プロフェノールオキシダーゼ・システムを活性化させる蛋白質及びこれをコーディングする遺伝子
本発明は、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）のプロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ：pro-phenoloxidase）システムを活性化させる新規の蛋白質、これをコーディングする遺伝子、前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出方法、及び前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出用キットを提供する。本発明はまた、前記キットの標準物質として有用な、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）のプロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ：pro-phenoloxidase）システムを活性化させる新規の蛋白質、これをコーディングする遺伝子、前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出方法、及び前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出用キットに関する。本発明はまた、前記キットの標準物質として有用な、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の遺伝工学研究は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のペプチドグリカン（ＰＧ）を認識する蛋白質であるDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＤがToll経路を活性化させ(Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2001) Nature 414, 756-759;及び Bischoff, V., Vignal, C., Boneca, I. G., Michel, T., Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2004) Nat Immunol 5, 1175-1180)、Drosophila ＰＧＲＰ−ＬＣ及びDrosophila ＰＧＲＰ−ＬＥがＩｍｄ経路に対する受容体であることを明らかにしている(Gottar, M., Gobert, V., Michel, T., Belvin, M., Duyk, G., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. & Royet, J. (2002) Nature 416, 640-644; Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D. & Anderson, K. V. (2002) Science 296, 359-362; 及びTakehana, A., Katsuyama, T., Yano, T., Oshima, Y., Takada, H., Aigaki, T. & Kurata, S. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 13705-13710)。Drosophilaグラム陰性菌結合蛋白質１（Drosophila ＧＮＢＰ１）の機能消失突然変異（loss-of-function mutant）の免疫表現型は、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡと区分できず、これは、２つの蛋白質がグラム陽性菌の感染に対する反応において、Toll経路を活性化させるために必要であるということを示す(Gobert, V., Gottar, M., Matskevich, A. A., Rutschmann, S., Royet, J., Belvin, M., Hoffmann, J. A. & Ferrandon, D. (2003) Science 302, 2126-2130; Pili-Floury, S., Leulier, F., Takahashi, K., Saigo, K., Samain, E., Ueda, R. & Lemaitre, B. (2004) J Biol Chem 279, 12848-12853;及びWang, L., Weber, A. N., Atilano, M. L., Filipe, S. R., Gay, N. J. & Ligoxygakis, P. (2006) EMBO J 25, 5005-5014)。しかし、グラム陰性菌認識におけるToll経路の上流（upstream）部分の分子レベルでのメカニズムは、まだはっきりと明らかにされていない。
【０００３】
浸襲する病原菌のメラニン化を誘導するプロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ）活性化カスケードは、無脊椎動物において、他の重要な固有の免疫防御メカニズムであり、これは、ペプチドグリカン（ＰＧ）及びβ−１，３−グルカンによって誘発される(Cerenius, L. & Soderhall, K. (2004) Immunol Rev 198, 116-126;及びKanost, M. R., Jiang, H. & Yu, X. Q. (2004) Immunol Rev 198, 97-105)。脊椎動物の補体システムと同様に、pro−ＰＯカスケードは、血漿内の蛋白質分解（proteolytic）カスケードである。従って、前記pro−ＰＯシステムは、細胞が含まれていない（cell-free）条件で、ＰＧ及びβ−１，３−グルカン認識、並びにそれに続く信号伝達に係る生化学的研究のための望ましいツールである。本発明者らは、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡと高い配列相同性を示すチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）ＰＧＲＰを同定した経緯がある。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと命名した前記ＰＧＲＰは、Tenebrio昆虫で、Ｌｙｓ−ＰＧ依存性pro−ＰＯシステムを活性介させた。驚くべきことに、新規の合成Ｌｙｓ−ＰＧ断片が、pro−ＰＯシステムの活性化において、水溶性のポリマー線形Ｌｙｓ−ＰＧの競争的阻害剤として機能する。前記合成Ｌｙｓ−ＰＧ断片（ここで、「合成ムロペプチドダイマー（synthetic muropeptide dimer）」と称する）は、下記化学式１の構造を有し、テトラサッカライド（ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ）が２個（two copies）のテトラペプチドステム（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ）に共有結合されている(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)。
【０００４】
【化１】
【０００５】
ＰＧ−断片なしに、またはＰＧ−断片との複合体を形成したＰＧＲＰ蛋白質についての最近の結晶構造に係る研究は、ＰＧ認識に対する構造的な根拠について重要な情報を提供した(Lim, J. H., Kim, M. S., Kim, H. E., Yano, T., Oshima, Y., Aggarwal, K., Goldman, W. E., Silverman, N., Kurata, S. & Oh, B. H. (2006) J Biol Chem 281, 8286-8295; Chang, C. I., Chelliah, Y., Borek, D., Mengin-Lecreulx, D. & Deisenhofer, J. (2006) Science 311, 1761-1764; Chang, C. I., Ihara, K., Chelliah, Y., Mengin-Lecreulx, D., Wakatsuki, S. & Deisenhofer, J. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102, 10279-10284; Guan, R., Roychowdhury, A., Ember, B., Kumar, S., Boons, G. J. & Mariuzza, R. A. (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101, 17168-17173; Kim, M. S., Byun, M. & Oh, B. H. (2003) Nat Immunol 4, 787-793;及びChang, C. I., Pili-Floury, S., Herve, M., Parquet, C., Chelliah, Y., Lemaitre, B., Mengin-Lecreulx, D. & Deisenhofer, J. (2004) PLoS Biol 2, E277)。Ｎ−アセチルグルコースアミン及びＮ−アセチルムラミン酸の糖がステム（stem）として短いペプチドと連結されたムロペプチドが、ＰＧＲＰ−ＳＡに対する最小結合単位として明らかにされた。
【０００６】
しかし、ＰＧＲＰによるＬｙｓ−ＰＧの認識信号が、いかようにpro−ＰＯまたはToll経路の活性化に至るセリンプロテアーゼ（ＳＰ：serine protease）カスケードを引き出しているかは不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、生体内のキイロショウジョウバエ（Drosophila）Toll経路、試験管内のpro−ＰＯ活性化システム、及び組み替えＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質を利用した生化学的な接近を介して、Ｌｙｓ−ＰＧ認識信号がいかように下流（downstream）に伝えられるかについて多様な研究を行った。その結果、本発明者らは、pro−ＰＯシステムに関与する蛋白質を分離し、また、前記蛋白質が血液などの検体中のバクテリア感染を検出するのに有用であることを発見した。また、本発明者らは、検体中のバクテリア感染の検出において、標準物質として有用である、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法を開発した。
【０００８】
従って、本発明は、プロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ）システムを活性化させる蛋白質及びこれをコーディングする遺伝子を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出方法を提供する。
本発明はまた、前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出用キットを提供する。
本発明はまた、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ）の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一様態によって、配列番号２のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のグラム陰性菌結合蛋白質１（Tenebrio ＧＮＢＰ１）、及びこれをコーディングするポリヌクレオチド、例えば配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１１】
本発明の他の様態によって、配列番号４のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−１（Tenebrio ＭＳＰ−１）、及びこれをコーディングするポリヌクレオチド、例えば配列番号５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１２】
本発明のさらに他の様態によって、 配列番号６のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−２（Tenebrio ＭＳＰ−２）、及びこれをコーディングするポリヌクレオチド、例えば配列番号７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明のさらに他の様態によって、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のペプチドグリカン認識蛋白質（Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）を検体に加え、インキュベーションする段階と、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を、段階（ａ）で得られたインキュベーション混合物に加え、インキュベーションする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られたインキュベーション混合物のうち、前記蛋白質と検体との反応性を検出する段階とを含む、検体中のバクテリア感染の検出方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに他の様態によって、 配列番号１のアミノ酸配列を有するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ；及び配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を含む、検体中のバクテリア感染の検出用キットが提供される。
【００１５】
本発明のさらに他の様態によって、 （ａ’）バクテリアから分離した不溶性ペプチドグリカンを、約ｐＨ８の緩衝液に懸濁させる段階と、（ｂ’）段階（ａ’）で得られた懸濁液をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）で処理する段階と、（ｃ’）段階（ｂ’）で得られた反応混合物を約９５℃で約１０分間加熱し、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、（ｄ’）段階（ｃ’）で得られた上澄み液をサイズ排除カラムで分画し、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画を回収する段階とを含む、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によってpro−ＰＯシステムを活性化させる新規の因子（すなわち、蛋白質）が同定された。前記蛋白質は、血液などの検体中のバクテリア感染を検出したり、あるいは検出用キットの製造に使われうる。また、本発明によって、ｂｌｐ及び／またはリゾチームを使用して血液などの検体を前処理する場合、バクテリア感染がpro−ＰＯシステムに関与する前記因子によって、さらに効果的に検出されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】線形ペプチドグリカン（ＰＧ）（ａ）、及び合成ムロペプチドダイマー（ｂ）の予想される構造を示し、白色大球、黒色大球、黒色小球、及び白色小球は、それぞれＳ．aureus ＰＧのＮ−アセチル−グルコースアミン、Ｎ−アセチルムラミン酸、ステムペプチド（stem peptides）及びグリシン残基を示す。
【図２】Toyopearl ＨＷ−５５Ｓサイズ排除コラム上の分画されたＳＬＰＧのＵＶ吸光度プロファイル及び各ＳＬＰＧ分画のＰＯ活性を示す。
【図３】水（白色バー）、合成ムロペプチドダイマー（ストライプ）またはＳＬＰＧ（黒色バー）を、野生型メス（female）成体キイロショウジョウバエ及びＰＧＲＰ−ＳＡｓｅｍｌ突然変異キイロショウジョウバエに注入した後の、ドロソマイシン（Ｄｒｓ）−Ｒｐ４９リポータ遺伝子の誘導を示す。Ｄｒｓ発現は、試験１８時間後に収集された４匹のキイロショウジョウバエで測定され、水注入後に得られた値（１００％に合わせる）に正常化（normalize）させた。バーは、４つの独立した試験の平均±ｓ．ｄ．を示す。
【図４】１００ｎｇの合成ムロペプチドダイマー（ａ）またはＳＬＰＧ（ｂ）をチャイロゴミムシダマシ幼虫（Tenebrio larvae）に注入した後の、１８時間内でのメラニン色素の出現を示す。
【図５】１０ｎＭのTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（０．２μｇ ｍｌ−１）及び異なる含有量のＳＬＰＧで測定したＬｙｓ−ＰＧ依存性ＰＯ活性を示す（■）。鐘状の容量−反応曲線は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの添加によって右に移動した。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ濃度を１２０ｎＭ（２．５μｇ ｍｌ−１）に増加させたとき、最大点は、１００ｎｇのＳＬＰＧで観察された（●）。インセット（insets）は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＳＬＰＧ間の仮想の複合体構造を示す。
【図６】ＳＬＰＧ存在下で、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液を使用して行った試験管内の復元（reconstitution）試験結果を示す（それぞれカラム２及び３）。また、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及びDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡをＳＬＰＧ存在下で同時にインキュベーションした（カラム４）。
【図７】それぞれ線形ＰＧ単独（ａ）及びリゾチームで部分的に分解させた線形ＰＧ（ｂ）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化させたToyopearl ＨＷ−５５Ｓカラムによって分画した結果を示す。
【図８】（ａ）は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＦｒ．１４の混合物を同じカラムに注入したときの結果を示し、（ｂ）は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及び３７℃で１６時間インキュベーションして完全にリゾチームで分解させたＳＬＰＧを、同じカラムに注入したときの結果を示す。
【図９】（Ａ）は、部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに結合するDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡの能力を示す。Lyso（−）及びLyso（＋）は、それぞれ天然（intact）及び部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧを示す。レーン１は、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ単独；レーン２及び４は、それぞれLyso（−）またはLyso（＋）ＰＧをDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡとインキュベーションしたときに、非結合のDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡの量を示す。レーン３及び５は、それぞれLyso（−）またはLyso（＋）ＰＧ上の結合されたＤｍ−ＰＧＲＰ−ＳＡの量を示す。（Ｂ）は、部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに対するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの結合能を示す。各レーンの意味は、前記（Ａ）と同一である。
【図１０】Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡが欠如した体液溶液と共にインキュベーションした後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した結果を示す。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡが欠如した体液溶液と共にインキュベーションした後、天然の不溶性ＰＧ（レーン１）、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ結合されたＰＧ（レーン２）、またはDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ結合されたＰＧ（レーン３）から蛋白質を抽出した。また、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの非存在または存在下で、Ｍ．luteus不溶性ＰＧ（レーン４及び５）、及び合成ムロペプチドダイマー結合された樹脂（レーン６及び７）を処理した。部分的に分解されたＰＧに結合されたDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡが２つのTenebrio蛋白質と反応しなかったことが注目すべきことである（レーン３）。
【図１１】（Ａ）は、バンド１、Tribolium castaneum ＧＮＢＰ−類似蛋白質（Ｔｃ−ＧＮＢＰ、ＸＰ＿９６９４４９）、Ｔ．molitorグルカン認識蛋白質（Ｔｍ−ＧＲＰ）、Anopheles gambiae ＧＮＢＰ１（Ａｇ−ＧＮＢＰ１、ＡＡＲ１３７５１）及びＤrosophia melanogaster ＧＮＢＰ１（Ｄｍ−ＰＧＲＰ１）のＮ−末端配列を比較した結果である。箱（box）は、バンド１の配列と同じ残基を示す。（Ｂ）は、バンド２、Tribolium castaneumセリンプロテアーゼ（Ｔｃ−ＳＰ、ＸＰ＿９６７４８６）、Ｍ．Sexta hemolymph protease−１４（Ｍｓ−ＨＰ１４）、Ａ．gambiaeセリンプロテアーゼ（ＡＧ−ＳＰ、ＸＰ＿３２１２６３）及びＤ．Melanogasterモジュラセリンプロテアーゼ（Ｄｍ−ＭＳＰ、ＣＧ３１２１７）のＮ−末端アミノ酸配列を比較した結果である。（Ｃ）は、バンド２の２つの内部配列（ピーク１及びピーク２）及びＴｃ−ＳＰの低密度リポプロテインレセプタＡリピート（low density lipoprotein receptor A repeat）ドメイン配列間の配列相同性を示す。
【図１２】Toll及びpro−ＰＯ経路の開始において、分子メカニズム（molecular events）を要約したモデルを示す。
【図１３】それぞれTenebrio ＧＲＰ−ＳＡ単独（Ａ）、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと線形ＰＧとの混合物（Ｂ）、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡと線形ＰＧとの混合物（Ｃ）、またはTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと線形ＰＧとの混合物（Ｄ）を、Toyopearl ＨＷ−５５Ｓサイズ排除（size-exclusion）カラムに注入して得られた結果を示す。
