フレームワーク修繕による免疫グロブリンの免疫原性の低下
【課題】親抗体の特異性および親和性を維持しつつ免疫原性が低下した、または排除された再作成免疫グロブリンを生産する新しくかつ改良された手段の提供。
【解決手段】得られた免疫グロブリンの特異性および親和性における有意な低下がないような状態で、意図した種、特に、ヒトで用いた場合に、潜在的免疫原性を低下させるように免疫グロブリンを再作成するための新規な、フレームワーク（ＦＲ）修繕と名付けられたアプローチ、つまり、ヒト化抗体の機能的ヒト抗体化への改変。
【解決手段】得られた免疫グロブリンの特異性および親和性における有意な低下がないような状態で、意図した種、特に、ヒトで用いた場合に、潜在的免疫原性を低下させるように免疫グロブリンを再作成するための新規な、フレームワーク（ＦＲ）修繕と名付けられたアプローチ、つまり、ヒト化抗体の機能的ヒト抗体化への改変。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ここにその内容を本出願に一体化させる２００１年６月２７日に出願された米国シリアル番号０９／８９２，６１３の利益を主張する。
【０００２】
本出願を通じて、種々の文献を括弧に入れて引用する。これらの刊行物の全内容の開示を、ここに、引用して本出願に一体化させ、本発明が属する技術水準をより充分に記載する。
【０００３】
本発明は、臨床的適応症（治療および診断双方）に関して抗体を再作成し、または再構成するにおける新規な方法に関する。該方法は組換え技術および抗体配列を再設計するにおける段階的および全体的アプローチの使用を組み合わせる。本発明は、特に、イン・ビボで用いた場合に未改変カウンターパートよりも免疫原性が低いように改変された抗体を提供する。
【背景技術】
【０００４】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、癌、移植、ウイルス感染等を含めた種々の病気の治療で用いられる最も成功した蛋白質薬剤となった。しかしながら、モノクローナル抗体の使用に関して問題があったので、魔法の弾丸の概念は実現するのに２５年より長きを要した。主な問題の１つは、齧歯類およびマウス源のものであるほとんどのモノクローナル抗体の元来の源に由来する。これらの外来性蛋白質のヒトへの反復された注入は、不可避的に、抗体に対する宿主免疫応答：いわゆるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の誘導をもたらす。キメラ抗体（例えば、ヒト定常領域に連結したマウス可変領域）を構築するための分子工学の技術を用いる初期の試みは、ＨＡＭＡ応答を軽減するのに幾分効果的であったが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答を誘導するのに充分に免疫原性であり得る全抗体配列の１／３を構成するマウス可変配列の大きなストレッチが依然としてある。抗体工学におけるより進歩した改良は、最近、ドナーマウスまたはラットの免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトフレームワーク領域に移植されたヒト化抗体を創製するのに利用されてきた（例えば、引用してここに一体化させるＥＰＯ公開番号０２３９４００）。該プロセスは「ヒト化」または「ＣＤＲ移植」と呼ばれる。ヒト化の元来の概念は、ヒトフレームワークへのＣＤＲの直接的移植を記載し、非−ヒト配列を５％未満まで低下させ、それにより、ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡ応答を低下させる。しかしながら、さらなる改変のないフレームワーク配列の直接的置き換えは、時々、１０倍以上もと大きな抗原に対する親和性を喪失しかねない（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｖｅｒｈｏｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６，１９８８）。ＣＤＲ移植された、またはヒト化された抗体の親和性を維持するためには、選択された位置におけるドナー免疫グロブリンからの対応するアミノ酸での、アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワークアミノ酸の置き換えが必要であろう。置き換えが起こる位置は公開された基準の組によって決定される（引用してここに一体化させる米国特許第５，８５，０８９号；米国特許第６９３，７６２号；米国特許第５，６９３，７６１号）。しかしながら、ヒトフレームワーク配列のストレッチ内のマウスアミノ酸の存在は、新しいＴおよびＢ細胞エピトープの創製において免疫原性であり得る。さらに、置き換えるべき適切なフレームワークアミノ酸の同定は時々困難であり得、さらに、ヒト化抗体の特異性および親和性に対する有意なインパクトなくしてヒト化における成功の機会を低下させる。
【０００５】
親抗体の特異性および親和性を維持しつつ免疫原性が低下した、または排除された再作成免疫グロブリンを生産する新しくかつ改良された手段が従って必要とされる。好ましくは、再作成された免疫グロブリンは、ＴまたはＢ細胞についての免疫原性エピトープの源であり得る、親抗体からのＦＲアミノ酸置換を含むべきではない。しかしながら、該アプローチは、少数のマウス残基またはマウス配列のストレッチを最終設計に含ませることができる配列設計における柔軟性を供し、最終の目標は、ヒトで用いるため得られた抗体の特異性および親和性を維持しつつ免疫原性を低下させることである。本発明はこれらの目標を満たすにおける方法およびアプローチを記載する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ドナー免疫グロブリンからの一般に１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および１以上のヒトまたは霊長類免疫グロブリンからのフレームワーク配列の部分を有する免疫グロブリン鎖を再作成するための新規な方法に関する。好ましい方法は、まず、全ての種の免疫グロブリンからのフレームワーク配列を、Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｍａｒｙｌａｎｄ：ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，１９９１）に従ってＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の区画化されたサブ領域に分割し、次いで、親免疫グロブリンの可変領域アミノ酸配列サブ領域における、全フレームワークの代わりに個々のＦＲを、ヒトまたは霊長類免疫グロブリン鎖の収集における対応する配列と比較し、次いで、最高程度の相同性を持つ適当なヒトまたは霊長類ＦＲを選択して、親免疫グロブリンの元来のＦＲを置き換えることを含む（フレームワーク−またはＦＲ修繕）。ヒトＦＲは１を超えるヒトまたは霊長類免疫グロブリン配列から選択することができる。ヒトまたは霊長類免疫グロブリン配列の収集は異なるデータベース（例えば、Ｋａｂａｔデータベース、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ インターネット等）から得ることができる。ヒトまたは霊長類免疫グロブリンから選択された個々のＦＲ配列は、典型的には、対応する親ＦＲ配列に対して６０％以上の相同性を有するであろう。高い総じての相同性が修復用のＦＲを選択するための重要な基準であろうが、もしＣＤＲに直接隣接する、あるいは抗原結合部位と接触するループ位置における配列の相同性がコンピューターモデリングを介して実験的に決定されるか、または予測されれば、より低い相同性のＦＲが用いられるであろう。そのＦＲが修復されるべき親免疫グロブリンは重鎖または軽鎖いずれかであり得る。修復された軽鎖および重鎖を用いて、部分的または全長ヒト定常領域を含むまたは含まない、２つの軽鎖／重鎖対を有する完全なＦＲ−修復免疫グロブリンまたは抗体を形成することができる。
【０００７】
（重鎖および軽鎖双方に適用される）親免疫グロブリン鎖を修復するために選択された個々のＦＲは：
（１）好ましくは、親免疫グロブリン鎖のそれと同一のＣＤＲに直ちに隣接するアミノ酸配列を有し；
（２）親免疫グロブリン鎖のそれと、もし完全でなくても同一の、構造において保存的に類似であるＣＤＲに直ちに隣接するアミノ酸配列を有し；
（３）好ましくは、三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲ（または効果的な抗原結合部位）から約３Å内にあり、かつ抗原、または親またはＦＲ修復免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用できると予測される親免疫グロブリンの対応するＦＲ位置において同一アミノ酸を有し；
（４）三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲ（または効果的な抗原結合部位）から約３Å内にあり、かつ抗原、または親またはＦＲ修復免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用できると予測される親免疫グロブリンの対応するＦＲ位置におけるアミノ酸と構造において保存的に類似するアミノ酸を有するべきである。
【０００８】
ＦＲ修復免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の各々は、典型的には、選択基準のいずれか１つまたは全てに従う１以上のヒトまたは霊長類免疫グロブリンからのＦＲ源を含む。本発明のＦＲ修復重鎖および軽鎖は、無傷抗体、抗体断片、または抗体−ベースの誘導体（例えば、一本鎖抗体、ダイアボディー等）と組み合わせた場合、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、抗原に対して親免疫グロブリンと実質的に同一の親和性および特性（例えば、結合に際しての内部化）を保持する。これらの親和性レベルは、抗原に対する親免疫グロブリンの元来の親和性の４倍の範囲内、好ましくは約２倍内で変化すべきである。
【０００９】
同様の原理が、異なる種からのＦＲを持つ一つの種の親免疫グロブリンを再作成するか、または修繕するのに適用される。蛋白質および／または分子工学の分野における当業者は、ＦＲ‐修復免疫グロブリン、またはその誘導体を得るために本発明の設計および原理を採用することができるであろう。一旦設計されれば、例えば、部位特異的突然変異誘発および遺伝子‐合成によってＦＲ修繕免疫グロブリン配列を構築するにおいて種々の技術が存在する。プロデューサー細胞系におけるトランスフェクションのための適当な免疫グロブリン定常重鎖および軽鎖を含む発現ベクターに、組み立てられたＦＲ修繕配列をサブクローン化する。細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞を含めた、異なる細胞系をＦＲ修繕免疫グロブリンの生産で用いることができる。
【００１０】
別法として、免疫グロブリンはトランスジェニックまたはトランスクマティック動物の乳中で、またはトランスジェニック植物中の貯蔵蛋白質として生産することができる。本発明は、結合親和性を犠牲とすることなく、かつ親免疫グロブリンのフレームワークアミノ酸の導入から得られた新しいＴおよびＢ細胞エピトープをヒトＦＲに導入する尤度なくして、免疫原生が低下したまたは排除された免疫グロブリンを創製するにおいて比較的容易で（ＣＤＲと相互作用する重要なＦＲアミノ酸を同定する必要無し）高度に柔軟性のある（もし必要であれば、個々のＦＲのマッチおよび変化に対する自由度）改良された新規な方法を提供する。ＦＲ修繕抗体は、単独で、あるいは他の免疫グロブリンまたは治療様式と組み合わせて用いられる、裸の形態のまたは融合または化学的コンジュゲートとして、低い（１０ｍｇ／ｍ2未満）または高い（１００ｍｇ／ｍ2を超える）用量で、単回で、または反復して用いられ、種々の病気を治療するのにヒトで用いるのに適当であろう。
【００１１】
発明の詳細な記載
本発明は、「フレームワーク（ＦＲ）修繕」と命名されたプロセスを介して、ヒトまたは霊長類の配列に対して高度な相同性を持つ免疫グロブリンの設計における新しいアプローチを確立することを目的とする。ＦＲ修繕免疫グロブリン（以後、修繕された免疫グロブリン）は、ヒトで用いる場合、実質的に低下した、または排除された免疫原性を有し、特異的抗原に対する親免疫グロブリンの特異性および親和性を維持しつつ、特異的抗原およびエフェクター機能（例えば、補体固定、ＡＤＣＣ等）を標的化する能力のごときヒト免疫グロブリンの特徴のほとんどまたは全てを担うであろう。修繕された免疫グロブリンは、そのうち、各可変領域が、Ｋａｂａｔの分類（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ）に従って、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を表わす配列を含む重鎖および軽鎖を含むであろう。１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む各親免疫グロブリン鎖の４つのＦＲの少なくとも一つは、対応するヒトまたは霊長類ＦＲで置き換えるか、またはそれで「修繕される」であろう。親免疫グロブリン鎖の２以上のＦＲを置き換えるべき場合、それらは同一のヒトまたは霊長類免疫グロブリンからの、または同一サブグループ内の、または異なるサブグループにおける異なるヒトまたは霊長類免疫グロブリンからの、またはヒトおよび霊長類免疫グロブリンの組合せからの対応するＦＲで修繕することができる。修繕された免疫グロブリンは典型的な医薬周辺において大規模生産用の適当な宿主系で発現され、適当な様式または組合せでヒトで用いて、広い範囲のヒトの病気を治療または検出するであろう。
【００１２】
本発明の良好な理解を保証するために、いくつかの定義を記載する。本明細書中で用いるごとく、「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコード化された１以上のポリペプチドよりなる蛋白質をいう：典型的な免疫グロブリン蛋白質は、対になった２つの重鎖と２つの軽鎖を含む。全長免疫グロブリン重鎖はサイズが約５０ｋＤであり（長さがほぼ４４６アミノ酸）、重鎖可変領域遺伝子（約１６０アミノ酸）および定常領域遺伝子によってコード化される。アルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミュー配列のごとき異なるイソタイプの重鎖定常領域をコード化する異なる定常領域遺伝子がある。全長免疫グロブリン軽鎖はサイズが約２５ｋＤであり（長さがほぼ２１４アミノ酸）、軽鎖可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコード化される。天然に生じる免疫グロブリンは、通常、各対が一つの軽鎖および一つの重鎖を有する免疫グロブリン鎖の二つの同一対よりなるテトラマーの形態の抗体として知られる。各対においては、軽鎖および重鎖可変領域は、一緒に、抗原への結合を担い、定常領域は抗体に典型的なエフェクター機能を担う。
【００１３】
免疫グロブリンはＦｖ（Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５８７９−５８３３；Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８）、ダイアボディー、ミニ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、二官能性ハイブリッド抗体（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５，１９８７）のごとき天然に生じる、化学的に改変された、または遺伝子工学的に作成されたのいずれかの異なる形態であり得る（一般に、Ｈｏｏｄら，「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，ＮＹ，第２版，１９８４；ＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ ３２３：１５−１６，１９８６参照）。
【００１４】
重鎖および軽鎖双方の可変領域は、Ｋａｂａｔのデータベース（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）で定義されているごとく、超可変配列の３つのストレッチ、または相補性決定領域（ＣＤＲ）によって中断された、４つのフレームワークサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含むセグメントに分類され、ＣＤＲ１はＦＲ１およびＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２およびＦＲ３の間に位置し、およびＣＤＲ３はＦＲ３およびＦＲ４の間に位置する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定のサブ領域を特定することなく、他の者によって言及されるフレームワーク領域は単一の天然に生じる免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。本明細書中で用いるごとく、ＦＲは、４つのサブ領域のうちの一つを表し、ＦＲ類はフレームワーク領域を構成する４つのサブ領域の２以上を表す。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域であり、ＣＤＲを位置決定し、それを整列させるように働く。ＣＤＲは、一義的には、結合特異性および親和性を抗原のエピトープに付与する抗体の結合部位の形成を担う。
【００１５】
親抗体は、低下したまたは最小化された免疫原生でもって、異なる種、例えば、ヒトに用いるのに適した形態、配列または構造に再作成し、再構成するか、または本発明ではＦＲ修繕すべき、特定の種、例えば、マウスの抗体である。
【００１６】
キメラ抗体は、親Ｖ‐領域配列からの優位な配列改変なくして、異なる種の対応する重鎖および軽鎖定常領域にその可変領域が連結された抗体である。キメラ抗体の構築は、通常、可変領域をコード化するＤＮＡ配列を、対応する定常鎖をコード化するＤＮＡ配列に連結することによって達成される。最も普通のタイプのキメラ抗体は、マウス可変領域およびヒト定常領域を含むものである。この場合、発現されたハイブリッド分子は、親マウス抗体の結合特異性および親和性、およびヒト抗体のエフェクター機能を有するであろう。最も重要には、組換え蛋白質のアミノ酸の２／３はヒト起源であり、従って、治療キメラ抗体のＣ２Ｂ８（またはＲｉｔｕｘａｎ）の場合におけるごとく、ヒトで用いた場合、低下したまたは有意でない免疫原性が予測される（Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１８５１−１８５７，１９９９；Ｃｏｉｆｆｉｅｒら，Ｂｌｏｏｄ ９２：１９２７−１９３２，１９９８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：２８２５−２８３３，１９９８）。
【００１７】
「ヒト化」免疫グロブリンは、一般に、ヒトフレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリンからの１以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンとして受け止められている（Ｊｏｎｅｓら，ｏｐ．ｃｉｔ；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，ｏｐ．ｃｉｔ；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，ｏｐ．ｃｉｔ．）。ＣＤＲを供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。通常、他の者によって用いられ、言及されてきたごとくアクセプターは単一のヒト免疫グロブリン種に由来する。「ヒト化」免疫グロブリンの親和性を維持するために、ドナーのアミノ酸残基は、アクセプター免疫グロブリンのフレームワーク領域に一体化されなければならないであろう。一連の刊行物（引用してここに一体化させる米国特許第５，８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，６９３，７６１号）に公表されているごとく、ドナー配列への変換用のアクセプター免疫グロブリン内の限定された数のアミノ酸を選択する基準の組がある。ヒト化免疫グロブリンは定常領域を含んでも含まなくてもよい。ヒト化重鎖免疫グロブリンは、対応するヒト重鎖定常領域を含むヒト化免疫グロブリンであり、ヒト化軽鎖免疫グロブリンは、対応するヒト軽鎖定常領域を含むヒト化免疫グロブリンである。ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。
【００１８】
成功したヒト化抗体は以下の特徴：
（１）ヒトで用いるためのヒト化抗体の複数注入を可能とする、ヒト化配列に由来する有意に低下した、好ましくは排除された免疫原生；
（２）元の抗原に対する特異性および親和性を含めた乱れが最小の免疫原生（３倍以内）；
（３）補体固定、補体媒介細胞傷害性、抗体依存性細胞の細胞傷害性等のごときヒトエフェクター機能を誘導することができること；
を有しなければならないであろう。
【００１９】
さらなる配列改変なくしてヒトアクセプターフレームワークへドナーＣＤＲを直接的に移植する結果、抗原親和性が実質的に喪失されるようである。選択されたドナーアミノ酸のアクセプターフレームワーク領域への導入は、幾分問題を矯正し、ほとんどの場合、親和性を改良するが、該アプローチは冗長であり、時々、突然変異する適当なフレームワークアミノ酸を同定するにおいてコンピューターモデリングの助けを要し、オールオアナンモードでのアクセプターヒトフレームワークの選択において柔軟性を欠く。最も重要なことには、ヒト「アクセプター」フレームワークにおいて親「ドナー」残基を保有することによって潜在的な新しい免疫原性エピトープを導入するようである。
【００２０】
本発明はこれらの問題に立ち向かい、免疫原性ではないか、または免疫原性が低いが、親抗体におけるごとく特異的抗原に対して元の親和性のほとんどまたは全てが保有されたＦＲ修繕抗体を創製するにおいて柔軟性および単純性が増大した新規なアプローチを創出する。キメラまたはヒト化免疫グロブリンに対する免疫応答のほとんどは、理論に拘束される意図はないが、可変領域におけるエピトープに対して向けられるので、本発明が実現する原理を、限定されるものではないが、例として可変領域を用いることによって説明する。
【００２１】
