フラップエンドヌクレアーゼ変異体。
【課題】従来法に比べ、より正確であり、簡便で検出効率の良い遺伝子多型解析が可能とする遺伝子多形解析用試薬を提供する。
【課題解決手段】
フラップエンドヌクレアーゼの基質結合部位に変異を導入し、基質特異性が変化した変異体を得る。得られた変異体は、3’突出末端を有するDNA基質のみに実質的に作用し、遺伝子多型解析試薬として使用するのに好適である。
【課題解決手段】
フラップエンドヌクレアーゼの基質結合部位に変異を導入し、基質特異性が変化した変異体を得る。得られた変異体は、3’突出末端を有するDNA基質のみに実質的に作用し、遺伝子多型解析試薬として使用するのに好適である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変化せしめた新規フラップエンドヌクレアーゼ変異体、及び該変異体を利用した遺伝子の多型解析用試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
フラップ(Flap)エンドヌクレアーゼはDNA複製・修復に必須な酵素であり、DNAの構造を特異的に認識しフラップ鎖を切断する。また、この酵素は、5‘exonuclease活性も有している。この酵素は、結晶構造が明らかにされ、基質認識機構に関して変異体を用いて詳しく調べられている。また、耐熱性のフラップエンドヌクレアーゼとして、パイロコッカス由来の耐熱性酵素も知られている。
一方、最近は、このようなフラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を利用して、遺伝子の多型解析に利用されている。
【0003】
遺伝子の多型とは、異なる個体間で、遺伝子上の同一箇所の塩基配列が異なることをいい、その頻度により突然変異と区別されるが、遺伝子の多型が直接疾病原因となっていることもあり、また、近年、最も頻度の高い多型である一塩基多型(SNP)が複雑に関連し、生活習慣病等の遺伝的要因になっているとも考えられ、そのためSNPの位置及びSNPの塩基に関する膨大なデータが集積されつつある。
上記Flapエンドヌクレアーゼを使用するSNP解析としては、インベーダー法が知られている。この方法はターゲット核酸(ゲノム上での一塩基多型を持った領域)に、インベーダープローブとシグナルプローブがアニールすることにより形成される3塩基の重複構造をフラープエンドヌクレア-ゼが認識してフラップ部分を切断するか否かを指標にして、SNPの有無等を解析するものであるが、現在まで知られているフラップエンドヌクレアーゼは、いずれも基質特異性が比較的広いものであるため、SNP以外の、例えば単なるニック(nick)等の遺伝子欠陥も検出してしまうため、信頼性において十分ではないものであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Kaiser,M., Lyamicheva, N., Ma, W., Miller, C., Neri, B., Fors, L., and Lyamichev, V.,(1999) J. Biol. Chem., 274,21387-21394
【非特許文献2】Lyamichev,V., Brow, M.A.D., Varvel, V.E., and Dahlberg, J. E., (1999) Proc. Natl.Acad. Sci., 96, 6143-6148
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変換し、遺伝子の多型解析において、従来法に比べ、より正確であり、検出効率の良い解析手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、以上のような課題を解決すべく、フラップ(Flap)エンドヌクレアーゼの基質結合部位に変異を導入し、基質特異性が変化した、変異体を作製した。
野生体のフラップ(Flap)エンドヌクレアーゼは、2本鎖DNAの一方のDNA鎖が3’末端突出構造を有して切断されている基質、同3’末端突出構造を持たない基質あるいはニック(nick)を有する基質等に作用し、基質特異性が広いのに対して、上記変異体は、2本鎖DNAの一方のDNA鎖が3’末端突出構造を有して切断され、かつ切断されたDNA鎖の相補鎖部分は連なって、他方のDNA鎖に対して欠落部分がない塩基対を形成している基質に作用する。すなわち、本発明の上記変異体は3’末端突出構造を有する基質に作用し、3’末端突出構造を有しない基質は殆ど切断できないという性質を有するが、さらに、3’末端突出構造を有する基質であっても、さらに特定構造のDNA鎖のみに作用する。
このような変異体酵素の基質特異性を利用すれば、遺伝子の多型解析において、多型が存在する場合のみを正確に蛍光検出できる新しい手段を提供できる。
【0007】
すなわち、本発明は以下(1)〜(6)に示すとおりである。
(1)野生型フラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したフラップエンドヌクレアーゼ変異体であって、該野生型エンドヌクレアーゼの基質のうち、2本鎖DNAの一方のDNA鎖が 3’末端突出構造を有して切断され、かつ切断された各DNA鎖は、他方のDNA鎖と相補の塩基配列部分を有し、これら相補の塩基配列部分は連らなって、他方のDNA鎖に対し欠落部分のない塩基対を形成しているDNA基質に作用し、他の基質に対しては作用しないかあるいは活性が低下していることを特徴とする、フラップエンドヌクレアーゼ変異体。
(2)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列において、(A)33番目のアミノ酸がアラニン又はロイシン、(B)35番目のアミノ酸がチロシン、(C)79番目のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン、(D)33番目と79番目のアミノ酸がともにアラニン、(E)33番目と35番目のアミノ酸がともにアラニン及び(F)278番目及び279番目のアミノ酸がともにアラニンである変異のうちいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体。
(3)上記(2)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードするDNA。
(4)上記(3)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードするDNAを含有する組み換えベクター。
(5)上記(4)に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
(6)上記(1)または(2)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体からなる、遺伝子多型解析用試薬。
【発明の効果】
【0008】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、3’末端が突出している基質、特に第1図に示す、3’突出末端を有するニック及びダブルフラップ基質のみに作用し、これ以外の野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質は殆ど切断できないという新規な性質を有する。このような基質特異性を有する本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を使用することにより、遺伝子の多型解析において、多型が存在する場合のみを正確に検出でき、しかもその検出が簡便に行えるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】フラップエンドヌクレアーゼの基質の構造を模式的に示した図である。
【図2】ダブルフラップ、ニック及び5’レセスエンド基質に対する各フラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図3】シングルフラップ、シュード−Y基質に対する各フラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図4】上記6種の各基質に対する本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図5】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の手法を示す模式図である。
【図6】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の他の手法を示す模式図である。
【図7】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の他の手法を示す模式図である。
【図8】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を遺伝子多型解析に使用するために、必要な基質特異性について試験した結果を示す電気泳動図である。
【図9】実施例5の実験に用いた基質の構造を模式的に示した図である。
【図10】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体(Y33AF79A,Y33AF35A)の各基質に対する活性を示す電気泳動写真である。
【図11】実施例7において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図12】実施例7において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を示す電気泳動写真である。
【図13】実施例7において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図14】実施例9において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図15】実施例9において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図16】実施例10において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図17】実施例10において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図18】実施例11において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図19】実施例11において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を示す電気泳動写真である。
【図20】本発明の酵素変異体を用いて、解析対象DNAにおけるSNPの有無及びそのホモ、へテロを判定するための手法を示す模式図である。
【図21】実施例12において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図22】実施例12において作成した基質に対する、野生株及び本発明の酵素変異体(F79A、F79H)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図23】実施例12において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体(Y33A、Y33L、F35A)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図24】実施例12において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体(Y33AF79A、F278AF279A、Y33AF35A)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図25】実施例13において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図26】実施例13において作成した基質に本発明の酵素変異体を作用させ、得られた各切断フラップ部分の質量分析結果を示すグラフである。
【図27】上記質量分析結果に基づく分子量と予想分子量がほぼ同一であることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変更したものである。野生型フラップエンドヌクレアーゼは、ニック(nick)、3’突出末端を有するニック(Nick with 3'projection)、5’レセス末端(5’Recess-end)、シングルフラップ(Single flap)、ダブルフラップ(Double flap)及びシュード−Y(Pseudo-Y)と呼ばれる基質に作用し、さらに、合流部にギャップ(隙間)を有するダブルフラップ(Double flap with gap at junction;以下、ギャップを有するダブルフラップという。)と呼ばれる構造を有するDNA基質にも作用する。これらのDNA基質の構造は図1に示される。
これらの基質のうち、ギャップを有するダブルフラップ(Double flap with gap at junction)基質は、2本鎖DNAの一方のDNA鎖が切断された3’末端突出構造を有するが、切断された各DNA鎖は、2本鎖DNAの他方のDNA 鎖に対して相補の塩基配列部分をそれぞれ有するが、該相補の塩基配列部分を併せても、他方のDNA鎖に対して欠落する塩基があり、他方のDNAと連続する塩基対が形成されていないものである。
【0011】
すなわち野生型フラップエンドヌクレアーゼは、基質特異性が広く、これら7種の各々構造が異なるDNA基質に作用する。また、フラップエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ作用とエキソヌクレアーゼ作用とを有し、野生型フラップエンドヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ作用により、上記7種のDNA基質のうち、ニック(nick)、3’突出末端を 有するニック(Nick with 3'projection)、及び5’レセス末端(5’Recess-end)基質における下流側ストランド(Downstream)の5’末端側を削除していく。また、エンドヌクレアーゼ作用により、シングルフラップ(Single flap)、ダブルフラップ(Double flap)、シュード−Y(Pseudo-Y)基質、ギャップを有するダブルフラップ基質(Double flap with gap at junction)有するフラップストランド(Flap Strand)の5’末端側フラップを切断するとともに、さらにエキソヌクレアーゼ作用により、切断部位の5’末端側を削除する。
【0012】
これに対して、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、上記野生型エンドヌクレアーゼの基質のうち、3’突出末端を有するニック(Nick with 3'projection)基質とダブルフラップ(Double flap)基質のみに作用する。
すなわち、3’突出末端を有するニック基質においては、下流側ストランド(Down Strand(C-1))の5’末端側塩基は、上流側ストランド(Upstream Strand (B-2))のフラップ基部の塩基の直前まで伸びており、下流側ストランド(Down Strand(C-1))と上流側ストランド(Upstream Strand(B-2)のテンプレートストランドに対する相補鎖部分は、連なって、他方のDNA鎖(Template Strand(A))に対して欠落部分のない塩基対を形成している。ダブルフラップ基質も、同様に他方のDNA鎖(Template Strand(A))に対するフラップストランド(Flap strand (C-3))及び上流側ストランド(Upstream Strand(B-2))の相補配列部分は、連なって、他方のDNA鎖(Template Strand(A))と欠落部分のない塩基対を形成している。
【0013】
しかし、本発明のエンドヌクレアーゼ変異体は、これら以外の上記5種のDNA基質に対しては、作用しないかあるいはその活性は極めて低い。
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の作用形態自体は、野生型と異ならず、3’突出末端を有するニック(Nick with 3'projection)の下流ストランドの5’末端側を削除し、ダブルフラップ(Double flap)のフラップストランド(Flap Strand)のフラップ部分を切断するとともに、さらにエキソヌクレアーゼ作用により、切断部位の5’末端側を削除する。
【0014】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型フラップヌクレアーゼの基質結合部位のアミノ酸を変異させたものである。この変異体酵素を得るには、配列番号2に示す野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1のアミノ酸配列をコードする遺伝子あるいはこれを含むプラスミドを鋳型とし、かつ変異を入れたプライマーを用いて、PCR増幅を行う部位特異的変異作成法により、変異体遺伝子を得て、該変異遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、この組み換えられた発現ベクターを宿主微生物に導入して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養し、培養物から目的のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を得ることができる。
【0015】
本発明においては、この手法により、パイロコツカス、ホリコシ(登録番号JCM9974)の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1の遺伝子(配列表の配列番号1)の変異体遺伝子を得、これを用いて得られた様々な酵素変異体の各基質に対する酵素活性を測定した結果、特定構造の3’突出末端を有するDNA基質のみに実質的に作用する耐熱性のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を見いだしているが、これを具体的に例示すると以下のとおりである。
【0016】
パイロコッカス ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1のアミノ酸配列(配列表の配列番号2)において、
(A)33番目のアミノ酸であるチロシンがアラニン又はロイシンに置換された変異体。
(以下、それぞれY33A、Y33Lと表示する場合がある。) 該変異体酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号4及び6に示される。
(B)35番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがチロシンに置換された変異体。
(以下、F35Yと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号8に示される。
(C)79番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン又はヒスチジンに置換された変異体。(以下、それぞれF79A、F79Hと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号10、12に示される。