【図１４】Ｌｙｓ型ＰＧ依存性メラニン合成に対するリゾチーム阻害剤の効果を示す。（Ａ）昆虫生理緩衝液（insect saline）。（Ｂ）不溶性Ｌｙｓ−ＰＧ。（Ｃ）部分的に分解されたＬｙｓ型ＰＧ。（Ｄ）リゾチーム阻害剤と不溶性Ｌｙｓ型ＰＧとの同時注入。（Ｅ）リゾチーム阻害剤単独。
【図１５】Tenebrio ＧＮＢＰ１のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図１６】Tenebrio ＧＮＢＰ１のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図１７】Tenebrio ＧＮＢＰ１のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図１８】Tenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図１９】Tenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図２０】Tenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図２１】Tenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者らは、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）のペプチドグリカン認識蛋白質（Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）とペプチドグリカン（ＰＧ）との複合体（complex）が下流段階への信号伝達に関与する蛋白質を引き寄せる（recruiting）ことによって、pro−ＰＯシステムを活性化させるということを明らかにした。また、本発明者らは、前記下流段階への信号伝達に関与する蛋白質がグラム陰性菌結合蛋白質１（ＧＮＢＰ１）類似蛋白質（すなわち、Tenebrio ＧＮＢＰ１）；及びＮ−末端に低密度脂質蛋白質類似ドメインと、補体系調節蛋白質類似ドメインとを有するTenebrio−多重ドメイン含有モジュラセリンプロテアーゼ（Tenebrio−multi−domain containing modular serine protease）（すなわち、Tenebrio ＭＳＰ）であることを明らかにした。また、本発明者らは、前記Tenebrio ＭＳＰが２つの形態、すなわち、Tenebrio ＭＳＰ−１及びTenebrio ＭＳＰ−２で存在することを明らかにした。さらに、本発明者らは、前記Tenebrio ＧＮＢＰ１及びTenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びこれをコーディングするヌクレオチド配列を明らかにした。前記Tenebrio ＧＮＢＰ１及びTenebrio ＭＳＰは、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡとＰＧとの複合体と共に、複合体を形成すると推定される。
【００１９】
従って、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のグラム陰性菌結合蛋白質１（Tenebrio ＧＮＢＰ１）を提供する。
【００２０】
また、本発明は、前記配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１をコーディングするポリヌクレオチド、望ましくは、配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−１（Tenebrio ＭＳＰ−１）を提供する。
また、本発明は、前記配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１をコーディングするポリヌクレオチド、望ましくは、配列番号５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−２（Tenebrio ＭＳＰ−２）を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２をコーディングするポリヌクレオチド、望ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
一具現例によって、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のペプチドグリカン認識蛋白質（Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）を検体に加え、インキュベーションする段階と、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を、段階（ａ）で得られたインキュベーション混合物に加え、インキュベーションする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られたインキュベーション混合物において、前記蛋白質と検体との反応性を検出する段階とを含む、検体中のバクテリア感染の検出方法が提供される。
【００２２】
検体中のバクテリア感染の検出方法において、前記検体は、輸血用血液や、ヒトを含む哺乳動物の血液や、野菜、肉類、果物のような食品や、調理あるいは非調理の食品や、水道水、地下水、雨水のような水や、無菌製品でありうる。前記検体は、微生物検出が必要なあらゆる検体でありうる。具体的に、本発明によるバクテリア感染の検出方法は、輸血用血液、またはヒトを含む哺乳動物の血液からのバクテリア感染の検出に適している。
【００２３】
本発明によるバクテリア感染の検出方法において、前記インキュベーションは、約３０℃で検体が前記蛋白質と十分に反応できる時間の間に遂行可能である。必要な場合、カルシウムイオン阻害剤として、ＥＤＴＡを含む多様な緩衝液中で遂行されうる。
【００２４】
また、段階（ｃ）で、前記反応性の検出は、サイズ排除Toyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂で充填されたカラムなどの、サイズ排除カラムを利用した通常の方法によって遂行されうる。
【００２５】
必要な場合、本発明によるバクテリア感染の検出方法は、検体をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ：β−lytic protease）及び／またはリゾチームで前処理する段階をさらに含むことができる。下記実施例で明らかにした通り、ほとんどの天然のグラム陽性菌のペプチドグリカンで、グリカン鎖が高度に架橋結合されており、前記ペプチドグリカンに対する認識蛋白質（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）の接近を制限できる。しかし、検体に対するβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）及び／またはリゾチームでの処理は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡとの複合体（complex）形成を促進する。
【００２６】
前記ｂｌｐは、土壌微生物のような多様な微生物から抽出できる。例えば、前記ｂｌｐは、アクロモバクター（Achromobacter）属微生物、望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）、さらに望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７から抽出しうる。又は、前記ｂｌｐは、公知の方法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)を使用し、商業的に有用な粗アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）製剤（和光純薬工業株式会社、０１４−０９６６１）を精製することによって、製造することも可能である。
【００２７】
前記ｂｌｐ前処理は、検体を約１μｇ／ｍｌ濃度のｂｌｐで処理し、約３７℃で約１４時間インキュベーションすることによって遂行することができる。
本発明のバクテリア感染の検出方法に使われる前記リゾチームは、商業的に有用なリゾチーム（例えば、hen egg white lysozyme）でありうる。前記リゾチームでの前処理は、検体を約１ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチームで処理し、約３７℃で多様な反応時間の間インキュベーションすることによって、遂行することができる。
【００２８】
また、他の具現例によって、配列番号１のアミノ酸配列を有するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ；及び配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を含む、検体中のバクテリア感染の検出用キットが提供される。
【００２９】
本発明の検出用キットにおいて、前記検体は、輸血用血液や、ヒトを含む哺乳動物の血液や、野菜、肉類、果物のような食品や、調理されたあるいは非調理の食品や、水道水、地下水、雨水のような水や、無菌製品でありうる。前記検体は、微生物検出が必要なあらゆる検体でありうる。具体的に、本発明による検出用キットは、輸血用血液、またはヒトを含む哺乳動物の血液からのバクテリア感染の検出に適している。
【００３０】
本発明の検出用キットは、反応性検出のための試薬、例えば、パラ−ニトロアニリン（ｐ−nitroaniline）に結合されたアミノ酸あるいはペプチド、pro−ＰＯシステムを活性化させる蛋白質、及びpro−ＰＯ酵素の発色基質などを含むことができる。前記検出用キットは、溶液、凍結乾燥粉末、冷凍溶液、またはストリップ状でありうる。それぞれの形態は、当業界で一般的な方法によって製剤化されうる。例えば、溶液状の検出用キットは、前記蛋白質を、ナトリウム−リン酸緩衝液、カリウム−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液のような緩衝液と、混合された形態あるいは分離された形態に混合して製剤化できる。必要な場合、前記溶液を冷凍させたり、または凍結乾燥することもできる。
【００３１】
本発明の検出用キットはβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）及び／またはリゾチームをさらに含むことができる。前記ｂｌｐは、土壌微生物のような多様な微生物から抽出できる。例えば、前記ｂｌｐは、アクロモバクター（Achromobacter）属微生物、望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）、さらに望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７から抽出しうる。選択的に、前記ｂｌｐは、公知の方法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)を使用し、商業的に有用な粗アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）製剤（和光純薬工業株式会社、０１４−０９６６１）を精製することによって、製造することも可能である。
【００３２】
本発明はまた、検体中のバクテリア感染の検出において、Ｌｙｓ−ＰＧの標準物質として使用可能な水溶性の線形リシン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法を提供する。すなわち、本発明は、（ａ’）バクテリアから分離した不溶性ペプチドグリカンを、約ｐＨ８の緩衝液に懸濁させる段階と、（ｂ’）段階（ａ’）で得られた懸濁液をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）で処理する段階と、（ｃ’）段階（ｂ’）で得られた反応混合物を約９５℃で約１０分間加熱し、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、（ｄ’）段階（ｃ’）で得られた上澄み液をサイズ排除カラムで分画し、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画を回収する段階とを含む、水溶性の線形リシン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法を提供する。
【００３３】
前記ＳＬＰＧ製造方法において、前記バクテリアから分離した不溶性ペプチドグリカンは、公知の方法(例えば、BL de Jonge, YS Chang, D Gage, and A Tomasz, Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A J. Biol. Chem., Jun 1992; 267: 11248 - 11254)によって製造できる。
【００３４】
段階（ａ’）の前記緩衝液は、約ｐＨ８．０のトリス緩衝液でありうる。また、前記ｂｌｐは、土壌微生物のような多様な微生物から抽出できる。例えば、前記ｂｌｐは、アクロモバクター（Achromobacter）属微生物、望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）、さらに望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７から抽出しうる。又は、前記ｂｌｐは、公知の方法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)を使用し、商業的に入手可能な粗アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）製剤（和光純薬工業株式会社、０１４−０９６６１）を精製することによって、製造することも可能である。
【００３５】
前記ｂｌｐ処理は、前記不溶性ペプチドグリカンを含む懸濁液を約１μｇ／ｍｌ濃度のｂｌｐで処理し、約３７℃で約１４時間インキュベーションすることによって、遂行することができる。
【００３６】
段階（ｃ’）で、前記遠心分離は、約１８，０００ｘｇで、約４℃の温度で約１０分間遂行されうる。必要な場合、前記遠心分離から得られた上澄み液は凍結乾燥させ、約４℃で保存できる。
【００３７】
段階（ｄ’）で、前記サイズ排除カラムは、Toyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂で充填されたカラムである。典型的に、前記カラムは、滅菌蒸溜水で平衡化させた後で使われる。前記分画化は、段階（ｃ’）で得られた溶液（すなわち、水溶性ＰＧ溶液）をカラムを介して溶離させることによって遂行されうる。得られた分画のうち、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画は、次の通り回収できる：それぞれの分画を希釈してチャイロゴミムシダマシ（Ｔ．molitor）幼虫の体液を添加する。得られた混合物を３０℃で５分間インキュベーションした後、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加する。ＣａＣｌ２溶液、４−メチルカテコール（４−ＭＣ）溶液、及び４−ヒドロキシプロリンエステル（４−ＨＰ）溶液を添加した後、混合する。前記混合物を３０℃恒温槽で保管する。Ｃａ２＋のみ存在する体液の色の変化に比べ、最大の色変化を示す時点で分光光度計を使用し、５２０ｎｍ波長で吸光度を測定する。
【００３８】
必要な場合、前記で得られたフェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画は、濃縮させ、Toyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂で充填されたカラムにローディングし、ＳＬＰＧ含有分画を分離することによって、さらに精製できる。
また、必要な場合、前記ＳＬＰＧ製造方法は、段階（ｄ’）から得られた分画を凍結乾燥する段階をさらに含むことができる。
【００３９】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明が下記実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００４０】
１．試験方法
（１）アクロモバクター（Achromobacter）β−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）の精製及び特性究明
報告された方法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)によって、商業的に入手可能な粗アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）製剤（和光純薬工業株式会社、０１４−０９６６１）からアクロモバクターβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）を均質に精製した。ｂｌｐの同定確認のために、Applied Biosystem automatic gas-phase amino acid sequencer上で精製されたｂｌｐのＮ−末端配列を決定した。Sakiyama法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1997) J Biochem (Tokyo) 122, 772-778)によって、マイクロコッカスルテウス（Micrococcus luteus）に対するｂｌｐの溶菌（bacterio lytic）活性を分析した。
【００４１】
（２）水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ）の精製
【００４２】
（２−１）菌株培養
スタフィロコックスアウレウス（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ １２５９８（Cowan serotype）菌株を液体培地（ＴＳＢ（tryptic soy broth）培地、１００ｍｌ）に接種し、３７℃で１２時間インキュベーションした。培養液２０ｍｌをそれぞれＴＳＢ培地２Ｌ（４００ｍｌＸ５ bottles）に接種した後、１２時間インキュベーションした。得られた培養液を６，０００ｒｐｍの回転速度で、４℃で３０分間遠心分離した。この後、菌体を回収し、滅菌蒸溜水２００ｍｌに懸濁した後、得られた菌体をさらに回収した。前記過程（すなわち、回収及び懸濁）を６回反復した。得られた菌体を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）７６．８ｍｌ中に懸濁させた後、得られた懸濁液を５０ｍｌ試験管二つに同量で移した。
【００４３】
（２−２）不溶性ペプチドグリカンの分離及び精製
不溶性ペプチドグリカンの分離及び精製は、公知の方法(BL de Jonge, YS Chang, D Gage, and A Tomasz Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A J. Biol. Chem., Jun 1992; 267: 11248−11254)によって次の通り行った。
【００４４】
前記で得られた菌体懸濁液に、９５℃に加熱した２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液１．６ｍｌを加えて４％の菌液を得て、これを９５℃で４５分間加熱した後、氷浴槽で十分に冷却した。得られた菌液を遠心分離した（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）。上澄み液を捨て、菌体を回収した。滅菌蒸溜水４０ｍｌを回収された菌体に加えた。前記と同じ条件で遠心分離を遂行し、菌体を回収した。前記過程を６回反復した。回収された菌体を１ＸＰＢＳ緩衝液４０ｍｌ中に懸濁した後、１００μｇ／ｍｌの濃度のＤNase及びＲNaseと３７℃で１８時間反応させた。反応混合物をトリプシン２００μｇ／ｍｌと３７℃で１８時間反応させた。９５℃に加熱した２０％ＳＤＳ溶液を前記反応混合物に加えて１％の菌液を得て、前記菌液を９５℃で１０分間加熱して酵素反応を停止させた。得られた反応混合物を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。沈殿物に滅菌蒸溜水４０ｍｌを加え、得られた溶液を遠心分離して（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。かような過程を３回反復した。得られた沈殿物を８Ｍ ＬｉＣｌ溶液４０ｍｌ中に懸濁させた後、滅菌蒸溜水４０ｍｌを加えた。得られた懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。回収された沈殿物を１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液４０ｍｌ中に懸濁させた後、滅菌蒸溜水４０ｍｌを加えた。得られた懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。回収された沈殿物を滅菌蒸溜水４０ｍｌ中に懸濁させた。得られた懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。回収された沈殿物をアセトン４０ｍｌ中に懸濁させた。得られた懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。回収された沈殿物を凍結乾燥し、約３８０〜４００ｍｇの不溶性ペプチドグリカンを得た。
【００４５】
（２−３）ＳＬＰＧの精製
前記で得られた不溶性ペプチドグリカンをβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）で処理した。すなわち、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中の前記で得られた不溶性ペプチドグリカン（２０ｍｇ）の懸濁液にｂｌｐ ２μｇ／ｍｌを加えた後、３７℃で１４時間反応させた。前記反応混合物を９５℃で１０分間煮沸した後、遠心分離した（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）。上澄み液を回収し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を４℃で保管した。
【００４６】
Toyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂６０ｍｌをカラム（２．６ｘ１５．５ｃｍ）に充填し、滅菌蒸溜水を使用して０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化させた後、前記で製造した水溶性ＰＧ溶液１ｍｇを前記カラムにローディングし、所定の体積に分画した。それぞれの分画を滅菌蒸溜水を使用して１００倍ずつ希釈した。それぞれの希釈液１０μｌを使用してＰＯ活性を測定した。
【００４７】
