フローセルデバイス
マイクロアレイシステムが開示される。マイクロアレイシステムは、平板基板上に形成されるマイクロアレイおよびマイクロアレイの周囲に形成されるインキュベーションチャンバーを含む。インキュベーションチャンバーは、その上にマイクロアレイが形成される底面および底面と対面しかつ通常は底面と平行である上面を含む複数の内面を有する。複数の内面のうち少なくとも１つは親水性面である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本明細書は、いずれもその全文が本明細書に参照文献として援用されている２００８年５月９日に出願された米国特許出願第１２／１４９，８６５の一部継続出願であり、かつ２００９年７月２４日出願の米国仮特許出願第６１／２１３，８８７号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野は、生体分子の検出、および、具体的には、標的捕捉面を含む反応チャンバー、廃液チャンバー、および反応チャンバーと廃液チャンバーを接続する可変幅導管を有するフローセルデバイスである。
【背景技術】
【０００３】
マイクロアレイは、複数の検出反応を同時に遂行することによってサンプルの複雑な分析を実施する大きな可能性をもたらす。典型的には、反応物分子の複数スポットのマイクロアレイを、顕微鏡用スライドグラスなどの平面基板上に、通常は２次元グリッドパターンで形成する。次に、液状サンプルおよび試薬をスライドに塗布して複数のスポットと同時に接触させる。マイクロアレイ中の結合分子により、結合した反応物分子の液状サンプルおよび試薬への曝露および洗浄のステップを含めて、多様な反応段階を実施してもよい。スライド上に固定された材料または液状サンプル中の材料をキャラクタライゼーションするため、反応の進捗または結果をマイクロアレイの各スポットにおいてモニタリングしてもよい。
【０００４】
マイクロアレイ分析は、通常数分から数時間のインキュベーション時間を要する。インキュベーション時間の長さは測定に依存し、かつ反応物の種類、混合度、サンプルの体積、標的コピー数、およびアレイの密度などの多様な因子によって決定される。インキュベーション時間中、液状サンプル中の標的分子はマイクロアレイプローブと密に接触しなければならない。通常、インキュベーションはインキュベーションチャンバーで実施される。インキュベーションチャンバーは、典型的にはマイクロアレイの周囲にガスケットを形成することによって形成される。ガスケットをカバースリップで被覆して密封チャンバーを形成する。カバースリップは、インキュベーション後のマイクロアレイの光学的照合を可能とするために、ガラスなどの透明な材料で製造することができる。
【０００５】
カバースリップが入口ポートおよびベントを有していない場合、カバースリップをガスケットの上部に載置する前に、液状サンプルおよび他の試薬をインキュベーションチャンバーに加える必要がある。反応混合物をガスケットの縁まで満たす場合、反応混合物がガスケットの側面より漏れ出し、ガスケット／カバーの密封を崩壊させて環境を汚染するリスクを高めることもある。充填およびベント用の穴を有するカバースリップはこれら２つの問題を回避する。しかし、カバースリップの穴からのインキュベーションチャンバーの充填には、しばしばインキュベーションチャンバーへの気泡またはエアポケットの導入というリスクがある。さらに、液状サンプルまたは反応混合物の表面張力が、液状サンプルまたは反応混合物による反応チャンバーの完全な充填を妨害することもある。部分的に充填されたチャンバーは、エアポケットがアレイスポットを覆いかつアレイスポットと液状サンプルまたは反応混合物との接触を妨害した場合に偽陰性となることもある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
標的分子を検出することを目的としたフローセルデバイスが開示される。フローセルデバイスは反応チャンバー、廃液チャンバー、入口ポート、反応チャンバーを入口ポートと接続する第１の導管、および反応チャンバーを廃液チャンバーと接続する第２の導管を含む。反応チャンバーは入口、出口、マイクロアレイ、およびチャンバーの上面および下面のうちいずれか一方にある親水性領域を有する。廃液チャンバーは、液状物が毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動することを可能とする吸収剤を有する。
【０００７】
標的分子を検出することを目的としたデバイスも開示される。デバイスは、入口、出口、標的分子と特異的に結合する標的捕捉面、および反応チャンバーの上面および底面のうち少なくとも一方にある親水性領域を有する反応チャンバー；液状物を毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動させることができる吸収剤を有する廃液チャンバー；および反応チャンバーを廃液チャンバーと接続する可変幅導管を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
発明を実施するための形態は、同様の番号が同様の要素を指す以下の図面を参照するであろう。
【０００９】
【図１】マイクロアレイシステムのインキュベーションチャンバーの実施形態の模式図である。
【図２】貫通するピペットチップを有するサポートハウジング内のドームバルブの模式図である。
【図３】廃液チャンバーを有するマイクロアレイシステムの実施形態の模式図である。
【図４】廃液チャンバーを有するマイクロアレイシステムの他の実施形態の模式図である。
【図５】一体型マイクロアレイシステムの実施形態の模式図である。
【図６】一体型マイクロアレイシステムの他の実施形態の模式図である。
【図７】一体型マイクロアレイアセンブリの構成要素を示す模式図である。
【図８】図７のアセンブリ用のスペーサーテープを示す模式図である。
【図９】図８のスペーサーテープの接着剤と結合する図７のアセンブリの上面フィルムを示す模式図である。
【図１０】厚みのある吸着材を考慮したスペーサーテープを示す模式図である。
【図１１】図９および１０におけるスペーサーのポケットに嵌合する吸収剤の模式図である。
【図１２】ベント孔を有する廃液チャンバー用のカバーを示す模式図である。
【図１３】ＰＣＲマイクロアレイシステムにおいてサンプル分析を実施するための方法を示すフローチャートである。
【図１４】プロテインマイクロアレイシステムにおいてサンプル分析を実施するための方法を示すフローチャートである。
【図１５】１５Ａおよび１５Ｂ「ストリッププロテインアレイ」および「ストリッププロテインアレイ」を含むよう適合させたプロテインマイクロアレイシステムの実施形態を示す。
【図１６Ａ】廃液チャンバーへの液状物の吸い上げを評価するために用いられる４つのマイクロアレイインキュベーションチャンバーアセンブリを示すピクトゥである。
【図１６Ｂ】図１６Ａのマイクロアレイインキュベーションチャンバーアセンブリを用いたハイブリダイゼーションの結果を示すピクトゥである。
【図１７Ａ】一体型マイクロアレイシステムの実施形態を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａのマイクロアレイシステムによるハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図１８Ａ】マイクロアレイシステムの実施形態の模式図である。
【図１８Ｂ】図１８Ａのマイクロアレイシステムによるハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図１８Ｃ】図１８Ａのマイクロアレイシステムのアレイマップである。
【図１９】チップマップ、プロテインアレイシステム、および実施例６の代表的なアレイの画像を示す図の組合せである。
【図２０】ガラス基板を有するマイクロアレイシステム上で増幅、つづいて洗浄および乾燥ステップを行った精製ＭＲＳＡ標的３００ｐｇの結果を示す。
【図２１Ａ】マイクロアレイシステムの反応チャンバーに含まれ、かつ図２０、２２および２３のためのデータを取得するために用いられたマイクロアレイのＭＲＳＡチップマップ。チップマップは、試験の信頼性を高めかつ４分区間の間での非均一性を評価するために４つの反復を有する。
【図２１Ｂ】チップマップと関連付けたプローブのリスト。同一ターゲット用のプローブは長さおよび配列が異なる。プローブ配列９および２９はメチシリン耐性を付与するｍｅｃＡ遺伝子に由来する。プローブ１４および４２は全てのＳｔａｐｈ株に存在するｔｕｆＡ遺伝子に由来する。プローブ１８、１９、３１および４３はｔｕｆＡ遺伝子に由来するが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにのみ特有である。プローブ３５、３６および３７はＳ．ａｕｒｅｕｓとｍｅｃＡカセットの接合領域を標的とする。
【図２２】ガラス基板を有するマイクロアレイシステム上で増幅し、その後液状物中で読み取った精製ＭＲＳＡ標的１ｎｇの結果を示す。
【図２３】乾燥ステップのないプラスチック基板上の精製３００ｐｇＭＲＳＡ標的の結果を示す。
【図２４】以下の条件下でＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ遺伝子１０４コピーによって攻撃されたアレイの原像の組合せである：パネル（ａ）試験管内で増幅、バイオチップ上でハイブリダイゼーション、ピペッターで洗浄、かつオンチップ乾燥の手順；パネル（ｂ）バイオチップ上でＰＣＲ増幅、ピペッターで洗浄、かつオンチップ乾燥の手順；パネル（ｃ）試験管内で増幅、フレームシール内のアレイ上でハイブリダイゼーション、フレームシールを除去、バス内で洗浄、かつ風乾の手順。パネル（ｄ）は画像と対応するアレイマップである。パネル（ｂ）のオンチップ増幅はマスターミックス中にハイブリダイゼーションマーカーがないので、ハイブリダイゼーションマーカーはパネル（ａ）および（ｃ）の画像内でのみ視認できることに留意されたい。
【図２５】以下の各条件における信号雑音比を比較する図である：１）バイオチップ上で増幅およびハイブリダイゼーションした後ピペッティング洗浄しさらにオンチップ乾燥するプロトコル、２）バイオチップ増幅した後ピペッティング洗浄するプロトコル、および３）試験管増幅した後フレームシールハイブリダイゼーションし、バス内で洗浄し、風乾。各例ともＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ遺伝子１０４コピーを増幅した。２つの標的の積分スポット強度よりローカルバックグラウンドを減算し、ｄＮ２０ナンセンススポットを用いて表示の比率を算出する。画像は、オーロラポートアレイ５０００を用いて、スポットが飽和値寸前となる長さまでの露出時間で画像を撮像した。
【図２６】以下の各条件における平均雑音（ｄＮ２０）信号を比較する図である：１）バイオチップ増幅の後１×ＳＳＰＥ ７５μＬおよび水２５μＬでピペッター洗浄；２）バイオチップ増幅の後１×ＳＳＰＥ １７５μＬおよび水２５μＬでピペッター洗浄；および３）試験管で増幅し、フレームシール内でハイブリダイゼーションし、マイクロアレイバス内でアレイを洗浄。インプットサンプルは、バイオチップおよびフレームシールのいずれについてもＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ遺伝子１０４コピーである。バイオチップはオーロラポートアレイ５０００で０．２秒間撮像した。ｄＮ２０（ナンセンスプローブ）スポットをスポットファインダーで同定し、さらに４つのｄＮ２０スポットの各積分蛍光強度よりローカルバックグラウンドを減算して平均し、最大値と最小値を表す誤差棒と共にプロットする。ｄＮ２０ナンセンスプローブは増幅反応由来の生成物などの標識化標的との非特異的結合により蛍光を発するため、ｄＮ２０信号は洗浄効果と反比例する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
この記載は、本発明の書面による記載全体の一部と見なすべき、添付の図面と関連付けて読まれることを意図している。図面は必ずしも縮尺を定めるものではなく、かつ明確性および簡潔性を目的とし、縮尺においてまたは幾分模式的な形態で、本発明の一定の性質が誇張して示されてもよい。記載においては、「前方」「後方」「上方」「下方」、「上部」および「底部」などの相対的な用語およびそれらの派生語は、その後に記載されるかまたは考察対象の図面に示されるところの方向を指すと解釈すべきである。これらの相対的な用語は、記載の簡便性を目的とし、かつ通常は特定の方向を要求することを意図していない。「連結された」および「接続された」などの接続、連結などに関する用語は、特に説明的に記載されない場合、構造物が介在構造、さらには両者が可動または剛直接続または関係を介して互いに直接的または間接的に固定または接続されることを特徴とする関係を指す。
【００１１】
本明細書に記載するところの用語「標的捕捉面」は、標的分子と特異的に結合する面を指す。標的捕捉面は、オリゴヌクレオチドプローブ、抗原、または抗体などの標的捕捉材料によってコーティングされる面であってもよい。標的捕捉面は、ヌクレオチドと特異的に結合する焼結ガラスフリット面などの、標的分子に対する特異的親和性を示す非コーティング面であってもよい。一部の実施形態においては、標的捕捉面はマイクロアレイを含む。
【００１２】
本明細書で用いるところの用語「マイクロアレイ」は、目的のリガンドとの結合のために提供された整列したスポットのアレイを指す。マイクロアレイは少なくとも２つのスポットからなる。目的のリガンドは核酸（例：分子ビーコン、アプタマー、ロックされた核酸、ペプチド核酸）、タンパク質、ペプチド、多糖類、抗体、抗原、ウイルスおよび細菌を含むが、これに限定されない。
【００１３】
本明細書で用いるところの用語「親水性面」は、そのような面上に静置した純水の水滴と６０°またはそれ以下の接触角を形成するような面を指す。本明細書で用いるところの用語「疎水性面」は、そのような面上に静置した純水の水滴と６０°よりも大きな接触角を形成するような面を指す。接触角は接触角角度計を用いて測定することができる。
【００１４】
本明細書に記載するところの用語「インキュベーションチャンバー」は、標的捕捉面またはマイクロアレイの周囲の密封された空間を指す。インキュベーションチャンバーは、液状サンプルで満たされるとき、液状サンプル中の標的分子が標的捕捉面またはマイクロアレイプローブと密接な接触を維持できるよう、標的捕捉面またはマイクロアレイが液状サンプルによって浸されることを可能とする。
【００１５】
本明細書においては、オンチップ増幅は、マイクロアレイを含むインキュベーションチャンバー内の溶液中で標的分子の対称または非対称増幅が発生するプロセスと定義される。
【００１６】
マイクロアレイシステムフォーマットにおいては他の増幅スキーム、たとえば同一または異なる濃度比の１つまたはそれ以上のプライマーがマイクロアレイ上に固定され、かつアレイ上で全体的または部分的に増幅が起こるものなどが可能である。追加的なプライマーを、アレイ上に固定されたプライマーと同一または異なる順番でチャンバー内に溶液として加えてもよい。これらの増幅スキームは、ＤＮＡまたはＲＮＡ酵素を用い、等温でまたは温度サイクルを用いて行うことができる。実施例は：アレイ化プライマー拡張（ＡＰＥＸ）、マルチプレックスマイクロアレイ促進ＰＣＲ（ＭＭＥ−ＰＣＲ）、ブリッジ増幅、単一ヌクレオチド取り込み、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、増幅抵抗性変異系（ＡＲＭＳ）およびインベーダーテクノロジーを含む。
【００１７】
マイクロアレイシステムに使用できる他の核酸反応は連結、エキソまたはエンドヌクレアーゼによる制限酵素消化、ニッキング酵素開裂、ハイブリダイゼーション保護測定（ＨＰＡ）または翻訳を含む。
【００１８】
上に指摘したように、液状サンプルまたは反応混合物の表面張力は、液状サンプルまたは反応混合物が、マイクロアレイシステムのインキュベーションチャンバーといった小さな空間を完全に充填することを妨害することが多い。表面張力は、多様な分子間力による液状物の分子間引力の結果である。液状物の本体においては、各分子は隣接する液状物分子によって全方向に同等に引かれ、その結果正味の力はゼロとなる。液状物の表面においては、分子は液状物内部のより深いところにある他の分子によって内向きに引かれ、かつ隣接する媒体内（真空、空気または他の液状物の場合）の分子によっては強く引かれない。したがって、表面にある全ての分子は内向きの分子引力を受け、これは圧縮に対する液状物の抵抗によってのみ均衡することができる。この内向きの引力は表面積を減少させる傾向があり、この点で液状物の表面は伸長した弾性膜と類似している。したがって、液状物は局部的に可能な最も小さな表面積となるまで密に収縮する。最終的な結果は、液状物が小空間内でほぼ球状の形態を維持し、かつ角、特に小空間内の立方体の角を満たさないというものである。マイクロアレイの面より被覆を離隔する典型的な小さな空隙は、しばしば液状物を円柱状の形態に圧縮する。
【００１９】
フローセルデバイスの場合、インキュベーションチャンバーを満たす液状物は、ハイブリダイゼーションバッファーまたは洗浄バッファーなどの水ベースの液状物である可能性が最も高い。水ベースの液状物の表面張力は、インキュベーションチャンバーの内面の少なくとも一部を親水性材料によってコーティングすることにより克服しうる。
【００２０】
本明細書に記載されるのは、標的捕捉面、および液状物がチャンバー内に入る際にこれと接触する親水性面を含むインキュベーションチャンバーを有するフローセルシステムである。液状物がチャンバーに流入する際にこれと接触する親水性面の使用によって、インキュベーションチャンバーの完全な充填が可能となる。一部の実施形態においては、親水性面はインキュベーションチャンバーの完全な上面を形成する。他の実施形態においては、標的捕捉面はマイクロアレイを含む。
【００２１】
図１はインキュベーションチャンバーの１つの実施形態を示す。この実施形態においては、平面基板３０の上面３２上にプリントまたは形成された複数のアレイスポット２２よりなるマイクロアレイ２０の周囲にインキュベーションチャンバー１０が形成される。面３２はインキュベーションチャンバー１０の底面も形成する。チャンバー１０の上面はカバースリップ４０によって被覆される。インキュベーションチャンバー１０は、典型的にはガラスまたはプラスチックスライドである平面基板３０のサイズと適合するあらゆるサイズまたは形状とすることができる。一部の実施形態においては、平面基板３０はリールトゥリール製法用に巻き取ることのできるプラスチックフィルムである。１つの実施形態においては、プラスチックフィルムはポリエステルである。
【００２２】
この実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０は平面基板３０の上部にガスケット３４を載置し、かつガスケット３４をカバースリップ４０で被覆することによって形成される。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０は平面基板３０にポケットまたは陥凹領域を作成し（たとえば成形またはエッチングなどによって）、マイクロアレイ２０をポケットまたは陥凹領域の底部にプリントし、かつポケットまたは陥凹領域をカバースリップ４０によって被覆することによって形成される。さらに他の実施形態においては、ポケットまたは陥凹領域はカバースリップ４０上に形成され、その後これを平面基板３０の上部に直接載置することによって形成される。
【００２３】
インキュベーションチャンバー１０は、インキュベーションチャンバー１０内でのハイブリダイゼーションまたは他のあらゆる反応に必要な液状物の体積を減少するよう、マイクロアレイ２０の周囲に形成される。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバーは約０．１〜１０ｃｍ２，好ましくは約０．２５〜２．５ｃｍ２の底面積、および約０．０５〜５ｍｍ、好ましくは約０．１〜１ｍｍの高さを有する。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバーの総容積は約１〜２５０μＬの範囲内である。
【００２４】
インキュベーションチャンバー１０は、その形態に応じ、その上にマイクロアレイ２０が形成される底面、底面と下方に向き合いかつ通常は底面と平行である上面、および１つまたはそれ以上の側面を含むいくつかの内面を有する。インキュベーションチャンバー１０の均一な充填を担保するために、全ての内面を親水性とする必要はない。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面のみが親水性である。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の底面のみが親水性である。他の実施形態においては、上面および底面が共に親水性である。さらに他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の全ての内面が親水性である。
【００２５】
親水性面は水を誘引する面である。親水性面は、典型的には電荷分極しかつ水素結合することのできる分子を含む。１つの実施形態においては、平面基板３０またはカバースリップ４０は親水性材料より製造され、かつこれによりそれぞれ親水性底面または親水性上面を提供する。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面または底面が不溶性親水性材料によってコーティングされる。親水性材料の例はポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル、ビオナイト、ポリ（Ｎ−ビニルラクタム）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリアクリルアミド、セルロース系材料、メチルセルロース、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、アルキルフェノールエトキシラート、複合ポリオールモノエステル、オレイン酸ポリオキシエチレンエステル、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンエステル、および脂肪酸ソルビタンエステルなどの親水性ポリマー；無機酸化物、金、ゼオライトおよびダイヤモンド様炭素などの無機親水性材料；およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、アルキル硫酸塩、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、アルキルベンゼンスルホン酸、石けん、脂肪酸塩、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）別名臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、アルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化牛脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミンオキシド、コカミドプロピルベタイン、ココヤシ両性グリシナートアルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（市販名はポロキサマーまたはポロキサミン）、アルキルポリグルコシド、脂肪アルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、コカミドＴＥＡなどの界面活性剤を含むが、これに限定されない。界面活性剤はポリウレタン類およびエポキシ類などの反応性ポリマーと混合して親水性コーティングの役割を果たすことができる。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面または底面が雰囲気プラズマ処理によって親水性とされる。
【００２６】
代替的に、インキュベーションチャンバーの底面または上面が市販の親水性テープまたはフィルムによって被覆されてもよい。親水性テープの例はアドヒーシブズ・リサーチ（ＡＲ）テープ９０１２８、ＡＲテープ９０４６９、ＡＲテープ９０３６８、ＡＲテープ９０１１９、ＡＲテープ９２２７６およびＡＲテープ９０７４１（アドヒーシブズ・リサーチ社、ペンシルバニア州グレンロック）を含むが、これに限定されない。親水性フィルムの例は（フィルムスペシャリティーズ社、ニュージャージー州ヒルズバラ）製のビステックス（登録商標）およびビスガードフィルムおよびレクサンＨＰＦＡＦ（ＧＥプラスチックス、マサチューセッツ州ピッツフィールド）を含むが、これに限定されない。他の親水性面はサーモディクス社（ミネソタ州イーデンプラリー）、バイオコート社（ペンシルバニア州ホーシャム）、アドバンスドサーフェステクノロジー（マサチューセッツ州ビルリカ）、およびハイドロマー社（ニュージャージー州ブランチバーグ）より入手できる。
【００２７】
１つの実施形態においては、親水性テープまたはフィルムはインキュベーションチャンバーの上面からのマイクロアレイの光学的照合を可能とするのに十分な透明性を有する。他の実施形態においては、親水性面はインキュベーションチャンバーの上面を親水性コーティングによって被覆することにより作成される。他の実施形態においては、親水性面は単純にカバースリップ４０を親水性テープまたは親水性フィルムと置換することによって作成される。
