または数回繰り返すこと；
ｋ）この層を、３７℃で９０分間インキュベートすること。
【０１０８】
（実施例２０）
その溶液混合物のｐＨを、その導入時にて、それぞれ、６、６．５、７および７．５に変えたこと以外、またはそのチューブ中の溶液のｐＨを、その工程中に制御して、それを６．５、７または７．５に維持したこと以外は、実施例４を繰り返した。
【０１０９】
（実施例２１）
その多孔性チューブを真空チャンバに入れる代わりに、このチューブを、塩（ＮａＣｌ）の濃縮水溶液を備えた容器に入れて、逆浸透により、このチューブの壁を通って該濃縮溶液に向かう水およびフィブリン−フィブリノーゲン拡散を形成すること以外は、実施例１を繰り返した。
【０１１０】
（実施例２２）
実施例１のフィブリノーゲンおよびトロンビン化合物を、注射器によってチューブに注入して、このチューブの内壁にフィブリン層を形成した。この方法により、フィブリノーゲンは、このチューブの内壁または該内壁の付近にあるフィブリン層に存在するようになる。
【０１１１】
このフィブリノーゲン溶液を除去し、このチューブを水に浸漬した（前洗浄）後、チューブを、実施例１で使用した真空チャンバに入れた。次いで、このチューブに脱塩水を供給し、それから、このチャンバに真空を作り（０．３×１０5Ｐａの圧力）、その結果、水は、チューブの壁を通って、その内壁から外壁へと吸引される。このチューブ壁を通って水が拡散することにより、未結合フィブリノーゲンは、このフィブリン層から、この支持体の外側に除去でき、その結果、このチューブの内壁付近に位置しているその少なくとも一部は、フィブリノーゲンを含まなくなる。
【０１１２】
（実施例２３）
そのチューブ壁を通って水を拡散することによる洗浄工程に、５％のグリセロールを含有する水溶液を使用したこと以外は、実施例２２を繰り返した。
【０１１３】
（実施例２４）
そのチューブ壁を通って水を拡散することによる洗浄工程に、５％のグリセロールおよび１％のアルブミンを含有する水溶液を使用したこと以外は、実施例２２を繰り返した。
【０１１４】
上記実施例では、人血に由来のフィブリノーゲンおよびトロンビンを使用することにより、フィブリン層を作製した。これらは、市場で入手できる製品（例えば、ＣＲＹＯＬＩＴＥ製の生体接着剤、例えば、製品ＦｉｂＲｘ、またはＶＩＴＥＸ（製品ＶＩＧｕａｒｄ））、または組換えフィブリノーゲンで置き換えることができた。
【０１１５】
本発明による要素または膜、例えば、実施例１〜１３の膜は、いくつかの用途で、例えば、ＥＰ ９６９１０８６７で記述されているように、バイオリアクター用の膜として、フィルター用の膜として、移植片（例えば、人工臓器）として、人工静脈として、人工動脈として、抗血栓物質として、心臓弁として、人工皮膚として、使用され得る；この膜はまた、試験キットまたは設備などの製造に適用され得る。
【０１１６】
グリセロールを添加せずに作製した凍結乾燥フィブリンネットワーク（実施例３）、凍結乾燥の前後で約５％のグリセロールを含有する溶液で作製したフィブリンネットワーク（実施例４）、および約１０％のグリセロールを含有する溶液で凍結乾燥して作製したフィブリンネットワーク（実施例６）に付着した細胞の形態を決定するために、多くの試験を実行した。
【０１１７】
これらの試験において、ダルベッコ変性イーグル培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）から、培養液を調製した。このＤＭＥＭ培地に、以下の成分（本明細書中において、重量％で示す）を添加した。
【０１１８】
２０％のＨＡＭ’Ｓ Ｆ１２（培地）；
１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）；
１％の非必須アミノ酸（すなわち、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン）；
１％のピルビン酸ナトリウム；
１％のペニシリウムストレプトマイシン；および
１％のＬ−グルタミン。
【０１１９】
この培地は、本明細書中以下にて、「調製ＤＭＥＭ培地」と呼ぶ。
【０１２０】
これらの試験で使用した細胞を、以下のようにして単離した：
ウシを屠殺した直後、ウシの大動脈を回収した。その大動脈の脂肪組織を分離した後、側副動脈を結紮した。その大動脈の内面を、３７℃で、１５分間にわたって、２５ＩＵ／ｍｌのコラゲナーゼを含有する溶液で処理した。この処理で解離した細胞を回収し、バリンＤ、１０％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢを含有するＤＭＥＭ培地に入れた。この培地を、２４時間後、再生した。
【０１２１】
２日後、この培養液を、７０％ＤＭＥＭ培地（これは、２０％のＨａｍ’ｓ Ｆ１２、１０％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢを含有する）に入れた。
【０１２２】
一旦、これらの細胞がコンフルーエンスに達すると、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の存在下でトリプリン（１ｍｇ／ｍｌ）の助けを借りて、回収した。
【０１２３】
次いで、それらを、「調製ＤＭＥＭ培地」で成長させる。
【０１２４】
これらの細胞をフィブリンネットワークを備えた支持体を含むペトリ皿に加える前に、これらの細胞をこのＤＭＥＭ培地（これは、トリプシン−ＥＤＴＡ培地（５倍濃縮）で３７℃で５分間にわたるインキュベーションにより、調製した）から回収し、次いで、１０％のＦＣＳを含有する培地１０ｍｌを加えて、その酵素の作用を停止した。トリパンブルーでマーキングした後、Ｂｕｒｋｅｒチャンバ中の細胞を数えることにより、顕微鏡の助けを借りて、この培地中の細胞数を測定した。この方法は、本明細書中以下、顕微鏡計数法と称する。得られた細胞数は、第一溶液に対して、２５，０００個の細胞／ｍｌであり、そして第二溶液に対して、１２５，０００個の細胞／ｍｌである。
【０１２５】
この培地（これは、それぞれ、５０，０００個の細胞および２５０，０００個の細胞を含有する）２ｍｌを、異なるペトリ皿（これは、それぞれ、グリセロールの添加なしで調製した凍結乾燥フィブリンネットワーク（皿１）、凍結乾燥前（皿２）および凍結乾燥後（皿３）に約５％のグリセロール（実施例４）を含有する溶液で調製したフィブリンネットワーク、および凍結乾燥と共に約１０％のグリセロール（実施例５）を含有する溶液で調製したフィブリンネットワーク（皿４）を含有する）に別々に加えた。
【０１２６】
ペトリ皿中の細胞の培養は、３７℃で、第一バッチの皿（５０，０００個の細胞を含有する皿）に対して、２時間行い、そして第二バッチの皿（２５０，０００個の細胞を含有する皿）に対して、１１日間行った。その培養時間（２時間または１１日間のいずれか）が終了したとき、ペトリ皿中のフィブリンネットワークを、２．５％グルタルアルデヒド溶液によって固定した。図１５、１６、１７および１８は、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の皿１、２、３および４のフィブリン層の上面図である。これらの図は、２時間の培養後、異なる皿上でのフィブリンネットワーク上の良好な細胞付着を示している。これらの細胞を、規則的かつ平らな配列で、その上面に分散する。
【０１２７】
３７℃で１１日間培養した皿について、その培養時間中において、皿の視覚検査を実行した。この検査は、８日間の培養後、皿１（グリセロールなしのフィブリンネットワーク）のネットワークのフィブリン分解が現れたのに対して、８日間の培養後、皿２、３および４のネットワークについては、フィブリン分解は認められなかったことを示した。
【０１２８】
１１日間の培養後、皿１、２および３について、生細胞数を数えた。この生細胞数は、酵素キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＷＳＴ−１（カタログ番号１６４４８０７−バッチ番号１４８９０８００）によって測定した。この方法の原理は、この培地に加えたテトラゾリウム塩がミトコンドリアの酵素（スクシネート−テトラゾリウム還元酵素）によりホルマザンに開裂することに基づく。この還元は、生細胞でのみ起こる。代謝的に活性な細胞により産生したホルマザンを、走査型分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）により、定量する。この定量は、ペトリ皿１、２および３の培地を新鮮培地（これは、ＷＳＴ−１酵素キットの溶液１００μｌを含有する）１ｍｌで置き換えることにより、行った。７％のＣＯ2を含有する雰囲気下にて３７℃で４時間のインキュベーション後、分光器での分析用に、各皿の着色溶液１００μｌを集めた。各溶液に対して、４５０ｎｍでの吸光度ピークと６５５ｎｍでの吸光度ピークとの間の差を測定した。皿２および３に対する吸光度差は、皿１に対するものよりもずっと顕著である（４０〜５０％高い）ことが分かった。皿１、２および３に対する吸光度差は、その中に細胞を有しない試料の吸光度差よりも少なくとも４倍高かった。この分析により、皿１、２および３中の細胞は、生存していること、さらに、グリセロールの存在は、良好な細胞生存度を保証することが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリンをベースにした層を備えた要素に関し、該要素は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）疎水性または実質的に疎水性の支持体であって、該支持体は、厚さ０．１〜５ｍｍの多孔性部分を有し、該細孔は、その厚さを横切って伸長していて、５〜１００μｍの結節間隔を有し、該多孔性部分の１面は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンをベースにした化合物で処理されている；および（ｂ）該支持体の該処理面を覆っているフィブリンをベースにした層。
【背景技術】
【０００２】
このような要素は、特許文献１および特許文献２から公知である。 これらの公知要素は、単に、フィブリノーゲンおよびトロンビンを含有する溶液に支持体を浸けることにより、またはこのような溶液を多孔性支持体に通して押すことにより、作製される。これらの公知要素は、簡単な浸漬により作製するとき、実質的に小型のフィブリン層を有し、その支持体細孔内には殆どまたは全くフィブリンを有しないか、またはフィブリンが直径の大きい細孔を簡単に通るので、直径の大きい細孔内にはフィブリンを有し直径の小さい細孔内にはフィブリンを有しない。このように、フィブリンが直径の大きい細孔を簡単に通ることから、均質性および／または均一性が欠けることになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９６／０７４４４号
【特許文献２】米国特許第５２９８２５５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの支持体細孔において、フィブリンの存在に関して、このように均質性または均一性が欠けていると、ある場合には、細胞の付着に影響を与えることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、これらの欠点をなくすことを目的としており、本明細書の第一段落で記述したような要素に関し、該要素は、該フィブリンベース層が該処理面において実質的に均一かつ均質であることにより、特徴付けられる。本発明によるフィブリン層は、フィブリノーゲンがなく、このフィブリン層と結合していないことにより、特徴付けられる。このフィブリン層上にフィブリノーゲンがないことは、その電気泳動図でγバンドがないことにより、検出され得る。このフィブリン層でのフィブリノーゲンの欠如は、フィブリン層を形成するように反応していないいずれのフィブリノーゲンも、この多孔性支持体を通って吸引されるという事実により、起こる。それゆえ、本発明による要素は、このフィブリン層と支持体との接触面において、実質的に、好ましくは、反応していないフィブリノーゲンが存在していないということにより、特徴付けられる。例えば、本発明による要素のフィブリン層は、フィブリンネットワークを形成するように反応していないフィブリノーゲンを、２重量％未満、好ましくは、１重量％未満、特に、０．５重量％未満、さらに特定すると、０．１重量％未満で含有する。