ＰＯ活性は、次の通り測定した：それぞれの希釈液１０μｌにチャイロゴミムシダマシ（Ｔ．molitor）幼虫の体液３０μｌ（体液蛋白質約２８０μｇ）を添加した後、３０℃で５分間インキュベーションさせた。２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）４３５μｌを添加した後、直ちに１Ｍ ＣａＣｌ２溶液５μｌ（最終濃度１０ｍＭ）を添加した。２５０ｍＭ４−メチルカテコール（４−ＭＣ）溶液４μｌ、及び６２．５ｍＭ４−ヒドロキシプロリンエステル（４−ＨＰ）溶液１６μｌを添加した後、混合した。前記混合物を３０℃恒温槽で保温した。Ｃａ２＋のみ存在する体液の色の変化に比べ、最大の色変化を示す時点で分光光度計を使用し、５２０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【００４８】
フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画を集め、ロータリ蒸留器を使用して４℃で濃縮した。濃縮額をさらに蒸溜水で０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化させた前記と同じカラムにローディングした。ＳＬＰＧ含有分画を分離（pooling）し、４℃で使用時まで保管した。前記Ｓ．aureus Ｌｙｓ−ＰＧ由来の精製されたＳＬＰＧを確認するために、ＳＬＰＧのアミノ酸組成を分析した結果、Ｓ．aureus Ｌｙｓ−ＰＧについて報告されたところ(Schleifer, K. H. & Kandler, O. (1972) Bacteriol Rev 36, 407-477)と同じアミノ酸組成（Ｄ−Ｇｌｕ：Ｌ−Ｇｌｙ：Ｄ−Ａｌａ：Ｌ−Ｌｙｓ＝１：５：１：１）であった。
【００４９】
（３）体液の回収、ＰＯ活性測定、及びメラニン合成
チャイロゴミムシダマシ（Ｔ．moliter）幼虫（mealworm）を、小麦ブラン（wheat bran）を含有した飼育器（terraria）中の実験室ベンチで飼育した。体液（hemolymph）は、公知の方法(Zhang, R., Cho, H. Y., Kim, H. S., Ma, Y. G., Osaki, T., Kawabata, S., Soderhall, K. & Lee, B. L. (2003) J Biol Chem 278, 42072-42079)によって回収した。ＰＯ活性分析は、本発明者らが発表した方法(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)によって行った。メラニン合成を試験するために、２μｌのＳＬＰＧ（５０μｇ／ｍｌ）、１０μｌの不溶性リジン型ペプチドグリカン（Ｌｙｓ−ＰＧ）（５ｍｇ／ｍｌ）、部分分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧ（５ｍｇ／ｍｌ）、または５μｌの化学式１の化合物（合成ムロペプチドダイマー）（２０μｇ／ｍｌ）を生きている幼虫に注入した。６μｌのＮ，Ｎ’，Ｎ’ ’−トリアセチルキトトリオースを６ｍＭの最終濃度で注入した。２４時間後に、メラニン色素の生成を評価した。
【００５０】
【化１】
【００５１】
（４）ＳＬＰＧ及び化学式１の化合物の注入
OregonＲキイロショウジョウバエを野生型菌株として使用した。ＰＧＲＰ−ＳＡｓｍｅｌは、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ中にsemmelweis突然変異（Ｃ５４Ｙ）を有した菌株である(Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2001) Nature 414, 756-759)。１０ｎｌの水、ＳＬＰＧ（１０ｍｇ ｍｌ−１）、または化学式１の化合物（１０ｍｇ ｍｌ−１）を前記野生型菌株またはＰＧＲＰ−ＳＡｓｍｅｌメス成体（２−４日齢）の胸部にNanoject装置（Drummond社）を使用して注入した。注入後、前記キイロショウジョウバエを２５℃で１８時間インキュベーションした。ドロソマイシン（drosomycin）発現レベルを報告された方法(Leulier, F., Parquet, C., Pili-Floury, S., Ryu, J. H., Caroff, M., Lee, W. J., Mengin-Lecreulx, D. & Lemaitre, B. (2003) Nat Immunol 4, 478-484)によって測定した。
【００５２】
（５）ＰＧＲＰ／ＳＬＰＧ複合体の形成
４０μｇのDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡまたはTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを４００μｇのＳＬＰＧと共に３０℃で３０分間インキュベーションした後、前記混合物を１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化させたSuperdex ２００ ＨＲ １０／３０カラムに注入した。ＰＧＲＰ−ＳＡ／ＳＬＰＧ複合体を含む分画を集めた（pool）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＰＧＲＰ−ＳＡの存在をモニタした。
【００５３】
（６）リゾチームによるＳＬＰＧ及び不溶性Ｌｙｓ−ＰＧの部分的な分解
ＰＯ活性を示す水溶性オリゴマーＬｙｓ−ＰＧ断片を得るために、１０μｌのリゾチーム（hen egg white lysozyme、Wako社）（１ｍｇ ｍｌ−１）を１００μｌの精製されたＳＬＰＧ（８００μｇ ｍｌ−１）に加え、３７℃で５分間インキュベーションした。部分的に分解されたＳＬＰＧを１０分間煮沸した後、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化させたToyopearl ＨＷ５５Ｓカラムにローディングした。ＰＯ活性を示す分画を集めた（pool）。部分的に分解された不溶性ポリマーＬｙｓ−ＰＧを得るために、Ｓ．aureus不溶性ＰＧ（４０ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中に懸濁させ、１０μｇのリゾチームと共に３７℃で３時間インキュベーションした。１０分間煮沸し、４℃で１０分間２０，０００ｘｇで遠心分離した後、ペレット分画中の残滓（residue）を８Ｍウレア溶液で３回及び蒸溜水で３回洗浄した。
【００５４】
（７）部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに対するＰＧＲＰの結合分析
結合分析（binding assay）は、報告された方法(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)によって行った。すなわち、１０μｇの精製されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡまたはDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の部分的に分解されたＳ．aureusまたはＭ．Luteus ＰＧ（５００μｇ）の５０％（ｖ／ｖ）懸濁液４０μｌと、４℃で１２時間撹拌器（shaker）中で混合した。上澄み液中の結合されていないＰＧＲＰ及びペレット分画中の結合されたＰＧＲＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００５５】
（８）Tenebrio ＧＮＢＰ１及び結合されたモジュラセリンプロテアーゼの同定
報告された方法(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)によって、化学式１の化合物の結合された親和性カラムを使用し、チャイロゴミムシダマシ（Ｔ．molitor）体液からTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液を製造した。前記溶液は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを除き、Ｌｙｓ−ＰＧによるpro−ＰＯシステムの活性化に必要なあらゆる必須構成成分を含有する。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（４０μｇ）を２００μｌのＰＢＳ緩衝液中の部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧ（８ｍｇ）と共に、４℃で１２時間インキュベーションした。インキュベーション後、４℃で１０分間２０，０００ｘｇで遠心分離し、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）でまず３回洗浄し、次に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ結合された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧを回収した。回収されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ結合されたＬｙｓ−ＰＧを、４℃で３時間２．５ｍｌのTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液（２０ｍｇの総蛋白質）と共にインキュベーションした。遠心分離によって不溶性残滓を除去した後、前記混合物を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに結合された蛋白質を１００μｌの２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液で抽出した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ポリアクリルアミドゲル上の蛋白質バンドをポリビニリデンジフルオライド（polyvinilidene difluoride）膜に転移させた後、５０ ｋＤａの蛋白質（Tenebrio ＧＮＢＰ１）及び３５ ｋＤａの蛋白質（Tenebrioモジュラセリンプロテアーゼ、Tenebrio ＭＳＰ）のＮ−末端配列をautomatic gas-phase amino acid sequencer（Applied Biosystem社）上で決定した。
【００５６】
（９）Tenebrio ＧＮＢＰ１とTenebrio ＭＳＰとのｃＤＮＡクローニング及びヌクレオチド配列分析
Tenebrio ＧＮＢＰ１のｃＤＮＡクローニングのために、縮退化されたセンス（degenerate sense）プライマーとして５’−ＧＡＲＧＣＮＴＡＹＧＡＲＣＣＮＡＡＲＧＧ−３’（配列番号８）、及び縮退化されたアンチセンスプライマーとして５’−ＡＴＲＴＣＹＴＣＹＴＧＲＴＴＲＴＴＮＧＣ−３’（配列番号９）［Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｎ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ］を使用し、公知の方法(Buck and Axel, Cell 65: 175-187, 1991; Riddle et al., Cell 75: 1401-1416, 1993; Krauss et al., Cell 75:1431-1444, 1993)によってＰＣＲを行った。５’−及び３’−ＲＡＣＥのために、SMART RACE ｃＤＮＡ Amplification method（CLONTECH）を使用した。あらゆるＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ ＴＡクローニング法（Invitrogen）を使用し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングした。配列分析は、３１３０ｘｌ Genetic Analyzer Sequencing method（Applied Biosystems）を使用して行った。
【００５７】
Tenebrio ＭＳＰのｃＤＮＡクローニングを、さらに５’−ＡＡＲＧＡＹＡＡＹＴＧＹＧＡＹＧＡＲＡＴ−３’（配列番号１０）及び５’−ＧＣＹＴＧＹＴＧＣＣＡＮＧＧＲＴＡＲＴＣ−３’（配列番号１１）をそれぞれ縮退化されたセンスプライマー及び縮退化されたアンチセンスプライマーとして使用し、前記と同じ方法で行った。
【００５８】
２．試験結果及び考察
（１）ＳＬＰＧは、Toll経路及びpro−ＰＯシステムを活性化させる
アクロモバクターｂｌｐ（Achromobacter ｂｌｐ）は、Ｓ．aureus ＰＧに存在するペンタ−Ｇｌｙブリッジ（penta−Ｇｌｙ bridge）中のペプチド結合を加水分解するリゾスタフィン類似（lysostaphin-like）酵素である(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)。従って、ｂｌｐは、ステムペプチドに連結されたＧｌｙ残基を有する不溶性ＰＧから水溶性ポリマーＰＧ断片を遊離させると期待される（図１）。水溶性のポリマーＬｙｓ−ＰＧ断片（ＳＬＰＧ）をＳ．aureus ＰＧからｂｌｐを使用して得た。ＳＬＰＧは、ステムペプチド間のペンタ−Ｇｌｙブリッジではない、糖間のβ−１，４グリコシド結合によって連結されたポリマー化されたムロペプチドであると推定される。従って、ＳＬＰＧは、いくつかのムロペプチドモチーフ（motifs）を有するために、ＰＧＲＰ−ＳＡに対する多重結合部位を有するようになる。さらに精製されたＳＬＰＧを使用し、組み替えDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質（これらは、バキュロウイルス昆虫細胞培養システム（baculovirus insect cell culture system）で発現及び精製される）のいずれもがＳＬＰＧに結合することが、サイズ排除カラムを使用して立証された（図１３の（Ｂ）及び（Ｃ））。しかし、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及び化学式１の化合物の混合物は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ単独と同じ溶離プロファイルを示し、これは、化学式１の化合物は、一分子のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡのみに結合できることを示唆する。
【００５９】
本発明者らは、ＳＬＰＧをチャイロゴミムシダマシ体液（Tenebrio hemolymph）に加えたとき、ＳＬＰＧが明確なＰＯ活性を持続的に誘導することを発見した（図２）。ＳＬＰＧが生体内でDrosophilaToll経路を活性化させることができるか否かを試験するために、野生型及びＰＧＲＰ−ＳＡｓｅｍｌ突然変異キイロショウジョウバエにＳＬＰＧを注入し、ドロソマイシン・コーディング遺伝子の発現をモニタリングした（図３）。ＳＬＰＧ−注入された野生型キイロショウジョウバエは、ドロソマイシン発現を正常に誘導したが、ＰＧＲＰ−ＳＡｓｅｍｌ突然変異キイロショウジョウバエは、抗菌ペプチドの誘導が不完全であった。これは、ＳＬＰＧがDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ−依存的方法でToll経路を活性化させることを示す。これと対照的に、化学式１の化合物は、野生型及びＰＧＲＰ−ＳＡｓｅｍｌ突然変異キイロショウジョウバエいずれでもドロソマイシン発現を誘導できなかった（図３）。同様に、ＳＬＰＧは、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio）の幼虫に注入したとき、pro−ＰＯシステムの活性化によって、メラニン合成を強く誘導した（図４）。このような結果は、前記ＰＧ断片がＰＧＲＰ−ＳＡに対する多重結合部位を含み、またToll経路及びpro−ＰＯ経路を誘導できるということを示唆する。最近、Ligoxygakisらは、Toll信号伝達経路を活性化させるためには、ＰＧの還元末端（reducing ends）の数を増加させることを提案した(Filipe, S. R., Tomasz, A. & Ligoxygakis, P. (2005) EMBO Rep 6, 327-333)。ＳＬＰＧ及び化学式１の化合物はいずれも１つの還元末端を含むが、ＳＬＰＧのみがToll経路及びpro−ＰＯ経路を誘導できるので、還元末端は重要ではないと推定される。
【００６０】
（２）pro−ＰＯカスケードの活性化のためにTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの近接（proximal）結合が必要である
ＰＧ依存性pro−ＰＯカスケードの活性化のためのＳＬＰＧの最小濃度を測定した。異なる量のＳＬＰＧを有するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液中でTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質をインキュベーションしてＰＯ活性を測定した。驚くべきことに、伝統的な鐘状（bell-shaped）の容量−反応曲線を示しつつ、ＰＯ活性が高濃度のＳＬＰＧでベースライン（baseline）までひどく阻害された（図５）。また、外部のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質を反応混合物に加えたとき、最大ＰＯ活性を示すＳＬＰＧの濃度が、さらに強いＰＯ活性を有しつつ、著しく増加した（図５）。このような結果は、あまりにも多くのＳＬＰＧはTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＬｙｓ−ＰＧからなる初期活性化複合体を損傷させつつ、ＰＧＲＰ−ＳＡ分子を隔離させる競争的阻害剤として作用するということを意味する。また、Ｌｙｓ−ＰＧの結合ユニット当たりのTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの量が、pro−ＰＯカスケードのための初期活性化複合体の形成において、重要であるということを意味する（図５のインセット）。類似の結果がカブトガニFactor Ｇのβ−１，３−グルカン認識及びザリガニpro−ＰＯシステムで報告された(Muta, T., Seki, N., Takaki, Y., Hashimoto, R., Oda, T., Iwanaga, A., Tokunaga, F. & Iwanaga, S. (1995) J Biol Chem 270, 892-897;及びSoderhall, K. & Unestam, T. (1979) Can J Microbiol. 25, 406-414)。
【００６１】
Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと類似した親和性を有してＳＬＰＧに結合できる組み替えDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡを使用し、Ｌｙｓ−ＰＧ認識に対する初期活性化段階を調査したが（図４）、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡは、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio）pro−ＰＯカスケード活性化を誘導できない（図６の第三カラム）。外部Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの存在時にも、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液にDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡを加える場合、ＳＬＰＧによって誘導されるＰＯ活性は強く抑制された。このような結果は、ＳＬＰＧに対する結合されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの存在にもかかわらず、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡによって、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡのための結合部位が置換されることによって、pro−ＰＯカスケードの初期活性化複合体が破壊されるということを意味する。また、このような結果は、Ｌｙｓ−ＰＧ上のＰＧＲＰ−ＳＡのクラスタ化（clustering）、すなわちＬｙｓ−ＰＧに対するＰＧＲＰ−ＳＡの近接結合が初期活性化複合体に必要であるということを強く示唆する。
【００６２】
（３）少なくとも２個のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ分子を受け入れるＬｙｓ−ＰＧ断片がpro−ＰＯシステムを活性化させる。
いかに多くの分子のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡがpro−ＰＯシステムのための初期活性化複合体を構成しているかを確認するために、リゾチームでＳＬＰＧを部分的に分解し、多様な長さの糖鎖を有するＰＧを生成させ、サイズ排除カラム上で、それぞれの長さによって分画した（図７の（ａ）及び（ｂ））。それぞれの分画を、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質及びＣａ２＋存在下で、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液とインキュベーションしたとき、３つの分画（７，１０及び１４番目の分画）がＰＯ活性を示した。それらのうち、分画１４でのＰＧ断片がpro−ＰＯカスケード活性を誘導できる最も小さなユニットであった。過量のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質を加えた後、サイズ排除カラム上での見かけ分子量をモニタリングすることによって、いかように多くのＰＧＲＰ−ＳＡ分子が分画１４中のＰＧ断片に結合できるかを分析した。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと混合された分画中のＰＧ断片間の複合体の見かけ分子量は、約４０ ｋＤａと決定され、これは、ＰＧ断片が２分子のＰＧＲＰ−ＳＡに結合することを示す。ＰＧ断片／Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ複合体をTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液とインキュベーションしたとき、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを加えずともＰＯ活性を誘導し、これは、２分子のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡが前記活性を誘導するのに十分であることを示す（図９の（Ｂ））。しかし、化学式１の化合物及びリゾチームと共にＳＬＰＧを持続的にインキュベーションして生成されたムロペプチド単量体は、サイズ排除カラム上のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質の分子量を変化させなかった（図９の（Ｂ））。このような結果は、化学式１の化合物及びムロペプチド単量体がただ１つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子にのみ結合することを示す。化学式１の化合物が２つ（two copies）のムロペプチドを含有するにもかかわらず、化学式１の化合物が１つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子にのみ結合することは、非常に注目する価値がある。これは、化学式１の化合物上の２つの結合部位があまりにも近く位置するために、化学式１の化合物上で結合された最初のＰＧＲＰ−ＳＡ分子による立体障害から起因すると推定される。しかし、ペンタ−Ｇｌｙブリッジで架橋結合されているムロペプチド二量体は、ペンタ−Ｇｌｙブリッジが２つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子の結合のための十分な空間を提供するために、２つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子を受容すると推定される。結果的に、ムロペプチド二量体は、Toll経路の活性を誘導すると報告された一方(Filipe, S. R., Tomasz, A. & Ligoxygakis, P. (2005) EMBO Rep 6, 327-333)、化学式１の化合物は、前記に示した通り、Toll及びpro−ＰＯ経路を活性化させない。かくして、２つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子を受容するＰＧ断片が下流のカスケード（downstream events）を誘導し、pro−ＰＯシステムを活性化させることができる最小ユニットであると結論することができる。
