プロテインキナーゼ活性の測定方法
【課題】 プロテインキナーゼ活性を小型の検出装置にて迅速、簡便且つ高感度に測定可能とする。
【解決手段】 特異的結合対を形成する組合せの一方の分子が結合したＡＴＰとプロテインキナーゼと基質とを反応させる工程と、プロテインキナーゼによるリン酸化によって一方の分子が結合した基質と、特異的結合対を形成する組合せの他方の分子が結合した金属微粒子とを接触させる工程と、金属微粒子を作用極の表面に集めた状態で金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化する工程と、金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する工程とを有し、前記電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。
【解決手段】 特異的結合対を形成する組合せの一方の分子が結合したＡＴＰとプロテインキナーゼと基質とを反応させる工程と、プロテインキナーゼによるリン酸化によって一方の分子が結合した基質と、特異的結合対を形成する組合せの他方の分子が結合した金属微粒子とを接触させる工程と、金属微粒子を作用極の表面に集めた状態で金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化する工程と、金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する工程とを有し、前記電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属微粒子を標識物質とするプロテインキナーゼ活性の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内で起きる様々な生命現象は、タンパク質リン酸化反応により巧妙に制御されている。したがって生命現象の仕組みを理解するためには、そのカギを握る５００種類以上のプロテインキナーゼ群あるいはその阻害剤、さらにはその活性化剤のそれぞれの活性を効率的に測定する手法の開発が非常に重要な意味を持つ。プロテインキナーゼ活性及びその阻害活性、活性化剤の測定方法としては、例えば３２Ｐを用いたオートラジオグラフィーや抗プロテインキナーゼ抗体を利用したＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）等が多用されている。また、近年では、金ナノ粒子等のような金属微粒子を標識物質とし、光学的手法により測定する方法も提案されており、例えば非特許文献１においては、リン酸化した後のプロテインキナーゼ基質を金ナノ粒子で標識した後、共鳴光散乱を検出することによりプロテインキナーゼ活性を測定する方法が提案されている。また、非特許文献２においては、金ナノ粒子を用いた比色分析によりプロテインキナーゼ活性を測定する方法が提案されている。
【非特許文献１】Anal. Chem. 2005, 77, 5770-5775
【非特許文献２】J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2214-2215
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前述のオートラジオグラフィーやＥＬＩＳＡは感度については良好であるものの、測定操作が煩雑で測定に長時間を要する等の問題がある。加えて、オートラジオグラフィーを用いる場合、放射性同位元素の取り扱いに関する多くの制約がある。また、非特許文献１，２等に記載される方法は、検出に光学系が必要であるため検出装置が大型化、複雑化する等の問題がある。
【０００４】
本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、プロテインキナーゼの活性を小型の検出装置にて迅速、簡便且つ高感度に測定可能なプロテインキナーゼ活性の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前述の目的を達成するために、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法は、特異的結合対を形成する組合せの一方の分子が結合したＡＴＰとプロテインキナーゼと基質とを反応させる工程と、前記プロテインキナーゼによるリン酸化によって前記一方の分子が結合した前記基質と、特異的結合対を形成する組合せの他方の分子が結合した金属微粒子とを接触させる工程と、前記金属微粒子を作用極の表面に集めた状態で前記金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化する工程と、前記金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する工程とを有し、前記電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定することを特徴とする。
【０００６】
金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化した後還元する際の電流値は、プロテインキナーゼによる基質のリン酸化の程度を表すので、これを指標としてプロテインキナーゼ活性の測定が実現される。また、作用極の表面に金属微粒子を集めた状態で金属微粒子を構成する金属の電気化学的な酸化還元を行うことにより、プロテインキナーゼの酵素反応の結果として集められた金属微粒子の全てを作用極表面との電子授受に関与させることができ、結果として高感度な測定が実現される。さらに、得られる還元電流値は、例えば酸化電流値に比較して含まれるノイズが少なく、プロテインキナーゼ活性の正確な測定が実現される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、従来のオートラジオグラフィーやＥＬＩＳＡのような複雑な操作を必要とせず簡便にプロテインキナーゼ活性を測定することができる。また、本発明によれば、例えばＥＬＩＳＡの検出工程において用いられるような大型の測定機器を必要とすることなく、簡便な操作にて、プロテインキナーゼの活性の高感度且つ正確な測定を実現することができる。さらに、本発明によれば、これらの活性測定に要する時間も大幅に短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【０００９】
本発明のプロテインキナーゼ活性の測定方法においては、先ず、特異的結合対を形成する組合せの一方の分子が結合したＡＴＰとプロテインキナーゼと基質とを反応させる工程を行う。これにより、プロテインキナーゼの働きにより基質がリン酸化され、リン酸基を介して基質に一方の分子が結合する。
【００１０】
特異的結合対を形成する組合せとしては、互いを認識して捕捉する組合せであればよく、例えばビオチンとアビジン、抗原と抗体、核酸と核酸、核酸と核酸結合タンパク質、レクチンと糖鎖、レセプターとリガンド等が挙げられる。この組合せの一方の分子をＡＴＰのリン酸基、具体的にはγ−リン酸基に、他方の分子を金属微粒子に結合させる。なかでもアビジンとビオチンは、特にビオチンが低分子であり酵素反応時の立体障害となり難く、しかも入手が容易で安価であることから、好ましい組合せである。
【００１１】
次に、プロテインキナーゼによるリン酸化によって一方の分子が結合した基質と、特異的結合対を形成する組合せの他方の分子が結合した金属微粒子とを接触させる工程を行う。一方の分子と他方の分子とが特異的に結合することにより、基質が金属微粒子により標識される。
【００１２】
標識物質である金属微粒子としては、例えば金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム等の微粒子やそれらのコロイド粒子等を用いることができる。特に粒径２０ｎｍ〜６０ｎｍの金微粒子を用いることが好ましい。
【００１３】
次に、特異的結合対を介して基質に結合した金属微粒子を作用極の表面に集めた状態で、金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化する。
【００１４】
金属微粒子を作用極の表面に集めた状態とするには、作用極の表面にプロテインキナーゼの基質を予め固定化しておく方法、ビーズ担体の表面にプロテインキナーゼの基質を予め固定化しておくとともに、ビーズ担体を作用極の表面に集めることにより金属微粒子を作用極の表面に集める方法等が挙げられる。
【００１５】
これらのうちビーズ担体を用いる方法は、プロテインキナーゼと基質とＡＴＰとを含む溶液中でこれらを反応させ、溶液からビーズ担体を分離して金属微粒子と接触させた後、金属微粒子との反応溶液からビーズ担体を分離し、ビーズ担体を作用極の表面に集めるという順序で実施することが好ましい。この場合、プロテインキナーゼを含む反応溶液全体に基質が拡散するので、迅速且つ確実に酵素反応を進行させることができるという利点がある。また、測定操作も簡便である。これに対し、作用極の表面にビーズ担体を集めた状態で酵素反応を行い、その後金属微粒子と反応させる順序では、測定操作が増えるほか、未反応の基質が増えるおそれがある。
【００１６】
ビーズ担体としては、基質を固定化可能であれば特に限定されるものではないが、作用極の表面に集める操作が容易であることから、磁気ビーズを用いることが好ましい。また、磁気的な分離が可能な磁気ビーズを使用することで、磁気ビーズの懸濁に必要な電気化学的測定用溶液の量を減らすことができる。この結果、電気化学的測定用溶液中に磁気ビーズ（金属微粒子）を高濃度に存在させることができるため、検出感度のさらなる向上を図ることができる。
