ベンゾピラノン化合物、その組成物および癌の治療または予防方法
本発明は、ベンゾピラノン化合物、ベンゾピラノン化合物を含む組成物、および、有効量のベンゾピラノン化合物を投与することを含む、癌を治療もしくは予防するため、または癌細胞もしくは新生物細胞の増殖を抑制するための方法に関する。ベンゾピラノン化合物は、式（Ｉ）を有し、またはその薬学的に許容される塩である。
【化１】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
【化１】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１０月１５日出願の米国仮出願第６０／４１８，４６９号の利益を主張し、その全文を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、癌を治療または予防するためのベンゾピラノン化合物、ベンゾピラノン化合物を含む組成物、およびベンゾピラノン化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
２．１ 癌
癌は、所定の正常組織に由来する異常細胞数の増大、その異常細胞による隣接組織の侵襲、または悪性細胞の局所的リンパ節および遠隔位へのリンパ節もしくは血液による拡散（転移）を主な特徴としている。臨床データおよび分子生物学的研究は、癌がわずかな前新生物変化で開始し、特定の条件下で新生物へと進行しうる多段階の過程であることを示している。新生物病変は、クローン性で進化し、特に新生物細胞が宿主の免疫監視を回避する条件下では、侵襲、増殖、転移および不均一性の能力が増大する（Roitt, I., Brostoff, J and Kale, D., Immunology, 17.1-17.12 (3rd ed., Mosby, St. Louis, Mo. , 1993)）。
【０００４】
癌のわずかに数種のみであるが以下に説明する。
【０００５】
他の種の癌の特徴は、医療従事者には周知であり、医学文献に記載されている。
【０００６】
２．２ 脳癌および脳転移
毎年約１０，０００件の脳腫瘍が発生し、また毎年約４０００件の脊髄腫瘍が発生する（Kornblith et al.(1985), Cancer : Principles and Practice of Oncology, 2nd Ed., DeVita, V., Hellman, S., Rosenberg, S., eds., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, Chapter 41 :Neoplasms of the Central Nervous System）。中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍は若年患者において最も多く発生する充実性腫瘍の群である（同上）。神経膠腫が全原発性ＣＮＳ腫瘍の約６０％を占め、最も多く発生する脳原発性腫瘍は星状細胞腫、髄膜腫、乏突起膠腫および組織細胞リンパ腫である（同上）。神経膠腫は通常脳の大脳半球に起るが、視神経、脳幹または小脳などの他の部分でも起ることがある（Brain Tumor Society; www/tbts.org/primary.htm）。
【０００７】
神経膠腫は、それが発生する膠細胞のタイプによって分類される。最も多く発生する膠細胞のタイプは星状細胞腫である。この腫瘍は、星状細胞と呼ばれる星状膠細胞から発生する。星状細胞腫にはその悪性度によって悪性度の等級がつけられている。悪性度ＩおよびＩＩの星状細胞腫とも呼ばれる低悪性度星状細胞腫は悪性度が最も低く、ゆっくりと増殖し、多くの場合手術により完全に除去することができる。悪性度ＩＩＩ星状細胞腫とも呼ばれる中悪性度星状細胞腫はより速く増殖し、より悪性である。悪性度ＩＩＩ星状細胞腫は、手術とそのあとの放射線療法および一部化学療法で治療される。悪性度ＩＶ星状細胞腫とも呼ばれる高悪性度星状細胞腫は、速く増殖し、近隣の組織を浸潤し、非常に悪性である。悪性度ＩＶ星状細胞腫は通常手術とそのあとの放射線療法と化学療法の組み合せで治療される。多形性膠芽腫は悪性度ＩＶ星状細胞腫であり、これは最も悪性なもので、致命的な原発性脳腫瘍である（同上）。
【０００８】
歴史的には、星状細胞腫の治療では、腫瘍除去の手術とそのあとの放射線療法が行なわれてきた。化学療法を放射線療法の前か後に行なってもよい（Kornblith et al.(1985), Cancer :Principles and Practice of Oncology, 2nd Ed., DeVita, V., Hellman, S., Rosenberg, S., eds., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, Chapter 41: Neoplasms of the Central Nervous System）。同じ手術手法および手術原理が多形性膠芽腫と悪性度の低い脳腫瘍に行なわれてきたが、多形性膠芽腫瘍の完全除去はより難しいものであった。
【０００９】
悪性度ＩＶの星状細胞脳腫瘍があると診断された患者の予後は統計的によくない。悪性度Ｉの星状細胞を治療した人は普通再発することなく１０年以上生存できるが、悪性度ＩＶ星状細胞腫瘍をもつ患者の平均生存期間は手術処置から１５週間である。悪性度ＩＶ星状細胞腫瘍の腫瘍増殖能力が高いため、手術のみの治療の１年後では患者のたったの５％が生存し、２年後ではほぼ０％の生存率である。手術による処置と組み合せた放射線治療では治療２年後の生存率は約１０％に上がる。しかしながら、実際５年より長く生存する患者はいない（同上）。
【００１０】
２．３ 現行の癌治療
現在のところ、癌療法は、患者の新生物細胞を根絶するために、手術、化学療法、および／または放射線治療を必要とする（たとえば、Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Chapter 12, Section IVを参照されたい）。これらの手法はすべて、患者にとって顕著な欠点を伴う。たとえば、手術は、患者の健康によっては禁忌になることもあるし、または患者に受け入れがたいこともある。さらに、手術では、新生物組織を完全に除去しえない可能性もある。放射線療法は、照射される新生物組織が正常組織よりも放射線に対して高い感受性を呈する場合にのみ効果があり、しかも放射線療法は、多くの場合、重篤な副作用を引き起こす可能性がある（上掲文献参照）。化学療法に関しては、新生物疾患の治療に利用可能なさまざまな化学療法剤が存在する。しかしながら、さまざまな化学療法剤が利用可能であるにもかかわらず、化学療法は多くの欠点を有する（たとえば、Stockdale, 1998, "Principles Of Cancer Patient Management" Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Ch. 12, sect. 10を参照されたい）。ほとんどすべての化学療法剤は有毒であり、化学療法は、重度の悪心、下痢、骨髄抑制、免疫抑制などを含めて、顕著でかつ多くの場合危険な副作用を引き起こす。このほか、多くの腫瘍細胞は、多剤耐性により化学療法剤に対して耐性があるかまたは耐性を獲得する。
【００１１】
脳腫瘍の治療にはニトロソ尿素化学療法薬が通常使われる。この化合物の鍵となる特性は、それが血液−脳関門を横断することができるという能力である。この化合物のうち１−３−ビス−２−クロロエチル−１−ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ， カルムスチンとも呼ばれる）が臨床的に最初に使われた。手術および／または放射線治療と組み合せたＢＣＮＵの使用は有効であることが示されているが、多形性膠芽腫脳腫瘍を治すには至っていない。さらに、長期に亘るニトロソ尿素治療による合併症が報告されている（Cohen et al.(l976), Cancer Treat. Rep. 60, 1257-1261）。この合併症には肺線維症、肝障害、腎不全、およびニトロソ尿素治療に伴う二次性腫瘍の症例が含まれる。
【００１２】
癌治療にエストロゲン受容体モジュレータータモキシフェンおよびラロキシフェンを使う研究も行なわれている。タモキシフェンは、再発性悪性神経膠腫の治療を行なうヒト臨床試験で使われている（Couldwell et al. (1996), Clin. Cancer Res. 2,619-622）。ラロキシフェンは、ネズミモデルにおいて尾腫瘍の肺への転位を抑制することが報告されている（Neubauer et al. (1995), Prostate 27,220-229）。
【００１３】
手術、放射線療法および化学療法の治療計画は悪性度ＩＶの星状細胞脳腫瘍をもつ患者の寿命をそこそこ長くするチャンスを与えるものであるが、それぞれの療法に伴うリスクは多い。治療の恩恵は少なく、治療により患者の残っている短い寿命のクオリティが大きく低下することがある。
【００１４】
従って、上記した伝統的療法の欠点を克服する抗癌性化合物および治療方法に対して当技術分野で明確なニーズが依然としてある。
【００１５】
本出願明細書の第２節における参考文献の記載および引用は、その参考文献が本出願に対して先行技術となるということを認めるものではない。
【発明の開示】
【００１６】
３．発明の概要
本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
【００１７】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
の化合物およびその薬学的に許容される塩に関する。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩（それぞれ「ベンゾピラノン化合物」である）は、患者における癌の治療または予防に有用である。
【００１９】
本発明はまた、有効量のベンゾピラノン化合物および薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む組成物に関する。該組成物は、患者における癌の治療または予防に有用である。
【００２０】
本発明はさらに、癌の治療または予防を必要とする患者に、有効量のベンゾピラノン化合物を投与することを含む癌の治療または予防方法に関する。
【００２１】
本発明はまたさらに、癌細胞または新生物細胞と有効量のベンゾピラノン化合物とを接触させることを含む癌細胞または新生物細胞の増殖を抑制する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
４．発明の詳細な説明
４．１ 定義
本明細書で使用する用語「Ｃ１−６アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の非環式炭化水素鎖を意味する。代表的な直鎖Ｃ１−６アルキルとしては、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチルおよび−ｎ−ヘキシルが挙げられる。代表的な分枝鎖Ｃ１−６アルキルとしては、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、−ネオペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、および３，３−ジメチルブチルが挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用する用語「Ｃ１−４アルキル」とは、１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の非環式炭化水素鎖を意味する。代表的な直鎖Ｃ１−４アルキルとしては、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピルおよび−ｎ−ブチルが挙げられる。代表的な分枝鎖Ｃ１−６アルキルとしては、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、および−ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用する用語「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「予防する」「予防している」および「予防」には、患者における癌の再発、拡張または発症を防止することが含まれる。
【００２６】
本明細書で使用する用語「治療する」「治療している」および「治療」には、原発性、局所性または転移性癌組織の根絶、除去、改変または調節、ならびに癌の拡散の最小化または遅延が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用する用語「患者」とは、動物、例えば限定するものではないが、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなどの動物を意味し、一実施形態においては哺乳動物、別の実施形態ではヒトを意味する。特定の実施形態において、患者は、幼児期、青年期または成人でありうる。
【００２８】
本明細書でベンゾピラノン化合物に関して使用する用語「有効量」とは、癌の治療または予防に有効なベンゾピラノン化合物の量を意味する。
【００２９】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される塩」としては、限定されるものではないが、式（Ｉ）の化合物の酸性基の塩または塩基性基の塩が挙げられる。本質的に塩基性である本方法および組成物において包含される化合物は、各種の無機および有機酸と様々な塩を形成することができる。そのような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩を生成させるのに用いることができる酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち薬理学上許容される陰イオンを含む塩を生成するものであり、例えば、限定するものではないが、硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サルチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））の塩が挙げられる。上記した酸に加えて、アミノ部分を含む本方法および組成物において包含される化合物は、各種のアミノ酸と医薬上または化粧品上許容される塩を生成することもできる。本質的に酸性である本方法および組成物において包含される化合物は、各種の薬理学上または化粧品上許容される陽イオンと塩基塩を生成することができる。そのような塩の例としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩、特にカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウムリチウム塩、亜鉛塩、カリウム塩、および鉄塩が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用する略語「ＤＭＡＰ」とは４−ジメチルアミノピリジンを意味する。
【００３１】
本明細書で使用する略語「ＤＭＦ」とはジメチルホルムアミドを意味する。
【００３２】
本明細書で使用する略語「ＮＢＳ」とはＮ−ブロモスクシンイミドを意味する。
【００３３】
本明細書で使用する略語「ＡＩＢＮ」とは２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する略語「ＤＭＥ」とはジメチルエーテルを意味する。
【００３５】
本明細書で使用する略語「ＤＩＡＤ」とはジイソプロピルアゾジカルボキシレートを意味する。
【００３６】
本明細書で使用する略語「ＣＤＩ」とは１，１’−カルボニルジイミダゾールを意味する。
【００３７】
本明細書で使用する略語「ＭＴＢＥ」とはメチルｔ−ブチルエーテルを意味する。
【００３８】
本発明は、本発明の非限定的実施形態の例示を目的とする以下の詳細な説明、および実施例を参照することによりより十分に理解することができる。
【００３９】
４．２ ベンゾピラノン化合物
上述したように、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
【００４０】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
のベンゾピラノン化合物、およびその薬学的に許容される塩に関する。
【００４１】
一実施形態において、Ｒ１はハロゲンである。
【００４２】
別の実施形態において、Ｒ１はトリフルオロメチルである。
【００４３】
別の実施形態において、Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルである。
【００４４】
別の実施形態において、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００４５】
具体的なベンゾピラノン化合物を以下の表１に示す。
【化３】
【００４６】
【表１】
【００４７】
４．３ ベンゾピラノン化合物の取得方法
ベンゾピラノン化合物は、当業者により公知の方法ならびに本明細書に開示する合成経路によって調製することができる。例えば、ベンゾピラノン化合物は以下の一般的な反応スキーム１または反応スキーム２によって合成することができる。
【化４】
【００４８】
反応スキーム１により、Ｒ１がフルオロである式（Ｉ）のベンゾピラノン化合物が得られる。
【化５】
【００４９】
反応スキーム２により、Ｒ１がフルオロ以外である式（Ｉ）のベンゾピラノン化合物が得られる。
【００５０】
ベンゾピラノン化合物のいくつかは、水または他の有機溶媒と溶媒和物を形成することもある。そのような溶媒和物も同様に本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
４．４ ベンゾピラノン化合物の治療および予防用途
ベンゾピラノン化合物の活性により、ベンゾピラノン化合物は獣医学およびヒト医学において有利なことに有用である。特に、ベンゾピラノン化合物は、癌の治療または予防に有用である。
【００５２】
一実施形態において、癌は、頭部、頚部、眼、口腔、咽喉、食道、胸部、骨、肺、大腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、精巣もしくは他の生殖器、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または神経系の腫瘍である。
【００５３】
別に実施形態において、癌は転移したものである。特定の実施形態において、転移した癌は、肺（小細胞および非小細胞のいずれも）、乳房、原発腫瘍不明、黒色腫または結腸を起源とする。
【００５４】
別の実施形態において、癌は原発性脳腫瘍である。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明において治療または予防対象の癌としては、限定されるものではないが、原発性頭蓋内中枢神経系腫瘍が挙げられる。原発性頭蓋内中枢神経系腫瘍には、例えば多形性膠芽腫、悪性星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫、低悪性度星状細胞腫、髄膜腫、間葉腫瘍、下垂体腫瘍、シュワン細胞腫などの髄鞘腫瘍、中枢神経系リンパ腫、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経細胞腫瘍および神経細胞／膠細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫瘍、または脈絡叢腫瘍が含まれる。
【００５６】
他の実施形態において、本発明において治療または予防対象の癌としては、限定されるものではないが原発性脊髄腫瘍、例えばシュワン細胞腫、髄膜腫、上衣細胞腫、肉腫、星状細胞腫、神経膠腫、血管腫瘍、脊索腫および類表皮腫などが挙げられる。
【００５７】
他の実施形態において、本発明において治療または予防対象の癌としては、限定されるものではないが、脳転移に寄与する原発性腫瘍、例えば肺（小細胞および非小細胞のいずれも）、乳房、原発腫瘍不明、黒色腫または結腸である。
【００５８】
獣医学的用途のために動物、あるいは臨床的用途のためにヒトなどの患者に投与する場合、ベンゾピラノン化合物は単離された形態でありうる。「単離された」とは、投与の前に、ベンゾピラノン化合物を、合成有機化学反応の混合物、または天然の生成物源、例えば植物、組織培養、細菌ブロスなどの他の成分から分離することを意味する。一実施形態において、ベンゾピラノン化合物は、通常の方法、例えば抽出とそのあとのクロマトグラフィー、再結晶、あるいは他の通常の方法により単離する。単離された形態では、ベンゾピラノン化合物は、単離されたものの少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９５重量％が単一のベンゾピラノン化合物である。「単一ベンゾピラノン化合物」とはベンゾピラノン化合物の１つのエナンチオマーまたは１つのラセミ化合物を意味する。
【００５９】
