プロテインキナーゼＮベータの更なる使用
【課題】腫瘍形成及び癌の治療における治療的アプローチに適した標的を提供すること、および腫瘍形成及び転移に関係する治療薬剤の提供。
【解決手段】ＰＩ３−キナーゼ経路の下流の標的としての、好ましくはＰＩ３−キナーゼ経路の下流の薬物標的としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用。プロテインキナーゼＮベータは、特定配列による、又はデータバンクエントリーＰＩＤｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有する。
【解決手段】ＰＩ３−キナーゼ経路の下流の標的としての、好ましくはＰＩ３−キナーゼ経路の下流の薬物標的としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用。プロテインキナーゼＮベータは、特定配列による、又はデータバンクエントリーＰＩＤｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼＮベータの使用に関する。
【０００２】
現代の医薬品開発は、もはや多かれ少なかれ発見的アプローチに基づくのではなく、典型的には疾患又は症状に内在する分子機序の解明、候補標的分子の同定及び該標的分子の評価を必要とする。一旦このような有効な標的分子（本明細書では標的とも呼ばれる）が利用可能になれば、これに向けられた医薬品候補を試験することができる。多くの場合、このような医薬品候補は、合成又は天然化合物よりなる化合物ライブラリーのメンバーである。またコンビナトリアルライブラリーの使用も普及している。このような化合物ライブラリーは、本明細書では候補化合物ライブラリーとも呼ばれる。過去において、このアプローチは成功したことが判明しているが、なお時間と費用のかかることである。現在は標的の同定と標的の検証には種々の技術が適用されている。
【０００３】
今だ多くの腫瘍及び癌は、ヒトの健康に対する大きな脅威である。副作用の少ない、より安全で強力な医薬品を創出するために、適切な化合物に対処されると、その活性又は存在に特異的かつ選択的に影響を受ける標的分子について知ることが必要である。有力な又は候補の医薬品であるかもしれない化合物と標的との間の好ましくは選択的かつ特異的な相互作用のため、例えば、癌、腫瘍形成及び転移のような疾患又は病状における標的の機能は影響を受け、そのため疾患が治療又は予防され、そして病状が改善する。
【０００４】
したがって本発明に内在する問題は、腫瘍形成及び癌の治療における治療的アプローチに適した標的を提供することであった。腫瘍形成及び転移に関係する標的を提供することが、本発明に内在する更に別の問題であった。
【０００５】
本発明に内在する問題は、第１の態様において、ＰＩ３−キナーゼ経路の下流の標的としての、好ましくはＰＩ３−キナーゼ経路の下流の薬物標的としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用により解決される。
【０００６】
本発明に内在する問題は、第２の態様において、疾患の治療及び／又は予防用の医薬の製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【０００７】
本発明の第１及び第２の態様による使用の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータは、配列番号１による、又はデータバンクエントリーＰＩＤ ｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有する。
【０００８】
本発明に内在する問題は、第３の態様において、疾患の治療及び／又は予防のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸、又はその断片若しくは誘導体の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【０００９】
本発明の第３の態様による使用の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータは、配列番号１による、又はデータバンクエントリーＰＩＤ ｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有する。
【００１０】
本発明の第３の態様による使用の別の実施態様において、核酸は、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸である。
【００１１】
本発明の態様のいずれかによる使用の別の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータは、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸によりコードされる。
【００１２】
本発明の第３の態様による使用の好ましい実施態様において、核酸配列は、遺伝暗号の縮重を別にして、本発明の第３の態様にしたがう本発明の核酸にハイブリダイズする。
【００１３】
本発明の態様のいずれかによる使用の更に別の実施態様において、核酸配列は、ストリンジェントな条件下で、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸配列又はその一部にハイブリダイズする核酸配列である。
【００１４】
本発明の任意の態様による使用の好ましい実施態様において、該疾患に関係する細胞がＰＴＥＮ活性を欠いているか、攻撃的挙動の増大を示すか、又は後期腫瘍の細胞であることを特徴とすることを、この疾患は特徴とする。
【００１５】
本発明の第３の態様による使用の更に好ましい実施態様において、疾患は後期腫瘍である。
【００１６】
本発明に内在する問題は、第４の態様において、疾患の治療及び／又は予防用薬のスクリーニングのための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための方法（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）であって、以下：
ａ）候補化合物を用意する工程、
ｂ）プロテインキナーゼＮベータ用の発現系及び／又はプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系を用意する工程；
ｃ）候補化合物を、プロテインキナーゼＮベータ用の発現系及び／又はプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系と接触させる工程；
ｄ）プロテインキナーゼＮベータの発現及び／又は活性が、候補化合物の影響下で変化するかどうかを決定する工程
を含むことを特徴とする方法により解決される。
【００１７】
本発明の第４の態様による方法の実施態様において、候補化合物は、化合物のライブラリーに含まれる。
【００１８】
本発明の第４の態様による方法の別の実施態様において、候補化合物は、ペプチド、タンパク質、抗体、アンチカリン、機能性核酸、天然化合物及び低分子を含む化合物類の群から選択される。
【００１９】
本発明の第４の態様による方法の好ましい実施態様において、機能性核酸は、アプタマー、アプタザイム、リボザイム、スピーゲルマー（spiegelmer）、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡを含む群から選択される。
【００２０】
本発明の第４の態様による方法の更に別の好ましい実施態様において、プロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸は、本発明の任意の他の態様に関連して記載されるものである。
【００２１】
本発明に内在する問題は、第５の態様において、疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発及び／又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、標的分子としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸又はその一部若しくは誘導体の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００２２】
本発明の第５の態様による使用の実施態様において、医薬及び／又は診断薬は、抗体、ペプチド、アンチカリン、低分子、アンチセンス分子、アプタマー、スピーゲルマー及びＲＮＡｉ分子を含む群から選択される作用物質を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の第５の態様による使用の好ましい実施態様において、この作用物質は、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する。
【００２４】
本発明の第５の態様による使用の代替の実施態様において、この作用物質は、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と、特にプロテインキナーゼＮベータのｍＲＮＡ、ゲノム核酸又はｃＤＮＡと相互作用する。
【００２５】
本発明に内在する問題は、第６の態様において、疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチドの使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００２６】
本発明の第６の態様による使用の実施態様において、ポリペプチドは、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に対する抗体、及びプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に結合するポリペプチドを含む群から選択される。
【００２７】
本発明に内在する問題は、第７の態様において、疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００２８】
本発明の第７の態様による使用の実施態様において、核酸は、アプタマー及びスピーゲルマーを含む群から選択される。
【００２９】
本発明に内在する問題は、第８の態様において、疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００３０】
本発明の第８の態様による使用の実施態様において、相互作用する核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び／又はｓｉＲＮＡである。
【００３１】
本発明の第８の態様による使用の更に別の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡである。
【００３２】
本発明の第８の態様による使用の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータ及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸は、本発明の任意の態様に関連して記載されるものである。
【００３３】
本発明に内在する問題は、第９の態様において、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と、あるいはプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する低分子；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に特異的な抗体；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチド；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸；あるいはプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質、及び少なくとも１つの薬剤学的に許容しうる担体を含む、好ましくは疾患の予防及び／又は治療のための薬剤組成物により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００３４】
本発明に内在する問題は、第１０の態様において、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、疾患又は症状の特性解析のためのキットであって、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に特異的な抗体、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチド、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用するポリペプチド、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質、及び場合により少なくとも１つの他の化合物を含むことを特徴とするキットにより解決される。
【００３５】
驚くべきことに本発明者らは、ＰＫＮベータとも呼ばれるプロテインキナーゼＮベータが、癌及び腫瘍に関連して有用な標的であることを見い出した。更に詳細には、本発明者らは、プロテインキナーゼＮベータが、ＰＩ−３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の下流の標的であることを発見した。更に驚くべきことに本発明者らは、プロテインキナーゼＮベータが、腫瘍形成及び転移に関連していることを発見した。特に後者の作用は、サプレッサー機能、更に具体的にはＰＴＥＮ腫瘍サプレッサー機能の消失に強く関連していると考えられる。実施例において証明されるように、プロテインキナーゼＮベータは、ＰＩ−３キナーゼ経路に対するインヒビターであるＰＴＥＮが活性でない条件下でアップレギュレートされる。プロテインキナーゼＮベータのアップレギュレーションのため、このようなアップレギュレーションが起こる細胞は、転移挙動及び遊走挙動の増大を示す。これは、プロテインキナーゼＮベータのインヒビターが、細胞の転移及び遊走挙動を制御するのに適切な手段であること、並びにこれが腫瘍及び癌、更に詳細には転移性であり、かつその細胞が転移及び／又は遊走挙動を示す腫瘍及び癌（本明細書では一般に、「本明細書に記載される疾患」又は「本明細書に記載される病状」と呼ばれる）の治療に適切な手段であることを意味する。本明細書に記載される疾患並びに本明細書に記載される病状はまた、腫瘍形成及び転移を含むことを特徴とする。これは特に、本明細書に記載される疾患及び本明細書に記載される病状に適用されるが、ここでこのような疾患又は病状に関係する細胞は、ＰＴＥＮ陰性であって、そしてこのことは、腫瘍サプレッサーＰＴＥＮが活性でないか、又は活性のレベルが低下していることを意味する。これらの疾患はまた、ＰＩ３−キナーゼ経路が一般に関係している疾患も含む。特に転移性腫瘍のほかに、糖尿病が、それぞれこの種の疾患及び病状に属する。したがって、細胞、特に本明細書に記載される疾患又は病状に関係し、そしてＰＴＥＮ陰性である細胞は、その作用のモードが、それぞれ関係する細胞におけるプロテインキナーゼＮベータの活性を低下又は排除するものである、薬物による治療に感受性である。よって、その腫瘍が好ましくは過剰活性化ＰＩ３−キナーゼ経路（特に限定されないが、ＰＩ３−キナーゼ経路の遺伝子コード成分（ｐ１１０、Ａｋｔ）の増幅又は突然変異のいずれかを介する）を特徴とするか、又はＰＴＥＮ陰性である患者、あるいはＰＴＥＮ陰性である細胞（特にこれらの細胞が、本明細書に記載される疾患に、又は本明細書に記載される病状に関係しているならば）を有する患者は、有利には該薬物を用いて治療することができる。このような活性の低下は、転写レベル又は翻訳のレベル（即ち、プロテインキナーゼＮベータの酵素活性）での低下のいずれかに由来するだろう。何らかの学説に捕らわれるつもりはなく、後者の態様、即ち、プロテインキナーゼＮベータの活性を修飾することもまた、ＰＫＮベータの特性に関する本発明者らの洞察力（即ち、ＰＫＮベータの酵素活性もまた、アップ−及びダウン−レギュレート、好ましくはダウン−レギュレートすることができること）に由来する成果である。
【００３６】
該薬物を用いて有利に治療することができる患者の更に別の群は、ＰＴＥＮ機能の消失の発生率の高い癌、特に後期腫瘍に罹患している患者である（Cantley, L.C.とNeel, B.G. (1999) 「腫瘍抑制への新しい洞察：ＰＴＥＮはホスホイノシチド３−キナーゼ／ＡＫＴ経路を抑止することにより腫瘍形成を抑制する（New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway）」 Proc Natl Acad Sci USA 96, 4240-4245；Ali, I.U. (2000) 「子宮内膜のためのゲートキーパー：ＰＴＥＮ腫瘍サプレッサー遺伝子（Gatekeeper for endometrium: the PTEN tumor suppressor gene）」 J Natl Cancer Inst 92, 861-863 ）。ＰＴＥＮの消失は、各腫瘍細胞の攻撃的及び侵襲的挙動の増大に相関する。このため、本発明の好ましい実施態様において、プロテインキナーゼＮベータ又はこれをコードする核酸に向けられた、それぞれ、本発明の種々の態様に関連して分析道具又は手段としても使用することができる診断薬、並びに治療薬は、上述の前提条件が満たされれば、即ち、ＰＴＥＮが攻撃的及び侵襲的挙動の増大に相関すれば、任意の腫瘍に使用することができる。
【００３７】
この種の薬物は、本明細書に与えられる開示、即ち、プロテインキナーゼＮベータが下流の薬物標的であること、並びにプロテインキナーゼＮベータが腫瘍形成及び転移並びにこれらに関連するか又は由来する疾患の標的であることに基づいて、設計、スクリーニング又は製造することができる。
【００３８】
プロテインキナーゼＮベータが上に略述されるような機序に関係しているため、これはまた、ある細胞又はこの種の細胞を体内に有する患者の、それぞれ転移及び腫瘍形成を受けるかどうかの状態を診断するためのマーカーとして使用することができる。この種のアプローチが役立ち、この目的に適用可能な一例としては、例えば、ＩＣＡＭ−１がある。ＩＣＡＭ−１は、転移を受ける胃癌の予後において使用される（Maruo Y, Gochi A, Kaihara A, Shimamura H, Yamada T, Tanaka N, Orita K, Int J Cancer, 2002 Aug 1; 100(4): 486-490）が、ここでｓ−ＩＣＡＭ−１レベルは、肝転移した患者において上昇していることが判った。別の例では、オステオポンチンが、乳癌の予後マーカーとして使用される（Rudland PS, Platt-Higgins A, El-Tanani M, De Silva Rudland S, Barraclough R, Winstanley JH, Howitt R, West CR, Cancer Res. 2002 Jun 15; 62(12): 3417-3427）。プロテインキナーゼＮベータの存在又は存在のレベル（タンパク質又はｍＲＮＡ）又は活性のレベルが、マーカーとして使用される限り、プロテインキナーゼＮベータと多少とも特異的に相互作用する任意の化合物は、よって適切な診断薬になる。
【００３９】
いずれにせよプロテインキナーゼＮベータと特異的及び／又は選択的に相互作用する薬物及び診断薬の方法及び設計の原則は、以下に開示される。
【００４０】
これらの知見に照らして、キナーゼＮベータは、典型的にはＰＩ−３キナーゼ経路に関連する態様の一部だけ（即ち、転移及び遊走）の選択的調節、並びに典型的にはＰＩ３−キナーゼ経路に関連するプロセス（更に具体的には、転移及び遊走）の選択的かつ特異的な診断的アプローチ（即ち、検出）を可能にする、適切な下流の薬物標的であることが判明する。
【００４１】
ＰＩ３−キナーゼ経路は、増殖因子誘導に及ぼすＰＩ３−キナーゼ活性及び平行シグナル伝達経路（parallel signalling pathway）を特徴とする。細胞の増殖因子刺激は、細胞膜のその同種の受容体の活性化をもたらし、そして次にＰＩ３−キナーゼのような細胞内シグナル伝達分子と結合してこれを活性化する。ＰＩ３−キナーゼ（調節性ｐ８５及び触媒性ｐ１１０サブユニットからなる）の活性化により、リン酸化によりＡｋｔの活性化が起こり、これによって増殖、生存又は遊走のような更に下流の細胞応答を支持する。よってＰＴＥＮは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼ経路に関係しており、そして細胞増殖及び形質転換の調節におけるその役割について過去に広範に研究されてきた腫瘍サプレッサーである（総説については、Stein, R.C.とWaterfield, M.D. (2000) 「ＰＩ３−キナーゼ阻害：医薬品開発の標的？（PI3-kinase inhibition: a target for drug development?）」 Mol Med Today 6, 347-357；Vazquez, F.とSellers, W.R. (2000) 「ＰＴＥＮ腫瘍サプレッサータンパク質：ホスホイノシチド３−キナーゼシグナル伝達のアンタゴニスト（The PTEN tumor suppressor protein: an antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling）」 Biochim Biophys Acta 1470, M21-35；Roymans, D.とSlegers, H. (2001) 「腫瘍の進行におけるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression）」 Eur J Biochem 268, 487-498を参照のこと）。腫瘍サプレッサーＰＴＥＮは、ＰＩ３−キナーゼ触媒反応を逆転させることによりＰＩ３−キナーゼの負のレギュレーターとして機能し、これによって経路の活性化が一時的かつ制御下で起こることを保証する。ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の慢性過剰活性化は、ＰＴＥＮの機能性不活化により引き起こされる。ＰＩ３−キナーゼ活性は、低分子インヒビターのＬＹ２９４００２の添加によりブロックすることができる。平行経路において作用するシグナル伝達キナーゼＭＥＫの活性及び下流応答は、例えば、低分子インヒビターのＰＤ９８０５９により阻害することができる。
【００４２】
ＰＴＥＮ機能の消失によるＰＩ３−キナーゼ経路の慢性活性化は、腫瘍形成及び転移への主要な引き金であり、この腫瘍サプレッサーが、制御された細胞増殖の重要なチェックポイントであることを示している。ＰＴＥＮノックアウト細胞は、ＰＩ３−キナーゼ経路が、ＰＩ３−キナーゼの活性化型を介して慢性に誘導されている細胞と同様の特徴を示す（Di Cristofano, A., Pesce, B., Cordon-Cardo, C.及びPandolfi, P.P. (1998) 「ＰＴＥＮは、胚発生及び腫瘍抑制に必須である（PTEN is essential for embryonic development and tumour suppression）」 Nat Genet 19, 348-355；Klippel, A., Escobedo, M.A., Wachowicz, M.S., Apell, G., Brown, T.W., Giedlin, M.A., Kavanaugh, W.M.及びWilliams, L.T. (1998) 「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化は細胞周期エントリーに充分であり、発癌性形質転換に典型的な細胞変化を促進する（Activation of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic of oncogenic transformation）」 Mol Cell Biol 18, 5699-5711；Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S.及びFukui, Y. (1999) 「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化による腺癌の脱分化（Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation of phosphatidylinositol 3-kinase）」 Proc Natl Acad Sci USA 96, 4874-4879）。
【００４３】
ＰＴＥＮは、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ経路、Ａｋｔ経路、ＥＧＦ関連オートクリンループ及びｍＴＯＲ経路のような、ＰＴＥＮ関連経路とも呼ばれる幾つかの経路に関係する。ＰＩ３−キナーゼ経路とは実際、ＰＩ３−キナーゼを直接又は間接のいずれかで伴う任意の経路である。ＰＩ３−キナーゼは、このような経路においてインヒビター又はアクチベーターのいずれかとして作用することができるか、あるいはそれ自体、経路の他の要素により調節されることもある。
【００４４】
ＰＩ３−キナーゼ経路に関係する疾患及び症状を報告する豊富な先行技術が存在する。よってこれらの症状及び疾患のどれもが、本発明の方法及び薬物及び診断薬により対処することができ、その設計、スクリーニング又は製造法が本発明において教示される。限定ではなく説明のため、以下に言及される：子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、腺癌、子宮内膜増殖症、コーデン（Cowden's）症候群、遺伝性非ポリープ症性結腸直腸癌、リー・フラウメニ（Li-Fraumene's）症候群、乳癌卵巣癌（breast-ovarian cancer）、前立腺癌（Ali, I.U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, June 07, 2000, page 861-863）、バナヤン・ゾナナ（Bannayan-Zonana）症候群、ＬＤＤ（レルミット・デュクロス（Lhermitte-Duclos'）症候群）（Macleod, K., 上記文献）、狂牛病（ＣＤ）及びバナヤン・ルバルカバ・ライリー（Bannayan-Ruvalcaba-Riley）症候群（ＢＲＲ）を含む過誤腫−大頭蓋症、粘膜皮膚病変（例えば、毛根鞘腫）、大頭蓋、精神遅滞、胃腸過誤腫、脂肪腫、甲状腺腫、乳房線維嚢胞病、小脳異形成神経節細胞腫並びに乳房及び甲状腺の悪性腫瘍（Vazquez, F., Sellers, W.R., 上記文献）。
【００４５】
この点から見て、プロテインキナーゼＮベータは、プロテインキナーゼＮベータの上流の標的に対する他の薬物に比べて副作用の少ない薬物により対処することができる、ＰＩ３−キナーゼ経路の有用な下流の薬物標的である。その範囲において本発明は、例えば、ＬＹ２９４００２のような当該分野において知られている薬物よりも選択性が高い、薬剤学的に活性な化合物の設計、スクリーニング、開発及び製造に適した薬物標的を提供する。エフェクター分子のこの特定の部分、即ち、プロテインキナーゼＮベータ及びこの経路に関係する任意の他の下流の分子を支配することにより、このシグナル伝達カスケードにおける、その非常に限定された数の平行分岐又は更に別の上流の標的だけが、有害作用を引き起こすようである。したがって、細胞周期、ＤＮＡ修復、アポトーシス、ブドウ糖輸送、翻訳に関連するＰＩ−３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の他の活性は、影響を受けない。また、インスリンシグナル伝達は誘導されないが、これは、ＬＹ２９４００２の使用に関連して観察される糖尿病性応答又は他の副作用が実際に回避されることを意味する。ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニルクロモン）は、リリー研究実験室（Lilly Research Laboratories）（インディアナポリス）によりＰＩ−３Ｋのインヒビターとして開発された幾つかのクロモン誘導体の低分子インヒビターの１つである（Vlahosら 1994, JBC 269, 5241-5248）。これは、ＰＩ−３Ｋ分子の触媒サブユニットのｐ１１０を標的とし、触媒中心でのＡＤＰ結合と競合することにより機能する。しかし、ＬＹ２９４００２は、異なる細胞内機能を有することが示唆されている、ｐ１１０の種々のアイソホーム（アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ）を識別することができない。
【００４６】
プロテインキナーゼＮベータはまた、ラパマイシンにより対処されるｍＴＯＲの更に下流でもある。Ｒａｆｔ又はＦＲＡＰとしても知られている、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的（mammalian Target Of Rapamycin ））は、ＰＩ３−キナーゼの下流で作用して、細胞周期へのｐｐ７０ Ｓ６キナーゼ依存性エントリーのようなプロセスを調節する。ｍＴＯＲは、ｐｐ７０ Ｓ６キナーゼ及び開始因子４Ｅを活性化することにより翻訳を制御するために、増殖因子及び栄養利用性のセンサーとして作用する。ｍＴＯＲ機能は、Ｔ細胞及びある種の腫瘍細胞の増殖をブロックする、細菌性マクロライドのラパマイシンにより阻害される（KuruvillaとSchreiber 1999, Chemistry & Biology 6, R129-R136）。
【００４７】
ラパマイシンとその誘導体が、現在臨床で使用されている適切な薬物であるという事実は、薬物標的がより有用で、副作用が少ないほど、それが、例えば、Yuらにより証明されたように特定の分子機序に対して特異的であることを立証している（Yu, K.ら (2001) Endocrine-Relat Canc 8, 249）。
【００４８】
プロテインキナーゼＮベータは、全てがプロテイン−セリン／トレオニンキナーゼであると言われているプロテインキナーゼＣファミリーの一員である。典型的には、この種のプロテインキナーゼは、１つの調節サブユニットと１つの触媒サブユニットを含み、カルシウムイオンとリン脂質をコファクターとして利用する。ジアシルグリセロールは、この種のプロテインキナーゼファミリーのアクチベーターとして作用する。プロテインキナーゼＣファミリーのメンバーは、ホルモン又は神経伝達物質に関連する幾つかのシグナル伝達経路に関係している。これらのプロテインキナーゼは、リン酸化によりその標的タンパク質の活性を調節する。当該分野では、プロテインキナーゼＣの非生理的な連続した活性化により、癌の発生に至りかねない形質転換した細胞表現型が生じることが知られている。
【００４９】
ｍＲＮＡとしてのプロテインキナーゼＮベータの完全な配列は、データバンクで、例えば、アクセッション番号ｇｉ７０１９４８８又はＮＭ＿０１３３５５の下に利用可能である。遺伝暗号を用いて、このｍＲＮＡから特定のアミノ酸配列を推定することができる。また、プロテインキナーゼＮベータのアミノ酸配列は、データバンクでアクセッション番号ｇｉ７０１９４８９又はＮＰ＿０３７４８７．１の下に利用可能である。所望の効果が実現できる限り、これの誘導体又は切断型を本発明により使用できることは、本発明に含まれる。よって誘導体化及び切断の程度は、当業者であればルーチン分析により求めることができる。核酸配列については、上述のアクセッション番号により特定される核酸に、又は上述のアミノ酸配列から誘導することができる任意の核酸配列にハイブリダイズしている核酸配列もまた、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸配列という用語に含まれる。このようなハイブリダイゼーションは、当業者には公知である。このようなハイブリダイゼーションの特殊性は、Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. (1989) 「分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.）」 Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratoryから理解することができる。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、厳密条件下でのハイブリダイゼーションである。更に、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸はまた、上述の核酸配列のいずれかに相同な核酸配列である（ここで、相同の程度は、好ましくは７５、８０、８５、９０又は９５％である）。プロテインキナーゼＮベータに関連する更に別の参考文献は、特に、Shibata H.ら, J. Biochem. (Tokyo) 2001 Jul; 130(1): 23-31；Dong, LQ, Proc Natl Acad Sci USA, 2000, May 09; 97(10): 5089-5094；及びOishi, K., Biochem Biophys Res Commun. 1999, Aug. 11; 261(3): 808-814である。
【００５０】
ヒトプロテインキナーゼＮベータに対する相同体は、特に、ハツカネズミ（M. musculus）、ドブネズミ（R. norvegicus）、シロイヌナズナ（A. thaliana）、シー・エレガンス（C. elegans）、ディー・メラノガステル（D. melanogaster）及びサッカロミケス・セレビシエ（S. cerevisiae）に見い出すことができる。同一性パーセントと整列領域の長さは、前述の多様な種について、それぞれ、６７％と２７９アミノ酸、５１％と８６６アミノ酸、３８％と３０５アミノ酸、３６％と８６１アミノ酸、６３％と２９６アミノ酸及び４４％と３６２アミノ酸である。当業者であれば、このような相同体を用いて生成した薬物又は診断薬がヒトプロテインキナーゼＮベータ又は任意の他の所望のプロテインキナーゼＮベータとなおも相互作用するのでなければ、これらや他の相同体のいずれもが、原則として本発明の実施に適していると認めるであろう。
【００５１】
ヒトアミノ酸配列はまた、ＰｒｏｔＥＳＴ、アクセッション番号ｐｉｒ：ＪＣ７０８３（ここで、各プロテインキナーゼＮベータは、ＪＣ７０８３プロテインキナーゼと呼ばれる）から取ることができる。ヒトプロテインキナーゼＮベータの遺伝子は、ヒト９番染色体上に位置する。プロテインキナーゼＮベータのｃＤＮＡソースは、一般に幾つかの癌及び種々の胎児性又は胚性組織、更に具体的には、特に、胃癌、腺癌、脳腫瘍、乳癌、バーキット腫、リンパ腫、子宮頚癌、軟骨肉腫、結腸癌、胎児眼、胎児レンズ、胎児前眼部、胎児視神経、胎児網膜、胎児網膜中心窩、胎児黄斑、胎児脈絡膜、線維莢膜細胞腫、生殖細胞系、頭部、頚部、心臓、腎臓、大細胞癌、平滑筋肉腫、転移性軟骨肉腫、卵巣、副甲状腺、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞癌、扁平上皮癌、睾丸、及び子宮である。このリストから、本明細書に与えられた技術的教示によりそれぞれ設計、スクリーニング又は製造される、本明細書において医薬とも呼ばれる薬物、及び病期決定薬（即ち、罹患しているかもしれない疾患の病期に関して患者の状態を識別するために使用することができる作用物質）を含む、更には患者に適用された処置の有効性をモニターするための診断薬が、本明細書に開示される他の疾患及び本明細書に開示される病状のいずれかに加えて、これらの疾患又は特定の細胞、組織若しくは臓器に関係する任意の疾患の治療、予防、診断、予後及びモニターにも使用できることは自明である。これらの疾患及び病状もまた、「本明細書に記載される疾患」という用語に含まれるものとする。