(D) 33番目のアミノ酸であるチロシンおよび79番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換された変異体(以下、Y33AF79Aと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号14に示される。
(E)33番目のアミノ酸であるチロシンおよび35番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換さ れた変異体(以下、Y33AF35Aと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号54に示される。
(F)278 番目のアミノ酸であるフェニルアラニンおよび279番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換された変異体。
(以下、F278AF279Aと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号16に示される。
【0017】
上記Y33A、Y33L、F35Y、F79A、F79H、Y33AF79、Y33AF35A、F278AF279Aの各遺伝子は、これら変異体ペプチドをコードするものであれば、特に制約はないが、これら遺伝子の塩基配列を例示すると、それぞれ順に配列表の配列番号3、5、7、9、11、13、53、15に示す配列が挙げられる。
以下の表1に、フラップエンドヌクレアーゼ −1(野生型)ファミリーのアミノ酸配列をアライメントして示す。
【0018】
【表1】
表中の符号は以下のとおりである
phFEN- 1;Pyrococcus horikoshiiのフラップエンドヌクレアーゼ−1(FEN-1)
mjFEN- 1;Methanococcus jannaschiiのFEN-1
spRAD2;Schizosaccharomyces pombのRAD2
hFEN-1;ヒトの FEN-1
T5 EXO;T5 エキソヌクレアーゼ
T7 EXO;T7gene6エキソヌクレアーゼ
E.coli pol.1;E.coliポリメラーゼ1における5’エキソヌクレアーゼドメイン
Tag.pol.1;Thermus aguaticusポリメラーゼ1における5’エキソヌクレアーゼドメイン
【0019】
これによれば、パイロコッカス ホリコシ由来のフラップエンドヌクレアーゼ−1の基質結合ドメインにおける、変異の対象とした部位のアミノ酸はほぼ共通しており、特に、フラップエンドヌクレアーゼ−1(FEN−1)については、ヒトを含めて全く共通している。
このことは、上記パイロコッカス ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1について施した変異を、他の生物由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1にも施せば、同様な基質特異性変化が起こることを強く示唆する。
【0020】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の有する、3’突出末端を有するDNA基質のみに実質的に作用するという基質特異性は、簡便、正確でかつ全く新しい、遺伝子の多型解析手法を提供する。
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を遺伝子多型解析用試薬として用いた場合における、遺伝子多型解析手法について以下に説明する。
【0021】
解析手法1
以下に図5のSNP解析を例にとり、説明する。
なお、図5中、FAM、TAMRAはそれぞれ蛍光色素を示し、2本線上側の−A−はSNPがなく正常の場合の塩基、−G−、−C−、−T−は、多型の場合の塩基を示す。
(a)SNP部位を含む試料DNAと相補の塩基配列を有し、その5’末端がSNP部位と対応する位置まで伸長し、かつ該5末端が、検体試料DNAにSNPがない場合の塩基(A)と塩基対を形成する塩基(T)となるようオリゴヌクレオチドを合成してプローブAとする。また、SNP部位を含む試料DNAと相補の塩基配列を有し、その3’末端がSNP部位と対応する位置まで伸長し、かつ該3’末端が、試料DNAにSNPがない場合の塩基(A)及び該塩基と塩基対を形成する塩基(T)以外の塩基(C、G)となるようにオリゴヌクレオチドを合成してプローブBとし、プローブAの5’末端およびプローブBの3’末端を、近接するとFRET効果を生じて、蛍光が発生しないかあるいは少なくとも発光強度が低下する色素でそれぞれ標識する。
FRET効果を生じる蛍光色素の組み合わせとしては、TAMRAとFAM、BHQ−1とTET、HEX、FAM等がある。例えば、プローブAの5’末端の標識にFANを用いた場合、プローブBの3’末端の標識はTAMRAを用いればよい。
(b)次いで試料DNAに上記プローブA及びプローブBをアニールさせる。このアニールした場合の2本鎖DNAの構造は、SNPがある場合とない場合とでは異なる。
【0022】
〔SNPがある場合〕
3’末端をCとしたプローブBを使用したとき、試料DNAのSNP部位に多型がある場合、すなわち試料DNAのSNP部位の塩基はG、CまたはTのいずれかである。
1)このうちGの場合には、プローブBの3’末端の塩基(C)と相補の関係にあり塩基対を形成するので、3’末端突出構造を形成しない(図5(1)中(A))。
2)Cの場合には、プローブAの5’末端の塩基(T)及びプローブBの3’末端の塩基(C)は、試料DNAのSNP部位の塩基(G)といずれも塩基対を形成せず、プローブAの5’末端の塩基(T)及びプローブBの3’末端の塩基(C)はいずれも突出構造をとり、プローブAとプローブBとにおける、試料DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料DNAに対して連続した塩基対を形成せず、ギャップを生じる(図5(1)中(B)) 。
3)Tの場合は、上記2)と同様に、プローブAの5’末端の塩基(T)及びプローブBの3’末端の塩基(C)は、試料DNAのSNP部位の塩基(T)といずれも塩基対を形成せず、プローブAの5’末端の塩基(T)及びプローブBの3’末端の塩基(C)はいずれも突出構造をとり、プローブAとプローブBとにおける、試料DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料DNAに対して連続した塩基対を形成しない(図5(1)中(B’)。
一方、3’末端塩基を(G)としたプローブBを使用したときも、同様で、試料DNAのSNP部位に多型がある場合には必ず、図5(1)の(A)、(B)または(B’)のいずれかの構造となる。
【0023】
〔SNPがない場合〕
これに対して、試料DNAのSNP部位に多型がない場合、すなわち試料DNAのSNP部位の塩基が(A)である場合は、プローブAの5’末端はTであるから塩基対を形成するとともに、プローブBの3’末端は(C)または(G)であるから、試料DNAのSNP部位の塩基(A)とは塩基対を形成せず、突出末端となる。すなわち、このときの構造は図1に示される3’突出末端を有するニック構造となり、プローブAの5’末端と、プローブBのフラップ部分を除く試料DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料DNAとともに欠落部分のない連続した塩基対を形成する(図5(1)(C))。
【0024】
(c)次いで、上記プローブAとBが試料DNAとアニールした状態で、本発明の遺伝子多型解析用試薬である、フラップエンドヌクレアーゼ変異体を作用させる。
試料DNAにSNPがある場合には、該フラップ エンドヌクレアーゼ変異体は、上記図5(1)の(A)、(B)、(B’)に示される構造のDNA基質にはいずれも作用しないので、プローブAの蛍光色素TAMRAとプローブBの蛍光色素FAMとは近接位置にあり、FRET効果により、蛍光は発生しない。
これに対して、SNPがない場合には、3’突出末端を有するニック構造となるから、フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、該構造を基質として認識し、プローブAの5末端が切断され、蛍光色素TAMRAが上記FAMとの近接位置から外れることにより蛍光を生じる。
したがって、蛍光の有無を検出することによりSNPの有無を判定できる。
【0025】
解析手法2
解析手法2は、図5(2)に示される。
なお、この手法は、プローブAの3’末端及び5’末端をそれぞれ近接によりFRET効果を生じる蛍光色素(例えば、TAMRAとFAM等の組み合わせ)により標識し、また、プローブBには蛍光標識しない他は、解析手法1と同様である。なお、この場合においてはプローブAの分子長は、その両端の蛍光色素が近接して、FRET効果により蛍光強度が低下するように、設計する(例えば、20mer以下)。
SNPがある場合においては、解析手法1と同様に、プローブBは3’末端突出構造を形成しないか(図5(2)(A))、あるいはプローブAとプローブBとにおける、試料DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料DNAに対して連続した塩基対を形成せず、ギャップを生じるので(図5(2)中(B)、(B’))、試料DNAにSNPがある場合には、使用したフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、いずれも作用しないので、FRET効果により、蛍光は強度は低いものとなる。それに対して、SNPがない場合には、3’突出末端を有するニック構造となるから、フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、該構造を基質として認識し、プローブAの5末端が切断され(図5(2)(C))、蛍光色
素TAMRAが上記FAMとの近接位置から外れることにより蛍光強度が増大し、蛍光強度を観察することにより、SNPの有無を判定できる。
この蛍 光標識手法によれば、プローブAの両端にそれぞれ異なる蛍光標識を行い、プローブBの3’末端に蛍光標識しないので、遺伝子多型解析においてプローブが解析対象遺伝子との間で、3’突出末端を有するニックあるいはダブルフラップを形成した場合、酵素活性が低下せずフラップストランドを切断できるので、感度よく解析することが可能となる。
遺伝子多型解析においてプローブが解析対象遺伝子との間で3’突出末端を形成した場合、酵素活性が低下せず、感度よく解析することが可能となる。
【0026】
解析手法3
図5中(3)で示される方法はSNPの塩基を決定する方法である。
この方法は、プローブAの5’末端をそれぞれ、例えばC、G、Aとした3種類のプローブA を用いるもので、該5’末端を標識する蛍光色素を各々異ならせるとともに、該蛍光色素として、プローブBの3末端を標識した蛍光色素とFRET効果により消光する色素を用いる。 しかし、その他の手法は上記解析手法1と同様である。
このような3種類のプロープAを用いた場合、その5’末端の塩基が、試料DNAのSNPの塩基と相補の場合のみ、3’突出末端を有するニック構造となるから、本発明のフラップエンドヌクレアーゼを作用させた場合に5’末端は切断され、蛍光を発生する。蛍光波長の種類から、どのプローブA由来のものかが分かり、その5’末端塩基からSNPの塩基の種類を特定できる。
【0027】
解析手法4
図6の方法は、SNPの塩基がすでに明らかとなっている場合に、簡便に検出する方法である。例えば、SNPの塩基が(A)であり、SNPのない場合の塩基が(G)である場合には、プロ-ブAの5’末端を(A)の相補塩基の(T)とするとともに、その3’末端と5’末端を、例えばTAMRAとFAMで標識する。このプローブAの長さは、上記解析手法1と同様に20mer以下にすることが好ましい。また、プローブの3’末端塩基はSNPのない場合の塩基 (G)と相補の塩基(C)にする。
試料DNAにSNPがある場合には、試料DNAとプローブA及びBをアニールさせたとき、3’末端突出ニック構造を形成するから、本発明のフラップエンドヌクレアーゼを作用させると、プローブAの5’末端が切断され、5’末端に標識された蛍光色素(FAM)が蛍光を発生する。一方、SNPがない場合はプローブBの3末端の塩基(C)は試料DNAのSNPのないときの塩基(G)と塩基対を形成し、3’末端突出構造を有しない(5’シングルフラップ構造)ので切断できない。したがって、プローブAの両末端に標識された上記蛍光色素は、FRET効果により消光されている。
したがって、SNPの塩基がすでに明らかであれば、上記のように各プローブを構成すれば、一回の試験で、簡便にSNPを解析できる。
【0028】
解析手法5
図7に示す方法は、ゲノムに存在するSNPを多数同時に解析する方法である。
例えば、ゲノム上のA, B, Cの位置にSNPが存在する場合、図7Bに示したように、プローブA、Bを作成する。プローブAにはSNPのGに相補するCを接合部に入れる。プロ-ブB の3’末端は、SNP無しの場合の塩基(T)と相補する塩基(A)にする。これらプローブを試料のゲノムDNAとアニールさせた場合、SNPが有る場合は、ダブルフラップ(double flap)構造ができ、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体により、接合部より1塩基中に入った所、1箇所で切断される。一方、SNPが無い場合は、シングルフラップ(singleflap)構造ができ、切断されない。
この解析手法に用いるプローブAは、検出する SNPの部位毎に、5’末端フラップの長さが変わるよう合成し、その5’末端にはビオチンを結合させる。例えば、図7に示される様に、SNPの部位、A、B、C毎に順に5’突出末端の長さを2-3塩基ずつ長くなるようにする。このことにより、本発明のエンドヌクレアーゼ変異体による、5’末端フラップの切断により、長さの異なったDNAフラグメントが得られる。5’末端にビオチンがついているため、アビジンカラムで精製することができ、精製されたDNAフラグメントの分子量は質量分析機(MS)により検出される。SNPの箇所により、得られるDNAフラグメントの長さが異なるために、検出される分子量により、SNPの箇所が特定できる。MALDI-TOFMSを使用すれば、384検体を解析でき、1検体で、10箇所以上のSNPを同時に解析できる。
【0029】
上記手法においては、DNAフラグメントの精製 のためプローブAの5’末端にビオチンを結合させるが、ZipTip等のDNA精製手段を用いれば、ビオチンを用いることなく、DNAフラグメントを精製でき、以後、上記と同様にして該フラグメントの分子量を測定できる。
また、DNAを構成する塩基はその分子量がそれぞれ異なるため、5’末端フラップが同じ長さであっても、該フラップを構成する塩基の組み合わせを変えることにより、フラップ鎖の分子量を変えることができ、切断されたDNAフラグメントの分子量を測定することにより、切断されたフラップを特定できる。すなわち、図7Cに示されるように、例えば、5’フラップ鎖の長さを同じ14merにしても、その構成塩基の差異により、一方のフラグメントの分子量は4865であり、他方は4940とすることが可能であり、両者は識別可能である。したがって、5’フラップ鎖の構成塩基をデザインし、切断DNAフラグメントの分子量を測定することにより、切断されたフラップの特定を行い、これに対応するSNPの位置が明らかになる。
さらに、フラップ鎖が長くなると、フラップエンドヌクレアーゼ変異体により切断しにくくなるが、塩基の組み合わせと塩基の長さを変えることにより、フラップエンドヌクレアーゼ変異体の作用の良好なフラップ鎖長さの範囲内において、極めて多種の分子量の異なったフラップ鎖を作成することが可能になる。
【0030】
解析手法6
遺伝子多型においては、ゲノム遺伝子と対立遺伝 子の間でSNPが同じ場合(ホモ)と異なる場合がある(ヘテロ)、本発明によれば、SNP塩基がすでに明らかな場合において、解析対象遺伝子試料のSNPの有無に加えて、該SNPがホモなのかあるいはヘテロなのかも簡単に見分けることができる。
この手法を図20に基づき以下に説明する。例えば、SNPがなく正常な塩基がAで、SNPがGである場合、5’末端の塩基をTとしたプローブA(T)と、CとしたプローブA(C)とをそれぞれ合成し、その両末端を異なる蛍光色素で標識する。このとき5’末端の蛍光色素を、例えば、プローブA(T)においてはFAMとし、プローブA(C)ではTETとするように各々異なるようにする。
この後、解析対象のDNAに対し、プローブA(T)およびプローブA(C)とプローブBとをアニーリングし、本発明の酵素変異体を作用させると、SNPがない場合(Aの場合)には、プローブA(T)のみが3’突出Nick構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、蛍光色素FAMに由来する蛍光が検出される。
SNPがホモ(ともにG)の場合、プローブA(C)のみが、3’突出Nick構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、蛍光色素TETに由来する蛍光が検出される。
一方、ヘテロの場合(AとG)には、プローブ A(T)とプローブA(C)は、ともに3’突出nick構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、TETとFAM由来の波長の異なる2つの蛍光が検出される。
なお、これ以外は、ギャップを有するダブルフラップ構造かあるいは3’突出構造を有しないシングルフラップ構造を形成するため。本発明の酵素により切断されない。
したがって、5’末端塩基が異なる2種のプローブAを使用し、本発明の酵素変異体を作用させて発生する蛍光波長を検出することによりSNPの有無及びホモ、ヘテロの判定を同時に行うことができる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【0031】
〔実施例1〕
変異体の作製
変異体Y33Aの遺伝子の作成は、以下のように行った。
以下に示す、共通プライマー及び変異の入ったプライマー(Y33A作成用プライマー)を合成し、パイロコッカス・ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1(FEN-1)の遺伝子(配列番号1)を含むPET11aプラスミドを鋳型として、初めに、制限酵素サイト(Nde1)の入ったFEN-Uプライマーと変異の入ったY33A-Rプライマー、それと制限酵素サイト(Xho1)の入ったFEN-Rプライマーと変異の入ったY33A-UでPCR(96度で5分加熱後に、DNA polymeraseを入れた。その後に96度1分、55度2分、70度2分の1サイクルを25回行った。)を行い、変異の入った、2つの断片を作成し、次に、これらの断片を鋳型にし、FEN-UプライマーとFEN-RプライマーでPCR(上記と同様の条件)を行い、変異を導入し、同時に遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。
フラップエンドヌクレアーゼ変異体Y33Aの構造遺伝子の塩基配列は、配列番号3に示す。
他のフラップエンドヌクレアーゼ変異体Y33L、F35Y、F79A、 F79H、Y33AF79A、F278AF279A及びY33AF35Aの各遺伝子も上記と同様に作成した。これら構造遺伝子の塩基配列は、それぞれ順に 配列表の配列番号5、7、9、11、13、15、53に示される。
【0032】
共通に使用するプライマー;
FEN-U
5’-GGGAATTCCTGCAGATCGCATATGGGTGTTCCTATCGGTGAC-3’(配列 番号17)
FEN-R
5’-ACGCGTCGACGTCCGCTCGAGCGGTTAGGGTTTCTTTTTAACGAACCAAC-
3’(配列番号18)
Y33A作成用プライマー;
Y33A-U
