フェノールオキシダーゼ遺伝子及びフェノールオキシダーゼの製造方法
【課題】環境、人体に対して温和な条件下での線維や毛髪の染色等に用いうる手段を提供すること。
【解決手段】特定の塩基配列又はそのバリアントを含有した、フェノールオキシダーゼをコードする核酸、該核酸によりコードされた組換えフェノールオキシダーゼ、該核酸を含有した発現ベクター、該発現ベクターを含有した形質転換体、該形質転換体を培養し、培養物中に組換えフェノールオキシダーゼを生成させ、回収する、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法及び該組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体。
【解決手段】特定の塩基配列又はそのバリアントを含有した、フェノールオキシダーゼをコードする核酸、該核酸によりコードされた組換えフェノールオキシダーゼ、該核酸を含有した発現ベクター、該発現ベクターを含有した形質転換体、該形質転換体を培養し、培養物中に組換えフェノールオキシダーゼを生成させ、回収する、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法及び該組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェノールオキシダーゼをコードする核酸、組換えフェノールオキシダーゼ、発現ベクター、形質転換体、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法、及び組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体に関する。さらに詳しくは、中性付近で高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼをコードする核酸、組換えフェノールオキシダーゼ、発現ベクター、形質転換体、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法、及び組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェノールオキシダーゼは、フェノール化合物、ポリフェノール化合物等の種々の基質に対して酸化作用を有する酸化酵素である。前記フェノールオキシダーゼは、大気中の酸素の存在下で種々の基質の酸化を触媒することができるため、酸素存在下で中間体としてのラジカル種の生成に起因する発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適している。
【０００３】
フェノールオキシダーゼには、フェノールオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ（カテコールオキシダーゼ）、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等があげられる。
【０００４】
したがって、前記フェノールオキシダーゼは、臨床分析、バイオセンサー、パルプ及び繊維の漂白、合成板の製造、木質の改善、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造、有機化合物の合成、染色及び抜染、洗濯時の色移り防止、廃液中のフェノール及びアニリン化合物の除去、毒性化合物の解毒、内分泌撹乱物質の分解、ジュースの混濁防止、食品の苦渋味の除去、家畜飼料の体内消化の促進、悪臭の抑制、化石燃料の脱硫、有害環境物質の分解処理等の多方面への幅広い応用が期待されている。
【０００５】
前記フェノールオキシダーゼは、従来から種々の植物、細菌類及び真菌類等に見出されており、例えば、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｃｔｒｅａｔｕｓ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、オウリキュラリア・ポリトリカ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ）、ガノデルム・ルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）、コプリナス・ミカセウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍｉｃａｃｅｕｓ）、ダエダレオプシス・スチラシナ（Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ ｓｔｙｒａｃｉｎａ）、コリオラス コンソルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｃｏｎｓｏｒｓ）、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｔｉｐｅｓ）等の担子菌に、フェノールオキシダーゼが見出されている（例えば、特許文献１等を参照のこと）。
【０００６】
しかしながら、前記フェノールオキシダーゼは、種々の基質に対する酵素活性の至適ｐＨを酸性側に有し、使用用途が限定されること、用いる基質によって至適ｐＨが大きく変動し、中性付近で種々の基質に対して効率よく作用しないこと等の欠点がある。また、担子菌における当該フェノールオキシダーゼの生産性は低く、生産されたフェノールオキシダーゼの純度も低いという欠点がある。また、前記特許文献１記載のフェノールオキシダーゼは、酸性条件で培養することにより見出される酵素である。
【特許文献１】特開昭６０−１５６３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、環境、人体に対して温和な条件下での線維や毛髪の染色等に用いうる手段を提供することに関する。本発明の１つの側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、かつ大量に供給しうる、フェノールオキシダーゼをコードする核酸を提供することに関する。また、本発明の他の側面は、種々の化合物に対して、中性付近で作用すること、中性ｐＨから弱アルカリ性ｐＨまでの広い範囲で高い安定性を示すこと、基質による至適ｐＨの変動が小さいこと、安価で大量に供給できること、高い純度であること等の特性を有する、組換えフェノールオキシダーゼを提供することに関する。本発明のさらに他の側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させることができる、発現ベクターを提供することに関する。また、本発明の別の側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させること、該フェノールオキシダーゼを回収、精製等に適した状態で発現させること等の少なくとも１つを可能にする、形質転換体を提供することに関する。本発明のさらに別の側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、大量に、高い純度で得ることができる、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法を提供することに関する。本発明のよりさらに別の側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼの回収、精製、スクリーニング等を可能にする抗体に関する。なお、本発明のさらなる課題は、本明細書の記載から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 （ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである核酸の塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなる、フェノールオキシダーゼをコードする核酸、
〔２〕 コードされるポリペプチドが、少なくともｐＨ５．０〜８．０にフェノールオキシダーゼ活性を有する、前記〔１〕記載の核酸、
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の核酸によりコードされてなる、組換えフェノールオキシダーゼ、
〔４〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の核酸を含有してなる、発現ベクター、
〔５〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の核酸の上流に、シグナル配列をコードする核酸が作動可能に連結されてなる、前記〔４〕記載の発現ベクター、
〔６〕 前記〔４〕又は〔５〕記載の発現ベクターを含有してなる、形質転換体、
〔７〕 酵母細胞又は糸状菌に由来する、前記〔６〕記載の形質転換体、
〔８〕 前記〔６〕又は〔７〕記載の形質転換体を培養し、培養物中に組換えフェノールオキシダーゼを生成させ、回収することを特徴とする、前記〔３〕記載の組換えフェノールオキシダーゼの製造方法、並びに
〔９〕 前記〔３〕記載の組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のフェノールオキシダーゼをコードする核酸によれば、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを発現させ、高い収率で、安価に、かつ大量に供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、種々の化合物に対して、中性付近で作用し、中性ｐＨから弱アルカリ性ｐＨまでの広い範囲で高い安定性を示し、基質による至適ｐＨの変動が小さいという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、安価で大量に、高い純度で提供され得る。本発明の発現ベクターによれば、前記フェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の形質転換体によれば、前記フェノールオキシダーゼを、効率よく大量に、回収、精製等に適した状態で発現させることはできるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の組換えフェノールオキシダーゼの製造方法によれば、前記フェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、大量に、高い純度で得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の抗体によれば、前記フェノールオキシダーゼの回収、精製、スクリーニング等を簡便に、高い感度で行なうことができるという優れた効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、１つの側面では、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼ、すなわち、中性フェノールオキシダーゼをコードする核酸である。
【００１１】
本発明において、フェノールオキシダーゼ活性は、基質に対する酸化活性、染料に対する脱色活性等を測定することにより評価される活性をいう。
【００１２】
前記「基質に対する酸化活性」は、測定対象となるポリペプチドの存在下、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミン化合物等を水素供与体として用いて酸素分子を還元する、基質の直接的な酸化反応を測定することによって求められうる。水素供与体としては、例えば、２，６−ジメトキシフェノール、オルト−アミノフェノール、パラ−フェニレンジアミン等を挙げることができる。前記酸化活性は、例えば、シリンガルダジン（５３０ｎｍ）、２，６−ジメトキシフェノール及びパラ−フェニレンジアミン（４７０ｎｍ）、オルト−アミノフェノール（４２０ｎｍ）における吸光度の変化により測定される。具体的には、０．２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ０．８９６ｍｌに、０．０５Ｍ ２，６−ジメトキシフェノール水溶液 ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得る。この基質溶液と測定対象となるポリペプチドを含む溶液 ０．００４ｍｌとを混合して、２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を開始させる。ついで、この２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を、４７０ｎｍにおける吸光度の変化により測定することによって、前記酸化活性を求められうる。前記酸化活性は、各基質に応じた波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義される。
【００１３】
本発明の核酸としては、具体的には、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである核酸の塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有した核酸が挙げられる。
【００１４】
前記（ａ）において、配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）をｐＨ６．０〜１２．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜１１．０、さらに好ましくはｐＨ８．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ９．０付近で培養することにより、中性ｐＨで高い活性を示す酵素として検出される中性フェノールオキシダーゼのアミノ酸配列である。
【００１５】
本発明の核酸は、コードされるポリペプチドが、前記基質に対する酸化活性の評価により、至適ｐＨ５．０〜８．０、好ましくは、至適ｐＨ５．０〜７．５を有することが示されるポリペプチドであれば、該核酸のバリアントであってもよい。前記バリアントは、自然発生のバリアントであってもよく、人為的に創出されたバリアントであってもよい。前記バリアントとしては、特に限定されないが、例えば、前記（ｃ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列を含有した核酸が挙げられる。
【００１６】
前記（ｂ）において、「少なくとも１個」とは、コードされるポリペプチドが、前記基質に対する酸化活性の評価及び／又は染料に対する脱色活性の評価により、至適ｐＨ５．０〜８．０、好ましくは、至適ｐＨ５．０〜７．５を有することを示すポリペプチドである範囲であればよく、例えば、１又は複数個、好ましくは、１又は数個であればよい。前記（ｂ）の塩基配列は、好ましくは、配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードすることが望ましい。
【００１７】
本明細書において、「アミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入」としては、例えば、
１） 配列番号：２において、フェノールオキシダーゼ活性の発現及び／又は該フェノールオキシダーゼ活性を発現するための立体構造の維持に無関係のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入（変異）、
２） 配列番号：２において、フェノールオキシダーゼ活性の発現及び／又は該フェノールオキシダーゼ活性を発現するための立体構造の維持に必須のアミノ酸残基の保存的置換、
等が挙げられる。
【００１８】
前記保存的置換としては、例えば、
− 疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等に類似した機能を発揮するアミノ酸残基（以下、本明細書においては、類似アミノ酸残基ともいう）との置換、
− 本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみしか該ポリペプチドの立体構造、折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸残基との置換
等が挙げられる。前記保存的置換としては、より具体的には、例えば、下記１．〜６．：
１．グリシン、アラニン；
２．バリン、イソロイシン、ロイシン；
３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；
４．セリン、スレオニン；
５．リジン、アルギニン；
６．フェニルアラニン、チロシン；
のいずれかの類似アミノ酸残基のグループ内でのアミノ酸残基の置換が挙げられる。
【００１９】
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」とは、中ストリンジェントな条件、好ましくは、高ストリンジェントな条件をいう。前記「ストリンジェントな条件」としては、より具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５重量％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡと５０体積％ ホルムアミドとを含む溶液中、室温、よりストリンジェントには、４２℃、一層ストリンジェントには、６０℃で１０時間インキュベーションし、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、室温、４２℃以上、よりストリンジェントには、５５℃、さらにストリンジェントには、６０℃等の条件下での洗浄を行なう条件が挙げられる。本発明においては、前記「ストリンジェントな条件」は、好ましくは、配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードする核酸との特異的なハイブリダイゼーションが達成されうる条件であることが望ましい。
【００２０】
本明細書において、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象の配列）を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、適切にアラインメントし、算出されうる。本明細書においては、前記マルチプルアラインメントにおける設定条件としては、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件（デフォルト値）が挙げられる。
【００２１】
なお、本明細書における配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの他、例えば、配列解析ソフト、具体的には、商品名：ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェア開発株式会社製）によるマルチプルアラインメントにおいて使用可能なアルゴリズムをデフォルト値の条件で用いて、算出された値であってもよい。
【００２２】
本発明においては、前記配列同一性は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも６５％、好ましくは、７０％以上、より好ましくは、７５％以上、さらに好ましくは、８０％以上、よりさらに好ましくは、８５％以上であることが望ましい。
【００２３】
前記（ａ）の塩基配列を含有した核酸は、例えば、慣用の化学合成により、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列を有する核酸を合成すること；配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列に基づき設計されたプライマー対及び／又はプローブを用い、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等の慣用の技術により、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の核酸から、取得すること等により得られうる。なお、得られた核酸は、ジデオキシ法、マキサム・ギルバート法、これらの方法に基づく改良法等により、配列決定することにより、前記（ａ）の塩基配列を含有するものであることを確認することにより、評価されうる。
【００２４】
前記（ａ）の塩基配列を含有した核酸は、具体的には、特に限定されないが、例えば、下記工程（１）〜（５）：
（１） フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）をフェノールオキシダーゼの発現に適した条件下に培養して、細胞中におけるフェノールオキシダーゼをコードするｍＲＮＡの発現量を増加させる工程、
（２） 前記工程（１）の後の細胞から、ｍＲＮＡを得る工程、
（３） 前記工程（２）で得られたｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴプライマー、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列に基づき設計されたプライマー対等を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行なう工程、
（４） 前記工程（３）で得られた産物を、適切なベクターに連結し、得られたベクターを用いて、適切な宿主細胞を形質転換する工程、
（５） 前記工程（４）で得られた形質転換体について、配列番号：１若しくは縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列又はその部分配列を保持し、フェノールオキシダーゼ活性を発現する形質転換体を選抜する工程、及び