【０００６】
有利には、このフィブリン層、および少なくとも、１０μｍの厚さを横切って伸長している支持体層は、このフィブリン層の重量に対して、１重量％未満、有利には、０．５重量％未満、好ましくは、０．１重量％未満の未反応フィブリノーゲンを含有する。好ましくは、フィブリンは、この支持体の処理多孔性部分の厚さを横切って、該処理面から少なくとも２μｍの深さまで伸長しており、両方とも、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔および２０μｍより大きい平均直径を有する細孔を通る。
【０００７】
特定の実施形態に従って、この支持体の多孔性部分は、この処理面の全面にわたって、実質的に均質かつ均一な多孔度を有し、一部のフィブリンは、この支持体の多孔性部分の厚さを横切って、少なくとも１０μｍの深さまで、均質かつ均一に伸長している。可能な実施形態によれば、この多孔性支持体は、このフィブリン層と接触している面から１０μｍより離れた層で、特に、２０μｍの深さまで、フィブリノーゲンを含有する。
【０００８】
このフィブリンネットワークが既に形成されたとき、乾燥したフィブリン層を再浸漬する際に、このネットワークで新たなフィブリン結合（このような結合は、このネットワークの胞（ａｌｖｅｏｌｉ）または一部の胞のサイズを小さくする）が形成されるのを防止するために、好ましくは、（未だに反応していない）遊離のフィブリノーゲンが存在しないようにしなければならない。
【０００９】
本発明の１実施形態によれば、このネットワークに付着したフィブリンの一部は、この支持体の処理多孔性部分の厚さを横切って、該処理面から少なくとも２μｍの深さまで伸長しており、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔および２０μｍより大きい平均直径を有する細孔を通る。この支持体は、任意の疎水性または実質的に疎水性の物質から製造され得るものの、それは、特に、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレートまたはポリテトラフルオロエチレンから製造され、該物質は、有利には、特に二軸方向に延伸されている。
【００１０】
疎水性または実質的に疎水性の物質との用語は、本明細書中にて、３０〜５０°のバイアスを有する物質を同定するのに使用され、このバイアスは、ＡＳＴＭ
Ｄ ２５７８−８４法で測定される。
【００１１】
有利には、この支持体の多孔性部分は、この処理面の全面にわたって、実質的に均質かつ均一な多孔度を有し、すなわち、表面単位による細孔の分布または数は、この多孔性部分に対して、実質的に均一である。例えば、ある多孔性部分では、この多孔性部分１ｃｍ2の面積における１０μｍよりも大きい直径を有する細孔は、多孔性部分の各ｃｍ2に対して、１０μｍよりも大きい直径を有する細孔の平均体積の０．８〜１．２倍、好ましくは、０．９〜１．１倍で変わる。
【００１２】
１実施形態によれば、このフィブリン層のうち、少なくとも、この多孔性支持体と接触している面とは反対の面は、安定化されている。特に、該フィブリンベース層は、少なくとも部分的に架橋されて、その間で開口部を有する隣接胞のネットワークを形成する。この層は、有利には、水溶性でない程度に充分に架橋されている。有利な１実施形態の詳細によれば、該層は、細胞および／またはタンパク質、特に、細胞−フィブリン結合を媒介するタンパク質（フィブロネクチンなど）を備えている。
【００１３】
このフィブリン層の厚さは、水和または再水和したとき、好ましい１実施形態の特徴によれば、１００μｍより大きく、１５０μｍより大きくさえあり得るが、この支持体の多孔性部分を覆う架橋フィブリンベース層（水和した状態または水和後の状態）は、０．５〜１００μｍ厚、有利には、２．５〜５０μｍ厚、好ましくは、５〜２０μｍ厚であり、架橋したフィブリンベース分子または結合間には、胞が形成されており、該胞は、５〜２５μｍ3の体積を有し、該房（ｃｈａｍｂｅｒ）の平均厚さまたは高さは、１〜５μｍ、特に、１〜３μｍである。
【００１４】
特定の１実施形態の詳細によれば、該フィブリン層で覆われた支持体部分の細孔は、水溶性または実質的に水溶性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われた内面を有する。例えば、該フィブリン層で覆われた支持体部分の細孔は、フィブリノーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、バイブロネクチン（ｖｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）またはそれらの混合物により、覆われている。特に、この処理面とは反対の支持体面は、水溶性または実質的に水溶性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われている。このような被覆は、この支持体のうち処理面と反対の面と接触している組織の癒着を向上させるのに、有利である。
【００１５】
有利な特徴によれば、少なくとも、この支持体の多孔性部分は、少なくとも部分的に、水溶性または水混和性の極性添加剤で覆われている。このような添加剤は、好ましくは、タンパク質に対して非変性で生体適合性の構造である。このような添加剤には、グリセロール、糖（スクロース、マンニトール、ソルビトールなど）が挙げられ得る。このような添加剤は、特に、水に溶解性であるかまたは少なくとも混和性であり、特に、大気圧での水の凍結温度と比較して、凍結温度を下げることができる水溶性または水混和性添加剤から選択される。
【００１６】
好ましい実施形態によれば、この要素は、乾燥しており、例えば、０．５重量％未満、または、さらに０．１重量％未満の水分を有する。
【００１７】
有利な実施形態によれば、このフィブリン層は、フィブロネクチンの存在下にて、架橋される。このフィブリン層中の架橋フィブロネクチン含量は、有利には、この架橋層中のフィブリンおよびフィブロネクチンの重量の０．５〜１５％、好ましくは、１〜１０％である。この含量は、この層中のフィブリンおよびフィブロネクチン結合の重量と比較した、この層中のフィブロネクチン結合の重量に対応している。
【００１８】
有利な実施形態の詳細によれば、このフィブリン層は、カルシウム、特に、カルシウムおよび塩素、さらに正確には、塩化カルシウムを含有する。このフィブリン層のカルシウム含量は、フィブリン層の体積単位（ｃｍ3）あたりのカルシウムのμｇで表わされるが、有利には、１〜１００μｇ／ｃｍ3、好ましくは、５〜９０μｇ／ｃｍ3、特に、１０〜５０μｇ／ｃｍ3である。このフィブリン層中の塩素含量は、有利には、１．５〜２００μｇ／ｃｍ3、好ましくは、８〜１７０μｇ／ｃｍ3、特に、１６〜１００μｇ／ｃｍ3である。カルシウムが塩化カルシウムの形態のとき、このフィブリン層中の塩化カルシウムの含量（これは、フィブリン層の体積単位（ｃｍ3）あたりの塩化カルシウムのμｇで表わされる）は、有利には、２．５〜３００μｇ／ｃｍ3、好ましくは、１３〜２６０μｇ／ｃｍ3、特に、２６〜１５０μｇ／ｃｍ3である。
【００１９】
有利には、このフィブリン層は、実質的に、塩化カルシウム以外のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を含有しない。
【００２０】
好ましくは、塩化カルシウムとは異なるアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩の含量は、このフィブリン層中の塩化カルシウムの含量の少なくとも１０分の１、好ましくは、２０分の１、特に、５０分の１である。
【００２１】
この支持体は、それが何であれ、多孔性支持体であり得るものの、この要素支持体は、好ましくは、生体適合性および／または生体分解性支持体である。
【００２２】
本発明に従った要素の１実施形態の特定の詳細によれば、この要素は、２層以上の重なり合ったフィブリン層を有する。有利には、これらの層は、異なる平均体積を備えた胞を有する。特に、この多孔性支持体と接触してこのフィブリン層を覆っているフィブリン層は、多孔性支持体と接触したフィブリン層の胞の平均体積と比較して、小さい平均体積を備えた胞を有する。例えば、この支持体と接触してフィブリン層を覆っているフィブリン層中の胞の平均体積は、この支持体と接触したフィブリン層中の胞の平均体積の０．５倍未満である。１実施形態によれば、この支持体と接触してこのフィブリン層を覆っているフィブリン層は、部分的に、この支持体と接触して該フィブリン層を貫通する。大きい胞を備えたフィブリン層での小さい胞を備えたフィブリン層の貫通は、有利には、小さい胞を備えたフィブリン層が、大きい胞を備えたフィブリン層の厚さの少なくとも５０％で貫通するように、しかし、好ましくは、その全厚未満で貫通するようにされる。
【００２３】
本発明の要素の層のフィブリンは、その多孔性基板中に存在するフィブリンと同様に、実質的に変性しておらず、好ましくは、全く変性していない。
【００２４】
本発明はまた、本発明に従って要素を作製する方法に関する。
【００２５】
この方法は、以下を提供する：
多孔性支持体の第一面の少なくとも多孔質部分は、フィブリンまたはフィブリノーゲンを含有する水溶液か、またはフィブリノーゲン含有化合物の１種以上のフィブリンベースと接触され、
この支持体の多孔性部分のうち該第一面と反対の面は、均質かつ均一に、該多孔性部分を少なくとも部分的に通って溶液を吸引する吸引力を受け、それにより、この多孔性部分に対して均質かつ均一に、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層を確実に堆積し、そして多孔性支持体の多孔性部分を通って、少なくとも、この溶液の水を確実に拡散するだけでなく、多孔性支持体を通って、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を確実に貫通させる。このような吸引により、特に、もし、このフィブリン層を水または水溶液で洗浄したなら、実質的にフィブリノーゲンを含まないフィブリン層が得られる。有利には、この多孔性物質を通るこの溶液の吸引は、少なくとも、フィブリンの架橋中において、好ましくは、少なくとも、このフィブリノーゲン含有物質の反応中およびフィブリンの架橋中において、行われる。この多孔性物質中に存在しているフィブリンは、従って、有利には、この多孔性物質の該第一面を覆っているフィブリン層と架橋される。
【００２６】
本発明による方法は、先に記述したように、それと適合する要素を提供する。
【００２７】
吸引によって、そのネットワークに付着されたフィブリンは、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔および２０μｍより大きい平均直径を有する細孔の両方において、少なくとも２μｍの深さまで、この多孔性支持体を貫通するように、配列されている。
【００２８】