蛋白質に対する免疫原性に寄与する少なくとも二つの種類のエピトープが存在する。いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」は、細胞内で蛋白質の分解の間に放出され、引き続いて、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示されて、Ｔ細胞の活性化をトリガーする短いペプチド配列である。ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたペプチドでは、次いで、Ｔ細胞のそのような活性化は、Ｂ細胞の直接的刺激によって抗体応答を生起して、そのような抗体を生産することができる。ヒト化可変領域の構造の詳細な分析は、潜在的に免疫原生であるＣＤＲのストレッチの不回避な存在を明らかにする。これらのＣＤＲは、フレームワーク配列の残りを４つのサブ領域、すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４に物理的かつ機能的に区画化する（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）。Ｔ細胞エピトープは線状の連続的な短いペプチドであるので、各ＦＲ区画におけるそのようなエプトープの有無は、異なるＦＲが同一または異なるフレームワークに由来するか否かを問わず、相互に対して相関を有すべきではない。Ｑｕｅｅｎらのヒト化アプローチを用いるアクセプターフレームワーク領域へのドナーフレームワーク残基の導入（引用して個々に一体化させる米国特許第５，８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，６９３，７６１号）は、新しい免疫原性Ｔ細胞エピトープを創製する可能性を有し、その結果、ヒト化抗体に対する免疫応答、特に、ドナーＣＤＲループによって形成されたイディオタイプ領域に対する抗体応答が誘出される。各ヒト化免疫グロブリン鎖へ一体化された３ないし７の間のドナーアミノ酸を有するのは普通ではなく、新しいＴ細胞エピトープについての出現の機会を多いに増加させる。
【００２２】
同様に、ヒトフレームワーク内に埋もれたこれらのドナー由来残基は、抗体によって認識できる新しい免疫原性Ｂ細胞エピトープを形成することができる。アクセプターフレームワークへのドナー残基の再導入は、ヒト化免疫グロブリンの元の抗原親和性を維持するにおいて重要であることはよく確立されているが、理想的には、さらなる改変および親和性の喪失なくしてドナーＣＤＲをアクセプターフレームワークに直接移植することによってヒト化を達成することができれば、それが好ましい。
【００２３】
本発明は、特異的抗原に対するその親和性がその元のレベルの３倍以内に維持される免疫グロブリンの免疫原性を低下させ、または排除するにおける新しいアプローチを提供する。該アプローチは柔軟であり、多様であり、単純であって、通常は技巧を凝らしたコンピューターモデリング分析を必要としない（がそれは、それが用いられるのを排除しない）。それは、以前の利用できる方法で抗体をヒト化するにおいて、免疫原性の低下および親和性の維持の間の逆関係の問題を取り扱う。例として免疫グロブリン可変領域を用い、１組の基準および原理が配列をＦＲ修繕するときに従われる。該基準を単独で用いることができるか、あるいは必要がある場合は組み合わせて、低下したまたは排除された免疫原性、および所望の親和性または他の特徴を達成することができる。
【００２４】
ＦＲ修繕による免疫グロブリン可変領域ヒト化において、親免疫グロブリンアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔら（ｏｐｔ．ｃｉｔ．）の分類に従ったＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４に区画化する。区画化されたＦＲの各々は別々に取り扱われ、それを用いて、公のドメイン、商業的存在、または私的所有いずれかで入手可能な全てのデータベースで見出される対応するＦＲセグメントと整列させる（例えば、Ｋａｂａｔデータベース，ｏｐｔ．ｃｉｔ．；ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）。免疫グロブリンは１を超える免疫グロブリン源からのＦＲで修繕することができる。好ましくは、対応する親ＦＲに対して最高程度の相同性（＞６０％）を持つヒトＦＲセグメントを用いる。しかしながら、免疫グロブリン鎖の一次配列中の３つのＣＤＲの１以上に隣接するＦＲ中のアミノ酸は当該抗原と直接相互作用することができ（引用してここに一体化させるＡｍｉｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７‐７５３，１９８６）、より低い相同性を持つヒトＦＲと同一のこれらのアミノ酸の選択は以下に記載する基準に従って用いる。
【００２５】
それが、ＣＤＲ１に直ぐに隣接する３以上のアミノ酸において、親ＦＲ１に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合には、ヒトＦＲ１が用いられる。
【００２６】
それが、フランキングＣＤＲ１およびＣＤＲ２に直ぐに隣接する両末端の３以上のアミノ酸において、親ＦＲ２に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合には、ヒトＦＲ２が用いられる。
【００２７】
それが、フランキングＣＤＲ２およびＣＤＲ３に直ぐに隣接する両末端の３以上のアミノ酸において、親ＦＲ３に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合には、ヒトＦＲ３が用いられる。
【００２８】
それが、ＣＤＲ３に直ぐに隣接する３以上のアミノ酸において親ＦＲ４に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合には、ヒトＦＲ４が用いられる。
【００２９】
ＣＤＲに隣接する３以上のアミノ酸において１００％相同性を持つＦＲが同定することができない場合、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒのごとき保存的に類似するアミノ酸を含むこれらの位置において最も近い相同性を持つＦＲが選択される。
好ましくは、コンピューターモデリング（その全てを引用して一体化させるＬｅｖｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：７１６８−７１７５，１９８９；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ３３５：５６４−５６８，１９８８；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：７５５−７５８，１９８６参照）、結晶構造、公開された情報または先行経験いずれかに基づいて、ＣＤＲ／抗原結合部位（その全てを引用してここに一体化させるＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７，１９８９およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５，１９９０）に近いか、あるいはそれとの相互作用を有することが知られている位置におけるそのアミノ酸が親ＦＲのそれと同一であるか、または保存的に類似するヒトＦＲが選択される。
【００３０】
ＦＲ修繕は、前記基準に適合する満足すべきＦＲを入手可能なデータベースが生じさせない場合、必要な場合の修繕されたＦＲの対応する位置における親アミノ酸の導入、または異なる霊長類、マウス等のごとき異なる種からの免疫グロブリンにＦＲを含めることを排除しない。重要な目標は、親和性の実質的喪失なくして、免疫原性が低下した、好ましくは排除された抗体を生産することである。該アプローチはこの点で成功する機会を上昇させ、柔軟性、簡潔性および操作の容易性の点で他の方法よりも優れたかなりの改良を伴う。
【００３１】
ヒト定常配列を運ぶＦＲ修繕抗体は、標的抗原に結合すると、補体媒介細胞傷害性（ＣＭ）または抗体依存性細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のごときヒト免疫エフェクター機能を誘導することができるであろう。さらに、治療または診断目的でヒトに注入すると、ヒトＦＲで修繕された抗体は非‐免疫原性であると予測され、すなわち、注入された蛋白質に対して抗体応答を誘導せず、もし必要であれば、最大臨床利益を達成するためのヒト患者への複数注入を可能とするであろう。非‐ヒト抗体は、ヒト抗体のそれよりもかなり短い循環半減期を有することが報告されている（Ｓｈａｗら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４‐４５３８，１９８７）。ほとんどのヒト配列を運ぶ修繕された抗体は、おそらくは、天然に生じるヒト抗体を暗示する延長された半減期を有するであろう。
【００３２】
ＦＲ修繕免疫グロブリンの構築において、免疫グロブリンの可変領域についての配列設計は、前記で説明した基準および原理を用いて成される。設計されたＦＲ修繕可変領域配列は、当業者によく知られた種々の標準的組換え技術を用いて組み立てられる。好ましくは、通常は約３５０塩基対のサイズの設計された配列は遺伝子合成され（その全てを引用してここに一体化させるＬｅｕｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１４１３−１４２７，１９９５；Ｄａｕｇｈｅｒｐｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２４７１−２４７６；ＤｅＭａｒｔｉｎｏら，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．４：８２９，１９９１；Ｊｏｎｅｓら，ｏｐ．ｃｉｔ）、あるいは部位またはオリゴヌクレオチドに特異的な突然変位誘発の方法によって、個々のＦＲを導入して親ＦＲを置き換えることができる（双方をここに引用して一体化させるＧｉｌｌｍａｎおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１−９７，１９７９；およびＲｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４）。
【００３３】
ＦＲ修繕免疫グロブリンをコード化するＤＮＡセグメントは、細菌増殖および異なる宿主細胞における発現に適したＤＮＡ発現ベクターにおいてヒト重鎖および軽鎖領域をコード化するＤＮＡ配列に連結される。種々の宿主細胞系における発現に適した種々のＤＮＡベクターがある。適当なＤＮＡベクターは、ＦＲ修繕免疫グロブリンの発現のために選択することができる。典型的には、適当な発現制御ＤＮＡ配列は、免疫グロブリン鎖をコード化するＤＮＡセグメントに作動可能に連結される。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトできるベクターにおける真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主用の制御配列も用いることができるＦＲ修繕免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコード化する配列は、一つの単一ＤＮＡ発現ベクターに、または別々の重鎖および軽鎖発現ベクターに取り込むことができる。後者の場合には、宿主細胞は、適当な対の重鎖および軽鎖ポリペプチドを持つＦＲ修繕抗体を生じさせるために双方のベクターが同時に取り込まれなければならない。一般に、後の分泌のためにゴルジ装置への免疫グロブリンポリペプチドの輸送を可能とするリーダー配列が、真核生物宿主細胞における発現のために各免疫グロブリン鎖のＮ末端に含まれる。一旦ベクターが適当な宿主細胞に取り込まれたならば、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下に維持され、その結果、ヒト化軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖ダイマーまたは無傷抗体、結合断片、単一鎖抗体（ｓＦｖ）、ダイアボディー、またはその誘導体、または他の免疫グロブリンの形態の収集および精製をそれに続けることができる（ここに引用して一体化させるＢｅｙｃｈｏｋ，Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７９参照）。
【００３４】
重鎖および軽鎖についての異なるヒト定常領域があるのは良く知られた事実である。特定のイソタイプは、異なる目的で用いるために選択することができる特定のエフェクター特徴を有する。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞、好ましくは不滅化Ｂ−細胞からよく知られた手法に従って単離することができる（Ｋａｂａｔ ｏｐ．ｃｉｔ．およびＷＰ８７／０２６７１参照）。本発明の免疫グロブリンを生じさせるためのＣＤＲは、同様に、例えばＣＤ２２およびＣＤ２０のごとき所定の抗原に結合させることができるモノクローナル抗体から誘導され、抗体を生産することができるマウス、ラット、ウサギまたは他の脊椎動物を含めたいずれかの便宜な哺乳動物源においてよく知られた方法によって生産される。定常領域およびフレームワークＤＮＡおよび分泌用の適当な源細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ここに引用して一体化させる「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，第６版，１９８８，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）のごとき多数の源から得ることができる。
【００３５】
（プロモーターおよびエンハンサーを含めた）発現制御配列に作動可能に連結したＦＲ修繕免疫グロブリン鎖についてのコーディング配列を含むＤＮＡ発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの一体化部分として宿主生物中で複製可能である。テトラサイクリン、ネオマイシン、ベータラクタマーゼ等のごとき選択マーカーをベクターに含ませて、ＤＮＡベクターで形質転換された細胞の検出を可能とする（例えば、ここに引用して一体化させる米国特許第４，７０４，３６２号）。
【００３６】
細菌宿主は、ＤＮＡベクターを増殖させるのに、ならびに取り込まれた免疫グロブリンＤＮＡを発現させるのに適している。例えば、大腸菌は、本発明についてのＤＮＡ配列をクローニングするのに用いる最も通常に用いられる原核生物宿主である。同一目的で有用な他の微生物宿主は、その例として、バチルス（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）および他の腸内細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｃｒｒａｔｉａ）、および種々のシュードモナス種を含む。これらの宿主におけるクローン化配列の発現は、宿主細胞に適合する発現制御配列（例えば、複製起点）、およびＤＮＡベクターに含ませるべき機能的プロモーターの存在を必要とする。よく知られたプロモーター系の例は、限定されるものではないが、トリプトファン（ＴＲＰ）プロモーター系、ベータ‐ラクタマーゼプロモーター系、ファージラムダプロモーター系等を含む。これらのプロモーターは、全ての必要なモチーフに加えて、任意に、オペレーター配列と共に、転写開始および翻訳に必要なリボソーム結合部位配列等を含む、プロモーター系の下流の機能的遺伝子配列の発現または転写を制御することを担う。
【００３７】
同様に、酵母のごとき他の微生物も発現で用いることができる。例えば、好ましい宿主は、所望により、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含めた、プロモーターのごとき適当な発現制御エレメント、および複製起点、終止配列などを含む発現ベクターに適した宿主であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓであろう。
【００３８】
無脊椎動物起源の真核生物宿主細胞を用いることができる。例えば、ｈｉ−５、ＳＦ９、ＳＦ２１のごとき昆虫細胞。宿主細胞における高レベル発現で重要な便宜なクローニング部位、プロモーター、終止配列を含む適当な発現ベクターは市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。
【００３９】
好ましくは、哺乳動物組織細胞培養を用いて、本発明のポリペプチドを発現させ、それを生産することができる（ここに引用して一体化させるＷｉｎｎａｃｋｅｒ，「Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ」，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，ＮＹ，ＮＹ，１９８７参照）。最も普通に用いられる哺乳動物宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、およびＳＰ２／０細胞系、ＮＳ０細胞系、ＹＢ２／０細胞系等のごとき骨髄腫細胞系、および形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞系は重鎖ＣＨ２ドメインにおいてアミノ酸２９７のごとき適当な部位において正しいグリコシル化を付与することができ、全長免疫グロブリンを分泌することができ、およびこの特別な発明で選択された宿主細胞系である。他の宿主細胞のための発現ベクターと同様に、真核生物細胞発現ベクターは、通常、グリコシル化および輸出のために発現されたポリペプチドをゴルジ装置に向けるためのリーダー配列、注目するＤＮＡセグメント（例えば、重鎖および軽鎖コーディング配列および発現制御配列）、終止コドン、（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化配列、および転写ターミネーター配列のごとき）他の必要なプロセッシング情報部位、および（突然変異体Ｄｈｆｒ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ヒグロマイシン、ネオマイシンのごとき）選択マーカーと共に、プロモーター（例えば、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するもの）、エンハンサーを含めた適当な発現制御配列を含む（個々に引用して一体化させるＫｅｌｌｅｍｓ，「Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」，Ｍａｒｃｅｍ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，１９９３参照）。
【００４０】
注目するＤＮＡセグメントを含むベクターを宿主細胞へ、宿主細胞ゲノムへ一時的にまたは安定して組み込むように導入するための多くの確立されよく知られた方法が存在する。それらは、限定されるものではないが、塩化カルシウムトランスフェクション、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション等を含む（ここに引用して一体化させるＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８２参照）。適当な発現ベクターが取り込まれた宿主細胞の同定は、典型的には、まず、ベクターで用いる選択マーカーに従った選択圧下で細胞を増殖させ、次いで、ＥＬＩＳＡおよびウエスタン分析のごとき標準的な手法によって、分泌された蛋白質、例えば、重鎖および軽鎖の２つの対を含む全抗体、または本発明の他の免疫グロブリンの形態を検出することによって達成できるであろう。発現された免疫グロブリンの精製は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含めた当該分野の標準的な手法に従って行なうことができる（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２参照）。少なくとも約９０ないし９５％均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、医薬用途では、９８ないし９９％以上の均一性が最も好ましい。所望により一旦部分的にまたは均一になるまで精製すれば、次いで、ポリペプチドは（体外を含めて）治療で、あるいはアッセイ手法、免疫蛍光染色等を開発し、実行するにおいて用いることができる（一般に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌｓ ＩおよびＩＩ，ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９７９および１９８１参照）。
【００４１】
本発明の抗体は、典型的には、個々に、または他の治療様式と組み合わせて、抗体‐ベースの療法に感受性の病気を治療するにおいて用途が見出されるであろう。例えば、免疫グロブリンは、全て、多くの先行抗体に伴う実質的有害免疫反応（例えば、アナフィラキシーショック）なくして、受動免疫化、または補体媒介溶解によるごとき望まない細胞または抗原の除去で用いることができる。
【００４２】
本発明の抗体の好ましい用法は、病巣部位において局所、皮下、静脈内および筋肉内のいずれかで投与される５０ｍｇないし４００ｍｇ／ｍ2の範囲の投与量でそれらの裸の形態（裸の抗体）を用いる病気の治療であろう。異なる間隔での複数投与を行なって、例えば、１週間間隔で、１週間に１回で４週間、最適な治療または診断応答が達成されるであろう。本発明に由来する抗体の用法は、化学療法薬物（例えば、ＣＨＯＰ、Ｄｏｘ、５−Ｆｕ等）、放射線療法、放射線免疫療法、ワクチン、酵素、トキシン／イムノトキシン、または本発明または他から由来する他の抗体のごとき異なる治療様式と組み合わせることができる。本発明の抗体は、抗―腫瘍抗体のイディオタイプに特異的であれば、腫瘍抗原に対するＡｂ３の誘導用の腫瘍ワクチンとして用いることができる。当業者によく知られた多数の更なる剤、または剤の組合せを利用することもできる。
【００４３】
加えて、本発明の抗体は異なる医薬組成物で利用することができる。該抗体は、それらの裸の形態で、あるいは薬物、放射性核種、トキシン、サイトカイン、可溶性因子、ホルモン、酵素（例えば、カルボキシルエステラーゼ、リボヌクレアーゼ）、ペプチド、（腫瘍ワクチンとしての）抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは標的化剤または送達ビヒクルとして働く抗体部位と共に特異的治療機能を有するいずれかの他のエフェクター分子とのコンジュゲーテッド蛋白質として用いることができる。さらに、本発明の抗体断片、単一鎖Ｆｖ、ダイアボディー等のごとき抗体または抗体誘導体は、（例えば、二特異的抗体としての）異なる発明の抗体または抗体誘導体、トキシン、サイトカイン、可溶性因子、ホルモン、酵素、ペプチド等のような他の機能性部位に対する融合蛋白質として用いることができる。当業者によく知られた医薬組成物の異なる組合せも利用することができる。
【００４４】
また、本発明のＦＲ修繕抗体は、例えば、特異的抗原の検出用の診断ツールとして、イン・ビトロ目的で用いることもできる。
【００４５】
以下の実施例は説明のために掲げ、限定するものではない。
【００４６】
実験
ＦＲ修繕免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列に設計するにおいて、（ＶＨおよびＶＬ双方に適用される）マウス可変領域配列を、Ｋａｂａｔの分類（Ｋａｂａｔら，ＯＰ．ＣＩＴ．）に従って、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４に区画化した。修繕のための個々のＦＲの選択は、前記したガイドラインに従った。
