プラチナ製剤を用いた化学療法治療に対する臨床応答を予測する方法
患者からの生物学的試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定する工程を含んでなり、メチル化の存在が化学療法治療への応答として患者のより長い生存を示す、シスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法治療に対するＮＳＣＬＣに罹患した患者の生存を予測するための方法。１４‐３‐３シグマ遺伝子のメチル化状態は血清試料において容易に決定される。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、診断の分野、特に遺伝子１４‐３‐３シグマのメチル化パターンに基づき、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）患者の生存を予測するための方法に関する。また、本発明はＮＳＣＬＣ患者の治療向け化学療法剤の使用にも関する。
【０００２】
背景技術
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は全肺癌の約８０％を占め、世界中において毎年新たに１２０万人の症例が報告されている。ＮＳＣＬＣは２００１年に世界中において百万人以上の死を招き、男性および女性双方における癌に関連した死亡の主な原因である（各々３１％および２５％）。進行性のＮＳＣＬＣの予後は惨憺たるものである。患者１１５５例に対する最近の米国東海岸癌臨床試験グループ(Eastern Cooperative Oncology Group)の試験は、用いた化学療法、すなわちシスプラチン／パクリタキセル、シスプラチン／ゲムシタビン、シスプラチン／ドセタキセル、カルボプラチン／パクリタキセルの間に差異を示さなかった。無増悪期間(time to progression)全体の中央値は３．６月間、中間生存(median survival)は７．９月間、３３％の１年生存率、および１１％の２年生存率であった。患者１２１８例における更に最近のランダム研究においては、ステージIIIＢ‐IV患者において１１月間の中間生存が報告されている。しかしながら、臨床パラメーターにおいては進行疾患の患者間において、生存に決定的な差異を完全に表わすことができず、ある者は何年も生存するが、他の者はわずか数月間である。
【０００３】
ＮＳＣＬＣ患者の全体５年生存は、過去２０年間にわたり１５％未満のままであった。ＴＮＭサブセットのステージ分類（Ｔ＝一次腫瘍、Ｎ＝局所リンパ節、Ｍ＝遠隔転移）による、類似した予後および治療オプションを有する患者群に区別できる。５年生存は病理ステージIIＢ（Ｔ１‐２Ｎ１Ｍ０、Ｔ３Ｎ０Ｍ０）において約２５％、ステージIIIＡ（Ｔ３Ｎ１Ｍ０、Ｔ１‐２‐３Ｎ２Ｍ０）において１３％、およびステージIIIＢ（Ｔ４Ｎ０‐１‐２Ｍ０）においては最低値の７％である。
【０００４】
現在、シスプラチン（ＤＤＰ）およびカルボプラチンが最も広く用いられている細胞傷害性抗癌剤の一つである。しかしながら、デノボまたは誘導されたメカニズムによるこれら薬物への耐性が、それらの治癒の可能性を減衰させている。これらの薬物は鎖内付加物の形成によりＤＮＡ構造を破壊する。ＤＤＰのようなプラチナ製剤(platinum agents)に対する耐性は、プラチナ付加物(platinum adducts)に対する寛容性の増加、薬物蓄積の減少、またはＤＮＡ修復の増加に起因していた。
【０００５】
１４‐３‐３σは、ヒト細胞においてＤＮＡ損傷に応答してＧ２細胞周期のチェックポイント制御に関与する１４‐３‐３スーパーファミリーの一員である。その機能はヒト結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６（１４‐３‐３σおよび野生型ｐ５３を発現する）において分析された。イオン化照射(ionizing irradiation)後、１４‐３‐３σ隔離Ｃｄｃ２／サイクリンＢ１は、細胞質において複合化し、こうしてＧ２において細胞を停止させ、損傷ＤＮＡの修復前にそれらが有糸分裂を始めないようにさせる。アドリアマイシンにより治療された１４‐３‐３σを欠く結腸癌腫細胞はＧ２停止を維持しないが、なおそれを始めさせることができ、有糸分裂破壊と細胞死とを招いてしまう。１４‐３‐３σの発現は、ｐ５３遺伝子不活化と、ＣｐＧアイランドのメチル化による１４‐３‐３σ遺伝子の抑制(silencing)とにより減少する。
【０００６】
プロテオーム解析(proteomic analysis)によると、１４‐３‐３σは乳癌試料において検出できず、１４‐３‐３σのプロモーター領域における正常非メチル化ＣｐＧアイランドの高メチル化が乳癌における転写レベルにおいて遺伝子抑制に関与していた（Ferguson AT,Evron E,Umbricht CB,et al.,High frequency of hypermethylation at the 14-3-3 sigma locus leads to gene silencing in breast cancer,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97:6049-54）。１４‐３‐３σ高メチル化の類似効果が、肺、胃、卵巣、前立腺、および肝細胞癌腫を含めた多くの腫瘍において報告された。
【０００７】
二本鎖ＤＮＡ断片は癌患者の血清中においてかなりの量が頻繁に現れ、転移患者の血清においてはそれよりも有意に高いレベルでみられることが知られている。頭および首、小細胞肺および非小細胞肺癌においては、腫瘍において検出される同様のマイクロサテライト変化が血漿または血清ＤＮＡにおいてもみられた（Sanchez-Cespedes M,Monzo M,Rosell R,et al.,Detection of chromosome 3p alterations in serum DNA of non-small-cell lung cancer patients,Ann.Oncol.,1998,9:113-6、Sozzi G,Musso K,Ratcliffe C,Goldstraw P,Pierotti MA,Pastorino U.,Detection of microsatellite alterations in plasma DNA of non-small cell lung cancer patients:a prospect for early diagnosis.Clin.Cancer Res.,1999,5:2689-92）。更に、腫瘍サプレッサー遺伝子のプロモーター領域における高メチル化の検出が、非小細胞肺癌患者の血清において初めて報告された。高メチル化は感受性メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイにより分析でき、それによると１０００の非メチル化対立遺伝子において一つのメチル化対立遺伝子を特定することができる（Herman JG,Graff JR,Myohanen S,Nelkin BD,Baylin SB.,Methylation-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93:9821-6）。
【０００８】
１４‐３‐３σは、胃癌６０例中４３％においてメチル化されていることがわかり、１４‐３‐３σメチル化陽性ヒト胃細胞系ＭＫＮ７４（野生型ｐ５３）およびＭＫＮ２８（変異ｐ５３）は双方ともアドリアマイシンに高度に感受性であったが、１４‐３‐３σメチル化陰性細胞系（野生型または変異ｐ５３）は耐性であった。
【０００９】
前記のように、ＮＳＣＬＣにおいては伝統的化学療法によって大きな全体的効果は達成できないが、化学的感受性とひいては生存性が個別に事前判定されることは明らかである。それでも、ＤＮＡ修復経路に関与しているとして特定された遺伝子異常のリスト増大と、ＮＳＣＬＣ患者の化学的感受性変化にもかかわらず、翻訳アッセイが個別化された化学療法向けになお開発されていなかった。
【００１０】
このように低い生存率と予測不能な化学的感受性とを有する、特にＮＳＣＬＣに罹患した患者において、最善の治療様式の選択に際して有益な臨床手段となりうる、化学療法に対する応答の予測法を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、差異的な(differential)生存性および化学的感受性を予測して、ＮＳＣＬＣに対する化学療法を個別選択する際において、有用な手段を提供する。
【００１２】
薬物耐性は、多様な生化学経路の活性化／抑制を伴う複雑で多因子性の事象である。我々はシスプラチン耐性および薬物応答を研究するためにプロテオームの手法を用いた。細胞周期のチェックポイントにおける欠陥が化学的感受性に寄与するという仮定から出発して、１４‐３‐３σメチル化陽性腫瘍の患者がシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた(cisplatin-or carboplatin-based)化学療法から、より大きな利益を得れるか否かについて我々は研究した。
【００１３】
意外にも、１４‐３‐３σが非小細胞肺癌患者の１／３の血清においてメチル化され、メチル化が全体的にこれら患者において有意に良好な中間生存(median survival)と関連していることを、我々は見出した。更に、１４‐３‐３σメチル化は応答者において生存に一層大きな影響を有していた。１４‐３‐３σメチル化陰性応答者における死亡リスクは、メチル化陽性応答者の場合よりほぼ５倍であった。
【００１４】
一つの態様において、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患した患者のシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法後の生存を予測するためのインビトロにおける方法であって、
ａ）患者の体液、血清、または組織試料から核酸を単離し、
ｂ）試料において、１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を確認し、
ｃ）その結果に従い、メチル化陽性またはメチル化陰性として規定される２群に前記患者を分類し、各群について生存に関する予後が明確にされること
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【００１５】
他の態様において、本発明はシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法治療に対するＮＳＣＬＣに罹患した患者の生存を予測するための方法であって、前記患者からの生物学的試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定する工程を含んでなり、メチル化の存在が化学療法治療への応答として患者のより長い生存を示すものであることを特徴とする方法に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣに罹患した対象のためにシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた個別的な化学療法治療を計画するための方法であって、
ｉ）患者からの生物学的試料により１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定し、
ii）個別的化学療法治療を計画する際に予備工程により得られたデータを考察すること
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明は、キットが、非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有した第一容器と、１４‐３‐３遺伝子のＣｐＧ含有核酸の増幅用のプライマーを含有した第二容器とを含んでなり、前記プライマーが修飾されたメチル化と非メチル化核酸とを識別するものである、ＮＳＣＬＣ患者の化学療法治療に対する生存を予測するためのキットおよびその使用にも関する。
【００１８】
特に重要なこととして、本発明の一つの態様によれば、１４‐３‐３σのメチル化が非小細胞肺癌患者の治療前体液において検出され、腫瘍組織においてはその必要性がなく、シスプラチンを用いた化学療法に適した患者を選択して、プラチナ製剤を用いた(platinum-based)ダブレットでの治療後における生存を予測する新規で正確な方法が提供される。好ましくは、体液は血清である。
【００１９】
従って、他の態様において、本発明は、試料が血清試料であることにより特徴づけられる、哺乳動物からの試料における１４‐３‐３シグマ遺伝子のメチル化状態の判定に関する。
【発明の具体的説明】
【００２０】
シスプラチンは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において、なおも組合せ化学療法の骨格を形成している。パートナー薬物がパクリタキセル、ドセタキセル、またはゲムシタビンであった場合でも、結果は類似したものとなる傾向がある。類似した結果は通常カルボプラチンにおいて得られるが、ランダム研究においては、中間生存がパクリタキセル／カルボプラチンにおいて８．２月間およびパクリタキセル／シスプラチンアームにおいて９．８月間であった。