有利には、この支持体のうち該第一面と反対の面は、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、その多孔性部分の２面間において、少なくとも０．３×１０5Ｐａの圧力差が生じる。好ましくは、この支持体のうち該第一面と反対の面は、０．５×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、その多孔性部分の２面間において、０．４×１０5Ｐａ以下の圧力差が生じる。好ましい実施形態によれば、この支持体の多孔性部分の厚さを横切ってフィブリンまたはフィブリノーゲンを効率的に通過させつつ、第一面と反対の支持体面は、断続的に、０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第一圧力を受け、第一圧力は、第二圧力よりも少なくとも５％高い。該第一面と反対の面において正圧または負圧を変える代わりに、該第一面に加える圧力を僅かに変えることも可能である。
【００２９】
有利には、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、そして０〜１００℃の温度、好ましくは、１５〜６０℃の温度、特に、２５〜４０℃の温度に晒される。
【００３０】
本発明による方法の変形に従って、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、逆浸透を生じるように選択された溶液を受け、これによって少なくともこの溶液の水は、この支持体の多孔性部分を通って、この第一面と接触して、拡散される。このような拡散は、それにより、この多孔性支持体の厚さを少なくとも部分的に通るフィブリンまたはフィブリノーゲンの実質的に均一かつ規則的な通過を保証する。
【００３１】
本発明の方法を実施するために、５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液、特に、５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質および１ｍｌあたり０．０１〜１０単位のトロンビンを含有する溶液、好ましくは、５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、ＸＩＩＩ因子、および１ｍｌあたり０．０１〜２単位、好ましくは０．０５〜１単位のトロンビンを含有する溶液が使用される。有利な実施形態によれば、この溶液は、１ｍｌあたり０．５単位未満のトロンビンを含有する。
【００３２】
１ｍｌあたり０．１〜１０単位のＸＩＩＩ因子を含有する溶液を使っても、有利であることが認められている。フィブリン溶解を少なくするかまたは遅らすために、１〜４０ミリモルのＣａＣｌ2／ｍｌ、特に１〜２０ミリモルのＣａＣｌ2／ｍｌを含有する溶液からも、有利な結果が得られている。それゆえ、例えば、２０ミリモルのＣａＣｌ2／ｍｌを使って調製したフィブリン層に対しては、このフィブリン層を調製した１週間後、フィブリノーゲンは、視覚的に検出されなかった。
【００３３】
このフィブリンネットワークの形成で使用される少量のトロンビンは、この多孔性支持体を貫通できる多量のフィブリノーゲンに対応していることが認められる。これにもかかわらず、本発明による方法は、特に、この支持体のうちこのフィブリン層と接触している面において、実質的にフィブリノーゲンを含まないフィブリン層を提供する。
【００３４】
本発明による方法の特徴に従って、第一工程中において、多孔性支持体の第一面の少なくとも一部は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液と接触して配置され、この間、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、均質かつ均一に吸引力を受けて、それにより、この多孔性支持体の厚さを横切って、少なくともこの溶液の水を確実に拡散し、そして第一面の該多孔性部分に対して均質かつ均一に、少なくとも２μｍの深さまで、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を確実に貫通させ、そして第二工程中において、このフィブリンおよび／またはフィブリノーゲン層が安定化される、
可能な実施形態に従って、この第一面の該部分と、移動している水溶液との間で、接触が生じる。
【００３５】
有利には、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液はまた、極性有機添加剤を含有する。このような極性有機添加剤を使用すると、フィブリンネットワーク中の繊維厚さを制御できることが判明した。さらに、このような有機添加剤が存在することにより、また、この乾燥工程中でのフィブリンベース層の保護において有利であり、これは、おそらく、洗浄後に生じ得る。この乾燥操作は、有利には、−３０℃〜−１００℃の温度、好ましくは、−４０℃〜−７０℃の温度で、少なくとも部分的に、凍結乾燥により行われる。例えば、この乾燥操作は、幾つかの工程、すなわち、（例えば、３０〜７０℃の温度で）温度を上げるかまたはこの支持体の多孔性部分と接触したフィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質溶液の除去後に真空を形成するための第一乾燥工程、および凍結乾燥のための第二乾燥工程で、実行される。
【００３６】
乾燥操作は、有利には、水、水溶液（例えば、グリセリンのような極性有機添加剤を（例えば、約１〜２０重量％、特に、約５〜１０重量％で）含有する水溶液）によって、１つ以上の洗浄工程後、実行される。特定の洗浄操作は、このフィブリン層を、水溶液（特に、グリセロールを（例えば、１〜２０重量％、特に、５〜１０重量％）で含有する水溶液）と接触して、この多孔性支持体と一体化すること、その後、この支持体の他の面を吸引力に晒して、この多孔性支持体を通って、この溶液を吸引することからなる。このような洗浄操作により、フィブリノーゲンを含まない多孔性支持体が得られる。この操作は、本発明とは対応していないフィブリン層を備えた支持体上で実行され得、それにより、この多孔性支持体をこのフィブリノーゲン含有溶液と単に接触させることにより得た生成物は、本発明による要素に変えることが可能となる。
【００３７】
本発明によりフィブリン層を形成する方法で使用されるフィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質の溶液は、好ましくは、０〜２０％、特に、３〜１５％、さらに特定すると、５〜１０％の該極性有機添加剤を含有する。この添加剤は、有利には、グリセロール、糖（マンニトール、ソルビトール、スクロース、グルコースなど）であり得る。本発明による方法において、約５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、約０．０１〜１０単位／ｍｌのトロンビンおよび５〜１０％のグリセロールを含有する溶液を使用するとき、フィブリン繊維のネットワークが得られ、ここで、その胞のサイズは、本発明による方法において、約５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、約０．０１〜１０単位／ｍｌのトロンビン（グリセロールなし）を含有する溶液を使って得られたネットワークのものと類似している。それにもかかわらず、グリセロールを使用して得られたネットワーク中の繊維サイズは、より小さく、それにより、グリセロールを用いると、この溶液中でフィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をうまく使用できた。
【００３８】
フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質の溶液のｐＨは、有利には、５〜８．５、好ましくは、５．５〜８、特に、６〜７．５である。この溶液のｐＨは、鉱物起源または有機起源の強酸（ＨＣｌ）または弱酸（クエン酸など）を添加することにより、緩衝溶液（例えば、トリス緩衝液）によって制御され得る。
【００３９】
この溶液はまた、有利には、少なくとも、水溶性タンパク質、特に、アルブミンを含有する。
【００４０】
特定の１実施形態によれば、少なくとも、このフィブリンまたはフィブリノーゲン化合物ベース層の堆積の一部に対して、第一面と接触した溶液中のフィブリンまたはフィブリノーゲン化合物の濃度は、この支持体を通って実質的に一定の水拡散を保証するために、制御される。
【００４１】
本発明による方法では、生体適合性または生体分解性多孔性支持体が使用される。
【００４２】
特定の実施形態によれば、それから得られる利点は、その開始から、この多孔性支持体の厚さを通る実質的に均一な水拡散を保証するように得られ、この多孔性部分は、このフィブリンまたはフィブリノーゲン含有溶液が該多孔性部分と接触する前に、湿潤剤および／または水溶性タンパク質および／または極性有機添加剤を有利に含有する水溶液で処理される。
【００４３】
本発明によれば、この多孔性支持体はまた、引き続いて、数層のフィブリン層を堆積するために、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液で処理され得る。本発明によれば、この多孔性支持体は、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有するがトロンビンを含有しない溶液で処理され得、次いで、前処理された支持体は、トロンビンを含有する溶液で処理され得る。
【００４４】
本発明はまた、本発明による要素からなる濾過膜を含有するフィルター、本発明による要素からなる膜を含有するバイオリアクター、本発明による要素からなる移植片、および本発明による要素から製造した人工皮膚に関する。
【００４５】
フィブリン（薄い繊維）をうまく使用するため、およびフィブリンネットワークに付着した細胞の良好な生存度を保証するために、グリセロールは、胞のサイズを制御するのに有用であることが分かったので、本発明の他の目的は、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした化合物であり、該化合物は、乾燥発泡体または乾燥発泡体粒子の形状を有し、０．０５〜１０重量％の水溶性または水混和性の極性有機添加剤を含有し、該発泡体は、房の少なくとも５０容量％からなる多孔度または５〜２５μｍ2の体積空洞（ｖｏｌｕｍｅ ｃａｖｉｔｉｅｓ）を有する。有利には、フィブリンの少なくとも９０重量％は、架橋形状である。おそらく、この化合物はまた、１種以上のタンパク質および／または１種以上の活性物質を含有する。極性添加剤のうちで、グリセリンが好ましいが、他の添加剤（例えば、糖、スクロース、グルコース、マンニトールなど）もまた使用され得る。その水含量は、有利には、０．５重量％より低い。実際、この発泡体または架橋フィブリンネットワークは、少なくとも部分的に、水溶性または水混和性の極性有機添加剤で覆われている。
【００４６】
この化合物の調製は、ある方法で行われ得、ここで、おそらく前乾燥工程後、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンの水溶液（これはまた、水溶性または水混和性の極性有機添加剤を含有する）は、凍結乾燥により乾燥され、該溶液の有機溶媒含量は、それを０．５重量％未満で含有する化合物を得るために、０．０５〜１０重量％である。有利には、凍結乾燥による乾燥操作は、−４０〜−１００℃、好ましくは、−５０℃〜−７５℃の温度で、行われる。特に、凍結乾燥は、３段階で実行され、各段階は、この化合物または溶液を−４０〜−１００℃まで温度低下させることに続いて、０．４ｂａｒ（０．４×１０5Ｐａ）未満まで圧力低下させることを包含する。例えば、第一段階では、圧力は、０．２〜０．４×１０5Ｐａまで低下され、最終段階では、圧力は、０．２×１０5Ｐａ未満まで低下される。
【００４７】
本発明はまた、フィブリノーゲンを含まないフィブリン層（特に、共にフィブリノーゲンを含まない多孔性支持体およびフィブリン層）を得るような様式で、このフィブリン層から未結合フィブリノーゲン（特に、この多孔性支持体で見られるフィブリノーゲン）を抽出させる方法に関する。この方法は、以下を提供する：