5’-ATAGATGCCCTAAACGCCATCGCGCAGTTTTTATCAACGATACGACAG-
3’(配列番号19)
Y33A-R
5’-CTGTCGTATCGTTGATAAAAACTGCGCGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-
3’(配列番号20)
Y33L作成用プライマー;
Y33L-U
5’-ATAGATGCCCTAAACGCCATCCTGCAGTTTTTATCAACGATACGACAG-
3’(配列番号21)
Y33L-R
5’-
CTGTCGTATCGTTGATAAAAACTGCAGGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-3’(配列番号22)
F35Y作成用プライマー;
F35Y-U
5’-GCCCTAAACGCCATCTATCAGTATTTATCAACGATACGACAGCGTGAT-
3’(配列番号23)
F35Y-R
5’-ATCACGCTGTCGTATCGTTGATAAATACTGATAGATGGCGTTTAGGGC-
3’(配列番号24)
F79A作成用プライマー;
F79A-U
5’-GGTATTAAGCCGGCCTACGTCGCGGATGGAAAGCCTCCGGAATTTAAA-
3’(配列番号25)
F79A-R
5’-TTTAAATTCCGGAGGCTTTCCATCCGCGACGTAGGCCGGCTTAATACC-
3’(配列番号26)
F79H作成用プライマー;
F79H-U
5’-
GGTATTAAGCCGGCCTACGTCCATGATGGAAAGCCTCCGGAATTTAAA-3’(配列番号27)
F79H-R
5’-
TTTAAATTCCGGAGGCTTTCCATCATGGACGTAGGCCGGCTTAATACC-3’(配列番号28)
F278AF279A作成用プライマー;
F278AF279A-U
5’-CTTTACGCTATTAAGGAAGCGGCGCTTAACCCTCCTGTCACTAATGAA-
3’(配列番号29)
F278AF279A-R
5’-TTCATTAGTGACAGGAGGGTTAAGCGCCGCTTCCTTAATAGCGTAAAG-
3’(配列番号30)
Y33AF35A作成用プライマー;
Y33AF35A-U
5'-ATAGATGCCCTAAACGCCATCGCGCAGGCGTTATCAACGATAAGACAGAGG-3'(配列番号39)
Y33AF35A-R
5'-CCTCTGTCTTATCGTTGATAACGCCTGCGCGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-3'(配列番号40)
また、Y33AF79A遺伝子については、上記Y33Aの遺伝子(配列番号3)を含有するプラスミドを精製し、これを鋳型にしてF79Aのプライマー(配列番号25,26)を用いて作成した(配列番号13)。
【0033】
次いで、PETlla(Novagen社製)を制限酵素NdeIとXhoIで切断・精製した後、上記の 各変異遺伝子とT4リガーゼで16℃、2時間反応させ連結した。連結したDNAの一部をE.coli−XLl−BlueMRFのコンピトセルに導入し各形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドをアルカリ法で精製し各発現プラスミドを得た。
【0034】
〔実施例2〕
組換え遺伝子の発現
大腸菌(E.coliBL21(DE3),Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、二本のフアルコンチューブに各々0.1mlづつ移し、その中に上記の各発現プラスミド溶液0.005mlを別々に加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOCmedium0.9mlを加え、37度で1時間振とう培養したる。
その後アンピシリンを含む2YT寒天プレートに適量まき、37度で一晩培養し、各形質転換体を得た。
当該各形質転換体をアンピシリンを含む2YT培 地(2リットル)で660nmの吸収が0.4 に達するまで37℃で培養した後、IPTG(Isopropy-b-D-thiogalactopyranoside)を1mMになるように加え、30℃で4時間培養した。培養後遠心分離(6,000rpm,20min)で集菌した。
【0035】
〔実施例3〕
変異酵素の精製
それぞれ集菌した菌体を−20度で凍結融解し、菌体の2倍の50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を加え懸濁液を得た。得られた各懸濁液について85度で30分加熱後遠心分離(11,000rpm,20min)し、HiTrapSP(フアルマシア社製)カラムに吸着させ、NaCl濃度勾配による溶出を行い活性 画分を得、Y33A、Y33L、F35Y、F79A、F79H、F278AF279A、Y33AF35A、及びY33AF79Aの精製酵素溶液とした。
【0036】
〔実施例4〕
酵素反応条件
(1)合成オリゴヌクレオチド
以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。なお、全てのオリゴヌクレオチドは北海道システムサイエンス社により合成された。
Template Strand(A);54-mer,
5’- GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Downstream Strand(C-1);28mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号35)
Upstream Strand(B-1);26-mer, 5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';(配列番号32)
Upstream Strand(B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
Flap Strand(C-2);32mer, 5'-
TAACTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'
(配列番号36)
Flap Strand(C-3);57-mer,5'-GCATCTGACGGATGTCAAGCAGTCCTAACTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC- 3'(配列番号37)
このうちDownstream Strand(C-1), Flap
Strand(C-2), Flap Strand(C-3)のオリゴヌクレオタイドは5’末端が蛍光ラベル(FAM)された。
【0037】
(2)基質の調整
上記オリゴヌクレオチドを〔(A)+(C-1)+(B-1)、(A)+(C-1)+(B-2)、(A)+(C-1)、(A)+(C-2)+(B- 1)、(A)+(C-3)+(B-2)及び(A)+(C-2)〕のように組み合わせて、それぞれ150mMNaClを含む、20mMトリス塩酸緩衝液(ph7.4)の中で煮沸し、溶液の温度を徐々に4度までさげることのよりアニーリングさせ、各々の基質を作製した。基質の名称と構造を図1に示す。
【0038】
(3)flap エンドヌクレアーゼ活性
10マイクロリットルの50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mM MgC12、100mg/ml,牛血清アルブミン)に2pmolesの蛍光ラベル(FAM)された各基質に酵素変異体Y33A,Y33L,F35Y,F79A,F79L,F79H,F278AF279Aをそれぞれ加え、60度で1分から10分まで反応させ、1分間隔で活性を測定した。次ぎに、10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA,1mg/mlキシレンシアノールを加え酵素反応を停止させた。これを100℃加温、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacryylamide gel電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad社製)でオートラジオグラフイー化し、反応物の分子種と量を測定した。Kinetics解析を行ない、KmとKcatを算出した。
(4)変異体の基質特異性
上記各変異体の基質特異性の変化を他の変異体及び野生型酵素(WT)とともに図2、3、4に示す。変異体Y33A,Y33L,F35Y,F79A,F79L,F79H,F278AF279A は、Nick,Recess-end,Sing1e flap,Pseudo-Y基質に対して、活性が著しく減少した。しかし、Double
flap,Nick with3’Projection基質に対しては、WTと比べて活性は殆ど変化がなかった。
5’末端の蛍光ラベルの基質は、野生型フラップエンドヌクレアーゼおよび該変異体のいずれもが切断した。
【0039】
〔実施例5〕
以下の各オリゴヌクレオチドを合成した。このうちりC−1及びC−4の5’末端は蛍光ラベル(FAM)されている。次いでこれらオリゴヌクレオチドを、実施例4と同様にアニーリングし図9に示す構造の基質を作成した。
Template Strand (A); 54-mer,
5’-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-3
(配列番号31)
Upstream Strand (B-3),
26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’(配列番号34)
Downstream Strand(C-1);28mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号35)
Downstream Strand (C-4);
29mer, 5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3’(配列番号38)
なお、基質の構造は、5’が1mer突出のsingle flap 構造(図9A)、nick領域に1 mer gapの入ったdouble flap 構造(図9B)、及びnick with 3’projection 構造(図9C)の3種である。
【0040】
ついで、10 マイクロリットルの50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,
100mg/ml 牛血清アルブミン)に、2pmolesの蛍光ラベル(FAM)された各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体F79A, Y33A, F278AF279Aを0.1ngと1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide gel 電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。
結果を図8に示す。これによれば、基質Cに対しては、野生型酵素及び本発明の変異体酵素はともに活性を示すが、基質A、Bに対しては野生型酵素が活性を示すのに対し、本発明の変異体酵素は、いずれも活性を示さない。この様な基質特異性は本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体が、上記多型解析手法に用いる試薬として、十分な性能を有することを示す。
【0041】
〔実施例6〕
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2, 100mg/ml 牛血清アルブミン)に、実施例4、5において作製された、2pmolesの蛍光ラベル(FAM)された合計7種の基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生型0.1ngと1ng, 変異体Y33AF35A, Y33AF79A 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide gel 電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。結果を図10に示す。
これによれば、野生型酵素は、上記7種の総ての基質に対して、活性を示すが、変異体Y33AF35A, Y33AF79Aは、3'が突出しているF(Nick with3’Projection構造)とG(Double flap構造)のみ活性を示す。しかし、3'が突出 しているが、1mer gapがあるC(ギャップを有するダブルフラップ構造)に対しては活性を示さない。
【0042】
〔実施例7〕
以下の各オリゴヌクレオチドを合成した。
Template Strand (A); 54mer,
5'-
GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-3’(配列番号31)
Upstream
Strand(B-1);26-mer,
5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';(配列番号32)
Upstream
Strand(B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
Upstream
Strand (B-3), 26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’(配列番号34)
Downstream
Strand(C-1-1);20mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号41)
Flap Strand
(C-4-1); 20mer, 5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGAC-3'(配列番号42)
このうちC-4-1、C-1-1については、5'末端にFAM,3'末端にTAMRAをラベルし、実施例4と同様にアニーリングし図11に示す構造の基質を作成した。
【0043】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml 牛血清アルブミン)に、1pmolesの蛍光ラベルされた上記基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide gel 電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。
結果を図12に示す。これによれば、野生型酵素は、図中(A)〜(C)の総ての基質に対して、活性を示すが、変異体酵素は、3'末端が突出している(C)のみ活性を示す。3'が突出しているが、1mer gapがある(B)、及び(A)に対しては活性を示さないか、又は非常に弱い活性を示す。
【0044】
〔実施例 8〕
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml 牛血清アルブミン)に、実施例7で作成した、10pmolesの蛍光ラベルされた基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生型と変異体 10ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止める。励起光494nm, 蛍光520nmで、フィルタ-500nmを使用して、分光蛍光光度計、FP-750(日本分光)で蛍光強度を測定した。
結果を図13に示す。なお、図13の各棒グラフの値は、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引いた値である。
この結果によれば、野生型酵素は、上記A〜Cの総ての基質に対して、活性を示すが、変異体酵素は3'末端が突出している基質Cのみ活性を示す。又3'末端が突出しているが、1mer gapがある基質Bに対しては活性を示さない。
【0045】
〔実施例9〕
以下のオリゴヌクレオチドを合成し、
Template Strand (A); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Upstream Strand(B-1);26-mer, 5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';(配列番号32)
Upstream Strand(B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
Upstream Strand (B-3),
26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’(配列番号34)
Downstream Strand(C-1);28mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号35)
Flap Strand(C-4); 29mer,
5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3’(配列番号38)
B-1、B-2、B-3の3'末端をTAMRAでラベルし、C-1、C-4の5'末端はFAMでラベルした。次に、これらオリゴヌクレオチドを実施例4と同様にアニーリングし図14に示す構造の基質を作成した。
【0046】
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml 牛血清アルブミン)に、10pmolesの蛍光ラベルされた上記各基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生体50ngと変異体を400ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。 次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止める。励起光494nm,蛍光520nmで、フィルタ-500nmを使用して、分光蛍光光度計、FP-750(日本分光)で蛍光強度を測定する。酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引く。これを各サンプルの値とする。
結果を図15に示す。
upstream Strand B-1, B-2, B-3 の3’末端にTAMRAが結合していると、野生型酵素、変異体酵素共に、3’末端に蛍光ラベルがないものに比べ活性が低くなる。しかし、酵素量を増加する (50ng)と、活性が検出された。野生型酵素は、基質A, B, C に高い活性を示したが、変異体酵素は、基質Aのみ高い活性を示した。したがって、このような蛍光標識手法によっても、多型解析が可能である。
【0047】
〔実施例10〕
多型解析の解析対象遺伝子のモデルとして、以下3種のオリゴヌクレオチドを合成した。
これらのオリゴヌクレオチドは下線部の塩基がそれぞれ異なり、この位置にSNPがあると想定している。
Template Strand (G); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号43)
Template Strand
(C); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGCCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号44)