【００２１】
多くの細胞毒性薬物が、発癌物質に起因するものと類似したＤＮＡ損傷を誘導する。発癌物質または細胞毒性薬物の共有結合が、“付加物(adduct)”と称される、ＤＮＡにおいて化学的に変化した塩基の形成をもたらす。シスプラチンは、シス立体配置において二つの不安定なクロロと二つの安定なアミンリガンドをもつ、硬質構造を有している。一部のアルキル化剤のように、中性薬物分子は反応形態へ変換させる必要がある。これは溶液中において非酵素的に生じ、置換反応が水分子との不安定クロロリガンドの段階的交換を行わせる。荷電アクア化種(aquated species)は高度に反応性であるが、クロロ‐モノアクオ(chloro-monoaquo)種が生理的ｐＨにおいてＤＮＡとの相互作用の観点から最も重要である。より安定な二座シクロブタンジカルボン酸リガンドであるカルボプラチンの場合は、アクア化反応がかなり遅い。これは薬物効力を減少させ、そのため同等の抗腫瘍効果のために多くの用量を要する。シスプラチンのモノアクア化種が形成されると、それはＤＮＡ塩基（優先的に、グアニンのＮ７）と直ちに反応して一官能性付加物を形成する。次いで一付加物においてプラチナと結合された残留塩素リガンドが加水分解され、得られたアクア化種が第二求核部位と相互作用してＤＮＡ架橋を形成する。１，２‐および１，３‐双方の鎖内ＤＮＡ架橋が形成される。反対グアニン塩基間の１，２‐鎖間架橋は両鎖の５′Ｇ‐Ｃ３′配列において優先的に形成される。しかしながら、鎖内付加物がシスプラチンの細胞毒性作用において最も大きな要因となっていることを、膨大な証拠により示されている。
【００２２】
シスプラチンは注射用の無菌溶液として通常処方され、静脈内に約５０〜１００ｍｇ／ｍ２の用量により定期的に投与される。この周期は約４〜８週間毎に繰り返してもよい。
【００２３】
シスプラチンおよびカルボプラチンはＮＳＣＬＣ患者において広く用いられているが、デノボまたは誘導されたメカニズムによるこれら薬物への耐性がそれらの治癒の可能性を減衰させている。一般的に、癌化学療法耐性の遺伝子メカニズムを理解することは難しい。過去３０年間にわたり、腫瘍内科医は癌患者の転帰を最良にすることに専念してきたが、現在では利用しうる新たな技術により、異なる群の癌患者において所定療法の効果を予測して化学療法を個別選択するために、多型性、遺伝子発現レベル、および遺伝子変異を研究できるようになっている。
【００２４】
非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）の患者において生存率を更に改善するのに際して、分子変化に基づくそれらの予後分類はきわめて重要である。このような分類は、より正確で有用な診断手段と、最終的にはより有用な治療法の選択肢をもたらすことになる。
【００２５】
発癌に関与する最も重要な変化の一つは、異常なプロモーターのメチル化である。この分野における関心は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）アッセイの実施により増してきた。シトシンが５位においてメチル化された場合に、ＤＮＡのメチル化が生じるが、これはＣｐＧジヌクレオチドにおいて直後に塩基グアニンがある場合のみ現れる。この修飾は、主にそれがＣｐＧに富む領域（ＣｐＧアイランド）を伴う場合に、遺伝子発現において重要な調節効果を有する。遺伝子のプロモーター領域においてメチル化されたシトシンは、その不活化につながる。
【００２６】
一つの態様において、本発明は、１４‐３‐３シグマ遺伝子の核酸のメチル化状態、特にプロモーター配列のメチル化状態に基づいて、シスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法後におけるＮＳＣＬＣ患者の生存を予測するための新規で正確な方法を提供する。一つの態様において、１４‐３‐３シグマＤＮＡ配列のエキソン１においてＣｐＧアイランドのメチル化パターンを調べることにより、メチル化状態が決定される。
【００２７】
１４‐３‐３タンパク質は、細胞タンパク質の広域配列の機能を制御する高度に保存されたホスホセリン／ホスホトレオニン結合分子のファミリーである。シグナル伝達、アポトーシス、細胞周期進行、およびＤＮＡ複製を含めた様々な生体調節工程において、それらは重要な役割を果たしている。哺乳動物細胞においては、七つの１４‐３‐３イソ型（ベータ、ガンマ、イプシロン、エータ、シグマ、シータ、およびゼータ）が確認されており、これらの各々が別々の組織局在性とイソ型特異的機能とを有しているようである。１４‐３‐３σ発現は上皮細胞に限定されている。以前の研究においては、１４‐３‐３タンパク質レベルが正常組織と比較してヒト肺癌においてより高いことを示していた。
【００２８】
全１４‐３‐３遺伝子中において、１４‐３‐３σが癌と最も直接的に関連していた（Hermeking H.,The 14-3-3 cancer connection,Nature Rev.Cancer,2003,3:931-43）。それは、細胞周期の進行を阻止し、幹細胞分画を残して細胞を分化させることにより、腫瘍サプレッサーとして機能すると考えられている。１４‐３‐３σの不活化は多くのレベルにおいて生じ、高頻度の１４‐３‐３σ不活化はそれが腫瘍形成において極めて重要な役割を有することを示している。
【００２９】
意外にも、１４‐３‐３シグマ遺伝子の高メチル化（ひいては抑制）を呈するＮＳＣＬＣ患者の方がシスプラチンまたはカルボプラチン化学療法に感受性であり、有意に良好な生存を示すことを、我々は見出した。生存におけるこの差異は、化学療法に応答する患者においてより多く顕示される。
【００３０】
本発明の方法は、その異なる態様において、ここで詳細に記載される。最初に、ＮＳＣＬＣに罹患した患者の試料組織または体液が採取される。本方法は患者からの組織または体液のいかなる種類にも適用しうる。
【００３１】
一つの態様では、腫瘍組織を検査することが好ましい。好ましくは、これは化学療法前に行われる。腫瘍またはその一部は患者から外科的に切除されるか、または定期的なバイオプシーにより得られる。試料の保存および取り扱いを簡素化するために、これらはホルマリン固定およびパラフィン包埋させてもよい。
【００３２】
しかしながら、臨床的な観点からは、ステージIV ＮＳＣＬＣ患者において気管支鏡検査により得られる腫瘍組織の不足により、組織試料の獲得が制限されている。初期段階において、ときどき我々はＲＮＡ抽出用の腫瘍組織を供する切除腫瘍試料から恩恵を受けていた。しかし、更に良い代替法は、試料として体液、特に血清を用いることである。
【００３３】
遺伝子分析においては、癌患者の血漿または血清中における無細胞循環ＤＮＡが対応腫瘍において記載されたものと類似した遺伝子変化を有していることを示した。ある研究においては、膠芽腫(glioblastoma)患者試料の腫瘍および血清中において一部遺伝子のメチル化間における高い相関とＮＳＣＬＣ患者試料における良い相関とがみられた（Ramirez,JL,Taron,M,et al.,Serum DNA as a tool for cancer patient management,Rocz.Akad.Med.Bialymst.,2003,48:34-41）。
【００３４】
したがって、本発明の他の態様において、試料は血液、血漿、または血清から選択されるＮＳＣＬＣ患者の体液であることが好ましい。更に好ましくは、それは血清である。血清は患者から容易かつ直ちに得られ、血液試料を採取して細胞を遠心により分離すれば十分である。
【００３５】
核酸、好ましくはＤＮＡは、当業者に知られている手順により試料から抽出され、QIAGENのQIAmp Blood Miniキットのようなものが市販されている。
【００３６】
核酸が単離されると、本発明の方法においては、対象から単離され、そして遺伝子１４‐３‐３シグマをコードする核酸のうち１以上のメチル化の状態を決定する。
【００３７】
ここで用いられている語句である“核酸”または“核酸配列”とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらの断片、一本鎖または二本鎖においてセンスまたはアンチセンス鎖を表わすゲノムまたは合成源のＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいは起源が天然または合成のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質に関する。当業者であれば理解されるように、核酸がＲＮＡである場合、デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴはリボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵにより各々置き換えられる。
【００３８】
ＷＯ０２／２７０１９号、米国特許第６，０１７，７０４号、米国特許第６，３３１，３９３号、および米国特許第５，７８６，１４６号において記載されている、核酸のメチル化状態を決定するいかなる方法も用いられ、それら各々は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。核酸のメチル化状態を決定することには、メチル化と非メチル化核酸とを識別するオリゴヌクレオチドプライマーにより核酸を増幅させることを含んでいる。このような方法の一つが実施例において詳細に記載されている。
【００３９】
好ましくは、メチル化ＣｐＧ含有核酸を検出するための方法においては、非メチル化シトシンを修飾する試薬と核酸含有試料とを接触させ、ＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより試料中のＣｐＧ含有核酸を増幅させ（前記オリゴヌクレオチドプライマーは修飾されたメチル化と非メチル化核酸とを識別する）、メチル化核酸を検出する。増幅工程は任意であり、望ましいが、必須ではない。本方法において、修飾された（例えば、化学的に修飾された）メチル化と非メチル化ＤＮＡとを識別しうるか否かは、ＰＣＲ反応自体に依存する。
【００４０】
ここで用いられている“修飾する”という用語は、非メチル化とメチル化シトシンとを識別する方法を容易にさせる他のヌクレオチドへの非メチル化シトシンの変換を意味する。好ましくは、前記試薬は非メチル化シトシンをウラシルに修飾する。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾するために用いられる試薬は重亜硫酸ナトリウムであるが、しかしながら、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンを同様に修飾する他の試薬も本方法により用いうる。重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）はシトシンの５，６‐二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとはほとんどしない。シトシンは重亜硫酸イオンと反応し、脱アミノ化を受けやすいスルホン酸シトシン反応中間体を形成して、スルホン酸ウラシルを生じる。スルホン酸基はアルカリ条件下において除去でき、ウラシルの形成をもたらす。ウラシルは、Ｔａｑポリメラーゼ、ひいてはＰＣＲにおいてチミンとして認識され（Ｃ→Ｕ→Ｔ）、得られた生成物は５‐メチルシトシンが出発鋳型ＤＮＡにおいて生じる位置のみでシトシンを含有している（ｍＣ→ｍＣ→Ｃ）。
【００４１】
１４‐３‐３シグマ遺伝子のメチル化状態を決定するために用いられるプライマーは、好ましくはプロモーター領域、更に好ましくはエキソン１からのものである。１４‐３‐３σ遺伝子内におけるＣｐＧジヌクレオチド３から９の間の領域は、得られる結果の正確さにより特に好ましい。
【００４２】
メチル化状態は定性的または定量的に決定される。蛍光を用いた定量的ＰＣＲ（Taqmanプローブのような蛍光プライマーを用いる）のような周知の方法が用いられる。更なる詳細は米国特許第６，３３１，３９３号においてみられる。
【００４３】
好ましい態様においては定性的測定が用いられ、それは研究室において実施することが迅速かつ簡単であり、結果が正確である。この態様においては、前記のようにメチル化と非メチル化ＤＮＡとを識別しうるプライマーがＰＣＲに用いられ、次いで、得られたＤＮＡが精製され、例えばアガロースゲル電気泳動による分離によりそのメチル化状態が決定される。ＵＶ光下において簡単な目視検査（事前の染色を要する）により、バンドがメチル化レーンに存在していればメチル化、またはバンドが非メチル化レーンのみに存在していれば非メチル化として試料を分類できる。合成によるメチル化および非メチル化ＤＮＡがコントロールとして用いられる。
【００４４】