この多孔性支持体の第一面上で付着されたフィブリン層の少なくとも一部は、極性有機添加剤を有利に含有する水溶液と接触され、そして
この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、均質かつ均一に、該多孔性部分を少なくとも部分的に通ってこの溶液を吸引する吸引力を受けて、それにより、該多孔性支持体に対して均質かつ均一に、この支持体の該第一面付近のフィブリノーゲンを確実に除去する。この吸引によって、少なくとも、この溶液の水は、この多孔性支持体の多孔性部分の厚さを通って拡散される。この方法が充分な時間にわたって適用されるなら、この多孔性部分の厚さを通って拡散される水の量は、多孔性部分の細孔中のフィブリノーゲンを除去または抽出するのに充分であり得る。従って、この吸引により、実質的にフィブリノーゲンを含まないフィブリン層が得られるか、またはフィブリノーゲンを含まない多孔性支持体およびフィブリン層さえ得られる。
【００４８】
１種以上の添加剤（例えば、１種以上の水溶性タンパク質、１種以上の薬剤など）を含有する水溶液を使用するとき、この洗浄工程により、この多孔性支持体に一定量の該添加剤を導入できるようになり、またはこの支持体のうちフィブリン層と接触していない面を該添加剤で被覆できるようになる。
【００４９】
溶液の吸引によって、水は、この多孔性支持体を貫通できるようになり、その結果、例えば、第一面（このフィブリン層を備えた面）から少なくとも２μｍ、有利には、少なくとも１０μｍ、好ましくは、少なくとも２０μｍの深さで、少なくとも、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔は、フィブリノーゲンを含まなくなる。
【００５０】
有利には、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、０．８×１０5 Ｐａ未満の圧力を受け、その多孔性部分の２面間において、少なくとも０．３×１０5Ｐａの圧力差が生じる。好ましくは、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、０．５×１０5Ｐａ未満、さらに好ましくは、０．４×１０5Ｐａ以下の圧力を受ける。好ましい実施形態によれば、この支持体の多孔性部分の厚さを横切って水を効率的に通過させつつ、第一面と反対の多孔性支持体面は、断続的に、０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第一圧力を受け、そして０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第二圧力を受け、第一圧力は、第二圧力よりも少なくとも５％高い。該第一面と反対の面において正圧または負圧を変える代わりに、該第一面に加える圧力を僅かに変えることも可能である。
【００５１】
有利には、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、そして０〜１００℃の温度、好ましくは、１５〜６０℃の温度、特に、２５〜４０℃の温度に晒される。
【００５２】
本発明による方法の変形に従って、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面は、逆浸透を生じるように選択された溶液を受け、少なくともこの溶液の水は、この支持体の多孔性部分を通って、この第一面と接触して、拡散を引き起こす。このような拡散は、それにより、この多孔性支持体の厚さを少なくとも部分的に通る水の実質的に均一かつ規則的な通過を保証する。
【００５３】
本発明のさらに他の目的は、生体吸収性物質または吸収性重合体（特に、ポリ乳酸重合体および／またはポリグリコール重合体および／または生体高分子）だけでなく構造タンパク質および多糖類から製造された層で覆われた多孔性支持体を作製する方法であり、該構造タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンおよびフィブリン、およびヒトまたは動物の組織を形成する他のタンパク質だけでなく、組換えタンパク質を含む群から選択される。 この方法により、水溶液または水性懸濁液が調製され、これは、１種以上の重合体および／または生体高分子および／または該重合体および／または生体高分子をその場で形成する物質を含有する。この溶液または懸濁液は、この多孔性支持体の少なくとも１つの異なる面（有利には、第一面と反対の面）から該溶液または懸濁液の水の少なくとも一部を吸引しつつ、多孔性支持体の第一面と接触される。この吸引力により、水および有利に吸収可能な生体高分子または重合体は、この多孔性支持体で拡散される。このような拡散を保証するために、この多孔性支持体のうち該第一面と反対の面（この溶液または懸濁液と接触している面）は、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、この間、この多孔性支持体の２つの面間において、少なくとも０．３×１０5Ｐａの圧力差が生じる。好ましくは、該第一面と反対の支持体面は、０．５×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の圧力を受ける。好ましい実施形態によれば、この支持体の多孔性部分の厚さを通って水を効率的に通過させつつ、この支持体のうち第一面と反対の面は、断続的に、０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第一圧力を受け、そして０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第二圧力を受け、第一圧力は、第二圧力よりも少なくとも５％高い。該第一面と反対の面において正圧または負圧を変える代わりに、該第一面に加える圧力を僅かに変えることも可能である。この重合体溶液または懸濁液と接触する面とは反対の該面はまた、逆浸透を生じるように選択された溶液の影響を受け得、少なくとも、この支持体の多孔性部分を通って第一面と接触するこの溶液の水の拡散を引き起こす。このような拡散は、それにより、この多孔性支持体の厚さを少なくとも部分的に通る水の実質的に均一かつ規則的な通過を保証する。この多孔性支持体を通って拡散している溶液は、有利には、２０〜７０℃、特に、３０〜５０℃の温度である。一旦、吸収性重合体または生体高分子が形成されると、この層は、有利には、凍結乾燥で乾燥される。凍結乾燥は、有利には、このフィブリン層に関して記述したように、行われる。もし、乾燥工程を凍結乾燥で実行するなら、この層を形成するのに使用する溶液は、有利には、例えば、約１〜１５％、特に、５〜１０％で、極性添加剤（特に、グリセロール）を含有する。
【００５４】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層を備えた要素であって、該要素は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）疎水性または実質的に疎水性の支持体であって、該支持体は、厚さ０．１〜５ｍｍの多孔性部分を有し、該細孔は、その厚さを横切って伸長していて、５〜１００μｍの結節間隔を有し、該多孔性部分の１面は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質をベースにした化合物で処理されている；および（ｂ）該支持体の該処理面を覆っているフィブリンベース層：ここで、該フィブリンベース層は、該処理面上において、実質的に均一かつ均質であり、該フィブリン層と、該支持体のうち少なくとも該フィブリン層と接触している面とは、実質的にフィブリンノーゲンを含まない、
要素。
（項目２） 前記フィブリン層と、少なくとも、１０μｍの厚さを横切って伸長している支持体とが、該フィブリン層の重量に対して、１重量％未満、有利には、０．５重量％未満、好ましくは、０．１重量％未満の未反応フィブリノーゲンを含有する、項目１に記載の要素。
（項目３） フィブリンが、前記支持体の前記処理多孔性部分の厚さを横切って、前記処理面から少なくとも２μｍの深さまで伸長しており、両方とも、１０〜２０μｍの平均直径を有する前記細孔および２０μｍより大きい平均直径を有する前記細孔を通る、項目１または２に記載の要素。
（項目４） 前記支持体の前記多孔性部分が、前記処理面の全面にわたって、実質的に均質かつ均一な多孔度を有し、一部のフィブリンが、該支持体の該多孔性部分の厚さを横切って、少なくとも１０μｍの深さまで、均質かつ均一に伸長している、項目１〜３のいずれかの項目に記載の要素。
（項目５） 前記多孔性支持体が、前記フィブリン層と接触している前記面から１０μｍより離れた層に、フィブリノーゲンを含有する、項目２に記載の要素。
（項目６） フィブリノーゲンが、前記支持体の厚さを横切って、少なくとも２０μｍの深さまで伸長している、項目５に記載の要素。
（項目７） 前記フィブリン層のうち、少なくとも、前記多孔性支持体と接触している面とは反対の面が安定化されている、項目１〜６のいずれかの項目に記載の要素。
（項目８） 前記フィブリンベース層が、少なくとも部分的に架橋されて、隣接胞のネットワークを形成する、項目７に記載の要素。
（項目９） 前記層が、細胞および／またはタンパク質、特に、細胞−フィブリン結合を媒介するタンパク質を備えている、項目１〜８のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１０） 前記支持体の前記多孔性部分を覆っている前記架橋フィブリンベース層が、乾燥状態で測定したとき、０．５〜１００μｍの厚さ、好ましくは、２．５〜５０μｍの厚さであり、該架橋フィブリンベース分子または結合間、または繊維間で、胞が形成され、該胞が、５〜２５μｍ3の体積を有し、該胞の平均厚さまたは高さが、１〜５μｍ、特に、１〜３μｍである、項目１〜９のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１１） 前記フィブリン層で覆われた前記支持体部分の前記細孔が、水溶性または実質的に水溶性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われた内面を有する、項目１〜１０のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１２） 前記処理面とは反対の前記支持体面が、水溶性または実質的に水溶性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われている、項目１１に記載の要素。
（項目１３） 前記支持体の前記多孔性部分の少なくとも前記細孔が、水溶性または水混和性の極性有機添加剤で覆われている、項目１〜１２のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１４） 前記架橋フィブリン繊維のネットワークが、水溶性または水混和性極性添加剤、好ましくは、グリセロール、糖およびそれらの混合物を含む群から選択される添加剤で少なくとも部分的に覆われている、そして／または該添加剤を含む、項目１３に記載の要素。
（項目１５） ０．５重量％未満、好ましくは、０．１重量％未満の水分含量を有する、項目１〜１４のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１６） フィブロネクチンが、前記フィブリン層に付着されており、該フィブロネクチン含量が、該層中のフィブリンおよびフィブロネクチンの重量と比較して、０．５〜１５％である、項目１〜１５のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１７） 前記フィブリン層が、該フィブリン層の体積１ｃｍ3あたり、１〜１００μｇ、好ましくは、１〜５０μｇのオーダーのカルシウムを含有する、項目１〜１６のいずれかの項目に記載の要素。