部分配列を含むクローンが得られた場合、任意に、（６）５’ＲＡＣＥ、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ等により、フェノールオキシダーゼをコードする核酸の全長を得る工程、
を行なう方法等により、得られうる。なお、前記工程（２）の後、（３’）工程（２）で得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを作製する工程、
（４’）配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列に基づき設計されたプローブを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等により、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、フェノールオキシダーゼをコードする核酸又はその一部を含むクローンを得る工程、
（５’）前記工程（４’）で得られた形質転換体について、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列を保持し、フェノールオキシダーゼ活性を発現する形質転換体を選抜する工程、及び
フェノールオキシダーゼをコードする核酸の一部を含むクローンが得られた場合、任意に、（６’）５’ＲＡＣＥ、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ等により、フェノールオキシダーゼをコードする核酸の全長を得る工程、
を行なってもよい。
【００２５】
なお、前記「フェノールオキシダーゼの発現に適した条件」としては、例えば、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）の菌糸体の小片を、液体培養用培地１｛組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部 水 （ｐＨ５．２）；１２１℃で１５分間滅菌したもの]中、２５℃で７日間、往復振とう培養（１５０往復／分）し、得られた培養液全量を、２Ｌ容三角フラスコ中５００ｍｌの前記液体培養用培地１に添加し、２５℃で３週間、往復振とう培養（１００往復／分）を行ない、得られた菌糸体を、液体培養用培地２〔組成：１．０重量％ グルコース、０．１重量％ 酵母エキス、０．１４重量％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．３６重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１０重量％ ミネラル混合液（組成：１．０重量％ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．０重量％ ＺｎＣｌ2、０．７重量％ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ）、ｐＨ９．２；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕で、２５℃で３日間培養すること等が挙げられる。かかる条件下における菌糸体の培養は、細胞中における当該フェノールオキシダーゼに対応するｍＲＮＡの存在比が向上し、本発明の核酸の取得が可能になる点で有利である。
【００２６】
前記プライマー対は、それぞれ、連続した少なくとも９ヌクレオチド長、好ましくは、連続した９〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは、連続した１２〜３０ヌクレオチド長であることが望ましい。また、前記プライマー対は、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列を基に、二次構造の形成、Ｔｍ値等を考慮し、慣用のプライマー設計用ソフトウェア等により、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列を含有した核酸又はその一部を増幅するに適した配列を有する２種のプライマーとして、設計されうる。
【００２７】
前記プローブとしては、本発明の核酸若しくはその相補鎖の全部又は一部が挙げられ、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸、該核酸の相補鎖、それらの一部等があげられる。前記プローブは、フェノールオキシダーゼをコードする核酸との特異性を十分に得る観点から、少なくとも１２ヌクレオチド長であることが望ましい。なお、前核酸又は相補鎖の一部は、本発明の核酸又はその相補鎖に特徴的な塩基配列からなる断片であってもよい。前記「本発明の核酸又はその相補鎖に特徴的な塩基配列」は、特に限定されないが、例えば、データベースの配列に対して、配列同一性が、好ましくは、１５％以下、より好ましくは、１０％以下、特に好ましくは、０％である塩基配列等が挙げられる。
【００２８】
なお、前記プローブ又はプライマー対の設計、慣用の遺伝子操作（例えば、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）は、例えば、モレキュラークローニング ア ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ、１９８９〕等が参照されうる。
【００２９】
前記バリアントの核酸は、自然界の生物からスクリーニングすること；前記（ａ）の塩基配列を含有した核酸に対して、人為的に所望の変異を導入すること等により得られうる。
【００３０】
自然界の生物からスクリーニングする場合、例えば、評価対象の生物から抽出された核酸について、前記プローブを用いて、前記「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションにより、スクリーニングすること；前記核酸について、前記プライマー対を用いたＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等による増幅産物の有無を調べること等が行なわれうる。一方、前記核酸のバリアントを人為的に創出する場合、該バリアントは、例えば、慣用の部位特異的変異導入方法等により作製されうる。
【００３１】
本発明の核酸は、前記（ａ）〜（ｄ）いずれかの塩基配列を含有するものであるため、適切な宿主において発現させることにより、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、かつ大量に供給することができるという優れた効果を発揮する。
【００３２】
本発明は、他の側面では、本発明の核酸によりコードされた組換えフェノールオキシダーゼに関する。
【００３３】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、本発明の核酸によりコードされるものであるため、
− 種々の化合物に対して、中性付近で作用すること
− 中性ｐＨから弱アルカリ性ｐＨまでの広い範囲で高い安定性を示すこと
− 種々の基質、特に、フェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物のいずれに対しても、至適ｐＨの変動が小さいこと
等の優れた性質を発現する。したがって、本発明の組換えフェノールオキシダーゼによれば、環境、人体に対して温和な条件下での線維や毛髪の染色等が可能になる。
【００３４】
また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、本発明の核酸によりコードされ、該核酸を発現させることにより得られるものであるため、安価で大量に供給できる。また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、本発明の核酸によりコードされ、該核酸を発現させることにより得られるものであるため、高い純度であるという優れた性質を有する。したがって、厳密な触媒反応を要する用途、例えば、化合物の合成等に好適である。
【００３５】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより算出した場合、２８ｋＤａの分子量を有する。前記分子量は、例えば、目的のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に供して、移動度を測定し、得られた測定値と、分子量が既知である分子量マーカーの移動度とを比較することにより算出されうる。
【００３６】
また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、至適ｐＨ５．０〜８．０、好ましくは至適ｐＨ５．０〜７．５を示す。本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、前記ｐＨ範囲で優れた酵素活性を示すため、水ベースの反応溶液を用いることができ、効率よく酵素反応を行なうために特別なｐＨ調整が必要とされないという優れた効果を発揮する。また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、水ベースの反応溶液を用いることができ、具体的には、例えば、特別なｐＨ調整を行っていない基質と酵素の水溶液でも効率よく反応を行なうことができる。
【００３７】
さらに、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、具体的にはフェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物を基質とする酸化反応において、中性付近、具体的には、ｐＨ５．０〜８．０、好ましくは、ｐＨ５．０〜７．５に至適ｐＨを有する。より具体的には、本発明のフェノールオキシダーゼは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜約７．５、より至適な範囲として、約５．０〜７．０であり、オルトアミノフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜８．０、より至適な範囲として約６．０〜７．５であり、パラフェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜６．５、より至適な範囲として、約５．０〜５．５である。
【００３８】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、中性ｐＨ〜弱アルカリ性ｐＨまでの広範囲で高いｐＨ安定性を示すという優れた性質を有する。具体的には、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、ｐＨ７．０〜１０．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも２５％の相対残存活性、好ましくは、ｐＨ７．５〜９．５において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも５０％の相対残存活性、より好ましくは、８．０〜９．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する。
【００３９】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、４０℃において、ｐＨ８．５で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも６０％の相対残存活性を維持するという熱安定性を示す。すなわち、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、前記温度範囲において優れた酵素活性を示すため、特別な温度条件に調整することなく、日常の生活温度（室温、水温、体温、気温等）で高い酵素活性を示す。したがって、本発明の組換えフェノールオキシダーゼによれば、染色、廃液処理、高分子化合物の合成などを簡便に行なうことができる。
【００４０】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、例えば、本発明の核酸を適切なベクターに組込み、得られた発現ベクターを用いて適切な宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより発現させうる。かかる発現ベクター及び形質転換体も本発明に含まれる。
【００４１】
本発明は、さらに他の側面では、本発明の核酸を含有した発現ベクターに関する。
【００４２】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸を含有するものであるため、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させることができる。
【００４３】
本発明の発現ベクターに用いられうるベクターとしては、組換えフェノールオキシダーゼを発現させるための宿主の種類、組換えフェノールオキシダーゼの用途等に応じて、適宜選択されうるが、例えば、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
【００４４】
前記ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａ、ｐＫＣＲ、これらの誘導体等が挙げられる。かかるベクターには、誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーター等のエレメント、分泌シグナル配列等をコードする核酸等を適宜有していてもよい。なお、誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いる場合、本発明の核酸は、該プロモーターと作動可能に連結される。
【００４５】
また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼを容易にかつ大量に製造する観点から、組換えフェノールオキシダーゼを、細胞外に分泌させうるベクター；組換えフェノールオキシダーゼを誘導発現させうるベクター；組換えフェノールオキシダーゼを、慣用の融合パートナー（Ｈｉｓタグ等）との融合タンパク質として発現させうるベクター等を用いてもよい。
【００４６】
本発明の発現ベクターは、本発明の組換えフェノールオキシダーゼを容易にかつ大量に製造する観点から、本発明の核酸の上流に、シグナル配列をコードする核酸が作動可能に連結されたベクターが好ましい。
【００４７】
本発明は、別の側面では、本発明の発現ベクターを含有した形質転換体に関する。
【００４８】
本発明の形質転換体は、本発明の核酸を含有しているため、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させることができるという優れた効果を発揮する、
【００４９】
本発明の形質転換体によれば、組換えフェノールオキシダーゼを回収、精製等に適した状態で発現させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明によれば、安価に組換えフェノールオキシダーゼを供給することができる。
【００５０】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを適切な宿主に導入することにより作製されうる。
【００５１】
前記宿主としては、本発明の核酸を導入し、組換えフェノールオキシダーゼを発現させるに適したものであればよく、例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞等が挙げられる。なかでも、本発明の核酸の供給源となる生物から単離されたフェノールオキシダーゼ（天然型フェノールオキシダーゼともいう）の性質を十分に発現させる観点から、酵母細胞、糸状菌が好ましい。
【００５２】
前記酵母細胞としては、例えば、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ） ＧＳ１１５株、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１株、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＳＭＤ１１６８株、サッカロマイセス セルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等挙げられる。
【００５３】
宿主への発現ベクターの導入方法としては、公知の導入方法が使用でき、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５４】
本発明の形質転換体は、組換えフェノールオキシダーゼを回収、精製等に、より適した状態で発現させる観点から、好ましくは、本発明の核酸の上流に、シグナル配列、具体的には、プレウロタス サジャー−カジュ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ）の分泌シグナルをコードする核酸が作動可能に連結されたベクター〔例えば、後述の実施例におけるｐＰＩＣ−Ｆ１（図２）等〕を、酵母細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株に導入して得られた形質転換体が望ましい。
【００５５】
本発明は、さらに別の側面では、本発明の形質転換体を培養し、培養物中に組換えフェノールオキシダーゼを生成させ、回収することを特徴とする、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法に関する。
【００５６】
本発明の形質転換体は、本発明の形質転換体が用いられているため、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、大量に、高い純度で得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００５７】
また、本発明の製造方法によれば、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間等について組換えフェノールオキシダーゼの発現の最適な条件を決定することによって、より効率よく組換えフェノールオキシダーゼを生産させることができる。
【００５８】
形質転換体の培養は、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株の場合、該Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株を、液体培養用培地３｛組成：１重量％ 酵母エキス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、２重量％ ポリペプトン〔日本製薬社製〕、２重量％ デキストロース〔ナカライテスク（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）社製〕、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの｝中、３０℃で一晩、往復振とう培養（１２０往復／分）し、得られた形質転換体の細胞を、液体培養用培地４｛組成：１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４重量％ 商品名：イーストニトロジェンベース （インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）、４×１０−５重量％ Ｄ−ビオチン （ナカライテスク 社製）、５体積％ メタノール、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの｝中、２４時間ごとに０．５体積％メタノールを追加しながら、２０℃で６日間、往復振とう培養（１２０往復／分）することが望ましい。
【００５９】
形質転換体の培養物からの組換えフェノールオキシダーゼの精製には、慣用のタンパク質精製法が用いられうる。
【００６０】
具体的には、形質転換体が、その細胞内に組換えフェノールオキシダーゼを蓄積するものである場合、培養終了後、遠心分離によって細胞を集め、得られた細胞を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得、該無細胞抽出液を、塩析、イオン交換（陽イオン交換又は陰イオン交換）クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法により精製することができる。かかる形質転換体においては、組換えフェノールオキシダーゼが細胞内に蓄積されるため、他の夾雑タンパク質に比べ、組換えフェノールオキシダーゼの割合が大きくなるため、精製を容易に行なうことができる。一方、形質転換体が、組換えフェノールオキシダーゼを細胞外に分泌するものである場合、培養上清から同様に精製を行なえばよい。かかる形質転換体を用いた場合、培養上清に組換えフェノールオキシダーゼが大量に蓄積されるため、より容易に、安価で、迅速に、精製を行なうことができる。
【００６１】
なお、組換えフェノールオキシダーゼが、インクルージョンボディーとして得られた場合、慣用のタンパク質の再生方法により、活性を示すポリペプチドとして、組換えフェノールオキシダーゼが得られうる。前記タンパク質の再生方法としては、例えば、形質転換体の培養終了後、遠心分離によって形質転換体の細胞を回収し、超音波処理等によって破砕し、遠心分離等を行なうことによりインクルージョンボディーを回収し、該インクルージョンボディーを、例えば、尿素、グアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じて前記タンパク質精製法により精製し、透析法、希釈法等を用いたリフォールディング操作を行なうこと等が挙げられる。