試料からメチル化状態が得られると、例において示された結果のとおりに生存が予測しうる。メチル化状態の患者は、シスプラチンまたはカルボプラチン化学療法により治療されると、無増悪期間および生存に改善を有するようになる。生存期間範囲は、メチル化患者の場合に平均で少なくとも３０％長いと予測できる。
【００４５】
化学療法後、患者が“応答者”群に属するか否かが明らかとなると、予測は更に改善されうる。そうであれば、４月後における生存の機会は、メチル化陰性応答者よりメチル化陽性応答者において少なくとも５倍高いと予測でき、生存期間範囲は一般的に１４‐３‐３シグマメチル化患者の場合に平均で少なくとも５０％長いと予測できる。
【００４６】
ここで用いられている“臨床応答”とは、化学療法剤においての治療に対する腫瘍の応答である。治療に対する応答を決定する基準は広く受け入れられており、効力別治療の比較を行える。完全応答（または完全緩解）は全ての検出可能な悪性疾患の消失である。部分応答は、病巣１以上の最大垂直径の積で約５０％縮小、新病巣なし、および病巣の進行なしである。応答者とは、シスプラチンまたはカルボプラチン化学療法に完全または部分応答を示す患者である。
【００４７】
本発明の他の態様によると、対象においてＮＳＣＬＣの化学療法治療に対して生存を予測するためのキットが提供される。本発明キットは、非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有した第一容器と、１４‐３‐３遺伝子のＣｐＧ含有核酸の増幅用のプライマーを含有した第二容器とを含み、前記プライマーは修飾されたメチル化と非メチル化核酸とを識別するものである。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾する試薬は重亜硫酸塩である。
【００４８】
本発明がこのように記載されてきたが、本発明の実施は以下に示された実験例において説明される。これらの例が特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４９】
進行非小細胞肺癌患者の血清において１４‐３‐３σメチル化を調べて、メチル化状態を生存と相関させる、多施設の前向き(multicenter prospective)研究が実施された。本研究は全部で６ヶ所の参加センターの独立倫理委員会において承認され、全患者が署名済みのインフォームド・コンセントを提出した。
【００５０】
患者
患者がステージIVまたはステージIIIＢ（悪性胸膜滲出がある）の組織学的に確認された非小細胞肺癌を有していれば、彼らは本研究に対して適格とみなされた。適格性に関する他の基準には、０（無症候性で十分に活動的）または１（症候性、十分に歩行可能、身体的に激しい活動の制限）の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）一般状態、少なくとも１８歳の年齢、適度な血液学的機能（少なくとも９ｇ／ｄＬ〔５．６ｍｍｏｌ／Ｌ〕のヘモグロビン、少なくとも１５００／ｍｍ３の好中球数、および少なくとも１００，０００／ｍｍ３の血小板数）、適度な腎臓機能（正常上限値の１．５倍未満の血清クレアチニン）、および適度な肝臓機能（正常上限値の１．５倍以下のビリルビン、正常上限値の５倍以下のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ）を含めた。臨床的に明らかな脳転移のある患者および以前に化学療法を受けた者は排除した。２（症候性、歩行可能、セルフケア可能、歩行時間の５０％以上はベッド外において過ごす）のＥＣＯＧ一般状態の患者も排除されたが、これらの患者は高率で重篤な有害事象と短い生存性を有していた以前の研究の結果に基づいたためである。
【００５１】
患者は、１日目に７５ｍｇ／ｍ２体表面積の用量によりシスプラチン＋１および８日目に１２５０ｍｇ／ｍ２の用量によりゲムシタビンを摂取した。サイクルは最大６サイクルで３週毎に繰り返した。
【００５２】
研究前に、全患者が臨床検査、二次元胸部Ｘ線と胸郭および腹部のコンピューター断層撮影を含む段階的手順を受けた。骨走査または脳のコンピューター断層撮影走査は骨または脳転移が疑われる患者のみにおいて必要とされた。化学療法剤の各投与前に、患者は定期的な生化学精密検査および血球計数からなる臨床検査を受けた。
【００５３】
段階的手順を繰り返すことにより、３回目および６回目治療サイクル後、臨床調査員により客観的応答が評価された。完全応答は全既知病変部位の消失として定義された、部分応答は測定可能病巣の最大垂直径の積の合計で約５０％以上の縮小、新病巣なし、および病巣の進行無しとして定義された、安定性疾患は測定可能病巣の最大垂直径の積の合計で５０％未満の縮小または２５％未満の増大および新病巣なしとして定義された、進行性疾患は測定可能病巣１以上の大きさにより２５％以上の増大または新病巣として定義された。応答の評価のために、完全または部分応答を得た患者は“応答者”とみなし、他の全患者は“非応答者”とみなした。無増悪期間は登録日から進行日までとして計算した。生存は登録日から死亡または最終臨床追跡日までとして計算した。
【００５４】
１４‐３‐３σのメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応分析
末梢血１０ｍＬを凝血アクチベーター管(clot activator tubes)に採取し、血清を遠心により細胞から分離させた。試料を１４‐３‐３σメチル化分析のために我々の研究所（Catalan Institute of Oncology,Barcelona,Spain）へ送った。QIAmp DNA Mini血液キット（Qiagen,Valencia,ＣＡ,ＵＳＡ）を用いて血清８００μＬからＤＮＡを抽出し、５０μＬの最終容量により再懸濁した。外科切除非小細胞肺癌患者２８例の独立群からの腫瘍および血清ＤＮＡ対をコントロールとして用いた。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（Palm,Oberlensheim,Germany）により得られたパラフィン包埋切除腫瘍組織から腫瘍ゲノムＤＮＡも得た。単離された腫瘍ＤＮＡをプロテイナーゼＫとインキュベートし、ＤＮＡをフェノール‐クロロホルムにより抽出し、エタノール沈降させた。精製された血清または腫瘍ＤＮＡを水酸化ナトリウムにより変性させ、メチル化ではなく非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸ナトリウムにより修飾した。
【００５５】
１４‐３‐３σ遺伝子内におけるＣｐＧジヌクレオチド３から９の間の領域にまたがるメチル化または修飾非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーによりメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を行った（図１）。次いで、ＤＮＡ試料をWizard ＤＮＡ精製樹脂（Promega,Madison,ＷＩ,ＵＳＡ）により精製し、再び水酸化ナトリウムにより処理し、エタノールによって沈降させ、水に再懸濁した。メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー〔５′‐ＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＴＣＧ‐３′（センス）および５′‐ＣＣＴＣＴＡＡＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧ‐３′（アンチセンス）〕および非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー〔５′‐ＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＴＧＴＧ‐３′（センス）および５′‐ＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡ‐３′（アンチセンス）〕により１０９ｂｐポリメラーゼ連鎖反応産物を得た。ポリメラーゼ連鎖反応条件は次の通りであった：９５℃において１２分間の１サイクル、９５℃において３０秒間、５８℃（非メチル化反応）または６４℃（メチル化反応）において３０秒間、７２℃において３０秒間の４５サイクル、および７２℃において７分間の１サイクル。
【００５６】
ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs,Beverly,ＭＡ,ＵＳＡ）によりインビトロ処理された胎盤ＤＮＡを１４‐３‐３σのメチル化対立遺伝子に関する陽性コントロールとして用い、正常リンパ球からのＤＮＡを陰性コントロールとして用いた。各５０μＬメチル化特異的増幅産物のうち１０μＬを非変性２％アガロースゲルに直接担持させ、臭化エチジウムにより染色し、紫外線照射下において検査した。試料は、メチル化対立遺伝子が存在し、メチル化ＤＮＡレーンでバンドとして目視された場合（図２）にはメチル化陽性として、一方バンドが非メチル化ＤＮＡレーンのみにおいてみられた場合（図２）にはメチル化陰性と判断した。
【００５７】
統計的分析
登録日からの生存が主なエンドポイントであった。０．０５を両側の有意水準と仮定して、９０％の検出力の下でメチル化陽性群において１年目の生存において１５％増を検出するように、患者１２１例の初期サンプルサイズを計算した（Parmar MKB,Machin D.,Sample sizes for survival studies,In Parmar MKB,Machin D,eds.,Survival analysis,A practical approach,Chichester,ＵＫ:John Wiley & Sons,1996:196-207）。分析は全１１５例の患者において行われた。１４‐３‐３σメチル化状態の生存期間をKaplan-Meier法により見積り、両側ログランク検定と比較した。１４‐３‐３σメチル化状態の基準特徴と応答とは、カテゴリー変数に関して両側Fisher正確確率検定またはカイ二乗検定により、および年齢に関してはスチューデントｔ検定により比較した。年齢の正規性はKolmogorov-Smirnov検定により証明した。応答と他の変数との間の相関は両側Fisher正確確率検定により判断した。メチル化状態に関する粗および調整したオッズ比を得るために、単変量および多変量ロジスティック回帰モデルを当てはめた。適合の良さを判断するために、Hosmer-Lemeshow尤度検定を用いた。各ポテンシャル予後因子と生存と無増悪期間との関係を判断するために、単変量Cox回帰分析を用いた。単変量解析において比較的有意（Ｐ＜０．１）であるとわかった因子は、生存により異なる変数の独立した有意性を評価するために、段階的手順（フォワードおよびバックワード双方）において多変量Cox比例ハザード回帰モデルに含めた。適合の良さを判断するために尤度比検定を用い、係数有意性を判断するためにWald検定を用いた。相対リスクと９５％信頼区間とは、事象に至る期間の全有意予測因子に関するCoxモデルから計算した。事象に至る期間の見積りは、関連９５％信頼区間において、累積罹患法に従い行った。応答と生存との関連を評価するために、ランドマーク分析を４月間のランドマーク期間で用いた。１４‐３‐３σメチル化状態を一般状態で調整して、応答で層別化されたCox回帰モデルを用いて多変量解析を行った。全回帰分析について、Coxモデルの前提条件を試し、満たした。統計的な有意差は０．０５に設定した。計算にＳＰＳＳ１１．０およびプロットにＳ‐ＰＬＵＳ６．１を用いて分析を行った。
【００５８】
結果
全部で１１５例の患者が２００１年８月１日〜２００２年６月３０日にこの研究に登録した。分析の時点でなお生存している患者の観察期間の中央値(median follow-up)は１７月間であった（範囲、１〜３０．７）。年齢の中央値は６２歳（範囲、３１〜８１）、男性，１０８例（９３．９％）、ＥＣＯＧ一般状態０，３２例（２７．８％）、１，８３例（７２．２％）、喫煙者，９９例（８６．１％）、腺癌，５１例（４４．７％）、扁平上皮細胞癌腫，４２例（３６．８％）、大細胞癌腫，２１例（１８．４％）であった。患者２５例（２１．７％）は悪性胸膜滲出を有し、８例（７％）は一次肺腫瘍の事前手術を受けた。どの患者も胸部放射線療法を受けなかった。全１１５例患者の特徴が表１において示される。
【００５９】
メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応分析の代表的結果が表１において示されている。患者３９例は１４‐３‐３σメチル化陽性、７６例は１４‐３‐３σメチル化陰性であった。人口学的および臨床的特徴はこれら二群間において均衡がとれていた（表１）。コントロールとして用いられた外科切除患者２８例中、７例は腫瘍および血清双方でメチル化陽性であり、残り２１例は腫瘍および血清双方でメチル化陰性であった。
【００６０】
【表１】
【００６１】
腫瘍応答