【００２８】
さらに他の実施形態においては、親水性面は細胞膜を溶解し、タンパク質を変性させ、かつ核酸を捕捉する化学物質を含浸させた親水性マトリクスである。親水性マトリクスはサンプルの精製およびサンプルのインキュベーションチャンバー内への均一な吸い上げという２つの機能を果たすであろう。１つの実施形態においては、親水性マトリクスはＦＴＡ紙（登録商標）（ワットマン社、ニュージャージー州フローハムパーク）である。生体サンプルをＦＴＡ紙に塗布すると、サンプルに含まれる細胞が紙の上で溶解する。紙を洗浄して全ての非ＤＮＡ材料を除去する（ＤＮＡは紙に絡め取られて残る）。次に、続いてマイクロアレイ分析を実施するためにＤＮＡを溶離する。代替的に、結合したＤＮＡを原位置で増幅し、溶離ステップを実施せずにマイクロアレイ検出を実施してもよい。
【００２９】
ＦＴＡ紙（登録商標）はアレイの対向面（すなわちインキュベーションチャンバーの上面）として用いることができる。代替的に、マイクロアレイをＦＴＡ紙にプリントしてもよく、さらにインキュベーションチャンバーの上面の透明なカバースライドによってマイクロアレイの可視化が可能となるであろう。他の実施形態においては、ＦＴＡ紙（登録商標）上の核酸サンプルの増幅を目的として、ＰＣＲ試薬をインキュベーションチャンバー内に導入してもよい。この実施形態においては、増幅はインキュベーションチャンバー１０の内部で実施されるであろう。
【００３０】
マイクロアレイ２０は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびプロテインマイクロアレイを含むがこれに限定されないあらゆる種類のマクロアレイとすることができる。１つの実施形態においては、マイクロアレイ２０は、たとえばいずれもその全文が本明細書に参照文献として援用される米国特許第５，７４１，７００号、第５，７７０，７２１号、第５，９８１，７３４号、第６，６５６，７２５号および米国特許出願第１０／０６８，４７４号、第１１／４２５，６６７号および第６０／７９３，１７６号に記載されるプリントゲルスポット法を用いて形成される。
【００３１】
他の実施形態においては、マイクロアレイシステムは液状物（例：サンプル、標的を含有するＰＣＲバッファー、ハイブリダイゼーションバッファー、または洗浄バッファー）をインキュベーションチャンバー１０に導入するための一方向バルブをさらに含む。生物兵器の検出など一定の用途においては、重要な懸念となる環境汚染を予防するために、サンプルは一方向バルブよりインキュベーションチャンバー１０に導入される。１方向バルブはチェックバルブであっても、またはインキュベーションチャンバー１０の入口ポートに載置するドームバルブであってもよい。多様なサイズのドームバルブが市販されている（例：マルチバルブ・インターナショナル製、オハイオ州イエロースプリングス）。図２に示す実施形態においては、ドームバルブ５０は２つのコンポーネント：ドーム型のバルブ本体５２およびバックシール５４を含む。バックシールは、イントロデューサー５６がバックシール５４を貫通することを可能とする穴（示さず）を有する。イントロデューサー５６は、バックシール５４を貫通するためのとがった先端を有するあらゆる液状物送達デバイスであってよい。この実施形態においては、イントロデューサー５６はピペットチップである。他の実施形態においては、イントロデューサー５６は注射針である。
【００３２】
ドームバルブ５０はイントロデューサー５６による容易なアクセスを可能とし、かつイントロデューサー５６の先端がバックシール５４よりドームバルブ５０内に入る際に先端に適合する。イントロデューサー５６の抜去後、バックシール５４の開口部は自然に閉鎖してサンプルがドームバルブ５０よりインキュベーションチャンバー１０外に漏出することを防止する。したがって、ドームバルブ５０は刺入可能な隔壁およびチェックバルブの両方の役割を果たす。ドームバルブは、支持構造５８を介してマイクロアレイアセンブリに設置してもよい。１つの実施形態においては、ドームバルブは入口ポート１１および入口導管１４を経てインキュベーションチャンバー１０と接続される（図３）。
【００３３】
さらに他の実施形態においては、マイクロアレイシステムはさらに廃液チャンバーを含む。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００（商標）マイクロアレイリーダーなどの多くの光学リーダーは、乾燥した画像を読み取るとき信号雑音比が改善する。したがって、マイクロアレイをマイクロアレイリーダーに載置する前に液状物をインキュベーションチャンバーより除去するために、廃液チャンバーをマイクロアレイシステムに組み込むことが有利である。今度は図３を参照すると、インキュベーションチャンバー１０は同一のマイクロアレイスライド上に形成された廃液チャンバー６０に接続される。
【００３４】
廃液チャンバー６０はあらゆる形状とすることが可能であり、かつ典型的にはインキュベーションチャンバー１０の容積よりも大きな容積を有している。１つの実施形態においては、廃液チャンバーはガスケットテープに形成された後、その上にマイクロアレイ２０がプリントされた基板３０（図１参照）と接着される。さらに他の実施形態においては、基板３０はその上面に切り欠きを有する。廃液チャンバー６０が一旦基板３０とガスケット３４の間に形成された後にインキュベーションチャンバー１０の深さよりも大きな深さを有するよう、切り欠きはガスケット３４の廃液チャンバー６０のサイズおよび位置と適合するサイズおよび位置を有する。他の実施形態においては、基板３０に切り欠きを容易に作成できるよう、基板３０はプラスチック材料で製造される。さらに他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０はいずれもガスケット３４を用いることなく基板３０上に形成される。しかし、廃液チャンバー６０はインキュベーションチャンバー１０の深さよりも大きな深さを有してもよい。
【００３５】
１つの実施形態においては、廃液チャンバー６０は、一旦インキュベーションチャンバー１０が液状物と接触すると、インキュベーションチャンバー１０より液状物を吸い上げ、それによりマイクロアレイ２０が乾いた状態で読み取られること可能とする吸収剤６２を含む。
【００３６】
吸収剤６２は比較的大量の液状物を保持することのできるあらゆる材料とすることができる。１つの実施形態においては、吸収剤６２は繊維の凝集物より製造される。他の実施形態においては、吸収剤６２はスルーエアーボンディング工程で生成された不織布である。不織布の構成繊維は親水性合成繊維、パルプなどの天然セルロース繊維、または再生セルロース繊維とすることができる。繊維は、液状物吸収を向上させるために界面活性剤または親水性油をコーティングしたり、または浸透させてもよい。本明細書における使用のための不織布は、スルーエアーボンディング工程に限定されず、スパンボンディング工程、エアーレイング工程、スパンレーシング工程などの他のあらゆる工程によって製造してもよい。１つの実施形態においては、吸収剤６２はミリポア社（マサチューセッツ州ビルリカ）製のセルロース紙（Ｃ０４８）である。
【００３７】
再度、図３を参照すると、廃液チャンバー６０は導管１２を介してインキュベーションチャンバー１０に接続される。導管１２は二重の目的を果たす。導管１２は、液状物で満たされるときにインキュベーションチャンバー１０と廃液チャンバー６０の間の液状物経路を提供する。空気で満たされるとき、導管１２はインキュベーションチャンバー１０を廃液チャンバー６０から離隔し、廃液チャンバー６０内の吸収剤６２による早すぎる吸い上げを防止する。
【００３８】
インキュベーションチャンバー１０内の液状物は、インキュベーションチャンバー１０内部の液状物を導管１２に押出し、かつ導管１２内の液状物と廃液チャンバー６０内の吸収剤６２との接触を確率させることによって除去される。接触は、インキュベーションチャンバー１０内の液状物に圧力を加えて液状物を導管１２から押し出すことによって、あるいは廃液チャンバー６０のベント６４に吸引を行って導管１２内の液状物を引き出すことによって確立してもよい。インキュベーションチャンバー１０内の液状物に対する圧力は、ドームバルブ５０から（例：ピペットまたはシリンジを用いて）圧力をかけることにより生成してもよい。インキュベーションチャンバー１０が親水性テープまたは親水性フィルムによってのみ被覆される場合、インキュベーションチャンバー１０内部の液状物に対する圧力はインキュベーションチャンバー１０の上面を形成する親水性テープまたはフィルムを単純に押すことによって生成してもよい。代替的に、導管１２中の液状物と吸収剤６２との接触は、吸収剤６２が導管１２内の液状物に触れるまで吸収剤６２を導管１２に向かって移動させることにより確立される。
【００３９】
一旦接触が確立されたならば、インキュベーションチャンバー１０内の液状物を、導管１２を経て廃液チャンバー６０内の吸収剤６２中に吸い上げる。液状物の流量は導管１２のサイズ、液状物の表面張力および粘度、および吸収剤６２の吸い上げ速度によって決定される。さらに、吸収剤がより飽和するにつれて流量は減少する。流量は、廃液チャンバー６０内への吸収剤６２の留置によって制御することもできる。導管１２の出口近傍に留置した吸収剤は、より離れて留置した吸収剤よりも高い流量をもたらす。したがって、吸収剤６２の隅を切り落とすことによって、導管１２の出口と吸収剤６２の距離の増加によるより遅い流量がもたらされる。
【００４０】
気泡がインキュベーションチャンバー１０内に導入される場合、気泡が導管１２内に滞留しかつ導管１２内の液状物の流動を部分的または完全に遮断することがある。気泡が液状物と吸収剤６２のまさに接触面に位置する場合、気泡が吸収剤６２の吸い上げ作用も停止させることがある。この問題は図４に示す導管の設計によって克服することができる。この実施形態においては、導管１２は３つのセクション：入口セクション１５、漏斗型接続セクション１６および出口セクション１７を含む。出口セクション１７は入口部分１５の直径よりも小さな直径を有する。より小さな直径は、出口セクション１７において、入口部分１５への圧よりも高い毛細管圧をもたらす。圧の差は出口セクション１７への液状物の移動に至る。操作中、すでに出口セクション１７にある液状物は出口セクション１７の外に押し出されかつ液状物と吸収剤６２の接触部分のエアーポケットの周囲を通過する。漏斗型接続部分１６は、導管の毛管現象による早すぎる吸い上げを防止するオーバーフロー領域を提供する。他の実施形態においては、出口セクション１７はより直径の大きな第１の部分（図４のセクション１７の水平部分に相当）およびより直径の小さな部分（廃液チャンバー６０に流入するセクション１７の垂直部分に相当）の２つのサブセクションにさらに分割される。
【００４１】
インキュベーションチャンバー１０におけるハイブリダイゼーションまたは増幅プロセスが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における熱サイクリングの変性ステップのような加熱ステップを包含する場合、インキュベーションチャンバー１０の内部の液状物が導管１２より押し出され、かつインキュベーションチャンバー１０内の圧力上昇により吸収剤６２との早すぎる接触を行うこともある。これらの状況下では、吸収剤６２による早すぎる吸い上げを防止するために、（インキュベーションチャンバー１０が充填される際に）導管１２内に意図的に空気を残してもよい。代替的に、吸収剤６２による早すぎる吸い上げを防止するために導管１２の内部に疎水性停止装置を配置してもよい。１つの実施形態においては、疎水性停止装置は疎水性内面を有する導管セクションを含む。１つの実施形態においては、疎水性面は未処理の導管面をテフロン（登録商標）、シリコンまたはシランなどの疎水性材料でコーティングまたは処理することにより形成される。他の実施形態においては、導管１２の内面は親水性材料によってコーティングされ、かつ疎水性停止装置は未処理の疎水性プラスチック材料を露出する非コーティング面を有する導管１２のセクションを含む。
【００４２】
他の実施形態においては、吸い上げが適切な間隔で起こることを担保するために、インキュベーションチャンバー１０を複数の廃液チャンバー６２と接続する。
【００４３】
均一に充填するための親水性インキュベーションチャンバー、サンプルの汚染を防止するための１方向バルブ、およびインキュベーションチャンバーから液状物を除去するための廃液チャンバーを有する一体型マイクロアレイシステムも、本明細書に記載される。今度は図５を参照すると、一体型マイクロアレイシステム１００の１つの実施形態は、基板３０上にプリントまたは形成されたマイクロアレイ２０、マイクロアレイ２０の周囲に形成された親水性インキュベーションチャンバー１０、導管（示さず）を介したインキュベーションチャンバー１０との流体連絡路内のドームバルブ５０、および導管１２を介してインキュベーションチャンバー１０と接続される廃液チャンバー６０を含む。吸収剤６２は、ベント６４を介して大気にベントされた廃液チャンバー６０に組み入れられる。透明親水性カバー７０はインキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０の上面を形成する。１つの実施形態においては、ベント６４は単純に廃液チャンバー６０のカバーに穴を打ち抜くことによって作成される。
【００４４】
親水性テープまたはフィルムによってインキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０を被覆することの長所のひとつは、薄いフィルムまたはテープが圧力下で変形することができることである。したがって、廃液チャンバーにわずかな圧を加えることによりインキュベーションチャンバー１０内で液状物を混合することが可能であり、これによりインキュベーションチャンバー１０にわずかな変形が、さらにこれによりインキュベーションチャンバー１０内における液状物の移動が引き起こされるであろう。
【００４５】
図６は、反応チャンバー１０、廃液チャンバー６０および洗浄バッファーチャンバー８０を含むマイクロアレイシステム１００の他の実施形態を示す。チャンバーは、チャンバー間の液状物の流動を制御する毛細管停止装置９０によって互いに接続される。毛細管停止装置は、流体流動を制御するために１つまたはそれ以上の「階段」セクションおよび／または１つまたはそれ以上の「スイッチバック」セクションを含んでもよい。この実施形態においては、ユーザーは始め入口９１より洗浄バッファーチャンバー８０を満たし、これを密封する。次に、ユーザーは入口９２より反応チャンバー１０をサンプルで満たし、これを密封する。最後にユーザーはベント９３を密封する。次に、マイクロアレイシステム１００を通常のスライドブロックサーモサイクラー（例：クワンタ・バイオテック、サーモフィッシャーなど）内に留置する。熱サイクリング後、マイクロアレイシステム１００を取り出し、ベント９３に細孔を開ける。ベント９３の細孔を開くと、その後洗浄バッファーが反応チャンバーを経て廃液チャンバーに移動するため、反応チャンバーは最終的に撮像のための乾燥状態となる。廃液チャンバー内の吸収剤６２は生成物を含み、かつベント９３に細孔を開くときのエアロゾル化を防止するであろう。１つの実施形態においては、多孔質膜を用いてエアロゾル化が起こらないことを担保してもよい。
【００４６】
他の実施形態においては、標的分子を検出することを目的としたマイクロアレイシステム２００が開示される。マイクロアレイシステム２００は反応チャンバー、廃液チャンバー、入口ポート、反応チャンバーを入口ポートと接続する第１の導管、および反応チャンバーを廃液チャンバーと接続する第２の導管を含む。反応チャンバーは入口、出口、マイクロアレイおよび液状サンプルがチャンバー内に気泡を伴わずに導入されることを可能とするチャンバーの上面および下面のうちいずれか一方上の親水性領域を有する。廃液チャンバーは、液状物が毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動することを可能とする吸収剤を有する。
【００４７】
図７はマイクロアレイシステム２００の１つの実施形態を示す。この実施形態においては、マイクロアレイシステム２００はマイクロアレイ２１１を有するアレイ基板２１０、反応チャンバースペーサー２２０、親水性カバー２３０、および廃液チャンバースペーサー２４０、吸収剤２５０およびベント孔２６１を有する廃液チャンバーカバー２６０を含む層構造を含む。反応チャンバースペーサー２２０は、組み立てられたマイクロアレイシステム内にアレイ２１１を取り囲む反応チャンバー２２１を形成する開口部、接続導管２２２および２２３、入口孔２２４および廃液チャンバー２２５を有する。導管２２２は反応チャンバー２２１を入口孔２２４と接続し、かつ導管２２３は反応チャンバー２２１を廃液チャンバー２２５と接続する。
【００４８】
親水性カバー２３０は反応チャンバー２２１および接続導管２２２および２２３の上部を被覆する。親水性カバー２３０は入口孔２２４および廃液チャンバー２２５に適合する入口孔開口部２３４および廃液チャンバー開口部２３５も含む。廃液チャンバースペーサー２４０は、親水性カバー２３０の廃液チャンバー開口部２３５およびスペーサー２２０の廃液チャンバーと適合する廃液チャンバー開口部２４５を有する。吸収剤２５０は廃液チャンバー２２０に嵌合するよう寸法取りされ、かつ廃液チャンバーカバー２６０によって被覆される。入口孔開口部２２４および２３４は、入口ポート２７０からの反応チャンバー２２１へのアクセスを提供する。
【００４９】
１つの実施形態においては、反応チャンバー２２１の側壁は反応中の気泡を捕捉するために親水性となっている。
【００５０】
他の実施形態においては、親水性カバー２３０は親水性領域が反応性チャンバー２２１の出口２２７の近傍に作成されるよう配置される。関連する実施形態においては、親水性領域は親水性ゲルエレメントによって作成される。
【００５１】
他の実施形態においては、反応チャンバー２２１内の内容物がマイクロアレイシステム２００から放出されることなく洗浄することを可能とするために、入口ポート２７０は刺入可能な膜／テープまたはドームバルブを含む。
【００５２】
他の実施形態においては、アレイ基板はガラスまたプラスチックである。さらに他の実施形態においては、反応チャンバースペーサー２２０は両面テープである。１つの実施形態においては、接続導管２２３は「階段およびスイッチバック」セクションを有する。図８に示すように、導管２２３の「階段」セクションは、アレイチャンバー側がより幅広く廃液チャンバー側で段階的に狭くなる複数のサブセクションを有する。この「階段」設計は早すぎる吸い上げを防止する。導管２２３の「スイッチバック」セクションは、一連の急激な導管の幅の変化および／または鋭い角を有する。これらの導管幅の変化および鋭い角は、ここでも液状物が反応チャンバー２２１から廃液チャンバー２２５に移動するためには好ましくない条件を再度作り出す。一部の実施形態においては、「鋭い角」は１３５°未満の角度で交差する２つの導管によって形成される角を指す。他の実施形態においては、導管２２３の「階段」セクションの１つまたはそれ以上のサブセクションの壁は、隣接する２つのサブセクションの壁の間で親水性の変化を引き起こすために、親水性または疎水性コーティングによってコーティングされる。１つの実施形態においては、反応チャンバー２２１の近傍にある導管２２３の「階段」セクションのサブセクションが親水性コーティングまたはポリマーによってコーティングされる一方で、隣接するサブセクションはコーティングされないか、または疎水性コーティングによってコーティングされる。そのような親水性の変化は、早すぎる吸い上げを防止するためのサブセクション間の流動停止装置として作用するであろう。
【００５３】
当業者は、マイクロアレイシステム２００が多くの変法を有することを理解するであろう。たとえば、反応チャンバー２２１、または廃液チャンバー２２５、またはそのいずれもがプラスチック基板２１０上に成形されてもよい。
【００５４】
マイクロアレイシステム２００にサンプル精製機能を組み入れてもよい。１つの実施形態においては、マイクロアレイシステム２００の入口ポート２７０は、サンプルから標的分子を精製または分離するためのサンプル精製マトリクスをさらに含む。代替的に、マイクロアレイシステム２００の反応チャンバー２２１はサンプルから標的分子を精製または分離するためのサンプル精製マトリクスをさらに含んでもよい。１つの実施形態においては、サンプル精製マトリクスはシリカである。
【００５５】
マイクロアレイ２１１は、標的分子に応じてオリゴヌクレオチドアレイまたはプロテインアレイとすることができる。１つの実施形態においては、マイクロアレイ２１１はオリゴヌクレオチドアレイであり、かつマイクロアレイシステム２００は標的ポリヌクレオチドを増幅および検出するために用いられる。
【００５６】
図８〜１２はマイクロアレイシステム２００の様々なコンポーネントの寸法を示す。
【００５７】
図１３はＰＣＲアレイ試験３００の実施形態を示すフローチャートである。簡単に言うと、全核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）をサンプルより分離し（ブロック３１０）、精製した核酸をＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび少なくとも１対のＰＣＲプライマーを含む増幅混合物と共にマイクロアレイシステム２００のアレイチャンバーに装填する（ブロック３２０）。ＰＣＲ反応はマイクロアレイシステム内で実施する（ブロック３３０）。増幅生成物をマイクロアレイシステム２００上でハイブリダイゼーションさせ（ブロック３４０）、さらにハイブリダイゼーションの結果をアレイリーダーで読み取る（３５０）。
【００５８】
サンプルはスワブ、鼻咽頭吸引液または全血サンプルなどのあらゆる生体サンプルとすることができる。全核酸は当業者に周知の方法によって分離してよい。１つの実施形態においては、全核酸はキアゲン試薬などの市販の核酸分離試薬またはキットによって分離される。他の実施形態においては、アコーニバイオシステムズが開発したサンプル調製デバイスによって全核酸を分離する。アコーニのサンプル調整法についての一般化された作業の順番は、溶解バッファーにおけるサンプルの変性；サンプル調製デバイス上への溶解サンプルの持続的な灌流；洗浄およびサンプル調製デバイスからの核酸の溶離を含む。
【００５９】
分離した核酸をマイクロアレイシステム２００に装填しさらに当業者に周知の方法でオンチップ増幅する。オンチップ増幅後、マイクロアレイシステム２００を所望の温度で一定時間インキュベートし（例：５０〜６５°で１０〜６０分）、アンプリコンをマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせる。インキュベーション後、マイクロアレイシステム２００を洗浄し（例：水などで）さらにマイクロアレイリーダー（例：アコーニのポータブルマイクロアレイリーダーなど）で撮像する。１つの実施形態においては、マイクロアレイシステムは撮像前に乾燥させる。他の実施形態においては、乾燥手順はインキュベーションチャンバーへのアセトンの導入および／またはインキュベーションチャンバーの加熱により遂行される。他の実施形態においては、非標識「順」プライマーに対して非常に過剰な量の蛍光標識された「逆」プライマー（例：５〜２０倍過剰）を含む非対称ＰＣＲマスターミックス中で、分離した核酸の増幅および増幅生成物の標識化を行う。この戦略により、その５’末端に単一の標識を有する一重らせん標的が主として生成される。
【００６０】
アレイ試験３００は多くの変法によって実施することができる。１つの実施形態においては、増幅された生成物はハイブリダイゼーション後反応チャンバー内に残留し、かつマイクロアレイの撮像前の洗浄もない。他の実施形態においては、増幅生成物は反応チャンバー内に留まり、かつＫｈｏｄａｋｏｖら（Ｋｈｏｄａｋｏｖ他、２００８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４４：２４１−２４８）が報告するところの成長曲線を示すために、ハイブリダイゼーション時にアレイスポットをリアルタイムで撮像する。さらに他の実施形態においては、反応チャンバーはＥＬＩＳＡなどのマルチステップ分析のための一連のインキュベーションおよび洗浄ステップを支援する。
【００６１】
他の実施形態においては、マイクロアレイ２１１はプロテインアレイであり、かつマイクロアレイシステム２００はタンパク質標的を検出するために用いることができる。図１４はプロテインアレイ試験４００の実施形態を示すフローチャートである。簡潔に言うと、サンプルよりタンパク質を抽出し（ブロック４１０）、抽出したタンパク質をアレイチャンバーに装填しかつマイクロアレイシステム２００のマイクロアレイと共にインキュベートし（ブロック４２０）、マイクロアレイを洗浄し（ブロック４３０）、さらに当業者に周知の方法を用いてマイクロアレイと結合したタンパク質標的を検出する（ブロック４４０）。
【００６２】
１つの実施形態においては、アレイエレメントと標的タンパク質の間の相互作用を改善するために、インキュベーションステップ４２０は周期的なまたは連続的振動の元で実施する。
【００６３】