【００４７】
それが、ＣＤＲ１に直ぐに隣接した３以上のアミノ酸において親ＦＲ１に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合にはヒトＦＲ１が用いられる。
【００４８】
それが、フランキングＣＤＲ１およびＣＤＲ２に直ぐに隣接した双方の端部の３以上のアミノ酸において親ＦＲ２に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合にはヒトＦＲ２が用いられる。
【００４９】
それが、フランキングＣＤＲ２およびＣＤＲ３に直ぐに隣接する双方の端部の３以上のアミノ酸において親ＦＲ３に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合にはヒトＦＲ３が用いられる。
【００５０】
それが、ＣＤＲ３に直ぐに隣接する３以上のアミノ酸において親ＦＲ４に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合にはヒトＦＲ４が用いられる。
【００５１】
ＣＤＲに隣接する３以上のアミノ酸における１００％相同性を持つヒトＦＲを同定することができない場合、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ：およびｐｈｅ、ｔｙｒのごとき保存的に類似するアミノ酸を含むこれらの位置において最も近い相同性を持つＦＲが選択される。
【００５２】
好ましくは、コンピューターモデリング（Ｌｅｖｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉら；ｏｐ．ｃｉｔ：Ｃｈｏｔｈｉａら，ｏｔ．ｃｉｔ．参照）、結晶構造、公表された情報、または以前の経験いずれかに基づいて、ＣＤＲ／抗原結合部位（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｃｈｏｔｈｉａら，ｏｐ．ｃｉｔ．およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら，ｏｐ．ｃｉｔ．）に近くであるか、またはそれとの相互作用を有することが知られている位置におけるそのアミノ酸が親ＦＲのそれと同一であるか、または保存的に類似するヒトＦＲが選択される。
【００５３】
前記の全てを満足する特定のヒトＦＲが入手不可能であって、直接的修繕の結果、親和性または特異性が喪失される場合、抗原結合部位との相互作用を有するか、または抗体の最終的な親和性に寄与すると考えられるマウス残基を最良の入手可能なＦＲに逆に導入する。別法として、マッチングヒトカウンターパートを持たない特定のＦＲは、改変のないそのマウス組成物に保存され、使用され；最終のＦＲ修繕配列はヒトおよびマウスＦＲの混合物を含むであろう。例示の目的で、２つのマウス抗Ｂ細胞抗体を、本明細書中に記載したアプローチを用いてＦＲ修繕する。
【００５４】
実施例１
ＦＲ修繕した抗ＣＤ２２抗体
ＦＲ修繕した抗ＣＤ２２軽鎖および重鎖についての遺伝子の設計
マウス抗ＣＤ２２抗体であるＲＦＢ４（Ｌｉら，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８：８５，１９８９；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｂｌｏｏｄ ９０：２０２０−２０２６，１９９７）の重鎖および軽鎖の配列を例として用い、ＦＲ修繕を用いて再作成された抗体の免疫原性を低下させるか、または排除するアプローチを説明する。マウス抗体についての重鎖（ａ）および軽鎖（ｂ）可変領域の配列を図１に示す。
【００５５】
ＲＦＢ４用の重鎖可変領域についての個々のＦＲの修繕は以下のごとくに行なった。
ａ．ＦＲ１；マウスＶＨのＦＲ１配列を、Ｋａｂａｔのデータベース（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）からのヒトＶＨのＦＲ１配列と比較した。最高の配列相同性のヒトＦＲ１が好ましいが、ＣＤＲ１に最も近い配列についての特定の強調を取った。マウスＦＲ１に対して最高の相同性の３つのＦＲ１配列がある。それらは、すなわち、ＥＩＫ、ＲＦ−ＳＪ１およびＷＡＳである。マウス親と同一のＣＤＲ１に最も近い５つの残基との最高の総じての相同性を持つＦＲ１はＥＩＫであるが、位置１２には失われた残基があり、これは、得られた抗体の免疫反応性に影響する潜在的問題を生じる可能性がある。修繕のためにピックアップした好ましいＦＲ１は、従って、ＷＡＳからのものであった。まず、ＣＤＲ１に対して３番目に近い残基位置２８を除き、ＣＤＲ１の次の１１のアミノ酸の全ストレッチはマウス親と同一である。位置２８において、マウス配列においてアラニンの代わりにセリン残基が見出される。セリンはアラニンのヒドロキシル化バージョンと考えられるので、変化は保存的である。さらに、ヒトおよびマウスの間で異なる残基は特徴が比較的類似する。例えば、位置５におけるバリンおよびロイシン、位置１３におけるリシンおよびグルタミン、位置１９におけるリシンおよびアルギニン、および位置２８におけるアラニンおよびセリン。従って、抗ＣＤ２２抗体のＦＲ１を修繕するために、ＷＡＳからのヒト配列を選択した（図２Ａ）。
【００５６】
ｂ．ＦＲ２：同一のトークンによって、かつ相同性の程度に基づき、抗ＣＤ２２抗体のＦＲ２を修繕するために、ヒトＷＡＳ配列を選択する（図２Ａ）。
【００５７】
ｃ．ＦＲ３：同一であるＣＤＲ２およびＣＤＲ３に最も近い配列および高度の相同性でもって、抗ＣＤ２２抗体のＦＲ３を修繕するために、ヒトＧＡＬ配列を選択した（図２Ａ）。
【００５８】
ｄ．ＦＲ４：同一であるＣＤＲ３に最も近い配列、およびマウス親に対する高度な相同性を持つ多くのヒトＦＲ４がある。この例では、抗ＣＤ２２抗体のＦＲ４を修繕するために、ヒトＤＯＢ配列を選択した（図２Ａ）。
【００５９】
抗ＣＤ２２抗体についてのＦＲ修繕ＶＨ配列の最終的設計（図３Ａ）は、ヒトＷＡＳ ＦＲ１およびＦＲ２，およびＧＡＬ ＦＲ３およびＤＯＢ ＦＲ４よりなり、抗ＣＤ２２抗体の元のＶＨ ＦＲを置き換える。ＦＲ修繕配列の最終設計において、マウスＦＲ残基の単一突然変異または再導入はない。
【００６０】
同様の戦略を用い、ＦＲ修繕した軽鎖（ＶＬ）についての配列設計は以下の通り行なった：
ａ．ＦＲ１：マウスＶＬのＦＲ１を修繕するために、ヒトＪＯＨを選択した。それは、高度の配列相同性、および親配列と同一であるＣＤＲ１に隣接する８つのアミノ酸のストレッチを有する（図２Ｂ）。
【００６１】
ｂ．ＦＲ２：同様の理由で、マウスＶＬのＦＲ２を修繕するために、ヒトＶｄ’ＣＬを選択した。４を超える同一配列がＣＤＲ１およびＣＤＲ２に隣接する（図２Ｂ）。
【００６２】
ｃ．ＦＲ３：マウスＶＬのＦＲ３を修繕するために、ヒトＷＥＳを選択した。ＦＲ３は最長の配列を有し、ＷＥＳおよびマウスＦＲ３の間の配列相同性は高く、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に近接する配列は同一である（図２Ｂ）。
【００６３】
ｄ．ＦＲ４：同様の理由で、マウスＶＬのＦＲ４を修繕するために、ヒトＲＺを選択した（図２Ｂ）。
【００６４】
抗ＣＤ２２抗体についてのＦＲ修繕ＶＬ配列の最終的設計（図３Ｂ）は、ヒトＪＯＨ ＦＲ１、Ｖｄ’ＣＬ ＦＲ２、ＷＥＳ ＦＲ３およびＲＺ ＦＲ４より成り、抗ＣＤ２２抗体の元のＶＬ ＦＲを置き換える。もう１度、ＦＲ修繕した配列の最終設計においてマウスＦＲ残基の突然変異または再導入はない。
【００６５】
ＦＲ修繕した重鎖および軽鎖遺伝子の構築
ＦＲ修繕した抗体の設計された重鎖および軽鎖可変領域配列は、種々の公表された方法を用い、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲの組合せを用いて組み立てられる（Ｌｅｕｎｇら，ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，ｏｐ．ｃｉｔ．；ＤｅＭａｒｔｉｎｏら，ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｊｏｎｅｓら，ｏｐ．ｃｉｔ．）。
【００６６】
ＦＲ修繕重鎖可変領域配列（配列番号１）を構築するには、全長ＤＮＡ配列を２つの半体：Ｎ末端半体およびＣ末端半体に分ける。両者をＰＣＲによって別々に構築し、完全な可変領域配列は、ＫｐｎＩ部位においてＮおよびＣ末端半体を接合することによって形成した。
Ｎ末端半体は以下のごとくに構築した：Ｎ鋳型（配列３）はＶＨ領域のアミノ酸１４ないし５０をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１１１量体）である（配列番号２）。該鋳型は２つのプライマーによってＰＣＲ増幅する；
５’プライマー（配列番号４）は、ＶＨ領域のアミノ酸１ないし１９をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（５７量体）である。プライマーの３’端部は１８ネクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【００６７】
３’プライマー（配列番号５）は、アミノ酸４３ないし５９をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４８量体）である。該プライマーは２１ヌクレオチドだけ鋳型と重複する。
【００６８】
Ｎ鋳型（配列番号３）は、標準的技術および手法を用い、５’および３’プライマー組（配列番号４および５）を用いてＰＣＲ増幅した。
【００６９】
Ｃ末端半体は以下のごとく構築した：Ｃ鋳型（配列番号６）はＶＨ領域のアミノ酸６８ないし１１１をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１３２量体）である（配列番号２）。該鋳型は２つのプライマーによってＰＣＲ増幅させた：
５’プライマー（配列番号７）は、ＶＨ領域のアミノ酸５５ないし７４をコード化する合成センス‐鎖オリゴヌクレオチド（６０量体）である。プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【００７０】
３’プライマー（配列番号８）は、ＶＨ領域のアミノ酸１０５ないし１２３をコード化する合成アンチセンス‐鎖オリゴヌクレオチド（５８量体）である。該プライマーおよび該鋳型は２１ヌクレオチドだけ重複する。
【００７１】
Ｃ鋳型（配列番号６）は、標準的技術および手法を用い、５’および３’プライマー組（配列番号７および８）を用いてＰＣＲ増幅させる。
【００７２】
全長ＦＲ修復ＲＦＢ４ ＶＨドメインの構築ではＮ鋳型（配列番号３、１１１量体）Ｃ鋳型（配列番号６、１３２量体）、およびそれらの核５’―および３’プライマー（Ｎ鋳型では配列番号４および５、およびＣ鋳型では配列番号７および８）を、自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏシステム ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成した。オリゴヌクレオチドはＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ−１０TMカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を通すことによって脱塩した。オリグヌクレオチドは２０μＭの最終濃度に調整した。種々の希釈（１０×、１００×、１０００×および１００００×等）における１μｌの鋳型オリゴヌクレオチドを、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ，１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．３，１５ｍＭのＭｇＣｌ2）および５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の存在下で、５μｌのそれらの対応するフランキングプライマーと混合した。この反応混合物を１００μｌの最終容量まで調整し、１分間の９４℃における変性、１分間の５０℃におけるアニーリング、および１分間の７２℃における重合よりなるＰＣＲ反応の３０サイクルに付した。ＰＣＲ反応混合物は、２％アガロースゲル電気泳動下で分析した。正しいサイズの充分に豊富な生成物を生起した最高鋳型希釈を、さらなる処理のために選択する。
【００７３】
ＮおよびＣ鋳型用の二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＫｐｎＩで制限消化した。制限したＮおよびＣ二本鎖ＤＮＡをＫｐｎＩ部位で連結し、連結した産物をＮ鋳型用の５’プライマー（配列番号４）およびＣ鋳型用の３’プライマー（配列番号８）を用いる更なるラウンドのＰＣＲ増幅に付した。〜３５０のサイズを持つＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に直接的にクローン化した。クローン化された断片の配列はサンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒら，ＰＮＡＳ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）によって、示されたＶＨ配列と同一であることが確認された。確認された配列を用いて、ＩｇＨプロモーター、Ｉｇエンハンサー、ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノム配列、および選択マーカーｇｐｔを含む重鎖発現ベクターのＶＨ配列を置き換えた。最終の重鎖発現ベクターをｈｐＲＦＢ４ｐＳＭｈと命名する。
【００７４】
ＦＲ修繕軽鎖可変領域配列（配列番号９）を構築するために、全長ＶＬ可変領域配列を２つの半体に分けた。Ｎ末端およびＣ末端半体をＰＣＲによって別々に組み立て、ＳｐｅＩ部位を介して一緒に接合した。
【００７５】
Ｎ末端半体は以下のごとく構築した：Ｎ鋳型（配列番号１１）は、ＶＬ領域のアミノ酸１１ないし４６をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１０８量体）である（配列番号１０）。鋳型は２つのプライマーによってＰＣＲ−増幅した。
【００７６】
５’プライマー（配列番号１２）はＶＬ領域のアミノ酸１ないし１７をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（５１量体）である。プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【００７７】
３’プライマー（配列番号１３）は、アミノ酸４０ないし５３をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４０量体）である。該プライマーは１８ヌクレオチドだけ鋳型と重複する。
Ｎ鋳型（配列番号１１）は、標準的技術および手法を用いて、５’および３’プライマーの組（配列番号１２および１３）を用いてＰＣＲを増幅させる。
【００７８】
Ｃ末端半体は以下のごとく構築した：Ｃ鋳型（配列番号１４）は、ＶＬ領域のアミノ酸５９ないし９８をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１２０量体）である（配列番号１０）。鋳型は二つのプライマーによってＰＣＲ‐増幅させた：
５’プライマー（配列番号１５）は、ＶＬ領域のアミノ酸５０ないし６５をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（４９量体）である。該プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【００７９】
３’プライマー（配列番号１６）は、ＶＬ領域のアミノ酸９２ないし１０７をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４８量体）である。該プライマーおよび該鋳型は２１ヌクレオチドだけ重複する。
【００８０】
Ｃ鋳型（配列番号１４）は、標準的技術および手法を用い、５’および３’プライマーの組（配列番号１５および１６）を用いてＰＣＲ増幅させる。
【００８１】
ＦＲ修繕ＲＦＢ４ ＶＬドメインの構築にはＮ鋳型（配列番号１１，１０８‐量体）、Ｃ鋳型（配列番号１４，１２０量体）、およびそれらの各５’および３’プライマー（Ｎ鋳型については配列番号１２および１３、およびＣ鋳型については配列番号１５および１６）を自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーで合成した。該オリゴヌクレオチドはＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ‐１０TMカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を通すことによって脱塩した。オリゴヌクレオチドは２０μＭの最終濃度に調整した。種々の希釈（１０×、１００×、１０００×および１０００×等）における１μｌの鋳型オリゴヌクレオチドを、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ2）および５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下で、５μｌのそれらの対応するフランキングプライマーと混合した。この反応混合物を１００μｌの最終容量に調整し、１分間の９４℃における変性、１分間の５０℃におけるアニーリング、および１分間の７２℃における重合よりなる３０サイクルのＰＣＲ反応に付した。ＰＣＲ反応混合物を２％アガロースゲル電気泳動下で分析した。正しいサイズの充分に豊富な産物を生起させる最高鋳型希釈をさらなる処理のために選択する。
【００８２】
ＮおよびＣ鋳型についての二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＳｐｅＩで制限‐消化した。制限されたＮ‐およびＣ二本鎖ＤＮＡをＳｐｅＩ部位で連結し、連結された産物を、Ｎ鋳型についての５’プライマー（配列番号１２）およびＣ鋳型についての３’プライマー（配列番号１６）を用いるもう一つのラウンドのＰＣＲ‐増幅に付した。〜３２０のサイズを持つＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化した。クローン化した断片の配列はサンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒ ｏｐ．ｃｉｔ．）によって、設計されたＶＬ配列と同一であることが確認された。確認された配列を用いて、ＩｇＨプロモーター、Ｉｇエンハンサー、ヒト・カッパ定常領域ゲノム配列、および選択マーカーｈｙｇを含む軽鎖発現ベクターのＶＬ配列を置き換えた。最終の軽鎖発現ベクターをｈｐＲＦＢ４ｐＳＭｋと命名する。
【００８３】
ＦＲ修繕した抗体の発現および親和性
発現プラスミドｈｐＲＦＢ４ｐＳＭｈおよびｈｐＲＦＢ４ｐＳＭｋを線状化し、マウスＳｐ２／０細胞に共トランスフェクトした。該プラスミドでトランスフェクトされた細胞を、標準的な方法によって、該プラスミド上のｇｐｔおよびｈｙｇ遺伝子によって付与されたマイコフェノール酸および／またはヒグロマイシンＢの存在下で選択した。選択で生存する細胞を、ＥＬＩＳＡ法を用い、ヒト抗体分泌につきテストした。ヒト抗体を分泌していると同定されているクローンを、５００ｍｌのローラー瓶中で生産用に拡大培養した。抗体は、標準的なプロテインＡカラムを用いて精製した。精製された抗体を、還元および非‐還元の双方の条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで分析した（図４）。ＦＲ修繕抗体（ｈｐＲＦＢ４）の親和性をフローサイトメトリーによってまず評価した。１％ＦＣＳおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを補足した最終容量１００μｌのＰＢＳ（ＰＢＳ‐ＦＡ）中で、１μｇの精製されたｈｐＲＦＢ４またはキメラＲＦＢ４（ｃＲＦＢ４）と共にＲａｊｉ細胞（５×１０5）を培養した。ｃＲＦＢ４は、改変することなくマウス親から直接由来した可変領域配列中のｈｐＲＦＢ４とは異なる。混合物を４℃において３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄して、未結合抗体を除去した。Ｒａｊｉ細胞への抗体の結合レベルは、最終容量１００μｌのＰＢＳ‐ＦＡ中に２０×希釈されたＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１、Ｆｃ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ ＧｒｏｖｅＰＡ）を添加し、４℃において３０分間インキュベートすることによって評価した。混合物をＰＢＳ３回洗浄し、ＦＡＣＳＣＡＮ蛍光細胞分析分離装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって蛍光強度を測定した（図５）。結果は、双方の抗体が同様な親和性をもってＲａｊｉ細胞によく結合したことを示した。
【００８４】
ＲＦＢ４のＶＨおよびＶＬ配列の再作成前および後に抗体の親和性を比較するために、競合結合アッセイを行なった。固定した量（ストックからの１０×希釈）のＦＴＴＣ‐コンジュゲーテッドＲＦＢ４（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）を変化させる濃度のｃＲＦＢ４またはｈｐＲＦＢ４いずれかと混合した。混合物をＰＢＳ‐ＦＡ中の最終容量１００μｌにてＲａｊｉ細胞に添加し、４℃にて３０分間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＩＴＣ‐ＲＦＢ４と結合したＲａｊｉ細胞の蛍光強度をＦＡＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって測定した。結果は、ＲＦＢ４配列のＦＲ修繕は、再作成された抗体の親和性に対して有意な効果を有しないことを示した（図６）。
【００８５】
実施例２
ＦＲ修繕した抗ＣＤ２０抗体
ＦＲ修繕した抗ＣＤ２０軽鎖および重鎖についての遺伝子の設計
マウス抗ＣＤ２０抗体１Ｆ５（Ｒｅｆ．）の重鎖および軽鎖配列を例として用いて、ＦＲ修繕を用いて再作成された抗体の免疫原性を低下させるか、または排除するアプローチを説明する。マウス抗体についての重鎖および軽鎖可変領域の配列を図（７）に示す。
【００８６】
１Ｆ５についてのＦＲ修繕免疫グロブリンのアミノ酸配列の設計において、前記した規則の同一の組が適用される。しかしながら、全ての前記した要件を満たす適当なＦＲがない状況が常にある。ＦＲ修繕アプローチはかなりの程度の柔軟性を提供し、問題のＦＲへのマウス残基の導入、別法として、改変なくして元のマウスＦＲを含ませることを可能とする。得られたＦＲ修繕抗体は、恐らくは、マウスまたはキメラ抗体と比較して有意に低下した免疫原性を有するであろう。抗ＣＤ２０抗体１Ｆ５を、これらの点を説明するためにＦＲ修繕についての例として用いる。
【００８７】
１Ｆ５ＶＨ配列の個々のＦＲの修繕は以下のごとく行なった：