【００１７】
金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化させるには、例えば、参照電極に対する作用極の電位を、金属微粒子に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。このことにより、作用極の表面に集めた金属微粒子を完全に酸化する。
【００１８】
金属微粒子に含まれる金属を酸化させるに際して、作用極の電位は、前記金属が酸化可能な電位とする。具体的には、作用極の電位は、使用する金属微粒子の種類に応じて適宜最適な値に設定する必要があるが、例えば、銀塩化銀参照電極に対して＋０．８Ｖ〜＋２．０Ｖとすることが好ましい。作用極の電位を前記範囲内にすることにより、作用極の表面に集めた金属微粒子を完全に酸化溶出させることができ、プロテインキナーゼ活性の感度を確実に向上させることができる。作用極の電位を前記範囲未満とした場合、測定時に還元電流のピークが現れないおそれがあり、逆に前記範囲を超えた場合、酸化させた金属微粒子の泳動による拡散が起こり、作用極表面近傍における酸化物の濃度が低下してしまい、これにより還元電流のピークが小さくなるおそれがある。
【００１９】
金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化させる具体的な手段としては、前記金属が酸化する電位に所定時間保持することが挙げられる。前記電位を所定時間保持する操作は、金属微粒子に含まれる金属を十分に酸化させられるため、好ましい方法である。また、前記電位を印加するに際しては、前述したように作用極の電位を所定の電位に保持する方法の他、例えばサイクリックボルタンメトリー等によって、作用極の電位を時間経過に伴い変化させてもよい。作用極の電位を時間経過に伴って変化させる場合には、金属微粒子が酸化する電位の範囲内（例えば、銀塩化銀参照電極に対し＋０．８Ｖ〜＋２．０Ｖ）において、作用極の電位を変化させることが好ましい。さらに、金属微粒子に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位を作用極に複数回印加してもよい。
【００２０】
金属微粒子に含まれる金属を酸化させるに際しては、金属微粒子の量に応じて最適な電荷量を与えるように注意する必要がある。電荷量は電流を積分した値であるため、作用極に印加する電位が比較的低い電位であれば、金属微粒子に含まれる金属を十分に酸化させるためには当該電位を長時間印加する必要がある。一方、作用極に印加する電位が比較的高い電位であれば、金属微粒子に含まれる金属を十分に酸化させるために必要な時間は短時間でよい。
【００２１】
例えば、金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化させるに際して、金属微粒子に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位に作用極の電位を保持する場合には、前記電位の保持時間を３００秒以内とすることが好ましい。保持時間を適切とすることにより、作用極の表面に集めた金属微粒子に含まれる金属を完全に酸化させることができ、測定感度を確実に向上させることができる。前記電位の保持時間は、１秒以上３００秒以下とすることがより好ましい。保持時間を１秒以上とすることで金属の酸化を十分に行うことができる。前記電位の保持時間のさらに好ましい範囲は、１秒以上１００秒以下である。
【００２２】
なお、少なくとも作用極及び対極の表面にプロテインキナーゼの基質を固定化するとともに、金属微粒子を作用極及び対極の表面に集めた状態とした後、金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化させる前に、作用極に対して対極を正電位とする電位制御を行い作用極表面に金属を析出させてもよい。作用極上のみに基質ペプチドを固定化して作用極のみを反応場とし、作用極、対極及び参照電極が同一基板上に例えば印刷形成されたプレナー型デバイスを用いる場合、反応場である作用極の面積はデバイス自体の大きさ、対極面積及び参照電極の面積等に制限されるため、感度の向上には限界がある。これに対し、作用極と少なくとも対極との両方に基質ペプチドを固定化して反応場として利用し、且つ、少なくとも対極の表面に集められた金属微粒子を酸化溶出させ、泳動させて作用極表面に析出させた後、電気化学的酸化を行うことにより、作用極以外の領域に集められた金属微粒子についても電気化学的測定の対象となるので、より多くの金属微粒子が作用極の表面に集められたことになり、検出感度のさらなる向上が実現される。
【００２３】
前述のように作用極表面に金属を析出させる条件は使用する前記測定用の溶液により変わるが、例えば、作用極に対する対極の電位を＋１Ｖ〜＋２Ｖの範囲内とすることが好ましい。前記範囲内とすることにより、少なくとも対極の表面に集められた金属微粒子を確実に溶出させ、作用極上へ泳動させることができる。作用極に対する対極の電位は、金属微粒子が酸化する電位に所定時間保持してもよいし、金属微粒子が酸化する電位の範囲内で時間経過に伴って変化させてもよい。
【００２４】
次に、金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する工程を行い、得られた電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定するには、例えば、作用極の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、前述の電位制御により酸化溶出した金属が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。
【００２５】
酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。
【００２６】
作用極の電位制御及び還元電流測定の際に用いる溶液としては、金属微粒子に含まれる金属を容易に電気化学的に酸化させることができることから、酸性溶液を用いることが好ましい。酸性溶液としては、金属微粒子の種類等に応じて適宜選択すればよいが、例えば塩酸、硝酸、酢酸、リン酸、クエン酸、硫酸等を含む水溶液を用いることができる。金属微粒子の電気化学的酸化のし易さを考慮すると、中でも、０．０５規定〜１規定の塩酸水溶液を用いることが好ましい。
【００２７】
作用極の電位制御及び電気化学測定の際に用いる溶液としては、酸性溶液の他、塩素を含む中性溶液を用いることも可能である。塩素を含む中性溶液を用いることにより、酸性溶液を用いる場合に比べて大きな電流変化量が得られ、結果として、より高感度な測定が達成される。また、酸性溶液を用いる場合、例えば低電位側における還元ピークの裾が上昇する等のようにピーク形状が非対称となったり、例えば０．１Ｖ付近においてノイズが発生することがある。これに対して、塩素を含む中性溶液を用いることで、還元ピークの裾が平坦となるとともに、前記ノイズ発生が抑えられるので、還元ピーク強度検出が簡便となる。さらに、酸性溶液やアルカリ溶液のような取扱いの難しい溶液の使用を回避することができ、測定操作を安全且つ簡便に実施することができる。塩素を含む中性溶液としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ等を用いたときに前記の効果を得られるが、特にＫＣｌを用いたときに効果が大きい。
【００２８】
以下、本発明の第１の実施形態について説明する。本実施形態は、基質を固定化した作用極を用いて金属微粒子を作用極の表面に集め、阻害剤の共存下でプロテインキナーゼの酵素活性を測定するものである。
【００２９】
先ず、図１に示すように、プロテインキナーゼの基質ペプチド１を作用極１１の表面に固定化する。また、特異的結合対を形成する組合せの一方の分子として、ビオチンをγ−リン酸基に結合させたＡＴＰと、他方の分子としてストレプトアビジン２を結合させた金（Ａｕ）ナノ粒子３であるストレプトアビジンコート金ナノ粒子４とを用意する。
【００３０】
次に、プロテインキナーゼとビオチン化ＡＴＰとキナーゼ阻害剤と作用極１１に固定化した基質ペプチド１とを接触させ、これらを反応させる。プロテインキナーゼ活性がある場合には、図１上段に示すように、プロテインキナーゼ活性の強さに応じて基質ペプチド１はリン酸化され、ビオチン５が基質ペプチド１に結合する。反応後、作用極１１を洗浄し、未反応のＡＴＰ等を除去する。
【００３１】
次に、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４を作用極１１上に供給し、基質ペプチド１とストレプトアビジンコート金ナノ粒子４とを接触させる。基質ペプチド１を介してビオチン５が作用極１１に結合している場合、ビオチン５とストレプトアビジン３とが結合することにより、基質ペプチド１に金ナノ粒子３が結合し、作用極１１の表面に金ナノ粒子３が集められる。
【００３２】
次に、金ナノ粒子３を電気化学的に酸化する。例えば、参照電極に対する作用極１１の電位を、金ナノ粒子３に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。
【００３３】