【００５２】
本明細書に開示される驚くべき知見に照らして、プロテインキナーゼＮベータは、それ自体、本明細書に記載される種々の疾患及び病状の予防及び／又は治療用の医薬として、並びにそのような目的の医薬の製造のために、及び診断薬の製造のために使用することができる。
【００５３】
上記と同義のプロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体がそのまま医薬として使用される場合に、好ましくは天然のプロテインキナーゼＮベータに対する競合物質として使用され、よってその正常な生物学的機能を妨害する。この目的に使用されるプロテインキナーゼＮベータは、触媒として不完全であることが特に好ましい。この種のプロテインキナーゼＮベータは、それぞれ生物体及び細胞に適用できるか、又は遺伝子治療によって生物体及び各細胞に導入することができる。
【００５４】
それ自体が見込みある薬物であることを別にして、プロテインキナーゼＮベータは、そこに化学物質（薬物若しくは薬物候補として、又は診断薬として使用することができる）を向けられる化合物として使用することができる。これらの化学物質は、抗体、ペプチド、アンチカリン、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ並びに低分子のような、種々の化合物類に属する。この化合物は、物理的若しくは化学的実体としてのプロテインキナーゼＮベータそれ自体、又はプロテインキナーゼＮベータに関連する情報のいずれかを使用することにより、設計、選択、スクリーニング、生成及び／又は製造される。該化合物類の設計、選択、スクリーニング、生成及び／又は製造プロセスにおいて、プロテインキナーゼＮベータはまた、それを必要とする患者への各化合物の最終的な適用よりはむしろ、そのプロセスにおいて使用される標的と見なされよう。種々の化合物類を提供するプロセスにおいて、本明細書においてプロテインキナーゼＮベータとも呼ばれるタンパク質のプロテインキナーゼＮベータ、又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸のいずれかを使用することができる。本明細書において使用されるときプロテインキナーゼＮベータという用語は、同様にそれ自体医薬として又は診断薬として適用されると活性な、各分類の化合物の該化合物類の設計、選択、スクリーニング、生成及び／又は製造を可能にする、プロテインキナーゼＮベータの任意の断片又は誘導体を含む。本明細書において使用されるときプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸という用語は、上記と同義のプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸、又はその一部を含む、任意の核酸を含むものとする。プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸の一部は、同様にそれ自体医薬として又は診断薬として適用されると活性な、該化合物類の設計、選択、スクリーニング、生成及び／又は製造になお適している限り、そのようなものと見なされる。プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸は、ゲノム核酸、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はそれぞれの一部であってよい。
【００５５】
上に略述されるように、本明細書に記載される、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、あるいはその核酸配列を別にして、プロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸から生じる作用を生み出すか又は抑制するために、他の手段又は化合物も利用できるということは、本発明に含まれる。このような手段は、スクリーニング法で決定又は選択することができる。このようなスクリーニング法において、第１工程は、１つ又は幾つかのいわゆる候補化合物を用意することである。本発明において使用されるとき、候補化合物とは、その適合性が、本明細書に記載される種々の疾患及び本明細書に記載される病状を治療又は緩和するための試験系において試験されるか、あるいはこの種の疾患及び病状のための診断手段又は診断薬として利用される、化合物である。候補化合物が、試験系においてそれぞれの作用を示すならば、該候補化合物は、該疾患及び病状の治療に適した手段又は作用物質であり、原則としてその上に該疾患及び病状に適した診断薬である。第２工程において、候補化合物は、プロテインキナーゼＮベータ発現系又はプロテインキナーゼＮベータ遺伝子産物（好ましくはｈｎＲＮＡ若しくはｍＲＮＡのような各遺伝子発現産物）、又はプロテインキナーゼＮベータ活性系又はプロテインキナーゼＮベータと接触させる。プロテインキナーゼＮベータ活性系はまた、本明細書においてプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系とも呼ばれ、かつ／又は好ましくはその検出する系の意味でも活用できる。
【００５６】
プロテインキナーゼＮベータ発現系は、基本的にはプロテインキナーゼＮベータの発現を示すか又は表示する発現系（ここで、発現の程度又はレベルは基本的には変化させられる）である。好ましくは、プロテインキナーゼＮベータ活性系は、本質的には、プロテインキナーゼＮベータの発現というよりはむしろ活性又は活性の状態が測定される発現系である。あるいは、プロテインキナーゼ活性系は、その活性を測定することができるプロテインキナーゼＮベータ、又はプロテインキナーゼＮベータを提供するか若しくはこれを含む系である。これらの系のいずれかにおいて、候補化合物の影響下でプロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸の活性が、候補化合物なしの状況とは異なるかどうかが試験される。特定の系が発現系又は活性系のいずれであるかに関わらず、それぞれ活性及び発現の増大又は低下のいずれかが起こり、そして測定できることは本発明の範囲に含まれる。典型的には、発現系及び／又は活性系は、細胞抽出物又は核抽出物などの細胞抽出物の画分のようなインビトロ反応である。本明細書において使用されるときプロテインキナーゼＮベータ発現系はまた、細胞、好ましくは本明細書に記載される疾患及び本明細書に記載される病状に関係する組織又は臓器の細胞であってもよい。
【００５７】
活性系又は発現系に増大又は低下があるかどうかは、例えば、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸（更に具体的にはｍＲＮＡ）の量の増大又は低下、あるいは候補化合物の影響下で発現されるプロテインキナーゼＮベータの増大又は低下を測定することにより、発現の各レベルで決定することができる。測定、更に具体的にはｍＲＮＡやタンパク質などのこの種の変化の定量測定に必要な技術は、当業者には知られている。また、例えば、適切な抗体の使用による、プロテインキナーゼＮベータの量又は含量を測定するための方法も当業者には知られている。抗体は、当業者に知られているように、そして、例えば、Harlow, E.,とLane, D., 「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されるように作成することができる。
【００５８】
プロテインキナーゼＮベータ発現系の場合は、プロテインキナーゼＮベータの活性の増大又は低下は、好ましくは機能性アッセイにおいて測定することができる。
【００５９】
候補化合物と、それぞれ発現系及び活性系との接触は、通常候補化合物の水溶液を、一般に本明細書では試験系と呼ばれる各反応系に加えることにより実行される。水溶液の他に、有機溶媒中の候補化合物の懸濁液又は溶液も使用することができる。この水溶液は、好ましくは緩衝液である。
【００６０】
好ましくは、それぞれ発現系及び活性系を用いる各測定において、単一候補化合物だけを使用する。しかし、幾つかのこの種の試験を高速大量処理系で平行して実行することも本発明に含まれる。
【００６１】
本発明の方法における更なる工程は、候補化合物の影響下で、それぞれ発現系及び活性系の発現又は活性が、プロテインキナーゼＮベータ又はこれをコードする核酸に対応して変化するかどうかを求めることにある。典型的には、これは、候補化合物を加えた系の反応を候補化合物の添加なしのものに対して比較することにより行われる。好ましくは、候補化合物は、化合物のライブラリーの一員である。基本的には、化合物の分類に関わらず、化合物の任意のライブラリーが本発明の目的に適している。化合物の適切なライブラリーは、特に、低分子、ペプチド、タンパク質、抗体、アンチカリン及び機能性核酸よりなるライブラリーである。これらの化合物は、当業者に知られているように、そして本明細書で略述されるように生成することができる。
【００６２】
プロテインキナーゼＮベータのタンパク質又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸に特異的な抗体の製造法は、当業者には知られており、そして例えば、Harlow, E.,とLane, D., 「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。好ましくは、本発明に関しては、CesarとMilsteinのプロトコール及びこれに基づく更に別の成果により製造することができるモノクローナル抗体を使用することができる。本明細書において使用されるとき抗体は、特に限定されないが、プロテインキナーゼＮベータへの結合に適切であり、かつこれが可能である限り、完全な抗体、抗体断片又は誘導体（Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片及び１本鎖抗体など）を含む。モノクローナル抗体は別として、ポリクローナル抗体も使用及び／又は作成することができる。ポリクローナル抗体の作成もまた当業者には知られており、そして例えば、Harlow, E.,とLane, D., 「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。好ましくは、治療目的に使用される抗体は、ヒト化されているか、又は上記と同義のヒト抗体である。
【００６３】
本発明に使用することができる抗体には、１つ又は幾つかのマーカー又は標識があってもよい。このようなマーカー又は標識は、その診断応用又はその治療応用のいずれかにおいて抗体を検出するために有用であろう。好ましくはマーカー及び標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、金及びフルオレセインを含む群から選択され、そして例えば、ＥＬＩＳＡ法において使用される。これら及び更に別のマーカー並びに方法は、例えば、Harlow, E.,とLane, D., 「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。
【００６４】
また、この標識又はマーカーが、検出とは別に、他の分子との相互作用のような追加の機能を示すことも本発明に含まれる。このような相互作用は、例えば、他の化合物との特異的な相互作用であってよい。これら他の化合物は、ヒト又は動物体のような、抗体が使用される系に固有のもの、あるいは各抗体を用いることにより分析される試料のいずれかであってよい。適切なマーカーは、例えば、ビオチン又はフルオレセインであってよく、こうしてマーキング又は標識された抗体と相互作用するために、各化合物又は構造上に存在するアビジン及びストレプトアビジンなどのような、その特異的な相互作用パートナーを伴う。
【００６５】
プロテインキナーゼＮベータのタンパク質又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸を用いて作成することができる、更に別の分類の医薬並びに診断薬は、これに結合するペプチドである。このようなペプチドは、ファージディスプレイ法のような最先端の方法を用いることにより作成することができる。基本的には、ファージの形などでペプチドのライブラリーを作成して、この種のライブラリーを標的分子（本発明の場合には、例えば、プロテインキナーゼＮベータ）と接触させる。このような標的分子に結合しているペプチドは、次に各反応から、好ましくは標的分子との複合体として取りだす。当業者には、この結合性が、少なくともある程度は、塩濃度などのような具体的に実現した実験設定に依存することが知られている。高い親和性又は大きな力で標的分子に結合しているペプチドを、ライブラリーの非結合メンバーから分離後、そして場合により標的分子とペプチドとの複合体からの標的分子の除去後、各ペプチドは、次に性状解析することができる。性状解析の前に、場合により、例えばペプチドをコードするファージを増殖させることにより、増幅工程が実現される。性状解析は、好ましくは標的結合ペプチドの配列決定を含む。基本的には、ペプチドは、その長さにおいて限定されないが、好ましくは約８〜２０アミノ酸の長さを持つペプチドが、好ましくは各方法で得られる。ライブラリーのサイズは、約１０2〜１０18個、好ましくは１０8〜１０15個の異なるペプチドであろうが、これに限定されない。
【００６６】
標的結合ポリペプチドの具体的な形は、いわゆる「アンチカリン」であり、これは特に、ドイツ特許出願DE 197 42 706に記述されている。
【００６７】
本発明により、プロテインキナーゼＮベータのタンパク質並びにプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸は、本明細書に記載される疾患及び本明細書に記載される病状の治療用の医薬の製造又は開発、並びに該疾患及び該病状の診断のための手段の製造及び／又は開発の標的として、スクリーニングプロセス（このスクリーニングプロセスでは、低分子又は低分子のライブラリーが使用される）において使用することができる。このスクリーニングは、標的分子を単一の低分子又は同時に若しくは連続して種々の低分子（好ましくは上に特定されるライブラリーからの低分子）と接触させる工程、及び標的分子に結合する低分子又はライブラリーのメンバー（他の低分子を伴ってスクリーニングされるならば、非結合又は非相互作用低分子から分離することができる）を同定する工程を含むことを特徴とする。結合及び非結合が、具体的な実験設定により強く影響を受けることは認められよう。反応パラメーターの厳密性を調節することで、結合と非結合の程度を変化させ、よってこのスクリーニングプロセスの微調整を可能にすることができる。好ましくは、標的分子と特異的に相互作用する１つ又は幾つかの低分子の同定後、この低分子を更に性状解析することができる。この更なる性状解析は、例えば、低分子の同定、並びにその分子構造と、更なる物理的、化学的、生物学的及び／又は医学的特性の決定にある。好ましくは、天然化合物は、約１００〜１０００Daの分子量を有する。また好ましくは、低分子は、当業者に知られているリピンスキー（Lepinsky）の５の規則を満たすものである。あるいは、低分子はまた、好ましくは非合成である天然産物とは対照的に、好ましくはコンビナトリアルケミストリーから生じる、合成低分子であると定義することもできる。しかし、これらの定義は、当該分野における各用語の一般的な理解にとって補助的なものに過ぎないことに注意すべきである。
【００６８】
また、プロテインキナーゼＮベータ及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸を、アプタマー及びスピーゲルマー（これらは次に、医薬又は診断薬のいずれかとして、直接又は間接に使用することができる）の製造又は選択のための標的分子として使用することも本発明に含まれる。
【００６９】
アプタマーは、１本鎖又は２本鎖のいずれかであり、そして標的分子と特異的に相互作用するＤ−核酸である。アプタマーの製造又は選択は、例えば、ヨーロッパ特許EP 0,533,838に記載されている。基本的には以下の工程が実現される。第１に、核酸の混合物、即ち、潜在的アプタマー（ここで、各核酸は、典型的には数個、好ましくは少なくとも８個の連続ランダム化ヌクレオチドのセグメントを含む）を用意する。この混合物を次に、標的分子と接触させるが、ここで核酸は、候補混合物に比較すると、標的に対する増大した親和性に基づくか、又は標的に対する大きな力で、標的分子に結合する。結合核酸は、次に混合物の残りから分離する。場合により、こうして得られる核酸は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して増幅する。これらの工程は、数回繰り返すことができ、そして最後には標的に特異的に結合する核酸の比が増大した混合物（場合により最終的な結合核酸は、ここから選択される）が得られる。これらの特異的に結合する核酸は、アプタマーと呼ばれる。アプタマーの作成又は同定のための方法の任意の段階で、標準法を用いてその配列を決定するために、個々の核酸の混合物の試料を取ることができる。例えば、アプタマーの作成の当業者には知られている規定の化学基を導入することにより、アプタマーを安定化できることは、本発明に含まれる。このような修飾は、例えば、ヌクレオチドの糖残基の２’位へのアミノ基の導入にある。アプタマーは、治療薬として現在使用されている。しかし、こうして選択又は作成したアプタマーを、医薬（好ましくは、低分子に基づく医薬）の開発のための標的検証のために、及び／又はリード化合物として使用できることもまた、本発明に含まれる。これは、実際には、標的分子とアプタマーとの間の特異的相互作用が候補薬物により阻害される、競合アッセイにより行われるが、ここで、標的とアプタマーとの複合体からのアプタマーの置換により、各薬物候補が、標的とアプタマーとの間の相互作用の特異的な阻害を可能にすることが推定でき、そして相互作用が特異的であるならば、該候補薬物は、少なくとも原則として、標的をブロックするのに適しており、よってこのような標的を含む各系においてその生物学的利用能又は活性を低下させる。こうして得られる低分子は次に、毒性、特異性、生分解性及び生物学的利用能のような、その物理的、化学的、生物学的及び／又は医学的特性を最適化するために、更に誘導体化及び修飾に付すことができる。
【００７０】
プロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸を用いて、本発明により使用又は作成することができるスピーゲルマーの作成又は製造は、同様の原理に基づく。スピーゲルマーの製造は、国際特許出願WO 98/08856に記載されている。スピーゲルマーは、Ｌ−核酸であって、このことは、これらが、アプタマーがそうであるようにＤ−ヌクレオチドからなるアプタマーというよりは、Ｌ−ヌクレオチドからなることを意味する。スピーゲルマーは、生物学的系において非常に高い安定性を持ち、そしてアプタマーと肩を並べて、これらが向けられる標的分子と特異的に相互作用するという事実を特徴とする。スピーゲルマーの作成を目的に、Ｄ−核酸の異常生殖集団が創出され、この集団を標的分子の光学対掌体と（本発明の場合には、例えば、天然のプロテインキナーゼＮベータのＬ−エナンチオマーのＤ−エナンチオマーと）接触させる。次に、標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する。しかし、標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸は、分離し、場合により測定及び／又は配列決定し、続いてＤ−核酸から得られる核酸配列情報に基づいて、対応するＬ−核酸が合成される。標的分子の光学対掌体と相互作用する前述のＤ−核酸と、配列に関して同一であるこれらのＬ−核酸は、その光学対掌体とよりはむしろ天然の標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの作成のための方法と同様に、種々の工程を数回繰り返すこともでき、そうして標的分子の光学対掌体と特異的に相互作用する核酸を濃縮することができる。
【００７１】
プロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸に基づいて、本明細書に開示されている標的分子として製造又は作成することができる更に別の化合物類は、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡである。
【００７２】
本発明の場合にはプロテインキナーゼＮベータである翻訳産物のレベルでは標的分子と相互作用しないが、むしろ転写産物、即ち、ゲノム核酸や、又はそれぞれ対応するｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡのような、そこから誘導される任意の核酸のような、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸とは相互作用することは、全ての前述の核酸の共通の特色である。この限りでは、前述の化合物類の標的分子は、好ましくはプロテインキナーゼＮベータのｍＲＮＡである。
【００７３】
リボザイムは、好ましくは基本的に２つの残基を含むＲＮＡからなる、触媒活性核酸である。第１の残基は、触媒活性を示すが、これに対して第２の残基は、標的核酸、本発明の場合にはプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸との特異的相互作用を担当する。典型的にはハイブリダイゼーション及び２本のハイブリダイズする鎖上の本質的に相補的な塩基のストレッチのワトソン・クリック（Watson-Crick）塩基対形成により、標的核酸とリボザイムの第２の残基との間で相互作用すると、触媒活性残基が活性になるが、これは、分子内又は分子間のいずれかで、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性である場合は標的核酸を触媒することを意味する。続いて、標的核酸の更なる分解が起こり、そして最後には、新たに合成されるプロテインキナーゼＮベータの欠乏と事前に存在するプロテインキナーゼＮベータの代謝回転のために、標的核酸並びに該標的核酸から誘導されるタンパク質（本発明の場合には、プロテインキナーゼＮベータである）の分解に至る。リボザイム、その使用及び設計の原理は、当業者には知られており、そして例えば、DohertyとDoudna（「リボザイム構造と機序（Ribozym structures and mechanism）」, Annu ref. Biophys. Biomolstruct. 2001; 30: 457-75）及びLewinとHauswirth（「リボザイム遺伝子治療（Ribozyme Gene Therapy）」, Applications for molecular medicine. 2001 7:221-8）に記載されている。
【００７４】
それぞれ、医薬の製造のための、及び診断薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、同様のモードの作用に基づく。基本的には、アンチセンスオリゴは、塩基の相補性に基づき、標的ＲＮＡと、好ましくはｍＲＮＡとハイブリダイズすることにより、ＲＮアーゼＨを活性化する。ＲＮアーゼＨは、ホスホジエステル及びホスホロチオエート結合ＤＮＡの両方により活性化される。しかしホスホジエステル結合ＤＮＡは、ホスホロチオエート結合ＤＮＡを除いて、細胞内ヌクレアーゼにより急速に分解する。これらの抵抗性の非天然ＤＮＡ誘導体は、ＲＮＡとのハイブリダイゼーションによりＲＮＡアーゼＨを阻害しない。言い換えると、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ有効である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、特に、米国特許US 5,849,902及びUS 5,989,912に記載されている。言い換えると、本発明の場合にはプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸である、標的分子の核酸配列に基づいて、各核酸配列を原則として推定できる標的タンパク質から、又は核酸配列それ自体（特にｍＲＮＡ）を知ることにより、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基の相補性の原理に基づいて設計することができる。
【００７５】
特に好ましいのは、短いストレッチのホスホロチオエートＤＮＡ（３〜９塩基）を有するアンチセンス−オリゴヌクレオチドである。細菌ＲＮアーゼＨの活性化には最低３個のＤＮＡ塩基が必要であり、そして哺乳動物ＲＮアーゼＨ活性化には最低５個の塩基が必要である。このようなキメラオリゴヌクレオチドには、ＲＮアーゼＨの基質を形成する中心領域があって、これが、ＲＮアーゼＨの基質を形成しない修飾ヌクレオチドからなるハイブリダイズする「アーム（arm）」に隣接している。キメラオリゴヌクレオチドのハイブリダイズするアームは、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロなどにより修飾されていてもよい。代替アプローチでは、該アームにメチルホスホネート又はホスホラミデート結合を利用した。本発明の実施に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの更に別の実施態様は、Ｐ−メトキシオリゴヌクレオチド、部分的Ｐ−メトキシオリゴデオキシリボヌクレオチド又はＰ−メトキシオリゴヌクレオチドである。
【００７６】
本発明に特にふさわしくかつ有用なのは、上記２つの引用したUS特許に更に詳細に記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、天然の５’→３’結合ヌクレオチドを含まない。正確にはこのオリゴヌクレオチドには２つのタイプのヌクレオチドがある：２’−デオキシホスホロチオエート（ＲＮアーゼＨを活性化する）と２’−修飾ヌクレオチド（活性化しない）。２’−修飾ヌクレオチドの間の結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート又はＰ−エトキシホスホジエステルであってよい。ＲＮアーゼＨの活性化は、細菌ＲＮアーゼＨを活性化するための３〜５個の間の２’−デオキシホスホロチオエートヌクレオチドを含み、そして真核生物及び特に哺乳動物ＲＮアーゼＨを活性化するための５〜１０個の間の２’−デオキシホスホロチオエートヌクレオチドを含む、隣接ＲＮアーゼＨ活性化領域により達成される。分解からの保護は、５’及び３’末端塩基を高度にヌクレアーゼ抵抗性にすることにより、そして場合により３’末端ブロック基を配置することにより達成される。
【００７７】
更に詳細には、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端及び３’末端；並びに２’−修飾ホスホジエステルヌクレオチド及び２’−修飾Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチドよりなる群から独立に選択される、１１〜５９個の５’→３’結合ヌクレオチドを含むことを特徴とする（ここで、５’末端ヌクレオシドは、３〜１０個の間の隣接ホスホロチオエート結合デオキシリボヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性化領域に結合しており、そして該オリゴヌクレオチドの３’末端は、逆向きデオキシリボヌクレオチド、１〜３個のホスホロチオエート２’−修飾リボヌクレオチドの隣接ストレッチ、ビオチン基及びＰ−アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチドよりなる群から選択される）。
【００７８】
また、５’末端ヌクレオシドが、ＲＮアーゼＨ活性化領域に結合していないが、３’末端ヌクレオシドは上に特定されているとおりのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してもよい。また、５’末端は、該オリゴヌクレオチドの３’末端というよりはむしろ特定の基から選択される。
【００７９】
適切かつ有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、５’末端ＲＮアーゼＨ活性化領域を含み、そして５〜１０個の間の隣接デオキシホスホロチオエートヌクレオチド；１１〜５９個の間の隣接５’→３’結合２’−メトキシリボヌクレオチド；並びに非５’−３’−ホスホジエステル結合ヌクレオチド、１〜３個の隣接５’−３’結合修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチド化学ブロック基よりなる群から引き出される、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在するエキソヌクレアーゼブロック基を有するものである。
【００８０】
２つの分類の特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のように特徴付けることができる：
【００８１】
本明細書では第２世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、第１の分類のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’→３’方向に７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチ、９個の２’−デオキシリボヌクレオチドのストレッチ、６個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチ及び３’末端の２’−デオキシリボヌクレオチドを含む、全部で２３個のヌクレオチドを含む。第１群の７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから、最初の４個はホスホロチオエート結合しているが、一方で次の４個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドは、ホスホジエステル結合している。また、最後の（即ち、最も３’末端の）２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと９個の２’−デオキシリボヌクレオチドよりなるストレッチの最初のヌクレオチドとの間にはホスホジエステル結合が存在する。全ての２’−デオキシリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合している。また最後の（即ち、最も３’末端の）２’−デオキシヌクレオチドと６個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドよりなるその次のストレッチの最初の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの間にもホスホロチオエート結合が存在する。６個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのこの群から、その最初の４個（再度５’→３’方向に）は、ホスホジエステル結合しているが、一方で、２０〜２２位に相当するその最後の３個は、ホスホロチオエート結合している。最後の（即ち、末端の３’末端の）２’−デオキシヌクレオチドは、最後の（即ち、最も３’末端の）２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに、ホスホロチオエート結合を介して結合している。
【００８２】
この第１の分類はまた、以下の概略構造を参照することにより説明することができる：ＲＲＲｎｎｎｎＮＮＮＮＮＮＮＮＮｎｎｎＲＲＲＮ。ここで、Ｒは、ホスホロチオエート結合した２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）を示し；ｎは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）を表し；Ｎは、ホスホロチオエート結合したデオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）を表す。
【００８３】
本明細書では第３世代（の）アンチセンスオリゴヌクレオチド又はジーンブロック（GeneBlocs）とも呼ばれる、特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの第２の分類はまた、以下の基本構造を持つ全部で１７〜２３個のヌクレオチドを含む（５’→３’方向に）。
【００８４】
５’末端には、エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を与えるのに適した構造であり、そして例えば、WO 99/54459に記載されている、逆向きの塩基脱落ヌクレオチドが存在する。この逆向きの塩基脱落配列は、ホスホジエステル結合している５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチに結合している。この５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチに続いて、全てがホスホロチオエート結合している７〜９個の２’−デオキシリボヌクレオチドのストレッチが存在する。最後の（即ち、最も３’末端の）２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと、２’−デオキシヌクレオチド含有ストレッチの最初の２’−デオキシヌクレオチドとの間の結合は、ホスホジエステル結合を介して生じる。７〜９個の２’−デオキシヌクレオチドのストレッチに近接して、５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドよりなるストレッチが連結している。最後の２’−デオキシヌクレオチドは、５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドよりなる最後に言及したストレッチの最初の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して結合している。５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチは、ホスホジエステル結合している。５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの第２のストレッチの３’末端には、別の逆向きの塩基脱落配列が結合している。
【００８５】
この第２の分類はまた、以下の概略構造を参照することにより説明することができる：（ジーンブロック（GeneBlocs）は、これも以下の概略構造を有する第３世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドを表す：）ｃａｐ−（ｎp）x（Ｎs）y（ｎp）z−ｃａｐ又はｃａｐ−ｎｎｎｎｎｎｎＮＮＮＮＮＮＮＮＮｎｎｎｎｎｎｎ−ｃａｐ。ここで、ｃａｐは、両方の末端の逆向きのデオキシ塩基脱落又は同様の修飾を表し；ｎは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）を表し；Ｎは、ホスホロチオエート結合したデオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）を表し；ｘは、５〜７の整数を表し；ｙは、７〜９の整数を表し；そしてｚは、５〜７の整数を表す。
【００８６】