患者１１５例が応答について判断可能であった。患者２例（１．７％）は完全応答に達し、４９例（４２．６％）は部分応答を有し、２７例（２３．５％）は安定性疾患を有し、および３７例（３２．２％）は進行性疾患を有した。単変量回帰モデルでは、ＥＣＯＧ一般状態のみが応答と有意に相関することを示した（粗オッズ比：一般状態０，２．３３（９５％信頼区間，１．０１‐５．３６）、Ｐ＝０．０５）。１４‐３‐３σメチル化陽性状態の粗オッズ比は２．１０（９５％信頼区間、０．９６‐４．５９）（Ｐ＝０．０６）であった。
【００６２】
無増悪期間(Time to progression)
全１１５例患者において無増悪期間の全体は６．９月間（９５％信頼区間，５．３‐８．５）であった。無増悪期間はメチル化陰性群において６．３月間（９５％信頼区間，４．５‐８．２）、およびメチル化陽性群において８．０月間（９５％信頼区間，５．３‐１０．７）であった（両側ログランク検定においてＰ＝０．０２７）。
【００６３】
単変量Cox回帰モデルでは、１４‐３‐３σメチル化状態のみが無増悪期間と有意に相関することを示した（ハザード比：１４‐３‐３σメチル化陰性状態，１．５９〔９５％信頼区間，１．０５‐２．４０〕、Ｐ＝０．０２９）。段階的多変量Cox比例ハザード回帰モデルにおいては、無増悪期間に関する独立予後因子として、１４‐３‐３σメチル化状態のみを確認した。患者６４例（５５．７％）は二次化学療法を受けなかった。二次化学療法を受けた残り５１例患者（４４．３％）のうち、３２例（６２．７％）はメチル化陰性、１９例（３７．３％）はメチル化陽性であった。
【００６４】
生存
全１１５例患者の中間生存は１０．９月間（９５％信頼区間，８．６‐１３．２）であった。中間生存は、メチル化陽性群の１５．１月間（９５％信頼区間，９．７‐２０．６）と比較して、メチル化陰性群において９．８月間（９５％信頼区間，７．３‐１２．５）であった（両側ログランク検定においてＰ＝０．００４）。単変量Cox回帰モデルにおいては、１４‐３‐３σメチル化状態およびＥＣＯＧ一般状態のみが生存と有意に相関することを示した（ハザード比：１４‐３‐３σメチル化陰性状態，２．０７〔９５％信頼区間，１．２４‐３．４５、Ｐ＝０．００６〕、一般状態１，２．４５〔９５％信頼区間，１．３９‐４．３２、Ｐ＝０．００２〕）（表２）。段階的多変量Cox回帰モデルにおいても、生存に関する独立予後マーカーとして、１４‐３‐３σメチル化状態およびＥＣＯＧ一般状態のみを確認した。
【００６５】
腫瘍応答および１４‐３‐３σメチル化状態による生存
全１１５例患者を含めた単変量Cox回帰モデルにおいては、１４‐３‐３σメチル化状態およびＥＣＯＧ一般状態に加えて、応答も生存と有意に相関することを示した（非応答者のハザード比，２．８４〔９５％信頼区間，１．７５‐４．６０、Ｐ＜０．００１〕）（表２）。
【００６６】
【表２】
【００６７】
腫瘍応答およびメチル化状態の生存に及ぼしうる影響を調べるために、更に予備解析を行った。４月間のランドマーク期間前に死亡した患者１６例を除くランドマーク分析から、残り９９例の患者において、応答が生存の改善に関して有意なままであることがわかった（非応答者のハザード比，２．１６〔９５％信頼区間，１．２９‐３．６１〕、Ｐ＝０．０３）。単変量Cox回帰モデルにおいては、１４‐３‐３σメチル化状態、ＥＣＯＧ一般状態および応答のみがこれら９９例患者において生存と有意に相関することを示した（ハザード比：１４‐３‐３σメチル化陰性状態，１．９９〔９５％信頼区間，１．１３‐３．５１、Ｐ＝０．０１７〕、一般状態１，２．１７〔９５％信頼区間，１．１９‐３．９５、Ｐ＝０．０１２〕、非応答者，２．６８〔９５％信頼区間，１．６５‐４．３７、Ｐ＜０．００１〕）。更に、応答、メチル化状態、および一般状態を含み、二次相互作用も考慮した、多変量Cox比例ハザード回帰モデルにおいては、生存に関する独立予後因子として、４月間の選択ランドマークにおいて１４‐３‐３σメチル化状態、ＥＣＯＧ一般状態、および応答を確認した（表３）。
【００６８】
【表３】
【００６９】
患者を応答により層別化し、二つの別々なCox回帰モデルを当てはめ、一般状態により１４‐３‐３σメチル化状態を調整した。死亡リスクの有意差は応答者群のみで観察され、１４‐３‐３σメチル化陰性応答者の死亡リスクはメチル化陽性応答者のほぼ５倍であった（ハザード比：４．８７〔９５％信頼区間，１．８８‐１２．６１〕、CoxモデルにおいてＰ＝０．００１）（表４）。
【００７０】
【表４】
【００７１】
１４‐３‐３σメチル化状態による応答者の生存に関するKaplan-Meier曲線においては、１４‐３‐３σメチル化陽性応答者２２例において中間生存に達しなかったことを示したが、１４‐３‐３σメチル化陰性応答者２９例においては、それが１１．３月間であった（９５％信頼区間，９．０‐１３．５）（両側ログランク検定においてＰ＝０．００１）（図３Ｂ）。１８月目の見積り生存率は、メチル化陽性応答者において６４％（９５％信頼区間，４４〜９４％）およびメチル化陰性応答者において２１％（９５％信頼区間，９〜４７％）（両側ログランク検定においてＰ＝０．０１７）である。メチル化陰性応答者はメチル化陽性応答者より４倍高い死亡リスクを有していた（ハザード比：３．９５〔９５％信頼区間，１．５７‐９．９４〕、CoxモデルにおいてＰ＝０．００４）。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】１４‐３‐３σ遺伝子構造およびエキソン１からのＤＮＡ配列。含まれるＣｐＧ部位が強調されており、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応においてメチル化について試験されるＣｐＧジヌクレオチドがボックスにおいて示されている（フォワードプライマーにおいてＣｐＧジヌクレオチド３および４とリバースプライマーにおいてＣｐＧジヌクレオチド８および９）。
【図２】１４‐３‐３σに関するメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応。製造業者のプロトコールに従い、QIAmp Blood Miniキット（QIAGEN,Valencia,ＣＡ,ＵＳＡ）を用いて、血清から抽出されたＤＮＡによりメチル化が検出された。重亜硫酸ナトリウム修飾が行われ、得られたＤＮＡ５μＬが非メチル化（Ｕ）またはメチル化（Ｍ）１４‐３‐３σに特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応増幅に付された。重亜硫酸修飾ヒト結腸直腸癌細胞系（ＨＴ２９〔American Type Culture Collection,Manassas,ＶＡ,ＵＳＡ〕）（Ｕ）が正常非メチル化コントロールとして用いられ、インビトロＳｓｓＩ重亜硫酸修飾胎盤ＤＮＡ（Ｍ）が陽性メチル化コントロールとして用いられた。無鋳型コントロール（Ｃ−）も汚染コントロールとしてポリメラーゼ連鎖反応に付された。試料は、メチル化対立遺伝子が存在し、メチル化ＤＮＡレーンでバンドとして目視された場合（患者２、４、７、１０）にはメチル化陽性として、一方バンドが非メチル化ＤＮＡレーンのみでみられた場合（患者１、３、５、６、８、９）にはメチル化陰性として判断された。
【図３】Ａは全患者に関する生存のKaplan-Meier確率を示している。メチル化陰性群においては、概算生存率が６月間において５０％（９５％信頼区間、６０〜８１％）、１２月間において３６％（９５％信頼区間、２６〜４９％）、１８月間において２０％（９５％信頼区間、１２〜３２％）である。メチル化陽性群においては、概算生存率が６月間において８７％（９５％信頼区間、７７〜９８％）、１２月間において６２％（９５％信頼区間、４８〜８０％）、１８月間において４１％（９５％信頼区間、２７〜６３％）である。Ｂは応答者に関する生存のKaplan-Meier確率を示している。メチル化陰性群においては、概算生存率が６月間において９３％（９５％信頼区間、８３〜１００％）、１２月間において４４％（９５％信頼区間、２８〜６９％）、１８月間において２１％（９５％信頼区間、９〜４７％）である。メチル化陽性群においては、概算生存率が６月間において９５％（９５％信頼区間、８７〜１００％）、１２月間において８５％（９５％信頼区間、７０〜１００％）、１８月間において６４％（９５％信頼区間、４４〜９４％）である。ＣＩ＝信頼区間
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、診断の分野、特に遺伝子１４‐３‐３シグマのメチル化パターンに基づき、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）患者の生存を予測するための方法に関する。また、本発明はＮＳＣＬＣ患者の治療向け化学療法剤の使用にも関する。
【０００２】
背景技術
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は全肺癌の約８０％を占め、世界中において毎年新たに１２０万人の症例が報告されている。ＮＳＣＬＣは２００１年に世界中において百万人以上の死を招き、男性および女性双方における癌に関連した死亡の主な原因である（各々３１％および２５％）。進行性のＮＳＣＬＣの予後は惨憺たるものである。患者１１５５例に対する最近の米国東海岸癌臨床試験グループ(Eastern Cooperative Oncology Group)の試験は、用いた化学療法、すなわちシスプラチン／パクリタキセル、シスプラチン／ゲムシタビン、シスプラチン／ドセタキセル、カルボプラチン／パクリタキセルの間に差異を示さなかった。無増悪期間(time to progression)全体の中央値は３．６月間、中間生存(median survival)は７．９月間、３３％の１年生存率、および１１％の２年生存率であった。患者１２１８例における更に最近のランダム研究においては、ステージIIIＢ‐IV患者において１１月間の中間生存が報告されている。しかしながら、臨床パラメーターにおいては進行疾患の患者間において、生存に決定的な差異を完全に表わすことができず、ある者は何年も生存するが、他の者はわずか数月間である。
【０００３】
ＮＳＣＬＣ患者の全体５年生存は、過去２０年間にわたり１５％未満のままであった。ＴＮＭサブセットのステージ分類（Ｔ＝一次腫瘍、Ｎ＝局所リンパ節、Ｍ＝遠隔転移）による、類似した予後および治療オプションを有する患者群に区別できる。５年生存は病理ステージIIＢ（Ｔ１‐２Ｎ１Ｍ０、Ｔ３Ｎ０Ｍ０）において約２５％、ステージIIIＡ（Ｔ３Ｎ１Ｍ０、Ｔ１‐２‐３Ｎ２Ｍ０）において１３％、およびステージIIIＢ（Ｔ４Ｎ０‐１‐２Ｍ０）においては最低値の７％である。
【０００４】
現在、シスプラチン（ＤＤＰ）およびカルボプラチンが最も広く用いられている細胞傷害性抗癌剤の一つである。しかしながら、デノボまたは誘導されたメカニズムによるこれら薬物への耐性が、それらの治癒の可能性を減衰させている。これらの薬物は鎖内付加物の形成によりＤＮＡ構造を破壊する。ＤＤＰのようなプラチナ製剤(platinum agents)に対する耐性は、プラチナ付加物(platinum adducts)に対する寛容性の増加、薬物蓄積の減少、またはＤＮＡ修復の増加に起因していた。
【０００５】
１４‐３‐３σは、ヒト細胞においてＤＮＡ損傷に応答してＧ２細胞周期のチェックポイント制御に関与する１４‐３‐３スーパーファミリーの一員である。その機能はヒト結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６（１４‐３‐３σおよび野生型ｐ５３を発現する）において分析された。イオン化照射(ionizing irradiation)後、１４‐３‐３σ隔離Ｃｄｃ２／サイクリンＢ１は、細胞質において複合化し、こうしてＧ２において細胞を停止させ、損傷ＤＮＡの修復前にそれらが有糸分裂を始めないようにさせる。アドリアマイシンにより治療された１４‐３‐３σを欠く結腸癌腫細胞はＧ２停止を維持しないが、なおそれを始めさせることができ、有糸分裂破壊と細胞死とを招いてしまう。１４‐３‐３σの発現は、ｐ５３遺伝子不活化と、ＣｐＧアイランドのメチル化による１４‐３‐３σ遺伝子の抑制(silencing)とにより減少する。
【０００６】
プロテオーム解析(proteomic analysis)によると、１４‐３‐３σは乳癌試料において検出できず、１４‐３‐３σのプロモーター領域における正常非メチル化ＣｐＧアイランドの高メチル化が乳癌における転写レベルにおいて遺伝子抑制に関与していた（Ferguson AT,Evron E,Umbricht CB,et al.,High frequency of hypermethylation at the 14-3-3 sigma locus leads to gene silencing in breast cancer,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97:6049-54）。１４‐３‐３σ高メチル化の類似効果が、肺、胃、卵巣、前立腺、および肝細胞癌腫を含めた多くの腫瘍において報告された。
【０００７】