金ナノ粒子３に含まれる金属を電気化学的に酸化させた後、電気化学的に還元する際に生じる電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。具体的には、例えば、作用極１１の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、図１上段に示すように前述の電位制御により酸化溶出した金が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。被検溶液に含まれるプロテインキナーゼ活性が強く、作用極１１の表面に集められた金ナノ粒子３が多いほど還元電流強度も大きくなることから、これに基づいてプロテインキナーゼの活性の強さを求めることができる。
【００３４】
一方、キナーゼ阻害剤によりプロテインキナーゼ活性が阻害されている場合や基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれていない場合等には、図１下段に示すように、酵素反応後においても作用極１１上の基質ペプチド１はプロテインキナーゼによりリン酸化されないので、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４は基質ペプチド１を標識しない。このため、電気化学検出を行ったとしてもシグナルは得られない。
【００３５】
以上のように、作用極１１の表面に基質ペプチド１を固定化することにより、作用極１１表面に集めた金属微粒子３中の金属の還元電流を指標としてプロテインキナーゼ活性を迅速、簡便且つ高感度に測定することができる。また、本実施形態においては、基質ペプチド１を予め作用極１１に固定化しておくので、酵素活性に応じた量の金属微粒子３を簡便且つ確実に作用極１１表面に集めることができる。
【００３６】
次に、本発明の第２の実施形態について説明する。本実施形態は、基質を固定化した磁気ビーズを用いて金ナノ粒子を作用極の表面に集め、プロテインキナーゼの酵素活性を測定するものである。本実施形態においては、反応時に基質が溶液中に拡散しているので、プロテインキナーゼの反応をより迅速に確実に進行させることができる。
【００３７】
先ず、図２に示すように、プロテインキナーゼの基質ペプチド１を磁気ビーズ２１に固定化する。また、第１の実施形態と同様に、特異的結合対を形成する組合せの一方の分子としてビオチンをリン酸基に結合させたＡＴＰと、他方の分子としてストレプトアビジン２を結合させた金（Ａｕ）ナノ粒子３であるストレプトアビジンコート金ナノ粒子４とを用意する。
【００３８】
次に、所定の容器内に満たした酵素反応溶液中で、プロテインキナーゼと、ビオチン化ＡＴＰと、磁気ビーズ２１に固定化した基質ペプチド１とを接触させ、これらを反応させる。基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれている場合には、図２上段に示すように、プロテインキナーゼ活性の強さに応じて基質ペプチド１はリン酸化され、ビオチン５が基質ペプチド１に結合する。
【００３９】
次に、前記反応溶液から前記磁気ビーズ２１を分離し、別の容器内で、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４と基質ペプチド１が固定化された磁気ビーズ２１とを接触させ、反応させる。基質ペプチド１を介してビオチン５が磁気ビーズ２１に結合している場合、ビオチン５とストレプトアビジン２とが結合することにより、基質ペプチド１を介して磁気ビーズ２１に金ナノ粒子３が結合する。
【００４０】
ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４を結合させた後、金ナノ粒子４と接触させた溶液から磁気ビーズ２１を分離して磁気ビーズ２１を作用極１１の表面に集めることにより、金ナノ粒子３を作用極１１の表面に集める。ビーズ担体として磁気ビーズを用いる場合、作用極１１の裏面に磁石を配置して磁気的な吸着力を利用することで、磁気ビーズに結合した金ナノ粒子を作用極表面に集める時間を短縮することができる。
【００４１】
次に、金ナノ粒子３に含まれる金属を電気化学的に酸化させる。例えば、参照電極に対する作用極の電位を、金ナノ粒子３に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。
【００４２】
金ナノ粒子３に含まれる金属を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じる電流値を測定し、これを指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。具体的には、例えば、作用極の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、図２上段に示すように前述の電位制御により酸化溶出した金属が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。被検溶液に含まれるプロテインキナーゼ活性が強く、作用極の表面に集められた金ナノ粒子３が多いほど還元電流強度も大きくなることから、これに基づいてプロテインキナーゼ活性を求めることができる。
【００４３】
一方、基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれていない場合や、プロテインキナーゼ活性が完全に阻害されている場合等には、図２下段に示すように、金ナノ粒子３は基質ペプチド１を標識しないので、電気化学シグナルは得られない。
【００４４】
以上のように、磁気ビーズ２１に基質ペプチド１を固定化した場合も、酵素反応後に磁気ビーズ２１を作用極１１の表面に集めることで、第１の実施形態と同様にプロテインキナーゼ活性を迅速、簡便且つ高感度に測定することができる。
【００４５】
また、本実施形態においては、反応溶液中に懸濁することが可能な磁気ビーズ等のビーズ担体に基質を固定化するので、基質を固定化した作用極表面で反応させる場合に比較して反応効率を高めることができる。
【００４６】
以下、本発明の第３の実施形態について説明する。本実施形態は、作用極、対極及び作用極−対極間に基質を固定化し、電気化学的酸化の前に所定の電位操作を行う方法である。
【００４７】
先ず、図３に示すように、作用極１１、対極１２及び参照電極（図示は省略する）が同一の基板１３上に形成されたプレナー型電極デバイスを用意し、作用極１１と対極１２の両方に、プロテインキナーゼに対する基質ペプチド１を固定化する。また、基板１３のうち、作用極１１と対極１２とで挟まれる電極間領域１３ａ上にも基質ペプチド１を固定化する。作用極１１と対極１２とで挟まれる電極間領域１３ａ上にも基質ペプチド１を固定化することで、さらなる高感度検出が達成される。電極デバイス表面は、非特異吸着を防ぐためにブロッキングする。また、第１の実施形態と同様に、ビオチンをリン酸基に結合させたＡＴＰと、ストレプトアビジン２を金ナノ粒子３に結合させたストレプトアビジンコート金ナノ粒子４とを用意する。なお、作用極１１、対極１２及び参照電極は互いに近接した場所に存在していれば、必ずしも同一基板上に形成されていなくてもよい。
【００４８】
次に、第１の実施形態と同様に、プロテインキナーゼとビオチン化ＡＴＰと作用極１１及び対極１２等に固定化した基質ペプチド１とを接触させ、これらを反応させる。それから、第１の実施形態と同様に、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４を作用極１１等に供給し、反応させる。基質ペプチド１を介してビオチン５が作用極１１に結合している場合、ビオチン５とストレプトアビジン２とが結合することにより、基質ペプチド１に金ナノ粒子３が結合し、作用極１１及び対極１２の表面に金ナノ粒子３が集められる。
【００４９】
次に、作用極１１、対極１２及び電極間領域１３ａの表面を必要に応じて洗浄した後、これらの表面を電気化学的測定用の溶液と接触させ、作用極１１に対して対極１２を正電位とする電位制御を行う。これにより、対極１２の表面に集められた金ナノ粒子３は酸化溶出し、溶液中を電気的に泳動する。また、作用極１１と対極１２との間に位置する電極間領域１３ａの表面に集められた金ナノ粒子３も、溶液中を電気的に泳動する。そして、作用極１１の表面に到達すると金６として析出する。この結果、反応に関与した全ての金ナノ粒子３が作用極１１の表面に集められることになる。
【００５０】
この後の工程は、前述した第１の実施形態と同様である。すなわち、金ナノ粒子３に含まれる金を電気化学的に酸化させ、次いで、金ナノ粒子３に含まれる金属を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じる電流値を測定し、これを指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。
【００５１】
以上のように、本実施形態によれば、作用極１１以外の少なくとも対極１２も反応場として利用するとともに、少なくとも対極１２の表面に集めた金ナノ粒子３を作用極１１表面へ移した後に、電気化学的な酸化と還元電流の測定を行うので、作用極１１の表面のみを反応場とする場合に比べてさらなる高感度化を実現することができる。また、少なくとも対極１２の表面に集められた金ナノ粒子３の作用極１１の表面への泳動は、作用極１１と対極１２との電位を制御するという簡便な操作で達成されるので、例えば溶液を撹拌するための機械的な構造は不要である。したがって、電極デバイス側の構造を変更することなく、また、極めて簡単な操作で高感度化を実現することができる。