ベンゾピラノン化合物は有利には組成物の形態、一実施形態においては医薬組成物の形態で投与する。これらの組成物は都合のよい経路、例えば注入またはボーラス注射により、上皮内層または粘膜・皮膚内層（例えば、口腔内粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により、あるいは対流補強型医薬送達系[convection-enhanced drug delivery system]を介して投与することができ、また別の有効薬物と一緒に投与することもできる。投与は全身的または局所的であってよい。各種の送達系が知られており、例えばリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル、カプセルの中への封入であり、本発明のベンゾピラノン化合物を投与するのに用いることができる。一部の実施形態では、本発明の１以上のベンゾピラノン化合物が患者に投与される。投与の方法には、限定するものではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、腟内、経皮、直腸からの、吸入による、あるいは耳、鼻、目、または皮膚への局所的な投与がある。特定の投与方法は担当の医師の判断に委ねられるものであるが、ある程度はその癌の所定の部位によって決まると考えられる。
【００６０】
一実施形態において、ベンゾピラノン化合物は、別の治療剤または予防剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、治療剤または予防剤は化学療法剤である。
【００６１】
別の実施形態においては、１以上のベンゾピラノン化合物を、治療を必要とする部分に局所的に投与するのが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではないが、手術の際の局所注入、局所適用（例えば手術の後の創傷包帯剤と組み合せて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、あるいは埋め込み（そのような埋め込みは多孔質、非多孔質、またはゼラチン状物質であり、シアラスチック[sialastic]膜などの膜またはファイバーである）により行なうことができる。１つの実施形態では、原発性脳腫瘍または転移性脳腫瘍の部位（または以前の部位）での直接注射による投与である。
【００６２】
一部の実施形態では、１以上のベンゾピラノン化合物を中枢神経系の中に、脳室内注射および髄鞘内注射などの好適な経路により導入するのが望ましいと考えられる。脳室内注射は、例えばオマヤレザバーなどのレザバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易に行なうことができる。
【００６３】
経肺的投与も用いることができ、例えば、吸入器または噴霧器および、エアロゾル化剤が入った製剤を使用することにより、あるいはフルオロカーボンまたは合成肺界面活性剤中の灌流を介して行なうことができる。一部の実施形態では、ベンゾピラノン化合物は、慣用の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐剤として製剤化することができる。
【００６４】
１つの実施形態では、ベンゾピラノン化合物は対流補強型医薬送達系を介して投与される。もう１つの実施形態では、ベンゾピラノン化合物は、米国特許第５，７２０，７２０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもののような対流補強型医薬送達系を介して投与される。対流補強型医薬送達では、灌流カテーテルの先端を組織（例えば、脳組織）内に配置し、灌流を行なっている間カテーテルの先端から正の圧力勾配を維持しながらカテーテルを通して医薬（例えば、ベンゾピラノン化合物）を供給することが行なわれる。カテーテルは、医薬を送達し、医薬の送達の最初から最後まで所望の圧力勾配を維持するポンプに連結されている。医薬送達速度は典型的には、灌流距離が約１ｃｍ以上で約０．５〜約４．０ｍｌ／分である。この方法は、脳および他の組織、特に充実性神経組織に医薬を送達するのに特に有用である。一部の実施形態において、対流補強型医薬送達は、ベンゾピラノン化合物を、高分子量極性分子例えば増殖因子、酵素、抗体、タンパク質複合体および遺伝子ベクターと組み合せて脳または他の組織に送達するのに有用である。これらの実施形態では、注入量は最大約１５．０ｍｌ／分とすることができる。
【００６５】
もう１つの実施形態では、本発明のベンゾピラノン化合物は小胞、特にリポソームで送達することができる（Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al. , in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds. ), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 同書, pp. 317-327; 総論的にも同書; を参照されたい）。
【００６６】
なおもう１つの実施形態では、ベンゾピラノン化合物は制御放出系で送達することができる。１つの実施形態では、ポンプを使用することができる（Langer, 上記書物; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al. , N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)を参照されたい）。もう１つの実施形態では、ポリマー性物質を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds. ), CRC Pres. , Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds. ), Wiley, New York(1984) ; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); を参照されたい、またLevy et al. , Science 228: 190 (1985); During et al. , Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al. , J. Neurosurg. 71: 105 (1989)も参照されたい）。なおもう１つの実施形態では、ベンゾピラノン化合物の標的（例えば、脳）の近傍に制御放出系を配置することができ、その結果全身性投与量のほんの一部の投与でよいことになる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra[上記書物], vol. 2, pp.115-138 (1984)を参照されたい）。Langer（Science 249: 1527-1533 (1990)）によるレビュー(総論)で議論されている他の制御放出系を使用することもできる。
【００６７】
本組成物は、患者に好適に投与するための形態を提供するよう、ベンゾピラノン化合物の有効量を、一実施形態では精製された形態で、適切な量の薬学的に許容される担体と一緒に含ませる。
【００６８】
一実施形態において、用語「薬学的に許容される」とは、連邦または州政府の規制当局により認可されていること、あるいは合衆国薬局方または、動物における、より特定的にはヒトにおける使用に対して一般に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」は、ベンゾピラノン化合物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は液体（例えば、水や油）であってよく、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物由来のものまたは合成されたものが挙げられる。医薬担体は、生理食塩水、ガムアカシア、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであってよい。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することもできる。患者に投与する場合、ベンゾピラノン化合物および薬学的に許容される担体は滅菌していてよい。ベンゾピラノン化合物を静脈内投与する場合は水が有用な担体である。生理食塩水溶液ならびにデキストローゼ水溶液およびグリセロール水溶液も液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。好適な医薬担体としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、メリケン粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、ドライミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も挙げられる。本組成物は、所望であれば、少量の湿潤化剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。
【００６９】
本組成物は、溶剤、懸濁液剤、乳液剤、錠剤、丸薬、ペレット剤、カプセル剤、液体を含んでいるカプセル剤、粉剤、持続放出型製剤、坐剤、エアロゾル剤、スプレー剤の剤形または使用するのに好適な他の剤形をとることができる。１つの実施形態では、薬学的に許容される担体はカプセルである（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号を参照）。好適な医薬担体の他の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００７０】
１つの実施形態において、ベンゾピラノン化合物は定型の手順に従ってヒト静脈内投与用の医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与用ベンゾピラノン化合物は滅菌等張性緩衝水溶液中の溶液である。必要な場合は、本組成物は可溶化剤を含んでいてもよい。静脈内投与用の組成物は場合によっては注射の部位における痛みをやわらげるための局部麻酔薬（例えばリグノカイン）を含んでいてもよい。通常、各成分は、例えば、有効成分の量を表示したアンプルまたはサシェットなどの密封容器中の乾燥凍結粉末または無水濃縮物として単位用量剤形で別々にまたは一緒にして提供される。ベンゾピラノン化合物を灌流により投与する場合は、例えば滅菌医薬用水または生理食塩水が入った灌流ボトルを用いて投与することができる。ベンゾピラノン化合物を注射により投与する場合は、成分を投与の前に混ぜることができるよう滅菌注射用の水または生理食塩水のアンプルを提供する。経口投与用組成物は、例えば錠剤、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、顆粒、粉末、乳液、カプセル、シロップ、またはエリキシルなどの形態であってよい。経口投与される組成物には、医薬として口当たりのよい製剤を提供するために例えばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味剤；ハッカ、ウインターグリーン油またはチェリー油などの香味剤；着色剤；および保存剤などの１以上の任意付加的な試剤が入っていてもよい。さらに、錠剤形態または丸薬形態の場合は、本組成物に、消化管中での崩壊および吸収を遅らせるためのコーティングを行なうことによって、長時間の持続作用を提供することもできる。浸透圧活性推進化合物[osmotically active driving compound]を包み込んでいる選択透過膜もまた経口投与されるベンゾピラノン化合物には好適である。これの以降のプラットフォームにおいて、カプセルを取り囲む環境からの流体をこの推進化合物が吸収し、膨潤してアパチャーから医薬または医薬組成物を押し出す。これらの送達プラットフォームは、瞬時放出製剤のスパイク状投与プロファイル（形状）に対して基本的に０次の投与プロファイルを提供することができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールなどの時間遅延物質を用いることもできる。経口用の組成物には、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を入れることができる。そのような担体は好ましくは医薬用のものである。
【００７１】
癌の治療または予防に有効であるベンゾピラノン化合物の量は標準的な手法により決定することができる。さらに、インビトロまたはインビボアッセイを場合によっては用いて至適用量範囲を特定するのに役立たせることもできる。有効な投与量は、投与の経路や疾病または疾患の程度にも依存するものであり、医師の判断および各患者の状況によって決定されるべきである。しかしながら、ベンゾピラノン化合物の有効経口投与量の一般的な範囲は、約０．５ｍｇ／日〜約５０００ｍｇ／日、一実施形態では約５００ｍｇ／日〜約３５００ｍｇ／日、別の実施形態では約１０００ｍｇ／日〜約３０００ｍｇ／日、別の１つの実施形態では約１５００ｍｇ／日〜約２５００ｍｇ／日、また別の１つの実施形態では約２０００ｍｇ／日である。もう１つの実施形態では、静脈内投与用の有効量は経口投与用量の約１０％であり、対流補強型医薬投与用の有効量は経口投与用量の約１％である。当然、多くの場合化合物の１日の投与量を少しずつ、１日のいくつかの時間に投与するのが実用的である。しかしながら、これらのいずれの場合においても、投与されるベンゾピラノン化合物の量は、有効成分の溶解度、用いる製剤、投与の経路などの因子に依存するものである。座剤は、通常約０．５重量％〜約１０重量％の範囲の有効量のベンゾピラノン化合物を含有する。経口用組成物は約１０％〜約９５％のベンゾピラノン化合物を含有しうる。本発明のいくつかの実施形態においては、経口投与用の好適な有効用量は通常体重１キログラム当りベンゾピラノン化合物約１０〜５００ｍｇである。他の実施形態では、有効な経口用量は体重１キログラム当り約１０〜１００、１００〜３００、３００〜９００、または９００〜１５００ｍｇである。他の実施形態では、有効な経口用量は体重１キログラム当り約１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００または４００〜５００ｍｇである。本発明の他の特実施形態においては、経口投与に有効な用量範囲は通常体重１キログラム当りベンゾピラノン化合物１〜７５００マイクログラムである。他の実施形態では、有効な経口用量は体重１キログラム当り約１〜１０、１０〜３０、３０〜９０、または９０〜１５０マイクログラムである。他の実施形態では、有効な経口用量は体重１キログラム当り約１５０〜２５０、２５０〜３２５、３２５〜４５０、４５０〜１０００または１０００〜７５００マイクログラムである。有効用量は、インビボ実験システムまたは動物モデル実験システムから導かれる用量−応答曲線から外挿することもできる。そのような動物実験およびシステムは当技術分野では周知である。
【００７２】
本発明はまた、１以上のベンゾピラノン化合物が充填された１以上の容器を含んでいるパックまたはキットも提供する。このような容器（１個または複数個）に場合によっては関係するのが、医薬または生物学的生成品の製造、使用または販売を規制する政府の当局が定める様式の注意書きであり、この注意書きはヒトへの投与に対する上記製造、使用または販売当局による認可を反映しているものとする。特定の実施形態においては、上記キットには、ベンゾピラノン化合物の前に、その後にまたは同時に投与することができる１以上の他の化学療法薬を入れておくこともできる。
【００７３】
ベンゾピラノン化合物は好ましくはヒトでの使用に先立ち所望の治療または予防の活性についてインビトロで、そしてそのあとインビボでアッセイする。例えば、インビトロアッセイを用いて、ある特定のベンゾピラノン化合物の投与がよいのか、それともベンゾピラノン化合物の組み合せの投与がよいのかを決定することができる。
【００７４】
１つの実施形態においては、患者の組織サンプルを培地中で増殖させ、そしてベンゾピラノン化合物と接触させるあるいはそれを投与し、組織サンプルへのそのようなベンゾピラノン化合物の作用結果を観察し、非接触の組織と比較を行なう。他の実施形態においては、細胞培養の細胞をベンゾピラノン化合物と接触させるあるいはそれを投与する細胞培養モデルを用い、そのようなベンゾピラノン化合物の組織サンプルへの作用結果を観察し、非接触の細胞培養との比較が行なわれる。通常、非接触細胞と比較して接触細胞の増殖または生存が少ないと、そのベンゾピラノン化合物は癌患者を治療するのに有効であることを示す。そのようなベンゾピラノン化合物はまた動物モデルシステムを用いて有効でありまた安全であることを示すこともできる。
【００７５】
ベンゾピラノン化合物は、薬学的に許容される塩の形態で投与しうる。薬学的に許容される塩は、有機化学では常識であるようにベンゾピラノン化合物の遊離塩形態を上記で説明したような好適な酸と反応させることで都合よく生成される。塩は、中程度の温度で高い収率で生成され、ベンゾピラノン化合物の塩形態を合成の最終工程において適切な酸性洗浄液から単に単離することで製造される。この塩形成性酸は、アルカノール（メタノール、エタノールもしくはイソプロパノール等）、ケトン（アセトン等）またはエステル（酢酸エステル等）などの無水または水含有有機溶媒中に溶解されていてもよい。これに対して、ベンゾピラノン化合物の遊離塩基形態が望まれている場合は、塩基性の最終洗浄工程から単離される。塩酸塩を生成させる代表的な手法では、遊離塩基を適切な溶媒に溶解させ、その溶液をモレキュラーシーブのようなものの上で十分乾燥させ、そのあとそれを通して塩化水素ガスをバブリングさせる。
【００７６】
４．５ 追加の治療
有効量のベンゾピラノン化合物の投与を含む癌の治療または予防方法は、さらに有効量の別の治療の適用（投与）を含んでもよい。他の治療としては、限定されるものではないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、骨髄移植、幹細胞置換療法、別の生物学的治療および免疫療法が挙げられる。
【００７７】
一実施形態において、本発明の方法は、血管形成阻害剤、例えば限定されるものではないが、以下：アンギオスタチン（プラスミノーゲン断片）、抗血管形成アンチトロンビンＩＩＩ、Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ、ＡＢＴ−６２７、Ｂａｙ１２−９５６６、ベネフィン、ベバシズマブ、ＢＭＳ−２７５２９１、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＡＩ、ＣＤ５９補体断片、ＣＥＰ−７０５５、Ｃｏｌ３、コンブレタスタチンＡ−４、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）、フィブロネクチン断片、Ｇｒｏ−ベータ、ハロフジノン、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖断片、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ＩＭ−８６２、インターフェロンα／β／γ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、Ｋｒｉｎｇｌｅ５（プラスミノーゲン断片）、マリマスタット、抗炎症性ステロイド（限定されるものではないが、デキサメタゾンなど）、メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ２７０２３Ａ）、ＭｏＡｂ ＩＭＣ−１Ｃ１１、ネオバスタット、ＮＭ−３、Ｐａｎｚｅｍ、ＰＩ−８８、胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター、血小板因子−４（ＰＦ４）、プリノマスタット、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、ＰＴＫ ７８７／ＺＫ ２２２５９４、レチノイドＳｏｌｉｍａｓｔａｔ、スクアラミン、ＳＳ３３０４、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ＴＮＰ−４７０、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）、ＺＤ６１２６、ＺＤ６４７４、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（ＦＴＩ）、およびビスホスホネート（例えば、アレンドロネート、エチドロネート、パミドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、ゾレドロネート、オルパドロネート、イカンドロネート、またはネリドロネートなど）の投与をさらに含む。
【００７８】