ａ．ＦＲ１：マウスＶＨのＦＲ１配列を、Ｋａｂａｔのデータベース（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）からのヒトＶＨのＦＲ１配列と比較した。最高の配列相同性のヒトＦＲ１が、特に、ＣＤＲ１に最も近い配列において好ましい。ＬＳ２‘ＣＬからのヒトＦＲ１配列はマウス抗ＣＤ２０抗体のそれに対して８０％近くの配列相同性を有し、ＣＤＲ１に隣接する１０の残基はマウス親配列と同一である。従って、ＬＳ２’ＣＬからのヒトＦＲ１配列を、抗ＣＤ２０抗体のＦＲ１を修繕するために選択した（図８Ａ）。
【００８８】
ｂ．ＦＲ２：抗ＣＤ２０抗体のＦＲ２配列を修繕するために、ヒトＮＥＷＭのＦＲ２配列を選択した。ＣＤＲ１に最も近いＮＥＷＭ ＦＲ２の第三の残基はマウス親配列のそれと同一ではないが、それは保存されたＫからＲへの変換である（図８Ａ）。
【００８９】
ｃ．ＦＲ３：満足すべき高い配列相同性を持つヒト重鎖ＦＲ３配列およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３に隣接する同一配列は同定することができなかった。７８３Ｃ’ＣＬからのヒトＦＲ３は７８％の配列相同性を呈したが、ＣＤＲ２に近接してそれを挟む残基は、差が保存されているにもかかわらず、劇的に異なった。例えば、ＣＤＲ２に最も近い一番目、二番目および四番目の残基である位置５７、５８および６０（Ｋａｂａｔのナンバリング，Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）におけるＫ、ＡおよびＬは、各々、保存されたヒト残基Ｒ、ＶおよびＩによって置き換えられる。それにもかかわらず、ＣＤＲ２に近接する多数の変化は、保存的であるが、その結果、抗原結合部位においてかなり立体配座が変化し得る。親和性の喪失の危険性なくして、かつＦＲ修繕アプローチの柔軟性に対する説明として、ＦＲ３はヒトＦＲのいずれかで修繕されないであろう。その代わり、マウスＦＲ３配列をこの特定の抗体で保持させた（図８Ａ）。
【００９０】
ｄ．ＦＲ４：ＣＤＲ３に最も近い配列が同一であり、マウス親に対する高度な相同性を持つ多くのヒトＦＲ４がある。この例においては、抗ＣＤ２０抗体のＦＲ４を修繕するために、ヒト４Ｇ１２’ＣＬ配列を選択した（図８Ａ）。
【００９１】
抗ＣＤ２０抗体についてのＦＲ修繕ＶＨ配列の最終設計（図９Ａ）は、ヒトＬＳ２’ＣＬ ＦＲ１、ＮＥＷＭ ＦＲ２、マウス１Ｆ５ ＦＲ３および４Ｇ１２’ＣＬ ＦＲ４よりなり、マウス抗ＣＤ２０抗体の元のＶＨ ＦＲ’を置き換える。
【００９２】
代替設計は、ヒトＬＳ２’ＣＬ ＦＲ１、ＮＥＷＭ ＦＲ２，７８３Ｃ’ＣＬ ＦＲ３、および４Ｇ１２’ＣＬ ＦＲ４に埋められたマウスＣＤＲを含む修繕されたＶＨであろう（図１０Ａ）。説明の目的で、前者のバージョンの構築を以下に記載する。
【００９３】
同様の戦略を用い、ＦＲ修繕軽鎖についての配列設計は以下のごとく構築した：
ａ．ＦＲ１：マウスＶＬのＦＲ１を修繕するために、ヒトＢＪ１９を選択した。これは、マウス親に対して最高の相同性を持つヒトＦＲ１配列である（６１％）。さらに、マウスのそれとは異なるヒト残基のいくつかは保存されている。例えば、各々、位置１８および１９におけるＥからＤ、およびＫからＲの変換は保存された変化である（図８Ｂ）。
【００９４】
ｂ．ＦＲ２：マウスＦＲ２に対して高い配列相同性（７３％）であることが判明したヒトＦＲ２、ＭＯＴがあるが、位置３２（Ｋａｂａｔのナンバリング，Ｋａｂａｔらｏｐ．ｃｉｔ．）におけるトリプトファン、ＣＤＲ２に最も近い三番目の残基を、ＭＯＴ ＦＲ２配列中の非保存的バリンで置き換えた。この置き換えは、潜在的に、抗原結合部位の最終立体配座に対して有意な影響を有するであろう。従って、ＶＬドメインのマウスＦＲ２はＦＲ修繕抗体の設計で残すと判断した（図８Ｂ）。
【００９５】
ｃ．ＦＲ３：マウスＶＬのＦＲ３を修繕するために、ヒトＷＥＳを選択した。ＦＲ３は最も長い配列を有し、ＷＥＳおよびマウスＦＲ３の間の配列相同性は７１％であり、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に近接してそれを挟む三つのヒト残基はマウスのそれと同一である（図８Ｂ）。
【００９６】
ｄ．ＦＲ４：同様の理由で、マウスＶＬのＦＲ４を修繕するために、ＮＩＧ‐５８からのヒトλ ＦＲ４配列を選択した。該配列は、ヒトおよびマウスの間で同一であるＣＤＲ３に隣接する７残基のストレッチに対して７２％相同性である（図８Ｂ）。
【００９７】
抗ＣＤ２０抗体についてのＦＲ修繕ＶＬ配列の最終設計（図９Ｂ）は、ヒトＢＪ１９ ＦＲ１、マウス１Ｆ５ ＦＲ２、ＷＥＳ ＦＲ３、およびＮＩＧ‐５８ ＦＲ４よりなり、抗ＣＤ２０抗体の元のＶＬ ＦＲを置き換える。ＦＲ修繕ＶＬの代替設計はヒトＢＪ１９ ＦＲ１、ＭＯＴＦＲ２、ＷＥＳ ＦＲ３、およびＮＩＧ‐５８ ＦＲ４よりなり、ＣＤＲループを支持する足場を形成する（図１０Ｂ）。本出願における説明の目的で、前者のＦＲ修繕ＶＬの構築のみを以下に記載する。
【００９８】
ＦＲ修繕重鎖および軽鎖遺伝子の構築
種々の公表された方法を用い、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲの組合せによって、ＦＲ修繕抗体の設計された重鎖および軽鎖可変領域配列を組み立てた。
【００９９】
ＦＲ修繕重鎖可変領域配列（配列番号１７）を構築するために、全長ＤＮＡ配列を二つの半体に分けた。Ｎ末端半体およびＣ末端半体をＰＣＲによって別々に構築し、ＳｐｅＩ部位においてＮ‐およびＣ末端半体を接合することによって、完全な可変領域配列を形成する。
【０１００】
Ｎ末端半体は以下のごとく構築した：Ｎ鋳型（配列番号１９）は、ＶＨ領域のアミノ酸１２ないし４９をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１１４量体）である（配列番号１８）。該鋳型を二つのプライマーによってＰＣＲ増幅する：
５’プライマー（配列番号２０）は、ＶＨ領域のアミノ酸１ないし１９をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（５７量体）である。プライマーの３’末端は、２４ヌクレオチドだけ鋳型の５’末端と重複する。
【０１０１】
３’プライマー（配列番号２１）は、アミノ酸４３ないし６０をコード化する合成アンチセンス‐鎖オリゴヌクレオチド（５５量体）である。該プライマーは２１ヌクレオチドだけ鋳型と重複する。
【０１０２】
標準的な技術および手法を用い、Ｎ鋳型（配列番号１９）を、５’および３’プライマーの組（配列番号２０および２１）を用いてＰＣＲ増幅する。
【０１０３】
Ｃ末端半体は以下のごとく構築した：Ｃ鋳型（配列番号２２）は、ＶＨ領域のアミノ酸７０ないし１１１をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１２６量体）である（配列番号１８）。該鋳型は二つのプライマーによってＰＣＲ‐増幅した：
５’プライマー（配列番号２３）は、ＶＨ領域のアミノ酸５７ないし７６をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（６１量体）である。該プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【０１０４】
３’プライマー（配列番号２４）は、ＶＨ領域のアミノ酸１０５ないし１２３をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（５９量体）である。該プライマーおよび該鋳型は２１ヌクレオチドだけ重複する。
【０１０５】
標準的な技術および手法を用い、Ｃ鋳型（配列番号２２）を、５’および３’プライマーの組（配列番号２３および２４）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１０６】
ＦＲ修繕１Ｆ５ ＶＨドメインの構築のために、Ｎ鋳型（配列番号１９、１１４‐量体）、Ｃ鋳型（配列番号２２、１２６量体）、およびそれらの各５’および３’プライマー（Ｎ鋳型については配列番号２０および２１、およびＣ鋳型については配列番号２３および２４）を自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーによって合成した。ＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ‐１０TMカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を通すことによって、オリゴヌクレオチドを脱塩した。オリゴヌクレオチドを２０μＭの最終濃度に調整した。１０μｌの１０× ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ2）および５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下で、種々の希釈（１０×、１００×、１０００×および１００００×等）における１μｌの鋳型オリゴヌクレオチドを５μｌのそれらの対応するフランキングプライマーと混合した。この反応混合物を１００μｌの最終容量に調整し、１分間の９４℃における変性、１．５分間の５０℃におけるアニーリング、および１分間の７２℃における重合よりなる３０サイクルのＰＣＲ反応に付した。２％アガロースゲル電気泳動下で、ＰＣＲ反応混合物を分析した。正しいサイズの充分に豊富な産物を生起させた最高の鋳型希釈をさらなる処理のために選択する。
【０１０７】
ＮおよびＣ鋳型についての二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＫｐｎＩ部位で制限消化した。ＮおよびＣ二本鎖ＤＮＡをＳｐｅＩ部位で連結し、連結された産物を、Ｎ鋳型についての５’プライマー（配列番号１９）およびＣ鋳型についての３’プライマー（配列番号２２）を用いるもう一つのラウンドのＰＣＲ増幅に付した。〜３５０のサイズを持つＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化した。クローン化された断片の配列は、サンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒら，ｏｐ．ｃｉｔ．）によって設計されたＶＨ配列と同一であることが確認された。確認された配列を用いて、ＩｇＨプロモーター、Ｉｇエンハンサー、ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノム配列、および選択マーカーｇｐｔを含む重鎖発現ベクターのＶＨ配列を置き換えた。最終の重鎖発現ベクターをｈｐ１Ｆ５ｐＳＭｈと命名する。
【０１０８】
ＦＲ修繕軽鎖可変領域配列（配列番号２５）を構築するために、全長ＶＬ可変領域配列を二つの半体に分ける。Ｎ末端およびＣ末端半体をＰＣＲによって別々に組み立て、ＢｓｐＥＩ部位を介して一緒に連結させる。
【０１０９】
Ｎ末端半体は以下のごとく構築した：Ｎ鋳型（配列番号２７）は、ＶＬ領域のアミノ酸９ないし５１をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１２９量体）である（配列番号２６）。該鋳型は二つのプライマーによってＰＣＲ増幅した：
５’プライマー（配列番号２８）は、ＶＨ領域のアミノ酸１ないし１５をコード化する合成センス‐鎖オリゴヌクレオチド（４５‐量体）である。該プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【０１１０】
３’プライマー（配列番号２９）は、アミノ酸４５ないし５７をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４０量体）である。該プライマーは２１ヌクレオチドだけ鋳型と重複する。
【０１１１】
標準的な技術および手法を用い、Ｎ鋳型（配列番号２７）を、５’および３’プライマーの組（配列番号２８および２９）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１１２】
Ｃ末端半体は以下のごとく構築した：Ｃ鋳型（配列番号３０）は、ＶＨ領域のアミノ酸６１ないし１００をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１２０量体）である（配列番号２６）。該鋳型は二つのプライマーによってＰＣＲ増幅する：
５’プライマー（配列番号３１）は、ＶＨ領域のアミノ酸５４ないし６７をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（４３量体）である。該プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【０１１３】
３’プライマー（配列番号３２）は、ＶＨ領域のアミノ酸９４ないし１０７をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４２量体）である。該プライマーおよび鋳型は２１ヌクレオチドだけ重複する。
【０１１４】
標準的な技術および手法を用い、Ｃ鋳型（配列番号３０）を、５’および３’プライマーの組（配列番号３１および３２）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１１５】
ＦＲ修繕１Ｆ５ＶＬドメインの構築のために、Ｎ鋳型（配列番号２７、１２９‐量体）、Ｃ鋳型（配列番号３０、１２０量体）およびそれらの各５’および３’プライマー（Ｎ鋳型についての配列番号２８および２９、およびＣ鋳型についての配列番号３１および３２）を自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーで合成した。ＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ−０TMカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を通すことによって、オリゴヌクレオチドを脱塩した。オリゴヌクレオチドを２０μＭの最終濃度に調整した。１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ2）および５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下で、種々の希釈（１０×、１００×、１０００×および１００００×等）における１μｌの鋳型オリゴヌクレオチドを５μｌのそれらの対応するフランキングプライマーと混合した。この反応混合物を１００μｌの最終容量に調整し、１分間の９４℃における変性、１．５分間の５０℃におけるアニーリング、および１分間の７２℃における重合よりなる３０サイクルのＰＣＲ反応に付した。２％アガロースゲル電気泳動下、ＰＣＲ反応混合物を分析した。正しいサイズの充分に豊富な産物を生起した最高の鋳型希釈を更なる処理のために選択する。
【０１１６】
ＮおよびＣ鋳型についての二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル‐精製し、ＳｐｅＩ部位で制限消化した。ＮおよびＣ二本鎖ＤＮＡをＢｓｐＥＩ部位において連結し、Ｎ鋳型についての５’プライマー（配列番号１２）およびＣ鋳型についての３’プライマー（配列番号１６）を用いて増幅した。〜３２０のサイズを持つＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化した。クローン化された断片の配列は、サンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒら，ｏｐ．ｃｉｔ．）によって設計されたＶＬ配列と同一であることが確認された。確認された配列を用いて、ＩｇＨプロモーター、Ｉｇエンハンサー、ヒト・カッパ定常領域ゲノム配列、および選択マーカーｈｙｇを含む軽鎖発現ベクターのＶＬを置き換えた。最終の軽鎖発現ベクターはｈｐ１Ｆ５ｐＳＭｋと命名する。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】マウス抗ＣＤ２２抗体ＲＦＢ４の重鎖（ＶＨ（Ａ））および軽鎖（ＶＬ（Ｂ））可変領域のアミノ酸配列（一文字コード）。ＣＤＲは四角で囲われている。
【図２Ａ−Ｂ】最高の相同性の異なるヒトＦＲにての、ＲＦＢ４の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域の区画化されたフレームワーク配列（ＦＲ）の比較。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を示す。ＣＤＲは四角で囲われている。ＦＲ配列の左側の括弧に入れたイタリック体はヒトＦＲの源を示す。対応するマウスＦＲのそれとは異なるヒトＦＲにおけるアミノ酸は太字で示す。
【図３】ＦＲ修繕抗体ｈｐＲＦＢ４の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域の最終設計配列（一文字コード）。ＣＤＲは四角で囲われている。元のマウスＦＲのそれとは異なるヒトＦＲにおけるアミノ酸を太字で示す。
【図４】還元および非還元双方の条件下での、精製されたｃＲＦＢ４およびｈｐＲＦＢ４のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析。
【図５】Ｒａｊｉ細胞に対するｃＲＦＢ４およびｈｐＲＦＢ４の結合特異性および親和性についてのフローサイトメトリー分析。対照として無関係な抗体を用いた。
【図６】ｃＲＦＢ４およびｈｐＲＦＢ４の間の結合親和性を比較する競合結合アッセイ。
【図７】マウス抗ＣＤ２０抗体１Ｆ５の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列（一文字コード）。ＣＤＲは四角で囲われている。
【図８Ａ−Ｂ】最高の相同性の異なるヒトＦＲを持つ１Ｆ５の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域の区画化フレームワーク配列（ＦＲ）の比較。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４が示される。ＣＤＲは四角で囲われている。ＦＲ配列の左側の横の括弧に入れたイタリック体は、ヒトＦＲの源を示す。対応するマウスＦＲのそれとは異なるヒトＦＲにおけるアミノ酸を太字で示す。
【図９】ＦＲ修繕抗体ｈｐ１Ｆ５の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）の最終設計配列（一文字コード）。ＣＤＲは四角で囲われている。元のマウスＦＲのそれとは異なるヒトＦＲにおけるアミノ酸を太字で示す。ヒト配列によって置き換えていないマウスＦＲに下線を施す。
【図１０】１Ｆ５についてのＦＲ修繕可変領域の代替設計のアミノ酸配列（代替設計）。ＣＤＲは四角で囲われている。対応するマウスフレームワークのそれとは異なるヒトフレームワークアミノ酸は太字で示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ここにその内容を本出願に一体化させる２００１年６月２７日に出願された米国シリアル番号０９／８９２，６１３の利益を主張する。
【０００２】
本出願を通じて、種々の文献を括弧に入れて引用する。これらの刊行物の全内容の開示を、ここに、引用して本出願に一体化させ、本発明が属する技術水準をより充分に記載する。
【０００３】
本発明は、臨床的適応症（治療および診断双方）に関して抗体を再作成し、または再構成するにおける新規な方法に関する。該方法は組換え技術および抗体配列を再設計するにおける段階的および全体的アプローチの使用を組み合わせる。本発明は、特に、イン・ビボで用いた場合に未改変カウンターパートよりも免疫原性が低いように改変された抗体を提供する。
【背景技術】
【０００４】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、癌、移植、ウイルス感染等を含めた種々の病気の治療で用いられる最も成功した蛋白質薬剤となった。しかしながら、モノクローナル抗体の使用に関して問題があったので、魔法の弾丸の概念は実現するのに２５年より長きを要した。主な問題の１つは、齧歯類およびマウス源のものであるほとんどのモノクローナル抗体の元来の源に由来する。これらの外来性蛋白質のヒトへの反復された注入は、不可避的に、抗体に対する宿主免疫応答：いわゆるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の誘導をもたらす。キメラ抗体（例えば、ヒト定常領域に連結したマウス可変領域）を構築するための分子工学の技術を用いる初期の試みは、ＨＡＭＡ応答を軽減するのに幾分効果的であったが、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答を誘導するのに充分に免疫原性であり得る全抗体配列の１／３を構成するマウス可変配列の大きなストレッチが依然としてある。抗体工学におけるより進歩した改良は、最近、ドナーマウスまたはラットの免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトフレームワーク領域に移植されたヒト化抗体を創製するのに利用されてきた（例えば、引用してここに一体化させるＥＰＯ公開番号０２３９４００）。該プロセスは「ヒト化」または「ＣＤＲ移植」と呼ばれる。ヒト化の元来の概念は、ヒトフレームワークへのＣＤＲの直接的移植を記載し、非−ヒト配列を５％未満まで低下させ、それにより、ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡ応答を低下させる。しかしながら、さらなる改変のないフレームワーク配列の直接的置き換えは、時々、１０倍以上もと大きな抗原に対する親和性を喪失しかねない（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｖｅｒｈｏｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６，１９８８）。ＣＤＲ移植された、またはヒト化された抗体の親和性を維持するためには、選択された位置におけるドナー免疫グロブリンからの対応するアミノ酸での、アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワークアミノ酸の置き換えが必要であろう。置き換えが起こる位置は公開された基準の組によって決定される（引用してここに一体化させる米国特許第５，８５，０８９号；米国特許第６９３，７６２号；米国特許第５，６９３，７６１号）。しかしながら、ヒトフレームワーク配列のストレッチ内のマウスアミノ酸の存在は、新しいＴおよびＢ細胞エピトープの創製において免疫原性であり得る。さらに、置き換えるべき適切なフレームワークアミノ酸の同定は時々困難であり得、さらに、ヒト化抗体の特異性および親和性に対する有意なインパクトなくしてヒト化における成功の機会を低下させる。
【０００５】