二本鎖ＤＮＡ断片は癌患者の血清中においてかなりの量が頻繁に現れ、転移患者の血清においてはそれよりも有意に高いレベルでみられることが知られている。頭および首、小細胞肺および非小細胞肺癌においては、腫瘍において検出される同様のマイクロサテライト変化が血漿または血清ＤＮＡにおいてもみられた（Sanchez-Cespedes M,Monzo M,Rosell R,et al.,Detection of chromosome 3p alterations in serum DNA of non-small-cell lung cancer patients,Ann.Oncol.,1998,9:113-6、Sozzi G,Musso K,Ratcliffe C,Goldstraw P,Pierotti MA,Pastorino U.,Detection of microsatellite alterations in plasma DNA of non-small cell lung cancer patients:a prospect for early diagnosis.Clin.Cancer Res.,1999,5:2689-92）。更に、腫瘍サプレッサー遺伝子のプロモーター領域における高メチル化の検出が、非小細胞肺癌患者の血清において初めて報告された。高メチル化は感受性メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイにより分析でき、それによると１０００の非メチル化対立遺伝子において一つのメチル化対立遺伝子を特定することができる（Herman JG,Graff JR,Myohanen S,Nelkin BD,Baylin SB.,Methylation-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93:9821-6）。
【０００８】
１４‐３‐３σは、胃癌６０例中４３％においてメチル化されていることがわかり、１４‐３‐３σメチル化陽性ヒト胃細胞系ＭＫＮ７４（野生型ｐ５３）およびＭＫＮ２８（変異ｐ５３）は双方ともアドリアマイシンに高度に感受性であったが、１４‐３‐３σメチル化陰性細胞系（野生型または変異ｐ５３）は耐性であった。
【０００９】
前記のように、ＮＳＣＬＣにおいては伝統的化学療法によって大きな全体的効果は達成できないが、化学的感受性とひいては生存性が個別に事前判定されることは明らかである。それでも、ＤＮＡ修復経路に関与しているとして特定された遺伝子異常のリスト増大と、ＮＳＣＬＣ患者の化学的感受性変化にもかかわらず、翻訳アッセイが個別化された化学療法向けになお開発されていなかった。
【００１０】
このように低い生存率と予測不能な化学的感受性とを有する、特にＮＳＣＬＣに罹患した患者において、最善の治療様式の選択に際して有益な臨床手段となりうる、化学療法に対する応答の予測法を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、差異的な(differential)生存性および化学的感受性を予測して、ＮＳＣＬＣに対する化学療法を個別選択する際において、有用な手段を提供する。
【００１２】
薬物耐性は、多様な生化学経路の活性化／抑制を伴う複雑で多因子性の事象である。我々はシスプラチン耐性および薬物応答を研究するためにプロテオームの手法を用いた。細胞周期のチェックポイントにおける欠陥が化学的感受性に寄与するという仮定から出発して、１４‐３‐３σメチル化陽性腫瘍の患者がシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた(cisplatin-or carboplatin-based)化学療法から、より大きな利益を得れるか否かについて我々は研究した。
【００１３】
意外にも、１４‐３‐３σが非小細胞肺癌患者の１／３の血清においてメチル化され、メチル化が全体的にこれら患者において有意に良好な中間生存(median survival)と関連していることを、我々は見出した。更に、１４‐３‐３σメチル化は応答者において生存に一層大きな影響を有していた。１４‐３‐３σメチル化陰性応答者における死亡リスクは、メチル化陽性応答者の場合よりほぼ５倍であった。
【００１４】
一つの態様において、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患した患者のシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法後の生存を予測するためのインビトロにおける方法であって、
ａ）患者の体液、血清、または組織試料から核酸を単離し、
ｂ）試料において、１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を確認し、
ｃ）その結果に従い、メチル化陽性またはメチル化陰性として規定される２群に前記患者を分類し、各群について生存に関する予後が明確にされること
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【００１５】
他の態様において、本発明はシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法治療に対するＮＳＣＬＣに罹患した患者の生存を予測するための方法であって、前記患者からの生物学的試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定する工程を含んでなり、メチル化の存在が化学療法治療への応答として患者のより長い生存を示すものであることを特徴とする方法に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣに罹患した対象のためにシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた個別的な化学療法治療を計画するための方法であって、
ｉ）患者からの生物学的試料により１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定し、
ii）個別的化学療法治療を計画する際に予備工程により得られたデータを考察すること
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明は、キットが、非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有した第一容器と、１４‐３‐３遺伝子のＣｐＧ含有核酸の増幅用のプライマーを含有した第二容器とを含んでなり、前記プライマーが修飾されたメチル化と非メチル化核酸とを識別するものである、ＮＳＣＬＣ患者の化学療法治療に対する生存を予測するためのキットおよびその使用にも関する。
【００１８】
特に重要なこととして、本発明の一つの態様によれば、１４‐３‐３σのメチル化が非小細胞肺癌患者の治療前体液において検出され、腫瘍組織においてはその必要性がなく、シスプラチンを用いた化学療法に適した患者を選択して、プラチナ製剤を用いた(platinum-based)ダブレットでの治療後における生存を予測する新規で正確な方法が提供される。好ましくは、体液は血清である。
【００１９】
従って、他の態様において、本発明は、試料が血清試料であることにより特徴づけられる、哺乳動物からの試料における１４‐３‐３シグマ遺伝子のメチル化状態の判定に関する。
【発明の具体的説明】
【００２０】
シスプラチンは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において、なおも組合せ化学療法の骨格を形成している。パートナー薬物がパクリタキセル、ドセタキセル、またはゲムシタビンであった場合でも、結果は類似したものとなる傾向がある。類似した結果は通常カルボプラチンにおいて得られるが、ランダム研究においては、中間生存がパクリタキセル／カルボプラチンにおいて８．２月間およびパクリタキセル／シスプラチンアームにおいて９．８月間であった。
【００２１】
多くの細胞毒性薬物が、発癌物質に起因するものと類似したＤＮＡ損傷を誘導する。発癌物質または細胞毒性薬物の共有結合が、“付加物(adduct)”と称される、ＤＮＡにおいて化学的に変化した塩基の形成をもたらす。シスプラチンは、シス立体配置において二つの不安定なクロロと二つの安定なアミンリガンドをもつ、硬質構造を有している。一部のアルキル化剤のように、中性薬物分子は反応形態へ変換させる必要がある。これは溶液中において非酵素的に生じ、置換反応が水分子との不安定クロロリガンドの段階的交換を行わせる。荷電アクア化種(aquated species)は高度に反応性であるが、クロロ‐モノアクオ(chloro-monoaquo)種が生理的ｐＨにおいてＤＮＡとの相互作用の観点から最も重要である。より安定な二座シクロブタンジカルボン酸リガンドであるカルボプラチンの場合は、アクア化反応がかなり遅い。これは薬物効力を減少させ、そのため同等の抗腫瘍効果のために多くの用量を要する。シスプラチンのモノアクア化種が形成されると、それはＤＮＡ塩基（優先的に、グアニンのＮ７）と直ちに反応して一官能性付加物を形成する。次いで一付加物においてプラチナと結合された残留塩素リガンドが加水分解され、得られたアクア化種が第二求核部位と相互作用してＤＮＡ架橋を形成する。１，２‐および１，３‐双方の鎖内ＤＮＡ架橋が形成される。反対グアニン塩基間の１，２‐鎖間架橋は両鎖の５′Ｇ‐Ｃ３′配列において優先的に形成される。しかしながら、鎖内付加物がシスプラチンの細胞毒性作用において最も大きな要因となっていることを、膨大な証拠により示されている。
【００２２】
シスプラチンは注射用の無菌溶液として通常処方され、静脈内に約５０〜１００ｍｇ／ｍ２の用量により定期的に投与される。この周期は約４〜８週間毎に繰り返してもよい。
【００２３】
シスプラチンおよびカルボプラチンはＮＳＣＬＣ患者において広く用いられているが、デノボまたは誘導されたメカニズムによるこれら薬物への耐性がそれらの治癒の可能性を減衰させている。一般的に、癌化学療法耐性の遺伝子メカニズムを理解することは難しい。過去３０年間にわたり、腫瘍内科医は癌患者の転帰を最良にすることに専念してきたが、現在では利用しうる新たな技術により、異なる群の癌患者において所定療法の効果を予測して化学療法を個別選択するために、多型性、遺伝子発現レベル、および遺伝子変異を研究できるようになっている。
【００２４】
非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）の患者において生存率を更に改善するのに際して、分子変化に基づくそれらの予後分類はきわめて重要である。このような分類は、より正確で有用な診断手段と、最終的にはより有用な治療法の選択肢をもたらすことになる。
【００２５】
発癌に関与する最も重要な変化の一つは、異常なプロモーターのメチル化である。この分野における関心は、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）アッセイの実施により増してきた。シトシンが５位においてメチル化された場合に、ＤＮＡのメチル化が生じるが、これはＣｐＧジヌクレオチドにおいて直後に塩基グアニンがある場合のみ現れる。この修飾は、主にそれがＣｐＧに富む領域（ＣｐＧアイランド）を伴う場合に、遺伝子発現において重要な調節効果を有する。遺伝子のプロモーター領域においてメチル化されたシトシンは、その不活化につながる。
【００２６】
一つの態様において、本発明は、１４‐３‐３シグマ遺伝子の核酸のメチル化状態、特にプロモーター配列のメチル化状態に基づいて、シスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法後におけるＮＳＣＬＣ患者の生存を予測するための新規で正確な方法を提供する。一つの態様において、１４‐３‐３シグマＤＮＡ配列のエキソン１においてＣｐＧアイランドのメチル化パターンを調べることにより、メチル化状態が決定される。
【００２７】
１４‐３‐３タンパク質は、細胞タンパク質の広域配列の機能を制御する高度に保存されたホスホセリン／ホスホトレオニン結合分子のファミリーである。シグナル伝達、アポトーシス、細胞周期進行、およびＤＮＡ複製を含めた様々な生体調節工程において、それらは重要な役割を果たしている。哺乳動物細胞においては、七つの１４‐３‐３イソ型（ベータ、ガンマ、イプシロン、エータ、シグマ、シータ、およびゼータ）が確認されており、これらの各々が別々の組織局在性とイソ型特異的機能とを有しているようである。１４‐３‐３σ発現は上皮細胞に限定されている。以前の研究においては、１４‐３‐３タンパク質レベルが正常組織と比較してヒト肺癌においてより高いことを示していた。
【００２８】
全１４‐３‐３遺伝子中において、１４‐３‐３σが癌と最も直接的に関連していた（Hermeking H.,The 14-3-3 cancer connection,Nature Rev.Cancer,2003,3:931-43）。それは、細胞周期の進行を阻止し、幹細胞分画を残して細胞を分化させることにより、腫瘍サプレッサーとして機能すると考えられている。１４‐３‐３σの不活化は多くのレベルにおいて生じ、高頻度の１４‐３‐３σ不活化はそれが腫瘍形成において極めて重要な役割を有することを示している。
