ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコンベクターおよびパラミクソウイルスタンパク質抗原を含む免疫原性組成物
自己増殖融合ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞から産生される。ブレブの自己増殖融合性は、複製欠損レプリコン粒子中に組み入れられた、ウイルス融合タンパク質をエンコードするヘテロローガスな遺伝子の発現から誘導される。得られるブレブは、重度の細胞変性効果を示す細胞の上清から収穫することができる。ブレブは、免疫原性組成物を形成し、パラインフルエンザウイルス３型などのパラミクソウイルスに対して哺乳動物を免疫化する方法を考案するために使用される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、パラインフルエンザウイルス３型などのパラミクソウイルスにより引き起こされる感染性疾患を治療または予防するための免疫原性組成物の分野に関する。本発明はまた、宿主細胞において外来遺伝子を発現するための組み換えＤＮＡの分野および方法の分野にも関する。
【０００２】
（従来技術）
パラミクソウイルスは、その膜が非常に感染性であり、流行性であり、疾患を引き起こす封入された（−）非セグメント化一本鎖ＲＮＡウイルスである。例としては、麻疹、流行性耳下腺炎、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスが挙げられる。世界保健機構（ＷＨＯ）により麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルスを撲滅させるために協調努力がなされている。他のパラミクソウイルス、例えばニューカッスル病ウイルスは家畜集団に大損害をもたらす。
アメリカ合衆国において、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）１、２、３、および４型は、幼児ならびに成人における呼吸器疾患での入院の主な原因である。例えば、ＲＳＶおよびＰＩＶは小児における細気管支炎およびクループの症例の主な原因である。同様に、ＲＳＶおよびＰＩＶは小児における肺炎およびインフルエンザに似た疾患の症例のほぼ半分の原因である。加えて、両ウイルスは、エアロゾル液滴により伝播させることができ、従って院内感染の原因である。
【０００３】
ヒトの健康および世界経済に対するＲＳＶおよびＰＩＶの影響を軽減するための試みが３０年以上も前に始まったが、ほとんど成功していない。例えば、ＲＳＶにおけるワクチン開発は、ホルマリン不活化全ウイルスＲＳＶワクチンに関する期待はずれの結果により早期に阻まれた。この件において、ホルマリン不活化全ウイルスで免疫化された対象は免疫化後さらに重度の疾患にかかった。Ｋｉｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４２２−４３４（１９６９）参照。有効なホルムアルデヒド−不活化ＰＩＶおよびＲＳＶワクチンを作るための従来の試みは、感染症に対する適切な防御をもたらすことができなかった。Ｃｈｉｎ，Ｊ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４４９−４６３（１９６９）参照。
【０００４】
現在、２種の生弱毒化ワクチン候補、ＰＩＶ３（ＪＳ株）のコールド・パッセージ誘導体（ｃｐ４５）およびウシパラインフルエンザウイルス３型が臨床試験において評価されている。Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ，２（７）：８９０−８９２（２００１）参照。結果として、ｃｐ４５は期待できるＰＩＶ３ワクチンと考えられる。
ＲＳＶおよびＰＩＶ研究のもう一つ別の重要な態様は、依然として、高齢者また肺炎および下気道感染症などの既存の病状をもった人たちにおける合併症の予防にとどまる。この点に関して、感染した対象集団に投与するためのベクターベースの精製されたタンパク質抗原を開発することが試みられてきた。Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．，ら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １３（３）：２６−２７３ （１９９６）参照。
【０００５】
パラミクソウイルス科のウイルスのヘテロローガスな遺伝子を組み入れ、発現する能力について様々なベクターが調べられてきた。これらとしては、例えば、野生型ワクシニアまたは弱毒化修飾アンカラワクシニア（ＭＶＡ）（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０（１９９８）；Ｅｌａｎｇｏ，Ｎ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８３：１９０６−１９１０（１９８６））複製能力ヒトアデノウイルスベクター（Ｍｉｔｔａｌ Ｓ．Ｋ．，ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４１（６）：２５３−２６０（１９９８））、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｋａｈｎ Ｓ．Ｊ．、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７５（２２）：１１０７９−８７（２００１））、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）（Ｐｅｒｏｕｌｉｓ、Ｉ．ら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４４：１０７−１１６（１９９９））、ＰＩＶ１／２または麻疹ウイルスゲノムを有する有効なベクターとしてのヒトＰＩＶ３（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｍ．Ｈ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９（１）：１３６−１５２（２００２））およびヒトＰＩＶ３ゲノムを有するウシＰＩＶ３（Ｈａｌｌｅｒ Ａ．Ａ．，ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（２４）：１１６２６−３５（２０００））が挙げられる。前記ベクターの全てについての前臨床研究から、対応する病原体に対して有望な防御効果が示された。
【０００６】
ＲＳＶおよびＰＩＶ病の流行および重度およびワクチンを製造するための従来の多くの試みにもかかわらず、これらの感染症を予防するための免疫原性組成物は現在のところ存在しない。従って、ＲＳＶ、ＰＩＶおよび他のパラミクソウイルスに対して防御免疫を誘発する免疫原性組成物および方法が必要とされている。
【非特許文献１】Ｋｉｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４２２−４３４（１９６９）
【非特許文献２】Ｃｈｉｎ，Ｊ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４４９−４６３（１９６９）
【非特許文献３】Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ，２（７）：８９０−８９２（２００１）
【非特許文献４】Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．，ら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １３（３）：２６−２７３ （１９９６）
【非特許文献５】Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０（１９９８）
【非特許文献６】Ｅｌａｎｇｏ，Ｎ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８３：１９０６−１９１０（１９８６）
【非特許文献７】Ｍｉｔｔａｌ Ｓ．Ｋ．，ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４１（６）：２５３−２６０（１９９８）
【非特許文献８】Ｋａｈｎ Ｓ．Ｊ．、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７５（２２）：１１０７９−８７（２００１）
【非特許文献９】Ｐｅｒｏｕｌｉｓ、Ｉ．ら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４４：１０７−１１６（１９９９）
【非特許文献１０】Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｍ．Ｈ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９（１）：１３６−１５２（２００２）
【非特許文献１１】Ｈａｌｌｅｒ Ａ．Ａ．，ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（２４）：１１６２６−３５（２０００）
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、パラミクソウイルス、例えばＲＳＶおよびＰＩＶに対して哺乳動物を免疫化するための免疫原性組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物に関する。ある具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられた場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において。前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。特定の具体例において、ＢＨＫ培養細胞における細胞変性効果は合胞体形成、単層破壊またはアポトーシスである。さらにもう一つ別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する。ある具体例において、防御免疫反応は哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による下気道の感染を予防する。もう一つ別の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による上気道の感染の重篤度を軽減する。特定の具体例において、免疫原性組成物は医薬的に許容される担体および／またはアジュバントをさらに含む。
【０００８】
一具体例において、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物を提供する。ある具体例において、パラミクソウイルスは、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型および呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルス糖タンパク質は、パラインフルエンザウイルス１型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス１型Ｆ、パラインフルエンザウイルス２型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス２型Ｆ、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ、パラインフルエンザウイルス４型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス４型Ｆからなる群から選択される。さらにもう一つ別の具体例において、特定のパラインフルエンザウイルスのＨＮおよびＦ糖タンパク質の両方は組み合わせられ、パラインフルエンザウイルス１型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス１型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス２型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス２型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；およびパラインフルエンザウイルス４型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス４型ＨＮ糖タンパク質遺伝子から選択される。別の具体例において、パラミクソウイルスは、呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質、および／または呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質である。本発明の一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、前記レプリコン粒子に感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
【０００９】
一具体例において、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子を提供する。もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号３に示される核酸配列を有するベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質をエンコードする組換え核酸分子を提供する。別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質は配列番号１に示される核酸によりエンコードされる。特定の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質は、配列番号２；配列番号３、および配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。別の具体例において、免疫原性組成物はさらに医薬的に許容される担体および／またはアジュバントを含む。
【００１０】
一具体例において、本発明はパラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の：（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物；および（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む方法を提供する。特定の具体例において、パラミクソウイルスはパラインフルエンザウイルス３型であり、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質またはパラインフルエンザウイルス３型融合（Ｆ）糖タンパク質である。もう一つ別の具体例において、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質のどちらも含む。さらにもう一つ別の具体例において、レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合にレプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。特定の具体例において、ＢＨＫ培養細胞における細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊またはアポトーシスである。特定の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）は検出可能な複製能力ベネズエウマ脳炎ウイルスを含有しない。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルスは呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質または呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質である。別の具体例において、糖タンパク質は、呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質のどちらも含む。ある具体例において、感染は下気道においてである。一方、もう一つ別の具体例においては、感染は上気道においてである。
【００１１】
本発明はさらに、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物も提供する。特定の具体例において、ブレブは融合性である。もう一つ別の具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含む。もう一つ別の具体例において、自己増殖ブレブは、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。さらに詳細には、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、ブレブはＢＨＫ培養細胞において以下の細胞変性効果：合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスのうちの１つまたはそれ以上を誘発する。もう一つ別の具体例において、ブレブ集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。ある具体例において、自己増殖ブレブは、哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する。特定の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による下気道の感染を予防する。もう一つ別の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による上気道の感染を予防するか、または感染の重篤度を軽減する。
【００１２】
本発明の実施形態は、パラミクソウイルスによる感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法を提供する。例えば、このような１つの方法は、免疫学的に有効な量の、（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質、（ｂ）医薬的に許容される担体を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含み、前記免疫原性組成物は、免疫反応を惹起するために十分な量で投与される。ある具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含む。ある具体例において、パラミクソウイルスは、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型および呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルス糖タンパク質は、パラインフルエンザウイルス１型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス１型Ｆ、パラインフルエンザウイルス２型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス２型Ｆ、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ、パラインフルエンザウイルス４型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス４型Ｆからなる群から選択される。特定の具体例において、特定のパラインフルエンザウイルスについてのＨＮおよびＦ糖タンパク質の両方は組み合わせられ、パラインフルエンザウイルス１型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス１型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス２型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス２型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス４型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス４型ＨＮ糖タンパク質遺伝子からなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルスは呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質、および／または呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質である。もう一つ別の具体例において、ブレブは融合性である。本発明の一具体例において、ブレブはＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合にレプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
【００１３】
別の具体例において、自己増殖融合性ブレブを含む免疫原性組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。もう一つ別の具体例において、自己増殖融合性ブレブを含む免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。
本発明はまた、パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の：（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物；（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む。一具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含む。ある具体例において、前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、パラインフルエンザウイルスは、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、およびパラインフルエンザウイルス４型からなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、ＨＮ糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質であり、Ｆ糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型融合（Ｆ）糖タンパク質である。特定の具体例において、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質のどちらも含む。
【００１４】
一具体例において、本発明は、パラインフルエンザウイルス３型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に、免疫学的に有効な量の：（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物；（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む方法を提供する。もう一つ別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質は、配列番号２、配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。特定の具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を、免疫反応を惹起するために十分な量で含む。もう一つ別の具体例において、前記集団は、検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。特定の具体例において、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する
【００１５】
（図面の簡単な記載）
図１は、ＶＥＥレプリカーゼ遺伝子、ＰＩＶ３Ｆ遺伝子およびＰＩＶ３ＨＮ遺伝子を示すＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンプラスミドの図である。
【００１６】
（発明の詳細な記載）
アルファウイルスはインビボおよびエクスビボ用途のために哺乳動物および昆虫細胞遺伝子送達系として遺伝子操作されてきた。アルファウイルスゲノムは、５’非構造タンパク質（ＮＳＰ）遺伝子とそれに続く、構造遺伝子の転写を調節するサブゲノムプロモーターの２つの領域に分割される単鎖（＋）ＲＮＡからなる。ＮＳＰ遺伝子は、ウイルスコアが細胞質中に放出された直後に翻訳される。ＮＳＰ複合体は、完全長アンチゲノムおよびゲノムを合成するためのレプリカーゼとして、また構造遺伝子をエンコードするサブゲノム転写物を合成するトランスクリプターゼとして機能する。アルファウイルスの例としては、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスが挙げられる。
【００１７】
アルファウイルスの複製は、構造遺伝子に依存し；従って、これらは除去することができ、外来遺伝子をその代わりに導入することができる。このように組み換えＲＮＡを細胞中に導入すると、その結果、外来遺伝子産物の複製および発現の１ラウンドを引き起こす。従って、これらのゲノムは「自殺」ベクターまたは「レプリコン」と呼ばれる。アルファベクターで外来遺伝子を送達する２つの主な利点は：１）高レベルの発現が得られること、および２）感染した細胞のアポトーシス（すなわち、プログラムされた細胞の死）であり、この結果、免疫系を変更し、強固な免疫反応を惹起する「危険な」シグナルが生じる。
レプリコンベクターは、ｃＤＮＡとして真核細胞ｐｏｌ ＩＩプロモーターベースのプラスミド送達ビヒクル中に組み入れられた裸のＲＮＡの形態で使用することができるか、あるいは感染性ウイルス様レプリコン粒子中に封入される。レプリコンベクターの有効な送達の結果、強固な外来遺伝子発現およびプログラムされた細胞の死がもたらされる。あらゆる場合において、ベクターは１ラウンドの複製のみを受け、生ウイルスと違って細胞から細胞への拡大を停止する。
【００１８】
レプリコンシステムは、以下の米国特許：米国特許第５１８５４４０号（標題「ベネズエラウマ脳炎ウイルスをコードするｃＤＮＡクローンおよびその弱毒化突然変異体」、Ｎ．Ｌ．Ｄａｖｉｓら）；米国特許第５５０５９４７号（標題「ベネズエラウマ脳炎ウイルスにおける弱毒化突然変異」、Ｒ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎら）；米国特許第６１５６５５８号（標題「アルファウイルスＲＮＡレプリコンシステム」、Ｒ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎら）；および米国特許第６５３１１３５号（標題「アルファウイルスＲＮＡレプリコンシステム」、Ｒ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎら）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）において詳細に記載されている。
【００１９】
本発明は、レプリコン発現ベクターを送達する新規方法を記載する。ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）レプリコンベクターは、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ）のヘマグルチニン（ＨＮ）および融合（Ｆ）タンパク質を同時に発現するために遺伝子操作された。ＶＥＥレプリコン粒子（ＶＲＰ）のキャラクタライゼーションの間、レプリコンについて知られていることと反対に、このシステムは組織培養においてＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコン感染に際して感染性粒子を産生することが観察された。これらの感染性粒子は：１）ＰＩＶ３ＨＮ、Ｆ、およびＶＥＥ ＮＳＰ複合体を発現し、２）自己増殖可能であり、３）その表面上にＨＮおよびＦタンパク質を含有し、４）繰り返す凍結−解凍サイクル中ずっと安定であり、５）サイズが異質であり、その一部は０．２ミクロンフィルターを通して濾過可能であり、６）高度に免疫原性であり、そして７）ゴールデンハムスターモデルにおけるＰＩＶ感染に対する有効な免疫原性組成物として使用できた。本発明を以下に詳細に記載する。
【００２０】
これらの研究の過程において、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦ遺伝子はレプリコンベクター中にクローンされた。結果として得られるベクター（ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ）は高度に免疫原性であり、鼻内または筋肉内経路により、１×１０４感染単位（ＩＵ）もの低い投与量でＰＩＶ３感染からハムスターを防御した。ＶＲＰパッケージング中のＨＮおよびＦの同時発現の結果、大きな合胞体形成が起こり；その結果、この特定のＶＲＰの力価はパッケージング反応あたり１×１０５ＶＲＰ以上に達することはないことが観察され、力価１０４〜５は他のＶＲＰベクターよりも低い。
感染性または「自己増殖」ブレブは、細胞をＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで感染させることによるか、または細胞をＶＥＥ−Ｈ／ＨＮレプリコンベクターＲＮＡ単独でトランスフェクトすることにより生成させることができる。「感染性ブレブ」または「自己増殖ブレブ」とは、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦ遺伝子または他のウイルス融合タンパク質を表面上に有し、自己増殖可能な外膜融合性ベシクルまたは融合性粒子を意味する。「感染性ブレブ」、「自己増殖ブレブ」、および「融合性粒子」なる用語は時々交換可能に用いられる。ブレブは、免疫原性組成物として投与された場合に、１０４合胞体形成単位（ＳＦＵ）の低い投与量でゴールデンハムスターの上および下気道をＰＩＶ３感染に対して防御することができた。これらの臨床前研究から、感染性粒子はＰＩＶ３の免疫原性組成物として使用できることが示された。
【００２１】
本発明はいくつかの当座の有用性を有する。第一に、ＰＩＶ３のＨＮおよびＦ遺伝子を同時に発現するためのＶＥＥレプリコン粒子の使用。第二に、表面上にＰＩＶまたは他の融合性タンパク質／糖タンパク質を有する自己増殖ブレブを生成させるためのＶＥＥレプリコン粒子の使用。第三に免疫原としての融合性自己増殖ブレブの使用。
本発明の一具体例において、ＨＮおよびＦ遺伝子の同時発現は、ゴールデンハムスターモデルにおいてＰＩＶ３に対する免疫を生じさせるのに、いずれかの遺伝子単独、または個々の発現後の［ＨＮ＋Ｆ］の組み合わせよりも有効であることが示された。理論に限定されないが、このベクターの免疫原性は、Ｆ／ＨＮ複合体の向上された提示レベルおよび／またはより長い半減期に関連する。あるいは、感染した細胞から放出される融合性粒子またはブレブは、発現の寿命および／または感染するようになる細胞の数を増大させることができる。
【００２２】
本発明のもう一つ別の具体例において、表面上にＨＮおよびＦを含有する融合性粒子またはブレブは、ゴールデンハムスターモデルにおいてＰＩＶ感染に対して有効な免疫原性組成物でもある。約１０〜１００のブレブがインビトロで感染した細胞あたり産生され、この系を大規模産生に好適にする。ブレブは、凍結−解凍サイクルを通して安定であった。自己増殖ブレブは、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮまたはブレブで細胞を感染させるか、あるいはＶＥＥレプリコン−Ｆ／ＨＮ ＲＮＡのエレクトロポレーションにより生成させることができる。
【００２３】
本発明の一具体例は、ヘテロローガスな病原体に対して防御を与えることができる追加の１または２の遺伝子を含むことである。融合性粒子が自己増殖性であるという事実により、インビトロで生成された免疫原性組成物よりも優れた利点がもたらされる。例えば、他のウイルス（麻疹、ＳＶ５、またはＨＩＶ）から得られる他の融合性タンパク質は、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦの代わりに用いることもでき、従って免疫原性組成物のレパートリーを増大させる。
ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）から誘導されるレプリコンは、免疫原性組成物の設計のための別のベクター系を表す。ＶＥＥレプリコンは、様々な動物細胞型を感染させることができることが証明されている。ＶＥＥレプリコンは、ウイルスならびに細菌抗原の抗原送達に用いられており［Ｄａｖｉｓ Ｎ．Ｌ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０（６）：３７８１−３７８７（１９９６）；Ｌｅｅ Ｊ．Ｓ．ら、．、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１８５（８）：１１９２−６（２００２）］、樹状細胞を目標とすることにより首尾よく強力な体液性ならびに細胞性免疫を誘発する［ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｇ．Ｈ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４（２）：９１４−９２２（２０００）］。
【００２４】
ＶＥＥレプリコンは、親ベネズエラウマ脳炎ウイルスのアル特性を利用する。ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）は、トガウイルス科のアルファウイルス属のメンバーである。ウイルスゲノムは、５’末端においてメチル化キャップで、また３’末端において可変長ポリ（Ａ）トラクトで修飾された一本鎖（＋）ＲＮＡである。一本鎖ウイルスカプシドタンパク質（ｃ）を含有する構造サブユニットは、二十面体ヌクレオカプシドにおいてＲＮＡゲノムと結合する。ビリオンにおいて、カプシドは、膜貫通型タンパク質スパイクの規則的な列で覆われた脂質エンベロープにより取り囲まれており、そのそれぞれは２種の糖タンパク質Ｅ１およびＥ２のヘテロダイマー複合体からなる。Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｃ．Ｅ．およびＥｄｄｙ、Ｇ．Ａ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６８：１−１５（１９７４）参照。ＶＥＥゲノムの構成およびＶＥＥ遺伝子発現の全体的な方法は、プロトタイプアルファウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスのものに匹敵する。（概説については、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｓ．およびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｍ．Ｊ．、Ｔｈｅ Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８６）参照。）例えば、ＶＥＥのトリニダードロバ株の部分ゲノム配列の詳細は、ＶＥＥ構造タンパク質が、ウイルスゲノムの３’側１／３に相当する２６６サブゲノムｍＲＮＡからポリタンパク質の形態で翻訳されることを明らかにする。タンパク分解処理により、成熟ビリオンにおいて見いだされるタンパク質が生じる。アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子は、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４の順序でゲノムの５’側の２／３に位置する。タンパク質はまずポリタンパク質前駆体として発現され、次いでタンパク分解処理されてその成熟形態にされる。成熟非構造タンパク質は、ゲノムＲＮＡの複製および２６ＳサブゲノムｍＲＮＡの合成に必要とされる。
【００２５】
ＶＥＥゲノムは、（＋）単鎖ＲＮＡ分子からなる。これは長さ約１１ｋｂで５’−キャップ構造および３’−ポリＡテールを有する。複製は、（−）鎖ＲＮＡ中間体を経由して進行し、これは、追加のウイルスゲノムの合成およびサブゲノムｍＲＮＡの転写用テンプレートとして使用される。遺伝子送達のためのベクターとして使用される場合、ウイルスＲＮＡ複製に必要でないウイルス構造タンパク質をエンコードするゲノムの３’側１／２を削除し、興味のある抗原をエンコードする遺伝子と置換する。これらのレプリコンのパッケージングは、ＶＥＥ構造タンパク質をエンコードする欠損ヘルパーＲＮＡの共トランスフェクションにより達成される。結果として得られるレプリコン粒子は、興味のある抗原をエンコードする遺伝子を組み入れるが、もはや感染性ウイルス粒子を生成させることができない。しかしながら、レプリコンは多量のヘテロローガスな遺伝子産物の発現を行うことができ、従って、抗原を送達するための有効な手段としての働きをする。
ＶＥＥレプリコン粒子がパラミクソウイルス科ウイルスの免疫原性組成物の設計においてベクターとして使用できるかどうかを評価するために、パラミクソウイルスの免疫原性組成物に関する研究のための実験用ウイルスとしての広範囲の用途のためにＰＩＶ３ウイルスが選択された。ＰＩＶおよびＲＳＶサブユニットワクチンの開発は、個々のウイルスタンパク質それ自体の抗原性および免疫原性の理解が十分でないことにより阻害される。例えば、ＰＩＶ３ゲノムは６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、これは次の非構造内部タンパク質：ヌクレオカプシド（ＮＰ）、マトリックス（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、ラージポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質および２つの表面糖タンパク質、ヘマグルチニンノイラミニダーゼ（ＨＮ）、および融合（Ｆ）をエンコードする。ＯＲＦはまた、それぞれＲＮＡ変更および別の翻訳開始のために発現される２つの他のタンパク質ＣおよびＶもエンコードする。第三のタンパク質Ｄは、おそらくは発現されるが、このタンパク質の機能は現在のところ確認されていない。今までのところ、ＰＩＶ３感染に対する防御におけるこれらの内部タンパク質の役割についてごくわずかの情報しか得られていない。ＰＩＶ３のＮＰと約８５％の相同性を共有するＰＩＶ１の核タンパク質（ＮＰ）は、優性ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドをエンコードし、非常に強力なＭＨＣクラスＩ限定応答を誘発し、マウスをＰＩＶ１感染から防御することが証明された。さらに、ＨＮおよびＦは、ＨＮについて少なくとも６、Ｆについて８の中和部位を含有する２つの主な中和抗原である。
【００２６】
ＨＮは、内部赤血球凝集反応およびノイラミニダーゼ活性を有するＩＩ型糖タンパク質である。ＨＮは細胞に対するウイルス付着を媒介し、融合プロセスを促進する。これはシアリン酸を除去してウイルス粒子を放出させ、凝集を防止する。Ｆタンパク質はＩ型糖タンパク質であり、ウイルス浸透および合胞体形成に重要である。Ｆｏのタンパク分解開裂は、２つのジスルフィド結合で結合したサブユニットＦ１およびＦ２を生じさせ、融合活性に必要である。Ｆのインビトロ融合活性はＨＮタンパク質の存在を必要とするので、ウイルス表面上でＨＮおよびＦが共存することは、生物学的に重要であると思われる。ＰＩＶ３サブユニットを含有する免疫原性組成物に関する臨床前研究から、ＨＮおよびＦを予防御抗体として用いる重要性に関するデータが得られた。
【００２７】
一般に、パラミクソウイルス、例えばパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する免疫原性組成物の設計は、下気道（ＬＲＴ）における感染を予防するために行われる。例えば、アジュバントの援助を受けて精製された、またはベクター発現されたＰＩＶ３ＨＮタンパク質は、動物モデルにおけるＬＲＴに対して防御を提供し、一方、精製またはベクター発現Ｆタンパク質は、部分的に防御を提供するか、または全く提供しなかった。組み換えＨＮおよびＦの組み合わせまたはキメラタンパク質Ｆ／ＨＮを用いる方法は、ＬＲＴ感染に対して防御を示した。研究は、ＨＮおよびＦタンパク質を同時に発現するＶＲＰを構築するために本明細書において記載されたようにして開始した。強力な有効性に潜在的に寄与し得る新規特性を有する有効なＶＥＥベースのＰＩＶサブユニット免疫原性組成物を本明細書において記載する。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、「感染性ブレブ」または「自己増殖ブレブ」、または「ブレブ」なる用語は、自己増殖できる、表面上にＰＩＶ３ＨＮおよびＦ遺伝子（または他のウイルス融合タンパク質）を有する外膜融合性ベシクルを意味する。「感染性ブレブ」、「自己増殖ブレブ」、ブレブ、および「融合性粒子」なる用語は、時々交換可能に用いられる。自己増殖は、ブレブ表面上の融合タンパク質を介してタンパク質により行われる。しかしながら、ブレブは、レプリコンＲＮＡも含有するので、新規細胞との融合に際して、レプリコンＲＮＡは転写され、融合タンパク質が細胞表面上に発現され、プロセスが再び開始される。本発明の自己増殖ブレブは、ＰＩＶ３に対する免疫原性組成物として有効であることが示された。約１０〜１００の自己増殖ブレブがインビトロで感染細胞あたり産生され、このシステムを大規模産生に好適にする。自己増殖ブレブは凍結−解凍サイクル全体にわたって安定であった。自己増殖ブレブは、細胞をＶＲＰ−Ｆ／ＨＮでまたは融合性粒子で感染させるか、またはＶＥＥレプリコン−Ｆ／ＨＮ ＲＮＡのエレクトロポレーションにより生成された。感染性ブレブが自己増殖性であるという事実により、インビトロで生成したサブユニットタンパク質よりも優れた利点がもたらされる。
【００２９】
「アルファウイルス」なる用語は、当該分野におけるその通常の意味を有し、アルファウイルスの様々な種、例えばイースタンウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ウェスタンウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、シンドビスウイルス、南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６、セムリキ森林熱ウイルスなどが挙げられる。概論に関しては、Ｆｉｅｌｄ’ｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第４版、第３０章：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ ｐｐ． ９１７−９６２ ｂｙ Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｄ．Ｅ．、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。本発明のける使用に好ましいアルファウイルスＲＮＡ転写物としては、ＶＥＥ、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスが挙げられる。
【００３０】
本発明の方法において用いられるアルファウイルス許容細胞は、ウイルスＲＮＡ転写物でのトランスフェクションに際してウイルス粒子を産生できる細胞である。アルファウイルスは、広い宿主範囲を有する。好適な哺乳動物宿主としては、これらに限定されないが、ベロ細胞、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞およびアカゲザル腎臓細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）が挙げられる。
ＶＲＰをＢＨＫ−２１系からの細胞において増殖させた。この場合において、ＢＨＫ細胞は、擬似表現型特性を共有しない他のＢＨＫクローン集団から区別するために、ＣＣＬ−１０クローンから誘導された。本発明において定義されるように、細胞はＢＨＫ２１または単にＢＨＫ細胞と称する。
本明細書において用いられるように「非構造タンパク質」または「ＮＳＰ」なる用語は、レプリコンのポリメラーゼ機能を意味する。例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）において、ポリメラーゼ機能は、１つのポリタンパク質として翻訳されたＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４タンパク質により提供される。非構造タンパク質遺伝子は、自律性複製のためのレプリコンＲＮＡの一部として必要とされる。
【００３１】
本明細書において用いられる「構造タンパク質」または「アルファウイルス構造タンパク質」なる語句は、ＲＮＡレプリコンの複製に必要とされるエンコードされたタンパク質を意味し、カプシドタンパク質、Ｅ１糖タンパク質、およびＥ２糖タンパク質を包含する。本明細書において記載されるように、アルファウイルスの構造タンパク質は、１以上のヘルパーＲＮＡ（すなわち、第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡ）上でエンコードされる。加えて、少なくとも１つの構造タンパク質をエンコードする領域がレプリコンＲＮＡから欠失しているので、前記レプリコンおよび結果として得られるアルファウイルス粒子が複製欠損であるとするならば、１以上の構造タンパク質を、レプリコンＲＮＡとして同じＲＮＡ分子上でエンコードすることができる。本明細書において用いられる場合、「欠失した」または「欠失」なる用語は、特定の核酸セグメントの全体的な欠失または特定のセグメントを標準的用法にしたがって操作不能または非構造的にするために十分な前記セグメントの部分の欠失を意味する。例えば、米国特許第４６５０７６４号（Ｔｅｍｉｎら）参照。本明細書において用いられるように「複製欠損」なる用語は、レプリコンＲＮＡがヘルパーＲＮＡの不在下で宿主細胞において新規ウイルス粒子を形成できないことを意味する。レプリコンＲＮＡは複製に必要なアルファウイルス構造タンパク質の全てをエンコードするわけではないので、レプリコンＲＮＡは複製欠損であり、必要とされる構造タンパク質の少なくとも１つがここから欠失している。
【００３２】
感染性複製欠損アルファウイルス粒子を発現するためのヘルパー細胞は、上述のように１組のＲＮＡを含む。ＲＮＡの組は、第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡを含む。第一ヘルパーＲＮＡは、少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするＲＮＡを含むが、すべてのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするわけではない。言い換えれば、第一ヘルパーＲＮＡは少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードせず；少なくとも１つのコードされないアルファウイルス構造タンパク質が第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。一具体例において、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質が第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。もう一つ別の具体例において、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ２糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ１糖タンパク質が第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。第三の具体例において、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質は第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。
【００３３】
第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡによりエンコードされる少なくとも１つの構造タンパク質と異なる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするＲＮＡを含む。従って、第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡによりエンコードされる少なくとも１つの構造タンパク質によりエンコードされない少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードする。第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡによりエンコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードせず、従って第一および第二のヘルパーＲＮＡは二重構造タンパク質をエンコードしない。第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡによりエンコードされるものと異なる構造タンパク質をエンコードする。第一ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ１糖タンパク質のみをエンコードするＲＮＡを含む具体例において、第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡから欠失しているアデノウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質の一方または両方をエンコードするＲＮＡを含み得る。第一ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ２糖タンパク質のみをエンコードするＲＮＡを含む具体例において、第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡから欠失しているアルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ１糖タンパク質の一方または両方をエンコードするＲＮＡを含み得る。第一ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質の両方をエンコードするＲＮＡを含む具体例において、第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡから欠失しているアルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするＲＮＡを含み得る。
【００３４】
一具体例において、パッケージングセグメントまたは「カプシド化配列」は、少なくとも第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。もう一つ別の具体例において、パッケージングセグメントは、第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーの両方から欠失している。
パッケージングセグメントが第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーの両方から欠失している具体例において、好ましくは、ヘルパー細胞は第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡに加えてレプリコンＲＮＡを含有する。レプリコンＲＮＡは、パッケージングセグメントおよび挿入されたヘテロローガスなＲＮＡをエンコードする。挿入されたヘテロローガスなＲＮＡは、ウイルス融合タンパク質をエンコードするＲＮＡ、または融合活性を生じさせるために必要なタンパク質、または融合活性を媒介できるペプチドをエンコードするＲＮＡである。典型的には、挿入されたヘテロローガスなＲＮＡは、タンパク質またはペプチドをエンコードし、これは望ましくは宿主、アデノウイルス許容細胞または自己増殖ブレブの融合パートナーにより発現され、前記細胞における前記タンパク質またはペプチドの発現に必要なプロモーターおよび調節セグメントを含む。好適な挿入されたヘテロローガスなＲＮＡの例としては、これらに限定されないが、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスをはじめとする広範囲のウイルスから得られるウイルスＲＮＡが挙げられる。
【００３５】
挿入されたヘテロローガスなＲＮＡを提供するために使用できる好適なウイルスＲＮＡ遺伝子の例としては、これらに限定されないが、パラインフルエンザウイルス１〜４型のＨＮおよびＦ遺伝子、特にパラインフルエンザウイルス３型のＨＮおよびＦ、インフルエンザヘマグルチニン遺伝子、インフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子、レンチウイルス糖タンパク質エンベロープ遺伝子、ＨＩＶエンベロープｇｐ１６０遺伝子、およびＨＩＶマトリックスカプシド融合遺伝子が挙げられる。本発明のもう一つ別の具体例において、挿入されたヘテロローガスなＲＮＡは、呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質または呼吸器合胞体ウイルスＦおよびＧタンパク質の両方をエンコードする。
【００３６】
一具体例において、レプリコンＲＮＡ、第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡは、第一分子、すなわちレプリコンＲＮＡが、パッケージングセグメントをエンコードするＲＮＡおよび融合活性をエンコードする挿入されたヘテロローガスなＲＮＡを含み、第二の分子、すなわち第一ヘルパーＲＮＡが、必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも１つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないＲＮＡを含み、第三の分子、すなわち第二のヘルパーＲＮＡが、必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも１つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないＲＮＡを含むように、独立した分子上に提供される。例えば、本発明のもう一つ別の具体例において、ヘルパー細胞は、（ａ）アルファウイルスパッケージング配列をエンコードするＲＮＡおよび融合活性をエンコードする挿入されたヘテロローガスなＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡ、（ｂ）アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含む第一ヘルパーＲＮＡ、ならびに（ｃ）アルファウイルスＥ１糖タンパク質、アルファウイルスＥ２糖タンパク質およびカプシドタンパク質が宿主細胞において集合してアルファウイルスレプリコン粒子を形成するように、アルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするＲＮＡを含む第二のヘルパーＲＮＡを含むＲＮＡの組み合わせを含む。
【００３７】
別の具体例において、レプリコンＲＮＡおよび第一ヘルパーＲＮＡは、別の分子上にあり、レプリコンＲＮＡおよび第二のヘルパーＲＮＡは１つの分子上に一緒にあるので、第一分子、すなわち第一ヘルパーＲＮＡは必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも１つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないＲＮＡを含み、第二の分子、すなわちレプリコンＲＮＡおよび第二のヘルパーＲＮＡは、パッケージングセグメント、挿入されたヘテロローガスなＤＮＡおよびカプシドタンパク質をエンコードするＲＮＡを含む。従って、カプシドタンパク質は、第二のヘルパーＲＮＡによりエンコードされるが、第二のヘルパーＲＮＡはレプリコンＲＮＡと一緒に第二の分子上に位置する。例えば、本発明の一具体例において、ヘルパー細胞は：（ａ）アルファウイルスパッケージング配列、挿入されたヘテロローガスなＲＮＡ、およびアルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡ、および（ｂ）アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含む第一ヘルパーＲＮＡを含む一組のＲＮＡを含むので、アルファウイルスＥ１糖タンパク質、アルファウイルスＥ２糖タンパク質およびカプシドタンパク質は宿主細胞において集合してアルファウイルス粒子を形成する。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「細胞変性効果（ＣＰＥ）」なる用語は、個々の培養された細胞またはウイルス感染による細胞において誘発される著しい形態上の変化を意味する。一般に、ＣＰＥは光学顕微鏡下で容易に見ることができる。ＣＰＥは、これらに限定されないが、以下の細胞現象を包含する：合胞体形成、単層破壊、円形化、収縮、屈折率の増大、融合、凝集、付着性の損失または溶解。これらの現象は、特定のウイルス、細胞型および状態に応じて単独または組み合わせで起こり得る。
【００３９】
本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含むことができる。アジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与された場合に免疫反応を向上させる物質である。これらに限定されないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５７２３１２７号参照）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（およびその突然変異形態）、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（例えば、米国特許第５０７８９９６号参照）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦ、および腫瘍壊死因子αおよびβをはじめとする多くのサイトカインまたはリンホカインが免疫調節活性を有することが証明されており、従ってアジュバントとして使用することができる。本発明において有用なさらに別のアジュバントとしては、これらに限定されないが、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳをはじめとするケモカインが挙げられる。付着分子、例えばセレクチン、たとえはＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンもアジュバントとして有用である。さらに別の有用なアジュバントとしては、制限なく、ムチン様分子、例えばＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１、インテグリン科のメンバー、例えばＬＡＦ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５、イムノグロブリン超科のメンバー、例えばＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭｓ、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３、副刺激分子、例えばＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、表皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮成長因子をはじめとする成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６をはじめとするレセプター分子が挙げられる。さらに別のアジュバント分子としては、カスパーゼ（ＩＣＥ）が挙げられる。国際特許公開番号ＷＯ９８／１７７９９およびＷＯ９９／４３８３９（本発明の一部として参照される）を参照。
【００４０】
免疫反応を向上させるために使用される好適なアジュバントとしては、制限なく、ＭＰＬ（３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピッド；Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（米国特許第４９１２０９４号（本発明の一部として参照される）に記載）が挙げられる。合成リピッドＡ類似体またはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはＣｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）から入手可能であり、米国特許第６１１３９１８号（本発明の一部として参照される）に記載されているその誘導体または類似体もアジュバントとしての使用に好適である。このようなＡＧＰの１つは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（５２９とも称する（以前はＲＣ５２９と称していた）である。この５２９アジュバントは、水性形態として、または安定なエマルジョンとして処方される。
【００４１】
さらに他のアジュバントとしては、鉱物油および水エマルジョン、アルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリアクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死菌ボルデテラ、サポニン、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ．）（米国特許第５０５７５４０号（本発明の一部として参照される）に記載）、およびこれから生じる粒子、例えばＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌リポ多糖類、合成ポリヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（米国特許第６２０７６４６号（本発明の一部として参照される）に記載）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはイー・コリ易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９が挙げられ；例えば国際特許公開番号ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５参照。
【００４２】
国際特許公開番号ＷＯ００／１８４３４に記載されているもの（アミノ酸位２９のグルタミン酸が別のアミノ酸（アスパラギン酸以外）、好ましくはヒスチジンにより置換されているもの）を包含するコレラ毒素およびその突然変異体もアジュバントとして有用である。同様にＣＴ毒素または突然変異体は、公開国際特許出願番号ＷＯ０２／０９８３６８（アミノ酸位１６のイソロイシンが別のアミノ酸により、単独またはアミノ酸位６８のセリンの別のアミノ酸による置換と組み合わせて置換されている；および／またはアミノ酸位７２のバリンが別のアミノ酸により置換されている）に記載されている。他のＣＴ毒素は、公開国際特許出願番号ＷＯ０２／０９８３６９（アミノ酸位２５のアルギニンが別のアミノ酸により置換されている；および／またはアミノ酸がアミノ酸位４９に挿入されている；および／または２つのアミノ酸がアミノ酸位３５および３６で挿入されている）に記載されている。
【００４３】
実施例
本発明を以下の実施例により説明する。しかしながら、本明細書のどこにおいてもこれらまたは他の実施例の使用は例示のみであり、本発明の範囲および意味または任意の例示された用語を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書に記載されている特定の具体例に限定されない。実際、本発明の多くの修飾および変更は、本明細書を読むと当業者には明らかであり、その精神および範囲を逸脱することなく行うことができる。
【００４４】
実施例１：ＰＩＶタンパク質を発現するＶＲＰのプラスミド構築
本発明は、ヒトＰＩＶ−３をモデルパラインフルエンザウイルスとして使用する。ヒトＰＩＶ３ウイルスストック（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ４７８８５／５７株）を既に記載されているようにして調製した。Ｓｔｏｋｅｓ、Ａ．ら、 Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：９１−１０３（１９９２）参照。ウイルスストックをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈降により精製した。Ｔｒｉｚｏｌ−ＬＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりＲＮＡを抽出し、Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いた逆転写ＰＣＲのテンプレートとして使用した。５’Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含むＮ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、ＨＮ、およびＦのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体にわたるフラグメントを増幅するためにプライマーを使用した。得られたフラグメントを次いで次の制限エンドヌクレアーゼで消化した：ＦについてＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ、ＨＮについてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ、ＮＰについてＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ、ＰおよびＣについてＡｃｃＩおよびＸｂａＩ、ならびにＭについてＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ。得られたフラグメントをシャトルプラスミドｐＫＳＲ１中にクローンした。その後、シャトルプラスミドから得られるＡｐａＩ−ＯＲＦ−ＮｏｔＩカセットを、ＶＥＥＶ ２６サブゲノムプロモーターの下流で、その制御下にあるｐＶＲ２００中にサブクローンして、レプリコン発現プラスミドｐＶＲ（ＮＰ）、ｐＶＲ（Ｐ）、ｐＶＲ（Ｍ）、ｐＶＲ（Ｃ）、ｐＶＲ（Ｆ）およびｐＶＲ（ＨＮ）を生成させた。