【００６３】
（４）リゾチームは、ＰＧ認識信号に対するＰＧの変形された形態（processed form）を提供する
ほとんどの天然のグラム陽性菌のＰＧは、ＳＬＰＧとは異なって、グリカン鎖間が高度に架橋結合されている。それらの高度な架橋結合構造によって、ＰＧＲＰ−ＳＡは、天然のＬｙｓ−ＰＧに対して接近が制限されうる。また、本発明者らがすでに報告した通り、超音波破砕（sonication）によって破壊された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧは、試験管内（in vitro）で強いＰＯ活性を示した一方、天然の不溶性Ｌｙｓ−ＰＧは、所定の時間にpro−ＰＯ活性化を誘導しなかった(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)。昆虫の体液に存在する酵素によってＰＧ構造をゆるめる（loosen）ために、リゾチームがほとんどあらゆる形態の天然の細菌ＰＧを加水分解できる理由から(Keep, N. H., Ward, J. M., Cohen-Gonsaud, M. & Henderson, B. (2006) Trends Microbiol 14, 271-276)、本発明者らは、リゾチームを選択した。Ｓ．aureus及びＭ．luteus由来のＬｙｓ−ＰＧの部分的な分解をリゾチームを使用して試験管内（in vitro）で実施した。部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧは、チャイロゴミムシダマシ体液中で、迅速かつ強いＰＯ活性を試験管内（in vitro）で誘導した（データ未記載）。また、部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧをチャイロゴミムシダマシ幼虫（Tenebrio larvae）に注入したとき、天然の不溶性Ｌｙｓ−ＰＧと比較し、さらに強くてさらに迅速なメラニン合成が注入されたあらゆる幼虫で観察された（それぞれ図１４（Ｂ）及び（Ｃ））。しかし、リゾチーム阻害剤であるＮ，Ｎ’，Ｎ’ ’−トリアセチルキトトリオースを天然のＬｙｓ−ＰＧと同時に注入したとき、いかなるメラニン合成も観察されず（図１４（Ｄ））、これは、天然のＬｙｓ−ＰＧは、リゾチームの酵素活性なしに、すなわち、リゾチームによる部分的な分解（degradation）なしでは、pro−ＰＯカスケードを活性化しえないことを示す。
【００６４】
試験管内（in vitro）でＰＧＲＰ−ＳＡによるＬｙｓ−ＰＧの認識において、リゾチームの役割を確認するために、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを使用して部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧに対するＰＧＲＰ−ＳＡの結合を測定した。驚くべきことに、リゾチームによるＬｙｓ−ＰＧの部分的な分解は、ＰＧに対するDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの結合を大きく増加させた（それぞれ、図９（Ａ）及び（Ｂ）のレーン５及び３）。ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＰＧ間の増加した相互作用は、ＰＧにおいてＰＧＲＰ−ＳＡの近接結合を引き起こし、これは、Toll及びpro−ＰＯ経路の活性化につながる。リゾチーム類似活性を示す他の蛋白質がＰＧＲＰ−ＳＡ結合のためにＰＧを変形させることができるという可能性は排除できないが、前記の試験管内（in vitro）生化学的証拠は、リゾチームが、Toll及びpro−ＰＯ経路における不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに対するDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡまたはTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの接近の増進において、重要な役割を果たすということを示す。
【００６５】
最近、Drosophila ＧＮＢＰ１が弱く架橋結合されたＭ．luteusＬｙｓ−ＰＧを加水分解するが、高度に架橋結合されたＳ．aureus Ｌｙｓ−ＰＧは、加水分解できない酵素活性を有するということが報告された(Wang, L., Weber, A. N., Atilano, M. L., Filipe, S. R., Gay, N. J. & Ligoxygakis, P. (2006) EMBO J 25, 5005-5014)。Wang，Ｌ．らは、ＧＮＢＰ１がリゾチーム類似活性を有するために、Drosophila ＧＮＢＰ１がDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡによる認識のために変形された形態のＰＧを提供すると提案した。ＧＮＢＰ１の制限されたリゾチーム類似活性及び体液中のリゾチームが高度に架橋結合されたＰＧに対して活性を有するという点を考慮すれば、ＰＧの変形において、ＧＮＢＰ１は体液のリゾチームよりも低い重要性を持つといえよう。しかし、ＧＮＢＰ１の制限されたリゾチーム類似活性は、認識信号を増幅したり、またはスカベンジング（scavenging）するのに、重要な役割を行うことが可能であろう。
【００６６】
（５）Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ／ＰＧ複合体は、Tenebrio ＧＮＢＰ１及びTenebrio多重ドメインモジュラセリンプロテアーゼ（ＭＳＰ）を寄せ集める
部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧに対する重畳された（clustered）Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ分子を認識するすぐ次の段階の下流因子（downstream effectors）を同定するために、組み替えTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを部分的に分解されたＳ．aureus ＰＧ及びＭ．luteusＰＧとインキュベーションし、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液に加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。その結果、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡが部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧに結合されたとき（図１０中、レーン２及び５）、約５０ ｋＤａの蛋白質（図１０中、バンド１）及び約３５ ｋＤａの蛋白質（図１０中、バンド２）が特異的に高く示された。しかし、化学式１の化合物結合されたセファロースレジンに結合されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡは、同じ条件で、前記約５０ ｋＤａ及び約３５ ｋＤａの蛋白質を寄せ集めることができなかった（図１０中、レーン７）。このような結果は、Ｌｙｓ−ＰＧ上のＰＧＲＰ−ＳＡ分子の重畳によって、前記２つの蛋白質が寄せ集められるということを示す。また、部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧに結合されたDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡは、前記２つのチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）蛋白質と反応しなかった（図１０中、レーン３）。
【００６７】
本発明者らは、Ｌｙｓ−ＰＧ上の重畳されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ上に高く示された前記２つの蛋白質を同定した。前記約５０ ｋＤａの蛋白質（バンド１）は、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）のＧＮＢＰ１（Tenebrio ＧＮＢＰ１）であった。前記約５０ ｋＤａの蛋白質（バンド１）のＮ−末端の３０個の残基は、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）ＧＮＢＰ及びアノフェレス（Anopheles）ＧＮＢＰ１蛋白質と、それぞれ８６．７％及び５１．７％の配列相同性を示した（図１１（Ａ））。ＧＮＢＰ１は、DrosophilaにおいてToll経路の活性化のためにＰＧＲＰ−ＳＡと物理的に反応すると報告されているが(Gobert, V., Gottar, M., Matskevich, A. A., Rutschmann, S., Royet, J., Belvin, M., Hoffmann, J. A. & Ferrandon, D. (2003) Science 302, 2126-2130)、ＰＧＲＰ−ＳＡに対するＧＮＢＰ１の強い結合は、これまで報告されたことがない。本発明者らの前記発見は、ＰＧ上のＰＧＲＰ−ＳＡ分子の重畳（clustering）がＰＧＲＰ−ＳＡとＧＮＢＰ１との相互作用を増進させるということを裏づけ、ＧＮＢＰ１類似体がpro−ＰＯ経路に関与できることを裏付ける。本発明者らはまた、前記約３５ ｋＤａの蛋白質（バンド２）がＮ−末端及び内部アミノ酸配列分析を介して、多重ドメインモジュラＳＰの活性型であることを明らかにした。前記約３５ ｋＤａの蛋白質（バンド２）のＮ−末端２０個の残基は、Ｔ．castaneumセリンプロテアーゼ（Ｔｃ−ＳＰ、accession numberＸＰ＿９６７４８６、図１１（Ｂ））のセリンプロテアーゼドメインと７０．６％の配列相同性を示した。Ｔｃ−ＳＰは、低密度脂質蛋白質受容体Ａ反復（ＬＤＬａ）ドメイン、１つのsushiドメイン、１つのcomplement control protein（ＣＣＰ）ドメイン、及びＳＰドメインを含むが、Toll及びpro−ＰＯカスケードで共通的に発見されるclipドメインを含まない。前記約３５ ｋＤａの蛋白質を、非還元条件下で蛋白質中の低密度脂質蛋白質受容体Ａ反復ドメイン配列の存在を介し、さらに確認した（図１１（Ｃ））。前記約３５ ｋＤａの蛋白質をTenebrioモジュラセリンプロテアーゼと命名した。Tenebrioモジュラセリンプロテアーゼと類似したドメイン配列を示すManduca sexta体液のプロテアーゼ１４（Ｍｓ−ＨＰ−１４）がＭ．sextaでpro−ＰＯ活性化システムの開始酵素として最近報告され、これは、curdlan、zymosan及び酵母と結合し、ペプチドグリカンと反応する(Ji, C., Wang, Y., Guo, X., Hartson, S. & Jiang, H. (2004) J Biol Chem 279, 34101-34106;及びWang, Y. & Jiang, H. (2006) J Biol Chem 281, 9271-9278)。本研究で、本発明者らは、Ｍｓ−ＨＰ−１４類似セリンプロテアーゼがpro−ＰＯ経路において、ＧＮＢＰ１類似体、ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＰＧからなる初期の活性化複合体として引き出されるということを初めて明らかにした。
【００６８】
本発明者らは、Toll及びpro−ＰＯ活性化経路の開始において、分子メカニズム（molecular events）を要約したモデルを、次の通り提案する（図１２参照）。少数のＰＧＲＰ−ＳＡ（Ｒ）分子が天然のＰＧに結合するにしても、免疫反応を活性化させられない（ａ）。グラム陽性バクテリアのＰＧは、リゾチームによって部分的に（ｂ）、または完全に（ｂ’）分解される。部分的に分解されたＰＧがバクテリア表面に結合するＰＧＲＰ−ＳＡ分子をさらにたくさん寄せ集める一方（ｂ）、完全に分解されたＰＧは、バクテリア細胞の溶解（lysis）に至るバクテリア表面上のＰＧＲＰ−ＳＡを寄せ集められない（ｂ’）。重畳されたＰＧＲＰ−ＳＡ分子は、ＧＮＢＰ１及びリポプロテインレセプタＡリピートドメイン（ＬＤＬ）を有するモジュラセリンプロテアーゼを寄せ集め、これは、モジュラセリンプロテアーゼを活性化させるようになる（ｃ）。活性化されたセリンプロテアーゼは、Toll及びプロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ）経路を活性化させるプロテオリティックカスケード（proteolytic cascede）を誘発し、これは侵襲したバクテリア周囲に抗菌性ペプチド（ＡＭＰ：anti-microbial peptide）及びメラニンを生成させる。
【００６９】
（６）Tenebrio ＧＮＢＰ１及びTenebrio ＭＳＰのｃＤＮＡクローニング及び配列分析
Tenebrio ＧＮＢＰ１ ｃＤＮＡクローニングの結果、Tenebrio ＧＮＢＰ１のポリヌクレオチドは、Metから停止コードンまでをコーディングする１，３２６個の核酸（配列番号３）からなっており、そのポリペプチドは、４４２個のアミノ酸（配列番号２）からなっていることを確認した。
【００７０】
また、Tenebrio ＭＳＰｃＤＮＡクローニングの結果、１，８９６個の核酸及び６３２個のアミノ酸からなる２つの変異体（variant）、すなわち、それぞれ配列番号４のアミノ酸配列／配列番号５のヌクレオチド配列及び配列番号６のアミノ酸配列／配列番号７のヌクレオチド配列を有する変異体が存在することを確認した。前記の通りに変異体は、得られた遺伝子が何種類かの昆虫から由来するものであるので、個体間の多形成（polymorphism）によって異なる対立形質（allele）の組み合わせが現れたために発生したと推定される。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）のプロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ：pro-phenoloxidase）システムを活性化させる新規の蛋白質、これをコーディングする遺伝子、前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出方法、及び前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出用キットに関する。本発明はまた、前記キットの標準物質として有用な、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の遺伝工学研究は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のペプチドグリカン（ＰＧ）を認識する蛋白質であるDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＤがToll経路を活性化させ(Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2001) Nature 414, 756-759;及び Bischoff, V., Vignal, C., Boneca, I. G., Michel, T., Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2004) Nat Immunol 5, 1175-1180)、Drosophila ＰＧＲＰ−ＬＣ及びDrosophila ＰＧＲＰ−ＬＥがＩｍｄ経路に対する受容体であることを明らかにしている(Gottar, M., Gobert, V., Michel, T., Belvin, M., Duyk, G., Hoffmann, J. A., Ferrandon, D. & Royet, J. (2002) Nature 416, 640-644; Choe, K. M., Werner, T., Stoven, S., Hultmark, D. & Anderson, K. V. (2002) Science 296, 359-362; 及びTakehana, A., Katsuyama, T., Yano, T., Oshima, Y., Takada, H., Aigaki, T. & Kurata, S. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99, 13705-13710)。Drosophilaグラム陰性菌結合蛋白質１（Drosophila ＧＮＢＰ１）の機能消失突然変異（loss-of-function mutant）の免疫表現型は、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡと区分できず、これは、２つの蛋白質がグラム陽性菌の感染に対する反応において、Toll経路を活性化させるために必要であるということを示す(Gobert, V., Gottar, M., Matskevich, A. A., Rutschmann, S., Royet, J., Belvin, M., Hoffmann, J. A. & Ferrandon, D. (2003) Science 302, 2126-2130; Pili-Floury, S., Leulier, F., Takahashi, K., Saigo, K., Samain, E., Ueda, R. & Lemaitre, B. (2004) J Biol Chem 279, 12848-12853;及びWang, L., Weber, A. N., Atilano, M. L., Filipe, S. R., Gay, N. J. & Ligoxygakis, P. (2006) EMBO J 25, 5005-5014)。しかし、グラム陰性菌認識におけるToll経路の上流（upstream）部分の分子レベルでのメカニズムは、まだはっきりと明らかにされていない。
【０００３】
浸襲する病原菌のメラニン化を誘導するプロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ）活性化カスケードは、無脊椎動物において、他の重要な固有の免疫防御メカニズムであり、これは、ペプチドグリカン（ＰＧ）及びβ−１，３−グルカンによって誘発される(Cerenius, L. & Soderhall, K. (2004) Immunol Rev 198, 116-126;及びKanost, M. R., Jiang, H. & Yu, X. Q. (2004) Immunol Rev 198, 97-105)。脊椎動物の補体システムと同様に、pro−ＰＯカスケードは、血漿内の蛋白質分解（proteolytic）カスケードである。従って、前記pro−ＰＯシステムは、細胞が含まれていない（cell-free）条件で、ＰＧ及びβ−１，３−グルカン認識、並びにそれに続く信号伝達に係る生化学的研究のための望ましいツールである。本発明者らは、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡと高い配列相同性を示すチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）ＰＧＲＰを同定した経緯がある。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと命名した前記ＰＧＲＰは、Tenebrio昆虫で、Ｌｙｓ−ＰＧ依存性pro−ＰＯシステムを活性介させた。驚くべきことに、新規の合成Ｌｙｓ−ＰＧ断片が、pro−ＰＯシステムの活性化において、水溶性のポリマー線形Ｌｙｓ−ＰＧの競争的阻害剤として機能する。前記合成Ｌｙｓ−ＰＧ断片（ここで、「合成ムロペプチドダイマー（synthetic muropeptide dimer）」と称する）は、下記化学式１の構造を有し、テトラサッカライド（ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−ＭｕｒＮＡｃ）が２個（two copies）のテトラペプチドステム（Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ）に共有結合されている(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)。
【０００４】
【化１】
【０００５】
ＰＧ−断片なしに、またはＰＧ−断片との複合体を形成したＰＧＲＰ蛋白質についての最近の結晶構造に係る研究は、ＰＧ認識に対する構造的な根拠について重要な情報を提供した(Lim, J. H., Kim, M. S., Kim, H. E., Yano, T., Oshima, Y., Aggarwal, K., Goldman, W. E., Silverman, N., Kurata, S. & Oh, B. H. (2006) J Biol Chem 281, 8286-8295; Chang, C. I., Chelliah, Y., Borek, D., Mengin-Lecreulx, D. & Deisenhofer, J. (2006) Science 311, 1761-1764; Chang, C. I., Ihara, K., Chelliah, Y., Mengin-Lecreulx, D., Wakatsuki, S. & Deisenhofer, J. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102, 10279-10284; Guan, R., Roychowdhury, A., Ember, B., Kumar, S., Boons, G. J. & Mariuzza, R. A. (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101, 17168-17173; Kim, M. S., Byun, M. & Oh, B. H. (2003) Nat Immunol 4, 787-793;及びChang, C. I., Pili-Floury, S., Herve, M., Parquet, C., Chelliah, Y., Lemaitre, B., Mengin-Lecreulx, D. & Deisenhofer, J. (2004) PLoS Biol 2, E277)。Ｎ−アセチルグルコースアミン及びＮ−アセチルムラミン酸の糖がステム（stem）として短いペプチドと連結されたムロペプチドが、ＰＧＲＰ−ＳＡに対する最小結合単位として明らかにされた。