親抗体の特異性および親和性を維持しつつ免疫原性が低下した、または排除された再作成免疫グロブリンを生産する新しくかつ改良された手段が従って必要とされる。好ましくは、再作成された免疫グロブリンは、ＴまたはＢ細胞についての免疫原性エピトープの源であり得る、親抗体からのＦＲアミノ酸置換を含むべきではない。しかしながら、該アプローチは、少数のマウス残基またはマウス配列のストレッチを最終設計に含ませることができる配列設計における柔軟性を供し、最終の目標は、ヒトで用いるため得られた抗体の特異性および親和性を維持しつつ免疫原性を低下させることである。本発明はこれらの目標を満たすにおける方法およびアプローチを記載する。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ドナー免疫グロブリンからの一般に１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および１以上のヒトまたは霊長類免疫グロブリンからのフレームワーク配列の部分を有する免疫グロブリン鎖を再作成するための新規な方法に関する。好ましい方法は、まず、全ての種の免疫グロブリンからのフレームワーク配列を、Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｍａｒｙｌａｎｄ：ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，１９９１）に従ってＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の区画化されたサブ領域に分割し、次いで、親免疫グロブリンの可変領域アミノ酸配列サブ領域における、全フレームワークの代わりに個々のＦＲを、ヒトまたは霊長類免疫グロブリン鎖の収集における対応する配列と比較し、次いで、最高程度の相同性を持つ適当なヒトまたは霊長類ＦＲを選択して、親免疫グロブリンの元来のＦＲを置き換えることを含む（フレームワーク−またはＦＲ修繕）。ヒトＦＲは１を超えるヒトまたは霊長類免疫グロブリン配列から選択することができる。ヒトまたは霊長類免疫グロブリン配列の収集は異なるデータベース（例えば、Ｋａｂａｔデータベース、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ インターネット等）から得ることができる。ヒトまたは霊長類免疫グロブリンから選択された個々のＦＲ配列は、典型的には、対応する親ＦＲ配列に対して６０％以上の相同性を有するであろう。高い総じての相同性が修復用のＦＲを選択するための重要な基準であろうが、もしＣＤＲに直接隣接する、あるいは抗原結合部位と接触するループ位置における配列の相同性がコンピューターモデリングを介して実験的に決定されるか、または予測されれば、より低い相同性のＦＲが用いられるであろう。そのＦＲが修復されるべき親免疫グロブリンは重鎖または軽鎖いずれかであり得る。修復された軽鎖および重鎖を用いて、部分的または全長ヒト定常領域を含むまたは含まない、２つの軽鎖／重鎖対を有する完全なＦＲ−修復免疫グロブリンまたは抗体を形成することができる。
【０００７】
（重鎖および軽鎖双方に適用される）親免疫グロブリン鎖を修復するために選択された個々のＦＲは：
（１）好ましくは、親免疫グロブリン鎖のそれと同一のＣＤＲに直ちに隣接するアミノ酸配列を有し；
（２）親免疫グロブリン鎖のそれと、もし完全でなくても同一の、構造において保存的に類似であるＣＤＲに直ちに隣接するアミノ酸配列を有し；
（３）好ましくは、三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲ（または効果的な抗原結合部位）から約３Å内にあり、かつ抗原、または親またはＦＲ修復免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用できると予測される親免疫グロブリンの対応するＦＲ位置において同一アミノ酸を有し；
（４）三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲ（または効果的な抗原結合部位）から約３Å内にあり、かつ抗原、または親またはＦＲ修復免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用できると予測される親免疫グロブリンの対応するＦＲ位置におけるアミノ酸と構造において保存的に類似するアミノ酸を有するべきである。
【０００８】
ＦＲ修復免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の各々は、典型的には、選択基準のいずれか１つまたは全てに従う１以上のヒトまたは霊長類免疫グロブリンからのＦＲ源を含む。本発明のＦＲ修復重鎖および軽鎖は、無傷抗体、抗体断片、または抗体−ベースの誘導体（例えば、一本鎖抗体、ダイアボディー等）と組み合わせた場合、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、抗原に対して親免疫グロブリンと実質的に同一の親和性および特性（例えば、結合に際しての内部化）を保持する。これらの親和性レベルは、抗原に対する親免疫グロブリンの元来の親和性の４倍の範囲内、好ましくは約２倍内で変化すべきである。
【０００９】
同様の原理が、異なる種からのＦＲを持つ一つの種の親免疫グロブリンを再作成するか、または修繕するのに適用される。蛋白質および／または分子工学の分野における当業者は、ＦＲ‐修復免疫グロブリン、またはその誘導体を得るために本発明の設計および原理を採用することができるであろう。一旦設計されれば、例えば、部位特異的突然変異誘発および遺伝子‐合成によってＦＲ修繕免疫グロブリン配列を構築するにおいて種々の技術が存在する。プロデューサー細胞系におけるトランスフェクションのための適当な免疫グロブリン定常重鎖および軽鎖を含む発現ベクターに、組み立てられたＦＲ修繕配列をサブクローン化する。細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞を含めた、異なる細胞系をＦＲ修繕免疫グロブリンの生産で用いることができる。
【００１０】
別法として、免疫グロブリンはトランスジェニックまたはトランスクマティック動物の乳中で、またはトランスジェニック植物中の貯蔵蛋白質として生産することができる。本発明は、結合親和性を犠牲とすることなく、かつ親免疫グロブリンのフレームワークアミノ酸の導入から得られた新しいＴおよびＢ細胞エピトープをヒトＦＲに導入する尤度なくして、免疫原生が低下したまたは排除された免疫グロブリンを創製するにおいて比較的容易で（ＣＤＲと相互作用する重要なＦＲアミノ酸を同定する必要無し）高度に柔軟性のある（もし必要であれば、個々のＦＲのマッチおよび変化に対する自由度）改良された新規な方法を提供する。ＦＲ修繕抗体は、単独で、あるいは他の免疫グロブリンまたは治療様式と組み合わせて用いられる、裸の形態のまたは融合または化学的コンジュゲートとして、低い（１０ｍｇ／ｍ2未満）または高い（１００ｍｇ／ｍ2を超える）用量で、単回で、または反復して用いられ、種々の病気を治療するのにヒトで用いるのに適当であろう。
【００１１】
発明の詳細な記載
本発明は、「フレームワーク（ＦＲ）修繕」と命名されたプロセスを介して、ヒトまたは霊長類の配列に対して高度な相同性を持つ免疫グロブリンの設計における新しいアプローチを確立することを目的とする。ＦＲ修繕免疫グロブリン（以後、修繕された免疫グロブリン）は、ヒトで用いる場合、実質的に低下した、または排除された免疫原性を有し、特異的抗原に対する親免疫グロブリンの特異性および親和性を維持しつつ、特異的抗原およびエフェクター機能（例えば、補体固定、ＡＤＣＣ等）を標的化する能力のごときヒト免疫グロブリンの特徴のほとんどまたは全てを担うであろう。修繕された免疫グロブリンは、そのうち、各可変領域が、Ｋａｂａｔの分類（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ）に従って、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を表わす配列を含む重鎖および軽鎖を含むであろう。１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む各親免疫グロブリン鎖の４つのＦＲの少なくとも一つは、対応するヒトまたは霊長類ＦＲで置き換えるか、またはそれで「修繕される」であろう。親免疫グロブリン鎖の２以上のＦＲを置き換えるべき場合、それらは同一のヒトまたは霊長類免疫グロブリンからの、または同一サブグループ内の、または異なるサブグループにおける異なるヒトまたは霊長類免疫グロブリンからの、またはヒトおよび霊長類免疫グロブリンの組合せからの対応するＦＲで修繕することができる。修繕された免疫グロブリンは典型的な医薬周辺において大規模生産用の適当な宿主系で発現され、適当な様式または組合せでヒトで用いて、広い範囲のヒトの病気を治療または検出するであろう。
【００１２】
本発明の良好な理解を保証するために、いくつかの定義を記載する。本明細書中で用いるごとく、「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコード化された１以上のポリペプチドよりなる蛋白質をいう：典型的な免疫グロブリン蛋白質は、対になった２つの重鎖と２つの軽鎖を含む。全長免疫グロブリン重鎖はサイズが約５０ｋＤであり（長さがほぼ４４６アミノ酸）、重鎖可変領域遺伝子（約１６０アミノ酸）および定常領域遺伝子によってコード化される。アルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミュー配列のごとき異なるイソタイプの重鎖定常領域をコード化する異なる定常領域遺伝子がある。全長免疫グロブリン軽鎖はサイズが約２５ｋＤであり（長さがほぼ２１４アミノ酸）、軽鎖可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコード化される。天然に生じる免疫グロブリンは、通常、各対が一つの軽鎖および一つの重鎖を有する免疫グロブリン鎖の二つの同一対よりなるテトラマーの形態の抗体として知られる。各対においては、軽鎖および重鎖可変領域は、一緒に、抗原への結合を担い、定常領域は抗体に典型的なエフェクター機能を担う。
【００１３】
免疫グロブリンはＦｖ（Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５８７９−５８３３；Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８）、ダイアボディー、ミニ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、二官能性ハイブリッド抗体（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５，１９８７）のごとき天然に生じる、化学的に改変された、または遺伝子工学的に作成されたのいずれかの異なる形態であり得る（一般に、Ｈｏｏｄら，「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，ＮＹ，第２版，１９８４；ＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ ３２３：１５−１６，１９８６参照）。
【００１４】
重鎖および軽鎖双方の可変領域は、Ｋａｂａｔのデータベース（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）で定義されているごとく、超可変配列の３つのストレッチ、または相補性決定領域（ＣＤＲ）によって中断された、４つのフレームワークサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含むセグメントに分類され、ＣＤＲ１はＦＲ１およびＦＲ２の間に位置し、ＣＤＲ２はＦＲ２およびＦＲ３の間に位置し、およびＣＤＲ３はＦＲ３およびＦＲ４の間に位置する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定のサブ領域を特定することなく、他の者によって言及されるフレームワーク領域は単一の天然に生じる免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。本明細書中で用いるごとく、ＦＲは、４つのサブ領域のうちの一つを表し、ＦＲ類はフレームワーク領域を構成する４つのサブ領域の２以上を表す。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域であり、ＣＤＲを位置決定し、それを整列させるように働く。ＣＤＲは、一義的には、結合特異性および親和性を抗原のエピトープに付与する抗体の結合部位の形成を担う。
【００１５】
親抗体は、低下したまたは最小化された免疫原生でもって、異なる種、例えば、ヒトに用いるのに適した形態、配列または構造に再作成し、再構成するか、または本発明ではＦＲ修繕すべき、特定の種、例えば、マウスの抗体である。
【００１６】
キメラ抗体は、親Ｖ‐領域配列からの優位な配列改変なくして、異なる種の対応する重鎖および軽鎖定常領域にその可変領域が連結された抗体である。キメラ抗体の構築は、通常、可変領域をコード化するＤＮＡ配列を、対応する定常鎖をコード化するＤＮＡ配列に連結することによって達成される。最も普通のタイプのキメラ抗体は、マウス可変領域およびヒト定常領域を含むものである。この場合、発現されたハイブリッド分子は、親マウス抗体の結合特異性および親和性、およびヒト抗体のエフェクター機能を有するであろう。最も重要には、組換え蛋白質のアミノ酸の２／３はヒト起源であり、従って、治療キメラ抗体のＣ２Ｂ８（またはＲｉｔｕｘａｎ）の場合におけるごとく、ヒトで用いた場合、低下したまたは有意でない免疫原性が予測される（Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１８５１−１８５７，１９９９；Ｃｏｉｆｆｉｅｒら，Ｂｌｏｏｄ ９２：１９２７−１９３２，１９９８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：２８２５−２８３３，１９９８）。
【００１７】
「ヒト化」免疫グロブリンは、一般に、ヒトフレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリンからの１以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンとして受け止められている（Ｊｏｎｅｓら，ｏｐ．ｃｉｔ；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，ｏｐ．ｃｉｔ；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，ｏｐ．ｃｉｔ．）。ＣＤＲを供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。通常、他の者によって用いられ、言及されてきたごとくアクセプターは単一のヒト免疫グロブリン種に由来する。「ヒト化」免疫グロブリンの親和性を維持するために、ドナーのアミノ酸残基は、アクセプター免疫グロブリンのフレームワーク領域に一体化されなければならないであろう。一連の刊行物（引用してここに一体化させる米国特許第５，８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，６９３，７６１号）に公表されているごとく、ドナー配列への変換用のアクセプター免疫グロブリン内の限定された数のアミノ酸を選択する基準の組がある。ヒト化免疫グロブリンは定常領域を含んでも含まなくてもよい。ヒト化重鎖免疫グロブリンは、対応するヒト重鎖定常領域を含むヒト化免疫グロブリンであり、ヒト化軽鎖免疫グロブリンは、対応するヒト軽鎖定常領域を含むヒト化免疫グロブリンである。ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。
【００１８】
成功したヒト化抗体は以下の特徴：
（１）ヒトで用いるためのヒト化抗体の複数注入を可能とする、ヒト化配列に由来する有意に低下した、好ましくは排除された免疫原生；
（２）元の抗原に対する特異性および親和性を含めた乱れが最小の免疫原生（３倍以内）；
（３）補体固定、補体媒介細胞傷害性、抗体依存性細胞の細胞傷害性等のごときヒトエフェクター機能を誘導することができること；
を有しなければならないであろう。
【００１９】
さらなる配列改変なくしてヒトアクセプターフレームワークへドナーＣＤＲを直接的に移植する結果、抗原親和性が実質的に喪失されるようである。選択されたドナーアミノ酸のアクセプターフレームワーク領域への導入は、幾分問題を矯正し、ほとんどの場合、親和性を改良するが、該アプローチは冗長であり、時々、突然変異する適当なフレームワークアミノ酸を同定するにおいてコンピューターモデリングの助けを要し、オールオアナンモードでのアクセプターヒトフレームワークの選択において柔軟性を欠く。最も重要なことには、ヒト「アクセプター」フレームワークにおいて親「ドナー」残基を保有することによって潜在的な新しい免疫原性エピトープを導入するようである。
【００２０】
本発明はこれらの問題に立ち向かい、免疫原性ではないか、または免疫原性が低いが、親抗体におけるごとく特異的抗原に対して元の親和性のほとんどまたは全てが保有されたＦＲ修繕抗体を創製するにおいて柔軟性および単純性が増大した新規なアプローチを創出する。キメラまたはヒト化免疫グロブリンに対する免疫応答のほとんどは、理論に拘束される意図はないが、可変領域におけるエピトープに対して向けられるので、本発明が実現する原理を、限定されるものではないが、例として可変領域を用いることによって説明する。
【００２１】
蛋白質に対する免疫原性に寄与する少なくとも二つの種類のエピトープが存在する。いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」は、細胞内で蛋白質の分解の間に放出され、引き続いて、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示されて、Ｔ細胞の活性化をトリガーする短いペプチド配列である。ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたペプチドでは、次いで、Ｔ細胞のそのような活性化は、Ｂ細胞の直接的刺激によって抗体応答を生起して、そのような抗体を生産することができる。ヒト化可変領域の構造の詳細な分析は、潜在的に免疫原生であるＣＤＲのストレッチの不回避な存在を明らかにする。これらのＣＤＲは、フレームワーク配列の残りを４つのサブ領域、すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４に物理的かつ機能的に区画化する（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）。Ｔ細胞エピトープは線状の連続的な短いペプチドであるので、各ＦＲ区画におけるそのようなエプトープの有無は、異なるＦＲが同一または異なるフレームワークに由来するか否かを問わず、相互に対して相関を有すべきではない。Ｑｕｅｅｎらのヒト化アプローチを用いるアクセプターフレームワーク領域へのドナーフレームワーク残基の導入（引用して個々に一体化させる米国特許第５，８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，６９３，７６１号）は、新しい免疫原性Ｔ細胞エピトープを創製する可能性を有し、その結果、ヒト化抗体に対する免疫応答、特に、ドナーＣＤＲループによって形成されたイディオタイプ領域に対する抗体応答が誘出される。各ヒト化免疫グロブリン鎖へ一体化された３ないし７の間のドナーアミノ酸を有するのは普通ではなく、新しいＴ細胞エピトープについての出現の機会を多いに増加させる。
【００２２】
同様に、ヒトフレームワーク内に埋もれたこれらのドナー由来残基は、抗体によって認識できる新しい免疫原性Ｂ細胞エピトープを形成することができる。アクセプターフレームワークへのドナー残基の再導入は、ヒト化免疫グロブリンの元の抗原親和性を維持するにおいて重要であることはよく確立されているが、理想的には、さらなる改変および親和性の喪失なくしてドナーＣＤＲをアクセプターフレームワークに直接移植することによってヒト化を達成することができれば、それが好ましい。
【００２３】
本発明は、特異的抗原に対するその親和性がその元のレベルの３倍以内に維持される免疫グロブリンの免疫原性を低下させ、または排除するにおける新しいアプローチを提供する。該アプローチは柔軟であり、多様であり、単純であって、通常は技巧を凝らしたコンピューターモデリング分析を必要としない（がそれは、それが用いられるのを排除しない）。それは、以前の利用できる方法で抗体をヒト化するにおいて、免疫原性の低下および親和性の維持の間の逆関係の問題を取り扱う。例として免疫グロブリン可変領域を用い、１組の基準および原理が配列をＦＲ修繕するときに従われる。該基準を単独で用いることができるか、あるいは必要がある場合は組み合わせて、低下したまたは排除された免疫原性、および所望の親和性または他の特徴を達成することができる。
【００２４】
ＦＲ修繕による免疫グロブリン可変領域ヒト化において、親免疫グロブリンアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔら（ｏｐｔ．ｃｉｔ．）の分類に従ったＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４に区画化する。区画化されたＦＲの各々は別々に取り扱われ、それを用いて、公のドメイン、商業的存在、または私的所有いずれかで入手可能な全てのデータベースで見出される対応するＦＲセグメントと整列させる（例えば、Ｋａｂａｔデータベース，ｏｐｔ．ｃｉｔ．；ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）。免疫グロブリンは１を超える免疫グロブリン源からのＦＲで修繕することができる。好ましくは、対応する親ＦＲに対して最高程度の相同性（＞６０％）を持つヒトＦＲセグメントを用いる。しかしながら、免疫グロブリン鎖の一次配列中の３つのＣＤＲの１以上に隣接するＦＲ中のアミノ酸は当該抗原と直接相互作用することができ（引用してここに一体化させるＡｍｉｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７‐７５３，１９８６）、より低い相同性を持つヒトＦＲと同一のこれらのアミノ酸の選択は以下に記載する基準に従って用いる。
【００２５】
それが、ＣＤＲ１に直ぐに隣接する３以上のアミノ酸において、親ＦＲ１に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合には、ヒトＦＲ１が用いられる。
【００２６】
それが、フランキングＣＤＲ１およびＣＤＲ２に直ぐに隣接する両末端の３以上のアミノ酸において、親ＦＲ２に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合には、ヒトＦＲ２が用いられる。
【００２７】
それが、フランキングＣＤＲ２およびＣＤＲ３に直ぐに隣接する両末端の３以上のアミノ酸において、親ＦＲ３に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合には、ヒトＦＲ３が用いられる。
【００２８】
それが、ＣＤＲ３に直ぐに隣接する３以上のアミノ酸において親ＦＲ４に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合には、ヒトＦＲ４が用いられる。
【００２９】
ＣＤＲに隣接する３以上のアミノ酸において１００％相同性を持つＦＲが同定することができない場合、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒのごとき保存的に類似するアミノ酸を含むこれらの位置において最も近い相同性を持つＦＲが選択される。