他の治療は、抗癌剤の投与でありうる。有用な抗癌剤としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：アシビシン、アクラルビシン、アコダゾールヒドロクロリド、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、アメタントロンアセテート、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレンヒドロクロリド、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシンヒドロクロリド、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキセート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、エルビタックス、エソルビシンヒドロクロリド、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクリジン、リン酸フルダラビン、フルロウラシル、フルロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシンヒドロクロリド、イフォスファミド、イルモフォシン、ＩｍｉＤｓＴＭ、インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−Ｉａ、インターフェロンγ−Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロンヒドロクロリド、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミンヒドロクロリド、メゲストロールアセテート、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、マイトクロミン、マイトギリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスペル、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロンヒドロクロリド、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴル、サフィンゴルヒドロクロリド、ＳｅｌＣｉｄＴＭ、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフル、テロキサントロンヒドロクロリド、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、トレストロンアセテート、トリシリビンホスフェート、トリメトレキセート、グルクロン酸トリメトレキセート、トリプトレリン、ツブロゾールヒドロクロリド、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、ビネピジンスルフェート、ビングリシネートスルフェート、ビンロイロシンスルフェート、酒石酸ビノレルビン、ビンロシジンスルフェート、ビンゾリジンスルフェート、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシンヒドロクロリドが挙げられる。他の抗癌剤としては、限定されるものではないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５−エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アムバムスチン、アミドックス、アミフォスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管形成阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリックス、抗背側化形態形成タンパク質−１、抗アンドロゲン、前立腺癌、抗エストロゲン、抗ネオプラストン、アフィジコリングリシネート、アポトーシス遺伝子調節因子、アポトーシス制御因子、アプリン酸、アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、βラクタム誘導体、β−アレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルフォキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カンプトテシン誘導体、カナリポックスＩＬ−２、カペシタビン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ Ｍ３、ＣＡＲＮ ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリックス、クロールン、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クラムベシディン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、キュラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクホスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシフォスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジコン、ダイデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール、９−、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルフォシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、フルオロダウノルニシンヒドロクロリド、フォルフェニメックス、フォルメスタン、フォストリエシン、フォテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレギュリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモフォシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫賦活ペプチド、インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール、４−、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン−Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトールスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミソール、リアロゾール、直鎖ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド７、ロバプラチン、ロムブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテフォシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、ミトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発性腫瘍抑制因子１−をベースとする治療、マスタード抗癌剤、マイカペルオキシドＢ、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ−アセチルジナリン、Ｎ−置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素モジュレーター、ニトロキシド酸化防止剤、ニトルリン、Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導物質、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキザウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサン多硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、酢酸フェニル、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、白金複合体、白金化合物、白金−トリアミド複合体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピル ビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡをベースとする免疫モジュレーター、プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類のプロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、
ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ１８６エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴル、サイントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ １ミメティックス、セムスチン、セネセンス由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達モジュレーター、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、ナトリウムフェニルアセテート、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォン酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、過剰活動性血管活性腸管ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフル、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチンミメティック、チマルファシン、チモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、チタノセンビクロリド、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキセート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメックス、泌尿生殖器洞由来増殖阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクター系、赤血球遺伝子治療、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブおよびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。一実施形態において、抗癌剤は、有効量のサリドマイドまたはトポイソメラーゼインヒビターの投与の前、後または同時に投与することができる５−フルオロウラシルまたはロイコボリンである。
【００７９】
他の治療としては、γ線、Ｘ線および癌細胞を破壊する他の放射線源を用いることを含む放射線療法でありうる。いくつかの実施形態において、放射線療法は、遠隔照射放射線療法、または遠隔照射源から放射線をあてる遠隔療法として適用する。他の実施形態において、放射線療法は、放射線照射源を癌細胞または腫瘍塊の近傍の体内に配置する、体内治療または近接照射法として行う。
【００８０】
４．６ 癌および新生物細胞の阻害と疾病
ベンゾピラノン化合物は、当技術分野で知られている各種のアッセイ、あるいは本明細書で説明されるアッセイを用いてインビトロおよびインビボにおいて腫瘍細胞の細胞増殖、細胞転移および／または腫瘍形成を抑制することを実証することができる。そのような活性は、インビトロアッセイにおいて本発明のベンゾピラノン化合物を腫瘍細胞と接触させることで実証することができる。通常、腫瘍細胞を様々な濃度のベンゾピラノン化合物に暴露し、そのあと生存細胞を対照と比較して測定する。そのようなアッセイでは癌細胞系の細胞、あるいは患者からの細胞が使用される。そのような生存および／または増殖を評価するのには当技術分野で周知の多くのアッセイを用いることができる。例えば、細胞増殖は、（３Ｈ）−チミジンの取り込みを、直接細胞計数により、またプロト癌遺伝子（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）または細胞周期マーカー（Ｒｂ、ｃｄｃ２、ｃｙｃｌｉｎ Ａ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅなど）などの既知の遺伝子の転写、翻訳または活性における変化を検出することによりアッセイすることができる。そのようなタンパク質およびｍＲＮＡならびに活性のレベルは当技術分野で周知のどの方法によっても決定することができる。例えば、タンパク質は、市販されている抗体（例えば、Santa Cruz Inc.からは多くの細胞周期マーカーが市販されている）を用いてウエスタンブロットまたは免疫沈降などの知られている免疫診断法により定量化することができる。ｍＲＮＡは、当技術分野において周知で常套的となっている方法により、例えばノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、または逆転写との関係におけるポリメラーゼ連鎖反応などにより定量化することができる。細胞の生死判別は、当技術分野で知られているトリパンブルー染色またはその他の細胞の死または生のマーカーを用いて評価することができる。分化は、形態などにおける変化に基づいて視覚的に評価することができる。
【００８１】
ベンゾピラノン化合物はまた、当技術分野で知られている各種のアッセイ、あるいは本明細書で説明されるアッセイを用いてインビトロおよびインビボにおいて神経膠腫の細胞増殖、細胞転移および腫瘍形成を抑制することを実証することができる。そのような活性は、インビトロアッセイにおいてベンゾピラノン化合物を神経膠腫の腫瘍細胞と接触させることで実証することができる（Haroun, R. I.etal., J. Neurooncol. 58: 115-23 (2002)；Sharma A. et al., J. Mol. Neurosci. 17: 331-9(2001)；Iwadate Y. etal., Int.J. Mol. Med.10 : 187-92 (2002)）。
【００８２】
本発明では、限定するものではないが、以下のような当技術分野で知られている様々な手法による細胞周期分析および細胞増殖分析を記載しておく。
【００８３】
１つの例としては、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取り込みを、増殖細胞を同定するアッセイとして用いることができる。ＢＲＤＵアッセイは、ＢＲＤＵを新たに合成されるＤＮＡ中に取り込むことによりＤＮＡ合成を行なっている細胞集団を同定する。新たに合成されるＤＮＡはこのあと抗ＢＲＤＵ抗体を用いて検出することができる（Hoshino et al., 1986, Int. J. Cancer38, 369; Campana et al. , 1988, J. Immunol. Meth. 107, 79を参照されたい）。
【００８４】
細胞増殖は（３Ｈ）−チミジンの取り込みを用いて調べることもできる（例えば、Chen, J. , 1996, Oncogene 13: 1395-403; Jeoung, J. , 1995, J. Biol. Chem. 270: 18367-73を参照されたい）。このアッセイはＳ相ＤＮＡ合成の定量的な特性決定を可能とする。このアッセイでは、ＤＮＡを合成する細胞は（３Ｈ）−チミジンを新たに合成されるＤＮＡ中に取り込む。取り込みはこのあと当技術分野の標準的な手法により例えばシンチレーションカウンター（例えば、Beckman LS 3800 Liquid Scintillation Counter）で放射性同位元素をカウントすることにより測定することができる。
【００８５】
増殖細胞の核抗原（PCNA）検出も細胞増殖を測定するのに用いることができる。PCNAは増殖細胞において特に細胞周期の初期G1相およびS相において発現が増大している36キロダルトンのタンパク質であり、それゆえ増殖細胞に対するマーカーとして役立ち得る。陽性の細胞は抗PCNA抗体を用いる免疫染色により同定される（Li et al. , 1996, Curr. Biol. 6: 189-199; Vassilev et al., 1995, J. Cell Sci. 108: 1205-15を参照されたい）。
【００８６】
細胞増殖は、細胞集団のサンプルを時間に対して計数（例えば、日毎の細胞計数）することで測定することができる。細胞は血球計と光学顕微鏡（例えば、HyLite hemacytometer, Hausser Scientific）を用いて計数することができる。細胞数を時間に対してプロットして目的の集団についての増殖曲線を求めることができる。好ましい実施形態では、この方法で計数される細胞に最初に色素トリパンブルー（Sigma）が混ぜられ、そうすると生存細胞はこの色素を排出するので集団中の生存細胞として計数される。
【００８７】
細胞のＤＮＡ計数および／または分裂指数は、例えば細胞のＤＮＡ倍数値に基づいて測定することもできる。例えば、細胞周期のＧ１相にある細胞は普通２ＮのＤＮＡ倍数値を有している。ＤＮＡが複製しているが有糸分裂までは進行していない細胞（例えば、Ｓ相にある細胞）は２Ｎより大きく最大４ＮのＤＮＡ含量の倍数値を示すと考えられる。倍数値および細胞周期速度はヨウ化プロピジウムアッセイを用いてさらに測定することができる（例えば、Turner, T. , et al. , 1998, Prostate 34: 175-81）を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡ倍数は、コンピュータ化されたマイクロデンシトメトリー染色システムでのＤＮＡフォイルゲン染色（これは化学量論量でＤＮＡに結合する）の定量化により決定することもできる（例えば、Bacus, S. , 1989, Am. J.Pathol. 135 : 783-92を参照されたい）。もう１つの実施形態では、ＤＮＡ含量は染色体展開の標本によって分析することができる（Zabalou, S. , 1994, Hereditas. 120: 127-40; Pardue, 1994, Meth. Cell Biol. 44: 333351）。
【００８８】
細胞周期のタンパク質（例えば、ＣｙｃＡ． ＣｙｃＢ， ＣｙｃＥ， ＣｙｃＤ， ｃｄｃ２， Ｃｄｋ４／６， Ｒｂ， ｐ２１， ｐ２７など）の発現は、細胞または細胞集団の増殖状態に関する重要な情報を提供する。例えば、抗増殖シグナル経路における同定はｐ２１ＣｉＰｌの誘発によって示され得る。細胞中のｐ２１発現レベルの増大は細胞周期Ｇ１への進入を遅延させる（Harper et al. , 1993, Cell 75: 805-816; Li et al. , 1996, Curr. Biol. 6: 189-199）。Ｐ２１誘発は、市販されている（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）特定の抗ｐ２１抗体を用いて免疫染色により同定することができる。同様にして、細胞周期タンパク質は、市販の抗体を用いてウエスタンブロット分析により調べることができる。もう１つの実施形態では、細胞集団は細胞周期タンパク質の検出の前に同期化される。細胞周期タンパク質は、目的のタンパク質に対する抗体を用いてＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーター）分析により検出することもできる。
【００８９】
細胞周期の長さまたは細胞周期の速さにおける変化の検出を用いて、ベンゾピラノン化合物による細胞増殖の抑制を測定することもできる。１つの実施形態では細胞周期の長さは細胞集団（例えば、本発明の１以上のベンゾピラノン化合物と接触させたまたは接触させていない細胞を用いて）の倍加時間により決定される。もう１つの実施形態では、ＦＡＣＳ分析を用いて細胞周期進行の相が分析されるあるいはＧ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍの画分が精製される（例えば、Delia, D. et al. , 1997, Oncogene 14: 2137-47を参照されたい）。
【００９０】
細胞周期チェックポイント（１個または複数個）の経過、および／または細胞周期チェックポイント（１個または複数個）の誘導は、本明細書に記載されている方法により、あるいは当技術分野で知られている方法により調べることができる。限定するものではないが、細胞周期チェックポイントは、ある特定の細胞の事象がある特定の順序で起ることを確実にするための機構である。チェックポイント遺伝子は、前の事象が先に完了することなく後の事象が起ることを可能とする突然変異により定義される（Weinert, T. , and Hartwell, L. , 1993, Genetics, 134: 63-80）。細胞周期チェックポイント遺伝子の誘導または抑制は、例えばウエスタンブロット分析、あるいは免疫染色などにより評価することができる。細胞周期チェックポイントの経過は、特定の事象が先に起ることなく（例えば、ゲノムＤＮＡの完全な複製なしに有糸分裂に進行すること）細胞がチェックポイントを進行するということによってさらに評価することができる
特定の細胞周期タンパク質発現の作用に加えて、細胞周期に関与するタンパク質の活性および翻訳後修飾は細胞の制御および増殖状態において不可欠の機能を有しうる。本発明では、関係する、当技術分野で知られている方法により検出される翻訳後修飾（例えばリン酸化反応）アッセイを記載しておく。例えば、リン酸化チロシン残基を検出する抗体は市販されており、ウエスタンブロット分析に用いてそのような修飾があるタンパク質を検出することができる。もう１つの例では、ミリスチン化などの修飾を薄層クロマトグラフィーまたは逆相ｈ．ｐ．ｌ．ｃ．で検出することができる（例えば、Glover, C., 1988, Biochem. J. 250: 485-91; Paige, L. , 1988, Biochem J. ; 250: 485-91を参照されたい）。