（項目１８） カルシウムが、塩化カルシウムの形態をとっている、項目１４に記載の要素。
（項目１９） 前記支持体が、２層の重なり合ったフィブリン層を有し、該支持体と接触している層が、該支持体と接触している該フィブリン層を覆う層の胞と比較して、大きい体積の胞を有する、項目１〜１８のいずれかの項目に記載の要素。
（項目２０） 前記支持体が、生体適合性および／または生体分解性である、項目１〜１９のいずれかの項目に記載の要素。
（項目２１） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素を作製する方法であって、ここで、多孔性支持体の第一面の少なくとも１つの多孔質部分は、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有する水溶液と接触して配置されており、ここで、該支持体の該多孔性部分のうち該第一面と反対の面は、均質かつ均一に、該多孔性部分を少なくとも部分的に通って該溶液を吸引する吸引力を受け、それにより、該多孔性部分に対して均質かつ均一に、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層を確実に堆積し、そして該多孔性支持体の該多孔性部分を通って、少なくとも、該溶液の水を確実に拡散するだけでなく、該多孔性支持体を通って、フィブリンまたはフィブリノーゲンを確実に貫通させる、
方法。
（項目２２） 前記支持体のうち前記第一面と反対の面が、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、ここで、前記多孔性部分の２面間において、少なくとも０．３×１０5Ｐａの圧力差が生じる、項目２１に記載の方法。
（項目２３） 前記第一面と反対の前記支持体面が、０．５×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ以下の圧力を受ける、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記第一面と反対の前記支持体面が、断続的に、０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第一圧力を受け、そして０．８×１０5Ｐａ未満、好ましくは、０．４×１０5Ｐａ未満の第二圧力を受け、該第一圧力が、該第二圧力よりも少なくとも５％高い、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５） 前記多孔性支持体のうち前記第一面と反対の面が、０．８×１０5Ｐａ未満の圧力を受け、そして０〜１００℃の温度、好ましくは、１５〜６０℃の温度に晒される、項目２２〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６） 前記多孔性支持体のうち前記第一面と反対の面が、逆浸透を生じるように選択された溶液を受け、少なくとも該溶液の水が、該第一面と接触して該支持体の前記多孔性部分を通って、拡散を引き起こす、項目２１に記載の方法。
（項目２７） ５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液が使用される、項目２１〜２６のいずれかに記載の方法。
（項目２８） ５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質および１ｍｌあたり０．０１〜１０単位のトロンビンを含有する溶液が使用される、項目２７に記載の方法。
（項目２９） ５〜２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、第ＸＩＩＩ因子、および１ｍｌあたり０．０１〜２単位のトロンビンを含有する溶液が使用される、項目２８に記載の方法。
（項目３０） １ｍｌあたり０．１〜１０単位のＸＩＩＩ因子を含有する溶液が使用される、項目２９に記載の方法。
（項目３１） 前記溶液が、１ｍｌあたり、１〜４０ミリモルの塩化カルシウムを含有する、項目２７〜３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２） 前記溶液が、０〜２０重量％、有利には、３〜１５重量％、好ましくは、５〜１０重量％の水溶性または水混和性の極性有機添加剤を含有する、項目２７〜３１のいずれかに記載の方法。
（項目３３） 前記添加剤が、グリセロールである、項目３２に記載の方法。
（項目３４） 第一工程中において、多孔性支持体の第一面の少なくとも一部が、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質を含有する溶液と接触して配置され、ここで、該多孔性支持体のうち該第一面と反対の面が、吸引力を受けて、それにより、該多孔性支持体の厚さを横切って、少なくとも該溶液の水を確実に拡散し、そして該第一面の該多孔性部分に対して均質かつ均一に、該多孔性支持体の厚さを横切って、フィブリンまたはフィブリノーゲンを確実に貫通させ、そして第二工程中において、前記フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン層が安定化される、項目２１〜３３のいずれかに記載の方法。
（項目３５） 前記第一面の前記部分と、移動している水溶液との間で、接触が生じる、項目２１〜３４のいずれかに記載の方法。
（項目３６） 湿潤剤を含有する水溶液が使用されて、前記支持体を前記フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質を含有する前記溶液と接触して配置する前に、前記多孔性支持体の前記細孔を満たす、項目２１〜３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７） 前記フィブリン層が、おそらく洗浄工程の後に、乾燥工程を受ける、項目２１〜３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８） 前記乾燥操作が、有利には、−３０℃〜−１００℃の温度、好ましくは、−４０℃〜−７０℃の温度で、少なくとも部分的に、凍結乾燥により行われる、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 少なくとも、前記フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質をベースにした層の堆積物の一部に対して、前記第一面と接触する前記溶液中のフィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質の濃度が、前記支持体を通る実質的に一定の水拡散を保証するために、制御されている、項目２８〜３８のいずれかに記載の方法。
（項目４０） 生体適合性および／または生体分解性の多孔性支持体が使用される、項目２１〜３９のいずれかに記載の方法。
（項目４１） 前記多孔性部分が、有利には湿潤剤、タンパク質または極性有機添加剤またはそれらの混合物を含有する水溶液で処理され、その後、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有物質を含有する前記溶液が該多孔性部分と接触される、項目２１〜４０のいずれかに記載の方法。
（項目４２） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素からなる膜を含む、フィルター。
（項目４３） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素からなる膜を含む、バイオリアクター。
（項目４４） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素からなる、移植片。
（項目４５） 項目１〜２０のいずれかに記載の要素から製造される、人工皮膚。
【００５５】
それ以上の特徴および詳細は、添付の図面を参照して、特定の実施形態の上記詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、本発明による要素の概略図である。
【図２】図２は、本発明による要素を作製するための設備の概略図である。
【図３】図３は、凍結乾燥前、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図４】図４は、凍結乾燥前、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図５】図５は、凍結乾燥前、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図６】図６は、凍結乾燥後、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図７】図７は、凍結乾燥後、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図８】図８は、凍結乾燥後、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときのフィブリンネットワークの薄片の断面図である。
【図９】図９は、断面で見たとき、１ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液によって得られたネットワークの断面図である。
【図１０】図１０は、断面で見たとき、１０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液によって得られたネットワークの断面図である。
【図１１】図１１は、断面で見たとき、２０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液によって得られたネットワークの断面図である。
【図１２】図１２は、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）を使って撮影したときの、ＣａＣｌ2を含有しない溶液によって得たネットワークの断面図である。
【図１３】図１３は、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）を使って撮影したときの、２．７ｍＭのＣａＣｌ2／ｍｌを含有する溶液によって得たネットワークの断面図である。
【図１４】図１４は、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）を使って撮影したときの、２７ｍＭのＣａＣｌ2／ｍｌを含有する溶液によって得たネットワークの断面図である。
【図１５】図１５は、５００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の細胞を有するフィブリンネットワークの上面図である。
【図１６】図１６は、５００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の細胞を有するフィブリンネットワークの上面図である。
【図１７】図１７は、５００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の細胞を有するフィブリンネットワークの上面図である。
【図１８】図１８は、５００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の細胞を有するフィブリンネットワークの上面図である。
【図１９】図１９は、１００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときの、細胞「Ｃ」を備えたフィブリン層４を有する多孔性支持体２の断面図である。