【０００６】
しかし、ＰＧＲＰによるＬｙｓ−ＰＧの認識信号が、いかようにpro−ＰＯまたはToll経路の活性化に至るセリンプロテアーゼ（ＳＰ：serine protease）カスケードを引き出しているかは不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、生体内のキイロショウジョウバエ（Drosophila）Toll経路、試験管内のpro−ＰＯ活性化システム、及び組み替えＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質を利用した生化学的な接近を介して、Ｌｙｓ−ＰＧ認識信号がいかように下流（downstream）に伝えられるかについて多様な研究を行った。その結果、本発明者らは、pro−ＰＯシステムに関与する蛋白質を分離し、また、前記蛋白質が血液などの検体中のバクテリア感染を検出するのに有用であることを発見した。また、本発明者らは、検体中のバクテリア感染の検出において、標準物質として有用である、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法を開発した。
【０００８】
従って、本発明は、プロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ）システムを活性化させる蛋白質及びこれをコーディングする遺伝子を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出方法を提供する。
本発明はまた、前記蛋白質を利用した検体中のバクテリア感染の検出用キットを提供する。
本発明はまた、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ）の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一様態によって、配列番号２のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のグラム陰性菌結合蛋白質１（Tenebrio ＧＮＢＰ１）、及びこれをコーディングするポリヌクレオチド、例えば配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１１】
本発明の他の様態によって、配列番号４のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−１（Tenebrio ＭＳＰ−１）、及びこれをコーディングするポリヌクレオチド、例えば配列番号５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１２】
本発明のさらに他の様態によって、 配列番号６のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−２（Tenebrio ＭＳＰ−２）、及びこれをコーディングするポリヌクレオチド、例えば配列番号７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明のさらに他の様態によって、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のペプチドグリカン認識蛋白質（Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）を検体に加え、インキュベーションする段階と、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を、段階（ａ）で得られたインキュベーション混合物に加え、インキュベーションする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られたインキュベーション混合物のうち、前記蛋白質と検体との反応性を検出する段階とを含む、検体中のバクテリア感染の検出方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに他の様態によって、 配列番号１のアミノ酸配列を有するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ；及び配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を含む、検体中のバクテリア感染の検出用キットが提供される。
【００１５】
本発明のさらに他の様態によって、 （ａ’）バクテリアから分離した不溶性ペプチドグリカンを、約ｐＨ８の緩衝液に懸濁させる段階と、（ｂ’）段階（ａ’）で得られた懸濁液をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）で処理する段階と、（ｃ’）段階（ｂ’）で得られた反応混合物を約９５℃で約１０分間加熱し、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、（ｄ’）段階（ｃ’）で得られた上澄み液をサイズ排除カラムで分画し、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画を回収する段階とを含む、水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によってpro−ＰＯシステムを活性化させる新規の因子（すなわち、蛋白質）が同定された。前記蛋白質は、血液などの検体中のバクテリア感染を検出したり、あるいは検出用キットの製造に使われうる。また、本発明によって、ｂｌｐ及び／またはリゾチームを使用して血液などの検体を前処理する場合、バクテリア感染がpro−ＰＯシステムに関与する前記因子によって、さらに効果的に検出されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】線形ペプチドグリカン（ＰＧ）（ａ）、及び合成ムロペプチドダイマー（ｂ）の予想される構造を示し、白色大球、黒色大球、黒色小球、及び白色小球は、それぞれＳ．aureus ＰＧのＮ−アセチル−グルコースアミン、Ｎ−アセチルムラミン酸、ステムペプチド（stem peptides）及びグリシン残基を示す。
【図２】Toyopearl ＨＷ−５５Ｓサイズ排除コラム上の分画されたＳＬＰＧのＵＶ吸光度プロファイル及び各ＳＬＰＧ分画のＰＯ活性を示す。
【図３】水（白色バー）、合成ムロペプチドダイマー（ストライプ）またはＳＬＰＧ（黒色バー）を、野生型メス（female）成体キイロショウジョウバエ及びＰＧＲＰ−ＳＡｓｅｍｌ突然変異キイロショウジョウバエに注入した後の、ドロソマイシン（Ｄｒｓ）−Ｒｐ４９リポータ遺伝子の誘導を示す。Ｄｒｓ発現は、試験１８時間後に収集された４匹のキイロショウジョウバエで測定され、水注入後に得られた値（１００％に合わせる）に正常化（normalize）させた。バーは、４つの独立した試験の平均±ｓ．ｄ．を示す。
【図４】１００ｎｇの合成ムロペプチドダイマー（ａ）またはＳＬＰＧ（ｂ）をチャイロゴミムシダマシ幼虫（Tenebrio larvae）に注入した後の、１８時間内でのメラニン色素の出現を示す。
【図５】１０ｎＭのTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（０．２μｇ ｍｌ−１）及び異なる含有量のＳＬＰＧで測定したＬｙｓ−ＰＧ依存性ＰＯ活性を示す（■）。鐘状の容量−反応曲線は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの添加によって右に移動した。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ濃度を１２０ｎＭ（２．５μｇ ｍｌ−１）に増加させたとき、最大点は、１００ｎｇのＳＬＰＧで観察された（●）。インセット（insets）は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＳＬＰＧ間の仮想の複合体構造を示す。
【図６】ＳＬＰＧ存在下で、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液を使用して行った試験管内の復元（reconstitution）試験結果を示す（それぞれカラム２及び３）。また、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及びDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡをＳＬＰＧ存在下で同時にインキュベーションした（カラム４）。
【図７】それぞれ線形ＰＧ単独（ａ）及びリゾチームで部分的に分解させた線形ＰＧ（ｂ）を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化させたToyopearl ＨＷ−５５Ｓカラムによって分画した結果を示す。
【図８】（ａ）は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＦｒ．１４の混合物を同じカラムに注入したときの結果を示し、（ｂ）は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及び３７℃で１６時間インキュベーションして完全にリゾチームで分解させたＳＬＰＧを、同じカラムに注入したときの結果を示す。
【図９】（Ａ）は、部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに結合するDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡの能力を示す。Lyso（−）及びLyso（＋）は、それぞれ天然（intact）及び部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧを示す。レーン１は、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ単独；レーン２及び４は、それぞれLyso（−）またはLyso（＋）ＰＧをDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡとインキュベーションしたときに、非結合のDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡの量を示す。レーン３及び５は、それぞれLyso（−）またはLyso（＋）ＰＧ上の結合されたＤｍ−ＰＧＲＰ−ＳＡの量を示す。（Ｂ）は、部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに対するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの結合能を示す。各レーンの意味は、前記（Ａ）と同一である。
【図１０】Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡが欠如した体液溶液と共にインキュベーションした後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した結果を示す。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡが欠如した体液溶液と共にインキュベーションした後、天然の不溶性ＰＧ（レーン１）、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ結合されたＰＧ（レーン２）、またはDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ結合されたＰＧ（レーン３）から蛋白質を抽出した。また、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの非存在または存在下で、Ｍ．luteus不溶性ＰＧ（レーン４及び５）、及び合成ムロペプチドダイマー結合された樹脂（レーン６及び７）を処理した。部分的に分解されたＰＧに結合されたDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡが２つのTenebrio蛋白質と反応しなかったことが注目すべきことである（レーン３）。
【図１１】（Ａ）は、バンド１、Tribolium castaneum ＧＮＢＰ−類似蛋白質（Ｔｃ−ＧＮＢＰ、ＸＰ＿９６９４４９）、Ｔ．molitorグルカン認識蛋白質（Ｔｍ−ＧＲＰ）、Anopheles gambiae ＧＮＢＰ１（Ａｇ−ＧＮＢＰ１、ＡＡＲ１３７５１）及びＤrosophia melanogaster ＧＮＢＰ１（Ｄｍ−ＰＧＲＰ１）のＮ−末端配列を比較した結果である。箱（box）は、バンド１の配列と同じ残基を示す。（Ｂ）は、バンド２、Tribolium castaneumセリンプロテアーゼ（Ｔｃ−ＳＰ、ＸＰ＿９６７４８６）、Ｍ．Sexta hemolymph protease−１４（Ｍｓ−ＨＰ１４）、Ａ．gambiaeセリンプロテアーゼ（ＡＧ−ＳＰ、ＸＰ＿３２１２６３）及びＤ．Melanogasterモジュラセリンプロテアーゼ（Ｄｍ−ＭＳＰ、ＣＧ３１２１７）のＮ−末端アミノ酸配列を比較した結果である。（Ｃ）は、バンド２の２つの内部配列（ピーク１及びピーク２）及びＴｃ−ＳＰの低密度リポプロテインレセプタＡリピート（low density lipoprotein receptor A repeat）ドメイン配列間の配列相同性を示す。
【図１２】Toll及びpro−ＰＯ経路の開始において、分子メカニズム（molecular events）を要約したモデルを示す。
【図１３】それぞれTenebrio ＧＲＰ−ＳＡ単独（Ａ）、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと線形ＰＧとの混合物（Ｂ）、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡと線形ＰＧとの混合物（Ｃ）、またはTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと線形ＰＧとの混合物（Ｄ）を、Toyopearl ＨＷ−５５Ｓサイズ排除（size-exclusion）カラムに注入して得られた結果を示す。
【図１４】Ｌｙｓ型ＰＧ依存性メラニン合成に対するリゾチーム阻害剤の効果を示す。（Ａ）昆虫生理緩衝液（insect saline）。（Ｂ）不溶性Ｌｙｓ−ＰＧ。（Ｃ）部分的に分解されたＬｙｓ型ＰＧ。（Ｄ）リゾチーム阻害剤と不溶性Ｌｙｓ型ＰＧとの同時注入。（Ｅ）リゾチーム阻害剤単独。
【図１５】Tenebrio ＧＮＢＰ１のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図１６】Tenebrio ＧＮＢＰ１のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図１７】Tenebrio ＧＮＢＰ１のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図１８】Tenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図１９】Tenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図２０】Tenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【図２１】Tenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者らは、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）のペプチドグリカン認識蛋白質（Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）とペプチドグリカン（ＰＧ）との複合体（complex）が下流段階への信号伝達に関与する蛋白質を引き寄せる（recruiting）ことによって、pro−ＰＯシステムを活性化させるということを明らかにした。また、本発明者らは、前記下流段階への信号伝達に関与する蛋白質がグラム陰性菌結合蛋白質１（ＧＮＢＰ１）類似蛋白質（すなわち、Tenebrio ＧＮＢＰ１）；及びＮ−末端に低密度脂質蛋白質類似ドメインと、補体系調節蛋白質類似ドメインとを有するTenebrio−多重ドメイン含有モジュラセリンプロテアーゼ（Tenebrio−multi−domain containing modular serine protease）（すなわち、Tenebrio ＭＳＰ）であることを明らかにした。また、本発明者らは、前記Tenebrio ＭＳＰが２つの形態、すなわち、Tenebrio ＭＳＰ−１及びTenebrio ＭＳＰ−２で存在することを明らかにした。さらに、本発明者らは、前記Tenebrio ＧＮＢＰ１及びTenebrio ＭＳＰのアミノ酸配列及びこれをコーディングするヌクレオチド配列を明らかにした。前記Tenebrio ＧＮＢＰ１及びTenebrio ＭＳＰは、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡとＰＧとの複合体と共に、複合体を形成すると推定される。
【００１９】
従って、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のグラム陰性菌結合蛋白質１（Tenebrio ＧＮＢＰ１）を提供する。
【００２０】
また、本発明は、前記配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１をコーディングするポリヌクレオチド、望ましくは、配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−１（Tenebrio ＭＳＰ−１）を提供する。
また、本発明は、前記配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１をコーディングするポリヌクレオチド、望ましくは、配列番号５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−２（Tenebrio ＭＳＰ−２）を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２をコーディングするポリヌクレオチド、望ましくは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
一具現例によって、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のペプチドグリカン認識蛋白質（Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）を検体に加え、インキュベーションする段階と、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を、段階（ａ）で得られたインキュベーション混合物に加え、インキュベーションする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られたインキュベーション混合物において、前記蛋白質と検体との反応性を検出する段階とを含む、検体中のバクテリア感染の検出方法が提供される。
【００２２】
検体中のバクテリア感染の検出方法において、前記検体は、輸血用血液や、ヒトを含む哺乳動物の血液や、野菜、肉類、果物のような食品や、調理あるいは非調理の食品や、水道水、地下水、雨水のような水や、無菌製品でありうる。前記検体は、微生物検出が必要なあらゆる検体でありうる。具体的に、本発明によるバクテリア感染の検出方法は、輸血用血液、またはヒトを含む哺乳動物の血液からのバクテリア感染の検出に適している。
【００２３】
本発明によるバクテリア感染の検出方法において、前記インキュベーションは、約３０℃で検体が前記蛋白質と十分に反応できる時間の間に遂行可能である。必要な場合、カルシウムイオン阻害剤として、ＥＤＴＡを含む多様な緩衝液中で遂行されうる。
【００２４】
また、段階（ｃ）で、前記反応性の検出は、サイズ排除Toyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂で充填されたカラムなどの、サイズ排除カラムを利用した通常の方法によって遂行されうる。
【００２５】
必要な場合、本発明によるバクテリア感染の検出方法は、検体をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ：β−lytic protease）及び／またはリゾチームで前処理する段階をさらに含むことができる。下記実施例で明らかにした通り、ほとんどの天然のグラム陽性菌のペプチドグリカンで、グリカン鎖が高度に架橋結合されており、前記ペプチドグリカンに対する認識蛋白質（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）の接近を制限できる。しかし、検体に対するβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）及び／またはリゾチームでの処理は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡとの複合体（complex）形成を促進する。
【００２６】
前記ｂｌｐは、土壌微生物のような多様な微生物から抽出できる。例えば、前記ｂｌｐは、アクロモバクター（Achromobacter）属微生物、望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）、さらに望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７から抽出しうる。又は、前記ｂｌｐは、公知の方法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)を使用し、商業的に有用な粗アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）製剤（和光純薬工業株式会社、０１４−０９６６１）を精製することによって、製造することも可能である。
【００２７】
前記ｂｌｐ前処理は、検体を約１μｇ／ｍｌ濃度のｂｌｐで処理し、約３７℃で約１４時間インキュベーションすることによって遂行することができる。
本発明のバクテリア感染の検出方法に使われる前記リゾチームは、商業的に有用なリゾチーム（例えば、hen egg white lysozyme）でありうる。前記リゾチームでの前処理は、検体を約１ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチームで処理し、約３７℃で多様な反応時間の間インキュベーションすることによって、遂行することができる。
【００２８】
また、他の具現例によって、配列番号１のアミノ酸配列を有するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ；及び配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を含む、検体中のバクテリア感染の検出用キットが提供される。
【００２９】
本発明の検出用キットにおいて、前記検体は、輸血用血液や、ヒトを含む哺乳動物の血液や、野菜、肉類、果物のような食品や、調理されたあるいは非調理の食品や、水道水、地下水、雨水のような水や、無菌製品でありうる。前記検体は、微生物検出が必要なあらゆる検体でありうる。具体的に、本発明による検出用キットは、輸血用血液、またはヒトを含む哺乳動物の血液からのバクテリア感染の検出に適している。