整数ｘ、ｙ及びｚは、ｘ及びｚが所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて同一であることが好ましいのではあるが、相互に独立に選択できることに注意すべきである。したがって、第３世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドの下記基本的設計又は構造は、以下のとおりであってよい：ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）7（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）7（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）7（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）8（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）8（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）8（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）9（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）9（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）9（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）7（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）7（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）7（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）8（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）8（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）8（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）9（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）9（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）9（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）7（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）7（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）7（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）8（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）8（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）8（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）9（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）9（ｎp）7−ｃａｐ及びｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）9（ｎp）7−ｃａｐ。
【００８７】
本明細書に与えられた技術的教示に基づいて作成でき、そして医薬及び／又は診断薬として使用できる、更に別の化合物類は、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸（好ましくはｍＲＮＡ）に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、典型的には約２１〜約２３個のヌクレオチドの長さを有する２本鎖ＲＮＡである。２本のＲＮＡ鎖の一方の配列は、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸のような、分解すべき標的核酸の配列に対応する。言い換えると、標的分子（本発明の場合にはプロテインキナーゼＮベータ）の核酸配列（好ましくはｍＲＮＡ配列）を知れば、該（例えば）プロテインキナーゼＮベータのｍＲＮＡに相補的な２本鎖の一方により、２本鎖ＲＮＡを設計することができ、そしてプロテインキナーゼＮベータをコードする遺伝子、ゲノムＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ又はｍＲＮＡを含む系への該ｓｉＲＮＡの適用により、各標的核酸は分解し、そして各タンパク質のレベルは低下する。それぞれ医薬及び診断薬として、該ｓｉＲＮＡを設計、構築及び使用する基本原理は、特に、国際特許出願WO 00/44895及びWO 01/75164に記述されている。
【００８８】
前述の設計原理に基づいて、一旦プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸配列が判れば、それぞれこのようなｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムを作成することができる。これはまた、ゲノム核酸を含む、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのような核酸の前駆分子にも当てはまる。当然ながら、各アンチセンス鎖を知ることによっても、塩基対相補性の基本原理（好ましくはワトソン・クリック塩基対形成に基づく）を前提として、このような核酸型化合物の設計は可能であろう。したがって、本発明の更に別の態様は、プロテインキナーゼＮベータに対するか、又はこれに特異的な、特定のｓｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンスヌクレオチドに関する。以下において、このことは、ｓｉＲＮＡにより更に説明されるが、当業者には受け入れられるであろうように、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイムにも同様に適用される。
【００８９】
このようなｓｉＲＮＡは、好ましくは１５〜２５個のヌクレオチドの長さであるが、これは実際には、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチドを含む任意の長さを意味する。更に別の実施態様において、ｓｉＲＮＡは、更に多くのヌクレオチドを示すことさえあろう。当該分野において周知の設計原理により、各ｓｉＲＮＡを作成することができる。したがって、本明細書において特許請求されるｓｉＲＮＡは、好ましくは、ＰＫＮ−ベータをコードするセンス若しくはアンチセンス鎖のいずれかに少なくとも部分的に相補的な、１５〜２５個の連続ヌクレオチドの任意のヌクレオチド長さのストレッチ、及び第１の鎖に（よってプロテインキナーゼＮベータをコードする、それぞれアンチセンス鎖及びセンス鎖に）少なくとも部分的に相補的な、第２のリボヌクレオチド鎖を含む。この種の２本鎖構造には、ｓｉＲＮＡの作成又は製造の当該分野において知られている任意の設計原理を適用することができる。本明細書に開示されるｓｉＲＮＡ空間は、そのアンチセンス鎖が、上に特定されているＰＫＮ−ベータをコードする配列のヌクレオチド番号１に相当するヌクレオチドから出発する、ｓｉＲＮＡ分子を含む。更にこのようなｓｉＲＮＡ分子は、上に特定されているＰＫＮ−ベータをコードする配列のヌクレオチド番号２に相当するヌクレオチドなどから出発する。ＰＫＮ−ベータをコードする配列にわたるこの種の走査は、ＰＫＮ−ベータに向けることができる、全ての可能なｓｉＲＮＡ分子を提供するために繰り返される。こうして作成される任意のｓｉＲＮＡ分子の長さは、ｓｉＲＮＡに適した任意の長さ、更に具体的には上に特定されている任意の長さであってよい。好ましくは、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡ分子空間の種々のｓｉＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖又はセンス鎖の最も５’末端のヌクレオチドを除いて重複する。こうして得られるアンチセンス配列が、少なくとも部分的には、機能的に活性なｓｉＲＮＡに必要とされる２本鎖構造を形成するために、塩基対形成により相補鎖形成する必要があることは明らかである。
【００９０】
抗体、ペプチド、アンチカリン、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド並びにｓｉＲＮＡのような、前述の化合物類の作用のモードに基づいて、それぞれプロテインキナーゼＮベータ及びこれをコードする核酸を標的とするこれらの化合物のいずれかを、本明細書に記載される疾患のいずれか及び本明細書に記載される病状のいずれかのための医薬又は診断薬の製造に使用することも本発明に含まれる。更に、これらの作用物質は、それぞれ、該疾患及び病状の進行、及び適用される任意の治療の成功をモニターするために使用することができる。
【００９１】
抗体、ペプチド、アンチカリン、低分子、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡのような本発明により設計される種々の化合物類はまた、薬剤組成物に含ませることができる。好ましくはこのような薬剤組成物は、本明細書に記載される疾患又は本明細書に記載される病状の治療に使用される。この薬剤組成物は、ある実施態様では、１つ又は幾つかの前述の化合物類及び／又は単一分類の１つ以上のメンバーと、場合により更に別の薬剤活性化合物、及び薬剤学的に許容しうる担体とを含むことができる。このような担体は、液体又は固体のいずれか、例えば、溶液、緩衝液、アルコール性溶液などであってよい。適切な固体担体は、特に、デンプンなどである。経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内などのような、具体的な経路の投与を実現するための、前述の化合物類の種々の化合物用の各処方を提供することは、当業者には知られている。
【００９２】
上述の様々な化合物類の種々の化合物はまた、単独又は組合せて、キットに従属させるか、又はキットに含ませることができる。このようなキットは、各化合物とは別に、更に１つ又は幾つかの更に別の要素又は化合物を含む（ここで、要素は、緩衝剤、陰性対照、陽性対照及び種々の化合物の使用に関する指示書を含む群から選択される）。好ましくは、種々の化合物は、乾燥又は液体の形のいずれかで、好ましくはそれぞれ単回投与のための単位用量として存在する。このキットは、本明細書に記載される疾患及び病状に関して、治療、診断又は疾患の進行若しくは適用療法のモニターのために使用することができる。
【００９３】
本発明は、以下の図面と実施例により今から更に説明されるが、これらは、保護の範囲を限定するものではない。該図面及び実施例から、更なる特色、実施態様及び利点を受け取ることができる：
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ＰＩ３−キナーゼ経路の増殖因子誘導活性化の概略図を示す；
【図２】図２は、ラパマイシンでの処置後の同所性ＰＣ−３マウスモデルにおけるリンパ節転移の測定を示す；
【図３】図３は、ＰＩ３−キナーゼ経路の下流の薬物標的としてＰＫＮベータを同定するための実験的アプローチを示す；
【図４】図４は、ＰＫＮベータでの第１次ジーンブロック（GeneBloc）スクリーニングを示す；
【図５】図５は、マトリゲル上でのＰＫＮベータ特異的ＧＢでトランスフェクトしたＰＣ３細胞の増殖を示す；
【図６】図６は、ＨｅＬａＢ細胞におけるｓｉＲＮＡの一過的発現によるＲＮＡ干渉を示す；
【図７】図７は、プローブとしてプロテインキナーゼＮベータのアンチセンス及びセンス配列を使用するハイブリダイゼーションに際してのヒト前立腺細胞及びヒト前立腺癌細胞の写真を示す；
【図８】図８は、２つの異なるｓｉＲＮＡ構築体を用いた同所性前立腺腫瘍モデルにおける原発性腫瘍の容量を描く線図（図８Ａ）、２つの異なるｓｉＲＮＡ構築体を用いた同所性前立腺腫瘍モデルにおけるリンパ節転移の容量を描く線図（図８Ｂ）、並びに対照ｓｉＲＮＡ（図８Ｃ１）及びプロテインキナーゼＮベータ特異的ｓｉＲＮＡ構築体（図８Ｃ２）を用いた同所性前立腺腫瘍モデルにおける前立腺及びリンパ節の写真を示す；
【図９】図９は、ＨｅＬａ細胞における一過性過剰発現での標準リン酸化基質としてＭＰＢを、そしてキナーゼ誘導体の相対発現レベルを検出するために抗プロテインキナーゼＮベータ抗体（抗ＰＫ）を使用する、種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体及びこれらの活性のウェスタンブロット分析（図９Ａ）、プロテインキナーゼＮベータのリン酸化型に特異的な抗体を使用する種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体の更に別のウェスタンブロット分析（図９Ｂ）、並びに使用した種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体の概略図（図９Ｃ）を示す；
【図１０】図１０は、ＨｅＬａ細胞でのその発現レベルをモニターするための種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体のウェスタンブロット（図１０Ａ）及びプロテインキナーゼＮベータ誘導体のリン酸化のゲル分析（図１０Ｂ）を示す；
【図１１】図１１は、ウェスタンブロッティングによりそのリン酸化型（図１１Ａ）を、又はオートラジオグラフィーにより32Ｐ標識リン酸の取り込み（図１１Ｂ）を検出する、プロテインキナーゼＮベータのタンパク質基質のリン酸化を検出するための免疫沈降アッセイの結果を示す。各免疫沈降物中に同程度の量のＰＫＮベータが存在することを保証するために、図１１Ａに示されるフィルターを抗ＰＫＮベータ抗体を用いて再精査した（「キナーゼ」、図１１Ｃ）。
【図１２】図１２は、ＨｅＬａ及びＰＣ−３細胞中で異なる時点でＬＹ２９４００２で処理した試料中の、内因性プロテインキナーゼＮベータの発現を対比するウェスタンブロット分析を示す。ＰＩ３−キナーゼインヒビターの効力を確認するために、リン酸化ＡＫＴのレベルを平行してモニターした。
【図１３】図１３は、免疫複合体中に存在する種々の組換えＰＫＮベータ誘導体の相対タンパク量及びキナーゼ活性を示す。各組換えタンパク質を発現する細胞は、表示された時間の細胞溶解の前にＰＩ３−キナーゼインヒビターのＬＹ２９４００２で処理してある。
【図１４】図１４は、写真のパネルを示すが、ここで、ＰＫＮベータ野生型（図１４Ａ）、ＰＫＮベータ誘導体ＴＡ（図１４Ｂ）、ＰＫＮベータ誘導体ＫＥ（図１４Ｃ）及びＰＫＮベータ デルタＮ（図１４Ｄ）のような、ＰＫＮベータ及びその誘導体の細胞内分布は、共焦点蛍光顕微鏡法により調査した。ＨＡ標識したＰＫＮベータの組換え誘導体は、ＨｅＬａ細胞で４８時間一過性発現させた。固定及び透過性化後、組換えタンパク質の発現は、抗ＨＡ抗体と、続いてＦＩＴＣ結合抗マウス抗体を用いて検出した。細胞は、細胞骨格アクチンをローダミン−ファロイジンで標識することにより対比染色した。
【００９５】
図１は、ＰＩ３−キナーゼ経路の増殖因子誘導活性化の概略図を示す。細胞の増殖因子刺激により、細胞膜でその同種の受容体の活性化が起こり、そして次にこれがＰＩ３−キナーゼのような細胞内シグナル伝達分子に結合してこれを活性化する。腫瘍サプレッサーのＰＴＥＮは、ＰＩ３−キナーゼ介在性の下流の応答を妨げて、この経路の活性化が一過性に起こることを保証する。ＬＹ２９４００２は、ＰＩ３−キナーゼの低分子インヒビターである。ＰＩ３−Ｋの既知の下流遺伝子の１つは、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）であり、これは臨床的に承認された薬物のラパマイシン（ラパミューン（Rapamune））により阻害することができる。ＰＩ３−Ｋは、細胞増殖、細胞生存、ブドウ糖輸送、翻訳、転移及び遊走の調節に関係する。Ｘは、下流のエフェクターを示しており、これは、癌細胞の転移挙動を促進することに関係していると予測される、見込みある薬物標的を表す。この経路の更に下流で作用するこの分類のエフェクター分子は、多面発現作用が少ないため、ｍＴＯＲのような「上流」の標的よりも良い薬物標的になりそうである。
【００９６】
図２〜図５の主題は、以下の実施例に関連して更に詳細に考察される。
【００９７】
図６は、ＨｅＬａＢ細胞中でのｓｉＲＮＡの一過性発現による干渉を示す。
【００９８】
（Ａ）ｓｉＲＮＡ分子は、標的特異的配列（２１量体のセンス配列と１２量体ポリＡストレッチが結合した逆進相補配列とを含む、目的の遺伝子から誘導された鋳型）のプロモーター（Ｕ６＋２）による発現によって作成された。転写によりＲＮＡは２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成するようである。
【００９９】
（Ｂ）ｓｉＲＮＡ発現のための標的遺伝子の鋳型配列。対応する配列は、Ｕ６＋２プロモーターカセットを持つ発現ベクターに導入した。
【０１００】
（Ｃ）細胞増殖及び繁殖に及ぼすｓｉＲＮＡ発現の効果。構築体（上記を参照のこと）は、ＲＮＡｉ干渉実験のためのＨｅＬａＢ細胞へのトランスフェクションにより一過性発現した。細胞は、トランスフェクションの４８時間後に回収して、続いて「マトリゲル（matrigel）」ゲルに接種（１ウェル当たり８００００細胞）した。対応する遺伝子の発現に及ぼすＲＮＡ干渉の作用は、トランスフェクトした細胞をマトリゲル上での増殖／繁殖についてアッセイすることにより分析した。ＰＴＥＮを標的としたｓｉＲＮＡの発現は、マトリゲル上のＨｅＬａＢ細胞増殖に影響しなかった（右のパネル）が、一方ｐ１００ベータ及びＰＫＮベータに特異的なｓｉＲＮＡの発現は、マトリゲル上のＨｅＬａＢ増殖の挙動を深刻に妨げた（中央及び右のパネル）。
【０１０１】
実施例１：材料と方法
細胞培養
ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＣＳ）、ゲンタマイシン（５０μg/ml）及びアンフォテリシン（５０ng/ml）を含む、Ｆ１２Ｋ栄養混合液（Nutrient Mixture）（カイン（Kaighn）の改変液）で培養した。トランスフェクションは、９６ウェルで、又は１０cmプレート（３０％〜５０％コンフルエンシー）で、オリゴフェクタミン（Oligofectamine）、リポフェクタミン（Lipofectamine）（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））、アルグフェクチン５０（Argfectin50）若しくはプロフェクチン５０（Profectin50）（アトゥゲン（Atugen）／ＧＯＴ、ベルリン、ドイツ）、又はフュージーン６（FuGene 6）（ロシュ（Roche））のような種々のカチオン性脂質を製造業者の指示書により用いることによって行った。ジーンブロック（GeneBlocs）は、前もって生成した無血清培地中のジーンブロックと脂質との５×濃縮複合体を、完全培地中の細胞に加えることによりトランスフェクトした。全トランスフェクション容量は、９６ウェルに塗布した細胞には１００μl、そして１０cmプレートの細胞には１０mlとした。最終脂質濃度は、細胞密度に応じて０．８〜１．２μg/mlであった。；ジーンブロック濃度は、各実験に示す。
【０１０２】
培養細胞は、トリプシン処理して、培地によりトリプシン作用を停止させてから回収した。洗浄手順（ＰＢＳ；遠心分離５分間／１，０００rpm）を追加して、接種すべき細胞数と容量を考えながら、最後にペレットを再懸濁する。
【０１０３】
タックマン（Taqman）分析によるＲＮＡレベルの相対量の測定。
９６ウェル中でトランスフェクトした細胞のＲＮＡを単離して、インビソルブ（Invisorb）ＲＮＡ ＨＴＳ９６キット（インビテック社（InVitek GmbH）、ベルリン）を用いて精製した。ＰＫＮベータｍＲＮＡ発現の阻害は、３００nM ＰＫＮベータ５’プライマー、３００nM ＰＫＮベータ３’プライマー及び１００nMのＰＫＮベータ・タックマン・プローブの標識ファム・タムラ（Fam-Tamra）を用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（タックマン）分析により検出した。反応は、５０μl中で行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出器（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））で製造業者の指示書により以下の条件下でアッセイした：４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒と６０℃で１分。
【０１０４】
マトリゲルマトリックス上でのインビトロ増殖。
ＰＣ３細胞は、マトリゲルに接種したとき、５μM ＬＹ２９４００２又はＤＭＳＯで処理した。接種の前に細胞をトランスフェクトするならば、細胞は、ジーンブロックでトランスフェクトして、トランスフェクションの４８時間後にトリプシン処理した。細胞は、培地中で洗浄して、２５０μlマトリゲル基底膜マトリックス（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））で前もってコーティングした二重反復の２４ウェル（１ウェル当たり１００，０００細胞）中に接種した。２４〜７２時間インキュベーション後、アキシオヴェルト（Axiovert）Ｓ１００顕微鏡（ツァイス（Zeiss））に接続したアキシオカム（Axiocam）カメラで倍率５×で写真を撮った。
【０１０５】
アフィメトリクス（Affymetrix）
マトリゲルで培養した細胞からの全ＲＮＡは、トータリー（Totally）ＲＮＡキット（アンビオン（AMBION））を用いて製造業者のプロトコールにより調製した。最後の工程で、沈降した全ＲＮＡをインビソルブ溶解緩衝液に再懸濁して、インビソルブのスピン細胞−ＲＮＡキット（インビテック（INVITEK））を用いて精製した。ビオチン標識ｃＲＮＡは、アフィメトリクスのプロトコールにより調製して、１５μgのｃＲＮＡをアフィメトリクス・ジーンチップ（GeneChip）セットＨＧ−Ｕ９５にハイブリダイズさせた。
【０１０６】
データ解析
生データは、アフィメトリクス・ジーンチップ・ソフトウェアのマイクロアレイ・スイート（Microarray Suite）ｖ４．０を用いて解析した。各プローブセットの強度は、１つの転写産物に対応する１６〜２０個のプローブ対のセットにわたって平均した、ミスマッチオリゴヌクレオチドに比較した最適マッチのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションシグナルの差として計算される。あるプローブセットの平均の差は、転写産物の豊富さに比例する。異なるアレイの全シグナル強度は、比較前に同じ値に概算した。実験及び基線アレイからの対応するプローブ対の強度の２つ１組の比較により、アフィメトリクスソフトウェアを用いて変化倍率を算出した。アフィメトリクスにより記述される決定行列を用いて、このソフトウェアはまた、絶対コール（ある実験において、転写産物が、存在しないか、最低限存在するか、又は存在する）及び示差コール（１つの実験を別のと比較した転写産物の豊富さ：増大、わずかに増大、変化なし、わずかに低下、低下）を生成する。結果は、マイクロソフト・エクセル（Microsoft Excel）にエクスポートして（絶対コール、示差コール、変化倍率）、フィルターにかけた。コールがないか、又はコール変化のない全てのプローブセットを破棄して、表を変化倍率によりソートした。
【０１０７】
動物試験
食品医薬品局（Food and Drug Administration）の非臨床実験室研究のための医薬品安全性試験実施基準（Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies）（ＧＬＰ規定）に対応して、及び法的根拠としてドイツ動物保護法により、インビボ実験を行った。
【０１０８】
ＳＰＦ条件（層流空気流装置（Laminar air flow equipment）、スキャンテイナー（Scantainer）、スキャンブル（Scanbur））下で維持したオスのシュー：ＮＭＲＩ−ニュー／ニュー（Shoe:NMRI-nu/nu）マウス（ティエルズクト・シェーンヴァルデ社（Tierzucht Schoenwalde GmbH））を、ヒト前立腺癌細胞のレシピエントとした。６〜８週齢で体重２８〜３０ｇのこの動物は、２×１０6個／０．０３mlの腫瘍細胞を、前立腺の左背側葉（ｉｐｒｏｓｔ；同所性）又は肝臓の左側葉の先端（ｉｈｅｐ；異所性）に接種した。この目的のために、ケタネスト（Ketanest）（パーク・デイビス社（Parke-Davis GmbH））とロンプン（Rompun）（バイエル・バイタル社（Bayer Vital GmbH））８０：１の混合物を用いて、それぞれ１００mg/kg及び５mg/kgの用量でマウスに全身麻酔をかけた。腹部体表面の徹底的な滅菌後、包皮腺の縁近くから始まって、約１cmある、腹部皮膚及び腹壁を通す切開を行った。１対のピンセットと綿棒を用いて、前立腺を明視化した。同所性細胞投与は、拡大鏡の助けを借りて、３０Ｇ ０．３０×１３のマイクロランス（microlance）針（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））を持つ１mlシリンジ（ヘンケ・サス・ヴォルフ社（Henke Sass Wolf GmbH））を用いて行われた。投与は成功し、接種部位に際立った水疱が観察された。創傷は、腹壁に関しては縫合材料（ＰＧＡレゾルバ（PGA Resorba）、フランツ・ヒルトナー社（Franz Hiltner GmbH））により、そして腹部皮膚にはマイケル（Michel）クランプ１１×２mm（ハイランド（Heiland））により閉じた。創傷用スプレー（ハンザプラスト・シュプルーフラスター（Hanzaplast Spruehpflaster）、バイヤースドルフ社（Beiersdorf AG））で病変部を覆った。術後相には、動物は、完全な目覚めまで温暖環境で維持した。動物は、それぞれ１群当たり５〜１０匹の動物よりなる処理群の数によりランダム化した。これらは、知見のプロトコール化を含めて、継続して点検した。１０mmのオートクレーブに耐えるＳｓｎｉｆｆ ＮＭ−Ｚ（ｓｓｎｉｆ、シュペツィアルディエテン社（Spezialdiaeten GmbH））を栄養強化食として投与し、飲料水はＨＣｌにより酸性にする（両方とも適宜）。
【０１０９】
評価
実際の用量レベルを投与するために、体重を処置日に記録した。同時に、体重の増加から、生物体全体に及ぼす治療法の影響の認識を導き出すことができる。
【０１１０】
血液穿刺は、０（基線）；１４；２８；及び３５日目（殺処分）に行われた。血液は、短時間麻酔した動物の眼窩静脈から抜き取った（ジエチルエーテル、オットー・フィッシャー社（Otto Fischar GmbH））。処置の適合性と副作用にデータを与える評価パラメーターは以下である：白血球数；血小板数；酵素。更に別の血行性パラメーターは、ビリルビン；クレアチニン；タンパク質；尿素；尿酸であった。
【０１１１】
全ての殺処分した動物は、完全に解剖して写真で記録した。腫瘍（前立腺）及び転移（尾部、腰部、腎リンパ節転移）は、１対のカリパスを用いて二次元で測定した。容量は、Ｖ（mm3）＝ａｂ2／２（ここでｂ＜ａ）により算出した。一般に、治療アプローチ用に遂行された細胞数は、前立腺に関して１００％の腫瘍獲得を引き起こす。幾つかの臓器（肝臓；脾臓；腎臓）の重量を、二次的副作用についての知見に関する追加データを解明するために記録した。
【０１１２】
組織学的分析のために、腫瘍組織（即ち、前立腺腫瘍及びリンパ節転移）の試料を５％ホルムアルデヒド中で固定してパラフィン包埋した。ルーチンとして、切片はＨＥ染色し、必要であれば特異的染色を行った（アザン（Azan）、ＰＡＳ）。
【０１１３】
腫瘍及び転移細胞のヒト起源を検出するために、適切な組織試料を液体窒素中で凍結した。ｈｕＨＰＲＴ特異的アンプリコン（amplicon）によるＰＣＲ及びタックマン分析を使用すると、我々は、５mg組織中に５０個のヒト細胞を検出することができた。
【０１１４】
治療結果は、マン・ホイットニー（Mann and Whitney）のｕ検定により統計的に検証した。
【０１１５】
実施例２：下流の薬物標的の適合性に関する実験的概念実証
引用例として本明細書に取り込まれる本明細書の導入部に略述されるように、シグナル伝達経路に対して下流に結びついている標的は、医薬及び診断薬の両方の設計又は開発に有用である。特定の標的が、別々の他の経路に結びついているか、又はシグナル伝達経路内のその位置により幾つかの生物学的現象（例えば、ＰＩ−３キナーゼの場合のように、転移と遊走、増殖、翻訳、アポトーシス、細胞周期、ＤＮＡ修復など）に結びついているならば、この標的に対処する任意の化合物には、幾つかの副作用がありそうであり、よってこれは、その系に対して有害であろうし、医学的観点から望ましくないであろう。したがって、更に下流で作用する標的が、治療的介入の第１選択になるはずである。
【０１１６】
本発明者らは、ＰＩ３−キナーゼ経路の制御下に、ｍＴＯＲとは別に更に可能性ある薬物標的が関与していることを見い出したが、これは転移と遊走の現象及びこのため腫瘍形成の制御に特異的である。製薬業界では、ラパミューンの商品名の下に販売されるラパマイシンが、転移と遊走を阻害するのに適していることが見い出されている。このことは、下流の薬物標的に対処するための方策の適合性を支持する。
【０１１７】
図２から判るように、ラパマイシンは、リンパ節転移の容量を低下させるのに適しており、その範囲では周知のＰＩ３−キナーゼインヒビターであるＬＹ２９４００２にその効果で匹敵する。図２Ａに描かれるように、腫瘍獲得モデルを使用し、ラパミューンでの処置は１日目に開始した。使用した両方の濃度（即ち、０．４mg/kg/投与〜２mg/kg/投与）で、陰性対照（リン酸緩衝生理食塩水とした）に比較した転移の測定容量（mm3）として表されるリンパ節転移の範囲の著しい縮小が起こった。
【０１１８】
組織学的分析のために、腫瘍組織（即ち、前立腺及びリンパ節転移）の試料は、５％ホルムアルデヒド中で固定してパラフィン包埋した。ルーチンとして、切片はＨＥ染色し、必要であれば特異的染色を行った（アザン、ＰＡＳ）。
【０１１９】
２８日目に開始する処置による樹立腫瘍モデルのラパミューン処置の場合にも、基本的に同じ結果が得られた。
【０１２０】
ラパマイシン（ラパミューン）での処置後の同所性ＰＣ−３マウスモデルにおけるリンパ節転移を測定した。図２（Ａ）には、（Ａ）の結果、腫瘍獲得モデルを示す。ヌードシュー：ＮＭＲＩ−ニュー／ニュー（Shoe:NMRI-nu/nu）マウス（１群８匹）に、２×１０6個のＰＣ３細胞を０．０３mlで前立腺内注射して、処置は、ラパミューンを用いて２８日間毎日前立腺内投与で２mg/kg及び０．４mg/kgの用量で行った。ＰＢＳを対照とした。
【０１２１】
樹立腫瘍（Ｂ）の処置には、細胞を２８日間ｉｐｒｏｓで増殖させて、処置は、移植後２９〜５０日目にラパミューンを用いて経口投与で行った。用量は、Ａに略述されるように選択した。動物は、それぞれ２９日目と５１日目に殺処分して、全リンパ節転移を測定した。
【０１２２】
実施例３：ＰＩ３−キナーゼ経路内の下流の薬物標的としてのＰＫＮベータの同定
基本的実験アプローチは、図３に示す。マトリゲルで培養したＰＣ３細胞は、ＤＭＳＯ又はＰＩ３−ＫインヒビターのＬＹ２９４００２のいずれかで処理して、全ＲＮＡを各試料から単離した。示差アフィメトリクス遺伝子発現プロファイリングを実行して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲタックマンアッセイを用いて発現を確認した。ｐ１１０□を非示差標準物質として使用した。ＰＣ３細胞は、ＰＴＥＮ −／−であるが、これは、腫瘍サプレッサーのＰＴＥＮが、これらの細胞中では事実上欠乏しているため、ＰＩ３−キナーゼ経路が恒久的に活性化されていることを意味するが、このため、マトリゲルアッセイにおいてその増殖パターンにより表される、細胞の転移活性又は挙動が増大する。浸潤性増殖能力を持つ細胞は、マトリゲルマトリックスのような基底膜では増殖の強化を示す（Petersen, O.W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A.R.及びBissell, M.J. (1992)）。基底膜との相互作用は、正常及び悪性ヒト乳房上皮細胞の増殖及び分化パターンを迅速に識別するのに役立つ。Proc Natl Acad Sci USA, 89, 9064-9068。（Sternbergerら, 2002 Antisense & Nucleic acid drug development 12:131-143も参照のこと）。
【０１２３】
これに関連して、ＰＣ３細胞がマトリゲル上で増殖したこと、及びそこから単離したＲＮＡが、従来の細胞培養プレートのような非マトリゲル環境で増殖した細胞から得られたどの調製物に比べても、インサイチューの状況又は結果により近いと想定される、インビボ環境に近いモデル系としてこれを受け取ったことに注意すべきである。
【０１２４】
実施例４：プロテインキナーゼＮベータに向けられた最適なアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング。
ＰＣ３細胞は、記載されるように種々のジーンブロック濃度でトランスフェクトし、そしてｍＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に３００nMのＰＫＮベータ特異的前進及び逆進プライマー並びに１００nMプローブ、そしてヒト■−アクチンに対する４０nM前進及び逆進プライマー並びに１００nMプローブによるタックマンアッセイを用いて測定した。ｍＲＮＡレベルは、内部アクチンレベルに対して標準化して、量はＧＢＣ（ジーンブロックコントロール（Gene Bloc Control）でトランスフェクトした細胞）に対して示す。
【０１２５】
この結果は、図４に示す。図４から特に有利なアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ジーンブロック７０２１０及び７０２１１を更なる試験のために選択した。
【０１２６】
ジーンブロックに関連して、種々の実施例で本明細書において使用されるとき、これらが全て本明細書に特定されている第３世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドであることに注意すべきであり、そしてこのことは、表１からも明らかなように、大文字が、ホスホジエステル結合よりはむしろホスホロチオエート結合により結合している、デオキシリボヌクレオチドを表すことを意味している。
【０１２７】
表１：使用した種々のジーンブロックの概観、その別名、標的核酸に対するミスマッチ並びにその配列及び構造の特徴
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
種々のジーンブロックは、以下の配列番号に相当する：
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
更には、上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ジーンブロック、即ち、第３世代アンチセンスオリゴヌクレオチドであるという事実を踏まえると、上の「ｔ」はいずれも実際には「ｕ」であることに注意すべきである。
【０１３２】
実施例５：プロテインキナーゼＮベータの選択的ノックダウン
プロテインキナーゼＮベータが、ＰＩ３−キナーゼ経路の適切な下流の薬物標的であることを証明するために、実施例４から得られるような２つの特に有利なジーンブロックを、マトリゲルに基づく増殖実験に使用した。マトリゲル増殖実験は、各細胞の転移及び遊走挙動を示す代理モデルとして採用される。細胞の更にコンフルエントな増殖は、その転移及び遊走挙動が増大する指標として取られるが、これにより細胞は、マトリゲルが与える三次元構造中に拡がることができる。