他の実施形態においては、抽出されたタンパク質をプロテインアレイ上に連続的に灌流する。さらに他の実施形態においては、アレイエレメントと標的タンパク質との相互作用を向上させるために、抽出されたタンパク質がインキュベーションステップにおいて導管内を循環できるよう、プロテインアレイエレメントは細長い導管内で複数の試験紙の形態（プロテインストリップアレイ）に配列される（図１５Ａ）。図１５Ｂは、導管を経て廃液チャンバーと接続されるサンプルレザバーを含むマイクロアレイシステムの実施形態を示す。プロテインアレイまたはプロテインストリップアレイは導管の内側にプリントされる。サンプルより抽出されたタンパク質はレザーバー内に装填され、さらにプロテインアレイ中を連続的に流動し、廃液チャンバーに流入する。
【００６４】
好ましくは、導管は導管の高さが１００〜２０００μｍ、より好ましくは２００〜５００μｍの範囲にある薄型導管である。多孔質ゲルラインを通過して、あるいは横切ってサンプルが連続的に灌流されるよう、流路上に多孔質ゲルラインが形成されるであろう。非常に薄型の導管中を連続的に灌流することによって迅速な拡散動態が１次元的にもたらされ、拡散境界層が崩壊し、かつ対流性移動が増加してアレイエレメントと標的タンパク質の相互作用が促進される。圧力および／または吸収剤によって制御される流量で、感度を高めるために大容積を灌流することができる。ゲルエレメントは流路を貫通するので、その３Ｄプロファイルは標準的な２Ｄ Ａｂアタッチメントよりも好ましい拡散導体も提供する。数秒と非常に速いことが示されている（Ｒｏｓｓｉｅｒ他、Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０００）迅速な拡散動態を促進するために、３Ｄ半球状のゲルドロップを有する十分に薄い導管も設計することも可能であろう。１つの実施形態においては、ゲルラインは０．５ｎｍ〜０．５μｍの範囲の多孔性を有する。
【００６５】
薄型導管設計においては、スペーサーテープは薄く、かつ導管内へのオーバーシャインを防止するために低いバックグラウンド蛍光を有する必要がある。導管上のカバーは、導管内に折れ曲がりさらにプロテインアレイのゲルストリップを損傷しないよう、親水性でありかつ十分に剛直であることが必要である。
【実施例１】
【００６６】
（親水性テープでインキュベーションチャンバーを被覆したところチャンバーが完全に充填された）
図３に示すようなマイクロアレイを構築した。スライドは長さ２．９５インチおよび幅０．７５インチを有していた。幅０．５ｍｍの導管１４は充填入口ポート１１をマイクロアレイインキュベーションチャンバー１０に接続し、２．０ｍｍ導管１２はマイクロアレイインキュベーションチャンバー１０を廃液チャンバー６０に接続し、さらに廃液チャンバー６０から外部までの１．０ｍｍ導管６４はベントの役割を果たす。マイクロアレイインキュベーションチャンバー１０は１０ｍｍ×１０ｍｍのサイズを有する。厚さ０．２５ｍｍを有する内部のガスケットテープ（３Ｍ社より入手、ＰａｒｔＮｏ．９０８７）をレーザー切断して上記に記載の形状寸法を有するガスケットを形成した。ガスケットは、ゲルスポットプリント工程に用いたスライドと同様の接触角の疎水性面に載置した。ガスケットの上部は、親水性面を提供するために親水性テープ（ＡＲ９０１２８）で密封した。水３０μＬにより、気泡またはエアーポケットを残すことなく均一にチャンバーを充填した。チャンバーは、ハイブリダイゼーションバッファー３０μＬ（３Ｍチオシアン酸グアニジン、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、および１５ｍＭ ＥＤＴＡ）によっても均一に満たされた。疎水性テープ（ＡＲ８１９２）を用いた同様の試験では、非均一な充填によりマイクロアレイチャンバー内にエアーポケットが残った。
【００６７】
この実験により、チャンバーの親水性面によって液状物の表面張力が克服され、かつ四隅を含めたチャンバーの完全な充填が可能となることが示された。四隅は典型的には液状物がチャンバーを満たす際にエアーポケットを捕捉するので、この結果は驚くべきものである。
【実施例２】
【００６８】
（廃液チャンバーの吸い上げ効率の評価）
図１６Ａは、吸収剤を収容する廃液チャンバーと接続された親水性インキュベーションチャンバーをそれぞれ有する４つの試験マイクロアレイスライドを示す。廃液チャンバーは大気中にベントされた。チャンバーは、マイクロアレイ支持スライド上部にガスケットを載置することによって形成された（グレースバイオラボが提供する両面テープよりレーザーカットする）。インキュベーションチャンバー内の親水性面は、インキュベーションチャンバー空隙を親水性テープ（ＡＲ９０４６９）で被覆することにより製造された。吸収剤はミリポア製であった（Ｃ０４８）。Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来の増幅生成物、ハイブリダイゼーションマーカー、ＢＳＡおよびハイブリダイゼーションバッファーを含むサンプル９５μＬを９５℃で５分間変性させ、さらに入口ポートよりインキュベーションチャンバーに導入した。次に入口ポートをテープ（ＡＲ９０６９７）で密封した。スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラーにおいて反応物を５０℃で１時間インキュベートした。マイクロアレイスライドをタワーから取り出し、室温で水１５０μＬにより洗浄した。入口ポートより水がインキュベーションチャンバーに加えられるにつれ、インキュベーションチャンバー内の液状物は、インキュベーションチャンバーを廃液チャンバーと接続する導管を通って廃液チャンバーに押し出された。インキュベーションチャンバー内の液状物と廃液チャンバー内の吸収剤との接触が一旦確立すると、吸収剤はインキュベーションチャンバーより液状物（洗浄容積を含む）を吸い出すことが可能であった。次に、マイクロアレイスライドを９５℃で２０分間加熱してインキュベーションチャンバーを完全に乾燥させた。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００（商標）上で、装置に全く手を加えずにマイクロアレイを撮像した。画像は、インキュベーションチャンバーを被覆する親水性テープ越しに撮像した。
【００６９】
図１６Ｂは、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥ステップ後のマイクロアレイの例の画像を示す。生成物スポットは暗い黒色の点として示される。対照スポットはＣｙ３スポットおよびハイブリダイゼーションマーカーを含む。各アレイは４つのサブアレイの反復であるので、４セットのＹｐ生成物スポットである。全ての試験スライド上で均一なハイブリダイゼーションが達成された。
【実施例３】
【００７０】
（ドームバルブ、親水性インキュベーションチャンバーおよび廃液チャンバーを含むマイクロアレイシステム）
図１７Ａは、親水性テープで被覆されたインキュベーションチャンバー、吸収剤が組み込まれた廃液チャンバー、およびインキュベーションチャンバーと接続されたドームバルブを有する一体型マイクロアレイシステムの実施例を示す。ハイブリダイゼーションマスターミックスおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ生成物からなるサンプル９５μＬを９５℃で５分間変性させ、さらにレイニンＰ２００ｕＬピペッターを用いてドームバルブよりインキュベーションチャンバーに導入した。サンプルは、気泡またはエアーポケットを残すことなくマイクロアレイチャンバーへ均一に流入した。インキュベーションチャンバーを、フローセルデバイスに全く変化を加えず、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラーにおいて５０℃で６０分間加熱した。マイクロアレイスライドをスライドタワーから取り出し、水１５０ｕＬで洗浄した。水がインキュベーションチャンバーに導入されるにつれ、インキュベーションチャンバー内部のハイブリダイゼーション混合物は廃液チャンバーに押し出され、さらにミリポアＣ０４８吸収剤がインキュベーションチャンバーより液状物の全量を吸い出した。次に、マイクロアレイスライドを９５℃で２０分間加熱してインキュベーションチャンバーを完全に乾燥させた。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００（商標）上で、装置に全く手を加えずにマイクロアレイを撮像した。画像は、インキュベーションチャンバーを被覆する親水性テープ越しに撮像した。
【００７１】
図１７Ｂは、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥ステップ後の例示的マイクロアレイの画像を示す。生成物スポットは暗い黒色の点として示される。対照スポットはＣｙ３スポットおよびハイブリダイゼーションマーカーを含む。各アレイは４つのサブアレイの反復であるので、４セットのＹｐ生成物スポットである。図８Ｂに示すように、全てのサブアレイにおいて均一なハイブリダイゼーションが達成された。
【実施例４】
【００７２】
（親水性インキュベーションチャンバーおよび廃液チャンバーを含むマイクロアレイシステム）
図１８Ａは、親水性チャンバー１０および廃液チャンバー６０を有するマイクロアレイシステムの他の実施形態を示す。２つのチャンバーは、入口セクション１５、漏斗状接続セクション１６、大直径出口セクション１７１および小直径出口セクション１７２を有する導管１２によって接続される。液状サンプルは、入口ポート１１および導管１４を経てインキュベーションチャンバー１０に加えられる。
【００７３】
図１８Ａに示すマイクロアレイシステムは、両面テープ（グレースバイオラド）よりレーザーカットされたガスケットを用いてガラススライド上に構築された。廃液チャンバー６０は濾紙吸収剤（ＣＦ４、ミリポア）を含み、かつ大気中にベントされた。生成するマイクロアレイアセンブリはレクサンＨＰＦＡＦ（０．００７”／１７５μｍ）曇り止めテープ（ＧＥプラスチックス）で被覆された。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓｅ由来の増幅生成物、ハイブリダイゼーションマーカー（ポジティブコントロール）、ＢＳＡおよびハイブリダイゼーションバッファーを含むサンプル２０μＬを９５℃で５分間変性させ、さらにレイニンＰ２００ｕＬピペッターを用いて入口ポート１１よりインキュベーションチャンバー１０に導入した。入口ポート１１をテープで密封し、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラー内において、スライド全体を５５℃で３０分間インキュベートさせた。スライドをタワーから取り出し、室温で水１５０ｕＬにより洗浄した。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００（商標）マイクロアレイリーダーによりアレイを撮像した（露出時間２秒）。図１８Ｂはハイブリダイゼーションの結果を示す。図１８Ｃはアレイスポットの配置を示すチップマップである。図１８Ｂに示すように、ハイブリダイゼーションコントロールおよびＳｔｒｅｓｔｏｃｏｃｃｕｓ特異性プローブより強い陽性結果が得られた。
【実施例５】
【００７４】
（ワンステッププロテインマイクロアレイシステム）
図５および図１８Ａに示す実施形態のものなどのワンステップ一体型プロテインマイクロアレイシステムは、捕捉抗体を含有するゲルドロップエレメントを用いて構築される。捕捉抗体は、生物兵器（ＢＷＡ）パネルに対して特異的に結合する抗体である。各ゲルスポットは特定のＢＷＡと結合する抗体を含む。金コロイド標識した二次抗体のセットを入口導管近傍の位置に留置する。二次抗体は同じパネルのＢＷＡを認識する。液状サンプルを入口導管よりインキュベーションチャンバーに装填するとき、金コロイド標識二次抗体はサンプルがインキュベーションチャンバーに入るにつれてサンプルと混合される。インキュベーション中、目的のＢＷＡがアレイゲルスポット内の抗体によって捕捉され、さらに二次抗体が捕捉されたＢＷＡと結合する。インキュベーション時間の後、非結合二次抗体が洗い流される。二次抗体はゲルスポット上に捕捉されたＢＷＡと結合し、マイクロアレイにおいて陽性シグナルを生成する。
【００７５】
本明細書で用いるところの用語「抗体」は、考えられる最も広い意味で用いられ、かつ抗体、組換え抗体、遺伝子操作抗体、キメラ抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、二機能性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ヘテロ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、脱免疫抗体、抗イディオタイプ抗体、および／または抗体フラグメントを含んでもよいが、これに限定されない。また用語「抗体」はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭなどの抗体の種類、および／またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１および／またはＩｇＡ２などのサブタイプを含んでもよいが、これに限定されない。用語「抗体」は、たとえば抗原結合可変領域などの、未修飾抗体の少なくとも一部分といった抗体フラグメントを含んでもよいが、これに限定されない。抗体フラグメントの例はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、二機能性抗体、線形抗体、短鎖抗体分子、多重特異性抗体、および／またはその他の抗体の抗原結合配列を含む。さらなる情報は、その全文が本明細書に参照文献として援用されている米国特許第５，６４１，８７０号、米国特許第４，８１６，５６７号、国際公開番号第ＷＯ９３／１１１６１号、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ他、二価抗体：小型二価および二重特異性抗体フラグメント、ＰＮＡＳ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）、Ｚａｐａｔａ他、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける効率的な生成および抗増殖性活性の亢進を目的とした線形Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの操作、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に認められうる。
【実施例６】
【００７６】
（マルチステッププロテインマイクロアレイシステム）
抗体を含有するゲルドロップエレメントを用いてマルチステップ一体型プロテインマイクロアレイシステムを構築した。アレイのチップマップを図１９に示す（上左の図）。ゲルドロップがプリントされたガラススライドを、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにより室温で１時間ブロッキングした。スライドをＤＩ水ですすぎ、粉塵のない環境で風乾させた。次に、ブロッキングしたガラススライド、レーザーカットしたアドケム製２５６Ｍテープ、親水性レクサンフィルム、およびドームバルブを用いてマイクロアレイシステムを組み立てた。図１９は、実験で用いられたマイクロアレイスライドの図を示す。ＳＥＢ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および１％ＢＳＡ添加１ｕｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）約２０μＬをドームバルブよりマイクロアレイシステムにピペッティングし、室温で６０分間インキュベートした。ＤＩ水２０μＬをピペッティングして（×２）マイクロアレイシステムをすすぎ、その後ピペッターを用いて風乾した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）３０μＬをマイクロアレイシステムにピペッティングした後、ピペッターを用いて風乾させた。１％ＢＳＡを含む抗ＳＥＢモノクローナル抗体ＰＢＳＴ希釈液２０μＬをマイクロアレイシステムにピペッティングし、室温で３０分間インキュベートした。ＤＩ水２０μＬ（×２）をマイクロアレイシステムにピペッティングし、その後ピペッターを用いて風乾した。ＰＢＳＴ３０μＬをマイクロアレイシステムにピペッティングし、その後ピペッターを用いて風乾した。１％ＢＳＡを含む２μｇ／ｍＬアレクサ５６８標識抗マウス抗体ＰＢＳＴ溶液２０μＬをマイクロアレイシステムにピペッティングし、室温で３０分間インキュベートした。マイクロアレイシステムは遮光した。ＤＩ水２０μＬ（×２）をマイクロアレイシステムにピペッティングした。１００％エタノールをマイクロアレイシステムのインキュベーションチャンバーにピペッティングし、さらに残留エタノールを吸収剤で吸い上げた。次にマイクロアレイシステムを５５℃で１０分間加熱した。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００において、６０５ｎｍフィルターによる緑色レーザー（５３２ｎｍ）を用いてマイクロアレイシステムを撮像した。プロテインアレイの代表的な画像を図１９に示す（下右の図）。
【００７７】
この実施形態においては、インキュベーションチャンバーを廃液チャンバーと接続する導管中に気泡が残り、インキュベーションチャンバー内の液状物を廃液から離隔して早すぎる吸い上げを防止した。
【実施例７】
【００７８】
（ＰＣＲマイクロアレイシステム）
アコーニサンプル調製デバイスまたは顧客が好むサンプル調製キット（例：キアゲン試薬）において、１ｍＬまでのスワブ、鼻咽頭吸引液または全血サンプルから全核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を分離する。アコーニのサンプル調整法についての一般化された作業の順番は、溶解バッファー中のサンプルの変性；サンプル調製装置上への溶解サンプルの持続的な注入；洗浄；および最終容積約１００μＬでの核酸の溶離を含む。溶離されたサンプルを、図８〜１２に示す寸法を有するマイクロアレイシステム内に装填する。非標識「順」プライマーよりも１０倍過量の蛍光標識「逆」プライマーを含む非対称ＰＣＲマスターミックス中で、標的の増幅および標識化を行う。この戦略により、その５’末端に単一の標識を有する一重らせん標的が主として生成される。オンチップ増幅後、アンプリコンをマイクロアレイシステムアセンブリ内において５０〜６５℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、マイクロアレイシステムを水で灌流する（全ての廃液はマイクロアレイシステム内に保持される）。
【００７９】
図８はマイクロアレイシステムアセンブリの入口孔の実施形態を示す。スペーサーテープの入口孔の範囲は２．０〜４．０ｍｍであるのに対し、カバーフィルムの穴の直径は０．８〜１．２ｍｍの範囲である。直径の違いは、毛細管作用を介して試薬がチャンバー内に引き込まれることを可能とする。これらの直径が同一であれば、スペーサーテープの疎水性壁が、引き込む毛細管作用にとって好ましくない条件をサンプルにおいて作り出す。さらに、入口導管の導管幅は反応チャンバーに近づくにつれて増加する。この増加は、液状物がチャンバーに流入するために鋭い屈曲をする必要なくチャンバーに流入することを可能とするためのものである。鋭い屈曲は、移動する境界の接触線が、液状物の廃液チャンバーへの流入を遮断するよう働く不連続性を有することを必要とする。液状物が反応チャンバーより流出することを防止するために、導管の接続に直角の角を用いる。
【００８０】
反応チャンバーの角を丸めて、粘性流動が表面駆動流の大半を占める高流量における充填を適合させる。この条件の際は角にエアポケットができやすい。さらに、反応が完了しかつ反応チャンバーが洗浄される場合、洗浄バッファーは反応チャンバーに吸い出される。陥凹した境界は、典型的には縁に沿ってチャンバー内に残留液状物を残し、縁は徐々に使い尽くされる。したがって、丸めた角によりチャンバーから液状物が完全に除去される時間が短縮される。
【００８１】
接続導管は「階段」オーバーフローセクションおよび「スイッチバック」セクションの２セクションからなる。「階段」セクションは、４５〜１３５°の範囲の角を作成するための、２．０ｍｍから始まって０．６ｍｍまで減少する導管寸法の変化がある。より具体的には、これらの角は９０°である。スイッチバック部分はやはり９０°の屈曲を伴う導管幅の一連の減少を有する。ここでも、これらの屈曲によって液状物の移動にとって好ましくない条件が作り出される。液状物が廃液チャンバーに近づくにつれて、直径の減少がより高い毛細管圧を作り出す。液状物が廃液チャンバーに接近するにつれて上昇する毛細管張力は、流路内にある気泡の効果を最小化する。接続導管の出口における気泡の曲率半径が、液状物の陥凹接触線と同じであれば、液状物は移動しない。しかし、気泡の曲率半径が液状物の陥凹接触線よりも小さければ、液状物は廃液チャンバーに流入し続けるであろう。したがって、小さな０．３ｍｍ導管が廃液チャンバーと接続する。０．２ｍｍまたはそれ以下の導管は、縁の周囲の液状物が蓄積し一体となる条件を作り出す。液状物が導管の両側から一体化する場合、液状物は移動しかつ反応チャンバーを空にし始めるであろう。廃液チャンバーの吸収剤が接続導管と直接流体連通であるよう、吸収剤は接触導管に対して押しつけられる。
【００８２】
入口ポートは厚さ０．７５ｍｍかつ内径０．９〜１．１ｍｍかつ外径６．３５ｍｍである。この直径は、チップがアレイ基板にふれかつ流動を妨げることなくＰ２０およびＰ１００ピペットチップに適合する。シリコン接着剤を有するホイルサークルまたはタブが入口ポートと結合する。シリコンは、マイクロアレイシステムの乾燥に用いられるアセトンなどの溶媒と適合する。ホイルにはピペットチップを刺入することができる。ホイルサークルまたはタブは、反応チャンバーがサンプルおよびＰＣＲマスターミックスで充填された後で貼付される。増幅後、反応チャンバーの洗浄を可能とするためにホイルに穴を開ける。吸収剤は、洗浄ステップ後に液状物がマイクロアレイシステムアセンブリから漏出するのを防ぐ。廃液チャンバーの遠位側にあるベント孔は、液状物がさらなるステップを必要とすることなく導入されることを可能とするために開いたままとする。ベント孔の半分は廃液チャンバーに露出しかつもう半分はガスケットによって被覆される。ホイルサークルは、剥離ライナーから剥がして入口ポートに貼付する半抜きロール上にあることが可能であり、あるいはタブの部分に剥離ライナーを付けたままホイルタブをマイクロアレイシステムアセンブリ上に配置することができる。ホイルタブは、剥離ライナーが取り除かれるときタブが入口ポートを被覆するように、製造時にマイクロアレイシステムアセンブリ上の位置に貼付する。
【実施例８】
【００８３】
（ガラス基板を有するＰＣＲマイクロアレイシステム上でのＭＲＳＡ標的の検出および乾燥インキュベーションチャンバーの撮像）
この実験の目的は、マイクロアレイシステムアセンブリにおいて多重反応を実施することである。エリーサイエンティフィック製の相似被覆を有するガラススライド（２５×７５×１ｍｍ）をアレイ基板として用いる。Ｒｕｂｉｎａら（Ｒｕｂｉｎａ他、２００３，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３４：１００８−１０２２，およびＲｕｂｉｎａ他、２００４．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２５：９２−１０６、その全文を本明細書に参照文献として援用）が報告するところのシングルステップ、ＵＶ誘導共重合反応における固形基板の代わりに、オリゴヌクレオチドプローブをポリマーバックボーンと共有結合的に架橋する。
【００８４】
メシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌（ＭＲＳＡ）をＡＴＣＣより培養として入手し、かつ協力者よりＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇ）を培養として入手し、アコーニのトゥルーチップ（カタログ番号３００−１０２０６）により精製した。トゥルーチッププロトコルは約４分を要し、以下の各ステップ：結合、洗浄、乾燥、および溶離について電子ピペッターによる５回の吸い上げおよび押出しのサイクルからなる。ＤＮＡの量はナノドロップ３３００蛍光分光光度計（デラウェア州ウィルミントン）で測定する。
【００８５】
図２０は、図７〜１２のマイクロアレイシステムデザインにおけるＭＲＳＡチップ（ｖ４．０）上で実施したＭＲＳＡ核酸の増幅を示す。ｍｅｃＡ、ｔｕｆＡ−３ｂ、ＳＣＣｍｅｃおよびＭ１３のプライマーセットを用いて、ＭＲＳＡ ＤＮＡ ３００ｐｇを多重反応で増幅する。画像はオーロラポートアレイ５０００により撮像する。アレイは図２１Ａおよび２１Ｂに示すチップマップを有した。マイクロアレイシステムアセンブリは、廃液チャンバー内にレーザーカット濾紙吸収剤（ワットマン３１ＥＴ ＣＨＲセルロースクロマトグラフィ紙、０．５ｍｍ）を収容した。組み立て後に親水カバーフィルムの上面（疎水性面）をＩＰＡで洗浄した。マスターミックスの調製は以下の通りであった：ホルムアルデヒド１０％を添加したキアゲンＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼキット（キアゲン、カタログ番号１２０５）を用いて、ＭＲＳＡの４プライマー（ｍｅｃＡ、ｔｕｆＡ−３ｂ、ＳＣＣｍｅｃおよびＭ１３）を含むマスターミックス１４μＬおよびメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸１０μＬを各反応について調製した（１５μＬ反応容積中で合計３００ｐｇのＤＮＡを増幅）。調製した反応混合物１４μＬをマイクロアレイシステムに添加した。サンプル入口ポートを、接着性裏材料を有するホイルテーププルタブで被覆し、廃液チャンバーのベントは開いたままとした。全てのスライドを、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラー上に載置し、増幅パラメータ：８６．５℃で２分間、および８６．５℃で４５秒、５０℃で１分３０秒で３５サイクル、および６５℃で５分間、８５℃で２分間および４０℃で４５分間の最終ステップにしたがって増幅した。増幅後、スライドタワーよりスライドを取り出し、次にサンプル入口ポートを被覆するホイルテープに細孔を開け、１×ＳＳＰＥ ３５μＬによりアレイを単回洗浄で洗浄した。次に、スライドを水２５μＬ、その後１００％アセトン７５μＬで洗浄した。次に、サーモフィッシャー２００１ＦＳＱデジタルコントロールドライバス用に設計されたカスタムヒートブロック上においてスライドを５０℃で１５分間乾燥させ、さらにポートアレイ５０００リーダーにおいて乾燥した状態で読み取る。