【００５２】
なお、前述の第１の実施形態〜第３の実施形態においては、プロテインキナーゼの酵素活性を測定する方法を例に挙げて説明したが、プロテインキナーゼの活性を測定することにより、酵素反応の際に共存させた阻害剤の活性を間接的に測定することも可能である。また、プロテインキナーゼの活性化剤の存在下で酵素反応させ、プロテインキナーゼの活性を測定することにより、活性化剤の活性を間接的に測定することも可能である。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１＞
本実施例では、作用極の表面にプロテインキナーゼ（ｐ６０ｃ−Ｓｒｃ）の基質ペプチド（Ｒａｙｔｉｄｅ）を固定化した平板型印刷電極を用い、金属微粒子として、ストレプトアビジンでコートされた金ナノ粒子を用いてプロテインキナーゼの活性の測定を試みた。
【００５４】
１．基質固定化印刷電極の作製
基質の固定化は、作用極のカーボンペーストと高い親和性を有して強く吸着するリンカー分子（1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester）を介して行った。印刷電極の作用極上にリンカー分子を５ｍＭ含む無水ジメチルホルムアミド溶液を滴下して１時間インキュベートした。リン酸バッファーで洗浄後、アッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）で規定濃度に調製した基質を印刷電極の作用極上に滴下し、一晩室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、１００ｍＭのエタノールアミンを３０分間適用し、電極表面のブロッキングを行った。このようにして調製した基質固定化印刷電極は４℃で保存した。
【００５５】
２．被検溶液中のキナーゼによるリン酸化
反応溶液として、１０μＬのキナーゼ溶液と１０μＬのＡＴＰ溶液とを混合して被検溶液を調製し、基質固定化印刷電極上に滴下し３０分間、３０℃でインキュベートした。反応は１０％ Ｈ３ＰＯ４溶液に浸して終了させ、０．５％ Ｈ３ＰＯ４溶液で洗浄し、乾燥させた。なお、前記キナーゼ溶液とは、任意濃度のキナーゼ（ｐ６０ｃ−Ｓｒｃ）と、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンと、０．２％β−メルカプトエタノールとを前記アッセイバッファー中に含むものである。また、前記ＡＴＰ溶液とは、１５０ｍＭのビオチン化ＡＴＰと、３０ｍＭのＭｇＣｌとを前記アッセイバッファー中に含むものである。
【００５６】
３．金ナノ粒子による標識
リン酸化された基質を金ナノ粒子で標識するために、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子を１０％ｖ／ｖ含む前記アッセイバッファー２０μＬを印刷電極上に滴下し、ゆっくり撹拌しながら１時間室温で反応させた。その後、洗浄、乾燥させた。
【００５７】
４．電気化学的測定
反応終了後の印刷電極に２０μＬの０．１ＭのＨＣｌを滴下し、印刷電極内の銀／塩化銀参照電極に対する作用極の電位を＋１．２Ｖとし、４０秒間保持した。
次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用極の電位を１Ｖから０Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス期間０．２秒、掃引速度０．０１Ｖ／ｓであった。電位に対する電流変化の特性図を図４に示した。図４より、＋０．５Ｖ付近に金の還元に伴う電流のピークが観察された。また、被検溶液中のキナーゼ活性と還元電流値との関係を図５に示す。これより、キナーゼ活性が高くなるにつれて電流値も増加することが示された。
【００５８】
５．プロテインキナーゼ阻害因子の検出
次に、反応溶液に任意濃度の阻害因子を添加し、プロテインキナーゼ活性と還元電流との関係について検討した。阻害因子の検出に際しては、任意の濃度の阻害因子を前述の反応溶液に添加し、さらにジメチルスルフォキシドを２％となるように添加した。４時間、３０℃でインキュベートし、前述の「２．被検溶液中のキナーゼによるリン酸化」と同様の方法で、反応を終了させ、洗浄、乾燥した後、金ナノ粒子による標識を行い、さらに電気化学的測定を行った。この結果、阻害因子の添加により測定電流値の低下が観察された。これより、前記方法により、阻害因子の検出が可能であることが示された。
【００５９】
＜実施例２＞
本実施例では、基質ペプチドを固定化した磁気ビーズを用いて、キナーゼ活性の測定を試みた。
【００６０】
１．基質固定化磁気ビーズの作製
１００μＬのカルボキシル化磁気ポリスチレンビーズを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、４００μＬのＰＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎを含む５０ｍＭリン酸バッファー）を加えて５分間撹拌した。洗浄後、１００μＬのＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide
Hydrochloride）とＮＨＳ（N-Hydroxysuccinimide）を最終濃度が２ｍＭと５ｍＭになるようにＰＢＳ−Ｔを加えて１時間撹拌した。磁気ビーズを分離後、基質ペプチドのＰＢＳ−Ｔ溶液を、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、１時間撹拌した。その後、１００μＬのエタノールアミンを最終濃度が１００ｍＭとなるように添加して１時間インキュベートして、ビーズ表面をブロッキング、洗浄し、再び１００μＬ中のＰＢＳ−Ｔに縣濁させて基質固定化ビーズ溶液とした。
【００６１】
２．被検溶液中のキナーゼによるリン酸化
反応溶液として、１００μＬの任意濃度のキナーゼ（ｐ６０ｃ−Ｓｒｃ）、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、３ｍＭアミノフィリン、４ｍＭジチオスレイトール、０．０５ｍＭビオチン化ＡＴＰ、及び０．８３％カゼインを含む５０ｍＭのリン酸バッファー溶液を調製した。これに１００μＬの基質固定化磁気ビーズ溶液を加えて被検溶液とし、３０分間、３０℃でインキュベートした。反応は２５０μＬのトリクロロ酢酸を最終濃度が６．７５％になるように加えて終了させた。その後、被検溶液から磁気的にビーズを分離し、マイクロチューブ内に収集した。
【００６２】
３．金ナノ粒子による標識
リン酸化された基質を金ナノ粒子で標識するために、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子を１０％ｖ／ｖ含む前記アッセイバッファー２０μＬをマイクロチューブに収集した磁気ビーズに滴下し、ゆっくり撹拌しながら１時間室温で反応させた。反応後、磁気的に磁気ビーズを収集し、洗浄後、１０μＬのリン酸バッファーに懸濁させた。
【００６３】
４．電気化学的測定
磁気ビーズ溶液を印刷電極上に滴下し、作用極の下に磁石を置いた状態で磁気ビーズを作用極上に集め、上澄を取り除き、０．１ＭのＨＣｌを２０μＬ滴下し、参照電極に対する作用極の電位を＋１．２Ｖとし、４０秒間保持した。
【００６４】
次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用極の電位を１Ｖから０Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス期間０．２秒、掃引速度０．０１Ｖ／ｓであった。実施例１の場合と同様に、＋０．５Ｖ付近に、金の還元に伴う電流のピークが観察された。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の第１の実施形態について説明するための模式図である。
【図２】本発明の第２の実施形態について説明するための模式図である。
【図３】本発明の第３の実施形態について説明するための模式図である。
【図４】実施例１で測定した電位に対する電流変化の特性図である。
【図５】実施例１で測定したプロテインキナーゼの活性と還元電流値との関係を示す特性図である。
【符号の説明】
【００６６】
１ 基質ペプチド、２ ストレプトアビジン、３ 金ナノ粒子、４ ストレプトアビジンコート金ナノ粒子、５ ビオチン、１１ 作用極、１２ 対極、１３ 基板、２１ 磁気ビーズ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属微粒子を標識物質とするプロテインキナーゼ活性の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内で起きる様々な生命現象は、タンパク質リン酸化反応により巧妙に制御されている。したがって生命現象の仕組みを理解するためには、そのカギを握る５００種類以上のプロテインキナーゼ群あるいはその阻害剤、さらにはその活性化剤のそれぞれの活性を効率的に測定する手法の開発が非常に重要な意味を持つ。プロテインキナーゼ活性及びその阻害活性、活性化剤の測定方法としては、例えば３２Ｐを用いたオートラジオグラフィーや抗プロテインキナーゼ抗体を利用したＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）等が多用されている。また、近年では、金ナノ粒子等のような金属微粒子を標識物質とし、光学的手法により測定する方法も提案されており、例えば非特許文献１においては、リン酸化した後のプロテインキナーゼ基質を金ナノ粒子で標識した後、共鳴光散乱を検出することによりプロテインキナーゼ活性を測定する方法が提案されている。また、非特許文献２においては、金ナノ粒子を用いた比色分析によりプロテインキナーゼ活性を測定する方法が提案されている。