【０１３３】
ＰＣ３細胞は、トランスフェクトし、前述のようにマトリゲルに接種して、増殖をモニターした。マトリゲルに接種した細胞のアリコートからｍＲＮＡを単離して、タックマンアッセイを用いて分析した（左のパネル）。ＰＫＮベータ特異的ｍＲＮＡは、内因性ｐ１１０α ｍＲＮＡレベルに対して標準化した。ＰＴＥＮ-/-ＰＣ−３細胞中でＰＴＥＮ特異的ジーンブロックを陰性対照として使用し、細胞外マトリックス中での増殖には陽性対照としてｐ１１０α特異的ジーンブロックを使用する。特異的増殖阻害は、ＰＫＮベータ特異的ジーンブロック７０２１０又は７０２１１で処理した細胞の増殖と、それぞれその対応するミスマッチのオリゴヌクレオチド７０６７６及び７０６７７とを比較することにより示される。
【０１３４】
各結果はまた、図５に図解される。ここから、ジーンブロック（gene block）７０２１１及び７０２１０が、本明細書に記載される疾患及び病状の治療のための医薬又は診断薬の製造に適した化合物であろうことが理解されよう。
【０１３５】
実施例６：ＨｅＬａＢ細胞におけるｓｉＲＮＡの一過性発現によるＲＮＡ干渉
この実験は、特異的に下流の薬物標的であるプロテインキナーゼＮベータに向けられることが可能な、ｓｉＲＮＡの成功した設計に関する一例である。図６（Ａ）に図解されるように、ｓｉＲＮＡ分子は、標的特異的配列（２１量体のセンス配列と１２量体ポリＡストレッチが結合した逆進相補配列とを含む、目的の遺伝子から誘導された鋳型）のプロモーター（Ｕ６＋２）による発現により作成した。転写によりＲＮＡは２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成するようである。
【０１３６】
ｐ１１０ベータ及びＰＴＥＮのような種々の構築体を、ＰＫＮベータのｍＲＮＡ配列に対して設計したｓｉＲＮＡと同じベクター構築体にして、それぞれ陽性及び陰性対照として使用した。各設計は、図６（Ｂ）に示すが、ｓｉＲＮＡ発現のための標的遺伝子の鋳型配列が、Ｕ６＋２プロモーターカセットを含む発現ベクター中に導入されている。
【０１３７】
この構築体は、ＲＮＡｉ干渉実験のためにＨｅＬａＢ細胞へのトランスフェクションにより一過性発現させた。トランスフェクトした４８時間後に細胞を回収して、次にマトリゲルに接種した（１ウェル当たり８００００細胞）。対応する遺伝子の発現に及ぼすＲＮＡ干渉の作用は、トランスフェクトした細胞をマトリゲルでの増殖／繁殖についてアッセイすることにより分析した。ＰＴＥＮを標的とするｓｉＲＮＡの発現は、マトリゲルでのＨｅＬａＢ細胞増殖に影響しなかった（右のパネル）が、一方ｐ１１０ベータ及びＰＫＮベータに特異的なｓｉＲＮＡの発現は、マトリゲル上のＨｅＬａＢ増殖の挙動を深刻に妨げた（中央及び右のパネル）。
【０１３８】
この点から見て、特定のｓｉＲＮＡは、本明細書に開示されるような疾患及び病状の治療に有効な手段であることが判明した。
【０１３９】
実施例７：ヒト前立腺腫瘍におけるプロテインキナーゼＮベータの検出
プロテインキナーゼＮベータが、前立腺腫瘍の治療における適切な標的であるという更なる証拠を与えるために、各ヒト前立腺組織をインサイチューハイブリダイゼーションに付した。
【０１４０】
インサイチューハイブリダイゼーションのために、センス及びアンチセンス鎖の両方を、ｐＣＲ４トポ（Topo）ベクター中で配列ＮＭ０１３３５５から１６７２〜２６６７位のヌクレオチドから調製したが、ここでＴ７及びＴ３ポリメラーゼを増幅目的に使用した。ヒト前立腺腫瘍細胞（ＰＣ−３）をマウスで増殖させた。解剖後、組織はイソペンタン溶液中で−２０℃で凍結して、切片を−１５℃で切り出し−８０℃で貯蔵した。ハイブリダイゼーションの前に、切片をパラホルムアルデヒド中で固定した。ヒト腫瘍標本をパラホルムアルデヒド中で固定して、パラフィン包埋した。腫瘍標本は、プロテイナーゼＫで処理してアセチル化した。核酸プローブは、35Ｓ−ＡＴＰと35Ｓ−ＵＴＰで二重標識して、組織と共に５８℃で５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液（０．４Ｍ ＮａＣｌ、５０％ホルムアミド、１×デンハルト（Denhardt）液、１０mMトリス、１mM ＥＤＴＡ、１０％デキストラン硫酸、１０μg/mlの各ｔＲＮＡ及びサケ精子ＤＮＡ、１０mM ＤＴＴ）中でインキュベートした。
【０１４１】
インサイチューハイブリダイゼーションの結果は、図７に図解される。前立腺腫瘍のインサイチューハイブリダイゼーションにプロテインキナーゼＮベータアンチセンスプローブを使用すると、この前立腺は激しく染色される（図７Ａ）。これとは対照的に、再度アンチセンスプローブを使用するとき、健常前立腺組織はあまり染色されず、バックグラウンドシグナルだけを与える（図７Ｃ）。これとは対照的に、両方の組織に関連してセンスプローブを使用すると、何のシグナルも与えなかった。
【０１４２】
実施例８：ｓｉＲＮＡによる原発性腫瘍及びリンパ節転移のインビボの縮小
この実施例は、同所性前立腺腫瘍モデルを用いた標的遺伝子のインビボ検証に関し、そしてプロテインキナーゼＮベータに対するｓｉＲＮＡを使用することにより、原発性腫瘍とリンパ節転移の両方の縮小が実現できることが証明できた。結果は、図８Ａ〜８Ｃに図解される。
【０１４３】
図８Ａの線図において、実施例１に記載されるように測定した、同所性前立腺腫瘍モデルにおける原発性腫瘍の容量は、以下の２つのｓｉＲＮＡ構築体のいずれかを用いて有意に縮小させることができた：
５’ａｃｔｇａｇｃａａｇａｇｇｃｔｔｔｇｇａｇ 又は
５’ａａａｔｔｃｃａｇｔｇｇｔｔｃａｔｔｃｃａ。
【０１４４】
陰性対照としてｐ１１０−αサブユニットに対するｓｉＲＮＡを使用し、そして陽性対照としてｐ１１０−βサブユニットに対するｓｉＲＮＡを使用した。よって陽性対照は、プロテインキナーゼＮベータＰＴＥＮの上流のレギュレーターに対応する。
【０１４５】
リンパ節転移におけるプロテインキナーゼＮベータをコードするｍＲＮＡを分解するために、２つの独立ｓｉＲＮＡ分子の更に別のセットを使用した。リンパ節転移は、以下のリンパ節に見い出される続発性腫瘍である：尾部、腰部、腎及び縦隔リンパ節（ここで、尾部リンパ節が前立腺に最も近く、そして縦隔リンパ節が移植腫瘍に最も遠い）。原発性腫瘍の場合のように、ｓｉＲＮＡ構築体は、プロテインキナーゼＮベータをコードするｍＲＮＡの縮小及び腫瘍容量の縮小に明らかに成功した（図８Ｂ）。陽性及び陰性対照は、原発性腫瘍の縮小に関連して考察されたとおりであった。両方の場合に、即ち、原発性腫瘍とリンパ節転移について、ヒト前立腺腫瘍細胞は、ポリメラーゼIII Ｕ６プロモーターから各ｓｉＲＮＡ分子を発現するように遺伝子操作した。
【０１４６】
これらの結果を別にして、図８Ｃ１及び図８Ｃ２に図解される明確な表現型分析は、ヒト前立腺腫瘍細胞中でのｓｉＲＮＡ構築体の転写の活性化により、リンパ節転移を有意に縮小することができ、そして図８Ｃ１に図解されるリンパ節の腫れは、図８Ｃ２に図解されるようにｓｉＲＮＡで処理した組織には存在しないことを示している。
【０１４７】
実施例９：プロテインキナーゼＮベータの機能特性解析
この実施例は、プロテインキナーゼＮベータの機能特性解析に関し、そして更に具体的には、リン酸化によるそのキナーゼ活性及びそのキナーゼ活性の調節に及ぼす、誘導体化（即ち、プロテインキナーゼＮベータの機能性アミノ酸残基の切断又は突然変異）の影響力に関する。
【０１４８】
少なくとも部分的には図９Ｃに概略図解されるように、本明細書に開示される野生型配列を指すアミノ酸残基により、以下のプロテインキナーゼＮベータ誘導体を作成した：
ａ）アミノ酸５３５〜８８９を含むキナーゼドメイン；
ｂ）アミノ酸２８８〜８８９を含むΔＮ；
ｃ）５８８位にリシンからアルギニンへの突然変異を有するキナーゼドメイン；
ｄ）５８８位にリシンからグルタミン酸への突然変異を有するキナーゼドメイン；
ｅ）アミノ酸７１８位のトレオニン残基がアラニン（ＴＡ７１８）又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸（ＴＤ７１８又はＴＥ７１８）のいずれかに変化している、リン酸化部位（ＡＧＣ活性化ループコンセンサス）に突然変異を有するキナーゼドメインの誘導体；及び
ｆ）完全長野生型ＰＫＮベータ分子（８８９アミノ酸）。
【０１４９】
各断片は、ＨｅＬａ細胞で一過性発現させた。これらの相対発現量は、抗ＰＫＮベータ抗体を用いてＨｅＬａ細胞抽出物のウェスタンブロット分析により測定した。
【０１５０】
ポリクローナル抗ＰＫＮベータ抗血清は、大腸菌（E. coli）でのＰＫＮベータのＣ末端アミノ酸（６０９〜８９９）の過剰発現を経て生成した。各タンパク質断片は、標準法により封入体からゲル精製し、回収して濃縮した。
【０１５１】
プロテインキナーゼＮベータは、その触媒ドメインにおいてＣ末端でＡＧＣ型キナーゼ分子との相同性を有する。キナーゼのファミリーは、酵素活性のためにはリン酸化されることを必要とする、触媒ドメインの活性化ループにおける保存トレオニン残基を特徴とする。活性化ループにおけるこのトレオニンと周囲のアミノ酸の前後関係の高度保存のため、この部位に対する抗ホスホ抗体は業者から調達できる。各抗体は、図９では抗Ｐ*−ＰＲＫと呼ばれ、そして図１０では抗Ｐ*−ＡＧＣキナーゼと呼ばれる。
【０１５２】
ＭＰＢは、標準的なインビトロのリン酸化基質であるミエリン塩基性タンパク質である。
【０１５３】
以下の結果を得た：
【０１５４】
【表３】
【０１５５】
＊ ＋；活性
−；不活性
！；他のキナーゼにおける同等の突然変異から予期されるような「過度の活性化」は観測されなかった（MorganとDebond, 1994）
【０１５６】
結果は、図９に図解される。
【０１５７】
図９Ａは、ＨｅＬａ細胞における一過性過剰発現での、標準リン酸化基質としてＭＰＢを使用する、種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体とその活性のゲル分析を示す。図９Ａから判るように、完全長プロテインキナーゼＮベータを別にして、他の点では野生型であるキナーゼドメインだけが、ＭＰＢのリン酸化において活性である。
【０１５８】
同じプロテインキナーゼＮベータ誘導体を使用するとき、７１８位に突然変異Ｔ／Ａを有するキナーゼドメインを含む誘導体を除いて、表示された他の全ての誘導体は、それらの更に別の固有の活性に関わらずリン酸化されたことが観察できる。
【０１５９】
データは、機能性キナーゼドメインと７１８位のリン酸化の存在が、ＰＫＮベータキナーゼ活性の必須条件であることを示している。しかし、ΔＮ版がキナーゼとして作用できないことから結論できるように、これらでは充分でない。データはまた、キナーゼ欠損ＫＲ５８８突然変異タンパク質が７１８位のリン酸化を保持しているため、ＰＫＮベータが、アミノ酸７１８で自己リン酸化しないが、代わりに別のキナーゼ分子によるリン酸化を必要とすることを示している。
【０１６０】
実施例１０：完全長ＰＫＮベータの性状解析
完全長分子に照らしてプロテインキナーゼＮベータの機能性アミノ酸残基の突然変異を分析するために、図１０及び１１に示されるように以下の実験を行った：
【０１６１】
ＰＫＮベータのキナーゼ活性をインビトロで測定するために、組換えＨＡ−又はＭｙｃ−標識ＰＫＮベータ誘導体をＨｅＬａ又はＣＯＳ−７細胞で一過性発現させた。小さなキナーゼドメイン誘導体を対照とした。組換え版のプロテインキナーゼＮベータを含む細胞抽出物を、同等の発現レベルを証明するために実施例９に記載されたように抗プロテインキナーゼＮベータ抗体（図１０Ａ）により、そして異なる程度のプロテインキナーゼＮベータ誘導体のインビボのリン酸化を示すために抗ホスホＡＧＣ部位抗体（抗−Ｐ*−ＡＧＣ−キナーゼとも呼ばれる）（図１０Ｂ）により、平行して精査した。
【０１６２】
実施例１１：完全長プロテインキナーゼＮベータの活性のためのリン酸化要求と、非放射活性インビトロキナーゼアッセイ法の開発−ＨＴＳアッセイのためのプロテインキナーゼＮベータの適合性
ＰＫＮベータ誘導分子を、抗標識抗体を使用することにより図１０に示される細胞抽出物から免疫沈降させた。免疫沈降物は、報告（Klippelら, 1996）されるように洗浄して、二等分した。一方の半分を、リン酸化基質として５μg ＭＢＰ（ＵＢＩ）、４mM ＭｇＣｌ2及びガンマ32Ｐ−ＡＴＰと共に緩衝液中で１０分間室温でインキュベートした。更に、ホスファターゼインヒビター及び非特異的に作用するキナーゼに対するインヒビターを、Klippelら, 1998にあるように加えた。放射活性リン酸の取り込みは、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる反応生成物の分離後にオートラジオグラフィーにより検出した（図１１Ｂ）。
【０１６３】
免疫沈降物のもう一方の半分は、２００μM ｒＡＴＰの存在下でリン酸化基質として１μg ＧＳＴ−ＧＳＫ３融合タンパク質（セル・シグナリング・テクノロジー（Cell Signaling Technology））と共にインキュベートした。続いて反応混合物は、８〜１６％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ホスホＧＳＫ３アルファ抗体（セル・シグナリング・テクノロジー）を用いたウェスタンブロッティングにより分析した（図１１Ａ）。次にフィルターをストリップして、抗ＰＫＮベータ抗血清で再精査することにより、各免疫沈降物中の相当量のＰＫＮベータタンパク質の存在を確認した（図１１Ｃ）。
【０１６４】
インビトロのリン酸化反応の特異性は、キナーゼ欠損変種（例えば、ＡＴＰ結合部位に突然変異を含む、上記を参照のこと）を活性タンパク質と平行して分析することにより制御した。
【０１６５】
他の点では完全長野生型プロテインキナーゼＮベータであるプロテインキナーゼＮベータのアミノ酸７１８でのＴＡ突然変異変種の場合のシグナルの欠乏は、このアミノ酸残基が、抗体により検出されるリン酸化の実にその位置であることを示す（図１０Ｂ）。キナーゼ欠乏変種（それぞれ図１０及び図９に示されるように、ＫＥ又はＫＲ突然変異）がこの部位でリン酸化されるという事実は、トレオニン７１８が自己リン酸化の基質ではないことを示す。むしろ細胞中の別のキナーゼが、この部位のリン酸化を担当しなければならない；そしてＰＫＤ１は、有力な候補である。
【０１６６】
また、実施例９の１つと組合せたこの実験から、７１８位でのプロテインキナーゼＮベータのリン酸化が、プロテインキナーゼＮベータ活性の必須条件であることが露呈した；この部位で試験した全ての突然変異は、リン酸化を妨げて、不活性なキナーゼ分子が生じた。この範囲において、本明細書に開示される本発明の任意の態様に関連して使用することができる、特に好ましいプロテインキナーゼＮベータは、７１８位がリン酸化されているプロテインキナーゼＮベータか、又は本明細書に記載されたようにキナーゼドメインのみを含む誘導体を含む、その誘導体である。データは更に、キナーゼ欠損ＫＥ５８８突然変異タンパク質が７１８位のリン酸化を保持しているため、完全長ＰＫＮベータもまたアミノ酸７１８で自己リン酸化しないが、代わりに別のキナーゼ分子によるリン酸化を必要とすることを示している。
【０１６７】
図１１から判るように、プロテインキナーゼＮベータの活性の測定は、プロテインキナーゼＮベータインヒビターのスクリーニングを高速大量処理系にすることができる形式に適応させることができる。
【０１６８】
第１工程で、非放射活性スクリーニング形式の適合性を決定したが、ここで実施例１０に関連して既に考察された種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体を、適切な基質をリン酸化するために使用した。このような基質は、例えば、ＭＢＰ又はＧＳＫ３ペプチドであってよく、これは典型的にはアガロース−若しくはセファロースビーズのような適切な担体又はプラスチック表面上に固定化される。本発明の場合には、そして図１１Ａに図解されるように、基質は、パラミオシンに融合したＧＳＫ３由来ペプチドである。第１列は、種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体を使用する全ての様々のアッセイ法が、実際に該誘導体を含むことを示している。完全長野生型プロテインキナーゼＮベータ又は実施例９と同義のキナーゼドメインだけが、基質をリン酸化するのに適していた。本発明の場合のリン酸化基質は、抗ホスホＧＳＫ３アルファ抗体により検出した（上述）。
【０１６９】
図１１Ａに図解される非放射活性アプローチが充分な感度であることを確認するために、リン酸化基質としてＭＢＰを使用して、放射活性アプローチを免疫沈降物の半分と平行して行った。キナーゼ活性の効果は、［32Ｐ］取り込みによるオートラジオグラフィーに示されるように、生成したリン酸化基質の量から理解できる。図１１Ａ及び１１Ｂから判るように、完全長野生型プロテインキナーゼＮベータ並びにキナーゼドメインは活性を示すが、一方、それぞれ完全長ＫＥ及び完全長ＴＡ突然変異タンパク質では、検出されない（図１１Ａ）か、又は非特異的キナーゼのバックグラウンド活性（図１１Ｂ）が検出された。
【０１７０】
要約すると、完全長野生型プロテインキナーゼＮベータ並びに本明細書に開示されたキナーゼドメインの両方の使用は、ＨＴＳ形式でのスクリーニング手順の設計のための適切な標的又は手段である。よって各工程は、以下を含む：
ａ）キナーゼ活性を示すにはタンパク質をリン酸化することが必要である（細菌系での発現では容易に達成できない）という事実に照らして、昆虫細胞系（Klippelら, 1997の種々のキナーゼのための例）のような非細菌発現系での発現により、精製した組換えプロテインキナーゼＮベータタンパク質を作成すること；
ｂ）ＧＳＫ３由来基質又は同様の基質の固定化、並びにｒＡＴＰ、ＭｇＣｌ2及びインヒビターの存在下で緩衝液中で精製プロテインキナーゼＮベータと共にこの基質をインキュベートすること；
ｃ）場合により連続洗浄後に、抗ホスホ−ＧＳＫ３抗体のような抗体などの適切な検出手段により、基質のリン酸化を検出すること、そして更に場合により続いてデルフィア（Delfia）又はランス（Lance）アッセイ系（パーキン・エルマー（Perkin Elmer））（ここで、リン酸化部位は、ユーロピウム標識抗体によって結合される）で現像すること。結合ユーロピウムの量は、次に時間分解蛍光分析法により定量される。
【０１７１】
実施例１２：内因性ＰＫＮ−ベータの発現レベルの測定
この実施例では、ＰＫＮ−ベータがＰＩ３−キナーゼ依存的に発現するという実験的証拠が与えられる。図３に示されるＰＫＮベータＲＮＡのＰＩ３−キナーゼ依存性発現は、ここではタンパク質レベルで更に確認される。
【０１７２】
ＰＣ−３細胞を本明細書の実施例１に記載されるように培養した。該ＰＣ−３細胞は、ＰＴＥＮ −／−である。ＨｅＬａ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手して、Sternbergerら（2002）に記載されるように増殖させた。トランスフェクションは、１０cmプレート（３０％〜５０％コンフルエンシーで）でヒュージーン（Fugene）６（ロシュ（Roche）、ナトリー、ニュージャージー州）を用いて製造業者の指示書により行った。培養細胞は、トリプシン処理して、培地によりトリプシン作用を停止させてから回収した。
【０１７３】
両方の細胞型、即ち、ＰＣ−３細胞とＨｅＬａ細胞は、１０μMのＬＹ２９４００２又はＤＭＳＯと共に表示される時間、処理した（ここで、ＤＭＳＯは、ＬＹ２９４００２の溶媒として使用し、このため、陰性対照として使用した）。
【０１７４】
生じた抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、続いてウェスタンブロッティングにより分析した。ｐ１１０（ローディングコントロールとした）、内因性ＰＫＮ−ベータ及びリン酸化Ａｋｔのような表示されるタンパク質のレベルは、各抗体を用いて検出した。リン酸化Ａｋｔ（Ｐ*−Ａｋｔ）は、ＬＹ２９４００２介在処理の有効性の対照とする。
【０１７５】
結果は、図１２に図解される。
【０１７６】
ＰＣ−３細胞ではＰＩ−３−キナーゼの阻害は、２４時間後の内因性ＰＫＮベータ発現の目に見える減少を引き起こし、タンパク質レベルは、４８時間の処理後に更に減少した。ＰＫＮベータタンパク質をより多く発現するＨｅＬａ細胞では、この作用はあまり劇的ではないが、ＬＹ２９４００２での４８時間処理後には減量が検出できる。
【０１７７】
ここから、ＰＩ３−キナーゼがＰＫＮ−ベータの発現を制御すると結論づけることができる。
【０１７８】
実施例１３：ＰＫＮ−ベータ活性はＰＩ３−キナーゼを必要とする
組換え野生型ＰＫＮ−ベータ又はＰＫＮ−ベータの誘導体（図１０〜１１に記載されるもの）をＨｅＬａ細胞で一過性発現させた。該誘導体は、本明細書の実施例１０に記載されるＰＫＮ−ベータ誘導体ＴＡ及び誘導体ＫＥである。ＰＫＮ−ベータは、各場合に上述のようにｍｙｃ−タグにより修飾し、そして抗Ｍｙｃ抗体を用いるＰＫＮ−ベータ及びその誘導体の沈降を可能にした。
【０１７９】
ＰＫＮ−ベータの活性の評価のために、免疫沈降物を用いてインビトロキナーゼ活性を上述のように行った。沈降物の半分は、インビトロキナーゼ反応に付し、２番目の半分は、抗ホスホ−ＰＲＫ抗体を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。フィルターをストリップして、抗ＰＫＮ−ベータ抗血清を用いて再精査した。ホスホ−ｐ７０ Ｓ６ キナーゼレベルは、わずか３時間処理後のＬＹ２９４００２処理の有効性を確認するために、前もって取りだした細胞溶解物のアリコートから分析した。抗ホスホｐ７０抗体は、セル・シグナリングから入手した。
【０１８０】
図１３から判るように、ＬＹ２９４００２処理は、ここでは再度ＭＢＰのリン酸化により測定された、ＰＫＮベータのキナーゼ活性の強力な阻害をもたらす。この作用は、わずか３時間の処理後にも目に見え、２４時間後にはＰＫＮベータ活性は、ほぼ完全に阻害された。ＰＫＮベータの７１８位のリン酸化はまた、ＬＹ２９４００２によるＰＩ３−キナーゼの阻害後も危機的であったが、この作用はキナーゼ活性に及ぼす作用よりは著しいものではなかった。
【０１８１】
ＰＫＮ−ベータのＴＡ誘導体は、上に示されるように不活性対照となり、そして７１８位のホスホ−トレオニン（Ｐ*−ＰＫ）に対する抗ホスホＰＲＫ抗体の特異性の対照となる。
【０１８２】
ＰＫＮ−ベータ誘導体ＫＥは、上述されるようにキナーゼ欠乏対照となる。そのリン酸化状態はまた、ある程度ＬＹ２９４００２処理に影響を受けるようであった。このことは、７１８位でＰＫＮベータのリン酸化を担当するキナーゼが、ＰＩ３−キナーゼ依存的に働くことを示している。
【０１８３】
最も重要なことには、この実験は、ＰＫＮベータが、ＰＩ３−キナーゼによりその発現レベルを介して調節される（図３及び１２を参照のこと）だけでなく、その活性化レベルでも調節されることを示している。これらの知見は、ＰＫＮベータが、種々のレベルで調節されるＰＩ３−キナーゼに等部位的に依存しているため、治療的介入のための活動亢進ＰＩ３−キナーゼ経路への干渉の「完璧な」下流の標的に相当することを示している。これにより、タンパク質ＰＫＮ−ベータとこれをコードする核酸の両方に明確な作用を示す化合物の生成が可能である。更に重要なことには、転写レベルよりむしろ翻訳レベル（即ち、発現されるタンパク質のレベル）でのＰＫＮ−ベータのこの種の活性変調は、転写レベルでの影響力よりも卓越しており、かつ長期にわたると考えられる。
【０１８４】
本発明の更に別のスクリーニング方法は、この具体的な洞察に基づき、そして好ましくは読み出しとして放射活性又は非放射活性のインビトロキナーゼアッセイを利用する。
【０１８５】
実施例１４：ＰＫＮ−ベータの局在シグナル
この実験では、種々のＰＫＮ−ベータ誘導体の局在を野生型ＰＫＮ−ベータの局在と比較した。図１４は、ＰＫＮベータ野生型（図１４Ａ）、ＰＫＮベータ誘導体ＴＡ（図１４Ｂ）、ＰＫＮベータ誘導体ＫＥ（図１４Ｃ）及びＰＫＮベータ デルタＮ（図１４Ｄ）のような、ＰＫＮベータ及びその誘導体の細胞内分布を共焦点蛍光顕微鏡法により調査した、写真を示している。ＨＡ標識したＰＫＮベータの組換え誘導体は、ＨｅＬａ細胞で４８時間一過性発現させた。固定及び透過性化後、組換えタンパク質の発現は、抗ＨＡ抗体と、続いてＦＩＴＣ結合抗マウス抗体を用いて検出した。細胞は、細胞骨格アクチンをローダミン−ファロイジンで標識することにより対比染色した。
【０１８６】
結果は、図１４Ａ〜１４Ｄに図解されるが、ここで複式写真の各左側の各写真は、ＦＩＴＣ特異的励起の細胞の写真に関し、そして右の写真は、ローダミン−ファロイジンに特異的な波長を用いて励起した同じ細胞を示している。ＦＩＴＣ染色は、各組換えタンパク質でトランスフェクトした細胞を示している。ローダミン−ファロイジン染色は、トランスフェクトした細胞としていない細胞を示している。
【０１８７】
図１４Ａから判るように、野生型ＰＫＮ−ベータは、大部分細胞の核に局在している。リン酸化部位突然変異のＰＫＮ−ベータＴＡ及びＫＥ突然変異株は両方とも、キナーゼ欠乏であり、野生型ＰＫＮ−ベータに比較して、もはや核内に集中していないが、むしろ細胞全体に行きわたっている。最後に、図１４Ｄに図解されるように、分子のＮ末端３番目を欠いており、そしてまたキナーゼ欠損である（図９を参照のこと）ＰＫＮ−ベータ誘導体ΔＮは、本質的に核から締め出されている。
【０１８８】
これらのデータは、核へのＰＫＮベータの正しい核内局在は、活性なキナーゼ分子として作用するその能力に依存し、そしてそのＮ末端ドメインの存在を必要とすることを示している。これは、ＰＩ−３キナーゼが、その細胞内局在をも調節するであろうことを意味する。
【０１８９】
明細書、配列リスト、請求の範囲及び／又は図面に開示される本発明の特色は、別々にも任意に組合せても、本発明をその種々の形態で実現するための構成要素である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼＮベータの使用に関する。
【０００２】
現代の医薬品開発は、もはや多かれ少なかれ発見的アプローチに基づくのではなく、典型的には疾患又は症状に内在する分子機序の解明、候補標的分子の同定及び該標的分子の評価を必要とする。一旦このような有効な標的分子（本明細書では標的とも呼ばれる）が利用可能になれば、これに向けられた医薬品候補を試験することができる。多くの場合、このような医薬品候補は、合成又は天然化合物よりなる化合物ライブラリーのメンバーである。またコンビナトリアルライブラリーの使用も普及している。このような化合物ライブラリーは、本明細書では候補化合物ライブラリーとも呼ばれる。過去において、このアプローチは成功したことが判明しているが、なお時間と費用のかかることである。現在は標的の同定と標的の検証には種々の技術が適用されている。
【０００３】
今だ多くの腫瘍及び癌は、ヒトの健康に対する大きな脅威である。副作用の少ない、より安全で強力な医薬品を創出するために、適切な化合物に対処されると、その活性又は存在に特異的かつ選択的に影響を受ける標的分子について知ることが必要である。有力な又は候補の医薬品であるかもしれない化合物と標的との間の好ましくは選択的かつ特異的な相互作用のため、例えば、癌、腫瘍形成及び転移のような疾患又は病状における標的の機能は影響を受け、そのため疾患が治療又は予防され、そして病状が改善する。
【０００４】
したがって本発明に内在する問題は、腫瘍形成及び癌の治療における治療的アプローチに適した標的を提供することであった。腫瘍形成及び転移に関係する標的を提供することが、本発明に内在する更に別の問題であった。
【０００５】
本発明に内在する問題は、第１の態様において、ＰＩ３−キナーゼ経路の下流の標的としての、好ましくはＰＩ３−キナーゼ経路の下流の薬物標的としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用により解決される。
【０００６】
本発明に内在する問題は、第２の態様において、疾患の治療及び／又は予防用の医薬の製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【０００７】
本発明の第１及び第２の態様による使用の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータは、配列番号１による、又はデータバンクエントリーＰＩＤ ｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有する。
【０００８】
本発明に内在する問題は、第３の態様において、疾患の治療及び／又は予防のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸、又はその断片若しくは誘導体の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【０００９】
本発明の第３の態様による使用の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータは、配列番号１による、又はデータバンクエントリーＰＩＤ ｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有する。
【００１０】
本発明の第３の態様による使用の別の実施態様において、核酸は、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸である。
【００１１】
本発明の態様のいずれかによる使用の別の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータは、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸によりコードされる。
【００１２】
本発明の第３の態様による使用の好ましい実施態様において、核酸配列は、遺伝暗号の縮重を別にして、本発明の第３の態様にしたがう本発明の核酸にハイブリダイズする。
【００１３】
本発明の態様のいずれかによる使用の更に別の実施態様において、核酸配列は、ストリンジェントな条件下で、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸配列又はその一部にハイブリダイズする核酸配列である。
【００１４】
本発明の任意の態様による使用の好ましい実施態様において、該疾患に関係する細胞がＰＴＥＮ活性を欠いているか、攻撃的挙動の増大を示すか、又は後期腫瘍の細胞であることを特徴とすることを、この疾患は特徴とする。
【００１５】
本発明の第３の態様による使用の更に好ましい実施態様において、疾患は後期腫瘍である。
【００１６】
本発明に内在する問題は、第４の態様において、疾患の治療及び／又は予防用薬のスクリーニングのための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための方法（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）であって、以下：
ａ）候補化合物を用意する工程、
ｂ）プロテインキナーゼＮベータ用の発現系及び／又はプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系を用意する工程；
ｃ）候補化合物を、プロテインキナーゼＮベータ用の発現系及び／又はプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系と接触させる工程；
ｄ）プロテインキナーゼＮベータの発現及び／又は活性が、候補化合物の影響下で変化するかどうかを決定する工程
を含むことを特徴とする方法により解決される。
【００１７】
本発明の第４の態様による方法の実施態様において、候補化合物は、化合物のライブラリーに含まれる。
【００１８】
本発明の第４の態様による方法の別の実施態様において、候補化合物は、ペプチド、タンパク質、抗体、アンチカリン、機能性核酸、天然化合物及び低分子を含む化合物類の群から選択される。
【００１９】
本発明の第４の態様による方法の好ましい実施態様において、機能性核酸は、アプタマー、アプタザイム、リボザイム、スピーゲルマー（spiegelmer）、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡを含む群から選択される。
【００２０】
本発明の第４の態様による方法の更に別の好ましい実施態様において、プロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸は、本発明の任意の他の態様に関連して記載されるものである。
【００２１】
本発明に内在する問題は、第５の態様において、疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発及び／又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、標的分子としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸又はその一部若しくは誘導体の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００２２】
本発明の第５の態様による使用の実施態様において、医薬及び／又は診断薬は、抗体、ペプチド、アンチカリン、低分子、アンチセンス分子、アプタマー、スピーゲルマー及びＲＮＡｉ分子を含む群から選択される作用物質を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の第５の態様による使用の好ましい実施態様において、この作用物質は、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する。
【００２４】
本発明の第５の態様による使用の代替の実施態様において、この作用物質は、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と、特にプロテインキナーゼＮベータのｍＲＮＡ、ゲノム核酸又はｃＤＮＡと相互作用する。
【００２５】
本発明に内在する問題は、第６の態様において、疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチドの使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００２６】
本発明の第６の態様による使用の実施態様において、ポリペプチドは、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に対する抗体、及びプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に結合するポリペプチドを含む群から選択される。
【００２７】
本発明に内在する問題は、第７の態様において、疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００２８】
本発明の第７の態様による使用の実施態様において、核酸は、アプタマー及びスピーゲルマーを含む群から選択される。
【００２９】
本発明に内在する問題は、第８の態様において、疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸の使用により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００３０】
本発明の第８の態様による使用の実施態様において、相互作用する核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び／又はｓｉＲＮＡである。
【００３１】
本発明の第８の態様による使用の更に別の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡである。
【００３２】
本発明の第８の態様による使用の実施態様において、プロテインキナーゼＮベータ及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸は、本発明の任意の態様に関連して記載されるものである。