【００６２】
組換えフェノールオキシダーゼの発現の確認は、前記と同様に、フェノールオキシダーゼ活性を測定することにより行なわれうる。
【００６３】
本発明は、よりさらに別の側面では、本発明の組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体に関する。本発明の抗体によれば、本発明の組換えフェノールオキシダーゼに結合するため、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼの回収、精製、スクリーニング等が可能になる。
【００６４】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明の抗体には、本発明の組換えフェノールオキシダーゼに対する結合性を呈するものであれば、抗体断片も含まれる。前記抗体断片としては、例えば、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント等が挙げられる。
【００６５】
本発明の抗体は、本発明の組換えフェノールオキシダーゼを用いて、ウサギ等の動物を免疫し、該動物から採血し、慣用の手法により精製を行なうことにより得られうる。かかる手法として、例えば、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ）編、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９２）等が参照される。
【００６６】
前記Ｆａｂフラグメントは、モノクローナル抗体を、パパインで消化することにより得られうる。また、前記Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、モノクローナル抗体を、ペプシンで消化することにより得られうる。
【００６７】
また、本発明の抗体について、本発明の組換えフェノールオキシダーゼと、他のフェノールオキシダーゼ等との交差反応を調べることにより、本発明の組換えフェノールオキシダーゼに対する特異性を評価されうる。
【００６８】
以下、本発明を実施例等により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、以下に示す播種、菌糸体の切り分け、及び培地の添加の各操作を、クリーンベンチ内で行なった。
【実施例１】
【００６９】
１白金耳相当量のフラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）を、固体培養用寒天培地｛組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製｝、２．０重量％ 寒天、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕 １０ｍｌを含む滅菌シャーレに播種し、２５℃で１０日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳にて５ｍｍ四方に切り分け、小片を得た。前記小片 １０片を、液体培養用培地１｛組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの｝に播種し、２５℃で、往復振とう培養（１５０往復／分）を行なった。なお、前記液体培養用培地１として、ｐＨを４．０から９．０の範囲で任意に調整された培地のそれぞれを用いた。得られた培養物について、フェノールオキシダーゼの活性を調べた。
【００７０】
酵素活性（酸化活性）は、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）又はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を緩衝液とし、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いて、４７０ｎｍにおける吸光度の変化により測定した。具体的には、９６穴のマイクロプレート〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、Ｃｏｓｔｅｒ（登録商標）３３６８〕のウェル内で、０．２Ｍ 前記緩衝液 ０．１ｍｌに、０．０２５Ｍ パラ−フェニレンジアミン水溶液 ０．０８ｍｌを添加し、基質溶液を調製した。この基質溶液について、Ｍｕｌｔｉ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（大日本製薬株式会社製、商品名：Ｖｉｅｎｔｏ）を用いて吸光度を測定することにより、酵素活性を求めた。なお、酵素活性は、４７０ｎｍにおける吸光度を、１分間で１上昇させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
【００７１】
各培養条件で７日間培養を行なった結果、ｐＨ５．０及びｐＨ８．０のそれぞれの反応ｐＨにおける酵素活性測定は、共に、培養日数が７日目で酵素活性が最も高く、すべての培養ｐＨ条件で、培養日数の経過により、酵素活性の増加を示した。
【００７２】
ｐＨ５．０にて酵素活性を測定した結果、ｐＨ４．０から９．０のｐＨ範囲で培養した各培養液において、すべて明確な酵素活性がみられなかった。具体的には、最も高い酵素活性を示したのは、ｐＨ９．０の培養条件で７日間培養することにより得られた培養液であったが、反応開始から１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、わずか０．１２であった。また、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液について、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、０．０６であった。
【００７３】
一方、ｐＨ８．０にて酵素活性を測定した結果、ｐＨ５．０から９．０のｐＨ範囲で培養した各培養液において、すべて明確な酵素活性が示された。なお、ｐＨ４．０で培養することにより得られた培養液は、明らかな酵素活性を示さなかったが、培養日数による酵素活性の増加がみられた。
【００７４】
また、培養ｐＨが高いｐＨである培養液ほど、高い酵素活性を示した。最も高い酵素活性を示した培養液は、ｐＨ９．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液で、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、１．２７であった。また、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液について、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、０．７８であった。
【００７５】
以上の結果から、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）において誘導されるフェノールオキシダーゼは、中性フェノールオキシダーゼであり、また、酸性側に至適ｐＨを有する酸性フェノールオキシダーゼ又は酸性フェノールオキシダーゼは誘導されないことがわかった。また、フラムリナ ベルティペスにおいては、ｐＨ８．０での酵素活性は、ｐＨ９．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液の酵素活性は、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液の酵素活性と比較して、約１．６倍も高くなることがわかった。
【００７６】
以上の結果から、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）中において、中性ｐＨで強い活性を示すフェノールオキシダーゼが存在することがわかった。
【実施例２】
【００７７】
固体培養用寒天培地〔組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、２．０重量％ 寒天、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕 １０ｍｌを含む滅菌シャーレに、エノキダケ〔フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕を１白金耳相当量播種し、２５℃で１０日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳にて５ｍｍ四方に切り分けた。前記小片 １０片を、液体培養用培地１〔組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部 水（ｐＨ５．２）；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕に播種し、２５℃で７日間、往復振とう培養（１５０往復／分）を行なった。得られた培養液全量を、２Ｌ容の三角フラスコ中５００ｍｌの前記液体培養用培地１に添加し、２５℃で３週間、往復振とう培養（１００往復／分）を行なった。
【００７８】
その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、培養液を取り去り、残部の菌糸体に、液体培養用培地２〔組成：１．０重量％ グルコース、０．１重量％ 酵母エキス、０．１４重量％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．３６重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１０重量％ ミネラル混合液（組成：１．０重量％ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．０重量％ ＺｎＣｌ2、０．７重量％ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ）、ｐＨ９．２；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕 ５００ｍｌを添加し、さらに２５℃で３日間培養した。
【００７９】
その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、デカンテーションにより培養液を回収した。
【００８０】
回収された培養液は、淡黄色若しくは黄褐色の清澄又は濁った液体であった。回収された培養液は、全容量３０６０ｍｌ、総力価１３１００Ｕ、総タンパク質量７７８ｍｇ、比活性１６．８Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【００８１】
前記培養液を凍結乾燥し、凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物を、１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、酵素溶液を得た。前記酵素溶液５０μｌを、１２．５重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いた未変性ＰＡＧＥに供した。未変性ＰＡＧＥ後のゲルを、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で振とう攪拌し、ついで、１ｍＭ オルトアミノフェノールを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中でゲルを５分間振とう攪拌することによって活性染色を行なった。その後、活性を示したバンドを切り出して、２５ｍＭ トリス−１９２ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．２）中、３０分間、振とう攪拌することにより洗浄を行った。洗浄後のゲルを、１２．５重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを転写装置〔マリソル（Ｍａｒｙｓｏｌ）社製、ＫＳ−８４６０〕にセットし、ＨＩＦＲＥＤ ＣＯＮＳＴＡＮＴ ＰＯＷＥＲ ＳＵＰＰＬＹ〔マリソル（Ｍａｒｙｓｏｌ）社製、ＭＰ−７３５２〕を用いて、ゲル１ｃｍ2あたり１ｍＡの定電流で１．５時間通電し、商品名：ＰｒｏｂｌｏｔｔTM ｍｅｍｂｒａｎｅ〔アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕に転写させた。転写後のメンブランを染色液（組成：０．１重量％ クマシーブリリアントブルー Ｒ−２５０、４０体積％ メタノール、残部 水）中、３分間、振とう攪拌し、脱色液（組成：５０体積％ メタノール、残部 水）中でタンパク質のバンドが見えるまで振とう攪拌することにより、染色を行なった。
【００８３】
染色されたバンドを切り出して、プロテインシーケンサー（アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、Ｐｒｏｃｉｓｅ ＴＭ ４９２ ＨＴ）に供して、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。
【００８４】
その結果、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）のフェノールオキシダーゼは、アミノ末端アミノ酸配列として、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有することがわかった。
【実施例３】
【００８５】
前記実施例２と同様に、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）を、固体培養用寒天培地で培養し、得られた菌糸体を、液体培養用培地１で培養し、その後、液体培養用培地２で培養することにより、中性ｐＨで強い活性を示すフェノールオキシダーゼを産生させると共に細胞中におけるフェノールオキシダーゼに対応するｍＲＮＡの存在比を向上させた。
【００８６】
フェノールオキシダーゼ産生中のフラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）を、アドバンテック東洋社製、商品名：定性濾紙Ｎｏ．１等を用いて、回収し、液体窒素を用いて急冷し凍結させた。
【００８７】
得られたフラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）を、液体窒素存在下で、乳鉢と乳棒とを用いて、パウダー状になるまで磨砕し、凍結菌体粉末を得た。約１００ｍｇの凍結菌体粉末から、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）社製の商品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｋｉｔを用い、製造者の指示に従って、全ｍＲＮＡ抽出溶液（５０μｇ相当量） ２０μｌを調製した。
【００８８】
得られたｍＲＮＡを製造者の指示に従い、アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製の商品名：Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行ない、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００８９】
前記実施例３で得られたＮ末端アミノ酸配列（配列番号：３）に基づき、５’側プライマー（配列番号：５）を設計し、合成した。また、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属以外の真菌のフェノールオキシダーゼの公知のアミノ酸配列において、高い同一性を有するコンセンサス配列：ＷＦＬＨＣＨ（配列番号：４）とＤＮＡ配列に基づき、３’側プライマー（配列番号：６）を合成した。
【００９０】
前記プライマー（各２０ｐｍｏｌ）と、ｃＤＮＡ ５ｎｇとＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑTM （タカラバイオ社製）とを用い、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）の全ｃＤＮＡを鋳型とし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、フェノールオキシダーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。
【００９１】
なお、ＰＣＲ条件は、９５℃で５分のインキュベーション後、９５℃で１分間と５０〜６０℃で１分間と７２℃で５分間とを１サイクルとして３５サイクルの反応を行ない、７２℃で１０分間インキュベーションする条件とした。
【００９２】
得られたＰＣＲ産物を、Ｔｒｉｓ／アセテート／ＥＤＴＡバッファー〔組成：０．４８４重量％ トリス、０．１４体積％ 酢酸、０．０７８８５重量％ エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸三ナトリウム塩、残部 水〕中、２．０重量％ アガロースゲルで電気泳動し、約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片に対応するバンドを切り出し、ゲル断片を得た。ついで、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用い、製造者の指示に従って、前記ゲル断片中のＤＮＡ断片を精製した。
【００９３】
得られたＤＮＡ断片を、製造者の指示に従って、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕を用いて、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒにクローン化した。なお、１．３ｋｂのＤＮＡを含むプラスミドを、ｐＧＥＭ−Ｆ１−Ｎという。
【００９４】
得られたベクターを精製し、鋳型として、製造者の指示に従って、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＰｒｉｍｅｒTM Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ〔アマシャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕を用いて、日立ＳＱ５５００Ｅ型 ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（日立製作所製）で解析して塩基配列を決定した。
【００９５】
決定された塩基配列中、ＳａｃＩ認識部位の上流の配列に基づき、５’側プライマー（配列番号：７）を合成した。また、アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製、商品名：Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔに含まれるオリゴヌクレオチド（配列番号：８）をプライマーとして、前記と同様に、ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行なった。その結果、約７００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。その後、得られたＤＮＡ断片を、前記と同様に、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒにクローン化した。得られたベクターを鋳型とし、前記と同様に、塩基配列を決定した。なお、７００ｂｐのＤＮＡを含むプラスミドを、ｐＧＥＭ−Ｆ１−Ｃという。
【００９６】
決定された塩基配列を、配列番号：１に示す。また、決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００９７】
その結果、フェノールオキシダーゼは、４９６アミノ酸残基のアミノ酸配列からなることが推定され、推定アミノ酸配列には、既知のフェノールオキシダーゼに認められる１２箇所の銅結合部位が完全に保存されていることが確認された。
【００９８】
その後、上記の方法により得られた２種のプラスミドを制限酵素ＳａｃＩで消化後、連結し、フェノールオキシダーゼ全長遺伝子を含むプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｆ１）を得た。このｐＧＥＭ−Ｆ１のプラスミドマップを図１に示す。
【実施例４】
【００９９】
（１）フェノールオキシダーゼのピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）による異種発現系の構築
フェノールオキシダーゼ遺伝子の５’側の塩基配列とそのシグナル配列の３’側の塩基配列とに基づき合成したＰＣＲ用５’プライマー（配列番号：１１）と、フェノールオキシダーゼ遺伝子中のＥｃｏＲＩ認識部位の下流の塩基配列に基づき合成した３’プライマー（配列番号：１２）とを用い、ｐＧＥＭ−Ｆ１のＥｃｏＲＩ消化産物を鋳型としてＰＣＲを行ない、フェノールオキシダーゼ遺伝子の部分ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分のインキュベーション後、９４℃で３０秒間と５５℃で３０秒間と７２℃で３０秒間とを１サイクルとして２５サイクルの反応を行ない、７℃で１０分間、インキュベーションする条件とした。
【０１００】