【００３０】
本発明の検出用キットは、反応性検出のための試薬、例えば、パラ−ニトロアニリン（ｐ−nitroaniline）に結合されたアミノ酸あるいはペプチド、pro−ＰＯシステムを活性化させる蛋白質、及びpro−ＰＯ酵素の発色基質などを含むことができる。前記検出用キットは、溶液、凍結乾燥粉末、冷凍溶液、またはストリップ状でありうる。それぞれの形態は、当業界で一般的な方法によって製剤化されうる。例えば、溶液状の検出用キットは、前記蛋白質を、ナトリウム−リン酸緩衝液、カリウム−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液のような緩衝液と、混合された形態あるいは分離された形態に混合して製剤化できる。必要な場合、前記溶液を冷凍させたり、または凍結乾燥することもできる。
【００３１】
本発明の検出用キットはβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）及び／またはリゾチームをさらに含むことができる。前記ｂｌｐは、土壌微生物のような多様な微生物から抽出できる。例えば、前記ｂｌｐは、アクロモバクター（Achromobacter）属微生物、望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）、さらに望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７から抽出しうる。選択的に、前記ｂｌｐは、公知の方法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)を使用し、商業的に有用な粗アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）製剤（和光純薬工業株式会社、０１４−０９６６１）を精製することによって、製造することも可能である。
【００３２】
本発明はまた、検体中のバクテリア感染の検出において、Ｌｙｓ−ＰＧの標準物質として使用可能な水溶性の線形リシン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法を提供する。すなわち、本発明は、（ａ’）バクテリアから分離した不溶性ペプチドグリカンを、約ｐＨ８の緩衝液に懸濁させる段階と、（ｂ’）段階（ａ’）で得られた懸濁液をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）で処理する段階と、（ｃ’）段階（ｂ’）で得られた反応混合物を約９５℃で約１０分間加熱し、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、（ｄ’）段階（ｃ’）で得られた上澄み液をサイズ排除カラムで分画し、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画を回収する段階とを含む、水溶性の線形リシン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法を提供する。
【００３３】
前記ＳＬＰＧ製造方法において、前記バクテリアから分離した不溶性ペプチドグリカンは、公知の方法(例えば、BL de Jonge, YS Chang, D Gage, and A Tomasz, Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A J. Biol. Chem., Jun 1992; 267: 11248 - 11254)によって製造できる。
【００３４】
段階（ａ’）の前記緩衝液は、約ｐＨ８．０のトリス緩衝液でありうる。また、前記ｂｌｐは、土壌微生物のような多様な微生物から抽出できる。例えば、前記ｂｌｐは、アクロモバクター（Achromobacter）属微生物、望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）、さらに望ましくは、アクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７から抽出しうる。又は、前記ｂｌｐは、公知の方法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)を使用し、商業的に入手可能な粗アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）製剤（和光純薬工業株式会社、０１４−０９６６１）を精製することによって、製造することも可能である。
【００３５】
前記ｂｌｐ処理は、前記不溶性ペプチドグリカンを含む懸濁液を約１μｇ／ｍｌ濃度のｂｌｐで処理し、約３７℃で約１４時間インキュベーションすることによって、遂行することができる。
【００３６】
段階（ｃ’）で、前記遠心分離は、約１８，０００ｘｇで、約４℃の温度で約１０分間遂行されうる。必要な場合、前記遠心分離から得られた上澄み液は凍結乾燥させ、約４℃で保存できる。
【００３７】
段階（ｄ’）で、前記サイズ排除カラムは、Toyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂で充填されたカラムである。典型的に、前記カラムは、滅菌蒸溜水で平衡化させた後で使われる。前記分画化は、段階（ｃ’）で得られた溶液（すなわち、水溶性ＰＧ溶液）をカラムを介して溶離させることによって遂行されうる。得られた分画のうち、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画は、次の通り回収できる：それぞれの分画を希釈してチャイロゴミムシダマシ（Ｔ．molitor）幼虫の体液を添加する。得られた混合物を３０℃で５分間インキュベーションした後、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加する。ＣａＣｌ２溶液、４−メチルカテコール（４−ＭＣ）溶液、及び４−ヒドロキシプロリンエステル（４−ＨＰ）溶液を添加した後、混合する。前記混合物を３０℃恒温槽で保管する。Ｃａ２＋のみ存在する体液の色の変化に比べ、最大の色変化を示す時点で分光光度計を使用し、５２０ｎｍ波長で吸光度を測定する。
【００３８】
必要な場合、前記で得られたフェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画は、濃縮させ、Toyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂で充填されたカラムにローディングし、ＳＬＰＧ含有分画を分離することによって、さらに精製できる。
また、必要な場合、前記ＳＬＰＧ製造方法は、段階（ｄ’）から得られた分画を凍結乾燥する段階をさらに含むことができる。
【００３９】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明が下記実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００４０】
１．試験方法
（１）アクロモバクター（Achromobacter）β−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）の精製及び特性究明
報告された方法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)によって、商業的に入手可能な粗アクロモペプチダーゼ（Achromopeptidase）製剤（和光純薬工業株式会社、０１４−０９６６１）からアクロモバクターβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）を均質に精製した。ｂｌｐの同定確認のために、Applied Biosystem automatic gas-phase amino acid sequencer上で精製されたｂｌｐのＮ−末端配列を決定した。Sakiyama法(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1997) J Biochem (Tokyo) 122, 772-778)によって、マイクロコッカスルテウス（Micrococcus luteus）に対するｂｌｐの溶菌（bacterio lytic）活性を分析した。
【００４１】
（２）水溶性の線形リジン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ）の精製
【００４２】
（２−１）菌株培養
スタフィロコックスアウレウス（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ １２５９８（Cowan serotype）菌株を液体培地（ＴＳＢ（tryptic soy broth）培地、１００ｍｌ）に接種し、３７℃で１２時間インキュベーションした。培養液２０ｍｌをそれぞれＴＳＢ培地２Ｌ（４００ｍｌＸ５ bottles）に接種した後、１２時間インキュベーションした。得られた培養液を６，０００ｒｐｍの回転速度で、４℃で３０分間遠心分離した。この後、菌体を回収し、滅菌蒸溜水２００ｍｌに懸濁した後、得られた菌体をさらに回収した。前記過程（すなわち、回収及び懸濁）を６回反復した。得られた菌体を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）７６．８ｍｌ中に懸濁させた後、得られた懸濁液を５０ｍｌ試験管二つに同量で移した。
【００４３】
（２−２）不溶性ペプチドグリカンの分離及び精製
不溶性ペプチドグリカンの分離及び精製は、公知の方法(BL de Jonge, YS Chang, D Gage, and A Tomasz Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A J. Biol. Chem., Jun 1992; 267: 11248−11254)によって次の通り行った。
【００４４】
前記で得られた菌体懸濁液に、９５℃に加熱した２０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液１．６ｍｌを加えて４％の菌液を得て、これを９５℃で４５分間加熱した後、氷浴槽で十分に冷却した。得られた菌液を遠心分離した（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）。上澄み液を捨て、菌体を回収した。滅菌蒸溜水４０ｍｌを回収された菌体に加えた。前記と同じ条件で遠心分離を遂行し、菌体を回収した。前記過程を６回反復した。回収された菌体を１ＸＰＢＳ緩衝液４０ｍｌ中に懸濁した後、１００μｇ／ｍｌの濃度のＤNase及びＲNaseと３７℃で１８時間反応させた。反応混合物をトリプシン２００μｇ／ｍｌと３７℃で１８時間反応させた。９５℃に加熱した２０％ＳＤＳ溶液を前記反応混合物に加えて１％の菌液を得て、前記菌液を９５℃で１０分間加熱して酵素反応を停止させた。得られた反応混合物を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。沈殿物に滅菌蒸溜水４０ｍｌを加え、得られた溶液を遠心分離して（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。かような過程を３回反復した。得られた沈殿物を８Ｍ ＬｉＣｌ溶液４０ｍｌ中に懸濁させた後、滅菌蒸溜水４０ｍｌを加えた。得られた懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。回収された沈殿物を１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液４０ｍｌ中に懸濁させた後、滅菌蒸溜水４０ｍｌを加えた。得られた懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。回収された沈殿物を滅菌蒸溜水４０ｍｌ中に懸濁させた。得られた懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。回収された沈殿物をアセトン４０ｍｌ中に懸濁させた。得られた懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）、沈殿物を回収した。回収された沈殿物を凍結乾燥し、約３８０〜４００ｍｇの不溶性ペプチドグリカンを得た。
【００４５】
（２−３）ＳＬＰＧの精製
前記で得られた不溶性ペプチドグリカンをβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）で処理した。すなわち、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中の前記で得られた不溶性ペプチドグリカン（２０ｍｇ）の懸濁液にｂｌｐ ２μｇ／ｍｌを加えた後、３７℃で１４時間反応させた。前記反応混合物を９５℃で１０分間煮沸した後、遠心分離した（１８，０００ｘｇ、４℃、１０分）。上澄み液を回収し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を４℃で保管した。
【００４６】
Toyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂６０ｍｌをカラム（２．６ｘ１５．５ｃｍ）に充填し、滅菌蒸溜水を使用して０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化させた後、前記で製造した水溶性ＰＧ溶液１ｍｇを前記カラムにローディングし、所定の体積に分画した。それぞれの分画を滅菌蒸溜水を使用して１００倍ずつ希釈した。それぞれの希釈液１０μｌを使用してＰＯ活性を測定した。
【００４７】
ＰＯ活性は、次の通り測定した：それぞれの希釈液１０μｌにチャイロゴミムシダマシ（Ｔ．molitor）幼虫の体液３０μｌ（体液蛋白質約２８０μｇ）を添加した後、３０℃で５分間インキュベーションさせた。２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）４３５μｌを添加した後、直ちに１Ｍ ＣａＣｌ２溶液５μｌ（最終濃度１０ｍＭ）を添加した。２５０ｍＭ４−メチルカテコール（４−ＭＣ）溶液４μｌ、及び６２．５ｍＭ４−ヒドロキシプロリンエステル（４−ＨＰ）溶液１６μｌを添加した後、混合した。前記混合物を３０℃恒温槽で保温した。Ｃａ２＋のみ存在する体液の色の変化に比べ、最大の色変化を示す時点で分光光度計を使用し、５２０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【００４８】
フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画を集め、ロータリ蒸留器を使用して４℃で濃縮した。濃縮額をさらに蒸溜水で０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化させた前記と同じカラムにローディングした。ＳＬＰＧ含有分画を分離（pooling）し、４℃で使用時まで保管した。前記Ｓ．aureus Ｌｙｓ−ＰＧ由来の精製されたＳＬＰＧを確認するために、ＳＬＰＧのアミノ酸組成を分析した結果、Ｓ．aureus Ｌｙｓ−ＰＧについて報告されたところ(Schleifer, K. H. & Kandler, O. (1972) Bacteriol Rev 36, 407-477)と同じアミノ酸組成（Ｄ−Ｇｌｕ：Ｌ−Ｇｌｙ：Ｄ−Ａｌａ：Ｌ−Ｌｙｓ＝１：５：１：１）であった。
【００４９】
（３）体液の回収、ＰＯ活性測定、及びメラニン合成
チャイロゴミムシダマシ（Ｔ．moliter）幼虫（mealworm）を、小麦ブラン（wheat bran）を含有した飼育器（terraria）中の実験室ベンチで飼育した。体液（hemolymph）は、公知の方法(Zhang, R., Cho, H. Y., Kim, H. S., Ma, Y. G., Osaki, T., Kawabata, S., Soderhall, K. & Lee, B. L. (2003) J Biol Chem 278, 42072-42079)によって回収した。ＰＯ活性分析は、本発明者らが発表した方法(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)によって行った。メラニン合成を試験するために、２μｌのＳＬＰＧ（５０μｇ／ｍｌ）、１０μｌの不溶性リジン型ペプチドグリカン（Ｌｙｓ−ＰＧ）（５ｍｇ／ｍｌ）、部分分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧ（５ｍｇ／ｍｌ）、または５μｌの化学式１の化合物（合成ムロペプチドダイマー）（２０μｇ／ｍｌ）を生きている幼虫に注入した。６μｌのＮ，Ｎ’，Ｎ’ ’−トリアセチルキトトリオースを６ｍＭの最終濃度で注入した。２４時間後に、メラニン色素の生成を評価した。
【００５０】
【化１】
【００５１】
（４）ＳＬＰＧ及び化学式１の化合物の注入
OregonＲキイロショウジョウバエを野生型菌株として使用した。ＰＧＲＰ−ＳＡｓｍｅｌは、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ中にsemmelweis突然変異（Ｃ５４Ｙ）を有した菌株である(Michel, T., Reichhart, J. M., Hoffmann, J. A. & Royet, J. (2001) Nature 414, 756-759)。１０ｎｌの水、ＳＬＰＧ（１０ｍｇ ｍｌ−１）、または化学式１の化合物（１０ｍｇ ｍｌ−１）を前記野生型菌株またはＰＧＲＰ−ＳＡｓｍｅｌメス成体（２−４日齢）の胸部にNanoject装置（Drummond社）を使用して注入した。注入後、前記キイロショウジョウバエを２５℃で１８時間インキュベーションした。ドロソマイシン（drosomycin）発現レベルを報告された方法(Leulier, F., Parquet, C., Pili-Floury, S., Ryu, J. H., Caroff, M., Lee, W. J., Mengin-Lecreulx, D. & Lemaitre, B. (2003) Nat Immunol 4, 478-484)によって測定した。
【００５２】
（５）ＰＧＲＰ／ＳＬＰＧ複合体の形成
４０μｇのDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡまたはTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを４００μｇのＳＬＰＧと共に３０℃で３０分間インキュベーションした後、前記混合物を１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化させたSuperdex ２００ ＨＲ １０／３０カラムに注入した。ＰＧＲＰ−ＳＡ／ＳＬＰＧ複合体を含む分画を集めた（pool）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＰＧＲＰ−ＳＡの存在をモニタした。
【００５３】
（６）リゾチームによるＳＬＰＧ及び不溶性Ｌｙｓ−ＰＧの部分的な分解
ＰＯ活性を示す水溶性オリゴマーＬｙｓ−ＰＧ断片を得るために、１０μｌのリゾチーム（hen egg white lysozyme、Wako社）（１ｍｇ ｍｌ−１）を１００μｌの精製されたＳＬＰＧ（８００μｇ ｍｌ−１）に加え、３７℃で５分間インキュベーションした。部分的に分解されたＳＬＰＧを１０分間煮沸した後、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化させたToyopearl ＨＷ５５Ｓカラムにローディングした。ＰＯ活性を示す分画を集めた（pool）。部分的に分解された不溶性ポリマーＬｙｓ−ＰＧを得るために、Ｓ．aureus不溶性ＰＧ（４０ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中に懸濁させ、１０μｇのリゾチームと共に３７℃で３時間インキュベーションした。１０分間煮沸し、４℃で１０分間２０，０００ｘｇで遠心分離した後、ペレット分画中の残滓（residue）を８Ｍウレア溶液で３回及び蒸溜水で３回洗浄した。
【００５４】
（７）部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに対するＰＧＲＰの結合分析
結合分析（binding assay）は、報告された方法(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)によって行った。すなわち、１０μｇの精製されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡまたはDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の部分的に分解されたＳ．aureusまたはＭ．Luteus ＰＧ（５００μｇ）の５０％（ｖ／ｖ）懸濁液４０μｌと、４℃で１２時間撹拌器（shaker）中で混合した。上澄み液中の結合されていないＰＧＲＰ及びペレット分画中の結合されたＰＧＲＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００５５】
（８）Tenebrio ＧＮＢＰ１及び結合されたモジュラセリンプロテアーゼの同定
報告された方法(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)によって、化学式１の化合物の結合された親和性カラムを使用し、チャイロゴミムシダマシ（Ｔ．molitor）体液からTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液を製造した。前記溶液は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを除き、Ｌｙｓ−ＰＧによるpro−ＰＯシステムの活性化に必要なあらゆる必須構成成分を含有する。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（４０μｇ）を２００μｌのＰＢＳ緩衝液中の部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧ（８ｍｇ）と共に、４℃で１２時間インキュベーションした。インキュベーション後、４℃で１０分間２０，０００ｘｇで遠心分離し、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）でまず３回洗浄し、次に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ結合された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧを回収した。回収されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ結合されたＬｙｓ−ＰＧを、４℃で３時間２．５ｍｌのTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液（２０ｍｇの総蛋白質）と共にインキュベーションした。遠心分離によって不溶性残滓を除去した後、前記混合物を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）で２回洗浄した。不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに結合された蛋白質を１００μｌの２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液で抽出した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ポリアクリルアミドゲル上の蛋白質バンドをポリビニリデンジフルオライド（polyvinilidene difluoride）膜に転移させた後、５０ ｋＤａの蛋白質（Tenebrio ＧＮＢＰ１）及び３５ ｋＤａの蛋白質（Tenebrioモジュラセリンプロテアーゼ、Tenebrio ＭＳＰ）のＮ−末端配列をautomatic gas-phase amino acid sequencer（Applied Biosystem社）上で決定した。