Template Strand (T); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGTCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号45)
【0048】
一方、プローブAとして以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは下線部の塩基がそれぞれ異なり、また各々標識する蛍光色素が異なる。
プロ-ブA(C); 28mer 5'-CCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'
(配列番号46)
5末端に蛍光(TET)がラベルされている。
プロ-ブA(G); 28mer 5'-GCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番号47)
5末端に蛍光(HEX)がラベルされている。
プロ-ブA(A); 28mer 5'-ACTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番号48)
5末端に蛍光(FAM)がラベルされている。
また、プローブBとして以下のDNAを合成し、その3'末端にクエンチャ-(BHQ-1)をラベルした。
プロ- ブB(upstrem strand b-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
以上のオリゴヌクレオチドを実施例4の方法と同様にアニーリングし、以下の基質1〜9を作成した。
このアニーリングにより形成される各基質の構造は図16の(1)〜(9)に示される。
【0049】
基質1 Template Strand (G)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質2 Template Strand (G)+プロ-ブA(G)+プロ-ブB
基質3 Template Strand (G)+プロ-ブA(A)+プロ-ブB
基質4 Template Strand (C)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質5 Template Strand (C)+プロ-ブA(G)+プロ-ブB
基質6 Template Strand (C)+プロ-ブA(A)+プロ-ブB
基質7 Template Strand (T)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質8 Template Strand (T)+プロ-ブA(G)+プロ-ブB
基質9 Template Strand (T)+プロ-ブA(A)+プロ-ブB
【0050】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン)に、40pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体170ngと変異体 400ngをそれぞれ加え、60度で10分反応させた。次に、50mMトリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止めた。蛍光種類により励起光、蛍光の波長が異なる。また、フィルタ-の種類も異なる。
TET 励起波長 510nm
蛍光波長 540nm フィルタ- 520nm
HEX 励起波長 520nm
蛍光波長 550nm フィルタ- 540nm
FAM 励起波長 494nm 蛍光波長 525nm フィルタ- 500nm
各基質に対する酵素作用の検出は、上記基質毎に、TET、HEX、FAMの励起波長で生じた蛍光をフィルターを通して、分光蛍光光度計、FP-750(日本分光)により蛍光強度を測定した。また、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引き。これを各サンプルの値とした。
【0051】
結果を図17に示す。
これによると、野生型は全ての基質に対して活性を示したが、本発明の全ての酵素変異体は、基質1、5、9に対して高い活性を示した。このことは、各Template Strand に対しては、それぞれプロ-ブA(C)、プローブA(A)及びプローブA(G)のみが塩基対を形成し、3’突出のNickを形成したことを意味する(図16)。 したがって例えば、プローブA(C)に由来するTETの蛍光が検出された場合には、Template StrandのSNP部位として想定した部位の塩基がGであることが分かり、本発明の酵素変異体を使用して生ずる蛍光の種類によりSNPの塩基を特定することができる。
【0052】
〔実施例11〕
以下の実験例は、SNPの塩基がすでに明らかになっている場合において、解析対象の遺伝子に当該SNPがある化否か判定するために、本発明の酵素変異体を使用した例である。
多型解析の解析対象遺伝子のモデルとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
これらの塩基配列中、下線部のGは正常な塩基であり、AはSNPであると想定している。
Template Strand (A); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Template Strand (G); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号43)
一方、プローブAとして、SNPに対応する5’末端がTである以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成し、該オリゴヌクレオチドの5’末端にFAM, 3’末端にTAMRAをそれぞれラベルした。
プロ-ブA(T); 20mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号49)
また、プローブBとして以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
プロ-ブ B ;27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号
33)
以上の オリゴヌクレオチドを実施例4の方法と同様にアニーリングした。これにより、図18に示される2種の構造の基質が形成される(ただし、蛍光色素は図示せず。)
【0053】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン)に、1pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体は 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide
gel電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad
社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。
結果を図19に示す。
これによれば、野生型酵素は、基質A、Bに対して、活性を示すが、本発明の変異体酵素は、いずれも基質Aのみに活性を示し、基質Bに対して、活性を示さないか叉は極めて弱い活性を示す。すなわち、SNPの塩基が明らかである場合においては、この塩基と塩基対を形成する塩基を5’末端に 有するプローブAを使用すれば、3’突 出のNickを形成し、本発明の酵素変異体により、プローブAの5’末端側は切断され、該末端に結合したFAN由来の蛍光を生ずる。これに対して、SNPがない場合にはプローブAは切断されず、蛍光を発生しない。したがって、蛍光の有無によりSNPの有無を判定できる(図6参照)。
【0054】
〔実施例12〕
以下の実験例は、SNPの塩基がすでに明らかになっている場合において、解析対象の遺伝子のSNPの有無及び該SNPがホモかヘテロかを判定するために、本発明
の酵素変異体を使用した例である。
解析対象遺伝子のモデルとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。なお、下線部の塩基はAが正常で、GがSNPである。
Template Strand (A); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Template Strand (G); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号43)
プローブAとして以下のオリゴヌクレオチドを合成、プローブA(T)の5’末端に FAM,3’末端にBHQ-1を標識し、また、プローブA(C)の5’末端にTET、3’末端にBHQ-1を標識 した。
プロ-ブA(T); 20mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-
3'(配列番号49)
プロ-ブA(C); 20mer ,5'-CCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号50)
プロ-ブ B(upstream strand B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
【0055】
以上のオリゴヌクレオチドを実施例4の方法と同様にアニーリングし、以下の基質1〜6を作成した。
基質1Template Strand(A)+プロ-ブ A(T)+プロ-ブB
基質2Template Strand(A)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質3Template Strand(G)+プロ-ブ A(T)+プロ-ブB
基質4Template Strand(G)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質5Template Strand(A), Template Strand(G)+プロ-ブA(T)+プロ-ブB
基質6Template Strand(A), Template Strand(G)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質1〜6の構造を図21に示す。
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン)に、10pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体は10ngをそれぞれ加え、60度で10分反応させた。次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止めた。
以下のように、蛍光種類により励起光、蛍光の波長が異なり、フィルタ-の種類も異なる。
TET 励起波長 510nm
蛍光波長 540nm フィルタ- 520nm
FAM 励起波長 494nm 蛍光波長 525nm フィルタ- 500nm
各基質に対する酵素作用の検出は、上記基質毎に、TET、HEX、FAMの励起波長で生じた蛍光をフィルターを通して、分光蛍光光度計、FP-750(日本分光)により蛍光強度を測定することにより行った。また、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引き。これを各サンプルの値とした。
【0056】
結果を図22、23、24に示す。
本発明の変異体酵素を使用した場合、Template Strand(A)の場合はFAMが検出され、基質1に対し高い活性を示した。Template Strand(G)の場合はTETが検出され、基質4に高い活性を示した。Template Strand(A)と(G)の場合は,FAMとTETが検出され、基質5、6に高い活性を示した。基質1、2は、解析対象遺伝子にSNPがない場合、基質 3、4は、SNPがGでホモの場合、及び基質5、6はSNPがAとGヘテロの場合にそれぞれ比定される。これらの場合において、各々異なる蛍光が検出できたことは、本発明の多型解析手法が、SNPの有無のみならずホモ、ヘテロの判定にも有効であることをします。
これに対して、野生型酵素の場合は、各基質に対して検出されるFAMとTETの蛍光強度の差が明らかでなかった。
【0057】
〔実施例 13〕
以下の実験例は、ゲノムに存在する複数のSNPを多数同時に解析する場合において、(解析手法5)において、検出されたSNPの位置を、切断される5’フラップ鎖の長さ変えずに、その塩基を変えることにより識別できることを検証するものである。
以下のオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。 Frap Strand(C−5)及び(C−6)は、ともに14merで長さは同じにしたが、フラップ部分の塩基は異なる(C−5;CCCAAAAAAAAAAA、C−6;AAAAAAAAAAAAAA)
Template Strand (A); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Upstream
Strand(B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
Flap Strand (C-5)
43mer; 5'-CCCAAAAAAAAAAATCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'(配列番号51)
Flap Strand (C-6) 43mer;
5'-AAAAAAAAAAAAAATCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番号52)
【0058】
以上のオリゴヌクレオチドを実施例4と同様にアニーリングし、以下の基質AとBを形成した。基質AとBの構造は、図25に示される。
基質A Template Strand (A)+ Flap Strand (C-5)+ Upstream Strand(B-2)
基質B Template Strand (A)+ Flap Strand (C-6)+ Upstream Strand(B-2)
次いで、190 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,)に、2.5マイクロモル各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体酵素 1.5マイクロモルをそれぞれ加え、60度で60分反応させた。0.2M EDTAを9.5マイクロリットル加え、最終濃度10mMにし、活性を止めた。各基質から得られた5’切断されたフラップ部を含むサンプル溶液を混合した後、以下のa)〜k)のようにして、ZipTip(Millipore corporation)で精製し、MALDI-TOF/MS分析器により分子量を測定した。この精製及び分子量測定工程以下のa)〜k)に示す。
【0059】
a) ZipTip(Millipore社製C18)をP10ピペットに装着し、50%AcCN中で5回ピペッティング
b) 0.1M TEAA溶液中で5回ピペッティング
c) サンプル(600ul中200ulを採取し乾燥後、20ul滅菌水で溶解したもの)を10回ほどピペッティング
d) 0.1M TEAA溶液を吸い取り、別の容器に排出する(5回実施)
e) 50%アセト二トリルにてDNAサンプルをマイクロチューブで溶出
f) DOWEX-50W-Hydrogen(SIGMA社製)をアンモニアフォームに置換したビーズをパラフィルム上にうすく撒き、その上に溶出したサンプル 7ulをスポット
g) 数回ピペッティングの後、乾燥しないように10分間ほど静置
h) TOF/MS測定用サンプルプレートに、マトリックス(3HPA;東京化成製の飽和水溶液)を1ulスポット
i) ビーズを吸い取らないように注意しながらサンプルを1ul採取し、マトリックスとプレート上で混合(ピペッティング)
j) サンプルプレートを風乾
k) MALDI-TOF/MS分析器において測定
【0060】
結果を図26、27に示す。
MASS の結果は、4868、4911にピ-クが検出された。4868は基質AのFlap鎖が切断されたオリゴヌクレオタイド 分子量4865Daに相当し、4991は基質BのFlap鎖が切断されたオリゴヌクレオチド 分子量4940Daに相当する。
他のピ-クは検出されなかった。フラップエンドヌクレア-ゼの切断点は、ジャンクション部分より1mer 中にはいったところの一ケ所であった。
オリゴヌクレオチドはZipTipで精製された。Flap strand はexonucleaseで分解されて、小さな分子量の所に検出され、サンプルの検出に邪魔にならなかった。Downsteam Strand Bは、検出されなかった。Template Strand AとDownstream Strand Bはまだアニールしており、この構造が酵素と結合し、Downstrean Strand Bが検出されなかったと思われる。
このように、切断されたオリゴヌクレオチドのみ検出できた。このことから、Flap strandの長さを変え、配列を変えることにより一度に多くの種類のSNP解析ができる。
【技術分野】
【0001】
本発明は、野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変化せしめた新規フラップエンドヌクレアーゼ変異体、及び該変異体を利用した遺伝子の多型解析用試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
フラップ(Flap)エンドヌクレアーゼはDNA複製・修復に必須な酵素であり、DNAの構造を特異的に認識しフラップ鎖を切断する。また、この酵素は、5‘exonuclease活性も有している。この酵素は、結晶構造が明らかにされ、基質認識機構に関して変異体を用いて詳しく調べられている。また、耐熱性のフラップエンドヌクレアーゼとして、パイロコッカス由来の耐熱性酵素も知られている。
一方、最近は、このようなフラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を利用して、遺伝子の多型解析に利用されている。
【0003】
遺伝子の多型とは、異なる個体間で、遺伝子上の同一箇所の塩基配列が異なることをいい、その頻度により突然変異と区別されるが、遺伝子の多型が直接疾病原因となっていることもあり、また、近年、最も頻度の高い多型である一塩基多型(SNP)が複雑に関連し、生活習慣病等の遺伝的要因になっているとも考えられ、そのためSNPの位置及びSNPの塩基に関する膨大なデータが集積されつつある。
上記Flapエンドヌクレアーゼを使用するSNP解析としては、インベーダー法が知られている。この方法はターゲット核酸(ゲノム上での一塩基多型を持った領域)に、インベーダープローブとシグナルプローブがアニールすることにより形成される3塩基の重複構造をフラープエンドヌクレア-ゼが認識してフラップ部分を切断するか否かを指標にして、SNPの有無等を解析するものであるが、現在まで知られているフラップエンドヌクレアーゼは、いずれも基質特異性が比較的広いものであるため、SNP以外の、例えば単なるニック(nick)等の遺伝子欠陥も検出してしまうため、信頼性において十分ではないものであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Kaiser,M., Lyamicheva, N., Ma, W., Miller, C., Neri, B., Fors, L., and Lyamichev, V.,(1999) J. Biol. Chem., 274,21387-21394
【非特許文献2】Lyamichev,V., Brow, M.A.D., Varvel, V.E., and Dahlberg, J. E., (1999) Proc. Natl.Acad. Sci., 96, 6143-6148