好ましくは、コンピューターモデリング（その全てを引用して一体化させるＬｅｖｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：７１６８−７１７５，１９８９；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ３３５：５６４−５６８，１９８８；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：７５５−７５８，１９８６参照）、結晶構造、公開された情報または先行経験いずれかに基づいて、ＣＤＲ／抗原結合部位（その全てを引用してここに一体化させるＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７，１９８９およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５，１９９０）に近いか、あるいはそれとの相互作用を有することが知られている位置におけるそのアミノ酸が親ＦＲのそれと同一であるか、または保存的に類似するヒトＦＲが選択される。
【００３０】
ＦＲ修繕は、前記基準に適合する満足すべきＦＲを入手可能なデータベースが生じさせない場合、必要な場合の修繕されたＦＲの対応する位置における親アミノ酸の導入、または異なる霊長類、マウス等のごとき異なる種からの免疫グロブリンにＦＲを含めることを排除しない。重要な目標は、親和性の実質的喪失なくして、免疫原性が低下した、好ましくは排除された抗体を生産することである。該アプローチはこの点で成功する機会を上昇させ、柔軟性、簡潔性および操作の容易性の点で他の方法よりも優れたかなりの改良を伴う。
【００３１】
ヒト定常配列を運ぶＦＲ修繕抗体は、標的抗原に結合すると、補体媒介細胞傷害性（ＣＭ）または抗体依存性細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のごときヒト免疫エフェクター機能を誘導することができるであろう。さらに、治療または診断目的でヒトに注入すると、ヒトＦＲで修繕された抗体は非‐免疫原性であると予測され、すなわち、注入された蛋白質に対して抗体応答を誘導せず、もし必要であれば、最大臨床利益を達成するためのヒト患者への複数注入を可能とするであろう。非‐ヒト抗体は、ヒト抗体のそれよりもかなり短い循環半減期を有することが報告されている（Ｓｈａｗら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４‐４５３８，１９８７）。ほとんどのヒト配列を運ぶ修繕された抗体は、おそらくは、天然に生じるヒト抗体を暗示する延長された半減期を有するであろう。
【００３２】
ＦＲ修繕免疫グロブリンの構築において、免疫グロブリンの可変領域についての配列設計は、前記で説明した基準および原理を用いて成される。設計されたＦＲ修繕可変領域配列は、当業者によく知られた種々の標準的組換え技術を用いて組み立てられる。好ましくは、通常は約３５０塩基対のサイズの設計された配列は遺伝子合成され（その全てを引用してここに一体化させるＬｅｕｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１４１３−１４２７，１９９５；Ｄａｕｇｈｅｒｐｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２４７１−２４７６；ＤｅＭａｒｔｉｎｏら，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．４：８２９，１９９１；Ｊｏｎｅｓら，ｏｐ．ｃｉｔ）、あるいは部位またはオリゴヌクレオチドに特異的な突然変位誘発の方法によって、個々のＦＲを導入して親ＦＲを置き換えることができる（双方をここに引用して一体化させるＧｉｌｌｍａｎおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８：８１−９７，１９７９；およびＲｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４）。
【００３３】
ＦＲ修繕免疫グロブリンをコード化するＤＮＡセグメントは、細菌増殖および異なる宿主細胞における発現に適したＤＮＡ発現ベクターにおいてヒト重鎖および軽鎖領域をコード化するＤＮＡ配列に連結される。種々の宿主細胞系における発現に適した種々のＤＮＡベクターがある。適当なＤＮＡベクターは、ＦＲ修繕免疫グロブリンの発現のために選択することができる。典型的には、適当な発現制御ＤＮＡ配列は、免疫グロブリン鎖をコード化するＤＮＡセグメントに作動可能に連結される。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトできるベクターにおける真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主用の制御配列も用いることができるＦＲ修繕免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコード化する配列は、一つの単一ＤＮＡ発現ベクターに、または別々の重鎖および軽鎖発現ベクターに取り込むことができる。後者の場合には、宿主細胞は、適当な対の重鎖および軽鎖ポリペプチドを持つＦＲ修繕抗体を生じさせるために双方のベクターが同時に取り込まれなければならない。一般に、後の分泌のためにゴルジ装置への免疫グロブリンポリペプチドの輸送を可能とするリーダー配列が、真核生物宿主細胞における発現のために各免疫グロブリン鎖のＮ末端に含まれる。一旦ベクターが適当な宿主細胞に取り込まれたならば、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下に維持され、その結果、ヒト化軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖ダイマーまたは無傷抗体、結合断片、単一鎖抗体（ｓＦｖ）、ダイアボディー、またはその誘導体、または他の免疫グロブリンの形態の収集および精製をそれに続けることができる（ここに引用して一体化させるＢｅｙｃｈｏｋ，Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７９参照）。
【００３４】
重鎖および軽鎖についての異なるヒト定常領域があるのは良く知られた事実である。特定のイソタイプは、異なる目的で用いるために選択することができる特定のエフェクター特徴を有する。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞、好ましくは不滅化Ｂ−細胞からよく知られた手法に従って単離することができる（Ｋａｂａｔ ｏｐ．ｃｉｔ．およびＷＰ８７／０２６７１参照）。本発明の免疫グロブリンを生じさせるためのＣＤＲは、同様に、例えばＣＤ２２およびＣＤ２０のごとき所定の抗原に結合させることができるモノクローナル抗体から誘導され、抗体を生産することができるマウス、ラット、ウサギまたは他の脊椎動物を含めたいずれかの便宜な哺乳動物源においてよく知られた方法によって生産される。定常領域およびフレームワークＤＮＡおよび分泌用の適当な源細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ここに引用して一体化させる「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，第６版，１９８８，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）のごとき多数の源から得ることができる。
【００３５】
（プロモーターおよびエンハンサーを含めた）発現制御配列に作動可能に連結したＦＲ修繕免疫グロブリン鎖についてのコーディング配列を含むＤＮＡ発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの一体化部分として宿主生物中で複製可能である。テトラサイクリン、ネオマイシン、ベータラクタマーゼ等のごとき選択マーカーをベクターに含ませて、ＤＮＡベクターで形質転換された細胞の検出を可能とする（例えば、ここに引用して一体化させる米国特許第４，７０４，３６２号）。
【００３６】
細菌宿主は、ＤＮＡベクターを増殖させるのに、ならびに取り込まれた免疫グロブリンＤＮＡを発現させるのに適している。例えば、大腸菌は、本発明についてのＤＮＡ配列をクローニングするのに用いる最も通常に用いられる原核生物宿主である。同一目的で有用な他の微生物宿主は、その例として、バチルス（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ）および他の腸内細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｃｒｒａｔｉａ）、および種々のシュードモナス種を含む。これらの宿主におけるクローン化配列の発現は、宿主細胞に適合する発現制御配列（例えば、複製起点）、およびＤＮＡベクターに含ませるべき機能的プロモーターの存在を必要とする。よく知られたプロモーター系の例は、限定されるものではないが、トリプトファン（ＴＲＰ）プロモーター系、ベータ‐ラクタマーゼプロモーター系、ファージラムダプロモーター系等を含む。これらのプロモーターは、全ての必要なモチーフに加えて、任意に、オペレーター配列と共に、転写開始および翻訳に必要なリボソーム結合部位配列等を含む、プロモーター系の下流の機能的遺伝子配列の発現または転写を制御することを担う。
【００３７】
同様に、酵母のごとき他の微生物も発現で用いることができる。例えば、好ましい宿主は、所望により、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含めた、プロモーターのごとき適当な発現制御エレメント、および複製起点、終止配列などを含む発現ベクターに適した宿主であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓであろう。
【００３８】
無脊椎動物起源の真核生物宿主細胞を用いることができる。例えば、ｈｉ−５、ＳＦ９、ＳＦ２１のごとき昆虫細胞。宿主細胞における高レベル発現で重要な便宜なクローニング部位、プロモーター、終止配列を含む適当な発現ベクターは市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。
【００３９】
好ましくは、哺乳動物組織細胞培養を用いて、本発明のポリペプチドを発現させ、それを生産することができる（ここに引用して一体化させるＷｉｎｎａｃｋｅｒ，「Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ」，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，ＮＹ，ＮＹ，１９８７参照）。最も普通に用いられる哺乳動物宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、種々のＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、およびＳＰ２／０細胞系、ＮＳ０細胞系、ＹＢ２／０細胞系等のごとき骨髄腫細胞系、および形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞系は重鎖ＣＨ２ドメインにおいてアミノ酸２９７のごとき適当な部位において正しいグリコシル化を付与することができ、全長免疫グロブリンを分泌することができ、およびこの特別な発明で選択された宿主細胞系である。他の宿主細胞のための発現ベクターと同様に、真核生物細胞発現ベクターは、通常、グリコシル化および輸出のために発現されたポリペプチドをゴルジ装置に向けるためのリーダー配列、注目するＤＮＡセグメント（例えば、重鎖および軽鎖コーディング配列および発現制御配列）、終止コドン、（リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化配列、および転写ターミネーター配列のごとき）他の必要なプロセッシング情報部位、および（突然変異体Ｄｈｆｒ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ヒグロマイシン、ネオマイシンのごとき）選択マーカーと共に、プロモーター（例えば、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するもの）、エンハンサーを含めた適当な発現制御配列を含む（個々に引用して一体化させるＫｅｌｌｅｍｓ，「Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」，Ｍａｒｃｅｍ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，１９９３参照）。
【００４０】
注目するＤＮＡセグメントを含むベクターを宿主細胞へ、宿主細胞ゲノムへ一時的にまたは安定して組み込むように導入するための多くの確立されよく知られた方法が存在する。それらは、限定されるものではないが、塩化カルシウムトランスフェクション、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション等を含む（ここに引用して一体化させるＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８２参照）。適当な発現ベクターが取り込まれた宿主細胞の同定は、典型的には、まず、ベクターで用いる選択マーカーに従った選択圧下で細胞を増殖させ、次いで、ＥＬＩＳＡおよびウエスタン分析のごとき標準的な手法によって、分泌された蛋白質、例えば、重鎖および軽鎖の２つの対を含む全抗体、または本発明の他の免疫グロブリンの形態を検出することによって達成できるであろう。発現された免疫グロブリンの精製は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含めた当該分野の標準的な手法に従って行なうことができる（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２参照）。少なくとも約９０ないし９５％均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、医薬用途では、９８ないし９９％以上の均一性が最も好ましい。所望により一旦部分的にまたは均一になるまで精製すれば、次いで、ポリペプチドは（体外を含めて）治療で、あるいはアッセイ手法、免疫蛍光染色等を開発し、実行するにおいて用いることができる（一般に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌｓ ＩおよびＩＩ，ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９７９および１９８１参照）。
【００４１】
本発明の抗体は、典型的には、個々に、または他の治療様式と組み合わせて、抗体‐ベースの療法に感受性の病気を治療するにおいて用途が見出されるであろう。例えば、免疫グロブリンは、全て、多くの先行抗体に伴う実質的有害免疫反応（例えば、アナフィラキシーショック）なくして、受動免疫化、または補体媒介溶解によるごとき望まない細胞または抗原の除去で用いることができる。
【００４２】
本発明の抗体の好ましい用法は、病巣部位において局所、皮下、静脈内および筋肉内のいずれかで投与される５０ｍｇないし４００ｍｇ／ｍ2の範囲の投与量でそれらの裸の形態（裸の抗体）を用いる病気の治療であろう。異なる間隔での複数投与を行なって、例えば、１週間間隔で、１週間に１回で４週間、最適な治療または診断応答が達成されるであろう。本発明に由来する抗体の用法は、化学療法薬物（例えば、ＣＨＯＰ、Ｄｏｘ、５−Ｆｕ等）、放射線療法、放射線免疫療法、ワクチン、酵素、トキシン／イムノトキシン、または本発明または他から由来する他の抗体のごとき異なる治療様式と組み合わせることができる。本発明の抗体は、抗―腫瘍抗体のイディオタイプに特異的であれば、腫瘍抗原に対するＡｂ３の誘導用の腫瘍ワクチンとして用いることができる。当業者によく知られた多数の更なる剤、または剤の組合せを利用することもできる。
【００４３】
加えて、本発明の抗体は異なる医薬組成物で利用することができる。該抗体は、それらの裸の形態で、あるいは薬物、放射性核種、トキシン、サイトカイン、可溶性因子、ホルモン、酵素（例えば、カルボキシルエステラーゼ、リボヌクレアーゼ）、ペプチド、（腫瘍ワクチンとしての）抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは標的化剤または送達ビヒクルとして働く抗体部位と共に特異的治療機能を有するいずれかの他のエフェクター分子とのコンジュゲーテッド蛋白質として用いることができる。さらに、本発明の抗体断片、単一鎖Ｆｖ、ダイアボディー等のごとき抗体または抗体誘導体は、（例えば、二特異的抗体としての）異なる発明の抗体または抗体誘導体、トキシン、サイトカイン、可溶性因子、ホルモン、酵素、ペプチド等のような他の機能性部位に対する融合蛋白質として用いることができる。当業者によく知られた医薬組成物の異なる組合せも利用することができる。
【００４４】
また、本発明のＦＲ修繕抗体は、例えば、特異的抗原の検出用の診断ツールとして、イン・ビトロ目的で用いることもできる。
【００４５】
以下の実施例は説明のために掲げ、限定するものではない。
【００４６】
実験
ＦＲ修繕免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列に設計するにおいて、（ＶＨおよびＶＬ双方に適用される）マウス可変領域配列を、Ｋａｂａｔの分類（Ｋａｂａｔら，ＯＰ．ＣＩＴ．）に従って、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４に区画化した。修繕のための個々のＦＲの選択は、前記したガイドラインに従った。
【００４７】
それが、ＣＤＲ１に直ぐに隣接した３以上のアミノ酸において親ＦＲ１に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合にはヒトＦＲ１が用いられる。
【００４８】
それが、フランキングＣＤＲ１およびＣＤＲ２に直ぐに隣接した双方の端部の３以上のアミノ酸において親ＦＲ２に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合にはヒトＦＲ２が用いられる。
【００４９】
それが、フランキングＣＤＲ２およびＣＤＲ３に直ぐに隣接する双方の端部の３以上のアミノ酸において親ＦＲ３に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合にはヒトＦＲ３が用いられる。
【００５０】
それが、ＣＤＲ３に直ぐに隣接する３以上のアミノ酸において親ＦＲ４に対して最高の相同性、好ましくは１００％を有する場合にはヒトＦＲ４が用いられる。
【００５１】
ＣＤＲに隣接する３以上のアミノ酸における１００％相同性を持つヒトＦＲを同定することができない場合、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ：およびｐｈｅ、ｔｙｒのごとき保存的に類似するアミノ酸を含むこれらの位置において最も近い相同性を持つＦＲが選択される。
【００５２】
好ましくは、コンピューターモデリング（Ｌｅｖｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉら；ｏｐ．ｃｉｔ：Ｃｈｏｔｈｉａら，ｏｔ．ｃｉｔ．参照）、結晶構造、公表された情報、または以前の経験いずれかに基づいて、ＣＤＲ／抗原結合部位（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｃｈｏｔｈｉａら，ｏｐ．ｃｉｔ．およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら，ｏｐ．ｃｉｔ．）に近くであるか、またはそれとの相互作用を有することが知られている位置におけるそのアミノ酸が親ＦＲのそれと同一であるか、または保存的に類似するヒトＦＲが選択される。
【００５３】
前記の全てを満足する特定のヒトＦＲが入手不可能であって、直接的修繕の結果、親和性または特異性が喪失される場合、抗原結合部位との相互作用を有するか、または抗体の最終的な親和性に寄与すると考えられるマウス残基を最良の入手可能なＦＲに逆に導入する。別法として、マッチングヒトカウンターパートを持たない特定のＦＲは、改変のないそのマウス組成物に保存され、使用され；最終のＦＲ修繕配列はヒトおよびマウスＦＲの混合物を含むであろう。例示の目的で、２つのマウス抗Ｂ細胞抗体を、本明細書中に記載したアプローチを用いてＦＲ修繕する。
【００５４】
実施例１
ＦＲ修繕した抗ＣＤ２２抗体
ＦＲ修繕した抗ＣＤ２２軽鎖および重鎖についての遺伝子の設計
マウス抗ＣＤ２２抗体であるＲＦＢ４（Ｌｉら，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８：８５，１９８９；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｂｌｏｏｄ ９０：２０２０−２０２６，１９９７）の重鎖および軽鎖の配列を例として用い、ＦＲ修繕を用いて再作成された抗体の免疫原性を低下させるか、または排除するアプローチを説明する。マウス抗体についての重鎖（ａ）および軽鎖（ｂ）可変領域の配列を図１に示す。
【００５５】
ＲＦＢ４用の重鎖可変領域についての個々のＦＲの修繕は以下のごとくに行なった。
ａ．ＦＲ１；マウスＶＨのＦＲ１配列を、Ｋａｂａｔのデータベース（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）からのヒトＶＨのＦＲ１配列と比較した。最高の配列相同性のヒトＦＲ１が好ましいが、ＣＤＲ１に最も近い配列についての特定の強調を取った。マウスＦＲ１に対して最高の相同性の３つのＦＲ１配列がある。それらは、すなわち、ＥＩＫ、ＲＦ−ＳＪ１およびＷＡＳである。マウス親と同一のＣＤＲ１に最も近い５つの残基との最高の総じての相同性を持つＦＲ１はＥＩＫであるが、位置１２には失われた残基があり、これは、得られた抗体の免疫反応性に影響する潜在的問題を生じる可能性がある。修繕のためにピックアップした好ましいＦＲ１は、従って、ＷＡＳからのものであった。まず、ＣＤＲ１に対して３番目に近い残基位置２８を除き、ＣＤＲ１の次の１１のアミノ酸の全ストレッチはマウス親と同一である。位置２８において、マウス配列においてアラニンの代わりにセリン残基が見出される。セリンはアラニンのヒドロキシル化バージョンと考えられるので、変化は保存的である。さらに、ヒトおよびマウスの間で異なる残基は特徴が比較的類似する。例えば、位置５におけるバリンおよびロイシン、位置１３におけるリシンおよびグルタミン、位置１９におけるリシンおよびアルギニン、および位置２８におけるアラニンおよびセリン。従って、抗ＣＤ２２抗体のＦＲ１を修繕するために、ＷＡＳからのヒト配列を選択した（図２Ａ）。
【００５６】
ｂ．ＦＲ２：同一のトークンによって、かつ相同性の程度に基づき、抗ＣＤ２２抗体のＦＲ２を修繕するために、ヒトＷＡＳ配列を選択する（図２Ａ）。
【００５７】
ｃ．ＦＲ３：同一であるＣＤＲ２およびＣＤＲ３に最も近い配列および高度の相同性でもって、抗ＣＤ２２抗体のＦＲ３を修繕するために、ヒトＧＡＬ配列を選択した（図２Ａ）。
【００５８】