【００３３】
本発明に内在する問題は、第９の態様において、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と、あるいはプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する低分子；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に特異的な抗体；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチド；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸；あるいはプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質、及び少なくとも１つの薬剤学的に許容しうる担体を含む、好ましくは疾患の予防及び／又は治療のための薬剤組成物により解決される（ここで、疾患は、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される）。
【００３４】
本発明に内在する問題は、第１０の態様において、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、疾患又は症状の特性解析のためのキットであって、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に特異的な抗体、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチド、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用するポリペプチド、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質、及び場合により少なくとも１つの他の化合物を含むことを特徴とするキットにより解決される。
【００３５】
驚くべきことに本発明者らは、ＰＫＮベータとも呼ばれるプロテインキナーゼＮベータが、癌及び腫瘍に関連して有用な標的であることを見い出した。更に詳細には、本発明者らは、プロテインキナーゼＮベータが、ＰＩ−３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の下流の標的であることを発見した。更に驚くべきことに本発明者らは、プロテインキナーゼＮベータが、腫瘍形成及び転移に関連していることを発見した。特に後者の作用は、サプレッサー機能、更に具体的にはＰＴＥＮ腫瘍サプレッサー機能の消失に強く関連していると考えられる。実施例において証明されるように、プロテインキナーゼＮベータは、ＰＩ−３キナーゼ経路に対するインヒビターであるＰＴＥＮが活性でない条件下でアップレギュレートされる。プロテインキナーゼＮベータのアップレギュレーションのため、このようなアップレギュレーションが起こる細胞は、転移挙動及び遊走挙動の増大を示す。これは、プロテインキナーゼＮベータのインヒビターが、細胞の転移及び遊走挙動を制御するのに適切な手段であること、並びにこれが腫瘍及び癌、更に詳細には転移性であり、かつその細胞が転移及び／又は遊走挙動を示す腫瘍及び癌（本明細書では一般に、「本明細書に記載される疾患」又は「本明細書に記載される病状」と呼ばれる）の治療に適切な手段であることを意味する。本明細書に記載される疾患並びに本明細書に記載される病状はまた、腫瘍形成及び転移を含むことを特徴とする。これは特に、本明細書に記載される疾患及び本明細書に記載される病状に適用されるが、ここでこのような疾患又は病状に関係する細胞は、ＰＴＥＮ陰性であって、そしてこのことは、腫瘍サプレッサーＰＴＥＮが活性でないか、又は活性のレベルが低下していることを意味する。これらの疾患はまた、ＰＩ３−キナーゼ経路が一般に関係している疾患も含む。特に転移性腫瘍のほかに、糖尿病が、それぞれこの種の疾患及び病状に属する。したがって、細胞、特に本明細書に記載される疾患又は病状に関係し、そしてＰＴＥＮ陰性である細胞は、その作用のモードが、それぞれ関係する細胞におけるプロテインキナーゼＮベータの活性を低下又は排除するものである、薬物による治療に感受性である。よって、その腫瘍が好ましくは過剰活性化ＰＩ３−キナーゼ経路（特に限定されないが、ＰＩ３−キナーゼ経路の遺伝子コード成分（ｐ１１０、Ａｋｔ）の増幅又は突然変異のいずれかを介する）を特徴とするか、又はＰＴＥＮ陰性である患者、あるいはＰＴＥＮ陰性である細胞（特にこれらの細胞が、本明細書に記載される疾患に、又は本明細書に記載される病状に関係しているならば）を有する患者は、有利には該薬物を用いて治療することができる。このような活性の低下は、転写レベル又は翻訳のレベル（即ち、プロテインキナーゼＮベータの酵素活性）での低下のいずれかに由来するだろう。何らかの学説に捕らわれるつもりはなく、後者の態様、即ち、プロテインキナーゼＮベータの活性を修飾することもまた、ＰＫＮベータの特性に関する本発明者らの洞察力（即ち、ＰＫＮベータの酵素活性もまた、アップ−及びダウン−レギュレート、好ましくはダウン−レギュレートすることができること）に由来する成果である。
【００３６】
該薬物を用いて有利に治療することができる患者の更に別の群は、ＰＴＥＮ機能の消失の発生率の高い癌、特に後期腫瘍に罹患している患者である（Cantley, L.C.とNeel, B.G. (1999) 「腫瘍抑制への新しい洞察：ＰＴＥＮはホスホイノシチド３−キナーゼ／ＡＫＴ経路を抑止することにより腫瘍形成を抑制する（New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway）」 Proc Natl Acad Sci USA 96, 4240-4245；Ali, I.U. (2000) 「子宮内膜のためのゲートキーパー：ＰＴＥＮ腫瘍サプレッサー遺伝子（Gatekeeper for endometrium: the PTEN tumor suppressor gene）」 J Natl Cancer Inst 92, 861-863 ）。ＰＴＥＮの消失は、各腫瘍細胞の攻撃的及び侵襲的挙動の増大に相関する。このため、本発明の好ましい実施態様において、プロテインキナーゼＮベータ又はこれをコードする核酸に向けられた、それぞれ、本発明の種々の態様に関連して分析道具又は手段としても使用することができる診断薬、並びに治療薬は、上述の前提条件が満たされれば、即ち、ＰＴＥＮが攻撃的及び侵襲的挙動の増大に相関すれば、任意の腫瘍に使用することができる。
【００３７】
この種の薬物は、本明細書に与えられる開示、即ち、プロテインキナーゼＮベータが下流の薬物標的であること、並びにプロテインキナーゼＮベータが腫瘍形成及び転移並びにこれらに関連するか又は由来する疾患の標的であることに基づいて、設計、スクリーニング又は製造することができる。
【００３８】
プロテインキナーゼＮベータが上に略述されるような機序に関係しているため、これはまた、ある細胞又はこの種の細胞を体内に有する患者の、それぞれ転移及び腫瘍形成を受けるかどうかの状態を診断するためのマーカーとして使用することができる。この種のアプローチが役立ち、この目的に適用可能な一例としては、例えば、ＩＣＡＭ−１がある。ＩＣＡＭ−１は、転移を受ける胃癌の予後において使用される（Maruo Y, Gochi A, Kaihara A, Shimamura H, Yamada T, Tanaka N, Orita K, Int J Cancer, 2002 Aug 1; 100(4): 486-490）が、ここでｓ−ＩＣＡＭ−１レベルは、肝転移した患者において上昇していることが判った。別の例では、オステオポンチンが、乳癌の予後マーカーとして使用される（Rudland PS, Platt-Higgins A, El-Tanani M, De Silva Rudland S, Barraclough R, Winstanley JH, Howitt R, West CR, Cancer Res. 2002 Jun 15; 62(12): 3417-3427）。プロテインキナーゼＮベータの存在又は存在のレベル（タンパク質又はｍＲＮＡ）又は活性のレベルが、マーカーとして使用される限り、プロテインキナーゼＮベータと多少とも特異的に相互作用する任意の化合物は、よって適切な診断薬になる。
【００３９】
いずれにせよプロテインキナーゼＮベータと特異的及び／又は選択的に相互作用する薬物及び診断薬の方法及び設計の原則は、以下に開示される。
【００４０】
これらの知見に照らして、キナーゼＮベータは、典型的にはＰＩ−３キナーゼ経路に関連する態様の一部だけ（即ち、転移及び遊走）の選択的調節、並びに典型的にはＰＩ３−キナーゼ経路に関連するプロセス（更に具体的には、転移及び遊走）の選択的かつ特異的な診断的アプローチ（即ち、検出）を可能にする、適切な下流の薬物標的であることが判明する。
【００４１】
ＰＩ３−キナーゼ経路は、増殖因子誘導に及ぼすＰＩ３−キナーゼ活性及び平行シグナル伝達経路（parallel signalling pathway）を特徴とする。細胞の増殖因子刺激は、細胞膜のその同種の受容体の活性化をもたらし、そして次にＰＩ３−キナーゼのような細胞内シグナル伝達分子と結合してこれを活性化する。ＰＩ３−キナーゼ（調節性ｐ８５及び触媒性ｐ１１０サブユニットからなる）の活性化により、リン酸化によりＡｋｔの活性化が起こり、これによって増殖、生存又は遊走のような更に下流の細胞応答を支持する。よってＰＴＥＮは、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３−キナーゼ経路に関係しており、そして細胞増殖及び形質転換の調節におけるその役割について過去に広範に研究されてきた腫瘍サプレッサーである（総説については、Stein, R.C.とWaterfield, M.D. (2000) 「ＰＩ３−キナーゼ阻害：医薬品開発の標的？（PI3-kinase inhibition: a target for drug development?）」 Mol Med Today 6, 347-357；Vazquez, F.とSellers, W.R. (2000) 「ＰＴＥＮ腫瘍サプレッサータンパク質：ホスホイノシチド３−キナーゼシグナル伝達のアンタゴニスト（The PTEN tumor suppressor protein: an antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling）」 Biochim Biophys Acta 1470, M21-35；Roymans, D.とSlegers, H. (2001) 「腫瘍の進行におけるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression）」 Eur J Biochem 268, 487-498を参照のこと）。腫瘍サプレッサーＰＴＥＮは、ＰＩ３−キナーゼ触媒反応を逆転させることによりＰＩ３−キナーゼの負のレギュレーターとして機能し、これによって経路の活性化が一時的かつ制御下で起こることを保証する。ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の慢性過剰活性化は、ＰＴＥＮの機能性不活化により引き起こされる。ＰＩ３−キナーゼ活性は、低分子インヒビターのＬＹ２９４００２の添加によりブロックすることができる。平行経路において作用するシグナル伝達キナーゼＭＥＫの活性及び下流応答は、例えば、低分子インヒビターのＰＤ９８０５９により阻害することができる。
【００４２】
ＰＴＥＮ機能の消失によるＰＩ３−キナーゼ経路の慢性活性化は、腫瘍形成及び転移への主要な引き金であり、この腫瘍サプレッサーが、制御された細胞増殖の重要なチェックポイントであることを示している。ＰＴＥＮノックアウト細胞は、ＰＩ３−キナーゼ経路が、ＰＩ３−キナーゼの活性化型を介して慢性に誘導されている細胞と同様の特徴を示す（Di Cristofano, A., Pesce, B., Cordon-Cardo, C.及びPandolfi, P.P. (1998) 「ＰＴＥＮは、胚発生及び腫瘍抑制に必須である（PTEN is essential for embryonic development and tumour suppression）」 Nat Genet 19, 348-355；Klippel, A., Escobedo, M.A., Wachowicz, M.S., Apell, G., Brown, T.W., Giedlin, M.A., Kavanaugh, W.M.及びWilliams, L.T. (1998) 「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化は細胞周期エントリーに充分であり、発癌性形質転換に典型的な細胞変化を促進する（Activation of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic of oncogenic transformation）」 Mol Cell Biol 18, 5699-5711；Kobayashi, M., Nagata, S., Iwasaki, T., Yanagihara, K., Saitoh, I., Karouji, Y., Ihara, S.及びFukui, Y. (1999) 「ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの活性化による腺癌の脱分化（Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation of phosphatidylinositol 3-kinase）」 Proc Natl Acad Sci USA 96, 4874-4879）。
【００４３】
ＰＴＥＮは、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ経路、Ａｋｔ経路、ＥＧＦ関連オートクリンループ及びｍＴＯＲ経路のような、ＰＴＥＮ関連経路とも呼ばれる幾つかの経路に関係する。ＰＩ３−キナーゼ経路とは実際、ＰＩ３−キナーゼを直接又は間接のいずれかで伴う任意の経路である。ＰＩ３−キナーゼは、このような経路においてインヒビター又はアクチベーターのいずれかとして作用することができるか、あるいはそれ自体、経路の他の要素により調節されることもある。
【００４４】
ＰＩ３−キナーゼ経路に関係する疾患及び症状を報告する豊富な先行技術が存在する。よってこれらの症状及び疾患のどれもが、本発明の方法及び薬物及び診断薬により対処することができ、その設計、スクリーニング又は製造法が本発明において教示される。限定ではなく説明のため、以下に言及される：子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、腺癌、子宮内膜増殖症、コーデン（Cowden's）症候群、遺伝性非ポリープ症性結腸直腸癌、リー・フラウメニ（Li-Fraumene's）症候群、乳癌卵巣癌（breast-ovarian cancer）、前立腺癌（Ali, I.U., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, no. 11, June 07, 2000, page 861-863）、バナヤン・ゾナナ（Bannayan-Zonana）症候群、ＬＤＤ（レルミット・デュクロス（Lhermitte-Duclos'）症候群）（Macleod, K., 上記文献）、狂牛病（ＣＤ）及びバナヤン・ルバルカバ・ライリー（Bannayan-Ruvalcaba-Riley）症候群（ＢＲＲ）を含む過誤腫−大頭蓋症、粘膜皮膚病変（例えば、毛根鞘腫）、大頭蓋、精神遅滞、胃腸過誤腫、脂肪腫、甲状腺腫、乳房線維嚢胞病、小脳異形成神経節細胞腫並びに乳房及び甲状腺の悪性腫瘍（Vazquez, F., Sellers, W.R., 上記文献）。
【００４５】
この点から見て、プロテインキナーゼＮベータは、プロテインキナーゼＮベータの上流の標的に対する他の薬物に比べて副作用の少ない薬物により対処することができる、ＰＩ３−キナーゼ経路の有用な下流の薬物標的である。その範囲において本発明は、例えば、ＬＹ２９４００２のような当該分野において知られている薬物よりも選択性が高い、薬剤学的に活性な化合物の設計、スクリーニング、開発及び製造に適した薬物標的を提供する。エフェクター分子のこの特定の部分、即ち、プロテインキナーゼＮベータ及びこの経路に関係する任意の他の下流の分子を支配することにより、このシグナル伝達カスケードにおける、その非常に限定された数の平行分岐又は更に別の上流の標的だけが、有害作用を引き起こすようである。したがって、細胞周期、ＤＮＡ修復、アポトーシス、ブドウ糖輸送、翻訳に関連するＰＩ−３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の他の活性は、影響を受けない。また、インスリンシグナル伝達は誘導されないが、これは、ＬＹ２９４００２の使用に関連して観察される糖尿病性応答又は他の副作用が実際に回避されることを意味する。ＬＹ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニルクロモン）は、リリー研究実験室（Lilly Research Laboratories）（インディアナポリス）によりＰＩ−３Ｋのインヒビターとして開発された幾つかのクロモン誘導体の低分子インヒビターの１つである（Vlahosら 1994, JBC 269, 5241-5248）。これは、ＰＩ−３Ｋ分子の触媒サブユニットのｐ１１０を標的とし、触媒中心でのＡＤＰ結合と競合することにより機能する。しかし、ＬＹ２９４００２は、異なる細胞内機能を有することが示唆されている、ｐ１１０の種々のアイソホーム（アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ）を識別することができない。
【００４６】
プロテインキナーゼＮベータはまた、ラパマイシンにより対処されるｍＴＯＲの更に下流でもある。Ｒａｆｔ又はＦＲＡＰとしても知られている、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的（mammalian Target Of Rapamycin ））は、ＰＩ３−キナーゼの下流で作用して、細胞周期へのｐｐ７０ Ｓ６キナーゼ依存性エントリーのようなプロセスを調節する。ｍＴＯＲは、ｐｐ７０ Ｓ６キナーゼ及び開始因子４Ｅを活性化することにより翻訳を制御するために、増殖因子及び栄養利用性のセンサーとして作用する。ｍＴＯＲ機能は、Ｔ細胞及びある種の腫瘍細胞の増殖をブロックする、細菌性マクロライドのラパマイシンにより阻害される（KuruvillaとSchreiber 1999, Chemistry & Biology 6, R129-R136）。
【００４７】
ラパマイシンとその誘導体が、現在臨床で使用されている適切な薬物であるという事実は、薬物標的がより有用で、副作用が少ないほど、それが、例えば、Yuらにより証明されたように特定の分子機序に対して特異的であることを立証している（Yu, K.ら (2001) Endocrine-Relat Canc 8, 249）。
【００４８】
プロテインキナーゼＮベータは、全てがプロテイン−セリン／トレオニンキナーゼであると言われているプロテインキナーゼＣファミリーの一員である。典型的には、この種のプロテインキナーゼは、１つの調節サブユニットと１つの触媒サブユニットを含み、カルシウムイオンとリン脂質をコファクターとして利用する。ジアシルグリセロールは、この種のプロテインキナーゼファミリーのアクチベーターとして作用する。プロテインキナーゼＣファミリーのメンバーは、ホルモン又は神経伝達物質に関連する幾つかのシグナル伝達経路に関係している。これらのプロテインキナーゼは、リン酸化によりその標的タンパク質の活性を調節する。当該分野では、プロテインキナーゼＣの非生理的な連続した活性化により、癌の発生に至りかねない形質転換した細胞表現型が生じることが知られている。
【００４９】
ｍＲＮＡとしてのプロテインキナーゼＮベータの完全な配列は、データバンクで、例えば、アクセッション番号ｇｉ７０１９４８８又はＮＭ＿０１３３５５の下に利用可能である。遺伝暗号を用いて、このｍＲＮＡから特定のアミノ酸配列を推定することができる。また、プロテインキナーゼＮベータのアミノ酸配列は、データバンクでアクセッション番号ｇｉ７０１９４８９又はＮＰ＿０３７４８７．１の下に利用可能である。所望の効果が実現できる限り、これの誘導体又は切断型を本発明により使用できることは、本発明に含まれる。よって誘導体化及び切断の程度は、当業者であればルーチン分析により求めることができる。核酸配列については、上述のアクセッション番号により特定される核酸に、又は上述のアミノ酸配列から誘導することができる任意の核酸配列にハイブリダイズしている核酸配列もまた、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸配列という用語に含まれる。このようなハイブリダイゼーションは、当業者には公知である。このようなハイブリダイゼーションの特殊性は、Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T. (1989) 「分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.）」 Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratoryから理解することができる。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、厳密条件下でのハイブリダイゼーションである。更に、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸はまた、上述の核酸配列のいずれかに相同な核酸配列である（ここで、相同の程度は、好ましくは７５、８０、８５、９０又は９５％である）。プロテインキナーゼＮベータに関連する更に別の参考文献は、特に、Shibata H.ら, J. Biochem. (Tokyo) 2001 Jul; 130(1): 23-31；Dong, LQ, Proc Natl Acad Sci USA, 2000, May 09; 97(10): 5089-5094；及びOishi, K., Biochem Biophys Res Commun. 1999, Aug. 11; 261(3): 808-814である。
【００５０】
ヒトプロテインキナーゼＮベータに対する相同体は、特に、ハツカネズミ（M. musculus）、ドブネズミ（R. norvegicus）、シロイヌナズナ（A. thaliana）、シー・エレガンス（C. elegans）、ディー・メラノガステル（D. melanogaster）及びサッカロミケス・セレビシエ（S. cerevisiae）に見い出すことができる。同一性パーセントと整列領域の長さは、前述の多様な種について、それぞれ、６７％と２７９アミノ酸、５１％と８６６アミノ酸、３８％と３０５アミノ酸、３６％と８６１アミノ酸、６３％と２９６アミノ酸及び４４％と３６２アミノ酸である。当業者であれば、このような相同体を用いて生成した薬物又は診断薬がヒトプロテインキナーゼＮベータ又は任意の他の所望のプロテインキナーゼＮベータとなおも相互作用するのでなければ、これらや他の相同体のいずれもが、原則として本発明の実施に適していると認めるであろう。
【００５１】
ヒトアミノ酸配列はまた、ＰｒｏｔＥＳＴ、アクセッション番号ｐｉｒ：ＪＣ７０８３（ここで、各プロテインキナーゼＮベータは、ＪＣ７０８３プロテインキナーゼと呼ばれる）から取ることができる。ヒトプロテインキナーゼＮベータの遺伝子は、ヒト９番染色体上に位置する。プロテインキナーゼＮベータのｃＤＮＡソースは、一般に幾つかの癌及び種々の胎児性又は胚性組織、更に具体的には、特に、胃癌、腺癌、脳腫瘍、乳癌、バーキット腫、リンパ腫、子宮頚癌、軟骨肉腫、結腸癌、胎児眼、胎児レンズ、胎児前眼部、胎児視神経、胎児網膜、胎児網膜中心窩、胎児黄斑、胎児脈絡膜、線維莢膜細胞腫、生殖細胞系、頭部、頚部、心臓、腎臓、大細胞癌、平滑筋肉腫、転移性軟骨肉腫、卵巣、副甲状腺、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小細胞癌、扁平上皮癌、睾丸、及び子宮である。このリストから、本明細書に与えられた技術的教示によりそれぞれ設計、スクリーニング又は製造される、本明細書において医薬とも呼ばれる薬物、及び病期決定薬（即ち、罹患しているかもしれない疾患の病期に関して患者の状態を識別するために使用することができる作用物質）を含む、更には患者に適用された処置の有効性をモニターするための診断薬が、本明細書に開示される他の疾患及び本明細書に開示される病状のいずれかに加えて、これらの疾患又は特定の細胞、組織若しくは臓器に関係する任意の疾患の治療、予防、診断、予後及びモニターにも使用できることは自明である。これらの疾患及び病状もまた、「本明細書に記載される疾患」という用語に含まれるものとする。
【００５２】
本明細書に開示される驚くべき知見に照らして、プロテインキナーゼＮベータは、それ自体、本明細書に記載される種々の疾患及び病状の予防及び／又は治療用の医薬として、並びにそのような目的の医薬の製造のために、及び診断薬の製造のために使用することができる。
【００５３】
上記と同義のプロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体がそのまま医薬として使用される場合に、好ましくは天然のプロテインキナーゼＮベータに対する競合物質として使用され、よってその正常な生物学的機能を妨害する。この目的に使用されるプロテインキナーゼＮベータは、触媒として不完全であることが特に好ましい。この種のプロテインキナーゼＮベータは、それぞれ生物体及び細胞に適用できるか、又は遺伝子治療によって生物体及び各細胞に導入することができる。
【００５４】
それ自体が見込みある薬物であることを別にして、プロテインキナーゼＮベータは、そこに化学物質（薬物若しくは薬物候補として、又は診断薬として使用することができる）を向けられる化合物として使用することができる。これらの化学物質は、抗体、ペプチド、アンチカリン、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ並びに低分子のような、種々の化合物類に属する。この化合物は、物理的若しくは化学的実体としてのプロテインキナーゼＮベータそれ自体、又はプロテインキナーゼＮベータに関連する情報のいずれかを使用することにより、設計、選択、スクリーニング、生成及び／又は製造される。該化合物類の設計、選択、スクリーニング、生成及び／又は製造プロセスにおいて、プロテインキナーゼＮベータはまた、それを必要とする患者への各化合物の最終的な適用よりはむしろ、そのプロセスにおいて使用される標的と見なされよう。種々の化合物類を提供するプロセスにおいて、本明細書においてプロテインキナーゼＮベータとも呼ばれるタンパク質のプロテインキナーゼＮベータ、又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸のいずれかを使用することができる。本明細書において使用されるときプロテインキナーゼＮベータという用語は、同様にそれ自体医薬として又は診断薬として適用されると活性な、各分類の化合物の該化合物類の設計、選択、スクリーニング、生成及び／又は製造を可能にする、プロテインキナーゼＮベータの任意の断片又は誘導体を含む。本明細書において使用されるときプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸という用語は、上記と同義のプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸、又はその一部を含む、任意の核酸を含むものとする。プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸の一部は、同様にそれ自体医薬として又は診断薬として適用されると活性な、該化合物類の設計、選択、スクリーニング、生成及び／又は製造になお適している限り、そのようなものと見なされる。プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸は、ゲノム核酸、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はそれぞれの一部であってよい。
【００５５】
上に略述されるように、本明細書に記載される、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、あるいはその核酸配列を別にして、プロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸から生じる作用を生み出すか又は抑制するために、他の手段又は化合物も利用できるということは、本発明に含まれる。このような手段は、スクリーニング法で決定又は選択することができる。このようなスクリーニング法において、第１工程は、１つ又は幾つかのいわゆる候補化合物を用意することである。本発明において使用されるとき、候補化合物とは、その適合性が、本明細書に記載される種々の疾患及び本明細書に記載される病状を治療又は緩和するための試験系において試験されるか、あるいはこの種の疾患及び病状のための診断手段又は診断薬として利用される、化合物である。候補化合物が、試験系においてそれぞれの作用を示すならば、該候補化合物は、該疾患及び病状の治療に適した手段又は作用物質であり、原則としてその上に該疾患及び病状に適した診断薬である。第２工程において、候補化合物は、プロテインキナーゼＮベータ発現系又はプロテインキナーゼＮベータ遺伝子産物（好ましくはｈｎＲＮＡ若しくはｍＲＮＡのような各遺伝子発現産物）、又はプロテインキナーゼＮベータ活性系又はプロテインキナーゼＮベータと接触させる。プロテインキナーゼＮベータ活性系はまた、本明細書においてプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系とも呼ばれ、かつ／又は好ましくはその検出する系の意味でも活用できる。
【００５６】
プロテインキナーゼＮベータ発現系は、基本的にはプロテインキナーゼＮベータの発現を示すか又は表示する発現系（ここで、発現の程度又はレベルは基本的には変化させられる）である。好ましくは、プロテインキナーゼＮベータ活性系は、本質的には、プロテインキナーゼＮベータの発現というよりはむしろ活性又は活性の状態が測定される発現系である。あるいは、プロテインキナーゼ活性系は、その活性を測定することができるプロテインキナーゼＮベータ、又はプロテインキナーゼＮベータを提供するか若しくはこれを含む系である。これらの系のいずれかにおいて、候補化合物の影響下でプロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸の活性が、候補化合物なしの状況とは異なるかどうかが試験される。特定の系が発現系又は活性系のいずれであるかに関わらず、それぞれ活性及び発現の増大又は低下のいずれかが起こり、そして測定できることは本発明の範囲に含まれる。典型的には、発現系及び／又は活性系は、細胞抽出物又は核抽出物などの細胞抽出物の画分のようなインビトロ反応である。本明細書において使用されるときプロテインキナーゼＮベータ発現系はまた、細胞、好ましくは本明細書に記載される疾患及び本明細書に記載される病状に関係する組織又は臓器の細胞であってもよい。
【００５７】
活性系又は発現系に増大又は低下があるかどうかは、例えば、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸（更に具体的にはｍＲＮＡ）の量の増大又は低下、あるいは候補化合物の影響下で発現されるプロテインキナーゼＮベータの増大又は低下を測定することにより、発現の各レベルで決定することができる。測定、更に具体的にはｍＲＮＡやタンパク質などのこの種の変化の定量測定に必要な技術は、当業者には知られている。また、例えば、適切な抗体の使用による、プロテインキナーゼＮベータの量又は含量を測定するための方法も当業者には知られている。抗体は、当業者に知られているように、そして、例えば、Harlow, E.,とLane, D., 「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されるように作成することができる。
【００５８】
プロテインキナーゼＮベータ発現系の場合は、プロテインキナーゼＮベータの活性の増大又は低下は、好ましくは機能性アッセイにおいて測定することができる。
【００５９】
候補化合物と、それぞれ発現系及び活性系との接触は、通常候補化合物の水溶液を、一般に本明細書では試験系と呼ばれる各反応系に加えることにより実行される。水溶液の他に、有機溶媒中の候補化合物の懸濁液又は溶液も使用することができる。この水溶液は、好ましくは緩衝液である。
【００６０】
好ましくは、それぞれ発現系及び活性系を用いる各測定において、単一候補化合物だけを使用する。しかし、幾つかのこの種の試験を高速大量処理系で平行して実行することも本発明に含まれる。
【００６１】
本発明の方法における更なる工程は、候補化合物の影響下で、それぞれ発現系及び活性系の発現又は活性が、プロテインキナーゼＮベータ又はこれをコードする核酸に対応して変化するかどうかを求めることにある。典型的には、これは、候補化合物を加えた系の反応を候補化合物の添加なしのものに対して比較することにより行われる。好ましくは、候補化合物は、化合物のライブラリーの一員である。基本的には、化合物の分類に関わらず、化合物の任意のライブラリーが本発明の目的に適している。化合物の適切なライブラリーは、特に、低分子、ペプチド、タンパク質、抗体、アンチカリン及び機能性核酸よりなるライブラリーである。これらの化合物は、当業者に知られているように、そして本明細書で略述されるように生成することができる。
【００６２】
プロテインキナーゼＮベータのタンパク質又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸に特異的な抗体の製造法は、当業者には知られており、そして例えば、Harlow, E.,とLane, D., 「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。好ましくは、本発明に関しては、CesarとMilsteinのプロトコール及びこれに基づく更に別の成果により製造することができるモノクローナル抗体を使用することができる。本明細書において使用されるとき抗体は、特に限定されないが、プロテインキナーゼＮベータへの結合に適切であり、かつこれが可能である限り、完全な抗体、抗体断片又は誘導体（Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片及び１本鎖抗体など）を含む。モノクローナル抗体は別として、ポリクローナル抗体も使用及び／又は作成することができる。ポリクローナル抗体の作成もまた当業者には知られており、そして例えば、Harlow, E.,とLane, D., 「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。好ましくは、治療目的に使用される抗体は、ヒト化されているか、又は上記と同義のヒト抗体である。
【００６３】
本発明に使用することができる抗体には、１つ又は幾つかのマーカー又は標識があってもよい。このようなマーカー又は標識は、その診断応用又はその治療応用のいずれかにおいて抗体を検出するために有用であろう。好ましくはマーカー及び標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、金及びフルオレセインを含む群から選択され、そして例えば、ＥＬＩＳＡ法において使用される。これら及び更に別のマーカー並びに方法は、例えば、Harlow, E.,とLane, D., 「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988)に記載されている。