得られたＰＣＲ産物（フェノールオキシダーゼ遺伝子５’改変の部分ＤＮＡ）にシグナル領域に対応する核酸を付加するために、ＰＣＲ用５’プライマー（配列番号：９）と、ＰＣＲ用３’プライマー（配列番号１０及び１２）とを用い、上記のＰＣＲ産物を鋳型としてＰＣＲを行ない、シグナル領域が付加されたフェノールオキシダーゼ遺伝子の部分ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分のインキュベーション後、９４℃で３０秒間と５５℃で３０秒間と７２℃で３０秒間とを１サイクルとして３０サイクルの反応を行ない、７２℃で１６分間インキュベーションする条件とした。
【０１０１】
得られたＰＣＲ産物（シグナル領域に対応する核酸を含むフェノールオキシダーゼ遺伝子の部分ＤＮＡ断片）及びｐＧＥＭ−Ｆ１の両方を、それぞれＥｃｏＲＩとＮｏｔＩとで消化した。
【０１０２】
得られた産物を、アガロースゲル電気泳動に供した。対応するバンドをゲルから切り出し、得られたゲル断片から、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用いＤＮＡ断片を抽出した。
【０１０３】
得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ消化プラスミドｐＰＩＣ３．５ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に連結して酵母形質転換用プラスミド（ｐＰＩＣ−Ｆ１）を得た。前記ｐＰＩＣ−Ｆ１のプラスミドマップを図２に示す。
【０１０４】
また、商品名：Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマニュアルに従い、前記ｐＰＩＣ−Ｆ１を、制限酵素ＭｓｓＩで開環し、エレクトロポレーション法により酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株を形質転換した。得られた形質転換酵母は、Ｈｉｓ+（ヒスチジン非要求性）である。
【０１０５】
（２）形質転換菌の培養と形質転換菌のスクリーニング
前記（１）で得られた形質転換酵母（Ｈｉｓ+）の適量を、ＭＤ寒天平板培地〔組成：１．３４重量％ ＹＮＢ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、４×１０-5重量％ ビオチン、 ２重量％ Ｄ−グルコース〕に塗布し、３０℃で一晩培養し、十分生育させた。得られたプレートに滅菌水を加え、形質転換酵母を懸濁した。得られた懸濁液を、適量のＧ４１８〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を含むＹＰＤ寒天平板培地〔１重量％ 酵母抽出物（ナカライテスク社製）、 ２重量％ ペプトン（日本製薬社製）、 ２重量％ Ｄ−グルコース、１．５重量％ 寒天〕に、一枚あたり１０5個の細胞となるように塗布し、３０℃で培養した。
【０１０６】
０．２５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＹＰＤ寒天平板培地に生育した形質転換酵母を、制限酵素ＭｓｓＩで開環したｐＰＩＣ−Ｆ１を用いて、再度形質転換して、同様の操作により、３．０ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８に耐性を示すコロニー（Ｇ４１８高耐性株）をスクリーニングした。
【０１０７】
（３）組換えフェノールオキシダーゼ（ｒＦ１）の発現
前記（２）で得られたＧ４１８高耐性株を、４ｍｌのＹＰＤ液体培地〔組成：１重量％ 酵母抽出物（ナカライテスク社製）、２重量％ ペプトン、２重量％ Ｄ−グルコース〕に接種して、試験管中で３０℃、２４時間振とう培養した。得られた培養物 ４ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコ中の１００ｍｌ ＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離に供して、酵母を回収し、適量のＢＭＭ最小培地〔組成：１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、１．３４重量％ ＹＮＢ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、４×１０-5重量％ ビオチン、０．５体積％ メタノール〕に再懸濁した。得られた懸濁液を、０．２ｍＭ ＣｕＣｌ2を含む４００ｍｌ ＢＭＭ最小培地（２Ｌ容三角フラスコ）に全量を接種した。
【０１０８】
２４時間ごとに、終濃度０．５体積％のメタノールを発現誘導基質として添加しながら２０℃で４日間振とう培養した。前記メタノールによる誘導により、組換えフェノールオキシダーゼ（ｒＦ１）を誘導発現させ、培養液中に放出させた。全量７．２Ｌの培養液から遠心分離により酵母細胞を除き、培養上清液として、粗酵素液を得た。
【０１０９】
０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）８００μｌに１０％のジメチルスルホキシドを含むオルトアミノフェノール水溶液 ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と粗酵素液 ０．１ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４２０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、オルトアミノフェノールを基質とした場合の酵素活性を測定した。なお、４２０ｎｍにおける吸光度を１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。その結果、得られた粗酵素液は、全容量７．０７Ｌ、総力価１８，６００Ｕ、総タンパク質５６００ｍｇ、比活性３．３Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【０１１０】
前記粗酵素液に、硫酸アンモニウム（ナカライテスク社製、試薬特級）を徐々に添加しながら、攪拌し、２５％ 飽和となるように調整した。これを、２５％ 飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した商品名：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ〔東ソー株式会社社製〕を充填したカラム（４．８×２０ｃｍ）に吸着させた。吸着後、２５％ 飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） ２Ｌを用いてカラムを洗浄した。その後、硫酸アンモニウムを２５〜０％飽和の濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記カラムに吸着された組換えフェノールオキシダーゼを溶出した。組換えフェノールオキシダーゼの画分を、得られた溶出画分についてパラフェニレンジアミンに対する酵素活性を測定することにより決定した。
【０１１１】
前記組換えフェノールオキシダーゼの画分を、商品名：Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｓｉｚｅ３６〔和光純薬工業株式会社製〕を用いて、５０ｍＭ トリス硫酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行ない、組換えフェノールオキシダーゼ溶液を得た。
【０１１２】
前記組換えフェノールオキシダーゼ溶液を、５０ｍＭ トリス硫酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化した商品名；ＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ〔東ソー株式会社製〕を充填したカラム（２．４×４０ｃｍ）に吸着させた。吸着後、０．１Ｍ 硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ トリス硫酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用い、２８０ｎｍにおける溶出液の吸光度が０．１以下になるまでカラムを洗浄した。その後、硫酸ナトリウムを０．１〜０．３５Ｍの濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記カラムに吸着された組換えフェノールオキシダーゼを溶出した。組換えフェノールオキシダーゼの画分は、得られた溶出画分についてパラフェニレンジアミンに対する酵素活性と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラフェニレンジアミンによる活性染色とを行うことにより決定された。組換えフェノールオキシダーゼの精製の一例を、表１に示す。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
前記組換えフェノールオキシダーゼの画分を、１０重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを、０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で平衡化し、その後、１ｍＭ パラフェニレンジアミンを含む０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で該ゲルを振とうすることにより、活性染色を行なった。
【０１１５】
また、前記組換えフェノールオキシダーゼの画分を、商品名：Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ−１０〔ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製〕を用いて、約１０倍量となるように濃縮した。得られた濃縮液を試料として、１０重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。前記試料に還元剤を添加せず、加熱処理を行なわない点以外、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法に従って電気泳動を行なった。泳動後のゲルを、染色用溶液〔組成：０．０５重量％ クマシーブリリアントブルー Ｒ２５０、５０体積％ メタノール、１０体積％ 酢酸、残部 水〕中で振とうした後、脱色用溶液〔組成：２５体積％ メタノール、７体積％ 酢酸、残部 水〕中で振とうすることにより、タンパク質染色を行なった。分子量マーカー〔アマシャム バイオサイエンシーズ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製、商品名：ＬＭＷ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ〕を同時に供し、移動度を比較することにより、組換えフェノールオキシダーゼの分子量を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の活性染色及びタンパク質染色を行なった結果を図３に示す。
【０１１６】
図３に示されるように、組換えフェノールオキシダーゼの画分は、活性染色及びタンパク質染色で単一のバンドを示し、分子量は２８ｋＤａであることがわかる。
【０１１７】
（４）組換えフェノールオキシダーゼの至適ｐＨ
５０ｍＭ パラフェニレンジアミン水溶液と、５０ｍＭ ２，６−ジメトキシフェノール水溶液と、５０ｍＭ オルトアミノフェノールの１０体積％ ジメチルスルホキシド溶液とを調製し、それぞれ、基質溶液とした。ｐＨをｐＨ４．５、ｐＨ５．３、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５及びｐＨ９．０それぞれに調整した混合緩衝液〔組成：０．２Ｍ 酢酸ナトリウム、０．２Ｍ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．２Ｍ トリス水溶液を、塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて目的のｐＨに調整〕 ８９５μｌと、５０ｍＭ 基質溶液 １００μｌと、組換えフェノールオキシダーゼ溶液 ５μｌ（０．１２５Ｕ、１．６μｇ）とを混合した。パラフェニレンジアミン及び２，６−ジメトキシフェノールについては、４７０ｎｍ、オルトアミノフェノールについては、４２０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。１分間に吸光度を１上昇させる酵素量を１単位（ユニット）とした。
【０１１８】
その結果、組換えフェノールオキシダーゼは、３種類の基質（パラフェニレンジアミン、２，６−ジメトキシフェノール、オルトアミノフェノール）に対して、中性付近で高い活性を示した。組換えフェノールオキシダーゼは、パラフェニレンジアミンに対して、ｐＨ５．０〜６．５において、最大活性を示すｐＨ５．３における活性と比較して、６０％以上の活性を示し、ｐＨ５．０〜５．５において、最大活性を示すｐＨ５．３における活性と比較して、８０％以上の活性を示した。また、組換えフェノールオキシダーゼは、２，６−ジメトキシフェノールに対して、ｐＨ５．０〜７．５において、最大活性を示すｐＨ６．５における活性と比較して、６０％以上の活性を示し、ｐＨ５．０〜７．０において、最大活性を示すｐＨ６．５における活性と比較して、８０％以上の活性を示した。さらに、組換えフェノールオキシダーゼは、オルトアミノフェノールに対しては、ｐＨ５．０〜８．０において、最大活性を示すｐＨ７．０の活性と比較して、６０％以上の活性を示し、ｐＨ６．０〜７．５において、最大活性を示すｐＨ７．０の活性と比較して、８０％以上の活性を示した。
【０１１９】
（５）組換えフェノールオキシダーゼのｐＨ安定性
組換えフェノールオキシダーゼ ２２μｌ（０．５３Ｕ、０．１７μｇ）をｐＨ２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０に調整した混合緩衝液〔組成；０．２Ｍ 酢酸、０．２Ｍ リン酸、０．２Ｍ ホウ酸水溶液を水酸化ナトリウム溶液により目的のｐＨに調整〕 ８８μｌと混合し、２５℃でインキュベーションした。インキュベーション開始から１時間後及び２０時間後、得られた混合溶液 ５０μｌと、０．５Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ８５０μｌと、５０ｍＭ オルトアミノフェノールの１０％ジメチルスルホキシド溶液 １００μｌとを混合し、波長４２０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。組換えフェノールオキシダーゼの１時間後のｐＨ安定性を、図４のパネル（Ａ）に、２０時間後のｐＨ安定性を、図４のパネル（Ｂ）に示す。
【０１２０】
組換えフェノールオキシダーゼは、ｐＨ３．５〜１１．０において、２５℃で１時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも２５％の相対残存活性を示した。また、ｐＨ４．０〜１０．５において、２５℃、１時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも５０％の相対残存活性を示した。また、ｐＨ７．０〜１０．０において、２５℃で１時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも８０％の相対残存活性を示した。
【０１２１】
また、組換えフェノールオキシダーゼはｐＨ７．５〜１０．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも２５％の相対残存活性を示した。また、ｐＨ７．５〜１０．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも５０％の相対残存活性を示した。また、ｐＨ８．０〜９．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも８０％の相対残存活性を示した。
【０１２２】
（６）組換えフェノールオキシダーゼの熱安定性
組換えフェノールオキシダーゼの溶出画分〔５０ｍＭ トリス硫酸緩衝液（ｐＨ８．５）〕を、４０℃及び５０℃でインキュベーションした。５、１０、１５、２０、３０、及び６０分後のそれぞれでサンプリングを行なった。インキュベーション後の前記溶液 ５０μｌと、０．５Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ８５０μｌと、５０ｍＭ オルトアミノフェノールの１０％ジメチルスルホキシド溶液 １００μｌとを混合し、波長４２０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。結果を図５に示す。図中、４０℃でインキュベーションの場合、ひし形、５０℃でインキュベーションの場合、四角で示す。
【０１２３】
その結果、組換えフェノールオキシダーゼは、５０℃で１０分間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性と比較して、２５％以上の相対残存活性を示し、５０℃で５分間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性と比較して、５０％以上の相対残存活性を示した。また、４０℃で２０分間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性と比較して、８０％以上の相対残存活性を示し、４０℃で６０分間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性と比較して、６０％以上の相対残存活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明によれば、環境、人体に対して温和な条件下での線維や毛髪の染色等を行なうことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、ｐＧＥＭ−Ｆ１の概略図を示す。図中、「Ｆ１」は、フェノールオキシダーゼ遺伝子を示す。
【０１２６】
【図２】図２は、酵母発現用プラスミドｐＰＩＣ−Ｆ１の概略図を示す。図中、「Ｆ１」は、フェノールオキシダーゼ遺伝子、「ｓｉｇｎａｌ」は、シグナル配列を示す。
【０１２７】
【図３】図３は、活性染色及びタンパク質染色の結果を示す。図３中、レーン１は、タンパク質染色の結果を示し、レーン２は、活性染色の結果を示し、レーンＭは、分子量マーカーを示す。
【０１２８】
【図４】図４は、組換えフェノールオキシダーゼのｐＨ安定性を調べた結果のグラフを示す。図４中、パネル（Ａ）は、１時間インキュベーション後のｐＨ安定性、パネル（Ｂ）は、２０時間インキュベーション後のｐＨ安定性を示す。
【０１２９】
【図５】図５は、組換えフェノールオキシダーゼの熱安定性を調べた結果のグラフを示す。図中、４０℃でインキュベーションの場合、ひし形、５０℃でインキュベーションの場合、四角で示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３０】
配列番号：３は、フェノールオキシダーゼのアミノ末端アミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号：４は、種々のフェノールオキシダーゼのコンセンサス配列である。
【０１３２】
配列番号：５は、プライマーの配列である。
【０１３３】
配列番号：６は、プライマーの配列である。
【０１３４】
配列番号：７は、プライマーの配列である。
【０１３５】
配列番号：８は、プライマーの配列である。
【０１３６】
配列番号：９は、プライマーの配列である。
【０１３７】
配列番号：１０は、プライマーの配列である。
【０１３８】
配列番号：１１は、プライマーの配列である。
【０１３９】
配列番号：１２は、プライマーの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェノールオキシダーゼをコードする核酸、組換えフェノールオキシダーゼ、発現ベクター、形質転換体、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法、及び組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体に関する。さらに詳しくは、中性付近で高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼをコードする核酸、組換えフェノールオキシダーゼ、発現ベクター、形質転換体、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法、及び組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェノールオキシダーゼは、フェノール化合物、ポリフェノール化合物等の種々の基質に対して酸化作用を有する酸化酵素である。前記フェノールオキシダーゼは、大気中の酸素の存在下で種々の基質の酸化を触媒することができるため、酸素存在下で中間体としてのラジカル種の生成に起因する発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適している。
【０００３】
フェノールオキシダーゼには、フェノールオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ（カテコールオキシダーゼ）、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等があげられる。