【実施例９】
【００８６】
（ガラス基板を有するＰＣＲマイクロアレイシステム上でのＭＲＳＡ標的の検出および液状物内での撮像）
この実験の目的は、マイクロアレイシステムアセンブリ内で単一反応を実施することである。エリーサイエンティフィック製の相似被覆を有するガラススライド（２５×７５×１ｍｍ）をアレイ基板として用いる。Ｒｕｂｉｎａらが報告するところのシングルステップＵＶ誘導共重合反応における固形基板（前掲）の代わりに、オリゴヌクレオチドプローブをポリマーバックボーンに共有結合的に架橋させる。図２２は、図７〜１２のマイクロアレイシステム設計におけるＭＲＳＡチップ（ｖ４．０）上で実施したメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸の増幅を示す。ｍｅｃＡプライマーを用いてＭＲＳＡ ＤＮＡ １ｎｇを単一反応で増幅する。画像はジーンピックス４０００Ｂで撮像する。アレイは図２１Ａおよび２１Ｂに示すチップマップを有した。フローセルは、廃液チャンバー内にレーザーカット濾紙吸収剤（ワットマン３１ＥＴ ＣＨＲセルロースクロマトグラフィ紙、０．５ｍｍ）を収容した。組み立て後に親水カバーフィルムの上面（疎水性面）をＩＰＡで洗浄した。マスターミックス調製は以下の通りである：ホルムアルデヒド１０％を添加したキアゲンＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼキット（キアゲン、カタログ番号２０１２０５、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ１．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）を用いて、ｍｅｃＡプライマーを含むマスターミックス１１．７μＬおよびメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸３．３μＬを、各反応について調製した（１５μＬ反応容積中で合計１ｎｇのＤＮＡを増幅）。調製した反応混合物１４μＬをマイクロアレイシステムに添加した。サンプル入口ポートを、接着性裏材料を有するホイルテーププルタブで被覆し、廃液チャンバーのベントは開いたままとした。全てのスライドを、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラー上に載置し、増幅パラメータ：８６．５℃で２分間、および８６．５℃で４５秒、５０℃で１分３０秒で３５サイクル、および６５℃で５分間、８５℃で２分間および４０℃で４５分間の最終ステップにしたがって増幅した。増幅後、スライドをスライドタワーより取り出し、アレイチャンバー内に残留する液状物と共にジーンピックス４０００Ｂにより撮像する。気泡はアレイの中央部ではなくスペーサーテープの疎水性壁に付着することに留意されたい。
【実施例１０】
【００８７】
（プラスチックスライドを有するＰＣＲマイクロアレイシステム上での乾燥ステップを伴わないＭＲＳＡ標的の検出）
この実験の目的は、アコーニおよびジーンピックス撮像装置上でのプラスチックスライドの評価である。プラスチックスライドは２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍの型で成形された。ゲルエレメントはプラスチック上に直接プリントされさらに実験前にＵＶ架橋された。図２３は、図１０および１４〜１８のマイクロアレイシステム設計におけるＭＲＳＡチップ（ｖ４．０）上で実施したメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸の増幅を示す。ｍｅｃＡおよびｔｕｆＡ−３ｂプライマーを用いて、ＭＲＳＡ ＤＮＡ ３００ｐｇを多重反応で増幅する。画像はアコーニが開発したプロトタイプリーダーにより撮像する。アレイは図２１Ａおよび２１Ｂに示すチップマップを有した。マイクロアレイシステムは、廃液チャンバー内にレーザーカット濾紙吸収剤（ワットマン３１ＥＴ ＣＨＲセルロースクロマトグラフィ紙、０．５ｍｍ）を収容した。組み立て後、親水カバーフィルムの上面（疎水性面）をＩＰＡで洗浄した。マスターミックス標本は以下の通りである：ホルムアルデヒド１０％を添加したキアゲンＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼキット（キアゲン、カタログ番号２０１２０５）を用いて、ｍｅｃＡおよびｔｕｆＡ−３ｂプライマーを含むマスターミックス１４μＬおよびメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸１０μＬを、各反応について調製した（１５μＬ反応容積中で合計３００ｐｇのＤＮＡを増幅）。調製した反応混合物１４μＬをマイクロアレイシステムに添加する。サンプル入口ポートを、接着性裏材料を有するホイルテーププルタブで被覆し、廃液チャンバーのベントは開いたままとした。全てのスライドを、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラー上に載置し、増幅パラメータ：８６．５℃で２分間、および８６．５℃で４５秒、５０℃で１分３０秒で３５サイクル、および６５℃で５分間、８５℃で２分間および４０℃で４５分間の最終ステップにしたがって増幅した。増幅後、スライドタワーよりスライドを取り出し、次にサンプル入口ポートを被覆するホイルテープに細孔を開け、１×ＳＳＰＥ ３５μＬによりアレイを単回洗浄で洗浄した。次にスライドをアコーニリーダー上で乾燥ステップなしで読み取った。
【実施例１１】
【００８８】
（異なるハイブリダイゼーション条件下での標的ＤＮＡの検出）
（バイオチップアセンブリ）
図７に示すバイオチップアセンブリはマイクロアレイ基板、スペーサーテープ、親水性上面フィルム、吸収剤を有する廃液チャンバー、入口ポートおよびベント孔からなる。マイクロアレイ基板はガラス（エリーサイエンティフィック、ニューハンプシャー州ポーツマス）またはプラスチックである。プラスチックスライドは２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍのサイズで成形される。一旦スペーサーテープが貼付されたならば、バイオチップの反応チャンバーにおいてアレイを位置決めする座標を用いてオリゴヌクレオチドプローブをブランクスライド上にプリントする。プリント方法は、Ｖａｓｉｌｉｓｋｏｖら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９９）およびＲｕｂｉｎａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００３）が報告した方法と同様に、共重合およびスライド上にプリントされＵＶ架橋されたオリゴヌクレオチドプローブ混合物よりなる。ゲルエレメントの直径は１５０μｍであり中心同士の距離は３００μｍである。バイオチップは入口導管用切り欠きを有するレーザーカット両面テープ、反応チャンバー、接続導管および廃液チャンバーより構築される。上面フィルムはアレイチャンバーおよび廃液チャンバーをそれぞれ被覆する。上面フィルムは、反応チャンバー全体を満たすための毛細管作用を可能とするため親水性である。吸収剤（ワットマンクロマトグラフィペーパー）は廃液チャンバー内に位置する。上面フィルムは、入口用の１ｍｍの穴および廃液チャンバーの遠位側の縁に位置するベント用の１ｍｍの穴を有する。フレームシール（バイオラッド、カリ孔ニア州ハーキュリーズ）は対照反応チャンバーの役割を果たす。バイオチップアセンブリおよびフレームシールは使用より少なくとも１時間前に準備する。
【００８９】
（サンプル調製およびハイブリダイゼーション）
実施例８に記載するように、アコーニのトゥルーチップを用いてＭＲＳＡ ＤＮＡを調製した。バイオチップ内ハイブリダイゼーション用：ハイブリダイゼーションマスターミックス１０μＬ（１．５Ｍチオシアン酸グアニジン、７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび３．７ｆｍｏｌ／ｕＬハイブリダイゼーション対照オリゴヌクレオチドを含有）、および増幅生成物５μＬからなる反応容積１５μＬを調製してバイオチップに加える。サンプル入口ポートを、直径６．３５ｍｍの円形にレーザーカットしたシリコンテープで被覆し、廃液チャンバーベントは開いたままとした。フレームシール内ハイブリダイゼーション用：ハイブリダイゼーションマスターミックス２０μＬおよびＭＲＳＡ増幅生成物１０μＬからなる反応物３０μＬをフレームシールに添加するために調製した。この３０μＬのうち２８μＬをフレームシールに加え、パラフィルムで被覆した。全てのスライドは、αユニットスライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ ＤＮＡエンジンサーモサイクラー上に載置し、５５℃で３時間ハイブリダイゼーションした。バイオチップおよびフレームシールマスターミックス溶液は、いずれも以下に記載するハイブリダイゼーションプロトコルの前に試験管内において９５℃で５分間変性した。標的はオンチップで変性できるので、このオフライン変性ステップはオンチップ増幅プロトコルの一部ではない。オンチップＰＣＲは実施例８に記載する方法により実施した。
【００９０】
（洗浄）
（バイオチップス）
ハイブリダイゼーションまたはオンチップ増幅後、アレイを容積範囲３５〜２００μＬの１×ＳＳＰＥで洗浄する。バイオチップをオーロラポートアレイ５０００に適合するように完全に乾燥させる。材料は、熱乾燥ステップの時間を短縮するアセトンに適合することが確認されている。したがって、一部の例では洗浄ステップ後に水２５μＬおよびその後アセトン１５μＬまたは７５μＬのバイオチップへのピペッティングが続く。アセトンがアレイチャンバーから完全に取り除かれたことを確認するために、バイオチップを３分間倒立させて残留アセトンを廃液チャンバー内に排出した。次に、サーモフィッシャー２００１ＦＳＱデジタルコントロールヒーター用に設計されたカスタムヒートブロックにおいて、スライドを５０℃で１５分間乾燥させる。洗浄前にフレームシールガスケットを取り外しかつ露出したアレイを通気して乾燥することを必要とするフレームシールプロトコルとは反対に、チップは取り外されないので、この乾燥手順は「オンチップ乾燥プロトコル」と呼ばれる。
【００９１】
（フレームシール）
フレームシールを取り外し、１×ＳＳＥＰおよび０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むテレケムアレイイット（商標）ブランドのハイスループットウォッシュステーション内でスライドを３分間洗浄し、水ですすぎ、濾過した圧縮空気で乾燥させる。
【００９２】
（検出および分析）
アレイはオーロラポートアレイ５０００リーダー、ジーンピックス４０００Ｂ、または検出のために斜方角レーザー発光法およびＣＣＤカメラを用いるアコーニのインハウスリーダーのいずれかで読み取る。いずれかのリーダーからの非ビニングアウトプット（１２ビット、オフセット＝０，ゲイン＝１）は、ＴＩＦＦ、改訂６．０スタンダードに適応する１６ビットグレイスケールタグ画像ファイルフォーマットで保存する。ゲノム化学研究所（Ｓａｅｅｄ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３）のオープンソースアプリケーション「スポットファインダー」（ウィンドウズ版３．１．１．、「Ｓｐｏｒｔｆｉｎｄｅｒ３．１．１．ｅｘｅ」）を用いて．ｔｉｆ画像を分析する。スポットファインダー内でＯｔｓｕ閾値化アルゴリズム（Ｌｉａｏ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１）による画像のセグメント化を実施し、全スポットについてのバックグラウンド補正積分強度（中央値）を、他の導出統計値、関連品質指標、およびアレイ位置インジケーターと共に、タブ区切りフラットファイル（．ｍｅｖ）フォーマットで保存した。続いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００３ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｃｋ３を用いて、各プローブについての反復スポットの平均積分強度を、ｄＮ２０ナンセンスオリゴヌクレオチド（非特異的ハイブリダイゼーション事象による生物学的ノイズのモデル）を含むスポットの平均強度と比較するデータ分析を実施する。
【００９３】
（結果）
図２４〜２６は：バイオチップにおけるハイブリダイゼーション、溶液相増幅後にバイオチップ内でハイブリダイゼーション、およびフレームシールフォーマットにおけるハイブリダイゼーションに大別される３つの異なる条件にゲルエレメントオリゴアレイを曝露する実験の結果を比較する。プロトコルは増幅後にガスケットを取り外すよう求めているが、これは汚染のリスクを導入し、かつそのために説得力のある均一性を提供しないので、フレームシールフォーマットにおけるオンチップＰＣＲは示さない。プロトコルは、オンチップ増幅およびバイオチップハイブリダイゼーションのいずれについても、１×ＳＳＰＥ １７５μＬ、水２５μＬ、およびアセトン１５μＬの洗浄バッファー体積で、実験の節に記載された方法により実施する。増幅マスターミックスはハイブリダイゼーションマーカーを含有しないので、図２４、パネルＢのハイブリダイゼーションスポットは蛍光を発しない。
【００９４】
図２５は、各条件について３回実施したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｇｅｎｕｓの信号ナンセンス比を、最小および最大値を示す誤差棒と共に示す。各条件についての出発ゲノムコピー数は約１０４である。このデータより、バイオチップ用のオンチップ増幅が、試験管で増幅してフレームシールに移す場合と同様に、試験管の中で増幅した後バイオチップに移す場合に匹敵する成績を示すことが示唆される。洗浄手順の有効性によって低いシグナルを有するナンセンスプローブで割る手法のため、この試験では誤差棒が大きくなっている。洗浄は標識プライマーまたはナンセンスプローブ由来の生成物を効果的に除去しているので、洗浄手順はナンセンスプローブのシグナル強度を低下させるはずであることに留意されたい。したがって、ナンセンスシグナル（分母）の小さな変化により比率が大きく変化する。図２６に示す３種類の異なる洗浄条件についてナンセンスシグナルを比較する追加的な試験は、この強度の変動性をさらに例示する。３つの条件全てについての変動性にもかかわらず、限られたデータセットより、バイオチップ上での小量ピペット洗浄プロトコルは、バス内での洗浄と同じであるかまたはこれよりすぐれていることが示唆される。このデータより、洗浄プロトコルは信号ナンセンス比を劣化させることなく１００μＬまで低下させることができる。実際に、追加的研究より３５μＬまでの体積低下が可能であることが示唆される。これらの低い体積により、チップ上で全ての試薬を含有しながら、洗浄ステップをラボオンチップフォーマットで実施し、さらにこれにより汚染リスクはなくならないまでも低下させることが可能となった。
【００９５】
本明細書において用いられる用語および記載は例示的な方法によってのみ説明され、制限を意味してはいない。当業者は、以下の請求項に定義されるところの本発明の趣旨および範囲内において、特に指示がない限り全ての用語がその最も広い意味で理解される多くの変法、およびその同等物が可能であることを理解するであろう。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本明細書は、いずれもその全文が本明細書に参照文献として援用されている２００８年５月９日に出願された米国特許出願第１２／１４９，８６５の一部継続出願であり、かつ２００９年７月２４日出願の米国仮特許出願第６１／２１３，８８７号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野は、生体分子の検出、および、具体的には、標的捕捉面を含む反応チャンバー、廃液チャンバー、および反応チャンバーと廃液チャンバーを接続する可変幅導管を有するフローセルデバイスである。
【背景技術】
【０００３】
マイクロアレイは、複数の検出反応を同時に遂行することによってサンプルの複雑な分析を実施する大きな可能性をもたらす。典型的には、反応物分子の複数スポットのマイクロアレイを、顕微鏡用スライドグラスなどの平面基板上に、通常は２次元グリッドパターンで形成する。次に、液状サンプルおよび試薬をスライドに塗布して複数のスポットと同時に接触させる。マイクロアレイ中の結合分子により、結合した反応物分子の液状サンプルおよび試薬への曝露および洗浄のステップを含めて、多様な反応段階を実施してもよい。スライド上に固定された材料または液状サンプル中の材料をキャラクタライゼーションするため、反応の進捗または結果をマイクロアレイの各スポットにおいてモニタリングしてもよい。
【０００４】
マイクロアレイ分析は、通常数分から数時間のインキュベーション時間を要する。インキュベーション時間の長さは測定に依存し、かつ反応物の種類、混合度、サンプルの体積、標的コピー数、およびアレイの密度などの多様な因子によって決定される。インキュベーション時間中、液状サンプル中の標的分子はマイクロアレイプローブと密に接触しなければならない。通常、インキュベーションはインキュベーションチャンバーで実施される。インキュベーションチャンバーは、典型的にはマイクロアレイの周囲にガスケットを形成することによって形成される。ガスケットをカバースリップで被覆して密封チャンバーを形成する。カバースリップは、インキュベーション後のマイクロアレイの光学的照合を可能とするために、ガラスなどの透明な材料で製造することができる。
【０００５】
カバースリップが入口ポートおよびベントを有していない場合、カバースリップをガスケットの上部に載置する前に、液状サンプルおよび他の試薬をインキュベーションチャンバーに加える必要がある。反応混合物をガスケットの縁まで満たす場合、反応混合物がガスケットの側面より漏れ出し、ガスケット／カバーの密封を崩壊させて環境を汚染するリスクを高めることもある。充填およびベント用の穴を有するカバースリップはこれら２つの問題を回避する。しかし、カバースリップの穴からのインキュベーションチャンバーの充填には、しばしばインキュベーションチャンバーへの気泡またはエアポケットの導入というリスクがある。さらに、液状サンプルまたは反応混合物の表面張力が、液状サンプルまたは反応混合物による反応チャンバーの完全な充填を妨害することもある。部分的に充填されたチャンバーは、エアポケットがアレイスポットを覆いかつアレイスポットと液状サンプルまたは反応混合物との接触を妨害した場合に偽陰性となることもある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
標的分子を検出することを目的としたフローセルデバイスが開示される。フローセルデバイスは反応チャンバー、廃液チャンバー、入口ポート、反応チャンバーを入口ポートと接続する第１の導管、および反応チャンバーを廃液チャンバーと接続する第２の導管を含む。反応チャンバーは入口、出口、マイクロアレイ、およびチャンバーの上面および下面のうちいずれか一方にある親水性領域を有する。廃液チャンバーは、液状物が毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動することを可能とする吸収剤を有する。
【０００７】
標的分子を検出することを目的としたデバイスも開示される。デバイスは、入口、出口、標的分子と特異的に結合する標的捕捉面、および反応チャンバーの上面および底面のうち少なくとも一方にある親水性領域を有する反応チャンバー；液状物を毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動させることができる吸収剤を有する廃液チャンバー；および反応チャンバーを廃液チャンバーと接続する可変幅導管を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
発明を実施するための形態は、同様の番号が同様の要素を指す以下の図面を参照するであろう。
【０００９】
【図１】マイクロアレイシステムのインキュベーションチャンバーの実施形態の模式図である。
【図２】貫通するピペットチップを有するサポートハウジング内のドームバルブの模式図である。
【図３】廃液チャンバーを有するマイクロアレイシステムの実施形態の模式図である。
【図４】廃液チャンバーを有するマイクロアレイシステムの他の実施形態の模式図である。
【図５】一体型マイクロアレイシステムの実施形態の模式図である。
【図６】一体型マイクロアレイシステムの他の実施形態の模式図である。
【図７】一体型マイクロアレイアセンブリの構成要素を示す模式図である。
【図８】図７のアセンブリ用のスペーサーテープを示す模式図である。
【図９】図８のスペーサーテープの接着剤と結合する図７のアセンブリの上面フィルムを示す模式図である。
【図１０】厚みのある吸着材を考慮したスペーサーテープを示す模式図である。
【図１１】図９および１０におけるスペーサーのポケットに嵌合する吸収剤の模式図である。
【図１２】ベント孔を有する廃液チャンバー用のカバーを示す模式図である。
【図１３】ＰＣＲマイクロアレイシステムにおいてサンプル分析を実施するための方法を示すフローチャートである。
【図１４】プロテインマイクロアレイシステムにおいてサンプル分析を実施するための方法を示すフローチャートである。
【図１５】１５Ａおよび１５Ｂ「ストリッププロテインアレイ」および「ストリッププロテインアレイ」を含むよう適合させたプロテインマイクロアレイシステムの実施形態を示す。
【図１６Ａ】廃液チャンバーへの液状物の吸い上げを評価するために用いられる４つのマイクロアレイインキュベーションチャンバーアセンブリを示すピクトゥである。
【図１６Ｂ】図１６Ａのマイクロアレイインキュベーションチャンバーアセンブリを用いたハイブリダイゼーションの結果を示すピクトゥである。
【図１７Ａ】一体型マイクロアレイシステムの実施形態を示す図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａのマイクロアレイシステムによるハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図１８Ａ】マイクロアレイシステムの実施形態の模式図である。
【図１８Ｂ】図１８Ａのマイクロアレイシステムによるハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図１８Ｃ】図１８Ａのマイクロアレイシステムのアレイマップである。
【図１９】チップマップ、プロテインアレイシステム、および実施例６の代表的なアレイの画像を示す図の組合せである。
【図２０】ガラス基板を有するマイクロアレイシステム上で増幅、つづいて洗浄および乾燥ステップを行った精製ＭＲＳＡ標的３００ｐｇの結果を示す。
【図２１Ａ】マイクロアレイシステムの反応チャンバーに含まれ、かつ図２０、２２および２３のためのデータを取得するために用いられたマイクロアレイのＭＲＳＡチップマップ。チップマップは、試験の信頼性を高めかつ４分区間の間での非均一性を評価するために４つの反復を有する。
【図２１Ｂ】チップマップと関連付けたプローブのリスト。同一ターゲット用のプローブは長さおよび配列が異なる。プローブ配列９および２９はメチシリン耐性を付与するｍｅｃＡ遺伝子に由来する。プローブ１４および４２は全てのＳｔａｐｈ株に存在するｔｕｆＡ遺伝子に由来する。プローブ１８、１９、３１および４３はｔｕｆＡ遺伝子に由来するが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにのみ特有である。プローブ３５、３６および３７はＳ．ａｕｒｅｕｓとｍｅｃＡカセットの接合領域を標的とする。
【図２２】ガラス基板を有するマイクロアレイシステム上で増幅し、その後液状物中で読み取った精製ＭＲＳＡ標的１ｎｇの結果を示す。
【図２３】乾燥ステップのないプラスチック基板上の精製３００ｐｇＭＲＳＡ標的の結果を示す。