【００６４】
また、この標識又はマーカーが、検出とは別に、他の分子との相互作用のような追加の機能を示すことも本発明に含まれる。このような相互作用は、例えば、他の化合物との特異的な相互作用であってよい。これら他の化合物は、ヒト又は動物体のような、抗体が使用される系に固有のもの、あるいは各抗体を用いることにより分析される試料のいずれかであってよい。適切なマーカーは、例えば、ビオチン又はフルオレセインであってよく、こうしてマーキング又は標識された抗体と相互作用するために、各化合物又は構造上に存在するアビジン及びストレプトアビジンなどのような、その特異的な相互作用パートナーを伴う。
【００６５】
プロテインキナーゼＮベータのタンパク質又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸を用いて作成することができる、更に別の分類の医薬並びに診断薬は、これに結合するペプチドである。このようなペプチドは、ファージディスプレイ法のような最先端の方法を用いることにより作成することができる。基本的には、ファージの形などでペプチドのライブラリーを作成して、この種のライブラリーを標的分子（本発明の場合には、例えば、プロテインキナーゼＮベータ）と接触させる。このような標的分子に結合しているペプチドは、次に各反応から、好ましくは標的分子との複合体として取りだす。当業者には、この結合性が、少なくともある程度は、塩濃度などのような具体的に実現した実験設定に依存することが知られている。高い親和性又は大きな力で標的分子に結合しているペプチドを、ライブラリーの非結合メンバーから分離後、そして場合により標的分子とペプチドとの複合体からの標的分子の除去後、各ペプチドは、次に性状解析することができる。性状解析の前に、場合により、例えばペプチドをコードするファージを増殖させることにより、増幅工程が実現される。性状解析は、好ましくは標的結合ペプチドの配列決定を含む。基本的には、ペプチドは、その長さにおいて限定されないが、好ましくは約８〜２０アミノ酸の長さを持つペプチドが、好ましくは各方法で得られる。ライブラリーのサイズは、約１０2〜１０18個、好ましくは１０8〜１０15個の異なるペプチドであろうが、これに限定されない。
【００６６】
標的結合ポリペプチドの具体的な形は、いわゆる「アンチカリン」であり、これは特に、ドイツ特許出願DE 197 42 706に記述されている。
【００６７】
本発明により、プロテインキナーゼＮベータのタンパク質並びにプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸は、本明細書に記載される疾患及び本明細書に記載される病状の治療用の医薬の製造又は開発、並びに該疾患及び該病状の診断のための手段の製造及び／又は開発の標的として、スクリーニングプロセス（このスクリーニングプロセスでは、低分子又は低分子のライブラリーが使用される）において使用することができる。このスクリーニングは、標的分子を単一の低分子又は同時に若しくは連続して種々の低分子（好ましくは上に特定されるライブラリーからの低分子）と接触させる工程、及び標的分子に結合する低分子又はライブラリーのメンバー（他の低分子を伴ってスクリーニングされるならば、非結合又は非相互作用低分子から分離することができる）を同定する工程を含むことを特徴とする。結合及び非結合が、具体的な実験設定により強く影響を受けることは認められよう。反応パラメーターの厳密性を調節することで、結合と非結合の程度を変化させ、よってこのスクリーニングプロセスの微調整を可能にすることができる。好ましくは、標的分子と特異的に相互作用する１つ又は幾つかの低分子の同定後、この低分子を更に性状解析することができる。この更なる性状解析は、例えば、低分子の同定、並びにその分子構造と、更なる物理的、化学的、生物学的及び／又は医学的特性の決定にある。好ましくは、天然化合物は、約１００〜１０００Daの分子量を有する。また好ましくは、低分子は、当業者に知られているリピンスキー（Lepinsky）の５の規則を満たすものである。あるいは、低分子はまた、好ましくは非合成である天然産物とは対照的に、好ましくはコンビナトリアルケミストリーから生じる、合成低分子であると定義することもできる。しかし、これらの定義は、当該分野における各用語の一般的な理解にとって補助的なものに過ぎないことに注意すべきである。
【００６８】
また、プロテインキナーゼＮベータ及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸を、アプタマー及びスピーゲルマー（これらは次に、医薬又は診断薬のいずれかとして、直接又は間接に使用することができる）の製造又は選択のための標的分子として使用することも本発明に含まれる。
【００６９】
アプタマーは、１本鎖又は２本鎖のいずれかであり、そして標的分子と特異的に相互作用するＤ−核酸である。アプタマーの製造又は選択は、例えば、ヨーロッパ特許EP 0,533,838に記載されている。基本的には以下の工程が実現される。第１に、核酸の混合物、即ち、潜在的アプタマー（ここで、各核酸は、典型的には数個、好ましくは少なくとも８個の連続ランダム化ヌクレオチドのセグメントを含む）を用意する。この混合物を次に、標的分子と接触させるが、ここで核酸は、候補混合物に比較すると、標的に対する増大した親和性に基づくか、又は標的に対する大きな力で、標的分子に結合する。結合核酸は、次に混合物の残りから分離する。場合により、こうして得られる核酸は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して増幅する。これらの工程は、数回繰り返すことができ、そして最後には標的に特異的に結合する核酸の比が増大した混合物（場合により最終的な結合核酸は、ここから選択される）が得られる。これらの特異的に結合する核酸は、アプタマーと呼ばれる。アプタマーの作成又は同定のための方法の任意の段階で、標準法を用いてその配列を決定するために、個々の核酸の混合物の試料を取ることができる。例えば、アプタマーの作成の当業者には知られている規定の化学基を導入することにより、アプタマーを安定化できることは、本発明に含まれる。このような修飾は、例えば、ヌクレオチドの糖残基の２’位へのアミノ基の導入にある。アプタマーは、治療薬として現在使用されている。しかし、こうして選択又は作成したアプタマーを、医薬（好ましくは、低分子に基づく医薬）の開発のための標的検証のために、及び／又はリード化合物として使用できることもまた、本発明に含まれる。これは、実際には、標的分子とアプタマーとの間の特異的相互作用が候補薬物により阻害される、競合アッセイにより行われるが、ここで、標的とアプタマーとの複合体からのアプタマーの置換により、各薬物候補が、標的とアプタマーとの間の相互作用の特異的な阻害を可能にすることが推定でき、そして相互作用が特異的であるならば、該候補薬物は、少なくとも原則として、標的をブロックするのに適しており、よってこのような標的を含む各系においてその生物学的利用能又は活性を低下させる。こうして得られる低分子は次に、毒性、特異性、生分解性及び生物学的利用能のような、その物理的、化学的、生物学的及び／又は医学的特性を最適化するために、更に誘導体化及び修飾に付すことができる。
【００７０】
プロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸を用いて、本発明により使用又は作成することができるスピーゲルマーの作成又は製造は、同様の原理に基づく。スピーゲルマーの製造は、国際特許出願WO 98/08856に記載されている。スピーゲルマーは、Ｌ−核酸であって、このことは、これらが、アプタマーがそうであるようにＤ−ヌクレオチドからなるアプタマーというよりは、Ｌ−ヌクレオチドからなることを意味する。スピーゲルマーは、生物学的系において非常に高い安定性を持ち、そしてアプタマーと肩を並べて、これらが向けられる標的分子と特異的に相互作用するという事実を特徴とする。スピーゲルマーの作成を目的に、Ｄ−核酸の異常生殖集団が創出され、この集団を標的分子の光学対掌体と（本発明の場合には、例えば、天然のプロテインキナーゼＮベータのＬ−エナンチオマーのＤ−エナンチオマーと）接触させる。次に、標的分子の光学対掌体と相互作用しないＤ−核酸を分離する。しかし、標的分子の光学対掌体と相互作用するＤ−核酸は、分離し、場合により測定及び／又は配列決定し、続いてＤ−核酸から得られる核酸配列情報に基づいて、対応するＬ−核酸が合成される。標的分子の光学対掌体と相互作用する前述のＤ−核酸と、配列に関して同一であるこれらのＬ−核酸は、その光学対掌体とよりはむしろ天然の標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの作成のための方法と同様に、種々の工程を数回繰り返すこともでき、そうして標的分子の光学対掌体と特異的に相互作用する核酸を濃縮することができる。
【００７１】
プロテインキナーゼＮベータ又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸に基づいて、本明細書に開示されている標的分子として製造又は作成することができる更に別の化合物類は、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡである。
【００７２】
本発明の場合にはプロテインキナーゼＮベータである翻訳産物のレベルでは標的分子と相互作用しないが、むしろ転写産物、即ち、ゲノム核酸や、又はそれぞれ対応するｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡのような、そこから誘導される任意の核酸のような、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸とは相互作用することは、全ての前述の核酸の共通の特色である。この限りでは、前述の化合物類の標的分子は、好ましくはプロテインキナーゼＮベータのｍＲＮＡである。
【００７３】
リボザイムは、好ましくは基本的に２つの残基を含むＲＮＡからなる、触媒活性核酸である。第１の残基は、触媒活性を示すが、これに対して第２の残基は、標的核酸、本発明の場合にはプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸との特異的相互作用を担当する。典型的にはハイブリダイゼーション及び２本のハイブリダイズする鎖上の本質的に相補的な塩基のストレッチのワトソン・クリック（Watson-Crick）塩基対形成により、標的核酸とリボザイムの第２の残基との間で相互作用すると、触媒活性残基が活性になるが、これは、分子内又は分子間のいずれかで、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性である場合は標的核酸を触媒することを意味する。続いて、標的核酸の更なる分解が起こり、そして最後には、新たに合成されるプロテインキナーゼＮベータの欠乏と事前に存在するプロテインキナーゼＮベータの代謝回転のために、標的核酸並びに該標的核酸から誘導されるタンパク質（本発明の場合には、プロテインキナーゼＮベータである）の分解に至る。リボザイム、その使用及び設計の原理は、当業者には知られており、そして例えば、DohertyとDoudna（「リボザイム構造と機序（Ribozym structures and mechanism）」, Annu ref. Biophys. Biomolstruct. 2001; 30: 457-75）及びLewinとHauswirth（「リボザイム遺伝子治療（Ribozyme Gene Therapy）」, Applications for molecular medicine. 2001 7:221-8）に記載されている。
【００７４】
それぞれ、医薬の製造のための、及び診断薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、同様のモードの作用に基づく。基本的には、アンチセンスオリゴは、塩基の相補性に基づき、標的ＲＮＡと、好ましくはｍＲＮＡとハイブリダイズすることにより、ＲＮアーゼＨを活性化する。ＲＮアーゼＨは、ホスホジエステル及びホスホロチオエート結合ＤＮＡの両方により活性化される。しかしホスホジエステル結合ＤＮＡは、ホスホロチオエート結合ＤＮＡを除いて、細胞内ヌクレアーゼにより急速に分解する。これらの抵抗性の非天然ＤＮＡ誘導体は、ＲＮＡとのハイブリダイゼーションによりＲＮＡアーゼＨを阻害しない。言い換えると、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ有効である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、特に、米国特許US 5,849,902及びUS 5,989,912に記載されている。言い換えると、本発明の場合にはプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸である、標的分子の核酸配列に基づいて、各核酸配列を原則として推定できる標的タンパク質から、又は核酸配列それ自体（特にｍＲＮＡ）を知ることにより、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基の相補性の原理に基づいて設計することができる。
【００７５】
特に好ましいのは、短いストレッチのホスホロチオエートＤＮＡ（３〜９塩基）を有するアンチセンス−オリゴヌクレオチドである。細菌ＲＮアーゼＨの活性化には最低３個のＤＮＡ塩基が必要であり、そして哺乳動物ＲＮアーゼＨ活性化には最低５個の塩基が必要である。このようなキメラオリゴヌクレオチドには、ＲＮアーゼＨの基質を形成する中心領域があって、これが、ＲＮアーゼＨの基質を形成しない修飾ヌクレオチドからなるハイブリダイズする「アーム（arm）」に隣接している。キメラオリゴヌクレオチドのハイブリダイズするアームは、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロなどにより修飾されていてもよい。代替アプローチでは、該アームにメチルホスホネート又はホスホラミデート結合を利用した。本発明の実施に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの更に別の実施態様は、Ｐ−メトキシオリゴヌクレオチド、部分的Ｐ−メトキシオリゴデオキシリボヌクレオチド又はＰ−メトキシオリゴヌクレオチドである。
【００７６】
本発明に特にふさわしくかつ有用なのは、上記２つの引用したUS特許に更に詳細に記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、天然の５’→３’結合ヌクレオチドを含まない。正確にはこのオリゴヌクレオチドには２つのタイプのヌクレオチドがある：２’−デオキシホスホロチオエート（ＲＮアーゼＨを活性化する）と２’−修飾ヌクレオチド（活性化しない）。２’−修飾ヌクレオチドの間の結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート又はＰ−エトキシホスホジエステルであってよい。ＲＮアーゼＨの活性化は、細菌ＲＮアーゼＨを活性化するための３〜５個の間の２’−デオキシホスホロチオエートヌクレオチドを含み、そして真核生物及び特に哺乳動物ＲＮアーゼＨを活性化するための５〜１０個の間の２’−デオキシホスホロチオエートヌクレオチドを含む、隣接ＲＮアーゼＨ活性化領域により達成される。分解からの保護は、５’及び３’末端塩基を高度にヌクレアーゼ抵抗性にすることにより、そして場合により３’末端ブロック基を配置することにより達成される。
【００７７】
更に詳細には、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端及び３’末端；並びに２’−修飾ホスホジエステルヌクレオチド及び２’−修飾Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチドよりなる群から独立に選択される、１１〜５９個の５’→３’結合ヌクレオチドを含むことを特徴とする（ここで、５’末端ヌクレオシドは、３〜１０個の間の隣接ホスホロチオエート結合デオキシリボヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性化領域に結合しており、そして該オリゴヌクレオチドの３’末端は、逆向きデオキシリボヌクレオチド、１〜３個のホスホロチオエート２’−修飾リボヌクレオチドの隣接ストレッチ、ビオチン基及びＰ−アルキルオキシホスホトリエステルヌクレオチドよりなる群から選択される）。
【００７８】
また、５’末端ヌクレオシドが、ＲＮアーゼＨ活性化領域に結合していないが、３’末端ヌクレオシドは上に特定されているとおりのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してもよい。また、５’末端は、該オリゴヌクレオチドの３’末端というよりはむしろ特定の基から選択される。
【００７９】
適切かつ有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、５’末端ＲＮアーゼＨ活性化領域を含み、そして５〜１０個の間の隣接デオキシホスホロチオエートヌクレオチド；１１〜５９個の間の隣接５’→３’結合２’−メトキシリボヌクレオチド；並びに非５’−３’−ホスホジエステル結合ヌクレオチド、１〜３個の隣接５’−３’結合修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチド化学ブロック基よりなる群から引き出される、オリゴヌクレオチドの３’末端に存在するエキソヌクレアーゼブロック基を有するものである。
【００８０】
２つの分類の特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のように特徴付けることができる：
【００８１】
本明細書では第２世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、第１の分類のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’→３’方向に７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチ、９個の２’−デオキシリボヌクレオチドのストレッチ、６個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチ及び３’末端の２’−デオキシリボヌクレオチドを含む、全部で２３個のヌクレオチドを含む。第１群の７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから、最初の４個はホスホロチオエート結合しているが、一方で次の４個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドは、ホスホジエステル結合している。また、最後の（即ち、最も３’末端の）２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと９個の２’−デオキシリボヌクレオチドよりなるストレッチの最初のヌクレオチドとの間にはホスホジエステル結合が存在する。全ての２’−デオキシリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合している。また最後の（即ち、最も３’末端の）２’−デオキシヌクレオチドと６個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドよりなるその次のストレッチの最初の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドとの間にもホスホロチオエート結合が存在する。６個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのこの群から、その最初の４個（再度５’→３’方向に）は、ホスホジエステル結合しているが、一方で、２０〜２２位に相当するその最後の３個は、ホスホロチオエート結合している。最後の（即ち、末端の３’末端の）２’−デオキシヌクレオチドは、最後の（即ち、最も３’末端の）２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに、ホスホロチオエート結合を介して結合している。
【００８２】
この第１の分類はまた、以下の概略構造を参照することにより説明することができる：ＲＲＲｎｎｎｎＮＮＮＮＮＮＮＮＮｎｎｎＲＲＲＮ。ここで、Ｒは、ホスホロチオエート結合した２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）を示し；ｎは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）を表し；Ｎは、ホスホロチオエート結合したデオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）を表す。
【００８３】
本明細書では第３世代（の）アンチセンスオリゴヌクレオチド又はジーンブロック（GeneBlocs）とも呼ばれる、特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドの第２の分類はまた、以下の基本構造を持つ全部で１７〜２３個のヌクレオチドを含む（５’→３’方向に）。
【００８４】
５’末端には、エキソヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を与えるのに適した構造であり、そして例えば、WO 99/54459に記載されている、逆向きの塩基脱落ヌクレオチドが存在する。この逆向きの塩基脱落配列は、ホスホジエステル結合している５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチに結合している。この５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチに続いて、全てがホスホロチオエート結合している７〜９個の２’−デオキシリボヌクレオチドのストレッチが存在する。最後の（即ち、最も３’末端の）２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドと、２’−デオキシヌクレオチド含有ストレッチの最初の２’−デオキシヌクレオチドとの間の結合は、ホスホジエステル結合を介して生じる。７〜９個の２’−デオキシヌクレオチドのストレッチに近接して、５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドよりなるストレッチが連結している。最後の２’−デオキシヌクレオチドは、５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドよりなる最後に言及したストレッチの最初の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して結合している。５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドのストレッチは、ホスホジエステル結合している。５〜７個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの第２のストレッチの３’末端には、別の逆向きの塩基脱落配列が結合している。
【００８５】
この第２の分類はまた、以下の概略構造を参照することにより説明することができる：（ジーンブロック（GeneBlocs）は、これも以下の概略構造を有する第３世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドを表す：）ｃａｐ−（ｎp）x（Ｎs）y（ｎp）z−ｃａｐ又はｃａｐ−ｎｎｎｎｎｎｎＮＮＮＮＮＮＮＮＮｎｎｎｎｎｎｎ−ｃａｐ。ここで、ｃａｐは、両方の末端の逆向きのデオキシ塩基脱落又は同様の修飾を表し；ｎは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）を表し；Ｎは、ホスホロチオエート結合したデオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）を表し；ｘは、５〜７の整数を表し；ｙは、７〜９の整数を表し；そしてｚは、５〜７の整数を表す。
【００８６】
整数ｘ、ｙ及びｚは、ｘ及びｚが所定のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて同一であることが好ましいのではあるが、相互に独立に選択できることに注意すべきである。したがって、第３世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドの下記基本的設計又は構造は、以下のとおりであってよい：ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）7（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）7（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）7（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）8（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）8（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）8（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）9（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）9（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）9（ｎp）5−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）7（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）7（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）7（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）8（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）8（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）8（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）9（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）9（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）9（ｎp）6−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）7（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）7（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）7（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）8（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）8（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）8（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）5（Ｎs）9（ｎp）7−ｃａｐ、ｃａｐ−（ｎp）6（Ｎs）9（ｎp）7−ｃａｐ及びｃａｐ−（ｎp）7（Ｎs）9（ｎp）7−ｃａｐ。
【００８７】
本明細書に与えられた技術的教示に基づいて作成でき、そして医薬及び／又は診断薬として使用できる、更に別の化合物類は、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸（好ましくはｍＲＮＡ）に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡは、典型的には約２１〜約２３個のヌクレオチドの長さを有する２本鎖ＲＮＡである。２本のＲＮＡ鎖の一方の配列は、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸のような、分解すべき標的核酸の配列に対応する。言い換えると、標的分子（本発明の場合にはプロテインキナーゼＮベータ）の核酸配列（好ましくはｍＲＮＡ配列）を知れば、該（例えば）プロテインキナーゼＮベータのｍＲＮＡに相補的な２本鎖の一方により、２本鎖ＲＮＡを設計することができ、そしてプロテインキナーゼＮベータをコードする遺伝子、ゲノムＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ又はｍＲＮＡを含む系への該ｓｉＲＮＡの適用により、各標的核酸は分解し、そして各タンパク質のレベルは低下する。それぞれ医薬及び診断薬として、該ｓｉＲＮＡを設計、構築及び使用する基本原理は、特に、国際特許出願WO 00/44895及びWO 01/75164に記述されている。
【００８８】
前述の設計原理に基づいて、一旦プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸配列が判れば、それぞれこのようなｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムを作成することができる。これはまた、ゲノム核酸を含む、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのような核酸の前駆分子にも当てはまる。当然ながら、各アンチセンス鎖を知ることによっても、塩基対相補性の基本原理（好ましくはワトソン・クリック塩基対形成に基づく）を前提として、このような核酸型化合物の設計は可能であろう。したがって、本発明の更に別の態様は、プロテインキナーゼＮベータに対するか、又はこれに特異的な、特定のｓｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンスヌクレオチドに関する。以下において、このことは、ｓｉＲＮＡにより更に説明されるが、当業者には受け入れられるであろうように、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイムにも同様に適用される。
【００８９】
このようなｓｉＲＮＡは、好ましくは１５〜２５個のヌクレオチドの長さであるが、これは実際には、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチドを含む任意の長さを意味する。更に別の実施態様において、ｓｉＲＮＡは、更に多くのヌクレオチドを示すことさえあろう。当該分野において周知の設計原理により、各ｓｉＲＮＡを作成することができる。したがって、本明細書において特許請求されるｓｉＲＮＡは、好ましくは、ＰＫＮ−ベータをコードするセンス若しくはアンチセンス鎖のいずれかに少なくとも部分的に相補的な、１５〜２５個の連続ヌクレオチドの任意のヌクレオチド長さのストレッチ、及び第１の鎖に（よってプロテインキナーゼＮベータをコードする、それぞれアンチセンス鎖及びセンス鎖に）少なくとも部分的に相補的な、第２のリボヌクレオチド鎖を含む。この種の２本鎖構造には、ｓｉＲＮＡの作成又は製造の当該分野において知られている任意の設計原理を適用することができる。本明細書に開示されるｓｉＲＮＡ空間は、そのアンチセンス鎖が、上に特定されているＰＫＮ−ベータをコードする配列のヌクレオチド番号１に相当するヌクレオチドから出発する、ｓｉＲＮＡ分子を含む。更にこのようなｓｉＲＮＡ分子は、上に特定されているＰＫＮ−ベータをコードする配列のヌクレオチド番号２に相当するヌクレオチドなどから出発する。ＰＫＮ−ベータをコードする配列にわたるこの種の走査は、ＰＫＮ−ベータに向けることができる、全ての可能なｓｉＲＮＡ分子を提供するために繰り返される。こうして作成される任意のｓｉＲＮＡ分子の長さは、ｓｉＲＮＡに適した任意の長さ、更に具体的には上に特定されている任意の長さであってよい。好ましくは、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡ分子空間の種々のｓｉＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖又はセンス鎖の最も５’末端のヌクレオチドを除いて重複する。こうして得られるアンチセンス配列が、少なくとも部分的には、機能的に活性なｓｉＲＮＡに必要とされる２本鎖構造を形成するために、塩基対形成により相補鎖形成する必要があることは明らかである。
【００９０】
抗体、ペプチド、アンチカリン、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド並びにｓｉＲＮＡのような、前述の化合物類の作用のモードに基づいて、それぞれプロテインキナーゼＮベータ及びこれをコードする核酸を標的とするこれらの化合物のいずれかを、本明細書に記載される疾患のいずれか及び本明細書に記載される病状のいずれかのための医薬又は診断薬の製造に使用することも本発明に含まれる。更に、これらの作用物質は、それぞれ、該疾患及び病状の進行、及び適用される任意の治療の成功をモニターするために使用することができる。
【００９１】
抗体、ペプチド、アンチカリン、低分子、アプタマー、スピーゲルマー、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡのような本発明により設計される種々の化合物類はまた、薬剤組成物に含ませることができる。好ましくはこのような薬剤組成物は、本明細書に記載される疾患又は本明細書に記載される病状の治療に使用される。この薬剤組成物は、ある実施態様では、１つ又は幾つかの前述の化合物類及び／又は単一分類の１つ以上のメンバーと、場合により更に別の薬剤活性化合物、及び薬剤学的に許容しうる担体とを含むことができる。このような担体は、液体又は固体のいずれか、例えば、溶液、緩衝液、アルコール性溶液などであってよい。適切な固体担体は、特に、デンプンなどである。経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内などのような、具体的な経路の投与を実現するための、前述の化合物類の種々の化合物用の各処方を提供することは、当業者には知られている。
【００９２】
上述の様々な化合物類の種々の化合物はまた、単独又は組合せて、キットに従属させるか、又はキットに含ませることができる。このようなキットは、各化合物とは別に、更に１つ又は幾つかの更に別の要素又は化合物を含む（ここで、要素は、緩衝剤、陰性対照、陽性対照及び種々の化合物の使用に関する指示書を含む群から選択される）。好ましくは、種々の化合物は、乾燥又は液体の形のいずれかで、好ましくはそれぞれ単回投与のための単位用量として存在する。このキットは、本明細書に記載される疾患及び病状に関して、治療、診断又は疾患の進行若しくは適用療法のモニターのために使用することができる。
【００９３】
本発明は、以下の図面と実施例により今から更に説明されるが、これらは、保護の範囲を限定するものではない。該図面及び実施例から、更なる特色、実施態様及び利点を受け取ることができる：
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ＰＩ３−キナーゼ経路の増殖因子誘導活性化の概略図を示す；
【図２】図２は、ラパマイシンでの処置後の同所性ＰＣ−３マウスモデルにおけるリンパ節転移の測定を示す；