【０００４】
したがって、前記フェノールオキシダーゼは、臨床分析、バイオセンサー、パルプ及び繊維の漂白、合成板の製造、木質の改善、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造、有機化合物の合成、染色及び抜染、洗濯時の色移り防止、廃液中のフェノール及びアニリン化合物の除去、毒性化合物の解毒、内分泌撹乱物質の分解、ジュースの混濁防止、食品の苦渋味の除去、家畜飼料の体内消化の促進、悪臭の抑制、化石燃料の脱硫、有害環境物質の分解処理等の多方面への幅広い応用が期待されている。
【０００５】
前記フェノールオキシダーゼは、従来から種々の植物、細菌類及び真菌類等に見出されており、例えば、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｃｔｒｅａｔｕｓ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、オウリキュラリア・ポリトリカ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ）、ガノデルム・ルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍ ｌｕｃｉｄｕｍ）、コプリナス・ミカセウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍｉｃａｃｅｕｓ）、ダエダレオプシス・スチラシナ（Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ ｓｔｙｒａｃｉｎａ）、コリオラス コンソルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｃｏｎｓｏｒｓ）、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｔｉｐｅｓ）等の担子菌に、フェノールオキシダーゼが見出されている（例えば、特許文献１等を参照のこと）。
【０００６】
しかしながら、前記フェノールオキシダーゼは、種々の基質に対する酵素活性の至適ｐＨを酸性側に有し、使用用途が限定されること、用いる基質によって至適ｐＨが大きく変動し、中性付近で種々の基質に対して効率よく作用しないこと等の欠点がある。また、担子菌における当該フェノールオキシダーゼの生産性は低く、生産されたフェノールオキシダーゼの純度も低いという欠点がある。また、前記特許文献１記載のフェノールオキシダーゼは、酸性条件で培養することにより見出される酵素である。
【特許文献１】特開昭６０−１５６３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、環境、人体に対して温和な条件下での線維や毛髪の染色等に用いうる手段を提供することに関する。本発明の１つの側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、かつ大量に供給しうる、フェノールオキシダーゼをコードする核酸を提供することに関する。また、本発明の他の側面は、種々の化合物に対して、中性付近で作用すること、中性ｐＨから弱アルカリ性ｐＨまでの広い範囲で高い安定性を示すこと、基質による至適ｐＨの変動が小さいこと、安価で大量に供給できること、高い純度であること等の特性を有する、組換えフェノールオキシダーゼを提供することに関する。本発明のさらに他の側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させることができる、発現ベクターを提供することに関する。また、本発明の別の側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させること、該フェノールオキシダーゼを回収、精製等に適した状態で発現させること等の少なくとも１つを可能にする、形質転換体を提供することに関する。本発明のさらに別の側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、大量に、高い純度で得ることができる、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法を提供することに関する。本発明のよりさらに別の側面は、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼの回収、精製、スクリーニング等を可能にする抗体に関する。なお、本発明のさらなる課題は、本明細書の記載から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 （ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである核酸の塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなる、フェノールオキシダーゼをコードする核酸、
〔２〕 コードされるポリペプチドが、少なくともｐＨ５．０〜８．０にフェノールオキシダーゼ活性を有する、前記〔１〕記載の核酸、
〔３〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の核酸によりコードされてなる、組換えフェノールオキシダーゼ、
〔４〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の核酸を含有してなる、発現ベクター、
〔５〕 前記〔１〕又は〔２〕記載の核酸の上流に、シグナル配列をコードする核酸が作動可能に連結されてなる、前記〔４〕記載の発現ベクター、
〔６〕 前記〔４〕又は〔５〕記載の発現ベクターを含有してなる、形質転換体、
〔７〕 酵母細胞又は糸状菌に由来する、前記〔６〕記載の形質転換体、
〔８〕 前記〔６〕又は〔７〕記載の形質転換体を培養し、培養物中に組換えフェノールオキシダーゼを生成させ、回収することを特徴とする、前記〔３〕記載の組換えフェノールオキシダーゼの製造方法、並びに
〔９〕 前記〔３〕記載の組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のフェノールオキシダーゼをコードする核酸によれば、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを発現させ、高い収率で、安価に、かつ大量に供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、種々の化合物に対して、中性付近で作用し、中性ｐＨから弱アルカリ性ｐＨまでの広い範囲で高い安定性を示し、基質による至適ｐＨの変動が小さいという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、安価で大量に、高い純度で提供され得る。本発明の発現ベクターによれば、前記フェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の形質転換体によれば、前記フェノールオキシダーゼを、効率よく大量に、回収、精製等に適した状態で発現させることはできるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の組換えフェノールオキシダーゼの製造方法によれば、前記フェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、大量に、高い純度で得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の抗体によれば、前記フェノールオキシダーゼの回収、精製、スクリーニング等を簡便に、高い感度で行なうことができるという優れた効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、１つの側面では、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼ、すなわち、中性フェノールオキシダーゼをコードする核酸である。
【００１１】
本発明において、フェノールオキシダーゼ活性は、基質に対する酸化活性、染料に対する脱色活性等を測定することにより評価される活性をいう。
【００１２】
前記「基質に対する酸化活性」は、測定対象となるポリペプチドの存在下、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミン化合物等を水素供与体として用いて酸素分子を還元する、基質の直接的な酸化反応を測定することによって求められうる。水素供与体としては、例えば、２，６−ジメトキシフェノール、オルト−アミノフェノール、パラ−フェニレンジアミン等を挙げることができる。前記酸化活性は、例えば、シリンガルダジン（５３０ｎｍ）、２，６−ジメトキシフェノール及びパラ−フェニレンジアミン（４７０ｎｍ）、オルト−アミノフェノール（４２０ｎｍ）における吸光度の変化により測定される。具体的には、０．２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ０．８９６ｍｌに、０．０５Ｍ ２，６−ジメトキシフェノール水溶液 ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得る。この基質溶液と測定対象となるポリペプチドを含む溶液 ０．００４ｍｌとを混合して、２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を開始させる。ついで、この２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を、４７０ｎｍにおける吸光度の変化により測定することによって、前記酸化活性を求められうる。前記酸化活性は、各基質に応じた波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義される。
【００１３】
本発明の核酸としては、具体的には、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである核酸の塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有した核酸が挙げられる。
【００１４】
前記（ａ）において、配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）をｐＨ６．０〜１２．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜１１．０、さらに好ましくはｐＨ８．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ９．０付近で培養することにより、中性ｐＨで高い活性を示す酵素として検出される中性フェノールオキシダーゼのアミノ酸配列である。
【００１５】
本発明の核酸は、コードされるポリペプチドが、前記基質に対する酸化活性の評価により、至適ｐＨ５．０〜８．０、好ましくは、至適ｐＨ５．０〜７．５を有することが示されるポリペプチドであれば、該核酸のバリアントであってもよい。前記バリアントは、自然発生のバリアントであってもよく、人為的に創出されたバリアントであってもよい。前記バリアントとしては、特に限定されないが、例えば、前記（ｃ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列を含有した核酸が挙げられる。
【００１６】
前記（ｂ）において、「少なくとも１個」とは、コードされるポリペプチドが、前記基質に対する酸化活性の評価及び／又は染料に対する脱色活性の評価により、至適ｐＨ５．０〜８．０、好ましくは、至適ｐＨ５．０〜７．５を有することを示すポリペプチドである範囲であればよく、例えば、１又は複数個、好ましくは、１又は数個であればよい。前記（ｂ）の塩基配列は、好ましくは、配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードすることが望ましい。
【００１７】
本明細書において、「アミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入」としては、例えば、
１） 配列番号：２において、フェノールオキシダーゼ活性の発現及び／又は該フェノールオキシダーゼ活性を発現するための立体構造の維持に無関係のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入（変異）、
２） 配列番号：２において、フェノールオキシダーゼ活性の発現及び／又は該フェノールオキシダーゼ活性を発現するための立体構造の維持に必須のアミノ酸残基の保存的置換、
等が挙げられる。
【００１８】
前記保存的置換としては、例えば、
− 疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等に類似した機能を発揮するアミノ酸残基（以下、本明細書においては、類似アミノ酸残基ともいう）との置換、
− 本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみしか該ポリペプチドの立体構造、折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸残基との置換
等が挙げられる。前記保存的置換としては、より具体的には、例えば、下記１．〜６．：
１．グリシン、アラニン；
２．バリン、イソロイシン、ロイシン；
３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；
４．セリン、スレオニン；
５．リジン、アルギニン；
６．フェニルアラニン、チロシン；
のいずれかの類似アミノ酸残基のグループ内でのアミノ酸残基の置換が挙げられる。
【００１９】
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」とは、中ストリンジェントな条件、好ましくは、高ストリンジェントな条件をいう。前記「ストリンジェントな条件」としては、より具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５重量％ ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡと５０体積％ ホルムアミドとを含む溶液中、室温、よりストリンジェントには、４２℃、一層ストリンジェントには、６０℃で１０時間インキュベーションし、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、室温、４２℃以上、よりストリンジェントには、５５℃、さらにストリンジェントには、６０℃等の条件下での洗浄を行なう条件が挙げられる。本発明においては、前記「ストリンジェントな条件」は、好ましくは、配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードする核酸との特異的なハイブリダイゼーションが達成されうる条件であることが望ましい。
【００２０】
本明細書において、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列）に対して、クエリー配列（評価対象の配列）を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、適切にアラインメントし、算出されうる。本明細書においては、前記マルチプルアラインメントにおける設定条件としては、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １、ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件（デフォルト値）が挙げられる。
【００２１】
なお、本明細書における配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの他、例えば、配列解析ソフト、具体的には、商品名：ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェア開発株式会社製）によるマルチプルアラインメントにおいて使用可能なアルゴリズムをデフォルト値の条件で用いて、算出された値であってもよい。
【００２２】
本発明においては、前記配列同一性は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも６５％、好ましくは、７０％以上、より好ましくは、７５％以上、さらに好ましくは、８０％以上、よりさらに好ましくは、８５％以上であることが望ましい。
【００２３】
前記（ａ）の塩基配列を含有した核酸は、例えば、慣用の化学合成により、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列を有する核酸を合成すること；配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列に基づき設計されたプライマー対及び／又はプローブを用い、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等の慣用の技術により、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）由来の核酸から、取得すること等により得られうる。なお、得られた核酸は、ジデオキシ法、マキサム・ギルバート法、これらの方法に基づく改良法等により、配列決定することにより、前記（ａ）の塩基配列を含有するものであることを確認することにより、評価されうる。
【００２４】
前記（ａ）の塩基配列を含有した核酸は、具体的には、特に限定されないが、例えば、下記工程（１）〜（５）：
（１） フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）をフェノールオキシダーゼの発現に適した条件下に培養して、細胞中におけるフェノールオキシダーゼをコードするｍＲＮＡの発現量を増加させる工程、
（２） 前記工程（１）の後の細胞から、ｍＲＮＡを得る工程、
（３） 前記工程（２）で得られたｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴプライマー、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列に基づき設計されたプライマー対等を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行なう工程、
（４） 前記工程（３）で得られた産物を、適切なベクターに連結し、得られたベクターを用いて、適切な宿主細胞を形質転換する工程、
（５） 前記工程（４）で得られた形質転換体について、配列番号：１若しくは縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列又はその部分配列を保持し、フェノールオキシダーゼ活性を発現する形質転換体を選抜する工程、及び
部分配列を含むクローンが得られた場合、任意に、（６）５’ＲＡＣＥ、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ等により、フェノールオキシダーゼをコードする核酸の全長を得る工程、
を行なう方法等により、得られうる。なお、前記工程（２）の後、（３’）工程（２）で得られたｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを作製する工程、
（４’）配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列に基づき設計されたプローブを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション等により、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、フェノールオキシダーゼをコードする核酸又はその一部を含むクローンを得る工程、
（５’）前記工程（４’）で得られた形質転換体について、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列を保持し、フェノールオキシダーゼ活性を発現する形質転換体を選抜する工程、及び
フェノールオキシダーゼをコードする核酸の一部を含むクローンが得られた場合、任意に、（６’）５’ＲＡＣＥ、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ等により、フェノールオキシダーゼをコードする核酸の全長を得る工程、
を行なってもよい。
【００２５】
なお、前記「フェノールオキシダーゼの発現に適した条件」としては、例えば、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）の菌糸体の小片を、液体培養用培地１｛組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部 水 （ｐＨ５．２）；１２１℃で１５分間滅菌したもの]中、２５℃で７日間、往復振とう培養（１５０往復／分）し、得られた培養液全量を、２Ｌ容三角フラスコ中５００ｍｌの前記液体培養用培地１に添加し、２５℃で３週間、往復振とう培養（１００往復／分）を行ない、得られた菌糸体を、液体培養用培地２〔組成：１．０重量％ グルコース、０．１重量％ 酵母エキス、０．１４重量％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．３６重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１０重量％ ミネラル混合液（組成：１．０重量％ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．０重量％ ＺｎＣｌ2、０．７重量％ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ）、ｐＨ９．２；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕で、２５℃で３日間培養すること等が挙げられる。かかる条件下における菌糸体の培養は、細胞中における当該フェノールオキシダーゼに対応するｍＲＮＡの存在比が向上し、本発明の核酸の取得が可能になる点で有利である。