【非特許文献１】Anal. Chem. 2005, 77, 5770-5775
【非特許文献２】J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2214-2215
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前述のオートラジオグラフィーやＥＬＩＳＡは感度については良好であるものの、測定操作が煩雑で測定に長時間を要する等の問題がある。加えて、オートラジオグラフィーを用いる場合、放射性同位元素の取り扱いに関する多くの制約がある。また、非特許文献１，２等に記載される方法は、検出に光学系が必要であるため検出装置が大型化、複雑化する等の問題がある。
【０００４】
本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、プロテインキナーゼの活性を小型の検出装置にて迅速、簡便且つ高感度に測定可能なプロテインキナーゼ活性の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前述の目的を達成するために、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法は、特異的結合対を形成する組合せの一方の分子が結合したＡＴＰとプロテインキナーゼと基質とを反応させる工程と、前記プロテインキナーゼによるリン酸化によって前記一方の分子が結合した前記基質と、特異的結合対を形成する組合せの他方の分子が結合した金属微粒子とを接触させる工程と、前記金属微粒子を作用極の表面に集めた状態で前記金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化する工程と、前記金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する工程とを有し、前記電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定することを特徴とする。
【０００６】
金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化した後還元する際の電流値は、プロテインキナーゼによる基質のリン酸化の程度を表すので、これを指標としてプロテインキナーゼ活性の測定が実現される。また、作用極の表面に金属微粒子を集めた状態で金属微粒子を構成する金属の電気化学的な酸化還元を行うことにより、プロテインキナーゼの酵素反応の結果として集められた金属微粒子の全てを作用極表面との電子授受に関与させることができ、結果として高感度な測定が実現される。さらに、得られる還元電流値は、例えば酸化電流値に比較して含まれるノイズが少なく、プロテインキナーゼ活性の正確な測定が実現される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、従来のオートラジオグラフィーやＥＬＩＳＡのような複雑な操作を必要とせず簡便にプロテインキナーゼ活性を測定することができる。また、本発明によれば、例えばＥＬＩＳＡの検出工程において用いられるような大型の測定機器を必要とすることなく、簡便な操作にて、プロテインキナーゼの活性の高感度且つ正確な測定を実現することができる。さらに、本発明によれば、これらの活性測定に要する時間も大幅に短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【０００９】
本発明のプロテインキナーゼ活性の測定方法においては、先ず、特異的結合対を形成する組合せの一方の分子が結合したＡＴＰとプロテインキナーゼと基質とを反応させる工程を行う。これにより、プロテインキナーゼの働きにより基質がリン酸化され、リン酸基を介して基質に一方の分子が結合する。
【００１０】
特異的結合対を形成する組合せとしては、互いを認識して捕捉する組合せであればよく、例えばビオチンとアビジン、抗原と抗体、核酸と核酸、核酸と核酸結合タンパク質、レクチンと糖鎖、レセプターとリガンド等が挙げられる。この組合せの一方の分子をＡＴＰのリン酸基、具体的にはγ−リン酸基に、他方の分子を金属微粒子に結合させる。なかでもアビジンとビオチンは、特にビオチンが低分子であり酵素反応時の立体障害となり難く、しかも入手が容易で安価であることから、好ましい組合せである。
【００１１】
次に、プロテインキナーゼによるリン酸化によって一方の分子が結合した基質と、特異的結合対を形成する組合せの他方の分子が結合した金属微粒子とを接触させる工程を行う。一方の分子と他方の分子とが特異的に結合することにより、基質が金属微粒子により標識される。
【００１２】
標識物質である金属微粒子としては、例えば金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム等の微粒子やそれらのコロイド粒子等を用いることができる。特に粒径２０ｎｍ〜６０ｎｍの金微粒子を用いることが好ましい。
【００１３】
次に、特異的結合対を介して基質に結合した金属微粒子を作用極の表面に集めた状態で、金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化する。
【００１４】
金属微粒子を作用極の表面に集めた状態とするには、作用極の表面にプロテインキナーゼの基質を予め固定化しておく方法、ビーズ担体の表面にプロテインキナーゼの基質を予め固定化しておくとともに、ビーズ担体を作用極の表面に集めることにより金属微粒子を作用極の表面に集める方法等が挙げられる。
【００１５】
これらのうちビーズ担体を用いる方法は、プロテインキナーゼと基質とＡＴＰとを含む溶液中でこれらを反応させ、溶液からビーズ担体を分離して金属微粒子と接触させた後、金属微粒子との反応溶液からビーズ担体を分離し、ビーズ担体を作用極の表面に集めるという順序で実施することが好ましい。この場合、プロテインキナーゼを含む反応溶液全体に基質が拡散するので、迅速且つ確実に酵素反応を進行させることができるという利点がある。また、測定操作も簡便である。これに対し、作用極の表面にビーズ担体を集めた状態で酵素反応を行い、その後金属微粒子と反応させる順序では、測定操作が増えるほか、未反応の基質が増えるおそれがある。
【００１６】
ビーズ担体としては、基質を固定化可能であれば特に限定されるものではないが、作用極の表面に集める操作が容易であることから、磁気ビーズを用いることが好ましい。また、磁気的な分離が可能な磁気ビーズを使用することで、磁気ビーズの懸濁に必要な電気化学的測定用溶液の量を減らすことができる。この結果、電気化学的測定用溶液中に磁気ビーズ（金属微粒子）を高濃度に存在させることができるため、検出感度のさらなる向上を図ることができる。
【００１７】
金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化させるには、例えば、参照電極に対する作用極の電位を、金属微粒子に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。このことにより、作用極の表面に集めた金属微粒子を完全に酸化する。
【００１８】
金属微粒子に含まれる金属を酸化させるに際して、作用極の電位は、前記金属が酸化可能な電位とする。具体的には、作用極の電位は、使用する金属微粒子の種類に応じて適宜最適な値に設定する必要があるが、例えば、銀塩化銀参照電極に対して＋０．８Ｖ〜＋２．０Ｖとすることが好ましい。作用極の電位を前記範囲内にすることにより、作用極の表面に集めた金属微粒子を完全に酸化溶出させることができ、プロテインキナーゼ活性の感度を確実に向上させることができる。作用極の電位を前記範囲未満とした場合、測定時に還元電流のピークが現れないおそれがあり、逆に前記範囲を超えた場合、酸化させた金属微粒子の泳動による拡散が起こり、作用極表面近傍における酸化物の濃度が低下してしまい、これにより還元電流のピークが小さくなるおそれがある。
【００１９】
金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化させる具体的な手段としては、前記金属が酸化する電位に所定時間保持することが挙げられる。前記電位を所定時間保持する操作は、金属微粒子に含まれる金属を十分に酸化させられるため、好ましい方法である。また、前記電位を印加するに際しては、前述したように作用極の電位を所定の電位に保持する方法の他、例えばサイクリックボルタンメトリー等によって、作用極の電位を時間経過に伴い変化させてもよい。作用極の電位を時間経過に伴って変化させる場合には、金属微粒子が酸化する電位の範囲内（例えば、銀塩化銀参照電極に対し＋０．８Ｖ〜＋２．０Ｖ）において、作用極の電位を変化させることが好ましい。さらに、金属微粒子に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位を作用極に複数回印加してもよい。
【００２０】
金属微粒子に含まれる金属を酸化させるに際しては、金属微粒子の量に応じて最適な電荷量を与えるように注意する必要がある。電荷量は電流を積分した値であるため、作用極に印加する電位が比較的低い電位であれば、金属微粒子に含まれる金属を十分に酸化させるためには当該電位を長時間印加する必要がある。一方、作用極に印加する電位が比較的高い電位であれば、金属微粒子に含まれる金属を十分に酸化させるために必要な時間は短時間でよい。