【００９１】
シグナル伝達および細胞周期タンパク質および／またはタンパク質複合体の活性には多くの場合キナーゼ活性が介在する。本発明では、ヒストンＨ１アッセイなどのアッセイによるキナーゼ活性の分析を記載しておく（例えば、Delia, D. et al. , 1997, Oncogene 14: 2137-47を参照されたい）。
【００９２】
ベンゾピラノン化合物は、当技術分野で周知の方法を用いてインビトロで培養細胞における細胞増殖を改変することを実証することもできる。原発性脳腫瘍および転移性脳腫瘍に対する細胞培養モデルの特定的な例としては、限定するものではないが、以下の米国特許：第６，１９４，１５８号；第６，０５１，３７６号；および第６，０７１，６９６号に記載されているものが挙げられる。
【００９３】
ベンゾピラノン化合物はインビトロで細胞転移（または悪性表現型への進行）を抑制することを実証することもできる。この実施形態では、転移細胞表現型をもつ細胞を１以上のベンゾピラノン化合物と接触させて、転移表現型に関連する特性（インビボでの腫瘍形成性能力に関連するインビトロ特性のセット）例えば、限定するものではないが、軟寒天におけるコロニー形成、より丸みのある細胞形態、緩い基層付着、接触抑制の喪失、足場依存性の喪失、プラスミノーゲンアクチベーターなどのプロテアーゼの放出、糖輸送の増大、血清要求の減少、または胎児抗原の発現などにおける変化について検査する（Luria et al. , 1978, General Virology, 3d Ed. , John Wiley & Sons, New York, pp. 436-446を参照されたい）。
【００９４】
浸潤性が喪失することまたは付着力が低下することを利用してベンゾピラノン化合物の抗癌作用を実証することもできる。例えば、転移性癌形成の臨界的な側面は、前癌細胞または癌細胞が疾患の原発部位から離れて第２の部位で新しい増殖コロニーをつくる能力である。細胞が周辺部位に侵入する能力は癌状態への可能性を反映するものである。浸潤性の喪失は、例えばＥ−カドヘリン介在細胞−細胞付着の誘導などの当技術分野で知られている様々な手法によって測定することもできる。そのようなＥ−カドヘリン介在付着は表現型の逆転および浸潤性の喪失を生じることができる（Hordijk et al. , 1997, Science 278: 1464-66）。
【００９５】
浸潤性の喪失はさらに細胞移動の抑制によっても調べることができる。各種の二次元および三次元の細胞マトリックスが市販されている（Calbiochem-Novabiochem Corp. San Diego, CA）。マトリックスを横断するまたはその中への細胞移動は、コマ撮り写真もしくはビデオ撮影の顕微鏡により、あるいは細胞移動の測定を可能とする当技術分野における方法により調べることができる。関係する実施形態において、浸潤性の喪失は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対する応答により調べられる。ＨＧＦ誘発細胞分散は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞などの細胞の浸潤と相関している。このアッセイは、ＨＧＦに応答して細胞分散活性を喪失した細胞集団を識別する（Hordijk et al. , 1997, Science 278: 1464-66）。
【００９６】
あるいは、浸潤性の喪失は走化性チャンバー（Neuroprobe/Precision Biochemicals Inc. Vancouver, BC）を通過する細胞移動により測定することもできる。そのようなアッセイでは、化学誘引剤がチャンバーの一方の側（例えば、底部チャンバー）でインキュベートされ、細胞が、反対側（例えば、頂部チャンバー）を隔てるフィルター上に塗布される。細胞が頂部チャンバーから底部チャンバーへ通過するためには、細胞はフィルター中の小さい穴を通って活発に移動しなければならない。移動した細胞数のチェッカーボード分析をこのあと浸潤性と相関させることができる（例えば、Ohnishi, T. , 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 193 : 518-25を参照されたい）。
【００９７】
ベンゾピラノン化合物はまたインビボで腫瘍形成を抑制することを実証することもできる。腫瘍形成および転移性拡散などの高増殖性疾患の膨大な数の動物モデルが当技術分野では知られている（Table 317-1, Chapter 317,"Principals of Neoplasia,"in Harrison's Principals of Internal Medicine, 13th Edition, Isselbacher et al. , eds. , McGraw-Hill, New York, p. 1814, and Lovejoy et al. , 1997, J. Pathol. 181: 130-135を参照されたい）。原発性脳腫瘍および転移性脳腫瘍についての特定的な例が以下の米国特許：第５，８９４，０１８号；第６，０２８，１７４号；および第６，２０３，７８７号（参照により本明細書に援用する）に記載されている。さらに、多数の癌のタイプに適用可能な汎用動物モデルが報告されており、限定するものではないが、ｐ５３−欠失マウスモデル（Donehower, 1996, Semin. Cancer Biol. 7: 269-278）、Ｍｉｎマウス（Shoemaker et al. , 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332: F25-F48）、ネズミにおける腫瘍に対する免疫応答（Frey, 1997, Methods, 12: 173-188）などが挙げられる。
【００９８】
例えば、ベンゾピラノン化合物を実験動物、好ましくは腫瘍が発達しやすい実験動物に投与し、そうしてこの実験動物をこのあと腫瘍形成の発生の低下についてベンゾピラノン化合物を投与していない対照との比較において調べることができる。あるいは、ベンゾピラノン化合物を腫瘍のある実験動物（例えば、悪性の、新生物細胞または転位細胞の導入により、あるいは発癌物質の投与により腫瘍が誘発された動物）に投与して、そのあとその実験動物における腫瘍を腫瘍後退についてベンゾピラノン化合物を投与していない対照動物との比較において調べることができる。
【００９９】
以下の実施例は本発明を理解する上において助けとなるよう記載するものであって、本明細書に記載され、特許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものではない。
【０１００】
以下の実施例は、本発明の非限定的な態様である。
【実施例１】
【０１０１】
実施例１および２は代表的なベンゾピラノン化合物の合成に関する。
【化６】
【０１０２】
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の４−クロロフェニル酢酸溶液（１１．０５ｇ、６４．８ｍｍｏｌ）を約１５分かけてＣＤＩ（１３．１３ｇ、８１ｍｍｏｌ）で数部ずつ処理し、気体の発生が停止するまで混合物を攪拌した。４−フルオロ−２−ヒドロキシアセトフェノン（５．０ｇ、３２．４ｍｍｏｌ）を添加し、続いて炭酸カルシウム（１５．７ｇ、１１３．６ｍｍｏｌ）および４−ＤＭＡＰ（約１ｇ）を添加した。反応混合物を約８０℃で約１０時間加温した後、室温に冷却した。水（２００ｍＬ）を添加し、水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、約３．５ｇ（３８％）のベンゾピラノン中間体を得た。
【０１０３】
ＣＣｌ４（２０ｍＬ）中のベンゾピラノン中間体の溶液（１．８５ｇ、６．８ｍｍｏｌ）をＮＢＳ（１．３３ｇ、７．５ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（０．０９ｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、約１５時間にわたり還流して混合物を加熱した。反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル／ヘキサン）を用いて精製し、約２．６ｇ（９２％）のブロモメチル−ビンゾピラノンを得た。
【０１０４】
ブロモメチル−ベンゾピラノン（１．０ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシフェニルボロン酸（０．５６ｇ、４．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液を、２Ｍ炭酸ナトリウム（５ｍＬ）および（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）−ジクロロパラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン複合体（０．１ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を約６時間かけて還流で加熱した後、室温に冷却した。粗生成物はフラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル／ヘキサン）を用いて精製し、約０．３０ｇ（３０％）のフェノールベンゾピラノンを得た。
【０１０５】
フェノールベンゾピラノン（０．２８ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．２８ｇ、１．１ｍｍｏｌ）および１−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジン（０．１３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ＣＨ２ＣＩ２（１：１，８ｍＬ）溶液をＤＩＡＤ（０．２２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）で処理し、反応混合物を室温で約６時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、粗生成物はフラッシュクロマトグラフィ（塩化メチレン／メタノール）を用いて精製し、約３５ｍｇ（１０％）の１３−（４−クロロフェニル）−７−フルオロ−４−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル］−クロメン−２−オンを得た。
【実施例２】
【０１０６】
【化７】
【０１０７】
Ｎ２雰囲気下で、３位をＲ１（上記定義の通り）で置換されたフェノール、および４−ヒドロキシフェニル酢酸（１．２当量）をクロロベンゼン中に懸濁する。三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（３当量）を約５分で約２０〜約２５℃にて添加する。懸濁液を約８０℃に加熱し、約４〜５時間攪拌した後、一晩かけて冷却する。
【０１０８】
沈殿した固形物をＮ２圧を用いて濾過し、ろ液を冷水（約０〜約５℃）に注ぐことにより直接急冷する（わずかに発熱性）。得られるろ過固形物をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。飽和水性炭酸ナトリウムを約１０〜約１５分以内にろ液に添加し、発砲を観察する。得られる固体は約２０℃で一晩攪拌する。懸濁液をろ過し、Ｈ２ＯおよびＭＴＢＥ（３回）で洗浄し、Ｎ２圧下で一晩乾燥させる。得られる生成物を約４０℃にて真空下で乾燥することで、一定量を達成する。
【０１０９】
４−クロロフェニル酢酸（２当量）をＤＭＦに溶解し、約１８℃で攪拌する。ＣＤＩ（２当量）を透明な緑色／黄色溶液にゆっくりと約１５分以内に添加する。ＣＤＩ添加の間に気体の発生（ＣＯ２）が観察される。混合物を約５５℃に加熱し、約２５分間この温度で攪拌し、約１０℃に冷却する。Ｋ２ＣＯ３（２当量）、ＤＭＡＰ（０．２当量）および直前のパラグラフの生成物を、この黄色／褐色懸濁液に添加し、懸濁液を約９４〜約９６℃に加温し、約１時間攪拌する。
【０１１０】
Ｋ２ＣＯ３をろ過し、ＤＭＦで洗浄する。ろ液を強く攪拌しながら冷水に注ぎ、混合物をさらに約１〜２時間攪拌する。懸濁液を約０〜約５℃冷却し、固形物をろ別する。ろ過固形物はＭＴＢＥと１．５Ｍ ＨＣｌの間に分布する。水相をＭＴＢＥで抽出する。有機相を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄する。有機相を約１．５〜１．７Ｍ溶液（０．６〜０．６５Ｌ／ｍｏｌ）になるまで濃縮し、ＥｔＯＡｃで希釈する。得られる懸濁液を約５５℃に加熱し、約１５分攪拌し、約３〜４時間かけて約０℃に冷却する。得られる生成物をろ過し、冷ＭＴＢＥ／ＥｔＯＡｃ５：１（約２０〜約２５℃）で洗浄し、Ｎ２を一晩流出して乾燥させる。
【０１１１】
直前のパラグラフの生成物（１当量）、トリフェニルホスフィン（２当量）、および１−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジン（３当量）のＴＨＦ／ＣＨ２ＣＩ２溶液をＤＩＡＤ（１．８当量）で処理し、反応混合物を室温で約６時間攪拌する。溶媒を除去し、粗精製物はフラッシュクロマトグラフィで精製し、７−置換３−（４−クロロフェニル）−４−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル］−クロメン−２−オン化合物を得る。
【０１１２】
本発明は、本発明のいくつかの態様を説明することを目的としたこれら実施例に開示されている特定的な実施形態により範囲が限定されるものであってはならず、機能的に同等であるどのような実施形態も本発明の範囲内に入る。実際、本明細書で示されたまた本明細書で記載された実施形態に加えての本発明の様々な改変は当業者には明らかなものであり、そのようなものは添付の特許請求の範囲内に入る。
【０１１３】
多数の文献を引用したが、それらの全開示内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１０月１５日出願の米国仮出願第６０／４１８，４６９号の利益を主張し、その全文を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、癌を治療または予防するためのベンゾピラノン化合物、ベンゾピラノン化合物を含む組成物、およびベンゾピラノン化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
２．１ 癌
癌は、所定の正常組織に由来する異常細胞数の増大、その異常細胞による隣接組織の侵襲、または悪性細胞の局所的リンパ節および遠隔位へのリンパ節もしくは血液による拡散（転移）を主な特徴としている。臨床データおよび分子生物学的研究は、癌がわずかな前新生物変化で開始し、特定の条件下で新生物へと進行しうる多段階の過程であることを示している。新生物病変は、クローン性で進化し、特に新生物細胞が宿主の免疫監視を回避する条件下では、侵襲、増殖、転移および不均一性の能力が増大する（Roitt, I., Brostoff, J and Kale, D., Immunology, 17.1-17.12 (3rd ed., Mosby, St. Louis, Mo. , 1993)）。
【０００４】
癌のわずかに数種のみであるが以下に説明する。
【０００５】
他の種の癌の特徴は、医療従事者には周知であり、医学文献に記載されている。
【０００６】
２．２ 脳癌および脳転移
毎年約１０，０００件の脳腫瘍が発生し、また毎年約４０００件の脊髄腫瘍が発生する（Kornblith et al.(1985), Cancer : Principles and Practice of Oncology, 2nd Ed., DeVita, V., Hellman, S., Rosenberg, S., eds., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, Chapter 41 :Neoplasms of the Central Nervous System）。中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍は若年患者において最も多く発生する充実性腫瘍の群である（同上）。神経膠腫が全原発性ＣＮＳ腫瘍の約６０％を占め、最も多く発生する脳原発性腫瘍は星状細胞腫、髄膜腫、乏突起膠腫および組織細胞リンパ腫である（同上）。神経膠腫は通常脳の大脳半球に起るが、視神経、脳幹または小脳などの他の部分でも起ることがある（Brain Tumor Society; www/tbts.org/primary.htm）。
【０００７】
神経膠腫は、それが発生する膠細胞のタイプによって分類される。最も多く発生する膠細胞のタイプは星状細胞腫である。この腫瘍は、星状細胞と呼ばれる星状膠細胞から発生する。星状細胞腫にはその悪性度によって悪性度の等級がつけられている。悪性度ＩおよびＩＩの星状細胞腫とも呼ばれる低悪性度星状細胞腫は悪性度が最も低く、ゆっくりと増殖し、多くの場合手術により完全に除去することができる。悪性度ＩＩＩ星状細胞腫とも呼ばれる中悪性度星状細胞腫はより速く増殖し、より悪性である。悪性度ＩＩＩ星状細胞腫は、手術とそのあとの放射線療法および一部化学療法で治療される。悪性度ＩＶ星状細胞腫とも呼ばれる高悪性度星状細胞腫は、速く増殖し、近隣の組織を浸潤し、非常に悪性である。悪性度ＩＶ星状細胞腫は通常手術とそのあとの放射線療法と化学療法の組み合せで治療される。多形性膠芽腫は悪性度ＩＶ星状細胞腫であり、これは最も悪性なもので、致命的な原発性脳腫瘍である（同上）。
【０００８】
歴史的には、星状細胞腫の治療では、腫瘍除去の手術とそのあとの放射線療法が行なわれてきた。化学療法を放射線療法の前か後に行なってもよい（Kornblith et al.(1985), Cancer :Principles and Practice of Oncology, 2nd Ed., DeVita, V., Hellman, S., Rosenberg, S., eds., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, Chapter 41: Neoplasms of the Central Nervous System）。同じ手術手法および手術原理が多形性膠芽腫と悪性度の低い脳腫瘍に行なわれてきたが、多形性膠芽腫瘍の完全除去はより難しいものであった。
【０００９】
悪性度ＩＶの星状細胞脳腫瘍があると診断された患者の予後は統計的によくない。悪性度Ｉの星状細胞を治療した人は普通再発することなく１０年以上生存できるが、悪性度ＩＶ星状細胞腫瘍をもつ患者の平均生存期間は手術処置から１５週間である。悪性度ＩＶ星状細胞腫瘍の腫瘍増殖能力が高いため、手術のみの治療の１年後では患者のたったの５％が生存し、２年後ではほぼ０％の生存率である。手術による処置と組み合せた放射線治療では治療２年後の生存率は約１０％に上がる。しかしながら、実際５年より長く生存する患者はいない（同上）。
【００１０】
２．３ 現行の癌治療
現在のところ、癌療法は、患者の新生物細胞を根絶するために、手術、化学療法、および／または放射線治療を必要とする（たとえば、Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Chapter 12, Section IVを参照されたい）。これらの手法はすべて、患者にとって顕著な欠点を伴う。たとえば、手術は、患者の健康によっては禁忌になることもあるし、または患者に受け入れがたいこともある。さらに、手術では、新生物組織を完全に除去しえない可能性もある。放射線療法は、照射される新生物組織が正常組織よりも放射線に対して高い感受性を呈する場合にのみ効果があり、しかも放射線療法は、多くの場合、重篤な副作用を引き起こす可能性がある（上掲文献参照）。化学療法に関しては、新生物疾患の治療に利用可能なさまざまな化学療法剤が存在する。しかしながら、さまざまな化学療法剤が利用可能であるにもかかわらず、化学療法は多くの欠点を有する（たとえば、Stockdale, 1998, "Principles Of Cancer Patient Management" Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Ch. 12, sect. 10を参照されたい）。ほとんどすべての化学療法剤は有毒であり、化学療法は、重度の悪心、下痢、骨髄抑制、免疫抑制などを含めて、顕著でかつ多くの場合危険な副作用を引き起こす。このほか、多くの腫瘍細胞は、多剤耐性により化学療法剤に対して耐性があるかまたは耐性を獲得する。
【００１１】
脳腫瘍の治療にはニトロソ尿素化学療法薬が通常使われる。この化合物の鍵となる特性は、それが血液−脳関門を横断することができるという能力である。この化合物のうち１−３−ビス−２−クロロエチル−１−ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ， カルムスチンとも呼ばれる）が臨床的に最初に使われた。手術および／または放射線治療と組み合せたＢＣＮＵの使用は有効であることが示されているが、多形性膠芽腫脳腫瘍を治すには至っていない。さらに、長期に亘るニトロソ尿素治療による合併症が報告されている（Cohen et al.(l976), Cancer Treat. Rep. 60, 1257-1261）。この合併症には肺線維症、肝障害、腎不全、およびニトロソ尿素治療に伴う二次性腫瘍の症例が含まれる。