【図２０】図２０は、１００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときの、細胞「Ｃ」を備えたフィブリン層４を有する多孔性支持体２の断面図である。
【図２１】図２１は、１０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときの、細胞「Ｃ」を備えたフィブリン層４を有する多孔性支持体２の断面図である。
【図２２】図２２は、低分子量のマーカー（１、６）、コントロールフィブリノーゲン（５）、コントロールフィブリン（４）、インキュベーション後に浸出液に由来の重合体層（その多孔性膜を通っている部分）およびインキュベーション後の浸出液の浮いている部分の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
図１は、本発明による要素の一部の拡大断面図を概略的に示す。
【００５８】
要素１は、以下の（ａ）および（ｂ）を含む：（ａ）疎水性または実質的に疎水性の支持体２、例えば、ＰＴＦＥ（これは、両方の軸方向に拡大され延伸されている）であって、これは、０．１〜５ｍｍ、例えば、３００〜５００μｍの厚さＥを備えた多孔性部分を有し、その細孔Ｐは、その厚さに沿って伸長しているが、５〜１００μｍ、例えば、約３０〜４０μｍの平均直径「ｄ」（細孔体積／細孔の表面）を有し、該支持体２の該多孔性部分の一面３は、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンベース化合物で処理されている；および（ｂ）フィブリンベース層４であって、これは、支持体２の処理面３を覆っている。
【００５９】
該フィブリンベース層４は、該処理面３において、実質的に均一かつ均質である。例えば、層４中のフィブリノーゲン（このフィブリン層に結合していないフィブリン）の含量は、このフィブリン層の０．５重量％より低く、好ましくは、０．１重量％より低い。
【００６０】
一部のフィブリノーゲンＦは、１０〜２０μｍの平均直径を有する細孔（その体積（μｍ3で表わす）を細孔壁の表面積（μｍ2で表わす）で割った値が１０〜２０μｍである細孔）および２０μｍより大きい平均直径を有する細孔の両方において、この支持体の処理した多孔性部分の厚さＥを横切って、該処理面から少なくとも１０μｍの深さ「ｅ」まで伸長し得る。特に、この多孔性部分の処理面の２５μｍより大きい全細孔では、一部のフィブリノーゲンは、この支持体の厚さＥを横切って、少なくとも３０μｍの深さ「ｅ」まで伸長している。それにもかかわらず、面３では、この支持体は、このネットワークに結合していないフィブリノーゲンを実質的に含まない。このフィブリンネットワークに結合していないフィブリノーゲンがないことは、この多孔性支持体を通る水の通過のせいである。特定の１実施形態では、この多孔性支持体は、このフィブリン層を支える面から、少なくとも１０μｍの深さまで、フィブリノーゲンを含まない。特に有利な実施形態によれば、この支持体は、その厚さ全体にわたって、フィブリノーゲンを含まない。
【００６１】
フィブリン層４は、図１で示すように、ＸＩＩＩ因子の存在により、架橋によって安定化されている。それゆえ、該層４は、隣接胞４０のネットワークを形成する。
【００６２】
面３から決定されるフィブリン層の厚さ「ｈ」（その脱水形態）は、例えば、約１０μｍであるのに対して、房またはセルの平均体積は、約１０μｍ3である。その胞は、開いており、その間に開口部を有する。胞との用語は、５μｍ3より大きい体積を有する無フィブリン領域を規定しており、これは、フィブリン結合で取り囲まれている。層４における胞の分布は、実質的に規則的であり、すなわち、層４で覆われた面３の１ｃｍ2の領域における胞の体積は、その領域の単位表面積（ｃｍ2）あたりの房の平均体積の０．８〜１．２倍（好ましくは、０．９〜１．１倍）である。これらの房の平均高さは、面３に垂直に測定したとき、例えば、２〜３μｍである。
【００６３】
図１で示した要素は、有利には、乾燥状態である。その水分含量は、例えば、０．０１重量％未満であり、これにより、この要素の優れた保存および安定性が保証される。この要素を再水和したとき、このフィブリン層は、例えば、１．５倍より大きい倍率、特に、１．６〜２．５倍で膨張する（再水和後のフィブリン層の厚さは、乾燥フィブリン層の厚さの１．６〜２．５倍に相当している）。
【００６４】
特定の実施形態によれば、細孔Ｐは、水溶性または実質的に水混和性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われた内面を有し、および／またはこの支持体のうち処理面とは反対の面６は、水溶性または実質的に水混和性のタンパク質で少なくとも部分的に覆われている。このような被覆は、例えば、細胞固定化、フィブリンまたはフィブリノーゲン含有物質で処理された面とは反対の面を取り囲む組織の癒着を助けるのに有利である。
【００６５】
１実施形態の有利な特徴によれば、この支持体の多孔性部分の細孔Ｐ（内壁）は、水溶性または水混和性の極性有機添加剤またはこのような添加剤の痕跡により、少なくとも部分的に覆われている。この極性有機添加剤はまた、有利には、層４のフィブリン層およびこの支持体の面３および６上で、少なくとも一部で存在している。この添加剤は、例えば、グリセロール、糖など、またはこれらの添加剤の混合物であり得る。該添加剤は、水に特に溶解性であるかまたは少なくとも混和性であり、特に、大気圧で水の凍結温度に対して、凍結温度を下げることができる水溶性添加剤のうちから選択される。このフィブリン、フィブリノーゲンおよび／またはトロンビン溶液中または湿潤架橋フィブリン層（これは、乾燥しておらず、その細孔中の水含量は、約５０％である）中の溶解性または混和性添加剤の量は、好ましくは、大気圧での凍結温度を−５℃未満、好ましくは、−１０℃未満で下げるのに充分である。
【００６６】
図示した実施形態の支持体は、ＰＴＦＥの生体適合性の多孔性支持体であるものの、他の生体適合性支持体、特に、生体分解性支持体または生体適合性で生体分解性の支持体は、使用できる。
【００６７】
本発明による要素を作製する方法の少数の例を以下で記述する。
【００６８】
本発明による１個以上の要素の作製には、その房内で大気圧に対して真空または負圧を生じるために、真空ポンプ１１に接続された真空チャンバ１０が使用される。このチャンバは、図２で概略的に示されている。
【００６９】
このチャンバは、これらの溶液をチューブの内部空間または中空部（これは、１〜１００ｍｍ、さらに特定すると、２〜１０ｍｍの内径を有する）に入れるための吸気口を有する。チューブ１３は、非多孔性リング１３Ｂで分離された多孔性円筒形部分１３Ａ（２０〜３０μｍの細孔の平均直径）を有する。そのチューブ厚は、この多孔性部分に対して、約２００〜３００μｍであった。吸気口１２は、液密様式でそこにこのチューブの末端１３Ｃを留める手段を含む。吸気口１２は、ダクト１５によって、フィブリノーゲン含有物質（１０〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度）の水溶液（これは、１ミリリットルあたり０．２〜２０単位のＸＩＩＩ因子（ＩＵ／ｍｌ）および１００〜１０００μｇ／ｍｌのフィブロネクチン）を含有するタンク１４に接続されており、ダクト１６によって、トロンビン（０．０５〜２ＩＵ／ｍｌの濃度）の水溶液を含有するタンク１７に接続されており、そしてダクト１８によって、水およびおそらく１種以上の添加剤を含有するタンク１９に接続されている。ダクト１５、１６および１８には、流体の通過を許容または防止するバルブＶが取り付けられている。該ダクトは、大気圧に依存して、１種以上の流体をこの吸気口に向ける。制御システム２０は、所望の容量およびこのチャンバ内で測定された容量に依存して、この真空ポンプの操作を制御する。
【００７０】
この吸気口に留めたものと反対のチューブ末端は、プラグ２１で閉じられるが、これは、有利には、バルブ２３付きのダクト２２により伸長され、チューブ内に含まれる流体または溶液の排出を可能にする。
【００７１】
このチャンバはまた、そのチャンバ温度を＋６０℃〜−１００℃の範囲に調節する手段２４を備えている。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
本実施例では、溶液Ａ（これは、２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン含有物質、１ｍｌあたり１０００μｇのフィブロネクチンおよび２ＩＵ／ｍｌのＸＩＩＩ因子を含有する）、および溶液Ｂ（これは、１ｍｌあたり０．２ＩＵのトロンビン、および４０ｍＭ（ミリモル）の塩化カルシウムを含有する）を使用した。
【００７３】
溶液Ａおよび溶液Ｂを、同じ流速で、この吸気口に供給して、溶液Ａおよび溶液Ｂの両方の１：１混合物を得た。そのように得た混合物は、１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン、５００μｇ／ｍｌのフィブロネクチン、１ＩＵ／ｍｌのＸＩＩＩ因子、０．１ＩＵ／ｍｌのトロンビンおよび２０ ｍＭ／ｍｌのＣａＣｌ2を含有していた。
【００７４】
このチューブの中空部および内部空間を、溶液ＡおよびＢの混合物で満たし、そのチャンバ圧を０．４×１０5Ｐａ（すなわち、大気圧に対して、約６００ミリバールの負圧）まで低下させた。この真空の形成により、水は、このチューブの多孔性部分の厚さを通って吸引される。この真空は、このチューブの外面で生じるので、後者は、僅かに伸展されるかまたは締められ、これは、このチューブの細孔を通る液体の拡散を助ける。
【００７５】
真空を作って維持している間、このチューブの外壁は、濡れていることが分かった。
【００７６】
約１〜３０分間にわたって真空を維持した後、このチャンバの圧力は、漸次、大気圧に戻した。一旦、このチューブを空にして水洗すると、チューブの内面は、約５μｍ厚の架橋フィブリン層で覆われていることが分かり、１５〜２０μｍ3の房または開放セルは、チューブの多孔性部分上にあった（この層を支える支持体の面に平行に測定したように、２〜３μｍのセル高さ、５〜７μｍ2の面積）。このフィブリン層だけでなく、フィブリン層との支持体界面上には、フィブリン層に結合していないフィブリノーゲンは存在しなかった。フィブリノーゲンは、この支持体の細孔において、１０μｍより大きい平均直径を有する全細孔に対して、少なくとも約２０μｍの深さ（このチューブの内面から）まで、存在していた。
【００７７】
この多孔性支持体を通るフィブリノーゲンの通過は、図２２の電気泳動図で確認される。実際、このフィブリノーゲン溶液と接触している面とは反対の面からの一部の液体を収集した。この液体をインキュベートした後、形成された重合体層（２）および上澄み液（３）の両方について、電気泳動ピークを決定した。この結果、インキュベーション後、この電気泳動（２）により、フィブリンに典型的なピークが明らかとなり、このことから、そのフィブリノーゲンは、この多孔性支持体を通ったことが判明した。
【００７８】
このチューブは、引き続いて、５０℃に加熱した気体で乾燥した。
【００７９】
（実施例２）
そのチャンバ内の圧力を約０．４×１０5Ｐａで維持して洗浄水がこの多孔性支持体を通って確実に拡散するようにしつつ、このチューブの内側に脱塩水流れを入れてフィブリノーゲン溶液を排出することにより、その洗浄工程を行ったこと以外は、実施例１を繰り返した。この拡散により、フィブリノーゲンは、この多孔性支持体から除去できる。
【００８０】
（実施例３）
そのチューブの温度を−６０℃まで下げて水を氷にし、それをこの温度で凍結乾燥することにより、このチューブを乾燥したこと以外は、実施例１を繰り返した。
【００８１】
（実施例４）