【００２１】
例えば、金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化させるに際して、金属微粒子に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位に作用極の電位を保持する場合には、前記電位の保持時間を３００秒以内とすることが好ましい。保持時間を適切とすることにより、作用極の表面に集めた金属微粒子に含まれる金属を完全に酸化させることができ、測定感度を確実に向上させることができる。前記電位の保持時間は、１秒以上３００秒以下とすることがより好ましい。保持時間を１秒以上とすることで金属の酸化を十分に行うことができる。前記電位の保持時間のさらに好ましい範囲は、１秒以上１００秒以下である。
【００２２】
なお、少なくとも作用極及び対極の表面にプロテインキナーゼの基質を固定化するとともに、金属微粒子を作用極及び対極の表面に集めた状態とした後、金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化させる前に、作用極に対して対極を正電位とする電位制御を行い作用極表面に金属を析出させてもよい。作用極上のみに基質ペプチドを固定化して作用極のみを反応場とし、作用極、対極及び参照電極が同一基板上に例えば印刷形成されたプレナー型デバイスを用いる場合、反応場である作用極の面積はデバイス自体の大きさ、対極面積及び参照電極の面積等に制限されるため、感度の向上には限界がある。これに対し、作用極と少なくとも対極との両方に基質ペプチドを固定化して反応場として利用し、且つ、少なくとも対極の表面に集められた金属微粒子を酸化溶出させ、泳動させて作用極表面に析出させた後、電気化学的酸化を行うことにより、作用極以外の領域に集められた金属微粒子についても電気化学的測定の対象となるので、より多くの金属微粒子が作用極の表面に集められたことになり、検出感度のさらなる向上が実現される。
【００２３】
前述のように作用極表面に金属を析出させる条件は使用する前記測定用の溶液により変わるが、例えば、作用極に対する対極の電位を＋１Ｖ〜＋２Ｖの範囲内とすることが好ましい。前記範囲内とすることにより、少なくとも対極の表面に集められた金属微粒子を確実に溶出させ、作用極上へ泳動させることができる。作用極に対する対極の電位は、金属微粒子が酸化する電位に所定時間保持してもよいし、金属微粒子が酸化する電位の範囲内で時間経過に伴って変化させてもよい。
【００２４】
次に、金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する工程を行い、得られた電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定するには、例えば、作用極の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、前述の電位制御により酸化溶出した金属が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。
【００２５】
酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。
【００２６】
作用極の電位制御及び還元電流測定の際に用いる溶液としては、金属微粒子に含まれる金属を容易に電気化学的に酸化させることができることから、酸性溶液を用いることが好ましい。酸性溶液としては、金属微粒子の種類等に応じて適宜選択すればよいが、例えば塩酸、硝酸、酢酸、リン酸、クエン酸、硫酸等を含む水溶液を用いることができる。金属微粒子の電気化学的酸化のし易さを考慮すると、中でも、０．０５規定〜１規定の塩酸水溶液を用いることが好ましい。
【００２７】
作用極の電位制御及び電気化学測定の際に用いる溶液としては、酸性溶液の他、塩素を含む中性溶液を用いることも可能である。塩素を含む中性溶液を用いることにより、酸性溶液を用いる場合に比べて大きな電流変化量が得られ、結果として、より高感度な測定が達成される。また、酸性溶液を用いる場合、例えば低電位側における還元ピークの裾が上昇する等のようにピーク形状が非対称となったり、例えば０．１Ｖ付近においてノイズが発生することがある。これに対して、塩素を含む中性溶液を用いることで、還元ピークの裾が平坦となるとともに、前記ノイズ発生が抑えられるので、還元ピーク強度検出が簡便となる。さらに、酸性溶液やアルカリ溶液のような取扱いの難しい溶液の使用を回避することができ、測定操作を安全且つ簡便に実施することができる。塩素を含む中性溶液としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ等を用いたときに前記の効果を得られるが、特にＫＣｌを用いたときに効果が大きい。
【００２８】
以下、本発明の第１の実施形態について説明する。本実施形態は、基質を固定化した作用極を用いて金属微粒子を作用極の表面に集め、阻害剤の共存下でプロテインキナーゼの酵素活性を測定するものである。
【００２９】
先ず、図１に示すように、プロテインキナーゼの基質ペプチド１を作用極１１の表面に固定化する。また、特異的結合対を形成する組合せの一方の分子として、ビオチンをγ−リン酸基に結合させたＡＴＰと、他方の分子としてストレプトアビジン２を結合させた金（Ａｕ）ナノ粒子３であるストレプトアビジンコート金ナノ粒子４とを用意する。
【００３０】
次に、プロテインキナーゼとビオチン化ＡＴＰとキナーゼ阻害剤と作用極１１に固定化した基質ペプチド１とを接触させ、これらを反応させる。プロテインキナーゼ活性がある場合には、図１上段に示すように、プロテインキナーゼ活性の強さに応じて基質ペプチド１はリン酸化され、ビオチン５が基質ペプチド１に結合する。反応後、作用極１１を洗浄し、未反応のＡＴＰ等を除去する。
【００３１】
次に、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４を作用極１１上に供給し、基質ペプチド１とストレプトアビジンコート金ナノ粒子４とを接触させる。基質ペプチド１を介してビオチン５が作用極１１に結合している場合、ビオチン５とストレプトアビジン３とが結合することにより、基質ペプチド１に金ナノ粒子３が結合し、作用極１１の表面に金ナノ粒子３が集められる。
【００３２】
次に、金ナノ粒子３を電気化学的に酸化する。例えば、参照電極に対する作用極１１の電位を、金ナノ粒子３に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。
【００３３】
金ナノ粒子３に含まれる金属を電気化学的に酸化させた後、電気化学的に還元する際に生じる電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。具体的には、例えば、作用極１１の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、図１上段に示すように前述の電位制御により酸化溶出した金が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。被検溶液に含まれるプロテインキナーゼ活性が強く、作用極１１の表面に集められた金ナノ粒子３が多いほど還元電流強度も大きくなることから、これに基づいてプロテインキナーゼの活性の強さを求めることができる。
【００３４】
一方、キナーゼ阻害剤によりプロテインキナーゼ活性が阻害されている場合や基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれていない場合等には、図１下段に示すように、酵素反応後においても作用極１１上の基質ペプチド１はプロテインキナーゼによりリン酸化されないので、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４は基質ペプチド１を標識しない。このため、電気化学検出を行ったとしてもシグナルは得られない。
【００３５】
以上のように、作用極１１の表面に基質ペプチド１を固定化することにより、作用極１１表面に集めた金属微粒子３中の金属の還元電流を指標としてプロテインキナーゼ活性を迅速、簡便且つ高感度に測定することができる。また、本実施形態においては、基質ペプチド１を予め作用極１１に固定化しておくので、酵素活性に応じた量の金属微粒子３を簡便且つ確実に作用極１１表面に集めることができる。
【００３６】
次に、本発明の第２の実施形態について説明する。本実施形態は、基質を固定化した磁気ビーズを用いて金ナノ粒子を作用極の表面に集め、プロテインキナーゼの酵素活性を測定するものである。本実施形態においては、反応時に基質が溶液中に拡散しているので、プロテインキナーゼの反応をより迅速に確実に進行させることができる。
【００３７】
先ず、図２に示すように、プロテインキナーゼの基質ペプチド１を磁気ビーズ２１に固定化する。また、第１の実施形態と同様に、特異的結合対を形成する組合せの一方の分子としてビオチンをリン酸基に結合させたＡＴＰと、他方の分子としてストレプトアビジン２を結合させた金（Ａｕ）ナノ粒子３であるストレプトアビジンコート金ナノ粒子４とを用意する。
【００３８】