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変換し、遺伝子の多型解析において、従来法に比べ、より正確であり、検出効率の良い解析手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、以上のような課題を解決すべく、フラップ(Flap)エンドヌクレアーゼの基質結合部位に変異を導入し、基質特異性が変化した、変異体を作製した。
野生体のフラップ(Flap)エンドヌクレアーゼは、2本鎖DNAの一方のDNA鎖が3’末端突出構造を有して切断されている基質、同3’末端突出構造を持たない基質あるいはニック(nick)を有する基質等に作用し、基質特異性が広いのに対して、上記変異体は、2本鎖DNAの一方のDNA鎖が3’末端突出構造を有して切断され、かつ切断されたDNA鎖の相補鎖部分は連なって、他方のDNA鎖に対して欠落部分がない塩基対を形成している基質に作用する。すなわち、本発明の上記変異体は3’末端突出構造を有する基質に作用し、3’末端突出構造を有しない基質は殆ど切断できないという性質を有するが、さらに、3’末端突出構造を有する基質であっても、さらに特定構造のDNA鎖のみに作用する。
このような変異体酵素の基質特異性を利用すれば、遺伝子の多型解析において、多型が存在する場合のみを正確に蛍光検出できる新しい手段を提供できる。
【0007】
すなわち、本発明は以下(1)〜(6)に示すとおりである。
(1)野生型フラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したフラップエンドヌクレアーゼ変異体であって、該野生型エンドヌクレアーゼの基質のうち、2本鎖DNAの一方のDNA鎖が 3’末端突出構造を有して切断され、かつ切断された各DNA鎖は、他方のDNA鎖と相補の塩基配列部分を有し、これら相補の塩基配列部分は連らなって、他方のDNA鎖に対し欠落部分のない塩基対を形成しているDNA基質に作用し、他の基質に対しては作用しないかあるいは活性が低下していることを特徴とする、フラップエンドヌクレアーゼ変異体。
(2)配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列において、(A)33番目のアミノ酸がアラニン又はロイシン、(B)35番目のアミノ酸がチロシン、(C)79番目のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン、(D)33番目と79番目のアミノ酸がともにアラニン、(E)33番目と35番目のアミノ酸がともにアラニン及び(F)278番目及び279番目のアミノ酸がともにアラニンである変異のうちいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体。
(3)上記(2)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードするDNA。
(4)上記(3)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードするDNAを含有する組み換えベクター。
(5)上記(4)に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
(6)上記(1)または(2)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体からなる、遺伝子多型解析用試薬。
【発明の効果】
【0008】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、3’末端が突出している基質、特に第1図に示す、3’突出末端を有するニック及びダブルフラップ基質のみに作用し、これ以外の野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質は殆ど切断できないという新規な性質を有する。このような基質特異性を有する本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を使用することにより、遺伝子の多型解析において、多型が存在する場合のみを正確に検出でき、しかもその検出が簡便に行えるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】フラップエンドヌクレアーゼの基質の構造を模式的に示した図である。
【図2】ダブルフラップ、ニック及び5’レセスエンド基質に対する各フラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図3】シングルフラップ、シュード−Y基質に対する各フラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図4】上記6種の各基質に対する本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性を示すグラフである。
【図5】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の手法を示す模式図である。
【図6】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の他の手法を示す模式図である。
【図7】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合の他の手法を示す模式図である。
【図8】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を遺伝子多型解析に使用するために、必要な基質特異性について試験した結果を示す電気泳動図である。
【図9】実施例5の実験に用いた基質の構造を模式的に示した図である。
【図10】本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体(Y33AF79A,Y33AF35A)の各基質に対する活性を示す電気泳動写真である。
【図11】実施例7において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図12】実施例7において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を示す電気泳動写真である。
【図13】実施例7において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図14】実施例9において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図15】実施例9において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図16】実施例10において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図17】実施例10において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図18】実施例11において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図19】実施例11において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を示す電気泳動写真である。
【図20】本発明の酵素変異体を用いて、解析対象DNAにおけるSNPの有無及びそのホモ、へテロを判定するための手法を示す模式図である。
【図21】実施例12において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図22】実施例12において作成した基質に対する、野生株及び本発明の酵素変異体(F79A、F79H)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図23】実施例12において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体(Y33A、Y33L、F35A)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図24】実施例12において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体(Y33AF79A、F278AF279A、Y33AF35A)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
【図25】実施例13において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
【図26】実施例13において作成した基質に本発明の酵素変異体を作用させ、得られた各切断フラップ部分の質量分析結果を示すグラフである。
【図27】上記質量分析結果に基づく分子量と予想分子量がほぼ同一であることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型フラップエンドヌクレアーゼの基質特異性を変更したものである。野生型フラップエンドヌクレアーゼは、ニック(nick)、3’突出末端を有するニック(Nick with 3'projection)、5’レセス末端(5’Recess-end)、シングルフラップ(Single flap)、ダブルフラップ(Double flap)及びシュード−Y(Pseudo-Y)と呼ばれる基質に作用し、さらに、合流部にギャップ(隙間)を有するダブルフラップ(Double flap with gap at junction;以下、ギャップを有するダブルフラップという。)と呼ばれる構造を有するDNA基質にも作用する。これらのDNA基質の構造は図1に示される。
これらの基質のうち、ギャップを有するダブルフラップ(Double flap with gap at junction)基質は、2本鎖DNAの一方のDNA鎖が切断された3’末端突出構造を有するが、切断された各DNA鎖は、2本鎖DNAの他方のDNA 鎖に対して相補の塩基配列部分をそれぞれ有するが、該相補の塩基配列部分を併せても、他方のDNA鎖に対して欠落する塩基があり、他方のDNAと連続する塩基対が形成されていないものである。
【0011】
すなわち野生型フラップエンドヌクレアーゼは、基質特異性が広く、これら7種の各々構造が異なるDNA基質に作用する。また、フラップエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ作用とエキソヌクレアーゼ作用とを有し、野生型フラップエンドヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ作用により、上記7種のDNA基質のうち、ニック(nick)、3’突出末端を 有するニック(Nick with 3'projection)、及び5’レセス末端(5’Recess-end)基質における下流側ストランド(Downstream)の5’末端側を削除していく。また、エンドヌクレアーゼ作用により、シングルフラップ(Single flap)、ダブルフラップ(Double flap)、シュード−Y(Pseudo-Y)基質、ギャップを有するダブルフラップ基質(Double flap with gap at junction)有するフラップストランド(Flap Strand)の5’末端側フラップを切断するとともに、さらにエキソヌクレアーゼ作用により、切断部位の5’末端側を削除する。
【0012】
これに対して、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、上記野生型エンドヌクレアーゼの基質のうち、3’突出末端を有するニック(Nick with 3'projection)基質とダブルフラップ(Double flap)基質のみに作用する。
すなわち、3’突出末端を有するニック基質においては、下流側ストランド(Down Strand(C-1))の5’末端側塩基は、上流側ストランド(Upstream Strand (B-2))のフラップ基部の塩基の直前まで伸びており、下流側ストランド(Down Strand(C-1))と上流側ストランド(Upstream Strand(B-2)のテンプレートストランドに対する相補鎖部分は、連なって、他方のDNA鎖(Template Strand(A))に対して欠落部分のない塩基対を形成している。ダブルフラップ基質も、同様に他方のDNA鎖(Template Strand(A))に対するフラップストランド(Flap strand (C-3))及び上流側ストランド(Upstream Strand(B-2))の相補配列部分は、連なって、他方のDNA鎖(Template Strand(A))と欠落部分のない塩基対を形成している。
【0013】
しかし、本発明のエンドヌクレアーゼ変異体は、これら以外の上記5種のDNA基質に対しては、作用しないかあるいはその活性は極めて低い。
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の作用形態自体は、野生型と異ならず、3’突出末端を有するニック(Nick with 3'projection)の下流ストランドの5’末端側を削除し、ダブルフラップ(Double flap)のフラップストランド(Flap Strand)のフラップ部分を切断するとともに、さらにエキソヌクレアーゼ作用により、切断部位の5’末端側を削除する。
【0014】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型フラップヌクレアーゼの基質結合部位のアミノ酸を変異させたものである。この変異体酵素を得るには、配列番号2に示す野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1のアミノ酸配列をコードする遺伝子あるいはこれを含むプラスミドを鋳型とし、かつ変異を入れたプライマーを用いて、PCR増幅を行う部位特異的変異作成法により、変異体遺伝子を得て、該変異遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、この組み換えられた発現ベクターを宿主微生物に導入して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養し、培養物から目的のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を得ることができる。
【0015】
本発明においては、この手法により、パイロコツカス、ホリコシ(登録番号JCM9974)の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1の遺伝子(配列表の配列番号1)の変異体遺伝子を得、これを用いて得られた様々な酵素変異体の各基質に対する酵素活性を測定した結果、特定構造の3’突出末端を有するDNA基質のみに実質的に作用する耐熱性のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を見いだしているが、これを具体的に例示すると以下のとおりである。
【0016】
パイロコッカス ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1のアミノ酸配列(配列表の配列番号2)において、
(A)33番目のアミノ酸であるチロシンがアラニン又はロイシンに置換された変異体。
(以下、それぞれY33A、Y33Lと表示する場合がある。) 該変異体酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号4及び6に示される。
(B)35番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがチロシンに置換された変異体。
(以下、F35Yと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号8に示される。
(C)79番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン又はヒスチジンに置換された変異体。(以下、それぞれF79A、F79Hと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号10、12に示される。
(D) 33番目のアミノ酸であるチロシンおよび79番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換された変異体(以下、Y33AF79Aと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号14に示される。
(E)33番目のアミノ酸であるチロシンおよび35番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換さ れた変異体(以下、Y33AF35Aと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号54に示される。
(F)278 番目のアミノ酸であるフェニルアラニンおよび279番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがともにアラニンに置換された変異体。
(以下、F278AF279Aと表示する場合がある。)該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号16に示される。
【0017】
上記Y33A、Y33L、F35Y、F79A、F79H、Y33AF79、Y33AF35A、F278AF279Aの各遺伝子は、これら変異体ペプチドをコードするものであれば、特に制約はないが、これら遺伝子の塩基配列を例示すると、それぞれ順に配列表の配列番号3、5、7、9、11、13、53、15に示す配列が挙げられる。
以下の表1に、フラップエンドヌクレアーゼ −1(野生型)ファミリーのアミノ酸配列をアライメントして示す。
【0018】
【表1】
表中の符号は以下のとおりである
phFEN- 1;Pyrococcus horikoshiiのフラップエンドヌクレアーゼ−1(FEN-1)
mjFEN- 1;Methanococcus jannaschiiのFEN-1
spRAD2;Schizosaccharomyces pombのRAD2
hFEN-1;ヒトの FEN-1
T5 EXO;T5 エキソヌクレアーゼ
T7 EXO;T7gene6エキソヌクレアーゼ
E.coli pol.1;E.coliポリメラーゼ1における5’エキソヌクレアーゼドメイン
Tag.pol.1;Thermus aguaticusポリメラーゼ1における5’エキソヌクレアーゼドメイン
【0019】
これによれば、パイロコッカス ホリコシ由来のフラップエンドヌクレアーゼ−1の基質結合ドメインにおける、変異の対象とした部位のアミノ酸はほぼ共通しており、特に、フラップエンドヌクレアーゼ−1(FEN−1)については、ヒトを含めて全く共通している。
このことは、上記パイロコッカス ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1について施した変異を、他の生物由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1にも施せば、同様な基質特異性変化が起こることを強く示唆する。
【0020】
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の有する、3’突出末端を有するDNA基質のみに実質的に作用するという基質特異性は、簡便、正確でかつ全く新しい、遺伝子の多型解析手法を提供する。