【図２４】以下の条件下でＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ遺伝子１０４コピーによって攻撃されたアレイの原像の組合せである：パネル（ａ）試験管内で増幅、バイオチップ上でハイブリダイゼーション、ピペッターで洗浄、かつオンチップ乾燥の手順；パネル（ｂ）バイオチップ上でＰＣＲ増幅、ピペッターで洗浄、かつオンチップ乾燥の手順；パネル（ｃ）試験管内で増幅、フレームシール内のアレイ上でハイブリダイゼーション、フレームシールを除去、バス内で洗浄、かつ風乾の手順。パネル（ｄ）は画像と対応するアレイマップである。パネル（ｂ）のオンチップ増幅はマスターミックス中にハイブリダイゼーションマーカーがないので、ハイブリダイゼーションマーカーはパネル（ａ）および（ｃ）の画像内でのみ視認できることに留意されたい。
【図２５】以下の各条件における信号雑音比を比較する図である：１）バイオチップ上で増幅およびハイブリダイゼーションした後ピペッティング洗浄しさらにオンチップ乾燥するプロトコル、２）バイオチップ増幅した後ピペッティング洗浄するプロトコル、および３）試験管増幅した後フレームシールハイブリダイゼーションし、バス内で洗浄し、風乾。各例ともＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ遺伝子１０４コピーを増幅した。２つの標的の積分スポット強度よりローカルバックグラウンドを減算し、ｄＮ２０ナンセンススポットを用いて表示の比率を算出する。画像は、オーロラポートアレイ５０００を用いて、スポットが飽和値寸前となる長さまでの露出時間で画像を撮像した。
【図２６】以下の各条件における平均雑音（ｄＮ２０）信号を比較する図である：１）バイオチップ増幅の後１×ＳＳＰＥ ７５μＬおよび水２５μＬでピペッター洗浄；２）バイオチップ増幅の後１×ＳＳＰＥ １７５μＬおよび水２５μＬでピペッター洗浄；および３）試験管で増幅し、フレームシール内でハイブリダイゼーションし、マイクロアレイバス内でアレイを洗浄。インプットサンプルは、バイオチップおよびフレームシールのいずれについてもＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ遺伝子１０４コピーである。バイオチップはオーロラポートアレイ５０００で０．２秒間撮像した。ｄＮ２０（ナンセンスプローブ）スポットをスポットファインダーで同定し、さらに４つのｄＮ２０スポットの各積分蛍光強度よりローカルバックグラウンドを減算して平均し、最大値と最小値を表す誤差棒と共にプロットする。ｄＮ２０ナンセンスプローブは増幅反応由来の生成物などの標識化標的との非特異的結合により蛍光を発するため、ｄＮ２０信号は洗浄効果と反比例する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
この記載は、本発明の書面による記載全体の一部と見なすべき、添付の図面と関連付けて読まれることを意図している。図面は必ずしも縮尺を定めるものではなく、かつ明確性および簡潔性を目的とし、縮尺においてまたは幾分模式的な形態で、本発明の一定の性質が誇張して示されてもよい。記載においては、「前方」「後方」「上方」「下方」、「上部」および「底部」などの相対的な用語およびそれらの派生語は、その後に記載されるかまたは考察対象の図面に示されるところの方向を指すと解釈すべきである。これらの相対的な用語は、記載の簡便性を目的とし、かつ通常は特定の方向を要求することを意図していない。「連結された」および「接続された」などの接続、連結などに関する用語は、特に説明的に記載されない場合、構造物が介在構造、さらには両者が可動または剛直接続または関係を介して互いに直接的または間接的に固定または接続されることを特徴とする関係を指す。
【００１１】
本明細書に記載するところの用語「標的捕捉面」は、標的分子と特異的に結合する面を指す。標的捕捉面は、オリゴヌクレオチドプローブ、抗原、または抗体などの標的捕捉材料によってコーティングされる面であってもよい。標的捕捉面は、ヌクレオチドと特異的に結合する焼結ガラスフリット面などの、標的分子に対する特異的親和性を示す非コーティング面であってもよい。一部の実施形態においては、標的捕捉面はマイクロアレイを含む。
【００１２】
本明細書で用いるところの用語「マイクロアレイ」は、目的のリガンドとの結合のために提供された整列したスポットのアレイを指す。マイクロアレイは少なくとも２つのスポットからなる。目的のリガンドは核酸（例：分子ビーコン、アプタマー、ロックされた核酸、ペプチド核酸）、タンパク質、ペプチド、多糖類、抗体、抗原、ウイルスおよび細菌を含むが、これに限定されない。
【００１３】
本明細書で用いるところの用語「親水性面」は、そのような面上に静置した純水の水滴と６０°またはそれ以下の接触角を形成するような面を指す。本明細書で用いるところの用語「疎水性面」は、そのような面上に静置した純水の水滴と６０°よりも大きな接触角を形成するような面を指す。接触角は接触角角度計を用いて測定することができる。
【００１４】
本明細書に記載するところの用語「インキュベーションチャンバー」は、標的捕捉面またはマイクロアレイの周囲の密封された空間を指す。インキュベーションチャンバーは、液状サンプルで満たされるとき、液状サンプル中の標的分子が標的捕捉面またはマイクロアレイプローブと密接な接触を維持できるよう、標的捕捉面またはマイクロアレイが液状サンプルによって浸されることを可能とする。
【００１５】
本明細書においては、オンチップ増幅は、マイクロアレイを含むインキュベーションチャンバー内の溶液中で標的分子の対称または非対称増幅が発生するプロセスと定義される。
【００１６】
マイクロアレイシステムフォーマットにおいては他の増幅スキーム、たとえば同一または異なる濃度比の１つまたはそれ以上のプライマーがマイクロアレイ上に固定され、かつアレイ上で全体的または部分的に増幅が起こるものなどが可能である。追加的なプライマーを、アレイ上に固定されたプライマーと同一または異なる順番でチャンバー内に溶液として加えてもよい。これらの増幅スキームは、ＤＮＡまたはＲＮＡ酵素を用い、等温でまたは温度サイクルを用いて行うことができる。実施例は：アレイ化プライマー拡張（ＡＰＥＸ）、マルチプレックスマイクロアレイ促進ＰＣＲ（ＭＭＥ−ＰＣＲ）、ブリッジ増幅、単一ヌクレオチド取り込み、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、増幅抵抗性変異系（ＡＲＭＳ）およびインベーダーテクノロジーを含む。
【００１７】
マイクロアレイシステムに使用できる他の核酸反応は連結、エキソまたはエンドヌクレアーゼによる制限酵素消化、ニッキング酵素開裂、ハイブリダイゼーション保護測定（ＨＰＡ）または翻訳を含む。
【００１８】
上に指摘したように、液状サンプルまたは反応混合物の表面張力は、液状サンプルまたは反応混合物が、マイクロアレイシステムのインキュベーションチャンバーといった小さな空間を完全に充填することを妨害することが多い。表面張力は、多様な分子間力による液状物の分子間引力の結果である。液状物の本体においては、各分子は隣接する液状物分子によって全方向に同等に引かれ、その結果正味の力はゼロとなる。液状物の表面においては、分子は液状物内部のより深いところにある他の分子によって内向きに引かれ、かつ隣接する媒体内（真空、空気または他の液状物の場合）の分子によっては強く引かれない。したがって、表面にある全ての分子は内向きの分子引力を受け、これは圧縮に対する液状物の抵抗によってのみ均衡することができる。この内向きの引力は表面積を減少させる傾向があり、この点で液状物の表面は伸長した弾性膜と類似している。したがって、液状物は局部的に可能な最も小さな表面積となるまで密に収縮する。最終的な結果は、液状物が小空間内でほぼ球状の形態を維持し、かつ角、特に小空間内の立方体の角を満たさないというものである。マイクロアレイの面より被覆を離隔する典型的な小さな空隙は、しばしば液状物を円柱状の形態に圧縮する。
【００１９】
フローセルデバイスの場合、インキュベーションチャンバーを満たす液状物は、ハイブリダイゼーションバッファーまたは洗浄バッファーなどの水ベースの液状物である可能性が最も高い。水ベースの液状物の表面張力は、インキュベーションチャンバーの内面の少なくとも一部を親水性材料によってコーティングすることにより克服しうる。
【００２０】
本明細書に記載されるのは、標的捕捉面、および液状物がチャンバー内に入る際にこれと接触する親水性面を含むインキュベーションチャンバーを有するフローセルシステムである。液状物がチャンバーに流入する際にこれと接触する親水性面の使用によって、インキュベーションチャンバーの完全な充填が可能となる。一部の実施形態においては、親水性面はインキュベーションチャンバーの完全な上面を形成する。他の実施形態においては、標的捕捉面はマイクロアレイを含む。
【００２１】
図１はインキュベーションチャンバーの１つの実施形態を示す。この実施形態においては、平面基板３０の上面３２上にプリントまたは形成された複数のアレイスポット２２よりなるマイクロアレイ２０の周囲にインキュベーションチャンバー１０が形成される。面３２はインキュベーションチャンバー１０の底面も形成する。チャンバー１０の上面はカバースリップ４０によって被覆される。インキュベーションチャンバー１０は、典型的にはガラスまたはプラスチックスライドである平面基板３０のサイズと適合するあらゆるサイズまたは形状とすることができる。一部の実施形態においては、平面基板３０はリールトゥリール製法用に巻き取ることのできるプラスチックフィルムである。１つの実施形態においては、プラスチックフィルムはポリエステルである。
【００２２】
この実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０は平面基板３０の上部にガスケット３４を載置し、かつガスケット３４をカバースリップ４０で被覆することによって形成される。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０は平面基板３０にポケットまたは陥凹領域を作成し（たとえば成形またはエッチングなどによって）、マイクロアレイ２０をポケットまたは陥凹領域の底部にプリントし、かつポケットまたは陥凹領域をカバースリップ４０によって被覆することによって形成される。さらに他の実施形態においては、ポケットまたは陥凹領域はカバースリップ４０上に形成され、その後これを平面基板３０の上部に直接載置することによって形成される。
【００２３】
インキュベーションチャンバー１０は、インキュベーションチャンバー１０内でのハイブリダイゼーションまたは他のあらゆる反応に必要な液状物の体積を減少するよう、マイクロアレイ２０の周囲に形成される。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバーは約０．１〜１０ｃｍ２，好ましくは約０．２５〜２．５ｃｍ２の底面積、および約０．０５〜５ｍｍ、好ましくは約０．１〜１ｍｍの高さを有する。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバーの総容積は約１〜２５０μＬの範囲内である。
【００２４】
インキュベーションチャンバー１０は、その形態に応じ、その上にマイクロアレイ２０が形成される底面、底面と下方に向き合いかつ通常は底面と平行である上面、および１つまたはそれ以上の側面を含むいくつかの内面を有する。インキュベーションチャンバー１０の均一な充填を担保するために、全ての内面を親水性とする必要はない。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面のみが親水性である。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の底面のみが親水性である。他の実施形態においては、上面および底面が共に親水性である。さらに他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の全ての内面が親水性である。
【００２５】
親水性面は水を誘引する面である。親水性面は、典型的には電荷分極しかつ水素結合することのできる分子を含む。１つの実施形態においては、平面基板３０またはカバースリップ４０は親水性材料より製造され、かつこれによりそれぞれ親水性底面または親水性上面を提供する。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面または底面が不溶性親水性材料によってコーティングされる。親水性材料の例はポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル、ビオナイト、ポリ（Ｎ−ビニルラクタム）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリアクリルアミド、セルロース系材料、メチルセルロース、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、アルキルフェノールエトキシラート、複合ポリオールモノエステル、オレイン酸ポリオキシエチレンエステル、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンエステル、および脂肪酸ソルビタンエステルなどの親水性ポリマー；無機酸化物、金、ゼオライトおよびダイヤモンド様炭素などの無機親水性材料；およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、アルキル硫酸塩、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、アルキルベンゼンスルホン酸、石けん、脂肪酸塩、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）別名臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、アルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化牛脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミンオキシド、コカミドプロピルベタイン、ココヤシ両性グリシナートアルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（市販名はポロキサマーまたはポロキサミン）、アルキルポリグルコシド、脂肪アルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、コカミドＴＥＡなどの界面活性剤を含むが、これに限定されない。界面活性剤はポリウレタン類およびエポキシ類などの反応性ポリマーと混合して親水性コーティングの役割を果たすことができる。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面または底面が雰囲気プラズマ処理によって親水性とされる。
【００２６】
代替的に、インキュベーションチャンバーの底面または上面が市販の親水性テープまたはフィルムによって被覆されてもよい。親水性テープの例はアドヒーシブズ・リサーチ（ＡＲ）テープ９０１２８、ＡＲテープ９０４６９、ＡＲテープ９０３６８、ＡＲテープ９０１１９、ＡＲテープ９２２７６およびＡＲテープ９０７４１（アドヒーシブズ・リサーチ社、ペンシルバニア州グレンロック）を含むが、これに限定されない。親水性フィルムの例は（フィルムスペシャリティーズ社、ニュージャージー州ヒルズバラ）製のビステックス（登録商標）およびビスガードフィルムおよびレクサンＨＰＦＡＦ（ＧＥプラスチックス、マサチューセッツ州ピッツフィールド）を含むが、これに限定されない。他の親水性面はサーモディクス社（ミネソタ州イーデンプラリー）、バイオコート社（ペンシルバニア州ホーシャム）、アドバンスドサーフェステクノロジー（マサチューセッツ州ビルリカ）、およびハイドロマー社（ニュージャージー州ブランチバーグ）より入手できる。
【００２７】
１つの実施形態においては、親水性テープまたはフィルムはインキュベーションチャンバーの上面からのマイクロアレイの光学的照合を可能とするのに十分な透明性を有する。他の実施形態においては、親水性面はインキュベーションチャンバーの上面を親水性コーティングによって被覆することにより作成される。他の実施形態においては、親水性面は単純にカバースリップ４０を親水性テープまたは親水性フィルムと置換することによって作成される。
【００２８】
さらに他の実施形態においては、親水性面は細胞膜を溶解し、タンパク質を変性させ、かつ核酸を捕捉する化学物質を含浸させた親水性マトリクスである。親水性マトリクスはサンプルの精製およびサンプルのインキュベーションチャンバー内への均一な吸い上げという２つの機能を果たすであろう。１つの実施形態においては、親水性マトリクスはＦＴＡ紙（登録商標）（ワットマン社、ニュージャージー州フローハムパーク）である。生体サンプルをＦＴＡ紙に塗布すると、サンプルに含まれる細胞が紙の上で溶解する。紙を洗浄して全ての非ＤＮＡ材料を除去する（ＤＮＡは紙に絡め取られて残る）。次に、続いてマイクロアレイ分析を実施するためにＤＮＡを溶離する。代替的に、結合したＤＮＡを原位置で増幅し、溶離ステップを実施せずにマイクロアレイ検出を実施してもよい。
【００２９】
ＦＴＡ紙（登録商標）はアレイの対向面（すなわちインキュベーションチャンバーの上面）として用いることができる。代替的に、マイクロアレイをＦＴＡ紙にプリントしてもよく、さらにインキュベーションチャンバーの上面の透明なカバースライドによってマイクロアレイの可視化が可能となるであろう。他の実施形態においては、ＦＴＡ紙（登録商標）上の核酸サンプルの増幅を目的として、ＰＣＲ試薬をインキュベーションチャンバー内に導入してもよい。この実施形態においては、増幅はインキュベーションチャンバー１０の内部で実施されるであろう。
【００３０】
マイクロアレイ２０は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびプロテインマイクロアレイを含むがこれに限定されないあらゆる種類のマクロアレイとすることができる。１つの実施形態においては、マイクロアレイ２０は、たとえばいずれもその全文が本明細書に参照文献として援用される米国特許第５，７４１，７００号、第５，７７０，７２１号、第５，９８１，７３４号、第６，６５６，７２５号および米国特許出願第１０／０６８，４７４号、第１１／４２５，６６７号および第６０／７９３，１７６号に記載されるプリントゲルスポット法を用いて形成される。
【００３１】
他の実施形態においては、マイクロアレイシステムは液状物（例：サンプル、標的を含有するＰＣＲバッファー、ハイブリダイゼーションバッファー、または洗浄バッファー）をインキュベーションチャンバー１０に導入するための一方向バルブをさらに含む。生物兵器の検出など一定の用途においては、重要な懸念となる環境汚染を予防するために、サンプルは一方向バルブよりインキュベーションチャンバー１０に導入される。１方向バルブはチェックバルブであっても、またはインキュベーションチャンバー１０の入口ポートに載置するドームバルブであってもよい。多様なサイズのドームバルブが市販されている（例：マルチバルブ・インターナショナル製、オハイオ州イエロースプリングス）。図２に示す実施形態においては、ドームバルブ５０は２つのコンポーネント：ドーム型のバルブ本体５２およびバックシール５４を含む。バックシールは、イントロデューサー５６がバックシール５４を貫通することを可能とする穴（示さず）を有する。イントロデューサー５６は、バックシール５４を貫通するためのとがった先端を有するあらゆる液状物送達デバイスであってよい。この実施形態においては、イントロデューサー５６はピペットチップである。他の実施形態においては、イントロデューサー５６は注射針である。
【００３２】
ドームバルブ５０はイントロデューサー５６による容易なアクセスを可能とし、かつイントロデューサー５６の先端がバックシール５４よりドームバルブ５０内に入る際に先端に適合する。イントロデューサー５６の抜去後、バックシール５４の開口部は自然に閉鎖してサンプルがドームバルブ５０よりインキュベーションチャンバー１０外に漏出することを防止する。したがって、ドームバルブ５０は刺入可能な隔壁およびチェックバルブの両方の役割を果たす。ドームバルブは、支持構造５８を介してマイクロアレイアセンブリに設置してもよい。１つの実施形態においては、ドームバルブは入口ポート１１および入口導管１４を経てインキュベーションチャンバー１０と接続される（図３）。
【００３３】
さらに他の実施形態においては、マイクロアレイシステムはさらに廃液チャンバーを含む。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００（商標）マイクロアレイリーダーなどの多くの光学リーダーは、乾燥した画像を読み取るとき信号雑音比が改善する。したがって、マイクロアレイをマイクロアレイリーダーに載置する前に液状物をインキュベーションチャンバーより除去するために、廃液チャンバーをマイクロアレイシステムに組み込むことが有利である。今度は図３を参照すると、インキュベーションチャンバー１０は同一のマイクロアレイスライド上に形成された廃液チャンバー６０に接続される。
【００３４】
廃液チャンバー６０はあらゆる形状とすることが可能であり、かつ典型的にはインキュベーションチャンバー１０の容積よりも大きな容積を有している。１つの実施形態においては、廃液チャンバーはガスケットテープに形成された後、その上にマイクロアレイ２０がプリントされた基板３０（図１参照）と接着される。さらに他の実施形態においては、基板３０はその上面に切り欠きを有する。廃液チャンバー６０が一旦基板３０とガスケット３４の間に形成された後にインキュベーションチャンバー１０の深さよりも大きな深さを有するよう、切り欠きはガスケット３４の廃液チャンバー６０のサイズおよび位置と適合するサイズおよび位置を有する。他の実施形態においては、基板３０に切り欠きを容易に作成できるよう、基板３０はプラスチック材料で製造される。さらに他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０はいずれもガスケット３４を用いることなく基板３０上に形成される。しかし、廃液チャンバー６０はインキュベーションチャンバー１０の深さよりも大きな深さを有してもよい。
【００３５】
１つの実施形態においては、廃液チャンバー６０は、一旦インキュベーションチャンバー１０が液状物と接触すると、インキュベーションチャンバー１０より液状物を吸い上げ、それによりマイクロアレイ２０が乾いた状態で読み取られること可能とする吸収剤６２を含む。
【００３６】
吸収剤６２は比較的大量の液状物を保持することのできるあらゆる材料とすることができる。１つの実施形態においては、吸収剤６２は繊維の凝集物より製造される。他の実施形態においては、吸収剤６２はスルーエアーボンディング工程で生成された不織布である。不織布の構成繊維は親水性合成繊維、パルプなどの天然セルロース繊維、または再生セルロース繊維とすることができる。繊維は、液状物吸収を向上させるために界面活性剤または親水性油をコーティングしたり、または浸透させてもよい。本明細書における使用のための不織布は、スルーエアーボンディング工程に限定されず、スパンボンディング工程、エアーレイング工程、スパンレーシング工程などの他のあらゆる工程によって製造してもよい。１つの実施形態においては、吸収剤６２はミリポア社（マサチューセッツ州ビルリカ）製のセルロース紙（Ｃ０４８）である。
【００３７】
再度、図３を参照すると、廃液チャンバー６０は導管１２を介してインキュベーションチャンバー１０に接続される。導管１２は二重の目的を果たす。導管１２は、液状物で満たされるときにインキュベーションチャンバー１０と廃液チャンバー６０の間の液状物経路を提供する。空気で満たされるとき、導管１２はインキュベーションチャンバー１０を廃液チャンバー６０から離隔し、廃液チャンバー６０内の吸収剤６２による早すぎる吸い上げを防止する。
【００３８】
インキュベーションチャンバー１０内の液状物は、インキュベーションチャンバー１０内部の液状物を導管１２に押出し、かつ導管１２内の液状物と廃液チャンバー６０内の吸収剤６２との接触を確率させることによって除去される。接触は、インキュベーションチャンバー１０内の液状物に圧力を加えて液状物を導管１２から押し出すことによって、あるいは廃液チャンバー６０のベント６４に吸引を行って導管１２内の液状物を引き出すことによって確立してもよい。インキュベーションチャンバー１０内の液状物に対する圧力は、ドームバルブ５０から（例：ピペットまたはシリンジを用いて）圧力をかけることにより生成してもよい。インキュベーションチャンバー１０が親水性テープまたは親水性フィルムによってのみ被覆される場合、インキュベーションチャンバー１０内部の液状物に対する圧力はインキュベーションチャンバー１０の上面を形成する親水性テープまたはフィルムを単純に押すことによって生成してもよい。代替的に、導管１２中の液状物と吸収剤６２との接触は、吸収剤６２が導管１２内の液状物に触れるまで吸収剤６２を導管１２に向かって移動させることにより確立される。
【００３９】
一旦接触が確立されたならば、インキュベーションチャンバー１０内の液状物を、導管１２を経て廃液チャンバー６０内の吸収剤６２中に吸い上げる。液状物の流量は導管１２のサイズ、液状物の表面張力および粘度、および吸収剤６２の吸い上げ速度によって決定される。さらに、吸収剤がより飽和するにつれて流量は減少する。流量は、廃液チャンバー６０内への吸収剤６２の留置によって制御することもできる。導管１２の出口近傍に留置した吸収剤は、より離れて留置した吸収剤よりも高い流量をもたらす。したがって、吸収剤６２の隅を切り落とすことによって、導管１２の出口と吸収剤６２の距離の増加によるより遅い流量がもたらされる。
【００４０】