次に、所定の容器内に満たした酵素反応溶液中で、プロテインキナーゼと、ビオチン化ＡＴＰと、磁気ビーズ２１に固定化した基質ペプチド１とを接触させ、これらを反応させる。基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれている場合には、図２上段に示すように、プロテインキナーゼ活性の強さに応じて基質ペプチド１はリン酸化され、ビオチン５が基質ペプチド１に結合する。
【００３９】
次に、前記反応溶液から前記磁気ビーズ２１を分離し、別の容器内で、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４と基質ペプチド１が固定化された磁気ビーズ２１とを接触させ、反応させる。基質ペプチド１を介してビオチン５が磁気ビーズ２１に結合している場合、ビオチン５とストレプトアビジン２とが結合することにより、基質ペプチド１を介して磁気ビーズ２１に金ナノ粒子３が結合する。
【００４０】
ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４を結合させた後、金ナノ粒子４と接触させた溶液から磁気ビーズ２１を分離して磁気ビーズ２１を作用極１１の表面に集めることにより、金ナノ粒子３を作用極１１の表面に集める。ビーズ担体として磁気ビーズを用いる場合、作用極１１の裏面に磁石を配置して磁気的な吸着力を利用することで、磁気ビーズに結合した金ナノ粒子を作用極表面に集める時間を短縮することができる。
【００４１】
次に、金ナノ粒子３に含まれる金属を電気化学的に酸化させる。例えば、参照電極に対する作用極の電位を、金ナノ粒子３に含まれる金属が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。
【００４２】
金ナノ粒子３に含まれる金属を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じる電流値を測定し、これを指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。具体的には、例えば、作用極の電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、図２上段に示すように前述の電位制御により酸化溶出した金属が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。被検溶液に含まれるプロテインキナーゼ活性が強く、作用極の表面に集められた金ナノ粒子３が多いほど還元電流強度も大きくなることから、これに基づいてプロテインキナーゼ活性を求めることができる。
【００４３】
一方、基質ペプチド１に対するプロテインキナーゼが含まれていない場合や、プロテインキナーゼ活性が完全に阻害されている場合等には、図２下段に示すように、金ナノ粒子３は基質ペプチド１を標識しないので、電気化学シグナルは得られない。
【００４４】
以上のように、磁気ビーズ２１に基質ペプチド１を固定化した場合も、酵素反応後に磁気ビーズ２１を作用極１１の表面に集めることで、第１の実施形態と同様にプロテインキナーゼ活性を迅速、簡便且つ高感度に測定することができる。
【００４５】
また、本実施形態においては、反応溶液中に懸濁することが可能な磁気ビーズ等のビーズ担体に基質を固定化するので、基質を固定化した作用極表面で反応させる場合に比較して反応効率を高めることができる。
【００４６】
以下、本発明の第３の実施形態について説明する。本実施形態は、作用極、対極及び作用極−対極間に基質を固定化し、電気化学的酸化の前に所定の電位操作を行う方法である。
【００４７】
先ず、図３に示すように、作用極１１、対極１２及び参照電極（図示は省略する）が同一の基板１３上に形成されたプレナー型電極デバイスを用意し、作用極１１と対極１２の両方に、プロテインキナーゼに対する基質ペプチド１を固定化する。また、基板１３のうち、作用極１１と対極１２とで挟まれる電極間領域１３ａ上にも基質ペプチド１を固定化する。作用極１１と対極１２とで挟まれる電極間領域１３ａ上にも基質ペプチド１を固定化することで、さらなる高感度検出が達成される。電極デバイス表面は、非特異吸着を防ぐためにブロッキングする。また、第１の実施形態と同様に、ビオチンをリン酸基に結合させたＡＴＰと、ストレプトアビジン２を金ナノ粒子３に結合させたストレプトアビジンコート金ナノ粒子４とを用意する。なお、作用極１１、対極１２及び参照電極は互いに近接した場所に存在していれば、必ずしも同一基板上に形成されていなくてもよい。
【００４８】
次に、第１の実施形態と同様に、プロテインキナーゼとビオチン化ＡＴＰと作用極１１及び対極１２等に固定化した基質ペプチド１とを接触させ、これらを反応させる。それから、第１の実施形態と同様に、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子４を作用極１１等に供給し、反応させる。基質ペプチド１を介してビオチン５が作用極１１に結合している場合、ビオチン５とストレプトアビジン２とが結合することにより、基質ペプチド１に金ナノ粒子３が結合し、作用極１１及び対極１２の表面に金ナノ粒子３が集められる。
【００４９】
次に、作用極１１、対極１２及び電極間領域１３ａの表面を必要に応じて洗浄した後、これらの表面を電気化学的測定用の溶液と接触させ、作用極１１に対して対極１２を正電位とする電位制御を行う。これにより、対極１２の表面に集められた金ナノ粒子３は酸化溶出し、溶液中を電気的に泳動する。また、作用極１１と対極１２との間に位置する電極間領域１３ａの表面に集められた金ナノ粒子３も、溶液中を電気的に泳動する。そして、作用極１１の表面に到達すると金６として析出する。この結果、反応に関与した全ての金ナノ粒子３が作用極１１の表面に集められることになる。
【００５０】
この後の工程は、前述した第１の実施形態と同様である。すなわち、金ナノ粒子３に含まれる金を電気化学的に酸化させ、次いで、金ナノ粒子３に含まれる金属を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じる電流値を測定し、これを指標としてプロテインキナーゼ活性を測定する。
【００５１】
以上のように、本実施形態によれば、作用極１１以外の少なくとも対極１２も反応場として利用するとともに、少なくとも対極１２の表面に集めた金ナノ粒子３を作用極１１表面へ移した後に、電気化学的な酸化と還元電流の測定を行うので、作用極１１の表面のみを反応場とする場合に比べてさらなる高感度化を実現することができる。また、少なくとも対極１２の表面に集められた金ナノ粒子３の作用極１１の表面への泳動は、作用極１１と対極１２との電位を制御するという簡便な操作で達成されるので、例えば溶液を撹拌するための機械的な構造は不要である。したがって、電極デバイス側の構造を変更することなく、また、極めて簡単な操作で高感度化を実現することができる。
【００５２】
なお、前述の第１の実施形態〜第３の実施形態においては、プロテインキナーゼの酵素活性を測定する方法を例に挙げて説明したが、プロテインキナーゼの活性を測定することにより、酵素反応の際に共存させた阻害剤の活性を間接的に測定することも可能である。また、プロテインキナーゼの活性化剤の存在下で酵素反応させ、プロテインキナーゼの活性を測定することにより、活性化剤の活性を間接的に測定することも可能である。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１＞
本実施例では、作用極の表面にプロテインキナーゼ（ｐ６０ｃ−Ｓｒｃ）の基質ペプチド（Ｒａｙｔｉｄｅ）を固定化した平板型印刷電極を用い、金属微粒子として、ストレプトアビジンでコートされた金ナノ粒子を用いてプロテインキナーゼの活性の測定を試みた。
【００５４】
１．基質固定化印刷電極の作製
基質の固定化は、作用極のカーボンペーストと高い親和性を有して強く吸着するリンカー分子（1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester）を介して行った。印刷電極の作用極上にリンカー分子を５ｍＭ含む無水ジメチルホルムアミド溶液を滴下して１時間インキュベートした。リン酸バッファーで洗浄後、アッセイバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）で規定濃度に調製した基質を印刷電極の作用極上に滴下し、一晩室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、１００ｍＭのエタノールアミンを３０分間適用し、電極表面のブロッキングを行った。このようにして調製した基質固定化印刷電極は４℃で保存した。
【００５５】
２．被検溶液中のキナーゼによるリン酸化
反応溶液として、１０μＬのキナーゼ溶液と１０μＬのＡＴＰ溶液とを混合して被検溶液を調製し、基質固定化印刷電極上に滴下し３０分間、３０℃でインキュベートした。反応は１０％ Ｈ３ＰＯ４溶液に浸して終了させ、０．５％ Ｈ３ＰＯ４溶液で洗浄し、乾燥させた。なお、前記キナーゼ溶液とは、任意濃度のキナーゼ（ｐ６０ｃ−Ｓｒｃ）と、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンと、０．２％β−メルカプトエタノールとを前記アッセイバッファー中に含むものである。また、前記ＡＴＰ溶液とは、１５０ｍＭのビオチン化ＡＴＰと、３０ｍＭのＭｇＣｌとを前記アッセイバッファー中に含むものである。
【００５６】
３．金ナノ粒子による標識