５０％の溶液Ａおよび５０％の溶液Ｂからなる混合物の約５重量％でグリセロールを添加したこと以外は、実施例３を繰り返した。この多孔性支持体およびフィブリン層の両方でグリセロールが存在していることにより、この要素にある程度の融通性が得られることに注目した。さらに、その凍結乾燥工程は、簡単であった。
【００８２】
その架橋フィブリンの形成時にグリセロールが存在していることは、このフィブリン層に規則的で均一な構造を与えるのに有利であることが判明した。さらに、グリセロールが存在していることにより、フィブリンおよびフィブリノーゲンがこのチューブの多孔性部分の細孔を通過し易くなった。
【００８３】
（実施例５）
５０％の溶液Ａおよび５０％の溶液Ｂからなる混合物の約１０重量％でグリセロールを添加したこと以外は、実施例４を繰り返した。この多孔性支持体およびフィブリン層の両方でグリセロールが存在していることにより、この要素にある程度の融通性が得られることに注目した。さらに、その凍結乾燥工程は、簡単であった。
【００８４】
実施例２および４に由来のフィブリンネットワークの一部を、凍結乾燥前および後に、その中に２〜２．５％のグルタルアルデヒドの溶液を含有する皿に一晩置いた。その後、グルタルアルデヒドで固定したネットワークの薄片を、加熱した小刀によって横に切断し、その薄片を、４０％、５０％、７０％、８０％、９０％および１００％のエタノール溶液で脱水した。
【００８５】
図３、４および５は、凍結乾燥前、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、それぞれ、実施例２、３および４に由来のフィブリンネットワークの薄片の断面図であるのに対して、図６、７および８は、凍結乾燥後、５，０００倍の倍率で、電子顕微鏡で撮影したときの、それぞれ、実施例２、３および４に由来のフィブリンネットワークの薄片の断面図である。これらの図を比較すると、その結果、凍結乾燥前の実施例２、３および４に由来のフィブリンネットワークの胞は、類似しており、凍結乾燥後の実施例２、３および４に由来のフィブリンネットワークの胞は、類似しており、グルセロールを使用することによって、このネットワークの繊維のサイズが小さくなっている。それゆえ、グリセロールは、この凍結乾燥工程中に繊維を保護するのに有用である以外に、このフィブリンネットワークの繊維のサイズまたは直径を制御できる試薬である。
【００８６】
（実施例６）
グリセロールを、まず、グルコースで置き換え、次いで、マンニトールで置き換えたこと以外は、実施例４を繰り返した。
【００８７】
（実施例７）
約１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンおよびそれぞれ１ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌおよび２０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液を使用したこと以外は、実施例１を繰り返した。
【００８８】
それにより得られたネットワークを、２〜２．５％のグルタルアルデヒドを含有する溶液および実施例４で記述したエタノール含有溶液で処理した。そのように得たネットワークの一部の薄片を、電子顕微鏡（走査型電子顕微鏡、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）で検査した。図９、１０および１１は、それぞれ、３，５００倍の倍率で、１ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌおよび２０ＩＵ／ｍｌのトロンビンを含有する溶液を使って得られたネットワークの断面図である。
【００８９】
これらの図９〜１１は、この溶液中のトロンビンが高濃度で存在していると、繊維の数が多くなるが、そのサイズは小さくなることを示している。
【００９０】
（実施例８）
０ｍＭ／ｍｌ、２．７ｍＭ／ｍｌおよび２７ｍＭ／ｍｌの濃度のＣａＣｌ2を有するトロンビンおよびフィブリノーゲン溶液を調製したこと以外は、実施例１を繰り返した。実施例４で記述したネットワークを処理し洗浄した後、０ｍＭ／ｍｌ（図１２）、２．７ｍＭ／ｍｌ（図１３）および２７ｍＭ／ｍｌ（図１４）を含有する溶液で得たネットワークの断面を、電子顕微鏡（走査型電子顕微鏡、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０）で５，０００倍の倍率で検査した。これらの図は、高いカルシウム含量が、多い繊維、その大きいサイズ、およびその胞の小さい体積に対応していることを示している。
【００９１】
（実施例９）
５％のグリセロール、２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン、１ｍｌあたり５００μｇのフィブロネクチン、１０ＩＵ／ｍｌのＸＩＩＩ因子、１ｍｌあたり１ＩＵのトロンビンおよび１ｍｌあたり４０ｍＭ（ミリモル）のカルシウムを含有する溶液を使用すること以外は、実施例４を繰り返した。
【００９２】
（実施例１０）
そのチャンバの真空を制御して、大気圧に対する６００ｍｂａｒ（約０．４×１０5Ｐａの圧力）から大気圧に対する６３０ｍｂａｒ（約０．３８×１０5Ｐａの圧力）まで断続的に変えたこと以外は、実施例４を繰り返した。この真空の変化は、この支持体の孔内でフィブリンおよびフィブリノーゲンが拡散するのに有利であることが分かった。水で洗浄し、このフィブリン層を水流と接触させ、そしてこのチャンバ内にて、大気圧に対する６００ｍｂａｒ（約０．４×１０5Ｐａの圧力）から大気圧に対する６３０ｍｂａｒ（約０．３８×１０5Ｐａの圧力）までの真空を作った後、この支持体およびフィブリン層は、それ以上の遊離のフィブリノーゲンを含有していなかった。
【００９３】
このチューブは、必要なら、凍結乾燥前または後に、１２１℃の温度で６０分間、例えば、オートクレーブで簡単に滅菌し得る。他の任意の滅菌法は、この架橋フィブリン層の胞構造も支持体構造も破壊しないという条件で、使用され得る。
【００９４】
（実施例１１）
そのチューブ内で実質的に一定のフィブリノーゲン濃度を保証するために、この拡散工程中にて、このチューブで、フィブリノーゲンの濃度を制御したこと以外は、実施例３を繰り返した。こうするために、バルブ２３を断続的に開いて、このチューブから一定量の溶液を排出し、このチューブに、フィブリノーゲンを殆どまたは全く含有しない溶液を供給した。これにより、このフィブリン層は、実質的に規則的かつ均質な厚さであることが保証される。
【００９５】
（実施例１２）
そのフィブリノーゲン濃度を実質的に連続的に制御して、このチューブの内壁にフィブリンが堆積するにつれて、この濃度を低下させたこと以外は、実施例１１を繰り返した。
【００９６】
（実施例１３）
そのチューブをフィブリノーゲン溶液で処理する前に、脱塩水、１ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含有する水溶液、１０ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含有する水溶液、３０ｍｇ／ｍｌのアルブミンを含有する水溶液を、それぞれ、このチューブに供給して、その細孔を該溶液で満たしたこと以外は、実施例３を繰り返した。
【００９７】
（実施例１４）
その溶液に含有されたタンパク質が、３０ｍｇ／ｍｌのアルブミンおよび１０ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンであること以外は、実施例３を繰り返した。ビブロネクチンなどのような他のタンパク質は、アルブミンおよび／またはフィブロネクチンに代えて、個々にまたは混合物中で使用できた。
【００９８】
ＷＯ９６／０７４４４で示すように、このフィブリン層は、それを変性するかまたはそれに特定の特性を与えるか、いずれかのために処理できる。
【００９９】
このフィブリン層は、水、１種以上の塩（おそらく、溶液中）、フィブリン層を備えた支持体の生体適合性を改良するのに使用される添加剤で処理され得る。これらの添加剤は、例えば、タンパク質、抗凝固剤、抗炎症化合物、移植片の拒絶を少なくする化合物、生細胞、細胞成長阻害剤、内皮細胞を刺激する試薬、抗生物質、抗新生物剤、遺伝子物質、架橋フィブリン層上の内皮細胞の成長および／または付着を促進および／または刺激するタンパク質、成長因子、ヘパリン結合のための成長因子、コレステロールに抗する物質（ＺＯＣＯＲ（登録商標））などから選択され得る。添加剤の一部の特定の例は、米国特許第５，６６０，８７３号で示されており、その内容は、参考として、含まれている。
【０１００】
このフィブリン層は、もし必要なら、例えば、プラスチンによって、加水分解され得る。
【０１０１】
（実施例１５）
第一工程中にて、このチューブに溶液Ａを供給して、このチャンバ内で真空を作ることにより、非架橋フィブリンまたはフィブリノーゲン層を得ること、および第二工程中にて、このチューブに溶液Ｂ（トロンビン）を供給して、フィブリンモノマーを形成し、架橋構造を得たこと以外は、実施例１を繰り返した。
【０１０２】
（実施例１６）
凍結乾燥を、数段階、すなわち、温度を−５８℃まで下げること、この−５８℃という温度を維持すること、１〜５時間にわたって真空を作ること（その凍結乾燥装置は、７Ｐａの圧力設定値で調節し、その結果、真空ポンプは連続的に作動し得た）、この真空を維持しつつ、温度を−５８℃から−２０℃〜−３０℃まで上げること、この真空を維持しつつ、−２０℃〜−３０℃の温度を少なくとも１０時間（１０〜１００時間）維持すること、この真空を維持しつつ、この温度を２０℃より高く上げることによって行ったこと以外は、実施例４を繰り返した。
【０１０３】
（実施例１７）
その多孔性チューブを、引き続いて、溶液Ａおよび溶液Ｂで処理したこと以外は、実施例１を繰り返した。
【０１０４】
本実施例の処理工程は、以下である：
ａ）このチューブに溶液Ａ（フィブリノーゲン）を供給すること；
ｂ）このチューブの外側の空間に真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ａを吸引すること；
ｃ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ａを除去すること；
ｄ）室温で１５分間にわたって堆積したフィブリノーゲン層をインキュベートすること（工程ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、工程ｅ）の前に、１回または数回、例えば、２回または３回繰り返され得る）；
ｅ）このチューブに溶液Ｂ（トロンビン）を供給すること；
ｆ）このチューブの外側の空間で真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ｂを吸引すること；
ｇ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ｂを除去すること；
ｈ）この層を３７℃で３０分間インキュベートすること；
ｉ）このチューブに溶液Ａ（フィブリノーゲン）を供給すること；
ｊ）このチューブの外側の空間に真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ａを吸引すること；
ｋ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ａを除去すること；
ｌ）この層を、室温で１５分間にわたってインキュベートすること（工程ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、１回または数回繰り返し得る）；
ｍ）この層を、３７℃で９０分間インキュベートすること。
【０１０５】
（実施例１８）
中間インキュベーション工程ｄ、ｈおよびｌを省いたこと以外は、実施例１６を繰り返した。
【０１０６】