気泡がインキュベーションチャンバー１０内に導入される場合、気泡が導管１２内に滞留しかつ導管１２内の液状物の流動を部分的または完全に遮断することがある。気泡が液状物と吸収剤６２のまさに接触面に位置する場合、気泡が吸収剤６２の吸い上げ作用も停止させることがある。この問題は図４に示す導管の設計によって克服することができる。この実施形態においては、導管１２は３つのセクション：入口セクション１５、漏斗型接続セクション１６および出口セクション１７を含む。出口セクション１７は入口部分１５の直径よりも小さな直径を有する。より小さな直径は、出口セクション１７において、入口部分１５への圧よりも高い毛細管圧をもたらす。圧の差は出口セクション１７への液状物の移動に至る。操作中、すでに出口セクション１７にある液状物は出口セクション１７の外に押し出されかつ液状物と吸収剤６２の接触部分のエアーポケットの周囲を通過する。漏斗型接続部分１６は、導管の毛管現象による早すぎる吸い上げを防止するオーバーフロー領域を提供する。他の実施形態においては、出口セクション１７はより直径の大きな第１の部分（図４のセクション１７の水平部分に相当）およびより直径の小さな部分（廃液チャンバー６０に流入するセクション１７の垂直部分に相当）の２つのサブセクションにさらに分割される。
【００４１】
インキュベーションチャンバー１０におけるハイブリダイゼーションまたは増幅プロセスが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における熱サイクリングの変性ステップのような加熱ステップを包含する場合、インキュベーションチャンバー１０の内部の液状物が導管１２より押し出され、かつインキュベーションチャンバー１０内の圧力上昇により吸収剤６２との早すぎる接触を行うこともある。これらの状況下では、吸収剤６２による早すぎる吸い上げを防止するために、（インキュベーションチャンバー１０が充填される際に）導管１２内に意図的に空気を残してもよい。代替的に、吸収剤６２による早すぎる吸い上げを防止するために導管１２の内部に疎水性停止装置を配置してもよい。１つの実施形態においては、疎水性停止装置は疎水性内面を有する導管セクションを含む。１つの実施形態においては、疎水性面は未処理の導管面をテフロン（登録商標）、シリコンまたはシランなどの疎水性材料でコーティングまたは処理することにより形成される。他の実施形態においては、導管１２の内面は親水性材料によってコーティングされ、かつ疎水性停止装置は未処理の疎水性プラスチック材料を露出する非コーティング面を有する導管１２のセクションを含む。
【００４２】
他の実施形態においては、吸い上げが適切な間隔で起こることを担保するために、インキュベーションチャンバー１０を複数の廃液チャンバー６２と接続する。
【００４３】
均一に充填するための親水性インキュベーションチャンバー、サンプルの汚染を防止するための１方向バルブ、およびインキュベーションチャンバーから液状物を除去するための廃液チャンバーを有する一体型マイクロアレイシステムも、本明細書に記載される。今度は図５を参照すると、一体型マイクロアレイシステム１００の１つの実施形態は、基板３０上にプリントまたは形成されたマイクロアレイ２０、マイクロアレイ２０の周囲に形成された親水性インキュベーションチャンバー１０、導管（示さず）を介したインキュベーションチャンバー１０との流体連絡路内のドームバルブ５０、および導管１２を介してインキュベーションチャンバー１０と接続される廃液チャンバー６０を含む。吸収剤６２は、ベント６４を介して大気にベントされた廃液チャンバー６０に組み入れられる。透明親水性カバー７０はインキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０の上面を形成する。１つの実施形態においては、ベント６４は単純に廃液チャンバー６０のカバーに穴を打ち抜くことによって作成される。
【００４４】
親水性テープまたはフィルムによってインキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０を被覆することの長所のひとつは、薄いフィルムまたはテープが圧力下で変形することができることである。したがって、廃液チャンバーにわずかな圧を加えることによりインキュベーションチャンバー１０内で液状物を混合することが可能であり、これによりインキュベーションチャンバー１０にわずかな変形が、さらにこれによりインキュベーションチャンバー１０内における液状物の移動が引き起こされるであろう。
【００４５】
図６は、反応チャンバー１０、廃液チャンバー６０および洗浄バッファーチャンバー８０を含むマイクロアレイシステム１００の他の実施形態を示す。チャンバーは、チャンバー間の液状物の流動を制御する毛細管停止装置９０によって互いに接続される。毛細管停止装置は、流体流動を制御するために１つまたはそれ以上の「階段」セクションおよび／または１つまたはそれ以上の「スイッチバック」セクションを含んでもよい。この実施形態においては、ユーザーは始め入口９１より洗浄バッファーチャンバー８０を満たし、これを密封する。次に、ユーザーは入口９２より反応チャンバー１０をサンプルで満たし、これを密封する。最後にユーザーはベント９３を密封する。次に、マイクロアレイシステム１００を通常のスライドブロックサーモサイクラー（例：クワンタ・バイオテック、サーモフィッシャーなど）内に留置する。熱サイクリング後、マイクロアレイシステム１００を取り出し、ベント９３に細孔を開ける。ベント９３の細孔を開くと、その後洗浄バッファーが反応チャンバーを経て廃液チャンバーに移動するため、反応チャンバーは最終的に撮像のための乾燥状態となる。廃液チャンバー内の吸収剤６２は生成物を含み、かつベント９３に細孔を開くときのエアロゾル化を防止するであろう。１つの実施形態においては、多孔質膜を用いてエアロゾル化が起こらないことを担保してもよい。
【００４６】
他の実施形態においては、標的分子を検出することを目的としたマイクロアレイシステム２００が開示される。マイクロアレイシステム２００は反応チャンバー、廃液チャンバー、入口ポート、反応チャンバーを入口ポートと接続する第１の導管、および反応チャンバーを廃液チャンバーと接続する第２の導管を含む。反応チャンバーは入口、出口、マイクロアレイおよび液状サンプルがチャンバー内に気泡を伴わずに導入されることを可能とするチャンバーの上面および下面のうちいずれか一方上の親水性領域を有する。廃液チャンバーは、液状物が毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動することを可能とする吸収剤を有する。
【００４７】
図７はマイクロアレイシステム２００の１つの実施形態を示す。この実施形態においては、マイクロアレイシステム２００はマイクロアレイ２１１を有するアレイ基板２１０、反応チャンバースペーサー２２０、親水性カバー２３０、および廃液チャンバースペーサー２４０、吸収剤２５０およびベント孔２６１を有する廃液チャンバーカバー２６０を含む層構造を含む。反応チャンバースペーサー２２０は、組み立てられたマイクロアレイシステム内にアレイ２１１を取り囲む反応チャンバー２２１を形成する開口部、接続導管２２２および２２３、入口孔２２４および廃液チャンバー２２５を有する。導管２２２は反応チャンバー２２１を入口孔２２４と接続し、かつ導管２２３は反応チャンバー２２１を廃液チャンバー２２５と接続する。
【００４８】
親水性カバー２３０は反応チャンバー２２１および接続導管２２２および２２３の上部を被覆する。親水性カバー２３０は入口孔２２４および廃液チャンバー２２５に適合する入口孔開口部２３４および廃液チャンバー開口部２３５も含む。廃液チャンバースペーサー２４０は、親水性カバー２３０の廃液チャンバー開口部２３５およびスペーサー２２０の廃液チャンバーと適合する廃液チャンバー開口部２４５を有する。吸収剤２５０は廃液チャンバー２２０に嵌合するよう寸法取りされ、かつ廃液チャンバーカバー２６０によって被覆される。入口孔開口部２２４および２３４は、入口ポート２７０からの反応チャンバー２２１へのアクセスを提供する。
【００４９】
１つの実施形態においては、反応チャンバー２２１の側壁は反応中の気泡を捕捉するために親水性となっている。
【００５０】
他の実施形態においては、親水性カバー２３０は親水性領域が反応性チャンバー２２１の出口２２７の近傍に作成されるよう配置される。関連する実施形態においては、親水性領域は親水性ゲルエレメントによって作成される。
【００５１】
他の実施形態においては、反応チャンバー２２１内の内容物がマイクロアレイシステム２００から放出されることなく洗浄することを可能とするために、入口ポート２７０は刺入可能な膜／テープまたはドームバルブを含む。
【００５２】
他の実施形態においては、アレイ基板はガラスまたプラスチックである。さらに他の実施形態においては、反応チャンバースペーサー２２０は両面テープである。１つの実施形態においては、接続導管２２３は「階段およびスイッチバック」セクションを有する。図８に示すように、導管２２３の「階段」セクションは、アレイチャンバー側がより幅広く廃液チャンバー側で段階的に狭くなる複数のサブセクションを有する。この「階段」設計は早すぎる吸い上げを防止する。導管２２３の「スイッチバック」セクションは、一連の急激な導管の幅の変化および／または鋭い角を有する。これらの導管幅の変化および鋭い角は、ここでも液状物が反応チャンバー２２１から廃液チャンバー２２５に移動するためには好ましくない条件を再度作り出す。一部の実施形態においては、「鋭い角」は１３５°未満の角度で交差する２つの導管によって形成される角を指す。他の実施形態においては、導管２２３の「階段」セクションの１つまたはそれ以上のサブセクションの壁は、隣接する２つのサブセクションの壁の間で親水性の変化を引き起こすために、親水性または疎水性コーティングによってコーティングされる。１つの実施形態においては、反応チャンバー２２１の近傍にある導管２２３の「階段」セクションのサブセクションが親水性コーティングまたはポリマーによってコーティングされる一方で、隣接するサブセクションはコーティングされないか、または疎水性コーティングによってコーティングされる。そのような親水性の変化は、早すぎる吸い上げを防止するためのサブセクション間の流動停止装置として作用するであろう。
【００５３】
当業者は、マイクロアレイシステム２００が多くの変法を有することを理解するであろう。たとえば、反応チャンバー２２１、または廃液チャンバー２２５、またはそのいずれもがプラスチック基板２１０上に成形されてもよい。
【００５４】
マイクロアレイシステム２００にサンプル精製機能を組み入れてもよい。１つの実施形態においては、マイクロアレイシステム２００の入口ポート２７０は、サンプルから標的分子を精製または分離するためのサンプル精製マトリクスをさらに含む。代替的に、マイクロアレイシステム２００の反応チャンバー２２１はサンプルから標的分子を精製または分離するためのサンプル精製マトリクスをさらに含んでもよい。１つの実施形態においては、サンプル精製マトリクスはシリカである。
【００５５】
マイクロアレイ２１１は、標的分子に応じてオリゴヌクレオチドアレイまたはプロテインアレイとすることができる。１つの実施形態においては、マイクロアレイ２１１はオリゴヌクレオチドアレイであり、かつマイクロアレイシステム２００は標的ポリヌクレオチドを増幅および検出するために用いられる。
【００５６】
図８〜１２はマイクロアレイシステム２００の様々なコンポーネントの寸法を示す。
【００５７】
図１３はＰＣＲアレイ試験３００の実施形態を示すフローチャートである。簡単に言うと、全核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）をサンプルより分離し（ブロック３１０）、精製した核酸をＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび少なくとも１対のＰＣＲプライマーを含む増幅混合物と共にマイクロアレイシステム２００のアレイチャンバーに装填する（ブロック３２０）。ＰＣＲ反応はマイクロアレイシステム内で実施する（ブロック３３０）。増幅生成物をマイクロアレイシステム２００上でハイブリダイゼーションさせ（ブロック３４０）、さらにハイブリダイゼーションの結果をアレイリーダーで読み取る（３５０）。
【００５８】
サンプルはスワブ、鼻咽頭吸引液または全血サンプルなどのあらゆる生体サンプルとすることができる。全核酸は当業者に周知の方法によって分離してよい。１つの実施形態においては、全核酸はキアゲン試薬などの市販の核酸分離試薬またはキットによって分離される。他の実施形態においては、アコーニバイオシステムズが開発したサンプル調製デバイスによって全核酸を分離する。アコーニのサンプル調整法についての一般化された作業の順番は、溶解バッファーにおけるサンプルの変性；サンプル調製デバイス上への溶解サンプルの持続的な灌流；洗浄およびサンプル調製デバイスからの核酸の溶離を含む。
【００５９】
分離した核酸をマイクロアレイシステム２００に装填しさらに当業者に周知の方法でオンチップ増幅する。オンチップ増幅後、マイクロアレイシステム２００を所望の温度で一定時間インキュベートし（例：５０〜６５°で１０〜６０分）、アンプリコンをマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせる。インキュベーション後、マイクロアレイシステム２００を洗浄し（例：水などで）さらにマイクロアレイリーダー（例：アコーニのポータブルマイクロアレイリーダーなど）で撮像する。１つの実施形態においては、マイクロアレイシステムは撮像前に乾燥させる。他の実施形態においては、乾燥手順はインキュベーションチャンバーへのアセトンの導入および／またはインキュベーションチャンバーの加熱により遂行される。他の実施形態においては、非標識「順」プライマーに対して非常に過剰な量の蛍光標識された「逆」プライマー（例：５〜２０倍過剰）を含む非対称ＰＣＲマスターミックス中で、分離した核酸の増幅および増幅生成物の標識化を行う。この戦略により、その５’末端に単一の標識を有する一重らせん標的が主として生成される。
【００６０】
アレイ試験３００は多くの変法によって実施することができる。１つの実施形態においては、増幅された生成物はハイブリダイゼーション後反応チャンバー内に残留し、かつマイクロアレイの撮像前の洗浄もない。他の実施形態においては、増幅生成物は反応チャンバー内に留まり、かつＫｈｏｄａｋｏｖら（Ｋｈｏｄａｋｏｖ他、２００８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４４：２４１−２４８）が報告するところの成長曲線を示すために、ハイブリダイゼーション時にアレイスポットをリアルタイムで撮像する。さらに他の実施形態においては、反応チャンバーはＥＬＩＳＡなどのマルチステップ分析のための一連のインキュベーションおよび洗浄ステップを支援する。
【００６１】
他の実施形態においては、マイクロアレイ２１１はプロテインアレイであり、かつマイクロアレイシステム２００はタンパク質標的を検出するために用いることができる。図１４はプロテインアレイ試験４００の実施形態を示すフローチャートである。簡潔に言うと、サンプルよりタンパク質を抽出し（ブロック４１０）、抽出したタンパク質をアレイチャンバーに装填しかつマイクロアレイシステム２００のマイクロアレイと共にインキュベートし（ブロック４２０）、マイクロアレイを洗浄し（ブロック４３０）、さらに当業者に周知の方法を用いてマイクロアレイと結合したタンパク質標的を検出する（ブロック４４０）。
【００６２】
１つの実施形態においては、アレイエレメントと標的タンパク質の間の相互作用を改善するために、インキュベーションステップ４２０は周期的なまたは連続的振動の元で実施する。
【００６３】
他の実施形態においては、抽出されたタンパク質をプロテインアレイ上に連続的に灌流する。さらに他の実施形態においては、アレイエレメントと標的タンパク質との相互作用を向上させるために、抽出されたタンパク質がインキュベーションステップにおいて導管内を循環できるよう、プロテインアレイエレメントは細長い導管内で複数の試験紙の形態（プロテインストリップアレイ）に配列される（図１５Ａ）。図１５Ｂは、導管を経て廃液チャンバーと接続されるサンプルレザバーを含むマイクロアレイシステムの実施形態を示す。プロテインアレイまたはプロテインストリップアレイは導管の内側にプリントされる。サンプルより抽出されたタンパク質はレザーバー内に装填され、さらにプロテインアレイ中を連続的に流動し、廃液チャンバーに流入する。
【００６４】
好ましくは、導管は導管の高さが１００〜２０００μｍ、より好ましくは２００〜５００μｍの範囲にある薄型導管である。多孔質ゲルラインを通過して、あるいは横切ってサンプルが連続的に灌流されるよう、流路上に多孔質ゲルラインが形成されるであろう。非常に薄型の導管中を連続的に灌流することによって迅速な拡散動態が１次元的にもたらされ、拡散境界層が崩壊し、かつ対流性移動が増加してアレイエレメントと標的タンパク質の相互作用が促進される。圧力および／または吸収剤によって制御される流量で、感度を高めるために大容積を灌流することができる。ゲルエレメントは流路を貫通するので、その３Ｄプロファイルは標準的な２Ｄ Ａｂアタッチメントよりも好ましい拡散導体も提供する。数秒と非常に速いことが示されている（Ｒｏｓｓｉｅｒ他、Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０００）迅速な拡散動態を促進するために、３Ｄ半球状のゲルドロップを有する十分に薄い導管も設計することも可能であろう。１つの実施形態においては、ゲルラインは０．５ｎｍ〜０．５μｍの範囲の多孔性を有する。
【００６５】
薄型導管設計においては、スペーサーテープは薄く、かつ導管内へのオーバーシャインを防止するために低いバックグラウンド蛍光を有する必要がある。導管上のカバーは、導管内に折れ曲がりさらにプロテインアレイのゲルストリップを損傷しないよう、親水性でありかつ十分に剛直であることが必要である。
【実施例１】
【００６６】
（親水性テープでインキュベーションチャンバーを被覆したところチャンバーが完全に充填された）
図３に示すようなマイクロアレイを構築した。スライドは長さ２．９５インチおよび幅０．７５インチを有していた。幅０．５ｍｍの導管１４は充填入口ポート１１をマイクロアレイインキュベーションチャンバー１０に接続し、２．０ｍｍ導管１２はマイクロアレイインキュベーションチャンバー１０を廃液チャンバー６０に接続し、さらに廃液チャンバー６０から外部までの１．０ｍｍ導管６４はベントの役割を果たす。マイクロアレイインキュベーションチャンバー１０は１０ｍｍ×１０ｍｍのサイズを有する。厚さ０．２５ｍｍを有する内部のガスケットテープ（３Ｍ社より入手、ＰａｒｔＮｏ．９０８７）をレーザー切断して上記に記載の形状寸法を有するガスケットを形成した。ガスケットは、ゲルスポットプリント工程に用いたスライドと同様の接触角の疎水性面に載置した。ガスケットの上部は、親水性面を提供するために親水性テープ（ＡＲ９０１２８）で密封した。水３０μＬにより、気泡またはエアーポケットを残すことなく均一にチャンバーを充填した。チャンバーは、ハイブリダイゼーションバッファー３０μＬ（３Ｍチオシアン酸グアニジン、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、および１５ｍＭ ＥＤＴＡ）によっても均一に満たされた。疎水性テープ（ＡＲ８１９２）を用いた同様の試験では、非均一な充填によりマイクロアレイチャンバー内にエアーポケットが残った。
【００６７】
この実験により、チャンバーの親水性面によって液状物の表面張力が克服され、かつ四隅を含めたチャンバーの完全な充填が可能となることが示された。四隅は典型的には液状物がチャンバーを満たす際にエアーポケットを捕捉するので、この結果は驚くべきものである。
【実施例２】
【００６８】
（廃液チャンバーの吸い上げ効率の評価）
図１６Ａは、吸収剤を収容する廃液チャンバーと接続された親水性インキュベーションチャンバーをそれぞれ有する４つの試験マイクロアレイスライドを示す。廃液チャンバーは大気中にベントされた。チャンバーは、マイクロアレイ支持スライド上部にガスケットを載置することによって形成された（グレースバイオラボが提供する両面テープよりレーザーカットする）。インキュベーションチャンバー内の親水性面は、インキュベーションチャンバー空隙を親水性テープ（ＡＲ９０４６９）で被覆することにより製造された。吸収剤はミリポア製であった（Ｃ０４８）。Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来の増幅生成物、ハイブリダイゼーションマーカー、ＢＳＡおよびハイブリダイゼーションバッファーを含むサンプル９５μＬを９５℃で５分間変性させ、さらに入口ポートよりインキュベーションチャンバーに導入した。次に入口ポートをテープ（ＡＲ９０６９７）で密封した。スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラーにおいて反応物を５０℃で１時間インキュベートした。マイクロアレイスライドをタワーから取り出し、室温で水１５０μＬにより洗浄した。入口ポートより水がインキュベーションチャンバーに加えられるにつれ、インキュベーションチャンバー内の液状物は、インキュベーションチャンバーを廃液チャンバーと接続する導管を通って廃液チャンバーに押し出された。インキュベーションチャンバー内の液状物と廃液チャンバー内の吸収剤との接触が一旦確立すると、吸収剤はインキュベーションチャンバーより液状物（洗浄容積を含む）を吸い出すことが可能であった。次に、マイクロアレイスライドを９５℃で２０分間加熱してインキュベーションチャンバーを完全に乾燥させた。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００（商標）上で、装置に全く手を加えずにマイクロアレイを撮像した。画像は、インキュベーションチャンバーを被覆する親水性テープ越しに撮像した。
【００６９】
図１６Ｂは、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥ステップ後のマイクロアレイの例の画像を示す。生成物スポットは暗い黒色の点として示される。対照スポットはＣｙ３スポットおよびハイブリダイゼーションマーカーを含む。各アレイは４つのサブアレイの反復であるので、４セットのＹｐ生成物スポットである。全ての試験スライド上で均一なハイブリダイゼーションが達成された。
【実施例３】
【００７０】
（ドームバルブ、親水性インキュベーションチャンバーおよび廃液チャンバーを含むマイクロアレイシステム）
図１７Ａは、親水性テープで被覆されたインキュベーションチャンバー、吸収剤が組み込まれた廃液チャンバー、およびインキュベーションチャンバーと接続されたドームバルブを有する一体型マイクロアレイシステムの実施例を示す。ハイブリダイゼーションマスターミックスおよびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ生成物からなるサンプル９５μＬを９５℃で５分間変性させ、さらにレイニンＰ２００ｕＬピペッターを用いてドームバルブよりインキュベーションチャンバーに導入した。サンプルは、気泡またはエアーポケットを残すことなくマイクロアレイチャンバーへ均一に流入した。インキュベーションチャンバーを、フローセルデバイスに全く変化を加えず、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラーにおいて５０℃で６０分間加熱した。マイクロアレイスライドをスライドタワーから取り出し、水１５０ｕＬで洗浄した。水がインキュベーションチャンバーに導入されるにつれ、インキュベーションチャンバー内部のハイブリダイゼーション混合物は廃液チャンバーに押し出され、さらにミリポアＣ０４８吸収剤がインキュベーションチャンバーより液状物の全量を吸い出した。次に、マイクロアレイスライドを９５℃で２０分間加熱してインキュベーションチャンバーを完全に乾燥させた。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００（商標）上で、装置に全く手を加えずにマイクロアレイを撮像した。画像は、インキュベーションチャンバーを被覆する親水性テープ越しに撮像した。
【００７１】
図１７Ｂは、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥ステップ後の例示的マイクロアレイの画像を示す。生成物スポットは暗い黒色の点として示される。対照スポットはＣｙ３スポットおよびハイブリダイゼーションマーカーを含む。各アレイは４つのサブアレイの反復であるので、４セットのＹｐ生成物スポットである。図８Ｂに示すように、全てのサブアレイにおいて均一なハイブリダイゼーションが達成された。
【実施例４】
【００７２】
（親水性インキュベーションチャンバーおよび廃液チャンバーを含むマイクロアレイシステム）
図１８Ａは、親水性チャンバー１０および廃液チャンバー６０を有するマイクロアレイシステムの他の実施形態を示す。２つのチャンバーは、入口セクション１５、漏斗状接続セクション１６、大直径出口セクション１７１および小直径出口セクション１７２を有する導管１２によって接続される。液状サンプルは、入口ポート１１および導管１４を経てインキュベーションチャンバー１０に加えられる。
【００７３】