【００４５】
２つのＰＩＶ遺伝子を含有するレプリコンを生成させるために、第二のＡｐａＩ−ＯＲＦ（ＨＮ）−ＮｏｔＩカセットをＦ遺伝子の下流のｐＶＲ（Ｆ）プラスミド中にサブクローンし、２つの外因性遺伝子を含有するレプリコンプラスミドｐＶＲ−Ｆ／ＨＮを生成させた。図１参照。加えて、ＶＥＥカプシドタンパク質（ｐＶ３０１４ｄｅｌｔａ５２０−７５０５ｄｅｌｔａ８４９５−１１２２９）または表面糖タンパク質ｇｐＥ１／Ｅ２（ｐＶ３０１４ｄｅｌｔａ５２０−７５０５ｄｅｌｔａ７５６５−８３８６）を発現できる２つのヘルパープラスミドをレプリコンパッケージングに使用した。Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１（１９９７）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。ダイターミネーターサイクルシーケンシングおよび３７７ＡＢＩ ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて得られるプラスミドを配列決定した。
【００４６】
実施例２：ＶＲＰ産生
この実施例は、実施例１において構築されたプラスミドからＲＮＡをＢＨＫ２１細胞中にエレクトロポレーションすることによりＰＩＶ３の抗原のそれぞれを発現するＶＲＰがどのように生成したかを説明する。もとのＶＥＥプラスミドｐＶＲ１００、および２つのヘルパープラスミドｐＨＣ（カプシド）およびｐＨＣ（ｇｐＥ１／Ｅ２）をＡｌｐｈａＶａｘ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）から入手した。Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１（１９９７）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。ＰＩＶ３糖タンパク質遺伝子のＲＴ−ＰＣＲフラグメントをｐＶＲ２００中に個々にまたはｐＶＲ１００中に（ＨＮとＦ一緒に）クローンした。生成したプラスミドを次いでインビトロ転写に付して、ＲＮＡを生成させた。ＲＮＡを次いでＢＨＫ２１細胞中にエレクトロポレーションして、ＮＰ、Ｍ、Ｐ、Ｃ、Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子（ＶＲＰ−ＮＰ、−Ｍ，−Ｐ，−Ｃ、−ＨＮ、−Ｆ、−Ｆ／ＨＮ）のいずれかをそれぞれエンコードするＶＲＰを生成させた。
【００４７】
個々のＰＩＶ遺伝子を得、これらを適当な発現ベクター中にクローンした後、ＮｏｔＩ直線化プラスミドテンプレートおよびｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてキャップされたＲＮＡ転写物を次いでインビトロで調製した。製造業者の指示に従って反応を行った。いずれかのプラスミドｐＶＲ（ＮＰ）、ｐＶＲ（Ｍ）、ｐＶＲ（Ｐ）、ｐＶＲ（Ｃ）、ｐＶＲ（ＨＮ）、ｐＶＲ（Ｆ）、ｐＶＲ（ＨＮ）＋ｐＶＲ（Ｆ）、またはｐＶＲ−Ｆ／ＨＮから得られる５０μｇの各ＲＮＡを、ヘルパープラスミドから得られる５０μｇのＲＮＡと共にＢＨＫ２１細胞中にエレクトロポレーションすることによりレプリコン粒子産生細胞を生成させた。Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１（１９９７）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。処理されたＢＨＫ細胞を次いでＴ−１７５フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培地は、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）と高グルコース、１０％ウシ胎仔血清および１％ピルビン酸ナトリウムから構成されていた。次に、培養上清をエレクトロポレーション後４８時間に収穫し、３２００ｒｐｍで遠心分離することにより清澄化させた。ＶＲＰをＰＢＳ中に再懸濁させ、ＢＨＫ２１細胞を感染させ、適当なＰＶＩ３特異性抗体を用いて免疫染色することにより力価を決定した。
【００４８】
実施例３：ＶＲＰおよびＰＩＶのウイルス価
ＰＩＶタンパク質および糖タンパク質を発現するＶＥＥレプリコン（ＶＲＰｓ）を免疫組織化学法により滴定した。ＶＲＰをＢＨＫ−２１系中で増殖させた。この場合、ＢＨＫ細胞は、擬似表現型特性を共有しない他のＢＨＫクローン集団から区別するために、ＣＣＬ−１０クローンから誘導された。本明細書において定義されるように、細胞はＢＨＫ２１または単にＢＨＫ細胞と称する。ＢＨＫ２１単層を連続希釈されたＶＥＥレプリコン：ＶＲＰ−ＮＰ；ＶＲＰ−Ｐ；ＶＲＰ−Ｍ；ＶＲＰ−Ｃ；ＶＲＰ−ＨＮ；ＶＲＰ−Ｆ； ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮおよびＶＲＰ−ＧＦＰで感染させ、３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。単層を次いで１：１アセトン／メタノールで５分間固定し、細菌から発現されたウサギ抗ＶＥＥ ＮＳＰ１タンパク質、ポリクローナルＡｂ ｒ８３５またはウマ抗ＰＩＶ３血清のいずれかで染色した。ｃｙＴＭ３接合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）またはホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＯＵＲＰ）接合抗ウマＡｂ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＭＤ）＋アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）パーオキシダーゼ基質キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）の何れかによりプラークを次いで検出した。プラークの数を顕微鏡下で計測し、ＶＥＥレプリコンについては１ｍｌあたりの感染単位（ｉｕ／ｍｌ）として、またはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコン感染から生じた二次感染粒子については１ｍｌあたりの合胞体形成単位（ｓｆｕ／ｍｌ）として記録した。
【００４９】
ＰＩＶ３ Ｗａｓｈ４７８８５／５７ウイルスストックまたは組織ホモジネートを、記載されているような修飾Ｈｅｍａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ検定（ＨＡＤ）プロトコルにより測定した。Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２ （１９９７）；Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０ （１９９８）参照。簡単に説明すると、１０倍連続希釈されたサンプルをＬＬＣ−ＭＫ２単層の９６穴プレート中、３７℃で滴定した。培養中、上清を６〜７日後に集め、０．５％モルモット赤血球を用いたＨＡ検定に付した。サンプル１ｍｌあたりの平均Ｌｏｇ１０ＴＣＩ５０を計算した。
【００５０】
実施例４：動物免疫化および攻撃
非免疫ハムスターの特定のＰＩＶタンパク質を発現するＶＲＰレプリコンでの免疫化は、その後のＰＩＶ感染からの防御免疫を惹起する。ＰＩＶ３に対して血清反応陰性の５〜８週令のゴールデンハムスターをＶＥＥレプリコン：ＶＲＰ−ＮＰ；ＶＲＰ−Ｐ；ＶＲＰ−Ｍ；ＶＲＰ−Ｃ（ＰＩＶ−３タンパク質ＮＰ、Ｐ、Ｍ、ＰＩＶ３のＣまたはＧＦＰを対照として発現）で、鼻内（ｉ．ｎ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）のいずれかで免疫化した。用量を表１に示す。動物を初期免疫化の３週間および５週間後に同じ用量（表１）で追加免疫した。７週間後に、ハムスターを１×１０６ＬｏｇＴＣＩＤ５０のＰＩＶ３（Ｗａｓｈ４７８８５／５７ウイルス株）で攻撃した。攻撃後４日に、鼻介骨および肺組織を集め、均質化した。Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２ （１９９７）；Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０ （１９９８）参照。これらのホモジネートにおけるＰＩＶ３複製を前記実施例３において記載されているようにしてＨＡＤアッセイにより分析した。全てのゴールデンハムスターおよびＢＡＬＢ／ｃマウスはチャールズ・リバー・ラボラトリー（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、現行のＮＩＨの“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，”および連邦政府および州法およびＷｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓにより維持されている現在行われている手順に従って飼育した。
本発明の一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために使用される場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明のもう一つ別の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
【００５１】
【表１】
【００５２】
ハムスターはＰＩＶ３複製およびＶＥＥ感染を支持する最小の動物モデルであるので、実験モデルとしてハムスターを使用して、ＰＩＶ３の内部タンパク質が動物においてＰＩＶ３感染に対して防御を提供する能力を調査した。Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０ （１９９９）参照。表１は、免疫化および攻撃後のＬＲＴおよびＵＲＴにおいて得られるウイルス価を示す。ｉ．ｎ．またはｉ．ｍ．により投与された１×１０６〜１×１０７ｉ．ｕの範囲の用量でＮＰ、Ｐ、Ｍ、またはＣのいずれかを発現した全てのＶＲＰは、ＶＲＰ−ＧＦＰおよびＰＢＳ群と比較して明らかな防御を示さなかった（表１）。生弱毒化ＰＩＶ３ウイルスであるｃｐ４５のみが、ハムスターをＰＩＶ３感染から防御できた。従って、内部タンパク質ＮＰ、Ｐ、Ｍ、およびＣはＰＩＶ３に対する免疫原性組成物中に封入するための候補としての効率をほとんどまたは全く有さないと結論づけられた。
【００５３】
ＶＲＰ発現ＨＮおよび／またはＦの防御を提供する能力を次に調べた。ハムスターを同じスケジュールおよび表２に示す用量で免疫化した。表２に示される結果は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化動物のみがＵＲＴにおいてほとんど完全に防御されたことを示す。ＶＲＰ−ＨＮ単独で免疫化されたハムスターは、ＵＲＴにおいて約１００倍ウイルス価が減少した。ハムスターをＶＲＰ−Ｆ／ＨＮではなくＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆでｉ．ｎ．免疫化すると、ＵＲＴにおいて１０倍しかウイルス複製が減少しなかった。さらに、ＶＲＰ−Ｆ免疫化は、ＵＲＴにおいて血清中和価および防御を惹起せず、ＬＲＴにおいてウイルス複製が１０倍だけ減少した（表２、実験１）。従って、ｉ．ｎ．免疫化により、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮを含む免疫原性組成物は、有意なレベルの中和価、ならびにＬＲＴにおいてＰＩＶ３感染に対する完全な防御を誘発し、ＵＲＴにおいてＰＩＶ３感染の重篤度を軽減した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
一般に、筋肉内免疫化は、ＰＩＶ３に対する防御免疫の惹起において鼻内免疫化よりも有効でない。例えば、筋肉内（ｉ．ｍ．）によりＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆで免疫化された動物は、ＬＲＴにおいてその後の攻撃感染から完全な防御をもたらしたこれらのレプリコンでの鼻内免疫化と比べて、約３ｌｏｇ１０ＬＲＴにおいてウイルス価が減少した（表２、実験１）。
ここでも、最も有効な免疫原性は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで得られ、これはｉ．ｍ．およびｉ．ｎ．免疫化のどちらについてもＬＲＴにおけるその後の攻撃感染から完全な防御をもたらした（表２、実験２）。完全な防御は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ以外のＶＲＰを用いたｉ．ｍ．免疫化により達成されなかった（表２）。
データから、ｉ．ｍ．免疫化によりＵＲＴにおいてウイルス価の減少および感染の重篤度の軽減という形態での一連の防御が可能であることが示された。特に、ＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ、ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆを用いた筋肉内免疫化の結果、ＰＢＳ対照と比較して約１０倍〜約１００倍の範囲でウイルス価が減少した（表２、実験１および２）。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮは、ｉ．ｎ．免疫化ほど有効でないが、ｉ．ｍ．により投与された場合にＬＲＴ感染に対して防御するための最良の候補であった。
【００５６】
実施例４’：ＰＩＶに対する体液性応答
Ａ．ＰＩＶ３特異性Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ：
マウスのリンパ節におけるＰＩＶ３特異性Ｉｇ分泌細胞をＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。簡単に説明すると、免疫化マウスのリンパ節から得られる単細胞懸濁液を、３７℃、５％ＣＯ２中、一夜、１００ｎｇの製剤で分裂させたＰＩＶ３ウイルスでコートされた９６穴イムロンＩＩプレート上（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｍａｓｓ．）でインキュベートした。細胞を次いで洗浄し、プレートに結合したＰＩＶ３−特異性全ＩｇまたはＩｇＡを、それぞれアルカリホスファターゼ接合体ヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡの混合物またはＩｇＡ単独により検出した。スポットを次に、アルカリホスファターゼ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて展開させ、Ｏｌｙｍｐｕｓ解剖顕微鏡（Ｌｅｅｄｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， Ｍｉｎｎ．）下で計測することにより定量化した。結果を１ｘ１０６細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として記録する。
【００５７】
Ｂ．ウイルス中和検定
ハムスター血清がＰＩＶ３ウイルス粒子を中和する能力を、ヘマグルチン化阻害検定（ＨＩ）により測定した。簡単に言うと、熱不活化血清を、レポーター破壊酵素（ＲＤＥ）（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）で１８〜２０時間３７℃で処理して、０．４％モルモットＲＢＣ（ｇｐＲＢＣ）で４℃で１時間インキュベートすることにより非特異性アグルチニンをさらに除去する前に、非特異性阻害剤を除去した。０．５％ｇｐＲＢＣを凝集させるために、ＰＩＶ３ウイルスの４ＨＡ単位を阻害するために、連続希釈処理された血清の終点を次に決定した。
ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮの示された保護有効性が、その保護効果の調査につながった。呼吸器病原体からの防御は、一般に粘膜免疫と関連する。したがって、肺または鼻のいずれかを排液する縦隔リンパ節（ＭＬＮ）および頚部リンパ節（ＣＬＮ）におけるＩｇＡ産生細胞の誘発を評価した。この場合、ハムスターの適当な検出試薬が入手できなかったので、マウスモデルを使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ハムスターについてと同じ免疫化スケジュールにしたがってＶＲＰ−ＨＮまたはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで免疫化した（ｉ．ｎ．）。個々のＣＬＮを集め、ＭＬＮをプールした。単細胞懸濁液をＬＮから調製し、全Ｉｇ分泌細胞またはＩｇＡ分泌細胞をＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ技術により分析した。
【００５８】
ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮでの免疫化は、他のＶＲＰでの免疫化と比較して高レベルの抗原特異性ＩｇＡを誘発した。例えば、ＶＲＰ−ＨＮでの免疫化は、ＣＬＮにおいてＰＩＶ３特異性Ｉｇ分泌細胞１ｘ１０６個あたり約８００ＳＦＣを誘発した。これらのうち、わずか約１０％のＩｇ分泌細胞がＰＩＶ−３特異性ＩｇＡ分泌細胞であった（１ｘ１０６細胞あたり１００ＳＦＣ未満）。対照的に、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化は、ＣＬＮにおいて１ｘ１０６個のＰＩＶ３特異性Ｉｇ−ＳＦＣあたり約４００ＳＦＣを誘発した。重要なことに、抗原特異性ＩｇＡ ＳＦＣの数は、ＶＲＰ−ＨＮ（１ｘ１０６細胞あたり約２５０ＳＦＣ）よりもパーセンテージ基準でずっと多かった。この場合、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化群におけるＩｇ分泌細胞の６０％より多くがＩｇＡであった。従って、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮはＵＲＴにおける抗原特異性ＩｇＡ産生を優先的に誘発し、これはより良好な防御効率と相関した（表２）。
【００５９】
ＭＬＮにおいて、ＰＩＶ−３特異性全Ｉｇ分泌細胞またはＩｇＡ分泌細胞の量は、ＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化の両方について類似し、両免疫化がハムスターのＬＲＴにおけるウイルス複製を完全に除去したという事実と一致した（表２）。
ウイルス攻撃後の防御免疫における中和抗体の役割を調べた。血清サンプルをＰＩＶ３攻撃の２日前に集め、ＰＩＶ中和価を測定した。表２は、中和価は、ＰＢＳ対照群において検出されず、ＬＲＴおよびＵＲＴにおけるウイルス複製はそれぞれ５．８±０．４および５．２±０．２のレベルまでであったことを示す。全実験群のうち、ＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ、またはＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−Ｆの組み合わせ（ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ）の免疫化により、著しいレベルのＨＩ価が誘発され、それぞれ６．３、７．１、および７．５のレベルに達し、これはｃｐ４５免疫化群（データは省略）に匹敵し、ＬＲＴにおいて完全な防御を示した。
【００６０】
実施例５：ＰＩＶ防御の最小投与量
有効な防御のために必要なＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化の最小投与量を評価した。２ｘ１０４ｉｕの用量でのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮは、ｉ．ｎ．投与された場合に、感染からＬＲＴを防御し、ウイルス複製を１００倍低下させることによりＵＲＴ感染に対して部分的防御をもたらした（表３、実施例１）。さらに、３回目の注射は不必要に思われ、ＬＲＴ感染を予防するためには、１ｘ１０４ｉ．ｕ．の用量での２回の注射で十分であった。１ｘ１０４ｉｕのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮを１回投与するだけでは十分でなかった（表３、実験２）。従って、ハムスターモデルにおいて、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮは、下および上気道におけるＰＩＶ３複製の確立を予防するための最も有効な方法であった。ＬＲＴ感染に対抗するために有効なＶＲＰ−Ｆ／ＨＮの投与量は、１ｘ１０４ｉｕで２回免疫化程度の低さであってよい。
データから、ＬＲＴにおけるウイルス複製を検出不能なレベルまで減少させ、ＵＲＴにおいてウイルス複製のレベルを約１００倍減少させるために、１×１０４ｉｕのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮを２回投与することによる免疫化で十分であることが示された。これは、ＰＩＶおよびＲＳＶ随伴肺炎などのある種の合併症を予防できるサブユニット組成物を調製するための一方法を示唆するので、意味のある功績である。データは、ＨＮおよびＦがＰＩＶ３サブユニットワクチンデザインに必要な２つの重要な抗原であることを示す。
【００６１】
【表３】
【００６２】
実施例６：ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染から起こる細胞変性効果
Ａ．アポトーシス
ＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ、またはＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆと比較すると、免疫原性組成物としてのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮの有効性は、作用機序の調査につながった。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染が培養における他のＶＲＰ感染と比較して独自のＣＰＥに至ることが観察された。これらのＶＲＰが培地中で増殖された場合のアポトーシスに至る可能性を調査した。ＢＨＫ２１単層をＶＲＰ−Ｆ／ＨＮまたはＶＲＰ−ＨＮで、ＭＯＩ＝０．５で感染させるか、または感染させなかった（対照として）。表４参照。単層形態を位相差顕微鏡下、１００倍の倍率で、感染後２４、４８、および７２時間に観察した。表４参照。ＣＰＥデータを、ＢＨＫ単層が破壊されて軽度のＣＰＥを示すか（＋）、または単層細胞がひどく破壊され、膜ブレブが形成されているかどうか（＋＋）または単層が完全に除去されて、ブレブおよびデブリスが上清中に残っているかどうか（＋＋＋）により特徴づけた。表４参照。
【００６３】
表４に示されるように、ＢＨＫ細胞がＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで感染した場合、２４時間後に、ＢＨＫ単層はＶＲＰ−ＨＮまたは他のＶＲＰ（データは省略）感染と比較して、破壊された。４８時間後、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮでの感染は、単層破壊を誘発し、明確な合胞体および膜ブレブが形成された。７２時間までに、単層は完全に除去され、ブレブおよびデブリスが上清中に残され、一方、ＶＲＰ−ＨＮで感染した群は、無傷の単層と全体を通してのアポトーシス事象による円形化を示した。表４参照。
【００６４】
【表４】
【００６５】
Ｂ．プラーク形態
従来の研究は、Ｆタンパク質の融合特性は、ＨＮタンパク質の存在を必要とし（Ｅｂａｔａ， Ｓ． Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８３：４３７−４４１（１９９１））、一方、それ自体はＨＮもＦも合胞体形成を誘発できなかったことを示していた。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染による独自のＣＰＥが合胞体形成による可能性を次に調べた。
細胞のＢＨＫ２１単層を異なるＶＲＰ、例えばＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ、ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−ＦまたはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで１５〜１８時間感染させ、単層を次いで固定し、ウマ抗ＰＩＶ３ポリクローナルＡｂ、次いで基質としてホースラディッシュパーオキシダーゼ接合抗ウマＡｂ＋アミノエチルカルバゾールパーオキシダーゼで；あるいはウサギ抗ＶＥＥ ＮＳＰ１ポリクローナルＡｂ ｒ８３５＋ｃｙＴＭ３接合ヤギ抗ウサギ抗体で染色した。明視野または蛍光顕微鏡下、１００倍の倍率で写真を撮影した。
【００６６】
予想されるように、ＶＲＰ−ＨＮまたはＶＲＰ−Ｆはそれ自体、個々のＶＲＰ感染により形成される明らかなＨＮ−またはＦ−発現プラークを示した。しかしながら、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染群における「プラーク」は、非常に大きなサイズを有し、容易に肉眼で見ることができた。多核化細胞がこれらの「プラーク」内で明らかに見られるので、これらの大きな「プラーク」は、実際に合胞体の形成を表した［合胞体形成に基づく滴定は、単一のレプリコンおよび複数の細胞に基づくので、感染単位（ｉｕ）の代わりに合胞体形成単位（ｓｆｕ）を要求した］。細胞がＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−Ｆに同時に感染した場合、合胞体形態を示す「プラーク」は少なかった（１％未満）。しかしながら、プラークは、ＶＲＰ−ＨＮまたはＶＲＰ−Ｆ感染単独により形成されるものと類似していた。プラークが抗ＶＥＥ ＮＳＰ１Ａｂで染色された場合に同じプラーク特性が見られた。合胞体形成も、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮからのＨＮおよびＦタンパク質の同時発現をさらに裏付けた。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染は実際に２つの異なるＣＰＥプロセス、アポトーシスおよび合胞体形成に至ると結論づけられた。
【００６７】
実施例７：ＨＮおよびＦの同時発現は感染性粒子を産生した
細胞の単層（「単層」）は非常に低い感染多重度（ＭＯＩ）（＜０．００１、データは省略）により破壊されるので、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ誘発ＣＰＥは非常に「伝染性」であることに注目された。従って、第二のレプリコンまたは感染性粒子のある形態が独自のＣＰＥから生成したと推測された。第二のレプリコンまたは感染性粒子は自己増殖性であり、ＨＮおよびＦ糖タンパク質に結合した膜を使用することにより他の細胞を感染させると融合プロセスが誘発された。
非レプリコン感染性薬剤が産生されたかどうかを評価するために、ＢＨＫ単層がＶＲＰ−Ｆ／ＨＮまたは他のＶＲＰで０．５のＭＯＩで３０分間感染させる実験をデザインした。単層を次いで３回洗浄して残存するＶＲＰを除去し、新鮮な培地を補充し、４８時間培養した。次に単層を、ＨＮおよびＦ発現について評価するためにウマ抗ＰＩＶ血清で染色するか、またはレプリコンＮＳＰ１タンパク質の存在を確認するためにＶＥＥのウサギ抗ＮＳＰ１で染色した。４８時間の最後に、細胞からの上清のアリコートを単層から除去し、新鮮なＢＨＫ単層を３０分間「感染」させるために使用した。３０分後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を補充し、４８時間インキュベートした。単層を次いでＣＰＥについて評価し、ＨＮおよびＦ発現についてはウマ抗ＰＩＶ３血清で、あるいはレプリコンタンパク質の存在を確認するためにはＶＥＥのウサギ抗ＮＳＰ１で染色した。最初の転移（第一転移）、もう一つの転移（第二転移）、および転移（第三転移）を通して工程を行った。全ての細胞を、ＨＮおよびＦ発現については抗ＰＩＶ３またはＶＥＥ ＮＳＰ１発現については抗ＶＥＥ ＮＳＰ１のいずれかで染色した。抗ＰＩＶ抗体については明視野下で、あるいは抗ＶＥＥ ＮＳＰ１抗体については蛍光顕微鏡下１００倍の倍率で写真を撮影した。免疫染色による発現の規模を、（−）から（＋＋＋＋＋）により表す。結果を表５に示す。
【００６８】
【表５】
【００６９】
ＶＲＰレプリコンでの感染の第一ラウンドにおいて、プラークは次のレプリコンで感染した細胞系において４８時間後に見ることができた：ＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ、およびＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ。表５参照。感染のこのラウンドにおいて、ヘルパープラスミドから誘導されるＶＥＥ糖タンパク質は細胞への侵入を促進した。
初期レプリコン感染におけるＣＰＥを考慮すると、ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ感染細胞は、ＨＮおよびＦの日和見的同時発現のために時々合胞体形成を示した。対照的に、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染は、４８時間後に細胞単層および明らかな合胞体の破壊を誘発した。表５参照。これらの全ては、ＶＥＥ ＮＳＰ１タンパク質を発現し、活性レプリコン活性を示した。表５参照。
感染の第二ラウンドにおいて、前記上清が新規単層に移された場合、ＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−Ｆ処理群において新しい感染活性はなかった。表５参照。同様に、ＰＩＶ３ＨＮおよびＨのさらなる発現もなく、ＶＥＥ ＮＳＰ１産生もなかった。表５参照。これらの群において、ＶＥＥヘルパータンパク質の入力がないことは、本発明以前に予想されるように、感染プロセスに致命的であることがわかった。
【００７０】
しかしながら驚くべきことに、感染性粒子はヘルパープラスミド上のＶＥＥタンパク質／ＨＮの不在下で、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ処理細胞の上清において産生された。例えば、本発明者らは多量のＰＩＶ３糖タンパク質ＨＮおよびＨがＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ処理細胞からの上清を未感染細胞単層に移した後に生じることを見いだした。表５参照。プロセスにおけるこの段階で、感染プロセスは細胞誘導ブレブの表面上のＰＩＶ ＨＮおよびＦタンパク質の表面発現融合活性により行われると考えられる。
加えて、ＮＳＰ１タンパク質は、転移後にＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ処理群において産生されることが確認され、このことはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞上清における強力な感染活性を示す。表５参照。ＶＥＥ表面糖タンパク質発現は、抗ＶＥＥポリクローナル血清での染色を用いて検出できず、従って潜在的な組み換え事象によるＶＥＥウイルスが生成されないことを示す。従って、感染性物質は、もとのＶＥＥレプリコンＲＮＡからなり、これはＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、およびＰＩＶ３ＨＮおよびＦ遺伝子を含むＶＥＥレプリカーゼを有する。加えて、本発明者らはこれらの同じタンパク質が発現されることを示す。
【００７１】
次の転移における感染活性は、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦの同時発現により促進されるようである。ＰＩＶ３糖タンパク質ＨＮおよびＦ抗原染色はごくわずかの量であり、ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ群において検出可能なＮＳＰ１発現はなかった。表５参照。この理由は、合胞体誘発活性を有するあるレプリコンは初期ＶＲＰ感染に持ち越すからである。表５参照。この裏付けとして、この残存活性は第二転移に持ち越すことができず、さらなるＰＩＶ３抗原は検出されないことが見いだされた。表５参照。
ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ処理細胞で見られる感染活性がないことと対照的に、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染の第一転移を受ける細胞からの上清は、未感染細胞に適用された場合に、合胞体形成、単層破壊、ＰＩＶ３ ＨＮ＆Ｆ抗原染色およびＶＥＥ ＮＳＰ１抗原染色を含む「感染性」現象の別のラウンドを誘発する。ここでも、これらの感染活性の結果としての検出可能なＶＥＥ表面糖タンパク質発現はなく、さらにＶＥＥウイルス汚染を除外する。
【００７２】
「感染性」現象のさらなるラウンドは、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞からの上清が追加のＢＨＫ単層に移された場合に生じた。表５参照。ＢＨＫ単層も抗ＶＥＥポリクローナル血清で染色し、ＶＥＥ表面糖タンパク質発現を示さず、ＶＥＥウイルスが生成しなかったことを示す。
前記観察は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞から生じる「感染性」タンパク質により促進される融合活性が存在し、これらの活性は連続して移されるという仮説をさらに裏付けた。
【００７３】
実施例８：感染性粒子はレプリコンでなく、ブレブであった
その性質を確認するために電子顕微鏡を用いて感染性粒子の形態的性質を調べた。もっと良く調べることにより、感染性粒子がＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンであることが除外され、その代わりに感染性物質が感染した細胞から誘導されるブレブと確認され、これはＰＩＶ３ＨＮおよびＦを同時発現する。
まずＰＢＳ中１：２０に希釈することにより、電子顕微鏡用にＶＲＰ−Ｆ／ＨＮブレブを調製した。ＳｌｏｔおよびＧｅｕｚｅにより１９８４年に開発された手順を変更したものを用いてホールブレブ、陰性染色、イムノゴールドラベリングを行った。Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ， ｂｙ Ｓｌｏｔ ａｎｄ Ｇｅｕｚｅ， Ｐｏｌｌａｃｋ ａｎｄ Ｖａｒｎｄｅｌｌ ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ＢＶ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．参照。ベシクルの液滴をパラフィルム上に置き、ｆｏｒｍｖａｒ−炭素コーティングされた金格子を各液滴上に下向きに置いた。過剰の流体を除去し、ＰＢＳおよび１％ＢＳＡ（５ｍｌ）と、後に１％冷水魚肉ゼラチンを含有するＰＢＳ（１０ｍｌ）を用いて２段階でブロッキングを行った。ブレブを有する格子を、湿潤チャンバー中でＰＢＳ ＢＳＡ中（１ｈ）１：５０に希釈された抗Ｆ ｍＡｂクローンＢ−１０２または抗ＨＮ ｍＡｂクローン６８／２上で反転させた。格子をＰＢＳ ＢＳＡ中５×１ｍｌでリンスした。６ｎｍコロイド状金ビーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ， Ｗ． Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）と結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍとともにインキュベーションすることにより抗原を検出した。ＰＢＳ中でリンスした（４×１ｍｌ）。細胞を有する格子を１％ＰＢＳ中グルタルアルデヒド（３ｍｌ）で安定化させた。各サンプルを次いで希釈された水中でリンスした（５×１ｍｌ）。最後に、ベシクルを有する格子を１％ＰＴＡ、ｐＨ６．５を用いて陰性染色した（３０秒）。対照サンプルを一次抗体の不在下でインキュベートした。８０ｋＶで操作するＺｅｉｓｓ１０Ｃ透過型電子顕微鏡で調査を行った。
【００７４】
上清から得られる感染性粒子のサンプルの電子顕微鏡研究により、感染性粒子はＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンでないことが示された。ＶＥＥレプリコンはＶＥＥウイルスと大きさが非常に近い７０ｎｍウイルス粒子である。Ｐａｒｅｄｅｓら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：９５３２（２００１）参照。陰性染色により、サイズにおける有意な量の異質性が明らかになった。対照的に、ＶＥＥレプリコンはサイズが均質であることが知られている。
感染性粒子は、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦ糖タンパク質の表面発現を示し、これは感染性物質としてのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンと一致しない。抗ＨＮモノクローナル抗体「クローン６８／２」および抗Ｆモノクローナル抗体「クローンＢ−１０２」を用いて、精製された感染性粒子をイムノゴールドラベリングに付した。結果から、ネズミＩｇイソタイプで染色された対照と比較して、感染性粒子は主に抗ＨＮおよび抗Ｆで染色されることがわかった。この結果は、ＶＥＥ糖タンパク質のみがレプリコンの表面上で発現されるので、感染性物質がレプリコンベースでないことをさらに裏付ける。ＶＥＥレプリコンのパッケージング特性に従って、ＰＩＶ３−ＨＮおよびＦ糖タンパク質はレプリコン粒子から除外される。Ｓｔｒａｕｓ， Ｊ．Ｈ． ＆ Ｓｔｒａｕｓｓ Ｅ．Ｇ．， Ｔｈｅ Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ： Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８（３）：４９１−５６２（１９９４）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。
【００７５】
実施例９：ＨＮおよびＦによる感染性ブレブの感染性
これらの感染性ブレブの細胞侵入を媒介する表面タンパク質の同一性を、特定のタンパク質に対する抗体が感染性を阻害するかどうかを評価することにより判断した。まず、ＧＦＰをエンコードする感染性ブレブまたはＶＥＥレプリコンを様々な抗体、例えば抗ＰＩＶ３血清；抗ＨＮ ｍＡｂ；抗Ｆ ｍＡｂ；抗ＨＮ ｍＡｂ＋抗Ｆ ｍＡｂ；正常血清およびイソタイプ対照ネズミＩｇと共に２時間プレインキュベートした。次に、ＢＨＫ単層を１時間、これらのプレインキュベートされた感染性ブレブまたはＶＥＥレプリコンで感染させた。単層を次いで洗浄し、成長培地と置換した。細胞を固定し、ウサギ抗ＶＥＥ ＮＳＰ１およびｃｙＴＭ３接合ヤギ抗ウサギ抗体で一夜染色することにより、ブレブによる感染を測定した。５時間培養後の緑色蛍光タンパク質の発現によりＶＥＥレプリコンによる感染を調べた。感染の規模の徴候を表６において（＋）、または（＋＋）として採点した。感染の徴候が無い場合は（−）と採点した。
【００７６】
【表６】
【００７７】
表６に示したデータから、感染性ブレブを抗ＰＩＶ３ポリクローナル抗血清またはＰＩＶ３ＨＮに対するモノクローナル抗体とともにプレインキュベーションすると、ブレブが自己増殖するかまたは新規細胞に感染する能力を完全にブロックしたことがわかる。ブレブをＰＩＶ３の融合タンパク質に対する単一のモノクローナル抗体と共にインキュベートした場合、感染性は幾分減少するが、全体的には阻害されなかった。ブレブをＶＥＥタンパク質に対するモノクローナル抗体とともにプレインキュベーションすることは、ブレブ感染性に対して効果が無かった。
抗体プレインキュベーションのその後の感染性に対する影響は、ブレブでなくレプリコンを使用した場合には非常に異なっていた。例えば、ＰＩＶ３に対するポリクローナル抗血清も、ＰＩＶ３糖タンパク質ＨＮおよびＦに対するモノクローナル抗体も、ＶＲＰ−ＨＮ／Ｐ感染性を阻害できなかった。表６参照。対照的に、ＶＥＥ表面糖タンパク質に対するモノクローナル抗体と共にプレインキュベーションした場合だけ、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染性を阻害することができた。
感染性の抗体阻害のこれらの研究からいくつかの重要な点を引き出すことができる。まず、感染性阻害の結果は、ＨＮおよびＦタンパク質は自己増殖ブレブの表面上に位置することを示した。結果はさらに、感染性と見られる自己増殖活性が、自己増殖ブレブの表面上に位置する融合性糖タンパク質ＰＩＶ３ ＨＮおよびＦにより促進されることを示した。対照的に、これらの結果は、レセプターと結合し、細胞を感染させるためにレプリコンが使用される場合に感染の第一ラウンドを行うＶＥＥ構造タンパク質Ｅ１およびＥ２であることを裏付けた。
【００７８】
実施例１０：感染性ブレブ対レプリコンの増幅
次に、これらの感染性自己増殖ブレブがウイルスのように増幅されるかどうか、またこのような増幅がもとのレプリコンの成長特性とどのように比較されるかを調べた。これを行うために、まず、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンを次のようにして増幅した：（ｉ）準融合性ＢＨＫ細胞のＴ−１７５フラスコを約１×１０５ｉｕ（ｓｆｕ）のＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで１時間感染させ；（ｉｉ）次に、細胞を洗浄し、新鮮な培地で置換し；（ｉｉｉ）ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ滴定についてと同じプロトコルを用いて合胞体形成活性を経時的にモニターした。最初の１６時間で、低力価の感染活性が存在することが判明した（〜３００ｓｆｕ）。合胞体は、滴定工程中に形成され、これはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮと類似した形態を示した。約４０時間後、合胞体形成活性はほぼ２５００倍に劇的に増大し、さらに７２時間変化しないままであった。従って、レプリコン粒子のバーストサイズは約０．１と計算された。
【００７９】
比較して、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞から生じる「感染性ブレブ粒子」がレプリコンのように増幅される能力を調べた。ここでも、約８０％コンフルエンシーのＢＨＫ細胞のＴ−１７５フラスコを使用し、これをＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞の培養上清の形態の約１×１０４ｓｆｕの自己増殖ブレブで１時間感染させた。次に、細胞を洗浄し、新鮮な培地で置換し、合胞体形成活性を経時的にモニターした。合胞体形成活性により測定される自己増殖ブレブの増幅は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンの増幅よりも良好であった。自己増殖ブレブの成長曲線は、最初の１６時間は低い力価（〜５００ｓｆｕ）を示し、続いて最初の４０時間で合胞体形成活性において大幅に５６０倍増大した。その後、最初の感染後約１１２時間で、合胞体形成活性の力価は約１５０００倍まで増大した。このデータはさらに、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染は、自己増殖ブレブと称する感染性粒子を生じさせ、これはさらに自己増殖することができたことを裏付ける。これらの第二の「感染性ブレブ」粒子は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染からのみ生じることができ、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ、ＶＲＰ−ＦまたはＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆからは生じなかった。この現象は、適当な防御免疫の有効なプライミングおよびＰＩＶ３感染に対する免疫原性組成物の候補としてのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮの有効性をさらに説明する。
【００８０】
実施例１１：感染性ブレブのキャラクタライゼーション
典型的な物理現象、例えば凍結−乾燥、撹拌、−８０℃に７日間凍結、２５０００ｐｍで２０分間遠心分離、および０．２μｍ、０．４５μｍ、および０．８μｍフィルターを通した濾過に対して自己増殖ブレブの脆弱可能性を調べた。ブレブを各物理試験に付す前後に滴定し、結果を以下の表７に示す。
これらの結果から、凍結、撹拌、および遠心分離などの日常的現象に直面した場合、物理的にブレブの感染性は強固であることがわかった。興味深いことに、感染性は撹拌により非常に向上され、これはおそらくは撹拌によりブレブの粘性または凝集性が一部破壊されるためであろう。感染性の濾過性は、ブレブは幾分凝集する傾向があることを裏付ける。
【００８１】
【表７】
【００８２】
実施例１２：感染性ブレブを用いた免疫化
Ａ．自己増殖感染性ブレブはハムスターをＰＩＶ３感染から防御した
表８は、ハムスターをＶＲＰ−Ｆ／ＨＮまたはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染ＢＨＫ細胞からの上清（ブレブ）のいずれかでワクチン接種した実験から得られた結果を示す。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮは１、２または３回のいずれかで接種した。表８参照。ブレブを１、２、または３回のいずれかで鼻内投与した。用量を表８に示し、初回投与２．８×１０４；２回目の投与２．６×１０３；３回目の投与１×１０５ｓｆｕであった。動物を全て１×１０６ＬｏｇＴＣＩＤ５０のＰＩＶウイルスで初期免疫化の７週間後に攻撃し、気道におけるウイルス複製を分析した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜６）で記録した。
表８における結果から、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンで免疫化されたハムスターは、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染ＢＨＫ細胞（ブレブ）で免疫化したハムスター（２回投与しか必要としなかった）と比較して、同じＨＩ価を惹起するために３回投与を必要としたことがわかった。さらに、ＬＲＴおよびＵＲＴにおけるウイルスを除去するためにはブレブを２回投与することで十分であったが、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンを２回投与して免疫化されたハムスターはＬＲＴにおいてのみ除去した。（表８参照）。
【００８３】
【表８】
【００８４】
ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ（ブレブ）での動物の防御について２回投与は最適用量のようであるので、ハムスターにおいて全体的な防御について最適経路を評価した。表９に示すこの研究において、同じＨＮタンパク質濃度（０．５８ｎｇ）（ＶＲＰ−ＨＮ、またはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染上清について）および／または同じＦ濃度（０．２１ｎｇ）（ＶＲＰ−ＦまたはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染上清について）を含有するブレブを鼻内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかで２回投与してハムスターを免疫化した。全接種剤は、７０００ｓｆｕ／用量に等しい感染性ブレブ活性を含有するＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染培養物からの上清を除いて０ｓｆｕを示した。表９参照。動物を次いで１×１０５ＬｏｇＴＣＩＤ５０のＰＩＶウイルスで最後の免疫化後７週間に鼻内攻撃し、気道におけるウイルス複製、および中和価を分析した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜６）で表した。
【００８５】
【表９】
【００８６】
結果から、鼻内径路により投与されたＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染ＢＨＫ細胞（ブレブ）は上および下気道の両方においてウイルスを除去したが、筋肉内経路により投与された場合には、下気道（ＬＲＴ）においてのみ除去したことがわかった。ＶＲＰ−ＨＮ、またはＶＲＰ−Ｆ、またはＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆを含有するレプリコン感染細胞から得られた上清で免疫化された動物は、ＬＲＴおよびＵＲＴからウイルスを除去しなかった。
【００８７】
当業者らは、ただ通常の実験を用いて、本明細書に記載された本発明の特定の具体例の多くの等価なものを認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＶＥＥレプリカーゼ遺伝子、ＰＩＶ３Ｆ遺伝子およびＰＩＶ３ＨＮ遺伝子を示すＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンプラスミドの図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、パラインフルエンザウイルス３型などのパラミクソウイルスにより引き起こされる感染性疾患を治療または予防するための免疫原性組成物の分野に関する。本発明はまた、宿主細胞において外来遺伝子を発現するための組み換えＤＮＡの分野および方法の分野にも関する。
【０００２】
（従来技術）
パラミクソウイルスは、その膜が非常に感染性であり、流行性であり、疾患を引き起こす封入された（−）非セグメント化一本鎖ＲＮＡウイルスである。例としては、麻疹、流行性耳下腺炎、呼吸器合胞体ウイルス、およびパラインフルエンザウイルスが挙げられる。世界保健機構（ＷＨＯ）により麻疹ウイルスなどのパラミクソウイルスを撲滅させるために協調努力がなされている。他のパラミクソウイルス、例えばニューカッスル病ウイルスは家畜集団に大損害をもたらす。
アメリカ合衆国において、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）１、２、３、および４型は、幼児ならびに成人における呼吸器疾患での入院の主な原因である。例えば、ＲＳＶおよびＰＩＶは小児における細気管支炎およびクループの症例の主な原因である。同様に、ＲＳＶおよびＰＩＶは小児における肺炎およびインフルエンザに似た疾患の症例のほぼ半分の原因である。加えて、両ウイルスは、エアロゾル液滴により伝播させることができ、従って院内感染の原因である。
【０００３】
ヒトの健康および世界経済に対するＲＳＶおよびＰＩＶの影響を軽減するための試みが３０年以上も前に始まったが、ほとんど成功していない。例えば、ＲＳＶにおけるワクチン開発は、ホルマリン不活化全ウイルスＲＳＶワクチンに関する期待はずれの結果により早期に阻まれた。この件において、ホルマリン不活化全ウイルスで免疫化された対象は免疫化後さらに重度の疾患にかかった。Ｋｉｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４２２−４３４（１９６９）参照。有効なホルムアルデヒド−不活化ＰＩＶおよびＲＳＶワクチンを作るための従来の試みは、感染症に対する適切な防御をもたらすことができなかった。Ｃｈｉｎ，Ｊ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４４９−４６３（１９６９）参照。
【０００４】
現在、２種の生弱毒化ワクチン候補、ＰＩＶ３（ＪＳ株）のコールド・パッセージ誘導体（ｃｐ４５）およびウシパラインフルエンザウイルス３型が臨床試験において評価されている。Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ，２（７）：８９０−８９２（２００１）参照。結果として、ｃｐ４５は期待できるＰＩＶ３ワクチンと考えられる。
ＲＳＶおよびＰＩＶ研究のもう一つ別の重要な態様は、依然として、高齢者また肺炎および下気道感染症などの既存の病状をもった人たちにおける合併症の予防にとどまる。この点に関して、感染した対象集団に投与するためのベクターベースの精製されたタンパク質抗原を開発することが試みられてきた。Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．，ら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １３（３）：２６−２７３ （１９９６）参照。
【０００５】
パラミクソウイルス科のウイルスのヘテロローガスな遺伝子を組み入れ、発現する能力について様々なベクターが調べられてきた。これらとしては、例えば、野生型ワクシニアまたは弱毒化修飾アンカラワクシニア（ＭＶＡ）（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０（１９９８）；Ｅｌａｎｇｏ，Ｎ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８３：１９０６−１９１０（１９８６））複製能力ヒトアデノウイルスベクター（Ｍｉｔｔａｌ Ｓ．Ｋ．，ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４１（６）：２５３−２６０（１９９８））、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｋａｈｎ Ｓ．Ｊ．、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７５（２２）：１１０７９−８７（２００１））、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）（Ｐｅｒｏｕｌｉｓ、Ｉ．ら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４４：１０７−１１６（１９９９））、ＰＩＶ１／２または麻疹ウイルスゲノムを有する有効なベクターとしてのヒトＰＩＶ３（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｍ．Ｈ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９（１）：１３６−１５２（２００２））およびヒトＰＩＶ３ゲノムを有するウシＰＩＶ３（Ｈａｌｌｅｒ Ａ．Ａ．，ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（２４）：１１６２６−３５（２０００））が挙げられる。前記ベクターの全てについての前臨床研究から、対応する病原体に対して有望な防御効果が示された。
【０００６】
ＲＳＶおよびＰＩＶ病の流行および重度およびワクチンを製造するための従来の多くの試みにもかかわらず、これらの感染症を予防するための免疫原性組成物は現在のところ存在しない。従って、ＲＳＶ、ＰＩＶおよび他のパラミクソウイルスに対して防御免疫を誘発する免疫原性組成物および方法が必要とされている。
【非特許文献１】Ｋｉｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４２２−４３４（１９６９）
【非特許文献２】Ｃｈｉｎ，Ｊ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４４９−４６３（１９６９）
【非特許文献３】Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ，２（７）：８９０−８９２（２００１）
【非特許文献４】Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．，ら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １３（３）：２６−２７３ （１９９６）
【非特許文献５】Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０（１９９８）
【非特許文献６】Ｅｌａｎｇｏ，Ｎ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８３：１９０６−１９１０（１９８６）
【非特許文献７】Ｍｉｔｔａｌ Ｓ．Ｋ．，ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４１（６）：２５３−２６０（１９９８）
【非特許文献８】Ｋａｈｎ Ｓ．Ｊ．、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７５（２２）：１１０７９−８７（２００１）
【非特許文献９】Ｐｅｒｏｕｌｉｓ、Ｉ．ら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４４：１０７−１１６（１９９９）
【非特許文献１０】Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ Ｍ．Ｈ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９（１）：１３６−１５２（２００２）
【非特許文献１１】Ｈａｌｌｅｒ Ａ．Ａ．，ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（２４）：１１６２６−３５（２０００）
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、パラミクソウイルス、例えばＲＳＶおよびＰＩＶに対して哺乳動物を免疫化するための免疫原性組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物に関する。ある具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられた場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において。前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。特定の具体例において、ＢＨＫ培養細胞における細胞変性効果は合胞体形成、単層破壊またはアポトーシスである。さらにもう一つ別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する。ある具体例において、防御免疫反応は哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による下気道の感染を予防する。もう一つ別の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による上気道の感染の重篤度を軽減する。特定の具体例において、免疫原性組成物は医薬的に許容される担体および／またはアジュバントをさらに含む。
【０００８】
一具体例において、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物を提供する。ある具体例において、パラミクソウイルスは、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型および呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルス糖タンパク質は、パラインフルエンザウイルス１型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス１型Ｆ、パラインフルエンザウイルス２型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス２型Ｆ、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ、パラインフルエンザウイルス４型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス４型Ｆからなる群から選択される。さらにもう一つ別の具体例において、特定のパラインフルエンザウイルスのＨＮおよびＦ糖タンパク質の両方は組み合わせられ、パラインフルエンザウイルス１型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス１型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス２型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス２型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；およびパラインフルエンザウイルス４型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス４型ＨＮ糖タンパク質遺伝子から選択される。別の具体例において、パラミクソウイルスは、呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質、および／または呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質である。本発明の一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、前記レプリコン粒子に感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
【０００９】
一具体例において、本発明は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子を提供する。もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号３に示される核酸配列を有するベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質をエンコードする組換え核酸分子を提供する。別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質は配列番号１に示される核酸によりエンコードされる。特定の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質は、配列番号２；配列番号３、および配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。別の具体例において、免疫原性組成物はさらに医薬的に許容される担体および／またはアジュバントを含む。
【００１０】
一具体例において、本発明はパラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の：（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物；および（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む方法を提供する。特定の具体例において、パラミクソウイルスはパラインフルエンザウイルス３型であり、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質またはパラインフルエンザウイルス３型融合（Ｆ）糖タンパク質である。もう一つ別の具体例において、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質のどちらも含む。さらにもう一つ別の具体例において、レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合にレプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。特定の具体例において、ＢＨＫ培養細胞における細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊またはアポトーシスである。特定の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）は検出可能な複製能力ベネズエウマ脳炎ウイルスを含有しない。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルスは呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質または呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質である。別の具体例において、糖タンパク質は、呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質のどちらも含む。ある具体例において、感染は下気道においてである。一方、もう一つ別の具体例においては、感染は上気道においてである。
【００１１】