【００２９】
意外にも、１４‐３‐３シグマ遺伝子の高メチル化（ひいては抑制）を呈するＮＳＣＬＣ患者の方がシスプラチンまたはカルボプラチン化学療法に感受性であり、有意に良好な生存を示すことを、我々は見出した。生存におけるこの差異は、化学療法に応答する患者においてより多く顕示される。
【００３０】
本発明の方法は、その異なる態様において、ここで詳細に記載される。最初に、ＮＳＣＬＣに罹患した患者の試料組織または体液が採取される。本方法は患者からの組織または体液のいかなる種類にも適用しうる。
【００３１】
一つの態様では、腫瘍組織を検査することが好ましい。好ましくは、これは化学療法前に行われる。腫瘍またはその一部は患者から外科的に切除されるか、または定期的なバイオプシーにより得られる。試料の保存および取り扱いを簡素化するために、これらはホルマリン固定およびパラフィン包埋させてもよい。
【００３２】
しかしながら、臨床的な観点からは、ステージIV ＮＳＣＬＣ患者において気管支鏡検査により得られる腫瘍組織の不足により、組織試料の獲得が制限されている。初期段階において、ときどき我々はＲＮＡ抽出用の腫瘍組織を供する切除腫瘍試料から恩恵を受けていた。しかし、更に良い代替法は、試料として体液、特に血清を用いることである。
【００３３】
遺伝子分析においては、癌患者の血漿または血清中における無細胞循環ＤＮＡが対応腫瘍において記載されたものと類似した遺伝子変化を有していることを示した。ある研究においては、膠芽腫(glioblastoma)患者試料の腫瘍および血清中において一部遺伝子のメチル化間における高い相関とＮＳＣＬＣ患者試料における良い相関とがみられた（Ramirez,JL,Taron,M,et al.,Serum DNA as a tool for cancer patient management,Rocz.Akad.Med.Bialymst.,2003,48:34-41）。
【００３４】
したがって、本発明の他の態様において、試料は血液、血漿、または血清から選択されるＮＳＣＬＣ患者の体液であることが好ましい。更に好ましくは、それは血清である。血清は患者から容易かつ直ちに得られ、血液試料を採取して細胞を遠心により分離すれば十分である。
【００３５】
核酸、好ましくはＤＮＡは、当業者に知られている手順により試料から抽出され、QIAGENのQIAmp Blood Miniキットのようなものが市販されている。
【００３６】
核酸が単離されると、本発明の方法においては、対象から単離され、そして遺伝子１４‐３‐３シグマをコードする核酸のうち１以上のメチル化の状態を決定する。
【００３７】
ここで用いられている語句である“核酸”または“核酸配列”とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはこれらの断片、一本鎖または二本鎖においてセンスまたはアンチセンス鎖を表わすゲノムまたは合成源のＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいは起源が天然または合成のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質に関する。当業者であれば理解されるように、核酸がＲＮＡである場合、デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴはリボヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵにより各々置き換えられる。
【００３８】
ＷＯ０２／２７０１９号、米国特許第６，０１７，７０４号、米国特許第６，３３１，３９３号、および米国特許第５，７８６，１４６号において記載されている、核酸のメチル化状態を決定するいかなる方法も用いられ、それら各々は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。核酸のメチル化状態を決定することには、メチル化と非メチル化核酸とを識別するオリゴヌクレオチドプライマーにより核酸を増幅させることを含んでいる。このような方法の一つが実施例において詳細に記載されている。
【００３９】
好ましくは、メチル化ＣｐＧ含有核酸を検出するための方法においては、非メチル化シトシンを修飾する試薬と核酸含有試料とを接触させ、ＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプライマーにより試料中のＣｐＧ含有核酸を増幅させ（前記オリゴヌクレオチドプライマーは修飾されたメチル化と非メチル化核酸とを識別する）、メチル化核酸を検出する。増幅工程は任意であり、望ましいが、必須ではない。本方法において、修飾された（例えば、化学的に修飾された）メチル化と非メチル化ＤＮＡとを識別しうるか否かは、ＰＣＲ反応自体に依存する。
【００４０】
ここで用いられている“修飾する”という用語は、非メチル化とメチル化シトシンとを識別する方法を容易にさせる他のヌクレオチドへの非メチル化シトシンの変換を意味する。好ましくは、前記試薬は非メチル化シトシンをウラシルに修飾する。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾するために用いられる試薬は重亜硫酸ナトリウムであるが、しかしながら、メチル化シトシンではなく非メチル化シトシンを同様に修飾する他の試薬も本方法により用いうる。重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）はシトシンの５，６‐二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとはほとんどしない。シトシンは重亜硫酸イオンと反応し、脱アミノ化を受けやすいスルホン酸シトシン反応中間体を形成して、スルホン酸ウラシルを生じる。スルホン酸基はアルカリ条件下において除去でき、ウラシルの形成をもたらす。ウラシルは、Ｔａｑポリメラーゼ、ひいてはＰＣＲにおいてチミンとして認識され（Ｃ→Ｕ→Ｔ）、得られた生成物は５‐メチルシトシンが出発鋳型ＤＮＡにおいて生じる位置のみでシトシンを含有している（ｍＣ→ｍＣ→Ｃ）。
【００４１】
１４‐３‐３シグマ遺伝子のメチル化状態を決定するために用いられるプライマーは、好ましくはプロモーター領域、更に好ましくはエキソン１からのものである。１４‐３‐３σ遺伝子内におけるＣｐＧジヌクレオチド３から９の間の領域は、得られる結果の正確さにより特に好ましい。
【００４２】
メチル化状態は定性的または定量的に決定される。蛍光を用いた定量的ＰＣＲ（Taqmanプローブのような蛍光プライマーを用いる）のような周知の方法が用いられる。更なる詳細は米国特許第６，３３１，３９３号においてみられる。
【００４３】
好ましい態様においては定性的測定が用いられ、それは研究室において実施することが迅速かつ簡単であり、結果が正確である。この態様においては、前記のようにメチル化と非メチル化ＤＮＡとを識別しうるプライマーがＰＣＲに用いられ、次いで、得られたＤＮＡが精製され、例えばアガロースゲル電気泳動による分離によりそのメチル化状態が決定される。ＵＶ光下において簡単な目視検査（事前の染色を要する）により、バンドがメチル化レーンに存在していればメチル化、またはバンドが非メチル化レーンのみに存在していれば非メチル化として試料を分類できる。合成によるメチル化および非メチル化ＤＮＡがコントロールとして用いられる。
【００４４】
試料からメチル化状態が得られると、例において示された結果のとおりに生存が予測しうる。メチル化状態の患者は、シスプラチンまたはカルボプラチン化学療法により治療されると、無増悪期間および生存に改善を有するようになる。生存期間範囲は、メチル化患者の場合に平均で少なくとも３０％長いと予測できる。
【００４５】
化学療法後、患者が“応答者”群に属するか否かが明らかとなると、予測は更に改善されうる。そうであれば、４月後における生存の機会は、メチル化陰性応答者よりメチル化陽性応答者において少なくとも５倍高いと予測でき、生存期間範囲は一般的に１４‐３‐３シグマメチル化患者の場合に平均で少なくとも５０％長いと予測できる。
【００４６】
ここで用いられている“臨床応答”とは、化学療法剤においての治療に対する腫瘍の応答である。治療に対する応答を決定する基準は広く受け入れられており、効力別治療の比較を行える。完全応答（または完全緩解）は全ての検出可能な悪性疾患の消失である。部分応答は、病巣１以上の最大垂直径の積で約５０％縮小、新病巣なし、および病巣の進行なしである。応答者とは、シスプラチンまたはカルボプラチン化学療法に完全または部分応答を示す患者である。
【００４７】
本発明の他の態様によると、対象においてＮＳＣＬＣの化学療法治療に対して生存を予測するためのキットが提供される。本発明キットは、非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有した第一容器と、１４‐３‐３遺伝子のＣｐＧ含有核酸の増幅用のプライマーを含有した第二容器とを含み、前記プライマーは修飾されたメチル化と非メチル化核酸とを識別するものである。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾する試薬は重亜硫酸塩である。
【００４８】
本発明がこのように記載されてきたが、本発明の実施は以下に示された実験例において説明される。これらの例が特許請求の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４９】
進行非小細胞肺癌患者の血清において１４‐３‐３σメチル化を調べて、メチル化状態を生存と相関させる、多施設の前向き(multicenter prospective)研究が実施された。本研究は全部で６ヶ所の参加センターの独立倫理委員会において承認され、全患者が署名済みのインフォームド・コンセントを提出した。
【００５０】
患者
患者がステージIVまたはステージIIIＢ（悪性胸膜滲出がある）の組織学的に確認された非小細胞肺癌を有していれば、彼らは本研究に対して適格とみなされた。適格性に関する他の基準には、０（無症候性で十分に活動的）または１（症候性、十分に歩行可能、身体的に激しい活動の制限）の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）一般状態、少なくとも１８歳の年齢、適度な血液学的機能（少なくとも９ｇ／ｄＬ〔５．６ｍｍｏｌ／Ｌ〕のヘモグロビン、少なくとも１５００／ｍｍ３の好中球数、および少なくとも１００，０００／ｍｍ３の血小板数）、適度な腎臓機能（正常上限値の１．５倍未満の血清クレアチニン）、および適度な肝臓機能（正常上限値の１．５倍以下のビリルビン、正常上限値の５倍以下のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ）を含めた。臨床的に明らかな脳転移のある患者および以前に化学療法を受けた者は排除した。２（症候性、歩行可能、セルフケア可能、歩行時間の５０％以上はベッド外において過ごす）のＥＣＯＧ一般状態の患者も排除されたが、これらの患者は高率で重篤な有害事象と短い生存性を有していた以前の研究の結果に基づいたためである。
【００５１】
患者は、１日目に７５ｍｇ／ｍ２体表面積の用量によりシスプラチン＋１および８日目に１２５０ｍｇ／ｍ２の用量によりゲムシタビンを摂取した。サイクルは最大６サイクルで３週毎に繰り返した。
【００５２】
研究前に、全患者が臨床検査、二次元胸部Ｘ線と胸郭および腹部のコンピューター断層撮影を含む段階的手順を受けた。骨走査または脳のコンピューター断層撮影走査は骨または脳転移が疑われる患者のみにおいて必要とされた。化学療法剤の各投与前に、患者は定期的な生化学精密検査および血球計数からなる臨床検査を受けた。
【００５３】
段階的手順を繰り返すことにより、３回目および６回目治療サイクル後、臨床調査員により客観的応答が評価された。完全応答は全既知病変部位の消失として定義された、部分応答は測定可能病巣の最大垂直径の積の合計で約５０％以上の縮小、新病巣なし、および病巣の進行無しとして定義された、安定性疾患は測定可能病巣の最大垂直径の積の合計で５０％未満の縮小または２５％未満の増大および新病巣なしとして定義された、進行性疾患は測定可能病巣１以上の大きさにより２５％以上の増大または新病巣として定義された。応答の評価のために、完全または部分応答を得た患者は“応答者”とみなし、他の全患者は“非応答者”とみなした。無増悪期間は登録日から進行日までとして計算した。生存は登録日から死亡または最終臨床追跡日までとして計算した。
【００５４】
１４‐３‐３σのメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応分析