【００２６】
前記プライマー対は、それぞれ、連続した少なくとも９ヌクレオチド長、好ましくは、連続した９〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは、連続した１２〜３０ヌクレオチド長であることが望ましい。また、前記プライマー対は、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列を基に、二次構造の形成、Ｔｍ値等を考慮し、慣用のプライマー設計用ソフトウェア等により、配列番号：１に示される塩基配列又は縮重を介して該配列番号：１と異なる塩基配列を含有した核酸又はその一部を増幅するに適した配列を有する２種のプライマーとして、設計されうる。
【００２７】
前記プローブとしては、本発明の核酸若しくはその相補鎖の全部又は一部が挙げられ、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸、該核酸の相補鎖、それらの一部等があげられる。前記プローブは、フェノールオキシダーゼをコードする核酸との特異性を十分に得る観点から、少なくとも１２ヌクレオチド長であることが望ましい。なお、前核酸又は相補鎖の一部は、本発明の核酸又はその相補鎖に特徴的な塩基配列からなる断片であってもよい。前記「本発明の核酸又はその相補鎖に特徴的な塩基配列」は、特に限定されないが、例えば、データベースの配列に対して、配列同一性が、好ましくは、１５％以下、より好ましくは、１０％以下、特に好ましくは、０％である塩基配列等が挙げられる。
【００２８】
なお、前記プローブ又はプライマー対の設計、慣用の遺伝子操作（例えば、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）は、例えば、モレキュラークローニング ア ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ、１９８９〕等が参照されうる。
【００２９】
前記バリアントの核酸は、自然界の生物からスクリーニングすること；前記（ａ）の塩基配列を含有した核酸に対して、人為的に所望の変異を導入すること等により得られうる。
【００３０】
自然界の生物からスクリーニングする場合、例えば、評価対象の生物から抽出された核酸について、前記プローブを用いて、前記「ストリンジェントな条件」下でのハイブリダイゼーションにより、スクリーニングすること；前記核酸について、前記プライマー対を用いたＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等による増幅産物の有無を調べること等が行なわれうる。一方、前記核酸のバリアントを人為的に創出する場合、該バリアントは、例えば、慣用の部位特異的変異導入方法等により作製されうる。
【００３１】
本発明の核酸は、前記（ａ）〜（ｄ）いずれかの塩基配列を含有するものであるため、適切な宿主において発現させることにより、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、かつ大量に供給することができるという優れた効果を発揮する。
【００３２】
本発明は、他の側面では、本発明の核酸によりコードされた組換えフェノールオキシダーゼに関する。
【００３３】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、本発明の核酸によりコードされるものであるため、
− 種々の化合物に対して、中性付近で作用すること
− 中性ｐＨから弱アルカリ性ｐＨまでの広い範囲で高い安定性を示すこと
− 種々の基質、特に、フェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物のいずれに対しても、至適ｐＨの変動が小さいこと
等の優れた性質を発現する。したがって、本発明の組換えフェノールオキシダーゼによれば、環境、人体に対して温和な条件下での線維や毛髪の染色等が可能になる。
【００３４】
また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、本発明の核酸によりコードされ、該核酸を発現させることにより得られるものであるため、安価で大量に供給できる。また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、本発明の核酸によりコードされ、該核酸を発現させることにより得られるものであるため、高い純度であるという優れた性質を有する。したがって、厳密な触媒反応を要する用途、例えば、化合物の合成等に好適である。
【００３５】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより算出した場合、２８ｋＤａの分子量を有する。前記分子量は、例えば、目的のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に供して、移動度を測定し、得られた測定値と、分子量が既知である分子量マーカーの移動度とを比較することにより算出されうる。
【００３６】
また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、至適ｐＨ５．０〜８．０、好ましくは至適ｐＨ５．０〜７．５を示す。本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、前記ｐＨ範囲で優れた酵素活性を示すため、水ベースの反応溶液を用いることができ、効率よく酵素反応を行なうために特別なｐＨ調整が必要とされないという優れた効果を発揮する。また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、水ベースの反応溶液を用いることができ、具体的には、例えば、特別なｐＨ調整を行っていない基質と酵素の水溶液でも効率よく反応を行なうことができる。
【００３７】
さらに、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、具体的にはフェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物を基質とする酸化反応において、中性付近、具体的には、ｐＨ５．０〜８．０、好ましくは、ｐＨ５．０〜７．５に至適ｐＨを有する。より具体的には、本発明のフェノールオキシダーゼは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜約７．５、より至適な範囲として、約５．０〜７．０であり、オルトアミノフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜８．０、より至適な範囲として約６．０〜７．５であり、パラフェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜６．５、より至適な範囲として、約５．０〜５．５である。
【００３８】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、中性ｐＨ〜弱アルカリ性ｐＨまでの広範囲で高いｐＨ安定性を示すという優れた性質を有する。具体的には、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、ｐＨ７．０〜１０．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも２５％の相対残存活性、好ましくは、ｐＨ７．５〜９．５において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも５０％の相対残存活性、より好ましくは、８．０〜９．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する。
【００３９】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、４０℃において、ｐＨ８．５で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも６０％の相対残存活性を維持するという熱安定性を示す。すなわち、本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、前記温度範囲において優れた酵素活性を示すため、特別な温度条件に調整することなく、日常の生活温度（室温、水温、体温、気温等）で高い酵素活性を示す。したがって、本発明の組換えフェノールオキシダーゼによれば、染色、廃液処理、高分子化合物の合成などを簡便に行なうことができる。
【００４０】
本発明の組換えフェノールオキシダーゼは、例えば、本発明の核酸を適切なベクターに組込み、得られた発現ベクターを用いて適切な宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより発現させうる。かかる発現ベクター及び形質転換体も本発明に含まれる。
【００４１】
本発明は、さらに他の側面では、本発明の核酸を含有した発現ベクターに関する。
【００４２】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸を含有するものであるため、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させることができる。
【００４３】
本発明の発現ベクターに用いられうるベクターとしては、組換えフェノールオキシダーゼを発現させるための宿主の種類、組換えフェノールオキシダーゼの用途等に応じて、適宜選択されうるが、例えば、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
【００４４】
前記ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａ、ｐＫＣＲ、これらの誘導体等が挙げられる。かかるベクターには、誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーター等のエレメント、分泌シグナル配列等をコードする核酸等を適宜有していてもよい。なお、誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いる場合、本発明の核酸は、該プロモーターと作動可能に連結される。
【００４５】
また、本発明の組換えフェノールオキシダーゼを容易にかつ大量に製造する観点から、組換えフェノールオキシダーゼを、細胞外に分泌させうるベクター；組換えフェノールオキシダーゼを誘導発現させうるベクター；組換えフェノールオキシダーゼを、慣用の融合パートナー（Ｈｉｓタグ等）との融合タンパク質として発現させうるベクター等を用いてもよい。
【００４６】
本発明の発現ベクターは、本発明の組換えフェノールオキシダーゼを容易にかつ大量に製造する観点から、本発明の核酸の上流に、シグナル配列をコードする核酸が作動可能に連結されたベクターが好ましい。
【００４７】
本発明は、別の側面では、本発明の発現ベクターを含有した形質転換体に関する。
【００４８】
本発明の形質転換体は、本発明の核酸を含有しているため、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、効率よく大量に発現させることができるという優れた効果を発揮する、
【００４９】
本発明の形質転換体によれば、組換えフェノールオキシダーゼを回収、精製等に適した状態で発現させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明によれば、安価に組換えフェノールオキシダーゼを供給することができる。
【００５０】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを適切な宿主に導入することにより作製されうる。
【００５１】
前記宿主としては、本発明の核酸を導入し、組換えフェノールオキシダーゼを発現させるに適したものであればよく、例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞等が挙げられる。なかでも、本発明の核酸の供給源となる生物から単離されたフェノールオキシダーゼ（天然型フェノールオキシダーゼともいう）の性質を十分に発現させる観点から、酵母細胞、糸状菌が好ましい。
【００５２】
前記酵母細胞としては、例えば、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ） ＧＳ１１５株、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１株、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＳＭＤ１１６８株、サッカロマイセス セルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等挙げられる。
【００５３】
宿主への発現ベクターの導入方法としては、公知の導入方法が使用でき、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５４】
本発明の形質転換体は、組換えフェノールオキシダーゼを回収、精製等に、より適した状態で発現させる観点から、好ましくは、本発明の核酸の上流に、シグナル配列、具体的には、プレウロタス サジャー−カジュ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｓａｊｏｒ−ｃａｊｕ）の分泌シグナルをコードする核酸が作動可能に連結されたベクター〔例えば、後述の実施例におけるｐＰＩＣ−Ｆ１（図２）等〕を、酵母細胞、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株に導入して得られた形質転換体が望ましい。
【００５５】
本発明は、さらに別の側面では、本発明の形質転換体を培養し、培養物中に組換えフェノールオキシダーゼを生成させ、回収することを特徴とする、組換えフェノールオキシダーゼの製造方法に関する。
【００５６】
本発明の形質転換体は、本発明の形質転換体が用いられているため、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼを、高い収率で、安価に、大量に、高い純度で得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００５７】
また、本発明の製造方法によれば、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサーの使用量、使用時間等について組換えフェノールオキシダーゼの発現の最適な条件を決定することによって、より効率よく組換えフェノールオキシダーゼを生産させることができる。
【００５８】
形質転換体の培養は、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株の場合、該Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株を、液体培養用培地３｛組成：１重量％ 酵母エキス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、２重量％ ポリペプトン〔日本製薬社製〕、２重量％ デキストロース〔ナカライテスク（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）社製〕、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの｝中、３０℃で一晩、往復振とう培養（１２０往復／分）し、得られた形質転換体の細胞を、液体培養用培地４｛組成：１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１．３４重量％ 商品名：イーストニトロジェンベース （インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）、４×１０−５重量％ Ｄ−ビオチン （ナカライテスク 社製）、５体積％ メタノール、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの｝中、２４時間ごとに０．５体積％メタノールを追加しながら、２０℃で６日間、往復振とう培養（１２０往復／分）することが望ましい。
【００５９】
形質転換体の培養物からの組換えフェノールオキシダーゼの精製には、慣用のタンパク質精製法が用いられうる。
【００６０】
具体的には、形質転換体が、その細胞内に組換えフェノールオキシダーゼを蓄積するものである場合、培養終了後、遠心分離によって細胞を集め、得られた細胞を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得、該無細胞抽出液を、塩析、イオン交換（陽イオン交換又は陰イオン交換）クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の一般的なタンパク質精製法により精製することができる。かかる形質転換体においては、組換えフェノールオキシダーゼが細胞内に蓄積されるため、他の夾雑タンパク質に比べ、組換えフェノールオキシダーゼの割合が大きくなるため、精製を容易に行なうことができる。一方、形質転換体が、組換えフェノールオキシダーゼを細胞外に分泌するものである場合、培養上清から同様に精製を行なえばよい。かかる形質転換体を用いた場合、培養上清に組換えフェノールオキシダーゼが大量に蓄積されるため、より容易に、安価で、迅速に、精製を行なうことができる。
【００６１】
なお、組換えフェノールオキシダーゼが、インクルージョンボディーとして得られた場合、慣用のタンパク質の再生方法により、活性を示すポリペプチドとして、組換えフェノールオキシダーゼが得られうる。前記タンパク質の再生方法としては、例えば、形質転換体の培養終了後、遠心分離によって形質転換体の細胞を回収し、超音波処理等によって破砕し、遠心分離等を行なうことによりインクルージョンボディーを回収し、該インクルージョンボディーを、例えば、尿素、グアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じて前記タンパク質精製法により精製し、透析法、希釈法等を用いたリフォールディング操作を行なうこと等が挙げられる。
【００６２】
組換えフェノールオキシダーゼの発現の確認は、前記と同様に、フェノールオキシダーゼ活性を測定することにより行なわれうる。
【００６３】
本発明は、よりさらに別の側面では、本発明の組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体に関する。本発明の抗体によれば、本発明の組換えフェノールオキシダーゼに結合するため、中性付近において、安定的に、高い酵素活性を示すフェノールオキシダーゼの回収、精製、スクリーニング等が可能になる。
【００６４】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明の抗体には、本発明の組換えフェノールオキシダーゼに対する結合性を呈するものであれば、抗体断片も含まれる。前記抗体断片としては、例えば、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント等が挙げられる。
【００６５】
本発明の抗体は、本発明の組換えフェノールオキシダーゼを用いて、ウサギ等の動物を免疫し、該動物から採血し、慣用の手法により精製を行なうことにより得られうる。かかる手法として、例えば、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ）編、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９２）等が参照される。
【００６６】
前記Ｆａｂフラグメントは、モノクローナル抗体を、パパインで消化することにより得られうる。また、前記Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、モノクローナル抗体を、ペプシンで消化することにより得られうる。
【００６７】
また、本発明の抗体について、本発明の組換えフェノールオキシダーゼと、他のフェノールオキシダーゼ等との交差反応を調べることにより、本発明の組換えフェノールオキシダーゼに対する特異性を評価されうる。
【００６８】
以下、本発明を実施例等により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、以下に示す播種、菌糸体の切り分け、及び培地の添加の各操作を、クリーンベンチ内で行なった。
【実施例１】
【００６９】