本発明はさらに、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物も提供する。特定の具体例において、ブレブは融合性である。もう一つ別の具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含む。もう一つ別の具体例において、自己増殖ブレブは、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。さらに詳細には、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、ブレブはＢＨＫ培養細胞において以下の細胞変性効果：合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスのうちの１つまたはそれ以上を誘発する。もう一つ別の具体例において、ブレブ集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。ある具体例において、自己増殖ブレブは、哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する。特定の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による下気道の感染を予防する。もう一つ別の具体例において、防御免疫反応は、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による上気道の感染を予防するか、または感染の重篤度を軽減する。
【００１２】
本発明の実施形態は、パラミクソウイルスによる感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法を提供する。例えば、このような１つの方法は、免疫学的に有効な量の、（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質、（ｂ）医薬的に許容される担体を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含み、前記免疫原性組成物は、免疫反応を惹起するために十分な量で投与される。ある具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含む。ある具体例において、パラミクソウイルスは、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型および呼吸器合胞体ウイルスからなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルス糖タンパク質は、パラインフルエンザウイルス１型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス１型Ｆ、パラインフルエンザウイルス２型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス２型Ｆ、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ、パラインフルエンザウイルス４型ＨＮ、パラインフルエンザウイルス４型Ｆからなる群から選択される。特定の具体例において、特定のパラインフルエンザウイルスについてのＨＮおよびＦ糖タンパク質の両方は組み合わせられ、パラインフルエンザウイルス１型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス１型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス２型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス２型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子；パラインフルエンザウイルス４型Ｆ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス４型ＨＮ糖タンパク質遺伝子からなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、パラミクソウイルスは呼吸器合胞体ウイルスであり、糖タンパク質は呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質、および／または呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質である。もう一つ別の具体例において、ブレブは融合性である。本発明の一具体例において、ブレブはＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合にレプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明の特定の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
【００１３】
別の具体例において、自己増殖融合性ブレブを含む免疫原性組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。もう一つ別の具体例において、自己増殖融合性ブレブを含む免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。
本発明はまた、パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の：（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物；（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む。一具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含む。ある具体例において、前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、パラインフルエンザウイルスは、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、およびパラインフルエンザウイルス４型からなる群から選択される。もう一つ別の具体例において、ＨＮ糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質であり、Ｆ糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型融合（Ｆ）糖タンパク質である。特定の具体例において、糖タンパク質はパラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質のどちらも含む。
【００１４】
一具体例において、本発明は、パラインフルエンザウイルス３型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に、免疫学的に有効な量の：（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物；（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含む方法を提供する。もう一つ別の具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質は、配列番号２、配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。特定の具体例において、自己増殖ブレブは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子は、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を、免疫反応を惹起するために十分な量で含む。もう一つ別の具体例において、前記集団は、検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない。特定の具体例において、自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する
【００１５】
（図面の簡単な記載）
図１は、ＶＥＥレプリカーゼ遺伝子、ＰＩＶ３Ｆ遺伝子およびＰＩＶ３ＨＮ遺伝子を示すＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンプラスミドの図である。
【００１６】
（発明の詳細な記載）
アルファウイルスはインビボおよびエクスビボ用途のために哺乳動物および昆虫細胞遺伝子送達系として遺伝子操作されてきた。アルファウイルスゲノムは、５’非構造タンパク質（ＮＳＰ）遺伝子とそれに続く、構造遺伝子の転写を調節するサブゲノムプロモーターの２つの領域に分割される単鎖（＋）ＲＮＡからなる。ＮＳＰ遺伝子は、ウイルスコアが細胞質中に放出された直後に翻訳される。ＮＳＰ複合体は、完全長アンチゲノムおよびゲノムを合成するためのレプリカーゼとして、また構造遺伝子をエンコードするサブゲノム転写物を合成するトランスクリプターゼとして機能する。アルファウイルスの例としては、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスが挙げられる。
【００１７】
アルファウイルスの複製は、構造遺伝子に依存し；従って、これらは除去することができ、外来遺伝子をその代わりに導入することができる。このように組み換えＲＮＡを細胞中に導入すると、その結果、外来遺伝子産物の複製および発現の１ラウンドを引き起こす。従って、これらのゲノムは「自殺」ベクターまたは「レプリコン」と呼ばれる。アルファベクターで外来遺伝子を送達する２つの主な利点は：１）高レベルの発現が得られること、および２）感染した細胞のアポトーシス（すなわち、プログラムされた細胞の死）であり、この結果、免疫系を変更し、強固な免疫反応を惹起する「危険な」シグナルが生じる。
レプリコンベクターは、ｃＤＮＡとして真核細胞ｐｏｌ ＩＩプロモーターベースのプラスミド送達ビヒクル中に組み入れられた裸のＲＮＡの形態で使用することができるか、あるいは感染性ウイルス様レプリコン粒子中に封入される。レプリコンベクターの有効な送達の結果、強固な外来遺伝子発現およびプログラムされた細胞の死がもたらされる。あらゆる場合において、ベクターは１ラウンドの複製のみを受け、生ウイルスと違って細胞から細胞への拡大を停止する。
【００１８】
レプリコンシステムは、以下の米国特許：米国特許第５１８５４４０号（標題「ベネズエラウマ脳炎ウイルスをコードするｃＤＮＡクローンおよびその弱毒化突然変異体」、Ｎ．Ｌ．Ｄａｖｉｓら）；米国特許第５５０５９４７号（標題「ベネズエラウマ脳炎ウイルスにおける弱毒化突然変異」、Ｒ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎら）；米国特許第６１５６５５８号（標題「アルファウイルスＲＮＡレプリコンシステム」、Ｒ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎら）；および米国特許第６５３１１３５号（標題「アルファウイルスＲＮＡレプリコンシステム」、Ｒ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎら）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）において詳細に記載されている。
【００１９】
本発明は、レプリコン発現ベクターを送達する新規方法を記載する。ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）レプリコンベクターは、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ）のヘマグルチニン（ＨＮ）および融合（Ｆ）タンパク質を同時に発現するために遺伝子操作された。ＶＥＥレプリコン粒子（ＶＲＰ）のキャラクタライゼーションの間、レプリコンについて知られていることと反対に、このシステムは組織培養においてＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコン感染に際して感染性粒子を産生することが観察された。これらの感染性粒子は：１）ＰＩＶ３ＨＮ、Ｆ、およびＶＥＥ ＮＳＰ複合体を発現し、２）自己増殖可能であり、３）その表面上にＨＮおよびＦタンパク質を含有し、４）繰り返す凍結−解凍サイクル中ずっと安定であり、５）サイズが異質であり、その一部は０．２ミクロンフィルターを通して濾過可能であり、６）高度に免疫原性であり、そして７）ゴールデンハムスターモデルにおけるＰＩＶ感染に対する有効な免疫原性組成物として使用できた。本発明を以下に詳細に記載する。
【００２０】
これらの研究の過程において、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦ遺伝子はレプリコンベクター中にクローンされた。結果として得られるベクター（ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ）は高度に免疫原性であり、鼻内または筋肉内経路により、１×１０４感染単位（ＩＵ）もの低い投与量でＰＩＶ３感染からハムスターを防御した。ＶＲＰパッケージング中のＨＮおよびＦの同時発現の結果、大きな合胞体形成が起こり；その結果、この特定のＶＲＰの力価はパッケージング反応あたり１×１０５ＶＲＰ以上に達することはないことが観察され、力価１０４〜５は他のＶＲＰベクターよりも低い。
感染性または「自己増殖」ブレブは、細胞をＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで感染させることによるか、または細胞をＶＥＥ−Ｈ／ＨＮレプリコンベクターＲＮＡ単独でトランスフェクトすることにより生成させることができる。「感染性ブレブ」または「自己増殖ブレブ」とは、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦ遺伝子または他のウイルス融合タンパク質を表面上に有し、自己増殖可能な外膜融合性ベシクルまたは融合性粒子を意味する。「感染性ブレブ」、「自己増殖ブレブ」、および「融合性粒子」なる用語は時々交換可能に用いられる。ブレブは、免疫原性組成物として投与された場合に、１０４合胞体形成単位（ＳＦＵ）の低い投与量でゴールデンハムスターの上および下気道をＰＩＶ３感染に対して防御することができた。これらの臨床前研究から、感染性粒子はＰＩＶ３の免疫原性組成物として使用できることが示された。
【００２１】
本発明はいくつかの当座の有用性を有する。第一に、ＰＩＶ３のＨＮおよびＦ遺伝子を同時に発現するためのＶＥＥレプリコン粒子の使用。第二に、表面上にＰＩＶまたは他の融合性タンパク質／糖タンパク質を有する自己増殖ブレブを生成させるためのＶＥＥレプリコン粒子の使用。第三に免疫原としての融合性自己増殖ブレブの使用。
本発明の一具体例において、ＨＮおよびＦ遺伝子の同時発現は、ゴールデンハムスターモデルにおいてＰＩＶ３に対する免疫を生じさせるのに、いずれかの遺伝子単独、または個々の発現後の［ＨＮ＋Ｆ］の組み合わせよりも有効であることが示された。理論に限定されないが、このベクターの免疫原性は、Ｆ／ＨＮ複合体の向上された提示レベルおよび／またはより長い半減期に関連する。あるいは、感染した細胞から放出される融合性粒子またはブレブは、発現の寿命および／または感染するようになる細胞の数を増大させることができる。
【００２２】
本発明のもう一つ別の具体例において、表面上にＨＮおよびＦを含有する融合性粒子またはブレブは、ゴールデンハムスターモデルにおいてＰＩＶ感染に対して有効な免疫原性組成物でもある。約１０〜１００のブレブがインビトロで感染した細胞あたり産生され、この系を大規模産生に好適にする。ブレブは、凍結−解凍サイクルを通して安定であった。自己増殖ブレブは、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮまたはブレブで細胞を感染させるか、あるいはＶＥＥレプリコン−Ｆ／ＨＮ ＲＮＡのエレクトロポレーションにより生成させることができる。
【００２３】
本発明の一具体例は、ヘテロローガスな病原体に対して防御を与えることができる追加の１または２の遺伝子を含むことである。融合性粒子が自己増殖性であるという事実により、インビトロで生成された免疫原性組成物よりも優れた利点がもたらされる。例えば、他のウイルス（麻疹、ＳＶ５、またはＨＩＶ）から得られる他の融合性タンパク質は、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦの代わりに用いることもでき、従って免疫原性組成物のレパートリーを増大させる。
ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）から誘導されるレプリコンは、免疫原性組成物の設計のための別のベクター系を表す。ＶＥＥレプリコンは、様々な動物細胞型を感染させることができることが証明されている。ＶＥＥレプリコンは、ウイルスならびに細菌抗原の抗原送達に用いられており［Ｄａｖｉｓ Ｎ．Ｌ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０（６）：３７８１−３７８７（１９９６）；Ｌｅｅ Ｊ．Ｓ．ら、．、Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、１８５（８）：１１９２−６（２００２）］、樹状細胞を目標とすることにより首尾よく強力な体液性ならびに細胞性免疫を誘発する［ＭａｃＤｏｎａｌｄ Ｇ．Ｈ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４（２）：９１４−９２２（２０００）］。
【００２４】
ＶＥＥレプリコンは、親ベネズエラウマ脳炎ウイルスのアル特性を利用する。ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）は、トガウイルス科のアルファウイルス属のメンバーである。ウイルスゲノムは、５’末端においてメチル化キャップで、また３’末端において可変長ポリ（Ａ）トラクトで修飾された一本鎖（＋）ＲＮＡである。一本鎖ウイルスカプシドタンパク質（ｃ）を含有する構造サブユニットは、二十面体ヌクレオカプシドにおいてＲＮＡゲノムと結合する。ビリオンにおいて、カプシドは、膜貫通型タンパク質スパイクの規則的な列で覆われた脂質エンベロープにより取り囲まれており、そのそれぞれは２種の糖タンパク質Ｅ１およびＥ２のヘテロダイマー複合体からなる。Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｃ．Ｅ．およびＥｄｄｙ、Ｇ．Ａ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６８：１−１５（１９７４）参照。ＶＥＥゲノムの構成およびＶＥＥ遺伝子発現の全体的な方法は、プロトタイプアルファウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスのものに匹敵する。（概説については、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｓ．およびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｍ．Ｊ．、Ｔｈｅ Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８６）参照。）例えば、ＶＥＥのトリニダードロバ株の部分ゲノム配列の詳細は、ＶＥＥ構造タンパク質が、ウイルスゲノムの３’側１／３に相当する２６６サブゲノムｍＲＮＡからポリタンパク質の形態で翻訳されることを明らかにする。タンパク分解処理により、成熟ビリオンにおいて見いだされるタンパク質が生じる。アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子は、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４の順序でゲノムの５’側の２／３に位置する。タンパク質はまずポリタンパク質前駆体として発現され、次いでタンパク分解処理されてその成熟形態にされる。成熟非構造タンパク質は、ゲノムＲＮＡの複製および２６ＳサブゲノムｍＲＮＡの合成に必要とされる。
【００２５】
ＶＥＥゲノムは、（＋）単鎖ＲＮＡ分子からなる。これは長さ約１１ｋｂで５’−キャップ構造および３’−ポリＡテールを有する。複製は、（−）鎖ＲＮＡ中間体を経由して進行し、これは、追加のウイルスゲノムの合成およびサブゲノムｍＲＮＡの転写用テンプレートとして使用される。遺伝子送達のためのベクターとして使用される場合、ウイルスＲＮＡ複製に必要でないウイルス構造タンパク質をエンコードするゲノムの３’側１／２を削除し、興味のある抗原をエンコードする遺伝子と置換する。これらのレプリコンのパッケージングは、ＶＥＥ構造タンパク質をエンコードする欠損ヘルパーＲＮＡの共トランスフェクションにより達成される。結果として得られるレプリコン粒子は、興味のある抗原をエンコードする遺伝子を組み入れるが、もはや感染性ウイルス粒子を生成させることができない。しかしながら、レプリコンは多量のヘテロローガスな遺伝子産物の発現を行うことができ、従って、抗原を送達するための有効な手段としての働きをする。
ＶＥＥレプリコン粒子がパラミクソウイルス科ウイルスの免疫原性組成物の設計においてベクターとして使用できるかどうかを評価するために、パラミクソウイルスの免疫原性組成物に関する研究のための実験用ウイルスとしての広範囲の用途のためにＰＩＶ３ウイルスが選択された。ＰＩＶおよびＲＳＶサブユニットワクチンの開発は、個々のウイルスタンパク質それ自体の抗原性および免疫原性の理解が十分でないことにより阻害される。例えば、ＰＩＶ３ゲノムは６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、これは次の非構造内部タンパク質：ヌクレオカプシド（ＮＰ）、マトリックス（Ｍ）、リンタンパク質（Ｐ）、ラージポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質および２つの表面糖タンパク質、ヘマグルチニンノイラミニダーゼ（ＨＮ）、および融合（Ｆ）をエンコードする。ＯＲＦはまた、それぞれＲＮＡ変更および別の翻訳開始のために発現される２つの他のタンパク質ＣおよびＶもエンコードする。第三のタンパク質Ｄは、おそらくは発現されるが、このタンパク質の機能は現在のところ確認されていない。今までのところ、ＰＩＶ３感染に対する防御におけるこれらの内部タンパク質の役割についてごくわずかの情報しか得られていない。ＰＩＶ３のＮＰと約８５％の相同性を共有するＰＩＶ１の核タンパク質（ＮＰ）は、優性ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドをエンコードし、非常に強力なＭＨＣクラスＩ限定応答を誘発し、マウスをＰＩＶ１感染から防御することが証明された。さらに、ＨＮおよびＦは、ＨＮについて少なくとも６、Ｆについて８の中和部位を含有する２つの主な中和抗原である。
【００２６】
ＨＮは、内部赤血球凝集反応およびノイラミニダーゼ活性を有するＩＩ型糖タンパク質である。ＨＮは細胞に対するウイルス付着を媒介し、融合プロセスを促進する。これはシアリン酸を除去してウイルス粒子を放出させ、凝集を防止する。Ｆタンパク質はＩ型糖タンパク質であり、ウイルス浸透および合胞体形成に重要である。Ｆｏのタンパク分解開裂は、２つのジスルフィド結合で結合したサブユニットＦ１およびＦ２を生じさせ、融合活性に必要である。Ｆのインビトロ融合活性はＨＮタンパク質の存在を必要とするので、ウイルス表面上でＨＮおよびＦが共存することは、生物学的に重要であると思われる。ＰＩＶ３サブユニットを含有する免疫原性組成物に関する臨床前研究から、ＨＮおよびＦを予防御抗体として用いる重要性に関するデータが得られた。
【００２７】
一般に、パラミクソウイルス、例えばパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する免疫原性組成物の設計は、下気道（ＬＲＴ）における感染を予防するために行われる。例えば、アジュバントの援助を受けて精製された、またはベクター発現されたＰＩＶ３ＨＮタンパク質は、動物モデルにおけるＬＲＴに対して防御を提供し、一方、精製またはベクター発現Ｆタンパク質は、部分的に防御を提供するか、または全く提供しなかった。組み換えＨＮおよびＦの組み合わせまたはキメラタンパク質Ｆ／ＨＮを用いる方法は、ＬＲＴ感染に対して防御を示した。研究は、ＨＮおよびＦタンパク質を同時に発現するＶＲＰを構築するために本明細書において記載されたようにして開始した。強力な有効性に潜在的に寄与し得る新規特性を有する有効なＶＥＥベースのＰＩＶサブユニット免疫原性組成物を本明細書において記載する。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、「感染性ブレブ」または「自己増殖ブレブ」、または「ブレブ」なる用語は、自己増殖できる、表面上にＰＩＶ３ＨＮおよびＦ遺伝子（または他のウイルス融合タンパク質）を有する外膜融合性ベシクルを意味する。「感染性ブレブ」、「自己増殖ブレブ」、ブレブ、および「融合性粒子」なる用語は、時々交換可能に用いられる。自己増殖は、ブレブ表面上の融合タンパク質を介してタンパク質により行われる。しかしながら、ブレブは、レプリコンＲＮＡも含有するので、新規細胞との融合に際して、レプリコンＲＮＡは転写され、融合タンパク質が細胞表面上に発現され、プロセスが再び開始される。本発明の自己増殖ブレブは、ＰＩＶ３に対する免疫原性組成物として有効であることが示された。約１０〜１００の自己増殖ブレブがインビトロで感染細胞あたり産生され、このシステムを大規模産生に好適にする。自己増殖ブレブは凍結−解凍サイクル全体にわたって安定であった。自己増殖ブレブは、細胞をＶＲＰ−Ｆ／ＨＮでまたは融合性粒子で感染させるか、またはＶＥＥレプリコン−Ｆ／ＨＮ ＲＮＡのエレクトロポレーションにより生成された。感染性ブレブが自己増殖性であるという事実により、インビトロで生成したサブユニットタンパク質よりも優れた利点がもたらされる。
【００２９】
「アルファウイルス」なる用語は、当該分野におけるその通常の意味を有し、アルファウイルスの様々な種、例えばイースタンウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ウェスタンウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、シンドビスウイルス、南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６、セムリキ森林熱ウイルスなどが挙げられる。概論に関しては、Ｆｉｅｌｄ’ｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第４版、第３０章：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ ｐｐ． ９１７−９６２ ｂｙ Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｄ．Ｅ．、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。本発明のける使用に好ましいアルファウイルスＲＮＡ転写物としては、ＶＥＥ、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスが挙げられる。
【００３０】
本発明の方法において用いられるアルファウイルス許容細胞は、ウイルスＲＮＡ転写物でのトランスフェクションに際してウイルス粒子を産生できる細胞である。アルファウイルスは、広い宿主範囲を有する。好適な哺乳動物宿主としては、これらに限定されないが、ベロ細胞、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞およびアカゲザル腎臓細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）が挙げられる。
ＶＲＰをＢＨＫ−２１系からの細胞において増殖させた。この場合において、ＢＨＫ細胞は、擬似表現型特性を共有しない他のＢＨＫクローン集団から区別するために、ＣＣＬ−１０クローンから誘導された。本発明において定義されるように、細胞はＢＨＫ２１または単にＢＨＫ細胞と称する。
本明細書において用いられるように「非構造タンパク質」または「ＮＳＰ」なる用語は、レプリコンのポリメラーゼ機能を意味する。例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）において、ポリメラーゼ機能は、１つのポリタンパク質として翻訳されたＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４タンパク質により提供される。非構造タンパク質遺伝子は、自律性複製のためのレプリコンＲＮＡの一部として必要とされる。
【００３１】
本明細書において用いられる「構造タンパク質」または「アルファウイルス構造タンパク質」なる語句は、ＲＮＡレプリコンの複製に必要とされるエンコードされたタンパク質を意味し、カプシドタンパク質、Ｅ１糖タンパク質、およびＥ２糖タンパク質を包含する。本明細書において記載されるように、アルファウイルスの構造タンパク質は、１以上のヘルパーＲＮＡ（すなわち、第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡ）上でエンコードされる。加えて、少なくとも１つの構造タンパク質をエンコードする領域がレプリコンＲＮＡから欠失しているので、前記レプリコンおよび結果として得られるアルファウイルス粒子が複製欠損であるとするならば、１以上の構造タンパク質を、レプリコンＲＮＡとして同じＲＮＡ分子上でエンコードすることができる。本明細書において用いられる場合、「欠失した」または「欠失」なる用語は、特定の核酸セグメントの全体的な欠失または特定のセグメントを標準的用法にしたがって操作不能または非構造的にするために十分な前記セグメントの部分の欠失を意味する。例えば、米国特許第４６５０７６４号（Ｔｅｍｉｎら）参照。本明細書において用いられるように「複製欠損」なる用語は、レプリコンＲＮＡがヘルパーＲＮＡの不在下で宿主細胞において新規ウイルス粒子を形成できないことを意味する。レプリコンＲＮＡは複製に必要なアルファウイルス構造タンパク質の全てをエンコードするわけではないので、レプリコンＲＮＡは複製欠損であり、必要とされる構造タンパク質の少なくとも１つがここから欠失している。
【００３２】
感染性複製欠損アルファウイルス粒子を発現するためのヘルパー細胞は、上述のように１組のＲＮＡを含む。ＲＮＡの組は、第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡを含む。第一ヘルパーＲＮＡは、少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするＲＮＡを含むが、すべてのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするわけではない。言い換えれば、第一ヘルパーＲＮＡは少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードせず；少なくとも１つのコードされないアルファウイルス構造タンパク質が第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。一具体例において、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質が第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。もう一つ別の具体例において、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ２糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ１糖タンパク質が第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。第三の具体例において、第一ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含み、アルファウイルスカプシドタンパク質は第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。
【００３３】