末梢血１０ｍＬを凝血アクチベーター管(clot activator tubes)に採取し、血清を遠心により細胞から分離させた。試料を１４‐３‐３σメチル化分析のために我々の研究所（Catalan Institute of Oncology,Barcelona,Spain）へ送った。QIAmp DNA Mini血液キット（Qiagen,Valencia,ＣＡ,ＵＳＡ）を用いて血清８００μＬからＤＮＡを抽出し、５０μＬの最終容量により再懸濁した。外科切除非小細胞肺癌患者２８例の独立群からの腫瘍および血清ＤＮＡ対をコントロールとして用いた。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（Palm,Oberlensheim,Germany）により得られたパラフィン包埋切除腫瘍組織から腫瘍ゲノムＤＮＡも得た。単離された腫瘍ＤＮＡをプロテイナーゼＫとインキュベートし、ＤＮＡをフェノール‐クロロホルムにより抽出し、エタノール沈降させた。精製された血清または腫瘍ＤＮＡを水酸化ナトリウムにより変性させ、メチル化ではなく非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸ナトリウムにより修飾した。
【００５５】
１４‐３‐３σ遺伝子内におけるＣｐＧジヌクレオチド３から９の間の領域にまたがるメチル化または修飾非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーによりメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を行った（図１）。次いで、ＤＮＡ試料をWizard ＤＮＡ精製樹脂（Promega,Madison,ＷＩ,ＵＳＡ）により精製し、再び水酸化ナトリウムにより処理し、エタノールによって沈降させ、水に再懸濁した。メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー〔５′‐ＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＴＣＧ‐３′（センス）および５′‐ＣＣＴＣＴＡＡＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧ‐３′（アンチセンス）〕および非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマー〔５′‐ＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＴＧＴＧ‐３′（センス）および５′‐ＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡ‐３′（アンチセンス）〕により１０９ｂｐポリメラーゼ連鎖反応産物を得た。ポリメラーゼ連鎖反応条件は次の通りであった：９５℃において１２分間の１サイクル、９５℃において３０秒間、５８℃（非メチル化反応）または６４℃（メチル化反応）において３０秒間、７２℃において３０秒間の４５サイクル、および７２℃において７分間の１サイクル。
【００５６】
ＳｓｓＩメチルトランスフェラーゼ（New England Biolabs,Beverly,ＭＡ,ＵＳＡ）によりインビトロ処理された胎盤ＤＮＡを１４‐３‐３σのメチル化対立遺伝子に関する陽性コントロールとして用い、正常リンパ球からのＤＮＡを陰性コントロールとして用いた。各５０μＬメチル化特異的増幅産物のうち１０μＬを非変性２％アガロースゲルに直接担持させ、臭化エチジウムにより染色し、紫外線照射下において検査した。試料は、メチル化対立遺伝子が存在し、メチル化ＤＮＡレーンでバンドとして目視された場合（図２）にはメチル化陽性として、一方バンドが非メチル化ＤＮＡレーンのみにおいてみられた場合（図２）にはメチル化陰性と判断した。
【００５７】
統計的分析
登録日からの生存が主なエンドポイントであった。０．０５を両側の有意水準と仮定して、９０％の検出力の下でメチル化陽性群において１年目の生存において１５％増を検出するように、患者１２１例の初期サンプルサイズを計算した（Parmar MKB,Machin D.,Sample sizes for survival studies,In Parmar MKB,Machin D,eds.,Survival analysis,A practical approach,Chichester,ＵＫ:John Wiley & Sons,1996:196-207）。分析は全１１５例の患者において行われた。１４‐３‐３σメチル化状態の生存期間をKaplan-Meier法により見積り、両側ログランク検定と比較した。１４‐３‐３σメチル化状態の基準特徴と応答とは、カテゴリー変数に関して両側Fisher正確確率検定またはカイ二乗検定により、および年齢に関してはスチューデントｔ検定により比較した。年齢の正規性はKolmogorov-Smirnov検定により証明した。応答と他の変数との間の相関は両側Fisher正確確率検定により判断した。メチル化状態に関する粗および調整したオッズ比を得るために、単変量および多変量ロジスティック回帰モデルを当てはめた。適合の良さを判断するために、Hosmer-Lemeshow尤度検定を用いた。各ポテンシャル予後因子と生存と無増悪期間との関係を判断するために、単変量Cox回帰分析を用いた。単変量解析において比較的有意（Ｐ＜０．１）であるとわかった因子は、生存により異なる変数の独立した有意性を評価するために、段階的手順（フォワードおよびバックワード双方）において多変量Cox比例ハザード回帰モデルに含めた。適合の良さを判断するために尤度比検定を用い、係数有意性を判断するためにWald検定を用いた。相対リスクと９５％信頼区間とは、事象に至る期間の全有意予測因子に関するCoxモデルから計算した。事象に至る期間の見積りは、関連９５％信頼区間において、累積罹患法に従い行った。応答と生存との関連を評価するために、ランドマーク分析を４月間のランドマーク期間で用いた。１４‐３‐３σメチル化状態を一般状態で調整して、応答で層別化されたCox回帰モデルを用いて多変量解析を行った。全回帰分析について、Coxモデルの前提条件を試し、満たした。統計的な有意差は０．０５に設定した。計算にＳＰＳＳ１１．０およびプロットにＳ‐ＰＬＵＳ６．１を用いて分析を行った。
【００５８】
結果
全部で１１５例の患者が２００１年８月１日〜２００２年６月３０日にこの研究に登録した。分析の時点でなお生存している患者の観察期間の中央値(median follow-up)は１７月間であった（範囲、１〜３０．７）。年齢の中央値は６２歳（範囲、３１〜８１）、男性，１０８例（９３．９％）、ＥＣＯＧ一般状態０，３２例（２７．８％）、１，８３例（７２．２％）、喫煙者，９９例（８６．１％）、腺癌，５１例（４４．７％）、扁平上皮細胞癌腫，４２例（３６．８％）、大細胞癌腫，２１例（１８．４％）であった。患者２５例（２１．７％）は悪性胸膜滲出を有し、８例（７％）は一次肺腫瘍の事前手術を受けた。どの患者も胸部放射線療法を受けなかった。全１１５例患者の特徴が表１において示される。
【００５９】
メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応分析の代表的結果が表１において示されている。患者３９例は１４‐３‐３σメチル化陽性、７６例は１４‐３‐３σメチル化陰性であった。人口学的および臨床的特徴はこれら二群間において均衡がとれていた（表１）。コントロールとして用いられた外科切除患者２８例中、７例は腫瘍および血清双方でメチル化陽性であり、残り２１例は腫瘍および血清双方でメチル化陰性であった。
【００６０】
【表１】
【００６１】
腫瘍応答
患者１１５例が応答について判断可能であった。患者２例（１．７％）は完全応答に達し、４９例（４２．６％）は部分応答を有し、２７例（２３．５％）は安定性疾患を有し、および３７例（３２．２％）は進行性疾患を有した。単変量回帰モデルでは、ＥＣＯＧ一般状態のみが応答と有意に相関することを示した（粗オッズ比：一般状態０，２．３３（９５％信頼区間，１．０１‐５．３６）、Ｐ＝０．０５）。１４‐３‐３σメチル化陽性状態の粗オッズ比は２．１０（９５％信頼区間、０．９６‐４．５９）（Ｐ＝０．０６）であった。
【００６２】
無増悪期間(Time to progression)
全１１５例患者において無増悪期間の全体は６．９月間（９５％信頼区間，５．３‐８．５）であった。無増悪期間はメチル化陰性群において６．３月間（９５％信頼区間，４．５‐８．２）、およびメチル化陽性群において８．０月間（９５％信頼区間，５．３‐１０．７）であった（両側ログランク検定においてＰ＝０．０２７）。
【００６３】
単変量Cox回帰モデルでは、１４‐３‐３σメチル化状態のみが無増悪期間と有意に相関することを示した（ハザード比：１４‐３‐３σメチル化陰性状態，１．５９〔９５％信頼区間，１．０５‐２．４０〕、Ｐ＝０．０２９）。段階的多変量Cox比例ハザード回帰モデルにおいては、無増悪期間に関する独立予後因子として、１４‐３‐３σメチル化状態のみを確認した。患者６４例（５５．７％）は二次化学療法を受けなかった。二次化学療法を受けた残り５１例患者（４４．３％）のうち、３２例（６２．７％）はメチル化陰性、１９例（３７．３％）はメチル化陽性であった。
【００６４】
生存
全１１５例患者の中間生存は１０．９月間（９５％信頼区間，８．６‐１３．２）であった。中間生存は、メチル化陽性群の１５．１月間（９５％信頼区間，９．７‐２０．６）と比較して、メチル化陰性群において９．８月間（９５％信頼区間，７．３‐１２．５）であった（両側ログランク検定においてＰ＝０．００４）。単変量Cox回帰モデルにおいては、１４‐３‐３σメチル化状態およびＥＣＯＧ一般状態のみが生存と有意に相関することを示した（ハザード比：１４‐３‐３σメチル化陰性状態，２．０７〔９５％信頼区間，１．２４‐３．４５、Ｐ＝０．００６〕、一般状態１，２．４５〔９５％信頼区間，１．３９‐４．３２、Ｐ＝０．００２〕）（表２）。段階的多変量Cox回帰モデルにおいても、生存に関する独立予後マーカーとして、１４‐３‐３σメチル化状態およびＥＣＯＧ一般状態のみを確認した。
【００６５】
腫瘍応答および１４‐３‐３σメチル化状態による生存
全１１５例患者を含めた単変量Cox回帰モデルにおいては、１４‐３‐３σメチル化状態およびＥＣＯＧ一般状態に加えて、応答も生存と有意に相関することを示した（非応答者のハザード比，２．８４〔９５％信頼区間，１．７５‐４．６０、Ｐ＜０．００１〕）（表２）。
【００６６】
【表２】
【００６７】
腫瘍応答およびメチル化状態の生存に及ぼしうる影響を調べるために、更に予備解析を行った。４月間のランドマーク期間前に死亡した患者１６例を除くランドマーク分析から、残り９９例の患者において、応答が生存の改善に関して有意なままであることがわかった（非応答者のハザード比，２．１６〔９５％信頼区間，１．２９‐３．６１〕、Ｐ＝０．０３）。単変量Cox回帰モデルにおいては、１４‐３‐３σメチル化状態、ＥＣＯＧ一般状態および応答のみがこれら９９例患者において生存と有意に相関することを示した（ハザード比：１４‐３‐３σメチル化陰性状態，１．９９〔９５％信頼区間，１．１３‐３．５１、Ｐ＝０．０１７〕、一般状態１，２．１７〔９５％信頼区間，１．１９‐３．９５、Ｐ＝０．０１２〕、非応答者，２．６８〔９５％信頼区間，１．６５‐４．３７、Ｐ＜０．００１〕）。更に、応答、メチル化状態、および一般状態を含み、二次相互作用も考慮した、多変量Cox比例ハザード回帰モデルにおいては、生存に関する独立予後因子として、４月間の選択ランドマークにおいて１４‐３‐３σメチル化状態、ＥＣＯＧ一般状態、および応答を確認した（表３）。
【００６８】
【表３】
【００６９】
患者を応答により層別化し、二つの別々なCox回帰モデルを当てはめ、一般状態により１４‐３‐３σメチル化状態を調整した。死亡リスクの有意差は応答者群のみで観察され、１４‐３‐３σメチル化陰性応答者の死亡リスクはメチル化陽性応答者のほぼ５倍であった（ハザード比：４．８７〔９５％信頼区間，１．８８‐１２．６１〕、CoxモデルにおいてＰ＝０．００１）（表４）。
【００７０】
【表４】
【００７１】
１４‐３‐３σメチル化状態による応答者の生存に関するKaplan-Meier曲線においては、１４‐３‐３σメチル化陽性応答者２２例において中間生存に達しなかったことを示したが、１４‐３‐３σメチル化陰性応答者２９例においては、それが１１．３月間であった（９５％信頼区間，９．０‐１３．５）（両側ログランク検定においてＰ＝０．００１）（図３Ｂ）。１８月目の見積り生存率は、メチル化陽性応答者において６４％（９５％信頼区間，４４〜９４％）およびメチル化陰性応答者において２１％（９５％信頼区間，９〜４７％）（両側ログランク検定においてＰ＝０．０１７）である。メチル化陰性応答者はメチル化陽性応答者より４倍高い死亡リスクを有していた（ハザード比：３．９５〔９５％信頼区間，１．５７‐９．９４〕、CoxモデルにおいてＰ＝０．００４）。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】１４‐３‐３σ遺伝子構造およびエキソン１からのＤＮＡ配列。含まれるＣｐＧ部位が強調されており、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応においてメチル化について試験されるＣｐＧジヌクレオチドがボックスにおいて示されている（フォワードプライマーにおいてＣｐＧジヌクレオチド３および４とリバースプライマーにおいてＣｐＧジヌクレオチド８および９）。