【００１２】
癌治療にエストロゲン受容体モジュレータータモキシフェンおよびラロキシフェンを使う研究も行なわれている。タモキシフェンは、再発性悪性神経膠腫の治療を行なうヒト臨床試験で使われている（Couldwell et al. (1996), Clin. Cancer Res. 2,619-622）。ラロキシフェンは、ネズミモデルにおいて尾腫瘍の肺への転位を抑制することが報告されている（Neubauer et al. (1995), Prostate 27,220-229）。
【００１３】
手術、放射線療法および化学療法の治療計画は悪性度ＩＶの星状細胞脳腫瘍をもつ患者の寿命をそこそこ長くするチャンスを与えるものであるが、それぞれの療法に伴うリスクは多い。治療の恩恵は少なく、治療により患者の残っている短い寿命のクオリティが大きく低下することがある。
【００１４】
従って、上記した伝統的療法の欠点を克服する抗癌性化合物および治療方法に対して当技術分野で明確なニーズが依然としてある。
【００１５】
本出願明細書の第２節における参考文献の記載および引用は、その参考文献が本出願に対して先行技術となるということを認めるものではない。
【発明の開示】
【００１６】
３．発明の概要
本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
【００１７】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
の化合物およびその薬学的に許容される塩に関する。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩（それぞれ「ベンゾピラノン化合物」である）は、患者における癌の治療または予防に有用である。
【００１９】
本発明はまた、有効量のベンゾピラノン化合物および薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む組成物に関する。該組成物は、患者における癌の治療または予防に有用である。
【００２０】
本発明はさらに、癌の治療または予防を必要とする患者に、有効量のベンゾピラノン化合物を投与することを含む癌の治療または予防方法に関する。
【００２１】
本発明はまたさらに、癌細胞または新生物細胞と有効量のベンゾピラノン化合物とを接触させることを含む癌細胞または新生物細胞の増殖を抑制する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
４．発明の詳細な説明
４．１ 定義
本明細書で使用する用語「Ｃ１−６アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の非環式炭化水素鎖を意味する。代表的な直鎖Ｃ１−６アルキルとしては、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピル、−ｎ−ブチル、−ｎ−ペンチルおよび−ｎ−ヘキシルが挙げられる。代表的な分枝鎖Ｃ１−６アルキルとしては、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、−ネオペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、および３，３−ジメチルブチルが挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用する用語「Ｃ１−４アルキル」とは、１〜４個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の非環式炭化水素鎖を意味する。代表的な直鎖Ｃ１−４アルキルとしては、−メチル、−エチル、−ｎ−プロピルおよび−ｎ−ブチルが挙げられる。代表的な分枝鎖Ｃ１−６アルキルとしては、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、および−ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用する用語「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「予防する」「予防している」および「予防」には、患者における癌の再発、拡張または発症を防止することが含まれる。
【００２６】
本明細書で使用する用語「治療する」「治療している」および「治療」には、原発性、局所性または転移性癌組織の根絶、除去、改変または調節、ならびに癌の拡散の最小化または遅延が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用する用語「患者」とは、動物、例えば限定するものではないが、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなどの動物を意味し、一実施形態においては哺乳動物、別の実施形態ではヒトを意味する。特定の実施形態において、患者は、幼児期、青年期または成人でありうる。
【００２８】
本明細書でベンゾピラノン化合物に関して使用する用語「有効量」とは、癌の治療または予防に有効なベンゾピラノン化合物の量を意味する。
【００２９】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される塩」としては、限定されるものではないが、式（Ｉ）の化合物の酸性基の塩または塩基性基の塩が挙げられる。本質的に塩基性である本方法および組成物において包含される化合物は、各種の無機および有機酸と様々な塩を形成することができる。そのような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩を生成させるのに用いることができる酸は、非毒性の酸付加塩、すなわち薬理学上許容される陰イオンを含む塩を生成するものであり、例えば、限定するものではないが、硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サルチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））の塩が挙げられる。上記した酸に加えて、アミノ部分を含む本方法および組成物において包含される化合物は、各種のアミノ酸と医薬上または化粧品上許容される塩を生成することもできる。本質的に酸性である本方法および組成物において包含される化合物は、各種の薬理学上または化粧品上許容される陽イオンと塩基塩を生成することができる。そのような塩の例としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩、特にカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウムリチウム塩、亜鉛塩、カリウム塩、および鉄塩が挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用する略語「ＤＭＡＰ」とは４−ジメチルアミノピリジンを意味する。
【００３１】
本明細書で使用する略語「ＤＭＦ」とはジメチルホルムアミドを意味する。
【００３２】
本明細書で使用する略語「ＮＢＳ」とはＮ−ブロモスクシンイミドを意味する。
【００３３】
本明細書で使用する略語「ＡＩＢＮ」とは２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する略語「ＤＭＥ」とはジメチルエーテルを意味する。
【００３５】
本明細書で使用する略語「ＤＩＡＤ」とはジイソプロピルアゾジカルボキシレートを意味する。
【００３６】
本明細書で使用する略語「ＣＤＩ」とは１，１’−カルボニルジイミダゾールを意味する。
【００３７】
本明細書で使用する略語「ＭＴＢＥ」とはメチルｔ−ブチルエーテルを意味する。
【００３８】
本発明は、本発明の非限定的実施形態の例示を目的とする以下の詳細な説明、および実施例を参照することによりより十分に理解することができる。
【００３９】
４．２ ベンゾピラノン化合物
上述したように、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
【００４０】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
のベンゾピラノン化合物、およびその薬学的に許容される塩に関する。
【００４１】
一実施形態において、Ｒ１はハロゲンである。
【００４２】
別の実施形態において、Ｒ１はトリフルオロメチルである。
【００４３】
別の実施形態において、Ｒ１はＣ１−Ｃ６アルキルである。
【００４４】
別の実施形態において、Ｒ１はＣ１−Ｃ４アルキルである。
【００４５】
具体的なベンゾピラノン化合物を以下の表１に示す。
【化３】
【００４６】
【表１】
【００４７】
４．３ ベンゾピラノン化合物の取得方法
ベンゾピラノン化合物は、当業者により公知の方法ならびに本明細書に開示する合成経路によって調製することができる。例えば、ベンゾピラノン化合物は以下の一般的な反応スキーム１または反応スキーム２によって合成することができる。
【化４】
【００４８】
反応スキーム１により、Ｒ１がフルオロである式（Ｉ）のベンゾピラノン化合物が得られる。
【化５】
【００４９】
反応スキーム２により、Ｒ１がフルオロ以外である式（Ｉ）のベンゾピラノン化合物が得られる。
【００５０】
ベンゾピラノン化合物のいくつかは、水または他の有機溶媒と溶媒和物を形成することもある。そのような溶媒和物も同様に本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
４．４ ベンゾピラノン化合物の治療および予防用途
ベンゾピラノン化合物の活性により、ベンゾピラノン化合物は獣医学およびヒト医学において有利なことに有用である。特に、ベンゾピラノン化合物は、癌の治療または予防に有用である。
【００５２】
一実施形態において、癌は、頭部、頚部、眼、口腔、咽喉、食道、胸部、骨、肺、大腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、精巣もしくは他の生殖器、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、および脳または神経系の腫瘍である。
【００５３】
別に実施形態において、癌は転移したものである。特定の実施形態において、転移した癌は、肺（小細胞および非小細胞のいずれも）、乳房、原発腫瘍不明、黒色腫または結腸を起源とする。
【００５４】
別の実施形態において、癌は原発性脳腫瘍である。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明において治療または予防対象の癌としては、限定されるものではないが、原発性頭蓋内中枢神経系腫瘍が挙げられる。原発性頭蓋内中枢神経系腫瘍には、例えば多形性膠芽腫、悪性星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫、低悪性度星状細胞腫、髄膜腫、間葉腫瘍、下垂体腫瘍、シュワン細胞腫などの髄鞘腫瘍、中枢神経系リンパ腫、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経細胞腫瘍および神経細胞／膠細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫瘍、または脈絡叢腫瘍が含まれる。
【００５６】
他の実施形態において、本発明において治療または予防対象の癌としては、限定されるものではないが原発性脊髄腫瘍、例えばシュワン細胞腫、髄膜腫、上衣細胞腫、肉腫、星状細胞腫、神経膠腫、血管腫瘍、脊索腫および類表皮腫などが挙げられる。
【００５７】
他の実施形態において、本発明において治療または予防対象の癌としては、限定されるものではないが、脳転移に寄与する原発性腫瘍、例えば肺（小細胞および非小細胞のいずれも）、乳房、原発腫瘍不明、黒色腫または結腸である。
【００５８】
獣医学的用途のために動物、あるいは臨床的用途のためにヒトなどの患者に投与する場合、ベンゾピラノン化合物は単離された形態でありうる。「単離された」とは、投与の前に、ベンゾピラノン化合物を、合成有機化学反応の混合物、または天然の生成物源、例えば植物、組織培養、細菌ブロスなどの他の成分から分離することを意味する。一実施形態において、ベンゾピラノン化合物は、通常の方法、例えば抽出とそのあとのクロマトグラフィー、再結晶、あるいは他の通常の方法により単離する。単離された形態では、ベンゾピラノン化合物は、単離されたものの少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９５重量％が単一のベンゾピラノン化合物である。「単一ベンゾピラノン化合物」とはベンゾピラノン化合物の１つのエナンチオマーまたは１つのラセミ化合物を意味する。
【００５９】
ベンゾピラノン化合物は有利には組成物の形態、一実施形態においては医薬組成物の形態で投与する。これらの組成物は都合のよい経路、例えば注入またはボーラス注射により、上皮内層または粘膜・皮膚内層（例えば、口腔内粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により、あるいは対流補強型医薬送達系[convection-enhanced drug delivery system]を介して投与することができ、また別の有効薬物と一緒に投与することもできる。投与は全身的または局所的であってよい。各種の送達系が知られており、例えばリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル、カプセルの中への封入であり、本発明のベンゾピラノン化合物を投与するのに用いることができる。一部の実施形態では、本発明の１以上のベンゾピラノン化合物が患者に投与される。投与の方法には、限定するものではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、腟内、経皮、直腸からの、吸入による、あるいは耳、鼻、目、または皮膚への局所的な投与がある。特定の投与方法は担当の医師の判断に委ねられるものであるが、ある程度はその癌の所定の部位によって決まると考えられる。
【００６０】
一実施形態において、ベンゾピラノン化合物は、別の治療剤または予防剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、治療剤または予防剤は化学療法剤である。
【００６１】
別の実施形態においては、１以上のベンゾピラノン化合物を、治療を必要とする部分に局所的に投与するのが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではないが、手術の際の局所注入、局所適用（例えば手術の後の創傷包帯剤と組み合せて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、あるいは埋め込み（そのような埋め込みは多孔質、非多孔質、またはゼラチン状物質であり、シアラスチック[sialastic]膜などの膜またはファイバーである）により行なうことができる。１つの実施形態では、原発性脳腫瘍または転移性脳腫瘍の部位（または以前の部位）での直接注射による投与である。
【００６２】
一部の実施形態では、１以上のベンゾピラノン化合物を中枢神経系の中に、脳室内注射および髄鞘内注射などの好適な経路により導入するのが望ましいと考えられる。脳室内注射は、例えばオマヤレザバーなどのレザバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易に行なうことができる。
【００６３】
経肺的投与も用いることができ、例えば、吸入器または噴霧器および、エアロゾル化剤が入った製剤を使用することにより、あるいはフルオロカーボンまたは合成肺界面活性剤中の灌流を介して行なうことができる。一部の実施形態では、ベンゾピラノン化合物は、慣用の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐剤として製剤化することができる。
【００６４】
１つの実施形態では、ベンゾピラノン化合物は対流補強型医薬送達系を介して投与される。もう１つの実施形態では、ベンゾピラノン化合物は、米国特許第５，７２０，７２０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもののような対流補強型医薬送達系を介して投与される。対流補強型医薬送達では、灌流カテーテルの先端を組織（例えば、脳組織）内に配置し、灌流を行なっている間カテーテルの先端から正の圧力勾配を維持しながらカテーテルを通して医薬（例えば、ベンゾピラノン化合物）を供給することが行なわれる。カテーテルは、医薬を送達し、医薬の送達の最初から最後まで所望の圧力勾配を維持するポンプに連結されている。医薬送達速度は典型的には、灌流距離が約１ｃｍ以上で約０．５〜約４．０ｍｌ／分である。この方法は、脳および他の組織、特に充実性神経組織に医薬を送達するのに特に有用である。一部の実施形態において、対流補強型医薬送達は、ベンゾピラノン化合物を、高分子量極性分子例えば増殖因子、酵素、抗体、タンパク質複合体および遺伝子ベクターと組み合せて脳または他の組織に送達するのに有用である。これらの実施形態では、注入量は最大約１５．０ｍｌ／分とすることができる。
【００６５】
もう１つの実施形態では、本発明のベンゾピラノン化合物は小胞、特にリポソームで送達することができる（Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al. , in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds. ), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 同書, pp. 317-327; 総論的にも同書; を参照されたい）。
【００６６】
なおもう１つの実施形態では、ベンゾピラノン化合物は制御放出系で送達することができる。１つの実施形態では、ポンプを使用することができる（Langer, 上記書物; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al. , N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)を参照されたい）。もう１つの実施形態では、ポリマー性物質を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds. ), CRC Pres. , Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds. ), Wiley, New York(1984) ; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); を参照されたい、またLevy et al. , Science 228: 190 (1985); During et al. , Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al. , J. Neurosurg. 71: 105 (1989)も参照されたい）。なおもう１つの実施形態では、ベンゾピラノン化合物の標的（例えば、脳）の近傍に制御放出系を配置することができ、その結果全身性投与量のほんの一部の投与でよいことになる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra[上記書物], vol. 2, pp.115-138 (1984)を参照されたい）。Langer（Science 249: 1527-1533 (1990)）によるレビュー(総論)で議論されている他の制御放出系を使用することもできる。
【００６７】
本組成物は、患者に好適に投与するための形態を提供するよう、ベンゾピラノン化合物の有効量を、一実施形態では精製された形態で、適切な量の薬学的に許容される担体と一緒に含ませる。
【００６８】
一実施形態において、用語「薬学的に許容される」とは、連邦または州政府の規制当局により認可されていること、あるいは合衆国薬局方または、動物における、より特定的にはヒトにおける使用に対して一般に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」は、ベンゾピラノン化合物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は液体（例えば、水や油）であってよく、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物由来のものまたは合成されたものが挙げられる。医薬担体は、生理食塩水、ガムアカシア、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであってよい。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用することもできる。患者に投与する場合、ベンゾピラノン化合物および薬学的に許容される担体は滅菌していてよい。ベンゾピラノン化合物を静脈内投与する場合は水が有用な担体である。生理食塩水溶液ならびにデキストローゼ水溶液およびグリセロール水溶液も液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。好適な医薬担体としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、メリケン粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、ドライミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も挙げられる。本組成物は、所望であれば、少量の湿潤化剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。