図１８Ａに示すマイクロアレイシステムは、両面テープ（グレースバイオラド）よりレーザーカットされたガスケットを用いてガラススライド上に構築された。廃液チャンバー６０は濾紙吸収剤（ＣＦ４、ミリポア）を含み、かつ大気中にベントされた。生成するマイクロアレイアセンブリはレクサンＨＰＦＡＦ（０．００７”／１７５μｍ）曇り止めテープ（ＧＥプラスチックス）で被覆された。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓｅ由来の増幅生成物、ハイブリダイゼーションマーカー（ポジティブコントロール）、ＢＳＡおよびハイブリダイゼーションバッファーを含むサンプル２０μＬを９５℃で５分間変性させ、さらにレイニンＰ２００ｕＬピペッターを用いて入口ポート１１よりインキュベーションチャンバー１０に導入した。入口ポート１１をテープで密封し、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラー内において、スライド全体を５５℃で３０分間インキュベートさせた。スライドをタワーから取り出し、室温で水１５０ｕＬにより洗浄した。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００（商標）マイクロアレイリーダーによりアレイを撮像した（露出時間２秒）。図１８Ｂはハイブリダイゼーションの結果を示す。図１８Ｃはアレイスポットの配置を示すチップマップである。図１８Ｂに示すように、ハイブリダイゼーションコントロールおよびＳｔｒｅｓｔｏｃｏｃｃｕｓ特異性プローブより強い陽性結果が得られた。
【実施例５】
【００７４】
（ワンステッププロテインマイクロアレイシステム）
図５および図１８Ａに示す実施形態のものなどのワンステップ一体型プロテインマイクロアレイシステムは、捕捉抗体を含有するゲルドロップエレメントを用いて構築される。捕捉抗体は、生物兵器（ＢＷＡ）パネルに対して特異的に結合する抗体である。各ゲルスポットは特定のＢＷＡと結合する抗体を含む。金コロイド標識した二次抗体のセットを入口導管近傍の位置に留置する。二次抗体は同じパネルのＢＷＡを認識する。液状サンプルを入口導管よりインキュベーションチャンバーに装填するとき、金コロイド標識二次抗体はサンプルがインキュベーションチャンバーに入るにつれてサンプルと混合される。インキュベーション中、目的のＢＷＡがアレイゲルスポット内の抗体によって捕捉され、さらに二次抗体が捕捉されたＢＷＡと結合する。インキュベーション時間の後、非結合二次抗体が洗い流される。二次抗体はゲルスポット上に捕捉されたＢＷＡと結合し、マイクロアレイにおいて陽性シグナルを生成する。
【００７５】
本明細書で用いるところの用語「抗体」は、考えられる最も広い意味で用いられ、かつ抗体、組換え抗体、遺伝子操作抗体、キメラ抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、二機能性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ヘテロ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、脱免疫抗体、抗イディオタイプ抗体、および／または抗体フラグメントを含んでもよいが、これに限定されない。また用語「抗体」はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭなどの抗体の種類、および／またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１および／またはＩｇＡ２などのサブタイプを含んでもよいが、これに限定されない。用語「抗体」は、たとえば抗原結合可変領域などの、未修飾抗体の少なくとも一部分といった抗体フラグメントを含んでもよいが、これに限定されない。抗体フラグメントの例はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、二機能性抗体、線形抗体、短鎖抗体分子、多重特異性抗体、および／またはその他の抗体の抗原結合配列を含む。さらなる情報は、その全文が本明細書に参照文献として援用されている米国特許第５，６４１，８７０号、米国特許第４，８１６，５６７号、国際公開番号第ＷＯ９３／１１１６１号、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ他、二価抗体：小型二価および二重特異性抗体フラグメント、ＰＮＡＳ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）、Ｚａｐａｔａ他、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける効率的な生成および抗増殖性活性の亢進を目的とした線形Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの操作、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に認められうる。
【実施例６】
【００７６】
（マルチステッププロテインマイクロアレイシステム）
抗体を含有するゲルドロップエレメントを用いてマルチステップ一体型プロテインマイクロアレイシステムを構築した。アレイのチップマップを図１９に示す（上左の図）。ゲルドロップがプリントされたガラススライドを、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにより室温で１時間ブロッキングした。スライドをＤＩ水ですすぎ、粉塵のない環境で風乾させた。次に、ブロッキングしたガラススライド、レーザーカットしたアドケム製２５６Ｍテープ、親水性レクサンフィルム、およびドームバルブを用いてマイクロアレイシステムを組み立てた。図１９は、実験で用いられたマイクロアレイスライドの図を示す。ＳＥＢ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および１％ＢＳＡ添加１ｕｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液）約２０μＬをドームバルブよりマイクロアレイシステムにピペッティングし、室温で６０分間インキュベートした。ＤＩ水２０μＬをピペッティングして（×２）マイクロアレイシステムをすすぎ、その後ピペッターを用いて風乾した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）３０μＬをマイクロアレイシステムにピペッティングした後、ピペッターを用いて風乾させた。１％ＢＳＡを含む抗ＳＥＢモノクローナル抗体ＰＢＳＴ希釈液２０μＬをマイクロアレイシステムにピペッティングし、室温で３０分間インキュベートした。ＤＩ水２０μＬ（×２）をマイクロアレイシステムにピペッティングし、その後ピペッターを用いて風乾した。ＰＢＳＴ３０μＬをマイクロアレイシステムにピペッティングし、その後ピペッターを用いて風乾した。１％ＢＳＡを含む２μｇ／ｍＬアレクサ５６８標識抗マウス抗体ＰＢＳＴ溶液２０μＬをマイクロアレイシステムにピペッティングし、室温で３０分間インキュベートした。マイクロアレイシステムは遮光した。ＤＩ水２０μＬ（×２）をマイクロアレイシステムにピペッティングした。１００％エタノールをマイクロアレイシステムのインキュベーションチャンバーにピペッティングし、さらに残留エタノールを吸収剤で吸い上げた。次にマイクロアレイシステムを５５℃で１０分間加熱した。オーロラフォトニクスポートアレイ５０００において、６０５ｎｍフィルターによる緑色レーザー（５３２ｎｍ）を用いてマイクロアレイシステムを撮像した。プロテインアレイの代表的な画像を図１９に示す（下右の図）。
【００７７】
この実施形態においては、インキュベーションチャンバーを廃液チャンバーと接続する導管中に気泡が残り、インキュベーションチャンバー内の液状物を廃液から離隔して早すぎる吸い上げを防止した。
【実施例７】
【００７８】
（ＰＣＲマイクロアレイシステム）
アコーニサンプル調製デバイスまたは顧客が好むサンプル調製キット（例：キアゲン試薬）において、１ｍＬまでのスワブ、鼻咽頭吸引液または全血サンプルから全核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を分離する。アコーニのサンプル調整法についての一般化された作業の順番は、溶解バッファー中のサンプルの変性；サンプル調製装置上への溶解サンプルの持続的な注入；洗浄；および最終容積約１００μＬでの核酸の溶離を含む。溶離されたサンプルを、図８〜１２に示す寸法を有するマイクロアレイシステム内に装填する。非標識「順」プライマーよりも１０倍過量の蛍光標識「逆」プライマーを含む非対称ＰＣＲマスターミックス中で、標的の増幅および標識化を行う。この戦略により、その５’末端に単一の標識を有する一重らせん標的が主として生成される。オンチップ増幅後、アンプリコンをマイクロアレイシステムアセンブリ内において５０〜６５℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、マイクロアレイシステムを水で灌流する（全ての廃液はマイクロアレイシステム内に保持される）。
【００７９】
図８はマイクロアレイシステムアセンブリの入口孔の実施形態を示す。スペーサーテープの入口孔の範囲は２．０〜４．０ｍｍであるのに対し、カバーフィルムの穴の直径は０．８〜１．２ｍｍの範囲である。直径の違いは、毛細管作用を介して試薬がチャンバー内に引き込まれることを可能とする。これらの直径が同一であれば、スペーサーテープの疎水性壁が、引き込む毛細管作用にとって好ましくない条件をサンプルにおいて作り出す。さらに、入口導管の導管幅は反応チャンバーに近づくにつれて増加する。この増加は、液状物がチャンバーに流入するために鋭い屈曲をする必要なくチャンバーに流入することを可能とするためのものである。鋭い屈曲は、移動する境界の接触線が、液状物の廃液チャンバーへの流入を遮断するよう働く不連続性を有することを必要とする。液状物が反応チャンバーより流出することを防止するために、導管の接続に直角の角を用いる。
【００８０】
反応チャンバーの角を丸めて、粘性流動が表面駆動流の大半を占める高流量における充填を適合させる。この条件の際は角にエアポケットができやすい。さらに、反応が完了しかつ反応チャンバーが洗浄される場合、洗浄バッファーは反応チャンバーに吸い出される。陥凹した境界は、典型的には縁に沿ってチャンバー内に残留液状物を残し、縁は徐々に使い尽くされる。したがって、丸めた角によりチャンバーから液状物が完全に除去される時間が短縮される。
【００８１】
接続導管は「階段」オーバーフローセクションおよび「スイッチバック」セクションの２セクションからなる。「階段」セクションは、４５〜１３５°の範囲の角を作成するための、２．０ｍｍから始まって０．６ｍｍまで減少する導管寸法の変化がある。より具体的には、これらの角は９０°である。スイッチバック部分はやはり９０°の屈曲を伴う導管幅の一連の減少を有する。ここでも、これらの屈曲によって液状物の移動にとって好ましくない条件が作り出される。液状物が廃液チャンバーに近づくにつれて、直径の減少がより高い毛細管圧を作り出す。液状物が廃液チャンバーに接近するにつれて上昇する毛細管張力は、流路内にある気泡の効果を最小化する。接続導管の出口における気泡の曲率半径が、液状物の陥凹接触線と同じであれば、液状物は移動しない。しかし、気泡の曲率半径が液状物の陥凹接触線よりも小さければ、液状物は廃液チャンバーに流入し続けるであろう。したがって、小さな０．３ｍｍ導管が廃液チャンバーと接続する。０．２ｍｍまたはそれ以下の導管は、縁の周囲の液状物が蓄積し一体となる条件を作り出す。液状物が導管の両側から一体化する場合、液状物は移動しかつ反応チャンバーを空にし始めるであろう。廃液チャンバーの吸収剤が接続導管と直接流体連通であるよう、吸収剤は接触導管に対して押しつけられる。
【００８２】
入口ポートは厚さ０．７５ｍｍかつ内径０．９〜１．１ｍｍかつ外径６．３５ｍｍである。この直径は、チップがアレイ基板にふれかつ流動を妨げることなくＰ２０およびＰ１００ピペットチップに適合する。シリコン接着剤を有するホイルサークルまたはタブが入口ポートと結合する。シリコンは、マイクロアレイシステムの乾燥に用いられるアセトンなどの溶媒と適合する。ホイルにはピペットチップを刺入することができる。ホイルサークルまたはタブは、反応チャンバーがサンプルおよびＰＣＲマスターミックスで充填された後で貼付される。増幅後、反応チャンバーの洗浄を可能とするためにホイルに穴を開ける。吸収剤は、洗浄ステップ後に液状物がマイクロアレイシステムアセンブリから漏出するのを防ぐ。廃液チャンバーの遠位側にあるベント孔は、液状物がさらなるステップを必要とすることなく導入されることを可能とするために開いたままとする。ベント孔の半分は廃液チャンバーに露出しかつもう半分はガスケットによって被覆される。ホイルサークルは、剥離ライナーから剥がして入口ポートに貼付する半抜きロール上にあることが可能であり、あるいはタブの部分に剥離ライナーを付けたままホイルタブをマイクロアレイシステムアセンブリ上に配置することができる。ホイルタブは、剥離ライナーが取り除かれるときタブが入口ポートを被覆するように、製造時にマイクロアレイシステムアセンブリ上の位置に貼付する。
【実施例８】
【００８３】
（ガラス基板を有するＰＣＲマイクロアレイシステム上でのＭＲＳＡ標的の検出および乾燥インキュベーションチャンバーの撮像）
この実験の目的は、マイクロアレイシステムアセンブリにおいて多重反応を実施することである。エリーサイエンティフィック製の相似被覆を有するガラススライド（２５×７５×１ｍｍ）をアレイ基板として用いる。Ｒｕｂｉｎａら（Ｒｕｂｉｎａ他、２００３，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３４：１００８−１０２２，およびＲｕｂｉｎａ他、２００４．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２５：９２−１０６、その全文を本明細書に参照文献として援用）が報告するところのシングルステップ、ＵＶ誘導共重合反応における固形基板の代わりに、オリゴヌクレオチドプローブをポリマーバックボーンと共有結合的に架橋する。
【００８４】
メシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌（ＭＲＳＡ）をＡＴＣＣより培養として入手し、かつ協力者よりＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇ）を培養として入手し、アコーニのトゥルーチップ（カタログ番号３００−１０２０６）により精製した。トゥルーチッププロトコルは約４分を要し、以下の各ステップ：結合、洗浄、乾燥、および溶離について電子ピペッターによる５回の吸い上げおよび押出しのサイクルからなる。ＤＮＡの量はナノドロップ３３００蛍光分光光度計（デラウェア州ウィルミントン）で測定する。
【００８５】
図２０は、図７〜１２のマイクロアレイシステムデザインにおけるＭＲＳＡチップ（ｖ４．０）上で実施したＭＲＳＡ核酸の増幅を示す。ｍｅｃＡ、ｔｕｆＡ−３ｂ、ＳＣＣｍｅｃおよびＭ１３のプライマーセットを用いて、ＭＲＳＡ ＤＮＡ ３００ｐｇを多重反応で増幅する。画像はオーロラポートアレイ５０００により撮像する。アレイは図２１Ａおよび２１Ｂに示すチップマップを有した。マイクロアレイシステムアセンブリは、廃液チャンバー内にレーザーカット濾紙吸収剤（ワットマン３１ＥＴ ＣＨＲセルロースクロマトグラフィ紙、０．５ｍｍ）を収容した。組み立て後に親水カバーフィルムの上面（疎水性面）をＩＰＡで洗浄した。マスターミックスの調製は以下の通りであった：ホルムアルデヒド１０％を添加したキアゲンＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼキット（キアゲン、カタログ番号１２０５）を用いて、ＭＲＳＡの４プライマー（ｍｅｃＡ、ｔｕｆＡ−３ｂ、ＳＣＣｍｅｃおよびＭ１３）を含むマスターミックス１４μＬおよびメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸１０μＬを各反応について調製した（１５μＬ反応容積中で合計３００ｐｇのＤＮＡを増幅）。調製した反応混合物１４μＬをマイクロアレイシステムに添加した。サンプル入口ポートを、接着性裏材料を有するホイルテーププルタブで被覆し、廃液チャンバーのベントは開いたままとした。全てのスライドを、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラー上に載置し、増幅パラメータ：８６．５℃で２分間、および８６．５℃で４５秒、５０℃で１分３０秒で３５サイクル、および６５℃で５分間、８５℃で２分間および４０℃で４５分間の最終ステップにしたがって増幅した。増幅後、スライドタワーよりスライドを取り出し、次にサンプル入口ポートを被覆するホイルテープに細孔を開け、１×ＳＳＰＥ ３５μＬによりアレイを単回洗浄で洗浄した。次に、スライドを水２５μＬ、その後１００％アセトン７５μＬで洗浄した。次に、サーモフィッシャー２００１ＦＳＱデジタルコントロールドライバス用に設計されたカスタムヒートブロック上においてスライドを５０℃で１５分間乾燥させ、さらにポートアレイ５０００リーダーにおいて乾燥した状態で読み取る。
【実施例９】
【００８６】
（ガラス基板を有するＰＣＲマイクロアレイシステム上でのＭＲＳＡ標的の検出および液状物内での撮像）
この実験の目的は、マイクロアレイシステムアセンブリ内で単一反応を実施することである。エリーサイエンティフィック製の相似被覆を有するガラススライド（２５×７５×１ｍｍ）をアレイ基板として用いる。Ｒｕｂｉｎａらが報告するところのシングルステップＵＶ誘導共重合反応における固形基板（前掲）の代わりに、オリゴヌクレオチドプローブをポリマーバックボーンに共有結合的に架橋させる。図２２は、図７〜１２のマイクロアレイシステム設計におけるＭＲＳＡチップ（ｖ４．０）上で実施したメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸の増幅を示す。ｍｅｃＡプライマーを用いてＭＲＳＡ ＤＮＡ １ｎｇを単一反応で増幅する。画像はジーンピックス４０００Ｂで撮像する。アレイは図２１Ａおよび２１Ｂに示すチップマップを有した。フローセルは、廃液チャンバー内にレーザーカット濾紙吸収剤（ワットマン３１ＥＴ ＣＨＲセルロースクロマトグラフィ紙、０．５ｍｍ）を収容した。組み立て後に親水カバーフィルムの上面（疎水性面）をＩＰＡで洗浄した。マスターミックス調製は以下の通りである：ホルムアルデヒド１０％を添加したキアゲンＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼキット（キアゲン、カタログ番号２０１２０５、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ１．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）を用いて、ｍｅｃＡプライマーを含むマスターミックス１１．７μＬおよびメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸３．３μＬを、各反応について調製した（１５μＬ反応容積中で合計１ｎｇのＤＮＡを増幅）。調製した反応混合物１４μＬをマイクロアレイシステムに添加した。サンプル入口ポートを、接着性裏材料を有するホイルテーププルタブで被覆し、廃液チャンバーのベントは開いたままとした。全てのスライドを、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラー上に載置し、増幅パラメータ：８６．５℃で２分間、および８６．５℃で４５秒、５０℃で１分３０秒で３５サイクル、および６５℃で５分間、８５℃で２分間および４０℃で４５分間の最終ステップにしたがって増幅した。増幅後、スライドをスライドタワーより取り出し、アレイチャンバー内に残留する液状物と共にジーンピックス４０００Ｂにより撮像する。気泡はアレイの中央部ではなくスペーサーテープの疎水性壁に付着することに留意されたい。
【実施例１０】
【００８７】
（プラスチックスライドを有するＰＣＲマイクロアレイシステム上での乾燥ステップを伴わないＭＲＳＡ標的の検出）
この実験の目的は、アコーニおよびジーンピックス撮像装置上でのプラスチックスライドの評価である。プラスチックスライドは２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍの型で成形された。ゲルエレメントはプラスチック上に直接プリントされさらに実験前にＵＶ架橋された。図２３は、図１０および１４〜１８のマイクロアレイシステム設計におけるＭＲＳＡチップ（ｖ４．０）上で実施したメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸の増幅を示す。ｍｅｃＡおよびｔｕｆＡ−３ｂプライマーを用いて、ＭＲＳＡ ＤＮＡ ３００ｐｇを多重反応で増幅する。画像はアコーニが開発したプロトタイプリーダーにより撮像する。アレイは図２１Ａおよび２１Ｂに示すチップマップを有した。マイクロアレイシステムは、廃液チャンバー内にレーザーカット濾紙吸収剤（ワットマン３１ＥＴ ＣＨＲセルロースクロマトグラフィ紙、０．５ｍｍ）を収容した。組み立て後、親水カバーフィルムの上面（疎水性面）をＩＰＡで洗浄した。マスターミックス標本は以下の通りである：ホルムアルデヒド１０％を添加したキアゲンＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼキット（キアゲン、カタログ番号２０１２０５）を用いて、ｍｅｃＡおよびｔｕｆＡ−３ｂプライマーを含むマスターミックス１４μＬおよびメシチリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）核酸１０μＬを、各反応について調製した（１５μＬ反応容積中で合計３００ｐｇのＤＮＡを増幅）。調製した反応混合物１４μＬをマイクロアレイシステムに添加する。サンプル入口ポートを、接着性裏材料を有するホイルテーププルタブで被覆し、廃液チャンバーのベントは開いたままとした。全てのスライドを、スライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ＤＮＡエンジンサーモサイクラー上に載置し、増幅パラメータ：８６．５℃で２分間、および８６．５℃で４５秒、５０℃で１分３０秒で３５サイクル、および６５℃で５分間、８５℃で２分間および４０℃で４５分間の最終ステップにしたがって増幅した。増幅後、スライドタワーよりスライドを取り出し、次にサンプル入口ポートを被覆するホイルテープに細孔を開け、１×ＳＳＰＥ ３５μＬによりアレイを単回洗浄で洗浄した。次にスライドをアコーニリーダー上で乾燥ステップなしで読み取った。
【実施例１１】
【００８８】
（異なるハイブリダイゼーション条件下での標的ＤＮＡの検出）
（バイオチップアセンブリ）
図７に示すバイオチップアセンブリはマイクロアレイ基板、スペーサーテープ、親水性上面フィルム、吸収剤を有する廃液チャンバー、入口ポートおよびベント孔からなる。マイクロアレイ基板はガラス（エリーサイエンティフィック、ニューハンプシャー州ポーツマス）またはプラスチックである。プラスチックスライドは２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍのサイズで成形される。一旦スペーサーテープが貼付されたならば、バイオチップの反応チャンバーにおいてアレイを位置決めする座標を用いてオリゴヌクレオチドプローブをブランクスライド上にプリントする。プリント方法は、Ｖａｓｉｌｉｓｋｏｖら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９９）およびＲｕｂｉｎａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００３）が報告した方法と同様に、共重合およびスライド上にプリントされＵＶ架橋されたオリゴヌクレオチドプローブ混合物よりなる。ゲルエレメントの直径は１５０μｍであり中心同士の距離は３００μｍである。バイオチップは入口導管用切り欠きを有するレーザーカット両面テープ、反応チャンバー、接続導管および廃液チャンバーより構築される。上面フィルムはアレイチャンバーおよび廃液チャンバーをそれぞれ被覆する。上面フィルムは、反応チャンバー全体を満たすための毛細管作用を可能とするため親水性である。吸収剤（ワットマンクロマトグラフィペーパー）は廃液チャンバー内に位置する。上面フィルムは、入口用の１ｍｍの穴および廃液チャンバーの遠位側の縁に位置するベント用の１ｍｍの穴を有する。フレームシール（バイオラッド、カリ孔ニア州ハーキュリーズ）は対照反応チャンバーの役割を果たす。バイオチップアセンブリおよびフレームシールは使用より少なくとも１時間前に準備する。
【００８９】
（サンプル調製およびハイブリダイゼーション）