ｄ．ＦＲ４：同一であるＣＤＲ３に最も近い配列、およびマウス親に対する高度な相同性を持つ多くのヒトＦＲ４がある。この例では、抗ＣＤ２２抗体のＦＲ４を修繕するために、ヒトＤＯＢ配列を選択した（図２Ａ）。
【００５９】
抗ＣＤ２２抗体についてのＦＲ修繕ＶＨ配列の最終的設計（図３Ａ）は、ヒトＷＡＳ ＦＲ１およびＦＲ２，およびＧＡＬ ＦＲ３およびＤＯＢ ＦＲ４よりなり、抗ＣＤ２２抗体の元のＶＨ ＦＲを置き換える。ＦＲ修繕配列の最終設計において、マウスＦＲ残基の単一突然変異または再導入はない。
【００６０】
同様の戦略を用い、ＦＲ修繕した軽鎖（ＶＬ）についての配列設計は以下の通り行なった：
ａ．ＦＲ１：マウスＶＬのＦＲ１を修繕するために、ヒトＪＯＨを選択した。それは、高度の配列相同性、および親配列と同一であるＣＤＲ１に隣接する８つのアミノ酸のストレッチを有する（図２Ｂ）。
【００６１】
ｂ．ＦＲ２：同様の理由で、マウスＶＬのＦＲ２を修繕するために、ヒトＶｄ’ＣＬを選択した。４を超える同一配列がＣＤＲ１およびＣＤＲ２に隣接する（図２Ｂ）。
【００６２】
ｃ．ＦＲ３：マウスＶＬのＦＲ３を修繕するために、ヒトＷＥＳを選択した。ＦＲ３は最長の配列を有し、ＷＥＳおよびマウスＦＲ３の間の配列相同性は高く、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に近接する配列は同一である（図２Ｂ）。
【００６３】
ｄ．ＦＲ４：同様の理由で、マウスＶＬのＦＲ４を修繕するために、ヒトＲＺを選択した（図２Ｂ）。
【００６４】
抗ＣＤ２２抗体についてのＦＲ修繕ＶＬ配列の最終的設計（図３Ｂ）は、ヒトＪＯＨ ＦＲ１、Ｖｄ’ＣＬ ＦＲ２、ＷＥＳ ＦＲ３およびＲＺ ＦＲ４より成り、抗ＣＤ２２抗体の元のＶＬ ＦＲを置き換える。もう１度、ＦＲ修繕した配列の最終設計においてマウスＦＲ残基の突然変異または再導入はない。
【００６５】
ＦＲ修繕した重鎖および軽鎖遺伝子の構築
ＦＲ修繕した抗体の設計された重鎖および軽鎖可変領域配列は、種々の公表された方法を用い、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲの組合せを用いて組み立てられる（Ｌｅｕｎｇら，ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，ｏｐ．ｃｉｔ．；ＤｅＭａｒｔｉｎｏら，ｏｐ．ｃｉｔ．；Ｊｏｎｅｓら，ｏｐ．ｃｉｔ．）。
【００６６】
ＦＲ修繕重鎖可変領域配列（配列番号１）を構築するには、全長ＤＮＡ配列を２つの半体：Ｎ末端半体およびＣ末端半体に分ける。両者をＰＣＲによって別々に構築し、完全な可変領域配列は、ＫｐｎＩ部位においてＮおよびＣ末端半体を接合することによって形成した。
Ｎ末端半体は以下のごとくに構築した：Ｎ鋳型（配列３）はＶＨ領域のアミノ酸１４ないし５０をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１１１量体）である（配列番号２）。該鋳型は２つのプライマーによってＰＣＲ増幅する；
５’プライマー（配列番号４）は、ＶＨ領域のアミノ酸１ないし１９をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（５７量体）である。プライマーの３’端部は１８ネクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【００６７】
３’プライマー（配列番号５）は、アミノ酸４３ないし５９をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４８量体）である。該プライマーは２１ヌクレオチドだけ鋳型と重複する。
【００６８】
Ｎ鋳型（配列番号３）は、標準的技術および手法を用い、５’および３’プライマー組（配列番号４および５）を用いてＰＣＲ増幅した。
【００６９】
Ｃ末端半体は以下のごとく構築した：Ｃ鋳型（配列番号６）はＶＨ領域のアミノ酸６８ないし１１１をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１３２量体）である（配列番号２）。該鋳型は２つのプライマーによってＰＣＲ増幅させた：
５’プライマー（配列番号７）は、ＶＨ領域のアミノ酸５５ないし７４をコード化する合成センス‐鎖オリゴヌクレオチド（６０量体）である。プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【００７０】
３’プライマー（配列番号８）は、ＶＨ領域のアミノ酸１０５ないし１２３をコード化する合成アンチセンス‐鎖オリゴヌクレオチド（５８量体）である。該プライマーおよび該鋳型は２１ヌクレオチドだけ重複する。
【００７１】
Ｃ鋳型（配列番号６）は、標準的技術および手法を用い、５’および３’プライマー組（配列番号７および８）を用いてＰＣＲ増幅させる。
【００７２】
全長ＦＲ修復ＲＦＢ４ ＶＨドメインの構築ではＮ鋳型（配列番号３、１１１量体）Ｃ鋳型（配列番号６、１３２量体）、およびそれらの核５’―および３’プライマー（Ｎ鋳型では配列番号４および５、およびＣ鋳型では配列番号７および８）を、自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏシステム ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成した。オリゴヌクレオチドはＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ−１０TMカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を通すことによって脱塩した。オリグヌクレオチドは２０μＭの最終濃度に調整した。種々の希釈（１０×、１００×、１０００×および１００００×等）における１μｌの鋳型オリゴヌクレオチドを、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ，１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．３，１５ｍＭのＭｇＣｌ2）および５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の存在下で、５μｌのそれらの対応するフランキングプライマーと混合した。この反応混合物を１００μｌの最終容量まで調整し、１分間の９４℃における変性、１分間の５０℃におけるアニーリング、および１分間の７２℃における重合よりなるＰＣＲ反応の３０サイクルに付した。ＰＣＲ反応混合物は、２％アガロースゲル電気泳動下で分析した。正しいサイズの充分に豊富な生成物を生起した最高鋳型希釈を、さらなる処理のために選択する。
【００７３】
ＮおよびＣ鋳型用の二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＫｐｎＩで制限消化した。制限したＮおよびＣ二本鎖ＤＮＡをＫｐｎＩ部位で連結し、連結した産物をＮ鋳型用の５’プライマー（配列番号４）およびＣ鋳型用の３’プライマー（配列番号８）を用いる更なるラウンドのＰＣＲ増幅に付した。〜３５０のサイズを持つＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に直接的にクローン化した。クローン化された断片の配列はサンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒら，ＰＮＡＳ ７４：５４６３−５４６７，１９７７）によって、示されたＶＨ配列と同一であることが確認された。確認された配列を用いて、ＩｇＨプロモーター、Ｉｇエンハンサー、ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノム配列、および選択マーカーｇｐｔを含む重鎖発現ベクターのＶＨ配列を置き換えた。最終の重鎖発現ベクターをｈｐＲＦＢ４ｐＳＭｈと命名する。
【００７４】
ＦＲ修繕軽鎖可変領域配列（配列番号９）を構築するために、全長ＶＬ可変領域配列を２つの半体に分けた。Ｎ末端およびＣ末端半体をＰＣＲによって別々に組み立て、ＳｐｅＩ部位を介して一緒に接合した。
【００７５】
Ｎ末端半体は以下のごとく構築した：Ｎ鋳型（配列番号１１）は、ＶＬ領域のアミノ酸１１ないし４６をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１０８量体）である（配列番号１０）。鋳型は２つのプライマーによってＰＣＲ−増幅した。
【００７６】
５’プライマー（配列番号１２）はＶＬ領域のアミノ酸１ないし１７をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（５１量体）である。プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【００７７】
３’プライマー（配列番号１３）は、アミノ酸４０ないし５３をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４０量体）である。該プライマーは１８ヌクレオチドだけ鋳型と重複する。
Ｎ鋳型（配列番号１１）は、標準的技術および手法を用いて、５’および３’プライマーの組（配列番号１２および１３）を用いてＰＣＲを増幅させる。
【００７８】
Ｃ末端半体は以下のごとく構築した：Ｃ鋳型（配列番号１４）は、ＶＬ領域のアミノ酸５９ないし９８をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１２０量体）である（配列番号１０）。鋳型は二つのプライマーによってＰＣＲ‐増幅させた：
５’プライマー（配列番号１５）は、ＶＬ領域のアミノ酸５０ないし６５をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（４９量体）である。該プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【００７９】
３’プライマー（配列番号１６）は、ＶＬ領域のアミノ酸９２ないし１０７をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４８量体）である。該プライマーおよび該鋳型は２１ヌクレオチドだけ重複する。
【００８０】
Ｃ鋳型（配列番号１４）は、標準的技術および手法を用い、５’および３’プライマーの組（配列番号１５および１６）を用いてＰＣＲ増幅させる。
【００８１】
ＦＲ修繕ＲＦＢ４ ＶＬドメインの構築にはＮ鋳型（配列番号１１，１０８‐量体）、Ｃ鋳型（配列番号１４，１２０量体）、およびそれらの各５’および３’プライマー（Ｎ鋳型については配列番号１２および１３、およびＣ鋳型については配列番号１５および１６）を自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーで合成した。該オリゴヌクレオチドはＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ‐１０TMカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を通すことによって脱塩した。オリゴヌクレオチドは２０μＭの最終濃度に調整した。種々の希釈（１０×、１００×、１０００×および１０００×等）における１μｌの鋳型オリゴヌクレオチドを、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ2）および５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下で、５μｌのそれらの対応するフランキングプライマーと混合した。この反応混合物を１００μｌの最終容量に調整し、１分間の９４℃における変性、１分間の５０℃におけるアニーリング、および１分間の７２℃における重合よりなる３０サイクルのＰＣＲ反応に付した。ＰＣＲ反応混合物を２％アガロースゲル電気泳動下で分析した。正しいサイズの充分に豊富な産物を生起させる最高鋳型希釈をさらなる処理のために選択する。
【００８２】
ＮおよびＣ鋳型についての二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＳｐｅＩで制限‐消化した。制限されたＮ‐およびＣ二本鎖ＤＮＡをＳｐｅＩ部位で連結し、連結された産物を、Ｎ鋳型についての５’プライマー（配列番号１２）およびＣ鋳型についての３’プライマー（配列番号１６）を用いるもう一つのラウンドのＰＣＲ‐増幅に付した。〜３２０のサイズを持つＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化した。クローン化した断片の配列はサンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒ ｏｐ．ｃｉｔ．）によって、設計されたＶＬ配列と同一であることが確認された。確認された配列を用いて、ＩｇＨプロモーター、Ｉｇエンハンサー、ヒト・カッパ定常領域ゲノム配列、および選択マーカーｈｙｇを含む軽鎖発現ベクターのＶＬ配列を置き換えた。最終の軽鎖発現ベクターをｈｐＲＦＢ４ｐＳＭｋと命名する。
【００８３】
ＦＲ修繕した抗体の発現および親和性
発現プラスミドｈｐＲＦＢ４ｐＳＭｈおよびｈｐＲＦＢ４ｐＳＭｋを線状化し、マウスＳｐ２／０細胞に共トランスフェクトした。該プラスミドでトランスフェクトされた細胞を、標準的な方法によって、該プラスミド上のｇｐｔおよびｈｙｇ遺伝子によって付与されたマイコフェノール酸および／またはヒグロマイシンＢの存在下で選択した。選択で生存する細胞を、ＥＬＩＳＡ法を用い、ヒト抗体分泌につきテストした。ヒト抗体を分泌していると同定されているクローンを、５００ｍｌのローラー瓶中で生産用に拡大培養した。抗体は、標準的なプロテインＡカラムを用いて精製した。精製された抗体を、還元および非‐還元の双方の条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで分析した（図４）。ＦＲ修繕抗体（ｈｐＲＦＢ４）の親和性をフローサイトメトリーによってまず評価した。１％ＦＣＳおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを補足した最終容量１００μｌのＰＢＳ（ＰＢＳ‐ＦＡ）中で、１μｇの精製されたｈｐＲＦＢ４またはキメラＲＦＢ４（ｃＲＦＢ４）と共にＲａｊｉ細胞（５×１０5）を培養した。ｃＲＦＢ４は、改変することなくマウス親から直接由来した可変領域配列中のｈｐＲＦＢ４とは異なる。混合物を４℃において３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄して、未結合抗体を除去した。Ｒａｊｉ細胞への抗体の結合レベルは、最終容量１００μｌのＰＢＳ‐ＦＡ中に２０×希釈されたＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１、Ｆｃ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ ＧｒｏｖｅＰＡ）を添加し、４℃において３０分間インキュベートすることによって評価した。混合物をＰＢＳ３回洗浄し、ＦＡＣＳＣＡＮ蛍光細胞分析分離装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって蛍光強度を測定した（図５）。結果は、双方の抗体が同様な親和性をもってＲａｊｉ細胞によく結合したことを示した。
【００８４】
ＲＦＢ４のＶＨおよびＶＬ配列の再作成前および後に抗体の親和性を比較するために、競合結合アッセイを行なった。固定した量（ストックからの１０×希釈）のＦＴＴＣ‐コンジュゲーテッドＲＦＢ４（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）を変化させる濃度のｃＲＦＢ４またはｈｐＲＦＢ４いずれかと混合した。混合物をＰＢＳ‐ＦＡ中の最終容量１００μｌにてＲａｊｉ細胞に添加し、４℃にて３０分間培養した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＩＴＣ‐ＲＦＢ４と結合したＲａｊｉ細胞の蛍光強度をＦＡＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって測定した。結果は、ＲＦＢ４配列のＦＲ修繕は、再作成された抗体の親和性に対して有意な効果を有しないことを示した（図６）。
【００８５】
実施例２
ＦＲ修繕した抗ＣＤ２０抗体
ＦＲ修繕した抗ＣＤ２０軽鎖および重鎖についての遺伝子の設計
マウス抗ＣＤ２０抗体１Ｆ５（Ｒｅｆ．）の重鎖および軽鎖配列を例として用いて、ＦＲ修繕を用いて再作成された抗体の免疫原性を低下させるか、または排除するアプローチを説明する。マウス抗体についての重鎖および軽鎖可変領域の配列を図（７）に示す。
【００８６】
１Ｆ５についてのＦＲ修繕免疫グロブリンのアミノ酸配列の設計において、前記した規則の同一の組が適用される。しかしながら、全ての前記した要件を満たす適当なＦＲがない状況が常にある。ＦＲ修繕アプローチはかなりの程度の柔軟性を提供し、問題のＦＲへのマウス残基の導入、別法として、改変なくして元のマウスＦＲを含ませることを可能とする。得られたＦＲ修繕抗体は、恐らくは、マウスまたはキメラ抗体と比較して有意に低下した免疫原性を有するであろう。抗ＣＤ２０抗体１Ｆ５を、これらの点を説明するためにＦＲ修繕についての例として用いる。
【００８７】
１Ｆ５ＶＨ配列の個々のＦＲの修繕は以下のごとく行なった：
ａ．ＦＲ１：マウスＶＨのＦＲ１配列を、Ｋａｂａｔのデータベース（Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）からのヒトＶＨのＦＲ１配列と比較した。最高の配列相同性のヒトＦＲ１が、特に、ＣＤＲ１に最も近い配列において好ましい。ＬＳ２‘ＣＬからのヒトＦＲ１配列はマウス抗ＣＤ２０抗体のそれに対して８０％近くの配列相同性を有し、ＣＤＲ１に隣接する１０の残基はマウス親配列と同一である。従って、ＬＳ２’ＣＬからのヒトＦＲ１配列を、抗ＣＤ２０抗体のＦＲ１を修繕するために選択した（図８Ａ）。
【００８８】
ｂ．ＦＲ２：抗ＣＤ２０抗体のＦＲ２配列を修繕するために、ヒトＮＥＷＭのＦＲ２配列を選択した。ＣＤＲ１に最も近いＮＥＷＭ ＦＲ２の第三の残基はマウス親配列のそれと同一ではないが、それは保存されたＫからＲへの変換である（図８Ａ）。
【００８９】
ｃ．ＦＲ３：満足すべき高い配列相同性を持つヒト重鎖ＦＲ３配列およびＣＤＲ２およびＣＤＲ３に隣接する同一配列は同定することができなかった。７８３Ｃ’ＣＬからのヒトＦＲ３は７８％の配列相同性を呈したが、ＣＤＲ２に近接してそれを挟む残基は、差が保存されているにもかかわらず、劇的に異なった。例えば、ＣＤＲ２に最も近い一番目、二番目および四番目の残基である位置５７、５８および６０（Ｋａｂａｔのナンバリング，Ｋａｂａｔら，ｏｐ．ｃｉｔ．）におけるＫ、ＡおよびＬは、各々、保存されたヒト残基Ｒ、ＶおよびＩによって置き換えられる。それにもかかわらず、ＣＤＲ２に近接する多数の変化は、保存的であるが、その結果、抗原結合部位においてかなり立体配座が変化し得る。親和性の喪失の危険性なくして、かつＦＲ修繕アプローチの柔軟性に対する説明として、ＦＲ３はヒトＦＲのいずれかで修繕されないであろう。その代わり、マウスＦＲ３配列をこの特定の抗体で保持させた（図８Ａ）。
【００９０】
ｄ．ＦＲ４：ＣＤＲ３に最も近い配列が同一であり、マウス親に対する高度な相同性を持つ多くのヒトＦＲ４がある。この例においては、抗ＣＤ２０抗体のＦＲ４を修繕するために、ヒト４Ｇ１２’ＣＬ配列を選択した（図８Ａ）。
【００９１】
抗ＣＤ２０抗体についてのＦＲ修繕ＶＨ配列の最終設計（図９Ａ）は、ヒトＬＳ２’ＣＬ ＦＲ１、ＮＥＷＭ ＦＲ２、マウス１Ｆ５ ＦＲ３および４Ｇ１２’ＣＬ ＦＲ４よりなり、マウス抗ＣＤ２０抗体の元のＶＨ ＦＲ’を置き換える。
【００９２】
代替設計は、ヒトＬＳ２’ＣＬ ＦＲ１、ＮＥＷＭ ＦＲ２，７８３Ｃ’ＣＬ ＦＲ３、および４Ｇ１２’ＣＬ ＦＲ４に埋められたマウスＣＤＲを含む修繕されたＶＨであろう（図１０Ａ）。説明の目的で、前者のバージョンの構築を以下に記載する。
【００９３】
同様の戦略を用い、ＦＲ修繕軽鎖についての配列設計は以下のごとく構築した：
ａ．ＦＲ１：マウスＶＬのＦＲ１を修繕するために、ヒトＢＪ１９を選択した。これは、マウス親に対して最高の相同性を持つヒトＦＲ１配列である（６１％）。さらに、マウスのそれとは異なるヒト残基のいくつかは保存されている。例えば、各々、位置１８および１９におけるＥからＤ、およびＫからＲの変換は保存された変化である（図８Ｂ）。
【００９４】
ｂ．ＦＲ２：マウスＦＲ２に対して高い配列相同性（７３％）であることが判明したヒトＦＲ２、ＭＯＴがあるが、位置３２（Ｋａｂａｔのナンバリング，Ｋａｂａｔらｏｐ．ｃｉｔ．）におけるトリプトファン、ＣＤＲ２に最も近い三番目の残基を、ＭＯＴ ＦＲ２配列中の非保存的バリンで置き換えた。この置き換えは、潜在的に、抗原結合部位の最終立体配座に対して有意な影響を有するであろう。従って、ＶＬドメインのマウスＦＲ２はＦＲ修繕抗体の設計で残すと判断した（図８Ｂ）。
【００９５】
ｃ．ＦＲ３：マウスＶＬのＦＲ３を修繕するために、ヒトＷＥＳを選択した。ＦＲ３は最も長い配列を有し、ＷＥＳおよびマウスＦＲ３の間の配列相同性は７１％であり、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に近接してそれを挟む三つのヒト残基はマウスのそれと同一である（図８Ｂ）。
【００９６】
ｄ．ＦＲ４：同様の理由で、マウスＶＬのＦＲ４を修繕するために、ＮＩＧ‐５８からのヒトλ ＦＲ４配列を選択した。該配列は、ヒトおよびマウスの間で同一であるＣＤＲ３に隣接する７残基のストレッチに対して７２％相同性である（図８Ｂ）。
【００９７】
抗ＣＤ２０抗体についてのＦＲ修繕ＶＬ配列の最終設計（図９Ｂ）は、ヒトＢＪ１９ ＦＲ１、マウス１Ｆ５ ＦＲ２、ＷＥＳ ＦＲ３、およびＮＩＧ‐５８ ＦＲ４よりなり、抗ＣＤ２０抗体の元のＶＬ ＦＲを置き換える。ＦＲ修繕ＶＬの代替設計はヒトＢＪ１９ ＦＲ１、ＭＯＴＦＲ２、ＷＥＳ ＦＲ３、およびＮＩＧ‐５８ ＦＲ４よりなり、ＣＤＲループを支持する足場を形成する（図１０Ｂ）。本出願における説明の目的で、前者のＦＲ修繕ＶＬの構築のみを以下に記載する。
【００９８】
ＦＲ修繕重鎖および軽鎖遺伝子の構築
種々の公表された方法を用い、オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲの組合せによって、ＦＲ修繕抗体の設計された重鎖および軽鎖可変領域配列を組み立てた。
【００９９】
ＦＲ修繕重鎖可変領域配列（配列番号１７）を構築するために、全長ＤＮＡ配列を二つの半体に分けた。Ｎ末端半体およびＣ末端半体をＰＣＲによって別々に構築し、ＳｐｅＩ部位においてＮ‐およびＣ末端半体を接合することによって、完全な可変領域配列を形成する。
【０１００】
Ｎ末端半体は以下のごとく構築した：Ｎ鋳型（配列番号１９）は、ＶＨ領域のアミノ酸１２ないし４９をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１１４量体）である（配列番号１８）。該鋳型を二つのプライマーによってＰＣＲ増幅する：
５’プライマー（配列番号２０）は、ＶＨ領域のアミノ酸１ないし１９をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（５７量体）である。プライマーの３’末端は、２４ヌクレオチドだけ鋳型の５’末端と重複する。