１白金耳相当量のフラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）を、固体培養用寒天培地｛組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製｝、２．０重量％ 寒天、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕 １０ｍｌを含む滅菌シャーレに播種し、２５℃で１０日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳にて５ｍｍ四方に切り分け、小片を得た。前記小片 １０片を、液体培養用培地１｛組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの｝に播種し、２５℃で、往復振とう培養（１５０往復／分）を行なった。なお、前記液体培養用培地１として、ｐＨを４．０から９．０の範囲で任意に調整された培地のそれぞれを用いた。得られた培養物について、フェノールオキシダーゼの活性を調べた。
【００７０】
酵素活性（酸化活性）は、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）又はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を緩衝液とし、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いて、４７０ｎｍにおける吸光度の変化により測定した。具体的には、９６穴のマイクロプレート〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、Ｃｏｓｔｅｒ（登録商標）３３６８〕のウェル内で、０．２Ｍ 前記緩衝液 ０．１ｍｌに、０．０２５Ｍ パラ−フェニレンジアミン水溶液 ０．０８ｍｌを添加し、基質溶液を調製した。この基質溶液について、Ｍｕｌｔｉ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（大日本製薬株式会社製、商品名：Ｖｉｅｎｔｏ）を用いて吸光度を測定することにより、酵素活性を求めた。なお、酵素活性は、４７０ｎｍにおける吸光度を、１分間で１上昇させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
【００７１】
各培養条件で７日間培養を行なった結果、ｐＨ５．０及びｐＨ８．０のそれぞれの反応ｐＨにおける酵素活性測定は、共に、培養日数が７日目で酵素活性が最も高く、すべての培養ｐＨ条件で、培養日数の経過により、酵素活性の増加を示した。
【００７２】
ｐＨ５．０にて酵素活性を測定した結果、ｐＨ４．０から９．０のｐＨ範囲で培養した各培養液において、すべて明確な酵素活性がみられなかった。具体的には、最も高い酵素活性を示したのは、ｐＨ９．０の培養条件で７日間培養することにより得られた培養液であったが、反応開始から１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、わずか０．１２であった。また、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液について、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、０．０６であった。
【００７３】
一方、ｐＨ８．０にて酵素活性を測定した結果、ｐＨ５．０から９．０のｐＨ範囲で培養した各培養液において、すべて明確な酵素活性が示された。なお、ｐＨ４．０で培養することにより得られた培養液は、明らかな酵素活性を示さなかったが、培養日数による酵素活性の増加がみられた。
【００７４】
また、培養ｐＨが高いｐＨである培養液ほど、高い酵素活性を示した。最も高い酵素活性を示した培養液は、ｐＨ９．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液で、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、１．２７であった。また、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液について、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、０．７８であった。
【００７５】
以上の結果から、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）において誘導されるフェノールオキシダーゼは、中性フェノールオキシダーゼであり、また、酸性側に至適ｐＨを有する酸性フェノールオキシダーゼ又は酸性フェノールオキシダーゼは誘導されないことがわかった。また、フラムリナ ベルティペスにおいては、ｐＨ８．０での酵素活性は、ｐＨ９．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液の酵素活性は、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液の酵素活性と比較して、約１．６倍も高くなることがわかった。
【００７６】
以上の結果から、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）中において、中性ｐＨで強い活性を示すフェノールオキシダーゼが存在することがわかった。
【実施例２】
【００７７】
固体培養用寒天培地〔組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、２．０重量％ 寒天、残部 水；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕 １０ｍｌを含む滅菌シャーレに、エノキダケ〔フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕を１白金耳相当量播種し、２５℃で１０日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳にて５ｍｍ四方に切り分けた。前記小片 １０片を、液体培養用培地１〔組成：２．４重量％ ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部 水（ｐＨ５．２）；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕に播種し、２５℃で７日間、往復振とう培養（１５０往復／分）を行なった。得られた培養液全量を、２Ｌ容の三角フラスコ中５００ｍｌの前記液体培養用培地１に添加し、２５℃で３週間、往復振とう培養（１００往復／分）を行なった。
【００７８】
その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、培養液を取り去り、残部の菌糸体に、液体培養用培地２〔組成：１．０重量％ グルコース、０．１重量％ 酵母エキス、０．１４重量％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．３６重量％ Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２重量％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１０重量％ ミネラル混合液（組成：１．０重量％ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．０重量％ ＺｎＣｌ2、０．７重量％ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ＣｏＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ）、ｐＨ９．２；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕 ５００ｍｌを添加し、さらに２５℃で３日間培養した。
【００７９】
その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、デカンテーションにより培養液を回収した。
【００８０】
回収された培養液は、淡黄色若しくは黄褐色の清澄又は濁った液体であった。回収された培養液は、全容量３０６０ｍｌ、総力価１３１００Ｕ、総タンパク質量７７８ｍｇ、比活性１６．８Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【００８１】
前記培養液を凍結乾燥し、凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物を、１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、酵素溶液を得た。前記酵素溶液５０μｌを、１２．５重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いた未変性ＰＡＧＥに供した。未変性ＰＡＧＥ後のゲルを、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で振とう攪拌し、ついで、１ｍＭ オルトアミノフェノールを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中でゲルを５分間振とう攪拌することによって活性染色を行なった。その後、活性を示したバンドを切り出して、２５ｍＭ トリス−１９２ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．２）中、３０分間、振とう攪拌することにより洗浄を行った。洗浄後のゲルを、１２．５重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００８２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを転写装置〔マリソル（Ｍａｒｙｓｏｌ）社製、ＫＳ−８４６０〕にセットし、ＨＩＦＲＥＤ ＣＯＮＳＴＡＮＴ ＰＯＷＥＲ ＳＵＰＰＬＹ〔マリソル（Ｍａｒｙｓｏｌ）社製、ＭＰ−７３５２〕を用いて、ゲル１ｃｍ2あたり１ｍＡの定電流で１．５時間通電し、商品名：ＰｒｏｂｌｏｔｔTM ｍｅｍｂｒａｎｅ〔アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕に転写させた。転写後のメンブランを染色液（組成：０．１重量％ クマシーブリリアントブルー Ｒ−２５０、４０体積％ メタノール、残部 水）中、３分間、振とう攪拌し、脱色液（組成：５０体積％ メタノール、残部 水）中でタンパク質のバンドが見えるまで振とう攪拌することにより、染色を行なった。
【００８３】
染色されたバンドを切り出して、プロテインシーケンサー（アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、Ｐｒｏｃｉｓｅ ＴＭ ４９２ ＨＴ）に供して、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。
【００８４】
その結果、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）のフェノールオキシダーゼは、アミノ末端アミノ酸配列として、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有することがわかった。
【実施例３】
【００８５】
前記実施例２と同様に、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）を、固体培養用寒天培地で培養し、得られた菌糸体を、液体培養用培地１で培養し、その後、液体培養用培地２で培養することにより、中性ｐＨで強い活性を示すフェノールオキシダーゼを産生させると共に細胞中におけるフェノールオキシダーゼに対応するｍＲＮＡの存在比を向上させた。
【００８６】
フェノールオキシダーゼ産生中のフラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）を、アドバンテック東洋社製、商品名：定性濾紙Ｎｏ．１等を用いて、回収し、液体窒素を用いて急冷し凍結させた。
【００８７】
得られたフラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）を、液体窒素存在下で、乳鉢と乳棒とを用いて、パウダー状になるまで磨砕し、凍結菌体粉末を得た。約１００ｍｇの凍結菌体粉末から、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）社製の商品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｋｉｔを用い、製造者の指示に従って、全ｍＲＮＡ抽出溶液（５０μｇ相当量） ２０μｌを調製した。
【００８８】
得られたｍＲＮＡを製造者の指示に従い、アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製の商品名：Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて逆転写反応を行ない、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００８９】
前記実施例３で得られたＮ末端アミノ酸配列（配列番号：３）に基づき、５’側プライマー（配列番号：５）を設計し、合成した。また、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属以外の真菌のフェノールオキシダーゼの公知のアミノ酸配列において、高い同一性を有するコンセンサス配列：ＷＦＬＨＣＨ（配列番号：４）とＤＮＡ配列に基づき、３’側プライマー（配列番号：６）を合成した。
【００９０】
前記プライマー（各２０ｐｍｏｌ）と、ｃＤＮＡ ５ｎｇとＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑTM （タカラバイオ社製）とを用い、フラムリナ ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）の全ｃＤＮＡを鋳型とし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ない、フェノールオキシダーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。
【００９１】
なお、ＰＣＲ条件は、９５℃で５分のインキュベーション後、９５℃で１分間と５０〜６０℃で１分間と７２℃で５分間とを１サイクルとして３５サイクルの反応を行ない、７２℃で１０分間インキュベーションする条件とした。
【００９２】
得られたＰＣＲ産物を、Ｔｒｉｓ／アセテート／ＥＤＴＡバッファー〔組成：０．４８４重量％ トリス、０．１４体積％ 酢酸、０．０７８８５重量％ エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸三ナトリウム塩、残部 水〕中、２．０重量％ アガロースゲルで電気泳動し、約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片に対応するバンドを切り出し、ゲル断片を得た。ついで、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用い、製造者の指示に従って、前記ゲル断片中のＤＮＡ断片を精製した。
【００９３】
得られたＤＮＡ断片を、製造者の指示に従って、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕を用いて、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒにクローン化した。なお、１．３ｋｂのＤＮＡを含むプラスミドを、ｐＧＥＭ−Ｆ１−Ｎという。
【００９４】
得られたベクターを精製し、鋳型として、製造者の指示に従って、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＰｒｉｍｅｒTM Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ〔アマシャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕を用いて、日立ＳＱ５５００Ｅ型 ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（日立製作所製）で解析して塩基配列を決定した。
【００９５】
決定された塩基配列中、ＳａｃＩ認識部位の上流の配列に基づき、５’側プライマー（配列番号：７）を合成した。また、アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製、商品名：Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔに含まれるオリゴヌクレオチド（配列番号：８）をプライマーとして、前記と同様に、ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行なった。その結果、約７００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。その後、得られたＤＮＡ断片を、前記と同様に、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒにクローン化した。得られたベクターを鋳型とし、前記と同様に、塩基配列を決定した。なお、７００ｂｐのＤＮＡを含むプラスミドを、ｐＧＥＭ−Ｆ１−Ｃという。
【００９６】
決定された塩基配列を、配列番号：１に示す。また、決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００９７】
その結果、フェノールオキシダーゼは、４９６アミノ酸残基のアミノ酸配列からなることが推定され、推定アミノ酸配列には、既知のフェノールオキシダーゼに認められる１２箇所の銅結合部位が完全に保存されていることが確認された。
【００９８】
その後、上記の方法により得られた２種のプラスミドを制限酵素ＳａｃＩで消化後、連結し、フェノールオキシダーゼ全長遺伝子を含むプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｆ１）を得た。このｐＧＥＭ−Ｆ１のプラスミドマップを図１に示す。
【実施例４】
【００９９】
（１）フェノールオキシダーゼのピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）による異種発現系の構築
フェノールオキシダーゼ遺伝子の５’側の塩基配列とそのシグナル配列の３’側の塩基配列とに基づき合成したＰＣＲ用５’プライマー（配列番号：１１）と、フェノールオキシダーゼ遺伝子中のＥｃｏＲＩ認識部位の下流の塩基配列に基づき合成した３’プライマー（配列番号：１２）とを用い、ｐＧＥＭ−Ｆ１のＥｃｏＲＩ消化産物を鋳型としてＰＣＲを行ない、フェノールオキシダーゼ遺伝子の部分ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分のインキュベーション後、９４℃で３０秒間と５５℃で３０秒間と７２℃で３０秒間とを１サイクルとして２５サイクルの反応を行ない、７℃で１０分間、インキュベーションする条件とした。
【０１００】
得られたＰＣＲ産物（フェノールオキシダーゼ遺伝子５’改変の部分ＤＮＡ）にシグナル領域に対応する核酸を付加するために、ＰＣＲ用５’プライマー（配列番号：９）と、ＰＣＲ用３’プライマー（配列番号１０及び１２）とを用い、上記のＰＣＲ産物を鋳型としてＰＣＲを行ない、シグナル領域が付加されたフェノールオキシダーゼ遺伝子の部分ＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分のインキュベーション後、９４℃で３０秒間と５５℃で３０秒間と７２℃で３０秒間とを１サイクルとして３０サイクルの反応を行ない、７２℃で１６分間インキュベーションする条件とした。
【０１０１】
得られたＰＣＲ産物（シグナル領域に対応する核酸を含むフェノールオキシダーゼ遺伝子の部分ＤＮＡ断片）及びｐＧＥＭ−Ｆ１の両方を、それぞれＥｃｏＲＩとＮｏｔＩとで消化した。
【０１０２】
得られた産物を、アガロースゲル電気泳動に供した。対応するバンドをゲルから切り出し、得られたゲル断片から、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ〔バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製〕を用いＤＮＡ断片を抽出した。
【０１０３】
得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ消化プラスミドｐＰＩＣ３．５ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に連結して酵母形質転換用プラスミド（ｐＰＩＣ−Ｆ１）を得た。前記ｐＰＩＣ−Ｆ１のプラスミドマップを図２に示す。
【０１０４】
また、商品名：Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマニュアルに従い、前記ｐＰＩＣ−Ｆ１を、制限酵素ＭｓｓＩで開環し、エレクトロポレーション法により酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５株を形質転換した。得られた形質転換酵母は、Ｈｉｓ+（ヒスチジン非要求性）である。
【０１０５】
（２）形質転換菌の培養と形質転換菌のスクリーニング