実施例８に記載するように、アコーニのトゥルーチップを用いてＭＲＳＡ ＤＮＡを調製した。バイオチップ内ハイブリダイゼーション用：ハイブリダイゼーションマスターミックス１０μＬ（１．５Ｍチオシアン酸グアニジン、７５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび３．７ｆｍｏｌ／ｕＬハイブリダイゼーション対照オリゴヌクレオチドを含有）、および増幅生成物５μＬからなる反応容積１５μＬを調製してバイオチップに加える。サンプル入口ポートを、直径６．３５ｍｍの円形にレーザーカットしたシリコンテープで被覆し、廃液チャンバーベントは開いたままとした。フレームシール内ハイブリダイゼーション用：ハイブリダイゼーションマスターミックス２０μＬおよびＭＲＳＡ増幅生成物１０μＬからなる反応物３０μＬをフレームシールに添加するために調製した。この３０μＬのうち２８μＬをフレームシールに加え、パラフィルムで被覆した。全てのスライドは、αユニットスライドタワーを接続したＭＪリサーチＰＴＣ−２００ ＤＮＡエンジンサーモサイクラー上に載置し、５５℃で３時間ハイブリダイゼーションした。バイオチップおよびフレームシールマスターミックス溶液は、いずれも以下に記載するハイブリダイゼーションプロトコルの前に試験管内において９５℃で５分間変性した。標的はオンチップで変性できるので、このオフライン変性ステップはオンチップ増幅プロトコルの一部ではない。オンチップＰＣＲは実施例８に記載する方法により実施した。
【００９０】
（洗浄）
（バイオチップス）
ハイブリダイゼーションまたはオンチップ増幅後、アレイを容積範囲３５〜２００μＬの１×ＳＳＰＥで洗浄する。バイオチップをオーロラポートアレイ５０００に適合するように完全に乾燥させる。材料は、熱乾燥ステップの時間を短縮するアセトンに適合することが確認されている。したがって、一部の例では洗浄ステップ後に水２５μＬおよびその後アセトン１５μＬまたは７５μＬのバイオチップへのピペッティングが続く。アセトンがアレイチャンバーから完全に取り除かれたことを確認するために、バイオチップを３分間倒立させて残留アセトンを廃液チャンバー内に排出した。次に、サーモフィッシャー２００１ＦＳＱデジタルコントロールヒーター用に設計されたカスタムヒートブロックにおいて、スライドを５０℃で１５分間乾燥させる。洗浄前にフレームシールガスケットを取り外しかつ露出したアレイを通気して乾燥することを必要とするフレームシールプロトコルとは反対に、チップは取り外されないので、この乾燥手順は「オンチップ乾燥プロトコル」と呼ばれる。
【００９１】
（フレームシール）
フレームシールを取り外し、１×ＳＳＥＰおよび０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むテレケムアレイイット（商標）ブランドのハイスループットウォッシュステーション内でスライドを３分間洗浄し、水ですすぎ、濾過した圧縮空気で乾燥させる。
【００９２】
（検出および分析）
アレイはオーロラポートアレイ５０００リーダー、ジーンピックス４０００Ｂ、または検出のために斜方角レーザー発光法およびＣＣＤカメラを用いるアコーニのインハウスリーダーのいずれかで読み取る。いずれかのリーダーからの非ビニングアウトプット（１２ビット、オフセット＝０，ゲイン＝１）は、ＴＩＦＦ、改訂６．０スタンダードに適応する１６ビットグレイスケールタグ画像ファイルフォーマットで保存する。ゲノム化学研究所（Ｓａｅｅｄ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３）のオープンソースアプリケーション「スポットファインダー」（ウィンドウズ版３．１．１．、「Ｓｐｏｒｔｆｉｎｄｅｒ３．１．１．ｅｘｅ」）を用いて．ｔｉｆ画像を分析する。スポットファインダー内でＯｔｓｕ閾値化アルゴリズム（Ｌｉａｏ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１）による画像のセグメント化を実施し、全スポットについてのバックグラウンド補正積分強度（中央値）を、他の導出統計値、関連品質指標、およびアレイ位置インジケーターと共に、タブ区切りフラットファイル（．ｍｅｖ）フォーマットで保存した。続いて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００３ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｃｋ３を用いて、各プローブについての反復スポットの平均積分強度を、ｄＮ２０ナンセンスオリゴヌクレオチド（非特異的ハイブリダイゼーション事象による生物学的ノイズのモデル）を含むスポットの平均強度と比較するデータ分析を実施する。
【００９３】
（結果）
図２４〜２６は：バイオチップにおけるハイブリダイゼーション、溶液相増幅後にバイオチップ内でハイブリダイゼーション、およびフレームシールフォーマットにおけるハイブリダイゼーションに大別される３つの異なる条件にゲルエレメントオリゴアレイを曝露する実験の結果を比較する。プロトコルは増幅後にガスケットを取り外すよう求めているが、これは汚染のリスクを導入し、かつそのために説得力のある均一性を提供しないので、フレームシールフォーマットにおけるオンチップＰＣＲは示さない。プロトコルは、オンチップ増幅およびバイオチップハイブリダイゼーションのいずれについても、１×ＳＳＰＥ １７５μＬ、水２５μＬ、およびアセトン１５μＬの洗浄バッファー体積で、実験の節に記載された方法により実施する。増幅マスターミックスはハイブリダイゼーションマーカーを含有しないので、図２４、パネルＢのハイブリダイゼーションスポットは蛍光を発しない。
【００９４】
図２５は、各条件について３回実施したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｇｅｎｕｓの信号ナンセンス比を、最小および最大値を示す誤差棒と共に示す。各条件についての出発ゲノムコピー数は約１０４である。このデータより、バイオチップ用のオンチップ増幅が、試験管で増幅してフレームシールに移す場合と同様に、試験管の中で増幅した後バイオチップに移す場合に匹敵する成績を示すことが示唆される。洗浄手順の有効性によって低いシグナルを有するナンセンスプローブで割る手法のため、この試験では誤差棒が大きくなっている。洗浄は標識プライマーまたはナンセンスプローブ由来の生成物を効果的に除去しているので、洗浄手順はナンセンスプローブのシグナル強度を低下させるはずであることに留意されたい。したがって、ナンセンスシグナル（分母）の小さな変化により比率が大きく変化する。図２６に示す３種類の異なる洗浄条件についてナンセンスシグナルを比較する追加的な試験は、この強度の変動性をさらに例示する。３つの条件全てについての変動性にもかかわらず、限られたデータセットより、バイオチップ上での小量ピペット洗浄プロトコルは、バス内での洗浄と同じであるかまたはこれよりすぐれていることが示唆される。このデータより、洗浄プロトコルは信号ナンセンス比を劣化させることなく１００μＬまで低下させることができる。実際に、追加的研究より３５μＬまでの体積低下が可能であることが示唆される。これらの低い体積により、チップ上で全ての試薬を含有しながら、洗浄ステップをラボオンチップフォーマットで実施し、さらにこれにより汚染リスクはなくならないまでも低下させることが可能となった。
【００９５】
本明細書において用いられる用語および記載は例示的な方法によってのみ説明され、制限を意味してはいない。当業者は、以下の請求項に定義されるところの本発明の趣旨および範囲内において、特に指示がない限り全ての用語がその最も広い意味で理解される多くの変法、およびその同等物が可能であることを理解するであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子を検出することを目的としたフローセルデバイスであって：
入口；
出口；
マイクロアレイ；および
反応チャンバーの上面または底面の少なくとも一方にある親水性領域を含む前記反応チャンバー；
液状物が毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動することを可能とする吸収剤を有する廃液チャンバー；
入口ポート；
前記反応チャンバーを前記入口ポートと接続する第１の導管；および
前記反応チャンバーを前記廃液チャンバーと接続する第２の導管を含む前記フローセルデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記反応チャンバーが反応中に気泡を捕捉するために疎水性側壁を含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項３】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記第２の導管が流動停止装置として働く疎水性内面を伴うセクションを含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項４】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記親水性領域が前記反応チャンバーの前記出口の近傍に作成されることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項５】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記親水性領域が親水性ゲルエレメントによって作成されることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項６】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記反応チャンバー内の内容物を前記マイクロアレイシステムから放出させることなく洗浄が発生することを可能とするために、前記入口ポートが刺入可能な膜またはテープまたはドームバルブを含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項７】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記洗浄ステップの前に液状物が前記廃液チャンバー中に移動するのを防ぐために前記接続導管が一連の導管幅の急激な変化および／または鋭い角を含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項８】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記反応チャンバーおよび前記廃液チャンバーが：
その上にマイクロアレイが形成される基板；
反応チャンバースペーサー；および
前記反応チャンバーを被覆する親水性カバーを含む層状構造内に形成されることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項９】
請求項８に記載のマイクロアレイシステムであって、前記層状構造が：
反応チャンバースペーサー；および
廃液チャンバーカバーをさらに含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１０】
請求項８に記載のマイクロアレイシステムであって、前記基板がガラスであることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１１】
請求項８に記載のマイクロアレイシステムであって、前記基板がプラスチックであることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１２】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記反応チャンバーおよび前記廃液チャンバーが成型によってプラスチック基板内に形成されることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１３】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記入口ポートまたは前記反応チャンバーがサンプル精製マトリクスを含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマイクロアレイシステムであって、前記精製マトリクスがシリカであることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１５】
標的分子を検出することを目的としたデバイスであって：
入口；
出口；
前記標的分子と特異的に結合する標的捕捉面；および
反応チャンバーの上面または底面の少なくとも一方にある親水性領域を含む前記反応チャンバー；
液状物が毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動することを可能とする吸収剤を有する廃液チャンバー；および
前記反応チャンバーを前記廃液チャンバーと接続する可変幅導管を含む前記デバイス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のデバイスであって、前記標的捕捉面がマイクロアレイを含むことを特徴とする前記デバイス。
【請求項１７】
請求項１５に記載のデバイスであって、前記導管が、第１のセクションが第２のセクションの直径または断面積よりも大きな直径または断面積を有することを特徴とする、前記反応チャンバーに近接する末端にある前記第１のセクションおよび前記廃液チャンバーに近接する末端にある前記第２のセクションの２つのセクションを含むことを特徴とする前記デバイス。
【請求項１８】
請求項１７に記載のデバイスであって、前記第２のセクションが２つのサブセクション：第１のサブセクションが第２のサブセクションとある角度を形成しかつ前記第２のサブセクションの直径よりも大きな直径を有することを特徴とする、前記第１のセクションと隣接する前記第１のサブセクションおよび前記廃液チャンバーと隣接する前記第２のサブセクションをさらに含むことを特徴とする前記デバイス。
【請求項１９】
請求項１５に記載のデバイスであって、前記廃液チャンバーがベントを含むことを特徴とする前記デバイス。
【請求項２０】
請求項１５に記載のデバイスであって、前記反応チャンバーの前記底面に標的捕捉面が形成されかつ前記反応性チャンバーの前記上面に前記親水性領域が形成されることを特徴とする前記デバイス。
【請求項２１】
標的分子を検出することを目的としたフローセルデバイスであって：
入口；
出口；
マイクロアレイ；および
反応チャンバーの上面または底面の少なくとも一方の上にある親水性領域を含む前記反応チャンバー；および
出口導管を含む前記フローセルデバイスであって、前記出口導管が前記反応チャンバーの前記出口と流体連通である前記フローセルデバイス。
【請求項２２】
請求項２１に記載のフローセルデバイスであって、前記出口導管が前記反応チャンバー側でより幅広くかつ前記反応チャンバーから離れて段階的に狭くなるサブセクションを含む階段セクションを含むことを特徴とする前記フローセルデバイス。
【請求項２３】
請求項２２に記載のフローセルデバイスであって、前記反応チャンバーに近接するサブセクションが親水性コーティングによりコーティングされることを特徴とするフローセルデバイス。
【請求項２４】
請求項２１に記載のフローセルデバイスであって、前記出口導管が１つまたはそれ以上の鋭い角を含むスイッチバックセクションを含むことを特徴とする前記フローセルデバイス。
【請求項２５】
請求項２１に記載のフローセルデバイスであって、多様な直径の複数のサブセクションを含む入口導管をさらに含むフローセルデバイス。
【請求項２６】
請求項２５に記載のフローセルデバイスであって、前記入口導管を通じて前記反応チャンバーと流体連通である洗浄バッファーチャンバーをさらに含むフローセルデバイス。
【請求項１】
標的分子を検出することを目的としたフローセルデバイスであって：
入口；
出口；
マイクロアレイ；および
反応チャンバーの上面または底面の少なくとも一方にある親水性領域を含む前記反応チャンバー；
液状物が毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動することを可能とする吸収剤を有する廃液チャンバー；
入口ポート；
前記反応チャンバーを前記入口ポートと接続する第１の導管；および
前記反応チャンバーを前記廃液チャンバーと接続する第２の導管を含む前記フローセルデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記反応チャンバーが反応中に気泡を捕捉するために疎水性側壁を含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項３】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記第２の導管が流動停止装置として働く疎水性内面を伴うセクションを含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項４】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記親水性領域が前記反応チャンバーの前記出口の近傍に作成されることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項５】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記親水性領域が親水性ゲルエレメントによって作成されることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項６】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記反応チャンバー内の内容物を前記マイクロアレイシステムから放出させることなく洗浄が発生することを可能とするために、前記入口ポートが刺入可能な膜またはテープまたはドームバルブを含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項７】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記洗浄ステップの前に液状物が前記廃液チャンバー中に移動するのを防ぐために前記接続導管が一連の導管幅の急激な変化および／または鋭い角を含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項８】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記反応チャンバーおよび前記廃液チャンバーが：
その上にマイクロアレイが形成される基板；
反応チャンバースペーサー；および
前記反応チャンバーを被覆する親水性カバーを含む層状構造内に形成されることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項９】
請求項８に記載のマイクロアレイシステムであって、前記層状構造が：
反応チャンバースペーサー；および
廃液チャンバーカバーをさらに含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１０】
請求項８に記載のマイクロアレイシステムであって、前記基板がガラスであることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１１】
請求項８に記載のマイクロアレイシステムであって、前記基板がプラスチックであることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１２】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記反応チャンバーおよび前記廃液チャンバーが成型によってプラスチック基板内に形成されることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１３】
請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記入口ポートまたは前記反応チャンバーがサンプル精製マトリクスを含むことを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマイクロアレイシステムであって、前記精製マトリクスがシリカであることを特徴とする前記マイクロアレイシステム。
【請求項１５】
標的分子を検出することを目的としたデバイスであって：
入口；
出口；
前記標的分子と特異的に結合する標的捕捉面；および
反応チャンバーの上面または底面の少なくとも一方にある親水性領域を含む前記反応チャンバー；
液状物が毛細管作用によって反応チャンバー内を洗浄のために移動することを可能とする吸収剤を有する廃液チャンバー；および
前記反応チャンバーを前記廃液チャンバーと接続する可変幅導管を含む前記デバイス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のデバイスであって、前記標的捕捉面がマイクロアレイを含むことを特徴とする前記デバイス。
【請求項１７】
請求項１５に記載のデバイスであって、前記導管が、第１のセクションが第２のセクションの直径または断面積よりも大きな直径または断面積を有することを特徴とする、前記反応チャンバーに近接する末端にある前記第１のセクションおよび前記廃液チャンバーに近接する末端にある前記第２のセクションの２つのセクションを含むことを特徴とする前記デバイス。
【請求項１８】
請求項１７に記載のデバイスであって、前記第２のセクションが２つのサブセクション：第１のサブセクションが第２のサブセクションとある角度を形成しかつ前記第２のサブセクションの直径よりも大きな直径を有することを特徴とする、前記第１のセクションと隣接する前記第１のサブセクションおよび前記廃液チャンバーと隣接する前記第２のサブセクションをさらに含むことを特徴とする前記デバイス。
【請求項１９】
請求項１５に記載のデバイスであって、前記廃液チャンバーがベントを含むことを特徴とする前記デバイス。
【請求項２０】
請求項１５に記載のデバイスであって、前記反応チャンバーの前記底面に標的捕捉面が形成されかつ前記反応性チャンバーの前記上面に前記親水性領域が形成されることを特徴とする前記デバイス。
【請求項２１】
標的分子を検出することを目的としたフローセルデバイスであって：
入口；
出口；
マイクロアレイ；および
反応チャンバーの上面または底面の少なくとも一方の上にある親水性領域を含む前記反応チャンバー；および
出口導管を含む前記フローセルデバイスであって、前記出口導管が前記反応チャンバーの前記出口と流体連通である前記フローセルデバイス。
【請求項２２】
請求項２１に記載のフローセルデバイスであって、前記出口導管が前記反応チャンバー側でより幅広くかつ前記反応チャンバーから離れて段階的に狭くなるサブセクションを含む階段セクションを含むことを特徴とする前記フローセルデバイス。
【請求項２３】
請求項２２に記載のフローセルデバイスであって、前記反応チャンバーに近接するサブセクションが親水性コーティングによりコーティングされることを特徴とするフローセルデバイス。
【請求項２４】
請求項２１に記載のフローセルデバイスであって、前記出口導管が１つまたはそれ以上の鋭い角を含むスイッチバックセクションを含むことを特徴とする前記フローセルデバイス。
【請求項２５】
請求項２１に記載のフローセルデバイスであって、多様な直径の複数のサブセクションを含む入口導管をさらに含むフローセルデバイス。
【請求項２６】
請求項２５に記載のフローセルデバイスであって、前記入口導管を通じて前記反応チャンバーと流体連通である洗浄バッファーチャンバーをさらに含むフローセルデバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図６】
【図７】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９】
【図２０】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図６】
【図７】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９】
【図２０】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２０１３−５００４６６（Ｐ２０１３−５００４６６Ａ）
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２１６１８（Ｐ２０１２−５２１６１８）
【出願日】平成２２年７月２１日（２０１０．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２０４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１１０６２
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ウィンドウズ
【出願人】（５１００４８３６９）アコーニ バイオシステムズ (8)
【氏名又は名称原語表記】ＡＫＯＮＮＩ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２１日（２０１０．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２０４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１１０６２
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ウィンドウズ
【出願人】（５１００４８３６９）アコーニ バイオシステムズ (8)
【氏名又は名称原語表記】ＡＫＯＮＮＩ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ
【Ｆターム（参考）】
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