第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡによりエンコードされる少なくとも１つの構造タンパク質と異なる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードするＲＮＡを含む。従って、第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡによりエンコードされる少なくとも１つの構造タンパク質によりエンコードされない少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードする。第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡによりエンコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をエンコードせず、従って第一および第二のヘルパーＲＮＡは二重構造タンパク質をエンコードしない。第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡによりエンコードされるものと異なる構造タンパク質をエンコードする。第一ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ１糖タンパク質のみをエンコードするＲＮＡを含む具体例において、第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡから欠失しているアデノウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質の一方または両方をエンコードするＲＮＡを含み得る。第一ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ２糖タンパク質のみをエンコードするＲＮＡを含む具体例において、第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡから欠失しているアルファウイルスカプシドタンパク質およびアルファウイルスＥ１糖タンパク質の一方または両方をエンコードするＲＮＡを含み得る。第一ヘルパーＲＮＡがアルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質の両方をエンコードするＲＮＡを含む具体例において、第二のヘルパーＲＮＡは、第一ヘルパーＲＮＡから欠失しているアルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするＲＮＡを含み得る。
【００３４】
一具体例において、パッケージングセグメントまたは「カプシド化配列」は、少なくとも第一ヘルパーＲＮＡから欠失している。もう一つ別の具体例において、パッケージングセグメントは、第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーの両方から欠失している。
パッケージングセグメントが第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーの両方から欠失している具体例において、好ましくは、ヘルパー細胞は第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡに加えてレプリコンＲＮＡを含有する。レプリコンＲＮＡは、パッケージングセグメントおよび挿入されたヘテロローガスなＲＮＡをエンコードする。挿入されたヘテロローガスなＲＮＡは、ウイルス融合タンパク質をエンコードするＲＮＡ、または融合活性を生じさせるために必要なタンパク質、または融合活性を媒介できるペプチドをエンコードするＲＮＡである。典型的には、挿入されたヘテロローガスなＲＮＡは、タンパク質またはペプチドをエンコードし、これは望ましくは宿主、アデノウイルス許容細胞または自己増殖ブレブの融合パートナーにより発現され、前記細胞における前記タンパク質またはペプチドの発現に必要なプロモーターおよび調節セグメントを含む。好適な挿入されたヘテロローガスなＲＮＡの例としては、これらに限定されないが、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、水疱性口内炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスをはじめとする広範囲のウイルスから得られるウイルスＲＮＡが挙げられる。
【００３５】
挿入されたヘテロローガスなＲＮＡを提供するために使用できる好適なウイルスＲＮＡ遺伝子の例としては、これらに限定されないが、パラインフルエンザウイルス１〜４型のＨＮおよびＦ遺伝子、特にパラインフルエンザウイルス３型のＨＮおよびＦ、インフルエンザヘマグルチニン遺伝子、インフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子、レンチウイルス糖タンパク質エンベロープ遺伝子、ＨＩＶエンベロープｇｐ１６０遺伝子、およびＨＩＶマトリックスカプシド融合遺伝子が挙げられる。本発明のもう一つ別の具体例において、挿入されたヘテロローガスなＲＮＡは、呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質または呼吸器合胞体ウイルスＦおよびＧタンパク質の両方をエンコードする。
【００３６】
一具体例において、レプリコンＲＮＡ、第一ヘルパーＲＮＡおよび第二ヘルパーＲＮＡは、第一分子、すなわちレプリコンＲＮＡが、パッケージングセグメントをエンコードするＲＮＡおよび融合活性をエンコードする挿入されたヘテロローガスなＲＮＡを含み、第二の分子、すなわち第一ヘルパーＲＮＡが、必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも１つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないＲＮＡを含み、第三の分子、すなわち第二のヘルパーＲＮＡが、必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも１つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないＲＮＡを含むように、独立した分子上に提供される。例えば、本発明のもう一つ別の具体例において、ヘルパー細胞は、（ａ）アルファウイルスパッケージング配列をエンコードするＲＮＡおよび融合活性をエンコードする挿入されたヘテロローガスなＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡ、（ｂ）アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含む第一ヘルパーＲＮＡ、ならびに（ｃ）アルファウイルスＥ１糖タンパク質、アルファウイルスＥ２糖タンパク質およびカプシドタンパク質が宿主細胞において集合してアルファウイルスレプリコン粒子を形成するように、アルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするＲＮＡを含む第二のヘルパーＲＮＡを含むＲＮＡの組み合わせを含む。
【００３７】
別の具体例において、レプリコンＲＮＡおよび第一ヘルパーＲＮＡは、別の分子上にあり、レプリコンＲＮＡおよび第二のヘルパーＲＮＡは１つの分子上に一緒にあるので、第一分子、すなわち第一ヘルパーＲＮＡは必要とされるアルファウイルス構造タンパク質の少なくとも１つをエンコードするが、全部をエンコードするわけではないＲＮＡを含み、第二の分子、すなわちレプリコンＲＮＡおよび第二のヘルパーＲＮＡは、パッケージングセグメント、挿入されたヘテロローガスなＤＮＡおよびカプシドタンパク質をエンコードするＲＮＡを含む。従って、カプシドタンパク質は、第二のヘルパーＲＮＡによりエンコードされるが、第二のヘルパーＲＮＡはレプリコンＲＮＡと一緒に第二の分子上に位置する。例えば、本発明の一具体例において、ヘルパー細胞は：（ａ）アルファウイルスパッケージング配列、挿入されたヘテロローガスなＲＮＡ、およびアルファウイルスカプシドタンパク質をエンコードするＲＮＡを含むレプリコンＲＮＡ、および（ｂ）アルファウイルスＥ１糖タンパク質およびアルファウイルスＥ２糖タンパク質をエンコードするＲＮＡを含む第一ヘルパーＲＮＡを含む一組のＲＮＡを含むので、アルファウイルスＥ１糖タンパク質、アルファウイルスＥ２糖タンパク質およびカプシドタンパク質は宿主細胞において集合してアルファウイルス粒子を形成する。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「細胞変性効果（ＣＰＥ）」なる用語は、個々の培養された細胞またはウイルス感染による細胞において誘発される著しい形態上の変化を意味する。一般に、ＣＰＥは光学顕微鏡下で容易に見ることができる。ＣＰＥは、これらに限定されないが、以下の細胞現象を包含する：合胞体形成、単層破壊、円形化、収縮、屈折率の増大、融合、凝集、付着性の損失または溶解。これらの現象は、特定のウイルス、細胞型および状態に応じて単独または組み合わせで起こり得る。
【００３９】
本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含むことができる。アジュバントは、免疫原または抗原と一緒に投与された場合に免疫反応を向上させる物質である。これらに限定されないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５７２３１２７号参照）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（およびその突然変異形態）、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（例えば、米国特許第５０７８９９６号参照）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦ、および腫瘍壊死因子αおよびβをはじめとする多くのサイトカインまたはリンホカインが免疫調節活性を有することが証明されており、従ってアジュバントとして使用することができる。本発明において有用なさらに別のアジュバントとしては、これらに限定されないが、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳをはじめとするケモカインが挙げられる。付着分子、例えばセレクチン、たとえはＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンもアジュバントとして有用である。さらに別の有用なアジュバントとしては、制限なく、ムチン様分子、例えばＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１、インテグリン科のメンバー、例えばＬＡＦ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５、イムノグロブリン超科のメンバー、例えばＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭｓ、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３、副刺激分子、例えばＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子、表皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮成長因子をはじめとする成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦレセプター、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６をはじめとするレセプター分子が挙げられる。さらに別のアジュバント分子としては、カスパーゼ（ＩＣＥ）が挙げられる。国際特許公開番号ＷＯ９８／１７７９９およびＷＯ９９／４３８３９（本発明の一部として参照される）を参照。
【００４０】
免疫反応を向上させるために使用される好適なアジュバントとしては、制限なく、ＭＰＬ（３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピッド；Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）（米国特許第４９１２０９４号（本発明の一部として参照される）に記載）が挙げられる。合成リピッドＡ類似体またはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはＣｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）から入手可能であり、米国特許第６１１３９１８号（本発明の一部として参照される）に記載されているその誘導体または類似体もアジュバントとしての使用に好適である。このようなＡＧＰの１つは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（５２９とも称する（以前はＲＣ５２９と称していた）である。この５２９アジュバントは、水性形態として、または安定なエマルジョンとして処方される。
【００４１】
さらに他のアジュバントとしては、鉱物油および水エマルジョン、アルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリアクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死菌ボルデテラ、サポニン、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ．）（米国特許第５０５７５４０号（本発明の一部として参照される）に記載）、およびこれから生じる粒子、例えばＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌リポ多糖類、合成ポリヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（米国特許第６２０７６４６号（本発明の一部として参照される）に記載）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはイー・コリ易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９が挙げられ；例えば国際特許公開番号ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５参照。
【００４２】
国際特許公開番号ＷＯ００／１８４３４に記載されているもの（アミノ酸位２９のグルタミン酸が別のアミノ酸（アスパラギン酸以外）、好ましくはヒスチジンにより置換されているもの）を包含するコレラ毒素およびその突然変異体もアジュバントとして有用である。同様にＣＴ毒素または突然変異体は、公開国際特許出願番号ＷＯ０２／０９８３６８（アミノ酸位１６のイソロイシンが別のアミノ酸により、単独またはアミノ酸位６８のセリンの別のアミノ酸による置換と組み合わせて置換されている；および／またはアミノ酸位７２のバリンが別のアミノ酸により置換されている）に記載されている。他のＣＴ毒素は、公開国際特許出願番号ＷＯ０２／０９８３６９（アミノ酸位２５のアルギニンが別のアミノ酸により置換されている；および／またはアミノ酸がアミノ酸位４９に挿入されている；および／または２つのアミノ酸がアミノ酸位３５および３６で挿入されている）に記載されている。
【００４３】
実施例
本発明を以下の実施例により説明する。しかしながら、本明細書のどこにおいてもこれらまたは他の実施例の使用は例示のみであり、本発明の範囲および意味または任意の例示された用語を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書に記載されている特定の具体例に限定されない。実際、本発明の多くの修飾および変更は、本明細書を読むと当業者には明らかであり、その精神および範囲を逸脱することなく行うことができる。
【００４４】
実施例１：ＰＩＶタンパク質を発現するＶＲＰのプラスミド構築
本発明は、ヒトＰＩＶ−３をモデルパラインフルエンザウイルスとして使用する。ヒトＰＩＶ３ウイルスストック（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ４７８８５／５７株）を既に記載されているようにして調製した。Ｓｔｏｋｅｓ、Ａ．ら、 Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：９１−１０３（１９９２）参照。ウイルスストックをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈降により精製した。Ｔｒｉｚｏｌ−ＬＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりＲＮＡを抽出し、Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いた逆転写ＰＣＲのテンプレートとして使用した。５’Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含むＮ、Ｐ、Ｍ、Ｃ、ＨＮ、およびＦのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体にわたるフラグメントを増幅するためにプライマーを使用した。得られたフラグメントを次いで次の制限エンドヌクレアーゼで消化した：ＦについてＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ、ＨＮについてＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ、ＮＰについてＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ、ＰおよびＣについてＡｃｃＩおよびＸｂａＩ、ならびにＭについてＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ。得られたフラグメントをシャトルプラスミドｐＫＳＲ１中にクローンした。その後、シャトルプラスミドから得られるＡｐａＩ−ＯＲＦ−ＮｏｔＩカセットを、ＶＥＥＶ ２６サブゲノムプロモーターの下流で、その制御下にあるｐＶＲ２００中にサブクローンして、レプリコン発現プラスミドｐＶＲ（ＮＰ）、ｐＶＲ（Ｐ）、ｐＶＲ（Ｍ）、ｐＶＲ（Ｃ）、ｐＶＲ（Ｆ）およびｐＶＲ（ＨＮ）を生成させた。
【００４５】
２つのＰＩＶ遺伝子を含有するレプリコンを生成させるために、第二のＡｐａＩ−ＯＲＦ（ＨＮ）−ＮｏｔＩカセットをＦ遺伝子の下流のｐＶＲ（Ｆ）プラスミド中にサブクローンし、２つの外因性遺伝子を含有するレプリコンプラスミドｐＶＲ−Ｆ／ＨＮを生成させた。図１参照。加えて、ＶＥＥカプシドタンパク質（ｐＶ３０１４ｄｅｌｔａ５２０−７５０５ｄｅｌｔａ８４９５−１１２２９）または表面糖タンパク質ｇｐＥ１／Ｅ２（ｐＶ３０１４ｄｅｌｔａ５２０−７５０５ｄｅｌｔａ７５６５−８３８６）を発現できる２つのヘルパープラスミドをレプリコンパッケージングに使用した。Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１（１９９７）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。ダイターミネーターサイクルシーケンシングおよび３７７ＡＢＩ ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて得られるプラスミドを配列決定した。
【００４６】
実施例２：ＶＲＰ産生
この実施例は、実施例１において構築されたプラスミドからＲＮＡをＢＨＫ２１細胞中にエレクトロポレーションすることによりＰＩＶ３の抗原のそれぞれを発現するＶＲＰがどのように生成したかを説明する。もとのＶＥＥプラスミドｐＶＲ１００、および２つのヘルパープラスミドｐＨＣ（カプシド）およびｐＨＣ（ｇｐＥ１／Ｅ２）をＡｌｐｈａＶａｘ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）から入手した。Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１（１９９７）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。ＰＩＶ３糖タンパク質遺伝子のＲＴ−ＰＣＲフラグメントをｐＶＲ２００中に個々にまたはｐＶＲ１００中に（ＨＮとＦ一緒に）クローンした。生成したプラスミドを次いでインビトロ転写に付して、ＲＮＡを生成させた。ＲＮＡを次いでＢＨＫ２１細胞中にエレクトロポレーションして、ＮＰ、Ｍ、Ｐ、Ｃ、Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子（ＶＲＰ−ＮＰ、−Ｍ，−Ｐ，−Ｃ、−ＨＮ、−Ｆ、−Ｆ／ＨＮ）のいずれかをそれぞれエンコードするＶＲＰを生成させた。
【００４７】
個々のＰＩＶ遺伝子を得、これらを適当な発現ベクター中にクローンした後、ＮｏｔＩ直線化プラスミドテンプレートおよびｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてキャップされたＲＮＡ転写物を次いでインビトロで調製した。製造業者の指示に従って反応を行った。いずれかのプラスミドｐＶＲ（ＮＰ）、ｐＶＲ（Ｍ）、ｐＶＲ（Ｐ）、ｐＶＲ（Ｃ）、ｐＶＲ（ＨＮ）、ｐＶＲ（Ｆ）、ｐＶＲ（ＨＮ）＋ｐＶＲ（Ｆ）、またはｐＶＲ−Ｆ／ＨＮから得られる５０μｇの各ＲＮＡを、ヘルパープラスミドから得られる５０μｇのＲＮＡと共にＢＨＫ２１細胞中にエレクトロポレーションすることによりレプリコン粒子産生細胞を生成させた。Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１（１９９７）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。処理されたＢＨＫ細胞を次いでＴ−１７５フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培地は、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）と高グルコース、１０％ウシ胎仔血清および１％ピルビン酸ナトリウムから構成されていた。次に、培養上清をエレクトロポレーション後４８時間に収穫し、３２００ｒｐｍで遠心分離することにより清澄化させた。ＶＲＰをＰＢＳ中に再懸濁させ、ＢＨＫ２１細胞を感染させ、適当なＰＶＩ３特異性抗体を用いて免疫染色することにより力価を決定した。
【００４８】
実施例３：ＶＲＰおよびＰＩＶのウイルス価
ＰＩＶタンパク質および糖タンパク質を発現するＶＥＥレプリコン（ＶＲＰｓ）を免疫組織化学法により滴定した。ＶＲＰをＢＨＫ−２１系中で増殖させた。この場合、ＢＨＫ細胞は、擬似表現型特性を共有しない他のＢＨＫクローン集団から区別するために、ＣＣＬ−１０クローンから誘導された。本明細書において定義されるように、細胞はＢＨＫ２１または単にＢＨＫ細胞と称する。ＢＨＫ２１単層を連続希釈されたＶＥＥレプリコン：ＶＲＰ−ＮＰ；ＶＲＰ−Ｐ；ＶＲＰ−Ｍ；ＶＲＰ−Ｃ；ＶＲＰ−ＨＮ；ＶＲＰ−Ｆ； ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮおよびＶＲＰ−ＧＦＰで感染させ、３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。単層を次いで１：１アセトン／メタノールで５分間固定し、細菌から発現されたウサギ抗ＶＥＥ ＮＳＰ１タンパク質、ポリクローナルＡｂ ｒ８３５またはウマ抗ＰＩＶ３血清のいずれかで染色した。ｃｙＴＭ３接合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）またはホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＯＵＲＰ）接合抗ウマＡｂ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＭＤ）＋アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）パーオキシダーゼ基質キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）の何れかによりプラークを次いで検出した。プラークの数を顕微鏡下で計測し、ＶＥＥレプリコンについては１ｍｌあたりの感染単位（ｉｕ／ｍｌ）として、またはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコン感染から生じた二次感染粒子については１ｍｌあたりの合胞体形成単位（ｓｆｕ／ｍｌ）として記録した。
【００４９】
ＰＩＶ３ Ｗａｓｈ４７８８５／５７ウイルスストックまたは組織ホモジネートを、記載されているような修飾Ｈｅｍａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ検定（ＨＡＤ）プロトコルにより測定した。Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２ （１９９７）；Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０ （１９９８）参照。簡単に説明すると、１０倍連続希釈されたサンプルをＬＬＣ−ＭＫ２単層の９６穴プレート中、３７℃で滴定した。培養中、上清を６〜７日後に集め、０．５％モルモット赤血球を用いたＨＡ検定に付した。サンプル１ｍｌあたりの平均Ｌｏｇ１０ＴＣＩ５０を計算した。
【００５０】
実施例４：動物免疫化および攻撃
非免疫ハムスターの特定のＰＩＶタンパク質を発現するＶＲＰレプリコンでの免疫化は、その後のＰＩＶ感染からの防御免疫を惹起する。ＰＩＶ３に対して血清反応陰性の５〜８週令のゴールデンハムスターをＶＥＥレプリコン：ＶＲＰ−ＮＰ；ＶＲＰ−Ｐ；ＶＲＰ−Ｍ；ＶＲＰ−Ｃ（ＰＩＶ−３タンパク質ＮＰ、Ｐ、Ｍ、ＰＩＶ３のＣまたはＧＦＰを対照として発現）で、鼻内（ｉ．ｎ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）のいずれかで免疫化した。用量を表１に示す。動物を初期免疫化の３週間および５週間後に同じ用量（表１）で追加免疫した。７週間後に、ハムスターを１×１０６ＬｏｇＴＣＩＤ５０のＰＩＶ３（Ｗａｓｈ４７８８５／５７ウイルス株）で攻撃した。攻撃後４日に、鼻介骨および肺組織を集め、均質化した。Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２ （１９９７）；Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０ （１９９８）参照。これらのホモジネートにおけるＰＩＶ３複製を前記実施例３において記載されているようにしてＨＡＤアッセイにより分析した。全てのゴールデンハムスターおよびＢＡＬＢ／ｃマウスはチャールズ・リバー・ラボラトリー（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、現行のＮＩＨの“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，”および連邦政府および州法およびＷｙｅｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓにより維持されている現在行われている手順に従って飼育した。
本発明の一具体例において、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子は、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために使用される場合に細胞変性効果を誘発する。もう一つ別の具体例において、レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清は、未感染細胞単層に移された場合に、レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発する。本発明のもう一つ別の具体例において、細胞変性効果は、合胞体形成、単層破壊およびアポトーシスからなる群から選択される。
【００５１】
【表１】
【００５２】
ハムスターはＰＩＶ３複製およびＶＥＥ感染を支持する最小の動物モデルであるので、実験モデルとしてハムスターを使用して、ＰＩＶ３の内部タンパク質が動物においてＰＩＶ３感染に対して防御を提供する能力を調査した。Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２３４−１３３０ （１９９９）参照。表１は、免疫化および攻撃後のＬＲＴおよびＵＲＴにおいて得られるウイルス価を示す。ｉ．ｎ．またはｉ．ｍ．により投与された１×１０６〜１×１０７ｉ．ｕの範囲の用量でＮＰ、Ｐ、Ｍ、またはＣのいずれかを発現した全てのＶＲＰは、ＶＲＰ−ＧＦＰおよびＰＢＳ群と比較して明らかな防御を示さなかった（表１）。生弱毒化ＰＩＶ３ウイルスであるｃｐ４５のみが、ハムスターをＰＩＶ３感染から防御できた。従って、内部タンパク質ＮＰ、Ｐ、Ｍ、およびＣはＰＩＶ３に対する免疫原性組成物中に封入するための候補としての効率をほとんどまたは全く有さないと結論づけられた。
【００５３】
ＶＲＰ発現ＨＮおよび／またはＦの防御を提供する能力を次に調べた。ハムスターを同じスケジュールおよび表２に示す用量で免疫化した。表２に示される結果は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化動物のみがＵＲＴにおいてほとんど完全に防御されたことを示す。ＶＲＰ−ＨＮ単独で免疫化されたハムスターは、ＵＲＴにおいて約１００倍ウイルス価が減少した。ハムスターをＶＲＰ−Ｆ／ＨＮではなくＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆでｉ．ｎ．免疫化すると、ＵＲＴにおいて１０倍しかウイルス複製が減少しなかった。さらに、ＶＲＰ−Ｆ免疫化は、ＵＲＴにおいて血清中和価および防御を惹起せず、ＬＲＴにおいてウイルス複製が１０倍だけ減少した（表２、実験１）。従って、ｉ．ｎ．免疫化により、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮを含む免疫原性組成物は、有意なレベルの中和価、ならびにＬＲＴにおいてＰＩＶ３感染に対する完全な防御を誘発し、ＵＲＴにおいてＰＩＶ３感染の重篤度を軽減した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
一般に、筋肉内免疫化は、ＰＩＶ３に対する防御免疫の惹起において鼻内免疫化よりも有効でない。例えば、筋肉内（ｉ．ｍ．）によりＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆで免疫化された動物は、ＬＲＴにおいてその後の攻撃感染から完全な防御をもたらしたこれらのレプリコンでの鼻内免疫化と比べて、約３ｌｏｇ１０ＬＲＴにおいてウイルス価が減少した（表２、実験１）。
ここでも、最も有効な免疫原性は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで得られ、これはｉ．ｍ．およびｉ．ｎ．免疫化のどちらについてもＬＲＴにおけるその後の攻撃感染から完全な防御をもたらした（表２、実験２）。完全な防御は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ以外のＶＲＰを用いたｉ．ｍ．免疫化により達成されなかった（表２）。
データから、ｉ．ｍ．免疫化によりＵＲＴにおいてウイルス価の減少および感染の重篤度の軽減という形態での一連の防御が可能であることが示された。特に、ＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ、ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆを用いた筋肉内免疫化の結果、ＰＢＳ対照と比較して約１０倍〜約１００倍の範囲でウイルス価が減少した（表２、実験１および２）。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮは、ｉ．ｎ．免疫化ほど有効でないが、ｉ．ｍ．により投与された場合にＬＲＴ感染に対して防御するための最良の候補であった。
【００５６】
実施例４’：ＰＩＶに対する体液性応答
Ａ．ＰＩＶ３特異性Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ：
マウスのリンパ節におけるＰＩＶ３特異性Ｉｇ分泌細胞をＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定した。簡単に説明すると、免疫化マウスのリンパ節から得られる単細胞懸濁液を、３７℃、５％ＣＯ２中、一夜、１００ｎｇの製剤で分裂させたＰＩＶ３ウイルスでコートされた９６穴イムロンＩＩプレート上（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， Ｍａｓｓ．）でインキュベートした。細胞を次いで洗浄し、プレートに結合したＰＩＶ３−特異性全ＩｇまたはＩｇＡを、それぞれアルカリホスファターゼ接合体ヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡの混合物またはＩｇＡ単独により検出した。スポットを次に、アルカリホスファターゼ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて展開させ、Ｏｌｙｍｐｕｓ解剖顕微鏡（Ｌｅｅｄｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， Ｍｉｎｎ．）下で計測することにより定量化した。結果を１ｘ１０６細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として記録する。
【００５７】
Ｂ．ウイルス中和検定
ハムスター血清がＰＩＶ３ウイルス粒子を中和する能力を、ヘマグルチン化阻害検定（ＨＩ）により測定した。簡単に言うと、熱不活化血清を、レポーター破壊酵素（ＲＤＥ）（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）で１８〜２０時間３７℃で処理して、０．４％モルモットＲＢＣ（ｇｐＲＢＣ）で４℃で１時間インキュベートすることにより非特異性アグルチニンをさらに除去する前に、非特異性阻害剤を除去した。０．５％ｇｐＲＢＣを凝集させるために、ＰＩＶ３ウイルスの４ＨＡ単位を阻害するために、連続希釈処理された血清の終点を次に決定した。
ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮの示された保護有効性が、その保護効果の調査につながった。呼吸器病原体からの防御は、一般に粘膜免疫と関連する。したがって、肺または鼻のいずれかを排液する縦隔リンパ節（ＭＬＮ）および頚部リンパ節（ＣＬＮ）におけるＩｇＡ産生細胞の誘発を評価した。この場合、ハムスターの適当な検出試薬が入手できなかったので、マウスモデルを使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ハムスターについてと同じ免疫化スケジュールにしたがってＶＲＰ−ＨＮまたはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで免疫化した（ｉ．ｎ．）。個々のＣＬＮを集め、ＭＬＮをプールした。単細胞懸濁液をＬＮから調製し、全Ｉｇ分泌細胞またはＩｇＡ分泌細胞をＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ技術により分析した。
【００５８】
ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮでの免疫化は、他のＶＲＰでの免疫化と比較して高レベルの抗原特異性ＩｇＡを誘発した。例えば、ＶＲＰ−ＨＮでの免疫化は、ＣＬＮにおいてＰＩＶ３特異性Ｉｇ分泌細胞１ｘ１０６個あたり約８００ＳＦＣを誘発した。これらのうち、わずか約１０％のＩｇ分泌細胞がＰＩＶ−３特異性ＩｇＡ分泌細胞であった（１ｘ１０６細胞あたり１００ＳＦＣ未満）。対照的に、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化は、ＣＬＮにおいて１ｘ１０６個のＰＩＶ３特異性Ｉｇ−ＳＦＣあたり約４００ＳＦＣを誘発した。重要なことに、抗原特異性ＩｇＡ ＳＦＣの数は、ＶＲＰ−ＨＮ（１ｘ１０６細胞あたり約２５０ＳＦＣ）よりもパーセンテージ基準でずっと多かった。この場合、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化群におけるＩｇ分泌細胞の６０％より多くがＩｇＡであった。従って、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮはＵＲＴにおける抗原特異性ＩｇＡ産生を優先的に誘発し、これはより良好な防御効率と相関した（表２）。
【００５９】
ＭＬＮにおいて、ＰＩＶ−３特異性全Ｉｇ分泌細胞またはＩｇＡ分泌細胞の量は、ＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化の両方について類似し、両免疫化がハムスターのＬＲＴにおけるウイルス複製を完全に除去したという事実と一致した（表２）。
ウイルス攻撃後の防御免疫における中和抗体の役割を調べた。血清サンプルをＰＩＶ３攻撃の２日前に集め、ＰＩＶ中和価を測定した。表２は、中和価は、ＰＢＳ対照群において検出されず、ＬＲＴおよびＵＲＴにおけるウイルス複製はそれぞれ５．８±０．４および５．２±０．２のレベルまでであったことを示す。全実験群のうち、ＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ、またはＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−Ｆの組み合わせ（ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ）の免疫化により、著しいレベルのＨＩ価が誘発され、それぞれ６．３、７．１、および７．５のレベルに達し、これはｃｐ４５免疫化群（データは省略）に匹敵し、ＬＲＴにおいて完全な防御を示した。
【００６０】
実施例５：ＰＩＶ防御の最小投与量
有効な防御のために必要なＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ免疫化の最小投与量を評価した。２ｘ１０４ｉｕの用量でのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮは、ｉ．ｎ．投与された場合に、感染からＬＲＴを防御し、ウイルス複製を１００倍低下させることによりＵＲＴ感染に対して部分的防御をもたらした（表３、実施例１）。さらに、３回目の注射は不必要に思われ、ＬＲＴ感染を予防するためには、１ｘ１０４ｉ．ｕ．の用量での２回の注射で十分であった。１ｘ１０４ｉｕのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮを１回投与するだけでは十分でなかった（表３、実験２）。従って、ハムスターモデルにおいて、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮは、下および上気道におけるＰＩＶ３複製の確立を予防するための最も有効な方法であった。ＬＲＴ感染に対抗するために有効なＶＲＰ−Ｆ／ＨＮの投与量は、１ｘ１０４ｉｕで２回免疫化程度の低さであってよい。
データから、ＬＲＴにおけるウイルス複製を検出不能なレベルまで減少させ、ＵＲＴにおいてウイルス複製のレベルを約１００倍減少させるために、１×１０４ｉｕのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮを２回投与することによる免疫化で十分であることが示された。これは、ＰＩＶおよびＲＳＶ随伴肺炎などのある種の合併症を予防できるサブユニット組成物を調製するための一方法を示唆するので、意味のある功績である。データは、ＨＮおよびＦがＰＩＶ３サブユニットワクチンデザインに必要な２つの重要な抗原であることを示す。
【００６１】
【表３】
【００６２】
実施例６：ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染から起こる細胞変性効果
Ａ．アポトーシス
ＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ、またはＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆと比較すると、免疫原性組成物としてのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮの有効性は、作用機序の調査につながった。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染が培養における他のＶＲＰ感染と比較して独自のＣＰＥに至ることが観察された。これらのＶＲＰが培地中で増殖された場合のアポトーシスに至る可能性を調査した。ＢＨＫ２１単層をＶＲＰ−Ｆ／ＨＮまたはＶＲＰ−ＨＮで、ＭＯＩ＝０．５で感染させるか、または感染させなかった（対照として）。表４参照。単層形態を位相差顕微鏡下、１００倍の倍率で、感染後２４、４８、および７２時間に観察した。表４参照。ＣＰＥデータを、ＢＨＫ単層が破壊されて軽度のＣＰＥを示すか（＋）、または単層細胞がひどく破壊され、膜ブレブが形成されているかどうか（＋＋）または単層が完全に除去されて、ブレブおよびデブリスが上清中に残っているかどうか（＋＋＋）により特徴づけた。表４参照。
【００６３】
表４に示されるように、ＢＨＫ細胞がＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで感染した場合、２４時間後に、ＢＨＫ単層はＶＲＰ−ＨＮまたは他のＶＲＰ（データは省略）感染と比較して、破壊された。４８時間後、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮでの感染は、単層破壊を誘発し、明確な合胞体および膜ブレブが形成された。７２時間までに、単層は完全に除去され、ブレブおよびデブリスが上清中に残され、一方、ＶＲＰ−ＨＮで感染した群は、無傷の単層と全体を通してのアポトーシス事象による円形化を示した。表４参照。
【００６４】
【表４】
【００６５】
Ｂ．プラーク形態
従来の研究は、Ｆタンパク質の融合特性は、ＨＮタンパク質の存在を必要とし（Ｅｂａｔａ， Ｓ． Ｎ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８３：４３７−４４１（１９９１））、一方、それ自体はＨＮもＦも合胞体形成を誘発できなかったことを示していた。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染による独自のＣＰＥが合胞体形成による可能性を次に調べた。
細胞のＢＨＫ２１単層を異なるＶＲＰ、例えばＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ、ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−ＦまたはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで１５〜１８時間感染させ、単層を次いで固定し、ウマ抗ＰＩＶ３ポリクローナルＡｂ、次いで基質としてホースラディッシュパーオキシダーゼ接合抗ウマＡｂ＋アミノエチルカルバゾールパーオキシダーゼで；あるいはウサギ抗ＶＥＥ ＮＳＰ１ポリクローナルＡｂ ｒ８３５＋ｃｙＴＭ３接合ヤギ抗ウサギ抗体で染色した。明視野または蛍光顕微鏡下、１００倍の倍率で写真を撮影した。
【００６６】
予想されるように、ＶＲＰ−ＨＮまたはＶＲＰ−Ｆはそれ自体、個々のＶＲＰ感染により形成される明らかなＨＮ−またはＦ−発現プラークを示した。しかしながら、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染群における「プラーク」は、非常に大きなサイズを有し、容易に肉眼で見ることができた。多核化細胞がこれらの「プラーク」内で明らかに見られるので、これらの大きな「プラーク」は、実際に合胞体の形成を表した［合胞体形成に基づく滴定は、単一のレプリコンおよび複数の細胞に基づくので、感染単位（ｉｕ）の代わりに合胞体形成単位（ｓｆｕ）を要求した］。細胞がＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−Ｆに同時に感染した場合、合胞体形態を示す「プラーク」は少なかった（１％未満）。しかしながら、プラークは、ＶＲＰ−ＨＮまたはＶＲＰ−Ｆ感染単独により形成されるものと類似していた。プラークが抗ＶＥＥ ＮＳＰ１Ａｂで染色された場合に同じプラーク特性が見られた。合胞体形成も、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮからのＨＮおよびＦタンパク質の同時発現をさらに裏付けた。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染は実際に２つの異なるＣＰＥプロセス、アポトーシスおよび合胞体形成に至ると結論づけられた。
【００６７】
実施例７：ＨＮおよびＦの同時発現は感染性粒子を産生した
細胞の単層（「単層」）は非常に低い感染多重度（ＭＯＩ）（＜０．００１、データは省略）により破壊されるので、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ誘発ＣＰＥは非常に「伝染性」であることに注目された。従って、第二のレプリコンまたは感染性粒子のある形態が独自のＣＰＥから生成したと推測された。第二のレプリコンまたは感染性粒子は自己増殖性であり、ＨＮおよびＦ糖タンパク質に結合した膜を使用することにより他の細胞を感染させると融合プロセスが誘発された。
非レプリコン感染性薬剤が産生されたかどうかを評価するために、ＢＨＫ単層がＶＲＰ−Ｆ／ＨＮまたは他のＶＲＰで０．５のＭＯＩで３０分間感染させる実験をデザインした。単層を次いで３回洗浄して残存するＶＲＰを除去し、新鮮な培地を補充し、４８時間培養した。次に単層を、ＨＮおよびＦ発現について評価するためにウマ抗ＰＩＶ血清で染色するか、またはレプリコンＮＳＰ１タンパク質の存在を確認するためにＶＥＥのウサギ抗ＮＳＰ１で染色した。４８時間の最後に、細胞からの上清のアリコートを単層から除去し、新鮮なＢＨＫ単層を３０分間「感染」させるために使用した。３０分後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を補充し、４８時間インキュベートした。単層を次いでＣＰＥについて評価し、ＨＮおよびＦ発現についてはウマ抗ＰＩＶ３血清で、あるいはレプリコンタンパク質の存在を確認するためにはＶＥＥのウサギ抗ＮＳＰ１で染色した。最初の転移（第一転移）、もう一つの転移（第二転移）、および転移（第三転移）を通して工程を行った。全ての細胞を、ＨＮおよびＦ発現については抗ＰＩＶ３またはＶＥＥ ＮＳＰ１発現については抗ＶＥＥ ＮＳＰ１のいずれかで染色した。抗ＰＩＶ抗体については明視野下で、あるいは抗ＶＥＥ ＮＳＰ１抗体については蛍光顕微鏡下１００倍の倍率で写真を撮影した。免疫染色による発現の規模を、（−）から（＋＋＋＋＋）により表す。結果を表５に示す。
【００６８】
【表５】
【００６９】
ＶＲＰレプリコンでの感染の第一ラウンドにおいて、プラークは次のレプリコンで感染した細胞系において４８時間後に見ることができた：ＶＲＰ−ＨＮ、ＶＲＰ−Ｆ、およびＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ。表５参照。感染のこのラウンドにおいて、ヘルパープラスミドから誘導されるＶＥＥ糖タンパク質は細胞への侵入を促進した。
初期レプリコン感染におけるＣＰＥを考慮すると、ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ感染細胞は、ＨＮおよびＦの日和見的同時発現のために時々合胞体形成を示した。対照的に、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染は、４８時間後に細胞単層および明らかな合胞体の破壊を誘発した。表５参照。これらの全ては、ＶＥＥ ＮＳＰ１タンパク質を発現し、活性レプリコン活性を示した。表５参照。
感染の第二ラウンドにおいて、前記上清が新規単層に移された場合、ＶＲＰ−ＨＮおよびＶＲＰ−Ｆ処理群において新しい感染活性はなかった。表５参照。同様に、ＰＩＶ３ＨＮおよびＨのさらなる発現もなく、ＶＥＥ ＮＳＰ１産生もなかった。表５参照。これらの群において、ＶＥＥヘルパータンパク質の入力がないことは、本発明以前に予想されるように、感染プロセスに致命的であることがわかった。
【００７０】
しかしながら驚くべきことに、感染性粒子はヘルパープラスミド上のＶＥＥタンパク質／ＨＮの不在下で、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ処理細胞の上清において産生された。例えば、本発明者らは多量のＰＩＶ３糖タンパク質ＨＮおよびＨがＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ処理細胞からの上清を未感染細胞単層に移した後に生じることを見いだした。表５参照。プロセスにおけるこの段階で、感染プロセスは細胞誘導ブレブの表面上のＰＩＶ ＨＮおよびＦタンパク質の表面発現融合活性により行われると考えられる。
加えて、ＮＳＰ１タンパク質は、転移後にＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ処理群において産生されることが確認され、このことはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞上清における強力な感染活性を示す。表５参照。ＶＥＥ表面糖タンパク質発現は、抗ＶＥＥポリクローナル血清での染色を用いて検出できず、従って潜在的な組み換え事象によるＶＥＥウイルスが生成されないことを示す。従って、感染性物質は、もとのＶＥＥレプリコンＲＮＡからなり、これはＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、およびＰＩＶ３ＨＮおよびＦ遺伝子を含むＶＥＥレプリカーゼを有する。加えて、本発明者らはこれらの同じタンパク質が発現されることを示す。
【００７１】
次の転移における感染活性は、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦの同時発現により促進されるようである。ＰＩＶ３糖タンパク質ＨＮおよびＦ抗原染色はごくわずかの量であり、ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ群において検出可能なＮＳＰ１発現はなかった。表５参照。この理由は、合胞体誘発活性を有するあるレプリコンは初期ＶＲＰ感染に持ち越すからである。表５参照。この裏付けとして、この残存活性は第二転移に持ち越すことができず、さらなるＰＩＶ３抗原は検出されないことが見いだされた。表５参照。
ＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆ処理細胞で見られる感染活性がないことと対照的に、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染の第一転移を受ける細胞からの上清は、未感染細胞に適用された場合に、合胞体形成、単層破壊、ＰＩＶ３ ＨＮ＆Ｆ抗原染色およびＶＥＥ ＮＳＰ１抗原染色を含む「感染性」現象の別のラウンドを誘発する。ここでも、これらの感染活性の結果としての検出可能なＶＥＥ表面糖タンパク質発現はなく、さらにＶＥＥウイルス汚染を除外する。
【００７２】
「感染性」現象のさらなるラウンドは、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞からの上清が追加のＢＨＫ単層に移された場合に生じた。表５参照。ＢＨＫ単層も抗ＶＥＥポリクローナル血清で染色し、ＶＥＥ表面糖タンパク質発現を示さず、ＶＥＥウイルスが生成しなかったことを示す。
前記観察は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞から生じる「感染性」タンパク質により促進される融合活性が存在し、これらの活性は連続して移されるという仮説をさらに裏付けた。
【００７３】
実施例８：感染性粒子はレプリコンでなく、ブレブであった
その性質を確認するために電子顕微鏡を用いて感染性粒子の形態的性質を調べた。もっと良く調べることにより、感染性粒子がＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンであることが除外され、その代わりに感染性物質が感染した細胞から誘導されるブレブと確認され、これはＰＩＶ３ＨＮおよびＦを同時発現する。
まずＰＢＳ中１：２０に希釈することにより、電子顕微鏡用にＶＲＰ−Ｆ／ＨＮブレブを調製した。ＳｌｏｔおよびＧｅｕｚｅにより１９８４年に開発された手順を変更したものを用いてホールブレブ、陰性染色、イムノゴールドラベリングを行った。Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ， ｂｙ Ｓｌｏｔ ａｎｄ Ｇｅｕｚｅ， Ｐｏｌｌａｃｋ ａｎｄ Ｖａｒｎｄｅｌｌ ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ＢＶ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．参照。ベシクルの液滴をパラフィルム上に置き、ｆｏｒｍｖａｒ−炭素コーティングされた金格子を各液滴上に下向きに置いた。過剰の流体を除去し、ＰＢＳおよび１％ＢＳＡ（５ｍｌ）と、後に１％冷水魚肉ゼラチンを含有するＰＢＳ（１０ｍｌ）を用いて２段階でブロッキングを行った。ブレブを有する格子を、湿潤チャンバー中でＰＢＳ ＢＳＡ中（１ｈ）１：５０に希釈された抗Ｆ ｍＡｂクローンＢ−１０２または抗ＨＮ ｍＡｂクローン６８／２上で反転させた。格子をＰＢＳ ＢＳＡ中５×１ｍｌでリンスした。６ｎｍコロイド状金ビーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ， Ｗ． Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）と結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍとともにインキュベーションすることにより抗原を検出した。ＰＢＳ中でリンスした（４×１ｍｌ）。細胞を有する格子を１％ＰＢＳ中グルタルアルデヒド（３ｍｌ）で安定化させた。各サンプルを次いで希釈された水中でリンスした（５×１ｍｌ）。最後に、ベシクルを有する格子を１％ＰＴＡ、ｐＨ６．５を用いて陰性染色した（３０秒）。対照サンプルを一次抗体の不在下でインキュベートした。８０ｋＶで操作するＺｅｉｓｓ１０Ｃ透過型電子顕微鏡で調査を行った。
【００７４】
上清から得られる感染性粒子のサンプルの電子顕微鏡研究により、感染性粒子はＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンでないことが示された。ＶＥＥレプリコンはＶＥＥウイルスと大きさが非常に近い７０ｎｍウイルス粒子である。Ｐａｒｅｄｅｓら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：９５３２（２００１）参照。陰性染色により、サイズにおける有意な量の異質性が明らかになった。対照的に、ＶＥＥレプリコンはサイズが均質であることが知られている。
感染性粒子は、ＰＩＶ３ＨＮおよびＦ糖タンパク質の表面発現を示し、これは感染性物質としてのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンと一致しない。抗ＨＮモノクローナル抗体「クローン６８／２」および抗Ｆモノクローナル抗体「クローンＢ−１０２」を用いて、精製された感染性粒子をイムノゴールドラベリングに付した。結果から、ネズミＩｇイソタイプで染色された対照と比較して、感染性粒子は主に抗ＨＮおよび抗Ｆで染色されることがわかった。この結果は、ＶＥＥ糖タンパク質のみがレプリコンの表面上で発現されるので、感染性物質がレプリコンベースでないことをさらに裏付ける。ＶＥＥレプリコンのパッケージング特性に従って、ＰＩＶ３−ＨＮおよびＦ糖タンパク質はレプリコン粒子から除外される。Ｓｔｒａｕｓ， Ｊ．Ｈ． ＆ Ｓｔｒａｕｓｓ Ｅ．Ｇ．， Ｔｈｅ Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ： Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８（３）：４９１−５６２（１９９４）（その開示は全体として本発明の一部として参照される）参照。
【００７５】
実施例９：ＨＮおよびＦによる感染性ブレブの感染性
これらの感染性ブレブの細胞侵入を媒介する表面タンパク質の同一性を、特定のタンパク質に対する抗体が感染性を阻害するかどうかを評価することにより判断した。まず、ＧＦＰをエンコードする感染性ブレブまたはＶＥＥレプリコンを様々な抗体、例えば抗ＰＩＶ３血清；抗ＨＮ ｍＡｂ；抗Ｆ ｍＡｂ；抗ＨＮ ｍＡｂ＋抗Ｆ ｍＡｂ；正常血清およびイソタイプ対照ネズミＩｇと共に２時間プレインキュベートした。次に、ＢＨＫ単層を１時間、これらのプレインキュベートされた感染性ブレブまたはＶＥＥレプリコンで感染させた。単層を次いで洗浄し、成長培地と置換した。細胞を固定し、ウサギ抗ＶＥＥ ＮＳＰ１およびｃｙＴＭ３接合ヤギ抗ウサギ抗体で一夜染色することにより、ブレブによる感染を測定した。５時間培養後の緑色蛍光タンパク質の発現によりＶＥＥレプリコンによる感染を調べた。感染の規模の徴候を表６において（＋）、または（＋＋）として採点した。感染の徴候が無い場合は（−）と採点した。
【００７６】
【表６】
【００７７】
表６に示したデータから、感染性ブレブを抗ＰＩＶ３ポリクローナル抗血清またはＰＩＶ３ＨＮに対するモノクローナル抗体とともにプレインキュベーションすると、ブレブが自己増殖するかまたは新規細胞に感染する能力を完全にブロックしたことがわかる。ブレブをＰＩＶ３の融合タンパク質に対する単一のモノクローナル抗体と共にインキュベートした場合、感染性は幾分減少するが、全体的には阻害されなかった。ブレブをＶＥＥタンパク質に対するモノクローナル抗体とともにプレインキュベーションすることは、ブレブ感染性に対して効果が無かった。
抗体プレインキュベーションのその後の感染性に対する影響は、ブレブでなくレプリコンを使用した場合には非常に異なっていた。例えば、ＰＩＶ３に対するポリクローナル抗血清も、ＰＩＶ３糖タンパク質ＨＮおよびＦに対するモノクローナル抗体も、ＶＲＰ−ＨＮ／Ｐ感染性を阻害できなかった。表６参照。対照的に、ＶＥＥ表面糖タンパク質に対するモノクローナル抗体と共にプレインキュベーションした場合だけ、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染性を阻害することができた。
感染性の抗体阻害のこれらの研究からいくつかの重要な点を引き出すことができる。まず、感染性阻害の結果は、ＨＮおよびＦタンパク質は自己増殖ブレブの表面上に位置することを示した。結果はさらに、感染性と見られる自己増殖活性が、自己増殖ブレブの表面上に位置する融合性糖タンパク質ＰＩＶ３ ＨＮおよびＦにより促進されることを示した。対照的に、これらの結果は、レセプターと結合し、細胞を感染させるためにレプリコンが使用される場合に感染の第一ラウンドを行うＶＥＥ構造タンパク質Ｅ１およびＥ２であることを裏付けた。
【００７８】
実施例１０：感染性ブレブ対レプリコンの増幅
次に、これらの感染性自己増殖ブレブがウイルスのように増幅されるかどうか、またこのような増幅がもとのレプリコンの成長特性とどのように比較されるかを調べた。これを行うために、まず、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンを次のようにして増幅した：（ｉ）準融合性ＢＨＫ細胞のＴ−１７５フラスコを約１×１０５ｉｕ（ｓｆｕ）のＶＲＰ−Ｆ／ＨＮで１時間感染させ；（ｉｉ）次に、細胞を洗浄し、新鮮な培地で置換し；（ｉｉｉ）ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ滴定についてと同じプロトコルを用いて合胞体形成活性を経時的にモニターした。最初の１６時間で、低力価の感染活性が存在することが判明した（〜３００ｓｆｕ）。合胞体は、滴定工程中に形成され、これはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮと類似した形態を示した。約４０時間後、合胞体形成活性はほぼ２５００倍に劇的に増大し、さらに７２時間変化しないままであった。従って、レプリコン粒子のバーストサイズは約０．１と計算された。
【００７９】
比較して、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞から生じる「感染性ブレブ粒子」がレプリコンのように増幅される能力を調べた。ここでも、約８０％コンフルエンシーのＢＨＫ細胞のＴ−１７５フラスコを使用し、これをＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染細胞の培養上清の形態の約１×１０４ｓｆｕの自己増殖ブレブで１時間感染させた。次に、細胞を洗浄し、新鮮な培地で置換し、合胞体形成活性を経時的にモニターした。合胞体形成活性により測定される自己増殖ブレブの増幅は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンの増幅よりも良好であった。自己増殖ブレブの成長曲線は、最初の１６時間は低い力価（〜５００ｓｆｕ）を示し、続いて最初の４０時間で合胞体形成活性において大幅に５６０倍増大した。その後、最初の感染後約１１２時間で、合胞体形成活性の力価は約１５０００倍まで増大した。このデータはさらに、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染は、自己増殖ブレブと称する感染性粒子を生じさせ、これはさらに自己増殖することができたことを裏付ける。これらの第二の「感染性ブレブ」粒子は、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染からのみ生じることができ、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ、ＶＲＰ−ＦまたはＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆからは生じなかった。この現象は、適当な防御免疫の有効なプライミングおよびＰＩＶ３感染に対する免疫原性組成物の候補としてのＶＲＰ−Ｆ／ＨＮの有効性をさらに説明する。
【００８０】
実施例１１：感染性ブレブのキャラクタライゼーション
典型的な物理現象、例えば凍結−乾燥、撹拌、−８０℃に７日間凍結、２５０００ｐｍで２０分間遠心分離、および０．２μｍ、０．４５μｍ、および０．８μｍフィルターを通した濾過に対して自己増殖ブレブの脆弱可能性を調べた。ブレブを各物理試験に付す前後に滴定し、結果を以下の表７に示す。
これらの結果から、凍結、撹拌、および遠心分離などの日常的現象に直面した場合、物理的にブレブの感染性は強固であることがわかった。興味深いことに、感染性は撹拌により非常に向上され、これはおそらくは撹拌によりブレブの粘性または凝集性が一部破壊されるためであろう。感染性の濾過性は、ブレブは幾分凝集する傾向があることを裏付ける。
【００８１】
【表７】
【００８２】
実施例１２：感染性ブレブを用いた免疫化
Ａ．自己増殖感染性ブレブはハムスターをＰＩＶ３感染から防御した
表８は、ハムスターをＶＲＰ−Ｆ／ＨＮまたはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染ＢＨＫ細胞からの上清（ブレブ）のいずれかでワクチン接種した実験から得られた結果を示す。ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮは１、２または３回のいずれかで接種した。表８参照。ブレブを１、２、または３回のいずれかで鼻内投与した。用量を表８に示し、初回投与２．８×１０４；２回目の投与２．６×１０３；３回目の投与１×１０５ｓｆｕであった。動物を全て１×１０６ＬｏｇＴＣＩＤ５０のＰＩＶウイルスで初期免疫化の７週間後に攻撃し、気道におけるウイルス複製を分析した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜６）で記録した。
表８における結果から、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンで免疫化されたハムスターは、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染ＢＨＫ細胞（ブレブ）で免疫化したハムスター（２回投与しか必要としなかった）と比較して、同じＨＩ価を惹起するために３回投与を必要としたことがわかった。さらに、ＬＲＴおよびＵＲＴにおけるウイルスを除去するためにはブレブを２回投与することで十分であったが、ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンを２回投与して免疫化されたハムスターはＬＲＴにおいてのみ除去した。（表８参照）。
【００８３】
【表８】
【００８４】
ＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ（ブレブ）での動物の防御について２回投与は最適用量のようであるので、ハムスターにおいて全体的な防御について最適経路を評価した。表９に示すこの研究において、同じＨＮタンパク質濃度（０．５８ｎｇ）（ＶＲＰ−ＨＮ、またはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染上清について）および／または同じＦ濃度（０．２１ｎｇ）（ＶＲＰ−ＦまたはＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染上清について）を含有するブレブを鼻内（ＩＮ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかで２回投与してハムスターを免疫化した。全接種剤は、７０００ｓｆｕ／用量に等しい感染性ブレブ活性を含有するＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染培養物からの上清を除いて０ｓｆｕを示した。表９参照。動物を次いで１×１０５ＬｏｇＴＣＩＤ５０のＰＩＶウイルスで最後の免疫化後７週間に鼻内攻撃し、気道におけるウイルス複製、および中和価を分析した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜６）で表した。
【００８５】
【表９】
【００８６】
結果から、鼻内径路により投与されたＶＲＰ−Ｆ／ＨＮ感染ＢＨＫ細胞（ブレブ）は上および下気道の両方においてウイルスを除去したが、筋肉内経路により投与された場合には、下気道（ＬＲＴ）においてのみ除去したことがわかった。ＶＲＰ−ＨＮ、またはＶＲＰ−Ｆ、またはＶＲＰ−ＨＮ＋ＶＲＰ−Ｆを含有するレプリコン感染細胞から得られた上清で免疫化された動物は、ＬＲＴおよびＵＲＴからウイルスを除去しなかった。
【００８７】
当業者らは、ただ通常の実験を用いて、本明細書に記載された本発明の特定の具体例の多くの等価なものを認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＶＥＥレプリカーゼ遺伝子、ＰＩＶ３Ｆ遺伝子およびＰＩＶ３ＨＮ遺伝子を示すＶＲＰ−Ｆ／ＨＮレプリコンプラスミドの図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子。