【図３】図３は、ＰＩ３−キナーゼ経路の下流の薬物標的としてＰＫＮベータを同定するための実験的アプローチを示す；
【図４】図４は、ＰＫＮベータでの第１次ジーンブロック（GeneBloc）スクリーニングを示す；
【図５】図５は、マトリゲル上でのＰＫＮベータ特異的ＧＢでトランスフェクトしたＰＣ３細胞の増殖を示す；
【図６】図６は、ＨｅＬａＢ細胞におけるｓｉＲＮＡの一過的発現によるＲＮＡ干渉を示す；
【図７】図７は、プローブとしてプロテインキナーゼＮベータのアンチセンス及びセンス配列を使用するハイブリダイゼーションに際してのヒト前立腺細胞及びヒト前立腺癌細胞の写真を示す；
【図８】図８は、２つの異なるｓｉＲＮＡ構築体を用いた同所性前立腺腫瘍モデルにおける原発性腫瘍の容量を描く線図（図８Ａ）、２つの異なるｓｉＲＮＡ構築体を用いた同所性前立腺腫瘍モデルにおけるリンパ節転移の容量を描く線図（図８Ｂ）、並びに対照ｓｉＲＮＡ（図８Ｃ１）及びプロテインキナーゼＮベータ特異的ｓｉＲＮＡ構築体（図８Ｃ２）を用いた同所性前立腺腫瘍モデルにおける前立腺及びリンパ節の写真を示す；
【図９】図９は、ＨｅＬａ細胞における一過性過剰発現での標準リン酸化基質としてＭＰＢを、そしてキナーゼ誘導体の相対発現レベルを検出するために抗プロテインキナーゼＮベータ抗体（抗ＰＫ）を使用する、種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体及びこれらの活性のウェスタンブロット分析（図９Ａ）、プロテインキナーゼＮベータのリン酸化型に特異的な抗体を使用する種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体の更に別のウェスタンブロット分析（図９Ｂ）、並びに使用した種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体の概略図（図９Ｃ）を示す；
【図１０】図１０は、ＨｅＬａ細胞でのその発現レベルをモニターするための種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体のウェスタンブロット（図１０Ａ）及びプロテインキナーゼＮベータ誘導体のリン酸化のゲル分析（図１０Ｂ）を示す；
【図１１】図１１は、ウェスタンブロッティングによりそのリン酸化型（図１１Ａ）を、又はオートラジオグラフィーにより32Ｐ標識リン酸の取り込み（図１１Ｂ）を検出する、プロテインキナーゼＮベータのタンパク質基質のリン酸化を検出するための免疫沈降アッセイの結果を示す。各免疫沈降物中に同程度の量のＰＫＮベータが存在することを保証するために、図１１Ａに示されるフィルターを抗ＰＫＮベータ抗体を用いて再精査した（「キナーゼ」、図１１Ｃ）。
【図１２】図１２は、ＨｅＬａ及びＰＣ−３細胞中で異なる時点でＬＹ２９４００２で処理した試料中の、内因性プロテインキナーゼＮベータの発現を対比するウェスタンブロット分析を示す。ＰＩ３−キナーゼインヒビターの効力を確認するために、リン酸化ＡＫＴのレベルを平行してモニターした。
【図１３】図１３は、免疫複合体中に存在する種々の組換えＰＫＮベータ誘導体の相対タンパク量及びキナーゼ活性を示す。各組換えタンパク質を発現する細胞は、表示された時間の細胞溶解の前にＰＩ３−キナーゼインヒビターのＬＹ２９４００２で処理してある。
【図１４】図１４は、写真のパネルを示すが、ここで、ＰＫＮベータ野生型（図１４Ａ）、ＰＫＮベータ誘導体ＴＡ（図１４Ｂ）、ＰＫＮベータ誘導体ＫＥ（図１４Ｃ）及びＰＫＮベータ デルタＮ（図１４Ｄ）のような、ＰＫＮベータ及びその誘導体の細胞内分布は、共焦点蛍光顕微鏡法により調査した。ＨＡ標識したＰＫＮベータの組換え誘導体は、ＨｅＬａ細胞で４８時間一過性発現させた。固定及び透過性化後、組換えタンパク質の発現は、抗ＨＡ抗体と、続いてＦＩＴＣ結合抗マウス抗体を用いて検出した。細胞は、細胞骨格アクチンをローダミン−ファロイジンで標識することにより対比染色した。
【００９５】
図１は、ＰＩ３−キナーゼ経路の増殖因子誘導活性化の概略図を示す。細胞の増殖因子刺激により、細胞膜でその同種の受容体の活性化が起こり、そして次にこれがＰＩ３−キナーゼのような細胞内シグナル伝達分子に結合してこれを活性化する。腫瘍サプレッサーのＰＴＥＮは、ＰＩ３−キナーゼ介在性の下流の応答を妨げて、この経路の活性化が一過性に起こることを保証する。ＬＹ２９４００２は、ＰＩ３−キナーゼの低分子インヒビターである。ＰＩ３−Ｋの既知の下流遺伝子の１つは、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）であり、これは臨床的に承認された薬物のラパマイシン（ラパミューン（Rapamune））により阻害することができる。ＰＩ３−Ｋは、細胞増殖、細胞生存、ブドウ糖輸送、翻訳、転移及び遊走の調節に関係する。Ｘは、下流のエフェクターを示しており、これは、癌細胞の転移挙動を促進することに関係していると予測される、見込みある薬物標的を表す。この経路の更に下流で作用するこの分類のエフェクター分子は、多面発現作用が少ないため、ｍＴＯＲのような「上流」の標的よりも良い薬物標的になりそうである。
【００９６】
図２〜図５の主題は、以下の実施例に関連して更に詳細に考察される。
【００９７】
図６は、ＨｅＬａＢ細胞中でのｓｉＲＮＡの一過性発現による干渉を示す。
【００９８】
（Ａ）ｓｉＲＮＡ分子は、標的特異的配列（２１量体のセンス配列と１２量体ポリＡストレッチが結合した逆進相補配列とを含む、目的の遺伝子から誘導された鋳型）のプロモーター（Ｕ６＋２）による発現によって作成された。転写によりＲＮＡは２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成するようである。
【００９９】
（Ｂ）ｓｉＲＮＡ発現のための標的遺伝子の鋳型配列。対応する配列は、Ｕ６＋２プロモーターカセットを持つ発現ベクターに導入した。
【０１００】
（Ｃ）細胞増殖及び繁殖に及ぼすｓｉＲＮＡ発現の効果。構築体（上記を参照のこと）は、ＲＮＡｉ干渉実験のためのＨｅＬａＢ細胞へのトランスフェクションにより一過性発現した。細胞は、トランスフェクションの４８時間後に回収して、続いて「マトリゲル（matrigel）」ゲルに接種（１ウェル当たり８００００細胞）した。対応する遺伝子の発現に及ぼすＲＮＡ干渉の作用は、トランスフェクトした細胞をマトリゲル上での増殖／繁殖についてアッセイすることにより分析した。ＰＴＥＮを標的としたｓｉＲＮＡの発現は、マトリゲル上のＨｅＬａＢ細胞増殖に影響しなかった（右のパネル）が、一方ｐ１００ベータ及びＰＫＮベータに特異的なｓｉＲＮＡの発現は、マトリゲル上のＨｅＬａＢ増殖の挙動を深刻に妨げた（中央及び右のパネル）。
【０１０１】
実施例１：材料と方法
細胞培養
ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＣＳ）、ゲンタマイシン（５０μg/ml）及びアンフォテリシン（５０ng/ml）を含む、Ｆ１２Ｋ栄養混合液（Nutrient Mixture）（カイン（Kaighn）の改変液）で培養した。トランスフェクションは、９６ウェルで、又は１０cmプレート（３０％〜５０％コンフルエンシー）で、オリゴフェクタミン（Oligofectamine）、リポフェクタミン（Lipofectamine）（ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））、アルグフェクチン５０（Argfectin50）若しくはプロフェクチン５０（Profectin50）（アトゥゲン（Atugen）／ＧＯＴ、ベルリン、ドイツ）、又はフュージーン６（FuGene 6）（ロシュ（Roche））のような種々のカチオン性脂質を製造業者の指示書により用いることによって行った。ジーンブロック（GeneBlocs）は、前もって生成した無血清培地中のジーンブロックと脂質との５×濃縮複合体を、完全培地中の細胞に加えることによりトランスフェクトした。全トランスフェクション容量は、９６ウェルに塗布した細胞には１００μl、そして１０cmプレートの細胞には１０mlとした。最終脂質濃度は、細胞密度に応じて０．８〜１．２μg/mlであった。；ジーンブロック濃度は、各実験に示す。
【０１０２】
培養細胞は、トリプシン処理して、培地によりトリプシン作用を停止させてから回収した。洗浄手順（ＰＢＳ；遠心分離５分間／１，０００rpm）を追加して、接種すべき細胞数と容量を考えながら、最後にペレットを再懸濁する。
【０１０３】
タックマン（Taqman）分析によるＲＮＡレベルの相対量の測定。
９６ウェル中でトランスフェクトした細胞のＲＮＡを単離して、インビソルブ（Invisorb）ＲＮＡ ＨＴＳ９６キット（インビテック社（InVitek GmbH）、ベルリン）を用いて精製した。ＰＫＮベータｍＲＮＡ発現の阻害は、３００nM ＰＫＮベータ５’プライマー、３００nM ＰＫＮベータ３’プライマー及び１００nMのＰＫＮベータ・タックマン・プローブの標識ファム・タムラ（Fam-Tamra）を用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（タックマン）分析により検出した。反応は、５０μl中で行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出器（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））で製造業者の指示書により以下の条件下でアッセイした：４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒と６０℃で１分。
【０１０４】
マトリゲルマトリックス上でのインビトロ増殖。
ＰＣ３細胞は、マトリゲルに接種したとき、５μM ＬＹ２９４００２又はＤＭＳＯで処理した。接種の前に細胞をトランスフェクトするならば、細胞は、ジーンブロックでトランスフェクトして、トランスフェクションの４８時間後にトリプシン処理した。細胞は、培地中で洗浄して、２５０μlマトリゲル基底膜マトリックス（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））で前もってコーティングした二重反復の２４ウェル（１ウェル当たり１００，０００細胞）中に接種した。２４〜７２時間インキュベーション後、アキシオヴェルト（Axiovert）Ｓ１００顕微鏡（ツァイス（Zeiss））に接続したアキシオカム（Axiocam）カメラで倍率５×で写真を撮った。
【０１０５】
アフィメトリクス（Affymetrix）
マトリゲルで培養した細胞からの全ＲＮＡは、トータリー（Totally）ＲＮＡキット（アンビオン（AMBION））を用いて製造業者のプロトコールにより調製した。最後の工程で、沈降した全ＲＮＡをインビソルブ溶解緩衝液に再懸濁して、インビソルブのスピン細胞−ＲＮＡキット（インビテック（INVITEK））を用いて精製した。ビオチン標識ｃＲＮＡは、アフィメトリクスのプロトコールにより調製して、１５μgのｃＲＮＡをアフィメトリクス・ジーンチップ（GeneChip）セットＨＧ−Ｕ９５にハイブリダイズさせた。
【０１０６】
データ解析
生データは、アフィメトリクス・ジーンチップ・ソフトウェアのマイクロアレイ・スイート（Microarray Suite）ｖ４．０を用いて解析した。各プローブセットの強度は、１つの転写産物に対応する１６〜２０個のプローブ対のセットにわたって平均した、ミスマッチオリゴヌクレオチドに比較した最適マッチのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションシグナルの差として計算される。あるプローブセットの平均の差は、転写産物の豊富さに比例する。異なるアレイの全シグナル強度は、比較前に同じ値に概算した。実験及び基線アレイからの対応するプローブ対の強度の２つ１組の比較により、アフィメトリクスソフトウェアを用いて変化倍率を算出した。アフィメトリクスにより記述される決定行列を用いて、このソフトウェアはまた、絶対コール（ある実験において、転写産物が、存在しないか、最低限存在するか、又は存在する）及び示差コール（１つの実験を別のと比較した転写産物の豊富さ：増大、わずかに増大、変化なし、わずかに低下、低下）を生成する。結果は、マイクロソフト・エクセル（Microsoft Excel）にエクスポートして（絶対コール、示差コール、変化倍率）、フィルターにかけた。コールがないか、又はコール変化のない全てのプローブセットを破棄して、表を変化倍率によりソートした。
【０１０７】
動物試験
食品医薬品局（Food and Drug Administration）の非臨床実験室研究のための医薬品安全性試験実施基準（Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies）（ＧＬＰ規定）に対応して、及び法的根拠としてドイツ動物保護法により、インビボ実験を行った。
【０１０８】
ＳＰＦ条件（層流空気流装置（Laminar air flow equipment）、スキャンテイナー（Scantainer）、スキャンブル（Scanbur））下で維持したオスのシュー：ＮＭＲＩ−ニュー／ニュー（Shoe:NMRI-nu/nu）マウス（ティエルズクト・シェーンヴァルデ社（Tierzucht Schoenwalde GmbH））を、ヒト前立腺癌細胞のレシピエントとした。６〜８週齢で体重２８〜３０ｇのこの動物は、２×１０6個／０．０３mlの腫瘍細胞を、前立腺の左背側葉（ｉｐｒｏｓｔ；同所性）又は肝臓の左側葉の先端（ｉｈｅｐ；異所性）に接種した。この目的のために、ケタネスト（Ketanest）（パーク・デイビス社（Parke-Davis GmbH））とロンプン（Rompun）（バイエル・バイタル社（Bayer Vital GmbH））８０：１の混合物を用いて、それぞれ１００mg/kg及び５mg/kgの用量でマウスに全身麻酔をかけた。腹部体表面の徹底的な滅菌後、包皮腺の縁近くから始まって、約１cmある、腹部皮膚及び腹壁を通す切開を行った。１対のピンセットと綿棒を用いて、前立腺を明視化した。同所性細胞投与は、拡大鏡の助けを借りて、３０Ｇ ０．３０×１３のマイクロランス（microlance）針（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））を持つ１mlシリンジ（ヘンケ・サス・ヴォルフ社（Henke Sass Wolf GmbH））を用いて行われた。投与は成功し、接種部位に際立った水疱が観察された。創傷は、腹壁に関しては縫合材料（ＰＧＡレゾルバ（PGA Resorba）、フランツ・ヒルトナー社（Franz Hiltner GmbH））により、そして腹部皮膚にはマイケル（Michel）クランプ１１×２mm（ハイランド（Heiland））により閉じた。創傷用スプレー（ハンザプラスト・シュプルーフラスター（Hanzaplast Spruehpflaster）、バイヤースドルフ社（Beiersdorf AG））で病変部を覆った。術後相には、動物は、完全な目覚めまで温暖環境で維持した。動物は、それぞれ１群当たり５〜１０匹の動物よりなる処理群の数によりランダム化した。これらは、知見のプロトコール化を含めて、継続して点検した。１０mmのオートクレーブに耐えるＳｓｎｉｆｆ ＮＭ−Ｚ（ｓｓｎｉｆ、シュペツィアルディエテン社（Spezialdiaeten GmbH））を栄養強化食として投与し、飲料水はＨＣｌにより酸性にする（両方とも適宜）。
【０１０９】
評価
実際の用量レベルを投与するために、体重を処置日に記録した。同時に、体重の増加から、生物体全体に及ぼす治療法の影響の認識を導き出すことができる。
【０１１０】
血液穿刺は、０（基線）；１４；２８；及び３５日目（殺処分）に行われた。血液は、短時間麻酔した動物の眼窩静脈から抜き取った（ジエチルエーテル、オットー・フィッシャー社（Otto Fischar GmbH））。処置の適合性と副作用にデータを与える評価パラメーターは以下である：白血球数；血小板数；酵素。更に別の血行性パラメーターは、ビリルビン；クレアチニン；タンパク質；尿素；尿酸であった。
【０１１１】
全ての殺処分した動物は、完全に解剖して写真で記録した。腫瘍（前立腺）及び転移（尾部、腰部、腎リンパ節転移）は、１対のカリパスを用いて二次元で測定した。容量は、Ｖ（mm3）＝ａｂ2／２（ここでｂ＜ａ）により算出した。一般に、治療アプローチ用に遂行された細胞数は、前立腺に関して１００％の腫瘍獲得を引き起こす。幾つかの臓器（肝臓；脾臓；腎臓）の重量を、二次的副作用についての知見に関する追加データを解明するために記録した。
【０１１２】
組織学的分析のために、腫瘍組織（即ち、前立腺腫瘍及びリンパ節転移）の試料を５％ホルムアルデヒド中で固定してパラフィン包埋した。ルーチンとして、切片はＨＥ染色し、必要であれば特異的染色を行った（アザン（Azan）、ＰＡＳ）。
【０１１３】
腫瘍及び転移細胞のヒト起源を検出するために、適切な組織試料を液体窒素中で凍結した。ｈｕＨＰＲＴ特異的アンプリコン（amplicon）によるＰＣＲ及びタックマン分析を使用すると、我々は、５mg組織中に５０個のヒト細胞を検出することができた。
【０１１４】
治療結果は、マン・ホイットニー（Mann and Whitney）のｕ検定により統計的に検証した。
【０１１５】
実施例２：下流の薬物標的の適合性に関する実験的概念実証
引用例として本明細書に取り込まれる本明細書の導入部に略述されるように、シグナル伝達経路に対して下流に結びついている標的は、医薬及び診断薬の両方の設計又は開発に有用である。特定の標的が、別々の他の経路に結びついているか、又はシグナル伝達経路内のその位置により幾つかの生物学的現象（例えば、ＰＩ−３キナーゼの場合のように、転移と遊走、増殖、翻訳、アポトーシス、細胞周期、ＤＮＡ修復など）に結びついているならば、この標的に対処する任意の化合物には、幾つかの副作用がありそうであり、よってこれは、その系に対して有害であろうし、医学的観点から望ましくないであろう。したがって、更に下流で作用する標的が、治療的介入の第１選択になるはずである。
【０１１６】
本発明者らは、ＰＩ３−キナーゼ経路の制御下に、ｍＴＯＲとは別に更に可能性ある薬物標的が関与していることを見い出したが、これは転移と遊走の現象及びこのため腫瘍形成の制御に特異的である。製薬業界では、ラパミューンの商品名の下に販売されるラパマイシンが、転移と遊走を阻害するのに適していることが見い出されている。このことは、下流の薬物標的に対処するための方策の適合性を支持する。
【０１１７】
図２から判るように、ラパマイシンは、リンパ節転移の容量を低下させるのに適しており、その範囲では周知のＰＩ３−キナーゼインヒビターであるＬＹ２９４００２にその効果で匹敵する。図２Ａに描かれるように、腫瘍獲得モデルを使用し、ラパミューンでの処置は１日目に開始した。使用した両方の濃度（即ち、０．４mg/kg/投与〜２mg/kg/投与）で、陰性対照（リン酸緩衝生理食塩水とした）に比較した転移の測定容量（mm3）として表されるリンパ節転移の範囲の著しい縮小が起こった。
【０１１８】
組織学的分析のために、腫瘍組織（即ち、前立腺及びリンパ節転移）の試料は、５％ホルムアルデヒド中で固定してパラフィン包埋した。ルーチンとして、切片はＨＥ染色し、必要であれば特異的染色を行った（アザン、ＰＡＳ）。
【０１１９】
２８日目に開始する処置による樹立腫瘍モデルのラパミューン処置の場合にも、基本的に同じ結果が得られた。
【０１２０】
ラパマイシン（ラパミューン）での処置後の同所性ＰＣ−３マウスモデルにおけるリンパ節転移を測定した。図２（Ａ）には、（Ａ）の結果、腫瘍獲得モデルを示す。ヌードシュー：ＮＭＲＩ−ニュー／ニュー（Shoe:NMRI-nu/nu）マウス（１群８匹）に、２×１０6個のＰＣ３細胞を０．０３mlで前立腺内注射して、処置は、ラパミューンを用いて２８日間毎日前立腺内投与で２mg/kg及び０．４mg/kgの用量で行った。ＰＢＳを対照とした。
【０１２１】
樹立腫瘍（Ｂ）の処置には、細胞を２８日間ｉｐｒｏｓで増殖させて、処置は、移植後２９〜５０日目にラパミューンを用いて経口投与で行った。用量は、Ａに略述されるように選択した。動物は、それぞれ２９日目と５１日目に殺処分して、全リンパ節転移を測定した。
【０１２２】
実施例３：ＰＩ３−キナーゼ経路内の下流の薬物標的としてのＰＫＮベータの同定
基本的実験アプローチは、図３に示す。マトリゲルで培養したＰＣ３細胞は、ＤＭＳＯ又はＰＩ３−ＫインヒビターのＬＹ２９４００２のいずれかで処理して、全ＲＮＡを各試料から単離した。示差アフィメトリクス遺伝子発現プロファイリングを実行して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲタックマンアッセイを用いて発現を確認した。ｐ１１０□を非示差標準物質として使用した。ＰＣ３細胞は、ＰＴＥＮ −／−であるが、これは、腫瘍サプレッサーのＰＴＥＮが、これらの細胞中では事実上欠乏しているため、ＰＩ３−キナーゼ経路が恒久的に活性化されていることを意味するが、このため、マトリゲルアッセイにおいてその増殖パターンにより表される、細胞の転移活性又は挙動が増大する。浸潤性増殖能力を持つ細胞は、マトリゲルマトリックスのような基底膜では増殖の強化を示す（Petersen, O.W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A.R.及びBissell, M.J. (1992)）。基底膜との相互作用は、正常及び悪性ヒト乳房上皮細胞の増殖及び分化パターンを迅速に識別するのに役立つ。Proc Natl Acad Sci USA, 89, 9064-9068。（Sternbergerら, 2002 Antisense & Nucleic acid drug development 12:131-143も参照のこと）。
【０１２３】
これに関連して、ＰＣ３細胞がマトリゲル上で増殖したこと、及びそこから単離したＲＮＡが、従来の細胞培養プレートのような非マトリゲル環境で増殖した細胞から得られたどの調製物に比べても、インサイチューの状況又は結果により近いと想定される、インビボ環境に近いモデル系としてこれを受け取ったことに注意すべきである。
【０１２４】
実施例４：プロテインキナーゼＮベータに向けられた最適なアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング。
ＰＣ３細胞は、記載されるように種々のジーンブロック濃度でトランスフェクトし、そしてｍＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４時間後に３００nMのＰＫＮベータ特異的前進及び逆進プライマー並びに１００nMプローブ、そしてヒト■−アクチンに対する４０nM前進及び逆進プライマー並びに１００nMプローブによるタックマンアッセイを用いて測定した。ｍＲＮＡレベルは、内部アクチンレベルに対して標準化して、量はＧＢＣ（ジーンブロックコントロール（Gene Bloc Control）でトランスフェクトした細胞）に対して示す。
【０１２５】
この結果は、図４に示す。図４から特に有利なアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、ジーンブロック７０２１０及び７０２１１を更なる試験のために選択した。
【０１２６】
ジーンブロックに関連して、種々の実施例で本明細書において使用されるとき、これらが全て本明細書に特定されている第３世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドであることに注意すべきであり、そしてこのことは、表１からも明らかなように、大文字が、ホスホジエステル結合よりはむしろホスホロチオエート結合により結合している、デオキシリボヌクレオチドを表すことを意味している。
【０１２７】
表１：使用した種々のジーンブロックの概観、その別名、標的核酸に対するミスマッチ並びにその配列及び構造の特徴
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
種々のジーンブロックは、以下の配列番号に相当する：
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
更には、上のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ジーンブロック、即ち、第３世代アンチセンスオリゴヌクレオチドであるという事実を踏まえると、上の「ｔ」はいずれも実際には「ｕ」であることに注意すべきである。
【０１３２】
実施例５：プロテインキナーゼＮベータの選択的ノックダウン
プロテインキナーゼＮベータが、ＰＩ３−キナーゼ経路の適切な下流の薬物標的であることを証明するために、実施例４から得られるような２つの特に有利なジーンブロックを、マトリゲルに基づく増殖実験に使用した。マトリゲル増殖実験は、各細胞の転移及び遊走挙動を示す代理モデルとして採用される。細胞の更にコンフルエントな増殖は、その転移及び遊走挙動が増大する指標として取られるが、これにより細胞は、マトリゲルが与える三次元構造中に拡がることができる。
【０１３３】
ＰＣ３細胞は、トランスフェクトし、前述のようにマトリゲルに接種して、増殖をモニターした。マトリゲルに接種した細胞のアリコートからｍＲＮＡを単離して、タックマンアッセイを用いて分析した（左のパネル）。ＰＫＮベータ特異的ｍＲＮＡは、内因性ｐ１１０α ｍＲＮＡレベルに対して標準化した。ＰＴＥＮ-/-ＰＣ−３細胞中でＰＴＥＮ特異的ジーンブロックを陰性対照として使用し、細胞外マトリックス中での増殖には陽性対照としてｐ１１０α特異的ジーンブロックを使用する。特異的増殖阻害は、ＰＫＮベータ特異的ジーンブロック７０２１０又は７０２１１で処理した細胞の増殖と、それぞれその対応するミスマッチのオリゴヌクレオチド７０６７６及び７０６７７とを比較することにより示される。
【０１３４】
各結果はまた、図５に図解される。ここから、ジーンブロック（gene block）７０２１１及び７０２１０が、本明細書に記載される疾患及び病状の治療のための医薬又は診断薬の製造に適した化合物であろうことが理解されよう。
【０１３５】
実施例６：ＨｅＬａＢ細胞におけるｓｉＲＮＡの一過性発現によるＲＮＡ干渉
この実験は、特異的に下流の薬物標的であるプロテインキナーゼＮベータに向けられることが可能な、ｓｉＲＮＡの成功した設計に関する一例である。図６（Ａ）に図解されるように、ｓｉＲＮＡ分子は、標的特異的配列（２１量体のセンス配列と１２量体ポリＡストレッチが結合した逆進相補配列とを含む、目的の遺伝子から誘導された鋳型）のプロモーター（Ｕ６＋２）による発現により作成した。転写によりＲＮＡは２本鎖ｓｉＲＮＡ分子を形成するようである。
【０１３６】
ｐ１１０ベータ及びＰＴＥＮのような種々の構築体を、ＰＫＮベータのｍＲＮＡ配列に対して設計したｓｉＲＮＡと同じベクター構築体にして、それぞれ陽性及び陰性対照として使用した。各設計は、図６（Ｂ）に示すが、ｓｉＲＮＡ発現のための標的遺伝子の鋳型配列が、Ｕ６＋２プロモーターカセットを含む発現ベクター中に導入されている。
【０１３７】
この構築体は、ＲＮＡｉ干渉実験のためにＨｅＬａＢ細胞へのトランスフェクションにより一過性発現させた。トランスフェクトした４８時間後に細胞を回収して、次にマトリゲルに接種した（１ウェル当たり８００００細胞）。対応する遺伝子の発現に及ぼすＲＮＡ干渉の作用は、トランスフェクトした細胞をマトリゲルでの増殖／繁殖についてアッセイすることにより分析した。ＰＴＥＮを標的とするｓｉＲＮＡの発現は、マトリゲルでのＨｅＬａＢ細胞増殖に影響しなかった（右のパネル）が、一方ｐ１１０ベータ及びＰＫＮベータに特異的なｓｉＲＮＡの発現は、マトリゲル上のＨｅＬａＢ増殖の挙動を深刻に妨げた（中央及び右のパネル）。
【０１３８】
この点から見て、特定のｓｉＲＮＡは、本明細書に開示されるような疾患及び病状の治療に有効な手段であることが判明した。
【０１３９】
実施例７：ヒト前立腺腫瘍におけるプロテインキナーゼＮベータの検出
プロテインキナーゼＮベータが、前立腺腫瘍の治療における適切な標的であるという更なる証拠を与えるために、各ヒト前立腺組織をインサイチューハイブリダイゼーションに付した。
【０１４０】
インサイチューハイブリダイゼーションのために、センス及びアンチセンス鎖の両方を、ｐＣＲ４トポ（Topo）ベクター中で配列ＮＭ０１３３５５から１６７２〜２６６７位のヌクレオチドから調製したが、ここでＴ７及びＴ３ポリメラーゼを増幅目的に使用した。ヒト前立腺腫瘍細胞（ＰＣ−３）をマウスで増殖させた。解剖後、組織はイソペンタン溶液中で−２０℃で凍結して、切片を−１５℃で切り出し−８０℃で貯蔵した。ハイブリダイゼーションの前に、切片をパラホルムアルデヒド中で固定した。ヒト腫瘍標本をパラホルムアルデヒド中で固定して、パラフィン包埋した。腫瘍標本は、プロテイナーゼＫで処理してアセチル化した。核酸プローブは、35Ｓ−ＡＴＰと35Ｓ−ＵＴＰで二重標識して、組織と共に５８℃で５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液（０．４Ｍ ＮａＣｌ、５０％ホルムアミド、１×デンハルト（Denhardt）液、１０mMトリス、１mM ＥＤＴＡ、１０％デキストラン硫酸、１０μg/mlの各ｔＲＮＡ及びサケ精子ＤＮＡ、１０mM ＤＴＴ）中でインキュベートした。
【０１４１】
インサイチューハイブリダイゼーションの結果は、図７に図解される。前立腺腫瘍のインサイチューハイブリダイゼーションにプロテインキナーゼＮベータアンチセンスプローブを使用すると、この前立腺は激しく染色される（図７Ａ）。これとは対照的に、再度アンチセンスプローブを使用するとき、健常前立腺組織はあまり染色されず、バックグラウンドシグナルだけを与える（図７Ｃ）。これとは対照的に、両方の組織に関連してセンスプローブを使用すると、何のシグナルも与えなかった。
【０１４２】
実施例８：ｓｉＲＮＡによる原発性腫瘍及びリンパ節転移のインビボの縮小
この実施例は、同所性前立腺腫瘍モデルを用いた標的遺伝子のインビボ検証に関し、そしてプロテインキナーゼＮベータに対するｓｉＲＮＡを使用することにより、原発性腫瘍とリンパ節転移の両方の縮小が実現できることが証明できた。結果は、図８Ａ〜８Ｃに図解される。
【０１４３】
図８Ａの線図において、実施例１に記載されるように測定した、同所性前立腺腫瘍モデルにおける原発性腫瘍の容量は、以下の２つのｓｉＲＮＡ構築体のいずれかを用いて有意に縮小させることができた：
５’ａｃｔｇａｇｃａａｇａｇｇｃｔｔｔｇｇａｇ 又は
５’ａａａｔｔｃｃａｇｔｇｇｔｔｃａｔｔｃｃａ。
【０１４４】
陰性対照としてｐ１１０−αサブユニットに対するｓｉＲＮＡを使用し、そして陽性対照としてｐ１１０−βサブユニットに対するｓｉＲＮＡを使用した。よって陽性対照は、プロテインキナーゼＮベータＰＴＥＮの上流のレギュレーターに対応する。
【０１４５】
リンパ節転移におけるプロテインキナーゼＮベータをコードするｍＲＮＡを分解するために、２つの独立ｓｉＲＮＡ分子の更に別のセットを使用した。リンパ節転移は、以下のリンパ節に見い出される続発性腫瘍である：尾部、腰部、腎及び縦隔リンパ節（ここで、尾部リンパ節が前立腺に最も近く、そして縦隔リンパ節が移植腫瘍に最も遠い）。原発性腫瘍の場合のように、ｓｉＲＮＡ構築体は、プロテインキナーゼＮベータをコードするｍＲＮＡの縮小及び腫瘍容量の縮小に明らかに成功した（図８Ｂ）。陽性及び陰性対照は、原発性腫瘍の縮小に関連して考察されたとおりであった。両方の場合に、即ち、原発性腫瘍とリンパ節転移について、ヒト前立腺腫瘍細胞は、ポリメラーゼIII Ｕ６プロモーターから各ｓｉＲＮＡ分子を発現するように遺伝子操作した。
【０１４６】
これらの結果を別にして、図８Ｃ１及び図８Ｃ２に図解される明確な表現型分析は、ヒト前立腺腫瘍細胞中でのｓｉＲＮＡ構築体の転写の活性化により、リンパ節転移を有意に縮小することができ、そして図８Ｃ１に図解されるリンパ節の腫れは、図８Ｃ２に図解されるようにｓｉＲＮＡで処理した組織には存在しないことを示している。
【０１４７】
実施例９：プロテインキナーゼＮベータの機能特性解析
この実施例は、プロテインキナーゼＮベータの機能特性解析に関し、そして更に具体的には、リン酸化によるそのキナーゼ活性及びそのキナーゼ活性の調節に及ぼす、誘導体化（即ち、プロテインキナーゼＮベータの機能性アミノ酸残基の切断又は突然変異）の影響力に関する。
【０１４８】
少なくとも部分的には図９Ｃに概略図解されるように、本明細書に開示される野生型配列を指すアミノ酸残基により、以下のプロテインキナーゼＮベータ誘導体を作成した：
ａ）アミノ酸５３５〜８８９を含むキナーゼドメイン；
ｂ）アミノ酸２８８〜８８９を含むΔＮ；
ｃ）５８８位にリシンからアルギニンへの突然変異を有するキナーゼドメイン；
ｄ）５８８位にリシンからグルタミン酸への突然変異を有するキナーゼドメイン；
ｅ）アミノ酸７１８位のトレオニン残基がアラニン（ＴＡ７１８）又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸（ＴＤ７１８又はＴＥ７１８）のいずれかに変化している、リン酸化部位（ＡＧＣ活性化ループコンセンサス）に突然変異を有するキナーゼドメインの誘導体；及び
ｆ）完全長野生型ＰＫＮベータ分子（８８９アミノ酸）。
【０１４９】
各断片は、ＨｅＬａ細胞で一過性発現させた。これらの相対発現量は、抗ＰＫＮベータ抗体を用いてＨｅＬａ細胞抽出物のウェスタンブロット分析により測定した。
【０１５０】
ポリクローナル抗ＰＫＮベータ抗血清は、大腸菌（E. coli）でのＰＫＮベータのＣ末端アミノ酸（６０９〜８９９）の過剰発現を経て生成した。各タンパク質断片は、標準法により封入体からゲル精製し、回収して濃縮した。
【０１５１】
プロテインキナーゼＮベータは、その触媒ドメインにおいてＣ末端でＡＧＣ型キナーゼ分子との相同性を有する。キナーゼのファミリーは、酵素活性のためにはリン酸化されることを必要とする、触媒ドメインの活性化ループにおける保存トレオニン残基を特徴とする。活性化ループにおけるこのトレオニンと周囲のアミノ酸の前後関係の高度保存のため、この部位に対する抗ホスホ抗体は業者から調達できる。各抗体は、図９では抗Ｐ*−ＰＲＫと呼ばれ、そして図１０では抗Ｐ*−ＡＧＣキナーゼと呼ばれる。
【０１５２】
ＭＰＢは、標準的なインビトロのリン酸化基質であるミエリン塩基性タンパク質である。
【０１５３】
以下の結果を得た：
【０１５４】
【表３】
【０１５５】
＊ ＋；活性
−；不活性
！；他のキナーゼにおける同等の突然変異から予期されるような「過度の活性化」は観測されなかった（MorganとDebond, 1994）
【０１５６】
結果は、図９に図解される。
【０１５７】
図９Ａは、ＨｅＬａ細胞における一過性過剰発現での、標準リン酸化基質としてＭＰＢを使用する、種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体とその活性のゲル分析を示す。図９Ａから判るように、完全長プロテインキナーゼＮベータを別にして、他の点では野生型であるキナーゼドメインだけが、ＭＰＢのリン酸化において活性である。
【０１５８】
同じプロテインキナーゼＮベータ誘導体を使用するとき、７１８位に突然変異Ｔ／Ａを有するキナーゼドメインを含む誘導体を除いて、表示された他の全ての誘導体は、それらの更に別の固有の活性に関わらずリン酸化されたことが観察できる。
【０１５９】
データは、機能性キナーゼドメインと７１８位のリン酸化の存在が、ＰＫＮベータキナーゼ活性の必須条件であることを示している。しかし、ΔＮ版がキナーゼとして作用できないことから結論できるように、これらでは充分でない。データはまた、キナーゼ欠損ＫＲ５８８突然変異タンパク質が７１８位のリン酸化を保持しているため、ＰＫＮベータが、アミノ酸７１８で自己リン酸化しないが、代わりに別のキナーゼ分子によるリン酸化を必要とすることを示している。
【０１６０】
実施例１０：完全長ＰＫＮベータの性状解析
完全長分子に照らしてプロテインキナーゼＮベータの機能性アミノ酸残基の突然変異を分析するために、図１０及び１１に示されるように以下の実験を行った：
【０１６１】