【００６９】
本組成物は、溶剤、懸濁液剤、乳液剤、錠剤、丸薬、ペレット剤、カプセル剤、液体を含んでいるカプセル剤、粉剤、持続放出型製剤、坐剤、エアロゾル剤、スプレー剤の剤形または使用するのに好適な他の剤形をとることができる。１つの実施形態では、薬学的に許容される担体はカプセルである（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号を参照）。好適な医薬担体の他の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００７０】
１つの実施形態において、ベンゾピラノン化合物は定型の手順に従ってヒト静脈内投与用の医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与用ベンゾピラノン化合物は滅菌等張性緩衝水溶液中の溶液である。必要な場合は、本組成物は可溶化剤を含んでいてもよい。静脈内投与用の組成物は場合によっては注射の部位における痛みをやわらげるための局部麻酔薬（例えばリグノカイン）を含んでいてもよい。通常、各成分は、例えば、有効成分の量を表示したアンプルまたはサシェットなどの密封容器中の乾燥凍結粉末または無水濃縮物として単位用量剤形で別々にまたは一緒にして提供される。ベンゾピラノン化合物を灌流により投与する場合は、例えば滅菌医薬用水または生理食塩水が入った灌流ボトルを用いて投与することができる。ベンゾピラノン化合物を注射により投与する場合は、成分を投与の前に混ぜることができるよう滅菌注射用の水または生理食塩水のアンプルを提供する。経口投与用組成物は、例えば錠剤、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、顆粒、粉末、乳液、カプセル、シロップ、またはエリキシルなどの形態であってよい。経口投与される組成物には、医薬として口当たりのよい製剤を提供するために例えばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味剤；ハッカ、ウインターグリーン油またはチェリー油などの香味剤；着色剤；および保存剤などの１以上の任意付加的な試剤が入っていてもよい。さらに、錠剤形態または丸薬形態の場合は、本組成物に、消化管中での崩壊および吸収を遅らせるためのコーティングを行なうことによって、長時間の持続作用を提供することもできる。浸透圧活性推進化合物[osmotically active driving compound]を包み込んでいる選択透過膜もまた経口投与されるベンゾピラノン化合物には好適である。これの以降のプラットフォームにおいて、カプセルを取り囲む環境からの流体をこの推進化合物が吸収し、膨潤してアパチャーから医薬または医薬組成物を押し出す。これらの送達プラットフォームは、瞬時放出製剤のスパイク状投与プロファイル（形状）に対して基本的に０次の投与プロファイルを提供することができる。モノステアリン酸グリセロールまたはステアリン酸グリセロールなどの時間遅延物質を用いることもできる。経口用の組成物には、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を入れることができる。そのような担体は好ましくは医薬用のものである。
【００７１】
癌の治療または予防に有効であるベンゾピラノン化合物の量は標準的な手法により決定することができる。さらに、インビトロまたはインビボアッセイを場合によっては用いて至適用量範囲を特定するのに役立たせることもできる。有効な投与量は、投与の経路や疾病または疾患の程度にも依存するものであり、医師の判断および各患者の状況によって決定されるべきである。しかしながら、ベンゾピラノン化合物の有効経口投与量の一般的な範囲は、約０．５ｍｇ／日〜約５０００ｍｇ／日、一実施形態では約５００ｍｇ／日〜約３５００ｍｇ／日、別の実施形態では約１０００ｍｇ／日〜約３０００ｍｇ／日、別の１つの実施形態では約１５００ｍｇ／日〜約２５００ｍｇ／日、また別の１つの実施形態では約２０００ｍｇ／日である。もう１つの実施形態では、静脈内投与用の有効量は経口投与用量の約１０％であり、対流補強型医薬投与用の有効量は経口投与用量の約１％である。当然、多くの場合化合物の１日の投与量を少しずつ、１日のいくつかの時間に投与するのが実用的である。しかしながら、これらのいずれの場合においても、投与されるベンゾピラノン化合物の量は、有効成分の溶解度、用いる製剤、投与の経路などの因子に依存するものである。座剤は、通常約０．５重量％〜約１０重量％の範囲の有効量のベンゾピラノン化合物を含有する。経口用組成物は約１０％〜約９５％のベンゾピラノン化合物を含有しうる。本発明のいくつかの実施形態においては、経口投与用の好適な有効用量は通常体重１キログラム当りベンゾピラノン化合物約１０〜５００ｍｇである。他の実施形態では、有効な経口用量は体重１キログラム当り約１０〜１００、１００〜３００、３００〜９００、または９００〜１５００ｍｇである。他の実施形態では、有効な経口用量は体重１キログラム当り約１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００または４００〜５００ｍｇである。本発明の他の特実施形態においては、経口投与に有効な用量範囲は通常体重１キログラム当りベンゾピラノン化合物１〜７５００マイクログラムである。他の実施形態では、有効な経口用量は体重１キログラム当り約１〜１０、１０〜３０、３０〜９０、または９０〜１５０マイクログラムである。他の実施形態では、有効な経口用量は体重１キログラム当り約１５０〜２５０、２５０〜３２５、３２５〜４５０、４５０〜１０００または１０００〜７５００マイクログラムである。有効用量は、インビボ実験システムまたは動物モデル実験システムから導かれる用量−応答曲線から外挿することもできる。そのような動物実験およびシステムは当技術分野では周知である。
【００７２】
本発明はまた、１以上のベンゾピラノン化合物が充填された１以上の容器を含んでいるパックまたはキットも提供する。このような容器（１個または複数個）に場合によっては関係するのが、医薬または生物学的生成品の製造、使用または販売を規制する政府の当局が定める様式の注意書きであり、この注意書きはヒトへの投与に対する上記製造、使用または販売当局による認可を反映しているものとする。特定の実施形態においては、上記キットには、ベンゾピラノン化合物の前に、その後にまたは同時に投与することができる１以上の他の化学療法薬を入れておくこともできる。
【００７３】
ベンゾピラノン化合物は好ましくはヒトでの使用に先立ち所望の治療または予防の活性についてインビトロで、そしてそのあとインビボでアッセイする。例えば、インビトロアッセイを用いて、ある特定のベンゾピラノン化合物の投与がよいのか、それともベンゾピラノン化合物の組み合せの投与がよいのかを決定することができる。
【００７４】
１つの実施形態においては、患者の組織サンプルを培地中で増殖させ、そしてベンゾピラノン化合物と接触させるあるいはそれを投与し、組織サンプルへのそのようなベンゾピラノン化合物の作用結果を観察し、非接触の組織と比較を行なう。他の実施形態においては、細胞培養の細胞をベンゾピラノン化合物と接触させるあるいはそれを投与する細胞培養モデルを用い、そのようなベンゾピラノン化合物の組織サンプルへの作用結果を観察し、非接触の細胞培養との比較が行なわれる。通常、非接触細胞と比較して接触細胞の増殖または生存が少ないと、そのベンゾピラノン化合物は癌患者を治療するのに有効であることを示す。そのようなベンゾピラノン化合物はまた動物モデルシステムを用いて有効でありまた安全であることを示すこともできる。
【００７５】
ベンゾピラノン化合物は、薬学的に許容される塩の形態で投与しうる。薬学的に許容される塩は、有機化学では常識であるようにベンゾピラノン化合物の遊離塩形態を上記で説明したような好適な酸と反応させることで都合よく生成される。塩は、中程度の温度で高い収率で生成され、ベンゾピラノン化合物の塩形態を合成の最終工程において適切な酸性洗浄液から単に単離することで製造される。この塩形成性酸は、アルカノール（メタノール、エタノールもしくはイソプロパノール等）、ケトン（アセトン等）またはエステル（酢酸エステル等）などの無水または水含有有機溶媒中に溶解されていてもよい。これに対して、ベンゾピラノン化合物の遊離塩基形態が望まれている場合は、塩基性の最終洗浄工程から単離される。塩酸塩を生成させる代表的な手法では、遊離塩基を適切な溶媒に溶解させ、その溶液をモレキュラーシーブのようなものの上で十分乾燥させ、そのあとそれを通して塩化水素ガスをバブリングさせる。
【００７６】
４．５ 追加の治療
有効量のベンゾピラノン化合物の投与を含む癌の治療または予防方法は、さらに有効量の別の治療の適用（投与）を含んでもよい。他の治療としては、限定されるものではないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、骨髄移植、幹細胞置換療法、別の生物学的治療および免疫療法が挙げられる。
【００７７】
一実施形態において、本発明の方法は、血管形成阻害剤、例えば限定されるものではないが、以下：アンギオスタチン（プラスミノーゲン断片）、抗血管形成アンチトロンビンＩＩＩ、Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ、ＡＢＴ−６２７、Ｂａｙ１２−９５６６、ベネフィン、ベバシズマブ、ＢＭＳ−２７５２９１、軟骨由来阻害剤（ＣＤＩ）、ＣＡＩ、ＣＤ５９補体断片、ＣＥＰ−７０５５、Ｃｏｌ３、コンブレタスタチンＡ−４、エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）、フィブロネクチン断片、Ｇｒｏ−ベータ、ハロフジノン、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖断片、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ＩＭ−８６２、インターフェロンα／β／γ、インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン−１２、Ｋｒｉｎｇｌｅ５（プラスミノーゲン断片）、マリマスタット、抗炎症性ステロイド（限定されるものではないが、デキサメタゾンなど）、メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）、２−メトキシエストラジオール、ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ２７０２３Ａ）、ＭｏＡｂ ＩＭＣ−１Ｃ１１、ネオバスタット、ＮＭ−３、Ｐａｎｚｅｍ、ＰＩ−８８、胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター、血小板因子−４（ＰＦ４）、プリノマスタット、プロラクチン１６ｋＤ断片、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、ＰＴＫ ７８７／ＺＫ ２２２５９４、レチノイドＳｏｌｉｍａｓｔａｔ、スクアラミン、ＳＳ３３０４、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、ＴＮＰ−４７０、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレティキュリン断片）、ＺＤ６１２６、ＺＤ６４７４、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（ＦＴＩ）、およびビスホスホネート（例えば、アレンドロネート、エチドロネート、パミドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、ゾレドロネート、オルパドロネート、イカンドロネート、またはネリドロネートなど）の投与をさらに含む。
【００７８】
他の治療は、抗癌剤の投与でありうる。有用な抗癌剤としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：アシビシン、アクラルビシン、アコダゾールヒドロクロリド、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、アメタントロンアセテート、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレンヒドロクロリド、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシンヒドロクロリド、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシレート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシレート、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキセート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、エルビタックス、エソルビシンヒドロクロリド、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクリジン、リン酸フルダラビン、フルロウラシル、フルロシタビン、フォスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシンヒドロクロリド、イフォスファミド、イルモフォシン、ＩｍｉＤｓＴＭ、インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−Ｉａ、インターフェロンγ−Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロンヒドロクロリド、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミンヒドロクロリド、メゲストロールアセテート、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン、マイトクロミン、マイトギリン、マイトマルシン、マイトマイシン、マイトスペル、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロンヒドロクロリド、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴル、サフィンゴルヒドロクロリド、ＳｅｌＣｉｄＴＭ、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフル、テロキサントロンヒドロクロリド、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、トレストロンアセテート、トリシリビンホスフェート、トリメトレキセート、グルクロン酸トリメトレキセート、トリプトレリン、ツブロゾールヒドロクロリド、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、ビネピジンスルフェート、ビングリシネートスルフェート、ビンロイロシンスルフェート、酒石酸ビノレルビン、ビンロシジンスルフェート、ビンゾリジンスルフェート、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシンヒドロクロリドが挙げられる。他の抗癌剤としては、限定されるものではないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５−エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アムバムスチン、アミドックス、アミフォスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、血管形成阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリックス、抗背側化形態形成タンパク質−１、抗アンドロゲン、前立腺癌、抗エストロゲン、抗ネオプラストン、アフィジコリングリシネート、アポトーシス遺伝子調節因子、アポトーシス制御因子、アプリン酸、アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、βラクタム誘導体、β−アレチン、ベタクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフレート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルフォキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カンプトテシン誘導体、カナリポックスＩＬ−２、カペシタビン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ Ｍ３、ＣＡＲＮ ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリックス、クロールン、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クラムベシディン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、キュラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクホスフェート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシフォスファミド、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジコン、ダイデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール、９−、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルフォシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、フルオロダウノルニシンヒドロクロリド、フォルフェニメックス、フォルメスタン、フォストリエシン、フォテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレギュリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモフォシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫賦活ペプチド、インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール、４−、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン−Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトールスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、レバミソール、リアロゾール、直鎖ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド７、ロバプラチン、ロムブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテフォシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、ミトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多発性腫瘍抑制因子１−をベースとする治療、マスタード抗癌剤、マイカペルオキシドＢ、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ−アセチルジナリン、Ｎ−置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素モジュレーター、ニトロキシド酸化防止剤、ニトルリン、Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導物質、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキザウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサン多硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、酢酸フェニル、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、白金複合体、白金化合物、白金−トリアミド複合体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピル ビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡをベースとする免疫モジュレーター、プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類のプロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、
ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ１８６エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ログレチミド、ロヒツキン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴル、サイントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ １ミメティックス、セムスチン、セネセンス由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達モジュレーター、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ナトリウムボロカプテート、ナトリウムフェニルアセテート、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォン酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、過剰活動性血管活性腸管ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフル、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチンミメティック、チマルファシン、チモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、チタノセンビクロリド、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキセート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメックス、泌尿生殖器洞由来増殖阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクター系、赤血球遺伝子治療、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブおよびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。一実施形態において、抗癌剤は、有効量のサリドマイドまたはトポイソメラーゼインヒビターの投与の前、後または同時に投与することができる５−フルオロウラシルまたはロイコボリンである。
【００７９】
他の治療としては、γ線、Ｘ線および癌細胞を破壊する他の放射線源を用いることを含む放射線療法でありうる。いくつかの実施形態において、放射線療法は、遠隔照射放射線療法、または遠隔照射源から放射線をあてる遠隔療法として適用する。他の実施形態において、放射線療法は、放射線照射源を癌細胞または腫瘍塊の近傍の体内に配置する、体内治療または近接照射法として行う。
【００８０】
４．６ 癌および新生物細胞の阻害と疾病
ベンゾピラノン化合物は、当技術分野で知られている各種のアッセイ、あるいは本明細書で説明されるアッセイを用いてインビトロおよびインビボにおいて腫瘍細胞の細胞増殖、細胞転移および／または腫瘍形成を抑制することを実証することができる。そのような活性は、インビトロアッセイにおいて本発明のベンゾピラノン化合物を腫瘍細胞と接触させることで実証することができる。通常、腫瘍細胞を様々な濃度のベンゾピラノン化合物に暴露し、そのあと生存細胞を対照と比較して測定する。そのようなアッセイでは癌細胞系の細胞、あるいは患者からの細胞が使用される。そのような生存および／または増殖を評価するのには当技術分野で周知の多くのアッセイを用いることができる。例えば、細胞増殖は、（３Ｈ）−チミジンの取り込みを、直接細胞計数により、またプロト癌遺伝子（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）または細胞周期マーカー（Ｒｂ、ｃｄｃ２、ｃｙｃｌｉｎ Ａ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅなど）などの既知の遺伝子の転写、翻訳または活性における変化を検出することによりアッセイすることができる。そのようなタンパク質およびｍＲＮＡならびに活性のレベルは当技術分野で周知のどの方法によっても決定することができる。例えば、タンパク質は、市販されている抗体（例えば、Santa Cruz Inc.からは多くの細胞周期マーカーが市販されている）を用いてウエスタンブロットまたは免疫沈降などの知られている免疫診断法により定量化することができる。ｍＲＮＡは、当技術分野において周知で常套的となっている方法により、例えばノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、または逆転写との関係におけるポリメラーゼ連鎖反応などにより定量化することができる。細胞の生死判別は、当技術分野で知られているトリパンブルー染色またはその他の細胞の死または生のマーカーを用いて評価することができる。分化は、形態などにおける変化に基づいて視覚的に評価することができる。
【００８１】
ベンゾピラノン化合物はまた、当技術分野で知られている各種のアッセイ、あるいは本明細書で説明されるアッセイを用いてインビトロおよびインビボにおいて神経膠腫の細胞増殖、細胞転移および腫瘍形成を抑制することを実証することができる。そのような活性は、インビトロアッセイにおいてベンゾピラノン化合物を神経膠腫の腫瘍細胞と接触させることで実証することができる（Haroun, R. I.etal., J. Neurooncol. 58: 115-23 (2002)；Sharma A. et al., J. Mol. Neurosci. 17: 331-9(2001)；Iwadate Y. etal., Int.J. Mol. Med.10 : 187-92 (2002)）。
【００８２】
本発明では、限定するものではないが、以下のような当技術分野で知られている様々な手法による細胞周期分析および細胞増殖分析を記載しておく。
【００８３】
１つの例としては、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取り込みを、増殖細胞を同定するアッセイとして用いることができる。ＢＲＤＵアッセイは、ＢＲＤＵを新たに合成されるＤＮＡ中に取り込むことによりＤＮＡ合成を行なっている細胞集団を同定する。新たに合成されるＤＮＡはこのあと抗ＢＲＤＵ抗体を用いて検出することができる（Hoshino et al., 1986, Int. J. Cancer38, 369; Campana et al. , 1988, J. Immunol. Meth. 107, 79を参照されたい）。
【００８４】
細胞増殖は（３Ｈ）−チミジンの取り込みを用いて調べることもできる（例えば、Chen, J. , 1996, Oncogene 13: 1395-403; Jeoung, J. , 1995, J. Biol. Chem. 270: 18367-73を参照されたい）。このアッセイはＳ相ＤＮＡ合成の定量的な特性決定を可能とする。このアッセイでは、ＤＮＡを合成する細胞は（３Ｈ）−チミジンを新たに合成されるＤＮＡ中に取り込む。取り込みはこのあと当技術分野の標準的な手法により例えばシンチレーションカウンター（例えば、Beckman LS 3800 Liquid Scintillation Counter）で放射性同位元素をカウントすることにより測定することができる。
【００８５】
増殖細胞の核抗原（PCNA）検出も細胞増殖を測定するのに用いることができる。PCNAは増殖細胞において特に細胞周期の初期G1相およびS相において発現が増大している36キロダルトンのタンパク質であり、それゆえ増殖細胞に対するマーカーとして役立ち得る。陽性の細胞は抗PCNA抗体を用いる免疫染色により同定される（Li et al. , 1996, Curr. Biol. 6: 189-199; Vassilev et al., 1995, J. Cell Sci. 108: 1205-15を参照されたい）。
【００８６】
細胞増殖は、細胞集団のサンプルを時間に対して計数（例えば、日毎の細胞計数）することで測定することができる。細胞は血球計と光学顕微鏡（例えば、HyLite hemacytometer, Hausser Scientific）を用いて計数することができる。細胞数を時間に対してプロットして目的の集団についての増殖曲線を求めることができる。好ましい実施形態では、この方法で計数される細胞に最初に色素トリパンブルー（Sigma）が混ぜられ、そうすると生存細胞はこの色素を排出するので集団中の生存細胞として計数される。
【００８７】
細胞のＤＮＡ計数および／または分裂指数は、例えば細胞のＤＮＡ倍数値に基づいて測定することもできる。例えば、細胞周期のＧ１相にある細胞は普通２ＮのＤＮＡ倍数値を有している。ＤＮＡが複製しているが有糸分裂までは進行していない細胞（例えば、Ｓ相にある細胞）は２Ｎより大きく最大４ＮのＤＮＡ含量の倍数値を示すと考えられる。倍数値および細胞周期速度はヨウ化プロピジウムアッセイを用いてさらに測定することができる（例えば、Turner, T. , et al. , 1998, Prostate 34: 175-81）を参照されたい）。あるいは、ＤＮＡ倍数は、コンピュータ化されたマイクロデンシトメトリー染色システムでのＤＮＡフォイルゲン染色（これは化学量論量でＤＮＡに結合する）の定量化により決定することもできる（例えば、Bacus, S. , 1989, Am. J.Pathol. 135 : 783-92を参照されたい）。もう１つの実施形態では、ＤＮＡ含量は染色体展開の標本によって分析することができる（Zabalou, S. , 1994, Hereditas. 120: 127-40; Pardue, 1994, Meth. Cell Biol. 44: 333351）。
【００８８】
細胞周期のタンパク質（例えば、ＣｙｃＡ． ＣｙｃＢ， ＣｙｃＥ， ＣｙｃＤ， ｃｄｃ２， Ｃｄｋ４／６， Ｒｂ， ｐ２１， ｐ２７など）の発現は、細胞または細胞集団の増殖状態に関する重要な情報を提供する。例えば、抗増殖シグナル経路における同定はｐ２１ＣｉＰｌの誘発によって示され得る。細胞中のｐ２１発現レベルの増大は細胞周期Ｇ１への進入を遅延させる（Harper et al. , 1993, Cell 75: 805-816; Li et al. , 1996, Curr. Biol. 6: 189-199）。Ｐ２１誘発は、市販されている（例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）特定の抗ｐ２１抗体を用いて免疫染色により同定することができる。同様にして、細胞周期タンパク質は、市販の抗体を用いてウエスタンブロット分析により調べることができる。もう１つの実施形態では、細胞集団は細胞周期タンパク質の検出の前に同期化される。細胞周期タンパク質は、目的のタンパク質に対する抗体を用いてＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーター）分析により検出することもできる。
【００８９】
細胞周期の長さまたは細胞周期の速さにおける変化の検出を用いて、ベンゾピラノン化合物による細胞増殖の抑制を測定することもできる。１つの実施形態では細胞周期の長さは細胞集団（例えば、本発明の１以上のベンゾピラノン化合物と接触させたまたは接触させていない細胞を用いて）の倍加時間により決定される。もう１つの実施形態では、ＦＡＣＳ分析を用いて細胞周期進行の相が分析されるあるいはＧ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍの画分が精製される（例えば、Delia, D. et al. , 1997, Oncogene 14: 2137-47を参照されたい）。
【００９０】
細胞周期チェックポイント（１個または複数個）の経過、および／または細胞周期チェックポイント（１個または複数個）の誘導は、本明細書に記載されている方法により、あるいは当技術分野で知られている方法により調べることができる。限定するものではないが、細胞周期チェックポイントは、ある特定の細胞の事象がある特定の順序で起ることを確実にするための機構である。チェックポイント遺伝子は、前の事象が先に完了することなく後の事象が起ることを可能とする突然変異により定義される（Weinert, T. , and Hartwell, L. , 1993, Genetics, 134: 63-80）。細胞周期チェックポイント遺伝子の誘導または抑制は、例えばウエスタンブロット分析、あるいは免疫染色などにより評価することができる。細胞周期チェックポイントの経過は、特定の事象が先に起ることなく（例えば、ゲノムＤＮＡの完全な複製なしに有糸分裂に進行すること）細胞がチェックポイントを進行するということによってさらに評価することができる
特定の細胞周期タンパク質発現の作用に加えて、細胞周期に関与するタンパク質の活性および翻訳後修飾は細胞の制御および増殖状態において不可欠の機能を有しうる。本発明では、関係する、当技術分野で知られている方法により検出される翻訳後修飾（例えばリン酸化反応）アッセイを記載しておく。例えば、リン酸化チロシン残基を検出する抗体は市販されており、ウエスタンブロット分析に用いてそのような修飾があるタンパク質を検出することができる。もう１つの例では、ミリスチン化などの修飾を薄層クロマトグラフィーまたは逆相ｈ．ｐ．ｌ．ｃ．で検出することができる（例えば、Glover, C., 1988, Biochem. J. 250: 485-91; Paige, L. , 1988, Biochem J. ; 250: 485-91を参照されたい）。
【００９１】
シグナル伝達および細胞周期タンパク質および／またはタンパク質複合体の活性には多くの場合キナーゼ活性が介在する。本発明では、ヒストンＨ１アッセイなどのアッセイによるキナーゼ活性の分析を記載しておく（例えば、Delia, D. et al. , 1997, Oncogene 14: 2137-47を参照されたい）。
【００９２】
ベンゾピラノン化合物は、当技術分野で周知の方法を用いてインビトロで培養細胞における細胞増殖を改変することを実証することもできる。原発性脳腫瘍および転移性脳腫瘍に対する細胞培養モデルの特定的な例としては、限定するものではないが、以下の米国特許：第６，１９４，１５８号；第６，０５１，３７６号；および第６，０７１，６９６号に記載されているものが挙げられる。
【００９３】
ベンゾピラノン化合物はインビトロで細胞転移（または悪性表現型への進行）を抑制することを実証することもできる。この実施形態では、転移細胞表現型をもつ細胞を１以上のベンゾピラノン化合物と接触させて、転移表現型に関連する特性（インビボでの腫瘍形成性能力に関連するインビトロ特性のセット）例えば、限定するものではないが、軟寒天におけるコロニー形成、より丸みのある細胞形態、緩い基層付着、接触抑制の喪失、足場依存性の喪失、プラスミノーゲンアクチベーターなどのプロテアーゼの放出、糖輸送の増大、血清要求の減少、または胎児抗原の発現などにおける変化について検査する（Luria et al. , 1978, General Virology, 3d Ed. , John Wiley & Sons, New York, pp. 436-446を参照されたい）。
【００９４】
浸潤性が喪失することまたは付着力が低下することを利用してベンゾピラノン化合物の抗癌作用を実証することもできる。例えば、転移性癌形成の臨界的な側面は、前癌細胞または癌細胞が疾患の原発部位から離れて第２の部位で新しい増殖コロニーをつくる能力である。細胞が周辺部位に侵入する能力は癌状態への可能性を反映するものである。浸潤性の喪失は、例えばＥ−カドヘリン介在細胞−細胞付着の誘導などの当技術分野で知られている様々な手法によって測定することもできる。そのようなＥ−カドヘリン介在付着は表現型の逆転および浸潤性の喪失を生じることができる（Hordijk et al. , 1997, Science 278: 1464-66）。
【００９５】
浸潤性の喪失はさらに細胞移動の抑制によっても調べることができる。各種の二次元および三次元の細胞マトリックスが市販されている（Calbiochem-Novabiochem Corp. San Diego, CA）。マトリックスを横断するまたはその中への細胞移動は、コマ撮り写真もしくはビデオ撮影の顕微鏡により、あるいは細胞移動の測定を可能とする当技術分野における方法により調べることができる。関係する実施形態において、浸潤性の喪失は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）に対する応答により調べられる。ＨＧＦ誘発細胞分散は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞などの細胞の浸潤と相関している。このアッセイは、ＨＧＦに応答して細胞分散活性を喪失した細胞集団を識別する（Hordijk et al. , 1997, Science 278: 1464-66）。
【００９６】
あるいは、浸潤性の喪失は走化性チャンバー（Neuroprobe/Precision Biochemicals Inc. Vancouver, BC）を通過する細胞移動により測定することもできる。そのようなアッセイでは、化学誘引剤がチャンバーの一方の側（例えば、底部チャンバー）でインキュベートされ、細胞が、反対側（例えば、頂部チャンバー）を隔てるフィルター上に塗布される。細胞が頂部チャンバーから底部チャンバーへ通過するためには、細胞はフィルター中の小さい穴を通って活発に移動しなければならない。移動した細胞数のチェッカーボード分析をこのあと浸潤性と相関させることができる（例えば、Ohnishi, T. , 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 193 : 518-25を参照されたい）。
【００９７】
ベンゾピラノン化合物はまたインビボで腫瘍形成を抑制することを実証することもできる。腫瘍形成および転移性拡散などの高増殖性疾患の膨大な数の動物モデルが当技術分野では知られている（Table 317-1, Chapter 317,"Principals of Neoplasia,"in Harrison's Principals of Internal Medicine, 13th Edition, Isselbacher et al. , eds. , McGraw-Hill, New York, p. 1814, and Lovejoy et al. , 1997, J. Pathol. 181: 130-135を参照されたい）。原発性脳腫瘍および転移性脳腫瘍についての特定的な例が以下の米国特許：第５，８９４，０１８号；第６，０２８，１７４号；および第６，２０３，７８７号（参照により本明細書に援用する）に記載されている。さらに、多数の癌のタイプに適用可能な汎用動物モデルが報告されており、限定するものではないが、ｐ５３−欠失マウスモデル（Donehower, 1996, Semin. Cancer Biol. 7: 269-278）、Ｍｉｎマウス（Shoemaker et al. , 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332: F25-F48）、ネズミにおける腫瘍に対する免疫応答（Frey, 1997, Methods, 12: 173-188）などが挙げられる。
【００９８】
例えば、ベンゾピラノン化合物を実験動物、好ましくは腫瘍が発達しやすい実験動物に投与し、そうしてこの実験動物をこのあと腫瘍形成の発生の低下についてベンゾピラノン化合物を投与していない対照との比較において調べることができる。あるいは、ベンゾピラノン化合物を腫瘍のある実験動物（例えば、悪性の、新生物細胞または転位細胞の導入により、あるいは発癌物質の投与により腫瘍が誘発された動物）に投与して、そのあとその実験動物における腫瘍を腫瘍後退についてベンゾピラノン化合物を投与していない対照動物との比較において調べることができる。
【００９９】
以下の実施例は本発明を理解する上において助けとなるよう記載するものであって、本明細書に記載され、特許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものではない。
【０１００】
以下の実施例は、本発明の非限定的な態様である。
【実施例１】
【０１０１】
実施例１および２は代表的なベンゾピラノン化合物の合成に関する。
【化６】
【０１０２】