【請求項２】
配列番号１に示される核酸配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子。
【請求項３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物。
【請求項４】
ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために使用される場合に、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が細胞変性効果を誘発する請求項３記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＢＨＫ培養細胞における前記細胞変性効果が合胞体形成である請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ＢＨＫ培養細胞における前記細胞変性効果が単層の破壊である請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって；
前記集団が、検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合、細胞変性効果を誘発し；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する、免疫原性組成物。
【請求項１０】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず、
前記レプリコン粒子が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に細胞変性効果を誘発し；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項１１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号１に示される核酸配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって；
前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。
【請求項１２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号１に示される核酸配列を有するベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって、
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項１３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号１に示す核酸配列を有し；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起し；
前記レプリコン粒子が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために用いられる場合に、細胞変性効果を誘発し；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移される場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を含む免疫原性組成物。
【請求項１４】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発し；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による下気道の感染を予防する請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記防御免疫反応が、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による上気道の重篤度を軽減する請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
さらに医薬的許容される担体を含む請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、前記パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、および前記パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質が配列番号１において示される核酸によりエンコードされる請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、前記パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、および前記パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質が配列番号２；配列番号３；および配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
さらにアジュバントを含む請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含み；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項２２】
前記パラミクソウイルスがパラインフルエンザウイルス３型である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型融合（Ｆ）糖タンパク質である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質の両方を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
前記パラミクソウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質である請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質である請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質の両方を含む請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
前記感染が下気道においてである請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
前記感染が上気道においてである請求項２１記載の方法。
【請求項３２】
パラインフルエンザウイルス３型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラミクソウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含み；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項３３】
前記感染が下気道においてである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記感染が上気道においてである請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫原性組成物が２回投与される請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫原性組成物が３回投与される請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記自己増殖ブレブが、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に、細胞変性効果を誘発する請求項３７記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
ＢＨＫ培養細胞における前記細胞変性効果が合胞体形成である請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
ＢＨＫ培養細胞における前記細胞変性効果が単層破壊である請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）に感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含む請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない免疫原性組成物。
【請求項４５】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。
【請求項４６】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し；
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。
【請求項４７】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し；
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項４８】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し；
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項４９】
前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による下気道の感染を予防する請求項４８記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による上気道の感染の重篤度を軽減する請求項４８記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
さらに医薬的に許容される担体を含む請求項４８記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
さらにアジュバントを含む請求項４８記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質が配列番号２；配列番号３；および配列番号４に示すアミノ酸配列を有し、
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し；
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移される場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項５４】
パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項５５】
前記パラインフルエンザウイルスが、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、およびパラインフルエンザウイルス４型からなる群から選択される請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記ＨＮ糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｆ糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型融合（Ｆ）糖タンパク質である請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質の両方を含む請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
前記感染が下気道においてである請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
前記感染が上気道においてである請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
パラインフルエンザウイルス３型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を免疫反応を惹起するために十分な量で含み；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項６２】
前記感染が下気道においてである請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記感染が上気道においてである請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫原性組成物が２回投与される請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
前記免疫原性組成物が３回投与される請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
パラインフルエンザウイルス３型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物
（ここで、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質は配列番号２；配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する）；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を、免疫反応を惹起するために十分な量で含み；
前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子。
【請求項２】
配列番号１に示される核酸配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質をエンコードする単離された組換え核酸分子。
【請求項３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物。
【請求項４】
ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために使用される場合に、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が細胞変性効果を誘発する請求項３記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
未感染細胞単層に移された場合に前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＢＨＫ培養細胞における前記細胞変性効果が合胞体形成である請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ＢＨＫ培養細胞における前記細胞変性効果が単層の破壊である請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって；
前記集団が、検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合、細胞変性効果を誘発し；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する、免疫原性組成物。
【請求項１０】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず、
前記レプリコン粒子が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に細胞変性効果を誘発し；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項１１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号１に示される核酸配列を有する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって；
前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。
【請求項１２】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号１に示される核酸配列を有するベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって、
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項１３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含み、レプリコンの核酸部分が配列番号１に示す核酸配列を有し；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起し；
前記レプリコン粒子が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために用いられる場合に、細胞変性効果を誘発し；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移される場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を含む免疫原性組成物。
【請求項１４】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物であって；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で細胞変性効果を誘発し；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子が哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による下気道の感染を予防する請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記防御免疫反応が、哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による上気道の重篤度を軽減する請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
さらに医薬的許容される担体を含む請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、前記パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、および前記パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質が配列番号１において示される核酸によりエンコードされる請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ、前記パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、および前記パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質が配列番号２；配列番号３；および配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
さらにアジュバントを含む請求項１４記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質および少なくとも１種のパラミクソウイルス糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含み；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項２２】
前記パラミクソウイルスがパラインフルエンザウイルス３型である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型融合（Ｆ）糖タンパク質である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質の両方を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
前記パラミクソウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルス付着（Ｇ）糖タンパク質である請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルス融合（Ｆ）糖タンパク質である請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
前記糖タンパク質が呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質の両方を含む請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
前記感染が下気道においてである請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
前記感染が上気道においてである請求項２１記載の方法。
【請求項３２】
パラインフルエンザウイルス３型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、前記対象に免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラミクソウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含むベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団を含む免疫原性組成物；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で投与することを含み；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記レプリコン粒子で感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項３３】
前記感染が下気道においてである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記感染が上気道においてである請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫原性組成物が２回投与される請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫原性組成物が３回投与される請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物。
【請求項３８】
前記自己増殖ブレブが、ＢＨＫ培養細胞の単層を感染させるために用いられる場合に、細胞変性効果を誘発する請求項３７記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
ＢＨＫ培養細胞における前記細胞変性効果が合胞体形成である請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
ＢＨＫ培養細胞における前記細胞変性効果が単層破壊である請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）に感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含む請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子が、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有しない免疫原性組成物。
【請求項４５】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。
【請求項４６】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し；
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する免疫原性組成物。
【請求項４７】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し；
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項４８】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し；
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項４９】
前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による下気道の感染を予防する請求項４８記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
前記防御免疫反応が哺乳動物宿主においてパラインフルエンザウイルス３型による上気道の感染の重篤度を軽減する請求項４８記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
さらに医薬的に許容される担体を含む請求項４８記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
さらにアジュバントを含む請求項４８記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物であって；
前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質が配列番号２；配列番号３；および配列番号４に示すアミノ酸配列を有し、
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
自己増殖ブレブの前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
自己増殖ブレブの前記集団が、培養されたＢＨＫ細胞の単層を感染させるために使用される場合に、細胞変性効果を誘発し；
自己増殖ブレブの前記集団に感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移される場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発し；
前記自己増殖ブレブが哺乳動物宿主において防御免疫反応を惹起する免疫原性組成物。
【請求項５４】
パラミクソウイルスによる気道の感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスＦ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルスＨＮ糖タンパク質遺伝子を含み；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項５５】
前記パラインフルエンザウイルスが、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、およびパラインフルエンザウイルス４型からなる群から選択される請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記ＨＮ糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｆ糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型融合（Ｆ）糖タンパク質である請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記糖タンパク質がパラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質の両方を含む請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
前記感染が下気道においてである請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
前記感染が上気道においてである請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
パラインフルエンザウイルス３型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を免疫反応を惹起するために十分な量で含み；
前記集団が検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【請求項６２】
前記感染が下気道においてである請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記感染が上気道においてである請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫原性組成物が２回投与される請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
前記免疫原性組成物が３回投与される請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
パラインフルエンザウイルス３型による感染に対して哺乳動物対象を免疫化する方法であって、免疫学的に有効な量の：
（ａ）ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質を含む自己増殖ブレブの集団を含む免疫原性組成物
（ここで、前記ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質、およびパラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質は配列番号２；配列番号３および配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する）；および
（ｂ）医薬的に許容される担体を、免疫反応を惹起するために十分な量で前記対象に投与することを含み；
前記自己増殖ブレブがベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）の集団で感染した細胞の上清から得られ、前記レプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼ遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルスレプリカーゼタンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ１糖タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルスＥ２糖タンパク質、パラインフルエンザウイルス３型Ｆ糖タンパク質遺伝子、パラインフルエンザウイルス３型ＨＮ糖タンパク質遺伝子を、免疫反応を惹起するために十分な量で含み；
前記集団は検出可能な複製能力ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有せず；
前記自己増殖ブレブで感染した細胞から得られる上清が、未感染細胞単層に移された場合に、前記レプリコン粒子の不在下で前記細胞変性効果を誘発する方法。
【図１】
【公表番号】特表２００７−５３４２９５（Ｐ２００７−５３４２９５Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５０４１（Ｐ２００６−５１５０４１）
【出願日】平成１６年６月２日（２００４．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７１２７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１６９６１
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５９１０００７９１）ワイス・ホールディングズ・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２日（２００４．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７１２７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１６９６１
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５９１０００７９１）ワイス・ホールディングズ・コーポレイション (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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