ＰＫＮベータのキナーゼ活性をインビトロで測定するために、組換えＨＡ−又はＭｙｃ−標識ＰＫＮベータ誘導体をＨｅＬａ又はＣＯＳ−７細胞で一過性発現させた。小さなキナーゼドメイン誘導体を対照とした。組換え版のプロテインキナーゼＮベータを含む細胞抽出物を、同等の発現レベルを証明するために実施例９に記載されたように抗プロテインキナーゼＮベータ抗体（図１０Ａ）により、そして異なる程度のプロテインキナーゼＮベータ誘導体のインビボのリン酸化を示すために抗ホスホＡＧＣ部位抗体（抗−Ｐ*−ＡＧＣ−キナーゼとも呼ばれる）（図１０Ｂ）により、平行して精査した。
【０１６２】
実施例１１：完全長プロテインキナーゼＮベータの活性のためのリン酸化要求と、非放射活性インビトロキナーゼアッセイ法の開発−ＨＴＳアッセイのためのプロテインキナーゼＮベータの適合性
ＰＫＮベータ誘導分子を、抗標識抗体を使用することにより図１０に示される細胞抽出物から免疫沈降させた。免疫沈降物は、報告（Klippelら, 1996）されるように洗浄して、二等分した。一方の半分を、リン酸化基質として５μg ＭＢＰ（ＵＢＩ）、４mM ＭｇＣｌ2及びガンマ32Ｐ−ＡＴＰと共に緩衝液中で１０分間室温でインキュベートした。更に、ホスファターゼインヒビター及び非特異的に作用するキナーゼに対するインヒビターを、Klippelら, 1998にあるように加えた。放射活性リン酸の取り込みは、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる反応生成物の分離後にオートラジオグラフィーにより検出した（図１１Ｂ）。
【０１６３】
免疫沈降物のもう一方の半分は、２００μM ｒＡＴＰの存在下でリン酸化基質として１μg ＧＳＴ−ＧＳＫ３融合タンパク質（セル・シグナリング・テクノロジー（Cell Signaling Technology））と共にインキュベートした。続いて反応混合物は、８〜１６％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ホスホＧＳＫ３アルファ抗体（セル・シグナリング・テクノロジー）を用いたウェスタンブロッティングにより分析した（図１１Ａ）。次にフィルターをストリップして、抗ＰＫＮベータ抗血清で再精査することにより、各免疫沈降物中の相当量のＰＫＮベータタンパク質の存在を確認した（図１１Ｃ）。
【０１６４】
インビトロのリン酸化反応の特異性は、キナーゼ欠損変種（例えば、ＡＴＰ結合部位に突然変異を含む、上記を参照のこと）を活性タンパク質と平行して分析することにより制御した。
【０１６５】
他の点では完全長野生型プロテインキナーゼＮベータであるプロテインキナーゼＮベータのアミノ酸７１８でのＴＡ突然変異変種の場合のシグナルの欠乏は、このアミノ酸残基が、抗体により検出されるリン酸化の実にその位置であることを示す（図１０Ｂ）。キナーゼ欠乏変種（それぞれ図１０及び図９に示されるように、ＫＥ又はＫＲ突然変異）がこの部位でリン酸化されるという事実は、トレオニン７１８が自己リン酸化の基質ではないことを示す。むしろ細胞中の別のキナーゼが、この部位のリン酸化を担当しなければならない；そしてＰＫＤ１は、有力な候補である。
【０１６６】
また、実施例９の１つと組合せたこの実験から、７１８位でのプロテインキナーゼＮベータのリン酸化が、プロテインキナーゼＮベータ活性の必須条件であることが露呈した；この部位で試験した全ての突然変異は、リン酸化を妨げて、不活性なキナーゼ分子が生じた。この範囲において、本明細書に開示される本発明の任意の態様に関連して使用することができる、特に好ましいプロテインキナーゼＮベータは、７１８位がリン酸化されているプロテインキナーゼＮベータか、又は本明細書に記載されたようにキナーゼドメインのみを含む誘導体を含む、その誘導体である。データは更に、キナーゼ欠損ＫＥ５８８突然変異タンパク質が７１８位のリン酸化を保持しているため、完全長ＰＫＮベータもまたアミノ酸７１８で自己リン酸化しないが、代わりに別のキナーゼ分子によるリン酸化を必要とすることを示している。
【０１６７】
図１１から判るように、プロテインキナーゼＮベータの活性の測定は、プロテインキナーゼＮベータインヒビターのスクリーニングを高速大量処理系にすることができる形式に適応させることができる。
【０１６８】
第１工程で、非放射活性スクリーニング形式の適合性を決定したが、ここで実施例１０に関連して既に考察された種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体を、適切な基質をリン酸化するために使用した。このような基質は、例えば、ＭＢＰ又はＧＳＫ３ペプチドであってよく、これは典型的にはアガロース−若しくはセファロースビーズのような適切な担体又はプラスチック表面上に固定化される。本発明の場合には、そして図１１Ａに図解されるように、基質は、パラミオシンに融合したＧＳＫ３由来ペプチドである。第１列は、種々のプロテインキナーゼＮベータ誘導体を使用する全ての様々のアッセイ法が、実際に該誘導体を含むことを示している。完全長野生型プロテインキナーゼＮベータ又は実施例９と同義のキナーゼドメインだけが、基質をリン酸化するのに適していた。本発明の場合のリン酸化基質は、抗ホスホＧＳＫ３アルファ抗体により検出した（上述）。
【０１６９】
図１１Ａに図解される非放射活性アプローチが充分な感度であることを確認するために、リン酸化基質としてＭＢＰを使用して、放射活性アプローチを免疫沈降物の半分と平行して行った。キナーゼ活性の効果は、［32Ｐ］取り込みによるオートラジオグラフィーに示されるように、生成したリン酸化基質の量から理解できる。図１１Ａ及び１１Ｂから判るように、完全長野生型プロテインキナーゼＮベータ並びにキナーゼドメインは活性を示すが、一方、それぞれ完全長ＫＥ及び完全長ＴＡ突然変異タンパク質では、検出されない（図１１Ａ）か、又は非特異的キナーゼのバックグラウンド活性（図１１Ｂ）が検出された。
【０１７０】
要約すると、完全長野生型プロテインキナーゼＮベータ並びに本明細書に開示されたキナーゼドメインの両方の使用は、ＨＴＳ形式でのスクリーニング手順の設計のための適切な標的又は手段である。よって各工程は、以下を含む：
ａ）キナーゼ活性を示すにはタンパク質をリン酸化することが必要である（細菌系での発現では容易に達成できない）という事実に照らして、昆虫細胞系（Klippelら, 1997の種々のキナーゼのための例）のような非細菌発現系での発現により、精製した組換えプロテインキナーゼＮベータタンパク質を作成すること；
ｂ）ＧＳＫ３由来基質又は同様の基質の固定化、並びにｒＡＴＰ、ＭｇＣｌ2及びインヒビターの存在下で緩衝液中で精製プロテインキナーゼＮベータと共にこの基質をインキュベートすること；
ｃ）場合により連続洗浄後に、抗ホスホ−ＧＳＫ３抗体のような抗体などの適切な検出手段により、基質のリン酸化を検出すること、そして更に場合により続いてデルフィア（Delfia）又はランス（Lance）アッセイ系（パーキン・エルマー（Perkin Elmer））（ここで、リン酸化部位は、ユーロピウム標識抗体によって結合される）で現像すること。結合ユーロピウムの量は、次に時間分解蛍光分析法により定量される。
【０１７１】
実施例１２：内因性ＰＫＮ−ベータの発現レベルの測定
この実施例では、ＰＫＮ−ベータがＰＩ３−キナーゼ依存的に発現するという実験的証拠が与えられる。図３に示されるＰＫＮベータＲＮＡのＰＩ３−キナーゼ依存性発現は、ここではタンパク質レベルで更に確認される。
【０１７２】
ＰＣ−３細胞を本明細書の実施例１に記載されるように培養した。該ＰＣ−３細胞は、ＰＴＥＮ −／−である。ＨｅＬａ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手して、Sternbergerら（2002）に記載されるように増殖させた。トランスフェクションは、１０cmプレート（３０％〜５０％コンフルエンシーで）でヒュージーン（Fugene）６（ロシュ（Roche）、ナトリー、ニュージャージー州）を用いて製造業者の指示書により行った。培養細胞は、トリプシン処理して、培地によりトリプシン作用を停止させてから回収した。
【０１７３】
両方の細胞型、即ち、ＰＣ−３細胞とＨｅＬａ細胞は、１０μMのＬＹ２９４００２又はＤＭＳＯと共に表示される時間、処理した（ここで、ＤＭＳＯは、ＬＹ２９４００２の溶媒として使用し、このため、陰性対照として使用した）。
【０１７４】
生じた抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、続いてウェスタンブロッティングにより分析した。ｐ１１０（ローディングコントロールとした）、内因性ＰＫＮ−ベータ及びリン酸化Ａｋｔのような表示されるタンパク質のレベルは、各抗体を用いて検出した。リン酸化Ａｋｔ（Ｐ*−Ａｋｔ）は、ＬＹ２９４００２介在処理の有効性の対照とする。
【０１７５】
結果は、図１２に図解される。
【０１７６】
ＰＣ−３細胞ではＰＩ−３−キナーゼの阻害は、２４時間後の内因性ＰＫＮベータ発現の目に見える減少を引き起こし、タンパク質レベルは、４８時間の処理後に更に減少した。ＰＫＮベータタンパク質をより多く発現するＨｅＬａ細胞では、この作用はあまり劇的ではないが、ＬＹ２９４００２での４８時間処理後には減量が検出できる。
【０１７７】
ここから、ＰＩ３−キナーゼがＰＫＮ−ベータの発現を制御すると結論づけることができる。
【０１７８】
実施例１３：ＰＫＮ−ベータ活性はＰＩ３−キナーゼを必要とする
組換え野生型ＰＫＮ−ベータ又はＰＫＮ−ベータの誘導体（図１０〜１１に記載されるもの）をＨｅＬａ細胞で一過性発現させた。該誘導体は、本明細書の実施例１０に記載されるＰＫＮ−ベータ誘導体ＴＡ及び誘導体ＫＥである。ＰＫＮ−ベータは、各場合に上述のようにｍｙｃ−タグにより修飾し、そして抗Ｍｙｃ抗体を用いるＰＫＮ−ベータ及びその誘導体の沈降を可能にした。
【０１７９】
ＰＫＮ−ベータの活性の評価のために、免疫沈降物を用いてインビトロキナーゼ活性を上述のように行った。沈降物の半分は、インビトロキナーゼ反応に付し、２番目の半分は、抗ホスホ−ＰＲＫ抗体を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。フィルターをストリップして、抗ＰＫＮ−ベータ抗血清を用いて再精査した。ホスホ−ｐ７０ Ｓ６ キナーゼレベルは、わずか３時間処理後のＬＹ２９４００２処理の有効性を確認するために、前もって取りだした細胞溶解物のアリコートから分析した。抗ホスホｐ７０抗体は、セル・シグナリングから入手した。
【０１８０】
図１３から判るように、ＬＹ２９４００２処理は、ここでは再度ＭＢＰのリン酸化により測定された、ＰＫＮベータのキナーゼ活性の強力な阻害をもたらす。この作用は、わずか３時間の処理後にも目に見え、２４時間後にはＰＫＮベータ活性は、ほぼ完全に阻害された。ＰＫＮベータの７１８位のリン酸化はまた、ＬＹ２９４００２によるＰＩ３−キナーゼの阻害後も危機的であったが、この作用はキナーゼ活性に及ぼす作用よりは著しいものではなかった。
【０１８１】
ＰＫＮ−ベータのＴＡ誘導体は、上に示されるように不活性対照となり、そして７１８位のホスホ−トレオニン（Ｐ*−ＰＫ）に対する抗ホスホＰＲＫ抗体の特異性の対照となる。
【０１８２】
ＰＫＮ−ベータ誘導体ＫＥは、上述されるようにキナーゼ欠乏対照となる。そのリン酸化状態はまた、ある程度ＬＹ２９４００２処理に影響を受けるようであった。このことは、７１８位でＰＫＮベータのリン酸化を担当するキナーゼが、ＰＩ３−キナーゼ依存的に働くことを示している。
【０１８３】
最も重要なことには、この実験は、ＰＫＮベータが、ＰＩ３−キナーゼによりその発現レベルを介して調節される（図３及び１２を参照のこと）だけでなく、その活性化レベルでも調節されることを示している。これらの知見は、ＰＫＮベータが、種々のレベルで調節されるＰＩ３−キナーゼに等部位的に依存しているため、治療的介入のための活動亢進ＰＩ３−キナーゼ経路への干渉の「完璧な」下流の標的に相当することを示している。これにより、タンパク質ＰＫＮ−ベータとこれをコードする核酸の両方に明確な作用を示す化合物の生成が可能である。更に重要なことには、転写レベルよりむしろ翻訳レベル（即ち、発現されるタンパク質のレベル）でのＰＫＮ−ベータのこの種の活性変調は、転写レベルでの影響力よりも卓越しており、かつ長期にわたると考えられる。
【０１８４】
本発明の更に別のスクリーニング方法は、この具体的な洞察に基づき、そして好ましくは読み出しとして放射活性又は非放射活性のインビトロキナーゼアッセイを利用する。
【０１８５】
実施例１４：ＰＫＮ−ベータの局在シグナル
この実験では、種々のＰＫＮ−ベータ誘導体の局在を野生型ＰＫＮ−ベータの局在と比較した。図１４は、ＰＫＮベータ野生型（図１４Ａ）、ＰＫＮベータ誘導体ＴＡ（図１４Ｂ）、ＰＫＮベータ誘導体ＫＥ（図１４Ｃ）及びＰＫＮベータ デルタＮ（図１４Ｄ）のような、ＰＫＮベータ及びその誘導体の細胞内分布を共焦点蛍光顕微鏡法により調査した、写真を示している。ＨＡ標識したＰＫＮベータの組換え誘導体は、ＨｅＬａ細胞で４８時間一過性発現させた。固定及び透過性化後、組換えタンパク質の発現は、抗ＨＡ抗体と、続いてＦＩＴＣ結合抗マウス抗体を用いて検出した。細胞は、細胞骨格アクチンをローダミン−ファロイジンで標識することにより対比染色した。
【０１８６】
結果は、図１４Ａ〜１４Ｄに図解されるが、ここで複式写真の各左側の各写真は、ＦＩＴＣ特異的励起の細胞の写真に関し、そして右の写真は、ローダミン−ファロイジンに特異的な波長を用いて励起した同じ細胞を示している。ＦＩＴＣ染色は、各組換えタンパク質でトランスフェクトした細胞を示している。ローダミン−ファロイジン染色は、トランスフェクトした細胞としていない細胞を示している。
【０１８７】
図１４Ａから判るように、野生型ＰＫＮ−ベータは、大部分細胞の核に局在している。リン酸化部位突然変異のＰＫＮ−ベータＴＡ及びＫＥ突然変異株は両方とも、キナーゼ欠乏であり、野生型ＰＫＮ−ベータに比較して、もはや核内に集中していないが、むしろ細胞全体に行きわたっている。最後に、図１４Ｄに図解されるように、分子のＮ末端３番目を欠いており、そしてまたキナーゼ欠損である（図９を参照のこと）ＰＫＮ−ベータ誘導体ΔＮは、本質的に核から締め出されている。
【０１８８】
これらのデータは、核へのＰＫＮベータの正しい核内局在は、活性なキナーゼ分子として作用するその能力に依存し、そしてそのＮ末端ドメインの存在を必要とすることを示している。これは、ＰＩ−３キナーゼが、その細胞内局在をも調節するであろうことを意味する。
【０１８９】
明細書、配列リスト、請求の範囲及び／又は図面に開示される本発明の特色は、別々にも任意に組合せても、本発明をその種々の形態で実現するための構成要素である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＩ３−キナーゼ経路の下流の標的としての、好ましくはＰＩ３−キナーゼ経路の下流の薬物標的としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用。
【請求項２】
疾患の治療及び／又は予防用の医薬の製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項３】
プロテインキナーゼＮベータが、配列番号１による、又はデータバンクエントリーＰＩＤ ｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有することを特徴とする、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
疾患の治療及び／又は予防のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸、又はその断片若しくは誘導体の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項５】
プロテインキナーゼＮベータが、配列番号１による、又はデータバンクエントリーＰＩＤ ｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有することを特徴とする、請求項４記載の使用。
【請求項６】
核酸が、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸であることを特徴とする、請求項４又は５記載の使用。
【請求項７】
プロテインキナーゼＮベータが、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸によりコードされる、請求項１、４又は５のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
核酸配列が、遺伝暗号の縮重を別にして、請求項４に特定された核酸にハイブリダイズする、請求項４記載の使用。
【請求項９】
核酸配列が、ストリンジェントな条件下で、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸配列又はその一部にハイブリダイズする核酸配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
疾患に関係する細胞が、ＰＴＥＮ活性を欠いているか、攻撃的挙動の増大を示すか、又は後期腫瘍の細胞であることを特徴とすることを、その疾患が特徴とする、請求項２〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
疾患が、後期腫瘍である、請求項２〜１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
疾患の治療及び／又は予防用薬のスクリーニングのための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための方法であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択され、以下：
ａ）候補化合物を用意する工程、
ｂ）プロテインキナーゼＮベータ用の発現系及び／又はプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系を用意する工程；
ｃ）候補化合物を、プロテインキナーゼＮベータ用の発現系及び／又はプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系と接触させる工程；
ｄ）プロテインキナーゼＮベータの発現及び／又は活性が、候補化合物の影響下で変化するかどうかを決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
候補化合物が、化合物のライブラリーに含まれることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
候補化合物が、ペプチド、タンパク質、抗体、アンチカリン、機能性核酸、天然化合物及び低分子を含む化合物類の群から選択されることを特徴とする、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
機能性核酸が、アプタマー、アプタザイム、リボザイム、スピーゲルマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発及び／又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、標的分子としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸又はその一部若しくは誘導体の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項１７】
医薬及び／又は診断薬が、抗体、ペプチド、アンチカリン、小分子、アンチセンス分子、アプタマー、スピーゲルマー及びＲＮＡｉ分子を含む群から選択される作用物質を含むことを特徴とする、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
作用物質が、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用することを特徴とする、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
作用物質が、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と、特にプロテインキナーゼＮベータのｍＲＮＡ、ゲノム核酸又はｃＤＮＡと、相互作用することを特徴とする、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチドの使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項２１】
ポリペプチドが、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に対する抗体、及びプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に結合するポリペプチドを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項２３】
核酸が、アプタマー及びスピーゲルマーを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項２５】
相互作用する核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び／又はｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸が、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡであることを特徴とする、請求項２４又は２５記載の使用。
【請求項２７】
プロテインキナーゼＮベータ及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸が、請求項１〜１１のいずれか１項記載のものである、請求項１６〜２６のいずれか１項記載の使用。
【請求項２８】
プロテインキナーゼＮベータ及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸が、請求項１〜１１のいずれか１項記載のものである、請求項１２〜１５記載の方法。
【請求項２９】
プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と、あるいはプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する小分子；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に特異的な抗体；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチド；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸；あるいはプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質、及び少なくとも１つの薬剤学的に許容しうる担体を含む、好ましくは疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、医薬組成物。
【請求項３０】
癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、疾患又は症状の特性解析のためのキットであって、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に特異的な抗体、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチド、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用するポリペプチド、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質、及び場合により少なくとも１つの他の化合物を含むことを特徴とするキット。
【請求項１】
ＰＩ３−キナーゼ経路の下流の標的としての、好ましくはＰＩ３−キナーゼ経路の下流の薬物標的としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用。
【請求項２】
疾患の治療及び／又は予防用の医薬の製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその断片若しくは誘導体の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項３】
プロテインキナーゼＮベータが、配列番号１による、又はデータバンクエントリーＰＩＤ ｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有することを特徴とする、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
疾患の治療及び／又は予防のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータをコードする核酸、又はその断片若しくは誘導体の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項５】
プロテインキナーゼＮベータが、配列番号１による、又はデータバンクエントリーＰＩＤ ｇ７０１９４８９若しくはデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８９によるアミノ酸配列、あるいはその一部又は誘導体を有することを特徴とする、請求項４記載の使用。
【請求項６】
核酸が、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸であることを特徴とする、請求項４又は５記載の使用。
【請求項７】
プロテインキナーゼＮベータが、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸によりコードされる、請求項１、４又は５のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
核酸配列が、遺伝暗号の縮重を別にして、請求項４に特定された核酸にハイブリダイズする、請求項４記載の使用。
【請求項９】
核酸配列が、ストリンジェントな条件下で、配列番号２による、又はデータバンクエントリーｇｉ７０１９４８８若しくはＮＭ＿０１３３５（好ましくはＮＭ＿０１３３５．１）による核酸配列又はその一部にハイブリダイズする核酸配列である、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
疾患に関係する細胞が、ＰＴＥＮ活性を欠いているか、攻撃的挙動の増大を示すか、又は後期腫瘍の細胞であることを特徴とすることを、その疾患が特徴とする、請求項２〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
疾患が、後期腫瘍である、請求項２〜１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
疾患の治療及び／又は予防用薬のスクリーニングのための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための方法であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択され、以下：
ａ）候補化合物を用意する工程、
ｂ）プロテインキナーゼＮベータ用の発現系及び／又はプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系を用意する工程；
ｃ）候補化合物を、プロテインキナーゼＮベータ用の発現系及び／又はプロテインキナーゼＮベータの活性を検出する系と接触させる工程；
ｄ）プロテインキナーゼＮベータの発現及び／又は活性が、候補化合物の影響下で変化するかどうかを決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
候補化合物が、化合物のライブラリーに含まれることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
候補化合物が、ペプチド、タンパク質、抗体、アンチカリン、機能性核酸、天然化合物及び低分子を含む化合物類の群から選択されることを特徴とする、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
機能性核酸が、アプタマー、アプタザイム、リボザイム、スピーゲルマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発及び／又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、標的分子としての、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸又はその一部若しくは誘導体の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項１７】
医薬及び／又は診断薬が、抗体、ペプチド、アンチカリン、小分子、アンチセンス分子、アプタマー、スピーゲルマー及びＲＮＡｉ分子を含む群から選択される作用物質を含むことを特徴とする、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
作用物質が、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用することを特徴とする、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
作用物質が、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と、特にプロテインキナーゼＮベータのｍＲＮＡ、ゲノム核酸又はｃＤＮＡと、相互作用することを特徴とする、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチドの使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項２１】
ポリペプチドが、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に対する抗体、及びプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に結合するポリペプチドを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項２３】
核酸が、アプタマー及びスピーゲルマーを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
疾患の治療及び／又は予防用医薬の開発又は製造のための、及び／又は疾患の診断用の診断薬の製造のための、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸の使用であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、使用。
【請求項２５】
相互作用する核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及び／又はｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸が、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡであることを特徴とする、請求項２４又は２５記載の使用。
【請求項２７】
プロテインキナーゼＮベータ及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸が、請求項１〜１１のいずれか１項記載のものである、請求項１６〜２６のいずれか１項記載の使用。
【請求項２８】
プロテインキナーゼＮベータ及び／又はプロテインキナーゼＮベータをコードする核酸が、請求項１〜１１のいずれか１項記載のものである、請求項１２〜１５記載の方法。
【請求項２９】
プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と、あるいはプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する小分子；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に特異的な抗体；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチド；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸；プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸；あるいはプロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質、及び少なくとも１つの薬剤学的に許容しうる担体を含む、好ましくは疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物であって、該疾患が、癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、医薬組成物。
【請求項３０】
癌、転移癌及びＰＩ３−キナーゼ経路に関係する任意の病的状態を含む群から選択される、疾患又は症状の特性解析のためのキットであって、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体に特異的な抗体、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用するポリペプチド、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用するポリペプチド、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体と相互作用する核酸、プロテインキナーゼＮベータ又はその一部若しくは誘導体をコードする核酸と相互作用する核酸を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質、及び場合により少なくとも１つの他の化合物を含むことを特徴とするキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−２６３３３（Ｐ２０１１−２６３３３Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２１３５１２（Ｐ２０１０−２１３５１２）
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【分割の表示】特願２００４−５３２０８１（Ｐ２００４−５３２０８１）の分割
【原出願日】平成１５年８月１０日（２００３．８．１０）
【出願人】（５０５０４７２５６）サイレンス・セラピューティクス・アーゲー (13)
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＬＥＮＣＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１３５１２（Ｐ２０１０−２１３５１２）
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【分割の表示】特願２００４−５３２０８１（Ｐ２００４−５３２０８１）の分割
【原出願日】平成１５年８月１０日（２００３．８．１０）
【出願人】（５０５０４７２５６）サイレンス・セラピューティクス・アーゲー (13)
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＬＥＮＣＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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