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を遺伝子多型解析用試薬として用いた場合における、遺伝子多型解析手法について以下に説明する。
【0021】
解析手法1
以下に図5のSNP解析を例にとり、説明する。
なお、図5中、FAM、TAMRAはそれぞれ蛍光色素を示し、2本線上側の−A−はSNPがなく正常の場合の塩基、−G−、−C−、−T−は、多型の場合の塩基を示す。
(a)SNP部位を含む試料DNAと相補の塩基配列を有し、その5’末端がSNP部位と対応する位置まで伸長し、かつ該5末端が、検体試料DNAにSNPがない場合の塩基(A)と塩基対を形成する塩基(T)となるようオリゴヌクレオチドを合成してプローブAとする。また、SNP部位を含む試料DNAと相補の塩基配列を有し、その3’末端がSNP部位と対応する位置まで伸長し、かつ該3’末端が、試料DNAにSNPがない場合の塩基(A)及び該塩基と塩基対を形成する塩基(T)以外の塩基(C、G)となるようにオリゴヌクレオチドを合成してプローブBとし、プローブAの5’末端およびプローブBの3’末端を、近接するとFRET効果を生じて、蛍光が発生しないかあるいは少なくとも発光強度が低下する色素でそれぞれ標識する。
FRET効果を生じる蛍光色素の組み合わせとしては、TAMRAとFAM、BHQ−1とTET、HEX、FAM等がある。例えば、プローブAの5’末端の標識にFANを用いた場合、プローブBの3’末端の標識はTAMRAを用いればよい。
(b)次いで試料DNAに上記プローブA及びプローブBをアニールさせる。このアニールした場合の2本鎖DNAの構造は、SNPがある場合とない場合とでは異なる。
【0022】
〔SNPがある場合〕
3’末端をCとしたプローブBを使用したとき、試料DNAのSNP部位に多型がある場合、すなわち試料DNAのSNP部位の塩基はG、CまたはTのいずれかである。
1)このうちGの場合には、プローブBの3’末端の塩基(C)と相補の関係にあり塩基対を形成するので、3’末端突出構造を形成しない(図5(1)中(A))。
2)Cの場合には、プローブAの5’末端の塩基(T)及びプローブBの3’末端の塩基(C)は、試料DNAのSNP部位の塩基(G)といずれも塩基対を形成せず、プローブAの5’末端の塩基(T)及びプローブBの3’末端の塩基(C)はいずれも突出構造をとり、プローブAとプローブBとにおける、試料DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料DNAに対して連続した塩基対を形成せず、ギャップを生じる(図5(1)中(B)) 。
3)Tの場合は、上記2)と同様に、プローブAの5’末端の塩基(T)及びプローブBの3’末端の塩基(C)は、試料DNAのSNP部位の塩基(T)といずれも塩基対を形成せず、プローブAの5’末端の塩基(T)及びプローブBの3’末端の塩基(C)はいずれも突出構造をとり、プローブAとプローブBとにおける、試料DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料DNAに対して連続した塩基対を形成しない(図5(1)中(B’)。
一方、3’末端塩基を(G)としたプローブBを使用したときも、同様で、試料DNAのSNP部位に多型がある場合には必ず、図5(1)の(A)、(B)または(B’)のいずれかの構造となる。
【0023】
〔SNPがない場合〕
これに対して、試料DNAのSNP部位に多型がない場合、すなわち試料DNAのSNP部位の塩基が(A)である場合は、プローブAの5’末端はTであるから塩基対を形成するとともに、プローブBの3’末端は(C)または(G)であるから、試料DNAのSNP部位の塩基(A)とは塩基対を形成せず、突出末端となる。すなわち、このときの構造は図1に示される3’突出末端を有するニック構造となり、プローブAの5’末端と、プローブBのフラップ部分を除く試料DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料DNAとともに欠落部分のない連続した塩基対を形成する(図5(1)(C))。
【0024】
(c)次いで、上記プローブAとBが試料DNAとアニールした状態で、本発明の遺伝子多型解析用試薬である、フラップエンドヌクレアーゼ変異体を作用させる。
試料DNAにSNPがある場合には、該フラップ エンドヌクレアーゼ変異体は、上記図5(1)の(A)、(B)、(B’)に示される構造のDNA基質にはいずれも作用しないので、プローブAの蛍光色素TAMRAとプローブBの蛍光色素FAMとは近接位置にあり、FRET効果により、蛍光は発生しない。
これに対して、SNPがない場合には、3’突出末端を有するニック構造となるから、フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、該構造を基質として認識し、プローブAの5末端が切断され、蛍光色素TAMRAが上記FAMとの近接位置から外れることにより蛍光を生じる。
したがって、蛍光の有無を検出することによりSNPの有無を判定できる。
【0025】
解析手法2
解析手法2は、図5(2)に示される。
なお、この手法は、プローブAの3’末端及び5’末端をそれぞれ近接によりFRET効果を生じる蛍光色素(例えば、TAMRAとFAM等の組み合わせ)により標識し、また、プローブBには蛍光標識しない他は、解析手法1と同様である。なお、この場合においてはプローブAの分子長は、その両端の蛍光色素が近接して、FRET効果により蛍光強度が低下するように、設計する(例えば、20mer以下)。
SNPがある場合においては、解析手法1と同様に、プローブBは3’末端突出構造を形成しないか(図5(2)(A))、あるいはプローブAとプローブBとにおける、試料DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料DNAに対して連続した塩基対を形成せず、ギャップを生じるので(図5(2)中(B)、(B’))、試料DNAにSNPがある場合には、使用したフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、いずれも作用しないので、FRET効果により、蛍光は強度は低いものとなる。それに対して、SNPがない場合には、3’突出末端を有するニック構造となるから、フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、該構造を基質として認識し、プローブAの5末端が切断され(図5(2)(C))、蛍光色
素TAMRAが上記FAMとの近接位置から外れることにより蛍光強度が増大し、蛍光強度を観察することにより、SNPの有無を判定できる。
この蛍 光標識手法によれば、プローブAの両端にそれぞれ異なる蛍光標識を行い、プローブBの3’末端に蛍光標識しないので、遺伝子多型解析においてプローブが解析対象遺伝子との間で、3’突出末端を有するニックあるいはダブルフラップを形成した場合、酵素活性が低下せずフラップストランドを切断できるので、感度よく解析することが可能となる。
遺伝子多型解析においてプローブが解析対象遺伝子との間で3’突出末端を形成した場合、酵素活性が低下せず、感度よく解析することが可能となる。
【0026】
解析手法3
図5中(3)で示される方法はSNPの塩基を決定する方法である。
この方法は、プローブAの5’末端をそれぞれ、例えばC、G、Aとした3種類のプローブA を用いるもので、該5’末端を標識する蛍光色素を各々異ならせるとともに、該蛍光色素として、プローブBの3末端を標識した蛍光色素とFRET効果により消光する色素を用いる。 しかし、その他の手法は上記解析手法1と同様である。
このような3種類のプロープAを用いた場合、その5’末端の塩基が、試料DNAのSNPの塩基と相補の場合のみ、3’突出末端を有するニック構造となるから、本発明のフラップエンドヌクレアーゼを作用させた場合に5’末端は切断され、蛍光を発生する。蛍光波長の種類から、どのプローブA由来のものかが分かり、その5’末端塩基からSNPの塩基の種類を特定できる。
【0027】
解析手法4
図6の方法は、SNPの塩基がすでに明らかとなっている場合に、簡便に検出する方法である。例えば、SNPの塩基が(A)であり、SNPのない場合の塩基が(G)である場合には、プロ-ブAの5’末端を(A)の相補塩基の(T)とするとともに、その3’末端と5’末端を、例えばTAMRAとFAMで標識する。このプローブAの長さは、上記解析手法1と同様に20mer以下にすることが好ましい。また、プローブの3’末端塩基はSNPのない場合の塩基 (G)と相補の塩基(C)にする。
試料DNAにSNPがある場合には、試料DNAとプローブA及びBをアニールさせたとき、3’末端突出ニック構造を形成するから、本発明のフラップエンドヌクレアーゼを作用させると、プローブAの5’末端が切断され、5’末端に標識された蛍光色素(FAM)が蛍光を発生する。一方、SNPがない場合はプローブBの3末端の塩基(C)は試料DNAのSNPのないときの塩基(G)と塩基対を形成し、3’末端突出構造を有しない(5’シングルフラップ構造)ので切断できない。したがって、プローブAの両末端に標識された上記蛍光色素は、FRET効果により消光されている。
したがって、SNPの塩基がすでに明らかであれば、上記のように各プローブを構成すれば、一回の試験で、簡便にSNPを解析できる。
【0028】
解析手法5
図7に示す方法は、ゲノムに存在するSNPを多数同時に解析する方法である。
例えば、ゲノム上のA, B, Cの位置にSNPが存在する場合、図7Bに示したように、プローブA、Bを作成する。プローブAにはSNPのGに相補するCを接合部に入れる。プロ-ブB の3’末端は、SNP無しの場合の塩基(T)と相補する塩基(A)にする。これらプローブを試料のゲノムDNAとアニールさせた場合、SNPが有る場合は、ダブルフラップ(double flap)構造ができ、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体により、接合部より1塩基中に入った所、1箇所で切断される。一方、SNPが無い場合は、シングルフラップ(singleflap)構造ができ、切断されない。
この解析手法に用いるプローブAは、検出する SNPの部位毎に、5’末端フラップの長さが変わるよう合成し、その5’末端にはビオチンを結合させる。例えば、図7に示される様に、SNPの部位、A、B、C毎に順に5’突出末端の長さを2-3塩基ずつ長くなるようにする。このことにより、本発明のエンドヌクレアーゼ変異体による、5’末端フラップの切断により、長さの異なったDNAフラグメントが得られる。5’末端にビオチンがついているため、アビジンカラムで精製することができ、精製されたDNAフラグメントの分子量は質量分析機(MS)により検出される。SNPの箇所により、得られるDNAフラグメントの長さが異なるために、検出される分子量により、SNPの箇所が特定できる。MALDI-TOFMSを使用すれば、384検体を解析でき、1検体で、10箇所以上のSNPを同時に解析できる。
【0029】
上記手法においては、DNAフラグメントの精製 のためプローブAの5’末端にビオチンを結合させるが、ZipTip等のDNA精製手段を用いれば、ビオチンを用いることなく、DNAフラグメントを精製でき、以後、上記と同様にして該フラグメントの分子量を測定できる。
また、DNAを構成する塩基はその分子量がそれぞれ異なるため、5’末端フラップが同じ長さであっても、該フラップを構成する塩基の組み合わせを変えることにより、フラップ鎖の分子量を変えることができ、切断されたDNAフラグメントの分子量を測定することにより、切断されたフラップを特定できる。すなわち、図7Cに示されるように、例えば、5’フラップ鎖の長さを同じ14merにしても、その構成塩基の差異により、一方のフラグメントの分子量は4865であり、他方は4940とすることが可能であり、両者は識別可能である。したがって、5’フラップ鎖の構成塩基をデザインし、切断DNAフラグメントの分子量を測定することにより、切断されたフラップの特定を行い、これに対応するSNPの位置が明らかになる。
さらに、フラップ鎖が長くなると、フラップエンドヌクレアーゼ変異体により切断しにくくなるが、塩基の組み合わせと塩基の長さを変えることにより、フラップエンドヌクレアーゼ変異体の作用の良好なフラップ鎖長さの範囲内において、極めて多種の分子量の異なったフラップ鎖を作成することが可能になる。
【0030】
解析手法6
遺伝子多型においては、ゲノム遺伝子と対立遺伝 子の間でSNPが同じ場合(ホモ)と異なる場合がある(ヘテロ)、本発明によれば、SNP塩基がすでに明らかな場合において、解析対象遺伝子試料のSNPの有無に加えて、該SNPがホモなのかあるいはヘテロなのかも簡単に見分けることができる。
この手法を図20に基づき以下に説明する。例えば、SNPがなく正常な塩基がAで、SNPがGである場合、5’末端の塩基をTとしたプローブA(T)と、CとしたプローブA(C)とをそれぞれ合成し、その両末端を異なる蛍光色素で標識する。このとき5’末端の蛍光色素を、例えば、プローブA(T)においてはFAMとし、プローブA(C)ではTETとするように各々異なるようにする。
この後、解析対象のDNAに対し、プローブA(T)およびプローブA(C)とプローブBとをアニーリングし、本発明の酵素変異体を作用させると、SNPがない場合(Aの場合)には、プローブA(T)のみが3’突出Nick構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、蛍光色素FAMに由来する蛍光が検出される。
SNPがホモ(ともにG)の場合、プローブA(C)のみが、3’突出Nick構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、蛍光色素TETに由来する蛍光が検出される。
一方、ヘテロの場合(AとG)には、プローブ A(T)とプローブA(C)は、ともに3’突出nick構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、TETとFAM由来の波長の異なる2つの蛍光が検出される。
なお、これ以外は、ギャップを有するダブルフラップ構造かあるいは3’突出構造を有しないシングルフラップ構造を形成するため。本発明の酵素により切断されない。
したがって、5’末端塩基が異なる2種のプローブAを使用し、本発明の酵素変異体を作用させて発生する蛍光波長を検出することによりSNPの有無及びホモ、ヘテロの判定を同時に行うことができる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【0031】
〔実施例1〕
変異体の作製
変異体Y33Aの遺伝子の作成は、以下のように行った。
以下に示す、共通プライマー及び変異の入ったプライマー(Y33A作成用プライマー)を合成し、パイロコッカス・ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ−1(FEN-1)の遺伝子(配列番号1)を含むPET11aプラスミドを鋳型として、初めに、制限酵素サイト(Nde1)の入ったFEN-Uプライマーと変異の入ったY33A-Rプライマー、それと制限酵素サイト(Xho1)の入ったFEN-Rプライマーと変異の入ったY33A-UでPCR(96度で5分加熱後に、DNA polymeraseを入れた。その後に96度1分、55度2分、70度2分の1サイクルを25回行った。)を行い、変異の入った、2つの断片を作成し、次に、これらの断片を鋳型にし、FEN-UプライマーとFEN-RプライマーでPCR(上記と同様の条件)を行い、変異を導入し、同時に遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。
フラップエンドヌクレアーゼ変異体Y33Aの構造遺伝子の塩基配列は、配列番号3に示す。
他のフラップエンドヌクレアーゼ変異体Y33L、F35Y、F79A、 F79H、Y33AF79A、F278AF279A及びY33AF35Aの各遺伝子も上記と同様に作成した。これら構造遺伝子の塩基配列は、それぞれ順に 配列表の配列番号5、7、9、11、13、15、53に示される。
【0032】
共通に使用するプライマー;
FEN-U
5’-GGGAATTCCTGCAGATCGCATATGGGTGTTCCTATCGGTGAC-3’(配列 番号17)
FEN-R
5’-ACGCGTCGACGTCCGCTCGAGCGGTTAGGGTTTCTTTTTAACGAACCAAC-
3’(配列番号18)
Y33A作成用プライマー;
Y33A-U
5’-ATAGATGCCCTAAACGCCATCGCGCAGTTTTTATCAACGATACGACAG-
3’(配列番号19)
Y33A-R
5’-CTGTCGTATCGTTGATAAAAACTGCGCGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-
3’(配列番号20)
Y33L作成用プライマー;
Y33L-U
5’-ATAGATGCCCTAAACGCCATCCTGCAGTTTTTATCAACGATACGACAG-
3’(配列番号21)
Y33L-R
5’-
CTGTCGTATCGTTGATAAAAACTGCAGGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-3’(配列番号22)
F35Y作成用プライマー;
F35Y-U
5’-GCCCTAAACGCCATCTATCAGTATTTATCAACGATACGACAGCGTGAT-
3’(配列番号23)
F35Y-R
5’-ATCACGCTGTCGTATCGTTGATAAATACTGATAGATGGCGTTTAGGGC-
3’(配列番号24)
F79A作成用プライマー;
F79A-U
5’-GGTATTAAGCCGGCCTACGTCGCGGATGGAAAGCCTCCGGAATTTAAA-
3’(配列番号25)
F79A-R
5’-TTTAAATTCCGGAGGCTTTCCATCCGCGACGTAGGCCGGCTTAATACC-
3’(配列番号26)
F79H作成用プライマー;
F79H-U
5’-
GGTATTAAGCCGGCCTACGTCCATGATGGAAAGCCTCCGGAATTTAAA-3’(配列番号27)
F79H-R
5’-
TTTAAATTCCGGAGGCTTTCCATCATGGACGTAGGCCGGCTTAATACC-3’(配列番号28)
F278AF279A作成用プライマー;
F278AF279A-U
5’-CTTTACGCTATTAAGGAAGCGGCGCTTAACCCTCCTGTCACTAATGAA-
3’(配列番号29)
F278AF279A-R
5’-TTCATTAGTGACAGGAGGGTTAAGCGCCGCTTCCTTAATAGCGTAAAG-
3’(配列番号30)
Y33AF35A作成用プライマー;
Y33AF35A-U
5'-ATAGATGCCCTAAACGCCATCGCGCAGGCGTTATCAACGATAAGACAGAGG-3'(配列番号39)
Y33AF35A-R
5'-CCTCTGTCTTATCGTTGATAACGCCTGCGCGATGGCGTTTAGGGCATCTAT-3'(配列番号40)
また、Y33AF79A遺伝子については、上記Y33Aの遺伝子(配列番号3)を含有するプラスミドを精製し、これを鋳型にしてF79Aのプライマー(配列番号25,26)を用いて作成した(配列番号13)。
【0033】
次いで、PETlla(Novagen社製)を制限酵素NdeIとXhoIで切断・精製した後、上記の 各変異遺伝子とT4リガーゼで16℃、2時間反応させ連結した。連結したDNAの一部をE.coli−XLl−BlueMRFのコンピトセルに導入し各形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドをアルカリ法で精製し各発現プラスミドを得た。