【００５６】
（９）Tenebrio ＧＮＢＰ１とTenebrio ＭＳＰとのｃＤＮＡクローニング及びヌクレオチド配列分析
Tenebrio ＧＮＢＰ１のｃＤＮＡクローニングのために、縮退化されたセンス（degenerate sense）プライマーとして５’−ＧＡＲＧＣＮＴＡＹＧＡＲＣＣＮＡＡＲＧＧ−３’（配列番号８）、及び縮退化されたアンチセンスプライマーとして５’−ＡＴＲＴＣＹＴＣＹＴＧＲＴＴＲＴＴＮＧＣ−３’（配列番号９）［Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｎ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ］を使用し、公知の方法(Buck and Axel, Cell 65: 175-187, 1991; Riddle et al., Cell 75: 1401-1416, 1993; Krauss et al., Cell 75:1431-1444, 1993)によってＰＣＲを行った。５’−及び３’−ＲＡＣＥのために、SMART RACE ｃＤＮＡ Amplification method（CLONTECH）を使用した。あらゆるＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ ＴＡクローニング法（Invitrogen）を使用し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングした。配列分析は、３１３０ｘｌ Genetic Analyzer Sequencing method（Applied Biosystems）を使用して行った。
【００５７】
Tenebrio ＭＳＰのｃＤＮＡクローニングを、さらに５’−ＡＡＲＧＡＹＡＡＹＴＧＹＧＡＹＧＡＲＡＴ−３’（配列番号１０）及び５’−ＧＣＹＴＧＹＴＧＣＣＡＮＧＧＲＴＡＲＴＣ−３’（配列番号１１）をそれぞれ縮退化されたセンスプライマー及び縮退化されたアンチセンスプライマーとして使用し、前記と同じ方法で行った。
【００５８】
２．試験結果及び考察
（１）ＳＬＰＧは、Toll経路及びpro−ＰＯシステムを活性化させる
アクロモバクターｂｌｐ（Achromobacter ｂｌｐ）は、Ｓ．aureus ＰＧに存在するペンタ−Ｇｌｙブリッジ（penta−Ｇｌｙ bridge）中のペプチド結合を加水分解するリゾスタフィン類似（lysostaphin-like）酵素である(Li, S., Norioka, S. & Sakiyama, F. (1998) J Biochem (Tokyo) 124, 332-339)。従って、ｂｌｐは、ステムペプチドに連結されたＧｌｙ残基を有する不溶性ＰＧから水溶性ポリマーＰＧ断片を遊離させると期待される（図１）。水溶性のポリマーＬｙｓ−ＰＧ断片（ＳＬＰＧ）をＳ．aureus ＰＧからｂｌｐを使用して得た。ＳＬＰＧは、ステムペプチド間のペンタ−Ｇｌｙブリッジではない、糖間のβ−１，４グリコシド結合によって連結されたポリマー化されたムロペプチドであると推定される。従って、ＳＬＰＧは、いくつかのムロペプチドモチーフ（motifs）を有するために、ＰＧＲＰ−ＳＡに対する多重結合部位を有するようになる。さらに精製されたＳＬＰＧを使用し、組み替えDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質（これらは、バキュロウイルス昆虫細胞培養システム（baculovirus insect cell culture system）で発現及び精製される）のいずれもがＳＬＰＧに結合することが、サイズ排除カラムを使用して立証された（図１３の（Ｂ）及び（Ｃ））。しかし、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及び化学式１の化合物の混合物は、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ単独と同じ溶離プロファイルを示し、これは、化学式１の化合物は、一分子のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡのみに結合できることを示唆する。
【００５９】
本発明者らは、ＳＬＰＧをチャイロゴミムシダマシ体液（Tenebrio hemolymph）に加えたとき、ＳＬＰＧが明確なＰＯ活性を持続的に誘導することを発見した（図２）。ＳＬＰＧが生体内でDrosophilaToll経路を活性化させることができるか否かを試験するために、野生型及びＰＧＲＰ−ＳＡｓｅｍｌ突然変異キイロショウジョウバエにＳＬＰＧを注入し、ドロソマイシン・コーディング遺伝子の発現をモニタリングした（図３）。ＳＬＰＧ−注入された野生型キイロショウジョウバエは、ドロソマイシン発現を正常に誘導したが、ＰＧＲＰ−ＳＡｓｅｍｌ突然変異キイロショウジョウバエは、抗菌ペプチドの誘導が不完全であった。これは、ＳＬＰＧがDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ−依存的方法でToll経路を活性化させることを示す。これと対照的に、化学式１の化合物は、野生型及びＰＧＲＰ−ＳＡｓｅｍｌ突然変異キイロショウジョウバエいずれでもドロソマイシン発現を誘導できなかった（図３）。同様に、ＳＬＰＧは、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio）の幼虫に注入したとき、pro−ＰＯシステムの活性化によって、メラニン合成を強く誘導した（図４）。このような結果は、前記ＰＧ断片がＰＧＲＰ−ＳＡに対する多重結合部位を含み、またToll経路及びpro−ＰＯ経路を誘導できるということを示唆する。最近、Ligoxygakisらは、Toll信号伝達経路を活性化させるためには、ＰＧの還元末端（reducing ends）の数を増加させることを提案した(Filipe, S. R., Tomasz, A. & Ligoxygakis, P. (2005) EMBO Rep 6, 327-333)。ＳＬＰＧ及び化学式１の化合物はいずれも１つの還元末端を含むが、ＳＬＰＧのみがToll経路及びpro−ＰＯ経路を誘導できるので、還元末端は重要ではないと推定される。
【００６０】
（２）pro−ＰＯカスケードの活性化のためにTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの近接（proximal）結合が必要である
ＰＧ依存性pro−ＰＯカスケードの活性化のためのＳＬＰＧの最小濃度を測定した。異なる量のＳＬＰＧを有するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液中でTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質をインキュベーションしてＰＯ活性を測定した。驚くべきことに、伝統的な鐘状（bell-shaped）の容量−反応曲線を示しつつ、ＰＯ活性が高濃度のＳＬＰＧでベースライン（baseline）までひどく阻害された（図５）。また、外部のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質を反応混合物に加えたとき、最大ＰＯ活性を示すＳＬＰＧの濃度が、さらに強いＰＯ活性を有しつつ、著しく増加した（図５）。このような結果は、あまりにも多くのＳＬＰＧはTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＬｙｓ−ＰＧからなる初期活性化複合体を損傷させつつ、ＰＧＲＰ−ＳＡ分子を隔離させる競争的阻害剤として作用するということを意味する。また、Ｌｙｓ−ＰＧの結合ユニット当たりのTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの量が、pro−ＰＯカスケードのための初期活性化複合体の形成において、重要であるということを意味する（図５のインセット）。類似の結果がカブトガニFactor Ｇのβ−１，３−グルカン認識及びザリガニpro−ＰＯシステムで報告された(Muta, T., Seki, N., Takaki, Y., Hashimoto, R., Oda, T., Iwanaga, A., Tokunaga, F. & Iwanaga, S. (1995) J Biol Chem 270, 892-897;及びSoderhall, K. & Unestam, T. (1979) Can J Microbiol. 25, 406-414)。
【００６１】
Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと類似した親和性を有してＳＬＰＧに結合できる組み替えDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡを使用し、Ｌｙｓ−ＰＧ認識に対する初期活性化段階を調査したが（図４）、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡは、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio）pro−ＰＯカスケード活性化を誘導できない（図６の第三カラム）。外部Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの存在時にも、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液にDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡを加える場合、ＳＬＰＧによって誘導されるＰＯ活性は強く抑制された。このような結果は、ＳＬＰＧに対する結合されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの存在にもかかわらず、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡによって、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡのための結合部位が置換されることによって、pro−ＰＯカスケードの初期活性化複合体が破壊されるということを意味する。また、このような結果は、Ｌｙｓ−ＰＧ上のＰＧＲＰ−ＳＡのクラスタ化（clustering）、すなわちＬｙｓ−ＰＧに対するＰＧＲＰ−ＳＡの近接結合が初期活性化複合体に必要であるということを強く示唆する。
【００６２】
（３）少なくとも２個のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ分子を受け入れるＬｙｓ−ＰＧ断片がpro−ＰＯシステムを活性化させる。
いかに多くの分子のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡがpro−ＰＯシステムのための初期活性化複合体を構成しているかを確認するために、リゾチームでＳＬＰＧを部分的に分解し、多様な長さの糖鎖を有するＰＧを生成させ、サイズ排除カラム上で、それぞれの長さによって分画した（図７の（ａ）及び（ｂ））。それぞれの分画を、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質及びＣａ２＋存在下で、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液とインキュベーションしたとき、３つの分画（７，１０及び１４番目の分画）がＰＯ活性を示した。それらのうち、分画１４でのＰＧ断片がpro−ＰＯカスケード活性を誘導できる最も小さなユニットであった。過量のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質を加えた後、サイズ排除カラム上での見かけ分子量をモニタリングすることによって、いかように多くのＰＧＲＰ−ＳＡ分子が分画１４中のＰＧ断片に結合できるかを分析した。Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡと混合された分画中のＰＧ断片間の複合体の見かけ分子量は、約４０ ｋＤａと決定され、これは、ＰＧ断片が２分子のＰＧＲＰ−ＳＡに結合することを示す。ＰＧ断片／Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ複合体をTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液とインキュベーションしたとき、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを加えずともＰＯ活性を誘導し、これは、２分子のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡが前記活性を誘導するのに十分であることを示す（図９の（Ｂ））。しかし、化学式１の化合物及びリゾチームと共にＳＬＰＧを持続的にインキュベーションして生成されたムロペプチド単量体は、サイズ排除カラム上のTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ蛋白質の分子量を変化させなかった（図９の（Ｂ））。このような結果は、化学式１の化合物及びムロペプチド単量体がただ１つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子にのみ結合することを示す。化学式１の化合物が２つ（two copies）のムロペプチドを含有するにもかかわらず、化学式１の化合物が１つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子にのみ結合することは、非常に注目する価値がある。これは、化学式１の化合物上の２つの結合部位があまりにも近く位置するために、化学式１の化合物上で結合された最初のＰＧＲＰ−ＳＡ分子による立体障害から起因すると推定される。しかし、ペンタ−Ｇｌｙブリッジで架橋結合されているムロペプチド二量体は、ペンタ−Ｇｌｙブリッジが２つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子の結合のための十分な空間を提供するために、２つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子を受容すると推定される。結果的に、ムロペプチド二量体は、Toll経路の活性を誘導すると報告された一方(Filipe, S. R., Tomasz, A. & Ligoxygakis, P. (2005) EMBO Rep 6, 327-333)、化学式１の化合物は、前記に示した通り、Toll及びpro−ＰＯ経路を活性化させない。かくして、２つのＰＧＲＰ−ＳＡ分子を受容するＰＧ断片が下流のカスケード（downstream events）を誘導し、pro−ＰＯシステムを活性化させることができる最小ユニットであると結論することができる。
【００６３】
（４）リゾチームは、ＰＧ認識信号に対するＰＧの変形された形態（processed form）を提供する
ほとんどの天然のグラム陽性菌のＰＧは、ＳＬＰＧとは異なって、グリカン鎖間が高度に架橋結合されている。それらの高度な架橋結合構造によって、ＰＧＲＰ−ＳＡは、天然のＬｙｓ−ＰＧに対して接近が制限されうる。また、本発明者らがすでに報告した通り、超音波破砕（sonication）によって破壊された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧは、試験管内（in vitro）で強いＰＯ活性を示した一方、天然の不溶性Ｌｙｓ−ＰＧは、所定の時間にpro−ＰＯ活性化を誘導しなかった(Park, J. W., Je, B. R., Piao, S., Inamura, S., Fujimoto, Y., Fukase, K., Kusumoto, S., Soderhall, K., Ha, N. C. & Lee, B. L. (2006) J Biol Chem 281, 7747-7755)。昆虫の体液に存在する酵素によってＰＧ構造をゆるめる（loosen）ために、リゾチームがほとんどあらゆる形態の天然の細菌ＰＧを加水分解できる理由から(Keep, N. H., Ward, J. M., Cohen-Gonsaud, M. & Henderson, B. (2006) Trends Microbiol 14, 271-276)、本発明者らは、リゾチームを選択した。Ｓ．aureus及びＭ．luteus由来のＬｙｓ−ＰＧの部分的な分解をリゾチームを使用して試験管内（in vitro）で実施した。部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧは、チャイロゴミムシダマシ体液中で、迅速かつ強いＰＯ活性を試験管内（in vitro）で誘導した（データ未記載）。また、部分的に分解された不溶性Ｌｙｓ−ＰＧをチャイロゴミムシダマシ幼虫（Tenebrio larvae）に注入したとき、天然の不溶性Ｌｙｓ−ＰＧと比較し、さらに強くてさらに迅速なメラニン合成が注入されたあらゆる幼虫で観察された（それぞれ図１４（Ｂ）及び（Ｃ））。しかし、リゾチーム阻害剤であるＮ，Ｎ’，Ｎ’ ’−トリアセチルキトトリオースを天然のＬｙｓ−ＰＧと同時に注入したとき、いかなるメラニン合成も観察されず（図１４（Ｄ））、これは、天然のＬｙｓ−ＰＧは、リゾチームの酵素活性なしに、すなわち、リゾチームによる部分的な分解（degradation）なしでは、pro−ＰＯカスケードを活性化しえないことを示す。
【００６４】
試験管内（in vitro）でＰＧＲＰ−ＳＡによるＬｙｓ−ＰＧの認識において、リゾチームの役割を確認するために、Drosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを使用して部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧに対するＰＧＲＰ−ＳＡの結合を測定した。驚くべきことに、リゾチームによるＬｙｓ−ＰＧの部分的な分解は、ＰＧに対するDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡ及びTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの結合を大きく増加させた（それぞれ、図９（Ａ）及び（Ｂ）のレーン５及び３）。ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＰＧ間の増加した相互作用は、ＰＧにおいてＰＧＲＰ−ＳＡの近接結合を引き起こし、これは、Toll及びpro−ＰＯ経路の活性化につながる。リゾチーム類似活性を示す他の蛋白質がＰＧＲＰ−ＳＡ結合のためにＰＧを変形させることができるという可能性は排除できないが、前記の試験管内（in vitro）生化学的証拠は、リゾチームが、Toll及びpro−ＰＯ経路における不溶性Ｌｙｓ−ＰＧに対するDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡまたはTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡの接近の増進において、重要な役割を果たすということを示す。
【００６５】
最近、Drosophila ＧＮＢＰ１が弱く架橋結合されたＭ．luteusＬｙｓ−ＰＧを加水分解するが、高度に架橋結合されたＳ．aureus Ｌｙｓ−ＰＧは、加水分解できない酵素活性を有するということが報告された(Wang, L., Weber, A. N., Atilano, M. L., Filipe, S. R., Gay, N. J. & Ligoxygakis, P. (2006) EMBO J 25, 5005-5014)。Wang，Ｌ．らは、ＧＮＢＰ１がリゾチーム類似活性を有するために、Drosophila ＧＮＢＰ１がDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡによる認識のために変形された形態のＰＧを提供すると提案した。ＧＮＢＰ１の制限されたリゾチーム類似活性及び体液中のリゾチームが高度に架橋結合されたＰＧに対して活性を有するという点を考慮すれば、ＰＧの変形において、ＧＮＢＰ１は体液のリゾチームよりも低い重要性を持つといえよう。しかし、ＧＮＢＰ１の制限されたリゾチーム類似活性は、認識信号を増幅したり、またはスカベンジング（scavenging）するのに、重要な役割を行うことが可能であろう。
【００６６】
（５）Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ／ＰＧ複合体は、Tenebrio ＧＮＢＰ１及びTenebrio多重ドメインモジュラセリンプロテアーゼ（ＭＳＰ）を寄せ集める
部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧに対する重畳された（clustered）Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ分子を認識するすぐ次の段階の下流因子（downstream effectors）を同定するために、組み替えTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡを部分的に分解されたＳ．aureus ＰＧ及びＭ．luteusＰＧとインキュベーションし、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ（−）溶液に加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。その結果、Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡが部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧに結合されたとき（図１０中、レーン２及び５）、約５０ ｋＤａの蛋白質（図１０中、バンド１）及び約３５ ｋＤａの蛋白質（図１０中、バンド２）が特異的に高く示された。しかし、化学式１の化合物結合されたセファロースレジンに結合されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡは、同じ条件で、前記約５０ ｋＤａ及び約３５ ｋＤａの蛋白質を寄せ集めることができなかった（図１０中、レーン７）。このような結果は、Ｌｙｓ−ＰＧ上のＰＧＲＰ−ＳＡ分子の重畳によって、前記２つの蛋白質が寄せ集められるということを示す。また、部分的に分解されたＬｙｓ−ＰＧに結合されたDrosophila ＰＧＲＰ−ＳＡは、前記２つのチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）蛋白質と反応しなかった（図１０中、レーン３）。
【００６７】