【０１０１】
３’プライマー（配列番号２１）は、アミノ酸４３ないし６０をコード化する合成アンチセンス‐鎖オリゴヌクレオチド（５５量体）である。該プライマーは２１ヌクレオチドだけ鋳型と重複する。
【０１０２】
標準的な技術および手法を用い、Ｎ鋳型（配列番号１９）を、５’および３’プライマーの組（配列番号２０および２１）を用いてＰＣＲ増幅する。
【０１０３】
Ｃ末端半体は以下のごとく構築した：Ｃ鋳型（配列番号２２）は、ＶＨ領域のアミノ酸７０ないし１１１をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１２６量体）である（配列番号１８）。該鋳型は二つのプライマーによってＰＣＲ‐増幅した：
５’プライマー（配列番号２３）は、ＶＨ領域のアミノ酸５７ないし７６をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（６１量体）である。該プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【０１０４】
３’プライマー（配列番号２４）は、ＶＨ領域のアミノ酸１０５ないし１２３をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（５９量体）である。該プライマーおよび該鋳型は２１ヌクレオチドだけ重複する。
【０１０５】
標準的な技術および手法を用い、Ｃ鋳型（配列番号２２）を、５’および３’プライマーの組（配列番号２３および２４）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１０６】
ＦＲ修繕１Ｆ５ ＶＨドメインの構築のために、Ｎ鋳型（配列番号１９、１１４‐量体）、Ｃ鋳型（配列番号２２、１２６量体）、およびそれらの各５’および３’プライマー（Ｎ鋳型については配列番号２０および２１、およびＣ鋳型については配列番号２３および２４）を自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーによって合成した。ＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ‐１０TMカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を通すことによって、オリゴヌクレオチドを脱塩した。オリゴヌクレオチドを２０μＭの最終濃度に調整した。１０μｌの１０× ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ2）および５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下で、種々の希釈（１０×、１００×、１０００×および１００００×等）における１μｌの鋳型オリゴヌクレオチドを５μｌのそれらの対応するフランキングプライマーと混合した。この反応混合物を１００μｌの最終容量に調整し、１分間の９４℃における変性、１．５分間の５０℃におけるアニーリング、および１分間の７２℃における重合よりなる３０サイクルのＰＣＲ反応に付した。２％アガロースゲル電気泳動下で、ＰＣＲ反応混合物を分析した。正しいサイズの充分に豊富な産物を生起させた最高の鋳型希釈をさらなる処理のために選択する。
【０１０７】
ＮおよびＣ鋳型についての二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＫｐｎＩ部位で制限消化した。ＮおよびＣ二本鎖ＤＮＡをＳｐｅＩ部位で連結し、連結された産物を、Ｎ鋳型についての５’プライマー（配列番号１９）およびＣ鋳型についての３’プライマー（配列番号２２）を用いるもう一つのラウンドのＰＣＲ増幅に付した。〜３５０のサイズを持つＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化した。クローン化された断片の配列は、サンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒら，ｏｐ．ｃｉｔ．）によって設計されたＶＨ配列と同一であることが確認された。確認された配列を用いて、ＩｇＨプロモーター、Ｉｇエンハンサー、ヒトＩｇＧ１定常領域ゲノム配列、および選択マーカーｇｐｔを含む重鎖発現ベクターのＶＨ配列を置き換えた。最終の重鎖発現ベクターをｈｐ１Ｆ５ｐＳＭｈと命名する。
【０１０８】
ＦＲ修繕軽鎖可変領域配列（配列番号２５）を構築するために、全長ＶＬ可変領域配列を二つの半体に分ける。Ｎ末端およびＣ末端半体をＰＣＲによって別々に組み立て、ＢｓｐＥＩ部位を介して一緒に連結させる。
【０１０９】
Ｎ末端半体は以下のごとく構築した：Ｎ鋳型（配列番号２７）は、ＶＬ領域のアミノ酸９ないし５１をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１２９量体）である（配列番号２６）。該鋳型は二つのプライマーによってＰＣＲ増幅した：
５’プライマー（配列番号２８）は、ＶＨ領域のアミノ酸１ないし１５をコード化する合成センス‐鎖オリゴヌクレオチド（４５‐量体）である。該プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【０１１０】
３’プライマー（配列番号２９）は、アミノ酸４５ないし５７をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４０量体）である。該プライマーは２１ヌクレオチドだけ鋳型と重複する。
【０１１１】
標準的な技術および手法を用い、Ｎ鋳型（配列番号２７）を、５’および３’プライマーの組（配列番号２８および２９）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１１２】
Ｃ末端半体は以下のごとく構築した：Ｃ鋳型（配列番号３０）は、ＶＨ領域のアミノ酸６１ないし１００をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（１２０量体）である（配列番号２６）。該鋳型は二つのプライマーによってＰＣＲ増幅する：
５’プライマー（配列番号３１）は、ＶＨ領域のアミノ酸５４ないし６７をコード化する合成センス鎖オリゴヌクレオチド（４３量体）である。該プライマーの３’端部は２１ヌクレオチドだけ鋳型の５’端部と重複する。
【０１１３】
３’プライマー（配列番号３２）は、ＶＨ領域のアミノ酸９４ないし１０７をコード化する合成アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド（４２量体）である。該プライマーおよび鋳型は２１ヌクレオチドだけ重複する。
【０１１４】
標準的な技術および手法を用い、Ｃ鋳型（配列番号３０）を、５’および３’プライマーの組（配列番号３１および３２）を用いてＰＣＲ増幅した。
【０１１５】
ＦＲ修繕１Ｆ５ＶＬドメインの構築のために、Ｎ鋳型（配列番号２７、１２９‐量体）、Ｃ鋳型（配列番号３０、１２０量体）およびそれらの各５’および３’プライマー（Ｎ鋳型についての配列番号２８および２９、およびＣ鋳型についての配列番号３１および３２）を自動Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーで合成した。ＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ−０TMカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を通すことによって、オリゴヌクレオチドを脱塩した。オリゴヌクレオチドを２０μＭの最終濃度に調整した。１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭのＭｇＣｌ2）および５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱTM ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の存在下で、種々の希釈（１０×、１００×、１０００×および１００００×等）における１μｌの鋳型オリゴヌクレオチドを５μｌのそれらの対応するフランキングプライマーと混合した。この反応混合物を１００μｌの最終容量に調整し、１分間の９４℃における変性、１．５分間の５０℃におけるアニーリング、および１分間の７２℃における重合よりなる３０サイクルのＰＣＲ反応に付した。２％アガロースゲル電気泳動下、ＰＣＲ反応混合物を分析した。正しいサイズの充分に豊富な産物を生起した最高の鋳型希釈を更なる処理のために選択する。
【０１１６】
ＮおよびＣ鋳型についての二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル‐精製し、ＳｐｅＩ部位で制限消化した。ＮおよびＣ二本鎖ＤＮＡをＢｓｐＥＩ部位において連結し、Ｎ鋳型についての５’プライマー（配列番号１２）およびＣ鋳型についての３’プライマー（配列番号１６）を用いて増幅した。〜３２０のサイズを持つＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化した。クローン化された断片の配列は、サンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒら，ｏｐ．ｃｉｔ．）によって設計されたＶＬ配列と同一であることが確認された。確認された配列を用いて、ＩｇＨプロモーター、Ｉｇエンハンサー、ヒト・カッパ定常領域ゲノム配列、および選択マーカーｈｙｇを含む軽鎖発現ベクターのＶＬを置き換えた。最終の軽鎖発現ベクターはｈｐ１Ｆ５ｐＳＭｋと命名する。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】マウス抗ＣＤ２２抗体ＲＦＢ４の重鎖（ＶＨ（Ａ））および軽鎖（ＶＬ（Ｂ））可変領域のアミノ酸配列（一文字コード）。ＣＤＲは四角で囲われている。
【図２Ａ−Ｂ】最高の相同性の異なるヒトＦＲにての、ＲＦＢ４の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域の区画化されたフレームワーク配列（ＦＲ）の比較。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を示す。ＣＤＲは四角で囲われている。ＦＲ配列の左側の括弧に入れたイタリック体はヒトＦＲの源を示す。対応するマウスＦＲのそれとは異なるヒトＦＲにおけるアミノ酸は太字で示す。
【図３】ＦＲ修繕抗体ｈｐＲＦＢ４の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域の最終設計配列（一文字コード）。ＣＤＲは四角で囲われている。元のマウスＦＲのそれとは異なるヒトＦＲにおけるアミノ酸を太字で示す。
【図４】還元および非還元双方の条件下での、精製されたｃＲＦＢ４およびｈｐＲＦＢ４のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析。
【図５】Ｒａｊｉ細胞に対するｃＲＦＢ４およびｈｐＲＦＢ４の結合特異性および親和性についてのフローサイトメトリー分析。対照として無関係な抗体を用いた。
【図６】ｃＲＦＢ４およびｈｐＲＦＢ４の間の結合親和性を比較する競合結合アッセイ。
【図７】マウス抗ＣＤ２０抗体１Ｆ５の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列（一文字コード）。ＣＤＲは四角で囲われている。
【図８Ａ−Ｂ】最高の相同性の異なるヒトＦＲを持つ１Ｆ５の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）可変領域の区画化フレームワーク配列（ＦＲ）の比較。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４が示される。ＣＤＲは四角で囲われている。ＦＲ配列の左側の横の括弧に入れたイタリック体は、ヒトＦＲの源を示す。対応するマウスＦＲのそれとは異なるヒトＦＲにおけるアミノ酸を太字で示す。
【図９】ＦＲ修繕抗体ｈｐ１Ｆ５の重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）の最終設計配列（一文字コード）。ＣＤＲは四角で囲われている。元のマウスＦＲのそれとは異なるヒトＦＲにおけるアミノ酸を太字で示す。ヒト配列によって置き換えていないマウスＦＲに下線を施す。
【図１０】１Ｆ５についてのＦＲ修繕可変領域の代替設計のアミノ酸配列（代替設計）。ＣＤＲは四角で囲われている。対応するマウスフレームワークのそれとは異なるヒトフレームワークアミノ酸は太字で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親の免疫グロブリンからの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ＦＲ１、ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４と定義された重鎖および軽鎖フレームワークセグメントを備えた可変領域を含む免疫グロブリンであって、重鎖の少なくとも２つのフレームワークセグメント並びに軽鎖の少なくとも２つのフレームワークセグメントはヒトまたは霊長類の免疫グロブリンからの対応するドナーフレームワークセグメントで置換され、重鎖のフレームワークセグメントは少なくとも３つの異なる免疫グロブリン重鎖からのものであり、軽鎖のフレームワークは少なくとも３つの異なる免疫グロブリン軽鎖からのものであることを特徴とする免疫グロブリン。
【請求項２】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントは置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項３】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲに隣接する３つのアミノ酸残基にて置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項４】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲに隣接する４つのアミノ酸残基にて置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項５】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲ/アンチゲン結合部位と相互作用することが知られる位置で対応する親ＦＲに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項６】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはオリジナルの親の免疫グロブリンからのものであることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項７】
ヒトＩｇＧ１定常領域およびヒトカッパ定常領域とをさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項８】
親の免疫グロブリンからの３つの重鎖および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワークセグメントとを備えた可変領域を含む免疫グロブリンを設計する方法であって、
Ａ．親の免疫グロブリンからのフレームワーク配列をＫａｂａｔ分類に従ってＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の区分されたセグメントに分割するステップと、
Ｂ．全フレームワークに代わって個別のフレームワークセグメントをヒトまたは霊長類の免疫グロブリン鎖の対応する配列と比較するステップと、
Ｃ．ヒトまたは霊長類のドナーフレームワークセグメントを選択して親の免疫グロブリンのオリジナルフレームワークセグメントを置換するステップ、または親の免疫グロブリンからのオリジナルフレームワークセグメントを維持するステップであって、重鎖のフレームワークセグメントは少なくとも３つの異なる免疫グロブリン重鎖からのものであり、軽鎖のフレームワークセグメントは少なくとも３つの異なる免疫グロブリン軽鎖からのものであるステップと、
を含んでいることを特徴とする方法。
【請求項９】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントは置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲに隣接する３つのアミノ酸残基にて置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲに隣接する４つのアミノ酸残基にて置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲ/アンチゲン結合部位と相互作用することが知られる位置で対応する親ＦＲに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはオリジナルの親の免疫グロブリンからのものであることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１４】
ヒトＩｇＧ１定常領域およびヒトカッパ定常領域とをさらに含んでいることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１】
親の免疫グロブリンからの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ＦＲ１、ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４と定義された重鎖および軽鎖フレームワークセグメントを備えた可変領域を含む免疫グロブリンであって、重鎖の少なくとも２つのフレームワークセグメント並びに軽鎖の少なくとも２つのフレームワークセグメントはヒトまたは霊長類の免疫グロブリンからの対応するドナーフレームワークセグメントで置換され、重鎖のフレームワークセグメントは少なくとも３つの異なる免疫グロブリン重鎖からのものであり、軽鎖のフレームワークは少なくとも３つの異なる免疫グロブリン軽鎖からのものであることを特徴とする免疫グロブリン。
【請求項２】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントは置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項３】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲに隣接する３つのアミノ酸残基にて置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項４】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲに隣接する４つのアミノ酸残基にて置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項５】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲ/アンチゲン結合部位と相互作用することが知られる位置で対応する親ＦＲに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項６】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはオリジナルの親の免疫グロブリンからのものであることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項７】
ヒトＩｇＧ１定常領域およびヒトカッパ定常領域とをさらに含んでいることを特徴とする請求項１記載の免疫グロブリン。
【請求項８】
親の免疫グロブリンからの３つの重鎖および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワークセグメントとを備えた可変領域を含む免疫グロブリンを設計する方法であって、
Ａ．親の免疫グロブリンからのフレームワーク配列をＫａｂａｔ分類に従ってＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の区分されたセグメントに分割するステップと、
Ｂ．全フレームワークに代わって個別のフレームワークセグメントをヒトまたは霊長類の免疫グロブリン鎖の対応する配列と比較するステップと、
Ｃ．ヒトまたは霊長類のドナーフレームワークセグメントを選択して親の免疫グロブリンのオリジナルフレームワークセグメントを置換するステップ、または親の免疫グロブリンからのオリジナルフレームワークセグメントを維持するステップであって、重鎖のフレームワークセグメントは少なくとも３つの異なる免疫グロブリン重鎖からのものであり、軽鎖のフレームワークセグメントは少なくとも３つの異なる免疫グロブリン軽鎖からのものであるステップと、
を含んでいることを特徴とする方法。
【請求項９】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントは置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲに隣接する３つのアミノ酸残基にて置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲに隣接する４つのアミノ酸残基にて置換ＦＲセグメントに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはＣＤＲ/アンチゲン結合部位と相互作用することが知られる位置で対応する親ＦＲに対して７１％以上の相同性を有していることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの前記ドナーフレームワークセグメントはオリジナルの親の免疫グロブリンからのものであることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１４】
ヒトＩｇＧ１定常領域およびヒトカッパ定常領域とをさらに含んでいることを特徴とする請求項８記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−６２３６７（Ｐ２００９−６２３６７Ａ）
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２５５６３（Ｐ２００８−２２５５６３）
【出願日】平成２０年９月３日（２００８．９．３）
【分割の表示】特願２００３−５０８９８７（Ｐ２００３−５０８９８７）の分割
【原出願日】平成１４年６月１０日（２００２．６．１０）
【出願人】（５０３４６１６６３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月３日（２００８．９．３）
【分割の表示】特願２００３−５０８９８７（Ｐ２００３−５０８９８７）の分割
【原出願日】平成１４年６月１０日（２００２．６．１０）
【出願人】（５０３４６１６６３）
【Ｆターム（参考）】
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