【0034】
〔実施例2〕
組換え遺伝子の発現
大腸菌(E.coliBL21(DE3),Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、二本のフアルコンチューブに各々0.1mlづつ移し、その中に上記の各発現プラスミド溶液0.005mlを別々に加え氷中に30分間放置した後42度でヒートショックを30秒間行い、SOCmedium0.9mlを加え、37度で1時間振とう培養したる。
その後アンピシリンを含む2YT寒天プレートに適量まき、37度で一晩培養し、各形質転換体を得た。
当該各形質転換体をアンピシリンを含む2YT培 地(2リットル)で660nmの吸収が0.4 に達するまで37℃で培養した後、IPTG(Isopropy-b-D-thiogalactopyranoside)を1mMになるように加え、30℃で4時間培養した。培養後遠心分離(6,000rpm,20min)で集菌した。
【0035】
〔実施例3〕
変異酵素の精製
それぞれ集菌した菌体を−20度で凍結融解し、菌体の2倍の50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を加え懸濁液を得た。得られた各懸濁液について85度で30分加熱後遠心分離(11,000rpm,20min)し、HiTrapSP(フアルマシア社製)カラムに吸着させ、NaCl濃度勾配による溶出を行い活性 画分を得、Y33A、Y33L、F35Y、F79A、F79H、F278AF279A、Y33AF35A、及びY33AF79Aの精製酵素溶液とした。
【0036】
〔実施例4〕
酵素反応条件
(1)合成オリゴヌクレオチド
以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。なお、全てのオリゴヌクレオチドは北海道システムサイエンス社により合成された。
Template Strand(A);54-mer,
5’- GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Downstream Strand(C-1);28mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号35)
Upstream Strand(B-1);26-mer, 5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';(配列番号32)
Upstream Strand(B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
Flap Strand(C-2);32mer, 5'-
TAACTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'
(配列番号36)
Flap Strand(C-3);57-mer,5'-GCATCTGACGGATGTCAAGCAGTCCTAACTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC- 3'(配列番号37)
このうちDownstream Strand(C-1), Flap
Strand(C-2), Flap Strand(C-3)のオリゴヌクレオタイドは5’末端が蛍光ラベル(FAM)された。
【0037】
(2)基質の調整
上記オリゴヌクレオチドを〔(A)+(C-1)+(B-1)、(A)+(C-1)+(B-2)、(A)+(C-1)、(A)+(C-2)+(B- 1)、(A)+(C-3)+(B-2)及び(A)+(C-2)〕のように組み合わせて、それぞれ150mMNaClを含む、20mMトリス塩酸緩衝液(ph7.4)の中で煮沸し、溶液の温度を徐々に4度までさげることのよりアニーリングさせ、各々の基質を作製した。基質の名称と構造を図1に示す。
【0038】
(3)flap エンドヌクレアーゼ活性
10マイクロリットルの50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mM MgC12、100mg/ml,牛血清アルブミン)に2pmolesの蛍光ラベル(FAM)された各基質に酵素変異体Y33A,Y33L,F35Y,F79A,F79L,F79H,F278AF279Aをそれぞれ加え、60度で1分から10分まで反応させ、1分間隔で活性を測定した。次ぎに、10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA,1mg/mlキシレンシアノールを加え酵素反応を停止させた。これを100℃加温、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacryylamide gel電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad社製)でオートラジオグラフイー化し、反応物の分子種と量を測定した。Kinetics解析を行ない、KmとKcatを算出した。
(4)変異体の基質特異性
上記各変異体の基質特異性の変化を他の変異体及び野生型酵素(WT)とともに図2、3、4に示す。変異体Y33A,Y33L,F35Y,F79A,F79L,F79H,F278AF279A は、Nick,Recess-end,Sing1e flap,Pseudo-Y基質に対して、活性が著しく減少した。しかし、Double
flap,Nick with3’Projection基質に対しては、WTと比べて活性は殆ど変化がなかった。
5’末端の蛍光ラベルの基質は、野生型フラップエンドヌクレアーゼおよび該変異体のいずれもが切断した。
【0039】
〔実施例5〕
以下の各オリゴヌクレオチドを合成した。このうちりC−1及びC−4の5’末端は蛍光ラベル(FAM)されている。次いでこれらオリゴヌクレオチドを、実施例4と同様にアニーリングし図9に示す構造の基質を作成した。
Template Strand (A); 54-mer,
5’-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-3
(配列番号31)
Upstream Strand (B-3),
26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’(配列番号34)
Downstream Strand(C-1);28mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号35)
Downstream Strand (C-4);
29mer, 5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3’(配列番号38)
なお、基質の構造は、5’が1mer突出のsingle flap 構造(図9A)、nick領域に1 mer gapの入ったdouble flap 構造(図9B)、及びnick with 3’projection 構造(図9C)の3種である。
【0040】
ついで、10 マイクロリットルの50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,
100mg/ml 牛血清アルブミン)に、2pmolesの蛍光ラベル(FAM)された各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体F79A, Y33A, F278AF279Aを0.1ngと1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide gel 電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。
結果を図8に示す。これによれば、基質Cに対しては、野生型酵素及び本発明の変異体酵素はともに活性を示すが、基質A、Bに対しては野生型酵素が活性を示すのに対し、本発明の変異体酵素は、いずれも活性を示さない。この様な基質特異性は本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体が、上記多型解析手法に用いる試薬として、十分な性能を有することを示す。
【0041】
〔実施例6〕
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2, 100mg/ml 牛血清アルブミン)に、実施例4、5において作製された、2pmolesの蛍光ラベル(FAM)された合計7種の基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生型0.1ngと1ng, 変異体Y33AF35A, Y33AF79A 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide gel 電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。結果を図10に示す。
これによれば、野生型酵素は、上記7種の総ての基質に対して、活性を示すが、変異体Y33AF35A, Y33AF79Aは、3'が突出しているF(Nick with3’Projection構造)とG(Double flap構造)のみ活性を示す。しかし、3'が突出 しているが、1mer gapがあるC(ギャップを有するダブルフラップ構造)に対しては活性を示さない。
【0042】
〔実施例7〕
以下の各オリゴヌクレオチドを合成した。
Template Strand (A); 54mer,
5'-
GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-3’(配列番号31)
Upstream
Strand(B-1);26-mer,
5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';(配列番号32)
Upstream
Strand(B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
Upstream
Strand (B-3), 26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’(配列番号34)
Downstream
Strand(C-1-1);20mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号41)
Flap Strand
(C-4-1); 20mer, 5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGAC-3'(配列番号42)
このうちC-4-1、C-1-1については、5'末端にFAM,3'末端にTAMRAをラベルし、実施例4と同様にアニーリングし図11に示す構造の基質を作成した。
【0043】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml 牛血清アルブミン)に、1pmolesの蛍光ラベルされた上記基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide gel 電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad 社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。
結果を図12に示す。これによれば、野生型酵素は、図中(A)〜(C)の総ての基質に対して、活性を示すが、変異体酵素は、3'末端が突出している(C)のみ活性を示す。3'が突出しているが、1mer gapがある(B)、及び(A)に対しては活性を示さないか、又は非常に弱い活性を示す。
【0044】
〔実施例 8〕
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml 牛血清アルブミン)に、実施例7で作成した、10pmolesの蛍光ラベルされた基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生型と変異体 10ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止める。励起光494nm, 蛍光520nmで、フィルタ-500nmを使用して、分光蛍光光度計、FP-750(日本分光)で蛍光強度を測定した。
結果を図13に示す。なお、図13の各棒グラフの値は、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引いた値である。
この結果によれば、野生型酵素は、上記A〜Cの総ての基質に対して、活性を示すが、変異体酵素は3'末端が突出している基質Cのみ活性を示す。又3'末端が突出しているが、1mer gapがある基質Bに対しては活性を示さない。
【0045】
〔実施例9〕
以下のオリゴヌクレオチドを合成し、
Template Strand (A); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Upstream Strand(B-1);26-mer, 5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG-3';(配列番号32)
Upstream Strand(B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
Upstream Strand (B-3),
26-mer, 5’-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3’(配列番号34)
Downstream Strand(C-1);28mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号35)
Flap Strand(C-4); 29mer,
5’-CTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3’(配列番号38)
B-1、B-2、B-3の3'末端をTAMRAでラベルし、C-1、C-4の5'末端はFAMでラベルした。次に、これらオリゴヌクレオチドを実施例4と同様にアニーリングし図14に示す構造の基質を作成した。
【0046】
10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml 牛血清アルブミン)に、10pmolesの蛍光ラベルされた上記各基質をそれぞれ加え、さらに各基質毎に酵素の野生体50ngと変異体を400ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。 次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止める。励起光494nm,蛍光520nmで、フィルタ-500nmを使用して、分光蛍光光度計、FP-750(日本分光)で蛍光強度を測定する。酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引く。これを各サンプルの値とする。
結果を図15に示す。
upstream Strand B-1, B-2, B-3 の3’末端にTAMRAが結合していると、野生型酵素、変異体酵素共に、3’末端に蛍光ラベルがないものに比べ活性が低くなる。しかし、酵素量を増加する (50ng)と、活性が検出された。野生型酵素は、基質A, B, C に高い活性を示したが、変異体酵素は、基質Aのみ高い活性を示した。したがって、このような蛍光標識手法によっても、多型解析が可能である。
【0047】
〔実施例10〕
多型解析の解析対象遺伝子のモデルとして、以下3種のオリゴヌクレオチドを合成した。
これらのオリゴヌクレオチドは下線部の塩基がそれぞれ異なり、この位置にSNPがあると想定している。
Template Strand (G); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号43)
Template Strand
(C); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGCCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号44)
Template Strand (T); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGTCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号45)
【0048】
一方、プローブAとして以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは下線部の塩基がそれぞれ異なり、また各々標識する蛍光色素が異なる。
プロ-ブA(C); 28mer 5'-CCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'
(配列番号46)
5末端に蛍光(TET)がラベルされている。
プロ-ブA(G); 28mer 5'-GCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番号47)
5末端に蛍光(HEX)がラベルされている。
プロ-ブA(A); 28mer 5'-ACTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番号48)
5末端に蛍光(FAM)がラベルされている。
また、プローブBとして以下のDNAを合成し、その3'末端にクエンチャ-(BHQ-1)をラベルした。
プロ- ブB(upstrem strand b-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
以上のオリゴヌクレオチドを実施例4の方法と同様にアニーリングし、以下の基質1〜9を作成した。
このアニーリングにより形成される各基質の構造は図16の(1)〜(9)に示される。
【0049】
基質1 Template Strand (G)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質2 Template Strand (G)+プロ-ブA(G)+プロ-ブB
基質3 Template Strand (G)+プロ-ブA(A)+プロ-ブB
基質4 Template Strand (C)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質5 Template Strand (C)+プロ-ブA(G)+プロ-ブB
基質6 Template Strand (C)+プロ-ブA(A)+プロ-ブB
基質7 Template Strand (T)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質8 Template Strand (T)+プロ-ブA(G)+プロ-ブB
基質9 Template Strand (T)+プロ-ブA(A)+プロ-ブB
【0050】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン)に、40pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体170ngと変異体 400ngをそれぞれ加え、60度で10分反応させた。次に、50mMトリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止めた。蛍光種類により励起光、蛍光の波長が異なる。また、フィルタ-の種類も異なる。