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の４−クロロフェニル酢酸溶液（１１．０５ｇ、６４．８ｍｍｏｌ）を約１５分かけてＣＤＩ（１３．１３ｇ、８１ｍｍｏｌ）で数部ずつ処理し、気体の発生が停止するまで混合物を攪拌した。４−フルオロ−２−ヒドロキシアセトフェノン（５．０ｇ、３２．４ｍｍｏｌ）を添加し、続いて炭酸カルシウム（１５．７ｇ、１１３．６ｍｍｏｌ）および４−ＤＭＡＰ（約１ｇ）を添加した。反応混合物を約８０℃で約１０時間加温した後、室温に冷却した。水（２００ｍＬ）を添加し、水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、約３．５ｇ（３８％）のベンゾピラノン中間体を得た。
【０１０３】
ＣＣｌ４（２０ｍＬ）中のベンゾピラノン中間体の溶液（１．８５ｇ、６．８ｍｍｏｌ）をＮＢＳ（１．３３ｇ、７．５ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（０．０９ｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、約１５時間にわたり還流して混合物を加熱した。反応混合物を濃縮し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル／ヘキサン）を用いて精製し、約２．６ｇ（９２％）のブロモメチル−ビンゾピラノンを得た。
【０１０４】
ブロモメチル−ベンゾピラノン（１．０ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシフェニルボロン酸（０．５６ｇ、４．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液を、２Ｍ炭酸ナトリウム（５ｍＬ）および（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）−ジクロロパラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン複合体（０．１ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を約６時間かけて還流で加熱した後、室温に冷却した。粗生成物はフラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル／ヘキサン）を用いて精製し、約０．３０ｇ（３０％）のフェノールベンゾピラノンを得た。
【０１０５】
フェノールベンゾピラノン（０．２８ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．２８ｇ、１．１ｍｍｏｌ）および１−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジン（０．１３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ／ＣＨ２ＣＩ２（１：１，８ｍＬ）溶液をＤＩＡＤ（０．２２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）で処理し、反応混合物を室温で約６時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、粗生成物はフラッシュクロマトグラフィ（塩化メチレン／メタノール）を用いて精製し、約３５ｍｇ（１０％）の１３−（４−クロロフェニル）−７−フルオロ−４−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル］−クロメン−２−オンを得た。
【実施例２】
【０１０６】
【化７】
【０１０７】
Ｎ２雰囲気下で、３位をＲ１（上記定義の通り）で置換されたフェノール、および４−ヒドロキシフェニル酢酸（１．２当量）をクロロベンゼン中に懸濁する。三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（３当量）を約５分で約２０〜約２５℃にて添加する。懸濁液を約８０℃に加熱し、約４〜５時間攪拌した後、一晩かけて冷却する。
【０１０８】
沈殿した固形物をＮ２圧を用いて濾過し、ろ液を冷水（約０〜約５℃）に注ぐことにより直接急冷する（わずかに発熱性）。得られるろ過固形物をＣＨ２Ｃｌ２で洗浄する。飽和水性炭酸ナトリウムを約１０〜約１５分以内にろ液に添加し、発砲を観察する。得られる固体は約２０℃で一晩攪拌する。懸濁液をろ過し、Ｈ２ＯおよびＭＴＢＥ（３回）で洗浄し、Ｎ２圧下で一晩乾燥させる。得られる生成物を約４０℃にて真空下で乾燥することで、一定量を達成する。
【０１０９】
４−クロロフェニル酢酸（２当量）をＤＭＦに溶解し、約１８℃で攪拌する。ＣＤＩ（２当量）を透明な緑色／黄色溶液にゆっくりと約１５分以内に添加する。ＣＤＩ添加の間に気体の発生（ＣＯ２）が観察される。混合物を約５５℃に加熱し、約２５分間この温度で攪拌し、約１０℃に冷却する。Ｋ２ＣＯ３（２当量）、ＤＭＡＰ（０．２当量）および直前のパラグラフの生成物を、この黄色／褐色懸濁液に添加し、懸濁液を約９４〜約９６℃に加温し、約１時間攪拌する。
【０１１０】
Ｋ２ＣＯ３をろ過し、ＤＭＦで洗浄する。ろ液を強く攪拌しながら冷水に注ぎ、混合物をさらに約１〜２時間攪拌する。懸濁液を約０〜約５℃冷却し、固形物をろ別する。ろ過固形物はＭＴＢＥと１．５Ｍ ＨＣｌの間に分布する。水相をＭＴＢＥで抽出する。有機相を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄する。有機相を約１．５〜１．７Ｍ溶液（０．６〜０．６５Ｌ／ｍｏｌ）になるまで濃縮し、ＥｔＯＡｃで希釈する。得られる懸濁液を約５５℃に加熱し、約１５分攪拌し、約３〜４時間かけて約０℃に冷却する。得られる生成物をろ過し、冷ＭＴＢＥ／ＥｔＯＡｃ５：１（約２０〜約２５℃）で洗浄し、Ｎ２を一晩流出して乾燥させる。
【０１１１】
直前のパラグラフの生成物（１当量）、トリフェニルホスフィン（２当量）、および１−（２−ヒドロキシエチル）ピロリジン（３当量）のＴＨＦ／ＣＨ２ＣＩ２溶液をＤＩＡＤ（１．８当量）で処理し、反応混合物を室温で約６時間攪拌する。溶媒を除去し、粗精製物はフラッシュクロマトグラフィで精製し、７−置換３−（４−クロロフェニル）−４−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル］−クロメン−２−オン化合物を得る。
【０１１２】
本発明は、本発明のいくつかの態様を説明することを目的としたこれら実施例に開示されている特定的な実施形態により範囲が限定されるものであってはならず、機能的に同等であるどのような実施形態も本発明の範囲内に入る。実際、本明細書で示されたまた本明細書で記載された実施形態に加えての本発明の様々な改変は当業者には明らかなものであり、そのようなものは添付の特許請求の範囲内に入る。
【０１１３】
多数の文献を引用したが、それらの全開示内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１がハロゲンである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ハロゲンがフルオロである、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１がＣ１−６アルキルである、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｃ１−６アルキルがメチルである、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｃ１−６アルキルがエチルである、請求項４記載の化合物。
【請求項７】
Ｃ１−６アルキルがｎ−プロピルである、請求項４記載の化合物。
【請求項８】
Ｃ１−６アルキルがイソプロピルである、請求項４記載の化合物。
【請求項９】
Ｃ１−６アルキルがｔ−ブチルである、請求項４記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１がトリフルオロメチルである、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項１２】
癌の治療または予防を必要としている患者に、下記式：
【化２】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、患者における癌の治療または予防方法。
【請求項１３】
Ｒ１がハロゲンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ハロゲンがフルオロである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１がＣ１−６アルキルである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
Ｃ１−６アルキルがメチルである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
Ｃ１−６アルキルがエチルである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
Ｃ１−６アルキルがｎ−プロピルである、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
Ｃ１−６アルキルがイソプロピルである、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ１−６アルキルがｔ−ブチルである、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１がトリフルオロメチルである、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
癌が原発性脳腫瘍である、請求項１２記載の方法。
【請求項２３】
癌が、頭部、頚部、眼、口腔、咽喉、食道、胸部、骨、肺、大腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、精巣もしくは他の生殖器、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳または神経系の腫瘍である、請求項１２記載の方法。
【請求項２４】
癌が原発性頭蓋内中枢神経系腫瘍である、請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
原発性頭蓋内中枢神経系腫瘍が、多形性膠芽腫、悪性星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫、低悪性度星状細胞腫、髄膜腫、間葉腫瘍、下垂体腫瘍、シュワン細胞腫などの髄鞘腫瘍、中枢神経系リンパ腫、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経細胞腫瘍および神経細胞／膠細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫瘍、または脈絡叢腫瘍である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
癌が原発性脊髄腫瘍である、請求項１２記載の方法。
【請求項２７】
原発性脊髄腫瘍が、シュワン細胞腫、髄膜腫、上衣細胞腫、肉腫、星状細胞腫、神経膠腫、血管腫瘍、脊索腫または類表皮腫である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
癌が転移したものである、請求項１２記載の方法。
【請求項２９】
転移した癌が、肺（小細胞および非小細胞のいずれも）、乳房、原発腫瘍不明、黒色腫または結腸を起源とする、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
癌細胞または新生物細胞と、下記式：
【化３】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量とを接触させることを含む、癌細胞または新生物細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項３１】
Ｒ１がハロゲンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ハロゲンがフルオロである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ１がＣ１−６アルキルである、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
Ｃ１−６アルキルがメチルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
Ｃ１−６アルキルがエチルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
Ｃ１−６アルキルがｎ−プロピルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
Ｃ１−６アルキルがイソプロピルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
Ｃ１−６アルキルがｔ−ブチルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１がトリフルオロメチルである、請求項３０記載の方法。
【請求項１】
下記式：
【化１】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１がハロゲンである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ハロゲンがフルオロである、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１がＣ１−６アルキルである、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ｃ１−６アルキルがメチルである、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｃ１−６アルキルがエチルである、請求項４記載の化合物。
【請求項７】
Ｃ１−６アルキルがｎ−プロピルである、請求項４記載の化合物。
【請求項８】
Ｃ１−６アルキルがイソプロピルである、請求項４記載の化合物。
【請求項９】
Ｃ１−６アルキルがｔ−ブチルである、請求項４記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１がトリフルオロメチルである、請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項１２】
癌の治療または予防を必要としている患者に、下記式：
【化２】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、患者における癌の治療または予防方法。
【請求項１３】
Ｒ１がハロゲンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ハロゲンがフルオロである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１がＣ１−６アルキルである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
Ｃ１−６アルキルがメチルである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
Ｃ１−６アルキルがエチルである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
Ｃ１−６アルキルがｎ−プロピルである、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
Ｃ１−６アルキルがイソプロピルである、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
Ｃ１−６アルキルがｔ−ブチルである、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１がトリフルオロメチルである、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
癌が原発性脳腫瘍である、請求項１２記載の方法。
【請求項２３】
癌が、頭部、頚部、眼、口腔、咽喉、食道、胸部、骨、肺、大腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、精巣もしくは他の生殖器、皮膚、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳または神経系の腫瘍である、請求項１２記載の方法。
【請求項２４】
癌が原発性頭蓋内中枢神経系腫瘍である、請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
原発性頭蓋内中枢神経系腫瘍が、多形性膠芽腫、悪性星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫、低悪性度星状細胞腫、髄膜腫、間葉腫瘍、下垂体腫瘍、シュワン細胞腫などの髄鞘腫瘍、中枢神経系リンパ腫、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経細胞腫瘍および神経細胞／膠細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、胚細胞腫瘍、または脈絡叢腫瘍である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
癌が原発性脊髄腫瘍である、請求項１２記載の方法。
【請求項２７】
原発性脊髄腫瘍が、シュワン細胞腫、髄膜腫、上衣細胞腫、肉腫、星状細胞腫、神経膠腫、血管腫瘍、脊索腫または類表皮腫である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
癌が転移したものである、請求項１２記載の方法。
【請求項２９】
転移した癌が、肺（小細胞および非小細胞のいずれも）、乳房、原発腫瘍不明、黒色腫または結腸を起源とする、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
癌細胞または新生物細胞と、下記式：
【化３】
〔式中、Ｒ１はハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−６アルキルである。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量とを接触させることを含む、癌細胞または新生物細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項３１】
Ｒ１がハロゲンである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ハロゲンがフルオロである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ１がＣ１−６アルキルである、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
Ｃ１−６アルキルがメチルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
Ｃ１−６アルキルがエチルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
Ｃ１−６アルキルがｎ−プロピルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
Ｃ１−６アルキルがイソプロピルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
Ｃ１−６アルキルがｔ−ブチルである、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１がトリフルオロメチルである、請求項３０記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５１５２７５（Ｐ２００６−５１５２７５Ａ）
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４５４３２（Ｐ２００４−５４５４３２）
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３２９３２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５００２
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０４１３５５５０）シグナル ファーマシューティカルズ，エルエルシー (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１５日（２００３．１０．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３２９３２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５００２
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０４１３５５５０）シグナル ファーマシューティカルズ，エルエルシー (21)
【Ｆターム（参考）】
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