（実施例１９）
その多孔性チューブを、引き続いて、溶液Ａおよび溶液Ｂで処理したこと以外は、実施例１を繰り返した。
【０１０７】
本実施例の処理工程は、以下である：
ａ）このチューブに溶液Ａ（フィブリノーゲン）を供給すること；
ｂ）このチューブの外側の空間に真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ａを吸引すること；
ｃ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ａを除去すること；
ｄ）室温で１５分間にわたって堆積したフィブリノーゲン層をインキュベートすること；
ｅ）このチューブに溶液Ｂ（トロンビン）を供給すること；
ｆ）このチューブの外側の空間で真空を作って、チューブの壁を通って溶液Ｂを吸引すること；
ｇ）このチューブ内に依然として存在している溶液Ｂを除去すること；
ｈ）この層を３７℃で３０分間インキュベートすること；
ｉ）このチューブを水で洗浄すること（好ましくは、連続的な洗浄操作）；
ｊ）工程ａ〜ｉを１回または数回繰り返すこと；
ｋ）この層を、３７℃で９０分間インキュベートすること。
【０１０８】
（実施例２０）
その溶液混合物のｐＨを、その導入時にて、それぞれ、６、６．５、７および７．５に変えたこと以外、またはそのチューブ中の溶液のｐＨを、その工程中に制御して、それを６．５、７または７．５に維持したこと以外は、実施例４を繰り返した。
【０１０９】
（実施例２１）
その多孔性チューブを真空チャンバに入れる代わりに、このチューブを、塩（ＮａＣｌ）の濃縮水溶液を備えた容器に入れて、逆浸透により、このチューブの壁を通って該濃縮溶液に向かう水およびフィブリン−フィブリノーゲン拡散を形成すること以外は、実施例１を繰り返した。
【０１１０】
（実施例２２）
実施例１のフィブリノーゲンおよびトロンビン化合物を、注射器によってチューブに注入して、このチューブの内壁にフィブリン層を形成した。この方法により、フィブリノーゲンは、このチューブの内壁または該内壁の付近にあるフィブリン層に存在するようになる。
【０１１１】
このフィブリノーゲン溶液を除去し、このチューブを水に浸漬した（前洗浄）後、チューブを、実施例１で使用した真空チャンバに入れた。次いで、このチューブに脱塩水を供給し、それから、このチャンバに真空を作り（０．３×１０5Ｐａの圧力）、その結果、水は、チューブの壁を通って、その内壁から外壁へと吸引される。このチューブ壁を通って水が拡散することにより、未結合フィブリノーゲンは、このフィブリン層から、この支持体の外側に除去でき、その結果、このチューブの内壁付近に位置しているその少なくとも一部は、フィブリノーゲンを含まなくなる。
【０１１２】
（実施例２３）
そのチューブ壁を通って水を拡散することによる洗浄工程に、５％のグリセロールを含有する水溶液を使用したこと以外は、実施例２２を繰り返した。
【０１１３】
（実施例２４）
そのチューブ壁を通って水を拡散することによる洗浄工程に、５％のグリセロールおよび１％のアルブミンを含有する水溶液を使用したこと以外は、実施例２２を繰り返した。
【０１１４】
上記実施例では、人血に由来のフィブリノーゲンおよびトロンビンを使用することにより、フィブリン層を作製した。これらは、市場で入手できる製品（例えば、ＣＲＹＯＬＩＴＥ製の生体接着剤、例えば、製品ＦｉｂＲｘ、またはＶＩＴＥＸ（製品ＶＩＧｕａｒｄ））、または組換えフィブリノーゲンで置き換えることができた。
【０１１５】
本発明による要素または膜、例えば、実施例１〜１３の膜は、いくつかの用途で、例えば、ＥＰ ９６９１０８６７で記述されているように、バイオリアクター用の膜として、フィルター用の膜として、移植片（例えば、人工臓器）として、人工静脈として、人工動脈として、抗血栓物質として、心臓弁として、人工皮膚として、使用され得る；この膜はまた、試験キットまたは設備などの製造に適用され得る。
【０１１６】
グリセロールを添加せずに作製した凍結乾燥フィブリンネットワーク（実施例３）、凍結乾燥の前後で約５％のグリセロールを含有する溶液で作製したフィブリンネットワーク（実施例４）、および約１０％のグリセロールを含有する溶液で凍結乾燥して作製したフィブリンネットワーク（実施例６）に付着した細胞の形態を決定するために、多くの試験を実行した。
【０１１７】
これらの試験において、ダルベッコ変性イーグル培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）から、培養液を調製した。このＤＭＥＭ培地に、以下の成分（本明細書中において、重量％で示す）を添加した。
【０１１８】
２０％のＨＡＭ’Ｓ Ｆ１２（培地）；
１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）；
１％の非必須アミノ酸（すなわち、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン）；
１％のピルビン酸ナトリウム；
１％のペニシリウムストレプトマイシン；および
１％のＬ−グルタミン。
【０１１９】
この培地は、本明細書中以下にて、「調製ＤＭＥＭ培地」と呼ぶ。
【０１２０】
これらの試験で使用した細胞を、以下のようにして単離した：
ウシを屠殺した直後、ウシの大動脈を回収した。その大動脈の脂肪組織を分離した後、側副動脈を結紮した。その大動脈の内面を、３７℃で、１５分間にわたって、２５ＩＵ／ｍｌのコラゲナーゼを含有する溶液で処理した。この処理で解離した細胞を回収し、バリンＤ、１０％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢを含有するＤＭＥＭ培地に入れた。この培地を、２４時間後、再生した。
【０１２１】
２日後、この培養液を、７０％ＤＭＥＭ培地（これは、２０％のＨａｍ’ｓ Ｆ１２、１０％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２．５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢを含有する）に入れた。
【０１２２】
一旦、これらの細胞がコンフルーエンスに達すると、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の存在下でトリプリン（１ｍｇ／ｍｌ）の助けを借りて、回収した。
【０１２３】
次いで、それらを、「調製ＤＭＥＭ培地」で成長させる。
【０１２４】
これらの細胞をフィブリンネットワークを備えた支持体を含むペトリ皿に加える前に、これらの細胞をこのＤＭＥＭ培地（これは、トリプシン−ＥＤＴＡ培地（５倍濃縮）で３７℃で５分間にわたるインキュベーションにより、調製した）から回収し、次いで、１０％のＦＣＳを含有する培地１０ｍｌを加えて、その酵素の作用を停止した。トリパンブルーでマーキングした後、Ｂｕｒｋｅｒチャンバ中の細胞を数えることにより、顕微鏡の助けを借りて、この培地中の細胞数を測定した。この方法は、本明細書中以下、顕微鏡計数法と称する。得られた細胞数は、第一溶液に対して、２５，０００個の細胞／ｍｌであり、そして第二溶液に対して、１２５，０００個の細胞／ｍｌである。
【０１２５】
この培地（これは、それぞれ、５０，０００個の細胞および２５０，０００個の細胞を含有する）２ｍｌを、異なるペトリ皿（これは、それぞれ、グリセロールの添加なしで調製した凍結乾燥フィブリンネットワーク（皿１）、凍結乾燥前（皿２）および凍結乾燥後（皿３）に約５％のグリセロール（実施例４）を含有する溶液で調製したフィブリンネットワーク、および凍結乾燥と共に約１０％のグリセロール（実施例５）を含有する溶液で調製したフィブリンネットワーク（皿４）を含有する）に別々に加えた。
【０１２６】
ペトリ皿中の細胞の培養は、３７℃で、第一バッチの皿（５０，０００個の細胞を含有する皿）に対して、２時間行い、そして第二バッチの皿（２５０，０００個の細胞を含有する皿）に対して、１１日間行った。その培養時間（２時間または１１日間のいずれか）が終了したとき、ペトリ皿中のフィブリンネットワークを、２．５％グルタルアルデヒド溶液によって固定した。図１５、１６、１７および１８は、電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ２０走査型電子顕微鏡）で撮影したときの、２時間培養後の皿１、２、３および４のフィブリン層の上面図である。これらの図は、２時間の培養後、異なる皿上でのフィブリンネットワーク上の良好な細胞付着を示している。これらの細胞を、規則的かつ平らな配列で、その上面に分散する。
【０１２７】
３７℃で１１日間培養した皿について、その培養時間中において、皿の視覚検査を実行した。この検査は、８日間の培養後、皿１（グリセロールなしのフィブリンネットワーク）のネットワークのフィブリン分解が現れたのに対して、８日間の培養後、皿２、３および４のネットワークについては、フィブリン分解は認められなかったことを示した。
【０１２８】
１１日間の培養後、皿１、２および３について、生細胞数を数えた。この生細胞数は、酵素キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＷＳＴ−１（カタログ番号１６４４８０７−バッチ番号１４８９０８００）によって測定した。この方法の原理は、この培地に加えたテトラゾリウム塩がミトコンドリアの酵素（スクシネート−テトラゾリウム還元酵素）によりホルマザンに開裂することに基づく。この還元は、生細胞でのみ起こる。代謝的に活性な細胞により産生したホルマザンを、走査型分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）により、定量する。この定量は、ペトリ皿１、２および３の培地を新鮮培地（これは、ＷＳＴ−１酵素キットの溶液１００μｌを含有する）１ｍｌで置き換えることにより、行った。７％のＣＯ2を含有する雰囲気下にて３７℃で４時間のインキュベーション後、分光器での分析用に、各皿の着色溶液１００μｌを集めた。各溶液に対して、４５０ｎｍでの吸光度ピークと６５５ｎｍでの吸光度ピークとの間の差を測定した。皿２および３に対する吸光度差は、皿１に対するものよりもずっと顕著である（４０〜５０％高い）ことが分かった。皿１、２および３に対する吸光度差は、その中に細胞を有しない試料の吸光度差よりも少なくとも４倍高かった。この分析により、皿１、２および３中の細胞は、生存していること、さらに、グリセロールの存在は、良好な細胞生存度を保証することが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
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【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１０−２６９１５４（Ｐ２０１０−２６９１５４Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４５６８７（Ｐ２０１０−１４５６８７）
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【分割の表示】特願２０００−５７９２７５（Ｐ２０００−５７９２７５）の分割
【原出願日】平成１１年１１月４日（１９９９．１１．４）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【分割の表示】特願２０００−５７９２７５（Ｐ２０００−５７９２７５）の分割
【原出願日】平成１１年１１月４日（１９９９．１１．４）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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