リン酸化された基質を金ナノ粒子で標識するために、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子を１０％ｖ／ｖ含む前記アッセイバッファー２０μＬを印刷電極上に滴下し、ゆっくり撹拌しながら１時間室温で反応させた。その後、洗浄、乾燥させた。
【００５７】
４．電気化学的測定
反応終了後の印刷電極に２０μＬの０．１ＭのＨＣｌを滴下し、印刷電極内の銀／塩化銀参照電極に対する作用極の電位を＋１．２Ｖとし、４０秒間保持した。
次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用極の電位を１Ｖから０Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス期間０．２秒、掃引速度０．０１Ｖ／ｓであった。電位に対する電流変化の特性図を図４に示した。図４より、＋０．５Ｖ付近に金の還元に伴う電流のピークが観察された。また、被検溶液中のキナーゼ活性と還元電流値との関係を図５に示す。これより、キナーゼ活性が高くなるにつれて電流値も増加することが示された。
【００５８】
５．プロテインキナーゼ阻害因子の検出
次に、反応溶液に任意濃度の阻害因子を添加し、プロテインキナーゼ活性と還元電流との関係について検討した。阻害因子の検出に際しては、任意の濃度の阻害因子を前述の反応溶液に添加し、さらにジメチルスルフォキシドを２％となるように添加した。４時間、３０℃でインキュベートし、前述の「２．被検溶液中のキナーゼによるリン酸化」と同様の方法で、反応を終了させ、洗浄、乾燥した後、金ナノ粒子による標識を行い、さらに電気化学的測定を行った。この結果、阻害因子の添加により測定電流値の低下が観察された。これより、前記方法により、阻害因子の検出が可能であることが示された。
【００５９】
＜実施例２＞
本実施例では、基質ペプチドを固定化した磁気ビーズを用いて、キナーゼ活性の測定を試みた。
【００６０】
１．基質固定化磁気ビーズの作製
１００μＬのカルボキシル化磁気ポリスチレンビーズを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、４００μＬのＰＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎを含む５０ｍＭリン酸バッファー）を加えて５分間撹拌した。洗浄後、１００μＬのＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl] carbodiimide
Hydrochloride）とＮＨＳ（N-Hydroxysuccinimide）を最終濃度が２ｍＭと５ｍＭになるようにＰＢＳ−Ｔを加えて１時間撹拌した。磁気ビーズを分離後、基質ペプチドのＰＢＳ−Ｔ溶液を、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、１時間撹拌した。その後、１００μＬのエタノールアミンを最終濃度が１００ｍＭとなるように添加して１時間インキュベートして、ビーズ表面をブロッキング、洗浄し、再び１００μＬ中のＰＢＳ−Ｔに縣濁させて基質固定化ビーズ溶液とした。
【００６１】
２．被検溶液中のキナーゼによるリン酸化
反応溶液として、１００μＬの任意濃度のキナーゼ（ｐ６０ｃ−Ｓｒｃ）、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、３ｍＭアミノフィリン、４ｍＭジチオスレイトール、０．０５ｍＭビオチン化ＡＴＰ、及び０．８３％カゼインを含む５０ｍＭのリン酸バッファー溶液を調製した。これに１００μＬの基質固定化磁気ビーズ溶液を加えて被検溶液とし、３０分間、３０℃でインキュベートした。反応は２５０μＬのトリクロロ酢酸を最終濃度が６．７５％になるように加えて終了させた。その後、被検溶液から磁気的にビーズを分離し、マイクロチューブ内に収集した。
【００６２】
３．金ナノ粒子による標識
リン酸化された基質を金ナノ粒子で標識するために、ストレプトアビジンコート金ナノ粒子を１０％ｖ／ｖ含む前記アッセイバッファー２０μＬをマイクロチューブに収集した磁気ビーズに滴下し、ゆっくり撹拌しながら１時間室温で反応させた。反応後、磁気的に磁気ビーズを収集し、洗浄後、１０μＬのリン酸バッファーに懸濁させた。
【００６３】
４．電気化学的測定
磁気ビーズ溶液を印刷電極上に滴下し、作用極の下に磁石を置いた状態で磁気ビーズを作用極上に集め、上澄を取り除き、０．１ＭのＨＣｌを２０μＬ滴下し、参照電極に対する作用極の電位を＋１．２Ｖとし、４０秒間保持した。
【００６４】
次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用極の電位を１Ｖから０Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス期間０．２秒、掃引速度０．０１Ｖ／ｓであった。実施例１の場合と同様に、＋０．５Ｖ付近に、金の還元に伴う電流のピークが観察された。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の第１の実施形態について説明するための模式図である。
【図２】本発明の第２の実施形態について説明するための模式図である。
【図３】本発明の第３の実施形態について説明するための模式図である。
【図４】実施例１で測定した電位に対する電流変化の特性図である。
【図５】実施例１で測定したプロテインキナーゼの活性と還元電流値との関係を示す特性図である。
【符号の説明】
【００６６】
１ 基質ペプチド、２ ストレプトアビジン、３ 金ナノ粒子、４ ストレプトアビジンコート金ナノ粒子、５ ビオチン、１１ 作用極、１２ 対極、１３ 基板、２１ 磁気ビーズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的結合対を形成する組合せの一方の分子が結合したＡＴＰとプロテインキナーゼと基質とを反応させる工程と、
前記プロテインキナーゼによるリン酸化によって前記一方の分子が結合した前記基質と、特異的結合対を形成する組合せの他方の分子が結合した金属微粒子とを接触させる工程と、
前記金属微粒子を作用極の表面に集めた状態で前記金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化する工程と、
前記金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する工程とを有し、
前記電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
前記基質は前記作用極に予め固定化されていることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
前記基質はビーズ担体に予め固定化されており、前記ビーズ担体を前記作用極の表面に集めることにより前記金属微粒子を前記作用極の表面に集めた状態とすることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
阻害剤又は活性化剤の存在下で前記ＡＴＰと前記プロテインキナーゼと前記基質とを反応させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項１】
特異的結合対を形成する組合せの一方の分子が結合したＡＴＰとプロテインキナーゼと基質とを反応させる工程と、
前記プロテインキナーゼによるリン酸化によって前記一方の分子が結合した前記基質と、特異的結合対を形成する組合せの他方の分子が結合した金属微粒子とを接触させる工程と、
前記金属微粒子を作用極の表面に集めた状態で前記金属微粒子に含まれる金属を電気化学的に酸化する工程と、
前記金属を電気化学的に還元する際に生じる電流値を測定する工程とを有し、
前記電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性を測定することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
前記基質は前記作用極に予め固定化されていることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
前記基質はビーズ担体に予め固定化されており、前記ビーズ担体を前記作用極の表面に集めることにより前記金属微粒子を前記作用極の表面に集めた状態とすることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【請求項４】
阻害剤又は活性化剤の存在下で前記ＡＴＰと前記プロテインキナーゼと前記基質とを反応させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１０２０８６（Ｐ２００８−１０２０８６Ａ）
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８６５２７（Ｐ２００６−２８６５２７）
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、ナノテク・先端部材実用化研究開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２０日（２００６．１０．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、ナノテク・先端部材実用化研究開発委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]