前記（１）で得られた形質転換酵母（Ｈｉｓ+）の適量を、ＭＤ寒天平板培地〔組成：１．３４重量％ ＹＮＢ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、４×１０-5重量％ ビオチン、 ２重量％ Ｄ−グルコース〕に塗布し、３０℃で一晩培養し、十分生育させた。得られたプレートに滅菌水を加え、形質転換酵母を懸濁した。得られた懸濁液を、適量のＧ４１８〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕を含むＹＰＤ寒天平板培地〔１重量％ 酵母抽出物（ナカライテスク社製）、 ２重量％ ペプトン（日本製薬社製）、 ２重量％ Ｄ−グルコース、１．５重量％ 寒天〕に、一枚あたり１０5個の細胞となるように塗布し、３０℃で培養した。
【０１０６】
０．２５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＹＰＤ寒天平板培地に生育した形質転換酵母を、制限酵素ＭｓｓＩで開環したｐＰＩＣ−Ｆ１を用いて、再度形質転換して、同様の操作により、３．０ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８に耐性を示すコロニー（Ｇ４１８高耐性株）をスクリーニングした。
【０１０７】
（３）組換えフェノールオキシダーゼ（ｒＦ１）の発現
前記（２）で得られたＧ４１８高耐性株を、４ｍｌのＹＰＤ液体培地〔組成：１重量％ 酵母抽出物（ナカライテスク社製）、２重量％ ペプトン、２重量％ Ｄ−グルコース〕に接種して、試験管中で３０℃、２４時間振とう培養した。得られた培養物 ４ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコ中の１００ｍｌ ＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離に供して、酵母を回収し、適量のＢＭＭ最小培地〔組成：１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、１．３４重量％ ＹＮＢ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、４×１０-5重量％ ビオチン、０．５体積％ メタノール〕に再懸濁した。得られた懸濁液を、０．２ｍＭ ＣｕＣｌ2を含む４００ｍｌ ＢＭＭ最小培地（２Ｌ容三角フラスコ）に全量を接種した。
【０１０８】
２４時間ごとに、終濃度０．５体積％のメタノールを発現誘導基質として添加しながら２０℃で４日間振とう培養した。前記メタノールによる誘導により、組換えフェノールオキシダーゼ（ｒＦ１）を誘導発現させ、培養液中に放出させた。全量７．２Ｌの培養液から遠心分離により酵母細胞を除き、培養上清液として、粗酵素液を得た。
【０１０９】
０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）８００μｌに１０％のジメチルスルホキシドを含むオルトアミノフェノール水溶液 ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と粗酵素液 ０．１ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４２０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、オルトアミノフェノールを基質とした場合の酵素活性を測定した。なお、４２０ｎｍにおける吸光度を１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。その結果、得られた粗酵素液は、全容量７．０７Ｌ、総力価１８，６００Ｕ、総タンパク質５６００ｍｇ、比活性３．３Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
【０１１０】
前記粗酵素液に、硫酸アンモニウム（ナカライテスク社製、試薬特級）を徐々に添加しながら、攪拌し、２５％ 飽和となるように調整した。これを、２５％ 飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した商品名：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ〔東ソー株式会社社製〕を充填したカラム（４．８×２０ｃｍ）に吸着させた。吸着後、２５％ 飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） ２Ｌを用いてカラムを洗浄した。その後、硫酸アンモニウムを２５〜０％飽和の濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記カラムに吸着された組換えフェノールオキシダーゼを溶出した。組換えフェノールオキシダーゼの画分を、得られた溶出画分についてパラフェニレンジアミンに対する酵素活性を測定することにより決定した。
【０１１１】
前記組換えフェノールオキシダーゼの画分を、商品名：Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｓｉｚｅ３６〔和光純薬工業株式会社製〕を用いて、５０ｍＭ トリス硫酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行ない、組換えフェノールオキシダーゼ溶液を得た。
【０１１２】
前記組換えフェノールオキシダーゼ溶液を、５０ｍＭ トリス硫酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化した商品名；ＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ〔東ソー株式会社製〕を充填したカラム（２．４×４０ｃｍ）に吸着させた。吸着後、０．１Ｍ 硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ トリス硫酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用い、２８０ｎｍにおける溶出液の吸光度が０．１以下になるまでカラムを洗浄した。その後、硫酸ナトリウムを０．１〜０．３５Ｍの濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記カラムに吸着された組換えフェノールオキシダーゼを溶出した。組換えフェノールオキシダーゼの画分は、得られた溶出画分についてパラフェニレンジアミンに対する酵素活性と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラフェニレンジアミンによる活性染色とを行うことにより決定された。組換えフェノールオキシダーゼの精製の一例を、表１に示す。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
前記組換えフェノールオキシダーゼの画分を、１０重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを、０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で平衡化し、その後、１ｍＭ パラフェニレンジアミンを含む０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で該ゲルを振とうすることにより、活性染色を行なった。
【０１１５】
また、前記組換えフェノールオキシダーゼの画分を、商品名：Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ−１０〔ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製〕を用いて、約１０倍量となるように濃縮した。得られた濃縮液を試料として、１０重量％ ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。前記試料に還元剤を添加せず、加熱処理を行なわない点以外、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法に従って電気泳動を行なった。泳動後のゲルを、染色用溶液〔組成：０．０５重量％ クマシーブリリアントブルー Ｒ２５０、５０体積％ メタノール、１０体積％ 酢酸、残部 水〕中で振とうした後、脱色用溶液〔組成：２５体積％ メタノール、７体積％ 酢酸、残部 水〕中で振とうすることにより、タンパク質染色を行なった。分子量マーカー〔アマシャム バイオサイエンシーズ（Ａｍａｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製、商品名：ＬＭＷ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ〕を同時に供し、移動度を比較することにより、組換えフェノールオキシダーゼの分子量を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の活性染色及びタンパク質染色を行なった結果を図３に示す。
【０１１６】
図３に示されるように、組換えフェノールオキシダーゼの画分は、活性染色及びタンパク質染色で単一のバンドを示し、分子量は２８ｋＤａであることがわかる。
【０１１７】
（４）組換えフェノールオキシダーゼの至適ｐＨ
５０ｍＭ パラフェニレンジアミン水溶液と、５０ｍＭ ２，６−ジメトキシフェノール水溶液と、５０ｍＭ オルトアミノフェノールの１０体積％ ジメチルスルホキシド溶液とを調製し、それぞれ、基質溶液とした。ｐＨをｐＨ４．５、ｐＨ５．３、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５及びｐＨ９．０それぞれに調整した混合緩衝液〔組成：０．２Ｍ 酢酸ナトリウム、０．２Ｍ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．２Ｍ トリス水溶液を、塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて目的のｐＨに調整〕 ８９５μｌと、５０ｍＭ 基質溶液 １００μｌと、組換えフェノールオキシダーゼ溶液 ５μｌ（０．１２５Ｕ、１．６μｇ）とを混合した。パラフェニレンジアミン及び２，６−ジメトキシフェノールについては、４７０ｎｍ、オルトアミノフェノールについては、４２０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。１分間に吸光度を１上昇させる酵素量を１単位（ユニット）とした。
【０１１８】
その結果、組換えフェノールオキシダーゼは、３種類の基質（パラフェニレンジアミン、２，６−ジメトキシフェノール、オルトアミノフェノール）に対して、中性付近で高い活性を示した。組換えフェノールオキシダーゼは、パラフェニレンジアミンに対して、ｐＨ５．０〜６．５において、最大活性を示すｐＨ５．３における活性と比較して、６０％以上の活性を示し、ｐＨ５．０〜５．５において、最大活性を示すｐＨ５．３における活性と比較して、８０％以上の活性を示した。また、組換えフェノールオキシダーゼは、２，６−ジメトキシフェノールに対して、ｐＨ５．０〜７．５において、最大活性を示すｐＨ６．５における活性と比較して、６０％以上の活性を示し、ｐＨ５．０〜７．０において、最大活性を示すｐＨ６．５における活性と比較して、８０％以上の活性を示した。さらに、組換えフェノールオキシダーゼは、オルトアミノフェノールに対しては、ｐＨ５．０〜８．０において、最大活性を示すｐＨ７．０の活性と比較して、６０％以上の活性を示し、ｐＨ６．０〜７．５において、最大活性を示すｐＨ７．０の活性と比較して、８０％以上の活性を示した。
【０１１９】
（５）組換えフェノールオキシダーゼのｐＨ安定性
組換えフェノールオキシダーゼ ２２μｌ（０．５３Ｕ、０．１７μｇ）をｐＨ２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０に調整した混合緩衝液〔組成；０．２Ｍ 酢酸、０．２Ｍ リン酸、０．２Ｍ ホウ酸水溶液を水酸化ナトリウム溶液により目的のｐＨに調整〕 ８８μｌと混合し、２５℃でインキュベーションした。インキュベーション開始から１時間後及び２０時間後、得られた混合溶液 ５０μｌと、０．５Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ８５０μｌと、５０ｍＭ オルトアミノフェノールの１０％ジメチルスルホキシド溶液 １００μｌとを混合し、波長４２０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。組換えフェノールオキシダーゼの１時間後のｐＨ安定性を、図４のパネル（Ａ）に、２０時間後のｐＨ安定性を、図４のパネル（Ｂ）に示す。
【０１２０】
組換えフェノールオキシダーゼは、ｐＨ３．５〜１１．０において、２５℃で１時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも２５％の相対残存活性を示した。また、ｐＨ４．０〜１０．５において、２５℃、１時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも５０％の相対残存活性を示した。また、ｐＨ７．０〜１０．０において、２５℃で１時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも８０％の相対残存活性を示した。
【０１２１】
また、組換えフェノールオキシダーゼはｐＨ７．５〜１０．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも２５％の相対残存活性を示した。また、ｐＨ７．５〜１０．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも５０％の相対残存活性を示した。また、ｐＨ８．０〜９．０において、２５℃で２０時間のインキュベーション条件下、最大の安定性を示したｐＨ９．０における活性と比較して、少なくとも８０％の相対残存活性を示した。
【０１２２】
（６）組換えフェノールオキシダーゼの熱安定性
組換えフェノールオキシダーゼの溶出画分〔５０ｍＭ トリス硫酸緩衝液（ｐＨ８．５）〕を、４０℃及び５０℃でインキュベーションした。５、１０、１５、２０、３０、及び６０分後のそれぞれでサンプリングを行なった。インキュベーション後の前記溶液 ５０μｌと、０．５Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ８５０μｌと、５０ｍＭ オルトアミノフェノールの１０％ジメチルスルホキシド溶液 １００μｌとを混合し、波長４２０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。結果を図５に示す。図中、４０℃でインキュベーションの場合、ひし形、５０℃でインキュベーションの場合、四角で示す。
【０１２３】
その結果、組換えフェノールオキシダーゼは、５０℃で１０分間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性と比較して、２５％以上の相対残存活性を示し、５０℃で５分間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性と比較して、５０％以上の相対残存活性を示した。また、４０℃で２０分間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性と比較して、８０％以上の相対残存活性を示し、４０℃で６０分間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性と比較して、６０％以上の相対残存活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明によれば、環境、人体に対して温和な条件下での線維や毛髪の染色等を行なうことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、ｐＧＥＭ−Ｆ１の概略図を示す。図中、「Ｆ１」は、フェノールオキシダーゼ遺伝子を示す。
【０１２６】
【図２】図２は、酵母発現用プラスミドｐＰＩＣ−Ｆ１の概略図を示す。図中、「Ｆ１」は、フェノールオキシダーゼ遺伝子、「ｓｉｇｎａｌ」は、シグナル配列を示す。
【０１２７】
【図３】図３は、活性染色及びタンパク質染色の結果を示す。図３中、レーン１は、タンパク質染色の結果を示し、レーン２は、活性染色の結果を示し、レーンＭは、分子量マーカーを示す。
【０１２８】
【図４】図４は、組換えフェノールオキシダーゼのｐＨ安定性を調べた結果のグラフを示す。図４中、パネル（Ａ）は、１時間インキュベーション後のｐＨ安定性、パネル（Ｂ）は、２０時間インキュベーション後のｐＨ安定性を示す。
【０１２９】
【図５】図５は、組換えフェノールオキシダーゼの熱安定性を調べた結果のグラフを示す。図中、４０℃でインキュベーションの場合、ひし形、５０℃でインキュベーションの場合、四角で示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１３０】
配列番号：３は、フェノールオキシダーゼのアミノ末端アミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号：４は、種々のフェノールオキシダーゼのコンセンサス配列である。
【０１３２】
配列番号：５は、プライマーの配列である。
【０１３３】
配列番号：６は、プライマーの配列である。
【０１３４】
配列番号：７は、プライマーの配列である。
【０１３５】
配列番号：８は、プライマーの配列である。
【０１３６】
配列番号：９は、プライマーの配列である。
【０１３７】
配列番号：１０は、プライマーの配列である。
【０１３８】
配列番号：１１は、プライマーの配列である。
【０１３９】
配列番号：１２は、プライマーの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである核酸の塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなる、フェノールオキシダーゼをコードする核酸。
【請求項２】
コードされるポリペプチドが、少なくともｐＨ５．０〜８．０にフェノールオキシダーゼ活性を有する、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
請求項１又は２記載の核酸によりコードされてなる、組換えフェノールオキシダーゼ。
【請求項４】
請求項１又は２記載の核酸を含有してなる、発現ベクター。
【請求項５】
請求項１又は２記載の核酸の上流に、シグナル配列をコードする核酸が作動可能に連結されてなる、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項４又は５記載の発現ベクターを含有してなる、形質転換体。
【請求項７】
酵母細胞又は糸状菌に由来する、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７記載の形質転換体を培養し、培養物中に組換えフェノールオキシダーゼを生成させ、回収することを特徴とする、請求項３記載の組換えフェノールオキシダーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項３記載の組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体。
【請求項１】
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである核酸の塩基配列、及び
（ｄ）配列番号：２との配列同一性が、少なくとも６５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、フェノールオキシダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなる、フェノールオキシダーゼをコードする核酸。
【請求項２】
コードされるポリペプチドが、少なくともｐＨ５．０〜８．０にフェノールオキシダーゼ活性を有する、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
請求項１又は２記載の核酸によりコードされてなる、組換えフェノールオキシダーゼ。
【請求項４】
請求項１又は２記載の核酸を含有してなる、発現ベクター。
【請求項５】
請求項１又は２記載の核酸の上流に、シグナル配列をコードする核酸が作動可能に連結されてなる、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項４又は５記載の発現ベクターを含有してなる、形質転換体。
【請求項７】
酵母細胞又は糸状菌に由来する、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６又は７記載の形質転換体を培養し、培養物中に組換えフェノールオキシダーゼを生成させ、回収することを特徴とする、請求項３記載の組換えフェノールオキシダーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項３記載の組換えフェノールオキシダーゼに対する抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−６７９８０（Ｐ２００６−６７９８０Ａ）
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２５８９９２（Ｐ２００４−２５８９９２）
【出願日】平成１６年９月６日（２００４．９．６）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月６日（２００４．９．６）
【出願人】（３９００１１４４２）株式会社マンダム (305)
【Ｆターム（参考）】
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