本発明者らは、Ｌｙｓ−ＰＧ上の重畳されたTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ上に高く示された前記２つの蛋白質を同定した。前記約５０ ｋＤａの蛋白質（バンド１）は、チャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）のＧＮＢＰ１（Tenebrio ＧＮＢＰ１）であった。前記約５０ ｋＤａの蛋白質（バンド１）のＮ−末端の３０個の残基は、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）ＧＮＢＰ及びアノフェレス（Anopheles）ＧＮＢＰ１蛋白質と、それぞれ８６．７％及び５１．７％の配列相同性を示した（図１１（Ａ））。ＧＮＢＰ１は、DrosophilaにおいてToll経路の活性化のためにＰＧＲＰ−ＳＡと物理的に反応すると報告されているが(Gobert, V., Gottar, M., Matskevich, A. A., Rutschmann, S., Royet, J., Belvin, M., Hoffmann, J. A. & Ferrandon, D. (2003) Science 302, 2126-2130)、ＰＧＲＰ−ＳＡに対するＧＮＢＰ１の強い結合は、これまで報告されたことがない。本発明者らの前記発見は、ＰＧ上のＰＧＲＰ−ＳＡ分子の重畳（clustering）がＰＧＲＰ−ＳＡとＧＮＢＰ１との相互作用を増進させるということを裏づけ、ＧＮＢＰ１類似体がpro−ＰＯ経路に関与できることを裏付ける。本発明者らはまた、前記約３５ ｋＤａの蛋白質（バンド２）がＮ−末端及び内部アミノ酸配列分析を介して、多重ドメインモジュラＳＰの活性型であることを明らかにした。前記約３５ ｋＤａの蛋白質（バンド２）のＮ−末端２０個の残基は、Ｔ．castaneumセリンプロテアーゼ（Ｔｃ−ＳＰ、accession numberＸＰ＿９６７４８６、図１１（Ｂ））のセリンプロテアーゼドメインと７０．６％の配列相同性を示した。Ｔｃ−ＳＰは、低密度脂質蛋白質受容体Ａ反復（ＬＤＬａ）ドメイン、１つのsushiドメイン、１つのcomplement control protein（ＣＣＰ）ドメイン、及びＳＰドメインを含むが、Toll及びpro−ＰＯカスケードで共通的に発見されるclipドメインを含まない。前記約３５ ｋＤａの蛋白質を、非還元条件下で蛋白質中の低密度脂質蛋白質受容体Ａ反復ドメイン配列の存在を介し、さらに確認した（図１１（Ｃ））。前記約３５ ｋＤａの蛋白質をTenebrioモジュラセリンプロテアーゼと命名した。Tenebrioモジュラセリンプロテアーゼと類似したドメイン配列を示すManduca sexta体液のプロテアーゼ１４（Ｍｓ−ＨＰ−１４）がＭ．sextaでpro−ＰＯ活性化システムの開始酵素として最近報告され、これは、curdlan、zymosan及び酵母と結合し、ペプチドグリカンと反応する(Ji, C., Wang, Y., Guo, X., Hartson, S. & Jiang, H. (2004) J Biol Chem 279, 34101-34106;及びWang, Y. & Jiang, H. (2006) J Biol Chem 281, 9271-9278)。本研究で、本発明者らは、Ｍｓ−ＨＰ−１４類似セリンプロテアーゼがpro−ＰＯ経路において、ＧＮＢＰ１類似体、ＰＧＲＰ−ＳＡ及びＰＧからなる初期の活性化複合体として引き出されるということを初めて明らかにした。
【００６８】
本発明者らは、Toll及びpro−ＰＯ活性化経路の開始において、分子メカニズム（molecular events）を要約したモデルを、次の通り提案する（図１２参照）。少数のＰＧＲＰ−ＳＡ（Ｒ）分子が天然のＰＧに結合するにしても、免疫反応を活性化させられない（ａ）。グラム陽性バクテリアのＰＧは、リゾチームによって部分的に（ｂ）、または完全に（ｂ’）分解される。部分的に分解されたＰＧがバクテリア表面に結合するＰＧＲＰ−ＳＡ分子をさらにたくさん寄せ集める一方（ｂ）、完全に分解されたＰＧは、バクテリア細胞の溶解（lysis）に至るバクテリア表面上のＰＧＲＰ−ＳＡを寄せ集められない（ｂ’）。重畳されたＰＧＲＰ−ＳＡ分子は、ＧＮＢＰ１及びリポプロテインレセプタＡリピートドメイン（ＬＤＬ）を有するモジュラセリンプロテアーゼを寄せ集め、これは、モジュラセリンプロテアーゼを活性化させるようになる（ｃ）。活性化されたセリンプロテアーゼは、Toll及びプロフェノールオキシダーゼ（pro−ＰＯ）経路を活性化させるプロテオリティックカスケード（proteolytic cascede）を誘発し、これは侵襲したバクテリア周囲に抗菌性ペプチド（ＡＭＰ：anti-microbial peptide）及びメラニンを生成させる。
【００６９】
（６）Tenebrio ＧＮＢＰ１及びTenebrio ＭＳＰのｃＤＮＡクローニング及び配列分析
Tenebrio ＧＮＢＰ１ ｃＤＮＡクローニングの結果、Tenebrio ＧＮＢＰ１のポリヌクレオチドは、Metから停止コードンまでをコーディングする１，３２６個の核酸（配列番号３）からなっており、そのポリペプチドは、４４２個のアミノ酸（配列番号２）からなっていることを確認した。
【００７０】
また、Tenebrio ＭＳＰｃＤＮＡクローニングの結果、１，８９６個の核酸及び６３２個のアミノ酸からなる２つの変異体（variant）、すなわち、それぞれ配列番号４のアミノ酸配列／配列番号５のヌクレオチド配列及び配列番号６のアミノ酸配列／配列番号７のヌクレオチド配列を有する変異体が存在することを確認した。前記の通りに変異体は、得られた遺伝子が何種類かの昆虫から由来するものであるので、個体間の多形成（polymorphism）によって異なる対立形質（allele）の組み合わせが現れたために発生したと推定される。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のグラム陰性菌結合蛋白質１（Tenebrio ＧＮＢＰ１）。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３のヌクレオチド配列を有する請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−１（Tenebrio ＭＳＰ−１）。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号５のヌクレオチド配列を有する請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号６のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−２（Tenebrio ＭＳＰ−２）。
【請求項８】
配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号７のヌクレオチド配列を有する請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のペプチドグリカン認識蛋白質（Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）を検体に加え、インキュベーションする段階と、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を、段階（ａ）で得られたインキュベーション混合物に加え、インキュベーションする段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で得られたインキュベーション混合物のうち、前記蛋白質と検体との反応性を検出する段階とを含む、検体中のバクテリア感染の検出方法。
【請求項１１】
前記検体が、輸血用血液、哺乳動物の血液、野菜、肉類、果物、調理あるいは非調理の食品、水道水、地下水、雨水、又は無菌製品である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検体が輸血用血液または哺乳動物の血液である請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記検体をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ：β−lytic protease）及び／またはリゾチームで前処理する段階をさらに含む請求項１０から請求項１２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｂｌｐがアクロモバクター（Achromobacter）属微生物に由来する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アクロモバクター（Achromobacter）属微生物がアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アクロモバクター（Achromobacter）属微生物がアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｂｌｐでの前処理が、検体を約１μｇ／ｍｌ濃度のｂｌｐで処理し、約３７℃で約１４時間インキュベーションすることによって遂行される請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記リゾチームでの前処理が、検体を約１ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチームで処理し、約３７℃でインキュベーションすることによって遂行される請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１のアミノ酸配列を有するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ；及び
配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を含む、検体中のバクテリア感染の検出用キット。
【請求項２０】
前記検体が、輸血用血液、哺乳動物の血液、野菜、肉類、果物、調理あるいは非調理の食品、水道水、地下水、雨水、又は無菌製品である請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記検体が輸血用血液または哺乳動物の血液である請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記検出用キットが、溶液、凍結乾燥粉末、冷凍溶液、またはストリップ状である請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
β−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）及び／またはリゾチームをさらに含む請求項１９から請求項２２のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
（ａ’）バクテリアから分離した不溶性ペプチドグリカンを、約ｐＨ８の緩衝液に懸濁させる段階と、
（ｂ’）段階（ａ’）で得られた懸濁液をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）で処理する段階と、
（ｃ’）段階（ｂ’）で得られた反応混合物を約９５℃で約１０分間加熱し、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、
（ｄ’）段階（ｃ’）で得られた上澄み液をサイズ排除カラムで分画し、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画を回収する段階とを含む、水溶性の線形リシン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法。
【請求項２５】
前記ｂｌｐがアクロモバクター（Achromobacter）属微生物に由来する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アクロモバクター（Achromobacter）属微生物がアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アクロモバクター（Achromobacter）属微生物がアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
段階（ｂ’）が、段階（ａ’）で得られた懸濁液を約１μｇ／ｍｌ濃度のｂｌｐで処理し、約３７℃で約１４時間インキュベーションすることによって遂行される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
段階（ｃ’）で、前記遠心分離が、約１８，０００ｘｇで、約４℃の温度で約１０分間遂行される請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
段階（ｄ’）で、前記サイズ排除カラムがToyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂で充填されたカラムである請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
段階（ｄ’）から得られた分画を凍結乾燥する段階をさらに含む請求項２４に記載の方法。
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のグラム陰性菌結合蛋白質１（Tenebrio ＧＮＢＰ１）。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３のヌクレオチド配列を有する請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−１（Tenebrio ＭＳＰ−１）。
【請求項５】
配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号５のヌクレオチド配列を有する請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号６のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のモジュラセリンプロテアーゼ−２（Tenebrio ＭＳＰ−２）。
【請求項８】
配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２をコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号７のヌクレオチド配列を有する請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するチャイロゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）由来のペプチドグリカン認識蛋白質（Tenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ）を検体に加え、インキュベーションする段階と、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を、段階（ａ）で得られたインキュベーション混合物に加え、インキュベーションする段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で得られたインキュベーション混合物のうち、前記蛋白質と検体との反応性を検出する段階とを含む、検体中のバクテリア感染の検出方法。
【請求項１１】
前記検体が、輸血用血液、哺乳動物の血液、野菜、肉類、果物、調理あるいは非調理の食品、水道水、地下水、雨水、又は無菌製品である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検体が輸血用血液または哺乳動物の血液である請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記検体をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ：β−lytic protease）及び／またはリゾチームで前処理する段階をさらに含む請求項１０から請求項１２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｂｌｐがアクロモバクター（Achromobacter）属微生物に由来する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アクロモバクター（Achromobacter）属微生物がアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アクロモバクター（Achromobacter）属微生物がアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｂｌｐでの前処理が、検体を約１μｇ／ｍｌ濃度のｂｌｐで処理し、約３７℃で約１４時間インキュベーションすることによって遂行される請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記リゾチームでの前処理が、検体を約１ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチームで処理し、約３７℃でインキュベーションすることによって遂行される請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１のアミノ酸配列を有するTenebrio ＰＧＲＰ−ＳＡ；及び
配列番号２のアミノ酸配列を有するTenebrio ＧＮＢＰ１、配列番号４のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−１、及び配列番号６のアミノ酸配列を有するTenebrio ＭＳＰ−２からなる群から選択される一種以上の蛋白質を含む、検体中のバクテリア感染の検出用キット。
【請求項２０】
前記検体が、輸血用血液、哺乳動物の血液、野菜、肉類、果物、調理あるいは非調理の食品、水道水、地下水、雨水、又は無菌製品である請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記検体が輸血用血液または哺乳動物の血液である請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記検出用キットが、溶液、凍結乾燥粉末、冷凍溶液、またはストリップ状である請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
β−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）及び／またはリゾチームをさらに含む請求項１９から請求項２２のうちいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
（ａ’）バクテリアから分離した不溶性ペプチドグリカンを、約ｐＨ８の緩衝液に懸濁させる段階と、
（ｂ’）段階（ａ’）で得られた懸濁液をβ−溶菌プロテアーゼ（ｂｌｐ）で処理する段階と、
（ｃ’）段階（ｂ’）で得られた反応混合物を約９５℃で約１０分間加熱し、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、
（ｄ’）段階（ｃ’）で得られた上澄み液をサイズ排除カラムで分画し、フェノールオキシダーゼ（ＰＯ）活性を示す分画を回収する段階とを含む、水溶性の線形リシン型ペプチドグリカン（ＳＬＰＧ：soluble linearized Lys-type peptidoglycan）の製造方法。
【請求項２５】
前記ｂｌｐがアクロモバクター（Achromobacter）属微生物に由来する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アクロモバクター（Achromobacter）属微生物がアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アクロモバクター（Achromobacter）属微生物がアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５６またはアクロモバクターlyticus（Achromobacter lyticus）ＡＴＣＣ ２１４５７である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
段階（ｂ’）が、段階（ａ’）で得られた懸濁液を約１μｇ／ｍｌ濃度のｂｌｐで処理し、約３７℃で約１４時間インキュベーションすることによって遂行される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
段階（ｃ’）で、前記遠心分離が、約１８，０００ｘｇで、約４℃の温度で約１０分間遂行される請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
段階（ｄ’）で、前記サイズ排除カラムがToyopearl ＨＷ５５Ｓ樹脂で充填されたカラムである請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
段階（ｄ’）から得られた分画を凍結乾燥する段階をさらに含む請求項２４に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４（ａ）】
【図４（ｂ）】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９（Ａ）】
【図９（Ｂ）】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図３】
【図４（ａ）】
【図４（ｂ）】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９（Ａ）】
【図９（Ｂ）】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２０１０−５１７５６１（Ｐ２０１０−５１７５６１Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４８９９３（Ｐ２００９−５４８９９３）
【出願日】平成２０年２月４日（２００８．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／０００６６４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９６９９４
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５００３０９９１９）ユーハン・コーポレイション (16)
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＨＡＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月４日（２００８．２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／０００６６４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９６９９４
【国際公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【出願人】（５００３０９９１９）ユーハン・コーポレイション (16)
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＨＡＮ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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