【図２】１４‐３‐３σに関するメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応。製造業者のプロトコールに従い、QIAmp Blood Miniキット（QIAGEN,Valencia,ＣＡ,ＵＳＡ）を用いて、血清から抽出されたＤＮＡによりメチル化が検出された。重亜硫酸ナトリウム修飾が行われ、得られたＤＮＡ５μＬが非メチル化（Ｕ）またはメチル化（Ｍ）１４‐３‐３σに特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応増幅に付された。重亜硫酸修飾ヒト結腸直腸癌細胞系（ＨＴ２９〔American Type Culture Collection,Manassas,ＶＡ,ＵＳＡ〕）（Ｕ）が正常非メチル化コントロールとして用いられ、インビトロＳｓｓＩ重亜硫酸修飾胎盤ＤＮＡ（Ｍ）が陽性メチル化コントロールとして用いられた。無鋳型コントロール（Ｃ−）も汚染コントロールとしてポリメラーゼ連鎖反応に付された。試料は、メチル化対立遺伝子が存在し、メチル化ＤＮＡレーンでバンドとして目視された場合（患者２、４、７、１０）にはメチル化陽性として、一方バンドが非メチル化ＤＮＡレーンのみでみられた場合（患者１、３、５、６、８、９）にはメチル化陰性として判断された。
【図３】Ａは全患者に関する生存のKaplan-Meier確率を示している。メチル化陰性群においては、概算生存率が６月間において５０％（９５％信頼区間、６０〜８１％）、１２月間において３６％（９５％信頼区間、２６〜４９％）、１８月間において２０％（９５％信頼区間、１２〜３２％）である。メチル化陽性群においては、概算生存率が６月間において８７％（９５％信頼区間、７７〜９８％）、１２月間において６２％（９５％信頼区間、４８〜８０％）、１８月間において４１％（９５％信頼区間、２７〜６３％）である。Ｂは応答者に関する生存のKaplan-Meier確率を示している。メチル化陰性群においては、概算生存率が６月間において９３％（９５％信頼区間、８３〜１００％）、１２月間において４４％（９５％信頼区間、２８〜６９％）、１８月間において２１％（９５％信頼区間、９〜４７％）である。メチル化陽性群においては、概算生存率が６月間において９５％（９５％信頼区間、８７〜１００％）、１２月間において８５％（９５％信頼区間、７０〜１００％）、１８月間において６４％（９５％信頼区間、４４〜９４％）である。ＣＩ＝信頼区間
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患した患者のシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法後の生存を予測するためのインビトロにおける方法であって、
ａ）前記患者の体液、血清、または組織試料から核酸を単離し、
ｂ）試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を確認し、そして
ｃ）その結果に従い、メチル化陽性またはメチル化陰性として規定される２群に前記患者を分類し、各群について生存に関する予後が明確にされること
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記メチル化の存在が、前記化学療法治療への応答として前記患者のより長い生存を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸のメチル化状態が核酸の調節領域において決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記調節領域がプロモーター領域、好ましくは１４‐３‐３シグマ遺伝子のエキソン１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が前記患者の腫瘍試料から単離されたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が前記患者の血清試料から単離されたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記シスプラチンを用いた化学療法が、単剤としてシスプラチンもしくはカルボプラチンから選択されるか、またはシスプラチン／パクリタキセル、シスプラチン／ゲムシタビン、シスプラチン／ドセタキセル、およびカルボプラチン／パクリタキセルから選択される組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
シスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法治療に対するＮＳＣＬＣに罹患した患者の生存を予測するための方法であって、前記患者からの生物学的試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定する工程を含んでなり、メチル化の存在が前記化学療法治療への応答として前記患者のより長い生存を示すものであることを特徴とする、方法。
【請求項９】
ＮＳＣＬＣに罹患した対象のためにシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた個別的な化学療法治療を計画するための方法であって、
ｉ）患者からの生物学的試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定し、
ii）メチル化の存在がシスプラチンまたはカルボプラチンを含んでなる化学療法治療においてより長い生存を有する患者の素因を示すことから、個別的な化学療法治療を計画する際に予備工程において得られたデータを考察すること
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
前記試料が血液試料である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有した第一容器と、１４‐３‐３遺伝子のＣｐＧ含有核酸の増幅用のプライマーを含有した第二容器とを含んでなり、前記プライマーが修飾されたメチル化と非メチル化核酸とを識別するものである、ＮＳＣＬＣ患者の化学療法治療に対する生存を予測するためのキット。
【請求項１２】
前記プライマーが、１４‐３‐３σのプロモーター領域、好ましくは１４‐３‐３σ遺伝子内におけるＣｐＧジヌクレオチド３から９の間の領域に属するものである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記非メチル化シトシンを修飾する試薬が重亜硫酸塩である、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＮＳＣＬＣ患者の化学療法治療に対する生存を予測するための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項１】
小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に罹患した患者のシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法後の生存を予測するためのインビトロにおける方法であって、
ａ）前記患者の体液、血清、または組織試料から核酸を単離し、
ｂ）試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を確認し、そして
ｃ）その結果に従い、メチル化陽性またはメチル化陰性として規定される２群に前記患者を分類し、各群について生存に関する予後が明確にされること
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記メチル化の存在が、前記化学療法治療への応答として前記患者のより長い生存を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸のメチル化状態が核酸の調節領域において決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記調節領域がプロモーター領域、好ましくは１４‐３‐３シグマ遺伝子のエキソン１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が前記患者の腫瘍試料から単離されたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が前記患者の血清試料から単離されたものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記シスプラチンを用いた化学療法が、単剤としてシスプラチンもしくはカルボプラチンから選択されるか、またはシスプラチン／パクリタキセル、シスプラチン／ゲムシタビン、シスプラチン／ドセタキセル、およびカルボプラチン／パクリタキセルから選択される組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
シスプラチンまたはカルボプラチンを用いた化学療法治療に対するＮＳＣＬＣに罹患した患者の生存を予測するための方法であって、前記患者からの生物学的試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定する工程を含んでなり、メチル化の存在が前記化学療法治療への応答として前記患者のより長い生存を示すものであることを特徴とする、方法。
【請求項９】
ＮＳＣＬＣに罹患した対象のためにシスプラチンまたはカルボプラチンを用いた個別的な化学療法治療を計画するための方法であって、
ｉ）患者からの生物学的試料において１４‐３‐３シグマをコードする核酸のメチル化状態を決定し、
ii）メチル化の存在がシスプラチンまたはカルボプラチンを含んでなる化学療法治療においてより長い生存を有する患者の素因を示すことから、個別的な化学療法治療を計画する際に予備工程において得られたデータを考察すること
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
前記試料が血液試料である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有した第一容器と、１４‐３‐３遺伝子のＣｐＧ含有核酸の増幅用のプライマーを含有した第二容器とを含んでなり、前記プライマーが修飾されたメチル化と非メチル化核酸とを識別するものである、ＮＳＣＬＣ患者の化学療法治療に対する生存を予測するためのキット。
【請求項１２】
前記プライマーが、１４‐３‐３σのプロモーター領域、好ましくは１４‐３‐３σ遺伝子内におけるＣｐＧジヌクレオチド３から９の間の領域に属するものである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記非メチル化シトシンを修飾する試薬が重亜硫酸塩である、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＮＳＣＬＣ患者の化学療法治療に対する生存を予測するための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のキットの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５３２５３１（Ｐ２００８−５３２５３１Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０１２４４（Ｐ２００８−５０１２４４）
【出願日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００２６１０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９７３４６
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０７３１１８８７）パンガエア、ビオテック、ソシエダッド、アノニマ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＮＧＡＥＡ ＢＩＯＴＥＣＨ， Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００２６１０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９７３４６
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０７３１１８８７）パンガエア、ビオテック、ソシエダッド、アノニマ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＮＧＡＥＡ ＢＩＯＴＥＣＨ， Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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