TET 励起波長 510nm
蛍光波長 540nm フィルタ- 520nm
HEX 励起波長 520nm
蛍光波長 550nm フィルタ- 540nm
FAM 励起波長 494nm 蛍光波長 525nm フィルタ- 500nm
各基質に対する酵素作用の検出は、上記基質毎に、TET、HEX、FAMの励起波長で生じた蛍光をフィルターを通して、分光蛍光光度計、FP-750(日本分光)により蛍光強度を測定した。また、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引き。これを各サンプルの値とした。
【0051】
結果を図17に示す。
これによると、野生型は全ての基質に対して活性を示したが、本発明の全ての酵素変異体は、基質1、5、9に対して高い活性を示した。このことは、各Template Strand に対しては、それぞれプロ-ブA(C)、プローブA(A)及びプローブA(G)のみが塩基対を形成し、3’突出のNickを形成したことを意味する(図16)。 したがって例えば、プローブA(C)に由来するTETの蛍光が検出された場合には、Template StrandのSNP部位として想定した部位の塩基がGであることが分かり、本発明の酵素変異体を使用して生ずる蛍光の種類によりSNPの塩基を特定することができる。
【0052】
〔実施例11〕
以下の実験例は、SNPの塩基がすでに明らかになっている場合において、解析対象の遺伝子に当該SNPがある化否か判定するために、本発明の酵素変異体を使用した例である。
多型解析の解析対象遺伝子のモデルとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
これらの塩基配列中、下線部のGは正常な塩基であり、AはSNPであると想定している。
Template Strand (A); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Template Strand (G); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号43)
一方、プローブAとして、SNPに対応する5’末端がTである以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成し、該オリゴヌクレオチドの5’末端にFAM, 3’末端にTAMRAをそれぞれラベルした。
プロ-ブA(T); 20mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号49)
また、プローブBとして以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
プロ-ブ B ;27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号
33)
以上の オリゴヌクレオチドを実施例4の方法と同様にアニーリングした。これにより、図18に示される2種の構造の基質が形成される(ただし、蛍光色素は図示せず。)
【0053】
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン)に、1pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体は 1ngをそれぞれ加え、60度で5分反応させた。次ぎに10マイクロリットルの95%ホルムアミド、20mM EDTA, 1mg/mlキシレンシアノ-ルを加え酵素反応を停止させた。これを、100度加熱、氷中急冷後、7M尿素を含む15%polyacrylamide
gel電気泳動(PAGE)で分析した。この電気泳動パターンをphosphoImager(Bio-Rad
社製)でオ-トラジオグラフイ-化した。
結果を図19に示す。
これによれば、野生型酵素は、基質A、Bに対して、活性を示すが、本発明の変異体酵素は、いずれも基質Aのみに活性を示し、基質Bに対して、活性を示さないか叉は極めて弱い活性を示す。すなわち、SNPの塩基が明らかである場合においては、この塩基と塩基対を形成する塩基を5’末端に 有するプローブAを使用すれば、3’突 出のNickを形成し、本発明の酵素変異体により、プローブAの5’末端側は切断され、該末端に結合したFAN由来の蛍光を生ずる。これに対して、SNPがない場合にはプローブAは切断されず、蛍光を発生しない。したがって、蛍光の有無によりSNPの有無を判定できる(図6参照)。
【0054】
〔実施例12〕
以下の実験例は、SNPの塩基がすでに明らかになっている場合において、解析対象の遺伝子のSNPの有無及び該SNPがホモかヘテロかを判定するために、本発明
の酵素変異体を使用した例である。
解析対象遺伝子のモデルとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。なお、下線部の塩基はAが正常で、GがSNPである。
Template Strand (A); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Template Strand (G); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGGCGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号43)
プローブAとして以下のオリゴヌクレオチドを合成、プローブA(T)の5’末端に FAM,3’末端にBHQ-1を標識し、また、プローブA(C)の5’末端にTET、3’末端にBHQ-1を標識 した。
プロ-ブA(T); 20mer,5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-
3'(配列番号49)
プロ-ブA(C); 20mer ,5'-CCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号50)
プロ-ブ B(upstream strand B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
【0055】
以上のオリゴヌクレオチドを実施例4の方法と同様にアニーリングし、以下の基質1〜6を作成した。
基質1Template Strand(A)+プロ-ブ A(T)+プロ-ブB
基質2Template Strand(A)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質3Template Strand(G)+プロ-ブ A(T)+プロ-ブB
基質4Template Strand(G)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質5Template Strand(A), Template Strand(G)+プロ-ブA(T)+プロ-ブB
基質6Template Strand(A), Template Strand(G)+プロ-ブA(C)+プロ-ブB
基質1〜6の構造を図21に示す。
次いで、10 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,100mg/ml
牛血清アルブミン)に、10pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体は10ngをそれぞれ加え、60度で10分反応させた。次に、50mM トリス塩酸緩衝液pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで反応を止めた。
以下のように、蛍光種類により励起光、蛍光の波長が異なり、フィルタ-の種類も異なる。
TET 励起波長 510nm
蛍光波長 540nm フィルタ- 520nm
FAM 励起波長 494nm 蛍光波長 525nm フィルタ- 500nm
各基質に対する酵素作用の検出は、上記基質毎に、TET、HEX、FAMの励起波長で生じた蛍光をフィルターを通して、分光蛍光光度計、FP-750(日本分光)により蛍光強度を測定することにより行った。また、酵素を入れないサンプルをコントロ-ルとし、酵素を入れたサンプルから、コントロ-ルの値を差し引き。これを各サンプルの値とした。
【0056】
結果を図22、23、24に示す。
本発明の変異体酵素を使用した場合、Template Strand(A)の場合はFAMが検出され、基質1に対し高い活性を示した。Template Strand(G)の場合はTETが検出され、基質4に高い活性を示した。Template Strand(A)と(G)の場合は,FAMとTETが検出され、基質5、6に高い活性を示した。基質1、2は、解析対象遺伝子にSNPがない場合、基質 3、4は、SNPがGでホモの場合、及び基質5、6はSNPがAとGヘテロの場合にそれぞれ比定される。これらの場合において、各々異なる蛍光が検出できたことは、本発明の多型解析手法が、SNPの有無のみならずホモ、ヘテロの判定にも有効であることをします。
これに対して、野生型酵素の場合は、各基質に対して検出されるFAMとTETの蛍光強度の差が明らかでなかった。
【0057】
〔実施例 13〕
以下の実験例は、ゲノムに存在する複数のSNPを多数同時に解析する場合において、(解析手法5)において、検出されたSNPの位置を、切断される5’フラップ鎖の長さ変えずに、その塩基を変えることにより識別できることを検証するものである。
以下のオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。 Frap Strand(C−5)及び(C−6)は、ともに14merで長さは同じにしたが、フラップ部分の塩基は異なる(C−5;CCCAAAAAAAAAAA、C−6;AAAAAAAAAAAAAA)
Template Strand (A); 54mer,
5'-GAGCTAGATGTCGGACTCTGCCTCAAGACGGTAGTCAACGTGCACTCGAGGTCA-
3’(配列番号31)
Upstream
Strand(B-2);27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3'(配列番号33)
Flap Strand (C-5)
43mer; 5'-CCCAAAAAAAAAAATCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'(配列番号51)
Flap Strand (C-6) 43mer;
5'-AAAAAAAAAAAAAATCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番号52)
【0058】
以上のオリゴヌクレオチドを実施例4と同様にアニーリングし、以下の基質AとBを形成した。基質AとBの構造は、図25に示される。
基質A Template Strand (A)+ Flap Strand (C-5)+ Upstream Strand(B-2)
基質B Template Strand (A)+ Flap Strand (C-6)+ Upstream Strand(B-2)
次いで、190 マイクロリットルの50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0、15mMMgCl2,)に、2.5マイクロモル各基質を加え、さらに各基質毎に酵素の野生体酵素 1.5マイクロモルをそれぞれ加え、60度で60分反応させた。0.2M EDTAを9.5マイクロリットル加え、最終濃度10mMにし、活性を止めた。各基質から得られた5’切断されたフラップ部を含むサンプル溶液を混合した後、以下のa)〜k)のようにして、ZipTip(Millipore corporation)で精製し、MALDI-TOF/MS分析器により分子量を測定した。この精製及び分子量測定工程以下のa)〜k)に示す。
【0059】
a) ZipTip(Millipore社製C18)をP10ピペットに装着し、50%AcCN中で5回ピペッティング
b) 0.1M TEAA溶液中で5回ピペッティング
c) サンプル(600ul中200ulを採取し乾燥後、20ul滅菌水で溶解したもの)を10回ほどピペッティング
d) 0.1M TEAA溶液を吸い取り、別の容器に排出する(5回実施)
e) 50%アセト二トリルにてDNAサンプルをマイクロチューブで溶出
f) DOWEX-50W-Hydrogen(SIGMA社製)をアンモニアフォームに置換したビーズをパラフィルム上にうすく撒き、その上に溶出したサンプル 7ulをスポット
g) 数回ピペッティングの後、乾燥しないように10分間ほど静置
h) TOF/MS測定用サンプルプレートに、マトリックス(3HPA;東京化成製の飽和水溶液)を1ulスポット
i) ビーズを吸い取らないように注意しながらサンプルを1ul採取し、マトリックスとプレート上で混合(ピペッティング)
j) サンプルプレートを風乾
k) MALDI-TOF/MS分析器において測定
【0060】
結果を図26、27に示す。
MASS の結果は、4868、4911にピ-クが検出された。4868は基質AのFlap鎖が切断されたオリゴヌクレオタイド 分子量4865Daに相当し、4991は基質BのFlap鎖が切断されたオリゴヌクレオチド 分子量4940Daに相当する。
他のピ-クは検出されなかった。フラップエンドヌクレア-ゼの切断点は、ジャンクション部分より1mer 中にはいったところの一ケ所であった。
オリゴヌクレオチドはZipTipで精製された。Flap strand はexonucleaseで分解されて、小さな分子量の所に検出され、サンプルの検出に邪魔にならなかった。Downsteam Strand Bは、検出されなかった。Template Strand AとDownstream Strand Bはまだアニールしており、この構造が酵素と結合し、Downstrean Strand Bが検出されなかったと思われる。
このように、切断されたオリゴヌクレオチドのみ検出できた。このことから、Flap strandの長さを変え、配列を変えることにより一度に多くの種類のSNP解析ができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の(1)または(2)に示されるフラップエンドヌクレアーゼ変異体からなる遺伝子多型解析用試薬。
(1)配列表の配列番号2に示されるパイロコッカス・ホリコシ由来のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列において、(A)33番目のアミノ酸がアラニン又はロイシン、(B)35番目のアミノ酸がチロシン、(C)79番目のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン、(D)33番目と79番目のアミノ酸がともにアラニン、(E)33番目と35番目のアミノ酸がともにアラニン、及び(F)278番目と279番目のアミノ酸がともにアラニンである変異のうちいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体
(2)パイロコッカス・ホリコシ以外の生物由来のフラップエンドヌクレアーゼ変異体であって、配列番号2に示されるフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列とのアライメント上の対応部位において、上記(1)の(A)〜(F)と同様のアミノ酸変異のいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体。
【請求項1】
以下の(1)または(2)に示されるフラップエンドヌクレアーゼ変異体からなる遺伝子多型解析用試薬。
(1)配列表の配列番号2に示されるパイロコッカス・ホリコシ由来のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列において、(A)33番目のアミノ酸がアラニン又はロイシン、(B)35番目のアミノ酸がチロシン、(C)79番目のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン、(D)33番目と79番目のアミノ酸がともにアラニン、(E)33番目と35番目のアミノ酸がともにアラニン、及び(F)278番目と279番目のアミノ酸がともにアラニンである変異のうちいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体
(2)パイロコッカス・ホリコシ以外の生物由来のフラップエンドヌクレアーゼ変異体であって、配列番号2に示されるフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列とのアライメント上の対応部位において、上記(1)の(A)〜(F)と同様のアミノ酸変異のいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異体。
【図2】
【図3】
【図4】
【図6】
【図9】
【図14】
【図16】
【図18】
【図20】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図1】
【図5】
【図7】
【図8】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図15】
【図17】
【図19】
【図21】
【図27】
【図3】
【図4】
【図6】
【図9】
【図14】
【図16】
【図18】
【図20】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図1】
【図5】
【図7】
【図8】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図15】
【図17】
【図19】
【図21】
【図27】
【公開番号】特開2010−200755(P2010−200755A)
【公開日】平成22年9月16日(2010.9.16)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−96197(P2010−96197)
【出願日】平成22年4月19日(2010.4.19)
【分割の表示】特願2006−528341(P2006−528341)の分割
【原出願日】平成17年1月21日(2005.1.21)
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り The Journal of Biological Chemistry,Vol.279,No.16,p.16687−16696,Jan 23 2004 [online]に発表
【出願人】(301021533)独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成22年9月16日(2010.9.16)
【国際特許分類】
【出願日】平成22年4月19日(2010.4.19)
【分割の表示】特願2006−528341(P2006−528341)の分割
【原出願日】平成17年1月21日(2005.1.21)
【新規性喪失の例外の表示】特許法第30条第1項適用申請有り The Journal of Biological Chemistry,Vol.279,No.16,p.16687−16696,Jan 23 2004 [online]に発表
【出願人】(301021533)独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Fターム(参考)】
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